BR112017012998B1 - Vírus da varíola suína recombinante (rspv), método para produzir um rspv e composição - Google Patents

Abstract

VÍRUS DA VARÍOLA SUÍNA RECOMBINANTE (rSPV), MÉTODO PARAPRODUZIR UM rSPV E COMPOSIÇÃO. A presente invenção refere-se a vírus da varíolasuína recombinantes inovadores e seu uso em composições devacina. Os vírus da varíola suína recombinantes da invençãosão produzidos pela inserção de um ou mais genes exógenos nogene de proteína de ligação IL-18 (IL18bp) do vírus da varíolasuína. A invenção é particularmente adequada para produzirvacinas suínas, particularmente, para vacinar suínos contrainfecção por PCV2.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a vírus de varíola suína recombinantes e seu uso em composições de vacina. Os vírus de varíola suína recombinantes da invenção são produzidos pela inserção de um ou mais genes exógenos no gene de proteína de ligação IL-18 (IL18bp) de vírus de varíola suína. A invenção é particularmente adequada para produzir vacinas suínas, particularmente para vacinar suínos contra infecção por PCV2.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Diferentes tipos de vírus têm sido propostos na técnica como vetor para entrega de gene ou expressão de peptídeo in vivo. Em particular, têm sido preparadas vacinas veterinárias que expressam pelo menos um antígeno relevante com o uso de vírus recombinantes como poxvírus (Ogawa R. et al., Vaccine, 8:486-490 (1990)), adenovírus (HSU, K. H. et al., Vaccine, 12; 607-612 (1994)), baculovírus, bem como herpesvírus (Shin, M. -F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:5867-5870 (1984)). Os exemplos de vetores virais específicos que permitem a expressão de um gene para um antígeno exógeno incluem vírus da doença de Aujeszky (vírus da pseudoraiva; PRV) (Van Zijl M. et al., J. Virol., 65:2761-2765 (1991)), herpesvírus de peru (HVT) (Morgan R. W. et al., Avian Dis. 36:858-870 (1992)), e vírus da doença de Marek (MDV). Os vetores recombinantes baseados no gênero herpesvírus estão sob estudo intenso.

[003] Há, entretanto, uma necessidade na técnica de novos produtos de vetor viral que possam ser usados para expressar proteínas ou peptídeos recombinantes in vivo. A esse respeito, o poxvírus tem sido manipulado para codificar diferentes polipeptídeos. O poxvírus, uma vez liberado no sangue a partir de células infectadas, pode infectar outras células e, por meio disso, levar potencialmente a níveis de expressão elevados. O poxvírus recombinante tem sido produzido a partir de diferentes tipos de poxvírus, incluindo vírus da varíola bovina, vírus da varíola e vírus da varíola suína (SPV). Até o presente momento, entretanto, os SPVs recombinantes têm sido produzidos essencialmente pela clonagem de sequências genéticas exógenas em uma região genética que é considerada não essencial para a sobrevivência de SPV, a região TK (Richard W. Moyer, Eladio Vinuela, E. P. J. Gibbs, documento US 5.651.972 (1997)).

[004] Os inventores da presente invenção verificaram e validaram atualmente uma região de inserção gênica inovadora de SPV na qual uma variedade de sequências genéticas exógenas pode ser inserida. Os vírus SPV recombinantes resultantes permitem a expressão eficiente e estável da sequência genética clonada e têm grande capacidade de clonagem. Além disso, esses vírus têm imunogenicidade aprimorada in vivo e podem ser usados para produzir agentes terapêuticos ou vacinas para tratamento de qualquer mamífero, particularmente, em suínos.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[005] A presente invenção refere-se a vírus da varíola suína recombinantes inovadores e seu uso para entrega de gene e expressão in vivo, particularmente, em composições de vacina. Os vírus da varíola suína recombinantes da invenção contêm uma ou mais sequências genéticas exógenas no gene de proteína de ligação IL-18 (IL18bp) do vírus da varíola suína. A invenção é particularmente adequada para produzir vacinas suínas, particularmente, para vacinar suínos contra infecção por PCV2.

[006] Um primeiro objetivo da presente invenção refere-se, dessa forma, a um vírus da varíola suína recombinante (rSPV) que compreende pelo menos uma primeira sequência genética exógena em seu genoma, em que a dita primeira sequência genética exógena é inserida no gene IL18bp do genoma de rSPV. Em uma modalidade particular, a sequência genética exógena é inserida em substituição de toda ou parte da sequência genética de IL18bp viral. Em uma modalidade particular adicional, o rSPV da invenção compreende adicionalmente pelo menos uma segunda sequência genética exógena inserida em uma região distinta do genoma de rSPV, por exemplo, no gene de timidina quinase (TK) viral ou gene de proteína de repetição de anquirina.

[007] Um objetivo adicional da invenção se situa em uma molécula de ácido nucleico que compreende o genoma de um rSPV como definido acima.

[008] Um objetivo adicional da invenção é uma célula hospedeira que compreende um rSPV ou uma molécula de ácido nucleico da invenção.

[009] A presente invenção fornece adicionalmente um método para produzir um rSPV, que compreende infectar ou introduzir em uma célula competente uma molécula de ácido nucleico como definido acima e coletar o rSPV.

[010] A invenção também se refere a um método para propagar um rSPV, que compreende infectar uma célula competente com um rSPV como definido acima e coletar o SPV produzido pelas ditas células.

[011] A invenção também está relacionada com uma composição, de preferência, uma composição veterinária, que compreende um rSPV como definido acima, ou uma célula como definido acima, ou uma molécula de ácido nucleico como definido acima, e um excipiente.

[012] Um objetivo adicional da invenção é uma composição de vacina que compreende um rSPV como definido acima, ou uma célula como definido acima, ou uma molécula de ácido nucleico como definido acima, um excipiente adequado e, opcionalmente, um adjuvante.

[013] A invenção também se refere a um rSPV ou célula ou molécula de ácido nucleico como definido acima para uso para entregar um agente terapêutico ou peptídeo ou proteína de vacinação a um porcino.

[014] A invenção também se refere a um rSPV ou célula ou molécula de ácido nucleico como definido acima para uso para imunizar ou vacinar um porcino contra um patógeno.

[015] A invenção também está relacionada com um kit de vacinação para imunizar um porcino que compreende os seguintes componentes: a. uma quantidade eficaz de um rSPV ou vacina como definido acima, e b. um meio para administrar o dito rSPV ou vacina ao dito porcino.

[016] Um objetivo adicional da invenção se refere a um plasmídeo ou vetor de transferência que compreende um transgene flanqueado por duas sequências de ácidos nucleicos homólogas à sequência genética de IL18bp, em que as ditas sequências de flanqueamento permitem a recombinação homóloga entre o plasmídeo de transferência e um genoma de SPV.

[017] A invenção pode ser usada para entregar e expressar qualquer sequência genética exógena a um mamífero, particularmente, um porcino. Isso é particularmente adequado para expressão de antígenos exógenos para imunizar ou vacinar porcino (por exemplo, porcos, leitões, porca).

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[018] Fig. 1. Construção de plasmídeo homólogo pSP92-Ess_ORF2.

[019] Fig. 2. Construção de plasmídeo homólogo pSP911-Ess_ORF2.

[020] Fig. 3. Ilustração de estruturas de genoma de SPVs parentais e recombinantes.

[021] Fig. 4. Western blotting de SVR12 e SVR13 purificados.

[022] As células ESK-4 foram infectadas com SPV parental (p), clone de SVR12 1H2C9D4G5 (G5) ou clone 2F5D5E5 (E5), ou clone de SVR13 G2C2D4 (D4) ou clone D10E5A5 (A5). Seis dias depois, os lisatos celulares foram aplicados a SDS- PAGE a 15% e a análise western blot com o uso de anti-ORF2 de rato (1:500), IgG secundária antirrato de cabra conjugada com biotina (1:1000) e ABC-ALP (Vecterstain). M: Marcador de peso molecular.

