ES2748468T3 - Virus de viruela porcina recombinante y vacunas - Google Patents
Virus de viruela porcina recombinante y vacunas Download PDFInfo
- Publication number
- ES2748468T3 ES2748468T3 ES15813838T ES15813838T ES2748468T3 ES 2748468 T3 ES2748468 T3 ES 2748468T3 ES 15813838 T ES15813838 T ES 15813838T ES 15813838 T ES15813838 T ES 15813838T ES 2748468 T3 ES2748468 T3 ES 2748468T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- rspv
- promoter
- gene sequence
- virus
- genome
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 54
- 241000700565 Swinepox virus Species 0.000 title abstract description 62
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 101
- 108010070145 interleukin-18 binding protein Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 36
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 31
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 31
- 241001673669 Porcine circovirus 2 Species 0.000 claims description 29
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 27
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 23
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 23
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 22
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 21
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 11
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 10
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 claims description 10
- 101100382437 Porcine circovirus 2 Cap gene Proteins 0.000 claims description 9
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 claims description 9
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 8
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 claims description 8
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 claims description 8
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 6
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 4
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 claims description 3
- 102000008102 Ankyrins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010049777 Ankyrins Proteins 0.000 claims description 2
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 claims description 2
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 2
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 claims description 2
- 101000834253 Gallus gallus Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 claims 1
- 241000701029 Murid betaherpesvirus 1 Species 0.000 claims 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 claims 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims 1
- 102000044166 interleukin-18 binding protein Human genes 0.000 abstract description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 66
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 25
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 24
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 19
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 18
- 241000700566 Swinepox virus (STRAIN KASZA) Species 0.000 description 16
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 16
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 14
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 14
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 11
- 241000589902 Leptospira Species 0.000 description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 9
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 9
- 101710159752 Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase subunit PhaE Proteins 0.000 description 8
- 101710130262 Probable Vpr-like protein Proteins 0.000 description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 8
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 7
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 7
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 7
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 7
- 101100191131 Arabidopsis thaliana P67 gene Proteins 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 5
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 5
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- -1 lymphokine Substances 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 5
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 4
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150009852 ORF2 gene Proteins 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N (+/-)-1,3-Butanediol Chemical compound CC(O)CCO PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L (5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl) phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP([O-])(=O)[O-])=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 2
- 241000606750 Actinobacillus Species 0.000 description 2
- 241000701386 African swine fever virus Species 0.000 description 2
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 2
- 101100367235 Arabidopsis thaliana SVR3 gene Proteins 0.000 description 2
- 241001235572 Balantioides coli Species 0.000 description 2
- 241000588779 Bordetella bronchiseptica Species 0.000 description 2
- 241001148534 Brachyspira Species 0.000 description 2
- 241000722022 Brachyspira innocens Species 0.000 description 2
- 241000510930 Brachyspira pilosicoli Species 0.000 description 2
- 241001148111 Brucella suis Species 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 2
- 241001647373 Chlamydia abortus Species 0.000 description 2
- 241001674218 Chlamydia pecorum Species 0.000 description 2
- 241000710777 Classical swine fever virus Species 0.000 description 2
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 2
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 2
- 241000223936 Cryptosporidium parvum Species 0.000 description 2
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 2
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 2
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 2
- 241000710945 Eastern equine encephalitis virus Species 0.000 description 2
- 241000223924 Eimeria Species 0.000 description 2
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000186810 Erysipelothrix rhusiopathiae Species 0.000 description 2
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 2
- 241000606807 Glaesserella parasuis Species 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000710842 Japanese encephalitis virus Species 0.000 description 2
- 241001469654 Lawsonia <weevil> Species 0.000 description 2
- 241000589929 Leptospira interrogans Species 0.000 description 2
- 241001550390 Leptospira interrogans serovar Canicola Species 0.000 description 2
- 241001518154 Leptospira kirschneri serovar Grippotyphosa Species 0.000 description 2
- 241001293418 Mannheimia haemolytica Species 0.000 description 2
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 2
- 241000186367 Mycobacterium avium Species 0.000 description 2
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 2
- 241001138504 Mycoplasma bovis Species 0.000 description 2
- 241000579205 Mycoplasma suis Species 0.000 description 2
- 239000005662 Paraffin oil Substances 0.000 description 2
- 241000606856 Pasteurella multocida Species 0.000 description 2
- 241000156302 Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus Species 0.000 description 2
- 241000702619 Porcine parvovirus Species 0.000 description 2
- 241001135989 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus Species 0.000 description 2
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 2
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 2
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 2
- 241000608282 Sagiyama virus Species 0.000 description 2
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 2
- 241001138501 Salmonella enterica Species 0.000 description 2
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 2
- 241000191982 Staphylococcus hyicus Species 0.000 description 2
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 2
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 2
- 241001485053 Suid betaherpesvirus 2 Species 0.000 description 2
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 2
- 208000003217 Tetany Diseases 0.000 description 2
- 241000223997 Toxoplasma gondii Species 0.000 description 2
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 2
- 208000010399 Wasting Syndrome Diseases 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 208000007456 balantidiasis Diseases 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 2
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 description 2
- 229940057995 liquid paraffin Drugs 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N nitro blue tetrazolium(2+) Chemical compound COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940051027 pasteurella multocida Drugs 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 201000010740 swine influenza Diseases 0.000 description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 2
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N (2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dimethoxy-2-(methoxymethyl)-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trimethoxy-6-(methoxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4,5,6-trimethoxy-2-(methoxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxane Chemical compound CO[C@@H]1[C@@H](OC)[C@H](OC)[C@@H](COC)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](OC)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OC)[C@H](OC)O[C@@H]2COC)OC)O[C@@H]1COC LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N 0.000 description 1
- LINMATFDVHBYOS-MBJXGIAVSA-N (2s,3r,4s,5r,6r)-2-[(5-bromo-1h-indol-3-yl)oxy]-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C=C12 LINMATFDVHBYOS-MBJXGIAVSA-N 0.000 description 1
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940058015 1,3-butylene glycol Drugs 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- HIQIXEFWDLTDED-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxy-1-piperidin-4-ylpyrrolidin-2-one Chemical compound O=C1CC(O)CN1C1CCNCC1 HIQIXEFWDLTDED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 235000003911 Arachis Nutrition 0.000 description 1
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101000609447 Beet necrotic yellow vein virus (isolate Japan/S) Protein P25 Proteins 0.000 description 1
- 101100472050 Caenorhabditis elegans rpl-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 1
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 1
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 101100364969 Dictyostelium discoideum scai gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 239000001856 Ethyl cellulose Substances 0.000 description 1
- ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N Ethyl cellulose Chemical compound CCOCC1OC(OC)C(OCC)C(OCC)C1OC1C(O)C(O)C(OC)C(CO)O1 ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 description 1
- 241000701047 Gallid alphaherpesvirus 2 Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 102100038353 Gremlin-2 Human genes 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 108010031571 Marek's disease virus glycoprotein B Proteins 0.000 description 1
- 241001502481 Meleagrid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 101001032860 Mus musculus Gremlin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101100364971 Mus musculus Scai gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 1
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 description 1
- 239000004264 Petrolatum Substances 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 241000202347 Porcine circovirus Species 0.000 description 1
- 101000984477 Porcine circovirus 2 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000011053 TCID50 method Methods 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001615 Tragacanth Polymers 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 206010044565 Tremor Diseases 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 238000002832 anti-viral assay Methods 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000000305 astragalus gummifer gum Substances 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 235000019437 butane-1,3-diol Nutrition 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 229940105329 carboxymethylcellulose Drugs 0.000 description 1
- 235000010418 carrageenan Nutrition 0.000 description 1
- 239000000679 carrageenan Substances 0.000 description 1
- 229920001525 carrageenan Polymers 0.000 description 1
- 229940113118 carrageenan Drugs 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000003240 coconut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019864 coconut oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 235000005687 corn oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002285 corn oil Substances 0.000 description 1
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002385 cottonseed oil Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L disodium;(4-nitrophenyl) phosphate;hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000624 ear auricle Anatomy 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 235000019325 ethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001249 ethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229960004667 ethyl cellulose Drugs 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000001866 hydroxypropyl methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010979 hydroxypropyl methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920003088 hydroxypropyl methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N hydroxypropyl methyl cellulose Chemical compound OC1C(O)C(OC)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 1
- XUGNVMKQXJXZCD-UHFFFAOYSA-N isopropyl palmitate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC(C)C XUGNVMKQXJXZCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004731 jugular vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 201000003265 lymphadenitis Diseases 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229960002900 methylcellulose Drugs 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000002941 microtiter virus yield reduction assay Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N n-(2-chloroethyl)-n-nitrosomorpholine-4-carboxamide Chemical compound ClCCN(N=O)C(=O)N1CCOCC1 LWGJTAZLEJHCPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002956 necrotizing effect Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019271 petrolatum Nutrition 0.000 description 1
- 229940066842 petrolatum Drugs 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920001515 polyalkylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L potassium sulfate Chemical compound [K+].[K+].[O-]S([O-])(=O)=O OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910052939 potassium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011151 potassium sulphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 235000013772 propylene glycol Nutrition 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012502 risk assessment Methods 0.000 description 1
- 235000005713 safflower oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000003813 safflower oil Substances 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 1
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 1
- 229920002545 silicone oil Polymers 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 1
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 1
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229940098465 tincture Drugs 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 239000007762 w/o emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L zinc;1-(5-cyanopyridin-2-yl)-3-[(1s,2s)-2-(6-fluoro-2-hydroxy-3-propanoylphenyl)cyclopropyl]urea;diacetate Chemical compound [Zn+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O.CCC(=O)C1=CC=C(F)C([C@H]2[C@H](C2)NC(=O)NC=2N=CC(=CC=2)C#N)=C1O UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/24043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24071—Demonstrated in vivo effect
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/10011—Circoviridae
- C12N2750/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Un virus de la viruela porcina recombinante (rSPV) que comprende al menos una primera secuencia de gen foránea en su genoma, en el que dicha primera secuencia de gen foránea se inserta en el gen de la proteína de unión a IL-18 (IL18bp) del genoma de rSPV.
