ES2960745T3 - Composiciones contra infecciones por cándida - Google Patents
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Abstract
La invención se refiere a composiciones para uso tópico que comprenden un imidazol y bromuro de domifen como ingredientes activos para usar en el tratamiento o prevención de una infección por hongos, en las que dicho imidazol se elige entre ketoconazol y clotrimazol. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Composiciones contra infecciones por cándida
Campo de la invención
La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas de imidazol y sales de amonio cuaternario frente a infecciones por cándida, en particular candidiasis vaginal recidivante, en donde dicho imidazol se elige entre ketoconazol y clotrimazol
Resumen
Las infecciones fúngicas relacionadas con la biopelícula de las mucosas son muy frecuentes y la incidencia de candidiasis oral y vulvovaginal recidivante es significativa.
Se han descrito diversos compuestos antifúngicos para combatir infecciones por cándida. Una composición bien conocida para el tratamiento de candidiasis vulvovaginal comprende nitrato de miconazol como principio activo y se vende con el nombre comercial Gyno Daktarin. La composición comprende estearato de glicol de polietilenglicol (PEG - 6 y PEG - 32), glicéridos de oleoilmacrogol, vaselina líquida, butilhidroxianisol, ácido benzoico.
El documento EP0832649 describe un efecto sinérgico de miconazoles y sales de amonio cuaternario en cultivos deCandida albicans, Staphylococcus aureusy una serie de especies deTrichopython.
El documento US4091090 divulga el efecto antifúngico tópico de bromuro de domifeno.
Las infecciones recidivantes con cándida están incrementando y se desean composiciones farmacéuticas más eficaces alternativas.
Compendio de la invención
La presente invención identificó combinaciones novedosas de los imidazoles, ketoconazol y clotrimazol, y la sal de amonio cuaternario bromuro de domifeno que son particularmente eficaz frente a biopelículas deCandida sp.La presente invención ilustra que bromuro de domifeno y dichos imidazoles presentan una actividad antibiopelícula, en donde dicho imidazol es potenciado por bromuro de domifeno. La invención se relaciona con la composición para uso tópico según la reivindicación 1. La composición para uso tópico comprende un imidazol elegido entre ketoconazol y clotrimazol, y bromuro de domifeno como principios activos para uso en el tratamiento o prevención de una infección fúngica. Las realizaciones preferidas para la composición para uso tópico se muestran en cualquiera de las reivindicaciones de 2 a 8
Descripción detallada de la invención
Breves descripciones de las figuras
Las abreviaturas usadas en las figuras son: MCZ: miconazol; DM: bromuro de domifeno; BKC: cloruro de benzalconio; DC: bromuro de decualinio; TB; bromuro de tetraetilamonio; BTC: cloruro de becetonio.
Figura 1. El tratamiento con bromuro de domifeno - miconazol combinado reduce la actividad metabólica de células de biopelícula deC. albicans.Los valores representan la actividad metabólica media de 4 réplicas biológicas independientes, determinada por tinción de viabilidad de CTB.
Figura 2. Actividad metabólica de células de biopelícula deC. albicansdespués del tratamiento de combinación de miconazol con compuestos de amonio cuaternario.Los valores representan la actividad metabólica media de 4 réplicas biológicas independientes, determinada por tinción de viabilidad de CTB.
2A:miconazol (MCZ) y cloruro de benzalconio (BKC)
2B:miconazol (MCZ) y bromuro de tetraetilamonio (TB)
2C:miconazol (MCZ) y cloruro de decualinio (DC)
Figura 3. Fluorescencia PI en células de biopelícula deC. albicansdespués del tratamiento de combinación con miconazol y compuestos de amonio cuaternario.La fluorescencia PI se midió cada 15 minutos durante 17 h en células de biopelícula deC. albicansdespués del tratamiento con miconazol y bromuro de domifeno, cloruro de benzalconio, cloruro de becetonio o cloruro de decualinio.
3A: miconazol y cloruro de benzalconio
3B: miconazol y bromuro de domifeno
3C: miconazol y cloruro de becetonio
3D: cloruro de miconazol y decualinio
Figura 4. Supervivencia de células de biopelícula de C. albicans después del tratamiento de combinación con miconazol y compuestos de amonio cuaternario.Los valores de log UFC medios ± DE se muestran para al menos 4 réplicas biológicas. Se realizó un análisis estadístico para evaluar las diferencias significativas entre tratamiento individual con bromuro de tetraetilamonio (50 pM), cloruro de becetonio (50 pM), cloruro de decualinio (12,5 pM), cloruro de benzalconio (50 pM) y bromuro de domifeno (50 pM) o bien combinaciones con miconazol. Se aplicaron un ANOVA bidireccional y una prueba de comparaciones múltiples de Sidak y se muestran valores depsignificativos.
Figura 5. Carga fúngica intravaginal de todos los grupos en diferentes momentos p.i.
La carga se muestra como el logaritmo de las unidades formadoras de colonias (ufc) presentes en el hisopo vaginal. Las barras de error representan EEM. G: grupo de tratamiento.
Figura 6: Carga fúngica intravaginal de todos los grupos.
La carga se muestra como el área bajo la curva (ABC) en comparación con el grupo de control (G1) (= 100 %). Mostrado como el log de las unidades formadoras de colonias (ufc) presentes en el hisopo vaginal. Las barras de error representan EEM. G: grupo de tratamiento.
Figura 7muestra la carga fúngica intravaginal de todos los grupos en diferentes días p.i.
Figura 8muestra la carga fúngica intravaginal de todos los grupos. La carga se muestra como el área bajo la curva (ABC).
Figura 9resume el resultado de la carga intravaginal de diferentes formulaciones el día 4, 9 y 14 postinfección.Figura 10muestra la supervivencia de células de biopelícula deC. glabratadespués de un tratamiento individual o de combinación con MCZ y DB.
Figura 11muestra la supervivencia de células de biopelícula deC. albicansdespués de un tratamiento individual o de combinación con un antimicótico y bromuro de domifeno.
Figura 12muestra que el tratamiento de MCZ-DB combinado reduce el valor de MIC en comparación con monotratamiento de MCZ frente a cultivos planctónicos deC. glabrata.
Definiciones:
Aproximadamentese usa para describir una desviación de un 10 % por debajo y por encima de un determinado valor. Así, por ejemplo, "aproximadamente 10" significa entre 9 y 11, "aproximadamente 50" significa entre 45 y 55.
Miconazol(((RS)-1-[2-(2,4-diclorofenil)-2-[(2,4-diclorofenil)metoxi]etil]imidazol) es un compuesto antifúngico que interfiere con el metabolismo de ergosterol, un componente de la membrana celular de levaduras. El compuesto se formula típicamente como su nitrato.
Bromuro de domifeno[bromuro de N,N-dimetil-N-(2-fenoxietilo)] es una sal de amonio cuaternario con propiedades antisépticas.
Viscosidaden el contexto de la presente invención se refiere a la resistencia a la deformación gradual por tensión de cizallamiento. La viscosidad se puede medir, por ejemplo, por un viscosímetro Brookfield HA.
Infección fúngicase refiere a una enfermedad provocada por uno o más seleccionados de la lista que comprendeCandida spp., Aspergillus spp., Cryptococcus spp., Pneumocystis spp., Zygomyces spp., Dermatofitos, Blastomyces spp., Histoplasma spp., Coccidoides spp., Sporothrix spp. Microsporidia spp., Malassezia spp.y basidiomicetos. Típicamente, la infección está provocada porCandida sp.tal comoCandida albicansyCandida glabrata.
