CN105377294A - 融合多肽和疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及新的免疫原性多肽以及它们在疫苗组合物中的用途。本发明还涉及核酸、载体和表达所述多肽的细胞以及它们的用途。更具体而言，本发明的多肽包含免疫原性结构域和来源于B5R基因的细胞膜定址结构域。本发明特别适合于生产用于非人动物的疫苗，特别是用于对猪进行疫苗接种以抵抗PCV2感染。

Description

融合多肽和疫苗

技术领域

本发明涉及新的免疫原性多肽以及它们在疫苗组合物中的用途。本发明还涉及核酸、载体和表达所述多肽的细胞以及它们的用途。更具体而言，本发明的多肽包含免疫原性结构域和来源于B5R基因的细胞膜定址(addressing)结构域。本发明特别适合于生产用于非人动物的疫苗，特别是用于对猪进行疫苗接种(vaccinating)以抵抗PCV2感染。

背景技术

猪环状病毒(porcinecircovirus，PCV)最初被鉴定为猪肾细胞培养物(PK15ATCCCCL-33)的污染物。PCV病毒粒子(virion)已被表征为具有约1.76kb的单链环状DNA的二十面体无包膜病毒。PCV被分类在环状病毒科(Circoviridaefamily)的环状病毒属(genusCircovirus)，环状病毒属还由其它动物环状病毒构成，例如鹦鹉喙羽病病毒(psittacinebeak-featherdiseasevirus)、鹅环状病毒、金丝雀环状病毒和鸽环状病毒。已识别出两种PCV基因型。PK15细胞来源的PCV已被认为对于猪是非致病性的，并被指定为PCV1型(PCV1)。另一方面，公认PCV2型(PCV2)是涉及数种猪疾病的主要感染因子。PCV2相关疾病对全球的猪生产者造成了重大经济损失。PCV2相关疾病在WO2007/076520中有所描述，包括例如断奶后多系统衰竭综合征(PostweaningMultisystemicWastingSyndrome，PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)、猪呼吸道疾病综合征(PRDC)、繁殖障碍、肉芽肿性肠炎、渗出性表皮炎、坏死性淋巴结炎以及先天性震颤。西欧于2000年、中欧于2003年具体报道了PCV2亚型A(PCV2A)和PCV2亚型B(PCV2B)的出现。最近，在2008年报道了野猪中的类似变化。

目前开发的PCV2疫苗(如(Merial)、CircoFLEX(BoehringerlngelheimVetmedica)或)要么为灭活PCV2疫苗、要么为亚单位疫苗。关于灭活PCV2疫苗，目前的PCV2毒株亚型A或亚型B存在一些缺点。特别是，只能以低滴度生产PCV2病毒，通常小于10⁵TCID50病毒颗粒/毫升。另外，这些病毒不能在组织培养物和永久感染细胞系中维持。关于PCV2亚单位疫苗，它们通常使用纯化的重组PCV2衣壳蛋白，该蛋白通过在杆状病毒系统中表达PCV2的ORF2基因而产生。就此而言，EP1741785中已报道了由PCV2分离株(isolate)Imp1011的ORF2编码的蛋白。WO2010/061000中已报道了由PCV2分离株PCV2Rm的ORF2编码的蛋白。EP1816200中已报道了由PCV2分离株412的ORF2编码的蛋白。EP1036180或EP2225367中已报道了由另外的PCV2分离株的ORF2编码的另一蛋白。

但是，这些天然衣壳蛋白的表达效率和免疫原性不佳，并且在疫苗接种的动物中不是总能提供所需水平的免疫保护。特别是，ORF2蛋白包含核定位序列，导致蛋白在细胞的细胞核中表达。这样的细胞内定位不便于该蛋白的提取或纯化，并且还可能阻止或减少在动物体内表达ORF2蛋白的DNA疫苗或载体疫苗的有效性。

WO2010/068969提出了通过使用外来分泌信号肽序列来改进ORF2的表达谱，以表达可溶形式的ORF2抗原。在这一申请中，提出了将ORF2与分泌信号或与细胞膜信号融合，并在构建体中包含切割位点，从而使得能够以可溶形式释放可溶性ORF2。该申请提出了关于可能的候选分泌肽的很长的预言性列表。但是，该申请并未包含表明通过改进ORF2的表达谱可获得有效的或改善的表达/免疫原性的任何实验数据。没有公开允许实现有效免疫(immunization)的构建体。

本发明提出了用于表达抗原性多肽的新的改善的构建体。本发明公开了专门适于抗原性多肽在细胞表面的改善表达的融合产物，尤其是使用病毒表达载体(如猪痘(swinepox)病毒)在细胞表面进行的改善表达。

本发明表明，通过使用B5R来源的定址信号在被感染/转导的细胞表面表达抗原性多肽，实现了改善的免疫应答，引起了有效的保护。通过在动物体内将抗原呈现在细胞表面，本发明的疫苗最有效地将抗原递送和暴露至免疫系统，特别是递送和暴露至免疫细胞(如淋巴细胞、树突状细胞和巨噬细胞)。通过将抗原呈现在细胞表面，本发明提供了处于活性构象的免疫原，从而引发强有力的保护性免疫应答。本发明可应用于任何抗原性多肽，特别是病毒抗原。

发明内容

本申请提供了含有可操作地连接至异源抗原性多肽的信号肽的多肽，所述信号肽来源于痘苗病毒(Vacciniavirus)的B5R基因。

在具体实施方式中，所述信号肽包含SEQIDNO：1或与SEQIDNO：1具有至少90％一致性的序列。所述抗原性多肽可为病毒抗原、细菌抗原或寄生虫抗原。所述抗原性多肽优选为病毒抗原，更特别地，所述抗原性多肽为衣壳蛋白或其免疫原性结构域。

在具体实施方式中，所述抗原性多肽为PCV2病毒的ORF2或其抗原性结构域。优选的实施方式使用含有SEQIDNO：3的序列或与SEQIDNO：3具有至少80％一致性的序列的抗原性多肽。

本发明的多肽可以是合成的或重组的，并且可包含转录后修饰(例如糖基化)、添加的化学基团等。最优选地，本发明的多肽在定址肽和抗原性肽之间没有切割位点。

本发明的另一目的为在其表面表达如上所定义的多肽的细胞。

本发明的另一目的涉及编码如上所定义的多肽的核酸。

本发明的另一目的为含有本发明的核酸的载体。所述载体优选为病毒载体，例如，最优选为伪狂犬病病毒(pseudorabiesvirus，PRV)或猪痘病毒(SPV)。使用猪痘特别有利，这是因为来源于痘苗病毒的B5R信号肽与猪痘具有改善的相容性。

本发明的另一目的在于包含如上所定义的多肽、细胞、核酸或载体的组合物。

本发明的另一目的是包含如上所定义的多肽、细胞、核酸或载体并任选包含佐剂的疫苗。

本发明还涉及在非人动物(例如，猪)中进行免疫(immunizing)或诱导免疫应答的方法，所述方法包括向所述动物给予如上所述的多肽、核酸、细胞、载体或疫苗。

本发明还涉及在非人动物(例如，猪)中治疗和/或预防PCV2相关疾病的方法，所述方法包括向所述动物给予如上所述的多肽、核酸、细胞、载体或疫苗。

本发明还涉及来源于痘苗病毒的B5R基因的信号肽用于在细胞中表达异源抗原性多肽的用途。

本发明可用于诱导免疫应答和/或对任何非人动物进行疫苗接种。它对于对猪进行疫苗接种以抵抗PCV2感染或PCV2疾病而言特别有用。

附图说明

图1：同源性质粒pSP72-Ess_ORF2的构建方案。

图2：使用单克隆抗体36F1进行的rSPV(SVR3，SVR7)的黑色斑块分析。用亲本(parent)SPV或重组体(SVR3或SVR7)感染ESK-4细胞。六天后，使用单克隆抗体36F1(1:500)、生物素缀合的兔抗小鼠IgG和ABC-ALP(Vecterstain)，对细胞进行黑色斑块分析。