[023] Fig. 5. Verificação de PCR de passagem in vitro de rSPVs. (A) resultados de PCR: A PCR foi conduzida com o uso um conjunto de iniciador de SP7450F e SP8552R. Cada modelo era DNA de vírus de passagem in vitro +0 ou +15p de clone de SVR12 1H2C7F3E5 (E5), clone 2F5D5E5G5 (G5), e clone de SVR13 G2C2D4 (D4), ou clone D10E5A5 (A5). Cada plasmídeo de transferência em transfecção para produzir SVR12 ou SVR13, e pCR4-SPV6030/9574, foi usado para um modelo de controle positivo (PC) ou controle negativo (NC), respectivamente. Os marcadores de peso molecular foram l0kb (Ml) e pHY. (B) regiões de flanqueamento de IL-18bp de parente e rSPVs. A caixa amarela é o gene IL-18bp.

[024] Fig. 6. Crescimento relativo de rSPVs em células Vero.

[025] As células Vero em placas de 6 poços foram infectadas com cada um dos três tipos de SPVs recombinantes, SVR3, SVR7 ou SVR12, em alto (cerca de 0,01) ou baixo (cerca de 0,001) MOL Em 0, 4, 7, 11 e 14 dias após a infecção (DPI), cada um dentre as células infectadas e os sobrenadantes foi colhido com raspadores de célula, e congelado e descongelado. Para titulação de vírus, esses lisatos celulares após terem sido centrifugados foram diluídos em série e infectados em células ESK-4 e incubados a 37 °C por 1 semana para formar placas. As razões de crescimento relativo foram calculadas com base em cada título de 0 DPI.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[026] A presente invenção se refere aos vírus da varíola suína recombinantes inovadores e aos usos dos mesmos. Os vírus da varíola suína recombinantes da invenção contêm uma ou mais sequências genéticas exógenas no gene de proteína de ligação IL-18 (IL18bp) do vírus da varíola suína. Como mostrado na seção experimental, tais vetores de SPV inovadores permitem a expressão de gene sustentada e eficiente. Além disso, os rSPVs da invenção são estáveis e podem produzir respostas imunológicas aprimoradas in vivo. Além disso, surpreendentemente, os vetores de SPV da invenção são mais seguros do que os SPVs anteriores, uma vez que não crescem em células de mamífero como as células Vero. Esse é o primeiro relato de um vírus SPV que contém um gene IL18-bp deletado, e a primeira demonstração de que as sequências genéticas exógenas podem ser clonadas nesse sítio resultando vetores de SPV recombinantes estáveis, imunogênicos e altamente produtores. O rSPV da invenção pode conter adicionalmente mais de uma sequência genética exógena, inseridas nos mesmos locais ou em locais distintos. As mesmas podem ser usadas em separado ou em combinação com outros vírus ou antígenos recombinantes para gerar vacinas aprimoradas. A invenção é particularmente adequada para produzir vacinas suínas, particularmente, para vacinar suínos contra infecção por PCV2.

rSPVs

[027] Dentro do contexto da invenção, um vírus da varíola suína recombinante designa, em geral, um vírus da varíola suína que tem um genoma manipulado artificialmente (por exemplo, recombinantemente). Os rSPVs incluem, particularmente, vírus da varíola suína que contêm material ou sequência genética exógena em seu genoma. Os rSPVs compreendem tipicamente um genoma de SPV que contém uma sequência genética exógena, embalada em um capsídeo ou envelope de SPV, que também pode conter uma proteína ou peptídeo exógena.

[028] O rSPV da presente invenção pode ser preparado partindo de qualquer SPV, como quaisquer SPVs de ocorrência natural ou quaisquer SPVs disponíveis junto a coleções como ATCC, CNCM, etc. De preferência, os rSPVs da invenção são produzidos a partir da cepa kasza de SPV (VR- 363), 17077-99 isolado (n° de Acesso GeneBank: AF410153.1) ou cepa VTCC/AVA/121 (n° de Acesso GeneBank: KJ725378.1). Tais SPVs estão disponíveis junto a coleções ou bibliotecas ou podem ser clonados a partir de suas sequências genômicas publicamente disponíveis. Adicionalmente, os isolados de SPV também podem ser isolados de animais infectados e usados para preparar o rSPV da invenção.

[029] O SPV ou rSPV pode ser cultivado ou mantido ou propagado em qualquer célula adequada. Por exemplo, os SPVs podem ser cultivados, mantidos ou propagados em células embrionárias de rins suínos, como as células ESK-4 (CL-184), rotineiramente cultivadas a 37 °C em CO2 a 5% em meio F-12K de Ham (Gibco, n° de Catálogo: 21127-022) suplementado com estreptomicina-penicilina a 1% (Gibco, n° de Catálogo: 15140-122) e FBS a 5% (Gibco, n° de Catálogo: 10437-028).

[030] A fim de construir um vírus recombinante da presente invenção, inicialmente, o vírus SPV pode ser propagado em uma célula hospedeira adequada e, então, no DNA genômico obtido. Subsequentemente, a região de IL18bp do DNA genômico é identificada, opcionalmente deletada, em toda ou em parte, e uma sequência genética exógena (ou um sítio de clonagem que permite a inserção de uma sequência genética exógena) é inserida na região, opcionalmente em substituição de toda ou parte da sequência genética endógena de IL18bp. O genoma de SPV recombinante obtido dessa forma pode ser usado para produzir rSPV por transformação de células competentes adequadas de acordo com as técnicas convencionais. Alternativamente, um vetor de transferência pode ser produzido contendo uma sequência genética exógena (ou um sítio de clonagem) flanqueada por sequências homólogas às regiões de IL18bp do gene. Mediante a introdução em uma célula competente na presença um vírus SPV ou genoma, a recombinação homóloga entre o vetor de transferência e o genoma gera o rSPV. Evidentemente, uma vez que um rSPV foi manipulado como descrito acima, isso pode ser facilmente replicado e propagado por cultura simples em quaisquer células competentes.

[031] Os SPVs podem ser cultivados, mantidos ou propagados em células embrionárias de rins suínos, como as células ESK-4 (CL-184), rotineiramente cultivadas a 37 °C em CO2 a 5% em meio F-12K de Ham (Gibco, n° de Catálogo: 21127-022) suplementado com estreptomicina-penicilina a 1% (Gibco, n° de Catálogo: 15140-122) e FBS a 5% (Gibco, n° de Catálogo: 10437-028). O DNA pode ser extraído a partir de células infectadas por vírus de acordo com qualquer método convencional. Por exemplo, as células crescidas em monocamadas podem ser raspadas e, então, girada para colher o sobrenadante. Após a proteína é desnaturada em um tampão de lise e removida, o DNA pode ser extraído com fenol e/ou etanol.

[032] O gene IL18bp de um DNA viral de SPV contém aproximadamente 402 bp e está, em geral, situado em resíduos nt 7745-8146 de genoma de SVP. Como um exemplo específico, em cepa kasza de SPV (VR-363), o gene IL18bp está situado em nt7745-8146.

[033] Em uma modalidade particular, os rSPVs da invenção contêm uma sequência genética exógena inserida em um local entre nt 7750 e nt 8140 de um genoma de SPV. A inserção da sequência genética exógena ocasiona uma interrupção da sequência genética nativa de IL18bp, em geral, impedindo a expressão de um IL18bp funcional. Em uma modalidade preferencial, a sequência genética exógena é inserida em substituição de sequência genética de IL18bp. A esse respeito, os rSPVs preferenciais da invenção compreendem uma deleção de pelo menos 10 a aproximadamente 400nt da sequência genética genômica de IL18bp, e uma sequência genética exógena situada no lugar da sequência deletada.

[034] As rSPVs preferenciais da invenção compreendem uma sequência genética exógena contida no gene IL18bp, em que o gene endógeno IL18bp carece de pelo menos 50nt, de preferência, pelo menos l00nt, ainda com mais preferência, pelo menos 150nt, pelo menos 200nt, pelo menos 250nt, pelo menos 300nt, adicionalmente com mais preferência entre 320nt e 380nt.

