ES2875950T3 - Péptidos CDC45L y vacunas que incluyen los mismos - Google Patents

Péptidos CDC45L y vacunas que incluyen los mismos Download PDF

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Abstract

Un péptido aislado de menos de 15 aminoácidos que tiene inducibilidad de linfocitos T citotóxicos (CTLs), en donde dicho péptido es un fragmento inmunológicamente activo de un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 o uno de sus péptidos modificados, y en donde dicho péptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NOs: 3; y (b) SEQ ID NO: 3, en la que están sustituidos 1 o 2 aminoácidos.

Description

DESCRIPCIÓN
Péptidos CDC45L y vacunas que incluyen los mismos
[Campo Técnico]
La presente invención se refiere al campo de la ciencia biológica, más específicamente al campo de la terapia del cáncer. En particular, la presente invención se refiere a nuevos péptidos que son extremadamente eficaces como vacunas para el cáncer y fármacos para tratar y prevenir tumores.
[Especialidad Precedente]
El cáncer de pulmón es la forma más común de cáncer, representando 1,35 millones de los 10,9 millones de nuevos casos de cáncer al año. También es la principal causa de muerte por una enfermedad asociada al cáncer, representando 1,18 millones de los 6,7 millones de muertes relacionadas con el cáncer en el mundo (NPL 1). A pesar de las recientes mejoras en la terapia sistémica, tal como quimioterapia y terapia molecular orientada, el pronóstico de pacientes con cáncer de pulmón en fase avanzada sigue siendo muy pobre (NPL 2). El cáncer de pulmón se vuelve a producir en 50% de los pacientes después de la cirugía y menos de 25% de los pacientes responden a quimioterapia sistémica. Según esto, se requieren urgentemente modalidades de tratamiento más eficaces, y la inmunoterapia representa un enfoque prometedor para terapias futuras del cáncer de pulmón (NPLs 3-5).
El éxito de las vacunas terapéuticas contra el cáncer se puede basar finalmente en la identificación de antígenos inmunogénicos que se sobreexpresan en tumores con relación a los tejidos normales. La inducción eficaz de linfocitos T citotóxicos (CTLs) por antígeno asociado al tumor (TAA) ha mostrado resultados prometedores (NPLs 6-7). Recientemente, el desarrollo de tecnologías de micromatrices de ADNc, acoplado con la información del genoma, ha proporcionado perfiles exhaustivos de la expresión génica de células malignas, que a continuación se pueden comparar con los de células normales (NPL 8). El perfilado de la expresión génica con tecnologías de micromatrices de ADNc constituye un enfoque eficaz para la identificación de nuevos TAAs útiles para el diagnóstico y la inmunoterapia del cáncer (NPLs 9-12).
Aunque se han publicado varios posibles TAAs expresados en el cáncer de pulmón (NPLs 13-14), es importante identificar múltiples TAAs sobreexpresados en un cáncer dado para desarrollar una inmunoterapia contra el cáncer mediada por células T más eficaz (NPL 15).
CDC45L (similar al ciclo de división celular 45) es una proteína celular esencial que funciona tanto en el inicio como en la elongación de la replicación de ADN para asegurar que el ADN cromosómico se replique solo una vez por ciclo celular (NPLs 16-19). CDC45L está altamente conservado entre todos los eucariotas, y una alteración dirigida de este gen provoca letalidad embrionaria en ratones (NPL 20). En seres humanos adultos, la gran mayoría de las células tiene división celular diferenciada y cesada, y solo una pequeña población de células está proliferando en algunos tejidos que se autorrenuevan (NPL 21). Así, aunque CDC45L está ausente en células humanas inactivas a largo plazo, terminalmente diferenciadas y senescentes, está presente a lo largo del ciclo celular de células cancerosas proliferativas (NPL 18). Según esto, la expresión de CDC45L está estrechamente asociada con poblaciones de células proliferativas, y así se considera que es un candidato prometedor para un nuevo marcador de la proliferación en la biología celular del cáncer (NPLs 18, 22). [NPL 23] divulga la inducción de CTL con péptido CDC45L de un modo restringido por HLA-A24. Sin embargo, no se identifica allí una estructura específica (es decir secuencia de aminoácidos) del péptido.
El documento WO 2007/013671 A2 divulga la sobreexpresión de CDC45L humano en cáncer de esófago, no proporciona de ese modo nada acerca de la inducción de CTL. Algunos péptidos de fragmentos inducibles de CTL se identificaron a partir de péptidos FoxP3, KDR (VEGFR2) y SPARC en los documentos WO 2008/081581 A1, EP 1548 032 A1 y EP 2030 984 A1, respectivamente. Sin embargo, no mencionan CDC45L.
Sin embargo, la utilidad de CDC45L como una diana para la inmunoterapia del cáncer todavía no se ha investigado a fondo.
[Lista de Citas]
[Bibliografía No Relacionada con las Patentes]
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[NPL 22] Li JN y cols. BMC Cancer 2008;8:395
[NPL 23] Tomita y cols. Proceedings of the 13th. Annual Meeting of the Japanese Society of Cancer Immunology, 20 de mayo de 2009
[Sumario de la Invención]
El alcance de la presente invención se define mediante el grupo de reivindicaciones adjuntas. La presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de péptidos que pueden servir como dianas de inmunoterapia. Debido a que los TAAs a veces son percibidos por el sistema inmunitarios "como propias" y por lo tanto a menudo no tienen inmunogenicidad, el descubrimiento de dianas apropiadas es de extrema importancia. Según se apunta anteriormente, CDC45L (una secuencia de aminoácidos y una secuencia génica típicas se muestran en SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 17, respectivamente, y las secuencias también están disponibles a partir del N° de Registro del GenBank NM_003504) se ha identificado como regulado al alza en cánceres, ejemplos de los cuales incluyen, pero no se limitan a, tumor testicular, cáncer pancreático, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de mama, cáncer esofágico, cáncer de próstata, leucemia mieloide crónica (CML), tumor de tejidos blandos, cáncer gástrico, cáncer hepatobiliar y cáncer colorrectal. Así, CDC45L es un candidato para la diana de la inmunoterapia de cánceres/tumores.
La presente invención se refiere además a la identificación de péptidos epitópicos específicos de los productos génicos de CDC45L que poseen la capacidad de inducir CTLs específicos para CDC45L. Según se analiza con detalle posteriormente, células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) obtenidas de un donante sano se estimularon usando posibles péptidos que se unen a HLA-A*2402 o HLA-A*0201 derivados de CDC45L. A continuación, se establecieron líneas de CTL con citotoxicidad específica contra las células diana positivas a HLA-A24 o HLA-A2 impulsadas con cada uno de los posibles péptidos. Estos resultados demuestran que estos péptidos son péptidos epitópicos restringidos por HLA-A24 o HLA-A2 que pueden inducir respuestas inmunitarias potentes y específicas contra células que expresan CDC45L. Además, los resultados indican que CDC45L es fuertemente inmunogénico y que sus epítopos son dianas eficaces para la inmunoterapia de cánceres/tumores.
Según esto, un objetivo de la presente invención es proporcionar péptidos aislados que se unen a antígeno HLA, particularmente los derivados de CDC45L (SEQ ID NO: 18) o uno de sus fragmentos inmunológicamente activos. Se espera que estos péptidos tengan inducibilidad de CTL y, así, se pueden usar para inducir CTL ex vivo o para ser administrados a un sujeto para inducir respuestas inmunitarias contra cánceres tales como tumor testicular, cáncer pancreático, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de mama, cáncer esofágico, cáncer de próstata, leucemia mieloide crónica (CML), tumor de tejido blandos, cáncer gástrico, cáncer hepatobiliar, cáncer colorrectal y similares. Péptidos preferidos son nonapéptidos o decapéptidos y, más preferiblemente, los que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEQ ID NOs: 1 a 16. De estos, el péptido que tiene una aminosecuencia de SEQ ID NO: 3 mostraba una fuerte inducibilidad de CTL y así son los más preferidos.