图3：SPV感染的细胞的IFA。用rSPV(SVR3或SVR7)或亲本SPV感染ESK-4细胞。五天后，将被感染的细胞用丙酮/甲醇(a)或无(b)处理，并使其与一抗[兔抗β-半乳糖苷酶(α-βGal)和鼠抗PCV2-ORF2(α-ORF2)(1:1000)]和二抗[山羊抗兔IgGAlexaFluor488和抗大鼠IgGAlexaFluor546(1:1000)]反应。

图4：针对PCV2的血清学IF滴度。将Rm40感染的RPL-2细胞涂布在96孔板的每个孔上。将细胞用丙酮/甲醇固定，并在封闭(处于PBS中的0.5％脱脂奶粉)后将血清的2倍稀释液孵育1hr。将兔中生产的抗猪IgG-FITC抗体(SIGMA目录号：F1638，1:1000)用作二抗。标准阳性猪血清PAB-PCV2(VMRD)的IF滴度为2560。

具体实施方式

本发明涉及新的免疫原性多肽及其用途、特别是在疫苗组合物中的用途。本发明还涉及核酸、载体和表达所述多肽的细胞以及它们的用途。更具体而言，本发明的多肽包含可操作地连接的免疫原性结构域和细胞膜定址结构域，其中，所述细胞膜定址结构域来源于B5R基因。本发明特别适合于生产用于非人动物的疫苗，特别是用于对猪进行疫苗接种以抵抗PCV2感染。

来源于B5R的细胞膜定址肽

术语“来源于”表示定址肽的序列与痘苗病毒的B5R基因的信号肽序列相同或基本上相似。在优选实施方式中，该定址肽包含与痘苗病毒的B5R基因的信号肽序列具有至少90％一致性、甚至更优选具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性的序列。

B5R基因的信号肽序列的最优选实例为SEQIDNO：1，或与SEQIDNO：1具有至少90％一致性的序列、更优选与SEQIDNO：1具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的序列。因此，在具体实施方式中，本发明的多肽包含信号肽序列，所述信号肽包含SEQIDNO：1或与SEQIDNO：1具有至少90％一致性的序列。

信号肽可包含来源于B5R基因的其它氨基酸，只要这些氨基酸不改变该肽的膜定址特性。就此而言，在具体实施方式中，信号肽包含SEQIDNO：2。SEQIDNO：2的氨基酸23-36基本上不参与膜定址功能。但是，所示出的结果表明，这些氨基酸有助于融合多肽的稳定和正确构象。

可替代地或额外地，信号肽可包含并非来源于B5R基因的其它氨基酸，只要这些氨基酸不改变该肽的膜定址特性。这些氨基酸可具有克隆效用(例如，限制性位点)，或可参与所述多肽的稳定。

信号肽优选包含不多于100个氨基酸，甚至更优选包含不多于50个氨基酸。

如上所说明的，本发明包括信号肽，所述信号肽含有与SEQIDNO：1或SEQIDNO：2具有至少90％一致性的序列。两个氨基酸序列或核酸序列间的同源程度可借助本领域中本身已知的计算机程序来确定，例如，GCG程序包中提供的GAP(ProgramManualfortheWisconsinPackage，版本8，1996年8月，GeneticsComputerGroup，575ScienceDrive，Madison，Wisconsin，USA53711)(Needleman,S.B.和Wunsch,CD.，(1970)，JournalofMolecularBiology，48，443-453)。使用GAP及以下设定进行DNA序列比较：GAP产生罚分(GAPcreationpenalty)为5.0和GAP延伸罚分(GAPextensionpenalty)为0.3。可使用例如空位产生罚分为5和空位宽度罚分(gapwidthpenalty)为0.3的默认设置，利用Pileup比对软件(可作为GCG程序包的一部分获得)将核酸分子/氨基酸分子彼此进行比对。

用于确定给定核酸分子是否杂交至指定核酸的合适实验条件可包括：将含有待检查的相关核酸样品的滤膜(filter)在5×SSC中预浸泡10分钟，并将该滤膜在5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS和100μg/ml的超声变性鲑鱼精DNA的溶液中预杂交，随后在约45℃下在含有浓度为10ng/ml的P-dCTP标记的探针的相同溶液中杂交12小时，这根据Sambrook等所述的杂交方法(1989，MolecularCloning，ALaboratoryManual，第2版，ColdSpringHarbour，NewYork)进行。然后，在至少55℃(低严格性)、至少60℃(中等严格性)、至少65℃(中等/高严格性)、至少70℃(高严格性)或至少75℃(非常高严格性)，将该滤膜在2×SSC(0.5％SDS)中洗涤两次(30分钟)。杂交可通过将滤膜暴露于x射线胶片来检测。

在优选实施方式中，信号肽包含SEQIDNO：1或SEQIDNO：2。

在具体实施方式中，信号肽由SEQIDNO：1或SEQIDNO：2构成。

抗原性多肽

本发明可与任何抗原性多肽一起使用，即，可与含有能够引起免疫应答的一个或多个表位的任何多肽一起使用。该多肽可以是完整的蛋白、蛋白的片段、或小肽(例如10个氨基酸的小肽)。优选地，抗原性多肽包含少于约500个氨基酸。

抗原性多肽相对于信号肽而言是“异源的(heterologous)”，这意味着抗原性多肽与信号肽在自然界中不是天然相关的。通常，抗原性多肽不是B5R蛋白的序列。术语“异源的”表明该抗原性多肽例如来自于不同于痘苗病毒的病毒，或者例如来自于不同于B5R蛋白的蛋白。

抗原性多肽可为病毒来源、细胞(例如，细菌)来源或寄生虫来源的抗原性多肽。

就此而言，如上所说明的，在优选实施方式中，抗原性多肽是PCV2病毒的ORF2蛋白或其抗原性结构域。

EP1741785中已报道了PCV2分离株Imp1011的ORF2蛋白。WO2010/061000中已报道了PCV2分离株PCV2Rm的ORF2蛋白。EP1816200中已报道了PCV2分离株412的ORF2蛋白。EP1036180或EP2225367中已报道了另外的PCV2分离株的另一ORF2蛋白。所有这些ORF2蛋白均被考虑用于本发明中。

在优选实施方式中，在本发明中使用的ORF2蛋白包含SEQIDNO：3，或与SEQIDNO：3具有至少80％一致性、甚至更优选与SEQIDNO：3具有至少82％、84％、86％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的任何序列。

通常，PCV2ORF2蛋白包含约234个氨基酸。该序列包含核定位序列(nuclearlocalizationsequence)，所述核定位序列通常对应于该序列的氨基酸1-42。

对于本发明而言，优选使用缺乏天然核定位序列(即，位于天然ORF2的残基1-42处的序列)的ORF2蛋白的部分，并优选用膜定址肽取代该序列。SEQIDNO：3为缺乏核定位序列的ORF2蛋白的氨基酸序列。

与SEQIDNO：3具有一致性并保留PCV2免疫原性活性的序列可人工得到，或者由上文列出的PCV2血清型或由另外的不同血清型获得。通常，将ORF2蛋白的前42个氨基酸移除以抑制核定位功能。

