ES2880017T3 - Agentes para su uso en el tratamiento de glioma - Google Patents

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Abstract

Un agente para su uso en el tratamiento del glioma en un sujeto interfiriendo con (a) la invasión y/o (b) la proliferación y/o (c) la comunicación intracelular y/o (d) la resistencia a radioterapia y/o quimioterapia de células de glioma mediadas por microtubos de tumor (TM), en donde dicho agente se selecciona del grupo que consiste en: (a1) un agente que es capaz de mediar la interferencia de ARN (iARN) para la atenuación génica específica del gen de la proteína 43 asociada al crecimiento (GAP43), en donde dicho agente se selecciona del grupo que consiste en ARN inhibidores pequeños (ARNip), microARN (miARN), ARN en horquilla pequeños (ARNhp), oligonucleótidos antisentido y ARN antisentido (ARNas) y en donde dicho agente está dirigido a una de las secuencias de ácido nucleico establecidas en SEQ ID NO: 1 a 5; (a2) un agente que es capaz de mediar la interferencia de ARN (iARN) para la atenuación génica específica del gen de la proteína 43 asociada al crecimiento (GAP43), en donde dicho agente es un oligonucleótido antisentido de ADN (ADNas) que comprende una de las secuencias de ácido nucleico establecidas en SEQ ID NO: 6 a 8 o un ARNas que comprende una de las secuencias de ácido nucleico establecidas en SEQ ID NO: 9 a 11; (b) un compuesto que es capaz de inhibir la actividad biológica de la proteína GAP43, en donde dicho compuesto es un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o un mimético de anticuerpo que se une específicamente a la proteína GAP43; (c) un agente que es capaz de mediar iARN para la atenuación génica específica del gen tweety humano homólogo 1 (Ttyh1), en donde dicho agente se selecciona del grupo que consiste en ARN inhibidores pequeños (ARNip), microARN (miARN), ARN en horquilla pequeños (ARNhp), oligonucleótidos antisentido y ARN antisentido (ARNas) y en donde dicho agente está dirigido a una de las secuencias de ácido nucleico establecidas en SEQ ID NO: 12 a 16; (d) un compuesto que es capaz de inhibir la actividad biológica de la proteína TTYH-1, en donde dicho compuesto es un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o un mimético de anticuerpo que se une específicamente a la proteína TTYH-1; (e) un agente que es capaz de mediar la interferencia de ARN (iARN) para la atenuación génica específica del gen de la conexina 43 (Cx43), en donde dicho agente se selecciona del grupo que consiste en ARN inhibidores pequeños (ARNip), microARN (miARN), ARN en horquilla pequeños (ARNhp), oligonucleótidos antisentido y ARN antisentido (ARNas) y en donde dicho agente está dirigido a la secuencia de ácido nucleico establecida en SEQ ID NO: 21; (f1) un compuesto que es capaz de inhibir la actividad biológica de la conexina 43 (Cx43), en donde dicho compuesto es un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o un mimético de anticuerpo que se une específicamente y/o bloquea funcionalmente Cx43; y (f2) un compuesto que es capaz de inhibir la actividad biológica de la conexina 43 (Cx43), en donde dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste en el péptido Gap 26 que bloquea la unión comunicante (SEQ ID NO: 17); péptido bloqueador de uniones comunicantes Gap 27 (SEQ ID NO: 18); ácido glicirretínico; quinina; anandamida; octanol; heptanol; ácido antranílico; ácido fenámico; ácido retinoico; y tonabersat.

Description

DESCRIPCIÓN
Agentes para su uso en el tratamiento de glioma
La presente invención se refiere a agentes para su uso en el tratamiento de glioma, en particular astrocitoma WHO II° y III°, así como IV° (glioblastoma), en un sujeto.
Los gliomas tales como tumores cerebrales astrocíticos, incluyendo glioblastomas, son neoplasias incurables caracterizadas por un crecimiento infiltrante difuso. Los astrocitomas (OMS II°, III°, IV° = glioblastomas) son ejemplos prototípicos de tumores altamente invasivos que colonizan difusamente su órgano hospedador, que en última instancia conduce a la disfunción neurológica y la muerte a pesar de la radioterapia y la quimioterapia intensivas. Los mecanismos celulares y/o moleculares de invasividad y resistencia a la terapia no se conocen bien hasta ahora. La terapia clásica de astrocitoma incluyendo glioblastoma incluye la resección quirúrgica de la parte sólida del tumor, radioterapia y quimioterapia. Sin embargo, hasta ahora estas terapias solo pueden retrasar la progresión de la enfermedad. No se conocen casos en que el astrocitoma o el glioblastoma puedan curarse.
Los oligodendrogliomas comparten el patrón de crecimiento infiltrante en el cerebro, pero son mucho más vulnerables a la intervención terapéutica que los astrocitomas. La presencia de su característica codeleción 1p/19q se asocia a una alta capacidad de respuesta a la radioterapia y quimioterapia combinada en oligodendrogliomas y los hace propensos a la apoptosis incluso sin terapia. La razón de eso sigue sin estar clara, igual que el mecanismo o mecanismos específicos de la resistencia en astrocitomas.
El documento WO2009/096615A1 describe una composición que contiene cafeína como un principio activo para prevenir y/o tratar tumores cerebrales. Eyler et al. (2011; Cell 146: 53-56) describe la promoción de la proliferación de células madre de glioma y el crecimiento tumoral por la óxido nítrico sintasa-2. El documento WO03/015713A2 describe un método para tratar tumores gliales, que comprende la administración de un antagonista del glutamato o un antagonista del receptor NMDA. Xie et al. (2009; Cancer Letters 282: 35-42) describe la inhibición de la proliferación y migración de células gliales malignas por el anestésico pentobarbital. Zhang et al. (2011; Cancer Research 71: 7155-7167) describe cómo el bloqueo de la señalización de TGF-p por un inhibidor de la quinasa TGF R-I mejora las respuestas a la radiación y prolonga la supervivencia en el glioblastoma. El documento WO2015/017034A1 describe métodos de tratamiento del cáncer basados en la alteración dirigida de la interacción entre la alfa conexina-43 y la ZO-I (zonula occludens-I). Jacobs et al. (2012; Neuro-Oncology 14: 119-131) describe una disminución del crecimiento tumoral en un modelo animal de glioblastoma multiforme por propentofilina.
En consecuencia, el problema técnico subyacente a la presente invención es proporcionar nuevos agentes para su uso en el tratamiento de glioma, en particular astrocitoma y glioblastoma, en un sujeto.
La solución al problema técnico anterior se logra mediante las realizaciones caracterizadas en la reivindicación. En particular, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un agente para su uso en el tratamiento de glioma en un sujeto, en donde dicho agente es capaz de interferir con (a) invasión y/o (b) proliferación y/o (c) comunicación intracelular y/o (d) resistencia a la radioterapia y/o quimioterapia de células de glioma mediada por microtubos tumorales (TM), en donde dicho agente se selecciona del grupo que consiste en:
(a1) un agente que es capaz de mediar la interferencia de ARN (iARN) para la atenuación génica específica del gen de la proteína 43 asociada al crecimiento (GAP43), en donde dicho agente se selecciona del grupo que consiste en ARN inhibidores pequeños (ARNip), microARN (miARN), ARN en horquilla pequeños (ARNhp), oligonucleótidos antisentido y ARN antisentido (ARNas) y en donde dicho agente está dirigido a una de las secuencias de ácido nucleico establecidas en SEQ ID NO: 1 a 5;
(a2) un agente que es capaz de mediar la interferencia de ARN (iARN) para la atenuación génica específica del gen de la proteína 43 asociada al crecimiento (GAP43), en donde dicho agente es un oligonucleótido antisentido de ADN (ADNas) que comprende una de las secuencias de ácido nucleico establecidas en SEQ ID NO: 6 a 8 o un ARNas que comprende una de las secuencias de ácido nucleico establecidas en SEQ ID NO: 9 a 11;
(b) un compuesto que es capaz de inhibir la actividad biológica de la proteína GAP43, en donde dicho compuesto es un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o un mimético de anticuerpo que se une específicamente a la proteína GAP43;
(c) un agente que es capaz de mediar iARN para la atenuación génica específica del gen tweety humano homólogo 1 (Ttyhl), en donde dicho agente se selecciona del grupo que consiste en ARN inhibidores pequeños (ARNip), microARN (miARN), ARN en horquilla pequeños (ARNhp), oligonucleótidos antisentido y ARN antisentido (ARNas) y en donde dicho agente está dirigido a una de las secuencias de ácido nucleico establecidas en SEQ ID NO: 12 a 16;
(d) un compuesto que es capaz de inhibir la actividad biológica de la proteína TTYH-1, en donde dicho compuesto es un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o un mimético de anticuerpo que se une específicamente a la proteína TTYH-1;
(e) un agente que es capaz de mediar la interferencia de ARN (iARN) para la atenuación génica específica del gen de la conexina 43 (Cx43), en donde dicho agente se selecciona del grupo que consiste en ARN inhibidores pequeños (ARNip), microARN (miARN), ARN en horquilla pequeños (ARNhp), oligonucleótidos antisentido y ARN antisentido (ARNas) y en donde dicho agente está dirigido a la secuencia de ácido nucleico establecida en SEQ ID NO: 21;
(f1) un compuesto que es capaz de inhibir la actividad biológica de la conexina 43 (Cx43), en donde dicho compuesto es un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o un mimético de anticuerpo que se une específicamente y/o bloquea funcionalmente Cx43; y (f2) un compuesto que es capaz de inhibir la actividad biológica de la conexina 43 (Cx43), en donde dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste en el péptido Gap 26 que bloquea la unión comunicante (SEQ ID NO: 17); péptido bloqueador de uniones comunicantes Gap 27 (SEQ ID NO: 18); ácido glicirretínico y derivados del mismo; quinina y derivados de la misma; anandamida; octanol; heptanol; ácido antranílico y derivados del mismo; ácido fenámico y derivados del mismo; anestésicos; ácido retinoico; y tonabersat.
La presente invención se basa en el descubrimiento de que muchas células tumorales en gliomas, en particular en astrocitomas y glioblastomas, extienden protrusiones de membrana ultralargas, tanto en cerebros de ratones vivos como en muestras de pacientes. Estas protrusiones, para las cuales se propone el término microtubos tumorales (TM), tienen características anatómicas y funcionales distintas. Las células de astrocitoma usan los TM como rutas para la invasión cerebral, proliferación y para interconectarse con otras células infiltrantes a largas distancias. La red celular ligada a TM resultante permite el intercambio intercelular de moléculas a través de uniones comunicantes de conexina 43 (Cx43), incluyendo la comunicación por ondas de calcio intercelulares (ICW, por sus siglas en inglés). Las TM se usan para detectar lesiones a los miembros de la red y para ejecutar una reparación de daños. Por otra parte, las células de astrocitoma conectadas a TM, pero no aquellas que permanecen desconectadas a lo largo de la progresión del tumor, están protegidas de la muerte celular infringida por la radioterapia. Se requirió la retención de los cromosomas 1p y 19q para la formación de TM intercelular y para una alta expresión de las proteínas asociadas al crecimiento neuronal GAP43 y Ttyh1. La atenuación génica de GAP43 inhibió la formación de TM y la interconexión de células tumorales impulsada por TM, lo que dio como resultado una notable reducción de la progresión del astrocitoma y la radiorresistencia. La atenuación génica de Ttyh1 inhibió drásticamente el crecimiento y la invasión de astrocitomas impulsados por TM, haciendo que los tumores no puedan crecer a un tamaño relevante en el cerebro. En resumen, las células de astrocitoma invasoras se conectan mediante TM a una red celular funcional. La desconexión de las células tumorales dirigidas a las TM surge como un nuevo paradigma para reducir la notoria resistencia al tratamiento de esta enfermedad.
El glioma a tratar puede seleccionarse del grupo que consiste en tumores cerebrales ricos en TM, en particular oligodendroglioma recurrente y astrocitoma primario y recurrente WHO II° y WHO III°, y glioblastoma (= astrocitoma who °IV). Además, el sujeto a tratar es preferentemente un ser humano.
De acuerdo con una primera realización, el agente para su uso de acuerdo con la presente invención es un agente que es capaz de mediar la interferencia de ARN (iARN) para la atenuación génica específica del gen de la proteína 43 asociada al crecimiento (GAP43), en donde el agente es como se definió anteriormente.
GAP43 se ha identificado en la presente invención como un factor importante para el desarrollo de TM y la función de los mismos. Generalmente, GAP43 es un factor para el crecimiento de las conexiones entre las células nerviosas durante el desarrollo embrionario y se regula negativamente en el sistema nervioso central (SNC) adulto. Además, está conectado a la homeostasis del calcio celular. La sobreexpresión de GAP43 en células neuronales y no neuronales conduce a la formación de protrusiones de membranas filamentosas. Tomado en conjunto, GAP43 es un factor necesario y suficiente para la formación de axones y otras estructuras que unen las células a través de tubos de membrana como las MT.
GAP43 se expresa altamente en líneas celulares de astrocitoma, donde se enriquece en la punta de TM en forma de cono de crecimiento. La atenuación génica lentivírica del gen GAP43 en células de glioblastoma primario condujo a una reducción drástica de la invasión, proliferación y diseminación mediadas por TM. En un modelo animal in vivo, los tumores respectivos apenas pudieron identificarse en el día 70 después del implante, mientras que los tumores control se habían extendido por todo el cerebro, conduciendo a complicaciones neurológicas letales solo unos días después. Al mismo tiempo, los animales de atenuación génica de GAP43 no mostraron ningún déficit clínico. En consecuencia, la atenuación génica de GAP43 en células de glioblastoma dio como resultado una supervivencia significativamente mejorada de los ratones, en comparación con los tumores control.
En estudios adicionales, GAP43 se ha identificado como un factor decisivo para la formación mediada por TM de la red celular funcional anterior. Finalmente, los tumores de atenuación génica de GAP43 mostraron un fuerte aumento en la degeneración de las células tumorales inducida por radiación, dando como resultado una fuerte degeneración de toda la población de células tumorales seis semanas después de la radiación. Por el contrario, las células tumorales control eran altamente resistentes a la radiación y empezaron a crecer tan pronto como seis semanas después de la radiación.
Por lo tanto, GAP43 se ha identificado en la presente invención como un mediador de todas las funciones relacionadas con MT tales como invasión, diseminación tumoral, interconexión, formación de redes estables y resistencia a la terapia.
Los agentes que son capaces de mediar la interferencia de ARN (iARN) para la atenuación génica específica del gen de la proteína 43 asociada al crecimiento (GAP43) se seleccionan de ARN inhibidores pequeños (ARNip), microARN (miARN), ARN en horquilla pequeños (ARNhp) y oligonucleótidos antisentido/ARN antisentido (ARNas). En resumen, los ARNip son ARN bicatenarios (ARNbc) cortos (habitualmente de 20 a 24 pb) con extremos 5' fosforilados y extremos 3' hidroxilados con dos nucleótidos colgantes. Fisiológicamente, la enzima Dicer cataliza la producción de ARNip a partir de ARNbc largo y ARNhp. Los ARNip se incorporan al complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) y actúan interfiriendo con la expresión de genes específicos con secuencias de nucleótidos complementarias haciendo que el ARNm se descomponga después de la transcripción, dando como resultado ninguna traducción. Los ARNhp son ARN que hacen una curva cerrada en horquilla estrecha y pueden escindirse por la enzima Dicer, dando como resultado un ARNip que se incorpora en el RISC. Los miARN son construcciones de ARN que pueden procesarse intracelularmente y finalmente también se escinden por Dicer, dando como resultado un ARNip y se incorpora al RISC. Finalmente, los oligonucleótidos-as/ARNas son oligonucleótidos/ARN monocatenarios que son complementarios a una cadena de ARN mensajero (ARNm) transcrita dentro de una célula y pueden inhibir la traducción de un ARNm complementario al emparejarse con él y obstruir físicamente la maquinaria de traducción. Los métodos para la generación y el uso de ARNip, ARNhp, miARN y oligonucleótidos-as/ARNas se conocen en la técnica para la atenuación génica de un gen particular de interés. Las secuencias diana para la atenuación génica del GAP43 de acuerdo con la presente invención se seleccionan de una de las siguientes secuencias:
CGTGGACACATAACAAGGAAA
(TRCN0000047323-NM_002045.2-212s1 c1; SEQ ID NO: 1);
CTGAAGCTAATAAGAAGGA
(TRCN0000047324-NM_002045.2-275s1c1; SEQ ID NO: 2);
TGTAGATGAAACCAAACCTAA
(TRCN0000047325-NM_002045.2-718s1c1; SEQ ID NO: 3);
CCACTAAAGCTTCCACTGATA
(TRCN0000047326-NM_002045.2-513s1c1; SEQ ID NO: 4); y
TCAAACAGTGTGGCTTAAAC
(TRCN0000421227-NM_002045.3-1302s21c1; SEQ ID NO: 5).
En una realización particular, los agentes que son capaces de mediar la interferencia de ARN (iARN) para la atenuación génica específica del gen GAP43 son oligonucleótidos antisentido de ADN que comprenden o consisten en una de las secuencias GCACAGCATGATCGTAT (SEQ ID NO: 6), TTTGTTCTTCTCATACAG (SEQ ID NO: 7) y ACAGCATCTGTCTTCTC (SEQ ID NO: 8). En una realización relacionada, dichos agentes son ARNas que comprenden o consisten en una de las secuencias respectivas GCACAGCAUGAUCGUAU (SEQ ID NO: 9), UUUGUUCUUCUCAUACAG (SEQ ID NO: 10) y ACAGCAUCUGUCUUCUC (SEQ ID NO: 11).
En otra realización, el agente para su uso de acuerdo con la presente invención es un compuesto que es capaz de inhibir la actividad biológica de la proteína GAP43, en donde dicho compuesto es un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o un mimético de anticuerpo que se une específicamente a la proteína GAP43.
En este contexto, los fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2 y fragmentos Fab'. Los miméticos de anticuerpos incluyen fragmentos variables monocatenarios (scFv), anticuerpos de un solo dominio, aficuerpos, anticalinas, DARPinas, monocuerpos, aptámeros de péptidos, afilinas, afímeros y afitinas como se conoce en la técnica. En este contexto, la expresión "anticuerpo que se une específicamente a la proteína GAP43" se usa como sinónimo de la expresión "anticuerpo anti-GAP43".
En una realización adicional, el agente para su uso de acuerdo con la presente invención es un agente que es capaz de mediar iARN para la atenuación génica específica del gen de la homólogo tweety humano 1 (Ttyhl), en donde el agente es como se definió anteriormente.
Ttyh1 se ha identificado en la presente invención como un factor importante para el desarrollo de TM y la función de los mismos. Generalmente, Ttyh1 se expresa específicamente en el cerebro, se requiere para la neuritogénesis y el desarrollo temprano del cerebro y está (como GAP43) regulada negativamente en el sistema nervioso central (SNC) del adulto. Además, está conectado a la homeostasis del calcio celular. También se ha demostrado que se expresa en astrocitos, con expresión aumentada después de una lesión/activación.
Ttyh1 está enriquecido a lo largo de la membrana de TM de las células invasoras del astrocitoma. La atenuación génica lentivírica del gen Ttyh1 en células de glioblastoma primario condujo a una reducción drástica de la invasión, proliferación y diseminación mediadas por TM. En un modelo animal in vivo, los respectivos tumores ya no pudieron identificarse por resonancia magnética en el día 70 después de la implantación, mientras que los tumores control se habían extendido por todo el cerebro y viéndose grandes lesiones que ocupan espacio en la resonancia magnética, conduciendo a complicaciones neurológicas letales solo unos días después. Al mismo tiempo, los animales de atenuación génica de Ttyhl no mostraron ningún déficit clínico.
Por lo tanto, Ttyh1 se ha identificado en la presente invención como mediador de la invasión y diseminación dependiente de Tm .
