BR112015025898B1 - Polipeptídeo, ácido nucleico, vetor, vírus da varíola suína recombinante, composição e vacina - Google Patents

Abstract

POLIPEPTÍDEO, CÉLULA, ÁCIDO NUCLEICO, VETOR, VÍRUS DA VARÍOLA SUÍNA RECOMBINANTE, COMPOSIÇÃO, VACINA, E USO DE UM PEPTÍDEO SINAL. A presente invenção se refere a novos polipeptídeos imunogênicos e ao seu uso em composições de vacina. A invenção também se refere a ácidos nucleicos, vetores e células que expressam os polipeptídeos e os usos destes. Os polipeptídeos da invenção compreendem, mais especificamente, um domínio imunogênico e um domínio de endereçamento de membrana celular que é derivado de um gene B5R. A invenção é particularmente adequada para a produção de vacinas para animais não humanos, particularmente para a vacinação de suínos contra infecção por PCV2.

Description

[001] A presente invenção se refere a novos polipeptídeos imunogênicos e ao seu uso em composições de vacina. A invenção também se refere a ácidos nucleicos, vetores e células que expressam os polipeptídeos e os usos destes. Os polipeptídeos da invenção compreendem, mais especificamente, um domínio imunogênico e um domínio de endereçamento de membrana celular que é derivado de um gene B5R. A invenção é particularmente adequada para a produção de vacinas para animais não humanos, particularmente para a vacinação de suínos contra infecção por PCV2.

ANTECEDENTES

[002] O circovírus suíno (PCV - porcine circovirus) foi identificado, originalmente, como um contaminante de culturas de células de rim de suínos (PK15 ATCC CCL-33). O vírion do PCV foi caracterizado como sendo um vírus não envelopado, icosaédrico, com um DNA circular de fita simples de cerca de 1,76 kb. O PCV foi classificado no gênero Circovírus da família Circoviridae, que consiste em outros circovírus de animais, tais como o vírus da doença do bico e da pena dos psitacídeos, circovírus de ganso, circovírus de canário e circovírus de pombo. Foram reconhecidos dois genótipos do PCV. O PCV derivado de células PK15 foi considerado como sendo não patogênico para porcos e é designado PCV tipo 1 (PCV1). Por outro lado, o PCV tipo 2 (PCV2) foi aceito como o principal agente infeccioso envolvido em várias doenças de suínos. Doenças associadas ao PCV2 causam perdas econômicas significativas para produtores de suínos em todo o mundo. Doenças associadas ao PCV2 são descritas no documento WO2007/076520 e incluem, por exemplo, Síndrome Multissistêmica do Definhamento dos Suínos (SMDS), Síndrome da Nefropatia e Dermatite Suína (PDNS), Complexo de Doenças Respiratórias de Suínos (CRS), distúrbios reprodutivos, enterite granulomatosa, epidermite exsudativa, linfadenite necrosante e tremores congênitos. Ocorrências de PCV2 subtipo A (PCV2A) e PCV2 subtipo B (PCV2B) foram reportadas, particularmente, na Europa Ocidental em 2000 e na Europa Central em 2003. Mais recentemente, foram reportadas em 2008, mudanças similares em javalis.

[003] As vacinas contra o PCV2 desenvolvidas atualmente, como Circovac® (Merial), Ingelvac®, CircoFLEX (Boehringer Ingelheim Vetmedica), ou Suvaxyn®, ou são vacinas de PCV2 inativado ou vacinas de subunidades. Em relação às vacinas de PCV2 inativado, as cepas de PCV2 do subtipo A ou B atuais apresentam várias deficiências. Particularmente, os vírus PCV2 só podem ser produzidos em títulos baixos, em geral inferiores a 10<5> TCID50 de partículas virais por ml. Além disso, estes vírus não podem ser mantidos em culturas de tecidos e linhagens de células permanentemente infectadas. Com relação às vacinas de subunidades de PCV2, estas usam, tipicamente, uma proteína do capsídeo do PCV2 recombinante purificada, produzida por expressão do gene ORF2 do PCV2 em um sistema de baculovírus. Com relação a isso, a proteína codificada pela ORF2 de isolados do PCV2 Imp1011 foi reportada no documento EP1741785. Uma proteína codificada pela ORF2 de isolados de PCV2 PCV2Rm foi reportada no documento WO2010/061000. Uma proteína codificada pela ORF2 de isolados de PCV2 412 foi reportada no documento EP1816200. Outra proteína codificada por uma ORF2 de outro isolado de PCV2 foi reportada nos documentos EP1036180 ou EP2225367.

[004] A eficiência de expressão e imunogenicidade destas proteínas naturais do capsídeo não são, no entanto, ideais e nem sempre proporcionam o nível necessário de proteção imune em animais vacinados. Em particular, a proteína ORF2 compreende uma sequência de localização nuclear, que leva à expressão da proteína no núcleo das células. Tal localização intracelular não facilita a extração ou purificação da proteína e também pode impedir ou reduzir a eficácia de vacinas de DNA ou de vetores que expressam a proteína ORF2 in vivo em animais.

[005] O pedido de patente WO2010/068969 propõe para modificar o perfil de expressão da ORF2 para expressar um antígeno da ORF2 na forma solúvel, utilizando sequências de peptídeo sinal de secreção externa. Neste pedido de patente, é proposto fundir a ORF2 a um sinal de secreção ou a um sinal da membrana celular, e incluir no construto um local de clivagem, de modo que a ORF2 solúvel possa ser liberada na forma solúvel. Este pedido propõe uma lista profética longa de peptídeos secretores candidatos potenciais. No entanto, o pedido não contêm quaisquer dados experimentais demonstrando que uma imunogenicidade/expressão melhorada ou eficaz pode ser obtida através da modificação do perfil de expressão de uma ORF2. Não é divulgado nenhum construto que permite uma imunização eficaz.

[006] A presente invenção propõe novos construtos melhorados para expressar polipeptídeos antigênicos. A presente invenção divulga produtos de fusão que são especificamente adaptados para a expressão melhorada de polipeptídeos antigênicos na superfície celular, especialmente utilizando um vetor de expressão viral, tal como um vírus da varíola suína.

[007] A invenção mostra que, ao expressar um polipeptídeo antigênico na superfície de células infectadas/transduzidas utilizando um sinal de endereçamento derivado de B5R, é obtida uma resposta imune melhorada, causando uma proteção eficaz. Ao apresentar o antígeno na superfície da célula in vivo no animal, as vacinas da invenção entregam e expõem, mais eficazmente, o antígeno ao sistema imune, particularmente, a células do sistema imune tais como linfócitos, células dendríticas e macrófagos. Ao apresentar o antígeno na superfície celular, a invenção proporciona o agente imunogênico, em uma conformação ativa, para induzir uma resposta imune protetora potente. A invenção pode ser aplicada a qualquer polipeptídeo antigênico, particularmente, antígenos virais.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[008] O presente pedido de patente proporciona um polipeptídeo compreendendo um peptídeo sinal derivado do gene B5R de um vírus Vaccinia, ligado operativamente a um polipeptídeo antigênico heterólogo.

[009] Em uma modalidade particular o peptídeo sinal compreende a SEQ ID NO: 1 ou uma sequência tendo, pelo menos, 90 % de identidade com a SEQ ID NO: 1. O polipeptídeo antigênico pode ser um antígeno viral, bacteriano ou parasitário. De preferência, ele é um antígeno viral, mais particularmente, uma proteína do capsídeo ou um domínio imunogênico desta.

[010] Em uma modalidade particular, o polipeptídeo antigênico é uma ORF2 de um vírus PCV2, ou um domínio antigênico desta. Uma modalidade preferida utiliza um polipeptídeo antigênico que compreende a sequência SEQ ID NO: 3 ou uma sequência tendo, pelo menos, 80 % de identidade com a SEQ ID NO: 3.

[011] O polipeptídeo da invenção pode ser sintético ou recombinante e pode compreender modificações pós-transcricionais, tais como glicosilação, adição de grupos químicos, etc. Mais de preferência, o polipeptídeo da invenção é desprovido de um local de clivagem entre o peptídeo de endereçamento e o peptídeo antigênico.

[012] Outro objeto da invenção é uma célula que expressa, na sua superfície, um polipeptídeo conforme definido acima.

[013] Ainda outro objeto da invenção se refere a um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo conforme definido acima.

[014] Outro objeto da invenção é um vetor compreendendo um ácido nucleico da invenção. De preferência, o vetor é um vector viral tal como, mais de preferência, um vírus da pseudo-raiva (PRV) ou um vírus da varíola suína (SPV). O uso de um vírus da varíola suína é particularmente vantajoso, uma vez que o peptídeo sinal derivado de um vírus Vaccinia tem compatibilidade melhorada com o vírus da varíola suína.

[015] Outro objeto adicional da invenção reside em uma composição compreendendo um polipeptídeo, uma célula, um ácido nucleico, ou um vetor, conforme definido acima.

[016] Outro objeto adicional da invenção é uma vacina compreendendo um polipeptídeo, uma célula, um ácido nucleico, ou um vetor, conforme definido acima e, opcionalmente, um adjuvante.

[017] A presente invenção também se refere a métodos para imunizar ou induzir uma resposta imune em animais não humanos (por exemplo, suínos), compreendendo a administração ao dito animal de um polipeptídeo, ácido nucleico, célula, vetor ou vacina conforme descrito acima.

[018] A presente invenção também se refere a métodos para o tratamento e/ou prevenção de doenças associadas ao PCV2 em animais não humanos (por exemplo, suínos), compreendendo a administração ao dito animal de um polipeptídeo, ácido nucleico, célula, vetor ou vacina conforme descrito acima.