如所说明的，本发明可与其它病毒抗原或病原性抗原的免疫原性多肽一起使用，例如，如选自于如下病毒或病原体中的病毒或病原体的任何蛋白(例如，糖蛋白、衣壳蛋白、或它们的抗原片段)：例如，胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneunomia)；腺病毒；甲病毒属(Alphavirus)，如东部马脑脊髓炎病毒(Easternequineencephalomyelitisviruses)；结肠小袋纤毛虫(Balantidiumcoli)；支气管败血性博德特氏杆菌(Bordetellabronchiseptica)；短螺旋体属(Brachyspiraspp.)，优选猪痢疾短螺旋体(B.hyodyentheriae)、多毛短螺旋体(B.pilosicoli)、非致病性短螺旋体(B.innocens)、猪布鲁氏菌(Brucellasuis)(优选生物变型(biovars)1、2和3)；经典猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒；衣原体属(Chlamydia/Chlamydophilasp.)，优选兽类衣原体(C.pecorum)和流产衣原体(C.abortus)；梭菌属(Clostridiumspp.)，优选艰难梭菌(Cl.difficile)，产气荚膜梭菌(Cl.perfringens)A型、B型和C型，诺维氏梭菌(Cl.novyi)，败毒梭菌(Cl.septicum)，破伤风梭菌(Cl.tetani)；消化道和呼吸道冠状病毒；微小隐孢子虫(Cryptosporidiumparvum)；艾美球虫属(Eimeriaspp)；猪附红细胞体(Eperythrozoonissuis)，目前命名为猪嗜血支原体(Mycoplasmahaemosuis)；猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)；大肠杆菌(Escherichiacoli)；副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis)，优选亚型1、亚型7和亚型14；血凝性脑脊髓炎病毒(Hemagglutinatingencephalomyelitisvirus)；猪等孢球虫属(lsosporasuis)；日本脑炎病毒；胞内劳森氏菌(Lawsoniaintracellulars)；钩端螺旋体属(Leptospiraspp.)，优选澳洲型钩端螺旋体(Leptospiraaustralis)、犬钩端螺旋体(Leptospiracanicola)、感冒伤寒型钩端螺旋体(Leptospiragrippotyphosa)、出血性黄疸钩端螺旋体(Leptospiraicterohaemorrhagicae)、问号钩端螺旋体(Leptospirainterrogans)、波蒙那钩端螺旋体(LeptospiraPomona)和塔拉索夫钩端螺旋体(Leptospiratarassovi)；溶血性曼氏菌(Mannheimiahaemolytica)；分枝杆菌属(Mycobacteriumspp.)，优选鸟分枝杆菌(M.avium)、胞内分枝杆菌(M.intracellular)和牛分枝杆菌(M.bovis)；肺炎支原体(Mycoplasmahyponeumoniae)；细小病毒(Parovirus)；多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida)；猪巨细胞病毒(cytomegolovirus)；猪细小病毒，猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus)；伪狂犬病病毒；轮状病毒；鹭山病毒(Sagiyamavirus)；沙门氏菌属(Salmonellaspp.)，优选鼠伤寒沙门氏菌(S.thyhimurium)和猪霍乱沙门氏菌(S.choleraesuis)；葡萄球菌属(Staphylococcusspp.)，优选猪葡萄球菌(S.hyicus)；链球菌属(Streptococcusspp.)，优选猪链球菌；猪巨细胞病毒；猪疱疹病毒；猪流感病毒；猪痘病毒；刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)；猪的水泡性口炎病毒或疹病毒(virusofexanthema)；或猪环状病毒的其它分离株和亚型。

多肽组装和生产

本发明的多肽通常包含可操作地连接至抗原性多肽的细胞膜定址肽。术语“可操作地连接(operablylinked)”说明两个结构域以允许多肽定址到细胞膜并在细胞外部表达抗原性多肽的方式彼此直接或间接融合。

最优选地，细胞膜定址肽位于N末端，免疫原性多肽位于C末端。这两个结构域共价连接，优选通过氨基键(aminobond)共价连接。因此，本发明的多肽由N末端至C末端优选包含：

.细胞膜定址肽，

.免疫原性多肽。

多肽可进一步包含额外的结构域或序列。例如，多肽在细胞膜定址肽和免疫原性多肽之间可包含接头序列。然而，两个结构域优选直接连接，而没有接头序列。此外，在优选实施方式中，多肽没有切割位点，从而使得免疫原性多肽暴露在细胞表面，并且基本上不以可溶形式释放。

本发明多肽的优选和具体实例包含SEQIDNO：4的氨基酸序列。

本发明的多肽可进一步包含N端甲硫氨酸残基。

本发明的多肽可为糖基化的。

本发明的多肽可通过合成方法或者通过重组手段生产。优选地，对本发明的多肽进行工程化，以在细胞或整个有机体中通过表达编码核酸分子直接产生/表达。实际上，本发明多肽的新表达谱特别适于DNA疫苗或载体疫苗的设计，所述DNA疫苗或载体疫苗包含编码本发明多肽的核酸分子。在引入有机体后，核酸进入细胞并表达多肽，该多肽暴露在细胞表面并表现出改善的免疫原性。如下面将讨论的，核酸可为裸(naked)核酸，或与任何合适的载体一起配制。或者，本发明可使用细胞疫苗，其中，所述多肽在培养中表达在细胞表面，将所得细胞用作疫苗组合物。

因此，本发明还涵盖和利用了编码如上所定义的多肽的核酸分子。

核酸

本发明的又一目的涉及编码如上所定义的多肽的核酸分子。该核酸可用于在体外生产所述多肽、或用于生产在其表面上表达所述多肽的细胞、或用于生产其中的活性剂为所述核酸或含有所述核酸的载体的疫苗。

本发明的核酸可为单链或双链的DNA或RNA。所述核酸通常为cDNA或RNA。所述核酸可通过本领域公知的技术来生产，例如合成、或克隆、或扩增编码免疫原性多肽的序列；合成、或克隆、或扩增编码细胞膜定址序列的序列；将序列连接，并在合适的载体和细胞中对其进行克隆/扩增。

在具体实施方式中，本发明涉及包含SEQIDNO：5的核酸分子。

载体

根据本发明的核酸分子可以提供为如下形式：核酸分子本身，如裸核酸分子；载体；病毒或宿主细胞等，无论是来自原核来源或真核来源。载体包括含有本发明的核酸分子的表达载体。例如，本发明的载体可包含转录启动子和/或转录终止子，其中，所述启动子与所述核酸分子可操作地连接，并且其中，所述核酸分子与所述转录终止子可操作地连接。

就此而言，本发明的具体目的是包含如上所定义的核酸的病毒载体。所述病毒载体可来源于不同类型的病毒，例如，优选猪痘病毒、禽痘(Fowlpox)病毒、伪狂犬病病毒、Aujesky病毒、沙门氏菌属、痘苗病毒、BHV(牛疱疹病毒)、HVT(火鸡疱疹病毒)、腺病毒、TGEV(传染性胃肠炎冠状病毒(TransmissibleGastroenteritidisCoronavirus))、红细胞病毒属(Erythrovirus)和SIV(猿猴免疫缺陷病毒)。

在优选实施方式中，载体为重组猪痘病毒。在猪中，猪痘病毒(SPV)只是轻度致病的，并引起保护性免疫应答。因此，SPV是猪中病毒载体的优秀候选者。产生重组SPV的一般程序在一些参考文献中有所描述(VetRec.1994年1月1日；134(1):13-8)。在典型的方法中，构建重组SPV的第一步是产生可引导本发明的抗原性多肽基因的转录单元插入SPV基因组中的同源性质粒。插入通过同源重组发生，从而需要所插入的DNA的侧翼为邻接的(contiguous)SPV基因组区域。在SPV重组体的情况下，胸苷激酶(TK)基因首选作为插入位点，其被证明是病毒复制的非必需区域。因为痘病毒的转录机制不能识别宿主细胞启动子，本发明的抗原性多肽基因优选与痘病毒启动子连接。对于重组SPV中的表达，优选痘苗病毒启动子(例如P11或P7.5)，但也可使用其它痘病毒启动子。一旦同源性质粒生成，就将它转染到先前已用SPV感染的感受态细胞(如胚胎猪肾(ESK-4)细胞或猪肾(PK-15)细胞)中。重组体通过复制的SPV基因组与转染的质粒之间的同源重组生成。可使用常规技术选择/筛选重组SPV。一种鉴定方法利用大肠杆菌lacZ基因作为标志物。在这种情况下，然后将显色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)(所述显色底物被表达的酶(β-半乳糖苷酶)的作用转化为蓝色化合物)用于鉴定相比于由非重组病毒生成的无色斑块背景的由重组病毒在后代中产生的病毒斑块。在无标志物基因的情况下，由重组SPV表达的抗原性多肽的生产可在免疫荧光分析中通过使用针对所述抗原性多肽的特异性抗体进行验证。使用上述方案，可产生表达本发明抗原性多肽的重组SPV。