[035] Os rSPVs específicos e preferenciais da invenção contêm uma deleção de pelo menos nt 100-200 de gene IL18bp, ainda com mais preferência, de pelo menos nt50-300 de gene IL18bp, como nt19-369 de gene IL18bp.

[036] A construção de um rSPV da invenção pode ser executada com o uso de métodos conhecidos per se na técnica, seguindo a diretriz e as informações contidas no presente pedido. Em particular, o elemento versado na técnica pode inserir uma sequência genética exógena na sequência de IL18bp, em substituição de toda ou parte da sequência endógena, pelo uso de métodos conhecidos como mutagênese, PCR, recombinação homóloga, etc.

[037] Em uma modalidade particular, um vetor de transferência é preparado por tecnologia de DNA recombinante na qual uma sequência genética exógena é clonada flanqueada por duas regiões de homologia de IL18bp. As regiões de homologia contêm tipicamente entre 50-1000 nt de sequência genética de IL18bp, permitindo a recombinação homóloga específica. O vetor de transferência pode ser preparado a partir de quaisquer plasmídeos conhecidos ou convencionais, cosmídeos, fagos e similares, como plasmídeos pBS, pBR322, pUC18, pUC19 e pHC79. O plasmídeo de transferência pode, então, ser introduzido em uma célula infectada com SPV com o uso de técnicas conhecidas como eletroporação, fosfato de cálcio, um método baseado em lipofectina ou similares. Os vírus SPV recombinantes que têm integrada a sequência genética exógena são, então, selecionados. Sua sequência pode ser verificada. O rSPV pode, então, ser mantido em qualquer célula competente adequada. O vírus pode ser mantido em cultura, ou purificado e congelado ou liofilizado.

Sequência genética exógena

[038] A sequência genética exógena pode ser qualquer sequência de ácidos nucleicos ou molécula não naturalmente presente em um genoma de SPV, ou não naturalmente presente em tal localização em um genoma de SPV. Uma sequência genética exógena compreende tipicamente uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um mRNA, um peptídeo ou um polipeptídeo (ou proteína). A sequência genética exógena pode, por exemplo, codificar vários tipos de moléculas ativas, como um antígeno, adjuvante, citocina, linfocina, fator de crescimento, enzima, marcador, etc.

[039] Em uma modalidade preferencial, a sequência genética exógena codifica um antígeno (peptídeo, polipeptídeo ou antígeno de proteína) de um patógeno de uma doença infecciosa de porcino e, com máxima preferência, um antígeno de um vírus, bactéria, fungo ou protozoário. Dentro do contexto da invenção, um peptídeo designa tipicamente uma molécula que compreende de 4 a 30 aminoácidos. Um polipeptídeo é qualquer polímero de aminoácido que compreende mais de 30 aminoácidos. O termo polipeptídeo inclui proteínas de comprimento completo.

[040] A sequência genética exógena codifica, de preferência, um peptídeo ou polipeptídeo (por exemplo, glicoproteína, proteína de capsídeo ou fragmento da mesma) de um vírus ou patógeno selecionado dentre circovírus de porcino (PCV1, PCV2, PCV2A, PCV2B), Actinobacillus pleuropneunomia; Adenovírus; Alfavírus como vírus de encefalomielite equina do leste; Balantidium coli; Bordetella bronchiseptica; Brachyspira spp., de preferência, B. hyodyentheriae, B. pilosicoli, B. innocens, Brucella suis, de preferência, biovares 1, 2 e 3; vírus de febre suína clássica, vírus de febre suína africana; Chlamydia e Chlamydophila sp. e, de preferência, C. pecorum e C. abortus; Clostridium spp., de preferência, Cl. difficile, Cl. perfringens tipos A, B e C, Cl. novyi, Cl. septicum, Cl. tetani; Coronavírus digestivo e respiratório; Cryptosporidium parvum; Eimeria spp; Eperythrozoonis suis atualmente chamado de Mycoplasma haemosuis; Erysipelothrix rhusiopathiae; Escherichia coli; Haemophilus parasuis, de preferência, subtipos 1, 7 e 14; Vírus de encefalomielite hemaglutinante; Isospora suis; Vírus de encefalite japonesa; Lawsonia intracelulares; Leptospira spp., de preferência, Leptospira australis, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagicae, Leptospira interrogans, Leptospira pomona e Leptospira tarassovi; Mannheimia haemolytica; Mycobacterium spp., de preferência, M. avium, M. intracelular e M. bovis: Mycoplasma hyponeumoniae; Parvovírus; Pasteurella multocida; Citomegalovírus de porcino; Parovírus de porcino, Vírus da síndrome respiratória e reprodutora de porcina: Vírus de pseudoraiva; Rotavírus; Vírus Sagiyama; Salmonella spp., de preferência, S. thyhimurium e S. choleraesuis; Staphylococcus spp., de preferência, S. hyicus; Streptococcus spp., de preferência, Strep suis; Citomegalovírus suíno; Vírus da herpes suína; Vírus da gripe suína; Vírus da varíola suína; Toxoplasma gondii; Vírus da estomatite vesicular ou vírus de exantema de suíno.

[041] Em uma modalidade particularmente preferencial, a sequência genética exógena codifica um antígeno de PCV2, particularmente, uma proteína ou peptídeo de PCV2, ainda mais particularmente, um capsídeo de PCV2 (por exemplo, ORF2), proteína ou peptídeo.

[042] A sequência genética exógena pode conter um promotor transcricional para permitir ou aumentar a expressão do mRNA ou polipeptídeo codificado. O promotor usado pode ser um promotor sintético ou natural, incluindo um promotor de SPV, um promotor de poxvírus ou um promotor derivado de diferentes vírus ou células como promotores derivados de organismos eucariotas ou procariotas. Os exemplos específicos de promotores incluem o promotor de vírus da varíola 7,5-kD (P7.5k) (Davison A. J. et al., J. Mol. Biol, 210(4):749-69 (1989)), promotor de 11 kD (P1lk) (Bertholet et al., Proc. Nat. Acad. Sci.,82:2096-2100 (1985)) ou promotor de 28 kD (P28k) (Weir J. P. & Moss B., J. Virol. 61:75-80 (1987)), ou um promotor de Poxvírus sintético artificial (Ps), o promotor de timidina quinase de herpesvírus (Ross L. J., Gen. Virol. 74:371-377 (1993)), promotor de proteína gB (supra) de HVT ou MDV, o promotor IE de citomegalovírus humano (HCMV) (Alting-Mess M. A., Nucleic Acids Res., 17:9494 (1989)), promotor de SV40 (Gunning P., Proc. Natl. Acad. Sci., 84:4931-4835 (1987)), promotor de [beta] actina (supra, e Kost A. T., Nucleic Acids Res., 11:8287-8301 (1983)), promotor de [beta]-globina (Spitzner J. R., Nucleic Acids Res., 18:1-11 (1990)), o promotor de LTR de vírus de sarcoma de Rous (Fiek A. et al., Nucleic Acids Res., 20:1785 (1992)) e similares. Além disso, os promotores das proteínas estruturais ou os genes essenciais de SPV também podem ser usados.

[043] O rSPV da invenção pode conter várias sequências genéticas exógenas, situadas em uma mesma região de clonagem (isto é, IL18bp) e/ou em sítios de clonagem distintos (sendo um deles IL18bp). Em uma modalidade particular, o rSPV da invenção compreende pelo menos 2 sequências genéticas exógenas que codificam dois antígenos distintos (de um mesmo patógeno ou de um patógeno distinto). Em uma modalidade particular adicional, o rSPV da invenção compreende pelo menos uma sequência genética exógena que codifica um antígeno de PCV2 e uma sequência genética exógena que codifica um antígeno distinto. Em uma outra modalidade particular, o rSPV da invenção compreende uma sequência genética exógena que codifica um antígeno e uma sequência genética exógena que codifica um adjuvante ou uma citocina. Em tal rSPV multivalente da invenção, as pelo menos duas sequências genéticas exógenas podem estar sob o controle do mesmo promotor ou de promotor distinto, e na mesma orientação ou em orientação oposta.