[019] A invenção também se refere ao uso de um peptídeo sinal derivado do gene B5R de um vírus Vaccinia, para a expressão de um polipeptídeo antigênico heterólogo em uma célula.

[020] A invenção pode ser utilizada para induzir uma resposta imune e/ou para vacinar qualquer animal não humano. Ela é particularmente útil para vacinar suínos contra a infecção por PCV2 ou doenças causadas por PCV2.

LEGENDA DAS FIGURAS

[021] Figura 1: Esquema de construção do plasmídeo homólogo, pSP72-Ess_ORF2.

[022] Figura 2: Ensaio em placa negra de rSPV (SVR3, SVR7) usando o anticorpo monoclonal 36F1. Células ESK- 4 foram infectadas com SPV parental ou recombinantes (SVR3 ou SVR7). Seis dias depois, as células foram submetidas a ensaio em placa negra utilizando o anticorpo monoclonal 36F1 (1:500), IgG anti-camundongo de coelho conjugada com biotina e ABC-ALP (Vecterstain).

[023] Figura 3: IFA de células infectadas por SPV. Células ESK-4 foram infectadas com rSPV (SVR3 ou SVR7) ou SPV parental. Cinco dias depois, as células infectadas foram tratadas com acetona/metanol (a) ou nada (b) e reagidas com anticorpos primários [anti-ü-galactosidase de coelho —- □Gal) e anti-PCV2-ORF2 de rato (D-ORF2) (1:1000)] e anticorpos secundários [IgG anti-coelho de cabra Alexa Fluor 488 e IgG anti-rato de cabra Alexa Fluor 546 (1:1000)].

[024] Figura 4: Títulos sorológicos IF contra PCV2. Células RPL-2 infectadas por Rm40 foram revestidas em cada poço de placas de 96 poços. As células foram fixadas com acetona/metanol e diluições de duas vezes de soros foram incubadas, durante 1 hora, após o bloqueio (0,5 % de leite desnatado em PBS). Anticorpos IgG-FITC anti-porco produzidos em coelho (SIGMA n° de catálogo: F1638, 1:1000) foram utilizados como anticorpos secundários. O título IF do soro de porco positivo padrão, PAB-PCV2 (VMRD) foi 2560.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[025] A presente invenção se refere a novos polipeptídeos imunogênicos e aos seus usos, particularmente em composições de vacina. A invenção também se refere a ácidos nucleicos, vetores e células que expressam os polipeptídeos e os usos destes. Os polipeptídeos da invenção compreendem, mais especificamente, um domínio imunogênico e um domínio de endereçamento de membrana celular que são ligados operativamente, em que o domínio de endereçamento de membrana celular é derivado de um gene B5R. A invenção é particularmente adequada para a produção de vacinas para animais não humanos, particularmente para a vacinação de suínos contra infecção por PCV2.

PEPTÍDEO DE ENDEREÇAMENTO DE MEMBRANA CELULAR DERIVADO DE B5R

[026] O termo "derivado de" indica que a sequência do peptídeo de endereçamento é idêntica ou substancialmente similar à sequência do peptídeo sinal de um gene B5R de um vírus Vaccinia. Em uma modalidade preferida, o peptídeo de endereçamento compreende uma sequência tendo, pelo menos, 90 % de identidade com a sequência do peptídeo sinal de um gene B5R de um vírus Vaccinia, ainda mais de preferência, pelo menos, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 % de identidade de sequência.

[027] Um exemplo mais preferido de uma sequência de um peptídeo sinal de um gene B5R é a SEQ ID NO: 1 ou uma sequência com uma identidade de, pelo menos, 90 % com a SEQ ID NO: 1, mais de preferência, pelo menos 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 % de identidade com a SEQ ID NO: 1. Consequentemente, em uma modalidade particular, o polipeptídeo da invenção compreende uma sequência de peptídeo sinal que compreende a SEQ ID NO: 1 ou uma sequência tendo, pelo menos, 90 % de identidade com a SEQ ID NO: 1.

[028] O peptídeo sinal pode compreender outros aminoácidos derivados do gene B5R, desde que estes aminoácidos não alterem as propriedades de endereçamento de membrana do peptídeo. Com relação a isso, em uma modalidade particular, o peptídeo sinal compreende a SEQ ID NO: 2. Os aminoácidos 23-36 da SEQ ID NO: 2 não participam substancialmente na função de endereçamento de membrana. No entanto, os resultados apresentados mostram que estes aminoácidos facilitam a estabilização e a conformação correta do polipeptídeo de fusão.

[029] Alternativamente, ou adicionalmente, o peptídeo sinal pode compreender outros aminoácidos que não são derivados do gene B5R, desde que estes aminoácidos não alterem as propriedades de endereçamento de membrana do peptídeo. Estes aminoácidos podem ter utilidade de clonagem (por exemplo, sítios de restrição), ou podem participar na estabilidade do polipeptídeo.

[030] De preferência, o peptídeo sinal não compreende mais do que 100 aminoácidos, ainda mais de preferência, não mais do que 50 aminoácidos.

[031] Conforme indicado acima, a invenção inclui peptídeos sinais compreendendo uma sequência tendo, pelo menos, 90 % de identidade com a SEQ ID NO: 1 ou 2. O grau de homologia entre duas sequências de aminoácidos ou de ácidos nucleicos pode ser determinado por meio de programas de computador conhecidos per se no estado da técnica, tal como GAP fornecido no pacote do programa GCG (Manual do Programa para o Pacote Wisconsin, Versão 8, Agosto de 1996, Genetics Computer Group, 575 Ciência Drive, Madison, Wisconsin, EUA, 5371 1) (Needleman, S. B. e Wunsch, CD., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453). Utilizando o GAP com as seguintes configurações para a comparação de sequências de DNA: penalidade de criação de lacunas de 5,0 e penalidade de extensão de lacuna de 0,3. Moléculas de ácidos nucleicos/aminoácidos podem ser alinhadas umas com as outras usando o software de alinhamento Pileup, disponível como parte do pacote do programa GCG, usando, por exemplo, as configurações padrão de penalização de criação de lacuna 5 e penalidade de largura de lacuna de 0,3.

[032] Condições experimentais adequadas para determinar se uma dada molécula de ácido nucleico se hibridiza com um ácido nucleico especificado envolvem a pré- imersão de um filtro contendo uma amostra relevante do ácido nucleico a ser examinado em 5 x SSC durante 10 minutos, e pré-hibridação do filtro em uma solução de 5 x SSC, 5 x solução de Denhardt, SDS a 0,5% e 100 [mu]g/ml de DNA de esperma de salmão sonicado desnaturado, seguido por hibridação na mesma solução contendo uma concentração de 10 ng/ml de uma sonda marcada com P-dCTP durante 12 horas a, aproximadamente, 45 °C, de acordo com os métodos de hibridação conforme descrito em Sambrook et al. (1989; Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbour, New York). O filtro, então, é lavado duas vezes durante 30 minutos em 2 x SSC, SDS a 0,5% a, pelo menos, 55 °C (estringência baixa), a pelo menos, 60 °C (estringência média), a pelo menos, 65 °C (estringência média/alta), pelo menos 70 °C (extringência alta), ou, pelo menos, 75 °C (estringência muito alta). A hibridação pode ser detectada pela exposição do filtro a um filme de raios-x.

[033] Em uma modalidade preferida, o peptídeo sinal compreende a SEQ ID NO: 1 ou 2.

[034] Em uma modalidade particular, o peptídeo sinal consiste na SEQ ID NO: 1 ou 2.

POLIPEPTÍDEOS ANTIGÊNICOS

[035] A invenção pode ser usada com qualquer polipeptídeo antigênico, ou seja, com qualquer polipeptídeo compreendendo um ou mais epítopos que podem causar uma resposta imune. O polipeptídeo pode ser uma proteína completa, um fragmento de uma proteína ou um peptídeo pequeno de, por exemplo, 10 aminoácidos. De preferência, o polipeptídeo antigênico compreende menos do que cerca de 500 aminoácidos.

[036] O polipeptídeo antigênico é "heterólogo" com relação ao peptídeo sinal, o que significa que o polipeptídeo antigênico não está associado naturalmente ao peptídeo sinal na natureza. Tipicamente, o polipeptídeo antigênico não é a sequência de uma proteína do B5R. O termo heterólogo indica, por exemplo, que o polipeptídeo antigênico é proveniente de um vírus diferente de um vírus Vaccinia, ou de uma proteína diferente de uma proteína do B5R, por exemplo.

[037] O polipeptídeo antigênico pode ser um polipeptídeo antigênico de um agente viral, celular (por exemplo, bacteriano) ou parasitário.

[038] Com relação a isso, conforme indicado acima, em uma modalidade preferida o polipeptídeo antigênico é uma proteína ORF2 de um vírus PCV2, ou um domínio antigênico desta.

[039] A proteína ORF2 do isolado de PCV2 Imp1011 foi reportada no documento EP1741785. A proteína ORF2 do isolado de PCV2 PCV2Rm foi reportada no documento WO2010/061000. A proteína ORF2 do isolado de PCV2 412 foi reportada no documento EP1816200. Outra proteína ORF2 de outro isolado de PCV2 foi reportada nos documentos EP1036180 ou EP2225367. Todas estas proteínas ORF2 estão contempladas para uso na presente invenção.

[040] Em uma modalidade preferida, a proteína ORF2 para uso na invenção compreende a SEQ ID NO: 3 ou qualquer sequência com uma identidade de, pelo menos, 80 % com a SEQ ID NO: 3, ainda mais de preferência, pelo menos, 82, 84, 86, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 % de identidade com a SEQ ID NO: 3.

