ES2884146T3 - Terapia dirigida al hígado basada en nanopartículas - Google Patents

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Abstract

Una nanopartícula que comprende: un núcleo que comprende un metal y/o un semiconductor; y una pluralidad de ligandos unidos covalentemente al núcleo, en donde dichos ligandos comprenden: (i) al menos un ligando de galactosa como un ligando dirigido al hígado; (ii) al menos un ligando de maitansinoide DM1; y (iii) al menos un ligando de dilución que comprende una cadena de poli u oligo etilenglicol que tiene un grupo terminal de ácido carboxílico.

Description

DESCRIPCIÓN
Terapia dirigida al hígado basada en nanopartículas
La presente solicitud reivindica la prioridad de la solicitud GB N.° 1701745,0 presentada el 2 de febrero de 2017.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a nanopartículas como vehículos para el suministro dirigido de agentes a tipos de tejido o a localizaciones específicos, concretamente para usar en medicina e incluye métodos para el tratamiento de trastornos tales como el cáncer de hígado. Las composiciones farmacéuticas, los procesos para la producción de las nanopartículas y los métodos para su uso también se desvelan.
Antecedentes de la invención
La presente invención se dirige a composiciones y productos y a métodos para fabricar y administrar tales composiciones y productos, incluyendo para el tratamiento de mamíferos y concretamente de seres humanos.
El suministro de fármacos supone varios desafíos considerables, concretamente con respecto al lugar de acción. En el caso del tratamiento de ciertos tumores, por ejemplo, siguen siendo necesarios sistemas de suministro que sean capaces de dirigir fármacos anticáncer al lugar del tumor, al tiempo que se minimizan los efectos inespecíficos.
El cáncer de hígado primario es el sexto cáncer más frecuente en todo el mundo y la segunda causa principal de muerte por cáncer. El cáncer de hígado más frecuente, representando aproximadamente un 75 % de todos los cánceres de hígado primarios, es el carcinoma hepatocelular (HCC, por sus siglas en inglés). E1HCC está formado por hepatocitos que se vuelven malignos. La hepatitis B, la hepatitis C, la aflatoxina B1 y el abuso de alcohol son los cuatro agentes responsables de aproximadamente un 80 % de los HCC humanos. Por tanto, las enfermedades subyacentes como la esteatohepatitis, la fibrosis y la cirrosis a menudo complican la terapia de1HCC convencional. En la actualidad, la resección quirúrgica es la opción de tratamiento principal para e1HCC, si el tumor es resecable. Sin embargo, solo un 10 - 20 % del HCC puede eliminarse completamente utilizando cirugía. Por tanto, el suministro de fármacos dirigido es de crucial interés debido tanto a la mejora de la eficacia de los productos quimioterapéuticos aprobados como a la reducción de sus efectos secundarios (Shi B. et al., J. Histochem. Cytochem., 2013, Vol. 61, págs. 901-909).
El documento WO0232404 describe nanopartículas de oro acopladas a carbohidratos (incluyendo acopladas a lactosa). El documento WO2014/125256 describe sistemas de suministro de nanopartículas para usar en el direccionamiento de agentes biológicamente activos al sistema nervioso central (SNC), por ejemplo, para el tratamiento de trastornos del SNC.
Garg et al., AAPS PharmSciTech, 2013, Vol. 14, N.° 3, págs. 1219-1226, describen un nanovehículo de oro de superficie modificada de lactosa para el suministro intracelular de un derivado de cumarina fluorescente para células hepáticas.
Penadés et al., Chem. Eur. J., Vol. 9, págs. 1909-1921 describen la síntesis de gliconanopartículas fluorescentes.
Penadés et al., Carbohydrate Research, Vol. 344, págs. 1474-1478 describen estudios que evalúan la influencia de la densidad y presentación de ligandos sobre el reconocimiento de los receptores de proteínas utilizando nanopartículas de oro funcionalizadas con lactosa.
Penadés et al., Chem. Bio. Chem., Vol. 5, págs. 291-297 describen estudios que investigan el uso de gliconanopartículas que presentan lactosa para reducir el progreso de la metástasis experimental.
Los documentos WO 2017/017063 y GB2541166 describen la terapia dirigida al hígado basada en nanopartículas y la obtención de imágenes.
Sigue habiendo una necesidad insatisfecha de sistemas de suministro de nanopartículas adicionales y de métodos de suministro de agentes bioactivos y/o detectables a un tejido específico o localización en un sujeto, incluyendo el tratamiento dirigido del cáncer de hígado primario. La presente invención aborda estas y otras necesidades.
Breve descripción de la invención
En términos generales, la presente invención se refiere a nanopartículas provistas de un resto dirigido al hígado y una carga útil, cuyas nanopartículas son útiles como vehículos para el suministro de la carga útil al hígado, incluyendo a las células enfermas del hígado. La carga útil puede comprender uno o más agentes bioactivos para aplicaciones terapéuticas.
El alcance de la invención se define mediante las reivindicaciones. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a productos (nanopartículas, composiciones farmacéuticas) de la presente invención para usar en un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal. La presente invención proporciona una nanopartícula que comprende: un núcleo que comprende un metal y/o un semiconductor; y una pluralidad de ligandos unidos covalentemente al núcleo, en donde dichos ligandos comprenden:
(i) al menos un ligando de galactosa como un ligando dirigido al hígado; (ii) al menos un ligando de maitansinoide DM1; y
(iii) al menos un ligando de dilución que comprende una cadena de poli u oligo etilenglicol que tiene un grupo terminal de ácido carboxílico.
En un aspecto adicional la nanopartícula, en donde al menos un ligando de dilución comprende SH-PEG-COOH; y/o en donde al menos un ligando de dilución comprende: HS-(OCH2 CH2 )q -COOH, donde q está entre 2 y 30, opcionalmente entre 6 y 10 o donde q está entre 20 y 60; y/o en donde al menos un ligando de dilución comprende HS-(OCH2 CH2)8-COOH.
Como se describe en detalle en el presente documento, se ha encontrado que una nanopartícula de [DM1]-[C2-a-Galactosa]-[PEG8COOH]@Au de acuerdo con la presente invención permite la administración de dosis de DM1 que de otra forma serían letales, facilita un mayor suministro tumoral (es decir, mayor concentración de DM1 tumoral frente al suministro de DM1 libre), mejoró la supervivencia animal y presentó una reducción seis veces mayor en el crecimiento tumoral in vivo en comparación con el tratamiento de referencia (SoC; en inglés, standard of care), Sorafenib.
En la presente invención el ligando dirigido al hígado comprende galactosa, tal como alfa-galactosa.
El ligando dirigido al hígado está unido covalentemente al núcleo a través de un primer enlazador, teniendo dicho enlazador una longitud de cadena de 2 a 50 átomos. En algunos casos, el primer enlazador comprende un grupo -(CH2)n (y/o -(OCH2CH2M , en donde n y m son independientemente > 1.
El primer enlazador puede estar unido al núcleo a través de un átomo de azufre terminal.
En la presente invención, la nanopartícula comprende al menos un ligando de maitansinoide DM1 como un ligando de carga útil. Otros ligandos de carga útil pueden ser maitansinoide DM4, doxorrubicina, irinotecán, Platino (II), Platino (IV), temozolomida, carmustina, camptotecina, docetaxel, sorafenib, maitansina, monometil auristatina E (MMAE, por sus siglas en inglés) y panobinostat.
De acuerdo con la divulgación, al menos un ligando de dilución comprende una cadena de poli u oligo etilenglicol. El ligando de dilución puede comprender un grupo terminal cargado negativamente o un grupo terminal capaz de tener carga negativa a pH fisiológico. De acuerdo con la invención, el ligando de dilución comprende una cadena de poli u oligo etilenglicol que tiene un grupo terminal de ácido carboxílico. En particular, el ligando de dilución puede comprender SH-PEG-COOH. En determinados casos, al menos un ligando de dilución comprende: HS-(OCH2CH2)q-COOH, donde q está entre 2 y 30, opcionalmente entre 6 y 10. En determinados casos q puede ser 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20. En determinados casos, uno o más ligandos que tienen cadenas de PEG más largas puede(n) emplearse solo(s) o junto con ligandos que tienen cadenas de PEG más cortas. Los datos preliminares sugieren que una nanopartícula de la invención que tiene ligandos de PEG2000 (es decir, poli(etilenglicol) que tiene un peso molecular en el intervalo de 1900 a 2200) presenta una semivida más larga (t-io) en comparación con una nanopartícula de la invención que tiene un cadena de PEG más corta. Por consiguiente, en algunas realizaciones, el ligando de dilución puede comprender un resto de poli(etilenglicol), lineal o ramificado que tiene un peso molecular promedio en el intervalo de 1000 a 3000 Daltons, por ejemplo, 1900 a 2200. En realizaciones particulares, el ligando de dilución puede comprender HS-(OCH2CH2)q-COOH, en donde q se elige de modo que proporcione un peso molecular promedio en el intervalo de 1000 a 3000 Daltons, tal como de 1900 a 2200 Daltons. En determinados casos, q puede estar en el intervalo de 20 a 60, tal como de 40 a 50. En determinados casos el número de ligandos de PEG puede ser de aproximadamente 1 a 10, por ejemplo de 1 a 8, por núcleo de nanopartícula. Se contempla específicamente que la nanopartícula puede comprender tanto una pluralidad de (por ejemplo, 10-50) ligandos que contienen PEG más cortos (por ejemplo, HS-(OCH2CH2)q-COOH, donde q está entre 2 y 30, opcionalmente entre 6 y 10) y uno o más (por ejemplo, 1-10) ligandos que contienen PEG más largos (por ejemplo, HS-(OCH2CH2)p-COOH, en donde p está en el intervalo de 20 a 60, opcionalmente 40 a 50).
En ciertas realizaciones, al menos un ligando de dilución comprende:
Figure imgf000004_0001
De acuerdo con la presente invención la pluralidad de ligandos comprende:
al menos un ligando de galactosa;
al menos un ligando de maitansinoide DM1; y
al menos un ligando de dilución que comprende SH-PEG-COOH. En algunos casos, SH-PEG-COOH es SH-PEG8-COOH.
De acuerdo con la invención la pluralidad de ligandos comprende:
al menos un ligando de galactosa (por ejemplo, SH-C2H2-alfa-galactosa);
al menos un ligando de maitansinoide DM1, por ejemplo, 3 a 8 ligandos de maitansinoide DM1 por núcleo o 4 a 6 ligandos de maitansinoide DM1 por núcleo o aproximadamente 5 ligandos de maitansinoide DM1 por núcleo; y al menos un ligando de dilución que comprende SH-PEG-COOH. En algunos casos, SH-PEG-COOH es SH-PEG8-COOH, es decir, ácido 1-mercapto-3,6,9,12,15,18,21,24-octaoxaheptacosan-27-oico.
La pluralidad de ligandos comprende solo (es decir, no hay otras especies de ligandos unidos covalentemente al núcleo de nanopartículas):
al menos un ligando de galactosa (por ejemplo, SH-C2H2-alfa-galactosa);
al menos un ligando de maitansinoide DM1, por ejemplo, 3 a 8 ligandos de maitansinoide DM1 por núcleo o 4 a 6 ligandos de maitansinoide DM1 por núcleo o aproximadamente 5 ligandos de maitansinoide DM1 por núcleo; y al menos un ligando de dilución que comprende SH-PEG-COOH. En algunos casos, SH-PEG-COOH es SH-PEG8-COOH, es decir, ácido 1-mercapto-3,6,9,12,15,18,21,24-octaoxaheptacosan-27-oico.
El núcleo comprende un metal seleccionado del grupo que consiste en: Au, Ag, Cu, Pt, Pd, Fe, Co, Gd, Zn o cualquier combinación de los mismos. En particular, el núcleo puede ser de oro.
En algunos casos, el diámetro del núcleo está en el intervalo de 1 nm a 5 nm, por ejemplo, en el intervalo de 2 nm a 4 nm.
En algunos casos, el diámetro de la nanopartícula incluyendo sus ligandos está en el intervalo de 3 nm a 50 nm. En algunos casos, la nanopartícula de este aspecto de la invención tiene la siguiente estructura general:
Figure imgf000005_0001
El número de ligandos de maitansinoide DM1 puede, por ejemplo, estar en el intervalo de 3 a 8 por núcleo de nanopartícula, tal como 4 a 6 por núcleo o aproximadamente 5 ligandos de maitansinoide DM1 por núcleo. El número de ligandos que contienen alfa-galactosa y/o ligandos que contienen PEGaCOOH normalmente será mayor, tal como más de 10 o más de 20. En algunos casos, el número de ligandos que contienen alfa-galactosa y/o ligandos que contienen PEGaCOOH no será más de 50, tal como no más de 25 o incluso no más de 20 por núcleo. En realizaciones particulares, los ligandos pueden estar en las siguientes proporciones (que pueden determinarse, por ejemplo, mediante RMN (en inglés, NMR) y/o mediante la proporción de entrada durante la síntesis):
45-50 % de alfa-Galactosa / 17-20 por núcleo;
45-50 % de PEG8-COOH / 17-20 por núcleo; y
10-15 % de DM1 / 4,5-6 por núcleo.
