ES2881332T3

ES2881332T3 - Ingrediente farmacéutico activo (IFA) que comprende cannabinoides para su uso en el tratamiento del cáncer

Info

Publication number: ES2881332T3
Application number: ES15733502T
Authority: ES
Inventors: Colin Stott; Marnie Duncan; Thomas Hill
Original assignee: GW Research Ltd
Current assignee: GW Research Ltd
Priority date: 2014-06-27
Filing date: 2015-06-26
Publication date: 2021-11-29
Anticipated expiration: 2035-06-26
Also published as: EP3160455B1; EP3160455A1; US20170143642A1; GB201411465D0; US9962341B2; WO2015198071A1; EP3915550A1; GB2527590A

Abstract

Un ingrediente farmacéutico activo (IFA) que comprende o consiste esencialmente en cannabidiol (CBD) y cannabigerol (CBG) para su uso en el tratamiento del melanoma, en donde el CBD y el CBG están presentes en una relación 1:1 (CBD:CBG).

Description

DESCRIPCIÓN

Ingrediente farmacéutico activo (IFA) que comprende cannabinoides para su uso en el tratamiento del cáncer

La presente invención se refiere a un ingrediente farmacéutico activo (IFA) que comprende o consiste esencialmente en cannabidiol (CBD) y cannabigerol (CBG) para su uso en el tratamiento del melanoma. La combinación de CBD y CBG está presente en una relación 1:1 (CBD:CBG).

Antecedentes de la invención

El cáncer es una clase de enfermedades que se produce porque las células se inmortalizan; dejan de responder a las señales habituales para detener el crecimiento lo cual es una función normal de la remodelación en el cuerpo que requiere de la muerte de células en el momento preciso. La apoptosis, o muerte celular programada, puede llegar a ser defectuosa y cuando esto sucede puede tener lugar una transformación maligna. Las células inmortalizadas crecen más allá de sus límites normales e invaden los tejidos adyacentes. Las células malignas pueden además metastatizar y dispersarse a otros lugares en el cuerpo a través del torrente sanguíneo o el sistema linfático. Las células cancerosas frecuentemente forman una masa conocida como un tumor.

Existen aproximadamente 200 tipos diferentes de cáncer; los cánceres pueden empezar en cualquier tipo de tejido corporal aunque muchos cánceres harán metástasis hacia otros tejidos corporales. Existen muchas causas diferentes de cáncer y estas incluyen; los carcinógenos, la edad, las mutaciones genéticas, los problemas del sistema inmunológico, la dieta, el peso, el estilo de vida, los factores ambientales tales como los contaminantes, algunos virus, por ejemplo, el virus del papiloma humano (VPH) está implicado en el cáncer del cuello del útero.

Existen muchas opciones de tratamientos diferentes para el cáncer y el tratamiento buscado se determina frecuentemente por el tipo y la etapa del cáncer. Las opciones de tratamiento incluyen; tratamiento con fármacos quimioterapéuticos, tratamiento con fármacos hormonales, radioterapia, cirugía, terapias complementarias y combinaciones de estos.

A Cannabis se le ha atribuido ser tanto un carcinógeno como un agente contra el cáncer. En particular se conoce que fumar cannabis es carcinogénico ya que el humo de cannabis contiene al menos 50 compuestos carcinogénicos conocidos diferentes, muchos de los cuales son las mismas sustancias encontradas en el humo del tabaco. Uno de estos carcinógenos, el benzopireno es conocido por provocar cáncer ya que altera un gen denominado p53, que es un gen supresor de tumores.

Los investigadores han descubierto que algunos cannabinoides, que incluyen el tetrahidrocannabinol (THC) y el cannabidiol (CBD), son capaces de promover el resurgimiento de la apoptosis, de manera que algunos tumores respondan a las señales, dejen de dividirse, y mueran. El proceso de apoptosis se valora por la observación de varios fenómenos que incluyen: reducción del volumen celular, condensación de la cromatina nuclear, cambios en la distribución de fosfolípidos en los fosfolípidos de la membrana plasmática, y escisión de la cromatina en fragmentos de ADN denominados escaleras de ADN.

Otro método por el cual crecen los tumores es mediante el aseguramiento de su nutrición: envían señales para promover la angiogénesis, el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos. Los cannabinoides también pueden desactivar estas señales.

Se ha demostrado que los cannabinoides tienen un efecto antiproliferativo sobre diferentes líneas celulares de cáncer. Los cannabinoides THC, el ácido tetrahidrocannabinólico (THCA), el CBD, el ácido cannabidiólico (CBDA), el cannabigerol (CBG) y el cannabicromeno (CBC) y los extractos de cannabinoides enriquecidos en THC o CBD se probaron en ocho líneas celulares diferentes en Ligresti y otros, (2006). Las líneas usadas en este estudio fueron: DU-145 (cáncer de próstata no sensible a las hormonas), MDA-MB-231 y MCF-7 (cáncer de mama), CaCo-2 (cáncer colorrectal), LiMol (cáncer de tiroides), RBL-2H3 (leucemia), AGS (cáncer de estómago) y C6 (células de glioma).

Los datos para cada cannabinoide en cada tipo de cáncer diferente varió, pero generalmente los mejores datos se observaron con el CBD o el extracto de cannabis enriquecido en CBD.

Los valores de IC50 variaron ampliamente entre los diferentes cannabinoides y las diferentes líneas celulares; sin embargo, los autores determinaron que el cannabinoide CBD fue el más efectivo en las líneas celulares de cáncer de mama.

Varias solicitudes de patentes describen el uso de cannabinoides en el tratamiento de tumores cerebrales, por ejemplo, el documento WO 2009/147439 describe una combinación de THC y CBD en el tratamiento del glioma, el documento W o 2009/147438 describe el uso de THC y CBD en combinación con agentes quimioterapéuticos no cannabinoides en el tratamiento del glioma y el documento WO 2011/110866 describe el uso de THC y CBD con temozolamida en el tratamiento del glioma.