Biopelículase refiere a un modo de crecimiento microbiano que comprende células sésiles, normalmente dentro de una matriz compleja y altamente heterogénea de polímeros extracelulares, y caracterizada por una sensibilidad reducida a agentes antifúngicos. Las biopelículas pueden contener microorganismos de especies individuales (por ejemplo, un hongo/levadura tal comoC. albicans)o de múltiples especies (tales comoC. albicans, C. glabratay otros microorganismos, preferiblemente levaduras y/u hongos o incluso procariotas). En un modo de realización preferente, dicha biopelícula es una biopelícula fúngica, más preferiblemente una biopelícula de especieCandida,que comprende una o más deC. albicans, C. glabrata,y/o C.cruse.Las biopelículas también pueden comprender o consistir en una biopelícula de especieAspergillus(por ejemplo,A. flavus, A. fumigatus, A. clavatus)o una especieFusarium(por ejemplo,F. oxysporum, F. culmorum).En el contexto de la presente invención, biopelícula se refiere típicamente a una biopelícula deCandida albicans.
Las composiciones como se describe en el presente documento generalmente comprenden miconazol y bromuro de domifeno en concentraciones que proporcionan un efecto sinérgico. La sinergia se produce cuando se encuentran valores de FICI de 0,5 o menos (menos de 0,45 o menos de 0,4). La medición de valores FICI se explica en la sección de ejemplos.
Las composiciones de la presente invención se pueden aplicar como geles o crema.
Lascremasse encuentran ahora en la técnica como emulsiones de aceite en agua (g/a) o agua en aceite (a/g). Típicamente contienen un emulsionante y un espesante.
Losgelesson conocidos en la técnica como preparaciones transparentes que contienen éteres de celulosa o carbómero en agua o una mezcla de agua-alcohol.
Tratamientoen el contexto de la presente invención se refiere a una reducción completa o parcial de la levadura y/o una reducción en los síntomas de una infección fúngica tales como prurito, ardor al orinar y flujo vaginal.
El miconazol como se describe en el presente documento se usa como un ejemplo de un imizadol, aunque no se considera parte de la presente invención como se define en las reivindicaciones.
La invención se resume en las siguientes declaraciones:
1. Una composición para uso tópico que comprende u imidazol o una sal del mismo, y bromuro de domifeno como principios activos para uso en el tratamiento o prevención de una infección fúngica, en donde dicho imidazol se elige entre ketoconazol y clotrimazol.
2. La composición según la afirmación 1, para uso en el tratamiento o prevención de una infección fúngica en donde la infección fúngica es una infección conCandidasp.
3. La composición según la afirmación 1 o 2, para uso en el tratamiento o prevención de una infección fúngica, en donde la infección fúngica es una infección conCandida albicans.
4. La composición según una cualquiera de las afirmaciones 1 a 3, para uso en el tratamiento de una biopelícula formada porCandidaalbicans.
5. La composición según una cualquiera de las afirmaciones 1 a 4, para uso en el tratamiento o prevención de una infección vulvovaginal.
6. La composición según una cualquiera de las afirmaciones 1 a 5, para uso en el tratamiento o prevención de una infección fúngica, en donde dicha infección fúngica es candidiasis vulvovaginal recurrente.
7. La composición según una cualquiera de las afirmaciones 1 a 6, para uso en el tratamiento o prevención de una infección fúngica, en donde dicho imidazol o una sal del mismo, y dicho bromuro de domifeno están presentes en una concentración sinérgicamente eficaz.
8. La composición según una cualquiera de las afirmaciones 1 a 7, para uso en el tratamiento o prevención de una infección fúngica, en donde dicho imidazol o sal del mismo se presenta con un exceso molar de 6 sobre bromuro de domifeno.
Estas formulaciones permiten, por un lado, la fácil retirada de la composición de un tubo o jeringa y, por otro lado, garantizan que la composición permanezca fijada en el sitio de aplicación.
Las composiciones de la presente invención son en general para uso tópico y se formulan para ser compatibles con el sitio de aplicación específico (piel, uñas, cabello). Para aplicaciones vulvovaginales, la composición se formula como una composición ácida a un pH de entre 2,75 y 3,5. El uso de ácido benzoico es bien conocido en la técnica. Otros tampones adecuados que se pueden usar en composiciones farmacéuticas para obtener un pH ácido son, por ejemplo, HCl y ácido láctico.
Puesto que el bromuro de domifeno es altamente soluble en agua y miconazol y sus sales son insolubles en agua, las composiciones somo se describe en el presente documento son preferiblemente una crema con un agente emulsionante, puesto que miconazol y nitrato de miconazol son insolubles en agua y bromuro de domifeno es altamente soluble en agua.
Diversas emulsiones de aceite en agua son conocidas en la técnica. En las formulaciones de la presente invención se usan típicamente vaselina líquida y glicéridos de lauroilmacrogol-6 como fase oleosa.
Para estabilizar la emulsión se pueden usar emulsionantes tales como, por ejemplo, una mezcla de polietilenglicol-6, palmitoestearato, estearato de etilenglicol y estearato de PEG-32.
Para incrementar la viscosidad de la emulsión, se pueden usar agentes espesantes tales como cetoestearilo.
Para una fijación óptima en el sitio de aplicación las formulaciones pueden comprender además un mucoadhesivo. Los mucoadhesivos adecuados para aplicación vulvovaginal incluyen polímeros que pueden formar hidrogeles tales como policarbofilo sintético, quitosano, derivados de celulosa (hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa e hidroxipropilmetilcelulosa), pectina, derivados de ácido hialurónico, poliacrilatos, tragacanto, alginato de carragenina y de sodio, polímeros tiolados.
Las aplicaciones farmacéuticas se pueden usar como profilácticas, pero se usan típicamente tras signos de infecciones fúngicas. La aplicación de la composición farmacéutica en la región infectada se puede realizar, por ejemplo, cada dos días, diariamente o dos veces tres veces al día durante un período de, por ejemplo, al menos 7, 14 o 21 días, o hasta que los signos de infección hayan desaparecido.
Las composiciones de la presente invención son igualmente adecuadas para el tratamiento de candidiasis vulvovaginal recidivante (es decir, se producen al menos cuatro episodios específicos en un año o se producen al menos tres episodios no relacionados con tratamiento antibiótico en un año). Las composiciones de la presente invención son adecuadas para la infección recidivante conC. albicansy específicamente adecuadas para infecciones recidivantes conC. tropicaliso C.glabrata,que son menos sensibles a monoterapias con miconazol.
Las composiciones farmacéuticas como se describe en el presente documento comprenden entre aproximadamente un 1 % (p/p) a aproximadamente un 5 % (p/p/) de miconazol o una sal del mismo (típicamente nitrato). Los modos de realización específicos se refieren a aproximadamente un 1 % (p/p/), aproximadamente un 1,5 % (p/p), aproximadamente un 2 % (p/p/) aproximadamente un 2,5 % (p/p), aproximadamente un 3 % (p/p/), aproximadamente un 4 % o aproximadamente un 5 % (p/p/) de nitrato de miconazol.
La cantidad de miconazol o su sal en las composiciones farmacéuticas como se describe en el presente documento está en un exceso molar de aproximadamente 2, aproximadamente 2,5, aproximadamente 3, aproximadamente 3,5 o aproximadamente 4, sobre la cantidad de bromuro de domifeno.