Los agentes que son capaces de mediar la interferencia de ARN (iARN) de acuerdo con esta realización adicional de la presente invención son como se define anteriormente para la primera realización de la presente invención. Lo mismo se aplica a los métodos para la generación y uso de los respectivos agentes.
Las secuencias diana para la atenuación génica del gen Ttyhl se seleccionan de las siguientes secuencias, en donde SEQ ID NO: 12 y 16 se prefieren particularmente: TCAGACATCCTGAGCTATTAT (ORF 880-900; SEQ ID NO: 12); CTTGGAGGAGACTCTGAATGT (ORF 1047-1067; SEQ ID NO: 13); CTCCAATCCAGACCCTTATGT (ORF 825-845; SEQ ID NO: 14); ATCGGTTTCTATGGCAACAGT (ORF 319-339; SEQ ID NO: 15); y GCTCTGACCACTAACACTCTT (3'UTR 91-111; SEQ ID NO: 16).
En otra realización, el agente para su uso de acuerdo con la presente invención es un compuesto que es capaz de inhibir la actividad biológica de la proteína TTYH-1, en donde el compuesto es un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o un mimético de anticuerpo que se une específicamente a la proteína TTYH-1. En este contexto, los fragmentos de anticuerpos y los miméticos de anticuerpos son como se definen anteriormente. Además, la expresión "anticuerpo que se une específicamente a la proteína TTYH-1" se usa como sinónimo de la expresión "anticuerpo anti-TTYH-1".
En una realización diferente, el agente para su uso de acuerdo con la presente invención es un agente que es capaz de mediar iARN para la atenuación génica específica del gen de la conexina 43 (Cx43), en donde el agente es como se definió anteriormente. La Conexina 43 (Cx43) es la proteína de unión comunicante más importante para la funcionalidad mediada por TM. Las uniones comunicantes Cx43 se encuentran regularmente en los puntos de contacto de las TM: son canales obligatorios necesarios para la función de la red de células tumorales mediadas por TM en los tumores cerebrales primarios, impulsando de esta manera su progresión y resistencia a la terapia. Específicamente, Las uniones comunicantes Cx43 son necesarias para el intercambio de moléculas entre células tumorales a través de TM, y son necesarias para las comunicaciones célula-célula en el glioma a través de ondas de calcio intercelulares (ICW). De 22 proteínas de unión comunicante conocidas, Cx43 es la única que está regulada diferencialmente en gliomas humanos 1p/19q codelecionados frente a intactos, haciéndola un candidato principal para la mediación de la resistencia al tratamiento. En consecuencia, la atenuación génica del ARNhp de Cx43 condujo a una disminución en el crecimiento del glioma y una prolongación de la supervivencia de los ratones portadores de tumores cerebrales. La secuencia diana para la atenuación génica del gen Cx43 es la secuencia GCCCAAACTGATGGTGTCAAT (SEQ ID NO: 21).
En una realización adicional, el agente para su uso de acuerdo con la presente invención es un compuesto que es capaz de inhibir la actividad biológica de Cx43, en donde el compuesto es un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o un mimético de anticuerpo que se une específicamente y/o bloquea funcionalmente Cx43. En este contexto, los fragmentos de anticuerpos y los miméticos de anticuerpos son como se definen anteriormente. Además, la expresión "anticuerpo que se une específicamente a Cx43" se usa como sinónimo de la expresión "anticuerpo anti-Cx43". En una realización adicional, se proporciona un compuesto que es capaz de inhibir la actividad biológica de la conexina 43 (Cx43), en donde dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste en el péptido Gap 26 que bloquea la unión comunicante (VCYDKSFPISHVR; SEQ ID NO: 17); péptido que bloquea la unión comunicante Gap 27 (SRPTEKTIFII; SEQ ID NO: 18); ácido glicirretínico y derivados del mismo, en particular carbenoxolona; quinina y derivados de la misma, en particular quinidina y mefloquina; anandamida; octanol; heptanol; ácido antranílico y derivados del mismo, ácido fenámico y derivados del mismo tales como ácido meclofenámico; anestésicos, en particular isoflurano y ketamina; ácido retinoico; y tonabersat.
El tratamiento del glioma en un sujeto de acuerdo con la presente invención puede comprender, además del uso de los agentes de la presente invención, una terapia tumoral adicional, en particular quimioterapia y/o radioterapia. La presente invención proporciona por primera vez enfoques terapéuticos para el tratamiento del glioma, en particular astrocitoma y glioblastoma, que se caracterizan por la reducción de la resistencia a la terapia del tumor, alta eficiencia, baja morbilidad y mortalidad, supervivencia prolongada y baja toxicidad relacionada con la terapia. Las figuras muestran:
Figura 1:
Los distintos microtubos de membrana contribuyen a la diseminación del tumor cerebral y conectan células tumorales individuales.
a, MPLSM in vivo de GBMSC S24 que crecen en el cerebro del ratón durante 60 días (D). Flechas: protrusiones celulares delgadas que se extienden hacia el cerebro normal en el borde del tumor, puntas de flecha: protrusiones intratumorales largas. Proyecciones de intensidad máxima (MIP, por sus siglas en inglés), 300­ 357 |jm de profundidad. b, Número y longitud de protrusiones en los mismos puntos de tiempo (tumores S24; n=77-120 células en n=3 ratones). c, Viaje de dos núcleos (flechas, puntas de flecha) después de la división nuclear (al inicio y a las 103 horas) a lo largo de protrusiones celulares de S24 GBMSC. Velocidad de los núcleos que viajan: 66,42 ± 36,25 jm/día, n=16 núcleos en n=6 ratones. Imágenes en 3D, dimensión z 63 jm. d, Las protrusiones son ricas en actina y arborizan (S24 Lifeact-YFP, MIP, dimensión z 15 jm). e, Reconstrucción 3D de microtubos de membrana en un astrocitoma T325 durante 3 días (MPLSM in vivo). Puntas de flecha: tubo principal estable; flechas: tubos laterales dinámicos. f, Imágenes de microscopía electrónica de barrido (MEB) de un microtubo de membrana S24 GBMSC (flecha, identificada por fotooxidación de GFP) en el parénquima cerebral de ratón, que contiene una mitocondria y microvesículas. Asteriscos: axones. g, Representación 3D de tubos de membrana que interconectan GBMSC S24 individuales a una red multicelular densa en un volumen cerebral ilustrativo de 238x192x90 jm. Los tubos intercelulares (que conectan) y que no conectan y las células tumorales conectadas y desconectadas se muestran codificadas por colores. Los tubos también se clasificaron como que conectan cuando la célula conectada estaba fuera de este volumen. h, Número de tubos de membrana por célula tumoral S24 que conectan esta célula con otra célula tumoral en la misma microrregión a lo largo del tiempo (n=141-437 células en n=3 ratones). Las barras de error muestran las desviaciones estándar.
Figura 2:
Diferentes líneas celulares de glioblastoma primario (GBMSC) que crecen hasta tumores astrocíticos en el cerebro de ratón.
a-f: Microscopía (3D) in vivo de 6 líneas GBMSC diferentes revela una formación abundante de protrusiones de membrana ultralargas en el cerebro de ratón: a T1, b T269, c T325, d S24, e WJ y f P3 (dimensiones z de 200 -500 jm de profundidad). Los recuadros muestran las áreas encuadradas en las imágenes correspondientes con mayor aumento, cubriendo una proporción de la dimensión z. Por línea celular, se muestran dos puntos de tiempo, adaptados a su velocidad de crecimiento in vivo (T269, P3 rápido; T1, S24 intermedio, T325 y WJ lento). g, Imagen 3D de un astrocitoma S24 (inyección de una mezcla 50:50 de células GFP o RFP positivas), revelando múltiples protrusiones de membrana ultralargas y muy delgadas (flechas) en el cerebro de un ratón vivo. Nótese que los tubos de membrana corren parcialmente en paralelo. h, Perfil CGH de la línea S24 GBMSC que demuestra alteraciones cromosómicas típicas de GBM (ganancia de cromosoma 7, pérdida de 10). i, El análisis FISH del cromosoma 7 de un GBMSC S24 en el área principal del tumor demuestra poliploidía: el 90 % de n = 100 células analizadas en el área del tumor principal eran claramente poliploides para el cromosoma 7, lo que indica que las GBMSC S24 implantadas dan lugar a tumores genéticamente identificables como glioblastomas. j, Secciones coronarias de cerebro de ratón completo el día 171 después de la inyección de S24 que muestran dos características principales del crecimiento del glioblastoma: invasión cerebral difusa en un patrón de diseminación típico (imagen izquierda) y un núcleo sólido, angiogénico identificado por cambios hemorrágicos del área principal del tumor (imagen de campo claro derecha). k, El aumento de la angiogénesis en este tumor se demuestra además mediante MPLSM dinámica in vivo. I, Punta S24 GBMSC rica en actina, invadiendo en el cerebro (imágenes de un solo plano; dibujo esquemático a continuación). MPLSM in vivo: a-g; k,l.
Figura 3:
Caracterización de microtubos de membrana en modelos de astrocitoma de ratón.
a, Inmunohistoquímicas confocales (proyecciones de máxima intensidad) de nestina humana (verde, permite la detección específica de estructuras relacionadas con S24 GBMSC en el cerebro de ratón) y otros factores celulares y moleculares diferentes (rojo, tinciones conjuntas). El grado de expresión del factor diferente en los tubos de membrana derivados de células tumorales se indica en el carril derecho: - = sin señal en los tubos de membrana, (-) = solo señal débil en un pequeño subconjunto de tubos de membrana, (+) = señal positiva en algunos tubos de membrana, = señal positiva en todos los tubos de membrana. b, Imágenes in vivo de S24 GBMSC que expresan genéticamente proteína verde fluorescente (GFP, verde) enlazadas a diferentes componentes celulares/moleculares. c, Ejemplo de un microtubo de membrana T325 GBMSC muy estable (puntas de flecha), seguido durante 126 días in vivo; MIP, dimensión z 48 jm. d, Imagen MEB de dos microtubos de membrana fotoconvertidos (flechas) y un núcleo de una célula cerebral no fotoconvertida (N). e, La reconstrucción 3D de imágenes MEB en serie (22,29 jm (xy) * 4,62 jm (z) = 102,9 jm 3) ilustra los contornos de la membrana. f, Velocidad máxima de las mitocondrias en tubos de membrana S24 frente al soma de célula tumoral in vivo (n=10 por grupo, prueba de la t, las líneas rojas muestran las medias). g, Reconstrucción 3D de secciones seriadas de MEB del microtubo de membrana (rojo) y los dos axones (verde), que se muestran en la Figura 1f. h, Imagen MPLSM 3D in vivo del modelo genético de glioma de ratón Tlx, con abundantes microtubos de membrana que conectan células de astrocitoma en forma de tallo único (dimensión z 83 jm). *p<0,05.
Figura 4:
Origen de las conexiones de TM entre las células de astrocitoma y la dinámica a largo plazo de las células de extensión de TM.
a, Gráficos que ilustran dos formas teóricamente posibles de conexiones intercelulares mediante tubos de membrana en un modelo de dos poblaciones de células tumorales marcadas con 2 proteínas fluorescentes diferentes: (1) las células tumorales permanecen conectadas después de la división celular con sus ancestros. En este caso, solo se esperan conexiones entre células del mismo color [GFP-GFP (verde) o RFP-RFP (rojo)]; (2) las células tumorales solo se conectan a células de glioma no relacionadas. Aquí, el 50 % de las conexiones serían entre células de diferente color [GFP-RFP o RFP-GFP (gris)] y el 25 % del mismo color [GFP-GFP (verde) y RFP-RFP (rojo)], respectivamente. b, Cuantificación del conjunto de datos real, donde se co-inyectó una mezcla 1:1 de S24 GBMSC que expresan GFP o RFP (S24GFP/S24RFP) en el cerebro del ratón, revelando que ambos mecanismos potenciales están en su lugar (n= 164 conexiones en n=3 ratones). c, Imagen 3D (70 días después de la inyección) de un coimplante de S24 GBMSC que expresan GFP y RFP. La cuantificación reveló que ambos fluoróforos grandes (que no pueden atravesar uniones comunicantes) nunca se colocalizaron en los somas celulares o en los TM (n = >2500 células de astrocitoma analizadas). d, e, Ejemplos de imágenes 3D de conexiones de tubos de membrana entre células de astrocitoma individuales no relacionadas que expresan de manera diferente GFP o RFP (flechas en d y e). f, Ejemplo de una imagen 3D de conexiones del mismo color entre dos células RFP positivas (flechas). g, Imagen MEB de un esferoide S24, panel izquierdo: el color amarillo marca los cuerpos celulares, las puntas de flecha apuntan a microtubos de membrana; panel derecho: gran aumento de los tubos con contacto directo con la membrana (flecha). h, Imágenes 3D de una célula de astrocitoma T325 perivascular (flechas), que primero utiliza un TM para explorar el nicho perivascular (D45-D73) hasta que se mueve a la región explorada, y permanece en una posición perivascular estricta hasta el día 255. Una segunda célula (punta de flecha) está inactiva hasta D129 y está embebida en una formación de bucle vascular, que persiste después de la desaparición del soma de la célula principal. i, MIP de una célula de astrocitoma S24 GFP que contiene TM que entra en una posición perivascular con el tiempo (flecha) y otra que permanece en su posición no vascular (parenquimatosa) durante 105 días (punta de flecha). Todas las imágenes fueron adquiridas por MPLSM in vivo, 50-650 pm de profundidad en el cerebro.
Figura 5:
Los microtubos tumorales (TM) son característicos de los gliomas humanos no co-delecionados 1p/19q.
a,b, Imágenes de inmunofluorescencia IDH1 R132H representativas de un astrocitoma no co-delecionado 1p/19q (a), y oligodendroglioma co-delecionado 1p/19q (b). c, Proporción de gliomas de pacientes con una longitud máxima de estructuras microtubulares para IDH1 R132H positivas en cortes finos convencionales de 3 pm. Oligodendroglioma (O, 1p/19q co-delecionado) grado II, III; y astrocitoma (A, 1p/19q no co-delecionado) grado II, III y IV (glioblastoma, GBM); n=20-24 pacientes por entidad tumoral, n=105 en total. d, Longitud máxima de microtubos de oligoastrocitomas con codeleción 1p/19q (OA CODEL; n=31 pacientes) y sin ella (OA NO-CODEL; n=9 pacientes). e, Longitud máxima de microtubos de tumores clasificados morfológicamente como astrocitomas pero con codeleción 1p/19q ("A" CODEL; n=6 pacientes) y tumores clasificados morfológicamente como oligodendrogliomas pero sin codeleción 1p/19q ("O" NO-CODEL; n=9 pacientes).
Figura 6:
Los gliomas codelecionados 1p/19q no muestran TM relevantes, mientras que los no codelecionados muestran TM incluso en el hemisferio contralateral en los pacientes.
a, Imagen 3D de un tumor de xenoinjerto de oligodendroglioma BT088 que crece en el cerebro de ratón, el recuadro muestra el área encuadrada con un aumento mayor. Las células son redondeadas, los TM son escasos. b, Cuantificación de longitudes de TM de células de oligodendroglioma BT088 (izquierda) y células de astrocitoma S24 (derecha), el día 60 después de la implantación del tumor. n=3 animales por entidad. c, Inmunohistoquímica IDH1 R132H del hemisferio cerebral contralateral (macroscópicamente libre de tumor) de un paciente fallecido por un astrocitoma WHO °III d, Inmunohistoquímica IDH1 ilustrativa de gliomas clasificados morfológicamente como oligoastrocitomas, con (izquierda) o sin (derecha) codeleción 1p/19q.
Figura 7:
Las conexiones de TM permiten la comunicación en redes multicelulares.
a, Imagen de lapso de tiempo representativa de ondas de calcio (Rho2-AM) viajando a lo largo de los TM de GBMSC (bidireccional; flechas). Flechas rojas: cruce de dos TM, con pico de calcio simultáneo. Derecha: Imagen 3D de la señal GBMSC GFP de esta región y representación 3D de las estructuras participantes de la onda de calcio (verde). El asterisco y el punto marcan dos células individuales. b, Frecuencia y sincronicidad (véase la sección de Métodos) de los picos de calcio en GBMSC, mostrado para células tumorales conectadas a TM frente a células tumorales no conectadas a TM (n = 40 frente a 43 células en n = 3 ratones/cond.; pruebas de la t). c, derecha: Transitorios de calcio (AF/F0, Rhod-2AM) de GMBSC no conectadas (gris) frente a células conectadas a TM (azul); las líneas discontinuas marcan los transitorios de calcio sincrónicos; izquierda: MIP (10 cortes) de la región correspondiente (células rojas: astrocitos; células verdes: células tumorales sin señal de Rhod-2AM; celdas amarillas: células tumorales con señal de Rhod-2AM). d, Mapa de calor representativo de los transitorios de calcio entre GBMSC. e, Frecuencia y sincronicidad de los picos de calcio registrados durante la superfusión cerebral con solución salina extracelular (ES-control) frente a carbenoxolona 100 pM (CBX) en GBMSC (recuadro azul) y astrocitos cerebrales normales (recuadro rojo); n=3 ratones por grupo; pruebas de la t. f, Captación de SR101 en un GBMSC no conectado a TM (imagen superior) y uno conectado a TM (imagen inferior). Derecha, cuantificación correspondiente (UA, unidades arbitrarias); n=55 células en n=3 ratones/condición; Prueba de Mann-Whitney. g, Imágenes 3D (dimensión z 180 pm) de tumores microinyectados SR101, sin (control, imagen superior) y con CBX co-inyectado (imagen inferior; zona de inyección: círculos) 120 min después de la inyección. Células rojas: astrocitos cerebrales normales. Gráfico: cuantificación correspondiente de la fluorescencia SR101 (n=4962-5676 células en n=3 ratones por grupo; prueba de Mann-Whitney). Las imágenes a, c, f y g son adquiridas por MPLSM in vivo. GBMSC: Línea S24. Las barras de error muestran las desviaciones estándar. *p<0,05, ***p<0,001.
Figura 8:
Comunicación intercelular a través de uniones comunicantes en células de astrocitoma conectadas a TM.
a, Ejemplo de una onda de calcio que implica TM de GBMSC en una región tumoral; medición mediante el sensor Twitch-3 codificado genéticamente que permite mediciones radiométricas de calcio a través de FRET. Se muestra una superposición de canales cpVenusCD y CFP. El color amarillo refleja bajas concentraciones de calcio, el color rojo altas. Derecha: proporciones de secciones individuales de una TM que ilustran la propagación de una onda de calcio a lo largo de la TM. b, Mapa de calor ilustrativo de comunicaciones de ondas de calcio intercelulares (ICW) entre células de astrocitoma T325 transfectadas con el sensor de calcio codificado genéticamente GCaMP3. c, Mapa de calor ilustrativo (indicador de calcio de molécula pequeña Fluo-4 AM). d, Análisis de la sincronicidad normalizada del valor inicial (véase Métodos para obtener detalles) de las señales de calcio entre las células de glioma S24 GBMSC frente a los astrocitos cerebrales normales. El inositol trifosfato (IP3) fue bloqueado por 2-APB, los receptores celulares de ATP por el antagonista del receptor 2 purinérgico no selectivo suramina, y las uniones comunicantes fueron bloqueadas por CBX (células de glioma: pruebas de la t, astrocitos: pruebas de Mann-Whitney). ES, solución salina extracelular usada como control. e, Imágenes en 3D de una célula tumoral S24 no conectada a TM (S24tdtomate), cargada con el tinte amarillo lucifer permeable de la unión comunicante mediante electroporación. f, Imágenes en 3D de células tumorales S24 conectadas a TM (S24tdtomate) después de la transferencia de tinte a una de las células conectadas a TM. g, Cuantificación de la intensidad de la fluorescencia amarilla de lucifer en las células vecinas próximas a la célula electroporada (n=4 secciones de n=2 ratones; n = 64 células conectadas a TM frente a n = 42 células no conectadas a TM cuantificadas; prueba de la t). h, Análisis de transferencia Western de la expresión de la proteína Cx43 en 4 líneas celulares GBMSC y 2 oligodendrogliomas. i, Inmunohistoquímica que demuestra la localización de diferentes conexinas en S24 GBMSC; no pudo observarse una expresión clara relacionada con TM y/o localización en los cruces de TM. a-d, adquirido por MPLSM in vivo. e, f, i: imágenes de microscopía confocal. *p<0,05, ***p<0,001.