Description
DESCRIPCIÓN
Virus de viruela porcina recombinante y vacunas
La presente invención se refiere a nuevos virus recombinantes de viruela porcina y su uso en composiciones de vacunas. Los virus de la viruela porcina recombinantes de la invención se producen insertando uno o más genes foráneos en el gen de la proteína de unión a IL-18 (IL18bp) del virus de la viruela porcina. La invención es particularmente adecuada para producir vacunas porcinas, particularmente para la vacunación de cerdos contra la infección por PCV2.
Antecedentes
Se han propuesto diferentes tipos de virus en la técnica como vectores para la administración de genes o la expresión de péptidos in vivo. En particular, se han preparado vacunas veterinarias que expresan al menos un antígeno relevante usando virus recombinantes tales como poxvirus (Ogawa R. et al., Vaccine, 8: 486-490 (1990)), adenovirus (HSU, K.H. et al., Vaccine, 12; 607-612 (1994)), baculovirus, así como herpesvirus (Shin, M. -F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 5867-5870 (1984)). Ejemplos de vectores de virus específicos que permiten la expresión de un gen para un antígeno foráneo incluyen el virus de la enfermedad de Aujeszky (virus de la seudorrabia; PRV) (Van Zijl M. et al., J. Virol., 65: 2761-2765 (1991)), herpesvirus de pavo (HVT) (Morgan R.W. et al., Avian Dis. 36: 858-870 (1992)) y el virus de la enfermedad de Marek (MDV). Los vectores recombinantes basados en el género herpesvirus están bajo estudio intensivo.
Sin embargo, existe la necesidad en la técnica de nuevos productos de vectores virales que puedan usarse para expresar péptidos o proteínas recombinantes in vivo. A este respecto, los poxvirus han sido diseñados para codificar diferentes polipéptidos. Los poxvirus, una vez liberados en la sangre por las células infectadas, pueden infectar otras células y, por lo tanto, potencialmente conducir a niveles de expresión elevados. Los poxvirus recombinantes se han producido a partir de diferentes tipos de poxvirus, incluidos el virus de la viruela vacuna, el virus vaccinia y el virus de la viruela porcina (SPV). Hasta ahora, sin embargo, los recombinantes SPV se han producido esencialmente clonando secuencias de genes foráneas en una región genética que se considera no esencial para la supervivencia de SPV, la región TK (Richard W. Moyer, Eladio Vinuela, E.P.J. Gibbs, US 5,651,972 (1997)).
Los inventores de la presente invención han encontrado y validado una nueva región de inserción de genes de SPV en la que se pueden insertar una variedad de secuencias de genes foráneas. Los virus SPV recombinantes resultantes permiten una expresión eficiente y estable de la secuencia del gen clonado, y tienen una gran capacidad de clonación. Además, estos virus tienen una inmunogenicidad mejorada in vivo y pueden usarse para producir terapias o vacunas para el tratamiento de cualquier mamífero, particularmente en cerdos.
Compendio de la invención
La presente invención se refiere a nuevos virus recombinantes de viruela porcina y su uso para la administración y expresión de genes in vivo, particularmente en composiciones de vacunas. Los virus de la viruela porcina recombinantes de la invención contienen una o más secuencias de genes foráneas en el gen de la proteína de unión a IL-18 (IL18bp) del virus de la viruela porcina. La invención es particularmente adecuada para producir vacunas porcinas, particularmente para la vacunación de cerdos contra la infección por PCV2.
Por lo tanto, un primer objeto de la presente invención se refiere a un virus de la viruela porcina recombinante (rSPV) que comprende al menos una primera secuencia de gen foránea en su genoma, en el que dicha primera secuencia de gen foránea se inserta en el gen IL18bp del genoma de rSPV. En una realización particular, la secuencia de gen foránea se inserta en reemplazo de toda o parte de la secuencia del gen IL18bp viral. En una realización particular adicional, el rSPV de la invención comprende además al menos una segunda secuencia de gen foránea insertada en una región distinta del genoma de rSPV, por ejemplo, en el gen viral de timidina quinasa (TK) o el gen de proteína repetida de Ankyrin.
Otro objeto de la invención reside en una molécula de ácido nucleico que comprende el genoma de un rSPV como se definió anteriormente.
Un objeto adicional de la invención es una célula huésped que comprende un rSPV o una molécula de ácido nucleico de la invención.
La presente invención proporciona además un método para producir un rSPV, que comprende infectar o introducir en una célula competente una molécula de ácido nucleico como se definió anteriormente y recolectar el rSPV.
La invención también se refiere a un método para propagar un rSPV, que comprende infectar una célula competente con un rSPV como se definió anteriormente y recolectar el rSPV producido por dichas células.
La invención también se refiere a una composición, preferiblemente una composición veterinaria, que comprende un rSPV como se definió anteriormente, o una célula como se definió anteriormente, o una molécula de ácido nucleico como se definió anteriormente, y un excipiente.
Un objeto adicional de la invención es una composición de vacuna que comprende un rSPV como se definió anteriormente, o una célula como se definió anteriormente, o una molécula de ácido nucleico como se definió anteriormente, un excipiente adecuado y, opcionalmente, un adyuvante.
La invención también se refiere a un rSPV o célula o molécula de ácido nucleico como se definió anteriormente para su uso para administrar un péptido o proteína terapéutico o de vacuna a un porcino.
La invención también se refiere a un rSPV o célula o molécula de ácido nucleico como se definió anteriormente para su uso para inmunizar o vacunar un porcino contra un patógeno.
La invención también se refiere a un kit de vacunación para inmunizar un porcino que comprende los siguientes componentes:
a. una cantidad efectiva de un rSPV o vacuna como se definió anteriormente, y
b. un medio para administrar dicho rSPV o vacuna a dicho porcino.
Un objeto adicional de la invención se refiere a un plásmido o vector lanzadera que comprende un transgén flanqueado por dos secuencias de ácido nucleico homólogas a la secuencia del gen IL18bp, permitiendo dichas secuencias flanqueantes la recombinación homóloga entre el plásmido lanzadera y un genoma s Pv .
La invención puede usarse para administrar y expresar cualquier secuencia génica foránea a un mamífero, particularmente un porcino. Es particularmente adecuado para expresar antígenos foráneos para inmunizar o vacunar porcino (por ejemplo, cerdos, lechones, cerdas).
Leyenda de las figuras
Figura 1. Construcción del plásmido homólogo pSP92-Ess_ORF2.
Figura 2. Construcción del plásmido homólogo pSP911-Ess_ORF2.
Figura 3. Ilustración de las estructuras genómicas de los SPV parentales y recombinantes.
Figura 4. Inmunoprecipitación Western de SVR12 y SVR13 purificados.
Las células ESK-4 se infectaron con SPV parental (p), clon SVR12 1H2C9D4G5 (G5) o clon 2F5D5E5 (E5), o clon SVR13 G2C2D4 (D4), o clon D10E5A5 (a 5). Seis días después, los lisados celulares se aplicaron a SDS-Pa GE al 15% y análisis de inmunoprecipitación Western usando anti-ORF2 de rata (1:500), IgG secundaria de cabra anti-rata conjugada con biotina (1:1000) y ABC-ALP (Vecterstain). M: marcador de peso molecular.
Figura 5. Verificación por PCR de pasaje in vitro de rSPVs.
(A) Resultados de la PCR: la PCR se realizó utilizando un conjunto de cebadores de SP7450F y SP8552R. Cada plantilla era ADN de virus del pase in vitro 0 o 15p del clon SVR12 1H2C7F3E5 (E5), el clon 2F5D5E5G5 (G5) y el clon SVR13 G2C2D4 (D4), o el clon D10E5A5 (A5). Cada plásmido de transferencia en la transfección para hacer SVR12 o SVR13, y pCR4-SPV6030/9574, se usó para una plantilla de control positivo (PC) o control negativo (NC), respectivamente. Los marcadores de peso molecular fueron 10 kb (M1) y pHY. (B) Regiones flanqueantes IL-18bp parentales y rSPVs. El recuadro amarillo es el gen IL-18bp.
Figura 6. Crecimiento relativo de rSPV en células Vero.
Las células Vero en placas de 6 pozos se infectaron con cada uno de los tres tipos de SPV recombinantes, SVR3, SVR7 o SVR12, a una MOI alta (aproximadamente 0.01) o baja (aproximadamente 0.001). A los 0, 4, 7, 11 y 14 días después de la infección (DPI), cada célula infectada y sobrenadante se cosecharon con raspadores celulares, y se congelaron y descongelaron. Para la titulación del virus, estos lisados celulares después de centrifugar se diluyeron en serie, se infectaron en células ESK-4 y se incubaron a 37°C durante 1 semana para formar placas. Las relaciones de crecimiento relativas se calcularon sobre la base de cada título de 0 DPI.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a los nuevos virus de la viruela porcina recombinantes y sus usos. Los virus de la viruela porcina recombinantes de la invención contienen una o más secuencias de genes foráneos en el gen de la proteína de unión a IL-18 (IL18bp) del virus de la viruela porcina. Como se muestra en la sección experimental, estos nuevos vectores SPV permiten una expresión génica sostenida y eficiente. Además, los rSPV de la invención son estables y pueden producir respuestas inmunes mejoradas in vivo. Además, sorprendentemente, los vectores SPV de la invención son más seguros que los SPV anteriores ya que no crecen en células de mamífero tales como las células Vero. Este es el primer informe de un virus SPV que contiene un gen IL18-bp eliminado, y la primera demostración de que las secuencias de genes foráneas pueden clonarse en este sitio dando como resultado vectores SPV recombinantes estables, inmunogénicos y altamente productores. El rSPV de la invención puede contener además
más de una secuencia de gen foránea, insertada en la misma ubicación o en ubicaciones distintas. Se pueden usar solos o en combinación con otros virus o antígenos recombinantes para generar vacunas mejoradas. La invención es particularmente adecuada para producir vacunas porcinas, particularmente para la vacunación de cerdos contra la infección por PCV2.
rSPVs
Dentro del contexto de la invención, un virus de la viruela porcina recombinante designa un virus de la viruela porcina que tiene un genoma diseñado artificialmente (por ejemplo, por vía recombinante) como se menciona en las reivindicaciones. El rSPV incluye, particularmente, virus de la viruela porcina que contienen material genético foráneo o secuencia en su genoma. El rSPV típicamente comprende un genoma de SPV que contiene una secuencia genética foránea, empaquetada en una cápside o envoltura de SPV, que también puede contener una proteína o péptido foráneo.