Así, por ejemplo, una composición farmacéutica con un exceso molar de 3 veces que comprende un bromuro de domifeno 10 milimolar contiene nitrato de miconazol 30 milimolar.
Cualquier combinación de las concentraciones mencionadas anteriormente de miconazol o sal y los valores mencionados anteriormente de exceso molar se divulgan aquí.
Los modos de realización específicos se refieren a composiciones farmacéuticas con aproximadamente un 2 % (p/p) de nitrato de miconazol con un exceso molar de 3 veces sobre bromuro de domifeno.
En el presente documento se describen combinaciones novedosas de miconazol (MC) y la sal de amonio cuaternario bromuro de domifeno que es particularmente eficaz contraCandida sp.y esto tanto en cultivos in vitro como en un entorno experimental utilizando un modelo de rata con una infección vaginal porCandida.
La presente descripción ilustra que el bromuro de domifeno y el miconazol muestran una actividad antibiopelículas sinérgica, basada en la determinación de los índices de concentración inhibitoria fraccional. Utilizando tinción de yoduro de propidio en tiempo real, el bromuro de domifeno combinado con miconazol , produce la muerte de células de biopelícula ya después de 2 h de tratamiento y proporciona una reducción de > 3 unidades LOG de ufc (unidades formadoras de colonias) en las biopelículas tratadas después de 24 h.
En el presente documento se describe:
1. Una composición para uso tópico que comprende miconazol o una sal del mismo y bromuro de domifeno como principios activos para uso en el tratamiento o prevención de una infección fúngica.
2. La composición según la afirmación 1, para uso en el tratamiento o prevención de una infección fúngica en donde la infección fúngica es una infección conCandidasp.
3. La composición según la afirmación 1 o 2, para uso en el tratamiento o prevención de una infección fúngica, en donde la infección fúngica es una infección conCandida albicansoCandida glabrata.
4. La composición según una cualquiera de las afirmaciones 1 a 3, para uso en el tratamiento de una biopelícula formada porCandidasp.
5. La composición según una cualquiera de las afirmaciones 1 a 4, para uso en el tratamiento o prevención de una infección vulvovaginal.
6. La composición según una cualquiera de las afirmaciones 1 a 5, para uso en el tratamiento o prevención de una infección fúngica, que se formula como una crema.
7. La composición según una cualquiera de las afirmaciones 1 a 6, para uso en el tratamiento o prevención de una infección fúngica, que comprende además un mucoadhesivo.
8. La composición según una cualquiera de las afirmaciones 1 a 7, para uso en el tratamiento o prevención de una infección fúngica, en donde el exceso molar de miconazol o una sal sobre bromuro de domifeno está entre 2 y 4.
9. La composición según una cualquiera de las afirmaciones 1 a 8, para uso en el tratamiento o prevención de una infección fúngica en donde la concentración de miconazol y su sal en dicha composición está entre un 2 y un 5 % (p/p).
10. La composición según una cualquiera de las afirmaciones 1 a 9, para uso en el tratamiento o prevención de una infección fúngica, en donde el exceso molar de miconazol o una sal sobre bromuro de domifeno está entre 2 y 4.
11. La composición según una cualquiera de las afirmaciones 1 a 10, para uso en el tratamiento o prevención de una infección fúngica en donde la concentración de nitrato de miconazol es de aproximadamente un 2 % (p/p) y el exceso molar de nitrato de miconazol sobre bromuro de domifeno es de aproximadamente 3.
12. La composición según una cualquiera de las afirmaciones 1 a 11, para uso en el tratamiento o prevención de una infección fúngica, en donde la composición se aplica durante un período de 14 días.
13. Una composición farmacéutica que comprende un vehículo fisiológicamente aceptable y que comprende como principios antifúngicos activos una mezcla de miconazol o una sal del mismo y bromuro de domifeno.
14. La composición según la afirmación 13, que comprende nitrato de miconazol.
15. La composición según la afirmación 13 o 14, que es una crema con una viscosidad de entre 0,3 Pas (300 cp) y 0,3 Pas (300 cp) a 180 rpm.
16. La composición según una cualquiera de las afirmaciones 12 a 15, que tiene un pH entre 2,7 y 3,5.
17. La composición según cualquiera de las afirmaciones 12 a 16, en donde el exceso molar de miconazol o una sal sobre bromuro de domifeno está entre 2 y 4.
18. La composición según una cualquiera de las afirmaciones 12 a 17, en donde la concentración de miconazol y su sal en dicha composición está entre un 2 y un 5 % (p/p).
19. La composición según una cualquiera de las afirmaciones 12 a 18, que comprende además un mucoadhesivo.
20. La composición según una cualquiera de las afirmaciones 12 a 19, que se envasa en un aplicador para suministro vaginal.
21. Un procedimiento para tratar o prevenir una infección fúngica que comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz de miconazol o una sal del mismo y bromuro de domifeno.
22. El procedimiento según la afirmación 21, en donde la infección fúngica es una infección conCandidasp. 23. El procedimiento según la afirmación 21 o 21, en donde la infección fúngica es una infección vulvovaginal. En el presente documento se describe:
1. Una composición para uso tópico que comprende miconazol o una sal del mismo y bromuro de domifeno como principios activos para uso en el tratamiento o prevención de una infección fúngica.
2. La composición según la realización 1, para uso en el tratamiento o prevención de una infección fúngica en donde la infección fúngica es una infección conCandidasp.
3. La composición según la realización 1 o 2, para uso en el tratamiento o prevención de una infección fúngica, en donde la infección fúngica es una infección conCandida albicansoCandida glabrata.
4. La composición según una cualquiera de las realizaciones 1 a 3, para uso en el tratamiento de una biopelícula formada porCandidasp.
5. La composición según una cualquiera de las realizaciones 1 a 4, para uso en el tratamiento o prevención de una infección vulvovaginal.
6. La composición según una cualquiera de las realizaciones 1 a 5, para uso en el tratamiento o prevención de una infección fúngica, que se formula como una crema.
7. La composición según una cualquiera de las realizaciones 1 a 6, para uso en el tratamiento o prevención de una infección fúngica, que comprende además un mucoadhesivo.
8. La composición según una cualquiera de las realizaciones 1 a 7, para uso en el tratamiento o prevención de una infección fúngica, en donde el exceso molar de miconazol o una sal sobre bromuro de domifeno está entre 2 y 4. 9. La composición según una cualquiera de las realizaciones 1 a 8, para uso en el tratamiento o prevención de una infección fúngica en donde la concentración de miconazol y su sal en dicha composición está entre un 2 y un 5 % (p/p).
10. La composición según una cualquiera de las realizaciones 1 a 9, para uso en el tratamiento o prevención de una infección fúngica, en donde el exceso molar de miconazol o una sal sobre bromuro de domifeno está entre 2 y 4.
11. La composición según una cualquiera de las realizaciones 1 a 10, para uso en el tratamiento o prevención de una infección fúngica en donde la concentración de nitrato de miconazol es de aproximadamente un 2 % (p/p) y el exceso molar de nitrato de miconazol sobre bromuro de domifeno es de aproximadamente 3.
12. La composición según una cualquiera de las realizaciones 1 a 11, para uso en el tratamiento o prevención de una infección fúngica, en donde la composición se aplica durante un período de 14 días.