[041] Tipicamente, as proteínas ORF2 de PCV2 compreendem cerca de 234 aminoácidos. A sequência compreende uma sequência de localização nuclear que, geralmente, corresponde aos aminoácidos 1-42 da sequência.

[042] É preferível, para a presente invenção, utilizar uma porção de uma proteína ORF2 que é desprovida da sequência de localização nuclear nativa (ou seja, a sequência nos resíduos 1 a 42 de uma ORF2 nativa) e substituir esta sequência pelo peptídeo de endereçamento de membrana. A SEQ ID NO: 3 é uma sequência de aminoácidos de uma proteína ORF2 desprovida da sequência de localização nuclear.

[043] Uma sequência com uma identidade com a SEQ ID NO: 3 e retendo atividade imunogênica ao PCV2 pode ser derivada artificialmente ou obtida a partir dos sorotipos de PCV2 listados acima, ou a partir de outros sorotipos distintos. Tipicamente, os primeiros 42 aminoácidos da proteína ORF2 são removidos para suprimir a função de localização nuclear.

[044] Conforme indicado, a invenção pode ser usada com polipeptídeos imunogênicos de outros antígenos virais ou patogênicos, tais como, por exemplo, qualquer proteína (por exemplo, glicoproteína, proteína do capsídeo, ou fragmento antigênico desta) de um vírus ou patógeno selecionado dentre, por exemplo, Actinobacillus pleuropneunomia; Adenovirus; Alphavirus tal como os vírus da encefalomielite equina do leste; Balantidium coli; Bordetella bronchiseptica; Brachyspira spp., de preferência, B. hyodyentheriae, B.pilosicoli, B. innocens, Brucella suis, de preferência, biovares 1 ,2 e 3; vírus da peste suína clássica, vírus da peste suína africana; Chlamydia e Chlamydophila sp. e, de preferência, C. pecorum e C. abortus; Clostridium spp., de preferência, Cl. difficile, Cl. perfringens tipos A, B e C, Cl. novyi, Cl. septicum, Cl. tetani; Coronavirus digestivo e respiratório; Cryptosporidium parvum ; Eimeria spp; Eperythrozoonis suis, denominado atualmente de Mycoplasma haemosuis; Erysipelothrix rhusiopathiae; Escherichia coli; Haemophilus parasuis, de preferência, subtipos 1 ,7 e 14; vírus da encefalomielite hemaglutinante; Isospora suis; vírus da encefalite japonesa; Lawsonia intracellulars; Leptospira spp., de preferência, Leptospira australis, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagicae, Leptospira interrogans, Leptospira Pomona e Leptospira tarassovi; Mannheimia haemolytica ; Mycobacterium spp., de preferência, M. avium, M. intracellular e M.bovis: Mycoplasma hyopneumoniae; Parvovirus; Pasteurella multocida; Citomegalovirus suíno; Parvovirus suíno, e vírus da síndrome respiratória e reprodutiva de suínos: Vírus da pseudo-raiva; rotavírus; vírus Sagiyama; Salmonella spp., de preferência, S. enterica, S. typhimurium e S. choleraesuis; Staphylococcus spp., de preferência, S. hyicus; Streptococcus spp., de preferência, Strep. suis; citomegalovírus suíno; vírus do herpes suíno; vírus da gripe suína; vírus da varíola suína; Toxoplasma gondii; vírus da estomatite vesicular ou vírus do exantema de suínos; ou outros isolados e subtipos de circovírus suíno.

PRODUÇÃO E MONTAGEM DO POLIPEPTÍDEO

[045] O polipeptídeo da invenção compreende, geralmente, um peptídeo de endereçamento de membrana celular ligado operativamente a um polipeptídeo antigênico. O termo "operativamente ligado" indica que os dois domínios são fundidos um ao outro, diretamente ou indiretamente, de uma maneira que permite o endereçamento do polipeptídeo a uma membrana celular e a expressão do polipeptídeo antigênico no exterior de uma célula.

[046] Mais de preferência, o peptídeo de endereçamento de membrana celular está localizado no N- terminal e o polipeptídeo imunogênico está localizado no C- terminal. Ambos os domínios são ligados covalentemente, de preferência, por uma ligação amino. Consequentemente, o polipeptídeo da invenção compreende, de preferência, de N -> C-ter: . o peptídeo de endereçamento de membrana celular, . o polipeptídeo imunogênico.

[047] O polipeptídeo pode compreender, ainda, domínios ou sequências adicionais. Por exemplo, o polipeptídeo pode compreender uma sequência de ligação entre o peptídeo de endereçamento de membrana celular e o polipeptídeo imunogênico. De preferência, no entanto, os dois domínios estão ligados diretamente, sem uma sequência de ligação. Além disso, em uma modalidade preferida, o polipeptídeo é desprovido de um local de clivagem, de modo que o polipeptídeo imunogênico é exposto na superfície da célula e, essencialmente, não liberado na forma solúvel.

[048] Um exemplo preferido e específico de um polipeptídeo da invenção compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.

[049] O polipeptídeo da invenção pode compreender, ainda, um resíduo de metionina N-terminal.

[050] O polipeptídeo da invenção pode ser glicosilado.

[051] Os polipeptídeos da invenção podem ser produzidos por um processo sintético, ou por meios recombinantes. De preferência, os polipeptídeos da invenção são concebidos para serem produzidos/expressos diretamente em células ou em organismos completos, por expressão de uma molécula de ácido nucleico de codificação. Com efeito, o novo perfil de expressão dos polipeptídeos da presente invenção é particularmente adaptado para a concepção de vacinas de DNA ou de vetores, que compreendem uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da invenção. Após a introdução em um organismo, o ácido nucleico entra na célula e expressa o polipeptídeo, que fica exposto na superfície da célula e apresenta imunogenicidade melhorada. Conforme será discutido abaixo, o ácido nucleico pode estar nu, ou formulado com qualquer vetor adequado. Alternativamente, a invenção pode utilizar vacinas de células, em que o polipeptídeo é expresso na superfície das células da cultura e as células resultantes são utilizadas como uma composição de vacina.

[052] Portanto, a invenção também abrange e utiliza moléculas de ácido nucleico que codificam polipeptídeos, conforme definido acima.

ÁCIDO NUCLEICO

[053] Outro objeto adicional da invenção se refere a um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo conforme definido acima. O ácido nucleico pode ser utilizado para produzir o polipeptídeo in vitro, ou para produzir células que expressam o polipeptídeo na sua superfície, ou para produzir vacinas em que o agente ativo é o ácido nucleico ou um vetor contendo o ácido nucleico.

[054] O ácido nucleico da invenção pode ser DNA ou RNA, de fita simples ou dupla. O ácido nucleico é, tipicamente, cDNA ou RNA. O ácido nucleico pode ser produzido por técnicas bem conhecidas no estado da técnica, tais como síntese, ou clonagem, ou amplificação da sequência que codifica o polipeptídeo imunogênico; síntese, ou clonagem, ou amplificação da sequência que codifica a sequência de endereçamento de membrana celular; ligação das sequências e a sua clonagem/amplificação em vetores e células apropriadas.

[055] Em uma modalidade particular, a invenção se refere a uma molécula de ácido nucleico compreendendo a SEQ ID NO: 5.

VETOR

[056] As moléculas de ácido nucleico de acordo com a invenção podem ser fornecidas na forma de uma molécula de ácido nucleico, per se, tal como moléculas de ácidos nucleicos nus; um vetor; vírus ou célula hospedeira, etc., tanto de origem procariótica como eucariótica. Os vetores incluem vetores de expressão que contêm uma molécula de ácido nucleico da invenção. Os vetores da presente invenção podem, por exemplo, compreender um promotor de transcrição e/ou um terminador de transcrição, em que o promotor está ligado operativamente com a molécula de ácido nucleico e em que a molécula de ácido nucleico está ligada operativamente com o terminador de transcrição.

[057] Com relação a isso, um objeto particular da invenção é um vetor viral compreendendo um ácido nucleico, conforme definido acima. O vetor viral pode ser derivado de diferentes tipos de vírus, tais como, de preferência, vírus da varíola suína, vírus da varíola aviária, vírus da pseudo- raiva, vírus de Aujesky, salmonela, vírus Vaccinia, BHV (Vírus do Herpes Bovino), HVT (Vírus do Herpes da Turquia), adenovírus, TGEV (Coronavírus da gastroenterite transmissível), Erythrovirus, e SIV (Vírus da Imunodeficiência Símia).

