ES2879254T3 - Polipéptidos de fusión y vacunas - Google Patents

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Abstract

Un polipéptido que comprende un péptido de direccionamiento a la membrana celular de no más de 50 aminoácidos derivado del gen B5R de un virus Vaccinia, unido operativamente a un polipéptido antigénico heterólogo, en donde el péptido de direccionamiento a la membrana celular comprende la SEQ ID NO: 1 o una secuencia que tiene al menos 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 1 y en donde el polipéptido antigénico es un ORF2 de un virus PCV2 o un dominio antigénico del mismo.

Description

DESCRIPCIÓN
Polipéptidos de fusión y vacunas
La presente invención se refiere a nuevos polipéptidos inmunogénicos y su uso en composiciones vacunales. La invención también se refiere a ácidos nucleicos, vectores y células que expresan los polipéptidos y el uso de los mismos. Los polipéptidos de la invención comprenden más específicamente un dominio inmunogénico y un dominio de direccionamiento a la membrana celular que se deriva de un gen B5R. La invención es particularmente adecuada para producir vacunas para animales no humanos, particularmente para vacunar a los cerdos contra la infección por PCV2.
Antecedentes
El circovirus porcino (PCV) se identificó originalmente como un contaminante de cultivos de células de riñón porcino (PK15 ATCC CCL-33). El virión de PCV se ha caracterizado por ser un virus icosaédrico no envuelto con un ADN circular monocatenario de aproximadamente 1,76 kb. El PCV se clasificó en el género Circovirus de la familia Circoviridae, que consiste en otros circovirus animales como el virus de la enfermedad de las plumas del pico de la psitácida, el circovirus del ganso, el circovirus canario y el circovirus de la paloma. Se han reconocido dos genotipos de PCV. El PCV derivado de células PK15 se ha considerado no patógeno para los cerdos y se denomina PCV tipo 1 (PCV1). Por otro lado, el PCV tipo 2 (PCV2) se ha aceptado como el principal agente infeccioso involucrado en varias enfermedades porcinas. Las enfermedades asociadas a PCV2 causan pérdidas económicas importantes a los productores de cerdos en todo el mundo. Las enfermedades asociadas a PCV2 se describen en el documento WO2007/076520 e incluyen, por ejemplo, síndrome de emaciación multisistémica posdestete (PMWS), síndrome de dermatitis y nefropatía porcina (PDNS), complejo de enfermedad respiratoria porcina (PRDC), trastornos reproductivos, enteris granulomatosa, epidermitis exudativa, linfadenitis necrotizante y temblores congénitos. Se han reportado especialmente en 2000 en Europa occidental y en 2003 en Europa central, casos de PCV2 subtipo A (PCV2A) y PCV2 subtipo B (PCV2B). Más recientemente en 2008, se han reportado cambios similares en jabalíes. Las vacunas contra PCV2 desarrolladas actualmente, como Circovac® (Merial), Ingelvac®, CircoFLEX (Boehringer lngelheim Vetmedica) o Suvaxyn®, son vacunas contra PCV2 inactivadas o vacunas de subunidades. Con respecto a las vacunas contra PCV2 inactivadas, las cepas actuales de PCV2 subtipo A o B presentan varias debilidades. Particularmente, los virus PCV2 solo pueden producirse con títulos bajos, generalmente menos de 10<5> TCID50 partículas virales por ml. Además, estos virus no se pueden mantener en cultivos de tejidos y líneas celulares infectadas de forma permanente. Con respecto a las vacunas de subunidades de PCV2, típicamente usan una proteína de la cápside de PCV2 recombinante purificada producida por la expresión del gen ORF2 de PCV2 en un sistema de baculovirus. En este sentido, la proteína codificada por ORF2 de los aislados Imp101 1 de PCV2 se ha informado en el documento EP1741785. Una proteína codificada por ORF2 del aislado PCV2Rm de PCV2 se ha informado en el documento WO2010/061000. La proteína codificada por ORF2 del aislado 412 de PCV2 se ha informado en el documento EP1816200. Otra proteína codificada por un ORF2 de otro aislado de PCV2 se ha reportado en los documentos EP1036180 o EP2225367.
Sin embargo, la eficacia de expresión y la inmunogenicidad de estas proteínas de la cápside natural no son óptimas y no siempre proporcionan el nivel requerido de protección inmunitaria en los animales vacunados. En particular, la proteína de ORF2 comprende una secuencia de localización nuclear que conduce a la expresión de la proteína en el núcleo de las células. Tal localización intracelular no facilita la extracción o purificación de la proteína y también podría prevenir o reducir la efectividad de las vacunas de ADN o vector que expresan la proteína de ORF2 in vivo en los animales.
El documento WO2010/068969 propone modificar el perfil de expresión de ORF2 para expresar un antígeno de ORF2 en forma soluble mediante el uso de secuencias de péptidos señal de secreción extrañas. En esta solicitud, se propone fusionar el ORF2 con una señal de secreción o con una señal de membrana celular, e incluir en la construcción un sitio de escisión para que el ORF2 soluble se pueda liberar en forma soluble. Esta solicitud propone una larga lista profética de posibles péptidos secretores candidatos. Sin embargo, la solicitud no contiene ningún dato experimental que demuestre que se puede obtener una expresión/inmunogenicidad mejorada o efectiva por la modificación del perfil de expresión de un ORF2. No se describe ninguna construcción que permita una inmunización efectiva.
Katz Ehud y otros (J. Virol. 71 (1997) pp3178-3187) se refiere a una proteína de fusión que comprende los 42 aminoácidos C-terminales de la proteína B5R y un VIH-1gp.
La presente invención propone nuevas construcciones mejoradas para expresar polipéptidos antigénicos. La presente invención describe productos de fusión que están específicamente adaptados para la expresión mejorada de polipéptidos antigénicos en la superficie celular, especialmente mediante el uso de un vector de expresión viral como el virus de la viruela porcina.
La invención muestra que al expresar un polipéptido antigénico en la superficie de las células infectadas/transducidas mediante el uso de una señal de direccionamiento derivada de B5R, se obtiene una respuesta inmunológica mejorada, lo que provoca una protección efectiva. Al presentar el antígeno en la superficie celular in vivo en el animal, las vacunas de la invención administran y exponen de manera más efectiva el antígeno al sistema inmunológico, particularmente a células inmunológicas tales como linfocitos, células dendríticas y macrófagos. Al presentar el antígeno en la superficie celular, la invención proporciona el inmunógeno en una conformación activa para provocar una potente respuesta inmunitaria protectora. La invención se puede aplicar a cualquier polipéptido antigénico, particularmente a antígenos virales.
Resumen de la invención
La presente solicitud proporciona un polipéptido que comprende un péptido de direccionamiento a la membrana celular de no más de 50 aminoácidos derivados del gen B5R de un virus Vaccinia unido operativamente a un polipéptido antigénico heterólogo, en donde el péptido de direccionamiento a la membrana celular comprende la SEQ ID NO: 1 o una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 1 y en la que el polipéptido antigénico es un ORF2 de un virus PCV2 o un dominio antigénico del mismo.
En una modalidad particular, el polipéptido antigénico comprende la secuencia de SEQ ID NO: 3 o una secuencia que tiene al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO: 3.
El polipéptido de la invención puede ser sintético o recombinante y puede comprender modificaciones postranscripcionales tales como glucosilación, grupos químicos añadidos, etc.
Con la máxima preferencia, el polipéptido de la invención carece de un sitio de escisión entre el péptido direccional y el péptido antigénico.