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de nanopartículas del primer aspecto de la invención y al menos un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
La composición farmacéutica puede ser una formulación de liberación sostenida, en donde al menos una porción de la pluralidad de nanopartículas están encapsuladas en un polímero biocompatible. La formulación de liberación sostenida puede estar en forma de una micropartícula, una microesfera, una perla o una película.
En algunos casos, la composición farmacéutica del segundo aspecto de la invención está en forma inyectable.
En un tercer aspecto, la presente invención proporciona una nanopartícula del primer aspecto de la invención o una composición farmacéutica del segundo aspecto de la invención para usar en medicina.
En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona una nanopartícula del primer aspecto de la invención o una composición farmacéutica del segundo aspecto de la invención para usar en el tratamiento de un trastorno hepático en un sujeto mamífero.
En algunos casos, el trastorno hepático comprende un cáncer primario o secundario del hígado.
En particular, el cáncer puede ser un carcinoma hepatocelular (HCC).
En determinados casos, el HCC puede estar en estadio C avanzado o estadio B intermedio, de acuerdo con la clasificación de Barcelona (véase, por ejemplo, Llovet et al., 2004, Liver Transplantation, Vol. 10, N.° 2, Supl. 1, págs. S115-S120). En determinados casos, el HCC puede haberse determinado como inadecuado para la resección quirúrgica.
En determinados casos, el cáncer puede seleccionarse de: hepatoblastoma, colangiocarcinoma, cistadenocarcinoma colangiocelular, angiosarcoma, hemangioendotelioma, sarcoma embrionario, fibrosarcoma, leiomiosarcoma y rabdomiosarcoma.
En determinados casos, de acuerdo con el cuarto aspecto, la presente invención, la nanopartícula del primer aspecto de la invención o una composición farmacéutica del segundo aspecto de la invención puede usarse en un método de tratamiento de dicho trastorno hepático (por ejemplo, un cáncer de hígado tal como HCC) en un sujeto mamífero en el que dicha nanopartícula o dicha composición farmacéutica se administra de forma simultánea, secuencialmente o por separado con un segundo agente anticanceroso. En casos particulares, dicho segundo agente anticanceroso puede comprender un inhibidor de quinasa (por ejemplo, inhibidor de la proteína tirosina quinasa), tal como Sorafenib (NEXAVAR (RTM)), Regorafenib (STIVARGA (RTM)) y/o Lenvatinib (LENVIMA (RTM)). En casos particulares, dicho segundo agente anticanceroso puede comprender un anticuerpo monoclonal, tal como un anticuerpo monoclonal antiPD-1 (por ejemplo, Nivolumab (OPDIVO (RTM))), un anticuerpo monoclonal antiCTLA4 (por ejemplo, Ipilumumab (Yervoy (RTM))) y un anticuerpo monoclonal antiPD-Ll (por ejemplo, Atezolizumab (Tecentriq (RTM)), un anticuerpo que se une a CD223, un anticuerpo que se une a TIM-3 o un anticuerpo que se une a OX-40. La terapia de combinación que emplea una nanopartícula de la presente invención o una composición farmacéutica que comprende la nanopartícula junto con (por ejemplo, administración secuencial) un segundo agente anticanceroso, tal como Sorafenib, puede presentar una eficacia clínica superior en comparación con un agente administrado solo. Se contempla que la terapia de combinación pueda comprender la administración intravenosa de una composición farmacéutica que comprende la nanopartícula de la presente invención y la administración oral de un segundo agente anticanceroso, tal como un inhibidor de quinasa, como se ha mencionado anteriormente.
En determinados casos, el método de tratamiento de dicho trastorno hepático (por ejemplo, un cáncer de hígado tal como HCC) en un sujeto mamífero puede comprender administrar dicha nanopartícula o dicha composición farmacéutica junto con una terapia de quimioembolización transarterial (TACE, por sus siglas en inglés).
En un quinto aspecto, la presente invención proporciona un método de tratamiento de un trastorno hepático en un sujeto mamífero, que comprende administrar una nanopartícula del primer aspecto de la invención o una composición farmacéutica del segundo aspecto de la invención al sujeto que necesita terapia.
En algunos casos, el trastorno hepático comprende un cáncer primario o secundario del hígado.
En particular, el cáncer puede ser un carcinoma hepatocelular (HCC).
En determinados casos, el cáncer puede seleccionarse de: hepatoblastoma, colangiocarcinoma, cistadenocarcinoma colangiocelular, angiosarcoma, hemangioendotelioma, sarcoma embrionario, fibrosarcoma, leiomiosarcoma y rabdomiosarcoma.
En determinados casos, de acuerdo con el quinto aspecto la presente invención, el método de tratamiento de dicho trastorno hepático (por ejemplo, un cáncer de hígado tal como HCC) puede comprender administrar dicha nanopartícula o dicha composición farmacéutica de forma simultánea, secuencialmente o por separado con un segundo agente anticanceroso. En casos particulares, dicho segundo agente anticanceroso puede comprender un inhibidor de quinasa (por ejemplo, inhibidor de la proteína tirosina quinasa), tal como Sorafenib (NEXAVAr (RTM)), Regorafenib (STIVa Rg A (Rt M)) y/o Lenvatinib (LENVIMA (RTM)). En casos particulares, dicho segundo agente anticanceroso puede comprender un anticuerpo monoclonal, tal como un anticuerpo monoclonal antiPD-1 (por ejemplo, Nivolumab (OPDIVO (RTM))), un anticuerpo monoclonal antiCTLA4 (por ejemplo, Ipilumumab (Yervoy (RTM))) y un anticuerpo monoclonal antiPD-Ll (por ejemplo, Atezolizumab (Tecentriq (Rt M)), un anticuerpo que se une a CD223, un anticuerpo que se une a TIM-3 o un anticuerpo que se une a OX-40. La terapia de combinación que emplea una nanopartícula de la presente invención o una composición farmacéutica que comprende la nanopartícula junto (por ejemplo, administración secuencial) con un segundo agente anticanceroso, tal como Sorafenib, puede presentar una eficacia clínica superior en comparación con un agente administrado solo. Se contempla que la terapia de combinación pueda comprender la administración intravenosa de una composición farmacéutica que comprende la nanopartícula de la presente invención y la administración oral de un segundo agente anticanceroso, tal como un inhibidor de quinasa, como se ha mencionado anteriormente.
En determinados casos, el método de tratamiento de dicho trastorno hepático (por ejemplo, un cáncer de hígado tal como HCC) en un sujeto mamífero puede comprender administrar dicha nanopartícula o dicha composición farmacéutica junto con una terapia de quimioembolización transarterial (TACE, por sus siglas en inglés).
En un sexto aspecto, la presente invención proporciona el uso de una nanopartícula del primer aspecto de la invención o una composición farmacéutica del segundo aspecto de la invención en la preparación de un medicamento para usar en un método del quinto aspecto de la invención.
En un séptimo aspecto, la presente invención proporciona un artículo de fabricación que comprende:
una nanopartícula del primer aspecto de la invención o una composición farmacéutica del segundo aspecto de la invención;
un envase para alojar la nanopartícula o la composición farmacéutica; y
un inserto o una etiqueta.
En algunos casos el inserto y/o la etiqueta proporcionan instrucciones, información de dosificación y/o administración relacionada con el uso de la nanopartícula o composición farmacéutica en el tratamiento de un trastorno hepático en un sujeto mamífero.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra una representación esquemática y simplificada de la biodistribución para agentes quimioterapéuticos convencionales y nanopartículas dirigidas al hígado.
La Figura 2 muestra una representación esquemática de una nanopartícula de oro funcionalizada con ligandos (de dilución) de carbohidratos, ligandos que contienen un agente de direccionamiento (Ri) y ligandos que contienen agentes quimioterapéuticos (R2). Los grupos etilenglicol y alquilo repetidos se indican mediante los subíndices x e y, respectivamente.
La Figura 3 muestra representaciones esquemáticas de un LacLL-NP sin una carga útil (a) y el correspondiente Pt-LacLL-NP (b) con una carga útil de Pt-succinato.
La Figura 4 muestra los espectros de RMN de 1H de las nanopartículas de la Figura 3 después del grabado con KCN. (a) muestra el espectro de LacLL-NPI después del grabado con KCN. Señales de indicadores: LacLL = 4,09 ppm, AL = 2,81 ppm, GlcC2 = 3,27 ppm; (b) muestra el espectro de Pt-LacLL-NP3 después del grabado con KCN. Señales de indicadores: Pt(IV)-suc = 2,47 ppm, LacLL = 4,08 ppm, AL = 2,79 ppm, GlcC2 = 3,26 ppm.
La Figura 5 muestra imágenes de MET y datos para LacLL-NPI.
La Figura 6 muestra los resultados de ICP-MS para la acumulación de GNP conjugadas con rodamina en diferentes órganos en el cuerpo. De izquierda a derecha, las lecturas del eje x: cerebro, corazón, riñón, hígado, pulmón, páncreas, bazo, tumor, vejiga e intestinos. MBLB-0126-012 es el control, MBLB-126-078 es LacLL-NP2, MBLB-135-042 es LacLL-NPl, MBLB-126-082 es LacSL-NP1 y MBLB-126-084 es LacSL-NP2.
La Figura 7 muestra los resultados del ensayo de viabilidad celular de MTT 72 h después del tratamiento con (a) Pt-LacLL-NP, (b) Pt libre, (c) Doxo-LacLL-NP y (d) doxorrubicina libre.
La Figura 8 muestra el direccionamiento in vitro de GNP a células de HCC medido como recuentos por campo con un aumento de 20x. El panel de la izquierda muestra una carencia de recuentos presentada por el control negativo. El panel y la barra centrales muestran los recuentos para GNP que tienen una corona de ligandos de galactosa-C2 y ligandos de HSPEG8COOH. El panel y la barra de la derecha muestran los recuentos para GNP que tienen una corona de ligandos de galactosa-C2 y ligandos de HSPEG8COOH, en los que una proporción de los ligandos de HSPEG8COOH se ha conjugado con el péptido de unión a glipicano-3, RLNVGGTYFlTt RQ (SEQ ID NO: 1), a través de su extremo N (aproximadamente 4 moléculas de péptidos por nanopartícula). Es evidente inmediatamente que las GNP que tienen el péptido de unión a glipicano-3 presentan un direccionamiento aumentado significativamente a las células de HCC en comparación con las GNP que carecen del péptido de unión a glipicano-3 (aproximadamente un direccionamiento aumentado 7 veces).
La Figura 9 muestra el efecto de diversas construcciones de GNP y del maitansinoide DM4 libre, sobre la viabilidad celular en células HEPG2 tras 72 horas de tratamiento a las concentraciones indicadas. La viabilidad celular medida como control porcentual en un ensayo de MTT se representa gráficamente frente a la concentración (de DM4 cuando está presente) en pg/ml (obsérvese la escala logarítmica del eje x). Las GNP con una corona de ligandos de galactosa-C2 y de HSPEG8COOH (proporción de 40:60) se muestran con cuadrados. Esta GNP, carente de DM4, esencialmente no presenta toxicidad en las condiciones ensayadas. Las GNP con una corona de ligandos de galactosa-C2, HSPEG8COOH y DM4 se muestran con círculos. La curva de dosis-toxicidad se parece mucho a la de DM4 libre mostrada con diamantes. Las GNP con una corona de ligandos de galactosa-C2, HSPEG8COOH y DM4, en donde una proporción de los ligandos de HSPEG8COOH está conjugada con el extremo N del péptido de unión a glipicano-3 RLNVGGTYFLTTRQ (SEQ ID NO: 1) (aproximadamente < 1 péptido por nanopartícula), se muestran con triángulos. La curva de dosis-toxicidad para estas GNP cargadas con DM4 y péptido de unión a glipicano-3 se parece mucho a la del DM4 libre, mostrada con diamantes.
La Figura 10 muestra un gráfico de los resultados de las pruebas de citotoxicidad in vitro en células Hep3B. El eje y muestra la CI50 en nM (escala logarítmica) y las barras a lo largo del eje x muestran los valores ± ETM para cada uno de los fármacos o construcciones (de izquierda a derecha): MTC-100038, DM1, Sorafenib, Regorafenib y Lenvatinib. Una altura de barra más baja indica una mayor potencia citotóxica.
La Figura 11 muestra un gráfico del cambio de peso corporal (%) para los animales por grupo de tratamiento frente al tiempo en días después del inicio del tratamiento. Los animales en este caso fueron un modelo de ratón con un xenoinjerto de HCC humano. Animales tratados por vía intravenosa (i.v.) durante cinco días consecutivos (área sombreada a la izquierda de la línea vertical punteada) en una dosis baja de 0,15 mg/kg de DM1 solo (triángulos invertidos) o una dosis alta de 0,45 mg/kg de DM1 solo (diamantes) o MTC-100038 en dosis de DM1 equivalentes bajas (círculos) y altas (cuadrados). El porcentaje de cambio de peso corporal se calculó basándose en el peso del animal el primer día de dosificación. Los puntos de datos representan el porcentaje de cambio medio del grupo en peso corporal ± ETM. El cambio de peso corporal es positivo en los animales tratados con nanopartículas MTC-100038, pero negativo (dosis baja) o fatal (dosis elevada) en los animales tratados con DM1 libre.