La patente EP1,802,274 describe el uso del cannabinoide CBD en la inhibición de la migración de células tumorales.

Un estudio posterior atribuyó un mecanismo para esto, al demostrar que el CBD es capaz de regular negativamente la expresión del inhibidor de la proteína de unión al ADN, Id-1 en células humanas de cáncer de mama (McAllister, 2007). Las concentraciones de CBD efectivas para inhibir la expresión de Id-1 se correlacionaron con las usadas para inhibir el fenotipo proliferativo e invasivo de las células de cáncer de mama. CBD fue capaz de inhibir la expresión de Id-1 a nivel de ARNm y proteína de una manera dependiente de la concentración.

Se ha demostrado además que el CBD inhibe la proliferación y la invasión de células cancerosas humanas a través de la modulación diferencial de las vías de ERKy ROS, y que la activación sostenida de la vía de ERK conduce a la regulación negativa de la expresión de Id-1. Se demostró además que el CBD regula positivamente el agente de prodiferenciación, Id-2. Con el uso de una línea celular 4T1 de ratón y un modelo de cáncer de mama metastásico, el CBD redujo significativamente la dispersión metastásica. Como tal, el CBD puede representar un tratamiento prometedor para el cáncer de mama en pacientes con tumores secundarios (McAllister, 2007).

La solicitud de patente GB2494461 describe el uso de los cannabinoides CBG, CBDV y THCV en el tratamiento de las células U87 de glioma.

Choi y otros (2008) describen la eficacia del CBD en varias líneas celulares y que la citotoxicidad del CBD aumentó de una manera dependiente de la dosis y el tiempo. Furthermore Baek y otros (1996) sugieren que CBG ejerce una actividad antitumoral contra las células de melanoma en un modelo de ratón.

Es un objetivo de la presente invención encontrar terapias contra el cáncer mejoradas y/o alternativas. Con este fin, una plataforma de datos que representa el uso de un IFA, que comprende o consiste esencialmente en una combinación de cannabidiol con otro cannabinoide seleccionado de cannabigerol (CBG), ácido cannabigerólico (CBGA), ácido cannabidiólico (CBDA) y tetrahidrocannabivarina (THCV) en varias líneas celulares de cáncer.

Definiciones y abreviaturas

Las definiciones de algunos de los términos usados para describir la invención se detallan más abajo:

Los fitocannabinoides descritos en la presente solicitud se enumeran más abajo junto con sus abreviaturas estándar.

La tabla anterior no es exhaustiva y simplemente detalla los cannabinoides que se identifican como referencia en la presente solicitud. Hasta ahora se han identificado más de 60 cannabinoides diferentes y estos cannabinoides se pueden dividir en diferentes grupos de la siguiente manera: Fitocannabinoides, Endocannabinoides y Cannabinoides sintéticos (que pueden ser nuevos cannabinoides o fitocannabinoides o endocannabinoides producidos sintéticamente).

Los "fitocannabinoides" son cannabinoides que se originan de la naturaleza y pueden encontrarse en la planta de cannabis. Los fitocannabinoides pueden aislarse de las plantas para producir un extracto altamente purificado o pueden reproducirse sintéticamente.

Los "cannabinoides altamente purificados" se definen como los cannabinoides que se extrajeron de la planta cannabis y se purificaron en la medida en que otros cannabinoides y componentes no cannabinoides (no necesarios) que se coextraen con los cannabinoides se eliminan, de manera que, el cannabinoide o los cannabinoides altamente purificados es/son de pureza superior o igual al 98 % (p/p). En el caso de un IFA que comprende una combinación de dos cannabinoides, los dos comprenden más de o igual al 98 % (p/p) del peso total.

Los "cannabinoides sintéticos" son compuestos que tienen una estructura cannabinoide o similar al cannabinoide y se fabrican mediante el uso de medios químicos en lugar de la planta.

Los fitocannabinoides pueden obtenerse como la forma neutral (forma descarboxilada) o la forma de ácido carboxílico en dependencia del método usado para extraer los cannabinoides. Por ejemplo se conoce que el calentamiento de la forma de ácido carboxílico provocará que la mayoría de la forma de ácido carboxílico se descarboxile hacia la forma neutral.

El término "Ingrediente Farmacéutico Activo" (IFA) se define por la FDA como "cualquier sustancia o mezcla de sustancias que se pretende usaren la fabricación de un producto farmacéutico y que, cuando se usa en la producción de un fármaco, se convierte en un ingrediente activo en el producto farmacéutico. Se pretende que dichas sustancias proporcionen actividad farmacológica u otro efecto directo en el diagnóstico, la cura, la mitigación, el tratamiento o la prevención de enfermedades o a afectar la estructura y función del cuerpo." Como tal, una combinación sinérgica entra dentro de la definición de un IFA.

El término "que comprende" se refiere a que los cannabinoides especificados están presentes en el IFA en más del 95 % (p/p).

El término "que consiste esencialmente en" se refiere a que los cannabinoides especificados están presentes en el IFA en más del 98 % (p/p).

Breve resumen de la descripción

De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un ingrediente farmacéutico activo (IFA) que comprende o consiste esencialmente en cannabidiol (CBD) y cannabigerol (CBG) para su uso en el tratamiento del melanoma, en donde el CBD y el CBG están presentes en una relación 1:1 (CBD:CBG).

Preferentemente, la dosis del IFA está entre 1 y 1000 mg/kg día.

En una modalidad adicional, se proporciona una formulación farmacéutica que comprende un IFA y uno o más excipientes.

Preferentemente, el CBD puede formularse para su administración por separado, secuencial o simultáneamente con el CBG o la combinación puede proporcionarse en una forma de dosificación única.