13. Una composición farmacéutica que comprende un vehículo fisiológicamente aceptable y que comprende como principios antifúngicos activos una mezcla de miconazol o una sal del mismo y bromuro de domifeno.
14. La composición según la realización 13, que comprende nitrato de miconazol.
15. La composición según la realización 13 o 14, que es una crema con una viscosidad de entre 0.3 Pas (300 cp) y 0.3 Pas (300 cp) a 180 rpm.
16. La composición según una cualquiera de las realizaciones 12 a 15, que tiene un pH entre 2,7 y 3,5.
17. La composición según cualquiera de las realizaciones 12 a 16, en donde el exceso molar de miconazol o una sal sobre bromuro de domifeno está entre 2 y 4.
18. La composición según una cualquiera de las realizaciones 12 a 17, en donde la concentración de miconazol y su sal en dicha composición está entre un 2 y un 5 % (p/p).
19. La composición según una cualquiera de las realizaciones 12 a 18, que comprende además un mucoadhesivo.
20. La composición según una cualquiera de las realizaciones 12 a 19, que se envasa en un aplicador para suministro vaginal.
Ejemplos
Ejemplo 1: materiales y procedimientos
Cepas y productos químicos.La cepa SC5314 deC. albicansse cultivó de forma rutinaria en placas de agar YPD (extracto de levadura al 1 %, peptona al 2 % (International Medical Products, Bélgica) y glucosa al 2 % (Sigma-Aldrich, EE. UU.)) a 30 °C. Se prepararon soluciones madre de miconazol (MCZ) (Sigma-Aldrich) en DMSO (VWR International, Bélgica). Se adquirió medio RPMI 1640 (pH 7,0) con L-glutamina y sin bicarbonato de sodio de Sigma-Aldrich y se tamponó con MOPS (Sigma-Aldrich). Se adquirió bromuro de domifeno de Selleck Chemicals y cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio y cloruro de tetraetilamonio de TCI Europe (Bélgica).
Ensayo de detección de antibiopelícula.Se diluyó un cultivo durante la noche deC. albicansSC5314, cultivado en YPD, hasta una densidad óptica de 0,1 (aproximadamente 106 células/ml) en medio RPMI y se añadieron 100 gl de esta suspensión a los pocillos de una microplaca de fondo redondo (TPP Techno Plastic Products AG, Suiza) (30, 31). Después de 1 h de adhesión a 37 °C, se aspiró el medio y se lavaron las biopelículas con 100 gl de solución salina tamponada con fosfato (PBS) para retirar células inadherentes, seguido de la adición de 100 gl de medio RPMI 1640. Se dejó que las biopelículas crecieran durante 24 h a 37 °C. Posteriormente, se añadieron 10 gM de miconazol en combinación con 25 gM de un compuesto de la colección Pharmakon 1600 (solución madre 2 mM en DMSO) en RPMI, dando como resultado un fondo de DMSO al 1,1 %. Las biopelículas se incubaron durante 24 h adicionales a 37 °C. Finalmente, las biopelículas se lavaron y cuantificaron con Cell-Titre Blue (CTB; Promega, EE. UU.) (32) añadiendo 100 gl de CTB diluido 1/10 en PBS a cada pocillo. Después de 1 h de incubación en la oscuridad a 37 °C, se midió la fluorescencia con un espectrómetro de fluorescencia (lector de microplacas multimodo Synergy Mx, BioTek, EE. UU.) a Aex 535 nm y Aem 590 nm. Los valores de fluorescencia de las muestras se corrigieron restando el valor de fluorescencia promedio de CTB de los pocillos sin inocular (blanco). Se calculó el porcentaje de células de biopelícula metabólicamente activas en relación con el tratamiento de control (DMSO al 1,1 %). Se consideró volver a someter a prueba los compuestos cuando su aplicación en presencia de miconazol 10 gM dio como resultado menos de un 60 % de actividad metabólica residual de células de biopelícula deC. albicansen comparación con el control de miconazol. Este experimento de confirmación se realizó dos veces y se incluyeron controles de solo compuesto.
Ensayo de tablero de ajedrez de biopelícula.Para determinar las posibles interacciones sinérgicas entre agentes antifúngicos por un lado y los potenciadores identificados por el otro, se usó un ensayo de tablero de ajedrez. Se añadió una combinación de compuesto antifúngico (miconazol, fluconazol, caspofungina o anfotericina B) y potenciador, diluidos dos veces en filas y columnas de una microplaca respectivamente, a biopelículas deC. albicanscultivadas como se describe anteriormente (fondo de DMSO al 0,6 %). Después de 24 h de incubación a 37 °C, las biopelículas se cuantificaron con el procedimiento CTB como se describe anteriormente. El sinergismo se determinó por cálculos de FICI (índice de concentración inhibidora fraccionaria).
El FICI se calculó por la fórmula FICI=[C(BEC-2<a>)/BEC-2<a>]+[C(BEC-2<b>)/BEC-2<b>], en dondeC(BEC-2A) y C(BEC-2<b>) son los valores de BEC-2 de los fármacos antifúngicos en combinación, y BEC-2<a>y B<e>C-2<b>son los valores de BEC-2 de los fármacos antifúngicos A y B solos. BEC-2 significa concentración de erradicación de biopelícula 2, que es la concentración mínima de un compuesto que provoca una disminución de dos veces de la actividad metabólica de biopelícula.
La interacción se definió como sinérgica para un valor de FICI<0,5, indiferente para 0,5<FICI<4 y antagonista para FICI>4.
Ensayo de PI y determinación de UFC.Se cultivaron biopelículas como se describe anteriormente y se trataron con dosis seleccionadas de miconazol y bromuro de domifeno, cloruro de benzalconio, cloruro de becetonio, cloruro de decualinio o bien bromuro de tetraetilamonio. Para obtener una lectura cinética de PI, se incubaron biopelículas, en presencia de PI al 3 %, en un lector multimodo (Syngergy MX, Biotek) que mide la fluorescencia cada 15 min durante 17 h (longitud de onda de emisión: 535 nm y longitud de onda de excitación: 617 nm). La determinación de UFC se realizó en biopelículas 24 h después del tratamiento. Con este fin, las biopelículas se lavaron con PBS y se rasparon completamente del fondo de la placa. Se plaquearon diluciones en serie en placas de agar YPD y se incubaron durante 48 h a 30 °C antes del recuento de colonias.
Ejemplo 2: detección para potenciadores de miconazol frente a biopelículas de C. albicans
Se sometió a prueba bromuro de domifeno (DB) para determinar su capacidad para reducir la actividad metabólica de biopelícula deC. albicanscon más de un 50 % en combinación con una dosis de miconazol subinhibidora y su perfil de toxicidad en células humanas.
Ejemplo 3: los compuestos de amonio cuaternario actúan sinérgicamente con miconazol frente a biopelículas de C. albicans
Para determinar si el bromuro de domifeno actúa sinérgicamente con miconazol frente a biopelículas deC. albicansse realizaron experimentos de tablero de ajedrez (figura 1) y cálculos de FICI (tabla 1). Los datos del tablero de ajedrez muestran que, en presencia de bromuro de domifeno, se pueden usar concentraciones menores de miconazol para reducir la actividad metabólica de biopelículas deC. albicans,indicativo de una disminución en la supervivencia de las células de biopelícula (figura 1). A continuación, se deriva la concentración tanto de miconazol como de bromuro de domifeno necesaria para erradicar la biopelícula deC. albicanscon un 50 % o 2 veces (concentración de erradicación de biopelícula 2, BEC-2), para permitir los cálculos de FICI (tabla 1).