Otro objeto de la invención es una célula que expresa en su superficie un polipéptido como se definió anteriormente. Otro objeto de la invención se refiere a un ácido nucleico que codifica un polipéptido como se definió anteriormente. Otro objeto de la invención es un vector que comprende un ácido nucleico de la invención. Preferentemente, el vector es un vector viral, tal como con la máxima preferencia un virus de la pseudorrabia (PRV) o un virus de la viruela porcina (SPV). El uso de una viruela porcina es particularmente ventajoso ya que el péptido señal de B5R derivado de un virus Vaccinia tiene una compatibilidad mejorada con la viruela porcina.
Un objeto adicional de la invención reside en una composición que comprende un polipéptido, una célula, un ácido nucleico o un vector como se definió anteriormente.
Otro objeto de la invención es una vacuna que comprende un polipéptido, una célula, un ácido nucleico o un vector como se definió anteriormente y, opcionalmente, un adyuvante.
La presente invención también describe métodos para inmunizar o inducir una respuesta inmunológica en animales no humanos (por ejemplo, cerdos) que comprenden administrar a dicho animal un polipéptido, ácido nucleico, célula, vector o vacuna como se describió anteriormente.
La presente invención también describe métodos para tratar y/o prevenir enfermedades asociadas a PCV2 en animales no humanos (por ejemplo, cerdos) que comprenden administrar a dicho animal un polipéptido, ácido nucleico, célula, vector o vacuna como se describió anteriormente.
La invención también describe el uso de un péptido señal derivado del gen B5R de un virus Vaccinia para la expresión de un polipéptido antigénico heterólogo en la célula.
La invención se puede usar para inducir una respuesta inmunológica y/o vacunar a cualquier animal no humano. Es particularmente útil vacunar a los cerdos contra la infección por PCV2 o las enfermedades por PCV2.
Leyenda de las Figuras
Figura 1: Esquema de construcción del plásmido homólogo, pSP72-Ess_ORF2.
Figura 2: Ensayo de placa negra de rSPV (SVR3, SVR7) mediante el uso del anticuerpo monoclonal 36F1. Las células ESK-4 se infectaron con SPV original o recombinantes (SVR3 o SVR7). Seis días después, las células se sometieron a un ensayo de placa negra mediante el uso de anticuerpo monoclonal 36F1 (1:500), anti-IgG de ratón en conejo conjugado con biotina y ABC-ALP (Vecterstain).
Figura 3: IFA de células infectadas con SPV. Las células ESK-4 se infectaron con rSPV (SVR3 o SVR7) o SPV original. Cinco días después, las células infectadas se trataron con acetona/metanol (a) o ninguno (b), y reaccionaron con los anticuerpos primarios \ [anti-p-galactosidasa (a-pGal) en conejo y anti-PCV2-ORF2 (a-ORF2) en rata (1:1000)] y los anticuerpos secundarios [anti-IgG de conejo Alexa Fluor 488 y anti-IgG de rata Alexa Fluor 546 (1:1000) en cabra].
Figura 4: Los títulos serológicos de IF contra células RPL-2 infectadas con PCV2._Rm40 se recubrieron en cada pocillo de placas de 96 pocillos. Las células se fijaron con acetona/metanol, y se incubaron diluciones dobles de sueros durante 1 h después del bloqueo (leche descremada al 0,5 % en PBS). Anticuerpo anti-IgG-FITC de cerdo producido en conejo (SIGMA Cat. #: F1638, 1:1000) se usaron como anticuerpos secundarios. Si el título del suero de cerdo positivo estándar, PAB-PCV2 (VMRD) fue de 2560.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a nuevos polipéptidos inmunogénicos y los usos de los mismos, particularmente en composiciones de vacunas. La invención también se refiere a ácidos nucleicos, vectores y células que expresan los polipéptidos y el uso de los mismos. Los polipéptidos de la invención comprenden más específicamente un dominio inmunogénico y un dominio de direccionamiento a la membrana celular que están unidos operativamente, en donde el dominio de direccionamiento a la membrana celular se deriva de un gen B5R. La invención es particularmente adecuada para producir vacunas para animales no humanos, particularmente para vacunar a los cerdos contra la infección por PCV2.
Péptido de direccionamiento a la membrana celular derivado de B5R
El término "derivado de" indica que la secuencia del péptido direccional es idéntica o sustancialmente similar a la secuencia del péptido señal de un gen B5R de un virus Vaccinia. Más específicamente, el péptido de direccionamiento comprende una secuencia que tiene al menos 90 % de identidad con la secuencia del péptido señal de un gen B5R de un virus Vaccinia, incluso con mayor preferencia al menos 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad de secuencia.
Un ejemplo de mayor preferencia de una secuencia de un péptido señal de un gen B5R es SEQ ID NO: 1 o una secuencia que tiene al menos 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 1, más preferentemente al menos 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 1. Por consiguiente, en una modalidad particular, el polipéptido de la invención comprende una secuencia de péptido señal que comprende SEQ ID NO: 1 o una secuencia que tiene al menos 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 1.
El péptido señal puede comprender otros aminoácidos derivados del gen B5R, siempre que estos aminoácidos no alteren las propiedades de dirección a la membrana del péptido. En este contexto, en una modalidad particular, el péptido señal comprende SEQ ID NO: 2. Los aminoácidos 23-36 de SEQ ID NO: 2 no participan sustancialmente en la función de direccionamiento a la membrana. Sin embargo, los resultados presentados muestran que estos aminoácidos facilitan la estabilización y la conformación adecuada del polipéptido de fusión.
Alternativamente, o además, el péptido señal puede comprender otros aminoácidos que no se deriven del gen B5R, siempre que estos aminoácidos no alteren las propiedades de direccionamiento a la membrana del péptido. Estos aminoácidos pueden tener utilidad para la clonación (por ejemplo, sitios de restricción, por ejemplo) o pueden participar en la estabilidad del polipéptido.
El péptido de direccionamiento a la membrana celular no comprende más de 50 aminoácidos.
Como se indicó anteriormente, la invención incluye péptidos señal que comprenden una secuencia que tiene al menos 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 1. El grado de homología entre dos secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos se puede determinar por medio de programas informáticos conocidos per se en la técnica tales como GAP proporcionado en el paquete de programas GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Versión 8, Agosto 1996, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 5371 1) (Needleman, S. B. and Wunsch, CD., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453). Uso de GAP con la siguiente configuración para la comparación de secuencias de ADN: penalización de creación de brechas de 5, 0 y penalización por extensión de brecha de 0,3. Las moléculas de ácido nucleico/aminoácido se pueden alinear entre sí mediante el uso del software de alineación Pileup, disponible como parte del paquete del programa GCG, mediante el uso de, por ejemplo, la configuración predeterminada de penalización de creación de brechas de 5 y penalización de ancho de brecha de 0,3.
Las condiciones experimentales adecuadas para determinar si una molécula de ácido nucleico determinada se hibrida con un ácido nucleico específico pueden implicar el remojo previo de un filtro que contiene una muestra relevante del ácido nucleico que se examinará en 5 x SSC durante 10 minutos, y la prehibridación del filtro en una solución de 5 x SSC, 5 x solución de Denhardt, SDS al 0,5 % y 100 pg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado sonicado, seguido de hibridación en la misma solución que contiene una concentración de 10 ng/ml de una sonda marcada con P-dCTP durante 12 horas a aproximadamente 45 <0>C, de acuerdo con los métodos de hibridación descritos en Sambrook y otros (1989; Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2da edición, Cold Spring Harbour, Nueva York). Después el filtro se lava dos veces durante 30 minutos en 2 x SSC, SDS al 0,5 % al menos 55 <0>C (rigurosidad baja), al menos 60 <0>C (rigurosidad media), al menos 65 <0>C (rigurosidad media/alta), al menos 70<0>C (rigurosidad alta), o al menos 75<0>C (rigurosidad muy alta). La hibridación puede detectarse mediante la exposición del filtro a una película de rayos X.
