ES2879289T3 - Dispositivo y método de enfoque tridimensional de microscopio - Google Patents
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Abstract
Dispositivo (II) para el enfoque tridimensional en un microscopio (I) de resolución dada, que comprende: - un detector (119) - unos medios de cálculo (121) caracterizado por que dicho detector está configurado para determinar, en un plano de medición dado, una imagen en fase y en intensidad de un campo electromagnético producido por la interacción de una onda luminosa incidente con un objeto de referencia (105) situado en un medio de referencia de índice dado, presentando el objeto de referencia un índice de refracción complejo cuya parte real y/o parte imaginaria es diferente, respectivamente, de la parte real y/o la parte imaginaria del índice de refracción del medio de referencia; y por que dichos medios de cálculo (121) están configurados para determinar, a partir de dicha al menos una imagen en fase y en intensidad, una variación de posición tridimensional del objeto de referencia (105).
Description
DESCRIPCIÓN
Dispositivo y método de enfoque tridimensional de microscopio
Campo técnico de la invención
La presente invención se refiere a un dispositivo y a un método de enfoque tridimensional para un microscopio.
Estado de la técnica
Los recientes avances en la obtención de imágenes biológicas han ampliado los límites de los microscopios existentes. Actualmente es posible, gracias a microscopios ópticos de ultra resolución como los microscopios PALM o STORM, obtener una resolución de localización de las moléculas observadas más allá del límite de difracción. No obstante, las inestabilidades inherentes a los microscopios conllevan una deriva en la posición de la muestra de la que se han obtenido imágenes, lo que compromete la precisión y exactitud de las imágenes. Estas derivas pueden estar relacionadas con vibraciones acústicas y mecánicas resultantes del medio ambiente, así como con variaciones de temperatura y pueden producirse en las tres direcciones. Además, los tiempos de adquisición de los datos obtenidos, por ejemplo, con un microscopio PALM ("Photo-activated localization microscopy" o microscopía de localización fotoactivada) pueden ser largos, a veces de varias horas, lo que aumenta la exigencia en términos de estabilidad del microscopio. En este contexto, se busca, por tanto, mantener el enfoque en la muestra a lo largo de las tres dimensiones con una muy buena resolución temporal y espacial.
Se han propuesto diferentes tipos de procedimientos de enfoque tridimensional en microscopía. Uno de estos procedimientos, comúnmente utilizado en microscopía óptica, consiste en inyectar un haz luminoso producido por una fuente de tipo LED IR en el microscopio, luego, en medir la señal reflejada por el cubreobjetos de la muestra (véase, por ejemplo, Zemek et al., "CRISP nearly eliminates microscopy focus drift", LASER FOCUS WORLD, 48(9), 9-10, 2012). Si bien estos sistemas son de uso común, la precisión obtenida para enfocar a lo largo del eje óptico no supera los 50 nm.
Con el objetivo de obtener una mejor precisión, existen otras técnicas que utilizan marcas micrométricas en el campo de visión del microscopio.
Por ejemplo, la solicitud de patente US2013027518 describe, en un modo de realización, un dispositivo de enfoque automático para un microscopio en el que una fuente de luz ilumina una muestra y un elemento de referencia. El elemento de referencia sirve como marca y se mantiene en el soporte de la muestra. La deriva en la posición de la muestra a lo largo del eje z (eje óptico del objetivo del microscopio) se corrige entonces midiendo la variación de una dimensión transversal de la imagen del elemento de referencia, la variación en la dimensión transversal correspondiente a una medición del valor absoluto de la variación de la posición axial del objeto de referencia. Aunque este dispositivo permite alcanzar una precisión del orden de unos veinte nanómetros, requiere ejercer un control de retroalimentación de bucle cerrado de la bandeja para ajustar la posición y evaluar el sentido de la variación de la posición axial del objeto de referencia.
Otro ejemplo para evaluar y por tanto paliar las derivas en la posición de la muestra observadas en un microscopio se describe en la solicitud de patente US2012300293. Esta se refiere a la medición de la intensidad de la luz difractada por unos marcadores con unas dimensiones de 300 nm a 4 pm dispuestos para formar una red bidimensional y que se encuentran sobre un soporte de una muestra que se va a observar. Esta técnica permite obtener precisiones teóricas del orden de algunas decenas de nanómetros, pero requiere la fabricación de una red microscópica bidimensional.
El documento DE 102011 003807 A1 describe un método de focalización automática durante el análisis microscópico de un objeto. El documento WO 2013/0010859 A1 describe un método para la localización tridimensional en microscopía de superresolución de una o más partículas emisoras. La presente invención propone un dispositivo y un método de enfoque tridimensional para un microscopio que permite, en concreto, un enfoque automático tridimensional con una sola medición y con una resolución inferior a 10 nm.
Compendio de la invención
Según un primer aspecto, la invención se refiere a un dispositivo de enfoque tridimensional en un microscopio de resolución dada que comprende, en concreto, un detector para la detección de fase e intensidad de un campo electromagnético y unos medios de cálculo.
De manera más específica, el detector está configurado para determinar en un plano de medición dado, una imagen en fase y en intensidad de un campo electromagnético producido por la interacción de una onda luminosa incidente con un objeto de referencia situado en un medio de referencia de índice dado, presentando el objeto de referencia un índice de refracción complejo cuya parte real y/o parte imaginaria es diferente, respectivamente, de la parte real y/o de la parte imaginaria del índice de refracción del medio de referencia.
Los medios de cálculo están configurados para determinar a partir de dicha al menos una imagen en fase y en intensidad, una variación de posición tridimensional del objeto de referencia.
