ES2877171T3 - Moduladores de PSGL-1 y usos de los mismos - Google Patents

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Abstract

Un antagonista del ligando 1 de la glicoproteína selectina P (PSGL-1) para su uso en el desencadenamiento de una respuesta de los linfocitos T o la restauración de la función de los linfocitos T en un método de tratamiento de una enfermedad infecciosa o un cáncer, comprendiendo dicho método administrar el antagonista del ligando 1 de la glicoproteína selectina P (PSGL-1) a un sujeto que lo necesite, en donde aumenta la respuesta de los linfocitos T CD8+ dependientes de CD4+.

Description

DESCRIPCIÓN
Moduladores de PSGL-1 y usos de los mismos
Campo de la invención
La presente invención se refiere en general a anticuerpos y, más específicamente, al uso de antagonistas del ligando 1 de la glicoproteína selectina P (PSGL-1) y usos de los mismos para modular una respuesta inmunitaria y tratar enfermedades infecciosas, cáncer y enfermedades y trastornos relacionados con la inmunidad y la inflamación.
Antecedentes de la invención
Las respuestas inmunitarias de los linfocitos T son críticas para la protección del hospedador contra los microbios, pero pueden volverse disfuncionales en infecciones crónicas. Con las infecciones víricas crónicas, tales como el VIH y la hepatitis B y C, las respuestas de los linfocitos T tienen una pérdida progresiva de función y muchos linfocitos T experimentan apoptosis. Los linfocitos T restantes quedan detenidos en un estado disfuncional, es decir, el agotamiento fenotípico. Aunque no se comprende del todo, se han identificado varios mecanismos subyacentes para el agotamiento de linfocitos T en el modelo de infección crónica por el virus de la coriomeningitits linfocítica (LC-MV) con la cepa Clon 13 (Cl13). En este modelo, los linfocitos T CD8+ específicos de virus están expuestos de forma crónica al antígeno y al interferón de tipo I dando como resultado la regulación positiva de la expresión de los receptores inmunitarios inhibidores, incluyendo PD-1, LAG-3, CD160 y BTLA. Las células también pierden motilidad, muestran una regulación transcripcional alterada y tienen una producción aumentada de las citocinas inhibidoras, IL-10 y TGFp. Con el tiempo, los linfocitos T CD8+ pierden su potencial proliferativo, su función citotóxica y su capacidad de producir IL-2, TNF-a e IFN-y. Los linfocitos T CD4+ presentan una diferenciación alterada de manera similar, con la regulación positiva de receptores inhibidores y pérdida de función. Cabe destacar que, los linfocitos T CD4+ específicos de virus pueden rescatar linfocitos T CD8+ agotados, permitiéndoles mediar en el aclaramiento vírico. Se cree que la producción de IL-2 e IL-21 por los linfocitos T CD4+ contribuye a revertir la respuesta defectuosa de los linfocitos T CD8+, lo que implica que las citocinas clave necesarias para una diferenciación efectora adecuada se vuelven limitantes después de la infección crónica. Por lo tanto, una interacción de varios procesos integrados se combina para desactivar la capacidad del sistema inmunitario de eliminar infecciones víricas crónicas.
Muchos cánceres, incluyendo el de piel, pulmón y riñón establecen estados similares de supresión inmunitaria y comparten muchas características comunes de disfunción inmunitaria como las observadas en infecciones víricas crónicas, incluyendo el VIH, la Hepatitis B y C. Estas incluyen la muerte de los linfocitos T que responden y la regulación positiva de los receptores inhibidores, incluyendo PD-1, Lag-3 y CTLA-4. Como tales, las inmunoterapias dirigidas a estimular las funciones críticas de las respuestas de los linfocitos T antitumorales son necesarias para erradicar el cáncer en estos entornos. Ahora es evidente que los virus crónicos y los tumores usurpan el sistema inmunitario comandando los controles naturales que impiden las respuestas inmunitarias excesivas. Uno de los principales problemas de la investigación biomédica es cómo desarrollar terapias para revertir esta inmunosupresión y promover la eliminación tumoral.
Ahora es evidente que revertir la disfunción de los linfocitos T podría restablecer las respuestas inmunitarias y conseguir la resolución de la enfermedad en una amplia gama de entornos clínicos. Los mecanismos de adhesión regulan la acumulación de linfocitos T tanto en tejidos tanto linfoides como no linfoides. Se ha usado la modulación de la expresión de moléculas de adhesión para influir en el desarrollo de linfocitos T efectores y de memoria y para distinguir células en diferentes etapas de diferenciación. El ligando 1 de la glicoproteína selectina P (PSGL-1), un ligando para la familia de selectina de receptores, L, E y P, se induce en gran medida en los linfocitos T después de una infección crónica por LCMV. El PSGL-1 es reconocido principalmente por regular el tráfico de linfocitos T hacia tejidos inflamados y por mediar en la migración de linfocitos T hacia tejidos linfoides en condiciones estables y después de respuestas inflamatorias. El PSGL-1 también puede regular la migración selectiva de los linfocitos T de memoria a la médula ósea después de la resolución de una respuesta.
A pesar de los nuevos tratamientos que pueden mejorar en gran medida la destrucción inmunitaria de una amplia gama de cánceres mediante el bloqueo de receptores inmunitarios inhibidores (por ejemplo, PD-1/PD-L1, CTLA-4) y mediante linfocitos T antitumorales, la eficacia se limita a un subconjunto de pacientes (con frecuencia <30 %). Por lo tanto, existe una necesidad crítica de desarrollar nuevas estrategias para aprovechar el sistema inmunitario y conseguir una inmunoterapia eficaz en los pacientes que no responden.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere al descubrimiento seminal de que el ligando 1 de la glicoproteína selectina P (PSGL-1) modula el sistema inmunitario y las respuestas inmunitarias. Específicamente, la presente invención proporciona un antagonista del ligando 1 de la glicoproteína selectina P (PSGL-1) para su uso en el desencadenamiento de una respuesta de los linfocitos T o la restauración de la función de los linfocitos T en un método de tratamiento de una enfermedad infecciosa o un cáncer, dicho método comprende administrar el antagonista del ligando 1 de la glicoproteína selectina P (PSGL-1) a un sujeto que lo necesite en donde la respuesta de los linfocitos T CD8+ dependientes de CD4+ aumenta.
La presente invención proporciona adicionalmente una composición farmacéutica que comprende un antagonista de PSGL-1 y un vehículo farmacéutico para su uso en el desencadenamiento de una respuesta de los linfocitos T o la restauración de la función de los linfocitos T en un método de tratamiento de una enfermedad infecciosa o un cáncer, dicho método comprende administrar el antagonista del ligando 1 de la glicoproteína selectina P (PSGL-1) a un sujeto que lo necesite en donde la respuesta de los linfocitos T CD8+ dependientes de CD4+ aumenta.
La divulgación también proporciona un método de tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por linfocitos T que comprende administrar un modulador del ligando 1 de la glicoproteína selectina P (PSGL-1) a un sujeto que lo necesite. En un aspecto, el modulador de PSGL-1 es un agonista o un antagonista. En otro aspecto, la enfermedad o trastorno mediado por linfocitos T es una enfermedad infecciosa, un cáncer, un trastorno autoinmunitario o un trastorno inflamatorio. En un aspecto específico, el modulador de PS-GL-1 es un agonista y la enfermedad o trastorno mediado por linfocitos T es una enfermedad o trastorno autoinmunitario o inflamatorio. En determinados aspectos, el modulador de PSGL-1 es un antagonista y la enfermedad o trastorno mediado por linfocitos T es un cáncer o una enfermedad infecciosa.
En un aspecto, el modulador de PSGL-1 es un anticuerpo, una molécula pequeña, una proteína, una proteína de fusión 0 un ácido nucleico. En un aspecto específico, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, anticuerpo quimérico, anticuerpo humano o anticuerpo humanizado. En otro aspecto, la respuesta de los linfocitos T CD8+ dependientes de CD4+ aumenta. En un aspecto adicional, los linfocitos T específicos de virus aumentan. En otro aspecto, la respuesta de los Treg y de las DC aumenta. En un aspecto adicional, la expresión de FoxP3, IL-10, TGF-p y/o MHC clase II aumenta. En un aspecto, la secreción de CD8+ de IPNy, TNFa y CD107 aumenta. En otros aspectos, la expresión de PD-1, BTLA y CD160 disminuye o aumenta. En un aspecto, la expresión de CD25 y T-bet aumenta. En otro aspecto, el aclaramiento vírico aumenta.
La divulgación también proporciona un método de desencadenamiento de una respuesta de los linfocitos T que comprende administrar un modulador de PS-GL-1 a un sujeto que lo necesite. En un aspecto, el modulador de PSGL-1 es un agonista o un antagonista. En otro aspecto, la enfermedad o trastorno mediado por linfocitos T es una enfermedad infecciosa, un cáncer, un trastorno autoinmunitario o un trastorno inflamatorio. En un aspecto, el modulador de PSGL-1 es un anticuerpo, una molécula pequeña, una proteína, una proteína de fusión o un ácido nucleico. En un aspecto específico, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, anticuerpo quimérico, anticuerpo humano o anticuerpo humanizado. En otro aspecto, la respuesta de los linfocitos T CD8+ dependientes de CD4+ aumenta. En un aspecto adicional, los linfocitos T específicos de virus aumentan. En otro aspecto, la respuesta de los Treg y de las DC aumenta. En un aspecto adicional, la expresión de FoxP3, IL-10, TGF-p y/o MHC clase II aumenta. En un aspecto, la secreción de CD8+ de IPNy, TNFa y CD107 aumenta. En otros aspectos, la expresión de PD-1, BTLA y CD160 disminuye o aumenta. En un aspecto, la expresión de CD25 y T-bet aumenta.
La divulgación también proporciona un método de restauración de la función de los linfocitos T que comprende administrar un modulador del ligando 1 de la glicoproteína selectina P (PSGL-1) a un sujeto que lo necesite. En un aspecto, el modulador de PSGL-1 es un agonista o un antagonista. En otro aspecto, la enfermedad o trastorno mediado por linfocitos T es una enfermedad infecciosa, un cáncer, un trastorno autoinmunitario o un trastorno inflamatorio. En un aspecto, el modulador de PSGL-1 es un anticuerpo, una molécula pequeña, una proteína, una proteína de fusión o un ácido nucleico. En un aspecto específico, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, anticuerpo quimérico, anticuerpo humano o anticuerpo humanizado. En otro aspecto, la respuesta de los linfocitos T CD8+ dependientes de CD4+ aumenta. En un aspecto adicional, los linfocitos T específicos de virus aumentan. En otro aspecto, la respuesta de los Treg y de las DC aumenta. En un aspecto adicional, la expresión de FoxP3, IL-10, TGF-p y/o MHC clase II aumenta. En un aspecto, la secreción de CD8+ de IFNy, TNFa y CD107 aumenta. En otros aspectos, la expresión de PD-1, BTLA y CD160 disminuye o aumenta. En un aspecto, la expresión de CD25 y T-bet aumenta.
La divulgación también proporciona una composición farmacéutica que comprende un modulador del ligando 1 de la glicoproteína selectina P (PSGL-1) y un vehículo farmacéutico. En un aspecto, el modulador de PSGL-1 es un anticuerpo, una molécula pequeña, una proteína, una proteína de fusión o un ácido nucleico. En un aspecto adicional, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, anticuerpo quimérico, anticuerpo humano o anticuerpo humanizado.
Breve descripción de los dibujos
Las Figuras 1A-E muestran la cinética de PSGL-1 y la acumulación de linfocitos T específicos de virus en ratones PSGL-1 KO (con PSGL-1 inactivado, por sus siglas en inglés) después de la infección por Clon 13 de LCMV. Los ratones WT (de tipo silvestre, por sus siglas en inglés) se representan por barras de color negro o círculos de color negro y los ratones PSGL-1 KO por barras de color blanco. (A) Intensidad de fluorescencia media (IFM) de niveles de PSGL-1 en linfocitos T CD8+ GP33-41+ con respecto a linfocitos T CD8+ en sangre de ratones WT sin infectar. (B) Se enumeraron las frecuencias y los números absolutos de linfocitos T CD8+ específicos de virus en bazo 8 días después de la infección (d.d.i.). (C) Gráficos de FACS de frecuencias de linfocitos T CD8+ específicos de virus en linfocitos T CD8+ GP33-41+. (D) Frecuencias y números absolutos de linfocitos T CD4+ GP66-76+ específicos de virus en bazo 8 d.d.i. (E) Gráficos de FACS de frecuencias de linfocitos T CD8+ específicos de virus en linfocitos T CD4+ GPaa -76+ específicos de virus.
Las Figuras 2A-E muestran que los linfocitos T de PSGL-1 KO específicos de virus muestran una supervivencia potenciada, pero no proliferación. Los ratones WT se representan por barras de color negro y los ratones PSGL-1 KO por barras de color blanco. (A-B) Niveles de células CD4+ GP33-41+ (A) y células CD4+ GP66-76+ (B) de bazos de Wt y PSGL-1 aislados 8 d.d.i. (C-D) Niveles de IL7Ra (C) y Bcl-2 (D) de bazos de WT y PSGL-1 aislados 10 d.d.i. (E) Niveles de CD25 de sangre de WT y PSGL-1 10 d.d.i.
Las Figuras 3A-G muestran una función de los linfocitos T efectores potenciada en ratones PSGL-1 KO. Los ratones WT se representan por barras de color negro y los ratones PSGL-1 KO por barras de color blanco. (A) Producción de INF-y e INF-y TNF-a en células CD8+ GP33-41+. (B) producción de INF-y e INF-y TNF-a en células CD8+ NP396-404+. (C) producción de células CD107+ INF-Y+ Tet+. (D) producción de Granzima B en células CD8+ GP33-41+. (E) producción de T-bet en células CD8+ GP33-41+. (F) producción de Eomas en células CD8+ GP33-41+. (G) producción de INF-y, INF-y TNF-a e INF-y TNF-a IL-2 en células CD4+ GP66-76+.
Las Figuras 4A-D muestran la expresión de receptores inhibidores en linfocitos T específicos de virus. Los ratones WT se representan por barras de color negro y los ratones PSGL-1 KO por barras de color blanco. (A) niveles de PD-1 en linfocitos T CD4+ GP66-76+ específicos de virus 7 d.d.i. (B) niveles de PD-1 en linfocitos T CD4+ GP66-76+ específicos de virus 8 d.d.i. (C) niveles de PD-1 en células CD8+ GP33-41+ específicas de virus y células CD8+ NP396-404+ 8 d.d.i. (D) niveles de CD160 y BTLA en células CD8+ GP33-41+ específicas de virus.
Las Figuras 5A-G muestran que la acumulación de linfocitos T CD8+ y CD4+ específicos de virus de PSGL-1 KO es intrínseca a la célula y que la ligadura de PSGL-1 de los linfocitos T CD8+ agotados disminuyó su supervivencia. Los linfocitos T transgénicos P14 sin activación previa de WT y PSG-L-1 KO se representan por círculos o los linfocitos T CD4+ transgénicos Smarta sin activación previa de 1PSGL-1 KO se representan por cuadrados. (A-B) relación de PSGL-1 KO a WT en bazo (A) o pulmón (B) de linfocitos T transgénicos P14 sin activación previa de WT y PSG-L-1 KO (círculos) o linfocitos T CD4+ transgénicos Smarta sin activación previa de 1PSGL-1 KO (cuadrados) 1 d.d.i. (C-D) el número de células P14 de WT (círculos) y PSGL-1 KO (cuadrados) (C) o células Smarta (D) en bazo 1 d.d.i. (E) dilución de CFSE en células P14 de w T o PSGL-1 KO a 2 d.d.i. (F-G) frecuencia de linfocitos T CD8+ GP33-41+ negativos para propidio (F) y niveles de PD-1 en linfocitos T CD8+ GP33-41+ (G) de esplenocitos aislados a 9 d.d.i.
Las Figuras 6A-E muestran que los ratones PSGL-1 KO tienen un control vírico acelerado y una inmunopatología extensa. (A-C) niveles víricos de LCMV en suero (A), curvas de supervivencia (B) y niveles de cinasa en suero (C) de ratones WT representados por círculos de color negro o barras de color negro y de ratones PSGL-1 KO representados por cuadrados de color blanco o barras de color blanco 8 d.d.i. (D) histología de HyE de pulmones de WT y PSGL-1 KO sin infectar e infectados del día 8. (E) Puntuaciones de patología en pulmones para WT y PSGL-1 KO sin infectar y 8 d.d.i.