Descripción detallada

Los ejemplos más abajo describen por primera vez varios ingredientes farmacéuticos activos (IFA) diferentes que comprenden combinaciones de cannabidiol y otro cannabinoide (CB) seleccionado del grupo que consiste en cannabigerol (CBG), ácido cannabigerólico (CBGA), ácido cannabidiólico (CBDA) y tetrahidrocannabivarina (THCV). Estos IFA han demostrado no solo ser eficaces, sino también que las combinaciones muestran sinergismo en el tratamiento de muchas líneas celulares de cáncer diferentes.

El ejemplo 1 se incluye solo a título informativo y no forma parte de la invención. En el Ejemplo 2, solo los datos para las líneas celulares de melanoma (WM115, A375) forman la base de la invención, los datos dirigidos a líneas celulares adicionales se incluyen solo para información.

Ejemplo 1: eficacia de los fitocanabinoides solos y en combinación en las líneas celulares de cáncer de mama y de hígado

Materiales y métodos

Líneas celulares:

Las líneas celulares probadas en este ejemplo fueron los siguientes. Cáncer de mama: MDA-MB-231; SK-BR3; y BT474. Cáncer de hígado: HepG2.

Los fitocannabinoides se probaron solos y en varias combinaciones de relaciones en medios que contenían concentraciones finales de suero bovino fetal al 10 % y al 1 % a las 72 h para las líneas de cáncer de mama y próstata y suero bovino fetal al 1 % para la línea de cáncer de hígado HepG2.

Preparación de las células:

Cada línea de células tumorales se mantuvo in vitro en RPMI 1640 FBS al 10 % inactivado por calor y L-glutamina 2 mM (medio de cultivo) a 37 °C en CO2 al 5 % y condiciones de humedad. Las células se recogieron, se lavaron, se resuspendieron en medio de cultivo y se contaron. Las células se resuspendieron en el medio de ensayo (RPMI 1640 FBS al 5 % inactivado por calor y L-glutamina 2 mM) a 8 x 104 - 2 x 105 células/mL (en dependencia del tipo de célula) y se colocaron alícuotas de 12,5 pL/pocillo en los 240 pocillos centrales de placas de cultivo de tejidos de los 384 pocillos (Corning CellBind, placas de pared negra); se colocaron alícuotas de 62,5 pL del medio de cultivo en los pocillos exteriores. Había 4 placas para cada línea celular. □ Las placas se incubaron durante la noche a 37 °C, en CO 2 humidificado al 5 %.

Preparación y colocación en placas de los fitocannabinoides (FBS al 1 %):

Los compuestos fitocannabinoides de prueba se prepararon en un vehículo de DMSO al 100 % a una concentración de disolución madre de 10 mM.

Dilución de un compuesto fitocannabinoide individual por sí solo:

A partir de la disolución madre de 10 mM, los compuestos se diluyeron hasta 125 pM en medio de cultivo libre de FBS.

Combinación de fitocannabinoides en una relación 1:1:

Se mezclaron juntos volúmenes iguales de disoluciones madre de 10 mM para dar una concentración final de 5 mM de cada compuesto. Estos se diluyeron en un medio de cultivo libre de FBS hasta 125 pM antes de la dilución en serie.

Combinación de fitocannabinoides en una relación 5:1:

Se añadieron 5 volúmenes de disolución madre de CBD de 10 mM a 1 volumen del otro agente (también a 10 mM) y 4 volúmenes de DMSO. Esto produjo una concentración final de 5 mM:1 mM. Luego, se diluyó en un medio de cultivo libre de FBS para que la concentración máxima de CBD fuera de 125 pM (antes de la dilución en serie). Cada disolución madre de compuesto y combinación de compuestos se diluyó en serie en un medio de cultivo libre de FBS (que contenía DMSO al 1,25 % v/v) de 125 pM a 41,7, 13,89, 4,63, 1,54, 0,514, 0,171, 0,057 y 0,019 pM (concentraciones finales de ensayo 1,25x). El vehículo se preparó a diluciones equivalentes en los medios de ensayo. La concentración final máxima del compuesto en el ensayo fue siempre 100 pM, por lo que CBD5:1CBG fue de 100 pM de CBD y 20 pM de CBG.

Controles positivos:

Se preparó el Taxotere SOC a una concentración de disolución madre de 1 mM en DMSO al 100 %. El Taxotere se diluyó en serie a partir de la disolución madre en un medio de cultivo libre de FBS hasta 12,5 pM, luego se diluyó en serie en un medio de cultivo libre de FBS que contenía DMSO al 1,25 % a 4,17, 1,39, 0,46, 0,154, 0,051, 0,017, 0,006, 0,002 pM (concentraciones finales de ensayo 1,25 x).

El Herceptin (en la formulación clínica) se diluyó en un medio libre de FBS y luego se diluyó en un medio libre de FBS hasta 1,25 pM. Luego, se diluyó en serie en un medio de cultivo libre de FBS hasta 0,417, 0,139, 0,046, 0,0154, 0,0051, 0,0017, 0,0006, 0,0002 pM (concentraciones finales de ensayo 1,25 x). Esto se colocó en placa como control positivo para las líneas celulares SKBR3 y BT474. Se añadieron 50 pL por pocillo de diluciones de compuesto/vehículo a las placas en repeticiones de 6. Cuando fue aplicable, el volumen total en el pocillo se completó hasta 62,5 pL con medio de ensayo. Condiciones del ensayo:

Las placas se incubaron por 72 h a 37 °C, en CO2 humidificado al 5 %. Para revelar las placas, a las 72 h, se añadieron 10 pL de reactivo CellTiter-BlueTM a cada pocillo de prueba/blanco. Las placas se incubaron a 37 °C, en CO2 humidificado al 5 %. La fluorescencia se midió mediante el uso de un lector de placas Flex II Station (longitud de onda de excitación de 570 nm, longitud de onda de emisión de 600 nm, corte de 590 nm) después de 3 h.