Tabla 1. Combinaciones sinérgicas de miconazol-bromuro de domifeno frente a biopelículas de C. albicans
(Tabla 1). Se encontraron combinaciones sinérgicas para combinaciones de bromuro de domifeno y Miconazol en una proporción de 1/9 a 1/2,3.
Para el interés de los inventores, se detectaron previamente otros compuestos de amonio cuaternario como potenciales potenciadores de miconazol, a saber, cloruro de benzalconio (BKC) y cloruro de becetonio (BTC) (datos no publicados). Sin embargo, su actividad en combinación con miconazol nunca se evaluó en análisis de tablero de ajedrez. Por lo tanto, en este estudio, se evaluaron las potenciales interacciones sinérgicas entre miconazol y diversos compuestos de amonio cuaternario, incluyendo cloruro de benzalconio, cloruro de becetonio, cloruro de decualinio (DC) y bromuro de tetraetilamonio (TB) (figura 2).
Se descubrió que cloruro de benzalconio, cloruro de becetonio y cloruro de decualinio actúan sinérgicamente con miconazol (FICI<0,5), mientras que este no es el caso para bromuro de tetraetilamonio (FICI>0,5). Estos datos sugieren que la acción sinérgica con miconazol es una característica de diversos compuestos de amonio cuaternario, lo que implica que la actividad se atribuye probablemente a la estructura química central de esta familia.
Ejemplo 4: las combinaciones de bromuro de domifeno - miconazol y cloruro de benzalconio - miconazol muestran una actividad fungicida destacada frente a biopelículas deC. albicans
Una reducción en la actividad metabólica, como se observa en los experimentos previos, no significa necesariamente que las células de biopelícula en investigación estén muertas. Bien podría ser que su metabolismo celular se atenúe en presencia de los compuestos, pero que revivan cuando se retira la tensión. Para evaluar cuánto daño se provoca realmente a las células y en qué marco temporal, se realizó un experimento de curso temporal en biopelículas deC. albicanstratadas con una combinación de bromuro de domifeno, cloruro de benzalconio, cloruro de becetonio o cloruro de decualinio (25 gM o 50 gM) y miconazol (75 gM o 150 gM) (dando como resultado una proporción de 1/3) o compuestos individuales, en presencia de yoduro de propidio (PI) (figura 3). Las concentraciones de los compuestos se eligieron en base a la observación en la figura 1 de que el bromuro de domifeno 25 gM en combinación con miconazol 500, 250, 125 o 62,5 gM dio como resultado una reducción de la actividad metabólica de biopelícula deC. albicanspor debajo de un 25 % (caja en la figura 1).
Es conocido que PI penetra a través de la membrana de células dañadas y su absorción es una indicación de muerte celular. Se observó solo un ligero incremento en la fluorescencia de PI cuando las células se trataron con miconazol 150 gM después de 16 h de tratamiento. Entre los tratamientos individuales con los compuestos de amonio cuaternario, solo bromuro de domifeno y cloruro de benzalconio mostraron un ligero incremento en la fluorescencia de PI 5-10 h después del tratamiento a 50 gM. Sin embargo, el efecto más rápido se observa para las combinaciones de miconazol con bromuro de domifeno, cloruro de benzalconio o bien cloruro de becetonio 50 gM, con valores de PI que comienzan a incrementar ya 2-3 h después del tratamiento. Sorprendentemente, no se pudo observar ningún incremento adicional en la fluorescencia de PI para las combinaciones de miconazol y cloruro de decualinio (figura 3). Sorprendentemente, no se observó ningún incremento para cloruro de decualinio, pero faltan combinaciones con 50 gM.
La capacidad de destrucción de los compuestos de amonio cuaternario en presencia o ausencia de miconazol se confirmó además por el recuento de UFC para dosis seleccionadas de los compuestos (figura 4).
Solo se observaron reducciones terapéuticamente interesantes en UFC (> 3 unidades log) para combinaciones de miconazol 150 gM con cloruro de benzalconio 50 gM y bromuro de domifeno 50 gM (figura 4). Curiosamente, en unos pocos casos, se observó esterilidad completa de la superficie después del tratamiento con estas combinaciones.
Ejemplo 5: la sinergia observada entre compuestos de amonio cuaternario y miconazol es específica de m iconazol.
Se evaluó si el compuesto de amonio cuaternario también podría incrementar la actividad del fluconazol frente a biopelículas deC. albicans.El fluconazol no mostró actividad antibiopelícula significativa por sí solo ni en combinación con bromuro de domifeno, cloruro de benzalconio, cloruro de becetonio o cloruro de decualinio 25 gM (BEC-2 > 500 gM) (datos no mostrados).
Ejemplo 6: formulaciones para aplicación vulvovaginal
El ejemplo ilustra la preparación de diferentes composiciones farmacéuticas que comprenden bromuro de domifeno y/o miconazol.
Tabla 2: formulación de composiciones de bromuro de domifeno y/o miconazol.
En F5, nitrato de miconazol está en un exceso molar de 3 veces sobre bromuro de domifeno
Ejemplo 7: modelo animal para infección vaginal por cándida
La formulación F5 anterior es una preparación de nitrato de miconazol - bromuro de domifeno con efecto sinérgicoin vitro(exceso molar de 3 veces de bromuro de domifeno sobre nitrato de miconazol) se somete a prueba en un modelo de rata.
F1 a F4 son controles sin principio activo (F1) nitrato de miconazol (F2 y F3) y bromuro de domifeno (F4)
Se mantienen ratas Wistar hembras (180-200 g) en grupos de 4 animales. La comida y el agua están disponibles a demanda. Las condiciones de cría son: temperatura ambiente 22 °C, humedad al 60 % y un ciclo día-noche de 12 h de luz/12 h de oscuridad.
Preacondicionamiento
Las ratas se someten a ovariectomía de 2 a 3 semanas antes de infección bajo anestesia por inhalación con isoflurano. Durante la recuperación, las ratas se colocan bajo una lámpara IR durante aproximadamente 30 minutos. Tres días antes de la infección, los animales reciben 1 mg de benzoato de estradiol en 0,1 ml de PEG400 SC y 200 pg de progesterona en 0,1 ml de PBS SC para inducir el estro artificial (dado como 1 inyección). Esta inyección se repite dos veces durante el experimento.
Preparación del inóculo y procedimiento de infección.
Se usa una crioreserva deCandida albicansB2630 para la infección. Cada vial contiene 1 ml de RPMI con glicerol al 10 % con un tamaño de inóculo de 5,108 ufc/ml. Se realiza una dilución de 1/5 en agua esterilizada antes de la infección. Los animales se infectan con 1,107 ufc en 100 pl usando una micropipeta con puntas desechables. El extremo de la punta se inserta en la vagina y la rata se sostiene ligeramente hacia arriba por la cola durante aproximadamente un minuto después de la instilación.
Grupos de tratamiento
Se inicia tratamientob.i.d.tópico la mañana después de la infección (D1) durante 4 días (200 pl/animal, aplicado insertando la punta de una jeringa de 1 ml en la vagina). Se han usado las siguientes formulaciones. (Los detalles de estas formulaciones se muestran anteriormente en la tabla 2).