Los péptidos de la presente invención abarcan aquellos en los que están sustituidos yen uno o dos aminoácidos, con la condición de que los péptidos modificados resultantes retengan la inducibilidad de CTL original.
La presente invención también proporciona polinucleótidos aislados que codifican uno cualquiera de los péptidos de la presente invención. Estos polinucleótidos se pueden usar para inducir APCs con inducibilidad de CTL y se pueden administrar a un sujeto para inducir respuestas inmunitarias contra cánceres al igual que los presentes péptidos.
Cuando se administran a un sujeto, los presentes péptidos están presentes preferiblemente sobre la superficie de APCs a fin de inducir CTLs que se orientan a los péptidos respectivos. Según esto, un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar composiciones o agentes que induzcan CTL, incluyendo estas composiciones o sustancias uno o más péptidos o polinucleótidos de la presente invención. La presente invención contempla además composiciones o agentes que incluyen uno o más péptidos o polinucleótidos de la presente invención formulados para el tratamiento y/o la profilaxis de cánceres así como la prevención de su recaída posoperatoria, incluyendo estos cánceres, pero no limitados a, tumor testicular, cáncer pancreático, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de mama, cáncer esofágico, cáncer de próstata, leucemia mieloide crónica (CML), tumor de tejido blandos, cáncer gástrico, cáncer hepatobiliar y cáncer colorrectal. Así, la presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas o agentes para el tratamiento y/o la profilaxis de cánceres y/o la prevención de su recaída posoperatoria, incluyendo estas composiciones farmacéuticas o agentes uno o más de los péptidos o polinucleótidos de la presente invención. Además de y/o en lugar del susodicho péptido o polinucleótido, las composiciones farmacéuticas o los agentes de la presente invención pueden incluir opcionalmente como ingredientes activos APCs o exosomas que presentan uno o más de los presentes péptidos de la presente invención.
Los péptidos y polinucleótidos de la presente invención pueden inducir APCs que presentan sobre su superficie un complejo de un antígeno HLA y un péptido presente, por ejemplo, al poner en contacto APCs derivadas de un sujeto con un péptido de la presente invención o al introducir un polinucleótido que codifica este péptido en APCs. Estas APCs tienen alta inducibilidad de CTL contra péptidos diana y encuentran uso en la inmunoterapia del cáncer. Por lo tanto, la presente invención abarca los métodos para inducir APCs con inducibilidad de CTL y las APCs obtenidas mediante estos métodos.
La presente invención también proporciona un método para inducir CTL que incluye la etapa de cocultivar células positivas a CD8 con APCs o exosomas que presentan un péptido de la presente invención sobre su superficie. Alternativamente, el método puede incluir la etapa de introducir un gen que incluye un polinucleótido que codifica un polipéptido de una subunidad del receptor de células T (TCR) capaz de unirse a un péptido de la presente invención. Los CTLs obtenidos mediante estos métodos pueden encontrar uso en el tratamiento y/o la prevención de cánceres, ejemplos de los cuales incluyen, pero no se limitan a, tumor testicular, cáncer pancreático, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de mama, cáncer esofágico, cáncer de próstata, leucemia mieloide crónica (CML), tumor de tejido blandos, cáncer gástrico, cáncer hepatobiliar y cáncer colorrectal. Por lo tanto, la presente invención abarca los CTLs obtenidos mediante los presentes métodos.
Otro objetivo más de la presente invención es proporcionar métodos para inducir una respuesta inmunitaria contra el cáncer en un sujeto que lo necesite, incluyendo estos métodos la etapa de administrar composiciones o agentes que incluyen los polipéptidos CDC45L de la presente invención o uno de sus fragmentos inmunológicamente activos, polinucleótidos que codifican los polipéptidos CDC45L de la presente invención, o exosomas o las APCs que presentan estos polipéptidos CDC45L.
La aplicabilidad de la presente invención se extiende a cualquiera de un número enfermedades relacionadas con o que surgen de la sobreexpresión de CDC45L, tales como cáncer, ejemplos del cual incluyen, pero no se limitan a, tumor testicular, cáncer pancreático, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de mama, cáncer esofágico, cáncer de próstata, leucemia mieloide crónica (CML), tumor de tejido blandos, cáncer gástrico, cáncer hepatobiliar y cáncer colorrectal.
Además de los anteriores, otros objetivos y características de la invención se harán más evidentes cuando la siguiente descripción detallada se lea junto con las figuras y los ejemplos adjuntos.
[Breve Descripción de los Dibujos]
Diversos aspectos y aplicaciones de la presente invención se harán evidentes para el experto al considerar la breve descripción de las figuras y la descripción detallada de la presente invención y sus realizaciones preferidas que siguen.
[Fig. 1a-d]
La Figura 1 está compuesta por una serie de fotografías, A a F, que representan los resultados de análisis de ARNm de CDC45L expresado en tejidos normales humanos, líneas celulares cancerosas y tejidos cancerosos. Partes A, B: RT-PCR y análisis de transferencia Northern de ARNm de CDC45L expresado en diversos tejidos normales. Parte C: análisis de RT-PCR de ARNm de CDC45L expresado en diversas líneas celulares cancerosas. Parte D: análisis de RT-PCR de ARNm de CDC45L expresado en tejidos de cáncer de pulmón y tejidos pulmonares normales adyacentes.
[Fig. 1e-f]
Parte E: análisis de RT-PCR de ARNm de CDC45L expresado en diversas líneas celulares cancerosas derivadas de cánceres gástrico, hepatobiliar, de mama, de páncreas y colorrectal. Parte F: Análisis inmunohistoquímico de proteína de CDC45L expresada en adenocarcinoma, carcinoma escamoso, carcinoma microcítico, pulmón normal, testículos y piel normal (amplificación original X400). Las señales de tinción positiva se observan como pardas. Barras de la escala, 50 micrómetros
[Fig. 2]
La Figura 2 representa un protocolo para la inducción de CTLs específicos de CDC45L procedentes de PBMC. Las PBMCs se aislaron de donantes, y se aislaron células T CD8+ y células CD14+ usando microcuentas revestidas con mAb anti-CD8 o mAb anti-CD14, respectivamente, a partir de las PBMC de los donantes sanos positivos a HLA-A24 y pacientes con cáncer de pulmón. Se obtuvieron DCs de células CD14+, a través de cultivo en presencia de GM-CSF e IL-4 durante 5 días. Las DCs se impulsaron con péptidos que se unen a HLA-A24 en presencia de microglobulina beta 2 durante 2 horas a 37 grados C. Estas DC impulsadas con péptido se irradiaron a continuación y se mezclaron en una relación 1:20 con células T CD8+ autólogas para generar CTLs reactivos con péptidos. Las células se cultivaron con IL-7 en AIM-V complementado con 2% de autosuero el día 0 y estos cultivos se complementaron con IL-2 el día 2. Dos estimulaciones semanales adicionales con blastos de PHA autólogos cargados con péptido se llevaron a cabo el día 7 y 14. Se llevaron a cabo ensayos ELISPOT de INF-gamma, movilización de CD107a y liberación de 51Cr a los 6 días después de la tercera ronda de estimulación con péptido de células T CD8+.