En una modalidad preferida, el péptido señal comprende la SEQ ID NO: 1 o 2.
En una modalidad particular, el péptido señal consiste en la SEQ ID NO: 1 o 2.
Polipéptido antigénico
El polipéptido antigénico es una proteína de ORF2 de un virus PCV2, o un dominio antigénico del mismo. El polipéptido puede ser una proteína completa, un fragmento de una proteína o un péptido pequeño de, por ejemplo, 10 aminoácidos. Preferentemente, el polipéptido antigénico comprende menos de aproximadamente 500 aminoácidos.
El polipéptido antigénico es "heterólogo" con respecto al péptido señal, lo que significa que el polipéptido antigénico no está asociado de forma natural al péptido señal en la naturaleza. Típicamente, el polipéptido antigénico no es la secuencia de una proteína B5R. El término heterólogo indica, por ejemplo, que el polipéptido antigénico es de un virus distinto de un virus Vaccinia, o de una proteína distinta de una proteína B5R, por ejemplo.
La proteína de ORF2 del aislado Imp1011 de PCV2 se ha informado en el documento EP1741785. La proteína de ORF2 del aislado PCV2Rm de PCv 2 se ha informado en el documento WO2010/061000. La proteína de ORF2 del aislado 412 de PCV2 se ha informado en el documento EP1816200. En las patentes EP1036180 o EP2225367 se ha informado de otra proteína de ORF2 de otro aislado de PCV2. Todas estas proteínas de ORF2 se contemplan para su uso en la presente invención.
En una modalidad preferida, la proteína de ORF2 para su uso en la invención comprende la SEQ ID NO: 3 o cualquier secuencia que tenga al menos 80 % de identidad con la SEQ ID NO: 3, incluso con mayor preferencia al menos 82, 84, 86, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 3.
Típicamente, las proteínas de ORF2 de PCV2 comprenden aproximadamente 234 aminoácidos. La secuencia comprende una secuencia de localización nuclear, que generalmente corresponde a los aminoácidos 1 -42 de la secuencia.
Se prefiere, para la presente invención, usar una porción de una proteína de ORF2 que carece de la secuencia de localización nuclear nativa (es decir, la secuencia en los residuos 1 a 42 de un ORF2 nativo) y reemplazar esta secuencia por el péptido de direccionamiento a la membrana. La SEQ ID NO: 3 es una secuencia de aminoácidos de una proteína de ORF2 que carece de secuencia de localización nuclear.
La secuencia que tiene identidad con la SEQ ID NO: 3 y que retiene la actividad inmunogénica de PCV2 puede derivarse artificialmente u obtenerse de los serotipos de PCV2 enumerados anteriormente, o de otros serotipos distintos. Típicamente, los primeros 42 aminoácidos de la proteína de ORF2 se eliminan para suprimir la función de localización-nuclear.
Ensamblaje y producción de polipéptidos
El polipéptido de la invención generalmente comprende un péptido de direccionamiento a la membrana celular unido operativamente a un polipéptido antigénico. El término "unido operativamente" indica que los dos dominios están fusionados entre sí, directa o indirectamente, de una manera que permite el direccionamiento del polipéptido a una membrana celular y la expresión del polipéptido antigénico fuera de la célula.
Con la máxima preferencia, el péptido de direccionamiento a la membrana celular está ubicado en el extremo N terminal y el polipéptido inmunogénico está ubicado en el extremo C terminal. Ambos dominios están unidos covalentemente, preferentemente mediante un enlace amino. Por consiguiente, el polipéptido de la invención preferentemente comprende, de N -> C-terminal:
• el péptido de direccionamiento a la membrana celular,
• el polipéptido inmunogénico
El polipéptido puede comprender además dominios o secuencias adicionales. Por ejemplo, el polipéptido puede comprender una secuencia de unión, entre el péptido de direccionamiento a la membrana celular y el polipéptido inmunogénico. Sin embargo, preferentemente, los dos dominios se unen directamente sin una secuencia de unión.
Además, en una modalidad preferida, el polipéptido carece de un sitio de escisión de modo que el polipéptido inmunogénico se expone en la superficie celular y esencialmente no se libera en forma soluble.
Un ejemplo preferido y específico de un polipéptido de la invención comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.
El polipéptido de la invención puede comprender además un residuo de metionina en el N-terminal.
El polipéptido de la invención puede estar glucosilado.
Los polipéptidos de la invención pueden producirse mediante un proceso de síntesis o por medios recombinantes. Preferentemente, los polipéptidos de la invención se diseñan para producirlos/expresarlos directamente en células u organismos completos mediante la expresión de una molécula de ácido nucleico codificante. De hecho, el nuevo perfil de expresión de los polipéptidos de la invención está particularmente adaptado para el diseño de vacunas de ADN o de vectores, que comprenden una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención. Tras la introducción en un organismo, el ácido nucleico entra en las células y expresa el polipéptido que queda expuesto en la superficie celular y exhibe una inmunogenicidad mejorada. Como se discutirá a continuación, el ácido nucleico puede estar desnudo o formulado con cualquier vector adecuado. Alternativamente, la invención puede usar vacunas celulares, en las que el polipéptido se expresa en cultivo en la superficie de las células y las células resultantes se usan como composición de vacuna.
Por lo tanto, la invención también abarca y utiliza moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos como se definió anteriormente.
Ácido nucleico
Otro objeto de la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido como se definió anteriormente. El ácido nucleico se puede usar para producir el polipéptido in vitro, o para producir células que expresan el polipéptido en su superficie, o para producir vacunas en las que el agente activo es el ácido nucleico o un vector que contiene el ácido nucleico.
El ácido nucleico de la invención puede ser ADN o ARN, monocatenario o bicatenario. El ácido nucleico es típicamente ADNc o ARN. El ácido nucleico puede producirse mediante técnicas bien conocidas en la técnica, tales como síntesis, clonación o amplificación de la secuencia que codifica el polipéptido inmunogénico; síntesis, clonación o amplificación de la secuencia que codifica la secuencia de direccionamiento a la membrana celular; ligación de las secuencias y su clonación/amplificación en vectores y células apropiados.
En una modalidad particular, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 5.
Vector
Las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención pueden proporcionarse en forma de una molécula de ácido nucleico per se tal como moléculas de ácido nucleico desnudas; un vector; virus o célula huésped, etc., ya sea de origen procariota o eucariota. Los vectores incluyen vectores de expresión que contienen una molécula de ácido nucleico de la invención. Los vectores de la presente invención pueden comprender, por ejemplo, un promotor transcripcional y/o un terminador transcripcional, en donde el promotor está unido operativamente con la molécula de ácido nucleico, y en donde la molécula de ácido nucleico está unida operativamente con el terminador transcripcional.
En este aspecto, un objeto particular de la invención es un vector viral que comprende un ácido nucleico como se definió anteriormente. El vector viral puede derivar de diferentes tipos de virus, tales como, preferentemente, viruela porcina, viruela aviar, pseudorrabia, virus Aujesky, salmonella, virus vaccinia, BHV (virus del herpes bovino), HVT (virus del herpes de Turquía), adenovirus, TGEV (Coronavirus de gastroenteritis transmisible), eritrovirus y VIS (virus de inmunodeficiencia de simios).