Las Figuras 7A-E muestran que la función óptima de los linfocitos T CD8+ específicos de virus en ratones PSGL-1 KO depende de la ayuda de los linfocitos T CD4+. Ratones WT representados por barras de color negro o círculos de color negro, ratones PSGL-1 KO representados por barras de color blanco o cuadrados de color blanco y ratones PSGL-1 KO empobrecidos en CD4 representados por barras de color gris o triángulos de color gris. (A) números absoluto de linfocitos T CD4+ GP66-76+ en bazo. (B) frecuencias de linfocitos T CD8+ GP33-41 y NP396-404 en sangre a 8 d.d.i. (C) número absoluto de linfocitos T CD8+ GP33-41 productores de citocinas en bazo 10 d.d.i. (D) niveles de PD-1 en linfocitos T CD8+ específicos GP33-41+ y NP396-404+ en bazo el día 10 d.d.i. (E) supervivencia y niveles víricos en suero 10 d.d.i.
Las Figuras 8A-E muestran la cinética de la respuesta de los linfocitos T CD8+ específicos de virus después de la infección por Cl13. Ratones WT (cuadrados o barras de color negro) o PSGL1-KO (cuadrados o barras de color blanco). (A-D) número absoluto de linfocitos T CD8+ GP33-41+ o NP396-404+ en los días 4, 6 y 8 d.d.i. (A, B, C) y 30 d.d.i. (D). (E) los gráficos de puntos representan un ratón representativo.
Las Figuras 9A-D muestran que los linfocitos T específicos de virus de PSGL-1 KO migran y se acumulan eficazmente en el pulmón. (AD) células de pulmones de ratones WT (barras de color negro) o PSGL1-K0 (barras de color blanco) el día 7,5 d.d.i. teñidas con tetrámeros de DbGP33-41 o tetrámeros de DbNP396-404 (A-B) o IAb-GP66-76 (C-D).
Las Figuras 10A-E muestran los niveles de receptores de citocinas en linfocitos T específicos de virus. Los ratones WT se representan por cuadrados o barras de color negro y los ratones PSGL-1 KO por cuadrados o barras de color blanco. (A) niveles de IL-7Ra en células GP33-41 a 4, 6 y 8 d.d.i. (B) niveles de IL-7Ra en células NP396-404 a 4, 6 y 8 d.d.i. (C) niveles de IL-21 a 9 d.d.i. (D) niveles de CD122 a 9 d.d.i. (E) niveles de IL-6R a 9 d.d.i.
Las Figuras 11A-E muestran que los linfocitos T efectores de ratones PSGL-1 KO expresan niveles de citocinas aumentados. Los ratones WT se representan por barras de color negro y los ratones PSGL-1 KO por barras de color blanco. (AC) producción de In F-y (A,C) y TNF-a (B) en linfocitos T c D8+ a 10 d.d.i. (D-E) producción de TNF-a (D) e IL-2 (E) en linfocitos T CD4+ a 10 d.d.i.
Las Figuras 12A-E muestran la expresión de receptores inhibidores en linfocitos T específicos de virus. Los ratones WT se representan por barras de color negro y los ratones PSGL-1 KO por barras de color blanco. (A-E) niveles de PD-1, CD160 y BTLA en linfocitos T CD8+ GP33-41- y NP396-404- específicos de virus el día 8 d.d. en bazo (A-B), en sangre el día 15 d.d.i. (C), 30 d.d.i. (D) y en bazo el día 112 d.d.i. (e )
Las Figuras 13A-E muestran el fenotipo de preinfección de las células P14 de WT y PSGL-1 KO sin activación previa y la proliferación de células P14 de WT y PSGL-1 KO. Los ratones WT se representan por barras de color negro y los ratones Tg P14+ transgénicos PSGL-1 KO se representan por barras de color blanco. (A-B) bazos teñidos con CD44 y CD62L (A) y CD25, CD69 y CDI27 (B). (c ) frecuencia de células P14 de WT o PSGL-1 KO en bazo y pulmón el día 13 d.d.i. (D) incorporación de Brdu en bazo y pulmón el día 13 d.d.i. (E) histogramas representativos en bazo.
Las Figuras 14A-B muestran una patología mayor en ratones PSGL-1 KO. Los ratones WT sin infectar se representan por círculos de color negro, los ratones PSGL-1 KO sin infectar se representan por cuadrados de barras de color blanco, los ratones infectados WT se representan por triángulos de color negro, los ratones infectados PSGL-1 KO se representan por triángulos de color blanco. (A) puntuaciones de patología para pulmón e hígado de WT y PSGL-1 KO. (B) estómago, intestino delgado y grueso aislados de ratones WT y PSGL-1 KO el día 9 d.d.i.
Las Figuras 15 A-D muestran la acumulación de linfocitos T PSGL-1KO específicos de virus después de la infección por Cl13. (A-D) Se enumeraron linfocitos T CD8+ específicos de virus en sangre a 8 d.d.i. (A) y 30 d.d.i. (B) después de la infección y en el bazo (C) y el pulmón (D) a 8 d.d.i.
Las Figuras 16A-C muestran una función antivírica potenciada de los linfocitos T CD8+ de PSGL-1 KO. (A-C) células de bazo estimuladas con los péptidos NP396-404 o GP33-41 y analizadas para determinar IFN-y y TNF-a (A, B) o CD107 (C).
Las Figuras 17A-B muestran la expresión de receptores inhibidores disminuida de los linfocitos T CD8+ específicos de virus. (A-B) Se evaluaron los linfocitos T específicos de virus a partir de niveles de PD-1 (A) y CD60 y BTLA (B). Las Figuras 18A-C muestran que los linfocitos T CD4+ de PSGL-1 KO muestran una supervivencia y una función mejoradas con una expresión del receptor inhibidor disminuida. (A-C) se midieron las frecuencias (A), las respuestas de citocinas (B) y los niveles de PD-1 y BTLA (C) 8 d.d.i.
Las Figuras 19A-B muestran que los ratones PSGL-1 KO aclaran el LCMV crónico y tienen mayores citocinas inflamatorias circulantes. (A) títulos de virus después de la infección. (B) niveles de citocinas 8 d.d.i.
Las Figuras 20A-D muestran que la supervivencia de los linfocitos T y PD-1 se modulan por la deficiencia de PGSL-1 después de la respuesta a la infección vírica y después del bloqueo de PSGL-1. (A-D) Niveles de linfocitos T CD8+ específicos de NP396-404 (A) y GP33-41 (B) analizados después de la infección. (C) niveles de linfocitos T CD8+ específicos de virus de PD-1 medidos en ratones WT y PSGL-1 KO. (D) se midieron los niveles de PD-1 en linfocitos T CD8+ NP396-404 específicos de LCMV o NP396-404 específicos de IAV 8 d.d.i.
Las Figuras 21A-B muestran la expresión de PSGL-1 y PD-1 por linfocitos T en el microambiente tumoral. (A) frecuencia de células CD4+ (izquierda), su expresión de PSGL-1 (centro) y la expresión de PD-1 por las células PSGL-1lo frente a las células PSGL-1high (derecha). (B) frecuencia de linfocitos T CD8+ (izquierda), su expresión de PSGL-1 alto (centro) y su expresión heterogénea de PD-1.
Las Figuras 22A-B muestran la expresión de PSGL-1 y la unión de PSGL-1 por los linfocitos T CD8+ en orejas melanoma+. (A) expresión de PD-1 y PSGL-1 en linfocitos T CD8+ CD44hi frente a CD44|D (B) frecuencia de linfocitos T CD8+ que tienen una unión funcional de PSGL-1.
Las Figuras 23A-B muestran los linfocitos T CD3+ en el tumor de melanoma y las frecuencias de Treg CD4+ y no-Treg CD4+. (A) linfocitos T CD3+ células mononucleares. (B) no Treg (linfocitos T efectores) CD4+ PSGL-1+, PD-1+ (doblemente positivo) y Treg con frecuencia alta dentro de los tumores alterados por citometría de flujo.
La Figura 24 muestra la presencia de células inmunitarias en melanoma y su expresión de PSGL-1. (A) linfocitos T (no Treg CD4+, Treg, células CD8+), linfocitos T NK, linfocitos NK, células dendríticas (DC, MHC II+, CD11c) células supresoras derivadas de mieloides (MDSC, Gr1+, CD11b) y macrófagos (MO, F4/80+,CD11b+) identificados dentro de tumores de melanoma. (B) estos subconjuntos de células inmunitarias expresaron PSGL-1.
Las Figuras 25A-F muestran la respuesta antitumoral de ratones deficientes en PS-GL-1 en comparación con ratones WT. (A) volumen y peso tumorales. (B) la frecuencia de linfocitos T CD8+ y CD4+ efectores. (C) la expresión de PD-1 por linfocitos T CD8+ y CD4+. (D-F) producción de citocinas por linfocitos T CD8+ y CD4+.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere al descubrimiento seminal de que el ligando 1 de la glicoproteína selectina P (PSGL-1) modula el sistema inmunitario y las respuestas inmunitarias. Específicamente, la presente invención proporciona un antagonista del ligando 1 de la glicoproteína selectina P (PSGL-1) para su uso en el desencadenamiento de una respuesta de los linfocitos T o la restauración de la función de los linfocitos T en un método de tratamiento de una enfermedad infecciosa o un cáncer, dicho método comprende administrar el antagonista del ligando 1 de la glicoproteína selectina P (PSGL-1) a un sujeto que lo necesite en donde la respuesta de los linfocitos T CD8+ dependientes de CD4+ aumenta.
Antes de describir las presentes composiciones y métodos, ha de comprenderse que la presente invención es como se define en las reivindicaciones adjuntas y no se limita a las composiciones, los métodos y las condiciones experimentales particulares descritos, ya que dichas composiciones, métodos y condiciones pueden variar. También ha de comprenderse que la terminología que se usa en el presente documento tiene solamente el fin de describir realizaciones particulares, y no tiene por objeto ser limitante, puesto que el alcance de la presente invención estará limitado solo en las reivindicaciones adjuntas.
A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que habitualmente comprende un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invención. Aunque puede usarse en la puesta en práctica o el ensayo de la invención cualquier método y material similar o equivalente a los que se describen en el presente documento, a continuación se describen los métodos y materiales preferidos. Las definiciones que se exponen a continuación son para la comprensión de la divulgación, pero en ningún caso se considerará que suplantan la comprensión de los términos por los expertos habituales en la materia.
Como se usa en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una", "el" y "la" incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, las referencias a "el método" incluyen uno o más métodos, y/o etapas del tipo que se describe en el presente documento que serán evidentes para los expertos en la materia tras leer la presente divulgación y así sucesivamente.
Los anticuerpos por lo general son glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 Dalton, compuestas por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera se une a una cadena pesada mediante un enlace disulfuro covalente, aunque el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera tiene también puentes disulfuro intracatenarios a espacios regulares. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (Vh) seguido de varios dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (Vl) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera se alinea con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que determinados restos de aminoácidos forman una interfaz entre los dominios variables de cadena ligera y pesada. Cada región variable está compuesta por tres segmentos denominados regiones determinantes de la complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) o regiones hipervariables y una porción más altamente conservada de dominios variables que se denomina región marco conservada (FR, por sus siglas en inglés). Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras comprenden cada uno cuatro regiones FR, que adoptan en gran medida una configuración de lámina p, conectadas por tres CDR, que forman bucles que conectan la estructura de la estructura de p y, en algunos casos, forman parte de la misma. Las CDR en cada cadena se mantienen próximas entre sí mediante las FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos. Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, sino que presentan diversas funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos.
Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de ellas pueden dividirse adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, 5, £, y y M, respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas.
La región Fc de un anticuerpo es la región de cola de un anticuerpo que interactúa con receptores de la superficie celular y algunas proteínas del sistema del complemento. Esta propiedad permite a los anticuerpos activar el sistema inmunitario. En los Isotipos de anticuerpos IgG, IgA e IgD, la región Fc se compone de dos fragmentos proteínicos idénticos, derivados de los dominios constantes segundo y tercero de las dos cadenas pesadas del anticuerpo; las regiones Fc de IgM e IgE contienen tres dominios constantes de la cadena pesada (dominios CH 2-4) en cada cadena polipeptídica. Las regiones Fc de las IgG llevan un sitio de N-glicosilación altamente conservado. La glicosilación del fragmento Fc es esencial para la actividad mediada por receptores de Fc. Los N-glicanos unidos a este sitio son predominantemente estructuras diantenarias con núcleo fucosilado del tipo complejo. Además, pequeñas cantidades de estos N-glicanos también llevan restos de ácido siálico unidos a-2,6 y GlcNAc bisecados.
El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refiere a anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada.
Los "fragmentos de anticuerpos" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, preferentemente la región de unión a antígeno o variable del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos, tricuerpos y similares; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenarias; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
La expresión "anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por las posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades pequeñas. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigiéndose contra un único sitio antigénico. Además, cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante del antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos porque se sintetizan mediante el cultivo de hibridoma, no contaminado por otras inmunoglobulinas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que han de usarse de acuerdo con la presente invención pueden prepararse mediante hibridomas, mediante métodos de ADN recombinante o pueden aislarse de bibliotecas de anticuerpos contra fagos.
Los anticuerpos monoclonales del presente documento incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase particular de anticuerpos, mientras que el resto de la cadena o cadenas es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada.
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab').sub.2 u otras subsecuencias de unión a antígeno de anticuerpos) que contienen una secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina no humana. En su mayoría, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en los que los restos de una región determinante de la complementariedad (CDR) del receptor se reemplazan por restos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata o conejo que tengan la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los restos de la región marco conservada (FR) de Fv de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los restos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en las CDR o las secuencias armazón importadas. Estas modificaciones se realizan para perfeccionar y maximizar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en los que todas o casi sustancialmente todas las CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado comprenderá también óptimamente al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana.
Los fragmentos de anticuerpo "Fv monocatenarios" o "sFv" comprenden los dominios Vh y Vl de un anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una única cadena polipeptídica. Preferentemente, el polipéptido de Fv comprende adicionalmente un enlazador polipeptídico entre los dominios Vh y Vl que permite que el sFv forme la estructura deseada para la unión a antígeno.
Las expresiones "molécula de fusión" y "proteína de fusión" se usan indistintamente y pretenden referirse a un polipéptido biológicamente activo, por lo general un HVEM o un anticuerpo, y a una molécula efectora, por lo general una proteína o secuencia peptídica unida covalentemente (es decir, fusionada) mediante un método recombinante, químico u otro método adecuado. Si se desea, la molécula de fusión puede fusionarse en uno o varios sitios a través de una secuencia de enlazador peptídico. Como alternativa, el enlazador peptídico puede usarse para ayudar en la construcción de la molécula de fusión. Las moléculas de fusión específicamente preferidas son las proteínas de fusión. Generalmente, la molécula de fusión también puede estar compuesta por moléculas de conjugado.
Las proteínas de fusión de Fc (también conocidas como proteína de fusión quimérica de Fc, Fc-Ig, proteína de fusión quimérica a base de Ig y proteína Fc-tag) se componen del dominio Fc de la IgG unida genéticamente a un péptido o proteína de interés. Las proteínas de fusión de Fc se han convertido en reactivos valiosos para la investigación in vivo e in vitro.
El compañero de unión fusionado con Fc puede variar de un único péptido, un ligando que se activa tras la unión a un receptor de la superficie celular, moléculas de señalización, el dominio extracelular de un receptor que se activa tras la dimerización o como una proteína cebo que se usa para identificar compañeros de unión en una micromatriz de proteínas.
Una de las características más valiosas del dominio Fc in vivo, es que puede prolongar drásticamente la semivida plasmática de la proteína de interés, que para los fármacos bioterápicos, da como resultado una eficacia terapéutica mejorada; un atributo que ha convertido a las proteínas de fusión de Fc en agentes bioterápicos atractivos.
Como se usan en el presente documento, las expresiones "ácidos nucleicos" o "secuencias de ácidos nucleicos" se refieren a un oligonucleótido, nucleótido, polinucleótido o cualquier fragmento de cualquiera de estos; e incluyen ADN o ARN (por ejemplo, ARNm, ARNr, ARNt, ARNi) de origen genómico o sintético que pueden ser monocatenarios o bicatenarios; y puede ser una cadena sentido o antisentido, o un ácido nucleico peptídico (ANP), o cualquier material similar al ADN o similar al ARN, de origen natural o sintético, incluyendo, por ejemplo, ARNi, ribonucleoproteínas (por ejemplo, por ejemplo, ARNi bicatenarios, por ejemplo, PNRi), ácidos nucleicos, es decir, oligonucleótidos, que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales.