Para la implementación del dispositivo, el objeto de referencia se elige integrado en un portamuestras del microscopio; más específicamente, el objeto de referencia puede estar inmóvil con respecto al portamuestras o presentar un desplazamiento conocido con respecto al portamuestras o bien presentar un desplazamiento inferior o igual a una precisión de puntería deseada. Los solicitantes han demostrado que es posible, a partir del análisis simultáneo en un plano de detección dado de imágenes en fase e intensidad del campo electromagnético producido por la interacción con el objeto de referencia, determinar de manera muy precisa las variaciones tanto axiales como laterales del objeto de referencia y, en consecuencia, las derivas del microscopio.
Un dispositivo de este tipo se puede integrar con facilidad en un microscopio convencional.
Según una variante, la onda luminosa que interactúa con el objeto de referencia puede ser emitida por la fuente luminosa del microscopio.
Según una variante de la invención, el dispositivo comprende una fuente de emisión propia para la emisión de un haz de iluminación del objeto de referencia. Un dispositivo de este tipo permite elegir de manera independiente de la fuente luminosa del microscopio las características de la fuente de emisión del haz de iluminación del objeto de referencia.
Según una variante de la invención, las dimensiones del objeto de referencia elegido para la implementación del dispositivo están comprendidas entre 0,1 y 2 veces la resolución del microscopio. En efecto, aunque es posible la interacción entre la onda luminosa incidente y el objeto de referencia independientemente del tamaño del objeto de referencia, se obtiene una interacción más fuerte con objetos de referencia de pequeñas dimensiones, lo que permite aumentar la precisión de la medición. Sin embargo, las dimensiones del objeto de referencia deben ser lo suficientemente grandes para que la formación de las imágenes del objeto de referencia no esté limitada por la resolución de la cámara.
Según una variante, el objeto de referencia puede formar parte de la muestra; se trata, por ejemplo, de un objeto de referencia intrínseco o endógeno a la muestra. De este modo, el elemento que sirve como objeto de referencia ya está presente en la muestra.
Según otra variante, el objeto de referencia es un elemento externo a la muestra, destinado a colocarse en un medio de referencia con un índice dado.
Por ejemplo, el objeto de referencia comprende una partícula de material metálico o de material dieléctrico, presentando, respectivamente, una parte real del índice de refracción o una parte imaginaria del índice de refracción diferente de la parte real o de la parte imaginaria del índice de refracción del medio de referencia. Esta diferencia es ventajosamente superior o igual a 0,1, ventajosamente, superior o igual a 0,5. Favorablemente, el uso de este tipo de material permite observar dependencias de fase e intensidad fuertemente contrastadas en función de la posición del objeto de referencia, resultante de interacciones más fuertes entre la onda luminosa incidente y el objeto de referencia.
Según una variante de la invención, el detector bidimensional de fase e intensidad comprende una máscara Hartmann modificada, que permite medir simultáneamente la intensidad y la fase de un campo electromagnético.
Según un segundo aspecto, la invención se refiere a un microscopio que comprende un portamuestras, una fuente de emisión de un haz de iluminación, un objetivo de microscopio, un dispositivo de enfoque tridimensional de acuerdo con la presente descripción, unos medios de desplazamiento relativo del portamuestras y del objetivo del microscopio a lo largo de las tres dimensiones.
Según una variante de la invención, el dispositivo comprende unos medios de control para transmitir a los medios de desplazamiento del microscopio la variación calculada de la posición tridimensional del objeto de referencia, lo que permite el enfoque automático del microscopio.
Según un tercer aspecto, la invención se refiere a un método de enfoque tridimensional en un microscopio, que comprende:
- la elección de un objeto de referencia en un medio de referencia con un índice dado, estando dicho objeto de referencia integrado en un portamuestras y presentando un índice de refracción complejo cuya parte real y/o parte imaginaria es diferente, respectivamente, de la parte real y/o imaginaria del índice de refracción del medio de referencia;
- la iluminación del objeto de referencia mediante una onda de luz incidente;
- la adquisición de al menos una imagen en fase y en intensidad, en un plano de medición dado, de un campo electromagnético producido por la interacción de la onda de luz incidente con el objeto de referencia;
- la determinación, a partir de dicha al menos una imagen en fase y en intensidad, de una variación de posición tridimensional del objeto de referencia.
Según una variante, el objeto de referencia elegido forma parte de la muestra; el objeto de referencia es, por ejemplo, intrínseco a la muestra.
Según una variante, el objeto de referencia es un objeto externo a la muestra y el método de enfoque tridimensional comprende la colocación del objeto de referencia en el medio de referencia.
Según una variante de la invención, el método de enfoque comprende una etapa de calibración preliminar, comprendiendo la etapa de calibración la determinación, para una serie de posiciones axiales del objeto de referencia, de la intensidad y fase en un punto dado del plano de medición.
La calibración permite así caracterizar el campo electromagnético producido por la interacción entre la onda incidente y el objeto de referencia, por ejemplo, por medio de nomogramas que dan la fase y la intensidad en función de la posición axial del objeto de referencia y facilitar la aplicación del método de enfoque tridimensional. La adquisición de una imagen o de una serie de imágenes en un solo plano de medición es suficiente en el transcurso de la operación para conocer con mucha precisión el valor y el sentido de la variación axial del objeto de referencia, pudiendo determinarse la variación lateral sobre la imagen en fase o en intensidad.
Según una variante de la invención, la etapa de calibración comprende el cálculo de imágenes en fase y en intensidad para diferentes posiciones axiales del objeto de referencia utilizando un algoritmo de propagación, lo que permite el establecimiento de nomogramas sin medición preliminar, simulando la forma del campo electromagnético resultante de la interacción entre la onda de luz incidente y el objeto de referencia, cuyas características se conocen.