[Fig. 3]
La Figura 3 está compuesta por una serie de gráficos de barras, A a C, que representan la respuesta de CTL a péptidos derivados de CDC45L en donantes sanos. Partes A, B, C: ensayo ELISPOT de CTLs reactivos con péptido reCDC45L generados de las PBMCs de donantes sanos positivas a HLA-A24 (A, C, donante sano 1; B, donante sano 4). Células T CD8+ se estimularon con DCs derivadas de monocitos autólogas (día 0) y blastos de PHA autólogos (días 7 y 14) impulsados con una mezcla de 4 de 16 péptidos posibles (SEQ ID NOs: 1 a 16). Los CTLs se recogieron el día 20, y los CTLs productores de IFN-gamma se detectaron mediante el ensayo ELISPOT. Las barras indican el número de puntos de IFN-gamma cuando las líneas de CTL se reestimulaban con células C1R-A2402 impulsadas con péptidos derivados de CDC45L (barras abiertas) o péptidos HIV-A24 irrelevantes (barras cerradas). La relación de efector a célula diana es 10:1. Los datos se indican como la media /- SD de ensayos por triplicado. Un representante de dos experimentos independientes con resultados similares se muestra para cada donante.
[Fig. 4]
La Figura 4 está compuesta por una serie de paneles que representan el nivel de CD107a expuesto sobre la superficie celular de células T CD8+ después de la estimulación con antígeno. Todos los péptidos se usaron a una concentración final de 1 microgramo/ml. Los casos mostrados están acotados para células T CD8+. Paneles superior y medio: estimulados con los péptidos derivados de CDC45L cognados. Paneles inferiores: estimulados con el péptido HIV-A24 irrelevante. Los números dentro de las gráficas indican el porcentaje de la población celular con la característica del cuadrante (linfocitos T CD8+ CD107a+). Cada carril es un representante de dos experimentos independientes con resultados similares.
[Fig. 5a-c]
La Figura 5 está compuesta por una serie de gráficas A a D, que representan la inducción de CTLs humanos específicos de CDC45L procedentes de PBMCs de los pacientes con cáncer de pulmón positivos a HLA-A24. Parte A: ensayo ELISPOt de CTLs inducidos a partir de los pacientes con cáncer de pulmón cocultivados con células diana impulsadas con péptido CDC45L-A24-9-109-2 (SEQ ID NO: 2), CDC45L-A24-9-294-3 (SEQ ID NO: 3), CDC45L-A24-9-556-4 (SEQ ID NO: 4), CDC45L-A24-9-370-7 (SEQ ID NO: 7) o CDC45L-A24-10-556-12 (SEQ ID NO: 12) La producción de IFN-gamma estimulada con células C1R-A*2402 impulsadas con péptido era significativamente mayor que la estimulada con células C1R-A*2402 impulsadas con péptido de HIV. Las barras indican el número de machas de IFN-gamma cuando las líneas de CTL generadas se reestimulaban con células C1R-A2402 impulsadas con péptidos derivados de CDC45L (barras abiertas) o péptidos HIV-A24 irrelevantes (barras cerradas). La relación de células efectoras a diana era 10:1. Los datos se presentan como la media /- SD de ensayos por triplicado. Parte B: Citotoxicidad de CTLs contra células C1R-A2402 impulsadas con péptidos derivados de CDC45L cognados (triángulo blanco; CDC45L-A24-9-109-2 (SEQ ID NO: 2), CDC45L-A24-9-294-3 (SEQ ID NO: 3), CDC45L-A24-9-556-4 (SEQ ID NO: 4), CDC45L-A24-9-370-7 (SEQ ID NO: 7) o CDC45L-A24-10-556-12 (SEQ ID NO: 12)) y células C1R-A2402 impulsadas con péptidos HIV-A24 irrelevantes (triángulo negro) en un ensayo de liberación de 51Cr. Cada valor representa el porcentaje de lisis específica calculado sobre los valores medios de un ensayo por triplicado. Parte C: Análisis de transferencia Western de lisados de células enteras derivados de células Lu99 (panel izquierdo, carril 1), células Lu99 transfectadas con ARNsi de CDC45L (panel izquierdo, carril 2) o ARNsi de GFP de control (panel izquierdo, carril 3) y células EBC-1 (panel derecho, carril 1), células EBC-1 transfectadas con ARNsi de CDC45L (panel derecho, carril 2) o ARNsi de GFP de control (panel derecho, Carril 3) usando anticuerpo anti-CDC45L. La actina beta servía como control interno.
[Fig. 5d]
Parte D: Supresión de la actividad citotóxica específica de CDC45L de CTLs mediante la regulación a la baja de proteína CDC45L en células diana Lu99 y EBC-1 (CDC45L+, HLA-A*2402+). Las actividades citotóxicas de CTLs contra Lu99, EBC-1, ARNsi de CDC45L Lu99, ARNsi de CDC45L EBC-1, ARNsi de GFP Lu99, ARNsi de GFP EBC-1 o A549 se analizaron mediante un ensayo de liberación de 51Cr. Cada valor representa el porcentaje de lisis específica calculado basándose en los valores medios de un ensayo por triplicado.
[Fig. 6]
La Figura 6 está compuesta por una serie de gráficos que representan la inhibición de respuestas de CTLs reactivos a CDC45L mediante mAb anti-HLA de clase I. Después de que las células diana Lu99 se incubaran con mAb anti-HLA clase I (W6/32, IgG2a) o mAb anti-HLA clase II de control (IgG2a) durante 1 h, las células Lu99 se cocultivaron con los CTLs generados a partir de células T CD8+ de donantes sanos o pacientes con cáncer de pulmón mediante estimulación con péptido CDC45L-A24-9-109-2 (SEQ ID NO: 2), CDC45L-A24-9-294-3 (SEQ ID NO: 3), CDC45L-A24-9-556-4 (SEQ ID NO: 4) o CDC45L-A24-9-370-7 (SEQ ID NO: 7). Se indica la producción de IFN-gamma (Parte A) y la citotoxicidad (Parte B) mediada por CTLs. Círculo blanco, Lu99; Círculo negro, Lu99 W6/32; Recuadro blanco, Lu99 mAb de control. Los datos se presentan como la media /- SD de ensayos por triplicado. Las diferencias estadísticamente significativas se indican con asteriscos (*P < 0,05).
[Fig. 7]
La Figura 7 está compuesta por una serie de gráficos, A a C, que representan la inducción de CTLs restringidos tanto por HLA-A24 (A*2402) como por HLA-A2 (A*0201) mediante la estimulación con péptido CDC45L-A2-9-556-4 (SEQ ID NO: 4, también denominado en la presente CDC45L-A24-9-556-4), 556KFLDALISL564. Parte A: Ensayo ELISPOT de IFN-gamma de CTLs inducidos a partir de un donante sano positivo a HLA-A*0201 cocultivados con células T2 impulsadas con péptido CDC45L-A2-9-556-4 (SEQ ID NO: 4). Los datos se presentan como la media /- SD de ensayos por triplicado. Parte B: Actividad citotóxica de CTLs contra células T2 impulsadas con péptido CDC45L-A2-9-556-4 (SEQ ID NO: 4) (triángulo blanco), células T2 impulsadas con péptido HIV-A2 de control (triángulo negro) y células C1R-A2402 impulsadas con péptido CDC45L-A2-9-556-4 (SEQ ID NO: 4) (recuadro negro) según se analiza mediante un ensayo de liberación de 51Cr. Parte C: Inhibición de respuestas de CTLs reactivos a CDC45L mediante mAb anti-HLA clase I según se analizaba mediante un ensayo de liberación de 51Cr. Después de que las células diana Panc1 (CDC45L+, HLA-A2+, HLA-A24-) se incubaran con mAb anti-HLA clase I (W6/32, IgG2a) o mAb anti-HLA clase II (IgG2a), durante 1 h, las células Panc1 se cocultivaron con los CTLs generados a partir de células T CD8+ de un donante sano positivo a HLA-A*0201 mediante la estimulación con péptido CDC45L-A2-9-556-4 (SEQ ID NO: 4). Círculo blanco, células Panc1; Círculo negro, Panc1 W6/32; Recuadro blanco, mAb de control Panc1 . Cada valor representa el porcentaje de lisis específica calculado basándose en los valores medios de un ensayo por triplicado. Se muestran datos representativos procedentes de tres experimentos independientes con resultados similares.
