ES2879306T3 - Extracto vegetal para prevenir y tratar la pérdida de cabello - Google Patents

Abstract

Uso cosmético de un extracto de planta de la especie Galeopsis tetrahit para estimular el crecimiento del cabello y/o prevenir o tratar la pérdida de cabello.

Description

DESCRIPCIÓN

Extracto vegetal para prevenir y tratar la pérdida de cabello

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una composición que contiene un extracto vegetal útil para prevenir y tratar la pérdida de cabello.

La presente invención tiene originen en el campo de las preparaciones de origen vegetal y productos para uso tricológico.

En particular, la presente invención se refiere al uso de un extracto de planta de una planta seleccionada para estimular el crecimiento del cabello, incrementar la plenitud del tallo piloso y promover el engrasamiento de las superficies del cuero cabelludo afectadas por adelgazamiento del cabello.

Antecedentes

La fisiología de las estructuras pilíferas del cuerpo humano y el estudio del tropismo capilar es el objeto de numerosos estudios científicos. Notoriamente, en el ciclo vital del bulbo piloso se suceden las fases anágena (crecimiento), catágena (involución) y telógena (reposo). Al período de crecimiento capilar sigue la fase de regresión, durante la cual la parte más profunda del folículo se dirige hacia la muerte celular programada. El ciclo comienza al final de esta fase. En la base del ciclo de crecimiento está la capacidad de las células del tallo del bulbo piloso para salir, alternativamente, de un estado inactivo.

Durante la fase de crecimiento del bulbo y la producción de cabello, predominan actividades de proliferación, diferenciación y supervivencia reguladas por factores de crecimiento. La fase de regresión, en cambio, se caracteriza por la activación de rutas moleculares que inducen la apoptosis en las células del bulbo. Sin embargo, con una cierta frecuencia, el mecanismo fisiológico del crecimiento capilar está sometido a desequilibrio. Una porción significativa de la población, especialmente varones, está afectada de hecho por problemas de adelgazamiento o incluso pérdida de cabello prematura. A partir de los estudios disponibles, se ha deducido que los fenómenos de pérdida temprana del cabello se deben a una pluralidad de causas incluyendo una falta de nutrientes, vitaminas y minerales, desequilibrios hormonales, desregulación de sistemas enzimáticos locales y condiciones de estrés del organismo.

En un intento de remediar y prevenir condiciones que aceleren la pérdida de cabello, se han formulado preparaciones tricológicas que, al actuar sobre el cuero cabelludo, la alimentación, la oxigenación y la microcirculación, tienden a mejorar condiciones que contribuyen al crecimiento fisiológico del cabello.

Entre los productos actualmente comercializados en el campo tricológico, algunos se basan en sustancias activas de origen natural que actúan localmente contribuyendo a estimular el tropismo del bulbo piloso y anexos cutáneos. El tratamiento del cabello con extractos procedentes de la especie de planta Galeopsis segetum Necker también se conoce de D. PINTO ET AL: "209 Galeopsis segetum Necker extracts for the prevention and treatment of hair", THE JOURNAL OF INVESTIGATIVE DERMATOLOGY : OFFICIAL JOURNAL OF THE SOCIETY FOR INVESTIGATIVE DERMATOLOGY AND THE EUROPEAN SOCIETY FOR DERMATOLOGICAL RESEARCH, vol. 136, n29, 1 de septiembre de 2016 (2016-09-01), página S196.

El Solicitante, que participa activamente en la preparación de los productos para la prevención de la pérdida de cabello, ha formulado recientemente una preparación para uso tricológico basada en un extracto de planta obtenido de la planta Galeopsis segetum Necker. La preparación es el objeto de la solicitud de patente europea EP3062636A0. Esta solicitud de patente europea documenta cómo un extracto de planta perteneciente a la especie Galeopsis segetum Necker lleva a cabo una acción estimulante satisfactoria de las células del folículo piloso y una normalización de las fases del ciclo vital de las estructuras pilíferas.

La actividad tricológica de este extracto de planta parecería ser atribuible, al menos en parte, a algunas sustancias biológicamente activas presentes en el extracto de Galeopsis segetum Necker incluyendo los flavonoides 7-(2"- alosil)-glucósido de éter 4’-metílico de hipolaetina monoacetilado, glucósido 7-(2"- alosil)-acetilado de éter 4’-metílico de hipolaetina, glucósido 7-(2”-alosil)monoacetilado de isoescutelarina, 7-(2"-alosil)glucósido de éter 4'-metílico de hipolaetina, glucósido 7-(2"-alosil)monoacetilado de hipolaetina, 7-(2"-alosil)glucósido de isoescutelarina y 7-(2"-alosil)glucósido de hipolaetina.

Como parte de su actividad de experimentación, el Solicitante ha encontrado ahora, de un modo totalmente inesperado, que algunas muestras que contienen extractos de especies diferentes de Galeopsis segetum Necker, aunque contienen los flavonoides previamente mencionados en cantidades marginales, sin embargo poseen una actividad biológica y antioxidante celular inesperadamente superior que la esperada.

Por lo tanto, el Solicitante encontró que este incremento en la actividad biológica y la actividad antioxidante celular está presente en un extracto de planta procedente de una planta accidental no perteneciente a la especie Galeopsis segetum Necker objeto de la solicitud de patente europea previa.

Por lo tanto, uno de los objetivos de la invención consiste en proporcionar un extracto de planta, diferente del extracto ya conocido de Galeopsis segetum Necker, que está provisto de un incremento en la actividad de estimulación de la proliferación de las células del bulbo piloso y que por lo tanto encuentra un uso específico en el campo tricológico. Otro propósito de la invención es proporcionar una composición para estimular el crecimiento del cabello basada en extractos de plantas procedentes de una planta alternativa a la especie Galeopsis segetum Necker, cuyo uso está sustancialmente libre de efectos secundarios. Otro propósito de la invención consiste en proporcionar una composición para uso tricológico que se puede aplicar localmente o administrar oralmente, cuyos ingredientes activos se originan de una planta de una especie alternativa a Galeopsis segetum Necker.

Compendio de la invención

En el contexto de una actividad de experimentación llevada a cabo en sus laboratorios, el Solicitante encontró inesperadamente que un extracto de planta obtenido de Galeopsis Tetrahit L., una planta herbácea perteneciente al género Galeopsis, posee actividades antioxidantes y de estimulación de la proliferación celular mayores que las esperadas para otras especies de Galeopsis tales como Galeopsis segetum Necker.

Debido al incremento de estas actividades, el extracto procedente de Galeopsis Tetrahit L. da como resultado una mejora sobre la proliferación celular del bulbo piloso y sobre el crecimiento del cabello en comparación con un extracto de Galeopsis segetum Necker.

La mejora de la actividad tricológica del extracto procedente de Galeopsis Tetrahit L. sobre un extracto de Galeopsis segetum Necker es sorprendente debido a que ambas especies pertenecen al mismo género de planta y se esperaba que ambas especies tuvieran una composición fitoquímica igual o muy similar.

Según un primer aspecto de la invención, el uso cosmético de un extracto de planta procedente de la especie seleccionada Galeopsis tetrahit se proporciona por lo tanto según la reivindicación 1 adjunta. En particular, la presente invención proporciona el uso no terapéutico o cosmético de una composición que comprende un extracto de planta de Galeopsis tetrahit y un portador fisiológicamente aceptable para estimular el crecimiento fisiológico del cabello, engrosar el cabello o incrementar el volumen capilar en un individuo.

Según un segundo aspecto, la invención proporciona usos en el campo médico-tricológico de un extracto de planta de Galeopsis tetrahit, en particular en el tratamiento o la prevención de la alopecia androgenética o del efluvio telógeno. Por lo tanto, la invención proporciona aplicaciones en los campos tanto cosmético como terapéutico-tricológico del extracto procedente de Galeopsis tetrahit o una composición que contiene el extracto.

Típicamente, el extracto de Galeopsis tetrahit o una composición que contiene el extracto es adecuado tanto para la aplicación local como para la administración oral.