Según una variante de la invención, el cálculo de las imágenes en fase y en intensidad durante la calibración se basa en al menos una imagen del objeto de referencia adquirida de antemano, lo que permite deducir los nomogramas sin conocer todas las características del objeto de referencia, del medio de referencia y de la fuente de emisión.
Según una variante de la invención, el método de enfoque tridimensional además comprende una etapa de transmisión a unos medios de desplazamiento, etc. de la variación calculada de la posición tridimensional del objeto de referencia, lo que permite realizar un enfoque automático.
Breve descripción de los dibujos
Otras ventajas y características de la invención resultarán evidentes tras la lectura de la descripción, ilustrada por las siguientes figuras:
- Figura 1A, un esquema que ilustra un microscopio equipado con un dispositivo de enfoque tridimensional que opera en transmisión, según un ejemplo de realización;
- Figura 1B, un esquema que ilustra un microscopio equipado con un dispositivo de enfoque tridimensional que opera en reflexión, según un ejemplo de realización de la invención;
- Figuras 2A a 2C, unos esquemas que ilustran ejemplos de objetos de referencia para un dispositivo de enfoque según la presente descripción;
- Figuras 3A a 3D, unos esquemas que ilustran diferentes configuraciones de colocación del objeto de referencia con respecto al portamuestras;
- Figuras 4A a 4F, unos ejemplos de imágenes en fase y en intensidad de un campo electromagnético producido por la interacción de una onda incidente con un objeto de referencia formado por una partícula metálica en diferentes posiciones axiales del objeto de referencia;
- Figuras 5A y 5B, unos ejemplos de gráficos, obtenidos experimental y digitalmente, que representan, respectivamente, la intensidad y la fase de un campo electromagnético producido por la interacción entre una onda incidente y un objeto de referencia formado por una partícula metálica, en función de la posición axial del objeto de referencia;
- Figuras 6A y 6B, unos ejemplos de gráficos, obtenidos digitalmente, que representan, respectivamente, la intensidad y la fase de un campo electromagnético producido por la interacción entre una onda incidente y el objeto de referencia en función de la posición axial del objeto de referencia, para un objeto de referencia de material metálico y para un objeto de referencia de material dieléctrico;
- Figuras 7A y 7B, unos ejemplos de gráficos que representan, respectivamente, la sensibilidad relativa en fase y en intensidad en función de la longitud de onda de iluminación del objeto de referencia;
- Figura 8, un gráfico que representa el desplazamiento necesario para el enfoque calculado por medio de un sistema de enfoque automático estándar y calculado por un ejemplo de dispositivo según la presente descripción.
Descripción detallada
En las figuras, los elementos idénticos están indicados con las mismas referencias.
La Figura 1A ilustra un ejemplo de un microscopio I que integra un dispositivo de enfoque tridimensional II según una variante de la invención que implementa una iluminación de transmisión.
Como se ilustra en el ejemplo de la Figura 1A, el microscopio comprende un canal de iluminación 1, así como un primer canal de detección 2. El canal de iluminación 1 comprende una fuente de emisión 101 de un haz de iluminación colimado y uniforme, tal como una fuente de luz coherente, por ejemplo, una iluminación Kohler que permite obtener una iluminación homogénea de una muestra 103 dispuesta en un portamuestras 107. La fuente de emisión es, por ejemplo, una fuente monocromática. El canal de detección 2 está destinado a formar una imagen de una zona de interés de la muestra en una superficie de detección de un detector matricial 117, por ejemplo, una cámara CCD o una cámara amplificada de tipo EMCCD (abreviatura de la expresión en anglosajona "Electron Multiplying Coupled Charge Display", dispositivo de carga acoplada multiplicadora de electrones). El primer canal de detección 2 comprende un objetivo de microscopio 109 destinado a funcionar, por ejemplo, en una configuración óptica de trabajo de foco infinito, es decir que, en la configuración óptima de trabajo, el haz emitido por una muestra 103 en el centro del campo objeto ("plano de trabajo") del objetivo del microscopio es un haz colimado en la salida del objetivo del microscopio 109. El primer canal de detección también comprende elementos ópticos que permiten la formación de la imagen en la superficie de detección, comprendiendo los elementos ópticos, por ejemplo, un sistema óptico de formación de imágenes objetivas 115 y, opcionalmente, unos medios de deflexión 111. El microscopio además comprende unos medios de desplazamiento 122 relativos entre el portamuestras 107 y el objetivo del microscopio 109 para ajustar el enfoque en la zona de interés de la muestra. En el ejemplo de la Figura 1, los medios de desplazamiento comprenden, por ejemplo, una plataforma motorizada, por ejemplo, una plataforma piezoeléctrica, que permiten desplazar el portamuestras 107 en un plano lateral XY perpendicular al eje óptico del objetivo del microscopio, así como a lo largo del eje Z paralelo al eje óptico del objetivo del microscopio.
Convencionalmente, un microscopio de este tipo está caracterizado por una "resolución" proporcional a la relación entre la longitud de onda central de la banda espectral de la fuente de iluminación 101 y la apertura numérica del objetivo del microscopio 109.
Como se ilustra en el ejemplo de la Figura 1A, el microscopio I además comprende un dispositivo de enfoque tridimensional II.
El dispositivo de enfoque tridimensional II comprende, en el ejemplo de la Figura 1, un objeto de referencia 105 destinado colocarse en un medio de referencia de índice dado, estando el objeto de referencia integrado en el portamuestras 107. Como alternativa, el objeto de referencia puede formar parte de la muestra, como se describirá con más detalle en lo sucesivo.