En una modalidad preferida, el vector es un virus de la viruela porcina recombinante. El virus de la viruela porcina (SPV) es solo levemente patógeno en los cerdos y provoca una respuesta inmunitaria protectora. Entonces, SPV es un excelente candidato para un vector viral en cerdos. El procedimiento general para la creación de SPV recombinante se describió en varias referencias (Vet Rec. 1994 Ene 1; 134(1 ):13-8.). En un método típico, el primer paso en la construcción de un SPV recombinante es crear plásmidos de homología que pueden dirigir la inserción de la unidad o unidades transcripcionales para el gen del polipéptido antigénico de esta invención en el genoma del SPV. La inserción se produce por recombinación homóloga y, por tanto, requiere que el ADN insertado esté flanqueado por una región genómica de SPV contigua. En el caso de los recombinantes de SPV, el gen de la timidina quinasa (TK) se seleccionó en primer lugar como sitio de inserción y resultó ser una región no esencial para la replicación del virus. Debido a que la maquinaria transcripcional del poxvirus no reconocerá los promotores de la célula huésped, el gen del polipéptido antigénico de esta invención está preferentemente unido a los promotores del poxvirus. Se prefieren los promotores de virus Vaccinia tales como P11 o P7.5 para la expresión en un SPV recombinante, pero pueden usarse otros promotores de poxvirus. Una vez que se ha generado el plásmido de homología, se transfecta a células competentes como células de riñón de cerdo embrionario (ESK-4) o de riñón de cerdo (PK-15) que se han infectado previamente con SPV. Los recombinantes se generan mediante recombinación homóloga entre los genomas de SPV que se replican y el plásmido transfectado. El SPV recombinante se puede seleccionar/tamizar mediante el uso de técnicas convencionales. Un método de identificación utiliza el gen lacZ de Escherichia coli como marcador. En este caso, un sustrato cromogénico, 5-bromo-4-cloro-3-indolil p-D-galactósido (X-gal), el cual se convierte en un compuesto azul por la acción de la enzima expresada (p-galactosidasa) luego se usa para identificar las placas de virus producidas por el virus recombinante en la progenie contra un fondo de placas incoloras generadas por virus no recombinantes. En el caso de que no haya un gen marcador, la producción del polipéptido antigénico expresado por SPV recombinante puede verificarse mediante el uso de anticuerpos específicos contra el polipéptido antigénico en un ensayo de inmunofluorescencia. Mediante el uso de los protocolos mencionados anteriormente, se puede generar SPV recombinante que exprese el polipéptido antigénico de esta invención.
También se pueden usar otros sistemas de expresión y vectores, tales como plásmidos que se replican y/o se integran en células de levadura.
La invención también se refiere a un método para preparar un polipéptido de la invención, el método comprende el cultivo de una célula huésped que contiene un ácido nucleico o vector como se definió anteriormente en condiciones adecuadas para la expresión del ácido nucleico y la recuperación del polipéptido. Como se indicó anteriormente, las proteínas y péptidos se pueden purificar de acuerdo con técnicas conocidas per se en la técnica. La invención también proporciona kits de expresión que comprenden (a) una célula huésped (preferentemente células de insecto o células de levadura), (b) medios para expresar un polipéptido de la invención, por ejemplo, que comprende un sistema de vector capaz de replicarse en dicha célula, y (c) medios para recuperar la proteína o péptido de la invención.
Composición de las vacunas
El término "vacuna" como se usa en la presente descripción incluye un agente que puede usarse para causar, estimular o amplificar el sistema inmunológico de los animales (por ejemplo, cerdos) contra un patógeno. Las vacunas de la invención pueden provocar, estimular o amplificar la inmunidad contra un virus PCV2.
El término "inmunización" incluye el proceso de administrar un inmunógeno a un sujeto. La inmunización puede, por ejemplo, permitir un nivel alto continuo de respuesta de anticuerpos y/o celular en la que los linfocitos T pueden matar o suprimir el patógeno en el animal no humano inmunizado, como el cerdo, que está dirigido contra un patógeno o antígeno al que el animal ha estado expuesto previamente.
Las vacunas de la invención comprenden una cantidad inmunológicamente efectiva de un polipéptido, célula o ácido nucleico como se describió anteriormente en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como resultado de la vacunación con una composición de la invención, los animales se vuelven al menos parcial o completamente inmunes a las infecciones por PCV2, o resistentes a desarrollar infecciones por PCV2 moderadas o graves. Se pueden usar vacunas de PCV2 para provocar una respuesta humoral y/o celular.
Las infecciones por PCV2 o enfermedades asociadas incluyen, entre otras, síndrome de emaciación multisistémica posdestete (PMWS), síndrome de dermatitis y nefropatía porcina (PDNS), complejo de enfermedad respiratoria porcina (PRDC), trastornos reproductivos, enteris granulomatosa, epidermitis exudativa, linfadenitis necrotizante y temblores congénitos. Preferentemente, un sujeto animal no humano, tal como un cerdo, está protegido hasta un punto en donde uno de todos los síntomas o efectos fisiológicos adversos de las infecciones por PCV2 se reducen, mejoran o previenen por completo de manera significativa.
La presente invención también se refiere a una vacuna de combinación que comprende un polipéptido, ácido nucleico o célula de la invención en combinación con al menos un antígeno proteico adicional [Gupi PS Nayar y otros (Can. Vet. J, vol. 38, 1997: 385-387) y Clark E. G. (Proc. Am. Assoc. Swine Prac. 1997; 499-501)].
En la práctica, la cantidad exacta requerida para una dosis inmunológicamente efectiva puede variar de un sujeto a otro en dependencia de factores tales como la edad y el estado general del sujeto, la naturaleza de la formulación y el modo de administración. Un experto en la técnica puede determinar una "cantidad efectiva" apropiada mediante el uso de solo experimentación rutinaria. Por ejemplo, se conocen métodos en la técnica para determinar o valorar las dosis adecuadas de una vacuna para encontrar dosis mínimas eficaces basadas en el peso del sujeto animal no humano, la concentración de la vacuna y otros factores típicos.
En una modalidad típica, la vacuna comprende una dosis unitaria de entre 0,1-50 pg, preferentemente entre 0,1 y 25, incluso con mayor preferencia entre 1 y 15 pg, típicamente aproximadamente 10 pg, de antígeno de polipéptido o ácido nucleico de la invención.
La dosis de la vacuna, la concentración de los componentes en la misma y el momento de administración de la vacuna, que provocan una respuesta inmunológica adecuada, pueden determinarse mediante métodos tales como titulaciones de anticuerpos de sueros, por ejemplo, mediante ELISA y/o análisis de ensayo de seroneutralización y/o por evaluación exposición de vacunación.
En una modalidad particular, la vacuna comprende el polipéptido de la invención en forma purificada, opcionalmente en combinación con cualquier excipiente o vehículo adecuado.
En otra modalidad particular, la vacuna comprende un ácido nucleico como se definió anteriormente, opcionalmente en combinación con cualquier excipiente o vehículo adecuado. Una vacuna más preferida comprende un vector viral que contiene un ácido nucleico como se definió anteriormente. Otra vacuna preferida comprende un virus de la viruela porcina que comprende un ácido nucleico como se definió anteriormente.
Las vacunas pueden comprender otros ingredientes, conocidos per se por un experto en la técnica, tales como vehículos, excipientes, diluyentes, adyuvantes, estabilizadores de liofilización, agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponadores del pH, aditivos gelificantes o potenciadores de la viscosidad farmacéuticamente aceptables, y conservantes, en dependencia de la vía de administración.