Por lo tanto, la presente invención tiene su origen en haber observado sorprendentemente cómo la Galeopsis tetrahit, una especie seleccionada perteneciente al género Galeopsis, posee componentes biológicamente activos, algunos no identificados, que estimulan la proliferación celular de los bulbos pilosos permitiendo un uso en el campo tricológico, para la aplicación local o la administración oral del extracto.

Típicamente, la composición de la invención contiene una cantidad cosméticamente o tricológicamente activa de uno o más componentes biológicamente activos disponibles en el extracto de Galeopsis tetrahit.

Según otro aspecto, la presente invención se refiere al uso cosmético de una combinación de extractos procedente de Galeopsis tetrahit y extraída de Galeopsis segetum Necker para estimular el crecimiento fisiológico del cabello y/o engrosar el cabello y/o incrementar la plenitud del cabello en un individuo.

Según un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una combinación de extracto procedente de Galeopsis tetrahit y extracto procedente de Galeopsis segetum Necker para el uso en el tratamiento de la alopecia androgenética o el efluvio.

Breve descripción de las figuras

Las características y ventajas de la presente invención se harán más evidentes a partir de los dibujos incluidos, en los que:

La Figura 1 muestra gráficos de barras que se refieren a un ensayo de MTT de 24 horas que ilustra el porcentaje de viabilidad celular con respecto a un control determinado mediante el tratamiento con extractos de plantas que contienen cantidades crecientes de Galeopsis tetrahit según el Ejemplo 7;

La Figura 2 muestra gráficos de barras representativos de datos comparativos de la actividad antioxidante expresados como un porcentaje de ROS de extractos de Galeopsis segetum y Galeopsis tetrahit, según se describe en el Ejemplo 7;

- La Figura 3 muestra gráficos de barras representativos de la actividad de protección celular contra el estrés oxidativo inducido por H2O2;

- La Figura 4 muestra gráficos de barras representativos de los efectos sobre la actividad de la isoforma 2 de 5 alfa-reductasa, de muestras de finasterida, y extractos hidroalcohólicos de Galeopsis segetum y Galeopsis tetrahit de la invención, según se presenta en el Ejemplo 7;

- La Figura 5 muestra una representación esquemática del principio de la prueba con diclorofluoresceína del Ejemplo 7;

- La Figura 6 muestra el espectro de RMN de 1H del extracto de partes aéreas de Galeopsis sp.;

- La Figura 7 muestra los espectros de RMN de 1H de las muestras bajo la investigación realizada en el Ejemplo 8;

- La Figura 8 muestra las proyecciones PC1 frente a PC2 de los espectros de 1H-NMR de los materiales de plantas de Galeopsis segetum y Galeopsis tetrahit y extractos de Galeopsis tetrahit según se evidencia en el Ejemplo 8;

- La Fig. 9 muestra la suma de informes de PC1 y PC2 para aproximadamente 63% de la varianza total;

- La Fig. 10 muestras la representación de cargas de PC1 según se describe en el Ejemplo 8;

- La Fig. 11 ilustra la comparación del perfil de RMN con la carga 1 según se presenta en el Ejemplo 8 para identificar las señales de RMN responsables de la separación de la agrupación de PCA;

- La Fig. 12 muestra los datos obtenidos del análisis estadístico PLS presentado en el Ejemplo 8.

Descripción detallada de la invención

El Solicitante ha encontrado que un extracto de planta procedente del género Galeopsis, especie Galeopsis tetrahit, contiene componentes biológicamente activos no identificados totalmente todavía que estimulan la proliferación celular a nivel del folículo piloso más intensivamente que otras especies de Galeopsis. La presente invención incluye aplicaciones tanto en el campo cosmético como en el campo médico-tricológico del extracto procedente de la especie de Galeopsis seleccionada según la invención.

Según un primer aspecto, la invención se refiere al uso cosmético no terapéutico de un extracto de planta procedente del género Galeopsis, especie tetrahit, para estimular el crecimiento capilar.

En particular, la invención se refiere al uso cosmético no terapéutico de un extracto de planta procedente de género Galeopsis especie Galeopsis tetrahit para mejorar la apariencia del cabello y/o para incrementar la plenitud del tallo piloso.

Según un segundo aspecto, la invención proporciona un extracto de planta de Galeopsis tetrahit para el uso en el tratamiento o la prevención de la alopecia androgenética o el efluvio telógeno. Según otros aspectos, la invención se refiere al uso cosmético o terapéutico en el campo tricológico de una combinación de extractos de planta procedentes de Galeopsis tetrahit y de Galeopsis segetum Necker.

Típicamente, el extracto de planta de Galeopsis tetrahit según la invención se puede incorporar o formular como una composición en aplicaciones tanto cosméticas como terapéuticas.

La composición de la invención se puede formular para aplicación local o para administración oral.

Galeopsis tetrahit L., también denominada en la presente Galeopsis tetrahit, una planta a partir de la cual se origina el extracto en la base de la invención, es una especie seleccionada del género Galeopsis. Dentro del campo de la invención, el extracto de planta se puede obtener de cualquier parte de la planta de Galeopsis tetrahit tal como raíces, hojas, frutos o incluso flores. Para los usos según la invención, el extracto se obtiene preferiblemente a partir de la parte aérea, típicamente las hojas, de la planta de Galeopsis tetrahit.

Según algunas realizaciones, el extracto de planta de la invención se obtiene mediante la extracción de una parte de la planta o de uno de sus tejidos usando un disolvente fisiológicamente aceptable como el medio de extracción.

Dentro del término de "disolvente fisiológicamente aceptable", se entiende un disolvente que no produce reacciones adversas significativas cuando se introduce en el cuerpo humano o se aplica al organismo humano.

Un disolvente adecuado para obtener el extracto de planta es un líquido fisiológicamente aceptable en el que sean solubles al menos algunos de los componentes biológicamente activos de la planta seleccionada y en el que no sufran una alteración que los prive de actividad.

En algunas realizaciones, el disolvente fisiológicamente aceptable se selecciona de agua, etanol, acetato de etilo y sus mezclas. Típicamente, el disolvente es una solución hidroalcohólica de agua/etanol.

Para obtener el extracto de planta de Galeopsis tetrahit, se pueden usar técnicas de extracción sólido-líquido para separar/extraer uno o más componentes biológicamente activos procedentes de los tejidos vegetales de la planta. En ciertas realizaciones, la extracción de uno o más componentes biológicamente activos tiene lugar al macerar una porción o matriz vegetal de Galeopsis tetrahit en un disolvente adecuado, por ejemplo una mezcla hidroalcohólica. Por ejemplo, se puede obtener un extracto adecuado al sumergir o macerar una porción de partes aéreas de planta de Galeopsis tetrahit en una mezcla de agua-etanol, durante un tiempo adecuado para enriquecer el disolvente de uno o más componentes biológicamente activos. Bajo estas condiciones, la extracción de los componentes biológicamente activos de los tejidos de planta de la planta seleccionada tiene lugar, sustancialmente, mediante difusión y/u osmosis. El tiempo de maceración de las porciones de planta en el disolvente es variable, por ejemplo de 1 a 48 horas.

Según ciertas realizaciones, la preparación de un extracto de Galeopsis tetrahit adecuado comprende las siguientes etapas:

- trituración de partes aéreas deshidratadas de la planta,

- adición de un disolvente de extracción tal como una mezcla de agua y etanol para obtener una relación de fármaco/disolvente hidroalcohólico de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 1:50 p/p,

- maceración de las partes aéreas,

- extracción de componentes biológicamente activos,

- filtración,

- concentración del filtrado, por ejemplo, a presión reducida mediante evaporación del disolvente hidroalcohólico, - continuación opcional de la evaporación hasta la eliminación del disolvente

- secado opcional del extracto.

En algunas realizaciones, la etapa de extracción se puede repetir dos o tres veces.

En la etapa final de retirada del disolvente mediante evaporación, se puede añadir opcionalmente un soporte sólido, tal como, a modo de ejemplo no limitativo, almidones o maltodextrinas, para obtener el extracto en la forma de polvo seco.