[Fig. 8a-b]
La Figura 8 está compuesta por una serie de gráficos, A a D, que representan la actividad tumoral in vivo de CTLs humanos reactivos a CDC45L en ratones NOD/SCID. Partes A, B, C: Actividad citotóxica específica de péptido de CTLs humanos generados a partir de donantes sanos mediante la estimulación con la mezcla de tres péptidos derivados de CDC45L. Parte A: Ensayo ELISPOT de IFN-gamma de CTLs cocultivados con células C1R-A2402 impulsadas con péptido bien CDC45L-A24-9-109-2 (SEQ ID NO: 2), bien CDC45L-A24-9-294-3 (SEQ ID NO: 3) o bien CDC45L-A24-9-556-4 (SEQ ID NO: 4). Parte B: citotoxicidad específica de CDC45L de CTLs contra Lu99 (CDC45L+, HLA-A24+) en ausencia (círculo blanco) o presencia de mAb anti-HLA clase I (W6/32, círculo negro) o mAb anti-HLA clase II de control (recuadro blanco) según se analiza mediante un ensayo de liberación de 51Cr.
[Fig. 8c-d]
Parte C: Actividad citotóxica de CTLs para células C1R-A2402 impulsadas con uno de tres péptidos derivados de CDC45L (círculo blanco, CDC45L-A24-9-109-2 (SEQ ID NO: 2); recuadro blanco, CDC45L-A24-9-294-3 (SEQ ID NO: 3); triángulo blanco, CDC45L-A24-9-556-4 (SEQ ID NO: 4)) o un péptido HIV-A24 irrelevante (círculo negro) según se analiza mediante un ensayo de liberación de 51Cr. Parte D: Tumores en ratones NOD/SCID inoculados intravenosamente con CTLs inducidos por CDC45L (recuadro negro, n = 5), células T CD8+ de control (rombo blanco, n = 5) o PBS sola (círculo blanco, n = 5). Cuando el tamaño del tumor alcanzaba aproximadamente 25 mm2 el día 7 después de la implantación del tumor subcutáneamente, CTLs humanos (4 X 106) reactivos con una mezcla de tres péptidos CDC45L se inocularon intravenosamente. La inoculación de CTL se repitió el día 14. Las células T CD8+ de control estimuladas con un péptido de HIV restringido por HLA-A24 irrelevante también se inocularon en ratones como un control. El tamaño del tumor se expresa en milímetros cuadrados. Cada símbolo representa tamaños de tumor medios en cada grupo de ratones; las barras indican SD. Se usó la prueba de la t de Student de dos colas para determinar la significación de las diferencias entre los dos grupos el día 42.
[Descripción de Realizaciones]
I. Definiciones
Las palabras "un", "uno(a)" y "el/la" según se usan en la presente significan "al menos uno" a menos que se indique específicamente otra cosa.
Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan intercambiablemente en la presente para hacer referencia a un polímero de residuos de aminoácido. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácido pueden ser un residuo o residuos modificados, o un residuo o residuos no presentes en la naturaleza, tales como un mimético o miméticos químicos artificiales de un aminoácido o aminoácidos presentes en la naturaleza correspondientes, así como a polímeros de aminoácidos presentes en la naturaleza.
El término "aminoácido" según se usa en la presente se refiere a aminoácidos presentes en la naturaleza y sintéticos, así como análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan de forma similar a los aminoácidos presentes en la naturaleza. El aminoácido puede ser bien L-aminoácidos o bien D-aminoácidos. Los aminoácidos presentes en la naturaleza son los codificados por el código genético, así como los modificados después de la traducción en células (p. ej., hidroxiprolina, gammacarboxiglutamato y O-fosfoserina). La expresión "análogo de aminoácido" se refiere a compuestos que tienen la misma estructura química básica (un carbono alfa unido a un hidrógeno, un grupo carboxi, un grupo amino y un grupo R) que un aminoácido presente en la naturaleza, pero tienen uno o más grupos R modificados o esqueletos modificados (p. ej., homoserina, norleucina, metionina, sulfóxido, metioninametilsulfonio). La expresión "mimético de aminoácido" se refiere a compuestos químicos que tienen estructuras diferentes pero funciones similares que los aminoácidos generales.
Los aminoácidos se pueden mencionar en la presente por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o los símbolos de una letra recomendados por la IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission.
Los términos "gen", "polinucleótidos", "nucleótidos" y "ácidos nucleicos" se usan intercambiablemente en la presente y, a menos que se indique específicamente otra cosa, se mencionan mediante sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados.
El término "composición" según se usa en la presente está destinado a abarcar un producto que incluye los ingredientes especificados en las cantidades especificadas, así como cualquier producto que resulte, directamente o indirectamente, de la combinación de los ingredientes especificados en las cantidades especificadas. Este término en relación con una "composición farmacéutica", está destinado a abarcar un producto que incluya el ingrediente o los ingredientes activos, y cualesquiera ingrediente o ingredientes inertes que constituyan en portador, así como cualquier producto de resulte, directamente o indirectamente, de la combinación, complejación o agregación de cualesquiera dos o más de los ingredientes, o de la disociación de uno o más de los ingredientes, o de otros tipos de reacciones o interacciones de uno o más de los ingredientes. Según esto, en el contexto de la presente invención, la expresión "composición farmacéutica" abarca cualquier composición elaborada al mezclar un compuesto de la presente invención y un portador farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable. La expresión "portador farmacéuticamente aceptable” o "portador fisiológicamente aceptable", según se usa en la presente, significa un material, una composición, una sustancia o un vehículo farmacéutica o fisiológicamente aceptable, incluyendo, pero no limitados a, una carga líquida o sólida, un diluyente, excipiente, disolvente o material encapsulante, implicado en el soporte o el transporte del ingrediente o los ingredientes activos desde un órgano, o porción del cuerpo, a otro órgano, o porción del cuerpo.
A menos que se defina otra cosa, el término "cáncer" se refiere a los cánceres o tumores que sobreexpresan el gen CDC45L, ejemplos de los cuales incluyen, pero no se limitan a, tumor testicular, cáncer pancreático, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de mama, cáncer esofágico, cáncer de próstata, leucemia mieloide crónica (CML), tumor de tejido blandos, cáncer gástrico, cáncer hepatobiliar y cáncer colorrectal.
A menos que se defina otra cosa, los términos "linfocito T citotóxico", "célula T citotóxica" y "CTL" se usan intercambiablemente en la presente y, a menos que se indique específicamente otra cosa, se refieren a un subgrupo de linfocitos T que son capaces de reconocer células extrañas (p. ej., células tumorales/cancerosas, células infectadas con virus) e inducir la muerte de estas células.
A menos que se defina otra cosa, el término "HLA-A24" se refiere al tipo HLA-A24 que contiene los subtipos tales como HLA-A*2402.
A menos que se defina otra cosa, el término "HLA-A2", según se usa en la presente, se refiere representativamente a los subtipos tales como HLA-A*0201 y HLA-A*0206.
A menos que se defina otra cosa, el término "estuche", según se usa en la presente, se usa en referencia a una combinación de reactivos y otros materiales. Se contempla en la presente que el estuche puede incluir una micromatriz, un chip, un marcador, etc. No se pretende que el término "estuche" se limite a una combinación particular de reactivos y/o materiales.