Moléculas de ácido nucleico

[044] A invenção também se refere a moléculas de ácido nucleico que compreendem o genoma de um rSPV da invenção. As moléculas de ácido nucleico da invenção podem ser DNA ou RNA, de filamento duplo ou de filamento único. O DNA ou RNA de filamento único pode ser o filamento de codificação, também conhecido como filamento senso ou pode ser o filamento de não codificação, também chamado de filamento antissenso. A invenção também se refere a variantes ou análogos de tais moléculas de ácido nucleico, por exemplo, moléculas que têm pelo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou mais de identidade de sequência das mesmas.

[045] O grau de homologia entre duas sequências de ácidos nucleicos pode ser determinado por meio de programas de computador conhecidos na técnica como GAP fornecido no pacote de programas GCG (Manual de Programa para o Wisconsin Package, Versão 8, agosto de 1996, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EUA 5371 1) (Needleman, S. B. e Wunsch, CD., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453). Com o uso do GAP com as seguintes configurações para comparação de sequência de DNA: penalidade por criação GAP de 5, 0 e penalidade por extensão GAP de 0,3. As moléculas de ácido nucleico podem ser alinhadas entre si com o uso do software de alinhamento Pileup, disponível como parte do pacote de programas GCG, que usa, por exemplo, as configurações predefinidas de penalidade por criação de lacuna de 5 e penalidade por largura de lacuna de 0,3.

[046] As condições experimentais adequadas para determinar se uma determinada molécula de ácido nucleico hibridiza para um ácido nucleico especificado podem envolver pré-embebição de um filtro que contém uma amostra relevante do ácido nucleico a ser examinado em 5 x SSC por 10 minutos, e pré-hibridização do filtro em uma solução de 5 x SSC, solução de Denhardt 5 x, 0,5% de SDS e 100 [mu]g/ml de DNA de espermatozoide de salmão sonicado desnaturado, seguido por hibridização na mesma solução que contém uma concentração de 10 ng/ml de uma sonda marcada P-dCTP por 12 horas a aproximadamente 45°C, de acordo com os métodos de hibridização como descrito em Sambrook et al. (1989; Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbour, Nova York, EUA). O filtro é, então, lavado duas vezes por 30 minutos em 2 x SSC, 0,5% de SDS pelo menos 55°C (baixa estringência), pelo menos 60°C (média estringência), pelo menos 65°C (média/alta estringência), pelo menos 70°C (alta estringência) ou pelo menos 75°C (muito alta estringência). A hibridização pode ser detectada pela exposição do filtro a um filme para raios X.

[047] As moléculas de ácido nucleico de acordo com a invenção podem ser fornecidas na forma de uma molécula de ácido nucleico per se como moléculas de ácido nucleico desprotegidas; um vetor; vírus ou célula hospedeira etc. Os vetores incluem vetores de expressão que contêm uma molécula de ácido nucleico da invenção.

Célula hospedeiras

[048] Em uma modalidade adicional da invenção, é fornecida uma célula hospedeira transformada com um ácido nucleico ou com um rSPV de acordo com a invenção. Tais células podem produzir rSPVs da invenção. Os exemplos adequados de células hospedeiras são conhecidos pelos elementos versados na técnica ou podem ser prontamente selecionados por aqueles elementos versados na técnica. As células hospedeiras são, de preferência, células eucariotas como células de mamífero (por exemplo, porco), fúngicas (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, Pichia, Aspergillus, Fusarium), de inseto e vegetais. Os exemplos específicos de células hospedeiras são células de rins suínos, como células ESK-4 (CL-184).

Composições de vacina e métodos

[049] O termo "vacina" como usado no presente documento inclui qualquer composição que pode ser usada para causar, estimular ou amplificar uma resposta imunológica em um animal (por exemplo, porcos) contra um patógeno. Os exemplos particulares de vacinas da invenção são composições com capacidade de causar ou estimular ou amplificar a imunidade contra um vírus de PCV2. Em uma vacina da invenção, a pelo menos uma sequência genética exógena deve codificar um antígeno ou um adjuvante.

[050] O termo "imunização" inclui o processo de entrega de um imunógeno a um indivíduo. A imunização pode, por exemplo, permitir uma continuação de nível alto de anticorpo e/ou resposta celular na qual os T-linfócitos podem exterminar ou suprimir o patógeno no animal não humano imunizado, como porco, que é direcionado contra um patógeno ou antígeno ao qual o animal foi anteriormente exposto.

[051] As vacinas da invenção compreendem uma quantidade imunologicamente eficaz de um rSPV ou ácido nucleico ou célula como descrito acima em um veículo farmaceuticamente aceitável.

[052] Na prática, a quantidade exata requerida para uma dose imunologicamente eficaz pode variar de indivíduo para indivíduo dependendo de fatores como a idade e a condição geral do indivíduo, a natureza da formulação e o modo de administração. A "quantidade eficaz" apropriada pode ser determinada por um elemento de conhecimento comum na técnica com o uso apenas da experimentação de rotina. Por exemplo, os métodos são conhecidos na técnica para determinar ou titular dosagens adequadas de uma vacina para encontrar dosagens eficazes mínimas com base no peso do indivíduo animal não humano, concentração da vacina e outros fatores típicos. Em uma modalidade típica, a vacina compreende uma dose unitária entre 10 e 10.000.000 TCID50, de preferência, entre 100 e 1.000.000 TCID50, ainda com mais preferência, entre 1.000 e 100.000 TCID50, de um rSPV da invenção. TCID50 designa a dose infectante de cultura de tecido mediana, isto é, a quantidade de vírus que produz alteração patológica em 50 % de culturas celulares inoculadas.

[053] A dosagem da vacina, a concentração de componentes na mesma e a cronologia de administração da vacina, que provocam respostas imunológicas adequadas, podem ser determinadas por métodos como por titulações de anticorpo de soros, por exemplo, por ELISA e/ou análise de ensaio de soroneutralização e/ou por avaliação de desafio de vacinação.

[054] As vacinas podem compreender outros ingredientes, conhecidos por si mesmos por um elemento de conhecimento comum na técnica, como carreadores farmaceuticamente aceitáveis, excipientes, diluentes, adjuvantes, estabilizadores de secagem por congelamento, agentes umectantes ou emulsificantes, agentes tamponantes de pH, aditivos de acentuação de gelificação ou viscosidade ou conservantes, dependendo da via de administração.

[055] Os exemplos de carreadores farmaceuticamente aceitáveis, excipientes ou diluentes incluem, mas não são limitados a água destilada ou desmineralizada; solução salina; óleos de base vegetal como óleo de amendoim, óleo de arachis, óleo de açafrão, óleo de oliva, óleo de semente de algodão, óleo de maís, óleo de gergelim ou óleo de coco; óleos de silicone, incluindo polissiloxanos, como polissiloxano de metila, polissiloxano de fenila e polissoloxano de metilfenila; silicones voláteis; óleos minerais como óleo de parafina líquida leve ou óleo de parafina líquida pesada; esqualeno; derivados de celulose como metilcelulose, etilcelulose, carboximetilcelulose, sal de sódio de carboximetilcelulose ou hidroxipropil metilcelulose; alcanóis inferiores, por exemplo, etanol ou isopropanol; aralcanóis inferiores; polialquileno glicóis inferiores ou alquileno glicóis inferiores, por exemplo, polietileno glicol, polipropileno glicol, etileno glicol, propileno glicol, 1,3-butileno glicol ou glicerina; ésteres de ácido graxo como palmitato de isopropila, miristato de isopropila ou oleato de etila; polivinilpirrolidona; ágar; carragena; goma tragacanto ou goma acácia e gel de petróleo. Tipicamente, o carreador (ou carreadores) formará de 10 % a 99,9 % em peso da composição de vacina e pode ser tamponado por métodos convencionais que usam reagentes conhecidos na técnica, como fosfato de sódio e hidrogênio, fosfato de sódio de di-hidrogênio, fosfato de potássio e hidrogênio, fosfato de potássio e di-hidrogênio, uma mistura dos mesmos e similares.