Según otra realización, el método de extracción de Galeopsis tetrahit comprende las siguientes etapas:

- trituración, por ejemplo, de las partes aéreas de la planta

- transferencia del polvo obtenido en un percolador adecuado

- percolación, por ejemplo, con una cantidad de disolvente de extracción a fin de tener una relación en peso de fármaco/disolvente de aproximadamente 1:20 a aproximadamente 1:100

- recirculación de la parte percolada hasta el agotamiento del material que se va a extraer

- prensado del lecho vegetal extraído para la recuperación de todo el disolvente de extracción

- filtración del lixiviado

- concentración del filtrado, por ejemplo, a presión reducida mediante evaporación del disolvente

- continuación opcional de la evaporación hasta la eliminación del disolvente

- secado opcional del extracto.

Según algunas realizaciones, en la etapa final de retirar el disolvente mediante evaporación, se añade un soporte sólido, por ejemplo un almidón o maltodextrina, para obtener el extracto en la forma de un polvo seco.

Típicamente, el extracto obtenido a partir de Galeopsis tetrahit puede ser fluido, blando o seco.

Por ejemplo:

- en el extracto fluido, 1 ml de extracto contiene componentes biológicamente activos solubles en 1 g de fármaco vegetal;

- en el extracto blando, el disolvente se evapora parcialmente en particular hasta que el extracto no humedezca un papel de filtro;

- en el extracto seco, el disolvente se evapora casi completamente para obtener un polvo.

Es posible preparar extractos de Galeopsis tetrahitde diferente polaridad.

Por ejemplo, es posible obtener un extracto de alta polaridad usando un disolvente polar tal como una solución hidroalcohólica, un extracto de polaridad intermedia usando un disolvente menos polar tal como acetato de etilo o un extracto apolar usando CO2 supercrítico con el que es posible extraer fracciones de fitocomplejos que llevan a cabo una actividad inhibidora contra la enzima 5 alfa-reductasa, tipo 2.

En ciertas realizaciones, la extracción se lleva a cabo usando una relación en peso entre disolvente y matriz vegetal que varía de 1:10 a 10:1.

Es posible extraer los componentes de planta biológicamente activos de Galeopsis tetrahit usando técnicas de extracción alternativas tales como, por ejemplo, mediante digestión, infusión, escurrimiento, decocción, percolación, extracción en contracorriente, extracción Soxhlet, extracción con gases supercríticos o ultrasonidos.

Los componentes biológicamente activos extraídos de Galeopsis tetrahit no se identificaron, sin embargo, se encontró con pruebas in vitro que determinan una acción de proliferación celular mayor que la encontrada con extractos procedentes de Galeopsis segetum Necker, bajo las mismas condiciones de extracción.

Los componentes biológicamente activos contenidos en el extracto de planta de la invención reactivan el ciclo vital de los folículos pilosos también en reposo del cuero cabelludo. Esta actividad también se ha detectado en las zonas del cuero cabelludo en las que los bulbos pilosos están parcialmente atrofiados, como en zonas en las que existe un adelgazamiento del cabello.

El extracto de planta procedente del género Galeopsis especie Galeopsis tetrahit puede estar contenido en una composición.

Según estos aspectos, la presente invención proporciona por lo tanto el uso cosmético de una composición que comprende un extracto de planta procedente de una planta perteneciente al género Galeopsis especie Galeopsis tetrahit y un portador fisiológicamente aceptable en el tratamiento y/o la prevención de la perdida de cabello o para estimular el crecimiento fisiológico del cabello o para mantener un tropismo capilar fisiológico.

El Solicitante también ha observado que el extracto de Galeopsis tetrahit posee una acción de inhibición de la enzima 5 alfa-reductasa, en particular de tipo 2, que lo hace útil para aplicaciones en el campo médico-tricológico como en el tratamiento o la prevención de la alopecia androgenética y/o del efluvio.

Según un cuarto aspecto, la invención se refiere a una composición que comprende un extracto de la planta Galeopsis tetrahit y un portador fisiológicamente aceptable para el uso en el tratamiento o la prevención de la alopecia androgenética y/o en el efluvio. La composición de la invención resulta eficaz para prevenir y/o tratar las formas de calvicie o adelgazamiento del cabello, el efluvio o la alopecia androgenética.

La composición de la invención se puede formular en una forma para aplicación tópica o en una forma para administración oral. Típicamente, la composición de la invención comprende un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

El portador, diluyente o excipiente fisiológicamente o farmacéuticamente adecuado se puede seleccionar basándose en la vía de administración para la que está destinada la composición farmacéutica resultante. Cualquier portador y/o excipiente adecuado para la forma de preparación deseada para la administración se contempla en los usos del extracto de planta o los ingredientes activos del mismo descritos allí.

Dentro del alcance de la presente invención, el término "portador" se refiere a un excipiente, vehículo, diluyente o adyuvante, que puede o puede estar presente en la composición de la invención.

En algunas realizaciones, la vía de administración de la composición de la invención es la vía tópica. En estos casos, la composición de la invención se puede aplicar, en una cantidad eficaz, directamente sobre el cuero cabelludo.

Por ejemplo, en el tratamiento de formas de pérdida o adelgazamiento del cabello, una cantidad cosméticamente/fisiológicamente activa de la composición se puede aplicar directamente sobre el cuero cabelludo, una o más veces al día convenientemente durante ciclos que duran 2-3 meses, alternados por períodos de ausencia de tratamiento. Según estos aspectos, la invención también se refiere a un método de tratamiento cosmético que comprende la aplicación sobre el cuero cabelludo, o una porción del mismo, de una cantidad eficaz de una composición según una o más de las realizaciones descritas y/o reivindicadas en ellos. La composición para aplicación tópica puede estar en forma sólida, semisólida o fluida. Formulaciones adecuadas en forma sólida incluyen cremas, geles, pomadas, pastas, ungüentos.

En otras realizaciones, la formulación para administración local está en forma fluida, por ejemplo en la forma de lociones, geles, champús, suspensiones, emulsiones.

En el caso de una forma de formulación fluida o semifluida, el extracto de planta se puede diluir en un portador en forma líquida fisiológicamente aceptable tal como agua, alcohol, solución hidroalcohólica o glicérica o mezclada con otros líquidos adecuados para la aplicación local.

A modo de ejemplo, las composiciones de la invención en forma líquida se pueden preparar al disolver los componentes biológicamente activos del extracto en agua y/o alcohol. La composición líquida se puede tamponar para alcanzar un intervalo de pH seleccionado convenientemente de 5 a 7 para ser compatible con el pH del cuero cabelludo y a continuación filtrarse y envasarse en recipientes adecuados tales como botellas o viales.

En algunas realizaciones, las composiciones de la invención comprenden excipientes comúnmente usados en la formulación de preparaciones cosméticas o farmacéuticas para uso local, tales como conservantes, agentes bactericidas, estabilizantes, emulsionantes, tampones, agentes humectantes y otros excipientes comúnmente usados en técnicas de preparación.

En una realización, la formulación para la aplicación local está en la forma de una emulsión que contiene el extracto transportado en un excipiente adecuado. En algunas realizaciones, la composición para aplicación tópica comprende un excipiente del tipo de hidroximetilcelulosa y/o un gelificante con HLB adecuado para la formulación y las sustancias.

Según otras realizaciones, la composición de la invención está en una forma para administración oral. En estos casos, la composición contiene el extracto de Galeopsis tetrahit que se define previamente y uno o más vehículos o excipientes adecuados para la administración oral. A modo de ejemplo, excipientes adecuados para la administración oral incluyen derivados de celulosa tales como hidroximetilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, metilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxietilcelulosa, carboxietilcelulosa, etilhidroxietilcelulosa, acetato-butirato de celulosa, acetato-ftalato de celulosa, y sus mezclas. Ejemplos adicionales de excipientes adecuados incluyen los polímeros pertenecientes a la familia de las lactamas tales como pirrolidona y sus derivados, por ejemplo polivinilpirrolidona, polivinilpolipirrolidona y sus mezclas, sales inorgánicas tales como fosfato cálcico o dicálcico, lubricantes tales como estearato magnésico, triacilgliceroles y sus mezclas. Las composiciones para administración oral pueden estar en forma sólida o líquida. Composiciones en forma sólida típicas incluyen cápsulas, polvos, gránulos, píldoras. Ejemplos de composiciones en forma líquida incluyen soluciones, emulsiones, suspensiones, jarabes. Las composiciones también pueden estar en la forma de liberación controlada de los componentes activos contenidos en las mismas. Los comprimidos comprenden generalmente un portador o excipiente adecuado en el que está dispersado el extracto de planta, típicamente en forma seca.