Como se usan en el presente documento, las expresiones "polipéptido" y "proteína" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a un compuesto de dos o más subunidades de aminoácidos, análogos de aminoácidos u otros peptidomiméticos, independientemente de la modificación postraduccional, por ejemplo, fosforilación o glicosilación. Las subunidades pueden unirse mediante enlaces peptídicos u otros enlaces tales como, por ejemplo, enlaces éster o éter. La presente definición abarca polipéptidos de longitud completa, polipéptidos truncados, mutantes puntuales, mutantes de inserción, variantes de corte y empalme, proteínas quiméricas y fragmentos de los mismos. En diversas realizaciones, los polipéptidos pueden tener al menos 10 aminoácidos o al menos 25, o al menos 50 o al menos 75 o al menos 100 o al menos 125 o al menos 150 o al menos 175 o al menos 200 aminoácidos.
Como se usa en el presente documento, la expresión "molécula pequeña" se refiere a un compuesto orgánico de bajo peso molecular (<900 Dalton) que puede ayudar a regular un proceso biológico, con un tamaño del orden de 10-9 m. La mayoría de los fármacos son moléculas pequeñas. Las moléculas pequeñas pueden tener una gran diversidad de funciones biológicas, sirviendo como moléculas de señalización celular, como fármacos en medicina, como pesticidas en agricultura y en muchas otras funciones. Estos compuestos pueden ser naturales (tales como metabolitos secundarios) o artificiales (tales como fármacos antivíricos); pueden tener un efecto beneficioso contra una enfermedad (tales como fármacos) o pueden ser perjudiciales (tales como teratógenos y carcinógenos). Los biopolímeros, tales como los ácidos nucleicos y las proteínas, y los polisacáridos (tales como el almidón o la celulosa) no son moléculas pequeñas, aunque sus monómeros constituyentes ribo o desoxirribonucleótidos, aminoácidos y monosacáridos, respectivamente, son con frecuencia moléculas pequeñas.
Como se usan en el presente documento, las expresiones "tratar" o "tratamiento" o "alivio" se refieren a un tratamiento terapéutico, a medidas profilácticas y/o preventivas, en donde el objetivo es prevenir o ralentizar (aminorar) la patología o el trastorno en cuestión. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya padecen el trastorno, así como aquellos propensos a tener el trastorno o aquellos en los que ha de prevenirse el trastorno.
La expresión "agente terapéutico", como se usa en el presente documento, incluye un compuesto o composición química capaz de inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administra a un paciente o sujeto. Un ejemplo de un agente terapéutico de la presente invención es un anticuerpo anti-PSGL-1 o una proteína de fusión de PSGL-1.
Como se usan en el presente documento, las expresiones "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" de un fármaco utilizado para tratar una enfermedad es una cantidad que puede reducir la gravedad de una enfermedad, reducir la gravedad de uno o más síntomas asociados a la enfermedad o a su tratamiento, o retrasar la aparición de síntomas más graves o una enfermedad más grave que puede aparecer con cierta frecuencia después de la afección tratada. Una "cantidad eficaz" puede determinarse empíricamente y de manera rutinaria, con respecto al fin indicado.
El agente terapéutico puede administrarse por cualquier medio adecuado, incluyendo la administración tópica, parenteral, subcutánea, intraperitoneal, intrapulmonar, intranasal, intravenosa y/o intralesional para tratar al sujeto.
Como se usa en el presente documento, la expresión "enfermedad o trastorno mediado por linfocitos T" se refiere a cualquier afección que se beneficiaría del tratamiento con un modulador de PSGL-1. Los ejemplos de enfermedades y trastornos que se beneficiarían del tratamiento anti-PSGL-1 incluyen enfermedades infecciosas, cáncer y enfermedades y trastornos inmunitarios, autoinmunitarios e inflamatorios. En particular, los sujetos que tienen cáncer o una enfermedad infecciosa pueden beneficiarse del tratamiento con un antagonista de PSGL-1 y los sujetos que tienen una enfermedad o trastorno autoinmunitario o inflamatorio pueden beneficiarse del tratamiento con un agonista de PSGL-1.
Una infección se produce cuando el cuerpo de un organismo es invadido por virus patógenos, partículas víricas infecciosas (viriones), hongos o bacterias que pueden unirse y entrar en células susceptibles. Un gran número de virus provocan enfermedades infecciosas. Los ejemplos de enfermedades infecciosas incluyen, pero sin limitación, Botulismo, Peste bubónica, Infección por calicivirus (Norovirus y Sapovirus), Varicela, Clamidia, Cólera, Infección por Clostridium difficile, Resfriado común (rinofaringitis vírica aguda; Coriza aguda), Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ), Fiebre del dengue, Difteria, Fiebre hemorrágica del Ébola, Gonorrea, Enfermedad de las manos, pies y boca (EMPB), Infección por Helicobacterpylori, Hepatitis A, Hepatitis B, Hepatitis C, Hepatitis D, Hepatitis E, Herpes simple, Virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), Virus del papiloma humano (VPH), Mononucleosis infecciosa por virus de Epstein-Barr (mono), Influenza (gripe), Legionelosis (enfermedad del legionario), Lepra, Enfermedad de Lyme (borreliosis de Lyme), Malaria, Fiebre hemorrágica de Marburgo (FHM), Sarampión, Síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS), Meningitis, Paperas, Pertusis (tosferina), Peste, Leucoencefalopatía multifocal progresiva, Rabia, Infección por rinovirus, Fiebre maculosa de las Montañas Rocosas (FMMR), Rubeola, Salmonelosis, SARS (síndrome respiratorio agudo grave), Sarna, Sepsis, Sigelosis (disentería bacilar), Culebrilla (herpes zóster), Virus de la viruela (viruela), Sífilis, Tétanos, Tuberculosis, Fiebre tifoidea, Fiebre del valle, Neumonía vírica, Fiebre del Nilo Occidental y Fiebre Amarilla.
Las enfermedades infecciosas se tratan habitualmente con agentes antivíricos, agentes antibacterianos o agentes antifúngicos. Los agentes antivíricos incluyen, pero sin limitación, Abacavir, Aciclovir, Aciclovir, Adefovir, Amantadina, Amprenavir, Ampligen, Arbidol, Atazanavir, Atripla, Balavir, Cidofovir, Combivir, Dolutegravir, Darunavir, Delavirdina, Didanosina, Docosanol, Edoxudina, Efavirenz, Emtricitabina, Enfuvirtida, Entecavir, Ecoliever, Famciclovir, Fomivirsen, Fosamprenavir, Foscarnet, Fosfonet, Inhibidor de la fusión, Ganciclovir, Ibacitabina, Imunovir, Idoxuridina, Imiquimod, Indinavir, Inosina, Inhibidor de la integrasa, Interferón de tipo III, Interferón de tipo II, Interferón de tipo I, Interferón, Lamivudina, Lopinavir, Lovirida, Maraviroc, Moroxidina, Metisazona, Nelfinavir, Nevirapina, Nexavir, Análogos de nucleósidos, Novir, Oseltamivir, Peginterferón alfa-2a, Penciclovir, Peramivir, Pleconarilo, Podofilotoxina, Inhibidor de proteasas, Raltegravir, Inhibidor de la transcriptasa inversa, Ribavirina, Rimantadina, Ritonavir, Piramidina, Saquinavir, Sofosbuvir, Estavudina, Potenciador sinérgico, aceite de árbol de té, Telaprevir, Tenofovir, Tenofovir disoproxilo, Tipranavir, Trifluridina, Trizivir, Tromantadina, Truvada, Valaciclovir, Valganciclovir, Vicriviroc, Vidarabina, Viramidina, Zalcitabina, Zanamivir y Zidovudina.
Los agentes antibacterianos incluyen, pero sin limitación, Amikacina, Gentamicina, Kanamicina, Neomicina, Netilmicina, Tobramicina, Paromomicina, Estreptomicina, Espectinomicina(Bs), Geldanamicina, Herbimicina, Rifaximina, Loracarbef, Ertapenem, Doripenem, Imipenem/Cilastatina, Meropenem, Cefadroxilo, Cefazolina, Cefalotina o Cefalothin), Cefalexina, Cefaclor, Cefprozilo, Cefuroxima, Cefixima, Cefdinir, Cefditoreno, Cefoperazona, Cefotaxima, Cefpodoxima, Ceftazidima, Ceftibuteno, Ceftizoxima), Ceftriaxona, Cefepima, Ceftarolina fosamilo, Ceftobiprol, Teicoplanina, Vancomicina, Telavancina, Dalbavancina, Oritavancina, , Clindamicina, Lincomicina, Daptomicina, Azitromicina, Claritromicina, Diritromicina, Eritromicina, Roxitromicina, Troleandomicina, Telitromicina, Espiramicina, Aztreonam, Furazolidona, Nitrofurantoína(Bs), Oxazolidinonas(Bs), Linezolida, Amoxicilina, Ampicilina, Azlocilina, Carbenicilina, Cloxacilina, Dicloxacilina, Flucloxacilina, Mezlocilina, Meticilina, Nafcilina, Oxacilina, Penicilina, Penicilina, Piperacilina, Penicilina G, Temocilina, Ticarcilina, Bacitracina, Colistina, Polimixina B, Ciprofloxacino, Enoxacino, Gatifloxacino, Gemifloxacino, Levofloxacino, Lomefloxacino, Moxifloxacino, Ácido nalidíxico, Norfloxacino, Ofloxacino, Trovafloxacino, Grepafloxacino, Esparfloxacino, Temafloxacino, Mafenida, Sulfacetamida, Sulfadiazina, Sulfadiazina de plata, Sulfadimetoxina, Sulfametizol, Sulfametoxazol, Sulfanilimida, Sulfasalazina, Sulfisoxazol, Trimetoprima, Demeclociclina, Doxiciclina, Minociclina, Oxitetraciclina, Tetraciclina, Estreptomicina y Fosfomicina.
Los agentes antifúngicos incluyen, pero sin limitación, Anfotericina B, Candicidina, Filipina, Hamicina, Natamicina, Nistatina, Rimocidina, Bifonazol, Butoconazol, Clotrimazol, Econazol, Fenticonazol, Isoconazol, Ketoconazol, Luliconazol, Miconazol, Omoconazol, Oxiconazol, Sertaconazol, Sulconazol, Tioconazol, Albaconazol, Efinaconazol, Epoxiconazol, Fluconazol, Isavuconazol, Itraconazol, Posaconazol, Propiconazol, Ravuconazol, Terconazol, Voriconazol, Abafungina, Amorolfina, Butenafina, Naftifina, Terbinafina, Anidulafungina, Caspofungina y Micafungina.
Una enfermedad o trastorno inmunitario es una disfunción del sistema inmunitario. Estos trastornos pueden caracterizarse de varias maneras: por el componente o componentes del sistema inmunitario afectados; por si el sistema inmunitario es hiperactivo o hipoactivo y por si la afección es congénita o adquirida. Las enfermedades autoinmunitarias surgen de una respuesta inmunitaria anómala del cuerpo contra sustancias y tejidos normalmente presentes en el cuerpo (autoinmunidad). Una de las principales formas de entender la fisiopatología subyacente de las enfermedades autoinmunitarias ha sido la aplicación de exploraciones de asociación del genoma completo, que han identificado un grado sorprendente de compartición genética entre las enfermedades autoinmunitarias.
Los trastornos autoinmunitarios incluyen, pero sin limitación, Encefalomielitis aguda diseminada (EMAD), Enfermedad de Addison, Agammaglobulinemia, Alopecia areata, Esclerosis lateral amiotrófica (también conocida como enfermedad de Lou Gehrig), Espondilitis anquilosante, Síndrome antifosfolípido, Síndrome antisintetasa, Alergia atópica, Dermatitis atópica, Anemia aplásica autoinmunitaria, Miocardiopatía autoinmunitaria, Enteropatía autoinmunitaria, Anemia hemolítica autoinmunitaria, Hepatitis autoinmunitaria, Enfermedad autoinmunitaria del oído interno, Síndrome linfoproliferativo autoinmunitario, Pancreatitis autoinmunitaria, Neuropatía periférica autoinmunitaria, Síndrome poliendocrino autoinmunitario, Dermatitis autoinmunitaria por progesterona, Púrpura trombocitopénica autoinmunitaria, Urticaria autoinmunitaria, Uveítis autoinmunitaria, Enfermedad de Balo/esclerosis concéntrica de Balo, Enfermedad de Beh^et, Enfermedad de Berger, Encefalitis de Bickerstaff, Síndrome de Blau, Penfigoide ampolloso, Cáncer, Enfermedad de Castleman, Enfermedad celíaca, Enfermedad de Chagas, Polineuropatía inflamatoria crónica desmielinizante, Polineuropatía inflamatoria crónica desmielinizante, Enfermedad pulmonar obstructiva crónica, Osteomielitis multifocal crónica recurrente, Síndrome de Churg-Strauss, Penfigoide cicatricial, Síndrome de Cogan, Enfermedad por crioaglutininas, Deficiencia del componente 2 del complemento, Dermatitis de contacto, Arteritis craneal, Síndrome CREST, Enfermedad de Crohn, Síndrome de Cushing, Angiitis leucocitoclástica cutánea, Enfermedad de Dego, Enfermedad de Dercum, Dermatitis herpetiforme, Dermatomiositis, Diabetes mellitus de tipo 1, Esclerosis sistémica cutánea difusa, Lupus eritematoso discoide, Síndrome de Dressler, Lupus inducido por fármacos, Eccema, Endometriosis, Fascitis eosinófila, Gastroenteritis eosinófila, Neumonía eosinófila, Epidermólisis ampollosa adquirida, Eritema nudoso, Eritroblastosis fetal, Crioglobulinemia mixta esencial, Síndrome de Evan, Fibrodisplasia osificante progresiva, Alveolitis fibrosa (o fibrosis pulmonar idiopática), Gastritis, Penfigoide gastrointestinal, Glomerulonefritis, Síndrome de Goodpasture, Enfermedad de injerto contra hospedador, Enfermedad de Graves, Síndrome de Guillain-Barre, Encefalopatía de Hashimoto, Tiroiditis de Hashimoto, Púrpura de Henoch-Schonlein, Herpes gestacional, también conocido como Penfigoide gestacional, Hidradenitis supurativa, Síndrome de Hughes-Stovin, Hipogammaglobulinemia, Enfermedades desmielinizantes inflamatorias idiopáticas, Fibrosis pulmonar idiopática, Púrpura trombocitopénica idiopática, Nefropatía por IgA, Miositis por cuerpos de inclusión, Cistitis intersticial, Artritis idiopática juvenil, también conocida como Artritis reumatoide juvenil, Enfermedad de Kawasaki, Síndrome miasténico de Lambert-Eaton, Vasculitis leucocitoclástica, Liquen plano, Liquen escleroso, Enfermedad por IgA lineal, Hepatitis lupoide, también conocida como hepatitis autoinmunitaria, Lupus eritematoso, Síndrome de Majeed, Colitis microscópica, Poliangitis microscópica, Síndrome de Miller-Fisher, Enfermedad mixta del tejido conectivo, Morfea, Enfermedad de Mucha-Habermann, también conocida como Pitiriasis liquenoide y varioliforme aguda, Esclerosis múltiple, Miastenia grave, Miositis, Enfermedad de Meniere, Narcolepsia, Neuromielitis óptica, Neuromiotonía, Penfigoide cicatricial ocular, Síndrome de opsoclono-mioclono, Tiroiditis de Ord, Reumatismo palindrómico, PANDAS (trastornos neuropsiquiátricos pediátricos autoinmunitarios asociados a estreptococos), Degeneración cerebelosa paraneoplásica, Hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN), Síndrome de Parry Romberg, Pars planitis, Síndrome de Parsonnage-Turner, Pénfigo vulgar, Encefalomielitis perivenosa, Anemia perniciosa, Síndrome POEMS, Poliarteritis nodosa, Polimialgia reumática, Polimiositis, Cirrosis biliar primaria, Colangitis esclerosante primaria, Neuropatía inflamatoria progresiva, Psoriasis, Artritis psoriásica, Aplasia pura de glóbulos rojos, Pioderma gangrenoso, Encefalitis de Rasmussen, Fenómeno de Raynaud, Síndrome de Reiter, Policondritis recidivante, Síndrome de las piernas inquietas, Fibrosis retroperitoneal, Fiebre reumática, Artritis reumatoide, Sarcoidosis, Esquizofrenia, Síndrome de Schmidt, Síndrome de Schnitzler, Escleritis, Esclerodermia, Enfermedad del suero, Síndrome de Sjogren, Espondiloartropatía, Síndrome de la persona rígida, Enfermedad de Still, Endocarditis bacteriana subaguda (EBS), Síndrome de Susac, Síndrome de Sweet, Corea de Sydenham, Oftalmía simpática, Lupus eritematoso sistémico, Arteritis de Takayasu, Arteritis temporal, Trombocitopenia, Síndrome de Tolosa-Hunt, Mielitis transversa, Colitis ulcerosa, Espondiloartropatía indiferenciada, Vasculitis urticaria, Vasculitis, Vitíligo, Granulomatosis de Wegener.