[058] Em uma modalidade preferida, o vetor é um vírus recombinante da varíola suína. O vírus da varíola suína (SPV) é apenas ligeiramente patogênico em suínos e induz uma resposta imune protetora. Assim, o SPV é um excelente candidato para vetor viral em suínos. O procedimento geral para a criação de SPV recombinante foi descrito em várias referências (Vet Rec. de 01 de janeiro de 1994; 134(1): 13 8). Em um método típico, a primeira etapa na construção de um SPV recombinante é criar plasmídeos homólogos, que podem direcionar a inserção da(s) unidade(s) de transcrição para o gene do polipeptídeo antigênico da presente invenção, no genoma do SPV. A inserção ocorre por recombinação homóloga e, por isso, requer que o DNA inserido seja ladeado por uma região genômica do SPV contígua. No caso de SPV recombinantes, o gene da timidina quinase (TK) foi selecionado, primeiramente, como o local de inserção e provou ser uma região não essencial para a replicação do vírus. Visto que o mecanismo de transcrição do vírus da família Poxviridae (poxvírus) não reconhecerá promotores de células hospedeiras, o gene do polipeptídeo antigênico da presente invenção é ligado, de preferência, a promotores de poxvírus. Promotores do vírus Vaccinia, tais como P11 ou P7.5 são preferidos para a expressão em um SPV recombinante, mas podem ser utilizados outros promotores de poxvírus. Uma vez que o plasmídeo homólogo tenha sido gerado, este é transfectado em células competentes, tais como células embrionárias de rim de suínos (ESK-4) ou células de rim de porco (PK-15), que tenham sido previamente infectadas com SPV. Os recombinantes são gerados por recombinação homóloga entre os genomas do SPV replicante e do plasmídeo transfectado. O SPV recombinante pode ser selecionado/selecionado utilizando técnicas convencionais. Um método de identificação utiliza o gene lacZ de Escherichia coli como um marcador. Neste caso, um substrato cromogênico, 5-bromo-4-cloro-3-indolil β-D- galactosídeo (X-gal), que é convertido a um composto azul pela ação da enzima expressa (β-galactosidase), é então utilizado para identificar as placas de vírus produzidas pelo vírus recombinante na prole, contra um fundo de placas incolores geradas por vírus não recombinantes. No caso de não haver um gene marcador, a produção do polipeptídeo antigênico expresso pelo SPV recombinante pode ser verificada utilizando anticorpos específicos contra o polipeptídeo antigênico, em um ensaio de imunofluorescência. Utilizando os protocolos mencionados acima, pode ser gerado um SPV recombinante que expressa o polipeptídeo antigênico da presente invenção.

[059] Outros sistemas de expressão e vetores também podem ser utilizados, tais como plasmídeos que se replicam e/ou se integram em células de levedura.

[060] A invenção também se refere a um método para a preparação de um polipeptídeo da invenção, tal método compreendendo a cultura de uma célula hospedeira contendo um ácido nucleico ou vetor, conforme definido acima, em condições adequadas para a expressão do ácido nucleico e recuperação do polipeptídeo. Conforme indicado acima, as proteínas e peptídeos podem ser purificados de acordo com técnicas conhecidas per se no estado da técnica. A invenção também proporciona kits de expressão compreendendo (a) uma célula hospedeira (de preferência, células de inseto ou células de levedura), (b) meios para a expressão de um polipeptídeo da invenção, por exemplo, compreendendo um sistema vetor capaz de ser replicado na dita célula e (c) meios para recuperar a proteína ou peptídeo da invenção.

COMPOSIÇÕES DE VACINA

[061] O termo "vacina", conforme utilizado aqui, inclui um agente que pode ser utilizado para provocar, estimular ou amplificar o sistema imune de animais (por exemplo, porcos) contra um agente patogênico. As vacinas da invenção são capazes de estimular ou provocar ou amplificar a imunidade contra um vírus PCV2.

[062] O termo "imunização" inclui o processo de fornecimento de um agente imunogênico a um sujeito. A imunização pode, por exemplo, permitir um nível constante elevado de anticorpos e/ou resposta celular, na qual os linfócitos T podem matar ou suprimir o patógeno no animal não humano imunizado, tal como o porco, que é direcionado contra um patógeno ou antígeno ao qual o animal tenha sido exposto previamente.

[063] As vacinas da invenção compreendem uma quantidade imunologicamente eficaz de um polipeptídeo, célula ou ácido nucleico, conforme descrito acima, em um veículo farmaceuticamente aceitável. Como um resultado da vacinação com uma composição da invenção, os animais se tornam, pelo menos, parcialmente ou completamente, imunes à infecção por PCV2, ou resistentes ao desenvolvimento de infecções por PCV2 moderadas ou graves. Vacinas contra PCV2 podem ser utilizadas para induzir uma resposta humoral e/ou uma resposta celular.

[064] Infecções por PCV2 ou doenças associadas incluem, entre outras, Síndrome Multissistêmica do Definhamento dos Suínos (SMDS), Dermatite Suína e Síndrome da Nefropatia (PDNS), Complexo da Doença Respiratória Suína (PRDC), distúrbios reprodutivos, enterite granulomatosa, epidermite exsudativa, linfadenite necrosante e tremores congênitos. De preferência, um sujeito animal não humano, tal como porco, é protegido em uma extensão em que um a todos os sintomas ou efeitos fisiológicos adversos das infecções por PCV2 são significativamente reduzidos, melhorados ou totalmente evitados.

[065] A presente invenção também se refere a uma vacina de combinação compreendendo um polipeptídeo, ácido nucleico ou uma célula da invenção, em combinação com, pelo menos, um antígeno proteico adicional [Gupi P. S. Nayar et al. (Can. Vet. J, vol. 38, 1997: 385-387) e Clark E. G. (Proc. Am. Assoc. Swine Prac. 1997; 499-501)].

[066] Na prática, a quantidade exata necessária para uma dose imunologicamente eficaz pode variar de sujeito para sujeito, dependendo de fatores tais como a idade e condição geral do sujeito, da natureza da formulação e do modo de administração. A "quantidade eficaz" apropriada pode ser determinada por um técnico com conhecimento ordinário do assunto utilizando apenas experimentação de rotina. Por exemplo, são conhecidos métodos no estado da técnica para determinar ou titular as dosagens adequadas de vacina, para encontrar as dosagens mínimas eficazes com base no peso do sujeito animal não humano, concentração da vacina e outros fatores típicos.

[067] Em uma modalidade típica, a vacina compreende uma dose unitária compreendida entre 0,1 a 50 μg, de preferência, entre 0,1 e 25, ainda mais de preferência, entre 1 e 15 μg, tipicamente, aproximadamente 10 μg de antígeno de polipeptídeo ou ácido nucleico da invenção.

[068] A dosagem da vacina, a concentração dos componentes nesta e o momento de administrar a vacina que provocam uma resposta imune adequada podem ser determinados por métodos tal como titulações de anticorpos em soros, por exemplo, por ELISA e/ou por análise de ensaio de neutralização de soro e/ou por avaliação de desafio de vacinação.

[069] Em uma modalidade particular, a vacina compreende o polipeptídeo da invenção na forma purificada, opcionalmente em combinação com qualquer excipiente ou veículo adequado.

[070] Em outra modalidade particular, a vacina compreende o ácido nucleico da invenção, conforme definido acima, opcionalmente em combinação com qualquer excipiente ou veículo adequado. Uma vacina mais preferida compreende um vetor viral contendo um ácido nucleico conforme definido acima. Outra vacina preferida compreende um vírus da varíola suína, que compreende um ácido nucleico conforme definido acima.

[071] As vacinas podem compreender outros ingredientes conhecidos per se por um especialista na técnica, tal como veículos, excipientes, diluentes, adjuvantes, estabilizantes de liofilização, agentes umectantes ou emulsionantes, agentes de tamponamento de pH, gelificantes ou aditivos melhoradores de viscosidade e conservantes farmaceuticamente aceitáveis, dependendo da via de administração.

[072] Exemplos de veículos, excipientes ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, água destilada ou desmineralizada; soro fisiológico; óleos a base de vegetais, tais como óleo de amendoim, óleo de arachis, óleo de cártamo, azeite de oliva, óleo de semente de algodão, óleo de milho, óleo de sésamo, ou óleo de coco; óleos de silicone, incluindo polissiloxanos, tais como polissiloxano de metila, polissiloxano de fenila e polissiloxano de metilfenila; silicones voláteis; óleos minerais, tais como óleo de parafina líquida leve, ou óleo de parafina líquida pesado; esqualeno; derivados de celulose, tais como metilcelulose, etilcelulose, carboximetilcelulose, sal de sódio de carboximetilcelulose, ou hidroxipropilmetilcelulose; alcanóis inferiores, por exemplo, etanol ou isopropanol; aralcanóis inferiores; polialquilenoglicóis inferiores ou alquilenoglicóis inferiores, por exemplo, polietilenoglicol, polipropilenoglicol, etilenoglicol, propilenoglicol, 1,3- butileno-glicol ou glicerina; ésteres de ácidos graxos, tal como palmitato de isopropila, miristato de isopropila ou oleato de etila; polivinilpirrolidona; ágar; carragena; goma tragacanto ou goma de acácia, e vaselina. Tipicamente, o veículo ou veículos formam de 10 % a 99,9 % em peso, da composição da vacina e podem ser tamponados por métodos convencionais, utilizando reagentes conhecidos no estado da técnica, tal como hidrogenofosfato de sódio, dihidrogenofosfato de sódio, hidrogenofosfato de potássio, dihidrogenofosfato de potássio, uma mistura dos mesmos, e semelhantes.

[073] Exemplos de adjuvantes incluem, mas não estão limitados a, emulsões óleo em água, hidróxido de alumínio (alúmen), complexos imunoestimulantes, polímeros ou copolímeros de bloco não iônicos, citocinas (como IL-1, IL-2, IL-7, IFN-[alfa], IFN-[beta], IFN-y, etc.), saponinas, monofosforil lipídio A (MLA), dipeptídeos de muramila (MDP) e semelhantes. Outros adjuvantes adequados incluem, por exemplo, sulfato de alumínio e potássio, enterotoxina(s) termo-lábil ou estável termicamente, isolada(s) a partir de Escherichia coli, toxina da cólera ou a subunidade B desta, toxina da difteria, toxina do tétano, toxina da tosse convulsa, adjuvante completo ou incompleto de Freund, etc. Adjuvantes à base de toxinas, tal como a toxina da difteria, a toxina do tétano e a toxina da tosse convulsa podem ser inativados antes do uso, por exemplo, por tratamento com formaldeído.