En la medida en que los métodos y las composiciones de la presente invención encuentren utilidad en el contexto del "tratamiento" del cáncer, un tratamiento se considera eficaz "si conduce a un beneficio clínico como tal como reducción en la expresión del gen CDC45L, o una disminución en el tamaño, la prevalencia o el potencial metastásico del cáncer en el sujeto. Cuando el tratamiento se aplica profilácticamente, "eficaz" significa que retarda o previene la formación de cánceres o previene o alivia un síntoma clínico del cáncer. La eficacia se determina en asociación con cualquier método conocido para diagnosticar o tratar el tipo de tumor particular.
En la medida que los métodos y las composiciones de la presente invención encuentren utilidad en el contexto de la "prevención" y la "profilaxis" del cáncer, estos términos se usan intercambiablemente en la presente para referirse a cualquier actividad que reduzca la carga de mortalidad o morbidez por la enfermedad. La prevención y la profilaxis se pueden producir "a niveles de prevención primario, secundario y terciario". Mientras que la prevención y la profilaxis primarias evitan el desarrollo de una enfermedad, los niveles secundario y terciario de prevención y profilaxis abarcan actividades destinadas a la prevención y la profilaxis de la progresión de una enfermedad y la emergencia de síntomas así como la reducción del impacto negativo de una enfermedad ya establecida al restaurar la función y reducir complicaciones relacionadas con la enfermedad. Alternativamente, la prevención y la profilaxis pueden incluir una amplia gama de terapias profilácticas destinadas a aliviar la gravedad del trastorno particular, p. ej. reducir la proliferación y la metástasis de tumores.
En el contexto de la presente invención, el tratamiento y/o la profilaxis del cáncer y/o la prevención de su recaída posoperatoria incluyen cualquiera de las siguientes etapas, tales como la retirada quirúrgica de células cancerosas, la inhibición del crecimiento de células cancerosas, la involución o regresión de un tumor, la inducción de la remisión y la supresión de la presencia del cáncer, la regresión del tumor y la reducción o la inhibición de metástasis. El tratamiento eficaz y/o la profilaxis del cáncer disminuye la mortalidad y mejora el pronóstico de individuos que tienen cáncer, disminuye los niveles de marcadores tumorales en la sangre y alivia síntomas detectables que acompañan al cáncer. Por ejemplo, la reducción o la mejora de los síntomas constituye un tratamiento eficaz y/o la profilaxis incluyen 10%, 20%, 30% o más de reducción, o una enfermedad estable
En el contexto de la presente invención, el término "anticuerpo" se refiere a inmunoglobulinas y sus fragmentos que son específicamente reactivos para una proteína diseñada o uno de sus péptidos. Un anticuerpo puede incluir anticuerpos humanos, anticuerpos primatizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos humanizados, anticuerpos fusionados a otras proteínas o radiomarcadores, y fragmentos de anticuerpo. Por otra parte, un anticuerpo de la presente se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (p. ej. anticuerpos biespecíficos) formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpo con la condición de que exhiban la actividad biológica deseada. Un "anticuerpo" indica todas las clases (p. ej. IgA, IgD, IgE, IgG y IgM.
A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado que es entendido comúnmente por un experto normal en la especialidad a la que pertenece la presente invención.
II. Péptidos
Para demostrar que los péptidos derivados de CDC45L funcionan como un antígeno reconocido por CTLs, péptidos derivados de CDC45L (SEQ ID NO: 18) se analizaron para determinar si eran epítopos antigénicos restringidos por HLA-A24 o A2 que son alelos de HLA comúnmente encontrados (Date Y y cols., Tissue Antigens 47: 93-101, 1996; Kondo A y cols., J Immunol 155: 4307-12, 1995; Kubo RT y cols., J Immunol 152: 3913-24, 1994). Candidatos de péptidos que se unen a HLA-A24 derivados de CDC45L se identificaron basándose en sus afinidades de unión a HLA-A24. Se considera que los siguientes péptidos son posibles péptidos para inmunoterapia;
CDC45L-A24-9-237-1 (SEQ ID NO: 1),
CDC45L-A24-9-109-2 (SEQ ID NO: 2),
CDC45L-A24-9-294-3 (SEQ ID NO: 3),
CDC45L-A24-9-556-4 (SEQ ID NO: 4),
CDC45L-A24-9-328-5 (SEQ ID NO: 5),
CDC45L-A24-9-396-6 (SEQ ID NO: 6),
CDC45L-A24-9-370-7 (SEQ ID NO: 7),
CDC45L-A24-9-192-8 (SEQ ID NO: 8),
CDC45L-A24-9-541-9 (SEQ ID NO: 9),
CDC45L-A24-9-364-10 (SEQ ID NO: 10),
CDC45L-A24-10-109-11 (SEQ ID NO: 11),
CDC45L-A24-10-556-12 (SEQ ID NO: 12),
CDC45L-A24-10-271-13 (SEQ ID NO: 13),
CDC45L-A24-10-313-14 (SEQ ID NO: 14),
CDC45L-A24-10-21-15 (SEQ ID NO: 15) y
CDC45L-A24-10-459-16 (SEQ ID NO: 16).
Por otra parte, después de la estimulación in vitro de células T por células dendríticas (DCs) impulsadas (cargadas) con estos péptidos, los CTLs se establecieron satisfactoriamente usando cada uno de los siguientes péptidos;
CDC45L-A24-9-109-2 (SEQ ID NO: 2),
CDC45L-A24-9-294-3 (SEQ ID NO: 3),
CDC45L-A24-9-556-4 (SEQ ID NO: 4),
CDC45L-A24-9-370-7 (SEQ ID NO: 7) y
CDC45L-A24-10-556-12 (SEQ ID NO: 12).
Estos CTLs establecidos mostraban una potente actividad de CTL específica contra células diana impulsadas con los péptidos respectivos. Los resultados en la presente demuestran que CDC45L es un antígeno reconocido por CTLs y que los péptidos probados son péptidos epitópicos de CDC45L restringidos por HLA-A24.
Entre estos péptidos, también se identificó CDC45L-A24-9-556-4 (SEQ ID NO: 4) como candidato de péptido que se une a HLA-A2. En la presente, CDC45L-A24-556-4 (SEQ ID NO: 4) también se denomina CDC45L-A2-9-556-4 (SEQ ID NO: 4) en el contexto de los péptidos restringidos por HLA-A2. Usando el péptido, CTLs contra células diana que expresan CDC45L y HLA-A2 se establecieron satisfactoriamente. Así, CDC45L-A2-9-556-4 (SEQ ID NO: 4) no es solo un péptido epitópico restringido por HLA-A24, sino también un péptido epitópico restringido por HLA-A24.
Puesto que el gen CDC45L se sobreexpresa en células y tejido cancerosos, incluyendo, por ejemplo, los de tumor testicular, cáncer pancreático, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de mama, y cáncer esofágico, cáncer de próstata, leucemia mieloide crónica (CML), tumor de tejido blandos, cáncer gástrico, cáncer hepatobiliar y cáncer colorrectal y no se expresa en la mayoría de los órganos normales, representa una buena diana para la inmunoterapia del cáncer. Así, la presente invención proporciona nonapéptidos (péptidos que consisten en nueve residuos de aminoácido) y decapéptidos (péptidos que consisten en diez residuos de aminoácido) correspondientes a epítopos reconocidos por CTL procedentes de CDC45L. Alternativamente, la presente invención proporciona péptidos aislados que se unen a antígenos HLA e inducen linfocitos T citotóxicos (CTLs), en donde el péptido tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 o es uno de sus fragmentos inmunológicamente activos. Ejemplos particularmente preferidos de la presente invención incluyen el péptido que tiene una SEQ ID NO: 3.