[056] Os exemplos adjuvantes incluem, porém, sem limitação, emulsões de óleo em água, hidróxido de alumínio (alum), complexos de imunoestimulação, copolímeros ou polímeros em bloco não iônicos, citocinas (como IL- 1, IL- 2, IL-7, IFN-[alfa], IFN-[beta], IFN-y, etc.), saponinas, lipídio de monofosforila A (MLA), dipeptídeos de muramila (MDP) e similares. Outros adjuvantes adequados incluem, por exemplo, sulfato de potássio e alumínio, enterotoxina(s) termoestável(is) ou estável(is) em calor isolada(s) de Escherichia coli, toxina de cólera ou a subunidade B da mesma, toxina de difteria, toxina de tétano, toxina de tosse convulsiva, adjuvante completo ou incompleto de Freund, etc. Adjuvantes à base de toxina, como toxina de difteria, toxina de tétano e toxina de tosse convulsiva podem ser inativados antes do uso, por exemplo, pelo tratamento com formaldeído.

[057] Os exemplos de estabilizadores de secagem por congelamento podem ser, por exemplo, carboidratos como sorbitol, manitol, amido, sacarose, dextrano ou glicose, proteínas como albumina ou caseína, e derivados das mesmas.

[058] As vacinas podem compreender antígenos de vários patógenos, como PCV2, Actinobacillus pleuropneunomia; Adenovírus; Alfavírus como vírus de encefalomielite equina do leste; Balantidium coli; Bordetella bronchiseptica; Brachyspira spp., de preferência, B. hyodyentheriae, B. pilosicoli, B. innocens, Brucella suis, de preferência, biovares 1, 2 e 3; vírus de febre suína clássica, vírus de febre suína africana; Chlamydia e Chlamydophila sp. e, de preferência, C. pecorum e C. abortus; Clostridium spp., de preferência, Cl. difficile, Cl. perfringens tipos A, B e C, Cl. novyi, Cl. septicum, Cl. tetani; Coronavírus digestivo e respiratório; Cryptosporidium parvum; Eimeria spp; Eperythrozoonis suis atualmente chamado de Mycoplasma haemosuis; Erysipelothrix rhusiopathiae; Escherichia coli; Haemophilus parasuis, de preferência, subtipos 1, 7 e 14; Vírus de encefalomielite hemaglutinante; Isospora suis; Vírus de encefalite japonesa; Lawsonia intracellulars; Leptospira spp., de preferência, Leptospira australis, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagicae, Leptospira interrogans, Leptospira pomona e Leptospira tarassovi; Mannheimia haemolytica; Mycobacterium spp., de preferência, M. avium, M. intracellular e M. bovis: Mycoplasma hyponeumoniae; Parvovírus; Pasteurella multocida; Citomegalovírus de porcino; Parovírus de porcino, Vírus da síndrome respiratória e reprodutora de porcina: Vírus de pseudoraiva; Rotavírus; Vírus Sagiyama; Salmonella spp., de preferência, S. thyhimurium e S. choleraesuis; Staphylococcus spp., de preferência, S. hyicus; Streptococcus spp., de preferência, Strep suis; Citomegalovírus suíno; Vírus da herpes suína; Vírus da gripe suína; Vírus da varíola suína; Toxoplasma gondii; Vírus da estomatite vesicular e/ou vírus de exantema de suíno.

[059] As composições de vacina da invenção podem ser formulações líquidas como uma solução aquosa, emulsão de água em óleo ou de óleo em água, xarope, um elixir, uma tintura, uma preparação para administração parenteral, subcutânea, intradérmica, intramuscular ou intravenosa (por exemplo, administração injetável), como suspensões ou emulsões estéreis. Tais formulações são conhecidas na técnica e são tipicamente preparadas por dissolução do antígeno e de outros aditivos típicos nos sistemas de carreador ou solvente apropriados. As formulações líquidas também podem incluir suspensões e emulsões que contêm agentes de suspensão ou emulsificação.

[060] A via de administração pode ser percutânea, através de administração mucosal ou através de uma via parenteral (intradérmica, intramuscular, subcutânea, intravenosa ou intraperitoneal). A vacina da invenção pode ser convenientemente administrada intranasalmente, transdermicamente (isto é, aplicada sobre ou na superfície da pele para absorção sistêmica), parenteralmente, ocularmente, etc. A via parenteral de administração inclui, porém, sem limitação, vias intramusculares, intravenosas, intraperitoneais e similares.

[061] As vacinas da invenção podem ser administradas como doses únicas ou em doses repetidas. As vacinas da invenção podem ser administradas sozinhas ou podem ser administradas simultânea ou sequencialmente com uma ou mais composições adicionais, como, por exemplo, outras composições imunogênicas ou de vacina de porcino. Onde as composições são administradas em diferentes tempos, as administrações podem ser separadas uma da outra ou sobrepostas em tempo.

[062] A presente invenção também se refere a métodos de imunização ou indução de respostas imunológica em um mamífero não humano (por exemplo, porcos) que compreende administrar ao dito mamífero um rSPV ou um ácido nucleico, ou uma célula ou uma vacina como descrito acima.

[063] As vacinas da invenção são, de preferência, administradas a porcos, porcos adultos, mas também a porcos jovens, leitões ou à porca em gestação. A vacinação de porcas gestantes é vantajosa, visto que pode conferir imunidade passiva a recém-nascidos através da transmissão de anticorpos maternais. Os porcos podem ter menos que 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 semana de idade; 1 a 6 semanas de idade; 2 a 5 semanas de idade; ou 3 a 4 semanas de idade. Desejavelmente, A vacina é administrada a um indivíduo que ainda não foi exposto ao patógeno.

[064] A presente invenção também fornece um recipiente que compreende uma quantidade imunologicamente eficaz de um rSPV, ácido nucleico, célula ou vacina como descrito acima. A invenção também fornece kits de vacinação que compreendem um recipiente opcionalmente estéril que compreende uma quantidade imunologicamente eficaz da vacina, meios para administrar a vacina a animais e, opcionalmente, um manual de instruções que inclui informações para a administração da quantidade imunologicamente eficaz da composição para tratamento e/ou prevenção de doença infecciosa.

Vacina de PCV2

[065] A invenção é particularmente adequada para o tratamento (preventivo curativo) de infecção de PCV2 e doenças associadas.

[066] As vacinas de PCV2 atualmente desenvolvidas, como Circovac® (Merial), Ingelvac®, CircoFLEX (Boehringer lngelheim Vetmedica) ou Suvaxyn®, são vacinas de PCV2 inativadas ou vacinas de Subunidade. As vacinas de subunidade de PCV2 usam tipicamente uma proteína de capsídeo de PCV2A purificada, recombinante produzida por expressão recombinante do gene ORF2 de PCV2A. A esse respeito, a proteína codificada por ORF2 de isolado Imp1011 de PCV2 foi relatada em EP1741785. Uma proteína codificada por ORF2 de isolado PCV2Rm de PCV2 foi relatada no documento WO2010/061000. Uma proteína codificada por ORF2 de isolado 412 de PCV2 foi relatada no documento EP1816200. Uma outra proteína codificada por um ORF2 de um isolado de PCV2 adicional foi relatada no documento EP1036180 ou EP2225367. As proteínas do tipo ORF2 sintéticas aprimoradas foram descritas no documento WO2013/030320 e no documento WO2014/167060.

[067] Em uma modalidade particular, a presente invenção se refere a um rSPV como definido acima em que a sequência genética exógena codifica um antígeno de PCV2, com mais preferência, uma proteína, polipeptídeo ou peptídeo de PCV2. Em uma modalidade mais preferencial, a presente invenção se refere a um rSPV como definido acima em que a sequência genética exógena codifica um polipeptídeo ORF2 de PCV2 ou um fragmento do mesmo. Em uma modalidade particular, o ORF2 é selecionado dentre ORF2 de isolados Impl0l1, PCV2Rm ou 412 de PCV2, ou um ORF2 que tem pelo menos 80 % de identidade de sequência com tais proteínas, ou um fragmento imunogênico das mesmas que compreende pelo menos 10, 15, com mais preferência, pelo menos 20 resíduos de aminoácidos contíguos das mesmas.