Figura 9:
Las uniones comunicantes de Conexina 43 conectan los TM en los astrocitomas.
a, Cuantificación de la expresión de la proteína Cx43 detectada por inmunohistoquímica en gliomas humanos 1p/19 codelecionados frente a no codelecionados (n=8 cada uno, prueba de la t). b, Doble inmunofluorescencia de nestina y Cx43 en tumores GBMSC S24 y T1 (las flechas apuntan a interconexiones TM Cx43 positivas, las puntas de flecha a TM Cx43 positivas). c, Imagen MEB de un contacto directo de membrana de 2 TM en el cerebro de ratón (identificado por fotooxidación). d, Sincronicidad de los picos de calcio en células S24 shControl frente a células shCx43 (n = 3 ratones/condición; prueba de Mann-Whitney). e, Proporción de células desprovistas de TM (0 TM) frente a células ricas en TM (> 4 TM) en estos tumores 20 y 40 días después de la implantación del tumor (n=3 ratones por grupo, ANOVA, prueba post-hoc de Tukey). f, Imágenes de resonancia magnética T2 de campo alto de tumores shControl frente a tumores shCx43, 72 días después de la implantación del tumor. Cuantificaciones de n=6 animales por grupo (prueba t). g, Gráfico de supervivencia de Kaplan-Meier de estos grupos (prueba de rengo logarítmico). Las barras de error muestran las desviaciones estándar. *p<0,05; ***p<0,001.
Figura 10:
Las redes de células de astrocitoma conectadas a TM pueden repararse a sí mismas y resistir la radioterapia. a, Serie temporal de imágenes 3D ilustrativas (54 |jm de espesor) de una región tumoral después de la destrucción inducida por láser de una GMBSC (círculo). Con el tiempo, un TM (puntas de flecha) se extiende y un núcleo (estrella) se transloca a través de ese TM hasta el mismo lugar en el que se encontraba antes la célula muerta. b, Imágenes en 3D (51 jm de espesor) de una región de tumor cerebral directamente antes del fotodaño en un área más grande (recuadros de puntos) y 2 días después. Imagen derecha: plano único de la región dañada. c, Evolución temporal de una región próxima a un fotodaño más grande (área punteada), flechas: TM de GBMSC que se extienden a la región fotodañada. MIP de 21 jm, n=3 ratones. d, Ejemplos de microrregiones tumorales GBMSC (imágenes 3D, 20 jm de profundidad) antes del inicio de la radiación (d0) y 7 días después (d7). Estrellas: GBMSC no conectados a t M; flecha: una célula ilustrativa con muchos TM. Gráfico: Cambio relativo de subtipos celulares bajo radiación simulada (Sham) o radiación (Rad) (n=3 ratones por grupo, pruebas de la t). e, Número de TM por célula en estos tumores (imágenes en 3D del lado izquierdo, n=5o células/punto de tiempo en n = 3 ratones por grupo, prueba de Mann-Whitney). f, Mapas de calor ilustrativos de los transitorios de calcio (Rhod-2AM) de una región tumoral GBMSC tratada de forma simulada (izquierda) y radiada (derecha). g, Sincronicidad de los transitorios de calcio después de un tratamiento simulado o radioterapia en regiones tumorales individuales de GBMSC (Fluo-4AM, n=3 ratones por grupo, prueba de Mann-Whitney). h, Cambios relativos de todas las células (izquierda) y subgrupos de GBMSC conectados a TM frente a no conectados de tumores shControl frente a shCx43 después de la simulación/radioterapia (n=3 ratones por grupo, pruebas de la t). Todas las imágenes se adquieren por MPLSM in vivo. GBMSC: Línea S24. Las barras de error muestran las desviaciones estándar. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001
Figura 11:
Efectos de la radioterapia sobre la morfología celular, la supervivencia a largo plazo y la homeostasis del calcio en astrocitomas.
a, 5 días después del inicio de la radioterapia (3x7 Gy), puede detectarse la fragmentación nuclear característica de la apoptosis (flecha) en una proporción de células en este momento. Verde, tinción nuclear por transducción de H2B-GFP; rojo, citoplasma de células S24. b, Curso temporal representativo de 42 días de una microrregión tumoral distinta, seguido después del inicio de la radioterapia (día 0). Las células conectadas a TM (dos ejemplos están marcados con estrellas negras) muestran supervivencia a largo plazo; nótese que las células supervivientes muestran un aumento en el número de sus TM. n=3 ratones por grupo. Todas las imágenes fueron adquiridas por MPLSM in vivo, 50-650 pm de profundidad en el cerebro. c-f, Mediciones radiométricas de los niveles de calcio basal. c, Relaciones medias de intensidades de fluorescencia de los compañeros FRET cpVenusCD y CFP, antes y después de dos días de radiación (2x7Gy) en células conectadas a t M (n=3 ratones por grupo; prueba de Mann-Whitney). d, Intensidades de fluorescencia (normalizadas por las intensidades medias de los conjuntos de datos correspondientes) en las células conectadas a TM para los dos socios FRET ilustrados por una transferencia de dispersión (los puntos negros representan las células analizadas el día antes de la radioterapia, puntos rojos 2 días después del inicio de la radioterapia); La regresión lineal reveló fuerzas de correlación similares en los dos puntos de tiempo (n=3 ratones), lo que refleja niveles de calcio muy homogéneos en las células del astrocitoma antes y después de la radioterapia. e, Relaciones medias de intensidades de fluorescencia de los socios FRET antes y después de dos días de radiación (2x7Gy) en células no conectadas, n=3 ratones; Prueba de Mann-Whitney. f, Intensidades de fluorescencia normalizadas en células no conectadas para los dos compañeros FRET. Aquí, la regresión lineal reveló niveles de calcio basal altamente homogéneos solo antes de la radioterapia, mientras que durante la radioterapia se perdió la correlación lineal, ilustrando niveles heterogéneos de calcio en las células analizadas. (n=3 ratones por grupo). GBMSC, línea celular S24.
Figura 12:
Análisis in silico de gliomas codelecionados 1p/19q frente a gliomas no codelecionados.
El análisis de la función biológica se realizó usando análisis de ruta de ingenuidad. a, Gráfico de barras de las funciones biológicas superiores posteriores reguladas diferencialmente. b, Mapa de calor de las funciones biológicas posteriores. El mapa está codificado por colores: naranja más intenso significa más activación en tumores no codelecionados 1p/19q (en comparación con los tumores codelecionados), azul al revés. Nótese la activación del "movimiento celular" y la "señalización de célula a célula" en tumores no codelecionados. c, Resultados del análisis de las rutas canónicas en gliomas 1p/19q no codelecionados frente a codelecionados. Puntuación z positiva más alta: regulada positivamente en gliomas 1p/19q no codelecionados frente a codelecionados; Puntuación z negativa más alta: regulada positivamente en gliomas codelecionados 1p/19q frente a gliomas no codelecionados.
Figura 13:
Dominio de la expresión de GAP-43 en gliomas no codelecionados 1p/19q; e ilustración esquemática del papel de los TM en la progresión del tumor cerebral.
a, Expresión de proteína TrkA, TrkB, NGF y NT-4 detectada por inmunohistoquímica en gliomas humanos 1p/19 codelecionados frente a no codelecionados (n=8 cada uno, pruebas de la t). b, Análisis de transferencia Western de la expresión de la proteína GAP-43 en 4 GBMSC cultivadas en neuroesfera no adherente (NSM) frente a diferenciación, condición adherente que contiene suero. c, Ensayo de invasión de esferoides a partir de células S24 shControl frente a shGAP-43 en una matriz de gel y la cuantificación correspondiente (prueba de la t). d, Análisis de transferencia Western de la expresión de proteína Cx26, C31, Cx37 y Cx43 en shGAP-43 Gb Ms C frente a shControles. Cabe destacar que, la caída de GAP-43 conduce a una reducción de proteína Cx43 del 89 %, mientras que la expresión de las otras conexinas no se redujo. e, La sobreexpresión de GAP-43 en células de oligodendroglioma BT088 da como resultado niveles de proteína similares a los de las GBMSC. f, Mecanismos anatómicos y moleculares de la diseminación tumoral impulsada por TM y la función de red en los astrocitomas. MV, microvesículas; mito, mitocondria; ER, retículo endoplasmático (identificado por positividad PDI); MT, microtúbulos. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001.
Figura 14:
Se requiere GAP-43 para el crecimiento y la función de TM.
a, Expresión de la proteína GAP-43 detectada por inmunohistoquímica en astrocitomas humanos 1 p/19 codelecionados frente a oligodendrogliomas no codelecionados (n=8 cada uno) y cuantificación correspondiente (prueba de Mann-Whitney). b, transferencia Western de GAP-43 de diferentes líneas celulares de glioma. c, Imágenes inmunocitológicas de la proteína GAP-43, con localización preferencial de GAP-43 en la punta Nestinnegativa de TM (flechas) en diferentes líneas de GBMSC. d, Imágenes 3D de células de glioma (izquierda, invertidas) y cuantificación de ramas laterales de TM 20 días después de la implantación (n=60 células en n=5/6 ratones, prueba de la t). e, Imágenes de un solo plano de exploración en mosaico de los tumores GBMSC S24 control (imagen superior) y shGAP-43 (imagen inferior); derecha: cuantificación correspondiente (n=3 ratones/condición; pruebas de Mann-Whitney). f, Distancia de invasión de células tumorales in vivo en 24 horas (n=3 ratones, prueba de Mann-Whitney). g, Proliferación in vivo de S24 GBMSC (volumen de 0,037 mm3; n=4 ratones, pruebas de Mann-Whitney). h, Fracción de células conectadas a TM el día 20 en tumores S24 (n=164 células en n=6 ratones, prueba de la t). i, Análisis de sincronicidad de los picos de calcio en células S24 shControl frente a células shGAP-43 in vivo (n = 3 ratones; prueba de Mann-Whitney). j, Imágenes de resonancia magnética T2 de tumores S24 shControl frente a tumores shGAP-43, 72 d después de la implantación del tumor. Cuantificaciones de n=6 animales por grupo (prueba t). k, Gráfico de supervivencia de Kaplan-Meier de estos grupos (prueba de rengo logarítmico). I, Evolución del tiempo después de la irradiación con 3x7 Gy en células de astrocitoma S24 shControl frente a shGAP-43, cuantificaciones correspondientes (n=3 ratones/grupo; pruebas de la t). m, Imágenes de resonancia magnética de tumores S24 shControl frente a tumores shGAP-43, 60 días después de la radiación (115 días después de la implantación del tumor); derecha: cuantificaciones de 5-6 animales por grupo (prueba de la t). n, Secciones de cerebro ilustrativas de IHC de Nestina de estos ratones; las regiones con densidades de células tumorales más altas (recuadros) se cuantificaron para el índice de proliferación (células positivas para Ki-67/todas las células; n=3 animales; prueba de la t). o-q, La sobreexpresión de GAP-43 en células de oligodendroglioma BT088 conduce a un aumento en el número de TM (o, izquierda: imágenes y cuantificaciones 3D invertidas, n=80 células en n=3 ratones/grupo), más ramas de TM (p, n=40 células en n=3 ratones/grupo) y una mayor capacidad de invasión (q, n=75 células en n=3 ratones/grupo; las líneas rojas muestran las medias; pruebas de la t) 14 días después de la inyección. r, cambio relativo de los volúmenes tumorales 21 días después de la radioterapia en tumores de control de vector BT088 frente a tumores de sobreexpresión de GAP-43 (n=3 ratones/grupo; prueba de la t). MPLSM in vivo: imágenes d, e, l y o, y cuantificaciones d-i, l, m, o-r. Las barras de error muestran las desviaciones estándar. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001.
Figura 15:
a, Los GBMSC de S24 shControl muestran TM delgados y regularmente ramificados in vivo, mientras que las células S24 shTTYH1 desarrollan TM aberrantes. Nótese la morfología anormal de los TM, que son cortos, muestran ramificaciones reducidas y cordones frecuentes. b, Distancia de las células tumorales individuales del tumor principal (el núcleo del tumor se definió como 500 pm), medida después del crecimiento in vivo el día 20 (n=3 ratones por grupo). Se muestran los números medios de células tumorales invadidas para cada intervalo. A diferencia de los tumores S24 shControl, los tumores S24 shTTYH1 son menos infiltrantes y solo se detectaron muy pocas células más allá del núcleo del tumor. [Intervalo <500 pm: 395 frente a 19,5 células [mediana] (p=0,004; Prueba de la U de Mann-Whitney), intervalo 500-1000 pm 260 frente a 1,5 células (P=0,004; Prueba de la U de Mann-Whitney) e intervalo >1000 pm: 138 frente a 0 células (p=0,004; Prueba de la U de Mann-Whitney).] c, La relación área del tumor/área del cerebro se midió el día 75 en exploraciones de MRI de 9,4 tesla (n=6 animales por grupo). En promedio, el 62,90 % del área del cerebro estaba visiblemente infiltrado por células tumorales S24 shControl mientras que solo el 5,82 % del área total del cerebro estaba visiblemente infiltrado por células S24 shTTYH1 (p=<0,001; Prueba t de dos colas). d, El análisis de supervivencia de Kaplan-Meier se realizó con 6 animales por grupo. El tiempo medio de supervivencia de los animales del grupo S24 shControl fue de 74,67 días en comparación con 176,17 días en el grupo S24 shTTYH1 (P=<0,001; Prueba de rango logarítmico).
Figura 16:
Nuevos candidatos moleculares para la formación de MT
(A, B) Glioma que crece en el cerebro de un ratón vivo después de la implantación de GBMSC de S24 cultivadas en condiciones de esferoide similar a un tallo (A), y que contiene suero, condiciones adherentes (B) (z = 180 pm; imágenes representativas 12 días después de la implantación). (C) Distancia de las células tumorales invadidas desde la superficie del tumor principal 14 días después de la implantación de las células S24 cultivadas en condiciones que contienen suero (adherente) versus suero libre (GBMSC) (20-115 células en n=3 ratones por grupo; prueba de Mann-Whitney). (D) Cuantificación de la longitud de TM de las células tumorales S24 cultivadas en condiciones de adherencia frente a GBMSC 14 días después de la implantación (20-52 TM en n=3 ratones por grupo; prueba de Mann-Whitney). (E) Imagen representativa del glioma S24 en el día 104, cuando se cultivaron GBMSC en condiciones similares a células madre antes (z = 165 pm). (F) Imagen representativa del glioma S24 en el día 101, cuando se cultivaron GBMSC en condiciones que contenían suero antes (z = 165 pm).
(G) Análisis de la ruta de ingenuidad de los datos de micromatrices de la comparación de GBMSC cultivadas en condiciones de esferoide similar a células madre frente a que contienen suero, condiciones adherentes que muestran las 10 categorías más activadas (para datos en profundidad, véase la Figura 17). Una puntuación z de activación positiva alta indica una regulación positiva en condiciones similares a las células madre. A-F: datos obtenidos por MPLSM in vivo, A, B, E, F: Imágenes en 3D.
Figura 17:
(A) Mapa de calor de las funciones biológicas del análisis de ruta de ingenuidad (IPA) que compara la expresión en GBMSC cultivadas en condiciones adherentes similares a las células madre frente a las que contienen suero (datos de micromatrices de ARN). (B) Mapa de calor IPA de la categoría de Movimiento Celular. Los mapas de calor están codificados por colores: un naranja más intenso indica una regulación positiva en condiciones similares a células madre. Las categorías se clasifican por logaritmo (valor p).
Figura 18:
(A) Análisis de transferencia Western de los niveles de expresión de proteínas TTYH1 y VGF de GBMSC S24 y T1 cultivadas en condiciones sin suero, no adherentes y condiciones que contienen suero, adherentes durante 7 días, demostrando una regulación negativa en el nivel de proteína en condiciones de adherencia. (B) Imágenes de proyección de intensidad máxima de tinciones inmunohistoquímicas de nestina humana (verde) y VGF (rojo) adquiridas por microscopía confocal (tumores S24 GBMSC); puntas de flecha: TM VGF-positivas. (C) Verificación de la eliminación de ARNhp de VGF en S24 GBMSC mediante análisis de transferencia Western (reducción del 95 % en el nivel de proteína). (D) Imágenes 3D in vivo MPLSM de S24 shControl y shVGF GBMSC en el día 40 (z = 45 |jm) que no demuestran ninguna aberración fenotípica obvia y ninguna diferencia aparente en la invasión y el crecimiento del tumor; GBMSC (verde) y vasos sanguíneos (azul).
Figura 19:
La proteína TTYH1 se localiza en distintas partes de las células de glioma y sus TM
(A) Imágenes de proyección de intensidad máxima (MIP) de tinciones inmunocitoquímicas de TTYH1 (rojo) en células S24 GFP (verde) que revelan una localización preferencial de la proteína TTYH1 a lo largo de la membrana de protrusión y en la punta en forma de cono de crecimiento de estas estructuras similares a TM (puntas de flecha; el aumento más alto de una punta se muestra en el panel inferior). (B, C) MIP de tinciones dobles inmunohistoquímicas de nestina humana (verde), que marca específicamente las GBMSC y sus TM, y TTYH1 (rojo) en los tumores S24 GBMSC. (B) demuestra una célula tumoral (cuerpo celular: asterisco) y su t M TTYH1-positivo (puntas de flecha) dentro de muchos TM TTYH1-negativo; (C) muestra una célula tumoral (cuerpo celular: asterisco) con TM TTYH1 positivo (puntas de flecha) y negativo (flechas). (D) Tinción inmunohistoquímica de IDH1 (identificación inequívoca de células tumorales con anticuerpo específico de mutación IDH1 R132H) y TTYH1 de una muestra de astrocitoma humano también demuestra una célula de glioma positiva para TTYH1 y su TM (punta de flecha) en tumores cerebrales humanos. (E) Imagen 3D de una tinción inmunocitoquímica de Integrina-a5 (ITGA5; verde) y TTYH1 (rojo) en células S24 (flecha: enriquecimiento de ITGA5 en la punta en forma de cono de crecimiento; punta de flecha: co-localización de ITGA5 y TTYH1 en la punta del TM). A-E: Microscopia confocal.
Figura 20:
TTYH1 impulsa la invasión de células de glioma
(A) Análisis de transferencia Western de los niveles de proteína TTYH1 en diferentes líneas celulares de glioma. (B) Lado izquierdo: La regresión lineal reveló una correlación entre el nivel medio de proteína TTYH1 evaluado con análisis de transferencia Western y la capacidad de infiltración difusa de tres líneas celulares de glioma diferentes in vivo. El coeficiente de invasión se definió como el número medio de células a más de 1500 jm del centro del volumen del tumor en relación con el área del volumen del tumor para describir el grado de capacidad de infiltración difusa de cada línea GBMSC (n=3 ratones por línea celular). Lado derecho: Imágenes 3D MPLSM in vivo representativas de tumores S24, T269 y T325 que muestran diferentes grados de infiltración difusa el día 39 (+/- 5 días). (C) Ensayo de invasión de esferoides de células S24 shControl frente a células shTTYH1 en una matriz de colágeno 48 horas después de la siembra. Los bordes de la superficie de los esferoides directamente después de la siembra están marcados como líneas blancas (n=3 esferoides por grupo; prueba de Mann-Whitney). (D, E) Serie temporal de imágenes 3D de S24 shControl GBMSC (z = 36 jm ) (D) y GBMSC S24 shTTYH1 (z=69 jm ) (E) revelan la capacidad de invasión deteriorada inducida por la atenuación génica de TTYH1. Las flechas en el panel de la izquierda indican la ruta de invasión posterior; las puntas de flecha etiquetan los cuerpos celulares de las GBMSC invasoras (verde), vasos sanguíneos (rojo). (F) Mediciones de la velocidad de invasión de un solo S24 shControl frente a las GBMSC shTTYH1 in vivo durante 24 horas (n=3 ratones por grupo; prueba de Mann-Whitney). (G, H) Imágenes 3D MPLSM in vivo ilustrativas de TM de S24 shControl y shTTYH1 GBMSC (G) así como TM de T269 shControl y shTTYH1 GBMSC (H). Nótese que las células de atenuación génica de shTTYH1 muestran TM morfológicamente alterados con formación de cuentas de filamentos (puntas de flecha). B, D-H: datos obtenidos por MPLSM in vivo.