也可使用其它表达系统和载体，例如在酵母细胞中复制和/或整合的质粒。

本发明还涉及用于制备本发明多肽的方法，所述方法包括在适合于核酸表达的条件下培养含有如上所定义的核酸或载体的宿主细胞，并回收所述多肽。如上所说明的，蛋白和肽可根据本领域中本身已知的技术进行纯化。本发明还提供了表达试剂盒，所述表达试剂盒包含(a)宿主细胞(优选昆虫细胞或酵母细胞)；(b)表达本发明多肽的工具(例如，含有能够在所述细胞中复制的载体系统的工具)；和(c)回收本发明的蛋白或肽的工具。

疫苗组合物

本文所用的术语“疫苗”包括可用于引起、刺激或增强动物(例如，猪)抵抗病原体的免疫系统的试剂。本发明的疫苗能够引起或刺激或增强抵抗PCV2病毒的免疫力。

术语“免疫(immunization)”包括向受试者递送免疫原的方法。例如，免疫可实现抗体和/或细胞应答的持续高水平，其中，T淋巴细胞能够杀死或抑制经免疫的非人动物(例如猪)中的病原体，所述抗体和/或细胞应答针对该动物以前所暴露至的病原体或抗原。

本发明的疫苗包含处于药学上可接受的载体(vehicle)中的免疫学有效量的如上所述的多肽、细胞或核酸。作为用本发明的组合物进行疫苗接种的结果，动物变得对PCV2感染至少部分免疫或完全免疫，或变得对发展成中度或重度PCV2感染具有抵抗力。PCV2疫苗可用于引起体液应答和/或细胞应答。

PCV2感染或相关疾病特别包括断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)、猪呼吸道疾病综合症(PRDC)、繁殖障碍、肉芽肿性肠炎、渗出性表皮炎、坏死性淋巴结炎以及先天性震颤。优选在一定程度上保护非人动物受试者(如猪)，其中，PCV2感染的一种至所有的不良生理症状或效果得到显著减少、改善或完全阻止。

本发明还涉及联合疫苗(combinationvaccine)，所述联合疫苗包含与至少一种另外的蛋白抗原联合的本发明的多肽、核酸或细胞[GupiP.S.Nayar等(Can.Vet.J，第38卷，1997:385-387)和ClarkE.G.(Proc.Am.Assoc.SwinePrac.1997；499-501)]。

在实践中，免疫学有效剂量所需的确切量会因受试者的不同而不同，这取决于各种因素，例如受试者的年龄和一般状况、制剂的性质和给药方式。适当的“有效量”可由本领域普通技术人员仅使用常规实验确定。例如，本领域中用于确定或滴定合适的疫苗剂量，以基于非人动物受试者的体重、疫苗的浓度和其它典型因素找到最小有效剂量的方法是已知的。

在典型的实施方式中，疫苗包含0.1-50μg、优选0.1-25μg、甚至更优选1-15μg、通常约10μg的单位剂量(unitarydose)的本发明的多肽或核酸抗原。

引发适当免疫应答的疫苗的剂量、其中的组分的浓度和给予疫苗的时间安排可由诸如通过血清的抗体滴定，例如通过ELISA和/或血清中和测定分析和/或通过疫苗接种激发(challenge)评价的方法来确定。

在具体实施方式中，疫苗包含任选地与任何合适的赋形剂或载体联合的处于纯化形式的本发明的多肽。

在另一具体实施方式中，疫苗包含任选地与任何合适的赋形剂或载体联合的如上所定义的核酸。最优选的疫苗包含含有如上所定义的核酸的病毒载体。又一优选的疫苗包含含有如上所定义的核酸的猪痘病毒。

取决于给药途径，疫苗可含有本身为本领域普通技术人员已知的其它成分，例如，药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂、佐剂、冷冻干燥稳定剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、凝胶化或粘度增强添加剂、以及防腐剂。

药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的实例包括但不限于：去矿质水或蒸馏水；盐溶液；基于植物的油，如花生油、落花生属油(arachisoil)、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油、芝麻油、或椰子油；硅酮油类，包括聚硅氧烷，例如甲基聚硅氧烷、苯基聚硅氧烷和甲基苯基聚硅氧烷(polysolpoxane)；挥发性硅酮；矿物油类，例如轻质液体石蜡油或重质液体石蜡油；角鲨烯；纤维素衍生物，例如甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠盐、或羟丙基甲基纤维素；低级链烷醇类(alkanols)，例如乙醇或异丙醇；低级芳烷醇类(aralkanols)；低级聚亚烷基二醇或低级亚烷基二醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1,3-丁二醇或甘油；脂肪酸酯类，如棕榈酸异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯或油酸乙酯；聚乙烯吡咯烷酮；琼脂；角叉菜胶；西黄蓍胶或阿拉伯树胶；以及凡士林。通常，载体将构成疫苗组合物的10wt％-99.9wt％，并且可使用本领域已知的试剂(例如，磷酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸氢钾、磷酸二氢钾，以及它们的混合物等)通过常规方法进行缓冲。

佐剂的实例包括但不限于：水包油乳剂、氢氧化铝(明矾)、免疫刺激复合物、非离子型嵌段聚合物或共聚物、细胞因子(像IL-1、IL-2、IL-7、IFN-α、IFN-β、IFN-γ等)、皂甙、单磷酰脂质A(MLA)、胞壁酰二肽(MDP)等。其它合适的佐剂包括例如硫酸铝钾、从大肠杆菌中分离的热不稳定或热稳定肠毒素、霍乱毒素或其B亚单位、白喉毒素、破伤风毒素、百日咳毒素、弗氏不完全佐剂或完全佐剂等。可在使用前例如通过甲醛处理使基于毒素的佐剂(如白喉毒素、破伤风毒素和百日咳毒素)灭活。

冷冻干燥稳定剂的实例例如可为：碳水化合物(carbohydrates)，如山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、蔗糖、葡聚糖或葡萄糖；蛋白，如白蛋白或酪蛋白，以及上述物质的衍生物。

疫苗可额外包含来自至少一种额外的病原体的至少一种免疫原，例如，猪病原体，例如，胸膜肺炎放线杆菌；腺病毒；甲病毒属，如东部马脑脊髓炎病毒；结肠小袋纤毛虫；支气管败血性博德特氏杆菌；短螺旋体属，优选猪痢疾短螺旋体、多毛短螺旋体、非致病性短螺旋体、猪布鲁氏菌(优选生物变型1、2和3)；经典猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒；衣原体属，优选兽类衣原体和流产衣原体；梭菌属，优选艰难梭菌，产气荚膜梭菌A型、B型和C型，诺维氏梭菌，败毒梭菌，破伤风梭菌；消化道和呼吸道冠状病毒；微小隐孢子虫；艾美球虫属；猪附红细胞体，目前命名为猪嗜血支原体；猪红斑丹毒丝菌；大肠杆菌；副猪嗜血杆菌，优选亚型1、亚型7和亚型14；血凝性脑脊髓炎病毒；猪等孢球虫属；日本脑炎病毒；胞内劳森氏菌；钩端螺旋体属，优选澳洲型钩端螺旋体、犬钩端螺旋体、感冒伤寒型钩端螺旋体、出血性黄疸钩端螺旋体、问号钩端螺旋体、波蒙那钩端螺旋体和塔拉索夫钩端螺旋体；溶血性曼氏菌；分枝杆菌属，优选鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌和牛分枝杆菌；肺炎支原体；细小病毒；多杀性巴氏杆菌；猪巨细胞病毒；猪细小病毒，猪繁殖与呼吸综合征病毒；伪狂犬病病毒；轮状病毒；鹭山病毒；沙门氏菌属，优选鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌；葡萄球菌属，优选猪葡萄球菌；链球菌属，优选猪链球菌；猪巨细胞病毒；猪疱疹病毒；猪流感病毒；猪痘病毒；刚地弓形虫；猪的水泡性口炎病毒和疹病毒；或猪环状病毒的其它分离株和亚型。