[068] Um aspecto adicional da invenção se refere a métodos de tratamento e/ou prevenção de uma doença associada a PCV2 em um mamífero não humano, e a métodos de imunização ou vacinação de indivíduo animal não humano, como porcos, suíno, porca, leitão, contra infecção por PCV2, que compreende administrar ao dito indivíduo animal um rSPV, um ácido nucleico, uma célula ou composição de vacina como definido acima.

[069] As infecções por PCV2 ou doenças associadas incluem, entre outros, Síndrome Multissistêmica do Definhamento Pós-desmame (PMWS), Síndrome de Dermatite e Nefropatia de Porcino (PDNS), Complexo de Doença Respiratória de Porcino (PRDC), transtornos reprodutores, Enterite granulomatosa, Epidermite exsudativa, Linfadenite necrotizante e tremores congênitos. De preferência, um indivíduo animal não humano, como porco, é protegido a um ponto em que um a todos os sintomas ou efeitos adversos fisiológicos de infecções por PCV2 são significativamente reduzidos, melhorados ou totalmente prevenidos.

[070] Em uma modalidade, as composições de vacina da invenção são administradas a um porco suscetível a ou, de outro modo, em risco de infecção por PCV2 para acentuar as capacidades de respostas imunológica próprias do indivíduo.

[071] De preferência, o indivíduo é um porco que está em necessidade de vacinação contra Síndrome Multissistêmica do Definhamento Pós-desmame (PMWS) e/ou Síndrome de Dermatite e Nefropatia de Porcino (PDNS).

[072] Aspectos e vantagens adicionais da invenção devem ser revelados na seguinte seção experimental, que ilustra a invenção reivindicada.

Exemplos Exemplo 1: Construção de plasmídeos para produção de SPVs recombinantes (1) Construção de pSP92-Ess_ORF2 (Figura 1)

[073] O DNA genômico de SPV foi preparado da seguinte forma:

[074] A cepa kasza de SPV (VR-363) e a célula de rins suínos embrionárias, células ESK-4 (CL-184) poderiam ser adquiridas junto à Coleção Americana de Culturas Celulares (ATCC). As células ESK-4 foram rotineiramente cultivadas a 37 °C em CO2 a 5 % em meio F-12K de Ham (Gibco, n° de Catálogo: 21127-022) suplementado com estreptomicina- penicilina a 1% (Gibco, n° de Catálogo: 15140-122) e FBS a 5% (Gibco, n° de Catálogo: 10437-028). Para preparação de DNA genômico de SPV, as células ESK-4 confluentes em um frasco de 225 cm2 foram infectadas com SPV e incubadas por 6 dias até que as células apresentassem 100% de efeito citopático (CPE). As células infectadas foram, então, colhidas pela raspagem de células no meio e centrifugação a 1300 rpm por 5 minutos. O meio foi decantado e o pélete celular foi moderadamente ressuspenso em 2 ml de Solução Salina de Tampão de Fosfato (PBS: 1,5 g de Na2HPO4, 0,2 g de KH2PO4, 0,8 g de NaCl e 0,2 g de KCl por litro H2O) e submetido a duas etapas de congelamento-descongelamento sucessivas. Os detritos celulares foram, então, removidos pela centrifugação a 3000 rpm por 5 minutos a 4°C. Os vírions de SPV, presentes no sobrenadante, foram, então, peletizados pela centrifugação a 20.000 xg por 20 minutos a 4°C. O pélete resultante foi, então, suspenso com l0 mM de Tris pH 7,5. Os DNAs genômicos de SPV foram, então, extraídos dos vírions de SPV pela suspensão com o tampão de lise (20 mM de Tris, pH9, NaCl2 a 0,1 M, EDTA a 5 mM, SDS a 0,1%, 0,2 mg/ml de proteinase K) e incubação a 60°C por 5 minutos. A extração de fenol:clororofórmio (1:1) foi realizada duas vezes, e a amostra precipitou pela adição de dois volumes de etanol e centrifugação. O sobrenadante foi decantado, e o pélete (DNA de SPV) foi seco por ar e reidratado em l0 mM de Tris pH 7,5, 1 mM de EDTA a 4°C.

[075] As regiões de flanqueamento de gene de proteína de ligação de interleucina-18 (IL-18bp) no genoma de SPV foram clonadas por Reação de Cadeia de Polimerase (PCR). Dois iniciadores (oligonucleotídeos sintéticos), SP6030F e SP9574R mostrados em SEQ ID NOs: 1 e 2 foram adquiridos junto à Takara Bio. A reação de PCR foi conduzida com o uso de LA Taq polimerase (Takara Bio) e um conjunto de iniciadores de SP6030F e SP9574R com DNA de SPV como um modelo de acordo com o protocolo do produtor.

[076] SEQ ID NO: 1: CGAATTCATTCCTTTATCTTTA

[077] SEQ ID NO: 2: GGAACTACGTTATACGATCAT

[078] O DNA amplificado de cerca de 3,5 kbp foi confirmado por uma eletroforese em gel de agarose a 0,8%, e purificado a partir do gel com o uso do Kit de Extração de Gel QIAquick (Qiagen). O fragmento de DNA purificado foi clonado no vetor pCR4-TOPO (Invitrogen) de acordo com o protocolo do produtor. 12 transformantes brancos resistentes à ampicilina foram coletados e crescidos em caldo de LB que contém 50 micro-g/ml de ampicilina, e cada plasmídeo foi preparado com Kit QuickLyse Miniprep (Qiagen). Cada plasmídeo foi digerido com Seal, e dois tipos de plasmídeos de candidato (ambas as direções de DNA inserido) foram selecionados. Os DNAs inseridos dos mesmos foram sequenciados com reagente de ciclo de sequenciamento baseado em química de corante (DTCS) e sequenciador de CEQ2000XL (Beckman Coulter). Um dos plasmídeos candidatos, pCR-SPV6030/9574 (n° 1), confirmou que continha o fragmento de DNA de 6,030nt a 9,574nt de DNA genômico de SPV (n° de Acesso GeneBank: NC 003389) e que o mesmo foi usado como um plasmídeo básico (Figura 1).

[079] Em seguida, A mutagênese de PCR foi conduzida para deletar uma parte do gene IL-18bp e para introduzir os sítios de enzima de restrição múltipla com o uso de pCR-SPV6030/9574 (n° 1) como um modelo e com o uso de dois tipos de conjuntos de iniciadores, (1) SEQ ID NOs: 3 e 4 ou (2) SEQ ID NOs: 5 e 6.

[080] SEQ ID NO: 3: TTCGCCCTTACGGTACCATTCCTTTATCTTTATAAACG

[081] SEQ ID NO: 4: CTATAATATTAAATAAGCTTTATGGAGTTGTTTAAATAC

[082] SEQ ID NO: 5: CACACGATAACACTGCAGTCCACATATTACGGTTC

[083] SEQ ID NO: 6: GCCGCGAATTCGCCCTCGAGGAGCTCACTACG

[084] Cada um dos produtos de PCR foi aplicado a uma eletroforese em gel de agarose a 0,8% e purificado com o uso do kit de Extração com Gel QIAquick. O fragmento de DNA purificado, que foi amplificado por PCR com o uso de um conjunto de iniciadores de SEQ ID NOs: 3 e 4, foi digerido com duas enzimas de restrição, KpnI e HindIII, e ligados com as mesmas enzimas de restrição-corte-pBluescript KS(+) (Stratagene). O plasmídeo resultante pBS-9L(Kpn..Hin) (Figura 1) foi digerido com SacI e PstI, e o mesmo fragmento de DNA de enzimas de restrição-corte amplificado por PCR com o uso de um conjunto de iniciadores de SEQ ID NOs: 5 e 6, foi inserido no mesmo. O plasmídeo resultante foi denominado pSP90 (Figura 1).