Figura 21:
(A) Verificación de la atenuación génica de ARNhp de TTYH1 en GBMSC S24 (izquierda) y T269 (derecha) mediante análisis de transferencia Western (reducción del 30 % en el nivel de proteína en S24 y reducción del 96 % en T269, respectivamente). (B) Imágenes MPLSM in vivo ilustrativas de células tumorales ricas en TM en tumores S24 shControl y S24 shTTYH1 que no muestran cambios fenotípicos en este subtipo celular. (C) También están presentes diferentes subtipos celulares con 0, 1, 2 y más de 4 TM en las líneas T269 y T1 GBMSC. (D) Cuantificación de las fracciones de GBMSC conectados a TM en los subgrupos celulares con 1­ 2 TM frente a más de 4 TM, demostrando que la mayoría de las células con más de 4 TM están conectadas, mientras que las células con 1-2 TM no están conectadas principalmente con otras células tumorales en este glioma a través de sus TM. B-D: datos obtenidos por MPLSM in vivo.
Figura 22:
Heterogeneidad e invasividad de las células de glioma relacionadas con TM
(A) Imágenes 3D MPLSM in vivo representativas de subtipos celulares con 0, 1, 2 y más de 4 TM (S24). (B) Demostración de subtipos celulares en astrocitomas humanos (anticuerpo específico de mutación IDH1 R132H). (C) Lado izquierdo: Fracciones relativas de GBMSC con 0, 1 o 2 y más de 4 TM en tumores S24 shControl frente a tumores shTTYH1 (20-25 días después de la implantación) (n=3 ratones por grupo; Pruebas de la t de dos colas). Lado derecho: Número absoluto de células tumorales por mm3 categorizados con respecto a estos subtipos celulares (n = 3 ratones por grupo; ANOVA en rangos). (D) Mediciones de la velocidad de invasión de S24 shControl frente a shTTYH1 GBMSC in vivo más de 24 horas subcategorizados con respecto a su número de TM (n=3 ratones por grupo; ANOVA en rangos). A-D: datos obtenidos por MPLSM in vivo.
Figura 23:
La colonización cerebral y el crecimiento de ahornas se reducen considerablemente por la deficiencia de TTYH1 (A-D) Imágenes representativas de un solo plano de S24 shControl (A) y shTTYHI (B) así como T269 shControl (C) y shTTYHI (D) tumores 20 días después de la implantación que demuestran la menor invasión provocada por la atenuación génica de TTYH1; las imágenes del medio y de la derecha muestran mayores aumentos de las regiones correspondientes en la vista general (izquierda); GBMSC (rojo), vasos sanguíneos (turquesa), círculo: sitio de inyección del tumor. Nótese que la tumorigenicidad se reduce enormemente en la línea celular T269 infiltrante altamente difusa. (E) Cuantificación correspondiente de células tumorales S24 invadidas por intervalo del tumor principal, que se definió como el área con un ancho radial de 500 pm (n = 3 ratones por grupo; pruebas de Mann-Whitney). (F) Número absoluto de células tumorales en T269 shControl frente a shTTYHI medido en una imagen de un solo plano de todo el hemisferio el día 20 (n = 3 ratones por grupo; Prueba de la t de dos colas). (G) imágenes de resonancia magnética tesla 9,4 T2 de S24 shControl (día 72) frente a tumores shTTYHI (día 75 después de la implantación), y la cuantificación correspondiente de la relación área tumoral/área cerebral (n=6 animales por grupo; Prueba de la t de dos colas); línea verde: área del tumor. (H) Gráfico de supervivencia de Kaplan-Meier de ratones S24 shControl frente a ratones portadores de tumor shTTYHI (n = 6 animales por grupo; prueba de rango logarítmico). A-F: datos obtenidos por MPLSM in vivo.
Figura 24:
Interconexiones de células tumorales mediadas por TM y radiorresistencia
(A) Proporción de S24 shControl conectado/no conectado a TM y GBMSC shTTYHI 20 y 40 días después de la implantación (n=3 ratones por grupo; pruebas de Mann-Whitney). (B) Lado izquierdo: imágenes representativas de MPLSM en 3D de tumores S24 shControl y shTTYHI antes y 7 días después de la irradiación (z=51 pm). Lado derecho: la cuantificación correspondiente muestra números absolutos de células en un volumen de 276*103 pm3 antes y 7 días después de la irradiación (n=3 animales por grupo; ANOVA en rangos). (C) Relación del número de células 7 días después/antes de la irradiación con respecto a la conectividad TM (n=3 ratones por grupo; ANOVA). A-C: datos obtenidos por MPLSM in vivo.
La presente invención se ilustrará adicionalmente mediante los siguientes ejemplos sin limitarse a los mismos. Ejemplos
Procedimientos experimentales:
Animales y procedimientos quirúrgicos.
Se usaron ratones desnudos NMRI de 8-10 semanas de edad para todos los estudios con células de tumor cerebral primario humano. Para investigar la formación de TM en un modelo de ratón de astrocitoma singénico, se usaron ratones Nestina-Tv-a; Tlx-GFP en combinación con vectores RCAS-PDGFB/AKT. Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices institucionales de investigación con animales de laboratorio después de la aprobación del Regierungsprasidium Karlsruhe, Alemania (autoridad gubernamental). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento de los animales y reducir el número de animales usados. Si los ratones mostraban síntomas neurológicos o una pérdida de peso significativa (>20 %), los experimentos se terminaron.
La implantación de la ventana craneal en ratones se realizó como se conoce en la técnica: Después de la retirada de la piel, se extrajo el hueso de los ratones anestesiados y se extrajeron las meninges. El agujero se cubrió con una ventana de vidrio redonda de 6 mm, que se pegó al hueso con cemento dental, y en la parte superior se colocó un anillo de titanio que encajaba en un soporte personalizado, para garantizar que no se produzcan artefactos de movimiento durante la toma de imágenes.
2-3 semanas después de la implantación de la ventana craneal, se inyectaron estereotácticamente 30.000 células tumorales en el cerebro del ratón a una profundidad de 500 pm, en un ángulo de 45°. Para experimentos de supervivencia, se inyectaron 50.000 células tumorales. En un subgrupo de ratones, se pegó un tubo de plástico corto debajo del vidrio, con un extremo dentro y otro fuera, que permitió la aplicación tópica de diferentes sustancias debajo de la ventana sin necesidad de volver a abrirla (por ejemplo, para obtener imágenes de calcio).
Para la microinyección intratumoral de sulforrodamina 101 (SR101, Molecular Probes, S-359), se inyectaron 50 nl de SR101 100 pM (con o sin CBX 100 pM, Sigma-Aldrich, C4790) con una pipeta de vidrio muy fina en regiones tumorales de densidades celulares similares, >90 días después de la inyección del tumor.
Los ratones desnudos NMRI macho de 8-10 semanas de edad (Charles River, Sulzfeld, Alemania) se usaron para estudiar el crecimiento de líneas celulares de tumores cerebrales primarios humanos in vivo. La implantación de la ventana craneal se realizó como se describió anteriormente. 2 semanas después de la implantación de la ventana craneal, los esferoides GBMSC se dividieron con accutase (A6964, Sigma Aldrich) para obtener una suspensión unicelular y se inyectaron corticalmente 40.000 células tumorales suspendidas en PBS a una profundidad de 500 pm. Para estudios de supervivencia y MRI, se inyectaron 50.000 células (tanto GBMSC de atenuación génica de Ttyhl como control de ARNhp adecuado), como parte de un enfoque experimental más amplio donde se investigaron múltiples atenuaciones génicas de genes. Los ratones se puntuaron clínicamente y se sacrificaron rápidamente si mostraban síntomas neurológicos o una pérdida de peso >20 %. Los tumores se irradiaron con 7 Gy durante tres días consecutivos el día 57 (+/- 8).
Tratamiento de radiación.
Los animales se anestesiaron con isoflurano y los tumores establecidos se irradiaron con 7 Gy durante tres días consecutivos (dosis total de 21 Gy) en regiones que coincidían en densidad de células tumorales usando un acelerador lineal de 6 MV con un colimador de 6 mm (ajustado al tamaño de la ventana) en una tasa de dosis de 3 Gy/min (Artiste, Siemens, Erlangen, Alemania) - o no se aplicó radiación (radiación simulada). El momento de la radiación fue alrededor del día 60 (+/- 10 días) después de la implantación del tumor. Para estudios de MRI, se usó una radiación cerebral total con la misma dosis y un tamaño de campo de 17 mm x 250 mm (que permite la irradiación de varios ratones) con el mismo acelerador. Los ojos y todos los órganos extracraneales estaban protegidos del campo de radiación. El programa de radiación usado es clínicamente relevante: su actividad biológica está en el intervalo de los 60 Gy comúnmente prescritos en fracciones de 2 Gy para pacientes con glioma maligno, asumiendo un a/p de ~ 10 en el modelo cuadrático lineal y teniendo en cuenta el corto tiempo de radiación de 3 días. Microscopía de barrido láser multifotón (MPLSM) in vivo.
La obtención de imágenes MPLSM se realizó con un microscopio Zeiss 7MP (Zeiss, Alemania) equipado con un láser Coherent Chameleon Ultrall (Coherent, Escocia). Se usaron las siguientes longitudes de onda para la excitación: 750 nm (dsRed, FITC-dextrano, tdTomate), 840 nm (Fluo-4AM), 850 nm (GFP, TRITC-dextrano, Rhod-2AM), 860 nm (CFP, para imágenes FRET) y 950 nm (tdTomate, YFP). Se usaron conjuntos de filtros apropiados [BP 500-550/b P 575-610 y BP 460-500/BP 525-560 (para FRET)]. Los ajustes convencionales para la obtención de imágenes fueron ganancias entre 650 y 750 (dependiendo de la profundidad, la intensidad de fluorescencia del fluoróforo y la calidad de la ventana) y un intervalo z de 3 pm. La potencia del láser se ajustó lo más bajo posible. Durante el procedimiento de obtención de imágenes, la temperatura corporal de los ratones se mantuvo constante usando un termómetro rectal y una almohadilla térmica. La concentración de isoflurano (en 100 % de O2) se eligió lo más baja posible (0,5-1,5%) para evitar interferencias con la comunicación del calcio entre las células de astrocitoma. Los dextranos fluorescentes [FITC (2M MW) - o TRITC (500.000 MW) - conjugado, 10 mg/ml, Sigma] se inyectaron i.v. para obtener angiogramas, lo que permitió determinar la posición relativa de las células de glioma a lo largo del tiempo.
Para la ablación in vivo de células de astrocitoma individuales, solo el volumen del núcleo celular marcado con GFP se expuso a un barrido continuo con un rayo láser de alta potencia y el láser se detuvo cuando se hizo visible la desintegración del núcleo. Se obtuvieron imágenes de la región inmediatamente después de la muerte inducida por láser y a las 1,5 h, 12 h, 24 h, 40 h y 60 h. Para investigar la reacción de los TM después del fotodaño de una región cerebral más amplia, un volumen mayor (0,5-1 x 106pm3) se escaneó repetidamente durante aprox. 8 minutos con alta potencia, dando como resultado una dosis total de fotones que fue >50 veces más alta que durante la obtención de imágenes de "diagnóstico".
Para estudios TTYH1, se usó un filtro BP500-550/BP 575-610 y las siguientes longitudes de onda: 850 nm (GFP, TRITC-dextrano) y 950 nm (tdTomate). Se usaron intervalos z de 3 pm y ganancias entre 620 y 750. La potencia del láser se ajustó lo más baja posible para evitar la fototoxicidad. Para la generación de imágenes in vivo, los ratones fueron narcotizados con isoflurano (en 100 % de O2). Los ratones se fijaron usando un anillo de titanio implantado a medida para garantizar una fijación estable e indolora durante los procedimientos de generación de imágenes repetitivos. El anillo también sirvió como depósito de agua permitiendo una adquisición de imágenes más prolongada. Un TRITC-Dextrano de alto peso molecular (500 kDa; 52194, Sigma Aldrich; 10 pg ml-1) se inyectó en la vena de la cola para realizar una angiografía. Los angiogramas superficiales hicieron posible encontrar exactamente la misma región durante puntos de tiempo de imágenes repetitivos, y la arquitectura de la vasculatura ayudó a identificar las mismas células durante un largo período de tiempo. Durante el procedimiento de obtención de imágenes, la temperatura corporal se mantuvo constante usando un termómetro rectal y una almohadilla térmica. Formación de imágenes de calcio in vivo con MPLSM.
Se usaron los siguientes indicadores de calcio de moléculas pequeñas: para células tumorales transfectadas con GFP: Rhod-2AM 2 mM (life technologies, R-1244); para RFP-transfectado: Fluo-4AM 2 mM (life technologies, F-14201). Los tintes disueltos se aplicaron a la superficie del cerebro durante 45 min. Se usaron regiones con una densidad de células tumorales similar. Para la combinación de radioterapia y formación de imágenes de calcio, los ratones se pretrataron con Fluo-4AM y se obtuvieron imágenes después de despertar con isoflurano bajo (0,5 %). Una hora después de la radioterapia, se obtuvieron imágenes de las mismas regiones para detectar cambios en la actividad del calcio. La inhibición farmacológica de la unión comunicante se logró mediante superfusión con el inhibidor de la unión comunicante CBX (100 pM; sustancia control: solución salina extracelular; n=3 ratones por grupo). Otras sustancias superfundidas fueron suramina (100 pM, antagonista de ATP) y borato de 2aminoetoxidifenilo (2-APB, 100 j M, inhibidor de los receptores de IP3).
Dos indicadores de calcio codificados genéticamente se transdujeron de forma lentivírica a GBMSC: (A) El sensor Lck-GCaMP3 en el vector rrl-CAG-IGC3 (promotor CAG para controlar la expresión de DsRed y sensor de Ca2+ que monitoriza cambios cercanos a la membrana en [Ca2+]I). (B) El sensor radiométrico de calcio Twitch-3 se usó para determinar las concentraciones de calcio intracelular mediante la transferencia de energía de resonancia de Forster (FRET) como se conoce en la técnica.
Estudios de MRI.
Las imágenes de MRI se obtuvieron el día 72 después de la implantación del tumor para los animales no irradiados y el día 115 para los ratones irradiados (60 días después de la radioterapia; se eligieron puntos de tiempo cuando los primeros animales de control desarrollaron síntomas neurológicos y/o perdieron un 20 % de peso, y tuvieron que ser sacrificados). Todas las exploraciones se realizaron en un escáner de RM de calibre horizontal de 9,4 T (BioSpec 94/20 USR, Bruker BioSpin GmbH, Ettlingen, Alemania) con una bobina de superficie de matriz en fase de cuatro canales. Los animales estaban bajo anestesia por inhalación. Se adquirió una secuencia de Adquisición Rápida con Ecos Reenfocados (RARE, por sus siglas en inglés) ponderada en T2 para determinar el volumen del tumor.
Las imágenes de MRI se obtuvieron el día 72 (S24 shControl) y el día 75 (S24 shTTYHI) después de la implantación de células tumorales en un escáner de RM de calibre horizontal de 9,4 T (BioSpec 94/20 USR, Bruker BioSpin GmbH) con una bobina de superficie de matriz en fase de cuatro canales. Para determinar el volumen tumoral se usó una secuencia de adquisición rápida ponderada en T2 con ecos reenfocados (RARE).
Experimentos de líneas celulares y cultivos celulares.
Las líneas de células tumorales derivadas de glioblastomas resecados se cultivaron en DMEM-F12 en condiciones sin suero ("similares a células madre") (GBMSC; P3, S24, T1, T269, T325, WJ). Estas 6 líneas de GBMSC se seleccionaron porque eran capaces de convertirse en tumores en cerebros de ratón. Dos líneas celulares de oligodendroglioma que albergaban la codeleción típica 1p/19q (BT088 y BT054) se mantuvieron en las mismas condiciones de cultivo; solo BT088 pudo formar tumores en ratones. Para garantizar la autenticidad, se confirmaron los cambios genéticos típicos del glioblastoma para S24 usando hibridación genómica comparativa (CGH, consúltese la Figura 2i); las líneas T1, T269, T325 y WJ se habían caracterizado antes, así como la línea P3. Las células se revisaron periódicamente para detectar infecciones por micoplasma y su autenticidad.
Las células tumorales se transdujeron con vectores lentivíricos para obtener imágenes multicolores y la detección in vivo de diferentes compartimentos celulares. Para la expresión de GFP citosólica, se usaron el pLKO.1-puro-CMV-TurboGFP_shnon-target-vector (SHC016 Sigma Aldrich), para la expresión citosólica de RFP (tdTomate) se utilizó el vector LeGo-T2 (amable obsequio de A. Trumpp) y la expresión nuclear de GFP (H2B-GFP) se logró mediante transducción con pLKO.1-LV-GFP (Addgene 25999, Elaine Fuchs). La transducción con pLenti6.2 hygro/V5-Lifeact-YFP (amable obsequio de P. Friedl) hizo posible obtener imágenes de la dinámica in vivo de los filamentos de actina, FUmGW (Addgene 22479, Connie Cepko) permitió la ilustración in vivo de las membranas celulares. Los microtúbulos se marcaron con el biosensor lentivírico LentiBrite™ GFP-Tubulin (17-10206, Merck Millipore). Se produjeron partículas lentivíricas como se conoce en la técnica. Para el seguimiento in vivo de Miosina II, se realizó una transfección de plásmido con FuGENE® HD (Promega) con el vector Myosin-IIA-GFP (Addgene 38297, Matthew Krummel).
La producción de atenuaciones génicas lentivíricas de Cx43 (pLKO1.1-puro-CMV-tGFP-vector, Sigma Aldrich, secuencia diana: GCCCAAACTGATGGTGTCAAT; SEQ ID NO: 19) y GAP-43 (pLKO1.1-puro-CMV-vector, Sigma Aldrich, secuencia diana: TGTAGATGAAACCAAACCTAA; SEQ ID NO: 3) mediante tecnología ARNhp se llevó a cabo como se conoce en la técnica. Las células control se infectaron con las partículas lentivíricas de ARNhp no diana apropiadas (SHC016, Sigma Aldrich). Para la sobreexpresión de GAP-43, el marco de lectura abierto de GAP-43 se clonó en el esqueleto del vector pCCL.PPT.SFFV.MCS.IRES.eGFP.WPRE (amable obsequio de H. Glimm). La producción de partículas lentivíricas y la transducción de células diana se realizó como se conoce en la técnica. Las células tumorales se incubaron con el virus recolectado y 8 mg/ml de polibreno (Merck Millipore, Darmstadt, Alemania) durante 24 h. Para algunos fines, las células se transdujeron secuencialmente con diferentes vectores. La eficiencia de la transducción se comprobó mediante la intensidad de fluorescencia de GFP y el análisis de transferencia Western. La cuantificación reveló un 80 % de atenuación génica de proteínas para Cx43 y un 92,5 % para GAP-43 (análisis de transferencia Western). Si fuera necesario, las células tumorales se seleccionaron para los fluoróforos mediante clasificación FACS (clasificador de células BD FACSAria™ II) o antibióticos.