El dispositivo de enfoque tridimensional II comprende, asimismo, un detector 119 que permite determinar en un plano de medición dado, una imagen en fase y en intensidad de un campo electromagnético producido por la interacción de una onda incidente con el objeto de referencia y unos medios de cálculo 121 que permiten determinar a partir de al menos una imagen en fase y en intensidad de dicho campo electromagnético, una variación en la colocación tridimensional del objeto de referencia. Estos medios de cálculo pueden conectarse a unos medios de control de la platina 122 para controlar el desplazamiento relativo entre el objetivo del microscopio y el portamuestras y así asegurar, por ejemplo, un enfoque automático.
En el ejemplo de la Figura 1A, la onda incidente procede de la fuente de iluminación 101 del microscopio. Sin embargo, el dispositivo de enfoque tridimensional también puede comprender una fuente específica como se describirá más adelante.
Ventajosamente, el plano de medición coincide sustancialmente con un plano situado en las proximidades del plano conjugado del objeto de referencia 105 para maximizar la sensibilidad del dispositivo, cuando el dispositivo para el enfoque tridimensional II está integrado en el microscopio I. De este modo, en el ejemplo de la Figura 1, el microscopio I comprende un segundo canal de detección 3 para el enfoque tridimensional, comprendiendo el segundo canal de detección 3, en el ejemplo de la Figura 1, el objetivo del microscopio 109 común con el canal de detección 2 del microscopio y un objetivo 113.
Según una variante de la invención ilustrada en la Figura 1B, la iluminación de la muestra se produce por reflexión. En este ejemplo, el haz de iluminación se refleja en una lámina 104, por ejemplo, una lámina dicroica o una lámina semirreflectante que permite el paso de los rayos recogidos, hacia el objetivo. Una vez más, la fuente de emisión puede formar parte del dispositivo de microscopio o del dispositivo de enfoque independientemente del dispositivo de microscopio.
Según la presente descripción, el objeto de referencia elegido para la implementación del enfoque tridimensional presenta un índice de refracción complejo cuya parte real y/o parte imaginaria es diferente, respectivamente, de la parte real y/o la parte imaginaria del índice de refracción del medio de referencia, de modo que se genera una modificación del campo electromagnético de la onda incidente que interactúa con el objeto de referencia. En caso de
que el objeto de referencia sea un elemento externo a la muestra, este último puede ser, por ejemplo, de un material metálico con una parte imaginaria del índice complejo predominante o de un material dieléctrico con una parte real del índice complejo predominante.
Por medio de referencia, en la presente descripción se entiende cualquier medio en contacto con el objeto de referencia. Este medio puede ser, en concreto, la propia muestra que se va a observar, un sustrato de un portamuestras, aire o gas circundante.
Ventajosamente, la variación del índice real o imaginario entre el medio de referencia y el objeto de referencia es superior o igual a 0,1.
Según una variante, el objeto de referencia puede formar parte de la muestra; de manera más específica, puede tratarse de un elemento intrínseco o "inherente" a la muestra. En cualquier caso, el elemento de la muestra elegido como objeto de referencia presenta, respectivamente, una parte real del índice de refracción o una parte imaginaria del índice de refracción diferente de la parte real o de la parte imaginaria del índice de refracción del medio de referencia. Según esta variante, el objeto de referencia puede ser, en concreto, una parte de una célula tal como un orgánulo, una vesícula, un núcleo, un nucléolo, o una célula entera tal como una bacteria, un resto o residuo presente en la muestra. En caso de que el objeto de referencia esté en el interior de la muestra, se puede considerar que este está integrado en el portamuestras, si se conoce su desplazamiento teórico con respecto a las estructuras de interés (es decir, las observadas por el usuario y que requieren un enfoque automático 3D), o si su desplazamiento durante el tiempo de medición es inferior o igual a la precisión de puntería deseada, normalmente, 1/10 de la resolución del microscopio. No obstante, preferiblemente, según esta variante, el objeto de referencia está inmóvil en el marco de referencia del microscopio; es común encontrar este caso en el estudio de muestras biológicas, cuando se estudian estas últimas después de haberlas sometido a un protocolo denominado de fijación.
En el caso de un objeto de referencia definido como un elemento intrínseco a la muestra, este puede elegirse e identificarse como "objeto de referencia" gracias a una imagen de la muestra en fase o en intensidad, dependiendo de si el objeto está, respectivamente, más desfasado o es más absorbente que su entorno circundante.
Las Figuras 2A a 2C ilustran diferentes variantes de un objeto de referencia en el caso de un objeto de referencia externo a la muestra. El objeto de referencia es, por ejemplo, una partícula o un conjunto de partículas depositadas sobre un sustrato de un portamuestras 107 (Figura 2A), un terminal o un conjunto de terminales litografiados sobre un sustrato de un portamuestras (Figura 2B), un grabado o un conjunto de grabados realizados en el propio portamuestras, pudiendo llenarse las cavidades así formadas con un líquido de un índice dado (Figura 2C). Según una variante, el objeto de referencia puede comprender una combinación de estos distintos elementos. Tal y como se han presentado en los ejemplos de las Figuras 3A a 3D, los objetos de referencia se pueden colocar en la superficie superior del sustrato del portamuestras (lado de la muestra de la Figura 3A), en la superficie inferior del sustrato (lado del objetivo de la Figura 3D), en la masa del sustrato (Figura 3B) o fijarse directamente a la muestra (Figura 3C).
Puede haber cualquier número (>1) de objetos de referencia, internos o externos a la muestra, dispuestos aleatoria o regularmente, lo que permite, en concreto, aumentar la sensibilidad del dispositivo de enfoque.