El rSPV de la presente invención puede prepararse a partir de cualquier SPV, tal como cualquier SPV natural o cualquier SPV disponible de colecciones tales como ATCc , CNCM, etc. Preferiblemente, el rSPV de la invención se produce a partir de la cepa kasza SPV (VR-363), aislado 17077-99 (GeneBank Acc: AF410153.1), o cepa VTCC/AVA/121 (GeneBank Acc: KJ725378.1). Dichos SPV están disponibles en colecciones o bibliotecas, o pueden clonarse a partir de sus secuencias genómicas disponibles públicamente. Otros aislados de SPV también pueden aislarse de animales infectados y usarse para preparar rSPV de la invención.
SPV o rSPV pueden cultivarse o mantenerse o propagarse en cualquier célula adecuada. Por ejemplo, los SPV pueden cultivarse, mantenerse o propagarse en células embrionarias de riñón porcino, como las células ESK-4 (CL-184), cultivarse de forma rutinaria a 37°C en 5% de CO2 en medio de Ham F-12K (Gibco, Cat. No.: 21127-022) suplementado con estreptomicina-penicilina al 1% (Gibco, Cat. No.: 15140-122) y 5% de FBS (Gibco, Cat. No.: 10437-028).
Para construir un virus recombinante de la presente invención, inicialmente, el virus SPV puede propagarse en una célula huésped adecuada y luego se obtiene el ADN genómico. Posteriormente, se identifica la región IL18bp del ADN genómico, opcionalmente eliminada, en todo o en parte, y se inserta una secuencia de gen foránea (o un sitio de clonación que permite la inserción de una secuencia de gen foránea) en la región, opcionalmente en reemplazo de toda o parte de la secuencia del gen IL18bp endógeno. El genoma de SPV recombinante así obtenido puede usarse para producir rSPV mediante transformación de células competentes adecuadas de acuerdo con técnicas convencionales. Alternativamente, se puede producir un vector lanzadera que contenga una secuencia de gen foránea (o un sitio de clonación) flanqueado por secuencias homólogas a las regiones del gen IL18bp. Tras la introducción en una célula competente en presencia de un virus o genoma de SPV, la recombinación homóloga entre el vector lanzadera y el genoma genera el rSPV. Por supuesto, una vez que un rSPV ha sido diseñado como se describió anteriormente, puede ser fácilmente replicado y propagado por cultivo simple en cualquier célula competente.
Los SPV pueden cultivarse, mantenerse o propagarse en células embrionarias de riñón porcino, como las células ESK-4 (CL-184), cultivarse rutinariamente a 37°C en 5% de CO2 en medio de Ham F-12K (Gibco, Cat. No.: 21127-022) suplementado con estreptomicina-penicilina al 1% (Gibco, Cat. No.: 15140-122) y 5% de FBS (Gibco, Cat. No.: 10437 028). El ADN se puede extraer de las células infectadas por virus de acuerdo con cualquier método convencional. Por ejemplo, las células cultivadas en monocapas pueden rasparse y luego rotarse para recolectar el sobrenadante. Después de desnaturalizar la proteína en un tampón de lisis y eliminarla, el ADN se puede extraer con fenol y/o etanol.
El gen IL18bp de un ADN SPV viral contiene aproximadamente 402 pb, y generalmente se encuentra en los restos nt 7745-8146 del genoma SVP. Como ejemplo específico, en la cepa SPV kasza (VR-363), el gen IL18bp se encuentra en nt7745-8146.
En una realización particular, los rSPV de la invención contienen una secuencia de gen foránea insertada en una ubicación entre nt 7750 y nt 8140 de un genoma de SPV. La inserción de la secuencia de gen foránea provoca una interrupción de la secuencia del gen IL18bp nativo, lo que generalmente impide la expresión de una IL18bp funcional. En una realización preferida, la secuencia de gen foránea se inserta en reemplazo de la secuencia del gen IL18bp. A este respecto, los rSPV preferidos de la invención comprenden una eliminación de al menos 10 a aproximadamente 400nt de la secuencia del gen genómico IL18bp, y una secuencia de gen foránea localizada en lugar de la secuencia eliminada.
Los rSPV preferidos de la invención comprenden una secuencia génica foránea contenida en el gen IL18bp, en donde el gen IL18bp endógeno carece de al menos 50nt, preferiblemente al menos 100nt, incluso más preferiblemente al menos 150nt, al menos 200nt, al menos 250nt, al menos 300nt, más preferiblemente entre 320nt y 380nt.
Los rSPV específicos y preferidos de la invención contienen una eliminación de al menos nt 100-200 del gen IL18bp, incluso más preferiblemente de al menos nt50-300 del gen IL18bp, tal como nt19-369 del gen IL18bp.
La construcción de un rSPV de la invención puede llevarse a cabo utilizando métodos conocidos per se en la técnica, siguiendo la guía e información contenida en la presente solicitud. En particular, el experto en la técnica puede insertar una secuencia de gen foránea en la secuencia de IL18bp, en reemplazo o toda o parte de la secuencia endógena, utilizando métodos conocidos tales como mutagénesis, PCR, recombinación homóloga, etc.
En una realización particular, se prepara un vector lanzadera mediante tecnología de ADN recombinante en el que una secuencia de gen foránea se clona flanqueada por dos regiones de homología de IL18bp. Las regiones de homología típicamente contienen cada una entre 50-1000 nt de secuencia del gen IL18bp, lo que permite una recombinación homóloga específica. El vector lanzadera puede prepararse a partir de cualquier plásmido, cósmido, fago y similares conocidos o convencionales, tales como plásmidos pBS, pBR322, pUC18, pUC19 y pHC79. El plásmido lanzadera se puede introducir luego en una célula infectada con SPV usando técnicas conocidas tales como electroporación, fosfato de calcio, un método basado en lipofectina o similares. Luego se seleccionan los virus SPV recombinantes que han integrado la secuencia de gen foránea. Su secuencia puede ser verificada. El rSPV puede mantenerse en cualquier celda competente adecuada. El virus puede mantenerse en cultivo, o purificarse y congelarse o liofilizarse.
Secuencia de genes foránea
La secuencia de genes foránea puede ser cualquier secuencia de ácidos nucleicos o molécula que no esté presente de forma natural en un genoma de SPV, o que no esté presente de forma natural en dicha ubicación en un genoma de SPV. Una secuencia de gen foránea típicamente comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un ARNm, un péptido o un polipéptido (o proteína). La secuencia de gen foránea puede, por ejemplo, codificar diversos tipos de moléculas activas, como un antígeno, adyuvante, citoquina, linfocina, factor de crecimiento, enzima, marcador, etc.
En una realización preferida, la secuencia de gen foránea codifica un antígeno (péptido, polipéptido o antígeno de proteína) de un patógeno de una enfermedad infecciosa porcina, y lo más preferiblemente un antígeno de un virus, bacteria, hongo o protozoo. Dentro del contexto de la invención, un péptido típicamente designa una molécula que comprende de 4 a 30 aminoácidos. Un polipéptido es cualquier polímero de aminoácidos que comprende más de 30 aminoácidos. El término polipéptido incluye proteínas de longitud completa.
La secuencia de genes foránea codifica preferiblemente un péptido o polipéptido (por ejemplo, glucoproteína, proteína de la cápside o fragmento de la misma) de un virus o patógeno seleccionado de circovirus porcino (PCV1, PCV2, PCV2A, PCV2B), Actinobacillus pleuropneunomia; adenovirus; alfavirus tales como los virus de la encefalomielitis equina del este; Balantidium coli; Bordetella bronchiseptica; Brachyspira spp., preferiblemente B. hyodyentheriae, B.pilosicoli, B. innocens, Brucella suis, preferiblemente biovars 1, 2 y 3; virus de la peste porcina clásica, virus de la peste porcina africana; Chlamydia y Chlamydophila sp. y preferiblemente C. pecorum y C. abortus; Clostridium spp., preferiblemente Cl. difficile, Cl. perfringens tipos A, B y C, Cl.novyi, Cl.septicum, Cl.tetani; Coronavirus digestivo y respiratorio; Cryptosporidium parvum; Eimeria spp; Eperythrozoonis suis actualmente llamado Mycoplasma haemosuis; Erysipelothrix rhusiopathiae; Escherichia coli; Haemophilus parasuis, preferiblemente subtipos 1, 7 y 14; virus de encefalomielitis hemaglutinante; lsospora suis; virus de la encefalitis japonesa; Intracelulares de Lawsonia; Leptospira spp., preferiblemente Leptospira australis, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagicae, Leptospira interrogans, Leptospira pomona y Leptospira tarassovi; Mannheimia haemolytica; Mycobacterium spp. preferiblemente, M. avium, M. intracelular y M. bovis: Mycoplasma hyponeumoniae; Parvovirus; Pasteurella multocida; citomegolovirus porcino; Parvovirus porcino, virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino: virus de la seudorrabia; Rotavirus; virus Sagiyama; Salmonella spp. preferiblemente, S. thyhimurium y S.choleraesuis; Staphylococcus spp., preferiblemente, S. hyicus; Streptococcus spp., preferiblemente Strep, suis; citomegalovirus porcino; virus del herpes porcino; virus de la gripe porcina; virus de la viruela porcina; Toxoplasma gondii; virus de la estomatitis vesicular o virus del exantema de los cerdos.