Para el seguimiento de las mitocondrias, se usó la tecnología BacMam 2.0 (CellLight® Mitochondria-GFP, BacMam 2.0, C10600, Life technologies).
Las líneas celulares de glioblastoma primario humano (GBMSC: S24, T269, T325, T1) se cultivaron en medio DMEM-F12 (31330-038, Gibco) en condiciones no adherentes sin suero, incluyendo el suplemento B27 (12587-010, Gibco), insulina 5 jg ml-1 (I9278, Sigma Aldrich), heparina 5 jg ml-1 (H4784, Sigma Aldrich), factor de crecimiento epidérmico 20 |jg ml-1 (rhEGF, 236-EG, R&D Systems) y factor de crecimiento de fibroblastos básico 20 |jg ml-1 (bFGF, PHG0021, ThermoFisher Scientific). Para condiciones adherentes, se cultivaron células de glioma S24 en DMEM (D6429, Sigma Aldrich) con FBS al 10 % (F7524, Sigma Aldrich).
Las GBMSC se transdujeron de manera estable con vectores lentivíricos para rastrear las células durante MPLSM in vivo. La expresión de RFP citosólica (tdTomate) se logró mediante transducción con el vector LeGo-T2 (obsequio de A. Trumpp). La atenuación génica lentivírica de TTYH1 (vector plKO.1-puro-CMV, Sigma Aldrich, secuencia diana: TCAGACATCCTGAGCTATTAT (SEQ ID NO: 12; para atenuación génica en S24), GCTCTGACCACTAACACTCTT (SEQ ID NO: 16; para atenuación génica en T269)) y VGF (secuencia diana no mostrada) mediante tecnología de ARNhp se llevó a cabo como se conoce en la técnica. Las secuencias de ARNhp se eligieron entre cinco secuencias diana diferentes probadas, de acuerdo con su capacidad para producir una reducción máxima de la expresión de proteínas conservando mejores capacidades de crecimiento in vitro de las células tumorales. Las células control se transdujeron con partículas lentivíricas apropiadas de plKO.1-puro-CMV-TurboGFP_shnon-target-vector (SHC016, Sigma Aldrich). Para la transducción, las células se incubaron con partículas lentivíricas y polibreno 10 jg ml-1 (TR-1003-G, Merck Millipore) durante 24 horas.
El análisis de transferencia Western reveló una atenuación génica del 95 % para VGF y una atenuación génica del 30 % para TTYH1 en la línea celular S24 GBMSC, y una atenuación génica del 96 % en la línea celular T269 GBMSC. Todas las células se probaron regularmente para detectar infecciones por micoplasma y se realizaron controles de especies para verificar su autenticidad.
Inmunohistoquímica (IHC) e Inmunocitoquímica (ICC).
Para IHC e ICC, se usaron protocolos convencionales. Para análisis del cerebro humano, se obtuvieron secciones delgadas (3 jm ) de tejido humano embebido en parafina fijado con formalina del Dpto. de Neuropatología en Heidelberg de acuerdo con la aprobación ética local. Las secciones humanas se incubaron con anticuerpos anti-IDH1 R132H (H09, Dianova), anti-Cx43 (C 6219, Sigma), anti-GAP-43 (8945, Cell Signaling), anti-NGF (ab52918, Abcam), anti-NT4 (ab150437, Abcam), anti-TrkA (ab76291, Abcam) y anti-TrkB (ab134155, Abcam). Si no se indica explícitamente, todos los oligodendrogliomas tenían una codeleción 1p/19q, y todos los astrocitomas no estaban codelecionados para 1p/19q. Para detectar células tumorales contralaterales en cerebros humanos, se analizaron grandes secciones como se conoce en la técnica. Para la detección por inmunofluorescencia de células tumorales IDH1 R132H positivas en secciones gruesas de tumores cerebrales humanos, se cortaron muestras humanas fijadas con paraformaldehído (PFA) en secciones de 100 jm y se incubaron durante 24 horas con el anticuerpo IDH1 R132H.
Para análisis de cerebro de ratón, los animales se perfundieron transcardialmente con PBS seguido de PFA al 4,5 %. Para ICC, las células se cultivaron en portaobjetos de vidrio durante 4 días y se fijaron con PFA. Se usaron los siguientes anticuerpos para secciones de criotomo de 10 jm e ICC: anti-nestina (ab6320, Abcam, tinción específica del filamento intermedio de nestina humana, que está altamente expresado en GBMSC, pero no detectable en el cerebro normal de un ratón), en combinación con anti-p-catenina (ab16051, Abcam), anti-p-parvina (sc-50775, Santa Cruz), anti-beta tubulina III (ab18207, Abcam), anti-Cx26 (ab59020, Abcam), anti-Cx31 (ab156582, Abcam), anti-Cx37 (ab185820, Abcam), anti-Cx43 (C6219, Sigma), anti-GAP-43 (8945, Cell Signaling), anti-GFAP (Z0334, Dako), anti-Ki-67 (M7240, Dako), anti-miosina IIa (ab24762, Abcam), anti-miosina X (22430002, Novus Bioscience), anti-N-Cadherina (ab18203, Abcam) y anti-PDI (ab3672, Abcam). Las imágenes se adquirieron usando un microscopio confocal Leica SP5.
En los estudios de TTYH1, para inmunohistoquímica, los ratones con tumores cerebrales completamente establecidos fueron perfundidos cardialmente con PBS, seguido de una solución de formaldehído tamponada con fosfato al 4,5 % (Roti-Histofix al 4,5 %, 2213, Carl Roth). Los cerebros se incubaron en una solución de sacarosa al 30 % durante la noche para crioprotección y luego se congelaron. La recuperación del epítopo inducida por calor con tampón citrato 0,01 M (pH=6,0) se realizó antes de la tinción inmunohistoquímica. Para inmunocitoquímica, las células se cultivaron en cubreobjetos durante 3 días y se fijaron con una solución de formaldehído al 4,5 % (Roti-Histofix al 4,5 %, 2213, Carl Roth) o acetona en lo sucesivo. Se usaron los siguientes anticuerpos para la tinción de secciones de criotomo de 10 jm e ICC: anti-nestina (ab6320, Abcam), anti-TTYH1 (HPA023617, Sigma Aldrich), anti-Integrina a5 (ab6131, Abcam), anti-VGF (PA5-20523, ThermoFisher Scientific). Como anticuerpos secundarios IgG de cabra anti-ratón, se usaron conjugado Alexa Fluor 488 (A-11029, ThermoFisher Scientific) e IgG de cabra anti-conejo, conjugado Alexa Fluor 633 (A-21070, ThermoFisher Scientific). Para la demostración de subtipos celulares en un espécimen de astrocitoma humano con mutación en IDH1, se fijaron muestras de tumores cerebrales humanos en PFA al 4% y se cortaron secciones de 100 jm en un vibratomo. La recuperación de antígeno inducida por calor se realizó con tampón Tris-EDTA. Las secciones flotantes libres se incubaron con el anticuerpo primario anti-IDH1 R132H (DIA H09; Dianova) durante 24 horas. Se usó un anticuerpo secundario anti­ ratón conjugado con AF488 (A11029; life technologies). Se usó una solución de Sudan Black para la reducción de la autofluorescencia. Para los cómputos IDH1/TTYH1 de un espécimen de astrocitoma humano, Se desparafinizaron secciones de 3 jm de muestras de tejido embebidas en parafina y se realizó la recuperación de antígeno inducida por calor con solución de acondicionamiento celular (pH=6,0) (CC2, n.° 950-123, Ventana). Se usaron anticuerpos primarios anti-IDH1 R132H (DIA H09; Dianova) y anti-TTYH1 (HPA023617, Sigma Aldrich).
Se adquirieron imágenes inmunohistoquímicas e inmunocitoquímicas confocales usando un microscopio Leica TCS SP5.
Fotooxidación de GFP y microscopía electrónica de barrido (MEB) de sección en serie.
Se prepararon diez bloques de tejido de tumor cerebral S24 GBMSC para fotooxidación como se conoce en la técnica. Se produjeron secciones en serie de 70 nm de espesor de tejido embebido en epon fotooxidado usando MEB 3D como se conoce en la técnica. Se formaron imágenes de un volumen de 747 pm3 y se reconstruyeron 6 de los 51 filamentos tumorales analizados en el mismo para el análisis del diámetro de t M. Con fines ilustrativos, también se reconstruyeron axones. Se formaron imágenes de las muestras con un microscopio electrónico de barrido Zeiss 1530. Las imágenes se alinearon manualmente. La membrana plasmática de los TM y los axones se trazó manualmente en cada sección dando como resultado un conjunto de contornos.
Para EM de esferoides, los esferoides de cinco días se fijaron con PFA al 4 %/GA al 0,5 %, se incubaron en ácido cacodílico y se fijaron posteriormente en ferrocianuro de potasio al 1,5 % y tetróxido de osmio al 2 %. Las secciones se deshidrataron y se almacenaron en epoxi/propilenóxido (1:1) durante la noche. Las secciones se embebieron en resina epoxi. Se prepararon secciones seriadas y se analizó un volumen de 2692 pm3
Transferencia Western.
Se realizaron transferencias Western de acuerdo con protocolos convencionales. Los lisados de proteína total (20­ 50 pg) se separaron electroforéticamente usando SDS-PAGE al 10%. Después de transferir y bloquear, los siguientes anticuerpos se usaron durante la noche a 4 °C: anti-Cx26 (ab59020, Abcam), anti-Cx31 (ab156582, Abcam), anti-Cx37 (ab185820, Abcam), anti-Cx43 (C 6219, Sigma), anti-GAP-43 (8945, Cell Signaling). Como control de carga, se usó anticuerpo anti-GAPDH (C4780, Linaris) o anticuerpo antialfa-tubulina (T9026, Sigma). Para estudios TTYH1, los geles se incubaron con anti-TTYH1 (HPA023617, Sigma Aldrich) y anti-VGF (PA5-20523, ThermoFisher Scientific) después de secar y bloquear durante la noche a 4 °C. Las transferencias se incubaron con anticuerpo secundario de burro anti-conejo enlazado a HRP (NA9340-1 ml, GE Healthcare) a temperatura ambiente durante 1 hora. Como control de carga se usaron anticuerpos anti-GAPDH (C4789, Linaris) e IgG-HRP de burro anti­ cabra (sc-2020, Santa Cruz Biotechnology). Los niveles de expresión de proteínas se midieron con ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD) después de la digitalización de películas Super RX-N (Fujifilm).
Electroporación/microinyección.
Se obtuvieron cortes de cerebro agudos horizontales de 2 ratones desnudos NMRI con S24 de 131 días como se conoce en la técnica. Los electrodos de parche con resistencias de 5-10 MQ se cargaron con amarillo lucifer (5 mg/ml, L0259, Sigma Aldrich) y se acercó a las células tumorales identificadas bajo control visual usando una lente de inmersión 63x, NA 1,0 (Zeiss). El colorante se transfirió a las células tumorales con un Axoporator 800A (Axon instruments) mediante pulsos de voltaje cuadrado de 1 ms a 50 Hz. La amplitud del pulso se ajustó entre -5 V y -20 V y la duración del tren se ajustó a 3 s para recibir un marcaje suficiente de la célula diana. Después de la electroporación, los presentes inventores obtuvieron dos pilas confocales secuenciales de color (LSM 5, Zeiss). Procesamiento de imágenes.
Las imágenes MPLSM fueron adquiridas por el software ZEISS ZEN (Zeiss, Alemania). Después del cálculo de la imagen principal (por ejemplo, la resta de diferentes canales para retirar el fondo no específico), las imágenes se transfirieron a Imaris (Bitplane, Suiza) para permitir la visualización en 3D, la representación y el análisis de los datos (para más detalles véase a continuación). Aquí, un subconjunto de imágenes se filtró con un filtro gaussiano después del análisis y antes de la extracción. Para la ilustración de diferentes aspectos planos individuales, se usaron proyecciones de máxima intensidad (MIP) o imágenes en 3D. Para una ilustración ilustrativa de la interconectividad de las células tumorales y las ramas de TM, las pilas z se renderizaron manualmente (cuerpos de células tumorales: función de superficie; t M: función de seguimiento de filamentos). Cuando un TM empezó en una célula y terminó en otra, estas células se definieron como conectadas. Se reconstruyeron micrografías electrónicas en serie usando el software OpenCAR. El análisis 3D de las imágenes EM se realizó usando el software Amira 5.4.6 (Visage Imaging, Richmond, Australia). Algunos de los datos (por ejemplo, imágenes de calcio) se transfirieron al software ImageJ (Rasband, W.S., ImageJ, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, EE.UU.). Los videos se extrajeron de ZEN o Imaris y se editaron en Adobe Premiere (Adobe Premiere Pro CS6, EE.UU.).
Cuantificación de datos de imágenes de histología y MPLSM.
En el tejido tumoral del paciente (solo de resecciones de tumores primarios), la longitud máxima de TM se midió en secciones de IDH1-IHC delgadas de 3 pm convencionales. Aquí, los TM se dividieron en 3 grupos: <50 pm (no califica como TM definido, porque otras estructuras celulares aún pueden confundirse con estructuras filamentosas de esta longitud); TM más cortos de 50-100 pm y TM más largos de >100 pm de longitud. El análisis cuantitativo de IHC humanas se realizó mediante una Histo-Puntuación (intervalo 0-300) como se conoce en la técnica.
Para datos de formación de imágenes in vivo, los números de TM, ramas/TM y conexiones/célula se contaron manualmente y las longitudes de TM se midieron manualmente en el modo de corte en Imaris. Para la cuantificación y análisis de células tumorales/TM antes y después de la radioterapia, las células se contaron en las mismas regiones antes de la radiación o la radiación simulada, y en diferentes momentos en lo sucesivo. Las células sin una conexión TM se definieron como "no conectadas" y las células con al menos una conexión o conexiones TM como "conectadas". Para analizar el número de TM antes y después de la irradiación, se contaron los TM de células individuales idénticas en ambos momentos. Se calcularon las proporciones para determinar los cambios relativos de los números de células y TM a lo largo del tiempo. Para la medición de los volúmenes tumorales en tumores BT088 antes y después de la radioterapia, se analizaron dos regiones por animal usando la función de superficie de Imaris. La velocidad media de la invasión de las células tumorales en los tumores S24 shControl frente a los tumores shGAP-43 se determinó mediante el análisis de tres puntos de tiempo de obtención de imágenes consecutivos dentro de un intervalo de tiempo de 24 horas in vivo. Las distancias de las células tumorales a la masa tumoral principal (definida como un radio de 0,5 mm alrededor de la mitad del tumor principal) se analizaron y se agruparon, o se mostraron como distancias individuales al núcleo tumoral principal en tumores que eran mucho menos invasivos (oligodendrogliomas). Los núcleos y las mitocondrias (datos de imágenes de lapso de tiempo) se marcaron usando la función de puntos de Imaris. Se conectaron a las pistas y se calculó la velocidad media de la pista. Las mitocondrias se clasificaron como localizadas en un TM ("TM") o soma de las células tumorales ("soma"). Para la cuantificación y análisis de la intensidad de fluorescencia después de la aplicación de SR101, todas las células tumorales que expresan GFP en un volumen se marcaron usando la función de puntos de Imaris y después se calcularon las intensidades medias del canal SR101 de estos puntos y se compararon entre sí.
Para el análisis de células inyectadas de amarillo lucifer, estas células se habían agrupado como "conectadas" o "no conectadas" dependiendo de su capacidad para transferir el tinte a las células vecinas antes del análisis de las intensidades medias de fluorescencia para el amarillo lucifer en estas células.
Las células positivas para Ki67 se contaron en 2 regiones (masa tumoral principal)/animal y se dividieron por el número total de núcleos teñidos con DAPI en estas regiones.
Cuantificación y análisis de datos de imágenes de calcio.
Las células tumorales o los astrocitos cerebrales no malignos se marcaron manualmente mediante el uso del ROI Manager de ImageJ. Los valores medios de gris se midieron a lo largo del tiempo. Estos datos fueron procesados por el programa GNU Octave 3.8.1 (John W. Eaton, GPL): las imágenes se normalizaron a la fluorescencia de fondo utilizando un intervalo deslizante de ± 10 imágenes. Los máximos locales de las señales de calcio fueron detectados por la función findpeaks (paquete de señales, Octave-Forge). Por lo tanto, pudo determinarse el número de picos de calcio de cada célula (N) y se calculó la frecuencia (f). La frecuencia se estandarizó para el número de celda de cada región para garantizar la comparabilidad. Se determinaron las células síncronas, el número de comunicaciones síncronas y el momento del disparo síncrono. Debido al hecho de que las imágenes se grabaron a través de un modo de línea, lo que conduce a una latencia en la detección de la señal, el análisis se realizó en una ventana de 2 fotogramas alrededor de cada pico. Esto permitió evaluar la sincronicidad S (SeR" U {0}), que se definió como la fracción del número total de células sincrónicas (N_Sín) dividido por el número de picos de calcio para la célula dada (N_Ca). En caso de que las celdas no estuvieran activas, se asignó una sincronicidad de cero.
^ p a r a N Ca> 0
Sincronicidad S =
. 0 para NCa = 0
Por tanto, la sincronicidad establece el número promedio de interacciones en el mismo momento. Por ejemplo, en un sistema con una sincronicidad de 1, una célula de disparo interactúa con una segunda. Para una sincronicidad de 10, una célula activa se comunica con otras 10 células.
Para la comparación entre diferentes bloqueadores in vivo, la sincronicidad se normalizó al nivel del valor inicial. Finalmente, los resultados se resumieron mediante un mapa de calor. El número de picos de calcio de estas células se codificó mediante un mapa de colores. Las células sincrónicas estaban conectadas por líneas, donde el color describía el momento del disparo sincrónico.
Para la medición de los cambios relativos en la intensidad de la fluorescencia, las células tumorales se marcaron de nuevo manualmente y se calcularon los cambios relativos (deltaF/F0). F0 se definió como la intensidad media del 20 % de los valores de gris más bajos en un ROI.
Para la cuantificación de los niveles de calcio intracelular, las intensidades de fluorescencia de cpVenusCD y CFP se midieron en células conectadas y no conectadas a TM antes y 2 días después de la radioterapia usando la función de puntos de Imaris. Para cada célula, estos valores se representaron gráficamente y se realizó un análisis de regresión lineal. Los valores de r2 altos representaron una concentración de calcio homogénea en las diferentes poblaciones, mientras que los valores de r2 bajos reflejaban niveles heterogéneos de calcio en una población de células.
Cuantificación y análisis de imágenes de MRI.
Se eligió el corte con el área tumoral más grande por ratón y tanto el tumor (hiperintenso en imágenes ponderadas en T2) como todo el cerebro se segmentaron manualmente. La proporción de estas dos áreas se determinó y comparó entre los diferentes grupos (n=6 ratones por grupo, pruebas de la t).
Caracterización funcional de la expresión diferencial de ARNm.
Los datos brutos de secuenciación de ARN (asignados a genes) y los datos de mutación IDH-1/2 curados se descargaron por primera vez del portal de datos The Cancer Genome Atlas (TCGA) el 30 de enero de 2015 y se actualizaron por última vez el 6 de mayo de 2015. Adicionalmente, se adquirieron llamadas de números de copia (utilizando g IsTIC 2.0) de cBioPortal64 y 450k-, así como resultados de agrupación CNV-NMF de Broad GDAC Firehose (http://gdac.broadinstitute.org/). Solo se mantuvieron las muestras mutantes de IDH que claramente se agruparon en el grupo codificado o no codificado (y tenían el perfil de número de copia respectivo) (197 muestras (127 no codelecionadas, 70 codelecionadas) en total para análisis adicionales. En primer lugar, el análisis de normalización y expresión génica diferencial de los recuentos de secuenciación de ARN se realizó usando el paquete65 edgeR, que asume una distribución binomial negativa de los datos de recuento, filtrando transcritos de baja expresión. Las rutas de señalización activadas diferencialmente y los efectos descendentes entre los tumores mutantes IDH codelecionados y no codelecionados se analizaron con el patentado Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN, Redwood City, CA, e E.UU.) usando un filtro de múltiplo de variación de |1,5| y FDR-q <0,0566 para la lista de entrada. En resumen, el software calcula tanto un valor p de superposición (basado en la prueba exacta de Fisher) como una puntuación z de activación, que se basa en el estado de expresión de genes activadores e inhibidores, para rutas curadas manualmente y funciones biológicas posteriores. Para este estudio exploratorio, de generación de hipótesis, se mantuvieron resultados tanto con p < 0,1 como una puntuación z > |1,5|.