[074] Exemplos de estabilizante de liofilização podem ser, por exemplo, carboidratos tal como sorbitol, manitol, amido, sacarose, dextrano ou glicose, proteínas tal como albumina ou caseína, e seus derivados.

[075] Adicionalmente, as vacinas podem compreender, pelo menos, um agente imunogênico de, pelo menos, um patógeno adicional, por exemplo, um patógeno de porco tal como Actinobacillus pleuropneunomia; Adenovirus; Alphavirus tal como os vírus da encefalomielite equina do leste; Balantidium coli; Bordetella bronchiseptica; Brachyspira spp., de preferência, B. hyodyentheriae, B.pilosicoli, B. innocens, Brucella suis, de preferência, biovares 1 ,2 e 3; vírus da peste suína clássica, vírus da peste suína africana; Chlamydia e Chlamydophila sp. e, de preferência, C. pecorum e C. abortus; Clostridium spp., de preferência, Cl. difficile, Cl. perfringens tipos A, B e C, Cl.novyi, Cl.septicum, Cl.tetani; Coronavirus digestivo e respiratório; Cryptosporidium parvum ; Eimeria spp; Eperythrozoonis suis, denominado atualmente de Mycoplasma haemosuis; Erysipelothrix rhusiopathiae; Escherichia coli; Haemophilus parasuis, de preferência, subtipos 1 ,7 e 14; vírus da encefalomielite hemaglutinante; Isospora suis ; vírus da encefalite japonesa; Lawsonia intracellulars; Leptospira spp., de preferência, Leptospira australis, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagicae, Leptospira interrogans, Leptospira Pomona e Leptospira tarassovi; Mannheimia haemolytica ; Mycobacterium spp., de preferência, M. avium, M. intracellular e M. bovis: Mycoplasma hyopneumoniae; Parvovírus; Pasteurella multocida; Citomegalovirus suíno; Parvovírus suíno, e vírus da síndrome respiratória e reprodutiva de suínos: Vírus da pseudo-raiva; rotavírus; vírus Sagiyama; Salmonella spp., de preferência, S. enterica, S. typhimurium e S. choleraesuis; Staphylococcus spp., de preferência, S. hyicus; Streptococcus spp., de preferência Strep. suis; citomegalovírus suíno; vírus do herpes suíno; vírus da gripe suína; vírus da varíola suína; Toxoplasma gondii; vírus da estomatite vesicular e vírus do exantema de suínos; ou outros isolados e subtipos de circovírus suíno.

[076] As composições ou vacinas da invenção podem ser formulações líquidas, tal como uma solução aquosa, uma emulsão água-em-óleo ou óleo-em-água, um xarope, um elixir, uma tintura, uma preparação para administração parentérica, subcutânea, intradérmica, intramuscular ou intravenosa (por exemplo, administração injetável), tal como suspensões ou emulsões estéreis. Tais formulações são conhecidas na técnica e são tipicamente preparadas por dissolução do antígeno e outros aditivos típicos no veículo ou sistemas de solventes apropriados. As formulações líquidas também podem incluir suspensões e emulsões que contêm agentes de suspensão ou emulsionantes.

[077] A via de administração pode ser percutânea, administração por via mucosal, ou por via parentérica (intradérmica, intramuscular, subcutânea, intravenosa, ou intraperitoneal). As composições de vacinas de acordo com a presente invenção podem ser administradas sozinhas, ou podem ser coadministradas ou administradas sequencialmente com outros tratamentos ou terapias.

[078] A presente invenção também se refere a métodos para imunizar ou induzir uma resposta imune em animais não humanos (por exemplo, porcos), compreendendo a administração ao dito animal de um polipeptídeo, ácido nucleico, célula, vetor ou vacina conforme descrito acima.

[079] A presente invenção também se refere a métodos para o tratamento e/ou prevenção de doenças associadas ao PCV2 em animais não humanos (por exemplo, porcos), compreendendo a administração ao dito animal de um polipeptídeo, ácido nucleico, célula, vetor ou vacina conforme descrito acima.

[080] Conforme mencionado acima, infecções por PCV2 ou doenças associadas incluem, entre outras, Síndrome Multissistêmica do Definhamento dos Suínos (SMDS), Dermatite Suína e Síndrome da Nefropatia (PDNS), Complexo da Doença Respiratória Suína (PRDC), distúrbios reprodutivos, enterite granulomatosa, epidermite exsudativa, linfadenite necrosante e tremores congênitos.

[081] A vacina da invenção pode ser convenientemente administrada por via intranasal, por via transdérmica (isto é, aplicado sobre ou na superfície da pele para absorção sistêmica), parenteralmente, ocularmente, etc. A via de administração parentérica inclui, mas não está limitada a, administração intramuscular, intravenosa, intraperitoneal e semelhantes.

[082] A dosagem das vacinas da presente invenção dependerá da espécie, raça, idade, tamanho, histórico de vacinação, estado de saúde do animal a ser vacinado, bem como da via de administração, ou seja, administração subcutânea, intradérmica, oral, intramuscular ou intravenosa.

[083] As vacinas da invenção podem ser administradas como doses únicas ou em doses repetidas. As vacinas da invenção podem ser administradas sozinhas, ou podem ser administradas simultaneamente ou sequencialmente com uma ou mais composições adicionais tal como, por exemplo, outras composições imunogênicas ou vacinas suínas. Onde as composições são administradas em momentos diferentes, as administrações podem ser separadas umas das outras ou sobrepostas no tempo.

[084] Em uma modalidade, as composições de vacina da invenção são administradas a um sujeito suscetível ou, de outro modo, em risco de infecção por PCV2, para aumentar a capacidade de resposta imune do próprio sujeito. O sujeito ao qual a vacina é administrada é, em uma modalidade, um porco. O animal pode ser susceptível à infecção por PCV2 ou por um vírus estreitamente relacionado.

[085] As vacinas da invenção, de preferência, são administradas a porcos, porcos adultos, mas também porcos jovens, leitões ou fêmeas grávidas, ou a outros tipos de animais não humanos. A vacinação de fêmeas grávidas é particularmente vantajosa por conferir imunidade passiva aos recém-nascidos através da transmissão de anticorpos maternos. Os porcos podem ter menos de 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 semana de idade; 1 a 6 semanas de idade; 2 a 5 semanas de idade; ou 3 a 4 semanas de idade. Por exemplo, animais de "teste" podem ser administrados com a vacina da invenção a fim de avaliar o desempenho da vacina, com vista ao eventual uso ou desenvolvimento de uma vacina para porcos. Desejavelmente, a vacina é administrada a um sujeito que ainda não foi exposto ao vírus PCV2. De preferência, o sujeito é um porco que necessita de vacinação contra a Síndrome Multissistêmica do Definhamento de Suínos (SMDS) e/ou Dermatite Suína e Síndrome da Nefropatia (PDNS).

[086] A presente invenção também inclui uma vacina de combinação, compreendendo vacinas da invenção e, pelo menos, um componente ativo imunogênico eficaz contra outro organismo causador de doença em suínos, tais como, por exemplo, Actinobacillus pleuropneunomia; Adenovírus; Balantidium coli; Bordetella bronchiseptica; Brachyspira spp., de preferência, B. hyodyentheriae, B.pilosicoli, Brucella suis, de preferência, biovares 1, 2 e 3; vírus da peste suína, vírus da peste suína africano; Chlamydia e Chlamydophila sp. e, de preferência, C. pecorum e C. abortus; Clostridium spp., de preferência, Cl. difficile, Cl. perfringens; coronavirus respiratório de suínos; Cryptosporidium parvum; Eimeria spp; Eperythrozoonis suis, denominado atualmente Mycoplasma haemosuis; Erysipelothrix rhusiopathiae; Escherichia coli; Haemophilus parasuis; vírus da encefalomielite hemaglutinante; Isospora suis; Lawsonia intracelulares; Leptospira spp., de preferência, Leptospira Pomona; Mannheimia haemolytica; Mycobacterium spp., de preferência, M. avium; Mycoplasma hyponeumoniae; Pasteurella multocida; citomegalovírus suíno; parvovírus suíno, vírus da síndrome respiratória e reprodutiva dos suínos, vírus da pseudo-raiva; Rotavírus; Salmonella spp., de preferência, S. thyhimurium e S. choleraesuis; Staphylococcus spp., de preferência, S. hyicus; Streptococcus spp., de preferência, S. suis; citomegalovírus suíno; vírus da gripe suína; vírus da varíola suína; Toxoplasma gondii; vírus da estomatite vesicular e vírus do exantema vesicular de suínos ou outros isolados e subtipos de circovírus suíno.

[087] A presente invenção também fornece um recipiente compreendendo uma quantidade imunologicamente eficaz de um polipeptídeo, ácido nucleico ou vacina, conforme descrito acima. A invenção também fornece kits de vacinação compreendendo, opcionalmente, um recipiente estéril compreendendo uma quantidade imunologicamente eficaz da vacina, meios para a administração da vacina a animais e, opcionalmente, um manual de instruções incluindo informação para a administração da quantidade imunologicamente eficaz da composição para o tratamento e/ou prevenção de doenças associadas ao PCV2.

[088] Outros aspectos e vantagens da invenção são fornecidos na seção seguinte, que deve ser considerada apenas como ilustrativa.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: CONSTRUÇÃO DE UM ÁCIDO NUCLEICO QUE CODIFICA UM POLIPEPTÍDEO ANTIGÊNICO COMPREENDENDO O PEPTÍDEO SINAL DO B5R E A ORF2 DO PCV2

[089] Dois DNAs sintéticos de fita dupla mostrados nas SEQ IDs NO: 6 e NO: 7 foram encomendados à Takara Bio (Japão). Seus sítios terminais 5'/3' de enzimas de restrição são BamHI/SalI e XbaI/SalI, respectivamente. Os DNAs foram clonados em plasmídeos, pMD18-Ess (B/X/S) e pMD18- ORF2 (X/S), respectivamente.