En una realización particularmente preferida, la secuencia de gen foránea codifica un antígeno PCV2, particularmente una proteína o péptido PCV2, incluso más particularmente una proteína o péptido de cápside PCV2 (por ejemplo, ORF2).
La secuencia de gen foránea puede contener un promotor transcripcional para permitir o aumentar la expresión del ARNm o polipéptido codificado. El promotor utilizado puede ser un promotor sintético o natural, que incluye un promotor SPV, un promotor de poxvirus o un promotor derivado de diferentes virus o células, tales como promotores derivados de organismos eucariotas o procariotas. Ejemplos específicos de promotores incluyen el promotor del virus vaccinia 7.5-kD (P7.5k) (Davison A.J. et al., J. Mol. Biol., 210(4): 749-69 (1989)), promotor 11-kD (P11k) (Bertholet et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 82: 2096-2100 (1985)) o promotor de 28 kD (P28k) (Weir J.P. & Moss B., J. Virol. 61: 75-80 (1987)), o un promotor sintético artificial de poxvirus (Ps), el promotor de timidina quinasa del herpesvirus (Ross L.J., Gen. Virol.
74: 371-377 (1993)), promotor de proteína gB (supra) de HVT o MDV, el promotor IE de citomegalovirus humano (HCMV) (Alting-Mess M.A., Nucleic Acids Res., 17: 9494 (1989)), promotor Sv 40 (Gunning P., Proc. Natl. Acad. Sci., 84: 4931-4835 (1987)), promotor de la [beta]actina (supra, y Kost A.T., Nucleic Acids Res., 11: 8287-8301 (1983)), promotor de la [beta]-globina (Spitzner J.R., Nucleic Acids Res., 18: 1-11 (1990)), el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous (Fiek A. et al., Nucleic Acids Res., 20: 1785 (1992)), y similares. Además, también se pueden usar promotores de las proteínas estructurales o los genes esenciales de SPV.
El rSPV de la invención puede contener varias secuencias de genes foráneas, ubicadas en una misma región de clonación (es decir, IL18bp) y/o en sitios de clonación distintos (uno de ellos es IL18bp). En una realización particular, el rSPV de la invención comprende al menos 2 secuencias de genes foráneas que codifican dos antígenos distintos (de un patógeno igual o distinto). En una realización particular adicional, el rSPV de la invención comprende al menos
una secuencia de gen foránea que codifica un antígeno PCV2 y una secuencia de gen foránea que codifica un antígeno distinto. En otra realización particular, el rSPV de la invención comprende una secuencia de gen foránea que codifica un antígeno y una secuencia de gen foránea que codifica un adyuvante o una citoquina. En tal rSPV multivalente de la invención, las al menos dos secuencias de genes foráneas pueden estar bajo el control del mismo promotor o distinto, y en la misma orientación u opuesta.
Moléculas de ácido nucleico
La invención también se refiere a moléculas de ácido nucleico que comprenden el genoma de un rSPV de la invención. Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden ser ADN o ARN, bicatenarias o monocatenarias. El ADN o ARN monocatenario puede ser la cadena codificadora, también conocida como la cadena en sentido, o puede ser la cadena no codificadora, también conocida como la cadena antisentido. La invención también se refiere a variantes o análogos de tales moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, moléculas que tienen al menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o más de identidad de secuencia de las mismas.
El grado de homología entre dos secuencias de ácido nucleico puede determinarse por medio de programas informáticos conocidos en la técnica como GAP proporcionado en el paquete del programa GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1996, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, Estados Unidos 5371 1) (Needleman, S.B. and Wunsch, CD., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453). Uso de GAP con los siguientes ajustes para la comparación de secuencias de ADN: penalización de creación de GAP de 5.0 y penalización de extensión de GAP de 0.3. Las moléculas de ácido nucleico pueden alinearse entre sí utilizando el software de alineación Pileup, disponible como parte del paquete del programa GCG, utilizando, por ejemplo, la configuración predeterminada de la penalización de creación de brechas de 5 y la penalización de ancho de brechas de 0.3.
Las condiciones experimentales adecuadas para determinar si una molécula de ácido nucleico dada se hibrida con un ácido nucleico específico puede implicar un remojo previo de un filtro que contiene una muestra relevante del ácido nucleico que se examinará en 5 x SSC durante 10 minutos, y la prehibridación del filtro en una solución de 5 x SSC, 5 x solución de Denhardt, SDS al 0.5% y 100 [mu]g/ml de ADN de esperma de salmón sometido a sonicación desnaturalizado, seguido de hibridación en la misma solución que contiene una concentración de 10 ng/ml de una sonda marcada con P-dCTP durante 12 horas a aproximadamente 45°C, de acuerdo con los métodos de hibridación como se describe en Sambrook et al. (1989; Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor, New York). El filtro se lava dos veces durante 30 minutos en 2 x SSC, SDS al 0.5% a al menos 55°C (baja restricción), a al menos 60°C (restricción media), a al menos 65°C (restricción medio/alta), a al menos 70°C (alta restricción), o a al menos 75°C (muy alta restricción). La hibridación puede detectarse mediante la exposición del filtro a una película de rayos X.
Las moléculas de ácido nucleico según la invención pueden proporcionarse en forma de una molécula de ácido nucleico per se tal como moléculas de ácido nucleico desnudas; un vector virus o célula huésped, etc. Los vectores incluyen vectores de expresión que contienen una molécula de ácido nucleico de la invención.
Células huésped
En una realización adicional de la invención, se proporciona una célula huésped transformada con un ácido nucleico o con un rSPV de acuerdo con la invención. Dichas células pueden producir rSPV de la invención. Los expertos en la técnica conocen ejemplos adecuados de células huésped o los expertos en la técnica pueden seleccionarlos fácilmente. Las células huésped son preferiblemente células eucariotas tales como células de mamífero (por ejemplo, cerdo), fúngicas (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, pichia, aspergillus, fusarium), de insectos y plantas. Ejemplos específicos de células huésped son las células de riñón porcino, como las células ESK-4 (CL-184).
Composiciones de vacunas y métodos.
El término "vacuna" tal como se usa en el presente documento incluye cualquier composición que pueda usarse para causar, estimular o amplificar una respuesta inmune en un animal (por ejemplo, cerdos) contra un patógeno. Ejemplos particulares de vacunas de la invención son composiciones como se mencionan en las reivindicaciones, capaces de causar o estimular o amplificar la inmunidad contra un virus PCV2. En una vacuna de la invención, la al menos una secuencia de gen foránea codificará un antígeno o un adyuvante.
El término "inmunización" incluye el proceso de administrar un inmunógeno a un sujeto. La inmunización puede, por ejemplo, permitir un alto nivel continuo de anticuerpos y/o respuesta celular en el que los linfocitos T pueden matar o suprimir el patógeno en el animal no humano inmunizado, como el cerdo, que se dirige contra un patógeno o antígeno al cual el animal ha sido expuesto previamente.
Las vacunas de la invención comprenden una cantidad inmunológicamente efectiva de un rSPV o ácido nucleico o célula como se describe anteriormente, en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En la práctica, la cantidad exacta requerida para una dosis inmunológicamente efectiva puede variar de un sujeto a otro dependiendo de factores tales como la edad y el estado general del sujeto, la naturaleza de la formulación y el
modo de administración. Un experto en la materia puede determinar la "cantidad efectiva" apropiada utilizando solo experimentación de rutina. Por ejemplo, se conocen métodos en la técnica para determinar o valorar dosis adecuadas de una vacuna para encontrar dosis efectivas mínimas basadas en el peso del sujeto animal no humano, la concentración de la vacuna y otros factores típicos. En una realización típica, la vacuna comprende una dosis unitaria de entre 10 y 10.000.000 TCID50, preferiblemente entre 100 y 1.000.000 TCID50, incluso más preferiblemente entre 1.000 y 100.000 TCID50, de un rSPV de la invención. TCID50 designa la dosis infecciosa mediana del cultivo de tejidos, es decir, la cantidad de virus que produce un cambio patológico en el 50% de los cultivos celulares inoculados.
La dosificación de la vacuna, la concentración de componentes en la misma y el momento de la administración de la vacuna, los cuales generan una respuesta inmune adecuada, se pueden determinar por métodos tales como por titulaciones de anticuerpos de sueros, por ejemplo, por ELISA y/o análisis de análisis de seroneutralización y/o por evaluación por desafío de vacunación.
Las vacunas pueden comprender otros ingredientes, conocidos per se por un experto en la materia, tales como vehículos farmacéuticamente aceptables, excipientes, diluyentes, adyuvantes, estabilizadores de liofilización, agentes humectantes o emulsionantes, agentes reguladores del pH, aditivos gelificantes o mejoradores de la viscosidad, o conservantes, según la vía de administración.