G1a: formulación 1a o control infectado tratado con vehículo (VICa):b.i.d.(200 pl) (n.° 2)
G1b: formulación 1b o control infectado tratado con vehículo (VICb):b.i.d.(200 pl) (n.° 2)
G2: formulación 2 (nitrato de miconazol):b.i.d.2 % superior durante 4 días (200 pl) (n.° 4)
G3: formulación 3 (nitrato de miconazol):b.i.d.4 % superior durante 4 días (200 pl) (n.° 4)
G4: formulación 4 (bromuro de domifeno):b.i.d.superior durante 4 días (200 pl) (n.° 4)
G5: formulación 5 (nitrato de miconazol/bromuro de domifeno):b.i.d.4 días (200 pl) (n.° 4)
Parámetros de evaluación
Control del estro: los días 4, 9 y 14, se toman frotis vaginales con un hisopo húmedo y se tiñen con Giemsa para comprobar el estro artificial (recuento microscópico de células epiteliales queratinizadas). Los días 2 y 7, se repiten las inyecciones de hormonas para mantener un estro continuo.
Peso corporal: seguimiento del peso corporal (BW) y cálculo del porcentaje de ganancia o pérdida en comparación con el BW antes de la infección (día 0).
Cargas de levaduras vaginales: se recogen muestras vaginales los días 4, 9 y 14. Se humedece un hisopo estéril en agua esterilizada, se inserta en la vagina y se gira dos veces. A continuación, se lleva el hisopo a un tubo con 1 ml de agua esterilizada y se coloca en el agitador de vórtice durante 40 segundos. Se preparan diluciones de diez veces de esta solución y se siembran en un agar Sabouraud. Después de 24-48 h de incubación a 37 °C, se cuentan las colonias y se calcula el número de ufc/ml como una medida de la carga intravaginal total. Los resultados se expresan como una función LOG del número de ufc que se encontraron en el hisopo (excepto cuando no hay colonias, donde el resultado = 0).
Resultados
Como no existieron diferencias entre ambos grupos de control de vehículo 1a y 1b, ambos grupos se combinaron y se muestran como grupo 1.
Control del estro
Se observaron niveles altos de células epiteliales queratinizadas durante todo el experimento (tabla 3), confirmando el estro permanente.
Tabla 3: porcentajes de células epiteliales queratinizadas observados durante todo el experimento en varios días p.i. G: grupo de tratamiento, R: número de animales.
Peso corporal
La desviación estándar del peso corporal promedio por animal permaneció constante durante el curso de la infección (tabla 4), indicando que no se produjo pérdida de peso grave.
Tabla 4: evolución del peso corporal vivo (g) de ratas tras infección vaginal con Candida albicans
Carga de levadura vaginal
La infección se mide contando la carga fúngica intravaginal de cada hisopo (figura 5) y calculando el área bajo la curva (ABC) (figura 6). Este procedimiento permite la comparación de la infección total de varios grupos de tratamiento con el grupo de control, mientras que los recuentos de ufc permiten una comparación en varios puntos temporales p.i. El ABC muestra claramente que un 2 % de miconazol no afecta al resultado de la infección, mientras que un 4 % de miconazol tiene un efecto positivo (reducción de un 33 % en el ABC). El potenciador DOM por sí solo no influye en el resultado de la infección, mientras que la combinación de 2 % MIC DOM reduce el ABC de la infección en un 66 %. En las condiciones experimentales indicadas, se pudo demostrar un efecto antifúngico del miconazol cuando se usa al 4 %. No se observó ningún efecto antifúngico para miconazol al 2 %, pero se observó un efecto significativo cuando se añadió el potenciador bromuro de domifeno, aunque el bromuro de domifeno por sí solo no influye en el resultado de la infección.
Ejemplo 8: infección vaginal por cándida (II)
Los animales, preacondicionamiento, preparación de inóculo y procedimiento de infección son como se describe en el ejemplo 7.
Grupos de tratamiento
Se inicia tratamientob.i.d.tópico la mañana después de la infección (D1) durante 4 días (200 pl/animal, aplicado insertando la punta de una jeringa de 1 ml en la vagina) G1: formulación 1 o control infectado tratado con vehículo (VIC):b.i.d.(200 pl) (n.° 4) G2: formulación 2 (nitrato de miconazol):b.i.d.2 % superior durante 4 días (200 pl) (n.° 9) G3: formulación 5 (nitrato de miconazol/1/3 mmol de bromuro de domifeno):b.i.d.4 días (200 pl) (n.° 10)
G4: formulación 4 (1/3 mmol de bromuro de domifeno):b.i.d.4 días (200 pl) (n.° 4)
Parámetros de evaluación
El control del estro, peso corporal y cargas vaginales de levadura se determinaron como se describe anteriormente.
Control del estro
Se observaron niveles altos de células epiteliales queratinizadas durante todo el experimento (tabla 5, que se relaciona con el estro. Se debe señalar que, para algunos animales en el grupo 3, la queratinización pareció disminuir alrededor del día 4. Esto se debe probablemente a la forma de muestreo, que se ha modificado para el día 9, demostrando que la queratinización todavía está en su sitio.
Tabla 5: porcentajes de células epiteliales queratinizadas
Peso corporal
La desviación estándar del peso corporal promedio por animal permaneció constante durante el curso de la infección (tabla 6), indicando que no se produjo una pérdida de peso grave.
Tabla 6: peso corporal (en g) de ratas en varios días p.i.
Cargas de levadura vaginal
La infección se mide contando la carga fúngica intravaginal de cada hisopo (tabla 7) y calculando el área bajo la curva (ABC) (figura 8). Este procedimiento permite la comparación de la infección total de varios grupos de tratamiento con el grupo de control, mientras que los recuentos de ufc permiten una comparación en varios puntos temporales p.i. El ABC muestra un claro efecto de miconazol al 2 %, coincidiendo con resultados previos, reduciendo la infección en un 65 %. También coincidiendo con resultados previos, la combinación de miconazol al 2 % potenciador reduce el ABC, pero solo hay un beneficio claro el día 4 en comparación con miconazol al 2 %. Coincidiendo con el primer experimento (exp. 2017-1146), domifeno por sí solo no reduce la infección. Para este experimento, no se ha observado agitación adicional de determinados grupos, al contrario que los resultados previos.
Tabla 7: Carga de infección intravaginal
La figura 7 muestra la carga fúngica intravaginal de todos los grupos en diferentes días p.i. La carga se muestra como el log de las unidades formadoras de colonias (ufc) presentes en el hisopo vaginal. Las barras de error representan EEM. La figura 8 muestra la carga fúngica intravaginal de todos los grupos. La carga se muestra como el área bajo la curva (ABC) en comparación con el grupo de control (G1) (= 100 %) se muestra como el log de las unidades formadoras de colonias (ufc) presentes en el hisopo vaginal. Las barras de error representan EEM. G: grupo de tratamiento.
Tanto miconazol al 2 % como miconazol al 2 % combinado con domifeno reducen la infección. El día 4, hay un efecto adicional de domifeno, pero este efecto no se puede observar los días 9 y 14.
La figura 9 resume el resultado de 3 experimentos obtenidos con 12 ratas como control, 17 ratas con tratamiento con 2 % mcz, 8 ratas con bromuro de domifeno solo, 18 ratas con tratamiento con 2 % MCZ 1/3 DB, 6 ratas con tratamiento con 2 % MCZ 1/6 DB.