Concentración final del experimento con FBS al 10 %:

Las condiciones experimentales fueron las mismas que las del experimento anterior, con las mismas diluciones de compuestos y volúmenes para colocar en placa pero mediante el uso de medios de cultivo que contienen FBS al 10 % en lugar de medios libres de FBS.

Resultados

Los fitocannabinoides se probaron solos y en combinación con CBD en un panel de líneas de cáncer de mama (BT474, MDA-MB231, SKBR3) e hígado (HepG2). El valor de IC50 para cada fitocannabinoide se calculó tanto solo como en combinación en cada línea celular.

Los valores de los datos primarios expresados en unidades de fluorescencia relativa se normalizaron con respecto al vehículo para cada placa individual y cualquier reducción de la fluorescencia indicó una disminución de la viabilidad. Los datos se analizaron en GraphPad PRISM mediante el uso de un gráfico sigmoidal no lineal con pendiente variable (regresión lineal asimétrica de cinco puntos) y, cuando fue posible, se generó un valor de IC50 para cada compuesto individual y combinación. Mediante el uso de este análisis, donde los intervalos de confianza del 95 % del IC50 (generados automáticamente en GraphPad PRISM) para el CDB solo y en combinación no se superpusieron, esto se calificó como significativo (p<0,05).

Los valores de IC50 calculados se resumen en las Tablas 1 y 2 más abajo.

Tabla 1: Valores de IC50 de fitocannabinoides combinaciones en líneas celulares en presencia de FBS al 1 %

Tabla 2: Valores de IC50 de los fitocannabinoides combinaciones en líneas celulares en presencia de FBS al 10 %

Los valores de IC50 de los agentes fitocannabinoides solos y en combinación fueron inferiores en las células probadas en medios que contenían FBS al 1 % en comparación con al 10 %. Eso se debe probablemente al hecho de que estos compuestos se unen altamente a las proteínas plasmáticas y, por tanto, en los medios que contienen FBS al 10 %, las células disponen de menos compuesto para tener efecto.

En general, el CBD y el CBG por sí solos fueron más potentes que las variantes ácidas CBGA y CBDA en las líneas celulares probadas.

El THCV también fue generalmente más potente que el CBGA y el CBDA. Cada uno de los p tuvo un valor de IC50 similar contra cada una de las cinco líneas celulares probadas, con una variación de no más de 3 veces cuando se probó.

La única excepción a esto fue el THCV, que se midió como 5 veces más potente en las células LNCAP en comparación con las células DU145 en medios que contenían FBS al 10 %.

Cuando se probó el CBD en combinación con el CBG y el THCV en una relación 1:1 en las células BT474 en medios que contenían FBS al 1 %, hubo una disminución significativa en el valor de IC50 (p<0,05) en comparación con el tratamiento con CBD solo.

Cuando se probó el CBD en combinación con el CBG y el THCV en una relación 1:1 en las células HepG2 hubo una disminución significativa en el valor de IC50 (p<0,05) en comparación con el tratamiento con CBD solo. También hubo un aumento significativo en el valor de IC50 (p<0.05) cuando el CBD se probó en una combinación de 1:1 con el CBDA en comparación con el tratamiento con CBD solo.

Cuando se probó el CBD en las células HepG2 (cáncer de hígado) en combinación con los fitocannabinoides en una relación 5:1, hubo una diferencia significativa en el valor de IC50 (p<0,05) de las combinaciones del CBDA y el THCV en comparación con el tratamiento con CBD solo.

Hubo una disminución significativa en el valor de IC50 (p<0,05) cuando se probó el CBD en combinación con el CBG en las células SKBR3 en medios que contenían FBS al 10 %.

Hubo una tendencia general en todas las líneas celulares probadas a que los valores de IC50 de las combinaciones de 1:1 de CBD con CBG y THCV fueran inferiores que el valor de IC50 del CBD solo en la misma línea celular.

Generación de los valores del índice de combinación (CI) del CBD en combinación con otros fitocannabinoides mediante el uso del método Chou-Talalay

Para el cálculo, los valores de los datos primarios expresados en unidades de fluorescencia relativa se normalizaron con respecto al vehículo para cada placa individual (establecido como 0 %) y la reducción de la fluorescencia se calculó como un aumento en la inhibición de la viabilidad.

Los datos se formatearon en Excel para cada placa de ensayo, de manera que se pudiera determinar el efecto promedio en cada concentración para cada fitocannabinoide por separado y cada una de las combinaciones.

Los datos medios en cada concentración de CBD se importaron al paquete de análisis Calcusyn. El software Calcusyn fue diseñado por M. Hayball y C.W. Lamble y calcula los valores del índice de combinación (CI) basándose en la fórmula de Chou y Talalay (Chou y Talalay, 1984). Mediante el uso de Calcusyn, el valor del CI de cada una de las combinaciones de CBD para cada línea celular se determinó en los valores de dosis efectiva del CBD al 50, 75, 90 y 95 %. Éstos se resumen en las Tablas 4 a 13. También se calculó el índice de combinación ponderado (Clwt), calculado mediante el uso de la ecuación Clwt = (IC50 2CI75 3CI90 4CI95)/10 (Chou, 2006).

La Tabla 3 contiene los resúmenes descriptivos de varios valores de IC de acuerdo con Chou y también contiene un glosario de términos de los datos reportados en tablas posteriores.

Tabla 3. Descripciones verbales de siner ismo anta onismo si nificado de los términos usados en las Tablas 4 a 13

Las descripciones verbales de CI en las Tablas 4 a 7 se basan en el Clwt.

Células de cáncer de mama BT474 sensibles a las hormonas.