Ejemplos de vehículos, excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen, entre otros, agua desmineralizada o destilada; solución salina; aceites a base de vegetales tales como aceite de maní, aceite de arachis, aceite de cártamo, aceite de oliva, aceite de semilla de algodón, aceite de maíz, aceite de sésamo o aceite de coco; aceites de silicona, que incluyen polisiloxanos, tales como metilpolisiloxano, fenilpolisiloxano y metilfenilpolisolpoxano; siliconas volátiles; aceites minerales tales como aceite de parafina líquido liviano o aceite de parafina líquido pesado; escualeno; derivados de celulosa tales como metilcelulosa, etilcelulosa, carboximetilcelulosa, sal sódica de carboximetilcelulosa o hidroxipropilmetilcelulosa; alcanoles inferiores, por ejemplo etanol o isopropanol; aralcanoles inferiores; polialquilenglicoles inferiores o alquilenglicoles inferiores, por ejemplo polietilenglicol, polipropilenglicol, etilenglicol, propilenglicol, 1,3-butilenglicol o glicerina; ésteres de ácidos grasos tales como palmitato de isopropilo, miristato de isopropilo u oleato de etilo; polivinilpirrolidona; agar; carragenano; goma de tragacanto o goma arábiga y vaselina. Típicamente, el portador o los portadores formarán del 10% al 99.9% en peso de la composición de la vacuna y se pueden tamponar mediante métodos convencionales usando reactivos conocidos en la técnica, tales como hidrogenofosfato de sodio, dihidrogenofosfato de sodio, hidrogenofosfato de potasio, dihidrogenofosfato de potasio, una mezcla de los mismos y similares.
Ejemplos de adyuvantes incluyen, entre otros, emulsiones de aceite en agua, hidróxido de aluminio (alumbre), complejos inmunoestimulantes, polímeros o copolímeros de bloque no iónicos, citoquinas (como IL-1, IL-2, IL-7, IFN-[alfa], FN-[beta], IFN-y, etc.), saponinas, monofosforil lípido A (MLA), dipéptidos de muramilo (MDP) y similares. Otros adyuvantes adecuados incluyen, por ejemplo, sulfato de aluminio y potasio, enterotoxinas termolábiles o estables al calor aisladas de Escherichia coli, toxina del cólera o la subunidad B de la misma, toxina diftérica, toxina tetánica, toxina pertussis, adyuvante incompleto o completo de Freund, etc. Los adyuvantes basados en toxinas, tales como la toxina de la difteria, la toxina del tétanos y la toxina de la tosferina pueden inactivarse antes del uso, por ejemplo, mediante tratamiento con formaldehído.
Ejemplos de estabilizadores de liofilización pueden ser, por ejemplo, carbohidratos como sorbitol, manitol, almidón, sacarosa, dextrano o glucosa, proteínas como albúmina o caseína y derivados de los mismos.
Las vacunas pueden comprender antígenos de varios patógenos, como PCV2, Actinobacillus pleuropneunomia; Adenovirus; Alfavirus tales como los virus de la encefalomielitis equina del este; Balantidium coli; Bordetella bronchiseptica; Brachyspira spp., preferiblemente B. hyodyentheriae, B.pilosicoli, B. innocens, Brucella suis, preferiblemente biovars 1, 2 y 3; virus de la peste porcina clásica, virus de la peste porcina africana; Chlamydia y Chlamydophila sp. y preferiblemente C. pecorum y C. abortus; Clostridium spp., preferiblemente Cl. difficile, Cl. perfringens tipos A, B y C, Cl. novyi, Cl. septicum, Cl. tetani; coronavirus digestivo y respiratorio; Cryptosporidium parvum; Eimeria spp; Eperythrozoonis suis actualmente llamado Mycoplasma haemosuis; Erysipelothrix rhusiopathiae; Escherichia coli; Haemophilus parasuis, preferiblemente subtipos 1, 7 y 14; virus de encefalomielitis hemaglutinante; lsospora suis; virus de la encefalitis japonesa; intracelulares de Lawsonia; Leptospira spp., preferiblemente Leptospira australis, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagicae, Leptospira interrogans, Leptospira pomona y Leptospira tarassovi; Mannheimia haemolytica; Mycobacterium spp. preferiblemente, M. avium, M. intracelular y M. bovis: Mycoplasma hyponeumoniae; Parvovirus; Pasteurella multocida; citomegolovirus porcino; Parvovirus porcino, virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino: virus de la seudorrabia; Rotavirus; virus Sagiyama; Salmonella spp. preferiblemente, S. thyphimurium y S. choleraesuis; Staphylococcus spp. preferiblemente, S. hyicus; Streptococcus spp., preferiblemente Strep, suis; citomegalovirus porcino; virus del herpes porcino; virus de la gripe porcina; virus de la viruela porcina; Toxoplasma gondii; virus de la estomatitis vesicular y/o virus del exantema de los cerdos.
Las composiciones de vacuna de la invención pueden ser formulaciones líquidas tales como una solución acuosa, agua en aceite o emulsión de aceite en agua, jarabe, un elíxir, una tintura, una preparación para administración parenteral, subcutánea, intradérmica, intramuscular o intravenosa (por ejemplo, administración inyectable), como suspensiones o emulsiones estériles. Dichas formulaciones son conocidas en la técnica y se preparan típicamente por
disolución del antígeno y otros aditivos típicos en los sistemas de vehículo o disolvente apropiados. Las formulaciones líquidas también pueden incluir suspensiones y emulsiones que contienen agentes de suspensión o emulsionantes.
La ruta de administración puede ser percutánea, vía administración de la mucosa o vía parenteral (intradérmica, intramuscular, subcutánea, intravenosa o intraperitoneal). La vacuna de la invención se puede administrar convenientemente por vía intranasal, transdérmica (es decir, se aplica sobre o en la superficie de la piel para absorción sistémica), parenteral, ocular, etc. La vía de administración parenteral incluye, pero no se limita a, intramuscular, intravenosa, rutas intraperitoneales y similares.
Las vacunas de la invención pueden administrarse como dosis únicas o en dosis repetidas. Las vacunas de la invención pueden administrarse solas, o pueden administrarse simultáneamente o secuencialmente administradas con una o más composiciones adicionales, tales como, por ejemplo, otras composiciones inmunogénicas o vacunas porcinas. Cuando las composiciones se administran en diferentes momentos, las administraciones pueden estar separadas entre sí o superpuestas en el tiempo.
La presente invención también se refiere a métodos para inmunizar o inducir una respuesta inmune en un mamífero no humano (por ejemplo, cerdos) que comprende administrar a dicho mamífero un rSPV o un ácido nucleico, o una célula o una vacuna como se describió anteriormente.
Las vacunas de la invención se administran preferiblemente a cerdos, cerdos adultos, pero también a cerdos jóvenes, lechones o cerdas gestantes. La vacunación de cerdas gestantes es ventajosa ya que puede conferir inmunidad pasiva a los recién nacidos mediante la transmisión de anticuerpos maternos. Los cerdos pueden tener menos de 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 semana de edad; 1 a 6 semanas de edad; 2 a 5 semanas de edad; o de 3 a 4 semanas de edad. Deseablemente, la vacuna se administra a un sujeto que aún no ha sido expuesto al patógeno.
La presente invención también proporciona un recipiente que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de rSPV, ácido nucleico, célula o vacuna como se describió anteriormente. La invención también proporciona kits de vacunación que comprenden un recipiente opcionalmente estéril que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de la vacuna, medios para administrar la vacuna a animales, y opcionalmente un manual de instrucciones que incluye información para la administración de la cantidad inmunológicamente efectiva de la composición para tratar y/o prevenir enfermedades infecciosas.
Vacuna PCV2
Los rSPV de la invención son particularmente adecuados para el tratamiento (curativo preventivo) de la infección por PCV2 y enfermedades asociadas.
Las vacunas PCV2 desarrolladas actualmente, como Circovac® (Merial), Ingelvac®, CircoFLEX (Boehringer Ingelheim Vetmedica) o Suvaxyn®, son vacunas PCV2 inactivadas o vacunas de subunidades. Las vacunas de la subunidad PCV2 típicamente usan una proteína de cápside PCV2A recombinante purificada producida por expresión recombinante del gen ORF2 de PCV2A. A este respecto, la proteína codificada por ORF2 de los aislados de PCV2 Imp1011 se ha reportado en EP1741785. Una proteína codificada por ORF2 de PCV2 aislado, PCV2Rm, se ha reportado en WO2010/061000. La proteína codificada por ORF2 del aislado de PCV2 412 se ha reportado en EP1816200. Otra proteína codificada por un ORF2 de otro aislado de PCV2 se ha reportado en EP1036180 o EP2225367. Las proteínas sintéticas de tipo ORF2 mejoradas se han descrito en WO2013/030320 y en WO2014/167060.
En una realización particular, la presente invención se refiere a un rSPV como se definió anteriormente en el que la secuencia de gen foránea codifica un antígeno PCV2, más preferiblemente una proteína, polipéptido o péptido PCV2. En una realización más preferida, la presente invención se refiere a un rSPV como se definió anteriormente en el que la secuencia de gen foránea codifica un polipéptido PCV2 ORF2 o un fragmento del mismo. En una realización particular, el ORF2 se selecciona de ORF2 de PCV2 aislados Imp1011, PCV2Rm o 412, o un ORF2 que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con tales proteínas, o un fragmento inmunogénico de las mismas que comprende al menos 10, 15, más preferiblemente en al menos 20 residuos de aminoácidos contiguos de los mismos.
Un aspecto adicional de la divulgación se refiere a métodos para tratar y/o prevenir una enfermedad asociada a PCV2 en un mamífero no humano, y a métodos para inmunizar o vacunar a un sujeto animal no humano, como cerdos, porcinos, cerdas, lechones, contra la infección por PCV2, que comprende administrar a dicho sujeto animal un rSPV, un ácido nucleico, una célula o una composición de vacuna como se definió anteriormente.