Ejemplo 9 Potenciación de miconazol por bromuro de domifeno frente a biopelículas de Candida glabrata Materiales y procedimientos
Cepas y productos químicos.La cepa BG2 deC. glabratase cultivó en placas de agar YPD (extracto de levadura al 1 %, peptona bacteriológica al 2 % (LabM, Reino Unido) y glucosa al 2 % (Sigma-Aldrich, EE. UU.)) a 30 °C. Se prepararon soluciones madre de miconazol (MCZ) (Sigma-Aldrich) en DMSO (VWR International, Bélgica). Se adquirió medio RPMI 1640 (pH 7,0) con L-glutamina y sin bicarbonato de sodio de Sigma-Aldrich y se tamponó con MOPS (Sigma-Aldrich). Se suministró bromuro de domifeno (DB) por Purna Pharmaceuticals y se preparó una solución de trabajo de tritón al 1 % (Sigma-Aldrich) en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
Ensayo de tablero de ajedrez de biopelícula con determinación de UFC.Se diluyó un cultivo durante la noche deC. glabrataBG2, cultivado en YPD a 30 °C, hasta una densidad óptica de 0,1 (aproximadamente 106 células/ml) en medio RPMI y se añadieron 100 pl de esta suspensión a los pocillos de una microplaca de fondo redondo (TPP Techno Plastic Products AG, Suiza). Después de 1 h de adhesión a 37 °C, se aspiró el medio y se lavaron las biopelículas con 100 pl de PBS para retirar las células inadherentes, seguido de la adición de 100 pl de medio RPMI 1640. Se dejó que las biopelículas crecieran durante 24 h a 37 °C. Para determinar la posible potenciación de MCZ por DB, se usó un ensayo de tablero de ajedrez. Se añadió una combinación de MCZ y DB, diluidos dos veces en filas y columnas de una microplaca respectivamente a biopelículas de aC. glabrata(fondo de DMSO 1 %). Después de 38 h de incubación a 37 °C, se realizó la determinación de UFC en las biopelículas tratadas. Con este fin, las biopelículas se lavaron con PBS, se rasparon completamente del fondo de la placa y se disolvieron en 100 pl de tritón (1 %). Se plaquearon diluciones en serie (10-2, 10-3 y 10-4) en placas de agar YPD, seguido de un período de incubación de 24 h a 37 °C y posterior recuento de colonias.
Resultados y análisis
Bromuro de domifeno potencia miconazol frente a biopelículas de C. albicans
Los compuestos de amonio cuaternario, como DB, son potenciadores de MCZ frente a biopelículas deC. albicans.Para determinar si DB también es un potenciador de MCZ frente a biopelículas de C.glabrata,se realizó un experimento de tablero de ajedrez. La figura 10 muestra la supervivencia de células de biopelícula de C.glabratadespués de un tratamiento individual o de combinación con MCZ y DB. Los valores de log UFC medios /- EEM se muestran para 6 repeticiones biológicas. Se realizó un análisis estadístico para evaluar las diferencias significativas entre ambos tratamientos individuales con MCZ (150 pM) y DB (37,5 pM) y una combinación. Se realizaron un ANOVA de bidireccional y una prueba de comparaciones múltiples de Tukey y se muestran las diferencias significativas.
Se sometieron a ensayo series de concentraciones de ambos compuestos y solo se observó una reducción significativa en UFC para una combinación de MCZ 500 pM con DB 37,5 pM en comparación con el tratamiento con compuesto individual.
La potenciación observada de MCZ por DB parece ser específica de MCZ
Se evaluó si DB también podría incrementar la actividad de posaconazol frente a biopelículas deC. glabrata.Posaconazol no mostró actividad antibiopelícula significativa por sí solo ni en combinación con DB (datos no mostrados).
Ejemplo 10 Potenciación de azoles por bromuro de domifeno frente a biopelículas de Candida albicans
Cepas y productos químicos.Tanto la cepa SC5314 como la cepa B59630 deC. albicans,amablemente suministradas por el laboratorio de microbiología, parasitología e higiene del prof. Paul Cos, se cultivaron en placas de agar YPD (extracto de levadura al 1 %, peptona bacteriológica al 2 % (LabM, Reino Unido) y glucosa al 2 % (Sigma-Aldrich, EE. UU.)) a 30 °C. Se prepararon soluciones madre de miconazol (MCZ) (Sigma-Aldrich), ketoconazol (TCI Europa, Bélgica), clotrimazol (Sigma-Aldrich), itraconazol (TCI) y fluconazol (MP Biomedicals, Francia) en DMSO (VWR International, Bélgica). Posaconazol (Noxafil) se compró a MSD. El medio RPMI 1640 (pH 7,0) con L-glutamina y sin bicarbonato de sodio se adquirió de Sigma-Aldrich y se tamponó con MOPS (Sigma-Aldrich). Se suministró bromuro de domifeno (DB) por Purna Pharmaceuticals y se preparó una solución de trabajo de tritón al 1 % (Sigma-Aldrich) en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
Ensayo de tablero de ajedrez de biopelícula con determinación de UFC.Se diluyó un cultivo durante la noche deC. albicanscultivado en YPD a 30 °C, hasta una densidad óptica de 0,1 (aproximadamente 106 células/ml) en medio RPMI y se añadieron 100 pl de esta suspensión a los pocillos de una microplaca de fondo redondo (TPP Techno Plastic Products AG, Suiza). Después de 1 h de adhesión a 37 °C, se aspiró el medio y se lavaron las biopelículas con 100 pl de PBS para retirar las células inadherentes, seguido de la adición de 100 pl de medio RPMI 1640. Se dejó que las biopelículas crecieran durante 24 h a 37 °C. Para determinar la posible potenciación de los agentes antifúngicos por DB, se usaron ensayos de tablero de ajedrez. Se añadió una combinación del compuesto antifúngico, un imidazol (MCZ, ketoconazol o clotrimazol) o bien un triazol (fluconazol, itraconazol o posaconazol) y DB, diluidos dos veces en filas y columnas de una microplaca respectivamente, a biopelículas deC. albicans.Después de 24 h de incubación a 37 °C, se realizó la determinación de UFC en las biopelículas tratadas. Con este fin, las biopelículas se lavaron con PBS, se rasparon completamente del fondo de la placa y se disolvieron en 100 pl de tritón (1 %). Se plaquearon diluciones en serie (10-1, 10-2 y 10-3) en placas de agar YPD, seguido de un período de incubación de 24 h a 37 °C y posterior recuento de colonias.
Resultados y discusión
Los compuestos de amonio cuaternario, como DB, son potenciadores de MCZ frente a biopelículas deC. albicans.Los imidazoles, por ejemplo MCZ, y triazoles, como fluconazol, son dos grupos de azoles, caracterizados por 2 y 3 átomos de nitrógeno en el anillo de azol respectivamente (Cleary y col. (1990). DICP,Annals of Pharmacother.,24: 148-152; Troyer y col. (2013).J.chem,2013: 1-23). Los azoles inhiben la biosíntesis de ergosterol y miconazol tiene un efecto adicional sobre las mitocondrias de la célula (Cleary y col. (1990). DICP,Annals of Pharmacother.,24: 148 152; Ghannoum y Rice (1999).Clinical Microbial.reviews,12(4): 501-517; Portillo y Gancedo (1984)Eur. J Biochem, 143(2): 273-276; Swamy y col. (1974).Antimicrob. Agents Chemother.5(4): 420-425). Para determinar si DB también potencia otros imidazoles y triazoles frente a biopelículas deC. albicans,se realizaron experimentos de tablero de ajedrez (figura 11).