Generalmente, programas informáticos disponibles actualmente, por ejemplo, en la Internet, tales como los descritos en Parker KC y cols., J Immunol 1 de enero de 1994, 152(1): 163-75 y Nielsen M y cols., Protein Sci 2003; 12: 1007­ 17 se pueden usar para calcular por ordenador las afinidades de unión entre diversos péptidos y antígenos HLA. La afinidad de unión con antígenos HLA se puede medir según se describe, por ejemplo, en Parker Kc y cols., J Immunol 1 de enero de 1994, 152(1): 163-75, Kuzushima K y cols., Blood 2001, 98(6): 1872-81, Larsen MV y cols. BMC Bioinformatics. 31 de octubre de 2007; 8: 424, Buus S y cols. Tissue Antigens., 62:378-84, 2003, Nielsen M y cols., Protein Sci 2003; 12: 1007-17 y Nielsen M y cols. PLoS ONE 2007; 2: e796, que se resumen, p. ej., en Lafuente EM y cols., Current Pharmaceutical Design, 2009, 15, 3209-3220. Los métodos para determinar la afinidad de unión se describen, por ejemplo, en the Journal of Immunological Methods, 1995, 185: 181-190 y Protein Science, 2000, 9: 1838-1846. Por lo tanto, se pueden seleccionar fragmentos derivados de CDC45L que tienen alta afinidad de unión con antígenos HLA usando estos programas informáticos. Así, la presente invención abarca péptidos compuestos por cualesquiera fragmentos derivados de CDC45L que se unan con antígenos HLA mediante estos programas conocidos. Por otra parte, estos péptidos pueden incluir el péptido que consiste en la longitud completa de CDC45L.
En general, la modificación de uno o más aminoácidos en un péptido no influirá en la función del péptido, y en algunos casos incluso potenciará la función deseada de la proteína original. De hecho, se ha mostrado que los péptidos modificados (es decir, péptidos compuestos por una secuencia de aminoácidos en la que uno, dos o varios residuos de aminoácido se han modificado (es decir, sustituido, añadido, eliminado y/o insertado) en comparación con una secuencia de referencia original) retienen la actividad biológica del péptido original (Mark y cols., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81: 5662-6; Zoller y Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10: 6487-500; Dalbadie-McFarland y cols., Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79: 6409-13). Así, en una realización, los péptidos de la presente invención tienen tanto inducibilidad de CTL como una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, en donde se sustituyen uno o dos aminoácidos.
Los expertos en la especialidad identificarán que las adiciones, eliminaciones o sustituciones individuales en una secuencia de aminoácidos que alteren un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos tienden a dar como resultado la conservación de las propiedades de la cadena lateral del aminoácido original. Como tales, a menudo se denominan "sustituciones conservativas" o "modificaciones conservativas", en donde la alteración de una proteína da como resultado una proteína modificada que tiene una función análoga a la proteína original. Tablas de sustituciones conservativas que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son muy conocidas en la especialidad. Ejemplos de características de cadenas laterales de aminoácidos que es deseable conservar incluyen, por ejemplo: aminoácidos hidrófobos (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), aminoácidos hidrófilos (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T) y cadenas laterales que tienen en común los siguientes grupos funcionales o: una cadena lateral alifática (G, A, V, L, I, P); una cadena lateral que contiene grupos hidroxilo (S, T, Y); una cadena lateral que contiene átomos de azufre (C, M); una cadena lateral que contiene ácido carboxílico y amida (D, N, E, Q); una cadena lateral que contiene base (R, K, H); y una cadena lateral que contiene grupos aromáticos (H, F, Y, W). Además, los ocho grupos siguientes contienen cada uno aminoácidos que son aceptados en la especialidad como sustituciones conservativas entre sí:
1) Alanina (A), Glicina (G);
2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E);
3) Asparagina (N), Glutamina (Q);
4) Arginina (R), Lisina (K);
5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V);
6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W);
7) Serina (S), Treonina (T); y
8) Cisteína (C), Metionina (M) (véase, p. ej., Creighton, Proteins 1984).
También se considera que estos péptidos modificados conservativamente son péptidos de la presente invención. Sin embargo, los péptidos de la presente invención no se restringen a los mismos y pueden incluir modificaciones no conservativas, con la condición de que el péptido modificado retenga la inducibilidad de CTL del péptido original. Por otra parte, los péptidos modificados no deben excluir péptidos inducibles de CTL de variantes polimórficas, homólogos entre especies y alelos de CDC45L
Cuando se usan en el contexto de la inmunoterapia del cáncer, los péptidos de la presente invención se deben presentar sobre la superficie de una célula o exosoma, preferiblemente como un complejo con un antígeno HLA. Por lo tanto, es preferible seleccionar péptidos que no solo induzcan CTLs sino que también posean alta afinidad de unión al antígeno HLA. A ese fin, los péptidos se pueden modificar mediante sustitución, inserción y/o adición de los residuos de aminoácido para dar un péptido modificado que tiene afinidad de unión mejorada. Además de péptidos que son exhibidos naturalmente, puesto que ya se conoce la regularidad de las secuencias de péptidos exhibidos mediante la unión a antígenos HLA (J Immunol 1994, 152: 3913; Immunogenetics 1995, 41: 178; J Immunol 1994, 155: 4307), se pueden introducir modificaciones basadas en esta regularidad en los péptidos inmunogénicos de la presente invención.
Por ejemplo, puede ser deseable sustituir el segundo aminoácido desde el extremo N por fenilalanina, metionina o triptófano y/o el aminoácido en el extremo C por fenilalanina, isoleucina, triptófano o metionina a fin de incrementar la afinidad de unión a HLA-A24. Así, un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 en la que el segundo aminoácido desde el extremo N se sustituye por fenilalanina, metionina o triptófano, y/o en donde el extremo C se sustituye por fenilalanina, isoleucina, triptófano o metionina son abarcados por la presente invención.
Alternativamente, puede ser deseable sustituir el segundo aminoácido desde el extremo N por leucina o metionina, y/o el aminoácido en el extremo C por valina o leucina a fin de incrementar la afinidad de unión a HLA-A2. Así, los péptidos que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEQ ID NO: 4 en donde el segundo aminoácido desde el extremo N se sustituye por leucina o metionina y/o en donde el extremo C se sustituye por valina o leucina son abarcados por la presente invención.
Las sustituciones se pueden introducir no solo en los aminoácidos terminales sino también en la posición de reconocimiento de péptidos del receptor de células T (TCR) potencial. Varios estudios han demostrado que un péptido son sustituciones de aminoácidos puede tener una función igual a o mejor que la del original, por ejemplo, CAP1, p53 (264-272), Her-2/neu (369-377) o gp 100 (209-217) (Zaremba y cols. Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997, T. K. Hoffmann y cols. J Immunol. (2002) Feb 1 ;168(3): 1338-47., S. O. Dionne y cols. Cancer Immunol immunother. (2003) 52: 199-206 y S. O. Dionne y cols. Cancer Immunology, Immunotherapy (2004) 53, 307-314).
La presente invención también contempla la adición de uno o dos aminoácidos que también se pueden añadir al extremo N y/o C de los presentes péptidos. Estos péptidos modificados que tienen alta afinidad de unión a HLA y retención de inducibilidad de CTL también se incluyen en la presente invención.
Sin embargo, cuando la secuencia peptídica es idéntica a una porción de la secuencia de aminoácidos de una proteína endógena o exógena que tiene una función diferente, se pueden inducir efectos secundarios tales como trastornos autoinmunitarios y/o síntomas alérgicos contra sustancias específicas. Por lo tanto, es preferible realizar en primer lugar búsquedas de homología usando bases de datos disponibles para evitar situaciones en las que la secuencia del péptido coincida con la secuencia de aminoácidos de otra proteína. Cuando esté claro a partir de las búsquedas de homología que no existe ningún péptido con 1 o 2 diferencias de aminoácidos en comparación con el péptido objetivo, el péptido objetivo se puede modificar a fin de incrementar su afinidad de unión con antígenos HLA, y/o incrementar su inducibilidad de CTL sin ningún peligro de estos efectos secundarios.