La Figura 12 muestra un gráfico del cambio de peso corporal (%) para los animales por grupo de tratamiento frente al tiempo en días después del inicio del tratamiento. Los animales en este caso eran un modelo de HCC de ratón con un xenoinjerto ortotópico de Hep3B. Se administraron i.v. MTC-100038, DM1 o vehículo a ratones desnudos BALB/c en ciclos de 2 x 5 días (sombreado), al tiempo que se administró Sorafenib por vía oral (v.o.) diariamente durante 21 días (línea discontinua) en una dosis de 60 mg/kg, que fue la dosis más alta tolerada en este modelo. El porcentaje de cambio de peso corporal se calculó basándose en el peso del animal el primer día de dosificación. Los puntos de datos representan el porcentaje de cambio medio del grupo en peso corporal ± ETM. Los grupos de tratamiento fueron: Vehículo (círculos negros), 60 mg/kg de Sorafenib (cuadrados), 0,150 mg/kg de DM1 libre (triángulos), 0,225 mg/kg de MTC-100038 (círculos verdes), 0,338 mg/kg de MTC-100038 (diamantes) y 0,450 mg/kg de MTC-100038 (triángulos invertidos). Se encontró que MTC-100038 fue bien tolerado con cambio de peso corporal positivo para todas las concentraciones de MTC-100038 ensayadas, que estuvo muy por encima del de los otros grupos de tratamiento.
La Figura 13 muestra un gráfico de la concentración de DM1 tumoral (ng/g) para un modelo de ratón NOD/SCID de xenoinjerto de cáncer hepatocelular humano Hep3B subcutáneo. La concentración tumoral de DM1 (media ± ETM) se muestra para animales tratados con MTC-100038 (dosis equivalente de 0,06 mg/kg de DM1) (barras de la izquierda) y animales libres tratados con DM1 libre (también dosis de 0,06 mg/kg) (barras de la derecha). Los puntos temporales son 2 horas (relleno sólido), 24 horas (líneas horizontales) y 48 horas (patrón cuadriculado). Una comparación de la concentración de DM1 a las 2 horas muestra que las nanopartículas de MTC-100038 presentaron una concentración aproximadamente 2 veces mayor (p<0,01) que el tratamiento con DM1 libre, indicando que el suministro de nanopartículas de DM1 que utiliza una construcción de nanopartículas de la presente invención aumentó la captación tumoral de DM1.
La Figura 14 muestra una visión general esquemática de la síntesis de MTC-100038. La nanopartícula de la izquierda tiene un núcleo de oro coronado con ligandos de C2-alfa-galactosa y PEGaCOOH. Las nanopartículas se hacen reaccionar con DM1 en DMSO/H2O para producir las nanopartículas de MTC-100038 cargadas con ligandos de DMA (aproximadamente 5 moléculas de DM1 por núcleo de nanopartícula), C2-alfa-galactosa y PEGaCOOH (nanopartícula derecha).
Descripción detallada de la invención
Al describir la presente invención, se emplearán los siguientes términos y se pretende que se definan como se indica a continuación.
Las características desveladas en la descripción anterior o en las reivindicaciones a continuación o en los dibujos adjuntos, expresadas en sus formas específicas o en términos de un medio para realizar la función desvelada o un método o proceso para obtener los resultados desvelados, según sea apropiado, pueden, por separado o en cualquier combinación de tales características, utilizarse para realizar la invención en diversas formas de la misma.
Aunque la invención se ha descrito en conjunto con las realizaciones de ejemplo descritas anteriormente, muchas modificaciones y variaciones equivalentes serán evidentes para los expertos en la materia cuando reciban la presente divulgación. Por consiguiente, las realizaciones de ejemplo de la invención expuestas anteriormente se consideran ilustrativas y no limitantes. Pueden hacerse diversos cambios en las realizaciones descritas sin apartarse del espíritu y el alcance de la invención.
Para evitar cualquier duda, cualesquier explicaciones teóricas proporcionadas en el presente documento se proporcionan con el fin de mejorar la comprensión del lector. Los inventores no desean quedar ligados a ninguna de estas explicaciones teóricas.
Cualesquier encabezados de sección utilizados en el presente documento tienen fines solamente organizativos y no deben considerarse limitantes de la materia objeto descrita.
En toda la presente memoria descriptiva, incluyendo las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera otra cosa, la palabra "comprenden" e "incluyen" y variaciones como "comprende", "que comprende" y "que incluye" se entenderá que implican la inclusión de un entero o medida o grupo de enteros o de medidas establecidos, pero no la exclusión de ningún otro entero o medida o grupo de enteros o de medidas.
Cabe señalar que, como se usa en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "uno/una" y "el/la" incluyen los referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. En el presente documento los intervalos se pueden expresar como desde "aproximadamente" un valor concreto y/o hasta "aproximadamente" otro valor concreto. Cuando se expresa un intervalo de este tipo, otra realización incluye desde dicho valor particular y/o hasta el otro valor particular. De forma similar, cuando los valores se expresan como aproximaciones, mediante el uso del antecedente "aproximadamente", se entenderá que el valor particular constituye otra realización. El término "aproximadamente" en relación con un valor numérico es opcional y significa, por ejemplo, /-10 %.
Ligandos dirigidos al hígado
El ligando dirigido al hígado se une, se acopla o interactúa con un receptor, marcador, proteína o antígeno presente en o sobre células hepáticas (en algunos casos células hepáticas sanas, en otros casos solo o predominantemente células cancerosas de un tumor hepático, por ejemplo, carcinoma hepatocelular, en todavía otros casos, presentes en o sobre tanto células hepáticas sanas como células cancerosas de un tumor hepático). En la unión o de otra manera, al ser atraído por el hígado (o un tumor del mismo), el ligando dirigido al hígado ayuda con el direccionamiento de la nanopartícula de la invención al sitio de acción prevista. El ligando dirigido al hígado está unido covalentemente al núcleo de la nanopartícula (directamente o más comúnmente a través de un enlazador) y por tanto actúa para provocar que la nanopartícula, incluida su carga útil, se asocie o de otra manera, entre en contacto con el hígado (o un tumor del mismo) con mayor frecuencia, durante más tiempo y/o a una concentración más alta de lo que sería el caso de la nanopartícula en ausencia del ligando dirigido al hígado. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "ligando dirigido al hígado" específicamente incluye no solo ligandos que se dirigen activamente al hígado, sino que también incluye ligandos que se dirigen pasivamente al hígado y/o que ayudan a la captación pasiva por las células hepáticas y/o las células cancerosas del hígado.
Entre los ejemplos de ligandos dirigidos al hígado se incluyen: galactosa (por ejemplo, alfa-galactosa), lactosa, FGF-4 (factor de crecimiento de fibroblastos 4), c-Met (receptor del factor de crecimiento de hepatocitos), un agente de unión a glipicano-3 (por ejemplo, un péptido de unión a glipicano-3), como se describe en el documento US8388937 (que incluye específicamente los péptidos de las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 10 al respecto, que se incorporan como referencia en el presente documento expresamente) o un anticuerpo antiglipicano-3), un agente de unión al receptor de alfa-fetoproteína (AFP) (por ejemplo, un péptido de unión al receptor de AFP, como se divulga en el documento US2012/0270238 o un anticuerpo de receptor antiAFP) y un agente de unión a ASGPR (por ejemplo, galactosa, N-acetilgalactosamina, lactosa, glucosa, manosa o un ligando glicomimético tal como se desvela en Mamidyala et al. , J. Am. Chem. Soc., 2012, Vol. 1334, N.° 4, págs. 1978-1981). El ligando dirigido al hígado puede ser también un anticuerpo o un fragmento del mismo, por ejemplo, un fragmento Fab (fragmento de unión a antígeno), anticuerpo/nanocuerpo de dominio único dirigido a una diana hepática o hepatocito, tal como glipicano-3, ASGPR, FGF-4, c-Met, AFP u otra proteína expresada en el hígado o receptor expresado en el hígado.
Se cree que el receptor de asialoglicoproteína (ASGPR, por sus siglas en inglés) es una diana adecuada para el direccionamiento de nanopartículas que transportan carga útil al hígado. ASGPR reconoce restos de galactosa y se expresa en el hígado y no en otros tejidos humanos. La unión combinada de agentes de direccionamiento (tales como lactosa) y de agentes quimioterapéuticos a una nanopartícula de oro ultrapequeña glicorrevestida (1,6-1,8 nm) proporciona propiedades únicas para el tratamiento del HCC. Después de la administración y la circulación en el cuerpo, las Au-NP (nanopartículas de Au) direccionadas se acumulan en el hígado y ASPGR, sobreexpresando HCC (Figura 1, "direccionamiento" ), si bien un agente quimioterapéutico convencional se distribuye ampliamente (Figura 1, "sin direccionamiento"). Asimismo, las Au-NP pequeñas (<2 nm) muestran un potencial de penetración tumoral aumentado en comparación con las NP mayores (~15nm) y proporcionan una cobertura superficial beneficiosa (Huang, K. et al. , ACS Nano, 2012, Vol. 6, págs. 4483-4493; Kumara, C. et al. , ACS Nano, 2014, Vol. 8, págs. 6431­ 6439). Un esquema de tal nanopartícula de oro funcionalizada se muestra en la Figura 2.
La corona de ligandos presenta metaestabilidad en condiciones fisiológicas debido al enlace Au-azufre, estable en plasma y liberado en el citosol. En este punto, los presentes inventores presentan resultados prometedores de un estudio de selección quimioterapéutica de GNP dirigida utilizando modelos in vitro , ex vivo e in vivo hacia un direccionamiento al hígado eficaz.
Los péptidos de unión a glipicano-3 incluyen RLNVGGTYFLTTRQ (SEQ ID NO: 1), YFLTTRQ (SEQ ID NO: 2) y variantes de los mismos que difieren de dicha secuencia por adición, deleción, sustitución o modificación química (por ejemplo, aminoácidos no naturales o modificados) de no más de 3, no más de 2 o no más de 1 aminoácido. Dichas variantes pueden comprender por ejemplo uno, dos o tres aminoácidos no naturales o modificados. Los aminoácidos no naturales adecuados incluyen, por ejemplo, D-aminoácidos, ornitina, ácido diaminobutírico ornitina, norleucina ornitina, pirilalanina, tienilalanina, naftilalanina, fenilglicina, aminoácidos alfa y alfa-disustituidos, aminoácidos N-alquilo, ácido láctico, derivados de haluros de aminoácidos naturales, tal como trifluorotirosina, p-Cl-fenilalanina, p-Brfenilalanina, pl-fenilalanina, L-alil-glicina, b-alanina, ácido l-a-amino butírico, ácido l-g-amino butírico, ácido l-a-amino isobutírico, ácido l-e-amino caproico, ácido 7-amino heptanoico, L metionina sulfona, L-norleucina, L-norvalina, p-nitro-L-fenilalanina, L-hidroxiprolina, L-tioprolina, derivados metílicos de fenilalanina, tal como 1-metil-Phe, pentametil-Phe, L-Phe (4-amino), L-Tyr(metilo), L-Phe(4-isopropilo), L-Tic (ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico), ácido L-diaminopropiónico y L-Phe(4-bencilo). Los péptidos pueden modificarse adicionalmente. Por ejemplo, uno o más enlaces amida pueden reemplazarse por enlaces éster o alquilo de la cadena principal. Puede haber sustituyentes N o C alquilo, modificaciones o limitaciones de la cadena lateral, tal como puentes de disulfuro, enlaces amida o éster de cadena lateral. Los péptidos variantes pueden incluir tanto péptidos modificados como análogos de péptidos sintéticos. Los péptidos pueden modificarse, por ejemplo, para mejorar las propiedades de solubilidad, formulación y almacenamiento o para proteger enlaces peptídicos lábiles incorporando estructuras no peptídicas.
Se contempla específicamente en el presente documento que el extremo N y/o extremo C de un péptido, tal como un péptido de unión a glipicano-3, puede modificarse mediante acetilación N-terminal y/o amidación C-terminal. En particular, tal(es) modificación(ones) terminal(es) puede(n) ayudar con la unión covalente del péptido dirigido al hígado a la nanopartícula (por ejemplo, a través de un enlazador).