[090] Como há um sítio XbaI na frente do sítio SalI do terminal 3' da SEQ ID NO: 6, o pMD18-Ess(B/X/S) foi cortado com duas enzimas de restrição, XbaI e SalI. Os fragmentos de DNA com 561 bp, que foram derivados do pMD18- ORF2 (X/S) cortado com XbaI and SalI, foram inseridos no sítio XbaI/SalI do pMD18-Ess (B/X/S). O plasmídeo resultante, pMD18-Ess_ORF2, inclui o gene do peptídeo antigênico de SEQ ID NO: 5.

[091] O plasmídeo pGTPs40K-S (descrito na Fig. 2 do documento USP 7.348.422) foi cortado com duas enzimas de restrição, BamHI e SalI e substituído com um fragmento de corte de BamHI/SalI de 0,7 kpb derivado do pMD18 Ess_ORF2. O plasmídeo resultante foi denominado pGTPs-Ess_ORF2. Este plasmídeo inclui um forte promotor de poxvírus (PS) e o gene do peptídeo antigênico de SEQ ID NO: 5.

EXEMPLO 2: PLASMÍDEOS PARA PRODUZIR SPV RECOMBINANTE

[092] Primeiramente, o DNA genômico do SPV foi preparado conforme a seguir:

[093] Cepa kasza de SPV (VR-363) e células embrionárias de rim de suínos, células ESK-4 (CL-184) puderam ser adquiridas da American Type Culture Collection (ATCC). As células ESK-4 foram rotineiramente cultivadas a 37 °C em 5 % de CO2 em meio de Ham F-12K (Gibco, N° de catálogo: 21127022) suplementado com 1 % de estreptomicina-penicilina (Gibco, N° de catálogo: 15140-122) e 5 % de FBS (Gibco, N° de catálogo: 10437-028). Para a preparação do DNA genômico do SPV, células ESK-4 confluentes em um frasco de 225 cm2 foram infectadas com SPV e incubadas durante 6 dias, até que as células apresentassem 100 % de efeito citopático (CPE). As células infectadas foram, então, colhidas por raspagem das células para o meio e centrifugando a 1300 rpm durante 5 min. O meio foi decantado e o sedimento celular foi suavemente ressuspenso em 2 ml de tampão de fosfato salino (PBS: 1,5 g de Na2HPO4, 0,2 g de KH2PO4, 0,8 g de NaCl e 0,2 g de KCl por litro de H2O) e submetido a dois congelamentos- descongelamentos sucessivos. Os restos celulares foram, então, removidos por centrifugação a 3000 rpm durante 5 min a 4 °C. Os vírions do SPV, presentes no sobrenadante, foram então sedimentados por centrifugação a 20.000 xg durante 20 min a 4 °C. O pélete resultante foi, então, suspenso com 10 mM de Tris pH 7,5. DNAs genômicos do SPV foram, então, extraídos dos vírions do SPV por suspensão com tampão de lise (20 mM de Tris, pH 9, 0,1 M de NaCl2, 5 mM de EDTA, 0,1 % de SDS, 0,2 mg/ml de proteinase K) e incubado a 60 °C durante 5 min. Foi realizada uma extração com fenol:clorofórmio (1:1) duas vezes e a amostra foi precipitada pela adição de dois volumes de etanol e centrifugação. O sobrenadante foi decantado e o pélete (DNA do SPV) foi seco ao ar e reidratado em 10 mM de Tris pH 7,5, 1 mM de EDTA a 4 °C.

[094] Em seguida, as regiões de flanqueamento TK no genoma do SPV foram clonadas por reação em cadeia da polimerase (PCR). Dois primers (oligonucleotídeos sintéticos), SP54242F e SP57617R mostrados nas SEQ ID NOs: 8 e 9 foram adquiridos da Takara Bio. A reação de PCR foi realizada utilizando polimerase LA Taq (Takara Bio) e um conjunto de primers de SP54242F e SP57617R com DNA do SPV como um modelo, de acordo com o protocolo do produtor.

[095] O DNA amplificado, de cerca de 3,4 kbp, foi confirmado por eletroforese em gel de agarose a 0,8 % e purificado, a partir do gel, utilizando o QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). O fragmento de DNA purificado foi clonado no vetor pCR4-TOPO (Invitrogen), de acordo com o protocolo do produtor. 14 transformantes brancas resistentes à ampicilina foram coletadas e cultivadas em caldo de cultura LB e cada plasmídeo foi preparado com QuickLyse Miniprep Kit (Qiagen). Cada plasmídeo foi digerido com SpeI, e dois tipos de plasmídeos candidatos (ambos os sentidos de DNA inserido) foram selecionados. Os DNAs inseridos deles foram sequenciados com reagente Dye Terminator Cycle Sequencing (DTCS) e sequenciador CEQ2000XL (Beckman Coulter). Um dos plasmídeos candidatos, pCR-SPV54242/57617 (#2), foi confirmado como contendo o fragmento de DNA de 54.242 nt a 57,617 nt do DNA genômico do SPV (GenBank Acc: NC_003389) e utilizado como um plasmídeo de base (Fig.1).

[096] Em seguida, foi realizada a mutagênese por PCR, para eliminar uma parte do gene TK e para introduzir os sítios múltiplos de enzimas de restrição utilizando o PCR- SPV54242/57617 (#2) como modelo e utilizando dois tipos de conjunto de primers, (1) SEQ ID NOs: 10 e 11, ou (2) SEQ ID NOs: 12 e 13.

[097] Cada produto de PCR foi aplicado a uma eletroforese em gel de agarose a 0,8 % e purificado utilizando o QIAquick Gel Extraction Kit. O fragmento de DNA purificado, que foi amplificado por PCR utilizando um conjunto de primers de SEQ ID NOs: 10 e 11, foi digerido com duas enzimas de restrição, KpnI e HindIII, e ligado com a mesma pBluescript KS (+) cortada com enzimas de restrição (Stratagene). O plasmídeo resultante pBS-TKR (Kpn.Hin) (Fig.1) foi digerido com SacI e PstI, e o mesmo fragmento de DNA cortado com enzimas de restrição amplificado por PCR utilizando um conjunto de primers de SEQ ID NOs: 12 e 13, foi inserido neste. O plasmídeo resultante foi denominado pSP70 (Fig.1).

[098] Entre os sítios EcoRI e HindIII nos sítios múltiplos de enzimas de restrição do pSP70 foram substituídos com o oligonucleotídeo adaptador preparado por hibridação de dois oligonucleotídeos sintéticos de DNA de SEQ ID NOs: 14 e 15. O plasmídeo resultante foi denominado pSP71 (Fig.1).

[099] O fragmento de DNA do cassete do gene "P7.5 promotor -LacZ' derivado do pNZ76, que foi cortado com HindIII e SmaI do pNZ76 e seguido de clivagem abrupta por DNA-polimerase (descrito no documento USP 5.387.519), foi ligado ao sítio SmaI do pSP71. O plasmídeo resultante foi denominado pSP72 (Fig. 1), e o cassete do gene 'P7.5-LacZ' foi inserido no gene TK (do 55625 nt ao 56170 nt no genoma do SPV).

[0100] O fragmento cortado BglI de 0,8 kb derivado de pGTPs-Ess_ORF2 (Exemplo 1) foi inserido no sítio SfiI do pSP72 e o plasmídeo resultante foi denominado como pSP72-Ess_ORF2 (Fig.1). Este plasmídeo inclui o cassete do gene 'promotor de poxvirus forte (PS)-Ess_ORF2' também dentro do gene TK, e foi utilizado como um plasmídeo homólogo para preparar um SPV recombinante, SVR7.

[0101] Em vez de Ess_ORF2, um gene natural ORF2- PCV2 foi inserido em outro plasmídeo homólogo para utilizar como referência. Embora tenham sido reportados muitos dados de sequência da ORF2-PCV2, um deles, o DNA de fita dupla de SEQ ID NO: 16, foi sintetizado. A SEQ ID NO: 16 é um complemento de DNA que codifica a ORF2 do PCV2 isolado na França (GenBank: AF055393), e sítios BamHI e SalI estão ligados nas extremidades 5' e 3' do mesmo, respectivamente. O DNA sintetizado foi cortado com BamHI e SalI e substituído com a região BamHI/SalI do pSP72-Ess_ORF2. O plasmídeo resultante foi denominado pSP72-ORF2 e utilizado como um plasmídeo homólogo para preparar um SPV recombinante, SVR3.

EXEMPLO 3: PRODUÇÃO DE SPVS, SVR3 E SVR7 RECOMBINANTES (1) PRODUÇÃO DE SPVS, SVR3 E SVR7 RECOMBINANTES

[0102] SPVs recombinantes foram gerados em células ESK-4 por recombinação homóloga entre o genoma do SPV de tipo selvagem e vetores de homologia. Células ESK-4 subconfluentes, em uma placa de 6 poços, foram infectadas com SPV de tipo selvagem, 4 h antes da transfecção cada uma com 2 g de pSP72-Ess_ORF2 ou pSP72-ORF2 usando reagente Lipofectamin Plus (Invitrogen) e deixadas incubar a 37 °C durante 5 dias até que tivesse ocorrido o efeito citopático (CPE). Os lisados celulares de células infectadas- transfectadas foram selecionados com relação à placas recombinantes expressando LEOs lisados celulares de células infectadas-transfectadas foram selecionados com relação a placas recombinantes expressando β-galactosidade, por adição de 0,5 mg/ml de Bluo-gal (Invitrogen N° de catálogo: 15519-028) na camada de agarose nutriente. Vírus recombinantes selvagens foram purificados através de 4-6 rodadas de seleção. SPVs recombinantes produzidos utilizando pSP72- Ess_ORF2 ou pSP72-ORF2 foram denominados SVR7 e SVR3, respectivamente.