Aunque se espera que los péptidos que tienen alta afinidad de unión a los antígenos HLA que se describen anteriormente sean muy eficaces, los posibles péptidos, que se seleccionan según la presencia de alta afinidad de unión como un indicador, se examinan adicionalmente con respecto a la presencia de inducibilidad de CTL. En la presente, la expresión "inducibilidad de CTL" indica la capacidad del péptido para inducir linfocitos citotóxicos (CTLs) cuando se presente sobre células que presentan antígenos (APCs). Además, "inducibilidad de CTL" incluye la capacidad del péptido para inducir la activación de CTL, la proliferación de CTL, promover la lisis por CTL de células diana y para incrementar la producción de IFN-gamma por CTL.
La confirmación de la inducibilidad de CTL se efectúa al inducir APCs que soportan antígenos del MHC humano (por ejemplo, linfocitos B, macrófagos y células dendríticas (DCs)), o más específicamente DCs derivadas de leucocitos mononucleares de sangre periférica humana y, después de la estimulación con los péptidos, mezclar con células positivas a CD8, y a continuación medir la IFN-gamma producida y liberada por CTL contra las células diana. Como el sistema de reacción, se pueden usar animales transgénicos que se han producido para expresar un antígeno HLA humano (por ejemplo, los descritos en BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol agosto 2000, 61(8): 764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice: dependent on MHC (HLA) class II restricted T(H) response). Por ejemplo, las células diana se pueden radiomarcar con 51Cr y similares, y la actividad citotóxica se puede calcular a partir de la radiactividad liberada de las células diana. Alternativamente, la inducibilidad de CTL se puede evaluar se puede examinar al medir IFN-gamma producida y liberada por CTL en presencia de APCs que soportan péptidos inmovilizados, y visualizar la zona de inhibición sobre el medio usando anticuerpos monoclonales anti-IFN-gamma.
Como resultado de examinar la inducibilidad de CTL de los péptidos que se describen anteriormente, se descubrió que un nonapéptido o decapéptido de SEQ ID NO: 3 mostraba una inducibilidad de CTL particularmente alta así como alta afinidad de unión a un antígeno HLA. Así, este péptido se ejemplifica como realizaciones preferidas de la presente invención.
Por otra parte, el resultado de análisis de homología mostraba que esos péptidos no tienen una homología significativa con péptidos derivados de cualesquiera otros productos génicos humanos conocidos. Según esto, se disminuye la posibilidad de respuestas inmunitarias desconocidas o no deseadas cuando se usen para inmunoterapia. Por lo tanto, también desde este aspecto, estos péptidos encuentran uso para provocar inmunidad en pacientes con cáncer frente a CDC45L. Así, los péptidos de la presente invención, preferiblemente, péptidos que tienen una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
Además de las modificaciones descritas anteriormente, los péptidos de la presente invención también pueden conectarse a otros péptidos, con la condición de que el péptido conectado resultante retenga la inducibilidad de CTL requerida del péptido original. Ejemplos de péptidos adecuados incluyen: los péptidos de la presente invención o los péptidos inducibles de CTL derivados de otros TAAs. Conectores interpeptídicos adecuados son muy conocidos en la especialidad e incluyen, por ejemplo, AAY (P. M. Daftarian y cols., J Trans Med 2007, 5:26), AAA, NKRK (R. P. M. Sutmuller y cols., J Immunol. 2000, 165: 7308-7315) o K (S. Ota y cols., Can Res. 62, 1471-1476, K. S. Kawamura y cols., J Immunol. 2002, 168: 5709-5715).
Por ejemplo, péptidos antigénicos no asociados a tumores CDC45L también se pueden usar de forma sustancialmente simultánea para incrementar la respuesta inmunitaria a través de HLA clase I y/o clase II. Está bien establecido que las células cancerosas pueden expresar más de un gen asociado a tumores. Así, está dentro del alcance de la experimentación habitual para un experto normal en la especialidad determinar si un sujeto particular expresa genes asociados a tumores adicionales, y a continuación incluir péptidos que se unen a HLA clase I y/o HLA clase II derivados de productos de expresión de estos genes en composiciones o vacunas de CDC45L según la presente invención.
Ejemplos de péptidos que se unen a HLA clase I y HLA clase II son conocidos por los expertos normales en la especialidad (por ejemplo, véase Coulie, Stem Cells 13:393-403, 1995), y se pueden usar en la invención de un modo similar a los divulgados en la presente. Así, un experto normal en la especialidad puede preparar fácilmente polipéptidos que incluyen uno o más péptidos de CDC45L y uno o más de los péptidos diferentes de CDC45L, o ácidos nucleicos que codifican estos polipéptidos, usando procedimientos estándar de la biología molecular.
Estos péptidos conectados anteriores se denominan en la presente "politopos", es decir, grupos de dos o más péptidos potencialmente estimulantes de respuestas inmunogénicas o inmunitarias que se pueden empalmar conjuntamente en diversas disposiciones (p. ej., concatenados, solapamiento). El politopo (o el ácido nucleico que codifica el politopo) se puede administrar en un protocolo de inmunización estándar, p. ej., a animales, para probar la eficacia del politopo para estimular, potenciar y/o provocar una respuesta inmunitaria.
Los péptidos se pueden empalmar entre sí bien directamente o bien a través del uso de secuencias de flanqueo para formar politopos, y el uso de politopos como vacunas en muy conocido en la especialidad (véanse, p. ej., Thomson y cols., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92(13):5845-5849, 1995; Gilbert y cols., Nature Biotechnol. 15(12):1280-1284, 1997; Thomson y cols., J Immunol. 157(2):822-826, 1996; Tarn y cols., J Exp. Med. 171(1):299-306, 1990). Politopos que contienen diversos números y combinaciones de epítopos se pueden preparar y probar con respecto al reconocimiento mediante CTLs y con respecto a la eficacia para incrementar una respuesta inmunitaria.
Los péptidos de la presente invención también se pueden conectar a otras sustancias, con la condición de que el péptido conectado resultante retenga la inducibilidad de CTL requerida del péptido original. Ejemplos de adecuadas incluyen, por ejemplo: péptidos, lípidos, un azúcar y cadenas sacarinas, grupos acetilo, polímeros naturales y sintéticos, etc. Los péptidos pueden contener modificaciones tales como glicosilación, oxidación de cadenas laterales o fosforilación, etc., con la condición de que las modificaciones no destruyan la actividad biológica del péptido original. Estos tipos de modificaciones se pueden realizar para conferir funciones adicionales (p. ej., función de orientación y función de aporte) o para estabilizar el polipéptido.
Por ejemplo, para incrementar la estabilidad in vivo de un polipéptido, se conoce en la especialidad la introducción de D-aminoácidos, miméticos de aminoácidos o aminoácidos no naturales; este concepto también se puede adaptar a los presentes polipéptidos. La estabilidad de un polipéptido se puede evaluar de un número de modos. A modo de ejemplo, peptidasas y diversos medios biológicos, tales como plasma y suero humanos, se pueden usar para probar la estabilidad (véase, p. ej., Verhoef y cols., Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986, 11: 291-302).
Por otra parte, según se apunta anteriormente, entre los péptidos modificados en los que están sustituidos, eliminados y/o añadidos uno, dos o varios residuos de aminoácido, los que tienen una actividad igual o superior en comparación con péptidos originales se pueden cribar o seleccionar. Por lo tanto, la divulgación también proporciona el método de cribado o selección de péptidos modificados que tienen una actividad superior en comparación con los originales. Un método ilustrativo incluye las etapas de:
a: sustituir, eliminar o añadir al menos un residuo de aminoácido de un péptido de la presente invención,
b: determinar la actividad del péptido producido en la etapa (a), y
c: seleccionar el péptido que tiene una actividad igual o superior en comparación con el original.