Los ejemplos de vehículos, excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, agua desmineralizada o destilada; solución salina; aceites de base vegetal tales como aceite de cacahuete, aceite de arachis, aceite de cártamo, aceite de oliva, aceite de semilla de algodón, aceite de maíz, aceite de sésamo, o aceite de coco; aceites de silicona, incluidos polisiloxanos, tales como metilpolisiloxano, fenilpolisiloxano y metilfenilpolisolpoxano; siliconas volátiles; aceites minerales tales como aceite de parafina líquido ligero o aceite de parafina líquido pesado; escualeno; derivados de celulosa tales como metilcelulosa, etilcelulosa, carboximetilcelulosa, sal sódica de carboximetilcelulosa o hidroxipropilmetilcelulosa; alcanoles inferiores, por ejemplo etanol o isopropanol; aralcanoles inferiores; polialquilenglicoles inferiores o alquilenglicoles inferiores, por ejemplo polietilenglicol, polipropilenglicol, etilenglicol, propilenglicol, 1 ,3-butilenglicol o glicerina; ésteres de ácidos grasos tales como palmitato de isopropilo, miristato de isopropilo u oleato de etilo; polivinilpirrolidona; agar; carragenano; goma de tragacanto o goma de acacia, y vaselina. Típicamente, el vehículo o vehículos formarán del 10 % al 99,9 % en peso de la composición de la vacuna y se pueden tamponar mediante métodos convencionales mediante el uso de reactivos conocidos en la técnica, tales como hidrogenofosfato de sodio, dihidrogenofosfato de sodio, hidrogenofosfato de potasio, dihidrogenofosfato de potasio, una mezcla de los mismos y similares.
Los ejemplos de adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, emulsiones de aceite en agua, hidróxido de aluminio (alumbre), complejos inmunoestimulantes, polímeros o copolímeros de bloques no iónicos, citocinas (como IL-1, IL-2, IL-7, IFN-[alfa], IFN-[beta], IFN-y, etc.), saponinas, monofosforil lípido A (MLA), muramil dipéptidos (MDP) y similares. Otros adyuvantes adecuados incluyen, por ejemplo, sulfato de aluminio y potasio, enterotoxinas termolábiles o termoestables aisladas de Escherichia coli, toxina del cólera o su subunidad B, toxina diftérica, toxina tetánica, toxina pertussis, adyuvante incompleto o completo de Freund, etc. Los adyuvantes a base de toxina, tales como la toxina diftérica, la toxina tetánica y la toxina pertussis pueden inactivarse antes de su uso, por ejemplo, mediante tratamiento con formaldehído.
Ejemplos de estabilizadores de congelación pueden ser, por ejemplo, carbohidratos como sorbitol, manitol, almidón, sacarosa, dextrano o glucosa, proteínas como albúmina o caseína y derivados de los mismos.
Las vacunas pueden comprender adicionalmente al menos un inmunógeno de al menos un patógeno adicional, por ejemplo, un patógeno porcino tal como Actinobacillus pleuropneunomia; Adenovirus; Alfavirus tales como virus de encefalomielitis equina del Este; Balantidium coli; Bordetella bronchiseptica; Brachyspira spp., preferentemente B. hyodyentheriae, B.pilosicoli, B. innocens, Brucella suis, preferentemente biovares 1, 2 y 3; virus de la peste porcina clásica, virus de la peste porcina africana; Chlamydia y Chlamydophila sp. y preferentemente C. pecorum y C. abortus; Clostridium spp., preferentemente Cl. difficile, Cl. perfringens tipos A, B y C, Cl.novyi, Cl.septicum, Cl.tetani; coronavirus digestivo y respiratorio; Cryptosporidium parvum; Eimeria spp; Eperythrozoonis suis actualmente denominado Mycoplasma haemosuis; Erysipelothrix rhusiopathiae; Escherichia coli; Haemophilus parasuis, preferentemente subtipos 1, 7 y 14; Virus de la encefalomielitis hemaglutinante; lsospora suis; virus de la encefalitis japonesa; Lawsonia intracellulars; Leptospira spp., preferentemente Leptospira australis, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagicae, Leptospira interrogans, Leptospira Pomona y Leptospira tarassovi; Mannheimia haemolytica; Mycobacterium spp. preferentemente, M. avium, M. intracelular y M. bovis: Mycoplasma hyponeumoniae; parvovirus; Pasteurella multocida; citomegolovirus porcino; parvovirus porcino, virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino: virus de la pseudorrabia; rotavirus; virus Sagiyama; Salmonella spp. preferentemente, S. thyhimurium y S. choleraesuis; Staphylococcus spp. preferentemente, S. hyicus; Streptococcus spp., preferentemente Strep, suis; Citomegalovirus porcino; virus del herpes porcino; virus de la influenza porcina; virus de la viruela porcina; Toxoplasma gondii; virus de la estomatitis vesicular y virus del exantema del cerdo; u otros aislados y subtipos de circovirus porcino.
Las composiciones de vacuna de la invención pueden ser formulaciones líquidas tales como una solución acuosa, agua en aceite o emulsión de aceite en agua, jarabe, un elixir, tintura, una preparación para administración parenteral, subcutánea, intradérmica, intramuscular o intravenosa (por ejemplo, administración inyectable), como suspensiones o emulsiones estériles. Tales formulaciones son conocidas en la técnica y típicamente se preparan mediante la disolución del antígeno y otros aditivos típicos en el vehículo apropiado o sistemas solventes. Las formulaciones líquidas también pueden incluir suspensiones y emulsiones que contienen agentes de suspensión o emulsionantes.
La vía de administración puede ser percutánea, por vía mucosa o vía parenteral (intradérmica, intramuscular, subcutánea, intravenosa o intraperitoneal). Las composiciones de vacunas de acuerdo con la presente invención pueden administrarse solas o pueden coadministrarse o administrarse secuencialmente con otros tratamientos o terapias.
La presente invención también describe métodos para inmunizar o inducir una respuesta inmunológica en animales no humanos (por ejemplo, cerdos) que comprenden administrar a dicho animal un polipéptido, ácido nucleico, célula, vector o vacuna como se describió anteriormente.
La presente invención también describe métodos para tratar y/o prevenir enfermedades asociadas a PCV2 en animales no humanos (por ejemplo, cerdos) que comprenden administrar a dicho animal un polipéptido, ácido nucleico, célula, vector o vacuna como se describió anteriormente.
Como se mencionó anteriormente, las infecciones por PCV2 o enfermedades asociadas incluyen, entre otras, síndrome de emaciación multisistémica posdestete (PMWS), síndrome de dermatitis y nefropatía porcina (PDNS), complejo de enfermedad respiratoria porcina (PRDC), trastornos reproductivos, enteris granulomatosa, epidermitis exudativa, linfadenitis necrotizante y temblores congénitos.
La vacuna de la invención se puede administrar convenientemente por vía intranasal, transdérmica (es decir, aplicada sobre o en la superficie de la piel para absorción sistémica), parenteral, ocular, etc. La vía de administración parenteral incluye, pero no se limita a, intramuscular, intravenosa, rutas intraperitoneales y similares.
La dosificación de las vacunas de la presente invención dependerá de la especie, raza, edad, tamaño, historial de vacunación, estado de salud del animal a vacunar, así como de la vía de administración, por ejemplo, subcutánea, intradérmica, oral intramuscular o administración intravenosa.
Las vacunas de la invención se pueden administrar como dosis únicas o en dosis repetidas. Las vacunas de la invención pueden administrarse solas o pueden administrarse simultánea o secuencialmente con una o más composiciones adicionales, tales como, por ejemplo, otras composiciones inmunogénicas o vacunas porcinas. Cuando las composiciones se administran en diferentes momentos, las administraciones pueden estar separadas entre sí o solaparse en el tiempo.
En una modalidad, las composiciones de vacuna de la invención se administran a un sujeto susceptible o en riesgo de contraer una infección por PCV2 para mejorar las propias capacidades de respuesta inmunológica del sujeto. En una modalidad, el sujeto al que se administra la vacuna es un cerdo. El animal puede ser susceptible a la infección por PCV2 o un virus estrechamente relacionado.
Las vacunas de la invención se administran preferentemente a cerdos, cerdos adultos, pero también a lechones, lechones o hembras preñadas, u otros tipos de animales no humanos.