Nanopartículas
Como se utiliza en el presente documento, "nanopartícula" se refiere a una partícula que tiene una escala nanométrica y no pretende expresar ninguna limitación de forma específica. En particular, "nanopartícula" engloba nanoesferas, nanotubos, nanocajas, nanoagrupaciones, nanobastones y similares. En ciertas realizaciones las nanopartículas y/o núcleos de nanopartícula contemplados en el presente documento tienen una geometría generalmente poliédrica o esférica. Las referencias al "diámetro" de una nanopartícula o un núcleo de nanopartícula generalmente se toman como la dimensión más larga de la nanopartícula o del núcleo de la nanopartícula, respectivamente. Para nanopartículas que tienen una geometría sustancialmente poliédrica o esférica, la dimensión más corta a través de la partícula normalmente estará dentro del 50% de la dimensión más larga a través de la partícula y puede estar, por ejemplo, dentro del 25% o el 10%.
Se han descrito nanopartículas que comprenden una pluralidad de ligandos que contienen carbohidratos en, por ejemplo, documento WO 2002/032404, documento WO 2004/108165, documento WO 2005/116226, documento W o 2006/037979, documento WO 2007/015105, documento WO 2007/122388, documento WO 2005/091704 (cuyos contenidos completos se han incorporado como referencia en el presente documento expresamente) y tales nanopartículas pueden encontrar uso de acuerdo con la presente invención.
Como se utiliza en el presente documento, "corona" se refiere a una capa o revestimiento, que puede cubrir parcial o completamente la superficie expuesta del núcleo de nanopartículas. La corona incluye una pluralidad de ligandos unidos covalentemente al núcleo de la nanopartícula. Por tanto, se puede considerar que la corona es una capa orgánica que rodea o que rodea parcialmente el núcleo metálico. En ciertas realizaciones la corona proporciona y/o participa en la pasivación del núcleo de la nanopartícula. Por tanto, en determinados casos, la corona puede incluir una capa de revestimiento suficientemente completa para estabilizar el núcleo de forma sustancial. En determinados casos la corona facilita la solubilidad, tal como la solubilidad en agua, de las nanopartículas de la presente invención.
Las nanopartículas son partículas pequeñas, por ejemplo, agrupaciones de átomos metálicos o semiconductores, que pueden utilizarse como un sustrato para ligandos de inmovilización.
Preferentemente, las nanopartículas tienen núcleos que tienen diámetros medios entre 0,5 y 50 nm, más preferentemente entre 0,5 y 10 nm, más preferentemente entre 0,5 y 5 nm, más preferentemente entre 0,5 nm y 3 nm y todavía más preferentemente entre 0,5 nm y 2,5 nm. Cuando se consideran los ligandos además de los núcleos, preferentemente el diámetro medio global de las partículas está entre 2,0 y 50 nm, más preferentemente entre 3 y
10 nm y más preferentemente entre 4 y 5 nm. El diámetro medio se puede medir usando técnicas bien conocidas en este campo, tales como microscopia electrónica de transmisión.
El material del núcleo puede ser un metal o un semiconductor y puede estar formado por más de un tipo de átomo.
Preferentemente, el material del núcleo es un metal seleccionado de Au, Fe o Cu. Los núcleos de nanopartículas también pueden formarse a partir de aleaciones que incluyen Au/Fe, Au/Cu, Au/Gd, Au/Fe/Cu, Au/Fe/Gd y Au/Fe/Cu/Gd y pueden utilizarse en la presente invención. Los materiales de núcleo preferidos son Au y Fe, siendo el
Au el material más preferido. Los núcleos de las nanopartículas preferentemente comprenden entre aproximadamente
100 y 500 átomos (por ejemplo, átomos de oro) para proporcionar diámetros nucleares en el intervalo de nanómetros.
Otros materiales de núcleo particularmente útiles están dopados con uno o más átomos que son activos en RMN, permitiendo que las nanopartículas se detecten utilizando RMN, tanto in vitro como in vivo. Entre los ejemplos de átomos activos de RMN se incluyen Mn+2, Gd+3, Eu+2, Cu+2, V+2, Co+2, Ni+2, Fe+2, Fe+3 y lantánidos+ cuánticos.
Los núcleos de nanopartículas que comprenden compuestos semiconductores pueden detectarse, dado que los cristales semiconductores de escala nanométrica son capaces de actuar como puntos cuánticos, es decir, pueden absorber luz, excitando de este modo los electrones en los materiales a mayores niveles de energía, liberando posteriormente fotones de luz a frecuencias características del material. Un ejemplo de material de núcleo semiconductor es seleniuro de cadmio, sulfuro de cadmio, telurio de cadmio. También se incluyen los compuestos de zinc tales como el sulfuro de zinc.
En algunas realizaciones, la nanopartícula o su ligando comprende un marcador detectable. El marcador puede ser un elemento del núcleo de la nanopartícula o del ligando. El marcador puede ser detectable debido a una propiedad intrínseca de ese elemento de la nanopartícula o por estar unido, conjugado o asociado con un resto adicional que es detectable. Los ejemplos preferidos de marcadores incluyen un marcador que es un grupo fluorescente, un radionúclido, un marcador magnético o un colorante. Los grupos fluorescentes incluyen fluoresceína, rodaminas o tetrametil rodamina, rojo Texas, Cy3, Cy5, etc. y pueden detectarse mediante la excitación del marcador fluorescente y la detección de la luz emitida utilizando espectroscopía de dispersión de Raman (Y.C. Cao, R. Jin, C. A. Mirkin, Science 2002, 297: 1536-1539).
En algunas realizaciones, las nanopartículas pueden comprender un radionúclido para usar en la detección de la nanopartícula utilizando la radiactividad emitida por el radionúclido, por ejemplo, utilizando PET, SPECT o para terapia, es decir, para eliminar células diana. Los ejemplos de radionucleidos comúnmente utilizados en la técnica que podrían adaptarse fácilmente para usar en la presente invención incluyen 99mTc, que existe en varios estados de oxidación aunque el más estable es TcO4-; 32P o 33P; 57Co; 59Fe; 67CU que a menudo se utiliza como sales de Cu2+; 67Ga que se utiliza comúnmente como una sal de Ga3+, por ejemplo, citrato de galio; 68Ge; 82Sr; 99Mo; 103Pd; 111In que se utiliza generalmente como sales de In3+; 125I o131I que se utiliza generalmente como yoduro de sodio; 137Cs; 153Gd; 153Sm; 158Au; 186Re; 201Tl utilizado generalmente como una sal de Tl+, tal como cloruro de talio; 39Y3+; 71Lu3+; y 24Cr2+. El uso general de radionúclidos como marcadores e indicadores es bien conocido en la técnica y se podría adaptar fácilmente por el experto en la materia para su uso en los aspectos de la presente invención. Los radionúclidos pueden emplearse más fácilmente dopando los núcleos de las nanopartículas o incluyéndolos como marcadores presentes como parte de ligandos inmovilizados en las nanopartículas.
Activos
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "agente biológicamente activo" o "agente bioactivo" pretende abarcar fármacos y profármacos que ejercen un efecto sobre un sistema biológico, preferentemente un efecto terapéutico. Las clases de agentes activos desvelados en el presente documento incluyen agentes quimioterapéuticos, por ejemplo, un maitansinoide (por ejemplo, maitansinoide DM4), doxorrubicina, temozolomida, irinotecán, carmustina, platino (IV), platino (II), camptotecina, docetaxel, sorafenib, maitansina, monometil auristatina E (MMAE) y un inhibidor de histona desacetilasa (HDAC)).
También se desvelan como ligandos de carga útil:
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y
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(Maitansinoide DM4) En la presente invención, el ligando de carga útil es Maitansinoide DM1.
Administración y tratamiento
Las nanopartículas y composiciones de la invención pueden administrarse a los pacientes por diferentes vías, incluyendo las vías enteral o parenteral. La administración parenteral incluye la administración por las siguientes vías: intravenosa, cutánea o subcutánea, nasal, intramuscular, intraocular, transepitelial, intraperitoneal y tópica (incluyendo dérmica, ocular, rectal, nasal, inhalación y aerosol) y vías sistémicas rectales.
La administración puede realizarse por ejemplo, por inyección, incluyendo la inyección de depósito.
Las nanopartículas de la invención pueden formularse como composiciones farmacéuticas que pueden estar en forma de composiciones sólidas o líquidas. Tales composiciones generalmente comprenderán un vehículo de algún tipo, por ejemplo, un vehículo sólido o un vehículo líquido tal como agua, petróleo, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintético. Pueden incluirse solución salina fisiológica o glicoles, tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol. Tales composiciones y preparaciones generalmente contienen al menos un 0,1 % en peso del compuesto.
Para la inyección intravenosa, cutánea o subcutánea o la inyección en el sitio de la afección, el principio activo estará en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable o líquido sin pirógenos y que tiene un pH, una isotonicidad y una estabilidad adecuados. Los expertos pertinentes en la materia serán bien capaces de preparar soluciones adecuadas usando, por ejemplo, soluciones de los compuestos o un derivado de los mismos, por ejemplo, en solución fisiológica, una dispersión preparada con glicerol, polietilenglicol líquido o aceites.
Además de uno o más de los compuestos, opcionalmente junto con otros ingredientes activos, las composiciones pueden comprender uno o más de un excipiente farmacéuticamente aceptable, vehículo, tampón, estabilizante, agente isotonizante, conservante o antioxidante u otros materiales bien conocidos por los expertos en la materia. Dichos materiales no deben ser tóxicos y no deben interferir con la eficacia del principio activo. La naturaleza precisa del vehículo u otro material puede depender de la vía de administración, por ejemplo, inyección intravenosa.
Preferentemente, las composiciones farmacéuticas se dan a un individuo en una cantidad profilácticamente eficaz o una cantidad terapéuticamente eficaz (según sea el caso, aunque la profilaxis puede considerarse terapia), que es suficiente para mostrar un beneficio al individuo. Normalmente, esto será para provocar una actividad terapéuticamente útil que proporcione beneficio al individuo. La cantidad real de los compuestos administrados y la tasa y la evolución temporal de la administración, dependerá de la naturaleza y la gravedad de la afección que se trate. La prescripción del tratamiento, por ejemplo, las decisiones sobre la dosificación, etc., son responsabilidad de los médicos de cabecera y otros facultativos y normalmente se tiene en cuenta el trastorno que ha de tratarse, la afección del paciente individual, el sitio de administración, el método de administración y otros factores conocidos por los facultativos. Pueden encontrarse ejemplos de las técnicas y protocolos mencionados anteriormente en Handbook of Pharmaceutical Additives, 2a edición (eds. M. Ash e I. Ash), 2001 (Synapse Information Resources, Inc., Endicott, Nueva York, Estados Unidos); Remington's Pharmaceutical Sciences, 20a edición, 2000, pub. Lippincott, Williams and Wilkins; y Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2a edición, 1994. A modo de ejemplo, las composiciones se administran preferiblemente a pacientes en dosificaciones de entre aproximadamente 0,01 y 100 mg de compuesto activo por kg de peso corporal y más preferentemente entre aproximadamente 0,5 y 10 mg/kg de peso corporal. Un beneficio del direccionamiento al hígado de las nanopartículas de la presente invención es que una dosis terapéuticamente eficaz de la "carga útil" activa puede ser menor en comparación con la dosis eficaz del mismo activo cuando se administra como un fármaco libre, por ejemplo, mediante administración sistemática.
Lo siguiente se presenta a modo de ejemplo y no debe interpretarse como una limitación del alcance de las reivindicaciones.
Ejemplos
Síntesis de ligandos y enlazadores ilustrativos
Ligando enlazador largo de lactosa
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También denominado Lac-O-EG6-Cn-SH y LacLL, este resto de ligando+enlazador tiene el nombre de la IUPAC (w-11 -tioundecil)-hexaetilengMcolil p-D-lactósido. Puede sintetizarse de acuerdo con A. G. Barrientos, J. M. de la Fuente, T. C. Rojas, A. Fernandez, S. Penadés, Chem. Eur. J. 2003, 9, 1909 - 1921.
Enlazador corto de glucosa (ligando de dilución)
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También denominado Glc-C2-SH, GlcSL, GlcC2, este ligando tiene el nombre de la IUPAC de tioetil p-D-glucopiranósido. Puede sintetizarse de acuerdo con la patente WO 2006/037979 A2 de Midatech y R. Ojeda, J. L. de Paz, A. G. Barrientos, M. Martin-Lomas, S. Penadés, Carbohydr. Res. 2007, 342, 448-459.
Enlazador de amino
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A menudo denominado el enlazador de amino, este enlazador se abrevia también AL y NH2-EG6-SH. Su nombre de IUPAC es a-amino-w-tiohexaetilenglicol. Puede sintetizarse y aislarse como el correspondiente disulfuro de hexaetilenglicol de la siguiente manera:
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Se describen los siguientes procedimientos representativos. Se disolvió hexaetilenglicol (90,0 g, 318,8 mmol) en diclorometano (1 l) y se añadieron trimetilamina (177 ml, 1275 mmol) y DMAP (1,94 g, 15,9 mmol). La mezcla se enfrió a 4 °C y se añadió en porciones cloruro de tosilo (181,8 g, 956,3 mmol) durante 30 minutos. Después de 10 minutos a aproximadamente 5 °C, la reacción se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó durante 3 horas, a continuación, se vertió en una solución de etilendiamina en diclorometano (23,0 ml 344,4 mmol en 630 ml). La capa orgánica se lavó (HCl, 630 ml, 5 %; NaHCO3 , 5 %; salmuera, cada 630 ml), se secó sobre Na2SO4 y se concentró al vacío para dar 217,69 g de producto que se usó sin purificación adicional.