Las enfermedades inflamatorias son un grupo grande de trastornos que subyacen a una gran diversidad de enfermedades humanas. El sistema inmunitario con frecuencia está implicado en los trastornos inflamatorios, demostrado tanto en reacciones alérgicas como en algunas miopatías, dando muchos trastornos del sistema inmunitario como resultado una inflamación anormal. Las enfermedades no inmunitarias con origen etiológico en procesos inflamatorios incluyen el cáncer, la ateroesclerosis y la cardiopatía isquémica. Hay una gran diversidad de proteínas implicadas en la inflamación, y cualquiera de ellas está expuesta a una mutación genética que perjudique o desregule de otro modo la función y expresión normales de esa proteína. Los ejemplos de trastornos asociados a la inflamación incluyen Acné vulgar, Asma, Enfermedades autoinmunitarias, Enfermedad celíaca, Prostatitis crónica, Glomerulonefritis, Hipersensibilidad, Enfermedades inflamatorias intestinales, Enfermedad inflamatoria pélvica, Lesión por reperfusión, Artritis reumatoide, Sarcoidosis, Rechazo de trasplantes, Vasculitis, Cistitis intersticial, Ateroesclerosis, Alergias, Miopatías, defectos leucocitarios y cáncer.
La expresión "inmunomodulador", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier agente terapéutico que modula el sistema inmunitario. Los ejemplos de inmunomoduladores incluyen eicosanoides, citocinas, prostaglandinas, interleucinas, quimiocinas, reguladores del punto de control, miembros de la superfamilia de TNF, miembros de la superfamilia de receptores de TNF e interferones. Los ejemplos específicos de inmunomoduladores incluyen PGI2, PGE2, PGF2, CCL14, CCL19, CCL20, CCL21, CCL25, CCL27, CXCL12, CXCL13, CXCL-8, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL11, CXCL10, IL1, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12, IL13, IL15, IL17, IL17, INF-a, INF-p, INF-£, INF-y, G-CSF, TNF-a, CTLA, CD20, PD1, PD1L1, PD1L2, ICOS, CD200, CD52, LTa, LTap, LIGHT, CD27L, 41BBL, FasL, Ox40L, April, TL1A, CD30L, TRAIL, RANKL, BAFF, TWEAK, CD40L, EDA1, EDA2, APP, NGF, TNFR1, TNFR2, LTpR, HVEM, CD27, 4-1BB, Fas, Ox40, AITR, DR3, CD30, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, BAFFR, TACI, BCMA, Fn14, CD40, EDAR XEDAR, DR6, DcR3, NGFR-p75 y Taj. Otros ejemplos de inmunomoduladores incluyen tocilizumab (Actemra), CDP870 (Cimzia), enteracept (Enbrel), adalimumab (Humira), Kineret, abatacept (Orencia), infliximab (Remicade), rituzimab (Rituxan), golimumab (Simponi), Avonex, Rebif, ReciGen, Plegridy, Betaseron, Copaxone, Novatrone, natalizumab (Tysabri), fingolimod (Gilenya), teriflunomida (Aubagio), BG12, Tecfidera y alemtuzumab (Campath, Lemtrada).
El cáncer es un grupo de enfermedades que implican un crecimiento celular anormal con el potencial de invadir o extenderse a otras partes del cuerpo. Los cánceres de ejemplo descritos por el Instituto Nacional del Cáncer incluyen: Leucemia linfoblástica aguda, en adultos; Leucemia linfoblástica aguda, infantil; Leucemia mieloide aguda, en adultos; Carcinoma adrenocortical; Carcinoma adrenocortical, infantil; Linfoma relacionado con SIDA; Neoplasias malignas relacionadas con SIDA; Cáncer de ano; Astrocitoma, cerebeloso infantil; Astrocitoma, cerebral infantil; Cáncer del conducto biliar, extrahepático; Cáncer de vejiga; Cáncer de vejiga, infantil; Cáncer de huesos, Osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno; Glioma del tallo cerebral, infantil; Tumor cerebral, en adultos; Tumor cerebral, Glioma del tallo cerebral, infantil; Tumor cerebral, Astrocitoma cerebeloso, infantil; Tumor cerebral, Astrocitoma cerebral/Glioma maligno, infantil; Tumor cerebral, Ependimoma, infantil; Tumor cerebral, Meduloblastoma, infantil; Tumor cerebral, Tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, infantiles; Tumor cerebral, Glioma de la vía óptica e hipotalámico, infantil; Tumor cerebral, infantil (otro); Cáncer de mama; Cáncer de mama y Embarazo; Cáncer de mama, infantil; Cáncer de mama, masculino; Adenomas bronquiales/carcinoides, infantil: Tumor carcinoide, infantil; Tumor carcinoide, gastrointestinal; Carcinoma, adrenocortical; Carcinoma, de células de los islotes; Carcinoma de sitio primario desconocido; Linfoma del sistema nervioso central, primario; Astrocitoma cerebeloso, infantil; Astrocitoma cerebral/Glioma maligno, infantil; Cáncer de cuello uterino; Cánceres infantiles; Leucemia linfocítica crónica; Leucemia mielógena crónica; Trastornos crónicos mieloproliferativos; Sarcoma de células claras de vainas tendinosas; Cáncer de colon; Cáncer colorrectal, infantil; Linfoma cutáneo de linfocitos T; Cáncer de endometrio; Ependimoma, infantil; Cáncer epitelial, ovárico; Cáncer de esófago; Cáncer de esófago, infantil; Familia de tumores de Ewing; Tumor extracraneal de células germinales, infantil; Tumor de células germinales extragonadales; Cáncer del conducto biliar extrahepático; Cáncer ocular, Melanoma intraocular; Cáncer ocular, Retinoblastoma; Cáncer de vesícula biliar; Cáncer gástrico (estómago); Cáncer gástrico (estómago), infantil; Tumor carcinoide gastrointestinal; Tumor de células germinales, extracraneal, infantil; Tumor de células germinales, extragonadal; Tumor de células germinales, ovárico; Tumor trofoblástico gestacional; Glioma, de tallo cerebral infantil; Glioma, de vía óptica e hipotalámico infantil; Leucemia de células pilosas; Cáncer de cabeza y cuello; Cáncer hepatocelular (hígado), en adultos (primario); Cáncer hepatocelular (hígado), infantil (primario); Linfoma de Hodgkin, en adultos; Linfoma de Hodgkin, infantil; Linfoma de Hodgkin durante el embarazo; Cáncer hipofaríngeo; Glioma Hipotalámico y de la Vía Óptica, infantil; Melanoma intraocular; Carcinoma de células de islote (páncreas); Sarcoma de Kaposi; Cáncer de riñón; Cáncer de laringe; Cáncer de laringe, infantil; Leucemia, Linfoblástica Aguda, en adultos; Leucemia, Linfoblástica Aguda, infantil; Leucemia, Mieloide Aguda, en adultos; Leucemia, Mieloide Aguda, infantil; Leucemia, Linfocítica Crónica; Leucemia, Mielógena Crónica; Leucemia, de células pilosas; Cáncer de labio y de la cavidad oral; Cáncer de hígado, en adultos (primario); Cáncer de hígado, infantil (primario); Cáncer de pulmón, no microcítico; Cáncer de pulmón, microcítico; Leucemia linfoblástica, aguda en adultos; Leucemia linfoblástica, aguda infantil; Leucemia Linfocítica, crónica; Linfoma, relacionado con el SIDA; Linfoma, del sistema nervioso central (primario); Linfoma, cutáneo de linfocitos T; Linfoma, de Hodgkin, en adultos; Linfoma, de Hodgkin; infantil; Linfoma, de Hodgkin durante el embarazo; Linfoma, No-Hodgkin, en adultos; Linfoma, No-Hodgkin, infantil; Linfoma, No-Hodgkin durante el embarazo; Linfoma, del sistema nervioso central primario; Macroglobulinemia, de Waldenstrom; Cáncer de mama masculino; Mesotelioma maligno, en adultos; Mesotelioma maligno, infantil; Timoma maligno; Meduloblastoma, infantil; Melanoma; Melanoma, intraocular; Carcinoma de células de Merkel; Mesotelioma, maligno; Cáncer de cuello escamoso metastásico con primario oculto; Síndrome de neoplasia endocrina múltiple, infantil; Mieloma múltiple/Neoplasia de células plasmáticas; Micosis fungoides; Síndromes mielodisplásicos; Leucemia mielógena, crónica; Leucemia mieloide, aguda infantil; Mieloma, múltiple; Trastornos mieloproliferativos, crónica; Cáncer de la cavidad nasal y del seno paranasal; Cáncer nasofaríngeo; Cáncer nasofaríngeo, infantil; Neuroblastoma; Linfoma no Hodgkin, en adultos; Linfoma no Hodgkin, infantil; Linfoma no Hodgkin durante el embarazo; Cáncer de pulmón no microcítico; Cáncer oral, infantil; Cáncer de la cavidad oral y el labio; Cáncer orofaríngeo; Osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno de hueso; Cáncer de ovario, infantil; Cáncer epitelial de ovario; Tumor de células germinales ováricas; Tumor ovárico de bajo potencial maligno; Cáncer de páncreas; Cáncer de páncreas, infantil, Cáncer de páncreas, de células de los islotes; Cáncer del seno paranasal y de la cavidad nasal; Cáncer paratiroideo; Cáncer de pene; Feocromocitoma; Tumores neuroectodérmicos primitivos pineales y supratentoriales, infantil; Tumor de la pituitaria; Neoplasia de células plasmáticas/Mieloma múltiple; Blastoma pleuropulmonar; Embarazo y Cáncer de mama; Embarazo y linfoma de Hodgkin; Embarazo y linfoma no Hodgkin; Linfoma del sistema nervioso central primario; Cáncer de hígado primario, en adultos; Cáncer de hígado primario, infantil; Cáncer de próstata; Cáncer de recto; Cáncer de células renales (riñón); Cáncer de células renales, infantil; Pelvis y uréter renal, Cáncer de células transicionales; Retinoblastoma; Rabdomiosarcoma, infantil; Cáncer de las glándulas salivales; Cáncer de glándula salival, infantil; Sarcoma, Familia de tumores de Ewing; Sarcoma, de Kaposi; Sarcoma (Osteosarcoma)/histiocitoma fibroso maligno de hueso; Sarcoma, Rabdomiosarcoma, infantil; Sarcoma, de tejidos blandos, en adultos; Sarcoma, de tejidos blandos, infantil; Síndrome de Sezary; Cáncer de piel; Cáncer de piel, infantil; Cáncer de piel (melanoma); Carcinoma de piel, de células de Merkel; Cáncer de pulmón microcítico; Cáncer del intestino delgado; Sarcoma de tejidos blandos, en adultos; Sarcoma de tejidos blandos, infantil; Cáncer escamoso de cuello con primario oculto, metastásico; Cáncer de estómago (gástrico); Cáncer de estómago (gástrico), infantil; Tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, infantil; Linfoma de linfocitos T, cutáneo; Cáncer de testículos; Timoma, infantil; Timoma, maligno; Cáncer de tiroides; cáncer de tiroides, infantil; Cáncer de células transicionales de la pelvis renal y el uréter; Tumor trofoblástico, gestacional; Cáncer de sitio primario desconocido, infantil; Cánceres inusuales infantiles; Uréter y pelvis renal, Cáncer de células transicionales; Cáncer de la uretra; Sarcoma uterino; Cáncer de vagina; Glioma de la vía óptica e hipotalámico, infantil; Cáncer de vulva; Macroglobulinemia de Waldenstrom; y Tumor de Wilms.
La expresión "agente quimioterápico", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier agente terapéutico utilizado para tratar el cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterápicos incluyen, pero sin limitación, Actinomicina, Azacitidina, Azatioprina, Bleomicina, Bortezomib, Carboplatino, Capecitabina, Cisplatino, Clorambucilo, Ciclofosfamida, Citarabina, Daunorrubicina, Docetaxel, Doxifluridina, Doxorrubicina, Epirrubicina, Epotilona, Etopósido, Fluorouracilo, Gemcitabina, Hidroxiurea, Idarrubicina, Imatinib, Irinotecán, Mecloretamina, Mercaptopurina, Metotrexato, Mitoxantrona, Oxaliplatino, Paclitaxel, Pemetrexed, Tenipósido, Tioguanina, Topotecán, Valrrubicina, Vinblastina, Vincristina, Vindesina, Vinorelbina, panitumamab, Erbitux (cetuximab), matuzumab, IMC-IIF 8, TheraCIM hR3, denosumab, Avastin (bevacizumab), Humira (adalimumab), Herceptin (trastuzumab), Remicade (infliximab), rituximab, Synagis (palivizumab), Mylotarg (gemtuzumab oxogamicina), Raptiva (efalizumab), Tysabri (natalizumab), Zenapax (dacliximab), NeutroSpec (fanolesomab de tecnecio (99mTc)), tocilizumab, ProstaScint (Capromab Pendetida marcado con Indio-I1l), Bexxar (tositumomab), Zevalin (ibritumomab tiuxetano (IDEC-Y2B8) conjugado con itrio 90), Xolair (omalizumab), MabThera (Rituximab), ReoPro (abciximab), MabCampath (alemtuzumab), Simulect (basiliximab), LeukoScan (sulesomab), CEA-Scan (arcitumomab), Verluma (nofetumomab), Panorex (Edrecolomab), alemtuzumab, CDP 870 y natalizumab.
El sistema inmunitario es un sistema de estructuras y procesos biológicos dentro de un organismo que protege contra las enfermedades. Este sistema es una red difusa y compleja de células que interactúan, productos celulares y tejidos formadores de células que protegen el cuerpo de agentes patógenos y otras sustancias extrañas, destruye las células infectadas y malignas, y retira los restos celulares: el sistema incluye el timo, el bazo, los ganglios linfáticos y el tejido linfático, las células madre, los leucocitos, los anticuerpos y las linfocinas. Las células B o linfocitos B son un tipo de linfocitos de la inmunidad humoral del sistema inmunitario adaptativo y son importantes para la vigilancia inmunitaria. Los linfocitos T o linfocitos T son un tipo de linfocitos que desempeñan una función fundamental en la inmunidad celular. Existen dos subtipos principales de linfocitos T: el linfocito T citolítico y el linfocito T auxiliar. Además, existen linfocitos T supresores que tienen una función en la modulación de la respuesta inmunitaria. Los linfocitos T citolíticos solo reconocen los antígenos acoplados a moléculas de MHC de clase I, mientras que los linfocitos T auxiliares solo reconocen antígenos acoplados a moléculas de MHC de clase II. Estos dos mecanismos de presentación de antígenos reflejan las diferentes funciones de los dos tipos de linfocitos T. El tercer subtipo menor son los linfocitos T y§ que reconocen antígenos intactos que no están unidos a receptores del MHC. Por el contrario, el receptor específico de antígeno de linfocitos B es una molécula de anticuerpo sobre la superficie de los linfocitos B, y reconoce patógenos enteros sin ninguna necesidad de procesar antígenos. Cada linaje de linfocitos B expresa un anticuerpo diferente, por lo que el conjunto completo de receptores de antígenos de linfocitos B representa todos los anticuerpos que el cuerpo puede fabricar.
El ligando 1 de la glicoproteína selectina P (PSGL-1) es expresado por las células hematopoyéticas y es un ligando altamente conservado para la familia de selectina de moléculas de adhesión, P, E y L, conocido por iniciar la migración celular. Las selectinas son parte de una familia más amplia de moléculas de adhesión celular. El PSGL-1 puede unirse a los tres miembros de la familia, pero se une con la mayor afinidad a la selectina P. El PSGL-1, una sialomucina fuertemente glicosilada que se expresa en la mayoría de los leucocitos, tiene una función doble como ligando de selectinas para la rodadura de leucocitos sobre selectinas vasculares expresadas en la inflamación y como facilitador de la migración selectiva de linfocitos T en reposo a órganos linfoides. Se ha descubierto que el PSGL-1 desempeña una función en otros contextos, tal como la migración selectiva de células madre hematopoyéticas a la médula ósea, la migración selectiva de progenitores al timo y la migración selectiva de linfocitos T a los SLO a través de interacciones con quimiocinas. La deficiencia de PSGL-1 parece influir en la homeostasis de los linfocitos T CD8+ de al menos tres formas diferentes: 1) interfiriendo con la entrada de linfocitos T en los ganglios linfáticos, limitando de este modo el acceso a citocinas homeostáticas y otras señales de prosupervivencia en el ganglio linfático; 2) prolongando el tiempo de residencia de los ganglios linfáticos, ampliando de este modo la exposición de los linfocitos T a las señales de prosupervivencia en los mismos; y 3) aumentando la sensibilidad de los linfocitos T a las citocinas.