La figura 11 muestra la supervivencia de células de biopelícula deC. albicansdespués del tratamiento individual o de combinación con un antimicótico y DB. (paneles A-D) Supervivencia de células de biopelícula de la cepa B59630 o la cepa SC5314 deC. albicansdespués del tratamiento individual o de combinación con un imidazol y DB. Los valores de log UFC medios /- EEM se muestran para al menos 3 réplicas biológicas. Se realizó un análisis estadístico para evaluar las diferencias significativas entre ambos tratamientos individuales con DB y con miconazol (A y C) (150 pM), ketoconazol (panel B) (300 pM) o bien clotrimazol (panel D) (150 pM) y combinaciones (fondo de DMSO al 1 %). Se realizaron un ANOVA bidireccional y una prueba de comparaciones múltiples de Tukey y se muestran las diferencias significativas.
(E-G) Supervivencia de células de biopelícula deC. albicansSC5314 después de tratamientos individuales o de combinación con un triazol y DB. Los valores de log UFC medios /- EEM se muestran para al menos 2 réplicas biológicas. Se realizó un análisis estadístico para evaluar las diferencias significativas entre ambos tratamientos individuales con DB y con fluconazol (panel E) (150 pM), itraconazol (panel F) (75 pM) o bien posaconazol (panel G)<(285 pM) y combinaciones (fondo de DMSO al 1 %, 2 % y 0,5 % respectivamente). Se realizaron un>ANO<v>A bidireccional y una prueba de comparaciones múltiples de Tukey y se muestran los valores de p.
Se sometieron a prueba series de concentraciones de azol y DB y la combinación, dando como resultado la reducción de UFC más significativa, se muestra en la figura 11. Solo se observaron reducciones significativas en UFC para combinaciones de DB con imidazoles en comparación con tratamientos de compuesto individual. La combinación MCZ y DB dio como resultado reducciones significativas en UFC en comparación con tratamientos de compuesto individual tanto para la cepa SC5314 como la cepa B59630 deC. albicans.En unos pocos casos, el tratamiento con estas combinaciones dio como resultado una esterilidad completa de la superficie. Los triazoles no mostraron actividad antibiopelícula significativa por sí mismos ni en combinación con DB, indicando que la potenciación observada de imidazoles por DB es específica de imidazol.
Ejemplo 11. Potenciación de miconazol por bromuro de domifeno frente a biopelículas de C. glabrata
Materiales y procedimientos
Cepas y productos químicos.La cepa BG2 de C.glabratase cultivó en placas de agar YPD (extracto de levadura al 1 %, peptona bacteriológica al 2 % (LabM, Reino Unido) y glucosa al 2 % (Sigma-Aldrich, EE. UU.)) a 30 °C. Se prepararon soluciones madre de miconazol (MCZ) (Sigma-Aldrich) en DMSO. Se adquirió medio RPMI 1640 (pH 7,0) con L-glutamina y sin bicarbonato de sodio de Sigma-Aldrich y se tamponó con MOPS (Sigma-Aldrich). Se suministró bromuro de domifeno (DB) por Purna Pharmaceuticals.
Ensayo de tablero de ajedrez con determinación de la concentración mínima inhibidora (MIC).Se diluyó un cultivo durante la noche de C.glabrataBG2, cultivado en YPD, hasta una densidad óptica de 0,1 (aproximadamente 106 células/ml) en medio RPMI, precalentado a 37 °C. Se añadieron 90 pl de la suspensión celular a los pocillos de una placa de 96 pocillos, que contenían 10 pl de una combinación de MCZ y DB, diluidos dos veces en filas y columnas respectivamente (fondo de DMSO al 2 %). Después de 24 y 48 h de incubación a 37 °C, se midió la absorbancia a 490 nm por un lector multimodo (lector de microplacas multimodo Synergy Mx, BioTek, EE. UU.).
El miconazol se potencia por DB frente a cultivos planctónicos de C. glabrata
El bromuro de domifeno (DB) es un potenciador del miconazol frente a biopelículas de C.glabrata.Para determinar si DB también potencia el miconazol frente a cultivos planctónicos deC. glabrata,se determinó la concentración mínima inhibidora (MIC), la concentración de miconazol que da lugar a una reducción en el crecimiento visible de un 50 %, se determinó por medio de un ensayo de tablero de ajedrez (figura 12). Los valores de MIC se determinaron usando Graphpad Prism 6 (tabla 8).
La figura 12 muestra que el tratamiento de MCZ-DB combinado reduce el valor de MIC en comparación con el monotratamiento de MCZ frente a cultivos planctónicos deC. glabrata.Los valores representan el crecimiento visible medio de 3 réplicas biológicas (A) como porcentaje del tratamiento de control (DMSO al 2 %) y (B) como porcentaje de monotratamiento con la correspondiente concentración de DB. Para diferentes concentraciones de DB, las curvas de dosis-respuesta de miconazol se muestran en diferentes colores (azul 0 pM; rojo 0,78 pM; verde 1,56 pM y púrpura 3,125 pM). Se sometió a prueba una serie de concentraciones de MCZ, que varían de 0,0075 pM a 1 mM. La absorbancia se midió después de 24 h de tratamiento.
Tabla 8. Valores de MIC para el tratamiento de 24 h con la combinación MCZ-DB frente a cultivos planctónicos de C. glabrata.Los valores de MIC, significativamente reducidos en comparación con el monotratamiento con MCZ, se indican en verde por # #. Se usó Graphpad Prism 6 para calcular los valores de MIC.
Los datos del tablero de ajedrez muestran que, en presencia de DB, se pueden usar concentraciones significativamente menores de MCZ para reducir el crecimiento visible con un 50 % en comparación con el monotratamiento con miconazol. Se observó una reducción significativa del valor de MIC para DB 3,125 pM.
Además, el cloruro de benzalconio (BKC), otro compuesto de amonio cuaternario, no pudo potenciar MCZ frente a cultivos planctónicos deC. glabrata(véase la figura 12C).
Claims (8)
1. Una composición para uso tópico que comprende un imizadol o una sal del mismo y bromuro de domifeno como principios activos para uso en el tratamiento o prevención de una infección fúngica, en donde dicho imidazol se elige entre ketoconazol y clotrimazol
2. La composición según la reivindicación 1, para uso en el tratamiento o prevención de una infección fúngica, en donde la infección fúngica es una infección conCandida sp.
3. La composición según la reivindicación 1 o 2, para uso en el tratamiento o prevención de una infección fúngica, en donde la infección fúngica es una infección conCandida albicans
4. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para uso en el tratamiento de una biopelícula formada porCandida albicans.
5. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para uso en el tratamiento o prevención de una infección vulvovaginal.
6. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para uso en el tratamiento o prevención de una infección fúngica, en donde dicha infección fúngica es candidiasis vulvovaginal recurrente.
7. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para uso en el tratamiento o prevención de una infección fúngica, en donde dicho imadazol o una sal del mismo y dicho bromuro de domifeno están presentes en una concentración sinérgicamente eficaz.
8. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para uso en el tratamiento o prevención de una infección fúngica, en donde dicho imadazol una sal del mismo están presentes en exceso molar de 6 sobre el bromuro de domifeno
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