Este producto se disolvió en dimetilformamida (1,4 l) y se añadió azida sódica (24,9 g, 382,5 mmol). La reacción se agitó en argón a temperatura ambiente durante 18 h, a continuación, se vertió en salmuera (1300 ml) y se extrajo con acetato de etilo (2 x 630 ml). Los extractos se secaron (Na2SO4), se concentraron al vacío y se purificaron (cromatografía, SiO2, acetona al 15^40 %/hexanos) para proporcionar 62,67 g (42 %) de azida de tosilo.
Esta azida de tosilo se disolvió en acetona (630 ml) y se añadió tioacetato de potasio (20,2 g, 176,5 g). Después de 19 h, la mezcla de reacción se vertió en salmuera (1,2 l) y se extrajo con acetato de etilo (3 x 600 ml). Los extractos se secaron (Na2SO4), se concentraron y se purificaron (cromatografía, SO 2, 0 ^ 4 % de metanol/diclorometano) para proporcionar 46,1 g de azida de tioacetilo (93 %).
Esta azida de tioacetilo se disolvió en metanol (1,1 l) y se añadió en porciones metóxido de sodio (68,1 g, 1261,5 mmol). La reacción se agitó (al aire libre) durante 5 días, a continuación, se diluyó con agua (700 ml) y se extrajo con diclorometano (2 x 700 ml). Los extractos se secaron (Na2SO4), se concentraron y se purificaron (cromatografía, SO 2, acetona al 40 %/hexanos) para proporcionar 22,3 g de disulfuro (55 %).
Este disulfuro se disolvió en tetrahidrofurano (225 ml) y se añadieron agua (70 ml) y trifenilfosfina (18,6 g, 71,0 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente en argón durante 16 h, a continuación, se diluyó con agua (50 ml) y se lavó con acetato de etilo (3 x 100 ml). La solución acuosa resultante se concentró al vacío para proporcionar 11,3 g de enlazador amino.
Ejemplo 1 - Síntesis de nanopartículas de oro de enlazador largo de lactosa dirigida al hígado (no de acuerdo con la invención)
La preparación y caracterización de nanopartículas de oro cargadas con una molécula dirigida al hígado, un enlazador de unión y un diluyente de carbohidratos unidos a la superficie de oro, se describen más adelante.
Se utilizaron los ligandos LacLL, AL y GlcC2. Se eligió un glicósido de hexaetilen glicolil undecanil lactosa como resto dirigido al hígado, al tiempo que se utilizó un glucósido C2 más corto como resto diluyente. Para la unión de cargas útiles quimioterapéuticas u otras moléculas terapéuticas o de diagnóstico similares a fármacos, colorantes fluorescentes y radio indicador, se utilizó un hexaetilenglicol funcionalizado con amino. El acoplamiento al núcleo de oro se obtuvo mediante un enlace de oro azufre.
Se sintetizaron nanopartículas de oro con diferentes proporciones de la molécula dirigida al hígado LacLL: LacLL-NP1 (LacLL: AL : GlcC2 - 9 : 50 : 41) y LacLL-NP2 (LacLL : AL : GlcC2 - 27 : 50 : 23).
Para la preparación de las nanopartículas los ligandos LacLL, AL y GlcC2 se disolvieron en metanol en las proporciones deseadas y se añadieron a una solución de HAuCU en agua. La sal de oro se redujo en presencia de tioles/disulfuros en agrupaciones de oro (0) con una corona de ligandos. Después de la purificación por filtración centrífuga repetida y dilución final al volumen deseado, se obtuvieron nanopartículas como soluciones acuosas (Figura 3A). La proporción de ligandos sobre la nanopartícula se confirmó mediante RMN de 1H. Por tanto, se trató una alícuota de la solución de nanopartículas con 0,3 m de KCN y 0,1 m de KOH en agua deuterada después del intercambio de disolvente en D2O. Después de grabar el núcleo de oro, se adquirieron los espectros de los ligandos libres y se determinó la proporción de ligandos mediante la integración de señales de indicadores que indican que la proporción original se mantuvo en las nanopartículas después de la reacción en el intervalo de error (Figura 4A). Los diámetros medios de estas construcciones, determinados mediante microscopía electrónica de transmisión (MET), fueron 2,06 nm y 1,98 nm para LacLL-NP1 y LacLL-NP2 (la Figura 5 muestra la MET de LacLL-NP1).
Sección experimental
LAcLL, AL y GlcC2 se sintetizaron de acuerdo con las referencias. HAuCU, NaBH4, KCN, KOH y metanol se adquirieron de Sigma Aldrich. Todos los reactivos se usaron sin purificación adicional. El agua MilliQ (18,2 mQ) se obtuvo del sistema de purificación de agua Simplicity (Merck Millipore). Las nanopartículas se caracterizaron mediante RMN de 1H después del grabado de KCN/KOH, DLS, MET y potencial zeta. La concentración de oro de la solución de nanopartículas se determinó mediante ICP-MS o MPAES.
Para la preparación de la muestra de RMN, se concentró 1 ml de solución de las nanopartículas y se lavó (3 x 2 ml de D2O) mediante filtración centrífuga (Amicon, 10 kDa, 4 ml). La solución de NP residual (~ 200 pl) se incubó con una solución de 0,3 m de KCN/0,1 m de KOH en D2O (~ 400 pl) durante 30 minutos a 50 °C. La mezcla se centrifugó brevemente y el sobrenadante se transfirió a un tubo de RMN. Los espectros de RMN de 1H se registraron en un espectrómetro de RMN Bruker AVANCE III 500. Los desplazamientos químicos se calibraron con el correspondiente disolvente (D2O = 4,79 ppm).
a) LacLL-NP1 (LacLL : AL : GlcC2 - 9: 50: 41)
Se añadieron soluciones metanólicas de LacLL (0,0410 mmol; 32,5 mg; 1,41 ml), GlcC2 (0,185 mmol; 44,5 mg; 1,58 ml) y AL (0,228 mmol; 67,7 mg; 2,40 ml) a un matraz de fondo redondo de 100 ml y se diluyeron con metanol (32,4 ml) para obtener una concentración de 0,012 M de solución de ligandos. A continuación, se añadió solución de HAuCl4 (60,0 mg; 0,152 mmol; 1 eq) en agua (6,09 ml). La mezcla de reacción se redujo con solución de NaBH4 (126 mg; 3,34 mmol; 22 eq) en agua (3,33 ml) con agitación vorticial. La solución resultante de nanopartículas de color negro se agitó a temperatura ambiente durante 35 minutos en un agitador orbital. Con el tiempo, las nanopartículas precipitaron. Después de finalizar la reacción, las nanopartículas restantes en solución se movieron hacia abajo por centrifugaron (1 min a 4500 rpm) y el precipitado se volvió a disolver en 4 ml de agua MilliQ. La suspensión acuosa de NP se transfirió a un filtro AMICON previamente lavado (4 ml, 10 kDa). Después de la concentración, las nanopartículas se lavaron cuatro veces con agua MilliQ (3-4 ml) mediante filtración centrífuga. Finalmente las nanopartículas se recogieron en un volumen final de 6 ml de agua MilliQ. Las nanopartículas se caracterizaron mediante RMN de 1H después del grabado de KCN/KOH, DLS, MET y potencial zeta. La concentración de oro de la solución de nanopartículas se determinó mediante ICP-MS. MET: diámetro medio 2,06 nm.
b) LacLL-NP2 (LacLL : AL : GlcC2 - 27: 50: 23)
Se añadieron soluciones metanólicas de LacLL (0,0870 mmol; 69,8 mg; 3,55 ml), GlcC2 (0,0710 mmol; 17,0 mg; 1,67 ml) y AL (0,159 mmol; 47,2 mg; 1,96 ml) a un matraz de fondo redondo de 100 ml y se diluyeron con metanol (19,3 ml) para obtener una concentración de 0,012 M de solución de ligandos. A continuación, se añadió solución de HAuCl4 (40,0 mg; 0,102 mmol; 1 eq) en agua (4,24 ml). La mezcla de reacción se redujo con NaBH4 (84,8 mg; 2,24 mmol; 22 eq) en agua (2,33 ml) con agitación vorticial. La solución resultante de nanopartículas de color negro se agitó a temperatura ambiente durante 35 minutos en un agitador orbital. Con el tiempo, las nanopartículas precipitaron. Después de finalizar la reacción, las nanopartículas restantes en solución se movieron hacia abajo por centrifugaron (1 min a 4500 rpm) y el precipitado se volvió a disolver en 4 ml de agua MilliQ. La suspensión acuosa de NP se transfirió a un filtro AMICON previamente lavado (4 ml, 10 kDa). Después de la concentración, las nanopartículas se lavaron cuatro veces con agua MilliQ (3-4 ml) mediante filtración centrífuga. Finalmente las nanopartículas se recogieron en un volumen final de 4 ml de agua MilliQ. Las nanopartículas se caracterizaron mediante RMN de 1H después del grabado de KCN/KOH, DLS, MET y potencial zeta. La concentración de oro de la solución de nanopartículas se determinó mediante ICP-MS. MET: diámetro medio 1,98 nm.
Ejemplo 2 - Funcionalización de nanopartículas de oro de enlazador largo de lactosa dirigida al hígado (no de acuerdo con la invención)
La funcionalización del enlazador de unión y la caracterización de nanopartículas de oro dirigidas al hígado equipadas con agentes quimioterapéuticos y un colorante fluorescente se describen más adelante.
Para la funcionalización de las nanopartículas dirigidas al hígado se eligieron dos agentes antineoplásicos como agentes quimioterapéuticos: succinato de platino (IV) (Pt(IV)-suc) y doxorrubicina. Ambos agentes quimioterapéuticos se acoplaron al enlazador de unión a través de la formación de unión a amida promovida por EDC*HCl / NHS. En el caso de Pt(IV)-suc, la reacción se realizó en DMSO, porque el compuesto no resultó soluble en sistemas acuosos. Por tanto, la solución de nanopartículas se intercambió a DMSO a través de liofilización o concentración centrífuga y dilución posterior. A continuación, el succinato preactivado de EDC*HCl / NHS se dejó reaccionar con las nanopartículas durante la noche. Los lavados finales para eliminar los reactivos restantes proporcionaron una solución acuosa de nanopartículas de oro dirigidas al hígado con cargas útiles de agentes quimioterapéuticos basados en platino (Figure 3B). La proporción de Pt/Au se determinó mediante MPAES en 1/15. La unión covalente del fármaco a la nanopartícula se demostró mediante RMN de 1H de la construcción final después del grabado (Figure 4B). La señal original del grupo amino metileno con un desplazamiento químico de 2,81 ppm desaparece virtualmente, al tiempo que puede observarse en el espectro un nuevo multiplete del grupo succínico etileno a 2,47 ppm. Las integrales de las señales de indicadores no cambiaron, indicando una estabilidad de corona durante las manipulaciones en las nanopartículas.
Para el acoplamiento de doxorrubicina se aplicó una estrategia de unión inversa. Primero, la función amino se convirtió a un resto carboxílico mediante la reacción de la LacLL-NP con anhídrido succínico. A continuación, el ácido carboxílico se dejó reaccionar con EDC*HCl / NHS en DMSO. Después del intercambio de disolvente, la solución de nanopartículas preactivadas se incubó con una solución de doxorrubicina en tampón HEPES. Después de una purificación mediante filtración centrífuga y una dilución final en tampón MES, se obtuvo una nanopartícula dirigida al hígado cargada útil con doxorrubicina. La concentración de oro y doxorrubicina se determinó mediante un ensayo colorimétrico.
El colorante fluorescente cloruro de ácido de sulfo-rodamina B se utilizó como una imitación de diagnóstico. El acoplamiento se realizó mediante una unión de sulfonamida del resto de cloruro de sulfonilo del cloruro de ácido de sulfo-rodamina B con función amino del enlazador de unión en la nanopartícula de oro dirigida al hígado. La reacción se realizó en tampón de carbonato a pH 9,3 para obtener partículas marcadas.
Los tres experimentos mostraron flexibilidad química para la funcionalización de nanopartículas de oro dirigidas al hígado.
Sección experimental
El cloruro de ácido de sulfo-rodamina B (Sulfo-rhodamine B acid chloride), EDC*HCl, NHS y DMSO se adquirieron de Sigma-Aldrich. Pt(IV)-succinato se adquirió de Charnwood Molecular. La doxorrubicina se adquirió de LC Labs. Todos los reactivos se usaron sin purificación adicional. El agua MilliQ (18,2 mQ) se obtuvo del sistema de purificación de agua Simplicity (Merck Millipore). Las nanopartículas se caracterizaron mediante RMN de 1H después del grabado de KCN/KOH, d Ls , MET y potencial zeta. La concentración de oro de la solución de nanopartículas se determinó mediante ICP-MS o MpA e S.