La vacunación de hembras preñadas es particularmente ventajosa, ya que confiere inmunidad pasiva a los recién nacidos a través de la transmisión de anticuerpos maternos. Los cerdos pueden tener menos de 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 semana de edad; 1 a 6 semanas de edad; 2 a 5 semanas de edad; o de 3 a 4 semanas de edad. Por ejemplo, a los animales de "prueba" se les puede administrar la vacuna de la invención con el fin de evaluar el rendimiento de la vacuna con vistas al uso o desarrollo eventual de una vacuna para cerdos. Atractivamente, la vacuna se administra a un sujeto que aún no ha estado expuesto a un virus PCV2. Preferentemente, el sujeto es un cerdo que necesita vacunación contra el síndrome de emaciación multisistémica posdestete (PMWS) y/o el síndrome de dermatitis y nefropatía porcina (PDNS).
La presente invención también incluye una vacuna combinada, que comprende las vacunas de la invención y al menos un componente activo inmunogénico efectivo contra otro organismo causante de enfermedad en cerdos como, por ejemplo, Actinobacillus pleuropneunomia; adenovirus; Balantidium coli; Bordetella bronchiseptica; Brachyspira spp., preferentemente B. hyodyentheriae, B.pilosicoli, Brucella suis, preferentemente biovares 1, 2 y 3; virus de la peste porcina clásica, virus de la peste porcina africana; Chlamydia y Chlamydophila sp. y preferentemente C. pecorum y C. abortus; Clostridium spp., preferentemente Cl. difficile, Cl.perfringens; coronavirus respiratorio porcino; Cryptosporidium parvum; Eimeria spp; Eperythrozoonis suis actualmente denominado Mycoplasma haemosuis; Erysipelothrix rhusiopathiae; Escherichia coli; Haemophilus parasuis; virus de la encefalomielitis hemaglutinante; lsospora suis; Lawsonia intracellulars; Leptospira spp., preferentemente Leptospira Pomona; Mannheimia haemolytica; Mycobacterium spp. preferentemente, M. avium; Mycoplasma hyponeumoniae; Pasteurella multocida; citomegolovirus porcino; parvovirus porcino, virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino, virus de la pseudorrabia; rotavirus; Salmonella spp. preferentemente, S. thyhimurium y S. choleraesuis; Staphylococcus spp. preferentemente, S. hyicus; Streptococcus spp., preferentemente S. suis; citomegalovirus porcino; virus de la influenza porcina; virus de la viruela porcina; Toxoplasma gondii; virus de la estomatitis vesicular y virus del exantema vesicular del cerdo u otros aislados y subtipos de circovirus porcino.
La presente invención también proporciona un recipiente que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de un polipéptido, ácido nucleico o vacuna como se describió anteriormente. La invención también proporciona kits de vacunación que comprenden un recipiente opcionalmente estéril que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de la vacuna, medios para administrar la vacuna a los animales y opcionalmente un manual de instrucciones que incluye información para la administración de la cantidad inmunológicamente efectiva de la composición para tratar y/o prevenir enfermedades asociadas a PCV2.
En la siguiente sección se proporcionan otros aspectos y ventajas de la invención, que deben considerarse únicamente como ilustrativos.
Ejemplos
Ejemplo 1: Construcción de un ácido nucleico que codifica un polipéptido antigénico que comprende el péptido señal de B5R y ORF2 de PCV2
Se solicitaron a Takara Bio (Japón) dos ADN de doble cadena sintéticos que se muestran en las SEQ ID NO: 6 y NO: 7. Sus sitios para las enzimas de restricción BamHI/SalI y XbaI/SalI, respectivamente son los 5'/3' terminales. Los ADN se clonaron en plásmidos, pMD18-Ess (B/X/S) y pMD18-ORF2 (X/S), respectivamente.
Como hay un sitio Xbal frente al sitio Sal I 3'-terminal de la SEQ ID NO: 6, el pMD18-Ess (B/X/S) se cortó con dos enzimas de restricción, Xbal y Sall. Los fragmentos de ADN de 561 pb que se derivaron de pMD18-ORF2 (X/S) cortados con XbalI y SalI se insertaron en el sitio XbaI/SalI de pMD18-Ess (B/X/S). El plásmido resultante, pMD18-Ess_ORF2, incluye el gen del péptido antigénico de SEQ ID NO: 5.
El plásmido, pGTPs40K-S (descrito en la Figura 2 del documento USP7,348,422) se cortó con dos enzimas de restricción, BamHI y SalI, y se reemplazó con un fragmento de corte de BamHI/SalI de 0,7 kpb derivado de pMD18-Ess_ORF2. El plásmido resultante se denominó pGTPs-Ess_ORF2. Este plásmido incluye un promotor fuerte de poxvirus (Ps) y el gen del péptido antigénico de SEQ ID NO: 5.
Ejemplo 2: Plásmidos para producir SPV recombinante
En primer lugar, el ADN genómico de SPV se preparó de la siguiente manera:
La cepa SPV kasza (VR-363) y las células de riñón de cerdo embrionario, las células ESK-4 (CL-184) se pudieron comprar en la American Type Culture Collection (ATCC). Las células ESK-4 se cultivaron de forma rutinaria a 37 °C en CO2 al 5 % en medio F-12K de Ham (Gibco, Cat. No.: 21127-022) suplementado con estreptomicina-penicilina al 1 % (Gibco, Cat. No.: 15140-122) y FBS al 5 % (Gibco, Cat. No.: 10437-028). Para la preparación de ADN genómico de SPV, las células ESK-4 confluentes en un matraz de 225 cm2 se infectaron con SPV y se incubaron durante 6 días hasta que las células mostraron un efecto citopático (CPE) del 100 %. Las células infectadas se colectaron por raspado de las células en el medio y centrifugación a 1300 rpm durante 5 min. El medio se decantó y el sedimento celular se resuspendió suavemente en 2 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS: 1,5 g de Na2HPO4, 0,2 g de KH2PO4, 0,8 g de NaCl y 0,2 g de KCl por litro de H2O) y se sometió a dos congelaciones-descongelaciones sucesivas. A continuación, se eliminaron los restos celulares mediante centrifugación a 3000 rpm durante 5 min a 4 °C. Los viriones de SPV, presentes en el sobrenadante, sedimentaron mediante centrifugación a 20000 xg durante 20 minutos a 4 °C. El sedimento resultante se suspendió luego con Tris a 10 mM pH 7,5. A continuación, se extrajeron los ADN genómicos de SPV de los viriones de SPV mediante suspensión con el tampón de lisis (Tris a 20 mM, pH 9, NaCl2 a 0,1 M, EDTA a 5 mM, SDS al 0,1 %, proteinasa K 0,2 mg/ml) e incubación a 60 °C durante 5 min. La extracción con fenol:clororoformo (1:1) se realizó dos veces y la muestra se precipitó mediante la adición de dos volúmenes de etanol y centrifugación. Se decantó el sobrenadante y el sedimento se secó al aire (ADN de SPV) y se rehidrató en Tris a 10 mM pH 7,5, EDTA a 1 mM a 4 °C.
A continuación, las regiones flanqueantes de TK en el genoma de SPV se clonaron mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se adquirieron dos cebadores (oligonucleótidos sintéticos), SP54242F y SP57617R, que se muestran en las SEQ ID NO: 8 y 9 de Takara Bio. La reacción de PCR se realizó mediante el uso de la polimerasa LA Taq (Takara Bio) y un conjunto de cebadores de SP54242F y SP57617R con ADN de SPV como molde de acuerdo con el protocolo del productor.