Estadísticas.
Los resultados de los análisis de imágenes se transfirieron al software SigmaPlot (software Systat, Inc., San José, California, EE.UU.) para probar la significancia estadística con las pruebas apropiadas (los datos se probaron para la normalidad usando la prueba de Shapiro-Wilk y para una varianza igual). Las cuantificaciones se realizaron a ciegas por dos investigadores independientes. La significación estadística se evaluó mediante la prueba de la t de Student bilateral para datos distribuidos normalmente. De lo contrario, se utilizó una prueba de Mann-Whitney para distribuciones no normales. Para más de dos grupos se realizó un ANOVA unidireccional o un ANOVA en los rangos. Para el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier, se realizó una prueba de rango logarítmico. Los resultados se consideraron estadísticamente significativos si el valor de p estaba por debajo de 0,05. Los tamaños de los grupos de animales se eligieron empíricamente y las mediciones longitudinales permitieron reducir el número de animales manteniendo una potencia adecuada. Si se aplicaron tratamientos, los animales se asignaron al azar a estos procedimientos. Los datos in vivo cuantitativos se representan normalmente como media ± desviación estándar. Los valores de sincronicidad y frecuencia de imágenes de calcio calculados se corrigieron para valores atípicos usando la prueba de Nalimov.
Para estudios TTYH1, los datos cuantitativos obtenidos se transfirieron al software SigmaPlot (Systat Software GmbH, Alemania) para probar la significancia estadística con las pruebas apropiadas. Se probó la normalidad de los conjuntos de datos con la prueba de Shapiro-Wilk. La significación estadística de los datos distribuidos normalmente se evaluó mediante una prueba de la t de Student bilateral. Los datos distribuidos de forma no normal se evaluaron con una prueba de suma de rangos de Mann-Whitney. Para análisis estadísticos de conjuntos de datos con más de dos grupos se realizaron ANOVA o ANOVA en rangos con las pruebas post-hoc apropiadas (Tukey para ANOVA, Student-Newman-Keuls y Dunn para ANOVA en rangos). Para el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier, se realizó una prueba de rango logarítmico. Para la correlación entre el nivel de proteína TTYH1 y el coeficiente de correlación se realizó un análisis de regresión lineal. Los resultados se consideraron estadísticamente significativos si el valor de p fue <0,05.
Los datos de MPLSM cuantitativo in vivo se representan como media, las barras de error muestran las desviaciones estándar. * P<0,05, ** P<0,01, *** P<0,001
Ensayo de invasión.
Para estudiar la capacidad de invasión de las GBMSC humanas in vitro, se sembraron esferoides individuales de GBMSC en un gel de matriz de colágeno I (Collagen I, A1048301, ThermoFisher Scientific; MEM, 31095-029, Gibco; Fibronectina, F2006, Sigma Aldrich) y la propagación de GBMSC individuales se controló mediante imágenes de microscopio óptico después de 0 y 48 horas. Para cuantificación, se midió la distancia radial de las 60 células de glioma invadidas más lejanas en la circunferencia completa del esferoide (aproximadamente una célula por 6°) y se expresó como diferencia con la distancia radial media del esferoide a las 0 horas.
Cuantificación de imágenes MPLSM y datos de MRI.
Para estudios TTYH1, los datos de MPLSM in vivo se analizaron usando Imaris (Bitplane, Suiza) e ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD). Para medidas de longitud de TM, los TM se midieron manualmente en el modo de corte de Imaris. Para las mediciones de la distancia de invasión, la distancia radial de todas las células tumorales invadidas desde los bordes del tumor se midió en el modo de corte de Imaris. La velocidad de invasión de diferentes subgrupos de GBMSC in vivo se determinó siguiendo las células tumorales individuales en tres puntos de tiempo dentro de las 24 horas del día 20 (+/-1) después de la inyección del tumor. La distancia entre las células tumorales y la masa tumoral (definida como un área con un ancho radial de 500 pm) se midió en una imagen de un solo plano. El número de TM por célula, la conectividad y el número de células antes y después de la radioterapia se contaron manualmente en las mismas regiones en diferentes momentos. Una célula se clasificó como conectada si al menos uno de sus TM conectaba directamente dos cuerpos de células tumorales. Para el coeficiente de invasión, el número de células a más de 1500 pm del centro del volumen del tumor se estableció en proporción al área del volumen del tumor.
Para la cuantificación de la relación tumor/área cerebral en resonancias magnéticas, el tumor y toda el área del cerebro se midieron manualmente en el portaobjetos ponderado en T2 con la mayor expansión tumoral.
Análisis de micromatrices de ARN y de rutas de ingenuidad
Para el análisis de micromatrices de ARN, las células se cultivaron en condiciones no adherentes sin suero o adherentes durante 4 semanas. Se recogieron triplicados biológicos y se aisló el ARN usando un kit RNeasy Mini (74104, Qiagen). El ARN se eluyó en TE/agua. La calidad del a Rn total se verificó mediante análisis en gel utilizando el ensayo de Nanochip de ARN total en un bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies GmbH, Berlín, Alemania). Solo se seleccionaron muestras con valores de índice de ARN superiores a 8,5 para el perfil de expresión. Las matrices Illumina Human Sentrix-12 BeadChip (Illumina, Inc.) se prepararon de acuerdo con el procedimiento de etiquetado de muestras recomendado por Illumina basado en el protocolo Eberwine modificado. El escaneo de micromatrices se realizó utilizando un escáner de matrices iScan. La extracción de datos se realizó para todas las perlas individualmente y los valores atípicos se retiraron cuando la diferencia absoluta con la mediana fue mayor que 2,5 veces MAD (método de Hampel 2,5). A continuación, todos los puntos de datos de nivel de perlas restantes se normalizaron por cuantiles. Para probar la significancia se utilizó la prueba de la t de Student en los valores de expresión de las perlas de los dos grupos de interés. En el caso de la importancia de la expresión contra el fondo, los presentes inventores probaron más que todas las perlas negativas para esta muestra y en el caso de comparar grupos separados, los presentes inventores probaron la desigualdad de las medias de los grupos. En ambos casos se aplicó la corrección de Benjamini-Hochberg al conjunto completo de valores p de todos los ProbelD en el chip. El valor de expresión promedio se calcula como la media de las expresiones medidas de las perlas junto con la desviación estándar de las perlas.
La lista de genes expresados diferencialmente se ingresó en análisis de rutas de ingenuidad (Qiagen, Redwood City, CA, EE.UU.), usando un múltiplo de variación > |2,5| y valor de p ajustado por FDR < 0,05 como criterio de inclusión. En resumen, el software calcula tanto un valor p de superposición (basado en la prueba exacta de Fisher) como una puntuación z de activación, que se basa en el estado de expresión de genes activadores e inhibidores, para funciones biológicas curadas manualmente. Para obtener una puntuación de activación para las categorías de funciones, los presentes inventores calcularon una puntuación z de activación media para todas las funciones incluidas en la categoría respectiva y, en paralelo, generaron una estadística de suma continua que se aumentó en 1 cuando se activó una función (z > 0) y disminuyó en 1 cuando se inhibió una función (z < 0) y finalmente se dividió entre el número de funciones en una categoría. La puntuación de activación de la categoría se calculó como puntuación z media * |suma acumulada|, para resaltar categorías activadas homogéneamente.
Ejemplo 1:
Tubos de membrana en progresión del glioma.
Para estudiar la aparición y la dinámica de las protrusiones de los tubos de membrana en tumores de mamíferos, los gliomas que crecen en el cerebro del ratón fueron seguidos por microscopía de barrido láser multifotón (MPLSM) in vivo en tres dimensiones hasta una profundidad de 750 pm, hasta durante un año. Después del trasplante de líneas celulares de glioblastoma derivadas de pacientes (n=6) que se mantuvieron en condiciones libres de suero, similares a células madre (GBMSC; Figura 2), muchas células tumorales formaron protrusiones celulares ultralargas. Estas protrusiones infiltraron el cerebro normal en el frente invasivo (Figura 1a), donde las células del astrocitoma se extendieron y retrajeron en un modo de barrido. El análisis de la dinámica de la punta de protrusión reveló una alta motilidad (Figura 21), similar a los conos de crecimiento neuronal durante el desarrollo. Cuando los tumores progresaron, el número de protrusiones celulares aumentó aún más, excediendo algunos 500 pm de longitud (Figura 1b). Los tubos de membrana resultantes se usaron como pistas para el viaje de los núcleos celulares, por ejemplo, después de la división nuclear (Figura 1c). Tomado en conjunto, estos datos sugieren que la formación de tubos de membrana es un medio eficaz de diseminación tumoral, añadiéndose a las estrategias conocidas.
Todos los tubos de membrana eran ricos en actina (Figura 1d), lo que también es típico de la mayoría de los nanotubos de membrana (MN). Por otra parte, la inmunohistoquímica y las imágenes en vivo revelaron que estaban encerrados por una membrana celular continua y eran positivos para miosina IIa, microtúbulos y proteína disulfuro isomerasa; parcialmente positivos para p-catenina, p-parvina y el marcador astrocítico GFAP; pero en gran parte negativos para N-cadherina, miosina X y el marcador neuronal p-tubulina III (Figura 3a, b). En conjunto, esto indica que estos tubos de membrana tienen una composición única y una potente maquinaria de motilidad; este último se comparte con otras extensiones celulares como MN, filopodios y neuritas. La arborización dendrítica fue frecuente, originándose tubos delgados de membrana a partir de los más gruesos (Figura 1d, e). Si bien los tubos más gruesos a menudo permanecieron estables durante largos períodos de tiempo, hasta más de 100 días (Figura 3c), las ramas laterales más pequeñas eran más dinámicas (Figura 1e). Para permitir el análisis ultraestructural de estos tubos delgados derivados de células tumorales en el cerebro del ratón mediante microscopía electrónica (EM), se realizó la fotooxidación de secciones de cerebro. Esto dio como resultado precipitados oscuros dentro de los tubos de células de astrocitoma que expresan proteína fluorescente verde (GFP) (Figura 3d). La microscopía electrónica de barrido de sección en serie (3D MEB) reveló que los tubos encerrados en la membrana celular tenían un área de sección transversal media de 1,57 ± 0,33 pm2 (n=6, Figura 3e) y contenía mitocondrias y vesículas (Figura 1f), lo que sugiere la producción local de ATP y el tráfico de vesículas en los tubos. Curiosamente, las mitocondrias viajaron más rápidamente en estos microtubos de membrana que en el soma celular (Figura 3f). Adicionalmente, 3D MEB reveló que un número importante de microtubos de membrana seguían axones en el cerebro (19,6% de n=51; Figura 1f, Figura 3g), que son estructuras líderes conocidas para la diseminación de células tumorales en astrocitomas.
La formación de imágenes in vivo del desarrollo del tubo de membrana en el tiempo reveló que un número creciente comenzaba en una y terminaba en otra célula de astrocitoma, creando una red anatómica multicelular (Figura 1g, h). También se encontraron abundantes tubos de membrana intercelular en un modelo de astrocitoma genético donde la expresión de GFP está impulsada por el promotor del receptor nuclear sin cola (Tlx), marcando una subpoblación de células tumorales con propiedades de células madre (Figura 3h). Los tubos de membrana intercelular fueron en parte el resultado de la división celular, con un contacto estable y duradero de las células hijas a largas distancias (Figura 1c), pero también de apareamiento de células de astrocitoma no relacionadas (Figura 4a-f). La formación de tubos de membrana de células tumorales parece ser una característica inherente de las células de astrocitoma, no restringida al microambiente cerebral (Figura 4g). Una pequeña proporción de células de astrocitoma portadoras de tubos de membrana se mantuvo inactiva durante meses, a menudo en un nicho perivascular que se ha asociado a la forma de célula madre de las células de glioma (Figura 4h, i).
La posición intercelular de muchos tubos de membrana de astrocitoma, junto con su alto contenido de F-actina, es reminiscente de MN; sin embargo, los MN informados hasta ahora tenían un ancho de menos de un pm; una longitud generalmente de decenas, raramente algunos cientos de pm; y vida útil documentada de menos de 60 minutos. Estas diferencias llevaron a la propuesta del nuevo término "microtubos tumorales", o TM, para las extensiones de membrana ultralargas, de larga duración y más gruesas descubiertas de las células de astrocitoma. Esto no excluye que los MN de células tumorales in vitro podrían ser un modelo para TM in vivo, donde se dispone de intervalos de tiempo mucho más largos para el crecimiento de tamaño, el grado de conectividad intercelular y el aumento de la funcionalidad.
Ejemplo 2:
Los microtubos tumorales caracterizan a los gliomas resistentes al tratamiento.
Para investigar si los TM también son característicos de los tumores cerebrales humanos, se tiñeron tejidos de glioma WO II°-IV° resecado de pacientes. Para detectar sin ambigüedades estructuras derivadas de células tumorales dentro del parénquima cerebral rico en filamentos, se utilizó el anticuerpo específico de mutación contra IDH1-R132H. Como en los modelos de astrocitoma en ratones, los TM eran abundantes en los astrocitomas humanos (Figura 5a): El 63 % de las células de astrocitoma tenían TM intercelulares (n=196 células en secciones de 100 pm de espesor de n=8 tumores WHO N°-NI° sin codeleción 1p/19q). Este número se reflejó particularmente bien en la línea celular S24 GBMSC en puntos de tiempo posteriores de crecimiento en cerebros de ratones (Figura 1b,h; día 60), por lo que este modelo se eligió como el principio uno para estudios in vivo adicionales.
Por el contrario, solo el 0,7 % de las células de oligodendroglioma en muestras de tumores humanos tenían TM intercelulares (Figura 5b; n=150 células de n=3 oligodendrogliomas con codeleción 1p/19q) y también en células de oligodendroglioma derivadas de pacientes que formaron tumores en ratones (Figura 6a,b). Un análisis más detallado de 105 gliomas humanos reveló que la formación de TM estaba muy influenciada por el tipo y grado de tumor, con una sorprendente correlación positiva de la longitud de TM y un pronóstico desfavorable: por ejemplo, los TM auténticos de un mínimo de 50 pm de longitud en secciones delgadas convencionales fueron detectables solo en el 19 % de los oligodendrogliomas WHO II°, pero en el 93 % de los astrocitomas WHO IV° (= glioblastomas) (Figura 5c). En los astrocitomas, los TM se detectaron incluso en el hemisferio cerebral contralateral que estaba macroscópicamente libre de tumores (Figura 6c). En gliomas clasificados histológicamente como oligoastrocitomas WHO 11-111°, el estado de codeleción 1p/19q determinaba fuertemente la longitud de TM en estos tumores morfológicamente similares (Figura 5d, Figura 6d). Por otra parte, el estado 1p/19q predijo mejor la aparición de TM que la clasificación morfológica del glioma (Figura 5e).
En resumen, los TM son característicos de gliomas 1p/19q no codelecionados, donde conectan células tumorales individuales entre sí, pero no están en gran medida en los tumores 1p/19q codelecionados. Esta fue una primera indicación de que los Tm podrían estar implicados en la resistencia al tratamiento.
Ejemplo 3:
Una red de comunicación.
Las ondas de calcio intercelular (ICW) pueden coordinar la actividad de las células individuales en un tejido multicelular, creando de esta manera una red funcional de comunicación, que incluye astrocitos del cerebro normal, neuronas y células de la glía radial durante el desarrollo del SNC. Se examinó si las conexiones de TM transmiten ICW entre células de astrocitoma diseminadas, pero conectadas a TM. En efecto, combinando sensores de calcio codificados genéticamente y de moléculas pequeñas con MPLSM in vivo, se observaron ICW extensas y de largo alcance, que implican muchas células de astrocitoma en diversas regiones tumorales. Las ICW se propagaron a lo largo de los TM en ambas direcciones (Figura 7a, Figura 8a). Un análisis adicional confirmó que las ICW, medidas por la sincronicidad de las fluctuaciones del calcio (véase Métodos para más detalles), estaban restringidas en gran medida a las células de astrocitoma con conexiones TM detectables (Figura 7b,c), permitiendo la comunicación de células individuales en un patrón reproducible (Figura 7c,d; Figura 8b,c).
Para MN, se han informado conexiones intercelulares in vitro que tienen extremos abiertos o que están separadas por uniones de separación. Curiosamente, este último parece ser un requisito previo para la propagación de ICW. Por lo tanto, se probó la hipótesis de que las uniones comunicantes, que permiten el intercambio de pequeñas moléculas entre células, estaban implicadas en ICW. En efecto, el bloqueo farmacológico de la unión comunicante redujo la frecuencia y sincronicidad de las ICW en las células de astrocitoma GBMSC in vivo, pero no en los astrocitos cerebrales registrados conjuntamente de esa región tumoral (Figura 7e). La inhibición del inositol trifosfato (IP3), que es permeable a la unión comunicante y el efector de la propagación de ICW mediada por unión comunicante también redujo las ICW entre células de astrocitoma (Figura 8d). Los receptores de ATP son otro componente de la propagación de ICW y su bloqueo redujo las ICW tanto en células astrocíticas malignas como normales (Figura 8d). La conexión funcional de células de astrocitoma individuales a través de uniones comunicantes asociadas a TM se verificó mediante la distribución rápida del colorante permeable sulforhodamina 101 en la red de células tumorales celulares conectadas a TM in vivo después de la inyección local (Figura 7f), que fue inhibida por el bloqueo de la unión comunicante (Figura 7g). Los experimentos adicionales confirmaron que otra molécula permeable a la unión comunicante se transfirió entre células conectadas a TM (Figura 8e-g), mientras que las moléculas grandes impermeables a la unión por espacios no lo eran (Figura 4c).
En resumen, Estos datos demuestran que los TM son importantes para la conexión de células de astrocitoma individuales a una red funcional a través de uniones comunicantes, implicando tanto las áreas tumorales sólidas como las invasivas.
Ejemplo 4:
La conexina 43 conecta TM.
Para identificar cuál de las 21 conexinas humanas que forman uniones comunicantes conocidas está implicada en la comunicación de célula a célula mediada por TM en los astrocitomas, se planteó la hipótesis de que la deficiencia de gliomas codificados con codificación 1p/19q para TM intercelulares también podría resultar en una menor expresión de las conexinas relevantes asociadas a TM. Hasta hoy, se han informado resultados contradictorios y múltiples funciones para las diferentes conexinas en la patología del glioma. El análisis de 197 muestras de glioma mutante IDH del conjunto de datos TCGA reveló una lista de genes expresados diferencialmente entre tumores 1p/19q no codificados frente a tumores codificados (Tabla 1).