本发明的疫苗组合物可为液体制剂，例如水溶液剂，油包水或水包油乳剂，糖浆剂，酏剂(elixir)，酊剂(tincture)，用于胃肠外给予、皮下给予、皮内给予、肌内给予或静脉内给予(例如，可注射式给予)的制剂，例如无菌混悬剂(suspensions)或乳剂。此类制剂是本领域已知的，并通常通过将抗原和其它典型添加剂溶解于适当的载体或溶剂体系中来制备。液体制剂也可包括含有悬浮剂或乳化剂的混悬剂和乳剂。

给予途径可为经皮的、经粘膜给予、或通过胃肠外途径(皮内途径、肌内途径、皮下途径、静脉内途径或腹膜内途径)。根据本发明的疫苗组合物可单独给予，或者可与其它处理或疗法共同给予或依次给予。

本发明还涉及在非人动物(例如，猪)中进行免疫或诱导免疫应答的方法，所述方法包括向所述动物给予如上所述的多肽、核酸、细胞、载体或疫苗。

本发明还涉及在非人动物(例如，猪)中治疗和/或预防PCV2相关疾病的方法，所述方法包括向所述动物给予如上所述的多肽、核酸、细胞、载体或疫苗。

如上所述，PCV2感染或相关疾病特别包括断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)、猪呼吸道疾病综合症(PRDC)、繁殖障碍、肉芽肿性肠炎、渗出性表皮炎、坏死性淋巴结炎及先天性震颤。

本发明的疫苗可方便地鼻内给予、透皮给予(即，涂敷在皮肤表面上或皮肤表面处以全身吸收)、胃肠外给予、眼部给予等。胃肠外给予途径包括但不限于肌内途径、静脉内途径、腹膜内途径等。

本发明的疫苗的剂量将取决于待进行疫苗接种的动物的物种、品种(breed)、年龄、大小、疫苗接种史、健康状况；以及给予途径(例如皮下给予、皮内给予、口服给予、肌内给予或静脉内给予)。

本发明的疫苗可作为单一剂量给予或以重复剂量给予。本发明的疫苗可单独给予，或者可与一种或多种另外的组分(如，例如其它猪免疫原性组合物或疫苗组合物)同时给予或依次给予。在于不同时间给予组合物的情况中，给予在时间上可为彼此分开的或重叠的。

在一个实施方式中，将本发明的疫苗组合物给予易感(susceptibleto)PCV2感染或处于PCV2感染风险中的受试者，以增强所述受试者自身的免疫应答能力。在一个实施方式中，给予疫苗的受试者是猪。该动物可能易被PCV2或密切相关的病毒感染。

本发明的疫苗优选给予猪、成年猪，但也给予幼猪、仔猪(piglets)或给予怀孕雌性、或给予其它类型的非人动物。怀孕雌性的疫苗接种特别有利，因为它经由母体抗体的传输赋予新生幼仔被动免疫。猪可为小于7、6、5、4、3、2或1周龄；1-6周龄；2-5周龄；或3-4周龄。例如，可给予“测试”动物本发明的疫苗，从而以猪疫苗的最终使用或开发为目的来评价该疫苗的性能。理想的是，将疫苗给予尚未暴露至PCV2病毒的受试者。优选地，受试者为需要进行疫苗接种来抵抗断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)和/或猪皮炎肾病综合征(PDNS)的猪。

本发明还包括联合疫苗，所述联合疫苗包含本发明的疫苗和对猪中另一致病有机体有效的至少一种免疫原性活性组分，所述致病有机体如，例如胸膜肺炎放线杆菌；腺病毒；结肠小袋纤毛虫；支气管败血性博德特氏杆菌；短螺旋体属，优选猪痢疾短螺旋体、多毛短螺旋体、猪布鲁氏菌(优选生物变型1、2和3)；经典猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒；衣原体属，优选兽类衣原体和流产衣原体；梭菌属，优选艰难梭菌，产气荚膜梭菌；猪呼吸道冠状病毒；微小隐孢子虫；艾美球虫属；猪附红细胞体，目前命名为猪嗜血支原体；猪红斑丹毒丝菌；大肠杆菌；副猪嗜血杆菌；血凝性脑脊髓炎病毒；猪等孢球虫属；胞内劳森氏菌；钩端螺旋体属，优选波蒙那钩端螺旋体；溶血性曼氏菌；分枝杆菌属，优选鸟分枝杆菌；肺炎支原体；多杀性巴氏杆菌；猪巨细胞病毒；猪细小病毒，猪繁殖与呼吸综合征病毒；伪狂犬病病毒；轮状病毒；沙门氏菌属，优选鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌；葡萄球菌属，优选猪葡萄球菌；链球菌属，优选猪链球菌；猪巨细胞病毒；猪流感病毒；猪痘病毒；刚地弓形虫；猪的水泡性口炎病毒和水泡性疹病毒；或猪环状病毒的其它分离株和亚型。

本发明还提供了含有免疫学有效量的如上所述的多肽、核酸或疫苗的容器。本发明还提供了疫苗接种试剂盒，所述疫苗接种试剂盒包含含有免疫学有效量的疫苗的任选的无菌容器、用于向动物给予所述疫苗的工具、以及任选的说明手册(instructionmanual)，所述说明手册包含给予免疫学有效量的组合物来治疗和/或预防PCV2相关疾病的信息。

本发明进一步的方面和优点在以下部分中提供，以下部分应被视为仅是说明性的。

实施例

实施例1：构建编码含有B5R信号肽和PCV2ORF2的抗原性多肽的核酸

从TakaraBio(日本)订购在SEQIDNO：6和SEQIDNO：7中示出的两个合成的双链DNA。它们5’、3’末端的限制性酶切位点分别为BamHI/SalI和XbaI/SalI。将所述DNA分别克隆到质粒pMD18-Ess(B/X/S)和pMD18-ORF2(X/S)中。

因为SEQIDNO：6的3’末端SalI位点的前面有XbaI位点，用两种限制性酶(XbaI和SalI)切割pMD18-Ess(B/X/S)。将来源于用XbaI和SalI切割pMD18-ORF2(X/S)得到的561bpDNA片段插入pMD18-Ess(B/X/S)的XbaI/SalI位点。所得质粒pMD18-Ess_ORF2包含SEQIDNO：5的抗原性肽基因。

用两种限制性酶(BamHI和SalI)切割质粒pGTPs40K-S(描述于USP7,348,422的图2中)，并用BamHI/SalI切出的0.7kbp片段(来源于pMD18-Ess_ORF2)替换。将所得质粒命名为pGTPs-Ess_ORF2。该质粒包含强痘病毒启动子(Ps)和SEQIDNO：5的抗原性肽基因。