El ADN amplificado de aproximadamente 3,4 kpb se confirmó mediante una electroforesis en gel de agarosa al 0,8 % y se purificó del gel mediante el uso del kit de extracción de gel QIAquick (Qiagen). El fragmento de ADN purificado se clonó en el vector pCR4-TOPO (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del productor. Se recogieron 14 transformantes resistentes a ampicilina blancos y se cultivaron en caldo lB y cada plásmido se preparó con el kit QuickLyse Miniprep (Qiagen). Cada plásmido se digirió con Spel y se seleccionaron dos tipos de plásmidos candidatos (en ambas direcciones del ADN insertado). Los ADN insertados de ellos se secuenciaron con reactivo de secuenciación de ciclo Dye Terminator (DTCS) y un secuenciador CEQ2000XL (Beckman Coulter). Se confirmó que uno de los plásmidos candidatos, pCR-SPV54242/57617 (#2), contenía el fragmento de ADN de 54242 nt a 57617 nt de ADN genómico de SPV (GeneBank Acc: NC_003389) y se usó como plásmido básico (Figura1).
A continuación, se realizó mutagénesis por PCR para eliminar una parte del gen TK e introducir los sitios de enzimas de restricción múltiples mediante el uso de pCR-SPV54242/57617 (# 2) como molde y mediante el uso de dos clases de cebadores, (1) SEQ ID NO: 10 y 11 o (2) SEQ ID NO: 12 y 13.
Cada producto de PCR se aplicó a una electroforesis en gel de agarosa al 0,8 % y se purificó mediante el uso del kit de extracción de gel QIAquick. El fragmento de ADN purificado, que se amplificó mediante PCR mediante el uso de un conjunto de cebadores de SEQ ID NO: 10 y 11, se digirió con dos enzimas de restricción, KpnI y HindIII, y se ligó con las mismas enzimas de restricción-corte-pBluescript KS (+) (Stratagene). El plásmido pBS-TKR resultante (Kpn.Hin) (Figura 1) se digirió con SacI y PstI, y el mismo fragmento de ADN cortado con enzimas de restricción se amplificó mediante PCR mediante el uso de un conjunto de cebadores de SEQ ID NO: 12 y 13, se insertó en él. El plásmido resultante se denominó pSP70 (Figura 1).
Entre los sitios EcoRI y HindIII en los sitios múltiples de enzimas de restricción de pSP70 se reemplazaron con el adaptador de oligonucleótidos preparado por hibridación de dos oligonucleótidos de ADN sintéticos de SEQ ID NO: 14 y 15. El plásmido resultante se denominó pSP71 (Figura 1).
El fragmento de ADN del casete genético del 'promotor P7.5-LacZ' derivado de pNZ76, que se cortó con HindIII y SmaI de pNZ76 y seguido de un despunte con ADN polimerasa (descrito en el documento USP5,387,519) se ligó en el sitio Smal de pSP71. El plásmido resultante se denominó pSP72 (Figura 1) y el casete del gen 'P7.5-LacZ' se insertó en el gen TK (de 55625 nt a 56170 nt en el genoma de SPV).
El fragmento de corte BglI de 0,8 kb derivado de pGTPs-Ess_ORF2 (Ejemplo 1) se insertó en el sitio SfiI de pSP72, y el plásmido resultante se denominó pSP72-Ess_ORF2 (Figura 1). Este plásmido incluía el casete del gen del 'promotor fuerte del virus de la viruela (Ps)-Ess_ORF2' también dentro del gen TK, y se usó como plásmido de homología para producir un SPV recombinante, SVR7.
En lugar de Ess_ORF2, se insertó un gen PCV2-ORF2 natural en otro plásmido de homología para usar como referencia. Aunque se informaron muchos datos de secuencia de PCV2-ORF2, se sintetizó uno de ellos, el ADN de doble hebra de SEQ ID NO: 16. La SEQ ID NO: 16 es el ADN complementario que codifica el ORF2 de PCV2 aislado en Francia (GenBank: AF055393), y los sitios BamHI y SalI están unidos en los extremos 5' y 3' del mismo, respectivamente. El ADN sintetizado se cortó con BamHI y SalI y se reemplazó con la región BamHI/SalI de pSP72-Ess_ORF2. El plásmido resultante se denominó pSP72-ORF2 y se usó como plásmido de homología para producir un SPV recombinante, SVR3.
Ejemplo 3: Producción de SPV recombinantes. SVR3 y SVR7
(1) Producción de SPV recombinantes, SVR3 y SVR7
Se generaron SPV recombinantes en células ESK-4 mediante recombinación homóloga entre el genoma de SPV de tipo salvaje y los vectores de homología. Se infectaron células ESK-4 subconfluentes en una placa de 6 pocillos con SPV de tipo salvaje, 4 horas antes de la transfección con 2 pg de pSP72-Ess_ORF2 o pSP72-ORF2 mediante el uso del reactivo Lipofectamin Plus (Invitrogen) y se dejaron incubar a 37 °C durante 5 días hasta que se produjo el efecto citopático (CPE). Los lisados celulares de células transfectadas infectadas se tamizaron para placas recombinantes que expresan p-galactosidasa mediante la adición de 0,5 mg/ml de Bluo-gal (Invitrogen Cat. No.: 15519-028) en la superposición de agarosa de nutrientes. Los virus recombinantes libres de contaminantes se purificaron mediante tamizaje de 4-6 rondas. Los SPV recombinantes producidos mediante el uso de pSP72-Ess_ORF2 o pSP72-ORF2 se denominaron SVR7 y SVR3, respectivamente.
(2) Ensayo de placa negra (BPA)
Se infectaron células ESK-4 en una placa de 24 pocillos con SVR3, SVR7 o SPV salvaje y se incubaron a 37 °C. Después de 6 días, la monocapa se fijó con acetona y metanol (2:1). El anticuerpo monoclonal neutralizante anti-PCV2 (Ingenase clon 36F1) se diluyó (dilución 1:500) en leche en polvo al 5 % en PBS y se aplicó a las células infectadas y se incubó durante 2 h a temperatura ambiente (TA). Las células infectadas se lavaron con PBS y se hicieron reaccionar con anti-IgG de ratón en conejo conjugado con biotina (dilución 1:1000) y VECTASTAIN ABC Standard Kit (Vector Laboratory PK-4000). Sustrato de fosfatasa alcalina, solución madre de n Bt /BCIP (Roche, Cat. No.: 11681451001), se diluyó en Tris a 0,1 M pH 9,5, NaCl a 0,1 M, MgCl2 a 50 mM, y se añadió a las células infectadas y se incubaron de 5-30 min a temperatura ambiente hasta que las placas de SVR3 o SVR7 se volvieron de color púrpura/negro. Mientras que las placas de SPV salvaje eran blancas (negativas), se confirmó que todas las placas de SVR3 y SVR7 eran negras (positivas) (Figura 2).
Ejemplo 4: Anticuerpos policlonales para detectar PCV2-ORF2
Para producir un anticuerpo policlonal contra PCV2-ORF2, las proteínas de fusión de glutatión S-transferasa (GST) con la región C-terminal de PCV2-ORF2 se expresaron en E. coli. En primer lugar, se produjo un fragmento de ADN mediante PCR mediante el uso de pMD18-ORF2 (X/S) (Ejemplo 1) como molde, y un conjunto de cebadores de SEQ ID NO: 17 y 18.
El ADN amplificado de 0,45 kpb se cortó con BamHI y SalI, y se insertó en los sitios BamHI/SalI de pGEX-6p-3 (GE Healthcare, 28-9546-51). Los plásmidos candidatos se secuenciaron con cebadores de secuenciación, pGEX-5'-SP o -3'-SP (GE Healthcare, 27-1410-01 o 27-1411-01, respectivamente) y se confirmó que eran los mismos del plan de construcción. El plásmido resultante se denominó pGEX-TGXR2.