El dispositivo de enfoque tridimensional según la presente descripción se basa en el análisis de la variación de fase y de intensidad del campo electromagnético producido por la interacción entre la onda incidente y el objeto de referencia colocado en el campo de observación de la muestra. De hecho, los solicitantes han demostrado que el análisis simultáneo, en un plano de detección dado, de imágenes en fase y en intensidad del campo electromagnético producido por la interacción con el objeto de referencia permite determinar con mucha precisión las variaciones axiales y laterales del objeto de referencia y, por tanto, las derivas del microscopio. La interacción entre la onda incidente y el objeto de referencia puede consistir en diferentes fenómenos físicos dependiendo de la naturaleza del objeto de referencia, por ejemplo, fenómenos de difusión o de absorción, pudiendo ser estos fenómenos resonantes en ciertos casos que se describirán con más detalle en lo sucesivo.
Para obtener una fuerte interacción entre el objeto de referencia y la onda de iluminación, es ventajoso que los elementos que forman el objeto de referencia (por ejemplo, partículas, terminales, grabados, etc.) presenten unas dimensiones del orden de la resolución del microscopio. Ventajosamente, los tamaños medios de los elementos que forman el objeto de referencia están comprendidos entre 0,1 y 2 veces la resolución del microscopio, ventajosamente, entre 0,5 y 1 veces la resolución del microscopio. De este modo, para un objetivo de microscopio que tenga una apertura numérica entre 0,5 y 1,3 y una fuente de iluminación que emita a una longitud de onda de iluminación comprendida entre 500 y 800 nm, las dimensiones del objeto de referencia (o de los elementos que forman el objeto de referencia) están comprendidas entre 40 nm y 3 pm.
La detección de imágenes en fase y en intensidad se realiza, por ejemplo, por medio de un detector bidimensional 119, pero también puede ser un detector unidimensional o puntual, combinado con un sistema de barrido.
Ventajosamente, el detector 119 permite un análisis simultáneo de la fase y de la intensidad. Se trata, por ejemplo, de un dispositivo de interferometría de desfase multilateral que utiliza una máscara Hartmann modificada, por ejemplo, por superposición de una red de amplitud de un período p dado y una red de fase de un período 2.p, por ejemplo, un detector de tipo SID4 de la empresa Phasics® que permite establecer un mapeo simultáneo de fase y de intensidad
de un frente de onda (P. Bon et al. Opt. Express 17, 13080 (2009)). Otros dispositivos permiten establecer el mapeo de fase del frente de onda y se pueden combinar con un detector de intensidad para el análisis simultáneo de la fase y de la intensidad. Los analizadores de frente de onda pueden comprender, por ejemplo y sin limitación, un analizador de curvatura, un sensor Shack-Hartmann, una configuración de microscopía de fase cuantitativa, por ejemplo, un dispositivo de holografía digital por configuración Mach-Zehnder o Michelson).
La Figura 4 presenta ejemplos de imágenes en intensidad (Figura 4A, Figura 4B, Figura 4C) y en fase (Figura 4D, Figura 4E, Figura 4F) adquiridas mediante un detector bidimensional de tipo Phasics®, estando el plano de medición combinado con el plano de trabajo del objetivo del microscopio.
De manera más específica, estas imágenes se obtienen con un objeto de referencia que comprende una partícula metálica de oro con un diámetro de 150 nm, dispuesta solidaria con el portamuestras e iluminada por una onda de iluminación con una longitud de onda de 670 nm, en diferentes posiciones relativas de la partícula con respecto al plano de trabajo del objetivo del microscopio. La posición indicada z = 0 corresponde a la posición de enfoque, para la que el objeto de referencia está en el plano de trabajo del objetivo del microscopio, combinado con el plano de medición del detector de fase y de intensidad. Las posiciones z+ y z- corresponden a las posiciones del objeto de referencia desfasadas a lo largo del eje óptico del objetivo del microscopio, a cada lado de la posición z = 0. De manera más específica, la posición z+ corresponde a un alejamiento del objeto de referencia con respecto al objetivo del microscopio y la posición z- a un acercamiento. Las imágenes denominadas "en fase" representan una diferencia de fase con respecto a una fase de referencia y, más específicamente, una diferencia de camino óptico u OPD, siglas de "Optical Phase Difference" en inglés, con respecto a un camino óptico de referencia calculado en una zona alejada del objeto de referencia, por ejemplo, en el borde del campo de observación, cuando la partícula metálica está en z = 0. Por otra parte, incluso si en la presente solicitud, solo se considera la intensidad del campo electromagnético, a los expertos en la técnica apreciarán que las imágenes denominadas "en intensidad" se pueden representar igualmente en amplitud, pudiéndose utilizar, por ejemplo, la amplitud del campo electromagnético en los cálculos de propagación.
En la Figura 4, la intensidad se representa en unidades arbitrarias ("AU") Mientras que la diferencia de camino óptico se representa en nm. Las imágenes de las Figuras 4A, 4B, 4C en intensidad muestran en el centro del campo (correspondiente al centro de la partícula) una intensidad mínima en z = 0 (Figura 4B), aumentando la intensidad a un lado y a otro de la posición de enfoque (Figuras 4A y 4C). En las imágenes en fase, se verifica que en el centro del campo la diferencia de fase es nula en el punto de enfoque (Figura 4E), tomándose este punto como punto de referencia para la fase y se constata que a un lado y a otro de la posición de enfoque, la diferencia de fase en el centro del campo es respectivamente positiva (Figura 4D en z+) y negativa (Figura 4F en z-).
Las Figuras 5A y 5B ilustran de este modo (curvas 51 y 53, respectivamente), la intensidad y la fase (o, más específicamente, la diferencia en la ruta óptica OPD), medidas a partir de imágenes tales como las representadas en la Figura 4, en función del desfase axial z del objeto de referencia con respecto a la posición z = 0 de enfoque. Estas curvas se obtienen con las mismas condiciones experimentales que las de la Figura 4 (partícula de oro con un diámetro de 150 nm y una longitud de onda de iluminación de 670 nm).