El extracto de planta que contiene los componentes biológicamente activos de la composición de la invención puede estar presente en una cantidad variable, por ejemplo, de 0,0001% en peso a 10% en peso, típicamente de 0,1 a 5% en peso.

Según algunas realizaciones, la composición de la invención comprende además una o más sustancias activas tales como vitaminas, minerales, micronutrientes y otras sustancias activas para estimular la actividad del folículo piloso. La composición de la invención en la forma para la administración oral puede ser un dispositivo médico, una formulación farmacéutica o un complemento dietético o nutricional.

Un producto nutracéutico es un producto alimenticio que puede ejercer un beneficio fisiológico o proporciona protección contra una desventaja o un trastorno fisiológico.

Complemento dietético o alimenticio significa un producto que puede contener, entre otros, una vitamina, un mineral, un extracto de planta, un aminoácido, un metabolito, un extracto, un concentrado o mezclas de estos ingredientes. La cantidad administrada y la frecuencia de la administración de la composición dependerán de la naturaleza y la gravedad de la enfermedad tricológica que se vaya a tratar.

La presente invención se describirá ahora con referencia a los siguientes ejemplos que se proporcionan solamente con propósitos de ilustración.

Ejemplos

Ejemplo 1

Comprimido para uso oral

Cantidad de componentes

Extracto seco de Galeopsis Tetrahit 5 - 100 mg

Celulosa microcristalina 200 - 300 mg

Dióxido de silicio (sílice coloidal) 2,5 - 10 mg Estearato magnésico 2,5 - 10 mg Polietilenglicol 0,5 - 2,5 mg

Alginato sódico 0,025 - 0,5 mg Hidroxipropilmetilcelulosa 100 - 200 mg Polivinilpirrolidona 0,5 - 1 mg

Copolímero de ácido metacrílico 3,5 - 8,5 mg Citrato de trietilo 0,5 - 1 mg

Ejemplo 2

Producto granular para uso oral

Cantidad de componentes

Eritritol 20 - 30% p/p

Galeopsis tetrahit 0,2 - 3,5% p/p

Manitol 39,7 - 6,2% p/p

Aroma 5 - 10% p/p

Sucralosa 0,1 - 0,3% p/p

Almidón 35 - 50% p/p

Ejemplo 3

Píldora para uso oral

Cantidad de componentes

Sacarosa extrafina 50 - 90 mg

Extracto blando de Galeopsis tetrahit 5 - 100 mg Celulosa microcristalina 10 - 50 mg

Talco 10 - 20 mg

Almidón de maíz 5 - 25 mg

Azúcar en polvo 5 - 15 mg

Sorbitol no cristalizable al 70% 5 - 10 mg Estearato magnésico 1 - 3 mg

Goma arábiga 2 - 3 mg

Dióxido de titanio 1 - 2,5 mg

Gelatina 1 - 3 mg

Copolímero tipo A de ácido metacrílico 1 - 2,5 mg Carbonato magnésico ligero 0,5 - 1 mg Polietilenglicol 0,1 - 0,3 mg

Ftalato de dibutilo 0,1 - 0,25 mg

Citrato de trietilo 0,002 - 0,05 mg Paraxibenzoato de metilo 0,01 - 0,03 mg

Ejemplo 4

Loción aplicación sobre cabello y cuero cabelludo Componente (nombre INCI o nombre comercial). Cantidad Hialuronato de hidroxipropiltrimonio 0,05 - 0,1 % Alcohol etílico desnaturalizado tipo C 5 - 20%

Ácido láctico 0,1 - 0,3%

Meditanox H-100,001 - 0,002%

Aceite de ricino hidrogenado PEG-400,5 - 1,5%

Di-t-butil-4-hidroxihidrocinamato de octadecilo 0,02 - 0,06% Lecithin NAT 85390,02 - 0,06%

Lypobelle soyaglycone 0,05 - 0,1%

Perfume Agrumes 2807/03 MOD.3 / HICC FREE 0,1 - 0,2% Extracto seco de Galeopsis Tetrahit 0,05 - 1%

Fomblin HC / PU-CAT50,005 - 0,02%

Agua c.s. hasta 100%

Ejemplo 5

Champú de tratamiento

Componente (nombre INCI o nombre comercial). Cantidad Sulfetal LA B-E 2 - 4%

Pentavitin 0,5 - 1,5%

UCARE Polymer JR-4000,5 - 1,5%

Amphotensid GB 20090,5 - 1,5%

Mirustile MFP PE - LQ -(WD) 0,25 - 0,75% Etilendiaminotetraacetato tetrasódico 0,2 - 0,6%

Antil 1270,1 - 0,3%

Oxetal VD 920,05 - 0,3%

Monohidrato de ácido cítrico 0,25 - 1% Hidroximetilglicinato sódico 0,4 - 1,6%

Glicéridos caprílico/ cáprico PEG-80,25 - 1%

Extracto seco de Galeopsis tetrahit 0,0025 - 1%

BHA 0,005 - 0,02%

Adipato de Di-PPG-2 Miret-101,25 - 5%

PEG-7 Isoestearato de dimeticona 0,25 - 1%

Agua c. s. hasta 100%

Ejemplo 6

Emulsión cutánea

Cantidad de componentes

Propilenglicol 6 - 8%

Estearato-palmitato de glicerilo 3 - 5%

Aceite de coco 2 - 4%

Alcohol cetoestearílico 1 - 3%

Cera emulsionante 1 - 3%

Alcohol bencílico 0,5 - 1,5%

Extracto blando de Galeopsis tetrahit 0,5 - 2%

Alcohol cetílico 0,25 - 1%

Agua c. s. hasta 100%

Ejemplo 7

Prueba comparativa

Estudio comparativo in vitro sobre Galeopsis segetum y Galeopsis tetrahit

Propósito de la prueba

El procedimiento experimental descrito posteriormente trata de un estudio comparativo de la actividad in vitro de extractos de planta de Galeopsis segetum y Galeopsis tetrahit, a fin de caracterizar su actividad antioxidante como una función de la actividad de estimulación del crecimiento del cabello.

Materiales

Muestras probadas

Todos los extractos se diluyeron 50 mg/ml en DMSO y se filtraron estérilmente.

Las soluciones madre se han almacenado a -20°C.

Indicaciones de solubilidad de las muestras

■ BIOMASA VEGETAL (Galeopsis segetum y Galeopsis tetrahit). Finamente molida con mortero y molinillo.

Diluida en DMSO al 100% no alcanza una solubilidad total. Sometida a ultrasonidos 15 minutos a TA, mayor dispersión. La solución de 5 mg/ml en DMEM es dispersable. La solución de 1 mg/ml es completamente soluble y se filtra mediante un filtro con malla de 0,22 pm;

■ MUESTRA HIDROALCOHÓLICA SECA (Galeopsis segetum y Galeopsis tetrahit): diluida en DMSO al 100%, alcanza la solubilidad total. Sometida a ultrasonidos 15 minutos a TA. La solución de 5 mg/ml en DMEM es dispersable. La solución de 1 mg/ml es completamente soluble y se filtra mediante una malla de 0,22 pm; Reactivos e instrumentación usados

Modelos Biológicos Usados

Cultivos de fibroblastos embrionarios cultivados

La línea inmortalizada de fibroblastos embrionarios murinos BALB/c3T3, Clon A31 (ATCC, Manassas, VA, EE. UU.) se obtuvo de National Institute for Cancer Research (Génova, Italia).

Las células se cultivaron en matraces estériles de 25 cm3 y se incubaron a 37°C en una atmosfera húmeda de CO2 al 5%. Se usó DMEM como medio de cultivo (medio de Eagle con modificación de Dulbecco, ATCC, Manassas, VA, EE. UU.) añadido a 10% de suero bovino fetal (FCS), 1% de aminoácidos no esenciales (NEAA, por sus siglas en inglés), 1% de una mezcla de penicilina y estreptomicina (Pen-Strep Mix). Estos últimos reactivos fueron adquiridos por Lonza Inc. (Barcelona, España)

Durante el cultivo, la división 1:3 se realizó cada 2 días, con 80% de confluencia, al lavar con 1x PBS (Lonza, Barcelona, España) y separación celular con una solución de tripsina-EDTA (Lonza, Barcelona, España) a 37°C durante 2 minutos.