实施例2：用于生产重组SPV的质粒

首先，如下制备SPV基因组DNA：

SPVkasza毒株(VR-363)和胚胎猪肾细胞ESK-4细胞(CL-184)可从美国模式培养物保藏中心(ATCC)购买。在37℃下5％CO₂中，将ESK-4细胞常规培养在补充有以下物质的Ham’sF-12K培养基(Gibco，目录号：21127-022)中：1％链霉素-青霉素(Gibco，目录号：15140-122)和5％FBS(Gibco，目录号：10437-028)。关于SPV基因组DNA制备，将225cm²烧瓶中的汇合ESK-4细胞用SPV感染并孵育6天，直到细胞显示出100％的细胞病变效应(cytopathiceffect，CPE)。然后，通过将细胞刮入培养基中并以1300rpm离心5min，收获被感染的细胞。将培养基倒出，并将细胞沉淀轻轻重悬于2ml磷酸盐缓冲盐水(PBS：每升H₂O中1.5gNa₂HPO₄、0.2gKH₂PO₄、0.8gNaCl和0.2gKCl)中并进行两个连续的冷冻解冻。然后通过在4℃下以3000rpm离心5分钟来将细胞碎片移除。然后通过在4℃下以20,000×g离心20min，使存在于上清液中的SPV病毒粒子沉淀。然后，将所得沉淀用10mMTris(pH7.5)悬浮。然后，通过用裂解缓冲液(20mMTris，pH9，0.1MNaCl₂，5mMEDTA，0.1％SDS，0.2mg/ml蛋白酶K)悬浮并在60℃下孵育5min，从SPV病毒粒子中提取SPV基因组DNA。进行两次酚:氯仿(1:1)提取，通过加入2倍体积的乙醇来使样品析出并离心。倒出上清液，将沉淀(SPVDNA)在空气中干燥，并在4℃下在10mMTrispH7.5、1mMEDTA中再水化。

接下来，通过聚合酶链式反应(PCR)克隆SPV基因组中的TK侧翼区域。SEQIDNO：8和SEQIDNO：9中示出的两个引物(合成的寡核苷酸)SP54242F和SP57617R购自TakaraBio。使用LATaq聚合酶(TakaraBio)以及引物组(SP54242F和SP57617R)、并以SPVDNA作为模板，根据生产商的方案进行PCR反应。

通过0.8％琼脂糖凝胶电泳确认约3.4kbp的扩增DNA，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)从凝胶中纯化。根据生产商的方案，将纯化的DNA片段克隆进pCR4-TOPO载体(Invitrogen)中。挑出14个白色氨苄青霉素抗性转化子，并在LB肉汤中进行生长，用QuickLyseMiniprep试剂盒(Qiagen)制备各质粒。将各质粒用SpeI消化，并选出两种候选质粒(两种方向的插入DNA)。使用染料终止循环测序试剂(DyeTerminatorCycleSequencingreagent)(DTCS)和CEQ2000XL测序仪(BeckmanCoulter)，对它们的插入DNA进行测序。证实候选质粒之一pCR-SPV54242/57617(#2)含有SPV基因组DNA的54,242nt-57,617nt的DNA片段(GeneBank登录号：NC_003389)，并将其用作基础质粒(图1)。

接着，使用pCR-SPV54242/57617(#2)作为模板、并使用两种引物组[(1)SEQIDNO：10和SEQIDNO：11或(2)SEQIDNO：12和SEQIDNO：13]进行PCR诱变，以删除TK基因的一部分并引入多限制性酶切位点。

对各PCR产物施用0.8％琼脂糖凝胶电泳，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒进行纯化。将纯化的DNA片段(使用引物组SEQIDNO：10和SEQIDNO：11通过PCR扩增而来)用两种限制性酶KpnI和HindIII进行消化，并与经相同的限制性酶切割的pBluescriptKS(+)(Stratagene)连接。将所得质粒pBS-TKR(Kpn.Hin)(图1)用SacI和PstI消化，并将经相同限制性酶切割的DNA片段(使用引物组SEQIDNO：12和SEQIDNO：13通过PCR扩增而来)插入其中。将所得质粒命名为pSP70(图1)。

用通过使两个合成的DNA寡核苷酸SEQIDNO：14和SEQIDNO：15退火而制备的寡核苷酸适体(adaptor)替换pSP70的多限制性酶切位点的EcoRI和HindIII位点之间的序列。将所得质粒命名为pSP71(图1)。

将来源于pNZ76的‘P7.5启动子-LacZ’基因盒的DNA片段(对pNZ76进行HindIII和SmaI切割，然后通过DNA聚合酶进行平端化(描述于USP5,387,519中))连接进pSP71的SmaI位点。将所得质粒命名为pSP72(图1)，‘P7.5-LacZ’基因盒被插入到TK基因(SPV基因组中的55625nt-56170nt)中。

将来源于pGTPs-Ess_ORF2(实施例1)的0.8kb的BglI切割的片段插入pSP72的SfiI位点，并将所得质粒命名为pSP72-Ess_ORF2(图1)。该质粒包含‘强痘病毒启动子(Ps)-Ess_ORF2’基因盒(也处于TK基因中)，并被用作同源性质粒来生成重组SPVSVR7。

将天然PCV2-ORF2基因代替Ess_ORF2插入到另一个同源性质粒以用作参比。虽然已报道了PCV2-ORF2的很多序列数据，合成它们中之一(SEQIDNO：16的双链DNA)。SEQIDNO：16为编码分离自法国的PCV2的ORF2的互补DNA(GenBank：AF055393)，在其5’末端和3’末端分别连接有BamHI位点和SalI位点。将该合成的DNA用BamHI和SalI切割，并替换pSP72-Ess_ORF2的BamHI/SalI区域。将所得质粒命名为pSP72-ORF2，并用作同源性质粒来生成重组SPVSVR3。

实施例3：重组SPV(SVR3和SVR7)的生产

(1)生产重组SPV(SVR3和SVR7)

通过野生型SPV基因组和同源性载体之间的同源重组在ESK-4细胞中生成重组SPV。在使用LipofectaminPlus试剂(Invitrogen)用各2μg的pSP72-Ess_ORF2或pSP72-ORF2进行转染前4小时，将6孔板中亚汇合(sub-confluent)的ESK-4细胞用野生型SPV进行感染，并使其在37℃下孵育5天，直至发生细胞病变效应(CPE)。通过在营养琼脂糖覆盖物中添加0.5mg/mlBluo-gal(Invitrogen目录号：15519-028)对来自被感染并被转染的细胞的细胞裂解物中的表达β-半乳糖苷酶的重组斑块进行筛选。通过4-6轮筛选纯化出无野生型的重组病毒。将使用pSP72-Ess_ORF2或pSP72-ORF2生产的重组SPV分别命名为SVR7和SVR3。

(2)黑色斑块分析(BPA)

用SVR3、SVR7或野生SPV感染24孔板中的ESK-4细胞，并在37℃下孵育。6天后，将单细胞层用丙酮和甲醇(2:1)固定。将中和性抗PCV2单克隆抗体(Ingenase克隆36F1)在处于PBS中的5％干奶粉中进行稀释(1:500稀释)，并施用于被感染的细胞，室温(RT)下孵育2小时。将被感染的细胞用PBS洗涤，并与生物素缀合的兔抗小鼠IgG(1:1000稀释)和VECTASTAINABC标准试剂盒(VectorLaboratoryPK-4000)反应。将碱性磷酸酶底物(NBT/BCIP储液，Roche，目录号：11681451001)稀释于0.1MTris(pH9.5)、0.1MNaCl、50mMMgCl₂中，并将其加入被感染的细胞，在RT下孵育5-30min，直到SVR3或SVR7的斑块变成紫色/黑色。来自野生SPV的斑块是白色的(阴性)，而来自SVR3和SVR7的所有斑块被证实为黑色的(阳性)(图2)。

实施例4：检测PCV2-ORF2的多克隆抗体

为了制造针对PCV2-ORF2的多克隆抗体，在大肠杆菌中表达带有PCV2-ORF2的C端区域的谷胱甘肽S转移酶(GST)融合蛋白。首先，使用作为模板的pMD18-ORF2(X/S)(实施例1)以及引物组(SEQIDNO：17和SEQIDNO：18)，通过PCR生产DNA片段。