Para la preparación de la muestra de RMN, se concentró 1 ml de solución de las nanopartículas y se lavó (3 x 2 ml de D2O) mediante filtración centrífuga (Amicon, 10 kDa, 4 ml). La solución de NP residual (~ 200 pl) se incubó con una solución de 0,3 m de KCN/0,1 m de KOH en D2O (~ 400 pl) durante 30 minutos a 50 °C. La mezcla se centrifugó brevemente y el sobrenadante se transfirió a un tubo de RMN. Los espectros de RMN de 1H se registraron en un espectrómetro de RMN Bruker AVANCE III 500. Los desplazamientos químicos se calibraron con el correspondiente disolvente (D2O = 4,79 ppm).
a) Pt-LacLL-NP3
Se concentraron 5 ml de solución acuosa de nanopartículas LacLL-NP1 (baja concentración de ligando dirigido) (21,4 pmol AL reactivo) mediante centrifugación (2 x 15 minutos a 4500 rpm) en un filtro Amicon (4 ml, 10 kDa) y se diluyeron en un volumen de 2,5 ml con DMSO. Antes de la adición a una solución de Pt(IV)-succinato (22,9 mg, 52,9 pmol) en DMSO (528 pl, 0,1 m), una solución de EDC*HCL (12,2 mg, 63,4 pmol) en DMSO (127 pl, 0,5 m) y de NHS (7,29 mg, 63,4 pmol) en DMSO (63,4 pl, 1,0 m) se mezclaron y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de 30 minutos de preactivación, la mezcla de reacción se añadió a la solución de nanopartículas y la mezcla se agitó en un agitador orbital a temperatura ambiente durante la noche. La solución de reacción se diluyó con 25 ml de agua MilliQ y se concentró y lavó repetidamente con agua MilliQ. El residuo de color negro se recogió en 5,00 ml de agua MilliQ. Las nanopartículas se caracterizaron mediante RMN de 1H después del grabado de KCN/KOH, DLS, MET y potencial zeta. La concentración de oro y platino de la solución de nanopartículas se determinó mediante ICP-MS. [Au], MPAES: 2,84 mg/ml; [Pt], MPAES: 0,19 mg/ml.
b) Doxo-LacLL-NP4
Succinación de la función de amino en LacLL-NP: Se concentraron 8,0 ml de solución acuosa de nanopartículas LacLL-NP1 (baja concentración de ligando dirigido) (33,8 pmol AL reactivo) mediante centrifugación (15 minutos a 4500 rpm) en un filtro Amicon (15 ml, 10 kDa) y se diluyeron en un volumen de 8,0 ml con DMSO. Se disolvió anhídrido succínico (16,9 mg, 169 pmol) en DMSO (564 pl) para obtener una solución 0,5 m y se añadió a la solución de nanopartículas. La mezcla de reacción se agitó en un agitador orbital a temperatura ambiente durante la noche. La solución de reacción se diluyó con 25 ml de agua MilliQ y se concentró y lavó repetidamente con agua MilliQ. El residuo de color negro se recogió en 5,00 ml de agua MilliQ. Las nanopartículas se caracterizaron mediante RMN de 1H después del grabado de KCN/KOH, DLS, MET y potencial zeta. La concentración de oro y platino de la solución de nanopartículas se determinó mediante ICP-MS.
Unión de doxorrubicina al enlazador de unión succinado de LacLL-NP: Se concentraron 3,0 ml de solución acuosa de nanopartículas LacLL-NP (10,0 pmol AL succinado reactivo) mediante centrifugación (15 minutos a 4500 rpm) en un filtro Amicon (4 ml, 10 kDa) y se diluyeron en un volumen de 3,0 ml con DMSO. Se añadió una solución de EDC*HCL (4,82 mg, 25,1 pmol) y (5,75 mg, 50,0 pmol) en DMSO (416 pl) que se incubó durante 15 minutos a la solución de nanopartículas y la mezcla se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente en un agitador orbital. La solución de nanopartículas se diluyó con agua (80 ml), se filtró por centrifugación, se diluyó con tampón HEPES (pH 7,8, 25,0 ml) y se añadió inmediatamente una solución de doxorrubicina (2,50 ml, 2,00 mg/ml en HEPES 20 mM). La reacción de acoplamiento se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Las nanopartículas acopladas con DOX se purificaron con agua MilliQ mediante filtración centrífuga (Amicon, 15 ml, 10 kDa). La solución residual se recogió en tampón MES (3,0 ml). Las nanopartículas se caracterizaron mediante RMN de 1H después del grabado de KCN/KOH, DLS, MET y potencial zeta. La concentración de oro de la solución de nanopartículas se determinó mediante ICP-MS. [Au], colorimétrico: 1,05 mg/ml; [Doxo], colorimétrico: 0,66 mg/ml.
c) sRhoB-LacLL-NP5
Se concentraron 3 ml de solución acuosa de nanopartículas LacLL-NP1 (0,609 pmol nanopartícula) (concentración baja de ligando dirigido) mediante filtración centrífuga (AMICON, 4 ml, 10 kDa) y se lavaron una vez con tampón Na2CO3 / NaHCO3 (0,1 M, pH 9,3). La solución residual se disolvió en 1,5 ml del tampón. Se añadió a la solución de NP una solución de cloruro de ácido de sulfo-rodamina B en DMF (133 jl, 9,14 |jmol, 5,27 mg) y la mezcla se agitó en un agitador orbital a temperatura ambiente durante la noche protegida de la luz del día. La mezcla de reacción se transfirió a un filtro AMICOn previamente lavado (4 ml, 10 kDa). La solución de nanopartículas se centrifugó y se lavó repetidamente tres veces con tampón Na2CO3 / NaHCO3 (0,1 M, pH 9,3) y repetidamente con agua Milli-Q hasta que el filtrado apareció incoloro. Finalmente, las nanopartículas se recogieron en 3 ml de agua Milli-Q. Las nanopartículas se caracterizaron mediante RMN de 1H después del grabado de KCN/KOH, DLS, MET y potencial zeta. La concentración de oro de la solución de nanopartículas se determinó mediante ICP-MS.
Ejemplo 3 - Direccionamiento al hígado de nanopartículas demostrado in vivo (no de acuerdo con la invención)
Las propiedades dirigida al hígado de las nanopartículas de oro de enlazador largo de lactosa podrían demostrarse mediante la comparación de diferentes construcciones de nanopartículas en un estudio de biodistribución in vivo. Se inyectaron dos nanopartículas de enlazador largo de lactosa con un contenido alto y bajo de la molécula dirigida al hígado (LacLL-NP1 (bajo) LAcLL-NP2 (alto)), dos nanopartículas de enlazador corto de lactosa similares (LacSL-NP1 (bajo) LacSL-NP2 (alto)) (la lactosa está unida a un enlazador C2) y una nanopartícula sin direccionamiento (Glc-NP), respectivamente, por vía intravenosa a ratones.
Después de un tiempo de circulación de 90 minutos, los animales se sacrificaron, se recogieron los órganos principales y se analizaron mediante ICP-MS para determinar la concentración de oro en los órganos. La representación gráfica de estos datos proporcionó un mapa de biodistribución para las diferentes construcciones (Figura 6). Como se esperaba, las construcciones de direccionamiento al hígado se encontraron principalmente en el hígado, si bien la nanopartícula sin direccionamiento se acumuló en los riñones. Se observó que la longitud del enlazador de la molécula dirigida al hígado influye en la captación hepática de la nanopartícula de oro. Para la versión de enlazador corto, un 42-46% de la cantidad de oro total encontrada estaba presente en el hígado. Por el contrario, para las construcciones de enlazador largo, casi todo el oro se detectó en el hígado (hasta un 91%).
Este experimento demuestra que las cargas útiles adecuadas pueden ser altamente eficaces dirigidas al hígado utilizando nanopartículas de oro de enlazador largo de lactosa dirigida al hígado.
Sección experimental
Líneas celulares y transfección
Las células de la línea celular de hepatocarcinoma, HepG2, se cultivaron en DMEM (Sigma Aldrich) suplementado con FCS al 10% (Gibco) a 37 °C, aire al 95 % y CO2 al 5 %, en placas Petri de 10 cm (b D), se lavaron con PBS 1X (Sigma Aldrich) y se pasaron tras el tratamiento con tripsina-EDTA al 0,05% (Gibco). Las células viables se contaron en un hemocitómetro en un ensayo de exclusión con azul tripán. Las células HepG2 se ensayaron regularmente para detectar micoplasma, utilizando un conjunto de cebadores comunes a todos los miembros del género Mycoplasma (Choppa et al., 1998). Las células se sembraron a una densidad de 2-3 104 células/cm2 en una placa de 6 pocillos y posteriormente se transfectaron con proporciones molares de 1:3 y 1:5 del vector pEGFP-Luc (Clontech) y PEI25 (Sigma-Aldrich). Tras la transfección, las células se seleccionaron añadiendo 800 jg / j l de G418 al medio de cultivo durante cuarenta y ocho horas. Posteriormente, las células se mantuvieron en medio fresco y se cultivaron hasta la confluencia. Con el fin de evaluar la señal de bioluminiscencia in vitro se realizó un ensayo de luciferasa simple con la ayuda de un lector de placas multimodal Mithras añadiendo D-Luciferasa a los lisados celulares en tampón CCLR (Tris-HCl 25 mM pH 7,8, DTT 2 mM, EGTA 2 mM, glicerol al 10 %, Triton X-100 al 1 %).
Alojamiento de los animales
Se adquirieron setenta ratones desnudos hembra BALB/c (6 semanas de edad) de un proveedor autorizado (Janvier Labs). Todos los ratones se alojaron en cabinas de flujo laminar en condiciones específicas sin patógenos a temperatura ambiente con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y se alimentaron con microgránulos y agua ad libitum. El Experimental Animal Committee de la USC aprobó el estudio con animales; por consiguiente, todos los experimentos con animales cumplen con las directrices de bienestar animal (Animal Welfare).
Xenoinjertos y obtención de imágenes de fluorescencia del infrarrojo cercano in vivo
Se inyectó por vía subcutánea la fase de crecimiento logarítmico de células HepG2 (105 células en 0,1 ml de PBS) en el flanco izquierdo de ratones desnudos atímicos (n=6 en cada grupo experimental) para establecer el modelo de ratones portadores de tumores. La implantación tumoral se examinó periódicamente mediante inspección visual y finalmente se confirmó mediante el registro de la señal bioluminiscente en un IVIS Spectrum (Caliper LifeSciences). Se administró D-Luciferina (150 mg/kg) con el fin de colocalizar la bioluminiscencia en las células tumorales con las NP fluorescentes. Los ratones portadores de tumores se dividieron en 5 grupos (incluido el grupo de control), seis ratones cada uno. El volumen tumoral se calculó mediante la fórmula: [(longitud2 x anchura)/2] (Soengas et al., 1999). Una vez que los tumores alcanzaron un volumen de 400 mm3, se administraron nanopartículas i.v.
Se adquirieron imágenes de fluorescencia in vivo utilizando un IVIS Spectrum (Caliper LifeSciences) para la detección de las GNP conjugadas con rodamina a los 0 min, 45 min y 90 min después de la inyección. Los ratones se anestesiaron utilizando isoflurano durante la adquisición de imágenes y tras la adquisición de imágenes de fluorescencia/bioluminiscencia, se sacrificaron (90 min después de la inyección) y sus órganos (cerebro, pulmones, corazón, hígado, bazo, páncreas, intestino, vejiga y riñones) y el tumor se recogieron para el análisis de ICP-MS posterior.
Resultados de ICP-MS
Figure imgf000018_0001
Ejemplo 4 - Citotoxicidad in vitro con nanopartículas de oro de enlazador largo de lactosa dirigida al hígado que portan una carga útil quimioterapéutica (no de acuerdo con la invención)
Se ensayó la citotoxicidad de nanopartículas de oro de enlazador largo de lactosa dirigida al hígado cargadas útiles con los agentes quimioterapéuticos Pt(IV)-succinato (Pt-LacLL-NP platino) y doxorrubicina (Doxo-LacLL-NP doxorrubicina) en comparación con el fármaco libre en un ensayo de viabilidad celular de MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro) (Figura 7). En el ensayo se utilizó la línea celular de carcinoma hepatocelular humano HepG2.
En el caso del agente antineoplásico basado en platino Pt(IV)-succinato, se demostró que la Pt-LacLL-NP es más potente que el fármaco libre. Para la nanopartícula, se observó un valor de IC50 de 12,8 pM, si bien para el fármaco libre se pudo encontrar un valor de 38,6 pM. Para la doxorrubicina, el compuesto libre mostró una citotoxicidad ligeramente mayor en comparación con la nanopartícula cargada útil. La unión del fármaco a la nanopartícula mantuvo la actividad quimioterapéutica y permite el uso de nanopartículas de oro de enlazador largo de lactosa dirigida al hígado como un sistema de suministro de fármacos.