(2) ENSAIO EM PLACA NEGRA (BPA)

[0103] Células ESK-4 em uma placa de 24 poços foram infectadas com SVR3, SVR7 ou SPV selvagem, e incubadas a 37 °C. Após 6 dias, a monocamada foi fixada com acetona e metanol (2:1). O anticorpo monoclonal anti-PCV2 neutralizante (Ingenase clone 36F1) foi diluído (1:500 de diluição) em 5 % de leite em pó em PBS e aplicado às células infectadas e estas foram incubadas durante 2 h à temperatura ambiente (TA). As células infectadas foram lavadas com PBS e reagidas com IgG anti-camundongo de coelho conjugada com biotina (diluição 1:1000), e kit padrão VECTASTAIN ABC (Vector Laboratory PK-4000). Substrato de fosfatase alcalina, solução padrão NBT/BCIP (Roche, N° ed cat.: 11681451001), foi diluído em 0,1 M de Tris pH 9,5, 0,1 M de NaCl, 50 mM de MgCl2, e adicionado às células infectadas que foram incubadas durante 5 a 30 minutos à temperatura ambiente, até que as placas de SVR3 ou SVR7 se tornassem de cor púrpura/preta. Enquanto que as placas com SPV selvagem eram brancas (negativo), todas as placas de SVR3 e SVR7 foram confirmadas como sendo pretas (positivo) (Figura 2).

EXEMPLO 4: ANTICORPOS POLICLONAIS PARA DETECÇÃO DE PCV2-ORF2

[0104] Para preparar o anticorpo policlonal contra PCV2-ORF2, as proteínas de fusão glutationa S- transferase (GST) com regiões C-terminal de PCV2-ORF2 foram expressas em E. coli. Primeiramente, um fragmento de DNA foi produzido por PCR utilizando pMD18-ORF2(X/S) (Exemplo 1) como modelo, e um conjunto de primers de SEQ ID NOs: 17 e 18.

[0105] O DNA amplificado de 0,45 kbp foi cortado com BamHI e SalI e inserido nos sítios BamHI/SalI de pGEX-6p- 3 (GE Healthcare, 28-9546-51). Plasmídeos candidatos foram sequenciados com primers de sequenciamento, pGEX-5'-SP ou pGEX-3'-SP (GE Healthcare, 27-1410-01 ou 27-1411-01, respectivamente) e confirmados como sendo os mesmos do plano de construção. O plasmídeo resultante foi denominado pGEX- TGXR2.

[0106] Células hospedeiras de E. coli, BL21 (GE Healthcare, 27-1542-01) foram transformadas com pGEX-TGXR2 e foi confirmado que as transformantes expressavam a proteína de fusão com cerca de 40 kDa por indução com isopropil β- -D- tio-galactosídeo (IPTG).

[0107] Para produzir a proteína de fusão para a imunização dos animais, uma única colônia de transformante foi inoculada em alíquotas de 5 ml de caldo de cultura LB contendo 50 μg/ml de ampicilina (Amp), e cultivadas durante a noite a 37 °C com agitação. Na manhã seguinte, a cultura da noite foi inoculada em 1 litro de caldo de cultura LB contendo Amp e cultivada a 37 °C, com agitação, até uma OD600 de 0,7, quando foi adicionado IPTG na cultura, até uma concentração final de 0,1 mM. As culturas foram incubadas por um período adicional de 3 horas a 37 °C com agitação. As bactérias foram coletadas por centrifugação a 3500 xg durante 20 min e ressuspensas em 20 ml de tampão de lise PBS (1 % de Triton X-100 em PBS). A suspensão bacteriana foi sonicada em gelo em pulsos de 10 segundos com 10 seg de repouso em gelo, por três vezes. O lisado foi centrifugado a 17.000 xg durante 20 minutos a 4 °C e o sobrenadante foi transferido para um tubo novo.

[0108] Como as proteínas de fusão GST desejadas foram formadas com corpos de inclusão, estes foram purificados com Mini Whole Gel Eluter (Bio-Rad Laboratories, N° de Cat.: 165-1255), de acordo com as instruções do fornecedor.

[0109] As proteínas de fusão GST desejadas de ~40 kDa foram purificadas na fração N° 7 do Mini Whole Gel Eluter (Fig.3b). A solução da fração n° 7 foi dialisada com PBS. Os anticorpos policlonais contra esta proteína de fusão foram produzidos por imunização de ratos. Três ratos fêmeas Wistar (SPF), com 5 semanas de idade, foram imunizados por via subcutânea com 0,1 mg de proteína GST-ORF2 como emulsões em adjuvante completo de Freund e, três semanas depois, eles receberam um reforço de 0,05 mg do mesmo antígeno misturado com adjuvante de Freund incompleto, por três vezes em intervalos de 3 semanas. Duas semanas após a última imunização, os ratos foram sangrados para a coleta de ~1 ml do soro por rato.

EXEMPLO 5: CARACTERIZAÇÃO DE PEPTÍDEOS ANTIGÊNICOS EXPRESSOS POR SPVS RECOMBINANTES

[0110] Foi realizado um ensaio de imunofluorescência (IFA) para confirmar a localização das proteínas ORF2 expressas por SVR3 ou SVR7. Células ESK-4 foram infectadas com rSPV (SVR3 ou SVR7) ou SPV parental. Cinco dias depois, as células infectadas foram lavadas duas vezes com PBS, tratadas à temperatura ambiente durante 5 minutos com (a) acetona/metanol (2:1) ou (b) PBS. A acetona/metanol ou PBS foi retirado e foi adicionado PBS para não deixar as amostras secarem. Elas foram lavadas duas vezes com PBS e reagidas, a 37 °C durante 30 min, com anticorpos primários [anti-β-galactosidase de coelho (α-βGal) (CAPPEL, n° de cat.: 0631-0002) e anti-PCV2-ORF2 de rato (α-ORF2) (Exemplo 4), (diluições de 1:1000 em PBS)].EHHEm seguida, as amostras foram lavadas três vezes com PBS e reagidas, a 37 °C durante 30 min, com anticorpos secundários [IgG anti-coelho de cabra (H+L) Alexa Fluor 488 (Life Technology, A-11006) e IgG anti-rato (H+L) Alexa Fluor 546 (A-11081) (diluições de 1:1000 em PBS)]. As amostras foram lavadas três vezes com PBS e observadas em um microscópio de fluorescência.

[0111] No caso de (a) células tratadas com acetona/MeOH, foram observadas tanto a β-galactosidase (sinal verde) e a ORF2 (sinal vermelho) nas células infectadas com cada um dos SVR3 ou SVR7, porque as membranas celulares foram permeáveis (Fig.3a). Ao contrário, no caso de (b) células intactas, tanto a β-galactosidase (verde) e a ORF2 (vermelho) não foram detectadas nas células infectadas com SVR3, mas a ORF2 (vermelho) foi claramente observada em células infectadas com SVR7 (Fig. 3b). Estes resultados indicam fortemente que a localização das proteínas ORF2 foi alterada de intracelular, tal como a ORF2 original expressa por SVR3, para extracelular e na superfície das células por SVR7.

[0112] Portanto, a eficácia da vacina por SVR7 é maior do que por SVR3 e o sinal de endereçamento derivado de B5R pode melhorar a resposta imune contra a ORF2 de PCV2.

EXEMPLO 6: EFICÁCIA DA VACINAÇÃO IN VIVO

[0113] Os porcos foram vacinados com vetores que codificam um polipeptídeo SVR7 da invenção. Como um exemplo comparativo, porcos foram vacinados com SVR3. Para a imunização, foram injetadas doses de 3-5 x104 TCID50/dose. Os porcos foram, então, desafiados com PCV2.

[0114] Mais especificamente, 24 leitões, que são negativos ou isentos de PCV2, foram instalados com 3 semanas de idade, antes da vacinação, e divididos em grupos distintos, tal como representado abaixo: Grupo SVR3: 7 leitões, ^4, ?3. Grupo SVR7: 7 leitões, ^4, ?3. Grupo não imunizado: 7 leitões, ^4, ?3. Grupo não imunizado, não desafiado: 3 leitões, ^3.

[0115] A vacinação foi realizada com 4 semanas de idade e o desafio por PCV2 foi realizado 2 semanas após a imunização. Para o desafio por PCV2, foram injetados 6 x 105 TCID50 de PCV2/dose. Na necropsia (4 semanas após o desafio [wpc] por PCV2), vários órgãos foram coletados para a detecção do PCV2, incluindo três órgãos linfóides, amígdalas, linfonodos inguinais, linfóides intestinais e timo.

[0116] O número de cópias do genoma do PCV2 foi determinado no soro, 1, 2 e 3 semanas após a vacinação. Os resultados apresentados a seguir mostram que as vacinas da invenção induziram uma forte redução no número de cópias do genoma do PCV2. Os resultados mostram que a vacina da presente invenção é mais potente do que uma vacina baseada em uma sequência de ORF2 nativa. TABELA: PERCENTAGEM (POSITIVA/TOTAL DE PORCOS) DE PORCOS POSITIVOS PARA PCV2-QPCR NO SORO

[0117] Além disso, os resultados apresentados na Figura 4 demonstram claramente que o SVR7 induziu uma resposta de anticorpos anti-PCV2 forte. Os resultados mostram que o SVR7 induziu anticorpos substanciais para a ORF2 do PCV2. A resposta de anticorpos foi mais forte do que com SVR3. A indução de uma resposta de anticorpos substancial está relacionada com um número substancialmente reduzido de cópias do genoma do PCV2.