Se comprueba en estas curvas el comportamiento par de la función en intensidad e impar de la función en fase del campo electromagnético producido por la interacción de la onda incidente y el objeto metálico de referencia medido distinto al del campo, en función de la posición axial de la partícula. Se observa que en la posición de enfoque (z = 0), la intensidad es mínima y la pendiente de la fase es máxima. De este modo, en el ejemplo de la Figura 5B, la pendiente es de - 98,2 nm x pm -1 en la posición z = 0. Las variaciones de fase y de intensidad tal como y se han ilustrado se pueden aprovechar para determinar con mucha precisión la variación en el desplazamiento axial de la partícula, como se describirá con más detalle en lo sucesivo. En efecto, sabiendo que la sensibilidad de una medición de fase es -N nm donde N es el número de mediciones promediadas, se puede estimar aproximadamente la precisión de la localización axial de una posición de enfoque Az = —^ x --------------1 « ” m es decir, de aproximadamente 1 nm para 10 medidas promediadas. Esta precisión está muy por debajo del tamaño de partícula.
Las Figuras 5A y 5B también muestran las curvas 52 y 54 calculadas aplicando un algoritmo de propagación digital a un par de imágenes de Intensidad/Fase tomadas en una posición dada del eje z, ventajosamente, en la posición de enfoque.
El algoritmo utilizado es un algoritmo de propagación digital del campo electromagnético. Un algoritmo de propagación digital del campo electromagnético se describe, por ejemplo, en Schnars et al. ("Digital recording and numerical reconstruction of holograms" Meas. Sci. Technol. 13 R85-R101 (2002)). Dicho algoritmo permite, a partir de una primera imagen en fase y en intensidad determinada en un primer plano, calcular una segunda imagen en fase y en intensidad en un segundo plano separado del primer plano a una distancia de propagación dada. El algoritmo de propagación se puede aplicar basándose en la totalidad de la imagen que se busca "propagar" o en una zona de la imagen, lo que permite ganar velocidad de adquisición. Esta zona de la imagen puede ser fija lateralmente o móvil para permanecer centrada en una zona de interés de la imagen gracias, por ejemplo, a un algoritmo de seguimiento de imágenes (o "tracking").
En las Figuras 5A y 5B se observa que las curvas experimentales (51,53) y las curvas calculadas mediante el algoritmo de propagación (curvas 52, 54) son similares. De este modo, se obtiene la misma curva de variación en fase o en intensidad si se hace una serie de mediciones del campo electromagnético en un punto del campo variando la posición axial del objeto de referencia o si se hace una única medición de intensidad y de fase en un plano dado y si se aplica el algoritmo de propagación digital. Por tanto, parece posible estimar el desplazamiento axial del objeto de referencia con una sola medición.
Parece asimismo que la naturaleza del objeto de referencia modifica la forma del campo electromagnético debido a las interacciones involucradas.
Los solicitantes han demostrado que los resultados presentados anteriormente con una partícula metálica también podrían obtenerse con un objeto de referencia de un material dieléctrico, preferiblemente, un objeto que presente una diferencia de índice significativa con el medio de referencia con el que está en contacto, por ejemplo, una partícula de material dieléctrico de alto índice. Esta diferencia de índice normalmente es superior o igual a 0,1, ventajosamente, superior o igual.
De este modo, las Figuras 6A y 6B representan el resultado del algoritmo de propagación digital descrito anteriormente aplicado para calcular la intensidad y la fase en el centro del campo en función de la posición axial del objeto de referencia para un objeto de referencia formado con un material metálico (curvas 61 y 63), y un objeto de referencia formado con un material dieléctrico (curvas 62 y 64). El objeto de referencia metálico es, como antes, una partícula de oro con un diámetro de 150 nm y el objeto de referencia dieléctrico es una partícula de poliestireno con un diámetro de 300 nm. La longitud de onda de iluminación es de 670 nm.
Observamos en las figuras que, en el caso de una partícula metálica, la dependencia de la intensidad con la posición z es una función par (curva 61) y la dependencia de la fase con la posición z es una función impar (curva 63) mientras que, en el caso de una nanopartícula de material dieléctrico, la dependencia de la intensidad con la posición z es una función impar (curva 62) y la dependencia de la fase con la posición Z es una función par (curva 64). Esta diferencia de comportamiento puede explicarse por la preponderancia de la parte real o imaginaria del índice de refracción complejo del objeto de referencia. La parte real del índice actúa sobre la fase de la onda y la parte imaginaria afecta a la intensidad de la onda. Por lo tanto, una partícula de índice real fuerte (en el caso de la partícula dieléctrica) tiene una firma importante en fase en la condición de la formación de imágenes (el valor del OPD es máximo en z = 0) y la firma se desvanece a un lado y a otro del plano de formación de imágenes (comportamiento par). Al contrario, en intensidad, la firma es débil en condiciones de formación de imágenes (el valor de la intensidad es casi nulo en z = 0). Para una partícula de fuerte índice imaginario (caso de la partícula metálica) el comportamiento de la intensidad (el valor de la intensidad es mínimo en z = 0) y de la fase (el valor del OPD es casi nulo en z = 0) está invertido.
El análisis de las imágenes en fase y en intensidad así realizado permite desarrollar un método de enfoque tridimensional en un microscopio rápido y extremadamente preciso.
De hecho, mediante la adquisición de una imagen o de una serie de N imágenes promediadas para obtener una mejor precisión, es posible determinar el desplazamiento axial y el sentido del desplazamiento de un objeto de referencia integrado en el portamuestras y deducir el desplazamiento relativo que se ha de efectuar entre el objetivo del microscopio y el portamuestras para obtener, por ejemplo, un enfoque automático que compense las derivas debidas por ejemplo a variaciones de temperatura o a vibraciones.