Se transformaron células huésped de E. coli, BL21 (GE Healthcare, 27-1542-01) con pGEX-TGXR2, y se confirmó que los transformantes expresan la proteína de fusión de aproximadamente 40 kDa mediante inducción con isopropil p-D-tiogalactósido (IPTG).
Para producir la proteína de fusión para la inmunización animal, se inoculó una única colonia del transformante en alícuotas de 5 ml de caldo LB que contenían 50 pg/ml de ampicilina (Amp) y se cultivó durante la noche a 37 °C con agitación. A la mañana siguiente, se inoculó el cultivo durante la noche en 1 litro de caldo LB que contenía Amp y se cultivó a 37 °C con agitación hasta una DO600 de 0,7, cuando se añadió IPTG a los cultivos hasta una concentración final de 0,1 mM. Los cultivos se incubaron durante 3 h más a 37 °C con agitación. Las bacterias se recogieron mediante centrifugación a 3500 xg durante 20 minutos y se resuspendieron en 20 ml de PBS como tampón de lisis (Triton X-100 al 1 % en PBS). La suspensión bacteriana se sometió a ultrasonidos en hielo en ráfagas de 10 s con 10 s de reposo sobre hielo tres veces. El lisado se centrifugó a 17000 xg durante 20 minutos a 4 °C y el sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo.
A medida que las proteínas de fusión GST objetivo formaban cuerpos de inclusión, se purificaron con Mini Whole Gel Eluter (Bio-Rad Laboratories, Cat. No.: 165-1255) de acuerdo con las instrucciones del proveedor.
Las proteínas GST de fusión objetivo de ~40 kDa que se purificaron en la fracción No.7 de Mini Whole Gel Eluter (Figura 3b). La solución de la fracción No. 7 se dializó con PBS. Se produjeron anticuerpos policlonales contra esta proteína de fusión por la inmunización de ratas. Se inmunizaron subcutáneamente tres ratas hembras Wister (SPF) de 5 semanas con 0,1 mg de la proteína GST-ORF2 como emulsiones en adyuvante completo de Freund y, tres semanas después, se reforzaron con 0,05 mg del mismo antígeno mezclado con adyuvante incompleto de Freund tres veces con intervalos de 3 semanas. Dos semanas después de la última inmunización, las ratas se desangraron para obtener el suero de ~1 ml por rata.
Ejemplo 5: Caracterización de péptidos antigénicos expresados por SPV recombinantes
Se llevó a cabo un ensayo de inmunofluorescencia (IFA) para confirmar la localización de las proteínas de ORF2 expresadas por SVR3 o SVR7. Las células ESK-4 se infectaron con rSPV (SVR3 o SVR7) o SPV original. Cinco días después las células infectadas se lavaron con PBS dos veces, se trataron a temperatura ambiente durante 5 minutos con (a) acetona/metanol (2:1) o (b) PBS. Se retiraron la acetona/metanol o PBS y se añadió PBS para no dejar secar las muestras. Se lavaron dos veces con PBS y se hicieron reaccionar a 37 °C durante 30 min con anticuerpos primarios [anti-p-galactosidasa (a-pGal) en conejo (CAPPEL, Cat.#: 0631-0002) y anti-PCV2-ORF2 (a-ORF2) en rata (Ejemplo 4), (diluciones 1:1000 en PBS)]. A continuación, las muestras se lavaron con PBS tres veces y se hicieron reaccionar a 37 °C durante 30 min con anticuerpos secundarios [anti-IgG de conejo (H+L) Alexa Fluor 488 (Life technology, A-11006) y anti-IgG de rata (H+L) Alexa Fluor 546 (A-11081) en cabra (diluciones 1:1000 en PBS)]. Las muestras se lavaron con PBS tres veces y se observaron en un microscopio de fluorescencia.
En el caso de (a) células tratadas con acetona/MeOH, se observaron tanto p-galactosidasa (señal verde) como ORF2 (señal roja) en las células infectadas con cada uno de SVR3 o SVR7, producto de las membranas celulares permeables (Figura 3a). Por el contrario, en el caso de (b) células intactas, no se detectaron ni la p-galactosidasa (verde) ni el ORF2 (rojo) en las células infectadas con SVR3, pero se observó claramente ORF2 (rojo) en las células infectadas con SVR7 (Figura 3b). Estos resultados indicaron claramente que la localización de las proteínas de ORF2 cambió de intracelular como el ORF2 original expresado por SVR3 a extracelular y en las superficies celulares por SVR7.
Por lo tanto, la eficacia de la vacuna de SVR7 es más fuerte que la de SVR3, y la señal de direccionamiento derivada de B5R podría mejorar la respuesta inmunológica contra PCV2-ORF2.
Ejemplo 6: Eficacia de la vacunación in vivo
Los cerdos se vacunaron con vectores que codifican un polipéptido de la invención SVR7. Como ejemplo comparativo, se vacunó a los cerdos con SVR3. Para la inmunización, se inyectaron 3-5x104 TCID50/dosis. A continuación, los cerdos se expusieron a PCV2.

Claims (22)

REIVINDICACIONES
1. Un polipéptido que comprende un péptido de direccionamiento a la membrana celular de no más de 50 aminoácidos derivado del gen B5R de un virus Vaccinia, unido operativamente a un polipéptido antigénico heterólogo, en donde el péptido de direccionamiento a la membrana celular comprende la SEQ ID NO: 1 o una secuencia que tiene al menos 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 1 y en donde el polipéptido antigénico es un ORF2 de un virus PCV2 o un dominio antigénico del mismo.
2. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde el péptido de direccionamiento a la membrana celular comprende la SEQ ID NO: 1.
3. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde el péptido de direccionamiento a la membrana celular comprende la SEQ ID NO: 2.
4. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el polipéptido antigénico es un ORF2 de un virus PCV2.
5. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el polipéptido antigénico comprende la secuencia de SEQ ID NO: 3 o una secuencia que tiene al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO: 3.
6. El polipéptido de la reivindicación 5, en donde el polipéptido antigénico comprende la secuencia de SEQ ID NO: 3 o una secuencia que tiene al menos 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 3.
7. El polipéptido de la reivindicación 6, en donde el polipéptido antigénico comprende la secuencia de SEQ ID NO: 3.
8. El polipéptido de la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.
9. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que además comprende un residuo de metionina N-terminal.
10. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que está glucosilado.
11. Una célula que expresa en su superficie un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
12. Un ácido nucleico que codifica un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
13. Un vector que comprende un ácido nucleico de la reivindicación 12.
14. El vector de la reivindicación 13, que es un vector viral.
15. El vector de la reivindicación 14, que es un virus de la pseudorrabia o un virus de la viruela porcina.
16. Una viruela porcina recombinante que comprende en su genoma un ácido nucleico de la reivindicación 12.
17. Una composición que comprende un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, una célula de la reivindicación 11, un ácido nucleico de la reivindicación 12 o un vector de cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16.
18. Una vacuna que comprende un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, una célula de la reivindicación 11, un ácido nucleico de la reivindicación 12 o un vector de cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16 y, opcionalmente, un adyuvante.
19. Un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, una célula de la reivindicación 11, un ácido nucleico de la reivindicación 12 o un vector de cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad asociada a PCV2 en un mamífero no humano.
20. El polipéptido, célula, ácido nucleico o vector para su uso de acuerdo con la reivindicación 19, en donde el mamífero no humano es un cerdo.
21. Un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, una célula de la reivindicación 11, un ácido nucleico de la reivindicación 12 o un vector de cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, para su uso para vacunar a un mamífero no humano contra la infección por PCV2.
22. El polipéptido, célula, ácido nucleico o vector para su uso de acuerdo con la reivindicación 21, en donde el mamífero no humano es un cerdo.
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