Las infecciones víricas crónicas representan un estado alterado de la homeostasis, un equilibrio intrincado entre el hospedador y el patógeno en el que ambos sobreviven, aunque a costa de la supresión del sistema inmunitario del hospedador. Aunque se cree que la molécula de adhesión PSGL-1 actúa principalmente en la migración celular, su expresión, capacidad de señalización y especificidad de unión sugieren funciones adicionales durante la infección.
El PSGL-1 es un regulador negativo de las respuestas de los linfocitos T, no reconocido hasta ahora, que está vinculado con los niveles de expresión de múltiples receptores inmunitarios inhibidores. Por lo tanto, el PSGL-1 tiene un potencial de traducción significativo para el tratamiento de trastornos inmunitarios e inflamatorios, incluyendo el cáncer. Se ha demostrado que la deficiencia de PSGL-1 permite que los linfocitos T CD8+ monten respuestas efectoras mayores a los virus de la gripe y de la coriomeningitis linfocítica (LCMV) en modelos murinos, medidas por la citotoxicidad, la producción de citocinas y el aclaramiento de virus potenciados. Por otra parte, los linfocitos T efectores y de memoria persisten en frecuencias elevadas debido a una supervivencia mejorada. En un modelo de infección crónica con la cepa variante de LCMV, Clon 13, la deficiencia de PSGL-1 previene la infección crónica. Los linfocitos T CD8+ conservan las funciones efectoras y no consiguen desarrollar los rasgos distintivos del agotamiento, que incluyen la expresión elevada de PD-1, así como de otros varios receptores inhibidores. Los linfocitos T CD8+ con características de agotamiento se encuentran en la sangre, los ganglios linfáticos y las células infiltrantes de tumores de pacientes con melanoma. Aunque los ensayos clínicos con anti-PD-Ll, -PD-1 o -CTLA-4 han demostrado una eficacia notable, los estudios de linfocitos T de pacientes con melanoma sugieren el concepto de que el bloqueo de múltiples receptores tendrá un mayor impacto. Puesto que una función mayor de linfocitos T PSGL-1 KO se asocia a niveles más bajos de múltiples receptores inhibidores, lo presentes inventores proponen que el bloqueo de PSGL-1 podría tener los atributos necesarios para mejorar las respuestas inmunitarias de linfocitos T contra el melanoma. El PSGL-1 también es expresado por linfocitos T reguladores (Treg) y DC, cuyas funciones tolerógenas se pierden con la deficiencia de PSGL-1. Por lo tanto, el bloqueo de PSGL-1 no solo podría potenciar las respuestas de los linfocitos T efectores, sino que también podría limitar las respuestas inmunosupresoras de Treg y DC.
Como se describe en los ejemplos a continuación, se estableció que el PSGL-1 inesperadamente desempeña una función como regulador de la función de los linfocitos T que puede ser aprovechada por un virus crónico para mantener la inmunidad de los linfocitos T efectores con control, permitiendo de este modo una infección persistente sino también limitando el daño tisular del hospedador mediado por el sistema inmunitario. En hospedadores deficientes en PSGL-1, los linfocitos T CD8+ y CD4+ no consiguieron adquirir los rasgos distintivos del agotamiento de los linfocitos T y, en cambio, se convirtieron en efectores multifuncionales robustos que se mantuvieron en niveles elevados y que, en conjunto, promovieron el aclaramiento temprano del virus, resultados que requerían mecánicamente linfocitos T CD4+. Esta inmunidad antivírica eficaz se vinculó con la expresión reducida de receptores inhibidores en linfocitos T tanto CD8+ como CD4+, así como niveles sistémicos aumentados de citocinas proinflamatorias y de patología inmunitaria. En ausencia de linfocitos T CD4+, los linfocitos T CD8+ de ratones deficientes en PSGL-1 no consiguieron regular negativamente los receptores inhibidores, mostraron un agotamiento funcional y fueron incapaces de soportar el aclaramiento del virus. Por lo tanto, el alivio de la inhibición dependiente de PSGL-1 de células CD4+ es clave para inducir una respuesta antivírica eficaz por los linfocitos T CD8+. El PSGL-1 también desempeña una función intrínseca en linfocitos T en la limitación de la supervivencia de células efectoras CD8+ y CD4+, que también podría contribuir a un control vírico reducido.
La replicación vírica persistente después de la infección por Cl13 impulsa el agotamiento de linfocitos T CD8+ y la apoptosis mediante la extinción de la producción, la disponibilidad y las respuestas a las citocinas de supervivencia ye, IL-2, 1L-7 y 1L-21. Cabe destacar que, la deficiencia de PSGL-1 se asoció a una expresión mayor y sostenida de IL-7Ra, así como de Bcl-2, sugiriendo que la señalización de IL-7Ra potenciada proporciona un mecanismo para mejorar la supervivencia de los linfocitos T efectores. Esta conclusión está respaldada por el hallazgo de que la administración terapéutica de IL-7 expande los linfocitos T CD8+ específicos de virus, aumenta su función efectora y evita la persistencia de la infección por Cl13. La expresión aumentada del receptor de IL-2 de alta afinidad, CD25, en linfocitos T CD8+ deficientes en PSGL-1, y la mayor disponibilidad de IL-2 de linfocitos T CD4+ también podrían ser la causa de la supervivencia y la función mejoradas de los linfocitos T CD8+ así como los CD4+. Estudios anteriores demostraron que la IL-2 aumenta los linfocitos T CD8+ específicos de virus y reduce la carga vírica cuando se administra a ratones infectados con Cl13. Puesto que la pérdida progresiva de función por los linfocitos T CD8+ puede conducir a la eliminación de clones de alta afinidad por apoptosis mediada por TGF-a que puede ser revertida por IL-2 y 1L-7, los hallazgos de los presentes inventores sugieren que, en combinación, las señales de IL-7 e IL-2 potenciadas a linfocitos T CD8-+ específicos de virus podrían contribuir a los mecanismos de supervivencia. Sin embargo, puesto que se detectaron niveles séricos elevados de IL-21 en el pico de la respuesta de los linfocitos T CD8+ en ratones deficientes en PSGL-1 y la IL-21 mantiene los linfocitos T CD8+ específicos de virus durante la infección crónica por LCMV, esta citocina yc que es producida por linfocitos T CD4+, así como por otros tipos de células, también podría contribuir al mecanismo de supervivencia de los linfocitos T CD8+ específicos de virus. También se observó niveles aumentados de IL-6, que es necesaria para la generación y la función de los linfocitos T foliculares auxiliares (Tfh), conduciendo de este modo a respuestas de anticuerpos mejoradas que contribuyen al control en última instancia del LCMV crónico. Los resultados que se describen a continuación indican que en ratones WT, el PSGL-1 desempeña una función central en la amortiguación de la respuesta de los linfocitos T a Cl 13 mediante la limitación de las respuestas de supervivencia de los linfocitos T CD8+ y c D4+ específicos de virus a varias citocinas prosupervivencia y mediante la restricción de la producción de citocinas clave implicadas en la ayuda de los linfocitos T CD4.
Las infecciones víricas crónicas mantienen las respuestas antivíricas de los linfocitos T en un estado de disfunción que se asocia a varios receptores inmunitarios inhibidores. Es sorprendente que cada uno de los receptores analizados, PD-1, CD160 y BTLA, se reguló negativamente en efectores CD8+ y CD4+ deficientes en PSGL-1 después de la infección por Cl13 y la respuesta antivírica mejoró drásticamente. Los resultados implican que el PSGL-1 es normalmente una parte clave de un programa regulador que evita las respuestas excesivas de los linfocitos T. La deficiencia de PSGL-1 no tuvo ningún efecto aparente sobre los linfocitos T en reposo ni condujo a respuestas inflamatorias inherentes; sin embargo, su ausencia da como resultado una inmunopatología y una mortalidad aumentada después de la infección por Cl13. Esto subraya la función del PSGL-1 en el equilibrio de las respuestas excesivas de los linfocitos T y la destrucción de tejido del hospedador al antígeno persistente. Mecanicísticamente, se descubrió que la ligadura de PSGL-1 durante la estimulación con antígenos condujo a la supervivencia reducida de los linfocitos T CD8+ agotados y a PD-1 regulado positivamente en las células viables restantes, lo que indica que la señalización del PSGL-1 se vincula con la expresión de este receptor.
Los cambios en la regulación transcripcional que por lo general se asocian a la disfunción de los linfocitos T CD8+ incluyen la expresión reducida de homes y el T-bet potenciado, que favorecen la diferenciación de efectores durante la infección crónica frente a la formación de memoria durante la infección aguda. Estos factores de transcripción tienen funciones opuestas en la infección crónica por LCMV, con linfocitos T CD8+ específicos de virus más agotados que expresan niveles más altos de homes y niveles de T-bet reducidos. Puesto que la expresión elevada de T-bet reprime la expresión de PD-1, es sorprendente que la deficiencia de PSGL-1 provocara homes reducidos y más T-bet, respaldando adicionalmente el concepto de que cambios en la regulación transcripcional y los marcadores de agotamiento están vinculados con la expresión de PSGL-1.
Puede encontrarse una expresión de PSGL-1 alta en muchos tipos celulares, incluyendo las DC y los Treg, donde se ha asociado a la regulación funcional, delineando las DC tolerógenas y los Treg más supresores. Por lo tanto, el PSGL-1 podría desempeñar funciones en otras células que contribuyen indirectamente a la disfunción de los linfocitos T durante la infección crónica. Sin embargo, los resultados de los presentes inventores indican que estos efectos, si se producen en el contexto de la deficiencia de PSGL-1, requieren la actividad de los linfocitos T CD411 para realizar la actividad reguladora de PSGL-1. Se ha publicado que los ratones deficientes en PSGL-1 presentan un fenotipo sutil y los datos de los presentes inventores indican que la infección es necesaria para inducir los efectos inhibidores dependientes de PSGL-1 profundos. A pesar del tráfico alterado de células pre-T al timo, y de los linfocitos T CD4+ sin activación previa a los ganglios linfáticos, los linfocitos T sin activación previa periféricos parecen generarse normalmente en ausencia de PSGL-1, aunque las células con fenotipo de memoria están algo aumentadas, posiblemente debido a un mayor recambio. Dados los efectos intrínsecos de linfocitos T de la deficiencia de PSGL-1 sobre la supervivencia de las células efectoras y la inversión de la inmunidad antivírica potenciada con el empobrecimiento de linfocitos T CD4+, los aspectos más sutiles de la regulación en el contexto de la deficiencia de PSGL-1 no parecen contribuir de forma sustancial a los resultados de este estudio.
Los recientes ensayos clínicos con anti-PD-1/PD-L1 y/o CTLA-4 respaldan el concepto de que la inmunidad frente a tumores o virus crónicos puede mejorarse interfiriendo en las vías inhibidoras. Además, el direccionamiento a combinaciones de receptores inhibidores puede conducir a una mayor eficacia y, puesto que múltiples receptores inhibidores disminuyen por PSGL-1, este receptor podría ser una diana novedosa cuya inhibición podría mejorar las respuestas de los linfocitos T en varios contextos clínicos.
En el presente documento se describe un método de tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por linfocitos T que comprende administrar un modulador del ligando 1 de la glicoproteína selectina P (PSGL-1) a un sujeto que lo necesite. En un aspecto, el modulador de PSGL-1 es un agonista o un antagonista. En otro aspecto, la enfermedad o trastorno mediado por linfocitos T es una enfermedad infecciosa, un cáncer, un trastorno autoinmunitario o un trastorno inflamatorio. En un aspecto adicional, la enfermedad infecciosa es Botulismo, Peste bubónica, Infección por calicivirus (Norovirus y Sapovirus), Varicela, Clamidia, Cólera, Infección por Clostridium diffiále, Resfriado común (rinofaringitis vírica aguda; Coriza aguda), Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ), Fiebre del dengue, Difteria, Fiebre hemorrágica del Ébola, Gonorrea, Enfermedad de las manos, pies y boca (EMPB), Infección por Helicobacterpylori, Hepatitis A, Hepatitis B, Hepatitis C, Hepatitis D, Hepatitis E, Herpes simple, Virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), Virus del papiloma humano (VPH), Mononucleosis infecciosa por virus de Epstein-Barr (mono), Influenza (gripe), Legionelosis (enfermedad del legionario), Lepra, Enfermedad de Lyme (borreliosis de Lyme), Malaria, Fiebre hemorrágica de Marburgo (FHM), Sarampión, Síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS), Meningitis, Paperas, Pertusis (tosferina), Peste, Leucoencefalopatía multifocal progresiva, Rabia, Infección por rinovirus, Fiebre maculosa de las Montañas Rocosas (FMMR), Rubeola, Salmonelosis, SARS (síndrome respiratorio agudo grave), Sarna, Sepsis, Sigelosis (disentería bacilar), Culebrilla (herpes zóster), Virus de la viruela (viruela), Sífilis, Tétanos, Tuberculosis, Fiebre tifoidea, Fiebre del valle, Neumonía vírica, Fiebre del Nilo Occidental o Fiebre Amarilla. En determinado aspecto, el cáncer es de próstata, colon, abdomen, hueso, mama, sistema digestivo, hígado, páncreas, peritoneo, glándulas endocrinas (suprarrenal, paratiroides, hipófisis, testículos, ovario, timo, tiroides), ojo, cabeza y cuello, sistema nervioso (central y periférico), sistema linfático, pelvis, piel, tejido blando, bazo, torácico o del tracto urogenital. En un aspecto adicional, el trastorno autoinmunitario es enfermedad de Addison, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Crohn, síndrome de Cushing, diabetes mellitus de tipo 1, enfermedad de injerto contra hospedador, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barre, lupus eritematoso, esclerosis múltiple, psoriasis, artritis psoriásica, artritis reumatoide, sarcoidosis, esclerodermia, lupus eritematoso sistémico, rechazo de trasplantes o vasculitis. En un aspecto específico, el modulador de PSGL-1 es un agonista y la enfermedad o trastorno mediado por linfocitos T es una enfermedad o trastorno autoinmunitario o inflamatorio. En determinados aspectos, el modulador de PSGL-1 es un antagonista y la enfermedad o trastorno mediado por linfocitos T es un cáncer o una enfermedad infecciosa.
En un aspecto, el modulador de PSGL-1 es un anticuerpo, una molécula pequeña, una proteína, una proteína de fusión 0 un ácido nucleico. En un aspecto específico, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, anticuerpo quimérico, anticuerpo humano o anticuerpo humanizado. En otro aspecto, la respuesta de los linfocitos T CD8+ dependientes de CD4+ aumenta. En un aspecto adicional, los linfocitos T específicos de virus aumentan. En otro aspecto, la respuesta de los Treg y de las DC aumenta. En un aspecto adicional, la expresión de FoxP3, IL-10, TGF-p y/o MHC clase II aumenta. En un aspecto, la secreción de CD8+ de IPNy, TNFa y CD107 aumenta. En otros aspectos, la expresión de PD-1, BTLA y CD160 disminuye o se reduce. En un aspecto, la expresión de CD25 y T-bet aumenta. En otro aspecto, el aclaramiento vírico aumenta. En un aspecto adicional, el método comprende adicionalmente la administración de un agente terapéutico. En un aspecto adicional, el agente terapéutico es un inmunomodulador, un agente quimioterápico, un agente antivírico, un agente antibacteriano o un agente antifúngico.
En el presente documento se desvela adicionalmente un método de desencadenamiento de una respuesta de los linfocitos T que comprende administrar un modulador de PSGL-1 a un sujeto que lo necesite. En un aspecto, el modulador de PSGL-1 es un agonista o un antagonista. En otro aspecto, la enfermedad o trastorno mediado por linfocitos T es una enfermedad infecciosa, un cáncer, un trastorno autoinmunitario o un trastorno inflamatorio. En un aspecto, el modulador de PSGL-1 es un anticuerpo, una molécula pequeña, una proteína, una proteína de fusión o un ácido nucleico. En un aspecto específico, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, anticuerpo quimérico, anticuerpo humano o anticuerpo humanizado. En otro aspecto, la respuesta de los linfocitos T CD8+ dependientes de CD4+ aumenta. En un aspecto adicional, los linfocitos T específicos de virus aumentan. En otro aspecto, la respuesta de los Treg y de las DC aumenta. En un aspecto adicional, la expresión de FoxP3, IL-10, TGF-p y/o MHC clase II aumenta. En un aspecto, la secreción de CD8+ de IPNy, TNFa y CD107 aumenta. En otros aspectos, la expresión de PD-1, BTLA y CD160 disminuye o aumenta. En un aspecto, la expresión de CD25 y T-bet aumenta.