Controles

ENSAYO DE MTT (BALB3T3)

CONTROL POSITIVO: Células no tratadas en medio DMEM (medio de Eagle con Modificación de Dulbecco, ATCC, Manassas, VA, EE. UU.) con 10% de suero bovino fetal (FCS), 1% de aminoácidos no esenciales (NEAA), 1% de una mezcla de penicilina y estreptomicina (Pen-Strep Mix), y mantenidas en placas de cultivo (96 pocillos) desde 25 cm² hasta 37°C y 5% de CO².

ENSAYO DCFH-DA y PRUEBA DE ESTRÉS OXIDATIVO INDUCIDO POR MTT (BALB3T3)

CONTROL NEGATIVO: Células no tratadas en medio DMEM (medio de Eagle con Modificación de Dulbecco, ATCC, Manassas, VA, EE. UU.) añadidas a 2,5% de suero bovino fetal (FCS), 1% de aminoácidos no esenciales (NEAA), 1% de una mezcla de penicilina y estreptomicina (Pen-Strep Mix), y mantenidas en placas de cultivo (96 pocillo) desde 25 cm2 hasta 37°C y 5% de CO2 en la oscuridad).

CONTROL POSITIVO: Células tratadas durante 2 h con peróxido de hidrógeno 1 mM en medio DMEM (medio de Eagle con Modificación de Dulbecco, ATCC, Manassas, VA, EE. UU.) añadidas a 2,5% de suero bovino fetal (FCS), 1% of aminoácidos no esenciales (NEAA), 1% de una mezcla de penicilina y estreptomicina (Pen-Strep Mix), y mantenidas en placas de cultivo (96 pocillo) desde 25 cm2 hasta 37°C y 5% de CO2 (en la oscuridad).

ESTUDIO DE MODULACIÓN DE 5-ALFA REDUCTASA (BALB3T3)

CONTROL NEGATIVO: Células no tratadas en medio DMEM (medio de Eagle con Modificación de Dulbecco, ATCC, Manassas, VA, EE. UU.) añadidas a 10% de suero bovino fetal (FCS), 1% de aminoácidos no esenciales (NEAA), 1% de una mezcla de penicilina y estreptomicina (Pen-Strep Mix) y 10 ng/ml de testosterona, y mantenidas en placas de cultivo (12 pocillos) desde 25 cm2 hasta 37°C y 5% de CO2.

CONTROL POSITIVO: Células tratadas durante 24 h con finasterida (0,05 mg/ml) en medio DMEM (medio de Eagle con Modificación de Dulbecco, ATCC, Manassas, VA, EE. UU.) añadidas a 10% de suero bovino fetal (FCS), 1% de aceites esenciales distintos de aminoácidos (NEAA), 1% de una mezcla de penicilina y estreptomicina (Pen-Strep Mix) y 10 ng/ml de testosterona, y mantenidas en placas de presentación (12 pocillos) de cultivo desde 25 cm2 hasta 37°C y 5% de CO2.

Métodos

Prueba de citotoxicidad preliminar (ensayo de MTT)-BALB3T3

Principios del método

El ensayo de MTT bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio es un ensayo colorimétrico usado para determinar la proliferación celular in vitro, ya que permite medir la proliferación celular y la vitalidad a través de la evaluación de la actividad mitocondrial.

Este método es muy útil para medir el crecimiento celular después del tratamiento con agentes mitogénicos, estímulos antigénicos, factores de crecimiento y para estudios de citotoxicidad.

La prueba implica el uso de un agente oxidante cromogénico, MTT, que consiste en un sistema policíclico (C18H16BrN5S) equipado con un anillo de tetrazolio que se puede reducir fácilmente mediante deshidrogenasas mitocondriales u otros sistemas de transporte electrónico, formando, para la apertura del anillo de tetrazolio, un compuesto cromogénico nitrogenado conocido como formazano. El formazano forma cristales insolubles en el ambiente intracelular, a los que las membranas son, sustancialmente, impermeables: por lo tanto, se permite la entrada de la molécula en la célula, pero no la salida de producto, si se ha metabolizado correctamente, esto es, si las cadenas de transporte electrónico todavía son metabólicamente activas.

Posteriormente, los cristales de formazano se solubilizan en dimetilsulfóxido (DMSO), determinando así el cambio de color de la solución de amarillo a azul oscuro-violeta.

Procedimiento experimental

El ensayo se efectuó siguiendo el método de Mosmann (1983), con algunas modificaciones menores. Células BALB3T3 se sembraron con una densidad de 5*104 células/pocillo en placas de 96 pocillos. Después de 24 horas, alcanzando una confluencia de aproximadamente 80%, las células se trataron con 6 concentraciones crecientes de extractos de Galeopsis segetum y Galeopsis tetrahit (biomasa vegetal y muestra hidroalcohólica seca) 10-20-50-100­ 200 mg/ml en medio completo. En cambio, las células de control se mantuvieron en cultivo en medio completo.

Las placas se incubaron a 37°C, al 5% de CO2 durante 24, 48 y 72 horas. Al final de todos los tratamientos, el medio se recogió y se reemplazó por 100 |ul de una solución de 0,5 mg/ml de MTT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) en medio de cultivo completo.

Después de 3 horas de incubación a 37°C, el medio se recogió y los cristales de formazano se solubilizaron con 100 |ul por pocillo de DMSO (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.). La placa, cubierta con aluminio, se puso en un agitador mecánico (Arhos 160 - PBI International, Milán, Italia) a 120 rpm durante 15 minutos a temperatura ambiente.

La absorbancia de la solución coloreada se midió mediante un lector de microplacas espectrofotométrico (BioTek Instruments Inc., Bad Friedrichshall, Alemania) a una longitud de onda de 570 nm (longitud de onda de referencia a 630 nm).

Los datos se expresaron como un porcentaje de viabilidad celular con respecto a células de control (ctr), según la siguiente fórmula:

% viabilidad celular / ctr = (Abs Muestra /Abs ctr) * 100

Todos los análisis se realizaron al menos dos veces usando muestras por duplicado.

MTT con estrés oxidativo inducido-BALB3T3

Principios del método

Los fibroblastos de ratón_BALB3T3 son uno de los modelos validados para estudios de estrés oxidativo in vitro (Subirade et al., 1995; Kutuk et al., 2004).

Estudios efectuados en 2005 por Rajapakse y colaboradores (2005) destacaron la posibilidad de explotar un método muy usado y versátil tal como el ensayo de MTT para la actividad antioxidante de estudio in vitro de compuestos activos. Específicamente, a través de este método, es posible estudiar los efectos protectores de estos compuestos sobre células posteriormente sometidas a estrés oxidativo. La inducción del estrés oxidativo se lleva a cabo mediante la incubación con peróxido de hidrógeno, un agente que induce la producción de daño oxidativo en las células a través de formación de ROS. Los posibles efectos protectores se pueden determinar a través de la determinación de la viabilidad celular después del estrés oxidativo de las células pretratadas / preexpuestas a los compuestos activos que se van a probar, en comparación con células sometidas al mismo estrés oxidativo. Una mayor viabilidad celular corresponderá a un efecto protector de los compuestos probados.

Procedimiento experimental

El ensayo se efectuó según el método descrito por Coda y colaboradores (Coda et al., 2012), con algunas modificaciones.

Se sembraron fibroblastos murinos BALB3T3 en una placa de 96 pocillos a una densidad de 5*104 células/pocillo y se incubaron a 37°C, a 5% de CO2, hasta aproximadamente 80% de confluencia.

Posteriormente, las células se incubaron durante 16 horas con Galeopsis segetum y Galeopsis tetrahit (biomasa de planta y muestra hidroalcohólica seca) a una concentración 50 |ug/ml.