Cuando se probó el efecto sobre la viabilidad de las células BT474 del CBD en combinación con los fitocannabinoides, las combinaciones de 1:1 de CBG con THCV en las células probadas en los medios que contenían FBS al 1 % dieron valores de Clwt que se calificaron como sinergismo moderado (Tabla 4).

Todas las demás combinaciones en estas condiciones se calificaron dentro del intervalo de antagonismo.

Tabla 4. Valores de CI de combinaciones de CBD:fitocannabinoides en células BT474 en FBS al 1 %

Células de cáncer de mama MDA-MB-231

En las células MDA-MB-231, los valores de Clwt generados mostraron que el efecto sobre la viabilidad de las células del CBD en combinación con los fitocannabinoides se calificó dentro del intervalo de sinergismo o casi aditivo para todas las combinaciones, excepto las combinaciones de 1:1 con CBG y CBGA en medios que contenían FBS al 1 % (Tabla 5).

Tabla 5. Valores de CI de combinaciones de CBD:fitocannabinoides en células MDA-MB-231 en FBS al 1 %

Células de cáncer de mama SKBR3

Cuando se probaron las células SKBR3 con combinaciones de CBD:fitocannabinoides en medios que contenían FBS al 1 %, se observó el mayor efecto de combinación en las células tratadas con la combinación de CBD:THCV, donde el Clwt se calificó como sinergismo (Tabla 6).

Tabla 6. Valores de CI de combinaciones de CBD:fitocannabinoides en células SKBR3 en FBS al 1 %

Discusión

El objetivo del estudio fue examinar in vitro los efectos del CBD en combinación con cuatro compuestos fitocannabinoides (CBG, CBGA, CBDA y THCV) sobre la viabilidad de tres líneas celulares de cáncer de mama y una línea celular de cáncer de hígado, para determinar si las combinaciones demostraron ser significativamente aditivas, antagónicas o sinérgicas, mediante el uso de la significación estadística o el método Chou-Talalay.

Los valores de IC50 del fitocannabinoide:

Los valores de IC50 para cada agente fitocannabinoide individual se generaron para cada línea celular sola y en combinación para generar datos de CI.

En resumen, se observaron las siguientes observaciones en este estudio para el fitocannabinoide probado como agente individual:

La potencia del fitocannabinoide en FBS al 10 % fue inferior al 1 %, lo que probablemente se deba a la unión al plasma. En general, cada agente individual tuvo un valor de IC50 similar en el panel de 6 líneas celulares, independientemente de la sensibilidad hormonal de cada línea (BT474 es sensible a las hormonas).

Además, el CBD y el CBG por sí solos fueron más potentes que las variantes ácidas CBDA y CBGA en las líneas celulares probadas.

Efecto del índice de combinación de los fitocannabinoides en presencia de CBD:

El método de Chou y Talalay usa el principio del efecto mediano basado en la ley de acción de masas para calcular el CI de dos agentes juntos. El método tiene en cuenta tanto la potencia de un compuesto en particular (Dm) como el parámetro de forma de la curva (m) de cada agente de prueba por sí solo (en este caso, el CBD y los agentes fitocannabinoides), así como la Dm y la m de los dos agentes en combinación (Chou, 2006).

Debido a que se tiene en cuenta el parámetro de forma, es posible tener valores inferiores de Dm del CBD y del fitocannabinoide en combinación en comparación con el CBD y el fitocannabinoide por sí solos, pero el valor de CI calculado es mayor que 1, por lo que el efecto combinado se clasifica como antagonismo.

Los efectos aditivos, de sinergismo y antagonismo del CBD en combinación con los fitocannabinoides en el panel de líneas celulares de cáncer de mama en medios que contienen FBS al 1 % tras el análisis mediante el uso del método de Chou y Talalay se resumen en la Tabla 7.

Tabla 7. Resumen de las calificaciones del Clwt para cada combinación en cada línea celular en medios que contienen FBS al 1 %.

En resumen, se observaron las siguientes observaciones en este estudio para el fitocannabinoide probado como combinación:

La combinación de CBD que pareció tener el mayor efecto sobre el sinergismo en todas las líneas celulares fue el CBD en combinación con THCV en una relación 1:1. Los efectos de esta combinación dieron valores de Clwt que se calificaron dentro del intervalo sinérgico o casi aditivo en todas las líneas celulares de cáncer de mama BT474, MDA-MB-231, SKBR3.

El CBD en combinación con el CBG en una relación 1:1 fue sinérgico en la línea celular BT474.

La línea celular donde el efecto de las combinaciones pareció tener el mayor efecto fue la línea MDA-MB-231 donde todas las combinaciones, excepto CBD:CBG y CBD:CBGA dieron valores de Clwt que calificaron dentro del intervalo de sinergismo o fueron casi aditivos.

El CBD parece ser más efectivo en combinación con el THCV o el CBG en una relación 1:1 en dependencia de la línea celular. Las células de cáncer de mama MDA-MB-231 parecen ser más sensibles a las combinaciones de CBD : fitocannabinoides.

Ejemplo 2: eficacia de los fitocanabinoides solos y en combinación en líneas celulares de cáncer de pulmón, páncreas, piel, ovarios, estómago, riñón y vejiga

Materiales y métodos

Líneas celulares:

Las siguientes líneas celulares se probaron en este ejemplo: cáncer de pulmón (A549, NCI-H460); cáncer de páncreas (PANC1, Mia-Pa-Ca-2); melanoma (WM115, A375); cáncer de ovario (o Vc AR3, SKOV3); cáncer de estómago (MKN45, HGC-27); cáncer de riñón (ACHN) y cáncer de vejiga (RT112).

Preparaciones de fitocannabinoides:

Los fitocannabinoides probados fueron los siguientes: cannabidiol (CBD); ácido cannabidiólico (CBDA); cannabigerol (CBG); ácido cannabigerólico (CBGA); tetrahidrocannabivarina (THCV); y tetrahidrocannabinol (THC).