[085] Entre EcoRI e HindIII, os sítios nos sítios de enzima de restrição múltipla de pSP90 foram substituídos pelo adaptador de oligonucleotídeo preparado pelo anelamento de dois oligonucleotídeos de DNA sintético de SEQ ID NOs: 7 e 8. O plasmídeo resultante foi denominado pSP91 (Figura 1).

[086] SEQ ID NO: 7: AATTGCCCGGGTACCGTCGATCGACTTTTTATGGCCCCCCCGGCCA

[087] SEQ ID NO: 8: AGCTTGGCCGGGGGGGCCATAAAAAGTCGATCGACGGTACCCGGGC

[088] O fragmento de DNA de cassete de gene "P7.5 promotor-LacZ" derivado de pNZ76, que foi cortado com HindIII e SmaI de pNZ76 e seguido pela clivagem abrupta por DNA polimerase (descrito no documento USP5.387.519) foi ligado no sítio SmaI de pSP91. O plasmídeo resultante foi denominado pSP92 (Figura 1), e o cassete de gene "P7.5-LacZ" foi inserido no gene IL-18bp (de 8,146nt a 7,745nt no genoma de SPV).

[089] O fragmento de corte de BglI de 0,8 kb derivado de pGTPs-Ess_ORF2 (Exemplo 1 do documento WO2014/167060) foi inserido no sítio SfiI de pSP92, e o plasmídeo resultante foi denominado pSP92-Ess_ORF2 (Figura 1). Esse plasmídeo incluiu o cassete de gene "promotor de poxvírus forte (Ps)-Ess_ORF2 (PCV2-ORF2 modificado)" também dentro do gene IL-18bp, e foi usado como um plasmídeo de homologia para produzir um SPV recombinante, SVR12.

(2) Construção de pSP911-EssORF2 (Figura 2)

[090] A sequência entre KpnI e PstI de pSP91 foi substituída pelo adaptador sintético mostrado em SEQ ID NO: 9 para inserir o promotor de 11 kD de vírus da varíola na mesma. O plasmídeo resultante foi designado como pSP911.

[091] SEQ ID NO: 9: GGTACCGAGCTCGGTAGCCCGGGCCATGGTAGATCCTCTAGAGGATCCAAT T CATTTATAGCATAGAA AAATGAAATTCTACTATATTTTCTGCAG

[092] Uma sequência de ácidos nucleicos sintéticos que codificam um ORF2 modificado de PCV2 (Ess_ORF2) foi obtida digerindo-se pGTPs-Ess_ORF2 com BamHI e SalI, e inserida em pSP911 cortado com BamHI e SalI. O plasmídeo resultante foi designado como pSP911- Ess_ORF2, e usado para produzir os vírus da varíola suína recombinantes SVR13.

Exemplo 2: Produção de vírus da varíola suína recombinantes (rSPVs) (1) Produção de SVR12 (Figura 3)

[093] O SPV recombinante foi gerado em células ESK-4 pela recombinação homóloga entre genoma de SPV do tipo selvagem e vetores de homologia. As células ESK-4 subconfluentes em uma placa com 6 poços foram infectadas com SPV do tipo selvagem (wtSPV), e 17 horas depois, as células infectadas com wtSPV passaram por transfecção com 2 μg de pSP92-Ess_ORF2 com o uso do reagente Lipofectamin Plus (Invitrogen) e permitiu-se a incubação das mesmas a 37 °C por 5 dias até que o efeito citopático (CPE) tenha ocorrido. Os lisatos celulares das células infectadas-transfectadas foram exibidos para β-galactosidase que expressam placas recombinantes pela adição de 0,5 mg/ml de Bluo-gal (Invitrogen n° de Catálogo: 15.519 a 15.028) na lâmina de sobreposição de agarose de nutriente. Os dois vírus recombinantes livres de wtSPV independentes foram purificados por meio de 3 a 4 ciclos de triagem. O rSPV purificado foi designado como SVR12. Dois clones purificados de SVR12 foram designados como clones 1H2C9D4G5 e 2F5D5E5.

(2) Produção de SVR13 (Figura 3)

[094] As células ESK-4 subconfluentes em uma placa com 6 poços foram infectadas com SPV do tipo selvagem (wtSPV), e 17 horas depois, as células infectadas com wtSPV passaram por transfecção com 2 μg de pSP911-Ess_ORF2 com o uso do reagente Lipofectamin Plus (Invitrogen) e permitiu-se a incubação das mesmas a 37 °C até que o efeito citopático (CPE) tenha ocorrido. Os lisatos celulares das células infectadas-transfectadas foram sementes de transfecção (TFS) para SVR13. TFS foi diluído em 1:20 com meio F-12K de Ham sem FBS, e infectado em células ESK-4 em placas com 96 poços. Sete dias depois, as células infectadas foram lisadas com tampão de lise (Tris-Cl a 20mM, NaCl a 0,1 M, EDTA a 5 mM, SDS a 0,1%, 200 μg/ml de protenase K) seguido do tratamento por calor (60 °C por 5 minutos, e 98 °C por 2 minutos). Essas amostras de DNA lisadas por célula infectada foram exibidas por PCR com um conjunto de iniciadores de 5'- GGCCGTTGATATGATGAGGT-3' (SEQ ID NOTO) e 5'- TCCAGCACTGGCTTAGGAGT-3' (SEQ ID NOT 1).

[095] As amostras que amplificam 0,3 kbp de fragmento de DNA foram positivas, e os sobrenadantes correspondentes foram encaminhados para a próxima etapa de triagem. A triagem foi repetida até que todas as placas mostradas fossem marcadas com ensaio de imunofluorescência (IFA) com o uso de soro de suíno anti-PCV2 (PAB-PCV2, VMR) como o primeiro anticorpo e IgG antissuíno conjugado por FITC (F1638-2ML, SIGMA) como o segundo anticorpo.

[096] Os dois clones recombinantes livres de wtSPV de SVR13 foram purificados de TFS através de três ciclos de triagem e designados como clones G2C2D4 e D10E5A5.

Exemplo 3: Análise in vitro de SPVs recombinantes (1) Expressão de genes PCV2-ORF2 por Western blot

[097] Os tamanhos moleculares de proteínas PCV2-ORF2 expressadas por rSPVs foram analisados por um SDS- PAGE a 15% e análise de Western blot com o uso de soros de rato anti-PCV2. As células ESK-4 foram infetadas com clone SVR12 1H2C9D4G5, clone 2F5D5E5, SVR14, SVR15 ou wtSPV. Seis dias depois, os lisatos celulares foram fracionados em um SDS-PAGE a 15%. As proteínas foram transferidas em uma membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF), Immobilon-P (Merk Millipore, n° de Catálogo: IPVH08130), e bloqueadas com leite seco a 5% em PBS. As manchas de membrana de PDVF foram sondadas com soros de rato anti-PCV2 (1:1.000) como o primeiro anticorpo, seguido da reação com IgG secundária antirrato de cabra conjugada com biotina (1:1.000), e Kit Padrão de VECTASTAIN ABC-AP (Vector Labs, AK-5000). As manchas de membrana foram desenvolvidas com substrato de fosfatase alcalina, Azul de nitrotetrazólio (NBT)/ 5-Fosfato de Bromo-4-Cloro-3-Indolila (BCIP).

[098] Os resultados de western blotting mostraram que SVR12 e SVR13 expressaram dois tipos de ORF2, tamanhos moleculares de 27kDa e 25kDa (Figura 4). A proteína 27kDa anterior corresponde a uma forma precursora, e a última 25kDa corresponde a uma forma processada após a clivagem na extremidade do peptídeo de sinal B5R. Esses resultados demonstraram, desse modo, a expressão eficaz de antígenos dos SPVs da invenção.