Las diluciones se prepararon a partir de soluciones madre de 1000x en DMSO, se filtraron estérilmente y usando medio DMEM complementado con 2,5% de suero bovino fetal (FCS), 1% de aminoácidos no esenciales (NEAA), 1% de una mezcla de penicilina y estreptomicina (Pen-Strep Mix).

Se usaron células tratadas con H2O2 1 mM como un control positivo; células mantenidas en medio de cultivo solo (DMEM 2,5% de FCS) se usaron en cambio como un control negativo.

Al final de las 16 horas de pretratamiento, las células se lavaron con PBS 1X y se incubaron durante 90 minutos con una solución 1 mM de H2O2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) en medio sin suero, en la oscuridad, a 37°C y 5% de CO2.

Una vez que se completaba la fase de inducción del estrés por oxidación, se evaluó la viabilidad celular de las diversas muestras, según el método descrito en el punto 4.1.2 (ensayo con MTT). Los datos se expresaron como un porcentaje de viabilidad celular en comparación con células de control no estresadas (ctr), según la siguiente fórmula: % viabilidad celular / ctr = (Abs Muestra /Abs ctr) * 100

Todos los análisis se realizaron al menos dos veces usando muestras por duplicado.

Estudio de los efectos de Galeopsis segetum y Galeopsis tetrahit y sobre la producción de ROS usando un ensayo de DCFH-DA-BALB3T3

Principios del método

La producción de ROS en la línea celular de fibroblastos murinos BALB3T3 se determinó mediante un espectrofotómetro usando el ensayo de diacetato de 2,7-diclorofluoresceína (DCFH-DA), según se describe por Tobi et al. (Tobi et al., 2000).

El DCFH-DA es un compuesto no fluorescente en forma lipófila, capaz de extenderse a través de la membrana celular. Una vez dentro de la célula, es desacetilado por las esterasas intracelulares hasta 2,7-diclorofluoresceína reducida (DCFH), que tampoco es fluorescente. La DCFH, incapaz de cruzar de nuevo la membrana celular, finalmente se termina acumulando en las células (Curtin et al., 2002). La reacción de ROS intracelular conduce a la oxidación de 2,7-diclorofluoresceína (DCF) DCFH, un compuesto muy fluorescente. Esta intensidad de fluorescencia se puede detectar mediante un fluorímetro, que permite estimar la cantidad de ROS producido en las células.

La Figura 5 muestra una representación esquemática del principio de ensayo de diclorofluoresceína: el precursor no fluorescente DCF entra en la célula, se desacetila y posteriormente se oxida, en el caso de un incremento de la presencia de ROS en la célula, para dar el fluoróforo DCF. Este se puede excitar a 538 nm, mediante un espectrofluorímetro, y emite fluorescencia a 485 nm.

Procedimiento experimental

El protocolo usado para este experimento representa una versión modificada de la descrita en un trabajo de Tobi y colaboradores (Tobi et al., 2000).

Fibroblastos murinos BALB3T3 se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 5*104 células/pocillo y se incubaron hasta que se alcanzaba aproximadamente 80% de confluencia.

Posteriormente, las células se incubaron durante 16 horas con Galeopsis segetum y Galeopsis tetrahit (biomasa de planta y muestra hidroalcohólica seca) a una concentración de 20 pg/ml. Las diluciones se prepararon a partir de una solución madre 1000X en DMSO, se filtraron estérilmente y usando medio DMEM complementado con 2,5% de suero bovino fetal (FCS, por sus siglas en inglés), 1% de aminoácidos no esenciales (NEAA), 1% de una mezcla de penicilina y estreptomicina (Pen-Strep Mix).

Células tratadas con H2O2 1 mM se usaron como un control positivo; en cambio, se usaron células mantenidas en medio de cultivo solas (DMEM 2,5% de FCS) como un control negativo.

Se probó a-tocoferol a una concentración de 25-50-250-500 pM.

Al final de la incubación, se indujo estrés oxidativo, mediante un tratamiento de 90 minutos con una solución 1 mM de H2O2, en la oscuridad, a 37°C y 5% de CO2.

Una vez se completaba el tratamiento, las células se lavaban dos veces con 1X PBS y se sometían a lisis con tampón de lisis CelLytic™ (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) según el protocolo del proveedor.

Posteriormente, los lisados se transfirieron a una placa negra de 96 pocillos y la fluorescencia de DCF se leyó espectrofluorimétricamente usando un lector de fluorescencia de microplacas FluoroskanAscent FL (Thermo Fisher ScientificInc., Waltham, MA, EE. UU.), con longitudes de onda de excitación y emisión de 485 y 538 nm, respectivamente.

Los valores de emisión (RFU) obtenidos para cada muestra, relacionados con la producción de ROS intracelular, se compararon con el valor de emisión obtenido para el control negativo (control, células tratadas con H2O21 mM) y se expresaron como un porcentaje de ROS producido según la siguiente ecuación:

% Productos de ROS / ctr = (ABs538 nm muestra (Abs538 nm ctr) * 100

Todos los análisis se realizaron al menos dos veces usando muestras por duplicado.

Efectos del estudio de Galeopsis segetum y Galeopsis tetrahit sobre la actividad de 5 alfa-reductasa (isoforma 2)-BALB3T3

Procedimiento experimental

La expresión génica de la isoforma 2 de 5 alfa-reductasa (SRD5A2) en células BALB3T3 se evaluó mediante RT-PCR cuantitativa (reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa - qRT-PCR) relativa.

Este análisis ha previsto 3 fases secuenciales:

■ Extracción de ARN total;

■ Transcripción inversa en ADNc;

■ qRT-PCR.

Fibroblastos murinos BALB3T3 se sembraron en placas de 12 pocillos a una densidad de 0,5*106 células/pocillo y se incubaron hasta que se alcanzaba aproximadamente 80% de confluencia.

Posteriormente, las células se incubaron durante 24 horas con Galeopsis segetum y Galeopsis tetrahit (biomasa vegetal y muestra hidroalcohólica seca) a las siguientes concentraciones: 20-50 y 100 pg/ml.

Las diluciones se prepararon a partir de soluciones madre de 1000x en DMSO, se filtraron estérilmente y usando medio DMEM añadido a 10% de suero bovino fetal (FCS), 1% de aminoácidos no esenciales (NEAA), 1% de una mezcla de penicilina y estreptomicina (Pen-Strep Mix).

Células mantenidas en medio de cultivo solo (DMEM 2,5% de FCS) se usaron en cambio como un control negativo. La finasterida, un inhibidor selectivo de la isoforma 2 de 5 alfa-reductasa (SRD5A2), se probó a una concentración de 0,05 mg/ml.

Al final de la incubación, se extrajo el ARN,

Se extrajo el ARN total de células BALB3T3 usando TriReagent (Sigma Aldrich) según el procedimiento descrito por Chomczynski y Mackey (1995).

Al final de la incubación con los compuestos activos de interés, las células se lavaron con PBS (1X) y finalmente se sometieron al procedimiento de extracción de ARN. Al final de la extracción, usando un espectrofotómetro (Jenway UV / VIS MOD: 6715, BS-6715B0), se calcularon las concentraciones en qg/ml de ARN total extraído a la longitud de onda de 260 nm. Finalmente, se evaluó la integridad del ARN (2 qg/ml) mediante marcha electroforética sobre gel de agarosa al 1%.

El ARN total se convirtió en ADNc (ADN complementario), usando una enzima capaz de sintetizar una molécula de ADN usando una hebra de ARN como una plantilla; esta enzima de ARN dependiente de ADN polimerasa se denomina transcriptasa inversa.

Se une al extremo 3' de una sola hebra de ARN y a través de los cebadores aleatorios y trifosfatos de desoxinucleótido (DNTP) sintetiza la hebra de ADNc.

Para este propósito, se usó un estuche comercial "PrimeScriptTM RT Reagent Kit (perfect Real Time)" (TakaraBioInc., Japón) que contiene 5X tampón PrimeScript (para tiempo real); PrimeScript RT Enzyme Mix1; OligodTPrimer; exámeros aleatorios; dhbO libre de ARNasa. El ARN extraído y cuantificado se diluyó hasta una concentración de 2 qg/ml y se retrotranscribió en ADNc. Se preparó una mezcla madre de 10 ql (que contenía 5X tampones PrimeScript (para tiempo real), PrimeScript RT Enzyme Mix1, OligodTPrimer 50 qM, exámeros aleatorios 100 qM) a la que se añadían 10 ql de ArN (2 qg/ml).