Los agentes de control positivo usados fueron el Taxotere (Docetaxel), el cisplatino y la gemcitabina.

Preparación de las células:

Cada línea de células tumorales se mantuvo in vitro en RPMI 1640 FBS al 10 % inactivado por calor y L-glutamina 2 mM (medio de cultivo) a 37 °C en CO2 al 5 % y condiciones de humedad. Las células se recogieron, se lavaron, se resuspendieron en medio de cultivo y se contaron. Las células se resuspendieron en medio de ensayo (RPMI 1640 FBS al 5 % inactivado por calor y L-glutamina 2 mM) a 4 x 104 células/mL (en dependencia del tipo de célula) y se colocaron en placas en los 240 pocillos centrales de placas de cultivo de tejidos de los 384 pocillos (Corning CellBind, placas de pared negra) alícuotas de 25 pL/pocillo; se tomaron alícuotas de 50 pL del medio de cultivo en los pocillos exteriores. Había 3 placas para cada línea celular.

Las placas se incubaron durante la noche a 37 °C, en CO2 humidificado al 5 %.

Preparación y colocación en placas de los fitocannabinoides (FBS al 1 %):

Los compuestos fitocannabinoides de prueba se prepararon en un vehículo de DMSO al 100 % a una concentración de disolución madre de 20 y 40 mM.

Dilución de un compuesto cannabinoide individual por sí solo:

A partir de la disolución madre de 20 mM en DMSO, esta se diluyó en serie (2 veces) en DMSO en una placa de 96 pocillos, hasta 20 (sin dilución), 10, 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,315, 0,157 y 0,79 mM. A continuación, se diluyeron 10 uL de cada dilución de compuesto en 990 uL de medio FBS al 1 % (v/v) en un bloque de pocillos profundos para obtener las concentraciones finales de 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,56 y 0,79 pM (concentraciones finales de ensayo 2x y DMSO al 1 %).

Todos los compuestos en relación 1:1:

Se mezcló un volumen igual de cada cannabinoide en la combinación (concentración de disolución madre de 40 mM) para hacer una disolución madre de 20 mM de cada cannabinoide en DMSO. Esta se diluyó en serie (2 veces) en DMSO en una placa de 96 pocillos, hasta 20 (sin dilución), 10, 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,315, 0,157 y 0,79 mM. A continuación, se diluyeron 10 uL de cada dilución de combinación en 990 uL de medio FBS al 1 % (v/v) en un bloque de pocillos profundos para obtener las concentraciones finales de 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,56 y 0,79 pM (concentraciones finales de ensayo 2x y DMSO al 1 %).

Controles positivos

Se preparó el Taxotere SOC en DMSO al 100 % para dar una concentración de disolución madre de 10 mM. Esta se diluyó en DMSO a partir de la disolución madre hasta 200 pM, luego se diluyó en serie (3 veces) en DMSO hasta 200 (sin dilución), 66,66, 22,22, 7,41,2,47, 0,82, 0,27, 0,09, 0,03 pM. Se diluyeron 10 pL de cada una de las diluciones del taxotere en 990 pL de medio FBS al 1 % (v/v) para obtener las concentraciones finales de 2, 0,67, 0,22, 0,074, 0,0247, 0,0082, 0,0027, 0,0009, 0,0003 pM (concentraciones finales de ensayo 2 x y DMSO al 1 %).

Se preparó la gemcitabina SOC en DMSO al 100 % para dar una concentración de disolución madre de 20 mM. Luego esta se diluyó en serie (3 veces) en DMSO en una placa de 96 pocillos, hasta 20 (sin dilución), 6,6, 2,2, 0,741, 0,247, 0,082, 0,027, 0,009 y 0,003 mM. A continuación, 10 uL de cada dilución se diluyeron adicionalmente en 990 uL de medio FBS al 1 % (v/v) para obtener las concentraciones finales de 200 (sin dilución), 66,66, 22,22, 7,41, 2,47, 0,82, 0,27, 0,09, 0,03 pM (concentraciones finales de ensayo 2x y DMSO al 1 %).

Se diluyó el cisplatino (disolución madre de 1 mg/mL=3,33 mM en agua) en un medio de FBS al 1 % para dar una concentración de disolución madre de 1 mM. Luego, esto se diluyó en el medio FBS al 1 % a partir de la disolución madre hasta 200 pM, luego se diluyó en serie (3 veces) en el medio Fb S al 1 % hasta 200 (sin dilución), 66,66, 22,22, 7,41,2,47, 0,82, 0,27, 0,09, 0,03 pM (concentraciones finales de ensayo 2 x; sin DMSO).

Condiciones del ensayo:

Las placas se incubaron por 72 h a 37 °C, en CO2 humidificado al 5 %. Para revelar las placas, a las 72 h, se añadieron 10 pL de reactivo CellTiter-Blue™ a cada pocillo de prueba/blanco.

Las placas se incubaron a 37 °C, en CO2 humidificado al 5 %. La fluorescencia se midió mediante el uso de un lector de placas Flex II Station (longitud de onda de excitación de 570 nm, longitud de onda de emisión de 600 nm, corte de 590 nm) después de 3 h.

Resultados

Los compuestos fitocannabinoides CBD, CBGA, CBG, CBDA, THCV y THC se probaron en un panel de líneas celulares de cáncer de pulmón (A549, NCI-H460), páncreas (PANC1, Mia-Pa-Ca-2), melanoma (WM115, A375), ovario (OVCAR3, SKOV3), estómago (Mk N45, HGC-27), riñón (ACHN) y vejiga (RT112) de acuerdo con el protocolo durante 72 h en un medio que contiene FBS al 1 %.

Se calcularon los valores IC50 de cada fitocannabinoide y de la combinación de CBD con los otros fitocannabinoides para cada línea celular. Los valores de los datos primarios expresados en unidades de fluorescencia relativa se normalizaron con respecto al vehículo para cada placa individual y cualquier reducción de la fluorescencia indicó una disminución de la viabilidad.