(2) Estabilidade a longo prazo e expressão de gene PCV2-ORF2

[099] Para verificar a estabilidade de rSPVs da invenção com o uso do gene IL-18bp como o sítio de inserção, SVR12 e SVR13 foram passados para as células ESK-4 15 vezes. A estabilidade e a expressão de genes inseridos após xl5 passagens foram verificadas por PCR e western blotting. Os resultados de PCR mostraram que os genes inseridos de todos os rSPVs foram estáveis após 15x passagens in vitro (Figura 5). Nenhuma banda de tamanhos irregulares de produtos de gene PCV2-ORF2 apareceu nas faixas de x15 passagens in vitro na membrana de PDVF em comparação com aquela xO passagem por análise western blot.

(3) Crescimento de recombinantes em células animais não-alvo

[0100] A segurança no ambiente de uma vacina viva geneticamente manipulada é uma preocupação importante. Como uma avaliação de risco de segurança de SPVs, a infecciosidade ou a capacidade de crescimento em linhagens celulares ou de animal não-alvo pode ser testada. SPVs geralmente não crescem em células HeLa, mas podem crescer em células Vero. As células Vero foram testadas de modo extensivo e se mostraram como livres de agentes adventícios, e são as mais amplamente aceitas pelas autoridades reguladoras para serem usadas para a produção de vacina como vacinas contra a epidemia de poliomielite e porcino.

[0101] As células vero (ATCC CCL-81; linhagem celular comercial derivada dos rins de um macaco-verde africano) cultivadas em placas com 6 poços foram infectadas em culturas separadas com três SPVs: SVR12 e dois SPVs comparativos, a saber, SVR3, que compreende um gene ORF2 no sítio de clonagem de ARP e SVR7, que compreende um gene ORF2 no sítio de clonagem de TK. A infecção foi realizada em duas multiplicidades de infeção (MOI) (Alta: ~0,01, e Baixa: ~0,001), e as células foram cultivadas em incubador a 37°C com CO2 a 5% por duas semanas após a infecção. Em 0, 4, 7, 11 e 14 dias após a infecção (DPI), as células infectadas e os sobrenadantes foram recuperados, congelados e descongelados. As quantidades de vírus infeccioso em 0, 4, 7, 11 e 14 DPI foram tituladas pelo ensaio TCID50 com o uso de células ESK-4 em placas com 24 poços.

[0102] Os resultados são resumidos na Tabela 1 e na Figura 6. As razões de crescimento relativo para cada título de '0 DPT são mostradas entre parênteses na Tabela 1, e o curso temporal das razões de crescimento relativo é plotado na Figura 6. Os resultados mostraram surpreendentemente que a capacidade de crescimento de SPVs recombinantes é influenciada pelos sítios de inserção, e que os SPVs recombinantes da invenção, com o uso do gene IL-18bp como o sítio de inserção, vantajosamente não cresceram em células Vero.

[0103] Isso é uma vantagem adicional dos SPVs recombinantes da invenção que usam gene IL-18bp como o sítio de inserção no ponto de menor risco em relação ao ambiente.

[0104] Tabela 1 Crescimento de rSPVs em células Vero

Exemplo 4: Indução de respostas imunológicas in vivo

[0105] Os grupos (N=7) de leitões de 4 anos de anticorpo negativo anti-PCV2 foram imunizados por via subcutânea no lóbulo da orelha esquerda com cada um dos SPVs recombinantes, SVR7 ou SVR12 em 5.0E+04 TCID50/porco, ou com PBS. As amostras de sangue foram retiradas da veia jugular externa em pré-imune, 1, 2 e 3 semanas após a imunização (wpi), e o anticorpo anti-PCV2 em soros foi medido pela imunofluorescência indireta. As células RPF-2 infectadas com PCV2 foram cultivadas nas placas de cultura de tecido com 96 poços, e fixadas por acetona/metanol (2:1). Após o boqueio com leite desnatado a 0,5% em PBS por 1 hora, as diluições duplas dos soros foram dispostas em camadas sobre os poços de placa de cultura de tecido de 96 poços e incubadas por 1 hora a 37°C. Os soros de porco PAB-PCV2 (VMRD) serialmente diluídos foram também dispostos em camadas em uma faixa de cada placa de 96 poços como soros de controle positivo. Após a incubação, as placas foram lavadas 3 vezes e os anticorpos IgG-FITC antiporco produzidos em coelho (SIGMA n° de Catálogo: F1638, 1:1000) foram dispostos em camadas sobre os poços de placa cultura de tecido de 96 poços e incubados por 1 hora a 37°C. Após a incubação, as placas foram lavadas com PBS três vezes. Os sinais dos anticorpos secundários foram detectados por uma microscopia fluorescente, e o sinal positivo ou negativo de cada poço foi registrado. A mais alta diluição que resulta em uma reação fluorescente positiva foi o título IF da amostra, e os erros experimentais dentre as placas e dias foram calibrados pelo título IF (1:2560) dos soros de controle positivo.

[0106] Os resultados obtidos mostram que os títulos IF médios de grupo vacinado com SVR12 foram estatisticamente (p<0,05) mais altos que os do grupo vacinado com SVR7. Além disso, a observação clínica de marca ou vermelhidão formada nos sítios de vacinação foi iniciada a partir de 1 a 3 wpi. Os tamanhos de marca pico do grupo vacinado com SVR12 foram menores que os do grupo vacinado com SVR7.

[0107] Os resultados acima indicam que o rSPV da invenção no qual um gene exógeno é inserido no gene IL-18bp, como SVR12, foi mais atenuado, e poderia induzir respostas imunológicas mais altas do que o rSPV que usa sítio TK como o sítio de inserção como SVR7.

Claims (13)

1. VÍRUS DA VARÍOLA SUÍNA RECOMBINANTE (rSPV), caracterizado por compreender pelo menos uma primeira sequência genética exógena em seu genoma, em que a dita primeira sequência genética exógena é inserida no gene de proteína de ligação IL-18 (IL18bp) do genoma de rSPV, e em que a primeira sequência genética exógena ser inserida na substituição de toda ou uma porção da sequência genética de IL18bp viral.

2. rSPV, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo genoma de rSPV compreender uma deleção de pelo menos l00bp da sequência genética de IL18bp, e em que a primeira sequência genética exógena está situada na dita deleção.

3. rSPV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por compreender adicionalmente pelo menos uma segunda sequência genética exógena inserida em uma região distinta do genoma de rSPV.

4. rSPV, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pela dita segunda sequência genética exógena ser inserida no gene de timidina quinase (TK) viral ou gene de proteína de repetição de anquirina.

5. rSPV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pela primeira e/ou a segunda sequências genéticas exógenas codificarem um antígeno.

6. rSPV, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pela dita primeira e/ou a segunda sequências genéticas exógenas codificarem um antígeno de PCV2.

7. rSPV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pela primeira ou a segunda sequências genéticas exógenas codificarem um antígeno capsular de PCV2.

8. rSPV, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pela dita primeira ou a segunda sequências genéticas exógenas codificarem uma proteína ou peptídeo ORF2 de PCV2.

9. rSPV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por cada uma dentre a primeira e/ou a segunda sequências genéticas exógenas conterem um promotor transcricional.

10. rSPV, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo promotor ser selecionado a partir do promotor de 7,5 kD (P7,5k), promotor de 11 kD (P1lk) ou promotor de 28 kD (P28k) do vírus vaccinia, um promotor de Poxvírus sintético artificial (Ps), o promotor beta-actina (Bac) de frango ou um derivado do mesmo, o promotor Pec, o promotor imediato-precoce (ie)1 de Citomegalovírus Murino (Mcmv), o promotor de Citomegalovírus Humano (Hcmv), o promotor de vírus Símio (SV)40, e o promotor de vírus do Sarcoma de Raus (RSV) ou quaisquer fragmentos dos mesmos que retêm uma atividade de promotor.

11. rSPV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por compreender um gene exógeno que codifica um antígeno de PCV2 em seu genoma, em que o dito gene exógeno é inserido no gene IL18bp do genoma de rSPV.

12. MÉTODO PARA PRODUZIR UM rSPV, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado por compreender infectar uma célula competente com uma molécula de ácido nucleico que compreende o genoma de um rSPV, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, e coletar o rSPV.

13. COMPOSIÇÃO, caracterizada por compreender um rSPV, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, e um excipiente.