Las infecciones por PCV2 o enfermedades asociadas incluyen, entre otras, el síndrome de desgaste multisistémico posdestete (PMWS), el síndrome de dermatitis y nefropatía porcina (PDNS), el complejo de enfermedades respiratorias porcinas (PRDC), trastornos reproductivos, enteritis granulomatosa, epidermitis exudativa, linfadenitis necrotizante y temblores congénitos. Preferiblemente, un sujeto animal no humano, como el cerdo, está protegido hasta el punto de que uno de todos los síntomas o efectos fisiológicos adversos de las infecciones por PCV2 se reducen, mejoran o previenen de manera significativa.
En una realización, las composiciones de vacuna de la invención se usan para la administración a un cerdo susceptible a o de otro modo en riesgo de infección por PCV2 para mejorar las capacidades de respuesta inmune propias del sujeto.
Preferiblemente, el sujeto es un cerdo que necesita vacunación contra el síndrome de desgaste multisistémico posdestete (PMWS) y/o el síndrome de dermatitis y nefropatía porcina (PDNS).
En la siguiente sección experimental se divulgarán aspectos y ventajas adicionales de la invención, lo que ilustra la invención reivindicada.
Ejemplos
Ejemplo 1: Construcción de plásmidos para hacer SPV recombinantes.
(1) Construcción de pSP92-Ess_ORF2 (Figura 1)
El ADN genómico de SPV se preparó de la siguiente manera:
Se pueden comprar adquirir la cepa de kasza SPV (VR-363) y célula de riñón porcino embrionario, células ESK-4 (CL-184), de la American Type Culture Collection (ATCC). Las células ESK-4 se cultivaron rutinariamente a 37°C en CO2 al 5% en medio de Ham F-12K (Gibco, Cat. No.: 21127-022) suplementado con estreptomicina-penicilina al 1% (Gibco, Cat. No: 15140-122) y 5% de FBS (Gibco, Cat. No.: 10437-028). Para la preparación del Ad N genómico de SPV, las células ESK-4 confluentes en un matraz de 225 cm2 se infectaron con SPV y se incubaron durante 6 días hasta que las células mostraron un 100% de efecto citopático (CPE). Las células infectadas se cosecharon raspando las células en el medio y centrifugando a 1300 rpm durante 5 minutos. El medio se decantó y el sedimento celular se resuspendió suavemente en 2 ml de solución salina tampón de fosfato (PBS: 1.5 g de Na2HPO4, 0.2 g de KH2PO4 , 0.8 g de NaCl y 0.2 g de KCl por litro de H2O) y se sometió a dos sucesivos procesos de congelación y descongelación. Los restos celulares se eliminaron por centrifugación a 3000 rpm durante 5 minutos a 4°C. Los viriones SPV, presentes en el sobrenadante, se sedimentaron por centrifugación a 20.000 xg durante 20 min a 4°C. El sedimento resultante se suspendió luego con Tris 10 mM, pH 7.5. Luego se extrajeron los ADN genómicos de SPV de los viriones de SPV suspendiéndolos con el tampón de lisis (Tris 20 mM, pH 9, NaCl20.1M, EDTA 5 mM, SDS al 0.1%, proteinasa K a 0.2 mg/ml) e incubando a 60°C durante 5 min. La extracción con fenol:clororoformo (1:1) se realizó dos veces, y la muestra precipitó mediante la adición de dos volúmenes de etanol y centrifugación. El sobrenadante se decantó y el sedimento (ADN SPV) se secó al aire y se rehidrató en Tris 10 mM, pH 7.5, EDTA 1 mM a 4°C.
Las regiones flanqueantes del gen de la proteína de unión a interleucina 18 (IL-18bp) en el genoma SPV se clonaron mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Dos cebadores (oligonucleótidos sintéticos), SP6030F y SP9574R que se muestran en las SEQ ID NO: 1 y 2 se compraron de Takara Bio. La reacción de PCR se realizó usando LA Taq polimerasa (Takara Bio) y un conjunto de cebadores de SP6030F y SP9574R con ADN de SPV como plantilla, de acuerdo con el protocolo del productor.
SEQ ID NO: 1: CGAATTCATTCCTTTATCTTTA
SEQ ID NO: 2: GGAACTACGTTATACGATCAT
El ADN amplificado de aproximadamente 3.5kbp se confirmó mediante una electroforesis en gel de agarosa al 0.8%, y se purificó del gel usando el Kit de extracción de gel QIAquick (Qiagen). El fragmento de ADN purificado se clonó en el vector pCR4-TOPO (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del productor. Se recogieron 12 transformantes blancos resistentes a la ampicilina y se cultivaron en caldo LB que contenía 50 microg/ml de ampicilina, y cada plásmido se preparó con QuickLyse Miniprep Kit (Qiagen). Cada plásmido se digirió con ScaI y se seleccionaron dos tipos de plásmidos candidatos (ambas direcciones del ADN insertado). Los ADN insertados de ellos se secuenciaron con el reactivo Dye Terminator Cycle Sequencing (DTCS) y el secuenciador CEQ2000XL (Beckman Coulter). Se confirmó que uno de los plásmidos candidatos, pCR-SPV6030/9574 (#1), contenía el fragmento de ADN de 6.030 a 9.574 nt de ADN genómico de SPV (GeneBank Acc: NC_003389) y se usó como un plásmido básico (Figura 1).
Luego, se realizó la mutagénesis por PCR para eliminar una parte del gen IL-18bp e introducir los sitios de enzimas de restricción múltiple usando pCR-SPV6030/9574 (#1) como plantilla y usando dos tipos de conjuntos de cebadores, (1) SEQ ID NO: 3 y 4 o (2) SEQ ID NO: 5 y 6.
SEQ ID NO: 3: TTCGCCCTTACGGTACCATTCCTTTATCTTTATAAACG
SEQ ID NO: 4: CTATAATATTAAATAAGCTTTATGGAGTTGTTTAAATAC
SEQ ID NO: 5: CACACGATAACACTGCAGTCCACATATTACGGTTC
SEQ ID NO: 6: GCCGCGAATTCGCCCTCGAGGAGCTCACTACG
Cada producto de PCR se aplicó a una electroforesis en gel de agarosa al 0.8% y se purificó utilizando el kit de extracción de gel QIAquick. El fragmento de ADN purificado, que se amplificó por PCR usando un conjunto de cebadores de SEQ ID NOs: 3 y 4, se digirió con dos enzimas de restricción, KpnI y HindIII, y se ligó con las mismas enzimas de restricción-corte-pBluescript KS(+) (Stratagene). El plásmido resultante pBS-9L (Kpn..Hin) (Figura 1) se digirió con SacI y PstI, y el mismo fragmento de ADN cortado con enzimas de restricción amplificado por PCR usando un conjunto de cebadores de SEQ ID NO: 5 y 6, fue insertado en él. El plásmido resultante se denominó pSP90 (Figura 1).
Entre los sitios EcoRI y HindIII los sitios de enzimas de restricción múltiple de pSP90 se reemplazaron con el adaptador de oligonucleótidos preparado mediante la fusión de dos oligonucleótidos de ADN sintéticos de SEQ ID NOs: 7 y 8. El plásmido resultante se denominó pSP91 (Figura1).
SEQ ID NO: 7: AATTGCCCGGGTACCGTCGATCGACTTTTTATGGCCCCCCCGGCCA
SEQ ID NO: 8: AGCTTGGCCGGGGGGGCCATAAAAAGTCGATCGACGGTACCCGGGC
El fragmento de ADN del casete del gen del promotor 'P7.5 -LacZ' derivado de pNZ76, que se cortó con HindIII y SmaI de pNZ76 y luego hizo romo con ADN polimerasa (descrito en el documento USP 5,387,519) se ligó al sitio SmaI de pSP91. El plásmido resultante se denominó pSP92 (Figura 1), y el casete del gen 'P7.5-LacZ' se insertó en el gen IL-18bp (desde 8.146 nt hasta 7.745 nt en el genoma SPV).
El fragmento de corte BglI de 0.8 kb derivado de pGTPs-Ess_ORF2 (Ejemplo 1 de WO2014/167060) se insertó en el sitio SfiI de pSP92, y el plásmido resultante se denominó pSP92-Ess_ORF2 (Figura 1). Este plásmido incluía el casete del gen 'promotor de poxvirus fuerte (Ps)-Ess_ORF2 (PCV2-ORF2 modificado) también dentro del gen IL-18bp, y se usó como un plásmido de homología para hacer un SPV recombinante, SVR12.
(2) Construcción de pSP911-EssORF2 (Figura 2)
La secuencia entre KpnI y PstI de pSP91 se reemplazó con el adaptador sintético mostrado en SEQ ID NO: 9 para insertar el promotor 11-kD del virus vaccinia en él. El plásmido resultante se designó como pSP911.
SEQ ID NO: 9:
GGTACCGAGCTCGGTAGCCCGGGCCATGGTAGATCCTCTAGAGGATCCAAT
T CATTT ATAGC AT AGAAAAAAAC AAAAT GAAATT CT ACTATATTTT CTGCAG
Se obtuvo una secuencia de ácido nucleico sintético que codifica un ORF2 modificado de PCV2 (Ess_ORF2) digiriendo pGTPs-Ess_ORF2 con BamHI y SalI, y se insertó en el corte pSP911 con BamHI y SalI. El plásmido resultante se designó como pSP911-Ess_ORF2, y se usó para hacer SVR13 de virus de la viruela porcina recombinante.