Tabla 1:
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De las 20 conexinas para las que se asignaron lecturas, solo la conexina 43 (Cx43, GJA1) se expresó de manera diferencial y se encontró que se encuentra entre los 100 principales genes regulados positivamente en tumores 1p/19q no codelecionados. Cx43 es una proteína conexina importante y también se expresa altamente en astrocitos, conectándolos a redes multicelulares funcionales y resistentes. En los gliomas, se confirmó una fuerte relación entre la retención de 1p/19q y la expresión de la proteína Cx43 en el tejido tumoral del paciente (Figura 9a) y también en las líneas celulares de glioma primario (Figura 8h). La microscopía confocal reveló inmunorreactividad puntual de Cx43 particularmente en los t M de las células de astrocitoma (Figura 9b), que no se observó para otras conexinas como Cx31 o Cx37 (localizadas en el cromosoma 1p) o Cx26 (expresado en astrocitos normales; Figura 8i). Notablemente, la inmunorreactividad de Cx43 se localiza con frecuencia en el mismo lugar donde dos TM diferentes se cruzan entre sí (Figura 9b). Los sitios de contacto de TM individuales con contacto directo membrana-membrana también se detectaron con 3D MEB (Figura 9c). Un análisis más detallado de los conjuntos de datos de ICW de los presentes inventores reveló que las ondas de calcio pueden propagarse a través de esos cruces de un TM a otro (Figura 7a, flecha roja). Tomado en conjunto, las uniones comunicantes Cx43 asociadas a TM, incluyendo aquellas que se encuentran entre diferentes MT en sus lugares de cruce frecuentes, crean una densa red de comunicación intercelular en los astrocitomas.
Para investigar el papel funcional de la proteína de unión comunicante Cx43 en la progresión del astrocitoma, se realizó una atenuación génica estable de ARNhp de Cx43 en GBMSC. Esto redujo significativamente la sincronicidad de las ICW in vivo (Figura 9d) y también la proporción de células de astrocitoma con múltiples TM en momentos posteriores (Figura 9e), lo que sugiere un papel para la comunicación mediada por la unión comunicante Cx43 en la estabilización a largo plazo de los TM. De acuerdo con el papel propuesto de los TM funcionales para la progresión tumoral, la deficiencia de Cx43 dio como resultado una reducción del tamaño del tumor en MRI (Figura 9f) y una mejora de la supervivencia (Figura 9g).
Ejemplo 5:
Una red autorreparable y resistente.
Para comprender el papel de los TM en la integridad y la resistencia de los tumores, se aprovechó el hecho de que las células individuales de astrocitoma mostraban una sorprendente heterogeneidad a lo largo de la progresión del tumor: mientras que la proporción de células conectadas a TM aumentó con el tiempo, una parte sustancial de las células de astrocitoma permaneció desconectada (Figura 1h). Esta heterogeneidad hizo posible estudiar el comportamiento biológico diferencial de las células tumorales conectadas con TM frente a las no conectadas con TM. Para investigar el papel de los MT en la reparación de daños in vivo, se realizó la ablación selectiva de células de astrocitoma individuales aplicando una dosis de láser fatal a una fracción de su volumen nuclear (1 pm3). Si la célula de astrocitoma extirpada era un miembro anterior de la red conectada a TM, los nuevos TM se extendieron hacia la célula muerta, se estabilizaron y en unos pocos días un nuevo núcleo avanzó a través de esos TM hasta el lugar mismo de la célula anterior (Figura 10a; n=8 eventos de reconstitución en 8 células tumorales fotodañadas de n=3 animales). Si se realizó una ablación de una célula no conectada a TM, tal mecanismo de reparación se observó con poca frecuencia (2/8 eventos en n=3 animales; p<0,01, Prueba exacta de Fisher). El daño de fotones subletales a un volumen mayor (0,5-1x106 pm3) que consiste en 6-10 células de astrocitoma y parénquima cerebral normal dio como resultado un marcado aumento en el contenido de células tumorales en 2 días (Figura 10b). Esto se debió a una rápida extensión de los TM en esa área dañada, seguido de un aumento de la densidad de células tumorales (Figura 10c).
A continuación, se investigó si las redes de células tumorales conectadas a TM también eran resistentes a los efectos citotóxicos de la radioterapia, que es un tratamiento convencional de los gliomas. Aunque las células conectadas a TM estaban en gran parte protegidas de la muerte celular, las células tumorales no conectadas murieron en números relevantes después de la radioterapia (Figura 10d, Figura 11a,b). Adicionalmente, las células de astrocitoma conectadas a TM aumentaron tanto su número de TM (Figura 10e) como su comunicación de calcio (Figura 10f,g) como reacción a la radioterapia. En concordancia, la caída de Cx43 redujo el efecto radioprotector de las interconexiones TM, mientras que las células de astrocitoma no conectadas con TM retrocedieron como en los tumores control (Figura 10h). Esto habla de un papel de las uniones comunicantes Cx43 funcionales en la radiorresistencia mediada por TM.
Para explorar los posibles mecanismos de protección de la citotoxicidad mediada por TM, se midieron los niveles basales de calcio intracelular en células de astrocitoma antes y durante la radioterapia, usando un indicador de calcio radiométrico. Los niveles de calcio basales fueron muy homogéneos en las células no irradiadas y también en las células conectadas a TM durante la radioterapia, mientras que las células no conectadas desarrollaron una alta variabilidad de sus niveles de calcio intracelular durante la irradiación (Figura 11c-f). Se requieren aumentos de los niveles de calcio intracelular para la citotoxicidad34 inducida por radioterapia, e incluso pequeños aumentos de calcio están implicados en la muerte celular apoptótica intrínseca en las células de glioma. Puede especularse que los TM intercelulares pueden servir como un medio para que una célula individual distribuya moléculas pequeñas como el calcio dentro de la red más grande, logrando niveles no letales.
En conjunto, esto aboga por un papel importante de la comunicación intercelular mediada por MT como medio de resistencia primaria y adaptativa a la radioterapia. En resumen, estos resultados apoyan el papel de los TM en la resistencia de las células de astrocitoma contra el estrés ambiental y en la comunicación de eventos adversos, conduciendo en última instancia a una supervivencia coordinada y, si fuera necesario, a la reparación de daños. Ejemplo 6:
GAP43: Un impulsor de la formación de TM.
A continuación, se buscó identificar las vías moleculares cruciales que impulsan la formación de TM, para comprender mejor su naturaleza y fundamentar su papel en la progresión y resistencia tumoral. Para este fin, el conjunto de datos in silico de gliomas 1p/19q codelecionados humanos frente a gliomas no codelecionados (Tabla 1) se analizó en primer lugar mediante el análisis de ruta de ingenuidad. Aquí, las rutas que se activaron de forma destacada en los gliomas no codelecionados 1p/19q incluyeron el "movimiento celular" y la "interacción y señalización de célula a célula", apoyando la función propuesta de TM en estos tumores (Figura 12a,b). Curiosamente, se encontraron muchas rutas involucradas en el crecimiento de neuritas, y protrusiones de membranas similares a neuritas se activaron más en gliomas 1p/19q codelecionados, incluyendo integrina, fosfolipasa C, GTPasas de la familia Rho, HMGB1 y también las rutas de señalización prototípicas de neurotropina/TRK (Figura 12c). Esto último se confirmó a nivel de proteínas en gliomas humanos, donde NGF (ubicado en 1p) y NT-4 (19q) se regularon negativamente en tumores 1p/19q codelecionados y también sus respectivos receptores de membrana TrkA y TrkB, que se han descrito anteriormente (Figura 13a). Juntos, estos datos indicaron que la formación de TM en las células tumorales y las extensiones de (o similares a) neuritas de las células no malignas comparten no solo muchas características morfológicas, sino potencialmente también características moleculares.
Al revisar la bibliografía sobre efectores descendentes conocidos particularmente relevantes para la formación de neuritas y protrusiones de membrana similares a neuritas, la proteína asociada al crecimiento GAP-43 entró en foco. GAP-43 se expresa altamente en conos de crecimiento axonal, inducida por la señalización del receptor de neurotropina, e impulsa la migración de células progenitoras neuronales. Notablemente, la sobreexpresión de GAP-43 es suficiente para el crecimiento de los tubos de membrana en células neuronales e incluso no neuronales. En efecto, GAP-43 se expresó significativamente más en gliomas humanos no codelecionados 1p/19q (Figura 14a) y líneas celulares primarias (Figura 14a, Figura 13b) en comparación con los gliomas codelecionados 1p/19q. Cabe destacar que, gAP-43 se localiza preferentemente en las puntas en forma de cono y nestina-negativas de los TM que brotan (Figura 14c), similar a su conocido enriquecimiento en el cono de crecimiento del nervio.
Para interferir con la formación de TM durante la progresión del astrocitoma, se diseñaron GBMSC con una atenuación genética de GAP-43. Aunque la variabilidad in vitro de estas células no se vio afectada, sus TM in vivo eran estructuralmente anormales, con ramificaciones reducidas (Figura 14d). Esto se asoció con una diseminación alterada de las células tumorales (Figura 14e, figura 13c), como resultado tanto de su velocidad de invasión disminuida (Figura 14f) como de su capacidad de proliferación (Figura 14g) en el cerebro del ratón. Cabe destacar que, las conexiones intercelulares de TM (Figura 14h) y las ICW (Figura 14i) se redujeron en los tumores deficientes en GAP-43, que se acompañó de una reducción selectiva de la expresión de la proteína de unión comunicante Cx43 (Figura 13d). Estas deficiencias en las características de la progresión tumoral mediadas por TM conducen a una reducción marcada del tamaño del tumor en el cerebro del ratón (Figura 14j) y a una supervivencia mejorada de los animales (Figura 14k). Cuando se aplicó la radioterapia, la deficiencia de GAP-43 dio como resultado una mayor regresión de las células tumorales, como se reveló por MPLSM repetitivo in vivo (Figura 14l). Esto fue confirmado por MRI 60 días después de la radiación, donde no se detectaron cambios relevantes en la señal derivada del tumor en animales portadores de tumor shGap43, mientras que los tumores control de ARNhp eran grandes, provocando síntomas neurológicos en ratones (Figura 14m). El análisis histológico en este momento confirmó un crecimiento tumoral extenso y difuso que afecta al hemisferio contralateral en los animales control, pero solo pequeños remanentes de células tumorales deficientes en proliferación en tumores de atenuación génica de GAP-43 (Figura 14n).
Finalmente, la proteína GAP-43 se sobreexpresó en células de oligodendroglioma primario 1p/19q codelecionado, para lograr niveles de proteína comparables a las líneas GBMSC 1p/19q codelecionado (Figura 13e) que se cultivaron en las mismas condiciones similares a células madre. Esto condujo a un desplazamiento morfológico a un fenotipo rico en TM por lo tanto similar a astrocitoma de células de oligodendroglioma que sobreexpresan GAP-43 (Figura 14o,p). Notablemente, la inducción de la formación de TM en estos tumores dio como resultado un aumento de la invasión de células tumorales en el cerebro (Figura 14q), y también un aumento de la radiorresistencia (Figura 14r); ambos fueron comparativamente bajos en oligodendrogliomas control.
Ejemplo 7:
Ttyh1: Otro impulsor de la formación de TM
Para encontrar impulsores moleculares más cruciales de la formación y funcionalidad de TM, se compararon los perfiles de expresión génica de GBMSC cultivados en condiciones de neuroesferas similares a células madre (capaces de colonización cerebral mediada por TM en 7 días) y la misma línea de GBMSC cultivada en condiciones adherentes, que contenían suero (no capaces de formar TM y colonizar el cerebro del ratón en 100 días). Aquí, GAP-43 fue el gen expresado de manera más diferencial y regulado positivamente en GBMSC similares a células madre, confirmando la importancia crucial de GAP-43 para la formación y función de TM descrita en el Ejemplo 6. Por otra parte, en esta detección también se identificó Ttyh1, que se ha asociado con el desarrollo neuronal y la homeostasis del calcio antes, para ser el tercer gen más expresado diferencialmente (de > 10.000 genes mapeados en la detección), de nuevo regulado positivamente en GBMSC similares a células madre. Curiosamente, Ttyh1 se encuentra en el cromosoma 19q y la expresión de proteínas fue mayor en las GBMSC 1p/19q no codelecionado en comparación con las células de oligodendroglioma 1p/19q codelecionado. En consecuencia, la expresión de ARNm de Ttyh1 también se reguló positivamente de forma significativa en gliomas humanos 1p/19q no codelecionados, en comparación con los codelecionados (8 veces, p=1,74 x 10-16, Tabla 1). Apoyando un papel central de Ttyh1 para la formación de TM, la deficiencia de Ttyh1 resultó en menos TM y altamente aberrantes en los astrocitomas (Figura 15a). En concordancia, La invasión y proliferación del cerebro se redujo drásticamente cuando se derribó Ttyh1 (Figura 15b), lo que provocó una fuerte inhibición del crecimiento tumoral en el cerebro del ratón (Figura 15c) y, en última instancia, los tiempos de supervivencia fueron más del doble en comparación con los animales control (Figura 15d).
Ejemplo 8:
Una detección para descubrir nuevos genes relevantes para TM
Para estudiar la formación y las funciones de los TM e interrogar a los posibles impulsores moleculares, las células de glioblastoma primario de tumores cerebrales resecados se mantuvieron en condiciones no diferenciadas, no adherentes, similares a las de células madre (GBMSC), y se siguió el crecimiento dinámico del tumor en el cerebro del ratón usando microscopía de barrido láser multifotón (MPLSM) in vivo. Esta técnica permite estudiar el crecimiento de los tumores cerebrales y el comportamiento celular de las células tumorales individuales, en minutos, horas, días, en última instancia, varios meses, en lo profundo del cerebro de los ratones vivos. Tan pronto como dos semanas después de la implantación, las GBMSC generalmente extendieron múltiples TM en el cerebro de un ratón vivo y habían comenzado a invadirlo de manera eficaz (Figura 16 A,C). Por el contrario, el cultivo de las mismas células de glioblastoma en condiciones de diferenciación, que contienen suero durante cuatro semanas in vitro resultó en un fuerte deterioro de la formación de TM in vivo durante muchas semanas, acompañado de una invasión masiva de células tumorales en el cerebro del ratón (Figura 16 B-D). Notablemente, cuando se sigue durante meses mediante microscopía intravital, estos efectos inhibidores de la invasión y de TM fueron reversibles. Alrededor del día 100 de crecimiento in vivo lento, los gliomas derivados de las células de glioblastoma que se habían cultivado en condiciones diferenciadoras in vitro se transformaron repentinamente en tumores invasivos y con dominio de TM, en este momento no es diferente a sus homólogos que progresan rápidamente donde las células de glioblastoma se habían cultivado en condiciones similares a células madre in vitro (Figura 16 E,F). Teniendo en cuenta estos descubrimientos, se planteó la hipótesis de que la diferenciación in vitro las condiciones de cultivo celular no erradicaron por completo las subpoblaciones de células tumorales relevantes para TM, pero disminuyó la expresión de genes relevantes para la TM y la invasión en la amplia población de células tumorales, que en principio es reversible cuando estas células son reeducadas posteriormente por el microambiente cerebral. Por tanto, era plausible realizar un análisis de micromatrices de expresión génica en el cual se compararon las células de glioblastoma cultivadas en ambas condiciones. El análisis de ingenuidad y la evaluación de la activación de la vía relativa revelaron que las rutas implicadas en el movimiento celular se activaban más en condiciones similares a células madre en comparación con las condiciones que contienen suero (Figura 16 G, Figura 17). Los tres genes: proteína asociada al crecimiento 43 (GAP-43), VGF (sin acrónimo), y homólogo tweety 1 (TTYH1) se expresaron más alto en condiciones similares a células madre en comparación con las condiciones de diferenciación (Tabla 2), lo que se confirmó en el nivel de proteína (Figura 17 A). Los tres se han asociado anteriormente con el desarrollo del SNC (neuronal particular). GAP-43 es el único gen conocido hasta ahora que impulsa la formación y función de TM, que apoyó el potencial de la detección para identificar genes relevantes para TM.
Tabla 2:
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Ejemplo 9:
Dos nuevos candidatos para la formación de TM
Tanto VGF como TTYH1 parecen tener funciones en el crecimiento de neuritas, lo que hizo que fuera interesante investigar si el segundo y tercer golpe de puntuación en la detección anterior también están implicados en el crecimiento de TM. Aunque VGF se expresó en GBMSC, detectable tanto en somas celulares como en TM (Figura 18 B), la marcada reducción de su expresión génica a través de ARNhp (Figura 18 C) no dio como resultado ninguna diferencia en el patrón de crecimiento de los gliomas en el cerebro, incluida la formación de TM (Figura 18 D). Esta aparente falta de relevancia funcional de VGF sugirió proceder a TTYH1. Para revelar los compartimentos subcelulares en los que se localizó TTYH1, se realizaron después tinciones inmunocitoquímicas de GBMSC, lo que demostró una localización preferencial de TTYH1 como estructuras puntuadas en el cuerpo celular, a lo largo de la membrana de protrusiones celulares similares a TM y más prominentes en sus puntas de crecimiento en forma de cono (Figura 19 A). Adicionalmente, se realizaron tinciones inmunohistoquímicas de gliomas S24 y muestras de tumores humanos para investigar si TTYH1 también puede encontrarse en TM en el cerebro de ratón y en astrocitoma humano. Dado que TTYH1 se expresa hasta cierto punto en el cerebro normal, se realizó una tinción de co-inmunofluorescencia con un anticuerpo anti-TTYH1 junto con una tinción específica de células tumorales (anticuerpo específico de mutación IDH1-R132H para muestras de tumores humanos, anti-Nestina humana para GBMSC que crecen en cerebros de ratón). Esto permite una detección inequívoca de células tumorales y sus protrusiones de TM filamentosos en el parénquima cerebral rico en filamentos. Las tinciones revelaron una expresión heterogénea: mientras que algunos t M fueron fuertemente TTYH1-positivos (puntas de flecha en la Figura 19 B y C), muchos TM fueron negativos (flechas en la Figura 19 B-D). Cabe destacar que, algunas células tumorales individuales tenían TM tanto positivos como negativos para TTYH1 (Figura 19 C). En los astrocitomas humanos, la gran mayoría (86,4 ± 5,35 %, 6 regiones de n=3 pacientes) de todos los cuerpos de células tumorales fueron TTYH1 positivos, algunos de ellos con TM claramente positivos para TTYH1 (Figura 19 D). Adicionalmente, se encontró la colocalización de TTYH1 e integrina a5, lo más pronunciada en la punta en forma de cono de crecimiento (Figura 19 E). Juntos, estos descubrimientos sugirieron investigar el papel de Tthy1 para la formación y función de TM, mientras que se cuestiona la relevancia de TTYH1 para los TM de all y/o las funciones relacionadas con TM de all.
Ejemplo 10:
TTYH1 impulsa la invasión de células de glioma y es crucial para la morfología de TM
La expresión de la proteína TTYH1 en diferentes GBMSC (Figura 20 A) se correlacionó con la capacidad de estas líneas celulares para invadir eficazmente el tejido cerebral in vivo (Figura 20 B). Esta fue la primera indicación de que TTYH1 podría tener relevancia funcional para la invasión de células de glioma.
Después se realizó la atenuación génica de TTYH1 mediada por ARNhp en las tres líneas celulares S24 de GBMSC altamente invasivas y que expresan TTYH1, T269 y T1, para investigar si la expresión disminuida de TTYH1 da como resultado una formación y/o función disminuidas de TM. Las GBMSC T1 no sobrevivieron a la atenuación génica y murieron in vitro, mientras que las células transducidas con shControl sobrevivieron. Por el contrario, en GBMSC S24 y T269, la viabilidad general de las células tumorales in vitro no se vio afectada (datos no mostrados) por la atenuación génica de TTYH1 (Figura 21 A).
Como TTYH1 se enriqueció en la punta invasiva de TM y se correlacionó con la capacidad de invasión de diferentes líneas de GBMSC, a continuación se estudió la capacidad de invasión de las células tumorales transducidas por ARNhp y shControl in vitro e in vivo. In vitro, la atenuación génica de TTYH1 condujo a una menor invasión en una matriz de colágeno I (Figura 20 C). Para investigar si este efecto inhibidor también estaba presente en la compleja matriz extracelular y el microambiente del cerebro vivo, se siguió la migración tridimensional de células de glioma individuales en un tumor cerebral en crecimiento durante 24 horas usando MPLSM in vivo. Esto reveló una reducción de casi 4 veces en la velocidad de invasión del soma celular promedio en las células de atenuación génica de TTYH1 (Figura 20 DF). Las células de glioma en los tumores control invadieron el cerebro de manera eficaz mientras extendían dinámicamente los TM (Figura 20 D) pero la invasión se redujo al mínimo en las GBMSC shTTYH1 (Figura 20 E, F).