En el presente documento también se describe un método de restauración de la función de los linfocitos T que comprende administrar un modulador del ligando 1 de la glicoproteína selectina P (PSGL-1) a un sujeto que lo necesite. En un aspecto, el modulador de PSGL-1 es un agonista o un antagonista. En otro aspecto, la enfermedad o trastorno mediado por linfocitos T es una enfermedad infecciosa, un cáncer, un trastorno autoinmunitario o un trastorno inflamatorio. En un aspecto, el modulador de PSGL-1 es un anticuerpo, una molécula pequeña, una proteína, una proteína de fusión o un ácido nucleico. En un aspecto específico, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, anticuerpo quimérico, anticuerpo humano o anticuerpo humanizado. En otro aspecto, la respuesta de los linfocitos T CD8+ dependientes de CD4+ aumenta. En un aspecto adicional, los linfocitos T específicos de virus aumentan. En otro aspecto, la respuesta de los Treg y de las DC aumenta. En un aspecto adicional, la expresión de FoxP3, IL-10, TGF-p y/o MHC clase II aumenta. En un aspecto, la secreción de CD8+ de IFNy, TNFa y CD107 aumenta. En otros aspectos, la expresión de PD-1, BTLA y CD160 disminuye o aumenta. En un aspecto, la expresión de CD25 y T-bet aumenta. En un aspecto adicional, el método comprende adicionalmente la administración de un agente terapéutico. En un aspecto adicional, el agente terapéutico es un inmunomodulador, un agente quimioterápico, un agente antivírico, un agente antibacteriano o un agente antifúngico.
En el presente documento también se describe una composición farmacéutica que comprende un modulador del ligando 1 de la glicoproteína selectina P (PSGL-1) y un vehículo farmacéutico. En un aspecto, el modulador de PSGL-1 es un anticuerpo, una molécula pequeña, una proteína, una proteína de fusión o un ácido nucleico. En un aspecto adicional, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, anticuerpo quimérico, anticuerpo humano o anticuerpo humanizado.
La invención en todos sus aspectos se ilustra adicionalmente en los siguientes Ejemplos. Los ejemplos, sin embargo, no limitan el alcance de la invención, que se define por las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplos
EJEMPLO 1
La expresión de PSGL-1 aumenta en los linfocitos T CD8+ específicos de virus y los ratones deficientes en PSGL-1 tienen una acumulación de linfocitos T específicos de virus durante la infección por C113
Para estudiar el PSGL-1 en la infección vírica crónica, se usó el virus LCMV C113, que da como resultado viremia a 90 d.d.i. y virus detectables en cerebro y riñón a 200 días después de la infección (d.d.i.). Los niveles de PSGL-I en linfocitos T CD8+ específicos para el epítopo de LCMV GP33-41+ se examinaron en primer lugar mediante tinción de tetrámeros. Aunque todos los linfocitos T expresan PSGL-1, los niveles aumentaron en los linfocitos T CD8+ específicos de virus en comparación con aquellos sin activación previa (Fig. 1a). Para examinar las contribuciones de PSGL-1 a la respuesta antivírica, se infectaron ratones WT o deficientes en PSGL-1 con Cl13 y se analizaron los linfocitos T CD8+ específicos para los epítopos GP33-41+ y NP396-404+ de LCMV. Los ratones deficientes en PSGL-1 tuvieron frecuencias muy aumentadas y números de linfocitos T CD8+ GP33-41+ a 8 d.d.i. (Fig. 1b). La diferencia en la acumulación de linfocitos T CD8+ no se observó hasta después de 4 d.d.i. (Fig. 8a-b) y las células tetraméricas se mantuvieron hasta 30 d.d.i. (Fig. 8c-e). Mucho más impresionante fue la conservación de linfocitos T NP396-404+ en ratones deficientes en PSGL-1 (Fig. 1 b,c), ya que estas células se suprimen en gran medida 30 d.d.i. en ratones WT (Fig. 8c-e). También se observó que los linfocitos T CD4+ GP66-76+ específicos de virus aumentaban en ratones deficientes en PSGL-1 (Fig. 1d,e). Esta diferencia se observó 5 d.d.i. (Fig. 7a).
Puesto que el compromiso de PSGL-1 en los linfocitos T por la selectina E y P en el endotelio puede ser importante para la migración a sitios de inflamación, La acumulación de linfocitos T CD8+ en la sangre y el bazo en los ratones deficientes en PSGL-1 podría ser el resultado de una migración alterada a sitios periféricos. El pulmón, que representa un sitio alternativo de infección que, a diferencia del bazo, requiere la regulación de los receptores de adhesión para la entrada de los linfocitos T, se examinó. Coherente con los hallazgos en el bazo, los linfocitos T CD8+ (Fig. 9a,b) y CD4+ específicos de virus (Fig. 9c,d) en los pulmones de ratones deficientes en PSGL-1 se acumularon en mayor medida que en ratones WT. Los resultados muestran que, en ratones deficientes en PSGL-1, los linfocitos T específicos de virus se conservan en números sorprendentemente más altos que las células WT.
EJEMPLO 2
Los linfocitos T CD8+ deficientes en PSGL-1 tienen una supervivencia potenciada
Una proliferación y/o una supervivencia potenciadas podrían explicar la acumulación de linfocitos T específicos de virus en ratones deficientes en PSGL-1. Para evaluar la proliferación, se analizó la incorporación de BrdU in vivo por linfocitos T CD8+ específicos de virus a 8 d.d.i. El BrdU marcó el -50 % de los linfocitos T CD8+ GP33-41+ WT, pero solo un -25 % de los linfocitos T CD8+ GP33-41+ deficientes en PSGL-1 (Fig. 2a). De manera similar, el número de linfocitos T CD4+ GP66-76 WT que incorporaron BrdU fue dos veces superior al de las células CD4+ específicas de virus deficientes en PSGL-1 (Fig. 2b). Puesto que la división no parecía explicar los números mayores de linfocitos T CD8+ deficientes en PSGL-1, se examinaron los niveles de expresión de las moléculas de supervivencia, IL-7Ra y su diana de señalización corriente abajo Bc 1-2 por las células efectoras CD8+. A 10 d.d.i., los linfocitos T tanto GP33-41 + como NP396-404+ de ratones deficientes en PSGL-1 mostraron niveles aumentados de IL-7Ra (Fig. 2c) y Bcl-2 (Fig. 2d) en comparación con las células WT. Además, los niveles de IL-7Ra en linfocitos T CD8+ específicos de virus deficientes en PSGL-1 fueron superiores a los de las células WT durante toda la fase de expansión (Fig. 10a,b). Los niveles de CD25 en linfocitos T GP33-41+ y NP396-404+ de ratones deficientes en PSGL-1 también habían aumentado (Fig. 2e), mientras que los receptores para otras citocinas que pueden potenciar la supervivencia de los linfocitos T eran similares o estaban reducidos, incluyendo IL-21R, CD122 y IL-6R (Fig. 10c-e). En conjunto, estos hallazgos indican que la acumulación de linfocitos T CD8+ específicos de virus en ratones deficientes en PSGL-1 fue probablemente un resultado de la supervivencia potenciada.
EJEMPLO 3
Los linfocitos T CD4+ y CD8+ específicos de virus en ratones deficientes en PSGL-1 son efectores multifuncionales
Puesto que la infección vírica crónica en ratones WT conduce a la pérdida secuencial de la capacidad de los linfocitos T CD8+ para producir IFN-y, TNF-a e IL-2, así como para producir más de una de estas citocinas simultáneamente, se examinó la producción de citocinas. Se descubrieron frecuencias mucho más altas de linfocitos T GP33-41 deficientes en PSGL-1 que secretan IPNy e IFN-y TNF -a conjuntamente en comparación con las células WT (Fig. 3a). Las respuestas de linfocitos T NP396-404+ también fueron funcionales (Fig. 3b). Por cada célula, el -10 % de los linfocitos T GP33-41 + produjeron IFN-y en ratones WT frente al -70 % en ratones deficientes en PSGL-1 (Fig. 3a). Además, los linfocitos T CD8+ deficientes en PSGL-1 específicos de virus produjeron niveles significativamente más altos de citocinas (Fig. 11a,b). Los linfocitos T CD8+ deficientes en PSGL-1 tanto GP33-41+ como NP396-404+ tenían niveles potenciados de CD107a, lo que indica una mejor desgranulación citotóxica, junto con la sección de IFN-y (Fig. 3c), aunque los linfocitos T CD8+ GP33-41+ WT y deficientes en PSGL-1 no difirieron con respecto a los niveles de la proteína granzima B (Gzrnb) (Fig. 3d).
Los programas transcripcionales difieren en la infección por LCMV aguda frente a la crónica. Aunque T-bet es importante en la regulación de la diferenciación de linfocitos T CD8+ efectores y de memoria durante las infecciones agudas, durante la infección por Cl13 los linfocitos T CD8+ agotados tienen una expresión reducida de T-bet, que actúa para mantener los niveles de PD-1. Puesto que T-bet puede unirse directamente al gen Pdcdl que codifica PD-1 y reprime su expresión, se examinaron los niveles de T-bet en linfocitos T CD8+ específicos de virus y se descubrió una expresión aumentada en linfocitos T GP33-44+ en ratones deficientes en PSGL-1 a 10 d.d.i. en comparación con las células WT (Fig. 3e). Además, niveles altos de Eomes, que marcan los linfocitos T CD8+ terminalmente diferenciadas destinadas a morir en ratones infectados con Cl13 Wt , se redujeron en linfocitos T GP33-41 + en ratones deficientes en PSGL-1 (Fig. 3f). Por lo tanto, aunque los linfocitos T CD8+ en ratones WT desarrollan agotamiento durante la infección por Cl13, en ratones deficientes en PSGL-1 generan, en cambio, efectores multifuncionales.
La importancia de los linfocitos T CD4+ durante la infección persistente se pone de manifiesto por el fracaso de ratones infectados con C113 empobrecidos en linfocitos T CD4+ para controlar la viremia. También se observó una funcionalidad mejorada con respecto a la producción de citocinas con células CD4+ GP66-76+ (Fig. 3 g, Fig. 11c-e). No solo los linfocitos T CD4+ más específicos de virus de ratones deficientes en PSGL-1 produjeron IFN-y, TNF-a e IL-2 elevados en comparación con los de los ratones WT y estos linfocitos T CD4+ específicos de virus eran multifuncionales con números aumentados de productores de citocinas dobles/triples (Fig. 3 g) que también produjeron niveles más altos de citocinas (Fig. 11c-e). Estos hallazgos demuestran que se desarrollan números mayores de linfocitos T efectores CD4+ específicos de virus funcionalmente superiores en ratones deficientes en PSGL-1 que en ratones WT, después de la infección por Cl13.
EJEMPLO 4
Los linfocitos T deficientes en PSGL-1 tienen una expresión reducida de receptores inhibidores
Puesto que el agotamiento de linfocitos T es, en parte, una consecuencia de la expresión de múltiples moléculas inhibidoras, incluyendo PD-1, CD1 60, Lag-3 y BTLA, estos receptores se examinaron en linfocitos T específicos de virus en ratones WT y deficientes en PSGL-1 después de la infección. Se observó que los niveles de PD-1 en linfocitos T CD4+ GPaa -76+ específicos de virus comenzaron a disminuir 7 d.d.i. en ratones deficientes en PSGL-1, y disminuyeron adicionalmente el día 8 (Fig. 4a, b). En este momento, los niveles de BTLA también disminuyeron en linfocitos T CD4 deficientes en PSGL-1 (Fig. 4b). Análogamente, en comparación con WT, los linfocitos T CD8+ deficientes en PSGL-1 expresaron niveles más bajos de PD-1, pero niveles similares de CD160 y BTLA a 8 d.d.i. (Fig. 12a,b). Los linfocitos T c D8+ específicos de virus deficientes en PSGL-1 mostraron una expresión disminuida de los tres receptores 9 d.d.i. (Fig. 4c,d). Además, la regulación negativa de PD-1 se mantuvo a 15, 30 y 112 d.d.i. (Fig. 12ce). Estos hallazgos indican que, aunque no está regulada de forma coordinada, la reducción de los niveles de receptores inhibidores se correlaciona con la funcionalidad de los linfocitos T CD4+ y CD8+ específicos de virus en ratones deficientes en PSGL-1 después de la infección por Cl13.
EJEMPLO 5
La acumulación de linfocitos T deficientes en PSGL-1 específicos de virus es intrínseca a la célula
Para abordar qué características de la respuesta mejorada a Cl13 en ratones deficientes en PSGL-1 eran intrínsecas a los linfocitos T, se usaron células P14 c D8+ transgénicas de TCR WT y deficientes en PSGL-1, que son específicas para el epítopo GP33-41 de LCMV, y se transfirieron estas células a hospedadores WT. El estado de activación de las células P14 WT y deficientes en PSGL-1 se examinó directamente ex vivo y se descubrieron niveles de expresión similares de CD44 y CD62L (Fig. 13a), y de CD25, CD69 y IL-7Ra (Fig. 13b). Después, las células P14 WT y deficientes en PSGL-1 se cotransfectaron en una relación 1:1 en hospedadores WT e infectaron los ratones con Cl13 un día después. En el bazo (Fig. 5a) y en el pulmón (Fig. 5b) a 5 y 7 d.d.i. se descubrió una relación aumentada de células P14 deficientes en PSGL-1 con respecto a las células P14 WT. Este aumento también se reflejó en números mayores de células P14 deficientes en PSGL-1 en bazos (Fig 5c) y en frecuencias aumentadas en el bazo y los pulmones a 13 d.d.i. (Fig 13c). Esta acumulación no fue el resultado de una proliferación aumentada, medida mediante la incorporación de BrdU a 8 d.d.i. (datos no mostrados) y a 13 d.d.i. (Fig. 13d,e), respaldando el concepto de que los linfocitos T deficientes en PSGL-1 sobrevivieron mejor que las células WT. Además, la dilución de CFSE en células P14 WT y deficientes en PSGL-1 fue idéntica a 2 d.d.i., de hecho en este momento las células WT tenían una ligera ventaja de acumulación (Fig. 5e). A pesar de la mayor acumulación, las células deficientes en PSGL-1, no de forma inesperada, mostraron un fenotipo agotado (producción disminuida de citocinas y alta de PD-1) cuando respondieron en el entorno WT con la infección por Cl13 (datos no mostrados). Por lo tanto, aunque la acumulación de linfocitos T CD8+ específicos de virus deficientes en PSGL-1 era intrínseca a la célula, su restauración funcional depende de factores adicionales en el entorno deficiente en PSGL-1. A continuación, la función de PSGL-1 en células CD4+ específicas de virus se examinó con linfocitos T CD4+ Smarta transgénicos WT y deficientes en PSGL-1. Cuando se transfirieron a ratones WT, se observó un aumento de la relación de células deficientes en PSGL-1 con respecto a las células WT 5 y 7 d.d.i. en bazo (Fig. 5a) y pulmones (Fig. 5b) después de la infección, con números paralelos aumentados (Fig. 5d). A pesar de tener una supervivencia intrínseca a la célula, los efectores deficientes en PSGL-1, tanto CD8+ como CD4+, no consiguen ser rescatados funcionalmente en un entorno WT.
EJEMPLO 6
La ligadura de PSGL-1 dism inuye la supervivencia de linfocitos T CD8+ agotados
Para determinar el impacto de la ligadura de PSGL-1 en linfocitos T CD8+ específicos de virus, se aislaron esplenocitos de ratones WT a 9 d.d.i., un punto en el que los linfocitos T CD8+ están funcionalmente agotados. Se descubrió un -7 % de linfocitos T CD8+ tetrámero+ viables después de 4 días de estimulación con GP33-41 (Fig. 5f). Cuando los esplenocitos se estimularon con el péptido GP33-41 en presencia de anticuerpo anti-PSGL-1, la supervivencia de los linfocitos T CD8+ tetrámeros disminuyó un -50 %, a niveles similares a aquellos en cultivos con medios que contienen solo IgG o anti-PSGL-1 (Fig. 5f). Los niveles de PD-1 aumentaron después de la estimulación con péptidos, y estos niveles se elevaron adicionalmente cuando, había presente anti-PSGL-1 durante la estimulación con péptidos (Fig. 5 g). Estos resultados muestran que la ligadura de PSGL-1 durante la estimulación con antígeno limita la supervivencia de los linfocitos T CD8+ específicos de virus y puede potenciar su expresión de PD-1.