Según una variante de implementación del método, a partir de una imagen o de una serie de imágenes adquiridas en un plano de medición dado, se determina el mejor plano de enfoque axial utilizando un algoritmo de propagación digital del campo electromagnético, por ejemplo, el algoritmo descrito anteriormente. Entonces se deduce la variación de desplazamiento axial y el sentido de desplazamiento. La variación lateral del objeto de referencia se puede medir en las imágenes iniciales o en las imágenes reconstruidas después de la propagación. En concreto, la medición del desplazamiento lateral será más precisa sobre la imagen reconstruida correspondiente a la imagen obtenida cuando el objeto de referencia se encuentra en el plano de enfoque.
Según una variante de la invención, se puede recurrir a una calibración del dispositivo de enfoque tridimensional.
Por ejemplo, la calibración puede comprender el registro de nomogramas como los ilustrados en las Figuras 5A y 5B.
La calibración puede ser teórica, suponiendo que se conocen el objeto de referencia y el medio de referencia (en tamaño e índice), así como la fuente de emisión. La calibración teórica comprende entonces la simulación de la propagación del campo electromagnético producido por la interacción de la onda incidente y del objeto de referencia para diferentes posiciones del objeto de referencia y el establecimiento de los nomogramas determinando en un punto del campo el valor de la fase y la intensidad. Ventajosamente, la calibración se realiza midiendo la fase y la intensidad en el centro del campo, correspondiente, por ejemplo, al centro de una partícula que forma el objeto de referencia. La curva impar, ya sea en fase o en intensidad, permite determinar con un punto de medición el valor y el sentido del desplazamiento axial.
Con una calibración de este tipo, al implementar el método de enfoque tridimensional, basta con adquirir una imagen o una serie de imágenes en un solo plano de medición para conocer con mucha precisión el valor y el sentido de la
variación axial del objeto de referencia, pudiéndose determinar la variación lateral en la imagen en fase o en intensidad, ventajosamente, en la curva par. Como alternativa, al conocerse el desplazamiento axial, es posible enviar un comando de desplazamiento relativo del objetivo del microscopio y del portamuestras para colocar el objeto de referencia en el plano de enfoque y luego medir con mucha precisión el desplazamiento lateral en la nueva imagen adquirida. Como alternativa, al conocerse el desplazamiento axial, es posible calcular la imagen en la posición de enfoque utilizando el algoritmo de propagación para medir el desplazamiento lateral en la imagen así reconstruida.
Según una variante, la calibración puede ser experimental y basarse al menos en una imagen del objeto de referencia adquirida de antemano. De este modo, el objeto de referencia o el objetivo del microscopio o bien el detector se desplaza axialmente y, para cada valor de desplazamiento, se adquiere una imagen o una serie de imágenes en fase y en intensidad. A continuación, se deducen los nomogramas, como los ilustrados, por ejemplo, en las Figuras 5A y 5B en el caso de una partícula metálica. Como alternativa, la calibración se puede obtener con una sola adquisición de imágenes en fase y en intensidad en un plano dado, después se obtienen los nomogramas procediendo a una propagación del campo electromagnético y a una reconstrucción de las imágenes en los diferentes planos.
La sensibilidad del método de enfoque tridimensional depende de la interacción entre la onda incidente y el objeto de referencia. Puede expresarse, por ejemplo, a partir de las amplitudes de variación de intensidad AI o de fase AO, por ejemplo, como se ilustra en las Figuras 5A y 5B.
A modo de ejemplo, las Figuras 7A y 7B representan la amplitud de variación de la señal medida respectivamente en intensidad y en fase en función de la longitud de onda de observación para una partícula de oro de 100 nm de diámetro. La variación de la señal se expresa en sensibilidad relativa, lo que significa que las magnitudes están en unidades arbitrarias. Los resultados experimentales se presentan mediante unos puntos cuadrados (curvas 71 y 72, respectivamente, para la sensibilidad en fase y en intensidad) y se comparan con una curva teórica que representa la sección eficaz de difusión de la nanopartícula calculada según la teoría de Mie.
Cabe observar en estas curvas una dependencia de la sensibilidad en función de la longitud de onda. Esta dependencia se explica por los efectos de resonancia plasmónica que entran en juego en las partículas metálicas para relaciones particulares entre el tamaño de la partícula y la longitud de onda de iluminación. En este ejemplo, la señal se maximiza utilizando una longitud de onda de iluminación de 600 nm para una partícula de oro de 100 nm de diámetro. De este modo, en caso de utilizar un objeto de referencia que comprenda partículas metálicas, será interesante elegir para el dispositivo de enfoque tridimensional una fuente específica de longitud de onda adaptada.
El método así descrito puede funcionar continua o puntualmente en momentos dados o elegidos por el usuario.
Los solicitantes han demostrado que el método de enfoque tridimensional según la presente descripción permite enfoques automáticos rápidos, normalmente, del orden de 10 ms, además de presentar una muy buena precisión. El tiempo para enfocar depende tanto de la velocidad de adquisición del detector (normalmente del orden de 60 imágenes por segundo para una imagen completa) como de la sensibilidad del detector, cuanto más sensible sea el detector, menor será el número de imágenes a promediar.
La Figura 8 ilustra así la comparación entre un enfoque automático obtenido por medio de la presente descripción (curva 82) y un enfoque automático obtenido en un microscopio comercial estándar (curva 81). La curva 81 se obtiene con un microscopio Nikon-Ti® equipado con un sistema comercial de enfoque axial de tipo "sistema de enfoque perfecto" (perfect focus system) como se describe en Zemek et al., ("CRISP nearly eliminates microscopy focus drift", LASER fOc US WORLD, 48(9), 9-10, 2012). La curva 82 se obtiene con un enfoque automático implementado mediante el método según la presente descripción, en donde se observa un objeto de referencia de tipo partícula de oro de 100 nm de diámetro iluminado por una onda de longitud de onda de 670 nm en iluminación de transmisión. Se realiza una única calibración en el tiempo t = 0 s.