将0.45kbp的扩增DNA用BamHI和SalI切割，并插入pGEX-6P-3(GEHealthcare，28-9546-51)的BamHI/SalⅠ位点。用测序引物pGEX-5’-SP或pGEX-3’-SP(GEHealthcare，分别为27-1410-01或27-1411-01)对候选质粒进行测序，并证实其与构建计划一致。将所得质粒命名为pGEX-TGXR2。

用pGEX-TGXR2转化大肠杆菌宿主细胞BL21(GEHealthcare，27-1542-01)，并通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导证实转化子表达约40kDa的融合蛋白。

为了生产融合蛋白以用于动物免疫，将转化子的单菌落接种到5ml等份的LB肉汤(含有50μg/ml氨苄青霉素(Amp))中，并在37℃下培养过夜，伴随振荡。第二天早上，将过夜培养物接种到1L含Amp的LB肉汤中，并在37℃下振荡培养到OD600为0.7，此时向培养物中加入终浓度为0.1mM的IPTG。将培养物在37℃下孵育另外的3小时，伴随振荡。通过在3500×g下离心20min来收集细菌，并将其重悬于20mlPBS裂解缓冲液(处于PBS中的1％TritonX-100)中。在冰上以脉冲(burst)10sec伴以停止(resting)10sec，将细菌悬浮液在冰上超声三次。将裂解物在4℃下以17,000×g离心20min，并将上清液转移到新管中。

因为目标GST融合蛋白形成包涵体，根据供应商的说明用MiniWholeGelEluter(Bio-RadLaboratories，目录号：165-1255)对其进行纯化。

在来自MiniWholeGelEluter的部分(fraction)No.7中纯化出约40kDa的目标GST融合蛋白(图3b)。将部分No.7的溶液用PBS透析。通过对大鼠进行免疫生产针对该融合蛋白的多克隆抗体。用0.1mgGST-ORF2蛋白(作为完全弗氏佐剂中的乳剂)皮下免疫5周龄的三只Wister雌性大鼠(SPF)，三周后，用与不完全弗氏佐剂混合的0.05mg相同抗原，以3周间隔对它们进行加强免疫(boosted)三次。最后一次免疫后的两周之后，对大鼠进行放血(exanguinated)，每只大鼠采集约1ml血清。

实施例5：表征由重组SPV表达的抗原性肽

进行免疫荧光分析(IFA)以确认由SVR3或SVR7表达的ORF2蛋白的定位。用rSPV(SVR3或SVR7)或亲本SPV感染ESK-4细胞。五天后，将被感染的细胞用PBS洗涤两次，在室温下用(a)丙酮/甲醇(2:1)或(b)PBS处理5min。移去丙酮/甲醇或PBS，并加入PBS以不让试样变干。将它们用PBS洗涤两次，并在37℃下与一抗[兔抗β-半乳糖苷酶(α-βGal)(CAPPEL，目录号：0631-0002)和大鼠抗PCV2-ORF2(α-ORF2)(实施例4)(PBS中1:1000稀释)]反应30min。接着，将试样用PBS洗涤三次，并在37℃下与二抗[山羊抗兔IgG(H+L)AlexaFluor488(Lifetechnology，A-11006)和抗大鼠IgG(H+L)AlexaFluor546(A-11081)(PBS中1:1000稀释)]反应30min。将试样用PBS洗涤三次，并在荧光显微镜下进行观测。

在(a)丙酮/MeOH处理的细胞的情况中，在用SVR3或SVR7各自感染的细胞中均观测到了β-半乳糖苷酶(绿色信号)和ORF2(红色信号)两种信号，因为细胞膜是可渗透的(图3a)。与此相反，在(b)未扰动细胞(intactcells)的情况中，在用SVR3感染的细胞上并未检测到β-半乳糖苷酶(绿色)和ORF2(红色)这二者，但在用SVR7感染的细胞上清楚地观测到ORF2(红色)(图3b)。这些结果有力地表明，ORF2蛋白的定位从例如由SVR3表达的原始ORF2所在的细胞内变化至由SVR7所实现的细胞外和细胞表面上。

因此，SVR7的疫苗效力比SVR3强，B5R来源的定址信号可改善针对PCV2-ORF2的免疫应答。

实施例6：体内疫苗接种的效力

用编码本发明的多肽SVR7的载体对猪进行疫苗接种。作为比较实施例，用SVR3对猪进行疫苗接种。对于免疫，注射3-5×10⁴TCID50/剂量。然后用PCV2对猪进行激发。

更具体而言，在疫苗接种前安顿3周龄的24头仔猪(无PCV2或PCV2阴性)，并将它们分成如下所示的不同的组：

SVR3组：7头仔猪，♂4，♀3。

SVR7组：7头仔猪，♂4，♀3。

非免疫组：7头仔猪，♂4，♀3。

非免疫非激发组：3头仔猪，♂3。

在4周龄时进行疫苗接种，并在免疫后2周进行PCV2激发。关于PCV2激发，注射6×10⁵TCID50的PCV2/剂量。在尸体剖检(necropsy)(PCV2激发后4周)时，收集若干器官以用于PCV2检测，包括树淋巴器官(treelymphoidorgan)、扁桃体、腹股沟-淋巴结、肠淋巴和胸腺。

疫苗接种后1周、2周和3周测定血清中的PCV2基因组拷贝数。下面给出的结果表明，本发明的疫苗诱发PCV2基因组拷贝数强烈降低。该结果表明，本发明的疫苗比基于天然ORF2序列的疫苗更有效。

表：血清中PCV2-qPCR阳性猪的百分比(阳性猪/总猪)

组	免疫前	激发前(6W)	1wpc(7W)	2wpc(8W)	3wpc(9W)
						SVR3	0％(0/7)	0％(0/7)	17％(1/6)	33％(2/6)	100％(6/6)
SVR7	0％(0/7)	0％(0/7)	0％(0/6)	0％(0/6)	67％(4/6)
						NI激发	0％(0/7)	0％(0/7)	0％(0/7)	29％(2/7)	100％(7/7)
NINC	0％(0/3)	0％(0/3)	0％(0/3)	0％(0/7)	0％(0/3)

此外，图4中所示的结果清楚地证明，SVR7诱导出强烈的抗PCV2抗体应答。该结果表明，SVR7诱导出大量针对PCV2ORF2的抗体。抗体应答比SVR3引起的抗体应答强。诱导出大量抗体应答与大幅降低的PCV2基因组拷贝数有关。

这些数据清楚地表明了本发明的多肽和载体的疫苗接种功效。

序列表

SEQIDNO:1:KTISVVTLLCVLPAVVYSTCTV

SEQIDNO:2:KTISVVTLLCVLPAVVYSTCTVPTMNNAKLTSTETS

SEQIDNO:3:

GVLNTRLSRTFGYTIKRTTVKTPSWAVDMMRFNINDFVPPGGGSNPRSVPFEYYRIRKVKVEFWPCSPITQGDRGVGSTAVILDDNFVTKATALTYDPYVNYSSRHTITQPFSYHSRYFTPKPVLDSTIDYFQPNNKRNQLWLRLQTAGNVDHVGLGTAFENSKYDQEYNIRVTMYVQFREFNLKDPPLNP

SEQIDNO:4:

KTISVVTLLCVLPAVVYSTCTVPTMNNAKLTSTETSWKKEKGVLNTRLSRTFGYTIKRTTVKTPSWAVDMMRFNINDFVPPGGGSNPRSVPFEYYRIRKVKVEFWPCSPITQGDRGVGSTAVILDDNFVTKATALTYDPYVNYSSRHTITQPFSYHSRYFTPKPVLDSTIDYFQPNNKRNQLWLRLQTAGNVDHVGLGTAFENSKYDQEYNIRVTMYVQFREFNLKDPPLNP