Las muestras se pusieron en un termociclador (Stratagene Mx3000P Real Time PCR System, Agilent Technologies Italy S.p.A., Milán, Italia) y se sometieron a retrotranscripción bajo las siguientes condiciones:

37°C durante 15 minutos;

85°C durante 5 segundos;

4°C mantenimiento.

Al final de la retrotranscripción a las muestras, se añadieron 30 ql de agua DEPC para obtener una concentración final de ADNc de 40 ng/ql.

QRT-PCR representa un método de amplificación y cuantificación en tiempo real de los amplificadores producidos al comprobar la fluorescencia emitida durante la reacción.

Para la amplificación por RT-PCR, se usó el sistema de sondeo TaqMan® (AppliedBiosystems). Se usaron las siguientes sondas TaqMan: Mm00446421ml (SDR5A2) y Mm00466519ml (p-actina). La p-actina se usó como el gen de control (constitutivo).

La sonda Taqman es un tipo de sonda que permite el desarrollo de fluorescencia durante la amplificación. En su extremo 5' se une un indicador (fluoróforo FAM™) mientras que en el extremo 3' un desactivador. La proximidad entre el indicador y el desactivador cancela la emisión de la señal de fluorescencia. Solo se detecta fluorescencia con la actividad de exonucleasa 5' de la ADN polimerasa termoestable (polimerasa de Taq) y la acumulación de productos de amplificación se puede evaluar al incrementar la fluorescencia del indicador que se incrementa con cada ciclo.

Para la qRT-PCR, se ha establecido una mezcla madre como sigue:

- 10 ql de "2X Premix Ex Taq";

- 1 ql de "20X TaqMan Gene ExpressionAssays" (que contienen 2 cebadores y la sonda fluorescente marcada con el fluoróforo FAM™);

- 0,4 ql de la referencia pasiva Rox II;

- 5 ql de agua DEPC.

Se añadieron a la mezcla madre 4 ql de ADNc para el gen diana y 1 ql de ADN para el gen constitutivo.

La amplificación se efectuó durante 40 ciclos bajo las siguientes condiciones:

95°C, 30 segundos (activación con AmpliTaq);

95°C, 5 segundos (desnaturalización)

60°C, 20 segundos (renaturalización - extensión);

Cada análisis se realizó por duplicado.

Los datos obtenidos se analizaron según el método 2^'ññ^Ct y así era posible calcular los valores de expresión relativos del gen de interés, normalizados con respecto al gen constitutivo y calibrados sobre la muestra de control (células no tratadas):

AACt = ACt^{diana-constitutivo} (control) - ACt^{diana-constitutivo} (células tratadas)

Suponiendo una eficacia de amplificación de 100%, se calculaba la 2-AA^Ct.

RESULTADOS

Ensayo de citotoxicidad preliminar (ensayo MTT) -BALB3T3

Tab. 1

La Figura 1 incluye los datos obtenidos a partir del ensayo de MTT (media ± EE).

Los resultados muestran cómo Galeopsis tetrahit ejerce un estímulo significativo en la actividad proliferativa de las células a todas las concentraciones estudiadas y presentadas en la Tabla 1 anteriormente. Este es un efecto deseable dentro del alcance de la acción sobre la fisiología capilar.

Producción intracelular de ROS (ensayo de DCFH-DA) -BALB3T3

Tab. 2

La Figura 2 adjunta a la presente solicitud presenta la actividad antioxidante tanto de Galeopsis segetum como de Galeopsis tetrahit. La Tabla 2 anterior muestra los datos de actividad eliminadora.

Los resultados muestran cómo los extractos expresan una fuerte actividad antioxidante, también en comparación con el a-tocoferol 25 pM.

Mientras que Galeopsis segetum tiene una actividad comparable al alfa-tocoferol, usado como un estándar de referencia para la eliminación, Galeopsis tetrahit tiene una actividad significativamente mejor que el alfa-tocoferol. Galeopsis tetrahit también demostró, con la misma concentración, una actividad casi doble en comparación con la Galeopsis segetum.

Estudio de los efectos de extractos de Galeopsis segetum y Galeopsis tetrahit sobre el estrés oxidativo inducido-BALB3T3

Tab. 3

La Figura 3 incluida en la presente muestra los datos para la actividad de protección celular contra el estrés oxidativo inducido por H2O2.

El estrés oxidativo inducido produce una situación de sufrimiento celular que da como resultado una pérdida de población celular significativa. El tratamiento con Galeopsis segetum y Galeopsis tetrahit muestra una capacidad protectora contra el proceso apoptótico inducido por estrés oxidativo.

Además, en este experimento, se usó alfa-tocoferol como un estándar de referencia para la protección contra el estrés oxidativo.

Galeopsis segetum muestra una actividad comparable al alfa-tocoferol mientras que Galeopsis tetrahit muestra una actividad significativamente mejor que tanto el alfa-tocoferol como Galeopsis segetum.

Estudio de los efectos de Galeopsis segetum y Galeopsis tetrahit sobre la actividad de 5 alfa-reductasa (isoforma 2) -BALB3T3

La Figura 4 ilustra los datos de expresión génica de la isoforma 2 de 5 alfa-reductasa, diana del fármaco finasterida, que se ha usado como una comparación. Incluso en este caso, se usaba el extracto hidroalcohólico de ambas plantas. Ejemplo 8

Análisis metabolómico de Galeopsis segetum Necky Galeopsis tetrahit L.

OBJETIVO DEL ESTUDIO:

En el presente ensayo, se describe la investigación fitoquímica de materiales y extractos de las plantas Galeopsis segetum Neck y Galeopsis tetrahit L. que hace uso de la técnica de la huella de RMN.

También se describe la comparación metabolómica de las dos especies.

MATERIALES Y MÉTODOS:

Muestras de Galeopsis sp. bajo examen

Número ID ID botánica

211973 G. segetum (Ref. material de planta) Material vegetal en bruto

211974 G. segetum (Ref. material de planta) Material vegetal en bruto

211975 G. segetum (Ref. material de planta) Material vegetal en bruto

211976 G. segetum (Ref. material de planta) Material vegetal en bruto

202517 G. tetrahit (Ref. material de planta) Material vegetal en bruto

202518 G. tetrahit (Ref. material de planta) Material vegetal en bruto

202519 G. tetrahit (Ref. material de planta) Material vegetal en bruto

203285 G. tetrahit (Ref. material de planta) Material vegetal en bruto

994/39/A - Extracto

1029/41/A - Extracto

1029/42/A - Extracto

Procedimiento de extracción para material vegetal en bruto:

El material en bruto molido se extrae en etanol al 40% durante 6 horas a 50°C en un baño calentado bajo agitación mecánica.

A continuación, cada extracto se filtra y el disolvente se evapora a través de liofilización.

Preparación de la muestra para el análisis:

Aproximadamente 10 mg de cada muestra se pesan y se disuelven en 1 ml de MeOD 99,8%/D2O tamponada 40/60 (v/v, tampón de fosfato, 100 pM).

Los espectros se registran en un Varian 400 MHz de RMN y a continuación se someten a análisis metabolómico usando el programa (Mathworks®).

Los parámetros experimentales se presentan posteriormente:

Parámetros de RMN:

Parámetro Valor

Tiempo de Adquisición (s) 3,9999

Frecuencia (MHz) 399,7839

Núcleo 1H

Número de Transitorios 32

Recuento de Puntos Originales 24752

Recuento de Puntos 32768

Secuencia Pulsátil wet ID

Ganancia del Receptor 42,00

SW(cíclico) (Hz) 6188,12

Disolvente D2O Tamponada/Metanol 9,8%

Temperatura (grados) 30°C

Preprocesamiento de datos de Matlab:

Normalización hasta 100

Centrado medio

Corrección de referencia a 0

RESULTADOS Y CONCLUSIONES

Los espectros de RMN de 1H-NMR se han registrado y procesado con VNMRJ 4.0 rev. Se ha usado Spectrus Platform de ACD/labs para la transformación de Fourier y la elaboración de los conjuntos de datos. Los datos brutos obtenidos de análisis de RMN se convirtieron en una matriz representada por los puntos de datos "n x m", donde "n" es el número de cada espectro y "m" es el valor de cada variable. Generalmente, el número de variables consiste en más de 15000 puntos de datos.