Las Tablas 8 y 9 más abajo proporcionan los valores de IC50 para los fitocannabinoides y las combinaciones de fitocannabinoides.

Tabla 8: Los valores de IC50 de los fitocannabinoides y combinaciones de CBD:fitocannabinoides en líneas celulares en presencia de FBS al 1 %

Tabla 9: Los valores de IC50 de los fitocannabinoides y combinaciones de CBD:fitocannabinoides en líneas celulares en presencia de FBS al 1 %

Este cálculo fue como se describió en el Ejemplo 1 anterior.

Células A549 (NSCLC de pulmón):

Cuando se probó el efecto sobre la viabilidad de las células A549 del CBD en una combinación de 1:1 con los fitocannabinoides en los medios que contenían FBS al 1 %, las combinaciones con CBG y THCV dieron valores de CIwt que se calificaron en el intervalo sinérgico (Tabla 10).

Las combinaciones CBD:CBDA y CBD:THC dieron un Clwt que se calificó como casi aditivo. La combinación CBD:CBGA calificó como ligeramente antagonista.

Tabla 10. Valores del índice de combinación de combinaciones de CBD:fitocannabinoides en células A549 en FBS al 1

%

Células H460 (NSCLC de pulmón)

Cuando se probó el efecto sobre la viabilidad de las células H460 del CBD en una combinación de 1:1 con los fitocannabinoides en los medios que contenían FBS al 1 %, todas las combinaciones dieron valores de CIwt que se calificaron en el intervalo sinérgico (Tabla 11).

Tabla 11. Valores del índice de combinación de combinaciones de CBD:fitocannabinoides en células NCI-H460 en FBS al 1 %

Células PANC-1 (cáncer de páncreas)

Cuando se probó el efecto sobre la viabilidad de las células PANC-1 del CBD en una combinación de 1:1 con los fitocannabinoides en los medios que contenían FBS al 1 %, las combinaciones con CBG, THCV y THC dieron valores de CIwt que se calificaron en el intervalo sinérgico (Tabla 12). Las combinaciones CBD:CBGA y c BD:CBDA dieron un CIwt que se calificó como antagonismo moderado.

Tabla 12. Valores del índice de combinación de combinaciones de CBD:fitocannabinoides en células PANC-1 en FBS al

1 %

Células MIA-PA-CA2 (cáncer de páncreas)

Cuando se probó el efecto sobre la viabilidad de las células MIA-PA-CA2 del CBD en una combinación de 1:1 con los fitocannabinoides en los medios que contenían FBS al 1 %, las combinaciones con CBG, CBDA, THCV y THC dieron valores de CIwt que se calificaron en el intervalo sinérgico o casi aditivo (Tabla 13). Las combinación CBD:CBGA dio un CIwt que se calificó como antagonismo moderado.

Tabla 13. Valores del índice de combinación de combinaciones de CBD:fitocannabinoides en las células MIA-PA-CA2 en FBS al 1 %

Células WM115 (melanoma)

Cuando se probó el efecto sobre la viabilidad de las células WM115 del CBD en una combinación de 1:1 con los fitocannabinoides en los medios que contenían FBS al 1 %, todas las combinaciones dieron valores de CIwt que se calificaron en el intervalo sinérgico (Tabla 14).

Tabla 14. Valores del índice de combinación de combinaciones de CBD:fitocannabinoides en células WM115 en FBS al

1 %

Células A375 (melanoma)

Cuando se probó el efecto sobre la viabilidad de las células A375 del CBD en una combinación de 1:1 con los fitocannabinoides en los medios que contenían FBS al 1 %, las combinaciones de CBD con CBG y THCV dieron valores de CIwt que se calificaron como sinergismo moderado mientras que las otras tres combinaciones se calificaron en el intervalo de antagonismo (Tabla 15).

Tabla 15. Valores del índice de combinación de combinaciones de CBD:fitocannabinoides en células A375 en FBS al 1

%

Células OVCAR3 (cáncer de ovario)

Cuando se probó el efecto sobre la viabilidad de las células OVCAR3 del CBD en una combinación de 1:1 con los fitocannabinoides en los medios que contenían FBS al 1 %, las combinaciones de CBD con CBG, CBGA, CBDAy THCV dieron valores de CIwt que se calificaron en el intervalo de sinergismo mientras que la combinación de CBD con THC se calificó como casi aditivo (Tabla 16).

Tabla 16. Valores del índice de combinación de combinaciones de CBD:fitocannabinoides en células OVCAR3 en FBS al 1 %

Células SKOV3 (cáncer de ovario)

Cuando se probó el efecto sobre la viabilidad de las células SKOV3 del CBD en una combinación de 1:1 con los fitocannabinoides en los medios que contenían FBS al 1 %, las combinaciones de CBD con CBG y THCV dieron valores de CIwt que se calificaron como sinergismo. Las combinaciones de CBD con CBDA y THC dieron valores de CIwt que se calificaron como casi aditivos, mientras que la combinación de CBD con CBGA se calificó como antagonismo ligero (Tabla Tabla 17. Valores del índice de combinación de combinaciones de CBD:fitocannabinoides en células SKOV3 en FBS al

1 %

Células MKN45 (cáncer de estómago)

Cuando se probó el efecto sobre la viabilidad de las células MKN45 del CBD en una combinación de 1:1 con los fitocannabinoides en los medios que contenían FBS al 1 %, las combinaciones de CBD con CBG, THCV y THC dieron valores de CIwt que se calificaron en el intervalo de sinergismo. Las combinaciones de CBD con CBGA y CBDA dieron valores de CIwt que se calificaron como casi aditivos (Tabla 18).