Resultados del ensayo de MTT
Figure imgf000018_0002
Sección experimental
Siembra celular en placas de microtitulación de 96 pocillos
Las células HepG2 se cultivaron en un matraz T-75. Para la transferencia de la célula se retiró el medio del matraz y las células se tripsinizaron durante 5 minutos. Las células se recogieron en un tubo Falcon y se diluyeron con medio celular completo. El recuento celular se realizó en una cámara Neubauer. Se preparó una solución celular para sembrar 4000 células por pocillo (200 pl por pocillo). La placa de microtitulación se incubó durante 24 h a 37 °C.
Tratamiento de la célula HepG2 sembrada
Para cada NP y fármaco, se prepararon formulaciones en medio celular.
Los compuestos se ensayaron en diferentes concentraciones (0,01, 0,05, 0,2, 1, 5, 25 y 125 pM basándose en la cantidad de fármaco). Para el tratamiento, el medio celular se retiró de todos los pocillos y se intercambió por formulaciones de fármacos. Se añadieron 200 pl de tratamientos por triplicado a cada pocillo. Las placas de microtitulación se incubaron durante 24 h, 48 h y 72 h a 37 °C.
Medición de MTT 24 h, 48 h y 72 h después del tratamiento
Se diluyeron 1,5 ml de solución de MTT (8,0 mg en 1,6 ml DMSO) con medio celular completo (sin rojo fenol). El medio celular de tratamiento se retiró de la placa de microtitulación, los pocillos se lavaron con 100 pl PBS y se añadieron 100 pl de la solución reactiva de MTT a cada pocillo. Después de una hora de incubación a 37 °C, la solución de MTT se eliminó y se añadieron 100 pl de DMSO para disolver el colorante de formazán. La absorbancia se midió a 570 nm.
Análisis estadístico y cálculo de CI50
Los datos se analizaron utilizando OriginPro8. Los datos normalizados se representaron gráficamente y la curva se ajustó utilizando un ajuste de curva de regresión no lineal (curva de dosis-respuesta sigmoidea con pendiente variable). Los valores de CI50 absolutos se obtuvieron por interpolación.
Ejemplo 5 - Selección de GNP dirigidas y direccionamiento al HCC in vitro
Se cribaron varias GNP dirigidas a bases/péptidos in vitro. Las GNP que tienen una corona mixta que comprende ligandos de galactosa-C2-SH (Gal-C2) y HSPEG8COOH se sintetizaron de acuerdo con una metodología análoga a la descrita anteriormente en los Ejemplos 1 y 2, sin embargo, con la galactosa-C2-SH reemplazando la glucosa-C2-SH y HSPEG8COOH (también abreviado SH-EGa-COOH o SH-(OCH2CH2)s-COOH) reemplazando el enlazador amino NH2-EG6-SH.
Se encontró que las GNP de Au@Gal-C2:HSPEG8COOH presentaron una unión inespecífica más baja (normal:células tumorales) y buena circulación de plasma in vivo. Por tanto, se seleccionó la corona de Gal-C2 y HSPEG8COOH para estudios de direccionamiento al HCC utilizando péptidos de unión a glipicano-3.
El péptido glipicano-3 descrito en el documento US8.388.937B2 (cuyos contenidos se incorporan como referencia en el presente documento expresamente); véase la SEQ ID NO: 1 del mismo, que tiene la secuencia de aminoácidos: RLNVGGTYFLTTRQ (Se Q ID NO: 1) se unió al grupo COOH terminal de una proporción de los ligandos de HSPEG8COOH a través del extremo N de dicho péptido. En una construcción de GNP de "carga alta" (véase la fila 1 en la tabla más adelante), se unieron aproximadamente 4 péptidos por núcleo de nanopartícula. Se encontró que las GNP de Au@Gal-C2: HSPEG8COOH:HSPEG8CONHRLNVGGTYFLTTRQ de "carga alta" presentaron aproximadamente un direccionamiento de 7 veces relativo a la GNP de base que carece del péptido RLNVGGTYFLTTRQ (véanse la Figura 8 y la primera fila de la siguiente tabla). Las GNP de Au@Gal-C2:HSPEG8COOH:HSPEG8CONHRLNVGGTYFLTTRQ de "carga baja" (véase la fila 3 de la siguiente tabla) presentaron aproximadamente un direccionamiento de 4,6 veces relativo a la GNP base que carece del péptido RLNVGGTYFLTTRQ.
Figure imgf000019_0001
Se ha llevado a cabo una investigación adicional en la que se evaluó la orientación y/o la protección terminal del péptido RLNVGGTYFLTTRQ unido. En particular, RLNVGGTYFLTTRQ (unido a PEG8COOH a través del extremo N, extremo COOH libre; descrito anteriormente) y RLNVGGTYFLTTRQ-NH2 (unido a PEG8COOH a través del extremo N, extremo amida primaria que reemplaza al extremo C convencional).
Una construcción adicional que se ha investigado comprende una corona mixta de galactosa-C2-SH y un enlazador amino (también conocido como "AL" o NH2-EG6-SH) en una proporción aproximadamente de 50:50. El péptido RLNVGGTYFLTTRQ se unió al enlazador amino a través del extremo C del péptido o usando una versión de acil-N-terminal del péptido y uniendo el acil-extremo N del péptido al enlazador de amino. Se emplearon dos métodos: (1) el péptido se unió a g NP-AL a través del extremo C (dando una partícula positiva); o (2) el péptido se unió a AL-SH en una primera etapa y el SH-EG6-NHCO-RLNVGGTYFLTTRQ se usó como un ligando en la síntesis de nanopartículas dando una partícula negativa. La partícula resultante puede representarse como: Au@GalC2:AL:AL-(Ac)-RLNVGGTYFLTTRQ.
Un péptido de unión a glipicano-3 adicional descrito en el documento US8.388.937B2 (cuyo contenido se incorpora como referencia en el presente documento expresamente); véase la SEQ ID NO: 10 del mismo, que tiene la secuencia de aminoácidos: YFLTTRQ (SEC ID NO: 2) se unió a ligandos de GNP como sigue. Una GNP que tiene una corona mixta de galactosa-C2-SH y un enlazador de amino (NH2-EG6-SH) en una proporción aproximadamente de 50:50 tuvo el péptido YFLTTRQ unido al enlazador de amino a través de un extremo N de acilo del péptido YFLTTRQ para producir una GNP que puede representarse por la siguiente fórmula: Au@GalC2:AL:AL-(Ac)-YFLTTRQ. Otras GNP producidas o contempladas en el presente documento incluyen: Au@GalC2:HSPEG8CONH-YFLTTRQ (unida a PEG8COOH a través del extremo N, extremo COOH libre) y Au@GalC2:HSPEG8CONH-YFLTTRQ-NH2 (unida a PEG8COOH a través del extremo N, extremo de amida primaria). Como se puede observar en la fila 2 de la tabla anterior, la GNP Au@GalC2:AL:AL-(Ac)-YFLTTRQ presentó aproximadamente un direccionamiento de 5 veces a las células HCC en comparación con la nanopartícula de base, que carece del péptido YFLTTRQ. Por tanto, estos resultados muestran que los péptidos de unión al glipicano-3 contribuyen al direccionamiento a1HCC y que una mayor carga de péptidos (es decir, más péptidos de unión al glipicano-3 por nanopartícula) aumenta el direccionamiento al HCC adicionalmente.
Ejemplo 6 -L a GNP de GalC2 dirigida a GLY-3 muestra toxicidad de células HEPG2 con una carga útil de DM4 (no de acuerdo con la invención)
Las siguientes construcciones de GNP se sintetizaron con el fin de evaluar su capacidad de eliminación de células tumorales contra células HepG2 (carcinoma hepatocelular de hígado):
las GNP con una corona de ligandos de galactosa-C2 y de HSPEG8COOH (proporción de 40:60), que pueden representarse por Au@GalC2:HSPEG8COOH.
Las GNP con una corona de ligandos de galactosa-C2, HSPEG8COOH y maitansinoide DM4, que puede representarse por Au@GalC2:HSPEG8COOH:DM4.
Las GNP con una corona de ligandos de galactosa-C2, HSPEG8COOH y maitansinoide DM4, en donde una proporción de los ligandos de HSPEG8COOH está conjugada con el extremo N del péptido de unión a glipicano-3 RLNVGGTYFLTTRQ (SEQ ID NO: 1) < 1 péptido por nanopartícula. Las GNP pueden representarse por:
Au@GalC2:DM4:HSPEG8COOH:HSPEG8CONHRLNVGGTYFLTTRQ.
También se utilizó maitansinoide DM4 libre como un control positivo en los experimentos de toxicidad de células HepG2.
El efecto de diversas construcciones de GNP y del maitansinoide DM4 libre, sobre la viabilidad celular en células HEPG2 tras 72 horas de tratamiento se muestra en la Figura 9. La viabilidad celular medida como control porcentual en un ensayo de MTT se representa gráficamente frente a la concentración. La GNP que carece de DM4 esencialmente no presentó toxicidad en las condiciones ensayadas. Ambas GNP con DM4 presentaron curvas de dosis-toxicidad que se parecían mucho a las de DM4 libre. Tomadas junto con el direccionamiento a1HCC, demostrado por las GNP que tienen péptido de unión a glipicano-3 como agentes dirigidos al hígado (véase el Ejemplo 5), estos resultados indican que las GNP que tienen una corona mixta de un ligando de dilución, un péptido de unión a glipicano-3 y un agente quimioterapéutico, tal como maitansinoide DM4, se espera que demuestren la eliminación de células cancerosas hepáticas seleccionadas al tiempo que minimicen los efectos inespecíficos (es decir, minimiza la toxicidad contra las células sanas).
Ejemplo 7 - Investigación de la solubilidad del enlazador de carboxilo PEGilado de a-Galactosa cargado con DM1 y de nanopartículas de a-Galactosa cargadas con DM1
El objetivo de este experimento fue investigar la solubilidad del enlazador de carboxilo PEGilado de a-Galactosa cargado con DM1 y de nanopartículas de a-Galactosa cargadas solo con DM1.
Se construyeron las siguientes nanopartículas:
[a-Galactosa] [DM1] AuGNP:
Figure imgf000021_0001
[a-Galactosa] [Peg8] [DMi] AuGNP:
Figure imgf000021_0002
PROCEDIMIENTO
La síntesis se llevó a cabo utilizando el método de intercambio de ligandos.
Las nanopartículas se analizaron mediante ensayo colorimétrico de oro, espectros UV-vis, DLS y HPLC. Se usó HPLC para cuantificar cualquier DM1 libre en la partícula que pudiera afectar la solubilidad o la distribución de tamaño. ANÁLISIS
Figure imgf000022_0001
Análisis de DLS
[a-Galactosa] [DM1] AuGNP. [Au]: 150 ppm
Disolvente: PBS x 10.
CONCLUSIONES
[a-Galactosa] [DM1] AuGNP
En agua, las nanopartículas de [a-Galactosa] [DM1] AuGNP presentan una solubilidad excelente y la distribución de tamaños es pequeña (~ 4,00 nm) como se esperaba.
En PBS, las muestras de nanopartículas de [a-Galactosa] [DM1] AuGNP comenzaron a presentar precipitación a lo largo del tiempo (24 horas), indicando una solubilidad inferior a la óptima.
[a-Galactosa] [Peg8] [DM1] AuGNP
Se encontró que las nanopartículas de oro PEGiladas de a-Galactosa cargadas con DM1 fueron completamente solubles tanto en agua como en PBS, ambos análisis muestran una distribución pequeña.
Ejemplo 8 - Investigación de la actividad y de la tolerabilidad in vitro e in vivo de nanopartículas de [DM1]-[C2- a-Galactosa]-[PEGsCOOH]@Au
Se prepararon nanopartículas de oro [DM1]-[C2-a-Galactosa]-[PEG8COOH]@Au mediante intercambio de ligandos como se describe en el Ejemplo 7 y se representaron esquemáticamente en la Figura 14. Se encontró que las nanopartículas de oro [DM1]-[C2-a-Galactosa]-[PEG8COOH]@Au tienen una carga de DM1 promedio de aproximadamente 5 moléculas de DM1 por núcleo de nanopartícula. A continuación en el presente documento, la nanopartícula de oro [DM1]-[C2-a-Galactosa]-[PEG8COOH]@Au se denomina "MTC-100038" o "MTC100038". La citotoxicidad de las construcciones de nanopartículas de oro GalC2-PEG8COOH-GNP (nanopartícula de oro parental no funcionalizada (MTC-100011)) y MTC-100038 se compararon con el fármaco DM1 libre en las líneas celulares HCC HEPG2 y HEP3B. Tanto el fármaco sin DM1 como MTC-100038 dieron como resultado niveles significativos y comparables de citotoxicidad, con IC50 de 4,15 nM y 9,40 nM, respectivamente. La nanopartícula de oro de base, MTC-100011, es decir, sin DM1 unida, no mostró citotoxicidad en este ensayo. Cabe destacar que, la conjugación de DM1 para formar MTC-100038 no altera significativamente la citotoxicidad de DM1, en comparación con el fármaco parental (véanse la Tabla más adelante y la Figura 10).