Ejemplo 2: Producción de virus de la viruela porcina recombinante (rSPV)
(1) Producción de SVR12 (Figura 3)
El SPV recombinante se generó en células ESK-4 por recombinación homóloga entre el genoma de SPV de tipo salvaje y los vectores de homología. Las células ESK-4 subconfluentes en una placa de 6 pozos se infectaron con SPV de tipo salvaje (wtSPV), y 17 horas después las células infectadas con wtSPV se transfectaron con 2 |jg de pSP92-Ess_ORF2 usando el reactivo Lipofectamin Plus (Invitrogen) y se dejó incubar a 37°C durante 5 días hasta que se produjo el efecto citopático (CPE). Los lisados celulares de células infectadas-transfectadas se seleccionaron para detectar placas recombinantes que expresaban p-galactosidasa mediante la adición de 0.5 mg/ml de Bluo-gal (Invitrogen Cat. No.: 15519-028) en la capa de nutrientes agarosa. Dos virus recombinantes libres de wtSPV independientes se purificaron a través de 3-4 rondas de detección. El rSPV purificado se designó como SVR12. Dos clones purificados de SVR12 se designaron como clones 1H2C9D4G5 y 2F5D5E5.
(2) Producción de SVR13 (Figura 3)
Las células ESK-4 subconfluentes en una placa de 6 pozos se infectaron con SPV de tipo salvaje (wtSPV), y 17 horas después las células infectadas con wtSPV se transfectaron con 2 jg de pSP911-Ess_ORF2 usando el reactivo Lipofectamin Plus (Invitrogen) y se dejó incubar a 37°C hasta que se produjo el efecto citopático (CPE). Los lisados celulares de células infectadas-transfectadas fueron semillas de transfección (TFS) para SVR13. El TFS se diluyó en 1:20 con medio de Ham F-12K sin FBS, y se infectó en células ESK-4 en placas de 96 pozos. Siete días después, las células infectadas se lisaron con tampón de lisis (Tris-Cl 20 mM, NaCl 0.1M, EDTA 5 mM, SDS al 0.1%, protenasa K 200 jg/m l) seguido de tratamiento térmico (60°C 5 min y 98°C 2 min). Estas muestras de ADN lisado de células infectadas se seleccionaron por PCR con un conjunto de cebadores de 5'-GGCCGTTGATATGATGAGGT-3' (SEQ ID NO: 10) y 5'-TCCAGCACTGGCTTAGGAGT-3' (SEQ ID NO: 11).
Las muestras que amplificaron el fragmento de ADN de 0.3kbp fueron positivas, y los sobrenadantes correspondientes se enviaron al siguiente paso de selección. El cribado se repitió hasta que todas las placas aparecieron teñidas con
un ensayo de inmunofluorescencia (IFA) usando suero de cerdo anti-PCV2 (PAB-PCV2, VMR) como el primer anticuerpo e IgG anti-cerdo conjugado con FITC (F1638-2ML, SIGMA) como el segundo anticuerpo.
Se purificaron dos clones recombinantes libres de wtSPV de SVR13 a partir de TFS a través de tres rondas de cribado, y se designaron como clones G2C2D4 y D10E5A5.
Ejemplo 3: Análisis in vitro de SPV recombinantes
(1) Expresión de genes PCV2-ORF2 por inmunoprecipitación Western
Los tamaños moleculares de las proteínas PCV2-ORF2 expresadas por rSPV se analizaron mediante un SDS-PAGE al 15% y un análisis de inmunoprecipitación Western usando sueros de rata anti-PCV2. Las células ESK-4 se infectaron con el clon SVR12 1H2C9D4G5, el clon 2F5D5E5, SVR14, SVR15 o wtSPV. Seis días después, los lisados celulares se fraccionaron en una SDS-PAGE al 15%. Las proteínas se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF), Immobilon-P (Merk Millipore, Cat. No: IPVH08130), y se bloquearon con leche en polvo al 5% en PBS. Las sondas de membrana PDVF se sondearon con suero de rata anti-PCV2 (1:1.000) como el primer anticuerpo, seguido de reacción con IgG secundaria de cabra anti-rata conjugada con biotina (1:1.000) y el kit estándar VECTASTAIN ABC-AP (Vector Labs, AK-5000). Las transferencias de membrana se desarrollaron con sustrato de fosfatasa alcalina, Nitroblue Tetrazolium (NBT)/5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP).
Los resultados de la inmunoprecipitación Western mostraron que SVR12 y SVR13 expresaron dos tipos de ORF2, tamaños moleculares de 27kDa y 25kDa (Figura 4). La proteína anterior de 27kDa corresponde a una forma precursora, y la última proteína de 25kDa corresponde a una forma procesada después de la escisión al final del péptido señal B5R. Estos resultados demuestran así la expresión efectiva de antígenos a partir de los SPV de la invención.
(2) Estabilidad a largo plazo y expresión del gen PCV2-ORF2
Para verificar la estabilidad de los rSPV de la invención usando el gen IL-18bp como el sitio de inserción, SVR12 y SVR13 se pasaron a las células ESK-4 15 veces. La estabilidad y la expresión de los genes insertados después de x15 pases se verificaron por PCR e inmunoprecipitación Western. Los resultados de la PCR mostraron que los genes insertados de todos los rSPV eran estables después de 15x pases in vitro (Figura 5). No apareció una banda de tamaños irregulares de productos del gen PCV2-ORF2 en los carriles de pasajes in vitro x15 en la membrana PDVF en comparación con el pasaje x0 por análisis de inmunoprecipitación Western.
(3) Crecimiento de recombinantes en células animales no diana
La seguridad en el medio ambiente de una vacuna viva genéticamente modificada es una preocupación importante. Como una evaluación de riesgo de seguridad de los SPV, se puede evaluar la capacidad de infectividad o crecimiento en animales o líneas celulares no objetivo. Los SPV generalmente no crecen en las células HeLa, pero pueden crecer en las células Vero. Las células Vero han sido ampliamente probadas y han demostrado estar libres de agentes adventicios, y son las más aceptadas por las autoridades reguladoras para usar en la producción de vacunas, como las vacunas contra la poliomielitis y la diarrea epidémica porcina.
Las células Vero (ATCC CCL-81; línea celular comercial derivada del riñón de un mono verde africano) cultivadas en placas de 6 pozos se infectaron en cultivos separados con tres SPV:SVR12 y dos SPV comparativos, a saber, SVR3, que comprende un gen ORF2 en el sitio de clonación ARP y SVR7, que comprende un gen ORF2 en el sitio de clonación TK. La infección se realizó a dos multiplicidades de infección (MOI) (alta: -0.01 y baja: -0.001), y las células se cultivaron en una incubadora a 37°C con 5% de CO2 durante dos semanas después de la infección. A los 0, 4, 7, 11 y 14 días después de la infección (DPI), las células infectadas y los sobrenadantes se recuperaron, se congelaron y se descongelaron. Las cantidades de virus infecciosos a 0, 4, 7, 11 y 14 DPI se valoraron mediante el ensayo TCID50 usando células ESK-4 en placas de 24 pozos.
Los resultados se resumen en la Tabla 1 y la Figura 6. Las relaciones de crecimiento relativas a cada título de '0 DPI' se muestran entre paréntesis en la Tabla 1, y el curso temporal de las relaciones de crecimiento relativo se trazan en la Figura 6. Los resultados muestran sorprendentemente que la capacidad de crecimiento de los SPV recombinantes está influenciada por los sitios de inserción, y los SPV recombinantes de la invención, usando el gen IL-18bp como el sitio de inserción, ventajosamente no crecieron en células Vero.
Esta es una ventaja adicional de los SPV recombinantes de la invención que usan el gen IL-18bp como el sitio de inserción en el punto de menor riesgo para el medio ambiente.
Tabla 1. Crecimiento de rSPV en células Vero
Ejemplo 4: Inducción de una respuesta inmune in vivo
Se inmunizaron grupos (N=7) de lechones negativos para anticuerpos anti-PCV2 de 4 semanas de edad por vía subcutánea en el lóbulo de la oreja izquierda con cada uno de los SPV recombinantes, SVR7 o SVR12 a 5.0E+04 TCID50/cerdo, o con PBS. Se tomaron muestras de sangre de la vena yugular externa en preinmunes, 1, 2 y 3 semanas después de la inmunización (wpi), y se midió el anticuerpo anti-PCV2 en suero mediante inmunofluorescencia indirecta. Las células RPL-2 infectadas con PCV2 se cultivaron en placas de cultivo de tejidos de 96 pozos y se fijaron con acetona/metanol (2:1). Después de bloquear con 0.5% de leche desnatada en PBS durante 1 hora, las diluciones dobles de los sueros se colocaron en capas en los pozos de la placa de cultivo de tejidos de 96 pozos y se incubaron durante 1 hora a 37°C. Los sueros de cerdo PAB-PCV2 (VMRD) diluidos en serie también se colocaron en capas en un carril de cada placa de 96 pozos como sueros de control positivo. Después de la incubación, las placas se lavaron 3 veces y los anticuerpos anti-IgG-FITC de cerdo producidos en conejo (SIGMA Cat. #: F1638, 1:1000) se colocaron en capas en los pozos de la placa de cultivo de tejidos de 96 pozos y se incubaron durante 1 hora a 37°C. Después de la incubación, las placas se lavaron con PBS tres veces. Las señales de los anticuerpos secundarios se detectaron por microscopía fluorescente y se registraron las señales positivas o negativas de cada pozo. La dilución más alta que resultó en una reacción fluorescente positiva fue el título de IF de la muestra, y los errores experimentales entre placas y días fueron calibrados por el título de IF (1:2560) del suero de control positivo.
Los resultados obtenidos muestran que los títulos IF promedio del grupo vacunado con SVR12 fueron estadísticamente (p<0.05) mayores que los del grupo vacunado con SVR7. Además, la observación clínica de la formación de viruela o enrojecimiento en los sitios de vacunación se inició de 1 a 3 wpi. Los tamaños máximos de viruela del grupo vacunado con SVR12 fueron más pequeños que los del grupo vacunado con SVR7.