Tabla 18. Valores del índice de combinación de combinaciones de CBD:fitocannabinoides en células MKN45 en FBS al

1 %

Células HGC27 (cáncer de estómago)

Cuando se probó el efecto sobre la viabilidad de las células HGC27 del CBD en una combinación de 1:1 con los fitocannabinoides en los medios que contenían FBS al 1 %, las combinaciones de CBD con CBG, THCV y THC dieron valores de CIwt que se calificaron como casi aditivos. Las combinaciones de CBD con CBGA y CBDA dieron valores de CIwt que se calificaron como antagonismo (Tabla 19).

Tabla 19. Valores del índice de combinación de combinaciones de CBD:fitocannabinoides en células HGC27 en FBS al

1%

Células ACHN (cáncer de riñón)

Cuando se probó el efecto del CBD sobre la viabilidad de las células ACHN en una combinación de 1:1 con los fitocannabinoides en los medios que contenían FBS al 1 %, las combinaciones de CBD con THCV y THC dieron valores de CIwt que se calificaron como sinergismo y sinergismo ligero respectivamente. Las combinaciones de CBD con CBG y CBGA dieron valores de CIwt que se calificaron como casi aditivos. La combinación de CBD con CBDA se calificó como antagonismo moderado (Tabla 20).

Tabla 20. Valores del índice de combinación de combinaciones de CBD:fitocannabinoides en células ACHN en FBS al 1

%

Células RT112 (cáncer de vejiga)

Cuando se probó el efecto sobre la viabilidad de las células RT112 del CBD en una combinación de 1:1 con los fitocannabinoides en los medios que contenían FBS al 1 %, la combinación de CBD con CBG dio un valor de ICwt que se calificó como sinergismo moderado. Las combinaciones de CBD con THCV y THC dieron valores de CIwt que se calificaron como casi aditivos. Las combinaciones de CBD con CBGA y CBDA dieron valores de CIwt que se calificaron como antagonismo moderado (Tabla 21).

Tabla 21. Valores del índice de combinación de combinaciones de CBD:fitocannabinoides en células RT112 en FBS al 1

%

Discusión

El objetivo de este ejemplo fue examinar in vitro los efectos de los fitocannabinoides como agentes individuales y también en combinación con el CBD sobre la viabilidad de varias líneas celulares de cáncer diferentes para determinar si las combinaciones demostraron ser aditivas, antagónicas o sinérgicas mediante el uso del método de Chou y Talalay. Efecto del combinaciones de CBD:fitocannabinoides

El método de Chou y Talalay usa el principio del efecto mediano basado en la ley de acción de masas para calcular el CI de dos agentes juntos. El método tiene en cuenta tanto la potencia de un compuesto particular (Dm) como el parámetro de forma de la curva (m) de cada agente de prueba por sí solo, así como la Dm y la m de los agentes en combinación. Los datos del índice de combinación de Chou y Talalay para cada línea celular se encuentran en las Tablas 13 a 24. El resumen de las calificaciones del índice de combinación ponderado se resume en la Tabla 22.

Tabla 22. Resúmenes de los índices de combinación de combinaciones de CBD:fitocannabinoides en las líneas celulares

En resumen, en este estudio se observaron las siguientes observaciones mediante el uso del método de Chou y Talalay para los CBD:fitocannabinoides probados en combinaciones:

Las líneas celulares más susceptibles a las combinaciones de CBD:fitocannabinoides son H460 de pulmón y WM115 de melanoma; donde cada combinación de CBD:fitocannabinoide se calificó en el intervalo sinérgico.

Las combinaciones de CBD:fitocannabinoides que se calificaron en el intervalo sinérgico o casi aditivo en todas las líneas celulares fueron CBD1:CBG1 y CBD1:THCV1.

La combinación que fue menos efectiva y calificó en el intervalo antagónico en 7 de las líneas celulares fue CBD1:CBGA1, seguida de cerca por CBD1:CDBA1 que calificó en el intervalo antagónico en 5 líneas celulares.

Este estudio muestra que los compuestos fitocannabinoides, en las condiciones probadas, tienen un efecto citotóxico claro sobre muchos tipos diferentes de células de líneas celulares de cáncer y proporciona datos de potencia similares al Ejemplo 1 en el que se probaron líneas celulares de mama, próstata e hígado.

En general, este estudio demostró que cuando el CBD se combina con otros fitocannabinoides, tienen el potencial de actuar de forma sinérgica sobre la viabilidad de varios tipos de cáncer diferentes.

Referencias

Baek y otros (1996) Archives of Pharmacol Research, vol 19, No. 3, 1996, páginas 228-230 "Synthesis and anti-tumour activity of cannabigerol"

Choi y otros (2008) Biomolecules & Therapeutics, vol 16, 2008, páginas 87-94 "Cannabidiol induces cytotoxicity and cell death via apotopic pathway in cancer cell lines"

Chou T.-C. & Talalay P. Adv. Enzyme Regul. 22:27-55 (1984)

Chou T.-C. Pharmacol. Rev. 58:621-681 (2006)

Ligresti y otros JPET 318:1375-1387 (2006)

McAllister SD, Christian RT, Horowitz MP, García A, Desprez PY. Mol Cancer Ther. (2007) Nov;6(11):2921-7.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un ingrediente farmacéutico activo (IFA) que comprende o consiste esencialmente en cannabidiol (CBD) y cannabigerol (CBG) para su uso en el tratamiento del melanoma, en donde el CBD y el CBG están presentes en una relación 1:1 (CBD:CBG).

2. Un ingrediente farmacéutico activo (IFA) para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la dosis del IFA está entre 1 y 1000 mg/kg día.

3. Una formulación farmacéutica que comprende el IFA de acuerdo con la reivindicación 1, para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores y uno o más excipientes.

4 Una formulación farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el CBD puede formularse para su administración por separado, secuencial o simultáneamente con el CBG o la combinación puede proporcionarse en una forma de dosificación única.