La matriz de datos se procesó haciendo uso de un análisis de componentes principales (PCA, por sus siglas en inglés) programado en el programa MATLAB de The MathWorks (Natick, EE. UU.). Los espectros originales se alinearon previamente usando el algoritmo COW (deformación optimizada por correlación, por sus siglas en inglés) [Tomasi et al., J. Chemom. Vol. 8 (2004) 231-241]. Los algoritmos COW están disponibles en línea en http://www.models.life.ku.dk/algorithms. Las señales se sometían a centrado de datos, normalización al porcentaje de las respuestas de señal totales dentro de cada espectro y la línea de base corregida. También se sometieron alternativamente a autoescalado a la unidad de varianza, a fin de hacer cada señal del conjunto de datos directamente comparable entre todos los espectros y atribuir la misma importancia a cada pico del espectro: el análisis resultante era comparable con los resultados no autoescalados [Van den Berg et al. BMC Genomics vol. 7 (2006), 142].

Un espectro de RMN de 1H típico de las partes aéreas de Galeopsis sp. se expone en la Figura 6: Los espectros de RMN de 1H alineados y normalizados relativos a las muestras bajo investigación se agotaron de picos pertenecientes a los disolventes y a azúcares, que son inútiles para la comparación entre material en bruto y extractos.

Los espectros obtenidos se presentan en la Figura 7.

Los espectros de RMN de 1H se representaron mediante una matriz de datos con 11 muestras x 16501 puntos de intensidades de desplazamientos químicos (variables) y se sometieron a una evaluación multivariable haciendo uso del análisis de componentes principales.

La proyección de PC1 frente a PC2 no supervisada de los espectros de RMN de 1H pertenecientes a materiales de planta de Galeopsis segetum y tetrahit (cuadrados verdes: materia prima de referencia de Galeopsis segetum, rombos azules: materia prima de referencia de Galeopsis tetrahit) y extractos de Galeopsis tetrahit (círculos negros) se presenta en la Figura 8.

La suma de PC1 y PC2 representa aproximadamente 63% de la varianza total (Figura 9).

Según se presenta en la Figura 8, los dos grupos de Galeopsis segetum y tetrahit resultaban estar separados a lo largo del PC1, que representa la mayoría de la varianza del conjunto de datos (41%). Los extractos 1029/41/A, 1029/42/A y 994/39/A establecidos en el espacio representado por la materia prima de referencia de G. tetrahit, sugiriendo la similitud de la composición fitoquímica con la especie Galeopsis tetrahit.

A fin de investigar adicionalmente los resultados obtenidos, se ha evaluado la representación de las cargas de PC1. La carga 1 para PC1 ayuda a asignar las variables (picos) que son las más responsables de la separación en el espacio PC1 frente al PC2. La carga 1 se representa en la Figura 10.

La carga 1 justifica la separación a lo largo del PC1: la mitad derecha de la superficie del PCA (parte positiva) corresponde a la parte superior de la carga 1 mientras que la zona izquierda del PCA (parte negativa) corresponde a la parte inferior de la carga.

Por lo tanto, comparando el perfil de RMN con la carga 1 es posible identificar las señales de RMN responsables de la separación por agrupación del PCA, según se presenta en la Figura 11.

Los picos 1 y 2 se pueden asignar tentativamente al resto acetato del conjunto de flavonoides, típico de la especie Segetum [Tomás-Barberán et al. BMC Genomics vol. 7 (2006), 142]. Los picos 3, 4, 5 y 6 están solapados haciendo difícil su atribución. Probablemente, estas señales pertenecen a ácidos cafeico o cafeoilquínico.

Adicionalmente, los conjuntos de datos de RMN se sometieron a un análisis estadístico supervisado (PLS, mínimos cuadrados parciales, por sus siglas en inglés), que permite clasificar muestras desconocidas usando materias primas estándar de referencia: esta función permite asignar las muestras desconocidas (en este caso los propios extractos) a una clase de los dos grupos de referencia.

Los datos obtenidos a partir de esta evaluación se muestran en la Figura 12 (representación de PLS) y en la Tabla 1 siguiente (valores predichos):

Tabla 1

ID muestra Valor predicho

211973 1,0

211974 1,0

211975 1,2

211976 0,9

211976-2 1,1

202517 2,1

202518 1,9

202519 2,1

203285 1,9

994/39/A 1,8

1029/41/A 1,6

1029/42/A 1,7

La Tabla 1 lista los valores predichos para cada muestra del conjunto de datos: puesto que a los grupos para G. segetum y tetrahit usados como el grupo de entrenamiento se les asignaban valores de 1 y 2, respectivamente, los valores cercanos a 1 permiten asignar la muestra a la clase segetum, mientras que los valores cercanos a 2 permiten asignar la muestra al grupo tetrahit.

Los resultados obtenidos esbozan que los tres extractos se pueden adscribir a la especie tetrahit. En conclusión, los métodos estadísticos tanto no supervisados como supervisados usados en este informe apoyan lo siguiente:

El análisis de RMN muestra las diferencias en la composición fitoquímica entre Galeopsis segetum Neck y Galeopsis tetrahit L. debidas a un patrón diferente de los metabolitos secundarios.

Los extractos obtenidos de material de planta de Galeopsis tetrahit muestran un patrón de metabolitos secundarios equivalente a la especie de material de planta de partida, a saber la Galeopsis tetrahit.

REFERENCIAS

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fibroblasts in culture under oxidative stress. Biol Trace Elem Res 47(1-3), 313-319.

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-Chomczynski P, Mackey K. Modification of the TR1 reagent procedure for isolation of

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Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Uso cosmético de un extracto de planta de la especie Galeopsis tetrahit para estimular el crecimiento del cabello y/o prevenir o tratar la pérdida de cabello.

2. El uso cosmético según la reivindicación 1, en el que dicho extracto de planta se obtiene mediante extracción con un disolvente fisiológicamente aceptable desde una porción o un tejido de la planta Galeopsis tetrahit.

3. Uso cosmético de una composición que comprende un extracto de planta de la especie Galeopsis tetrahit y un portador fisiológicamente aceptable para estimular el crecimiento del cabello y/o prevenir o tratar la pérdida de cabello.

4. El uso de una composición según la reivindicación 3, en el que dicha composición está en una forma para administración oral o aplicación tópica.

5. El uso de una composición según la reivindicación 3 o 4, en el que dicha composición está en una forma para administración tópica, seleccionada de una solución, una loción, una emulsión, un champú, una crema y una pomada.

6. El uso de una composición según la reivindicación 3 o 4, en el que dicha composición está en una forma para administración oral, seleccionada de comprimidos, cápsulas, píldoras y polvo granulado.

7. El uso de una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, que comprende además uno o más ingredientes bilógicos activos seleccionados entre vitaminas, minerales, micronutrientes y una de sus mezclas.

8. El uso de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 3, 4, 6 o 7, caracterizada por que es un producto nutracéutico, un alimento funcional, un integrador dietético o un complemento alimentario.

9. Un extracto de planta de Galeopsis tetrahit, para el uso en el tratamiento o la prevención de alopecia androgenética o efluvio telógeno.

10. Una composición que comprende un extracto de planta de Galeopsis tetrahit y un portador fisiológicamente aceptable para el uso en la prevención o el tratamiento de alopecia androgenética o efluvio telógeno.

11. Uso cosmético de una combinación de un extracto procedente de Galeopsis tetrahit y un extracto procedente de Galeopsis segetum Necker para estimular el crecimiento fisiológico del cabello y/o el relleno capilar y/o incrementar el volumen de cabello en un individuo.

12. Un extracto procedente de Galeopsis tetrahit en combinación con un extracto procedente de Galeopsis segetum Necker para el uso en el tratamiento de alopecia androgenética o efluvio.