Después de la implantación en el cerebro del ratón, pudieron observarse características sorprendentes de GBMSC shTTYH1: sus TM, que eran las principales rutas de invasión (Figura 20 D, E), con frecuencia mostraban anomalías morfológicas que se asemejaban a cadenas de perlas (Figura 20 G,H). Este fenómeno se había observado después del silenciamiento de TTYH1 en neuronas del hipocampo. in vitro antes. Notablemente, la morfología de una subpoblación de GBMSC con múltiples conexiones Tm a otras células tumorales no se vio alterada por la atenuación génica de TTYH1 mediada por ARNhp, que incluían sus TM de apariencia normal in vivo (Figura 21 B). Aunque TTYH1 también se localizó en algunos TM de esta subpoblación (Figura 19 C), no tuvo un impacto morfológico aparente en este subtipo de células y sus respectivos TM.
Ejemplo 11:
Heterogeneidad celular, invasividad y TTYH1
Durante el análisis del comportamiento de GBMSC individual en el cerebro vivo, se observó que existían distintos subgrupos celulares con respecto a la extensión y el patrón de formación de TM, reproducible en diferentes líneas de GBMSC (Figura 22 A, Figura 21 C). Estos subtipos morfológicos también pudieron encontrarse en muestras de astrocitoma humano (Figura 22 B), donde las células tumorales podrían subcategorizarse de manera similar según su número de TM. Los cuatro subtipos celulares fueron los más llamativos: células tumorales sin TM; 1 TM (célula unipolar); 2 TM (célula bipolar); y más de 4 TM (célula multipolar).
La atenuación génica de TTYH1 redujo la porción relativa de células con 1 o 2TM, mientras que la población con más de 4 TM aumentó relativamente (aunque no absolutamente) (Figura 22 C). Para comprender mejor estos subtipos celulares potenciales y excluir que simplemente la integración en una red multicelular densamente tejida obstaculice la migración de células de glioma, se analizó la velocidad de invasión de las poblaciones de células tumorales con 0 TM frente a 1 o 2 TM frente a > 4 TM, tanto para el control como para los gliomas shTTYH1. Este análisis reveló que los somas de células tumorales cerebrales con 1 o 2 TM invadieron significativamente más rápido que las células sin TM, o más de 4 TM (Figura 22 D). Los análisis de vídeo de los movimientos celulares in vivo durante 2-3 horas confirmaron que las células tumorales control con 1-2 TM eran altamente dinámicas en el cerebro vivo, mientras que aquellas con muchos TM demostraron un fenotipo más en reposo. La atenuación génica de TTYH1 redujo la velocidad de invasión de esta población de células tumorales particularmente móvil que se extiende de 1 a 2 t M (Figura 22 D). Por el contrario, las interconexiones célula-célula mediadas por TM particularmente extensas de GBMSC con más de 4 TM, reduciendo plausiblemente su capacidad de invasión, se conservó en los tumores shTTYH1 en comparación con los controles (Figura 21 D). Considerándolo todo, estos datos indican que la capacidad de invasión reducida de las células de atenuación génica de TTYH1 es un efecto combinado de una reducción proporcional de la subpoblación de células tumorales particularmente competentes para la invasión con 1 o 2 TM y un déficit de migración adicional de las células restantes de este subtipo.
Ejemplo 12:
El crecimiento de glioma se reduce fuertemente por la deficiencia de TTYH1
Para investigar si la morfología comprometida de TM y la función de las GBMSC shTTYH1 impidieron su colonización cerebral eficaz, a continuación se analizaron las imágenes MPLSM in vivo de grandes regiones del cerebro. Mientras que los tumores control revelaron una infiltración difusa de todo el hemisferio cerebral con muchas células que habían migrado a más de 1 mm del tumor principal (Figura 23 A), los tumores de atenuación génica S24 GBMSC TTYH1 estaban creciendo circunscritos en el sitio de implantación, con solo unas pocas células tumorales que han invadido el cerebro (Figura 23 B,E). En T269 GBMSC, una línea celular de glioma altamente invasiva que muestra un patrón de crecimiento muy difuso, la atenuación génica del ARNhp de TTYH1 condujo a una marcada reducción de la tumorigenicidad general in vivo, con muy pocas células tumorales remanentes detectables en el parénquima cerebral después de muchas semanas (Figura 23 C,D,F).
Para investigar el efecto de la caída de TTYH1 sobre el crecimiento macroscópico del tumor cerebral, los tumores S24 después de más de 70 días se analizaron mediante MRI de campo alto. Se eligió el modelo S24 debido a las tres líneas GBMSC probadas, S24 GBMSC fueron los menos afectados por la atenuación génica de TTYH1, con cierta capacidad conservada para colonizar el cerebro in vivo. Fue evidente una marcada reducción del tamaño del tumor de la resonancia magnética por la caída de TTYH1, con cambios mínimos de señal derivados del tumor detectables y un desplazamiento medio de la línea media de solo 0,08 (± 0,07) mm (Figura 23 G). Al mismo tiempo, los tumores control eran muy grandes y ocupaban espacio, extendiéndose por todo el hemisferio (Figura 23 G), lo que conduce a un efecto de masa significativo con un desplazamiento medio de la línea media de 1,35 mm (0,16) mm (p = <0,001) y síntomas neurológicos. De manera más importante, la inhibición de la progresión del glioma por la regulación negativa de TTYH1 mejoró significativamente el curso clínico de la enfermedad, con una mediana de supervivencia enormemente prolongada (de 75 a 182 días; Figura 23 H) en este modelo animal de glioma maligno que en muchos aspectos refleja estrechamente la enfermedad humana.
Ejemplo 13:
Una red de células tumorales más interconectada es más resistente a la radiación
Finalmente el objeto fue aclarar si la atenuación génica de TTYH1 también influyó en otra función crucial mediada por TM: la interconexión de células individuales de glioma a una red multicelular grande y resistente. Como la fracción relativa de células portadoras de múltiples TM se aumentó en los pequeños tumores de atenuación génica de TTYH1 de baja densidad celular (Figura 22 C), se investigó si esto conduce a redes multicelulares más interconectadas. En efecto, la conectividad anatómica célula-célula a través de TM se aumentó en los tumores de atenuación génica de TTYH1 (Figura 24 A).
Se ha demostrado que una interconectividad más alta de TM conduce a una mayor resistencia de las células de glioma contra los efectos citotóxicos de la radioterapia. En consecuencia, los gliomas de atenuación génica TTYH1 escasos y deficientes en invasión, pero más densamente interconectados fueron altamente resistentes a la terapia cuando se trataron con radioterapia, en comparación con los tumores control (Figura 24 B). Un análisis más detallado reveló que los efectos citotóxicos de la irradiación estaban en gran parte restringidos a las células tumorales no conectadas a TM, mientras que las GBMSC conectadas a TM estaban protegidas en gran medida (Figura 24 C) y esto fue muy similar para shTTYH1 y los gliomas control (Figura 24 C). Juntos, estos datos hablan de las interconexiones entre células tumorales y células tumorales mediadas por TM funcionalmente no perturbadas a pesar de la deficiencia de TTYH1, preservando la radiorresistencia de estos tumores de crecimiento deficiente.
Análisis:
Ha sido una pregunta de larga data en neurooncología por qué la codeleción de los brazos cromosómicos 1p y 19q en los gliomas se asocia a un curso mucho mejor de la enfermedad y, en particular, una mejor supervivencia después de la terapia citotóxica. Análogamente, la razón del comportamiento biológico agresivo de los gliomas no codelecionados, que incluye glioblastomas primarios, no se comprende completamente. Aquí se demuestra que la capacidad de formar TM ultralargos y altamente funcionales a través de la expresión competente de GAP-43 y Ttyh1 es un determinante importante de la progresión y la resistencia a la terapia en tumores cerebrales 1p/19q no codelecionados.
En conclusión, estos datos apoyan la noción de que los tumores son órganos complejos, que hasta ahora se ha atribuido a la contribución de apoyo de los tipos de células no malignas, incluyendo las neuronas en los tumores cerebrales. El presente estudio se suma a este concepto al demostrar que las células cancerosas individuales dentro de un tumor se comunican y cooperan entre sí de una manera compleja pero ordenada que en sí misma recuerda a un órgano funcional. Ha quedado claro que los tumores pueden secuestrar programas que forman parte del desarrollo normal de los tejidos. El descubrimiento clave de este estudio es que los TM, generados por mecanismos similares a axones en neuronas, representan un medio por el cual las células tumorales invadidas pueden comunicarse con sus semejantes a largas distancias, dando como resultado una funcionalidad óptima, una progresión tumoral eficiente y, específicamente a través de GAP-43, resistencia a eventos adversos como la radioterapia (Figura 13f). Por lo tanto, el direccionamiento farmacológico de la formación y función de los TM se suma a los intentos de encontrar el talón de Aquiles de los tumores cerebrales resistentes al tratamiento.
Más que eso, los resultados de los presentes estudios implican que existen al menos dos subtipos diferentes de células de glioma de TM dominantes: uno particularmente invasivo con 1-2 TM donde TTYH1 es de alta relevancia funcional, y uno con múltiples TM, formando típicamente una red multicelular densa con otras células de glioma; este último parece no verse comprometido por la interferencia con TTYH1.
Primero, un análisis de micromatrices que compara células de glioblastoma primario que se cultivaron en dos condiciones diferentes in vitro (que las hizo competentes en TM frente a deficientes en TM transitoriamente in vivo) no solo confirmó a GAP-43 como un controlador de TM, sino que identificó a los nuevos candidatos VGF y TTYH1. De estos dos, solo la atenuación genética de TTYH1 produjo un fenotipo significativo en las GBMSC in vitro e in vivo. Confirmando aún más la validez de este enfoque de detección, OLIG2, que fue el quinto gen más regulado positivamente en condiciones similares a células madre, antes estaba relacionado con la presencia de células de glioblastoma y también con el desarrollo del SNC. Análogamente, en una detección similar realizada en 6 líneas celulares de glioblastoma primario diferentes, los tres GAP-43, TTYH1, y OLIG2 se encontraban entre los 20 principales genes regulados positivamente en condiciones similares a células madre frente a condiciones diferenciadoras.
TTYH1 es una proteína de membrana con conductancia de cloruro y actividad de unión a calcio, que normalmente se expresa de forma restrictiva en el tejido neural y los testículos, particularmente durante el desarrollo. Si bien todavía no se ha publicado mucho trabajo con respecto a TTYH1, se ha implicado en la plasticidad estructural neuronal, la homeostasis del calcio y el desarrollo embrionario. Curiosamente, la sola sobreexpresión de TTYH1 fue suficiente para inducir extensiones marcadas de neuritas, es decir, protrusiones de membrana largas implicadas en la formación de axones y dendritas, en células neuronales y no neuronales, mientras que la atenuación génica de TTYH1 condujo a cambios morfológicos de protrusiones descritas como perlas de neuritas. El último cambio fenotípico también fue evidente en las células de glioma in vivo después de la atenuación génica del ARNhp de TTYH1 en el presente estudio. Los informes posteriores indicaron que TTYH1 también se expresa en astrocitos reactivos y en migración donde se concentra en el borde de ataque de los filopodios, similares a los resultados actuales de la distribución subcelular de la proteína TTYH1 en las células de glioma. La expresión basal en astrocitos no reactivos fue baja, enfatizando una función más restringida al subgrupo migratorio de células, que de nuevo está de acuerdo con los presentes descubrimientos en células de glioma. Curiosamente, se ha demostrado que la actividad neuronal promueve la proliferación y el crecimiento del glioma de alto grado a través de la secreción regulada por actividad de Neuroligina-3, que se asoció (aunque no se verificó funcionalmente) a una expresión de TTYH1 aumentada en una detección de expresión génica.
Dado que una de las funciones propuestas de TTYH1 incluye un canal de cloruro activado por Ca2+, es posible que ejecute su función pro-migratoria a través de sus propiedades conductoras de cloruro. Los gliomas acumulan iones de cloruro y, por lo tanto, crean un gradiente de cloruro dirigido hacia fuera. Al eflujo de cloruro le sigue un eflujo de agua, permitiendo que la célula migrante ajuste su forma celular al migrar a través de espacios extracelulares estrechos. El bloqueo o atenuación génica de los canales de cloruro conduce a una capacidad de invasión reducida similar al efecto de la atenuación génica de TTYH1. La interferencia con los canales y transportadores de iones cloruro se investiga actualmente como posible diana terapéutica en ensayos clínicos. Esto podría explicar por qué TTYH1 juega un papel funcional preliminar en los TM del subtipo de células de glioma migratorias 1-2 TM, mientras que la proteína se encuentra en muchos TM de todos los subtipos de células de glioma. La formación de perlas de filamentos observada inducido por la atenuación génica de TTYH1 podría ser el equivalente al hinchamiento celular local, lo que impide la adaptación eficaz de la forma celular, que es crucial para la translocación celular en el neuropilo denso.
Otro posible mecanismo de acción de TTYH1 podría ser una interacción con integrinas pro-invasivas, ya que se ha demostrado que TTYH1 se co-localizó con a5-integrina, lo que también se observó en las GBMSC del presente estudio. Las integrinas interactúan indirectamente con el citoesqueleto de actina, están implicadas en la migración de los conos de crecimiento y se enriquecen en las puntas de los conos de crecimiento. Ya que TTYH1 puede interactuar directamente con el citoesqueleto al unirse a actina y tubulina y ambos elementos del citoesqueleto son componentes estructurales en los TM, es posible que TTYH1 pueda ser un mediador de las interacciones integrinaactina y que los efectos sobre el citoesqueleto sean responsables de la invasión alterada en las células de atenuación génica de Tthyl.
Al comparar el impacto cuantitativo de la expresión de TTYH1 inalterada en la colonización cerebral exitosa con el de GAP-43, parece que TTYH1 podría ser incluso más relevante para la invasión de células tumorales y el crecimiento general del tumor que GAP-43. De hecho, los descubrimientos de este estudio sugieren una participación particular de TTYH1 en la extensión y función de TM dinámicos de las células de glioma migratorio. Los presentes resultados también demuestran que la atenuación génica de TTYH1 en tres líneas GBMSC diferentes fue letal para una de ellas in vitro, en gran parte letal para una de ellas in vivo y disminuyó fuertemente el crecimiento in vivo en la tercera (S24). Esto respalda un impacto crucial de la expresión competente de TTYH1 sobre la viabilidad celular, o al menos la capacidad de colonizar el cerebro en diferentes gliomas. Por el contrario, a diferencia de GAP-43, su atenuación génica incluso aumentó el número relativo de células de glioma de TM altamente interconectados, más estacionarias en S24 GBMSC. Puede especularse que el pequeño tamaño y el déficit invasivo de los tumores de atenuación génica de TTYH1 podrían facilitar la interconexión de las células tumorales vecinas con los TM, usando maquinarias independientes de TTYH1 como GAP-43 para la formación de este subtipo de TM. Finalmente, los resultados de este estudio respaldan el descubrimiento de que las células de glioma interconectadas con TM construyen el esqueleto resistente del tumor cerebral que no se ve afectado de manera relevante por los efectos adversos de la radioterapia, sin importar cuán deficiente en invasión y pequeño sea el tumor.
En conclusión, junto a GAP-43, TTYH1 es un nuevo impulsor molecular importante de distintas funciones de TM que hasta ahora se ha asociado principalmente al desarrollo y la reparación del SNC. También proporciona información adicional importante sobre la heterogeneidad de las células tumorales asociadas a TM en los gliomas, apuntando hacia la necesidad de distintas estrategias terapéuticas para dirigirse a diferentes subtipos de células tumorales. Ambos subtipos de células tumorales asociados a TM con sus características intrínsecas de infiltración difusa (1­ 2 TM) frente a alta resistencia a la terapia (TM múltiples) parecen contribuir al mal pronóstico actual de los astrocitomas malignos. Por lo tanto, la pregunta de cómo y cuándo dirigirse a qué TM es probablemente la más importante traduccionalmente. En contraste con GAP-43, cuya inhibición parece ser más prometedora durante la radioterapia, la ventana terapéutica más prometedora para la inhibición de TTYH1 podría ser después finalización de la terapia citotóxica estándar, o incluso en lugar de; debería evitarse la combinación con radioterapia. Los fuertes efectos anti-invasivos y anti-proliferativos de la atenuación genética de TTYH1, sin embargo, y la importancia potencialmente limitada para el SNC adulto no maligno hacen de TTYH1 una diana interesante para el desarrollo de fármacos en el futuro.

Claims (2)

REIVINDICACIONES
1. Un agente para su uso en el tratamiento del glioma en un sujeto interfiriendo con (a) la invasión y/o (b) la proliferación y/o (c) la comunicación intracelular y/o (d) la resistencia a radioterapia y/o quimioterapia de células de glioma mediadas por microtubos de tumor (TM),
en donde dicho agente se selecciona del grupo que consiste en:
(a1) un agente que es capaz de mediar la interferencia de ARN (iARN) para la atenuación génica específica del gen de la proteína 43 asociada al crecimiento (GAP43), en donde dicho agente se selecciona del grupo que consiste en ARN inhibidores pequeños (ARNip), microARN (miARN), ARN en horquilla pequeños (ARNhp), oligonucleótidos antisentido y ARN antisentido (ARNas) y en donde dicho agente está dirigido a una de las secuencias de ácido nucleico establecidas en SEQ ID NO: 1 a 5;
(a2) un agente que es capaz de mediar la interferencia de ARN (iARN) para la atenuación génica específica del gen de la proteína 43 asociada al crecimiento (GAP43), en donde dicho agente es un oligonucleótido antisentido de ADN (ADNas) que comprende una de las secuencias de ácido nucleico establecidas en SEQ ID NO: 6 a 8 o un ARNas que comprende una de las secuencias de ácido nucleico establecidas en SEQ ID NO: 9 a 11;
(b) un compuesto que es capaz de inhibir la actividad biológica de la proteína GAP43, en donde dicho compuesto es un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o un mimético de anticuerpo que se une específicamente a la proteína GAP43;
(c) un agente que es capaz de mediar iARN para la atenuación génica específica del gen tweety humano homólogo 1 (Ttyh1), en donde dicho agente se selecciona del grupo que consiste en ARN inhibidores pequeños (ARNip), microARN (miARN), ARN en horquilla pequeños (ARNhp), oligonucleótidos antisentido y ARN antisentido (ARNas) y en donde dicho agente está dirigido a una de las secuencias de ácido nucleico establecidas en SEQ ID NO: 12 a 16;
(d) un compuesto que es capaz de inhibir la actividad biológica de la proteína TTYH-1, en donde dicho compuesto es un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o un mimético de anticuerpo que se une específicamente a la proteína TTYH-1;
(e) un agente que es capaz de mediar la interferencia de ARN (iARN) para la atenuación génica específica del gen de la conexina 43 (Cx43), en donde dicho agente se selecciona del grupo que consiste en ARN inhibidores pequeños (ARNip), microARN (miARN), ARN en horquilla pequeños (ARNhp), oligonucleótidos antisentido y ARN antisentido (ARNas) y en donde dicho agente está dirigido a la secuencia de ácido nucleico establecida en SEQ ID NO: 21;
(f1) un compuesto que es capaz de inhibir la actividad biológica de la conexina 43 (Cx43), en donde dicho compuesto es un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o un mimético de anticuerpo que se une específicamente y/o bloquea funcionalmente Cx43; y
(f2) un compuesto que es capaz de inhibir la actividad biológica de la conexina 43 (Cx43), en donde dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste en el péptido Gap 26 que bloquea la unión comunicante (SEQ ID NO: 17); péptido bloqueador de uniones comunicantes Gap 27 (SEQ ID NO: 18); ácido glicirretínico; quinina; anandamida; octanol; heptanol; ácido antranílico; ácido fenámico; ácido retinoico; y tonabersat.
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