EJEMPLO 7
Los ratones deficientes en PSGL-1 aclaran el control de LCMV crónico pero muestran una inmunopatología potenciada
Puesto que se observaron respuestas de linfocitos T CD4+ y CD8+ funcionales mejoradas junto con la expresión de receptores inmunitarios disminuida en ratones deficientes en PSGL-1 en comparación con WT, se examinó la capacidad de los ratones deficientes en PSGL1 para controlar el virus Cl13. Se descubrió que en comparación con los ratones WT, que tenían una viremia elevada hasta 30 d.d.i., los ratones deficientes en PSGL-1 aclararon el virus de la sangre 15 d.d.i. (Fig. 6a). Sin embargo, la respuesta de linfocitos T antivíricos mejorada se asoció a una mortalidad >50 %, comenzando la muerte a 8 d.d.i. (Fig. 6b). Para abordar la inflamación sistémica, se examinaron las citocinas proinflamatorias y se observó que los ratones deficientes en PSGL-1 tenían niveles séricos drásticamente elevados de IL-6, IL-21, TNF-a e IFN-y (Fig. 6c). Además, la inmunopatología pulmonar que incluía infiltrados pulmonares (Fig. 6d, Fig. 14a), edema e inflamación a 8 d.d.i. (Fig. 6d,e) aumentó en ratones infectados deficientes en PSGL-1. La patología elevada también fue evidente en los riñones, hígados e intestinos (Fig. 14a,b). Por lo tanto, aunque los ratones deficientes en PSGL-1 controlaron la replicación vírica mucho más eficazmente que los ratones WT, esto da como resultado una inflamación amplia y a una mortalidad aumentada debido a la inmunopatología. Por lo tanto, PSGL-1 actúa para limitar una respuesta efectora demasiado exuberante.
EJEMPLO 8
La función óptima de los linfocitos T CD8+ específicos de virus en ratones deficientes en PSGL-1 requiere linfocitos T CD4+
Se observaron aumentos de linfocitos T CD4+ GP66-76+ en ratones deficientes en PSGL-1 5 d.d.i. y con una acumulación cada vez mayor a 9 d.d.i. (Fig. 7a), lo que concuerda con una función para la deficiencia de PSGL-1 en linfocitos T CD4+ en el impacto de la respuesta de los linfocitos T CD8. Para examinar su contribución, los linfocitos T CD4+ de ratones deficientes en PSGL-1 se empobrecieron mediante la administración de un anticuerpo anti-CD4. Las respuestas de los linfocitos T CD8+ a C113 se compararon con las de los linfocitos T CD8+ deficientes en PSGL-1 de ratones tratados con un anticuerpo de control, o con las de los linfocitos T WT. Se descubrió que los ratones deficientes en PSGL-1 empobrecidos en linfocitos T CD4+ tenían frecuencias reducidas de linfocitos T CD8+ GP33-41+ y NP396-404+ a los niveles descubiertos en ratones WT (Fig. 7b). Además, tenían números reducidos de IFN-y y linfocitos T CD8+ IFN-Y+TNF-a+ en comparación con ratones deficientes en PSGL-1 que tenían linfocitos T CD4+ a 1o d.d.i. (Fig. 7c). Esto se reflejó en cambios en los niveles de PD-1 en linfocitos T GP33-41+ y NP396-404+, que se mantuvieron elevados y fueron niveles similares a los niveles en las células WT (Fig. 7d). A diferencia de los ratones deficientes en PSGL-1, en los que los niveles séricos de C113 se redujeron a 10 d.d.i., en ratones empobrecidos en linfocitos T CD4+, los niveles de virus se mantuvieron comparables a los de los ratones WT (Fig. 7e), mientras que los títulos en los ratones deficientes en PSGL-1 disminuyeron en este tiempo. Además, la mortalidad de los ratones deficientes en PSGL-1 después de 10 d.d.i. se previno en ratones empobrecidos en linfocitos T CD4+ (Fig. 7e). Estos resultados muestran que para que los linfocitos T CD8+ deficientes en PSGL-1 específicos de virus escapen al agotamiento funcional, requieren la ayuda de linfocitos T CD4+. Por lo tanto, por su número y función mejorados, se determinó que los linfocitos T CD4+ modulan la función de los linfocitos T CD8+ en el contexto de la deficiencia de PS-GL-1.
Materiales y métodos
Ratones. Se adquirieron ratones C57BL/6.1 y ratones Selplg-I en los laboratorios Jackson. Los ratones se cruzaron y se mantuvieron en instalaciones específicas sin patógenos y se infectaron en instalaciones convencionales BSL-2 en el Instituto de Investigación Médica Sanford-Burnham. Los ratones Selplg-I se retrocruzaron con ratones C57BL/6J durante más de 10 generaciones. Se obtuvieron ratones transgénicos TCR PI4 y Smarta de Charles D. Surh (El Instituto de Investigación Scripps). Estos ratones se cruzaron con ratones Ly5.1 (B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ) y con ratones Thy 1.1 (B6.PL-Thy 1a/CyJ), Selplg-/-. Los ratones utilizados para los experimentos tenían al menos seis semanas de edad. Los experimentos fueron de acuerdo con las normas IACUC del Instituto de Investigación Médica Sanford-Burnham y fueron aprobados por veterinarios.
Infección, proliferación y transferencia de células. Se propagó la cepa LC-MV Cl13 en células de riñón de hámster bebé y se tituló en células de riñón de mono verde africano Vero. Se diluyeron soluciones madre congeladas en medio de células M Vero y se inyectaron i.v. 2 x 106 unidades formadoras de placas (UFP) de LCMV Cl13. Para evaluar la proliferación se inyectaron a los ratones por vía i.p. 2 mg de BrdU (Sigma-Aldrich) 16 horas antes de aislar los linfocitos de bazos y pulmones los días 8 o 13 después de la infección. Para la transferencia adoptiva, se purificaron células P14 de WT y P14 de PSGL-1 KO (Stemcell Tech) y se transfirieron 1 x 103 células i.v. a ratones WT que fueron infectados con LCMV C113, 1 día después.
Citometría de flu jo y tinción. Las células se tiñeron en la superficie durante 20 min a 4 °C o 1 h 15 min a temperatura ambiente para la tinción de tetrámeros en PBS complementado con tampón de tinción de FACS (FBS al 2 % y azida de sodio al 0,01 %). Se usaron los siguientes anticuerpos de Biolegend: anti-CD8a (clon 53-6.7), anti-PD-1 (clon RMP1-30), anti-CD4 (clon GKI.5), anti-CD90.1 (clon OX-7), anti-CD45.1 (clon A20), anti-IL-21R (clon 4A9), anti-CD126 (clon D7715A7), anti-CD44 (clon IM7), anti-cD62L (clon MEL-14). Los siguientes clones eran de eBioscience: anti-CD127 (IL-7Ra clon A7R34), anti-CD160 (clon ebiocnx-3), anti-BTLA (clon 6f7). Los siguientes anticuerpos eran de BD: anti-CD122 (clon TM-(31), anti-BcI-2 (clon 3F11), anti-CD107 (clon 1D4B), anti-CD162 (clon 2PH1), anti-CD25 (clon 3C7), anti-CD69 (clon H12F3), anti-Va2 (clon B20.1). Los tetrámeros H-2Db-GP33-41, H-2Db -NP396-404 se adquirieron en Beckman Coulter. El tetrámero 1Ab-66-77 fue proporcionado por la instalación central de NIH. Las células se lavaron dos veces con tampón de tinción de FACS y se fijaron durante 15 min con formaldehído al 1 % en PBS. Las células se lavaron dos veces y se resuspendieron en tampón de tinción de FACS. Para la tinción de citocinas intracelulares, las células se fijaron y se permeabilizaron con el kit Cytofix/Cytoperm (BD) y se tiñeron con anti-GzmB (clon MHGBO5: invitrogen), anti-TNF-a (clon MP6-XT22: biolegend), antiIFN-Y (clon X iV iG1,2: Biolegend), anti-IL-2 (clon JES6-5H4: eBioscience). La tinción con BrdU se realizó usando un kit de eBioscience. Para la detección de factores de transcripción, las células se fijaron y se permeabilizaron usando el kit de tinción FoxP3 (eBioscience) y se tiñeron con anti-Tbet (clon 4B10: Biolegend), anti-Eomes (clon Dan11mag: eBioscience). Las células teñidas se analizaron en un citómetro de flujo LSRFortessa (BD).
Estimulación peptídica ex vivo . Se sembraron 2 x 106 esplenocitos de animales infectados en placas de fondo redondo de 96 pocillos. Las células se estimularon en vitro durante 5 horas a 37 °C con 2pg/ml de péptidos GP33-41, NP396-404 o GP61-80 (AnaSpec), IL-250U/ml (NCI) y Brefeldina A 1 pg/ml (Sigma). Después, las células estimuladas se lavaron, se tiñeron en la superficie y después se tiñeron intracelularmente. Ligadura de PSGL-1 ex vivo. Se sembraron 2 x 106 esplenocitos de animales infectados con LCMV Cl13 el día 9 en placas de fondo redondo de 96 pocillos. Las células se estimularon in vitro durante 4 días a 37 °C con IL-2 50U/ml (NIH) en medio RPMI-1640 (Cellgro) complementado con hepes 10 mM (Cellgro), aminoácidos no esenciales lx MEM (Cellgro), piruvato de sodio 1 mM (Cellgro) y FBS al 10% inactivado por calor (Hyclon), y las siguientes condiciones: IgG de rata 10 pg/ml (jacksonImmuno Research), anti-PSGL-1 10 pg/ml (4rA iO BioXCell), 2 pg/ml de GP33-41 (AnaSpec) o anti-PSGL-1 (4RA10 BioXCell) 2 pg/ml de GP33-41 (AnaSpec). Después, las células cultivadas se lavaron y se tiñeron con yoduro de propidio (1 pg/ml) durante 10 min a temperatura ambiente. Las células se lavaron y se tiñeron con anti-CD8aa, tetrámero H-2D -GP33-41 (Beckman Coulter), anti-PD-1 durante 1 h 15 min a temperatura ambiente en tampón de tinción de FRCS. Las células teñidas se analizaron en un citómetro de flujo LSRFortessa (BD) y las células vivas se determinaron excluyendo las células PI+.
Marcado de CFSE. Los linfocitos T CD8+ se enriquecieron negativamente a partir de bazos de ratones transgénicos TCR P14 WT y PSGL-1 KO (Stemcell Tech) sin infectar. Se agruparon números iguales de células purificadas P14 WT y PSGL-1 KO y se marcaron con CFSE 5 pM (Life Technologies) a 37 °C durante 10 minutos, y se lavaron con PBS. Las células P14 WT y PSGL-1 KO se cotransfirieron en una relación 1:1 (1 x 106 células de cada una) i.v. a receptores WT. Los hospedadores WT se infectaron con LCMV Cl 132 x 106 UFP y la dilución de CFSE se examinó mediante FACS el día 2 d.d.i.
Empobrecimiento de CD4. Los ratones recibieron dos inyecciones intraperitoneales de 500 pg de anticuerpos de empobrecimiento de CD4 (clon GM .5, BioXCell) el día -1 y 0 y después se infectaron con LCMV C113. Se confirmó la eficacia del empobrecimiento de CD4 en la sangre y los bazos de los ratones tratados.
Citocinas y patología. Se aisló el suero de ratones WT y PSGL-1 KO el día 8 d.d.i. y los niveles de citocinas para IL-6, IL-21, TNF-a y IFN-y se examinaron usando una matriz múltiple de citocinas personalizada de 9 perlas (Millipore). Las muestras se analizaron en un instrumento Luminex IS200. Se fijaron hígado, riñón y pulmones en formol de cinc (z-fix Anatech), se incluyeron en parafina y se seccionaron. Los tejidos se tiñeron con HyE y se exploraron digitalmente usando Aperio ScanScope. La puntuación de la patología fue una evaluación ciega de las muestras de tejido por un patólogo. Las puntuaciones variaron de 0 a 3,5, indicando el cero que no había patología, y las puntuaciones más altas indicaron una patología aumentada.
Análisis de datos. Los datos de citometría de flujo se analizaron usando el software FlowJo (TreeStar). Los gráficos se prepararon usando el software GraphPad Prism.
Análisis estadístico. Se usó el software GraphPad Prism para analizar los grupos experimentales usando un ensayo de t de student, la significación se ajustó a p < 0,05. Se usó un ensayo de Mantel-Cox y Gehan-Breslow-Wilcoxon para comparar las curvas de supervivencia.
EJEMPLO 10
Respuestas antivíricas
En estudios del virus LCMV Cl13 que produce una infección crónica en ratones, se descubrió que la deficiencia de PSGL-1 dio como resultado números aumentados de linfocitos T CD8+ específicos de virus después de la infección (Fig. 15A,B), que se extendió al menos a d30 (Fig. 15C), lo que indica un impacto duradero en la persistencia de los linfocitos T. Este hallazgo es digno de mención para los linfocitos T específicos de NP396-404, que se suprimen después de la infección por C113. Este efecto se debió a la supervivencia mejorada de los linfocitos T más que a la expansión aumentada (no se muestra). Puesto que PSGL-1 regula la migración selectiva de leucocitos y la infección por LCMV es sistémica, Se sometió a ensayo el reclutamiento de linfocitos T a un sitio periférico, en este caso los pulmones, para ver si había un efecto. Sin embargo, había números mayores de linfocitos T específicos de virus en ratones PSGL-1 KO que en ratones WT (Fig. 15D), lo que descarta un deterioro general de la capacidad migratoria. Los linfocitos T c D8+ pierden progresivamente su función efectora después de la infección por C113, en primer lugar la capacidad de producir IL-2, TNF-a, y por último la actividad de IFN-y y CTL. En respuestas antivíricas eficaces, los linfocitos T CD8+ expresan múltiples funciones efectoras simultáneamente. Como se muestra en la Fig. 16, tanto los linfocitos T específicos de GP33-41 como de NP396-404 de ratones PSGL-1 KO presentaron frecuencias mayores de células IFN-Y+ e IFN-Y/INP-a doble+ que los linfocitos T CD8+ específicos de virus de ratones WT (Fig. 16A,B), lo que indica una mayor funcionalidad. La desgranulación citotóxica en combinación con la producción de IFN-y también fue mayor (Fig. 16C). Los datos demuestran que el PSGL-1 tiene un efecto amortiguador inesperado sobre las respuestas de los linfocitos T CD8+.
Los linfocitos T CD8+ agotados se caracterizan por la expresión de múltiples receptores inmunitarios inhibidores, en particular PD-1, pero también BTLA, CD160, LAG 3, TIM-3 y 2B4. Se descubrió que los niveles reducidos de receptores inhibidores en los linfocitos T CD8+ se asoció a una función mejorada (Fig. 17) para los linfocitos T específicos tanto de GP33-41 como de NP396-404. También se descubrieron niveles más bajos de 2B4 y LAG 3 (no se muestran). Se analizaron los linfocitos T CD4+ que respondían a Cl13 en ratones WT y PSGL-1 KO. Como se ha demostrado para los linfocitos T CD8+, había frecuencias muy aumentadas de linfocitos T CD4+ específicos de virus en ratones KO (Fig. 18A) que se asociaron a una supervivencia mejor. Además, los linfocitos T CD4+ específicos de virus de ratones PSGL-1 KO produjeron más citocinas que los de ratones WT, y también había más células polifuncionales (Fig. 18B). Una función mayor se asoció a una expresión disminuida de los receptores inhibidores, PD-1 y BTLA (Fig. 18C). Estos datos indican que el PSGL-1 tiene una función más amplia que la de mediar la migración en los linfocitos T y actúa como represor de las respuestas de los linfocitos T tanto CD8+ como CD4+. Para determinar si la función y la supervivencia mejoradas de los linfocitos T influía en la respuesta antivírica, se midió el aclaramiento vírico. Como se muestra en la Fig. 17A, la deficiencia de PSGL-1 permitió aclarar el virus C113. También se detectaron niveles mayores de las citocinas IL-6, 1L-21, TNF-a y el IFN-y en los sueros de ratones PSGL-1 KO en comparación con los ratones WT (Fig. 19B), proporcionando de este modo una lectura para una respuesta mejorada. Para estudiar adicionalmente el PSGL-1 en la inmunidad antivírica, se analizaron los niveles de expresión de PD-1 después de la infección por la cepa de LCMV Armstrong, que es rápidamente aclarada por el sistema inmunitario. Se observó una mayor persistencia de linfocitos T CD8+ en este entorno (Fig. 20) con un efecto más temprano y pronunciado de PD-1 sobre los linfocitos T CD8+ específicos de virus NP396-404 (Fig. 20A) que sobre los específicos de GP33-41 (Fig. 20B). Para ambos clones, se observaron niveles menores de PD-1 de linfocitos T PSGL-1 KO (Fig 20C). Para abordar si los niveles de PD-1 en PSGL-1 pueden ser dianas, se administró un anticuerpo de bloqueo anti-PSGL-1 (4RA10) o IgG de control a ratones WT después de la infección por el virus de la gripe A (VGA) o por LCMV Cl13. Los grupos tratados con anti-PSGL-1 tenían una frecuencias mayores de linfocitos T CD8+ específicos de virus (no se muestran) y estas células expresaron niveles más bajos de PD-1 que los controles (Fig 20D). En conjunto, estos hallazgos indican que el PSGL-1 tiene una función general hasta ahora desconocida en la modulación a la baja de las respuestas de los linfocitos T.