Figure imgf000022_0002
Se descubrió que MTC-100038 es un inhibidor potente de la viabilidad celular en el intervalo de nM en todas las (ocho) líneas celulares derivadas de pacientes humanos ensayadas. Los valores de CI50 fueron comparables a los de DM1 libre y la viabilidad celular en inhibición máxima se inhibió en mayor medida por MTC-100038 que por DM1 libre a una concentración equivalente de DM1.
Tras la determinación de la actividad de citotoxicidad in vitro, se llevaron a cabo pruebas in vivo, utilizando modelos de ratón tanto de xenoinjerto subcutáneo y ortotópico y como de implantación de líneas celulares de HCC reconocidas donde se hubo confirmado la citotoxicidad in vitro. En todos los estudios, la tolerabilidad se evaluó antes del estudio para guiar la selección de dosis para los estudios de eficacia.
Los efectos de MTC-100038 sobre el crecimiento tumoral in vivo se han estudiado en los siguientes modelos: • Eficacia antitumoral en el modelo de xenoinjerto HEP3B de modelo subcutáneo
• Eficacia antitumoral en el modelo de xenoinjerto BEL7404 subcutáneo
• Eficacia antitumoral en el modelo de xenoinjerto HEP3B ortotópico (lóbulo hepático izquierdo).
Como se muestra en la Figura 11, MTC-100038 mostró una tolerabilidad mejorada relativa a una dosis de otra forma letal de DM1 (es decir, sin suministro de nanopartículas) en un modelo de ratón con xenoinjerto de HCC humano. Además, la Figura 12 muestra que MTC-100038 se tolera bien en comparación con la dosis máxima tolerable (MTD, por sus siglas en inglés) de Sorafenib en el modelo de xenoinjerto ortotópico HEP3B de HCC.
Asimismo, los estudios de biodistribución han demostrado que MTC-100038 aumenta el suministro de DM1 tumoral frente a DM1 solo (Figura 13).
La farmacocinética in vivo y la biodistribución de DM1 se estudiaron en el modelo de xenoinjerto de cáncer hepatocelular humano Hep3B subcutáneo (Tabla 1). La concentración de oro y DM1 en muestras de hígado y riñón se evaluaron 2, 24 y 48 horas después de la última administración del fármaco.
La concentración de DM1 fue más alta en hígado y riñón a las 2 horas y posteriormente disminuyó progresivamente a las 24 y 48 horas con una semivida tisular aproximada de 12-24 horas. En el tumor Hep3B subcutáneo, la concentración de DM1 disminuyó en aproximadamente un 40 % entre 2 y 24 horas después de la última dosis, pero no disminuyó adicionalmente a las 48 horas. Cabe destacar que, la concentración de DM1 en el tumor después de la dosificación con MTC-100038 fue de aproximadamente el doble de la medida después de la misma dosis de DM1 administrada sola, indicando que la nanopartícula aumentó la captación de DM1 (véase la Figura 13).
Eficacia antitumoral en el modelo de xenoinjerto de HEP3B subcutáneo
Se evaluó la eficacia antitumoral in vivo de MTC-100038 en un modelo de xenoinjerto de cáncer hepatocelular Hep3B subcutáneo en ratones NOD/SCID. Brevemente, se implantaron subcutáneamente en ratones n Od /SCID (18-22 g, n=10 por grupo) células hepatocelulares HEP 3B (3 x 106) en 0,1 ml de PBS para el desarrollo tumoral. La asignación de grupo/dosificación comenzó cuando los tumores alcanzaron un volumen predeterminado de tumores subcutáneos de ~200 mm3 (n=10 por grupo). La dosificación (i.v.) comenzó sobre una base de QD x 5 (diaria durante 5 días) para MTC-100038 y DM1 libre en las concentraciones indicadas en la tabla a más adelante. El tamaño tumoral se midió dos veces por semana y el volumen se expresó en mm3. A continuación, el tamaño tumoral se utilizó para los cálculos de los valores de T/C. El valor de T/C (en porcentaje) es una indicación de la eficacia antitumoral (de forma óptima, se considera que un artículo de prueba tiene actividad antitumoral cuando T/C es de un 50% o menos); T y C son los volúmenes medios de los grupos tratados y de control, respectivamente, en un día dado.
Como se muestra en la siguiente tabla, MTC-100038 ralentiza el crecimiento tumoral en un xenoinjerto humano Hep3B subcutáneo en ratones NOD/SCID (inmunocomprometido) de una forma dependiente de la dosis.
Figure imgf000023_0001
• *Mediciones tomadas el día 13. Datos = Media ± ETM
• **T/C es una medida de la inhibición del crecimiento tumoral. Se calcula dividiendo el volumen tumoral promedio para el grupo de tratamiento, por el volumen promedio para el grupo de vehículo. De manera óptima, un tratamiento eficaz presenta T/C < 50%.
Los datos anteriores indican que MTC-100038 tiene una mayor actividad antitumoral que el fármaco parental DM1, proporcionando un bloqueo completo del crecimiento tumoral desde el punto de tratamiento en una dosis de 0,45 mg/kg. La eficacia mejorada de MTC-100038 refleja una mayor concentración de DM1 en el tejido tumoral que, sin desear quedar ligado a teoría alguna, se cree que se debió al menos a:
a) captación mejorada de DM1 en las células cancerosas cuando se administró en la nanopartícula y b) la biodistribución alterada y la menor toxicidad de MTC-100038, que permitió administrar dosis 3 veces más altas de DM1 a los ratones en comparación con DM1 solo.
Eficacia antitumoral en el modelo de xenoinjerto de BEL7404 subcutáneo
Se evaluó la eficacia antitumoral in vivo de MTC-100038 en un modelo de xenoinjerto de cáncer hepatocelular BEL7404 subcutáneo en ratones NOD/SCID. Brevemente, se implantaron subcutáneamente en ratones NOD/SCID (18-22 g, n=10 por grupo) células tumorales BEL7404 (3 x 106) en 0,1 ml de PBS para el desarrollo tumoral. La asignación de grupo/dosificación comenzó cuando los tumores alcanzaron un volumen predeterminado de tumores subcutáneos de ~200 mm3 Los grupos de tratamiento y la dosificación son como se indica en la tabla más adelante.
El tamaño tumoral se midió dos veces por semana y el volumen se expresó en mm3. A continuación, el tamaño tumoral se utilizó para los cálculos de los valores de T/C. Los resultados de la inhibición de crecimiento tumoral se muestran en la tabla más adelante.
Figure imgf000024_0002
• *Mediciones tomadas el día 13. Datos = Media ± ETM
• **T/C es una medida de la inhibición del crecimiento tumoral. Se calcula dividiendo el volumen tumoral promedio para el grupo de tratamiento, por el volumen promedio para el grupo de vehículo. De manera óptima, un tratamiento eficaz presenta T/C < 50%.
Los datos anteriores muestran que el tratamiento con DM1 solo en un nivel de dosis de 0,15 mg/kg no produjo actividad antitumoral, en comparación con el grupo de control de vehículo. El tratamiento con Sorafenib a 60 mg/kg durante 21 días dio como resultado una inhibición del crecimiento tumoral significativa, en comparación con el vehículo. MTC-100038 mostró una inhibición dependiente de la dosis del crecimiento tumoral, con un nivel de dosis de 0,3375 mg/kg produciendo una actividad antitumoral superior, en comparación con Sorafenib.
Eficacia antitumoral en el modelo de xenoinjerto de HEP3B ortotópico
Se evaluó la eficacia antitumoral in vivo de MTC-100038 en un modelo de xenoinjerto de cáncer hepatocelular ortotópico en ratones desnudos BALB/c. Brevemente, se implantaron en ratones desnudos BALB/c (18-23 g, n=10/grupo) aproximadamente 3x106 células Hep3B-Luc mezcladas con Matrigel BD en 20 pl (PBS:Matrigel = 1:1). Los animales se seleccionaron y aleatorizaron (basándose en su densidad de bioluminiscencia) el día 7 después de la implantación tumoral en 6 grupos utilizando un diseño de bloques aleatorizados basado en su bioluminiscencia. La pauta de tratamiento y posológica fue como se muestra en la tabla más adelante.
La bioluminiscencia tumoral se utilizó para el cálculo del valor de T/C (en porcentaje), donde T y C son la bioluminiscencia media de los grupos tratados y de control, respectivamente, en un día dado. El análisis estadístico de la diferencia en bioluminiscencia entre los grupos y el análisis de la interacción farmacológica se realizaron sobre los datos obtenidos en el mejor momento terapéutico después de la dosis final (el día 21° después del inicio del tratamiento).
Se realizó un ANOVA de una vía para comparar la bioluminiscencia entre grupos y cuando se obtuvo un estadístico F significativo (una proporción entre la varianza del tratamiento y la varianza del error), se llevaron a cabo comparaciones entre grupos con la prueba de Games-Howell, con p < 0.05 estadísticamente significativa.
Los resultados del análisis de la inhibición de crecimiento tumoral calculados sobre las mediciones de bioluminiscencia el día 21 se muestran en la tabla más adelante.
Figure imgf000024_0001
• *Mediciones tomadas el día 21. Datos = Media ± ETM
• **T/C es una medida de la inhibición del crecimiento tumoral. Se calcula dividiendo la bioluminiscencia promedio

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una nanopartícula que comprende:
un núcleo que comprende un metal y/o un semiconductor; y
una pluralidad de ligandos unidos covalentemente al núcleo,
en donde dichos ligandos comprenden:
(i) al menos un ligando de galactosa como un ligando dirigido al hígado;
(ii) al menos un ligando de maitansinoide DM1; y
(iii) al menos un ligando de dilución que comprende una cadena de poli u oligo etilenglicol que tiene un grupo terminal de ácido carboxílico.
2. La nanopartícula de acuerdo con la reivindicación 1, en donde al menos un ligando de dilución comprende SH-PEG-COOH; y/o en donde al menos un ligando de dilución comprende:
HS-(OCH2CH2)q-COOH, donde q está entre 2 y 30, opcionalmente entre 6 y 10 o donde q está entre 20 y 60; y/o en donde al menos un ligando de dilución comprende:
Figure imgf000027_0001
3. La nanopartícula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el núcleo comprende un metal seleccionado del grupo que consiste en: Au, Ag, Cu, Pt, Pd, Fe, Co, Gd, Zn o cualquier combinación de los mismos y preferentemente el núcleo comprende oro.
4. La nanopartícula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el diámetro del núcleo está en el intervalo de 1 nm a 5 nm; y/o en donde el diámetro de la nanopartícula incluyendo sus ligandos está en el intervalo de 3 nm a 50 nm.
5. Una nanopartícula que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000028_0001
6. Una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de nanopartículas una cualquiera de las reivindicaciones anteriores y al menos un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptables.
7. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la composición farmacéutica es una formulación de liberación sostenida y en donde al menos una porción de la pluralidad de nanopartículas están encapsuladas en un polímero biocompatible y opcionalmente la formulación de liberación sostenida está en forma de una micropartícula, una microesfera, una perla o una película.
8. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6 o la reivindicación 7, en donde la composición está en forma inyectable.
9. Una nanopartícula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o una composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 para usar en medicina.
10. Una nanopartícula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o una composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 para usar en el tratamiento de un trastorno hepático en un sujeto mamífero.
11. La nanopartícula o la composición para usar de acuerdo con la reivindicación 10, en donde dicho trastorno hepático comprende un cáncer primario o secundario del hígado.
12. La nanopartícula o la composición para usar de acuerdo con la reivindicación 11, en donde dicho cáncer es el carcinoma hepatocelular (HCC); o en donde dicho cáncer se selecciona de: hepatoblastoma, colangiocarcinoma, cistadenocarcinoma colangiocelular, angiosarcoma, hemangioendotelioma, sarcoma embrionario, fibrosarcoma, leiomiosarcoma y rabdomiosarcoma.
13. La nanopartícula o la composición para usar de acuerdo con la reivindicación 11 o la reivindicación 12, en donde dicha nanopartícula o dicha composición se administran de forma simultánea, secuencialmente o por separado con un segundo agente anticanceroso y opcionalmente en donde dicho segundo agente anticanceroso comprende un inhibidor de quinasa seleccionado del grupo que consiste en: Sorafenib, Regorafenib y Lenvatinib.
14. Un artículo de fabricación que comprende:
una nanopartícula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o una composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8;
un envase para alojar la nanopartícula o la composición farmacéutica; y
un inserto o una etiqueta
15. El artículo de fabricación según la reivindicación 14, en donde el inserto y/o la etiqueta proporcionan instrucciones, información de dosificación y/o administración relacionadas con el uso de la nanopartícula o de la composición farmacéutica en el tratamiento de un trastorno hepático en un sujeto mamífero.
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