Los resultados anteriores indican que el rSPV de la invención en el que se inserta un gen foráneo dentro del gen IL-18bp, tal como SVR12, estaba más atenuado y podría inducir respuestas inmunes más altas que el rSPV que usa el sitio TK como el sitio de inserción tal como SVR7.
Claims (16)
1. Un virus de la viruela porcina recombinante (rSPV) que comprende al menos una primera secuencia de gen foránea en su genoma, en el que dicha primera secuencia de gen foránea se inserta en el gen de la proteína de unión a IL-18 (IL18bp) del genoma de rSPV.
2. El rSPV de la reivindicación 1, en el que la primera secuencia génica foránea se inserta en reemplazo de toda o una porción de la secuencia génica viral IL18bp.
3. El rSPV de la reivindicación 2, en el que el genoma de rSPV comprende una eliminación de al menos 100 pb de la secuencia del gen IL18bp, y en el que la primera secuencia de gen foránea se encuentra en dicha eliminación.
4. El rSPV de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además al menos una segunda secuencia de gen foránea insertada en una región distinta del genoma de rSPV, preferiblemente en el gen viral de timidina quinasa (TK) o el gen de proteína de repetición de Ankyrin.
5. El rSPV de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la primera y/o segunda secuencia de gen foránea codifica un antígeno, preferiblemente un antígeno PCV2.
6. El rSPV de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la primera o segunda secuencia de gen foránea codifica un antígeno de la cápside PCV2, preferiblemente una proteína o péptido PCV2 ORF2.
7. El rSPV de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que cada una de las secuencias genéticas foráneas primera y/o segunda contiene un promotor transcripcional.
8. El rSPV de la reivindicación 7, en el que el promotor se selecciona del promotor del virus vaccinia 7.5-kD (P7.5k), promotor 11-kD (P11k) o promotor 28-kD (P28k), un promotor sintético artificial de Poxvirus (Ps), el promotor de betaactina (Bac) de pollo o un derivado del mismo, el promotor de Pec, el promotor de citomegalovirus murino (Mcmv) inmediato-temprano (es decir) 1 promotor, el promotor de citomegalovirus humano (Hcmv), el promotor del virus de smio (SV)40, y el promotor del virus del sarcoma de Raus (RSV), o cualquier fragmento del mismo que retenga una actividad promotora.
9. Un rSPV de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno PCV2 en su genoma, en el que dicha secuencia de ácido nucleico se inserta en el gen IL18bp del genoma de rSPV.
10. Una molécula de ácido nucleico que comprende el genoma de un rSPV de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
11. Una célula huésped que comprende un rSPV de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 10.
12. Un método para producir un rSPV de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende
infectar una célula competente con una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 10 y recolectar el rSVP.
13. Una composición que comprende rSPV de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y un excipiente.
14. Una composición de la reivindicación 13, que es una vacuna.
15. Un rSPV de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para uso en la inmunización de un porcino contra un patógeno.
16. Un kit de vacunación para inmunizar un porcino que comprende los siguientes componentes:
a. una cantidad efectiva de una vacuna de la reivindicación 14, y
b, un medio para administrar dicha vacuna a dicho porcino.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP14307110.8A EP3034609A1 (en) | 2014-12-19 | 2014-12-19 | Recombinant swinepox virus and vaccines |
| PCT/EP2015/080468 WO2016097281A1 (en) | 2014-12-19 | 2015-12-18 | Recombinant swinepox virus and vaccines |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2748468T3 true ES2748468T3 (es) | 2020-03-16 |
Family
ID=52345012
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES15813838T Active ES2748468T3 (es) | 2014-12-19 | 2015-12-18 | Virus de viruela porcina recombinante y vacunas |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10106819B2 (es) |
| EP (2) | EP3034609A1 (es) |
| CN (1) | CN107532151B (es) |
| CA (1) | CA2969605C (es) |
| DK (1) | DK3234159T3 (es) |
| ES (1) | ES2748468T3 (es) |
| MX (1) | MX2017008087A (es) |
| PH (1) | PH12017501100A1 (es) |
| RU (1) | RU2727899C2 (es) |
| WO (1) | WO2016097281A1 (es) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3254692A1 (en) * | 2016-06-10 | 2017-12-13 | Ceva Sante Animale | Multivalent recombinant spv |
| EP3720485A1 (en) | 2017-12-08 | 2020-10-14 | Ceva Sante Animale | Recombinant swinepox virus and vaccines |
| EP3720484A1 (en) * | 2017-12-08 | 2020-10-14 | Ceva Sante Animale | Recombinant swinepox virus encoding a pcv3 antigen |
| CN113373119A (zh) * | 2021-06-02 | 2021-09-10 | 江西农业大学 | 一种表达非洲猪瘟病毒三基因缺失重组伪狂犬病毒毒株、构建方法及其应用 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2531729B2 (ja) | 1987-03-27 | 1996-09-04 | 日本ゼオン株式会社 | 組み換えアビポックスウイルス |
| US5651972A (en) | 1989-04-21 | 1997-07-29 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Use of recombinant swine poxvirus as a live vaccine vector |
| US6127163A (en) * | 1992-01-13 | 2000-10-03 | Syntro Corporation | Recombinant swinepox virus |
| RU2076735C1 (ru) * | 1994-03-23 | 1997-04-10 | ГНЦВБ "Вектор" | Живая рекомбинантная вакцина гепатита в на основе вируса осповакцины для перорального применения и способ ее получения |
| UA78180C2 (uk) | 1997-10-03 | 2007-03-15 | Меріаль | Кільцевий вірус свині типу ii, вакцини та діагностичні реагенти |
| FR2772047B1 (fr) | 1997-12-05 | 2004-04-09 | Ct Nat D Etudes Veterinaires E | Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection |
| EP1816200B1 (en) | 1997-12-11 | 2016-03-09 | Merial | Postweaning multisystemic wasting syndrome virus for pigs |
| EP2225367A1 (en) | 2007-12-21 | 2010-09-08 | Wyeth LLC | Methods and compositions for immunizing pigs against porcine circovirus |
| WO2010061000A1 (en) | 2008-11-28 | 2010-06-03 | Ceva Sante Animale | Novel porcine circovirus type 2b isolate and uses thereof |
| EP2564869A1 (en) | 2011-09-02 | 2013-03-06 | Ceva Sante Animale | Synthetic capsid proteins and uses thereof |
| EP2789346A1 (en) | 2013-04-11 | 2014-10-15 | CEVA Santé Animale SA | Fusion polypeptides and vaccines |
-
2014
- 2014-12-19 EP EP14307110.8A patent/EP3034609A1/en not_active Withdrawn
-
2015
- 2015-12-18 DK DK15813838.8T patent/DK3234159T3/da active
- 2015-12-18 CN CN201580076539.8A patent/CN107532151B/zh active Active
- 2015-12-18 WO PCT/EP2015/080468 patent/WO2016097281A1/en active Application Filing
- 2015-12-18 ES ES15813838T patent/ES2748468T3/es active Active
- 2015-12-18 EP EP15813838.8A patent/EP3234159B1/en active Active
- 2015-12-18 MX MX2017008087A patent/MX2017008087A/es active IP Right Grant
- 2015-12-18 US US15/536,058 patent/US10106819B2/en active Active
- 2015-12-18 CA CA2969605A patent/CA2969605C/en active Active
- 2015-12-18 RU RU2017125494A patent/RU2727899C2/ru active
-
2017
- 2017-06-13 PH PH12017501100A patent/PH12017501100A1/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2017125494A (ru) | 2019-01-21 |
| US10106819B2 (en) | 2018-10-23 |
| MX2017008087A (es) | 2017-10-31 |
| RU2727899C2 (ru) | 2020-07-24 |
| CN107532151B (zh) | 2021-10-19 |
| CA2969605C (en) | 2023-06-20 |
| WO2016097281A1 (en) | 2016-06-23 |
| CA2969605A1 (en) | 2016-06-23 |
| DK3234159T3 (da) | 2019-09-23 |
| BR112017012998A2 (pt) | 2018-03-06 |
| US20170335343A1 (en) | 2017-11-23 |
| PH12017501100B1 (en) | 2017-11-27 |
| RU2017125494A3 (es) | 2019-07-17 |
| CN107532151A (zh) | 2018-01-02 |
| EP3234159B1 (en) | 2019-06-12 |
| PH12017501100A1 (en) | 2017-11-27 |
| EP3234159A1 (en) | 2017-10-25 |
| EP3034609A1 (en) | 2016-06-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107805631B (zh) | 编码传染性喉气管炎病毒和新城疫病毒抗原的重组非致病性马立克氏病病毒构建体 | |
| ES2879254T3 (es) | Polipéptidos de fusión y vacunas | |
| ES2748468T3 (es) | Virus de viruela porcina recombinante y vacunas | |
| US20220088187A1 (en) | Recombinant non-pathogenic marek's disease virus constructs encoding multiple heterologous antigens | |
| US20240123057A1 (en) | Recombinant Non-Pathogenic Marek's Disease Virus Constructs Encoding Infectious Laryngotracheitis Virus and Infectious Bursal Disease Virus Antigens | |
| US11020472B2 (en) | Multivalent recombinant SPV | |
| US20200405842A1 (en) | Recombinant swinepox virus encoding a pcv3 antigen | |
| US20200390878A1 (en) | Recombinant swinepox virus and vaccines | |
| EP3468589A1 (en) | Multivalent recombinant spv | |
| BR112017012998B1 (pt) | Vírus da varíola suína recombinante (rspv), método para produzir um rspv e composição |