EJEMPLO 11
Modelo de melanoma BRAFV600E PTEN
Uno de los mejores modelos murinos actualmente disponibles de melanoma humano agresivo es un modelo genético inducible que combina la mutación BRAFV600E, que está presente en el -65 % de los pacientes, con el silenciamiento de PTEN, una combinación que se encuentra en el -20 % de los pacientes. La inducción por Cre/Lox de BRAFV600E y la supresión de PTEN se controla temporalmente en los melanocitos con la activación de un promotor de melanocitotirosinasa, Try:CreER, mediante el tratamiento localizado de la piel con tamoxifeno. Existe una penetración del 100 %, con lesiones pigmentadas que se desarrollan a las 2 semanas y enfermedad metastásica al pasar 1 mes. Se detectaron linfocitos T CD3+ y células mononucleares CD45+ dentro de los tumores asociados a la piel (datos no mostrados). Los tumores se analizaron mediante citometría de flujo. Se detectaron linfocitos T tanto CD4+ como CD8+ fácilmente (Fig. 21A, B, paneles de la izquierda). El PSGL-1 se expresa en -1/2 de las células CD4+, y son estas células las que tienen PD-1 alto (Fig. 21A, paneles central y derecho). Los linfocitos T CD8+ eran exclusivamente PSGL-P, y tenían una expresión mixta de p D-1 (Fig. 21B). Además, en orejas melanoma+, se detectó una expresión aumentada de PD-1 y p Sg L-1 en linfocitos T CD44+CD8+ activados (Fig. 22A). Estos linfocitos T PD-1hi agotados también tenían una unión funcional a PSGL-1 (Fig. 22B). Estos resultados indican que los linfocitos T CD8+ infiltrantes tumorales tienen PD-1, PSGL-1 y actividad de unión PSGL-1 aumentados. En estudios adicionales, se indujo melanoma en ratones mediante la inducción por Cre/Lox de la mutación BRAFV600E y la supresión de PTEN en melanocitos con la activación de un promotor de la melanocito-tirosinasa, Tyr::CreER, mediante el tratamiento localizado de la piel con tamoxifeno. 1 mes después del tratamiento, los presentes inventores observaron linfocitos T CD3+ mononucleares en su interior (Fig. 23A) y no Treg (linfocitos T efectores) PSGL-1+, PD-1+ (doblemente positivo) CD4+ y Treg con frecuencia alta dentro de los tumores alterados por citometría de flujo (Fig. 23B). En comparación, pocos linfocitos T expresaron ambas moléculas en la piel que drena GL de ratones portadores de tumores o de ratones no portadores de tumores. Se descubrió que los linfocitos T CD3+ estaban distribuidos por todo el melanoma (Fig. 23A) y tanto los no Treg CD4+ como los Tre eran detectables y coexpresaban PD-1 y PSGL-1 (Fig. 23B). Estudios adicionales de melanomas de estos ratones muestran que las células inmunitarias pueden distinguirse fácilmente mediante citometría de flujo, incluyendo linfocitos T CD8+ y CD4+, Treg, MDSC y DC, linfocitos NK, linfocitos T NK y macrófagos (Fig. 24).
EJEMPLO 12
Para identificar células que expresan PSGL-1 y sus respuestas dentro del melanoma primario y metastásico.
Cambios en las células inmunitarias con el desarrollo del melanoma: Se establecerá la cinética de crecimiento tumoral y el desarrollo de infiltrados mediante el tratamiento con 4 hidroxitamoxifeno (4-HT) de ratones Tyr:CreER;Braf/Ptenlox/lox en el flanco a las 6 semanas de edad. Se usará inmunohistoquímica para evaluar los tumores a intervalos semanales una vez que se detecten los tumores, centrándose en particular en los linfocitos T CD44- y CD8+ y su localización en los márgenes tumorales frente a la infiltración en los tumores. Para estudios de citometría de flujo, se comparará el melanoma primario y GL drenantes y se evaluarán los cambios que se producen después de la metástasis a otros sitios cutáneos, GL y pulmones. Se analizará la expresión de PSGL-1 y receptores inhibidores (PD-1, Tim-3, Lag-1, BTLA, CTLA-4 y CD160) en Treg CD8+, CD4+ y FoxP3+ en los tumores, ganglios linfáticos drenantes y ganglios linfáticos no drenantes, sangre, bazo y pulmones con el tiempo después del tratamiento con 4-HT. Los estudios del modelo de melanoma B16 demostraron que los linfocitos T CD84- específicos de tumores pueden controlarse usando tetrámeros de MHC de clase I cargados con el péptido gp10025-33 (KVPRNQDWL) de pmel-1, el homólogo de ratón de gp10025-33 un componente estructural de la matriz del melanosoma humano que se expresa por los melanocitos así como por las células de melanoma maligno. Este péptido es expresado por los melanomas inducidos en el modelo de melanoma BRAFV600E PTEN. Por lo tanto, para estudiar las respuestas de los linfocitos T específicos de tumores se usarán tetrámeros de pmel disponibles en el mercado. Si hay cambios en las frecuencias o los linfocitos T CD8+ específicos de melanoma, se abordarán sus niveles de expresión de PSGL-1 y si muestran diferencias con respecto a la población global de linfocitos T CD8+ en la expresión de receptores inhibidores. Se usará tinción intracelular (ICS) después de la estimulación con anti-CD3 para controlar las funciones de los linfocitos T CD4+ y CD8+ mediante la producción de citocinas (IL-2, IFN-y, TNF-a) y se usará la reestimulación del péptido pmel para evaluar la producción de citocinas por los linfocitos T CD8+ específicos de tumores. Para los linfocitos T CD8+ se comprobará la actividad citotóxica mediante la tinción con granzima B, así como la desgranulación mediante la medición de CD107.
Se someterá a ensayo la actividad inmunosupresora de los Treg por los niveles de expresión de FoxP3, que se correlacionan con la función (16), así como la producción de 1L-10 y TGF-p por SCI. Se evaluarán las relaciones de linfocitos T efectores CD4+ y CD8+ con respecto a los Treg en los melanomas y GL drenantes para determinar los cambios que se producen con el tiempo después de la aparición de melanoma en la piel. La expansión de estas poblaciones se examinará mediante la administración de BrdU en el agua potable, iniciando el tratamiento a las 1, 2, 3 o 4 semanas después del tratamiento con 4-HT, analizando los linfocitos T en los melanomas, los tejidos linfáticos y la sangre. Para interrogar adicionalmente el microambiente tumoral, se analizarán las frecuencias de DC (MHC II+,CD11c+), MDSC (Gr1+,CD11b+) y M4 (F4/80+,CD11b+). Para abordar la función en estas poblaciones, se usará ICS para analizar la producción de IL-12 y 1L-10, que se asocian a las DC inmunógenas frente a las tolerógenas (17), y a los macrófagos M1 frente a los M2, respectivamente, mientras que la IL-10 distingue MDSC.
EJEMPLO 13
Para determ inar si el direccionamiento a PSGL-1 puede retrasar o controlar el desarrollo de melanoma y sus metástasis.
Impacto del PSGL-1 en el melanoma. Usando un enfoque de quimera de médula ósea, se abordará si la deficiencia de PSGL-1 conduce a cambios en las funciones de las células inmunitarias dentro del melanoma o en el compartimento linfoide. Se creará deficiencia de PSGL-1 en las células hematopoyéticas mediante la inyección de médula ósea PSGL-1 KO en ratones Tyr: CreER; Braf/Ptenloxilox irradiados y se tratarán con 4-HT 8 semanas después. Los controles recibirán médula ósea WT. Se evaluarán los cambios con respecto al crecimiento tumoral y la metástasis, y en las frecuencias y funciones, así como la expresión de receptores inhibidores en las células inmunitarias en el microambiente tumoral, compartimento linfático, pulmones y sangre usando histología y citometría de flujo, centrándose en las mejores lecturas y puntos temporales definidos en esos estudios. Se examinará la evidencia de autoinmunidad/inmunopatología mediante histología, puesto que la deficiencia o el bloqueo de receptores inhibidores se asocia al desarrollo de inflamación.
La Figura 25 muestra respuestas potenciadas de linfocitos T antitumorales en ratones deficientes en PSGL-1. WT (barras de color negro o círculos de color negro) y PSGL-1 KO (barras de color blanco o cuadrados) recibieron una inyección subcutánea de células de melanoma (Yumm 1.5. peso tumoral el día 14 y volumen hasta el día 12 después de la inyección) (A). El número absoluto de linfocitos T efectores CD8+ (izquierda) y CD4+ (derecha) por gramo de tumor (B). Expresión de PD-1 en linfocitos T efectores (C). Producción de citocinas por los linfocitos T CD4+ (D) y CD8+ (E). La tinción de citocinas representativa se muestra en (F).
Para abordar los efectos intrínsecos de la deficiencia de PSGL-1 en los linfocitos T, se usarán dos enfoques. En primer lugar, se generarán quimeras en las que se suprimirá PSGL-1 exclusivamente en linfocitos T para la comparación con quimeras con células WT marcadas alélicamente. Para conseguir esto, ratones Tyr:CreER;Braf/Ptenlox/lox (Thy1.2, CD45.2) irradiados letalmente se reconstituyen con una relación 80:20 de células de médula ósea TCR WS KO (CD45.2):PSGL-1 KO (Thy1.1, CD45.2). Los ratones serán tratados con 4-HT 8 semanas después y se evaluará el desarrollo y las metástasis de los tumores y las respuestas de los linfocitos T. Como segundo enfoque, se cruzarán ratones pmel Tg con ratones PSGL-1 Thy1.1, CD45.2 KO. Se inyectarán linfocitos T8+ aislados de estos ratones o de ratones WT pmel Tg (Thy1.1, CD45.2) en Tyr:CreER;Braf/Pten lox/lox (Thy 1.2, Ly 5.2) en una dosis optimizada. Como alternativa, los presentes inventores han utilizado una estirpe celular de melanoma, (Yumm 1.5) derivada de un melanoma primario inducido. Se implantaron células tumorales s.c. en una dosis de 5 x 105 (flanco derecho) en ratones WT o deficientes en PSGL-1. En la Fig. 24, el crecimiento tumoral se controló por volumen y peso (A), y se determinaron las frecuencias de los linfocitos T efectores CD8+ y CD4+ (B). Los ratones deficientes en PSGL-1 tenían tumores más pequeños y contenían números mayores de linfocitos T. Los linfocitos T expresaron niveles más bajos de PD-1 (C) y fueron más funcionales medido mediante la producción de citocinas (D-F).
Inhibición inmunoterápica de la función de PSGL-1. Se determinará si el bloqueo de PSGL-1 con un mAb agonista (4RA10) o una proteína de fusión Fc de PSGL-1 recombinante puede controlar el crecimiento y/o las metástasis del melanoma con la inversión de la disfunción de los linfocitos T. Estos reactivos se someterán a ensayo como tratamiento del melanoma primario, así como después de que se haya producido la metástasis. Para el tumor primario, la inyección local de mAb en el tumor se comparará con el tratamiento sistémico. Para el tratamiento local, se usará una dosis inicial de 100 |jg de IgG anti-PSGL-1 o de control en el momento de la detección del tumor primario. Para el tratamiento sistémico se inyectarán 300 jg/mAb/dosis i.p. con tratamiento en días alternos durante 5 días y se seguirá el crecimiento tumoral y las metástasis cutáneas de los animales. A 1 mes, los animales se examinarán para determinar linfocitos T CD8+ pmel-tetrámero+, su expresión superficial de receptores inhibidores y sus respuestas en la sangre, el bazo, GL y, como se indica, tumores. Los efectos de iniciar el tratamiento sistémico con mAb se examinarán 1, 2, 3 o 4 semanas después de la detección del tumor primario para abordar si el anti-PSGL-1 puede influir en la respuesta antitumoral con la progresión de la enfermedad. Como segunda estrategia para bloquear el PSGL-1, se administrará Fc de PSGL-1 con Ig humana como control. Los niveles de mAb y proteína de fusión se evaluarán en el suero cada 3-4 días mediante ELISA para determinar las semividas, y para abordar si hay cambios en el fenotipo de los linfocitos T y/o en las respuestas con la descomposición de estos reactivos. Se medirán los niveles de IL-6, lL-21, TNF-a e IFN-Y en los sueros a intervalos semanales después del inicio de la terapia para determinar si se producen cambios en los niveles de citocinas y si existe una asociación con la actividad antitumoral o la resolución tumoral mejoradas.
Aunque la invención se ha descrito con referencia a los ejemplos anteriores, se comprenderá que el alcance de la invención abarca las modificaciones y las variaciones. En consecuencia, la invención solo está limitada por las siguientes reivindicaciones.

Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Un antagonista del ligando 1 de la glicoproteína selectina P (PSGL-1) para su uso en el desencadenamiento de una respuesta de los linfocitos T o la restauración de la función de los linfocitos T en un método de tratamiento de una enfermedad infecciosa o un cáncer, comprendiendo dicho método administrar el antagonista del ligando 1 de la glicoproteína selectina P (PSGL-1) a un sujeto que lo necesite, en donde aumenta la respuesta de los linfocitos T CD8+ dependientes de c D4+.
2. El antagonista de PSGL-1 para el uso de la reivindicación 1, en donde la enfermedad infecciosa se selecciona del grupo que consiste en Botulismo, Peste bubónica, Infección por calicivirus (Norovirus y Sapovirus), Varicela, Clamidia, Cólera, Infección por Clostridium difficile, Resfriado común (rinofaringitis vírica aguda; Coriza aguda), Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ), Fiebre del dengue, Difteria, Fiebre hemorrágica del Ébola, Gonorrea, Enfermedad de las manos, pies y boca (EMPB), Infección por Helicobacter pylori, Hepatitis A, Hepatitis B, Hepatitis C, Hepatitis D, Hepatitis E, Herpes simple, Virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), Virus del papiloma humano (VPH), Mononucleosis infecciosa por virus de Epstein-Barr (mono), Influenza (gripe), Legionelosis (enfermedad del legionario), Lepra, Enfermedad de Lyme (borreliosis de Lyme), Malaria, Fiebre hemorrágica de Marburgo (FHM), Sarampión, Síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS), Meningitis, Paperas, Pertusis (tosferina), Peste, Leucoencefalopatía multifocal progresiva, Rabia, Infección por rinovirus, Fiebre maculosa de las Montañas Rocosas (FMMR), Rubeola, Salmonelosis, SARS (síndrome respiratorio agudo grave), Sarna, Sepsis, Sigelosis (disentería bacilar), Culebrilla (herpes zóster), Virus de la viruela (viruela), Sífilis, Tétanos, Tuberculosis, Fiebre tifoidea, Fiebre del valle, Neumonía vírica, Fiebre del Nilo Occidental y Fiebre Amarilla; o
en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de próstata, colon, abdomen, hueso, mama, sistema digestivo, hígado, páncreas, peritoneo, glándulas endocrinas (suprarrenal, paratiroides, hipófisis, testículos, ovario, timo, tiroides), ojo, cabeza y cuello, sistema nervioso (central y periférico), sistema linfático, pelvis, piel, tejido blando, bazo, torácico y del tracto urogenital.
3. El antagonista de PSGL-1 para el uso de la reivindicación 1, en donde el antagonista de PSGL-1 es un anticuerpo, una molécula pequeña, una proteína, una proteína de fusión o un ácido nucleico; y opcionalmente
en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado.
4. El antagonista de PSGL-1 para el uso de la reivindicación 1,
en donde los linfocitos T específicos de virus aumentan; o
en donde la expresión de FoxP3, IL-10, TGF-p y/o MHC clase II aumenta; o
en donde la secreción de CD8+ de IFNy, TNFa y CD107 aumenta; o
en donde la expresión de PD-1, BTLA y CD160 disminuye; o
en donde la expresión de CD25 y T-bet aumenta; o
en donde el aclaramiento vírico aumenta.
5. Una composición farmacéutica que comprende un antagonista de PSGL-1 y un vehículo farmacéutico para su uso en el desencadenamiento de una respuesta de los linfocitos T o la restauración de la función de los linfocitos T en un método de tratamiento de una enfermedad infecciosa o un cáncer, comprendiendo dicho método administrar el antagonista del ligando 1 de la glicoproteína selectina P (PSGL-1) a un sujeto que lo necesite, en donde la respuesta de los linfocitos T CD8+ dependientes de CD4+ aumenta.
6. La composición para el uso de la reivindicación 5, en donde el antagonista de PSGL-1 es un anticuerpo, una molécula pequeña, una proteína, una proteína de fusión o un ácido nucleico.
7. La composición para el uso de la reivindicación 6, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado.
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