[0118] Estes dados ilustram claramente a eficácia da vacinação com polipeptídeos e vetores da invenção. LISTA DE SEQUÊNCIAS SEQ ID NO: 1: KTISVVTLLCVLPAVVYSTCTV SEQ ID NO: 2: KTISVVTLLCVLPAVVYSTCTVPTMNNAKLTSTETS SEQ ID NO: 3: GVLNTRLSRTFGYTIKRTTVKTPSWAVDMMRFNINDFVPPGGGSNPRSVPF EYYRIRKVKVEFWPCSPITQGDRGVGSTAVILDDNFVTKATALTYDPYVNYSSRHTITQPF SYHSRYFTPKPVLDSTIDYFQPNNKRNQLWLRLQTAGNVDHVGLGTAFENSKYDQEYNIRV TMYVQFREFNLKDPPLNP SEQ ID NO: 4 KTISVVTLLCVLPAVVYSTCTVPTMNNAKLTSTETSWKKEKGVLNTRLSRT FGYTIKRTTVKTPSWAVDMMRFNINDFVPPGGGSNPRSVPFEYYRIRKVKVEFWPCSPITQ GDRGVGSTAVILDDNFVTKATALTYDPYVNYSSRHTITQPFSYHSRYFTPKPVLDSTIDYF QPNNKRNQLWLRLQTAGNVDHVGLGTAFENSKYDQEYNIRVTMYVQFREFNLKDPPLNP SEQ ID NO: 5: ATGAAAACGATTTCCGTTGTTACGTTGTTATGCGTACTACCTGCTGTTGTT TATTCAACATGTACTGTACCCACTATGAATAACGCTAAATTGACGTCTACCGAAACATCGT GGAAAAAAGAGAAAGGAGTCTTGAACACCAGATTGTCTAGAACCTTCGGTTACACCATTAA GAGAACCACCGTCAAAACCCCATCTTGGGCTGTCGATATGATGAGATTCAACATCAACGAT TTCGTCCCACCTGGTGGTGGATCAAACCCTAGATCCGTTCCATTCGAGTACTACAGAATCA GAAAAGTCAAAGTCGAGTTCTGGCCATGCTCTCCTATTACTCAGGGTGATAGAGGAGTTGG ATCAACTGCCGTCATCTTGGATGACAACTTCGTCACTAAGGCTACTGCCTTGACCTACGAT CCTTACGTCAATTACTCTAGTAGACACACCATCACCCAACCATTCTCATACCATTCCAGAT ACTTCACTCCAAAACCTGTCTTGGACTCAACCATCGATTACTTTCAACCAAACAACAAGAG AAACCAATTGTGGTTGAGATTGCAAACTGCCGGTAACGTCGATCATGTCGGATTGGGAACC GCCTTCGAAAACTCCAAATACGACCAGGAGTACAACATTAGAGTCACCATGTACGTCCAAT TCAGAGAGTTCAACTTGAAGGACCCACCATTGAACCCATAA SEQ ID NO: 6: GGATCCACCATGAAAACGATTTCCGTTGTTACGTTGTTATGCGTACTACCT GCTGTTGTTTATTCAACATGTACTGTACCCACTATGAATAACGCTAAATTGACGTCTACCG AAACATCGTGGAAAAAAGAGAAAGGAGTCTTGAACACCAGATTGTCTAGACATTGAACCCA TAAGTCGAC SEQ ID NO: 7: TCTAGAACCTTCGGTTACACCATTAAGAGAACCACCGTCAAAACCCCATCT TGGGCTGTCGATATGATGAGATTCAACATCAACGATTTCGTCCCACCTGGTGGTGGATCAA ACCCTAGATCCGTTCCATTCGAGTACTACAGAATCAGAAAAGTCAAAGTCGAGTTCTGGCC ATGCTCTCCTATTACTCAGGGTGATAGAGGAGTTGGATCAACTGCCGTCATCTTGGATGAC AACTTCGTCACTAAGGCTACTGCCTTGACCTACGATCCTTACGTCAATTACTCTAGTAGAC ACACCATCACCCAACCATTCTCATACCATTCCAGATACTTCACTCCAAAACCTGTCTTGGA CTCAACCATCGATTACTTTCAACCAAACAACAAGAGAAACCAATTGTGGTTGAGATTGCAA ACTGCCGGTAACGTCGATCATGTCGGATTGGGAACCGCCTTCGAAAACTCCAAATACGACC AGGAGTACAACATTAGAGTCACCATGTACGTCCAATTCAGAGAGTTCAACTTGAAGGACCC ACCATTGAACCCATAAGTCGAC SEQ ID NO: 8: AATATTACGGGTGCTGTTT SEQ ID NO: 9: AAAAACATCGTATTCCTG SEQ ID NO: 10: CGTTCATGTTAAGCTTAACCTGAAATATTG SEQ ID NO: 11: GTTTAAACGAATTCGGTACCCTTAAAAACATCG SEQ ID NO: 12: CGCCGAGCTCGAGAATATTACGGGTGCTGTTTTTAC SEQ ID NO: 13: CCAGACTGCAGAGAACATAGGTCCTAATATAAG SEQ ID NO: 14: AATTGCCCGGGTACCGTCGATCGACTTTTTATGGCCCCCCCGGCCA SEQ ID NO: 15: AGCTTGGCCGGGGGGGCCATAAAAAGTCGATCGACGGTACCCGGGC SEQ ID NO: 16: GGATCCACCATGACGTATCCAAGGAGGCGTTACCGGAGAAGAAGACACCGC CCCCGCAGCCATCTTGGCCAGATCCTCCGCCGCCGCCCCTGGCTCGTCCACCCCCGCCACC GTTACCGCTGGAGAAGGAAAAATGGCATCTTCAACACCCGCCTCTCCCGCACCTTCGGATA TACTGTCAAGCGAACCACAGTCAGAACGCCCTCCTGGGCGGTGGACATGATGAGATTCAAT ATTAATGACTTTCTTCCCCCAGGAGGGGGCTCAAACCCCCGCTCTGTGCCCTTTGAATACT ACAGAATAAGAAAGGTTAAGGTTGAATTCTGGCCCTGCTCCCCGATCACCCAGGGTGACAG GGGAGTGGGCTCCAGTGCTGTTATTCTAGATGATAACTTTGTAACAAAGGCCACAGCCCTC ACCTATGACCCCTATGTAAACTACTCCTCCCGCCATACCATAACCCAGCCCTTCTCCTACC ACTCCCGCTACTTTACCCCCAAACCTGTCCTAGATTCCACTATTGATTACTTCCAACCAAA CAACAAAAGAAACCAGCTGTGGCTGAGACTACAAACTGCTGGAAATGTAGACCACGTAGGC CTCGGCACTGCGTTCGAAAACAGTATATACGACCAGGAATACAATATCCGTGTAACCATGT ATGTACAATTCAGAGAATTTAATCTTAAAGACCCCCCACTTAACCCTTAATAGTCGAC SEQ ID NO: 17: GGTGGTGGATCCAACCCTAGATCCG SEQ ID NO: 18: GGTGGGTCGACCAAGTTGAACTCTCTG

Claims (16)

1. POLIPEPTÍDEO, caracterizado por compreender um peptídeo de endereçamento de membrana celular de até 50 aminoácidos derivado do gene B5R de um vírus Vaccinia, ligado operativamente a um polipeptídeo antigênico heterólogo, em que o peptídeo de endereçamento da membrana celular compreende a SEQ ID NO: 1 e em que o polipeptídeo antigênico é um ORF2 de um vírus PCV2 ou um domínio antigênico deste.

2. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo peptídeo de endereçamento de membrana celular consistir na SEQ ID NO: 1.

3. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo peptídeo de endereçamento de membrana celular compreender a sequência de SEQ ID NO: 2.

4. POLIPEPTÍDEO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo polipeptídeo antigênico ser um ORF2 de um vírus PCV2.

5. POLIPEPTÍDEO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo polipeptídeo antigênico compreender a sequência de SEQ ID NO: 3.

6. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo polipeptídeo antigênico consistir na SEQ ID NO: 3.

7. POLIPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.

8. POLIPEPTÍDEO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por compreender, adicionalmente, um resíduo de N-ter metionina.

9. POLIPEPTÍDEO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por ser glicosilado.

10. ÁCIDO NUCLEICO, caracterizado por compreender a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 5.

11. VETOR, caracterizado por compreender um ácido nucleico, conforme definido na reivindicação 10.

12. VETOR, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por ser um vetor viral.

13. VETOR, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por ser um vírus da pseudo-raiva ou um vírus da varíola suína.

14. VÍRUS DA VARÍOLA SUÍNA RECOMBINANTE, caracterizado por compreender em seu genoma um ácido nucleico, conforme definido na reivindicação 10.

15. COMPOSIÇÃO, caracterizada por compreender um polipeptídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, um ácido nucleico, conforme definido na reivindicação 10, ou um vetor, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 11 a 13.

16. VACINA, caracterizada por compreender um polipeptídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, um ácido nucleico, conforme definido na reivindicação 10, ou um vetor, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 11 a 13 e, opcionalmente, um adjuvante.

Images