SEQIDNO:5:

ATGAAAACGATTTCCGTTGTTACGTTGTTATGCGTACTACCTGCTGTTGTTTATTCAACATGTACTGTACCCACTATGAATAACGCTAAATTGACGTCTACCGAAACATCGTGGAAAAAAGAGAAAGGAGTCTTGAACACCAGATTGTCTAGAACCTTCGGTTACACCATTAAGAGAACCACCGTCAAAACCCCATCTTGGGCTGTCGATATGATGAGATTCAACATCAACGATTTCGTCCCACCTGGTGGTGGATCAAACCCTAGATCCGTTCCATTCGAGTACTACAGAATCAGAAAAGTCAAAGTCGAGTTCTGGCCATGCTCTCCTATTACTCAGGGTGATAGAGGAGTTGGATCAACTGCCGTCATCTTGGATGACAACTTCGTCACTAAGGCTACTGCCTTGACCTACGATCCTTACGTCAATTACTCTAGTAGACACACCATCACCCAACCATTCTCATACCATTCCAGATACTTCACTCCAAAACCTGTCTTGGACTCAACCATCGATTACTTTCAACCAAACAACAAGAGAAACCAATTGTGGTTGAGATTGCAAACTGCCGGTAACGTCGATCATGTCGGATTGGGAACCGCCTTCGAAAACTCCAAATACGACCAGGAGTACAACATTAGAGTCACCATGTACGTCCAATTCAGAGAGTTCAACTTGAAGGACCCACCATTGAACCCATAA

SEQIDNO:6:

GGATCCACCATGAAAACGATTTCCGTTGTTACGTTGTTATGCGTACTACCTGCTGTTGTTTATTCAACATGTACTGTACCCACTATGAATAACGCTAAATTGACGTCTACCGAAACATCGTGGAAAAAAGAGAAAGGAGTCTTGAACACCAGATTGTCTAGACATTGAACCCATAAGTCGAC

SEQIDNO:7:

TCTAGAACCTTCGGTTACACCATTAAGAGAACCACCGTCAAAACCCCATCTTGGGCTGTCGATATGATGAGATTCAACATCAACGATTTCGTCCCACCTGGTGGTGGATCAAACCCTAGATCCGTTCCATTCGAGTACTACAGAATCAGAAAAGTCAAAGTCGAGTTCTGGCCATGCTCTCCTATTACTCAGGGTGATAGAGGAGTTGGATCAACTGCCGTCATCTTGGATGACAACTTCGTCACTAAGGCTACTGCCTTGACCTACGATCCTTACGTCAATTACTCTAGTAGACACACCATCACCCAACCATTCTCATACCATTCCAGATACTTCACTCCAAAACCTGTCTTGGACTCAACCATCGATTACTTTCAACCAAACAACAAGAGAAACCAATTGTGGTTGAGATTGCAAACTGCCGGTAACGTCGATCATGTCGGATTGGGAACCGCCTTCGAAAACTCCAAATACGACCAGGAGTACAACATTAGAGTCACCATGTACGTCCAATTCAGAGAGTTCAACTTGAAGGACCCACCATTGAACCCATAAGTCGAC

SEQIDNO:8:

AATATTACGGGTGCTGTTT

SEQODNO:9:

AAAAACATCGTATTCCTG

SEQIDNO:10:

CGTTCATGTTAAGCTTAACCTGAAATATTG

SEQIDNO:11:

GTTTAAACGAATTCGGTACCCTTAAAAACATCG

SEQIDNO:12:

CGCCGAGCTCGAGAATATTACGGGTGCTGTTTTTAC

SEQIDNO:13:

CCAGACTGCAGAGAACATAGGTCCTAATATAAG

SEQIDNO:14:

AATTGCCCGGGTACCGTCGATCGACTTTTTATGGCCCCCCCGGCCA

SEQIDNO:15:

AGCTTGGCCGGGGGGGCCATAAAAAGTCGATCGACGGTACCCGGGC

SEQIDNO:16:

GGATCCACCATGACGTATCCAAGGAGGCGTTACCGGAGAAGAAGACACCGCCCCCGCAGCCATCTTGGCCAGATCCTCCGCCGCCGCCCCTGGCTCGTCCACCCCCGCCACCGTTACCGCTGGAGAAGGAAAAATGGCATCTTCAACACCCGCCTCTCCCGCACCTTCGGATATACTGTCAAGCGAACCACAGTCAGAACGCCCTCCTGGGCGGTGGACATGATGAGATTCAATATTAATGACTTTCTTCCCCCAGGAGGGGGCTCAAACCCCCGCTCTGTGCCCTTTGAATACTACAGAATAAGAAAGGTTAAGGTTGAATTCTGGCCCTGCTCCCCGATCACCCAGGGTGACAGGGGAGTGGGCTCCAGTGCTGTTATTCTAGATGATAACTTTGTAACAAAGGCCACAGCCCTCACCTATGACCCCTATGTAAACTACTCCTCCCGCCATACCATAACCCAGCCCTTCTCCTACCACTCCCGCTACTTTACCCCCAAACCTGTCCTAGATTCCACTATTGATTACTTCCAACCAAACAACAAAAGAAACCAGCTGTGGCTGAGACTACAAACTGCTGGAAATGTAGACCACGTAGGCCTCGGCACTGCGTTCGAAAACAGTATATACGACCAGGAATACAATATCCGTGTAACCATGTATGTACAATTCAGAGAATTTAATCTTAAAGACCCCCCACTTAACCCTTAATAGTCGAC

SEQIDNO:17:GGTGGTGGATCCAACCCTAGATCCG

SEQIDNO:18:GGTGGGTCGACCAAGTTGAACTCTCTG

Claims (18)

1.一种含有可操作地连接至异源抗原性多肽的信号肽的多肽，所述信号肽来源于痘苗病毒的B5R基因。

2.如权利要求1所述的多肽，其中，所述信号肽包含SEQIDNO：1或与SEQIDNO：1具有至少90％一致性的序列。

3.如权利要求2所述的多肽，其中，所述信号肽包含SEQIDNO：2。

4.如权利要求1-3中任一项所述的多肽，其中，所述抗原性多肽为病毒抗原性多肽。

5.如权利要求4所述的多肽，其中，所述抗原性多肽为PCV2病毒的抗原性多肽。

6.如权利要求5所述的多肽，其中，所述抗原性多肽为PCV2病毒的ORF2或其抗原性结构域。

7.如权利要求6所述的多肽，其中，所述抗原性多肽包含SEQIDNO：3的序列或与SEQIDNO：3具有至少80％一致性的序列。

8.如权利要求1所述的多肽，所述多肽包含SEQIDNO：4的氨基酸序列。

9.如在先权利要求中任一项所述的多肽，所述多肽进一步包含N末端甲硫氨酸残基。

10.如在先权利要求中任一项所述的多肽，所述多肽为糖基化的。

11.一种细胞，所述细胞在其表面上表达在先权利要求中任一项所述的多肽。

12.编码权利要求1-9中任一项所述的多肽的核酸。

13.含有权利要求12所述的核酸的载体。

14.如权利要求13所述的载体，所述载体为病毒载体，优选为伪狂犬病病毒或猪痘病毒。

15.一种重组猪痘，所述重组猪痘在其基因组中含有权利要求12所述的核酸。

16.一种组合物，所述组合物含有权利要求1-10中任一项所述的多肽、权利要求11所述的细胞、权利要求12所述的核酸、或权利要求13-15中任一项所述的载体。

17.一种疫苗，所述疫苗含有权利要求1-10中任一项所述的多肽、权利要求11所述的细胞、权利要求12所述的核酸、或权利要求13-15中任一项所述的载体，并任选含有佐剂。

18.来源于痘苗病毒的B5R基因的信号肽用于在细胞中表达异源抗原性多肽的用途。