Estas dos curvas ponen de manifiesto la viabilidad del método según la presente descripción, que además presenta una muy buena resolución temporal.
El método de enfoque tridimensional descrito en la presente descripción se puede utilizar para realizar un enfoque automático en tiempo real o en determinados momentos del experimento, en un microscopio. Como alternativa, el método también se puede utilizar para controlar la colocación de una muestra. En estas condiciones, la medición sirve como bucle de retroalimentación para controlar con precisión la colocación de la muestra en caso de que el sistema de desplazamiento no realice su desplazamiento teórico.
Aunque se describe a través de un número determinado de ejemplos de realización detallados, el dispositivo de enfoque tridimensional según la invención comprende diversas variantes, modificaciones y mejoras que serán evidentes para los expertos en la técnica, entendiéndose que estas distintas variantes, modificaciones y mejoras se encuentran dentro del alcance de la invención, tal y como se define en las siguientes reivindicaciones.
Claims (16)
1. Dispositivo (II) para el enfoque tridimensional en un microscopio (I) de resolución dada, que comprende:
- un detector (119)
- unos medios de cálculo (121)
caracterizado por que
dicho detector está configurado para determinar, en un plano de medición dado, una imagen en fase y en intensidad de un campo electromagnético producido por la interacción de una onda luminosa incidente con un objeto de referencia (105) situado en un medio de referencia de índice dado, presentando el objeto de referencia un índice de refracción complejo cuya parte real y/o parte imaginaria es diferente, respectivamente, de la parte real y/o la parte imaginaria del índice de refracción del medio de referencia; y por que dichos medios de cálculo (121) están configurados para determinar, a partir de dicha al menos una imagen en fase y en intensidad, una variación de posición tridimensional del objeto de referencia (105).
2. Dispositivo según la reivindicación 1, que comprende una fuente de emisión de un haz de iluminación del objeto de referencia (105).
3. Dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las dimensiones del objeto de referencia (105) están comprendidas entre 0,1 y 2 veces la resolución del microscopio (I).
4. Dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la diferencia de índice entre el objeto de referencia y el medio de referencia es superior o igual a 0,1, ventajosamente, superior o igual a 0,5.
5. Dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que además comprende dicho objeto de referencia, estando dicho objeto de referencia destinado a colocarse en un medio de referencia de índice dado y presentando un índice de refracción complejo cuya parte real y/o parte imaginaria es diferente, respectivamente, de la parte real y/o la parte imaginaria del índice de refracción del medio de referencia.
6. Dispositivo según la reivindicación 5, en donde el objeto de referencia (105) comprende una partícula metálica.
7. Dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6, en donde el objeto de referencia (105) comprende una partícula dieléctrica.
8. Dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el detector de fase y de intensidad (119) comprende una máscara de Hartmann modificada.
9. Microscopio que comprende:
- un portamuestras (107);
- una fuente de emisión de un haz de iluminación (101);
- un objetivo de microscopio (109);
- un dispositivo de enfoque tridimensional (II) según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores;
- unos medios de desplazamiento relativo (122) del portamuestras y de un objetivo de microscopio a lo largo de las tres dimensiones.
10. Microscopio según la reivindicación 9, que comprende unos medios de control para transmitir a los medios de desplazamiento (122) del microscopio la variación calculada de la posición tridimensional del objeto de referencia.
11. Método de enfoque tridimensional en un microscopio, que comprende:
- la elección de un objeto de referencia (105) en un medio de referencia con un índice dado, estando dicho objeto de referencia integrado en un portamuestras (107) y presentando un índice de refracción complejo cuya parte real y/o parte imaginaria es diferente, respectivamente, de la parte real y/o imaginaria del índice de refracción de dicho medio de referencia;
- la iluminación del objeto de referencia mediante una onda luminosa incidente (1);
- la adquisición de al menos una imagen en fase y en intensidad, en un plano de medición dado, de un campo electromagnético producido por la interacción de la onda incidente (1) con el objeto de referencia (105);
- la determinación, a partir de dicha al menos una imagen en fase y en intensidad, de una variación de posición tridimensional del objeto de referencia (105).
12. Método de enfoque tridimensional en un microscopio según la reivindicación 11, en donde el objeto de referencia forma parte de la muestra.
13. Método de enfoque tridimensional en un microscopio según una cualquiera de las reivindicaciones 11 o 12, en donde el objeto de referencia es externo a la muestra y el método comprende la colocación del objeto de referencia en el medio de referencia.
14. Método de enfoque para un microscopio según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, que comprende una etapa de calibración preliminar, comprendiendo la etapa de calibración la determinación, para una serie de posiciones axiales del objeto de referencia (105), de la intensidad y de la fase del campo electromagnético producido por la interacción de la onda incidente (1) con el objeto de referencia (105) en un punto dado del plano de medición.
15. Método de enfoque para un microscopio según la reivindicación 14, en donde la etapa de calibración comprende la adquisición de al menos una imagen en fase y en intensidad del campo electromagnético producido por la interacción de la onda incidente (1) con el objeto de referencia (105) para un posición axial del objeto de referencia y el cálculo de imágenes en fase y en intensidad para diferentes posiciones axiales del objeto de referencia obtenidas a partir de la imagen en fase y en intensidad medida utilizando un algoritmo de propagación.
16. Método de enfoque para un microscopio según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, que además comprende la transmisión al microscopio de la variación calculada en la posición tridimensional del objeto de referencia (105).
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