En la presente, la actividad que se va a ensayar puede incluir actividad de unión al MHC, inducibilidad de APC o CTL y actividad citotóxica. Preferiblemente, la actividad a ensayar es la inducibilidad de CTL y esta actividad se puede ensayar usando los métodos descritos en los "EJEMPLOS"
En la presente, los péptidos de la presente invención también se pueden describir como "péptido o péptidos CDC45L" o "polipéptido o polipéptidos CDC45L".
III. Preparación de péptidos CDC45L
Los péptidos de la presente invención se pueden preparar usando técnicas muy conocidas. Por ejemplo, los péptidos se pueden preparar sintéticamente, usando tecnología de ADN recombinante o síntesis química. Los péptidos de la presente invención se pueden sintetizar individualmente o como polipéptidos más largos que incluyen dos o más péptidos. A continuación, los péptidos se pueden aislar, es decir, purificar o aislar, a fin de que estén sustancialmente libres de otras proteínas de células hospedadoras presentes en la naturaleza y sus fragmentos, o cualesquiera otras sustancias químicas.
Los péptidos de la presente invención pueden contener modificaciones, tales como glicosilación, oxidación de cadenas laterales o fosforilación, con la condición de que las modificaciones no destruyan la actividad biológica del péptido original. Otras modificaciones ilustrativas incluyen la incorporación de D-aminoácidos u otros miméticos de aminoácido que se pueden usar, por ejemplo, para incrementar la semivida en suero de los péptidos.
Un péptido de la presente invención se puede obtener a través de síntesis química basándose en la secuencia de aminoácidos seleccionada. Ejemplos de métodos de síntesis de péptidos convencionales que se pueden adaptar para la síntesis incluyen:
(i) Peptide Synthesis, Interscience, Nueva York, 1966;
(ii) The Proteins, Vol. 2, Academic Press, Nueva York, 1976;
(iii) Peptide Synthesis (en japonés), Maruzen Co., 1975;
(iv) Basics and Experiment of Peptide Synthesis (en japonés), Maruzen Co., 1985;
(v) Development of Pharmaceuticals (segundo volumen) (en japonés), Vol. 14 (peptide synthesis), Hirokawa, 1991;
(vi) documento WO99/67288; y
(vii) Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, "Solid Phase Peptide Synthesis", Academic Press, Nueva York, 1980, 100-118.
Alternativamente, los presentes péptidos se pueden obtener adaptando cualesquiera métodos de manipulación genética conocidos para producir péptidos (p. ej., Morrison J, J Bacteriology 1977, 132: 349-51; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (eds. Wu y cois.) 1983, 101: 347-62). Por ejemplo, en primer lugar, se prepara un vector adecuado que aloja un polinucleótido que codifica el péptido objetivo en una forma expresable (p. ej., aguas abajo de una secuencia reguladora correspondiente a una secuencia promotora) y se transforma en una célula hospedadora adecuada. Estos vectores y células hospedadoras también son proporcionados por la presente invención. A continuación, la célula hospedadora se cultiva para producir el péptido de interés. El péptido también se puede producir in vitro adoptando un sistema de traducción in vitro.
IV. Polinucleótidos
La presente invención también proporciona polinucleótidos que codifican cualquiera de los susodichos péptidos de la presente invención. Estos incluyen polinucleótidos derivados del gen CDC45L presente en la naturaleza (N° de Registro del GenBank NM_003504 (por ejemplo, SEQ ID NO: 17)) así como los que tienen sus secuencias nucleotídicas modificadas conservativamente. En la presente, la expresión "secuencia nucleotídica modificada conservativamente" se refiere a secuencias que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. A modo de ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican todos el aminoácido alanina. Así, en cualquier posición en la que una alanina sea especificada por un codón, el codón se puede alterar hasta cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Estas variaciones de ácidos nucleicos son "variaciones sinónimas", que son una especie de variaciones modificadas conservativamente. Cualquier secuencia de ácido nucleico de la presente que codifique un péptido también describe cualquier posible variación sinónima del ácido nucleico. Un experto en la especialidad identificará que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que normalmente es el único codón para la metionina, y TGG, que normalmente es el único codón para el triptófano) se puede modificar para dar una molécula funcionalmente idéntica. Según esto, cada variación sinónima de un ácido nucleico que codifique un péptido está descrita implícitamente en cada secuencia divulgada.
El polinucleótido de la presente invención puede estar compuesto por ADN, ARN o sus derivados. Como se sabe bien en la especialidad, una molécula de ADN está compuesta por bases tales como las bases presentes en la naturaleza A, T, C y G y T se reemplaza por U en un ARN. Un experto identificará que también se pueden incluir en los polinucleótidos bases no presentes en la naturaleza.
El polinucleótido de la presente invención puede codificar múltiples péptidos de la presente invención con o sin secuencias de aminoácidos intermedias. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos intermedia puede proporcionar un sitio de escisión (p. ej., secuencia de reconocimiento enzimático) del polinucleótido o los péptidos traducidos. Por otra parte, el polinucleótido puede incluir cualesquiera secuencias adicionales a la secuencia codificante que codifica el péptido de la presente invención. Por ejemplo, el polinucleótido puede ser un polinucleótido recombinante que incluye secuencias reguladoras requeridas para la expresión del péptido o puede ser un vector de expresión (plásmido) con genes marcadores y similares. En general, estos polinucleótidos recombinantes se pueden preparar mediante la manipulación de polinucleótidos a través de técnicas recombinantes convencionales usando, por ejemplo, polimerasas y endonucleasas.
Se pueden usar técnicas tanto recombinantes como de síntesis química para producir los polinucleótidos de la presente invención. Por ejemplo, un polinucleótido se puede producir mediante la inserción en un vector apropiado, que se puede expresar cuando se transfecte en una célula competente. Alternativamente, un polinucleótido se puede amplificar usando técnicas de PCR o expresión en hospedadores adecuados (véase, p. ej., Sambrook y cols., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 1989). Alternativamente, un polinucleótido se puede sintetizar usando las técnicas en fase sólida, según se describe en Beaucage SL & lyer RP, Tetrahedron 1992, 48: 2223-311; Matthes y cols., EMBO J 1984, 3: 801-5.
V. Exosomas
La presente invención proporciona además vesículas intracelulares llamadas exosomas, que presentan complejos formados entre los péptidos de la presente invención y antígenos HLA sobre su superficie. Los exosomas se pueden preparar, por ejemplo, usando los métodos detallados en las Publicaciones Kohyo de Solicitud de Patente Japonesa N° Hei 11-510507 y WO99/03499, y se pueden preparar usando APCs obtenidas de pacientes que estén sometidos a tratamiento y/o prevención. Los exosomas de la presente invención se pueden inocular como vacunas, de un modo similar a los péptidos de la presente invención.
El tipo de antígenos HLA incluidos en los complejos debe coincidir con el del sujeto que requiera tratamiento y/o prevención. Por ejemplo, en la población japonesa, HLA-A24 y HLA-A2, particularmente HLA-A*2402 y HLA-A*0201 y HLA-A*0206, son los más prevalentes y por lo tanto serían apropiados para el tratamiento de un paciente japonés. El uso de los tipos A24 y a 2 que están altamente expresados en los japoneses y los caucásicos es favorable para obtener resultados eficaces, y también encuentran uso subtipos tales como A*2402, A*0201 y A*0206. Típicamente, en el entorno clínico, el tipo de antígeno HLA del paciente que requiera tratamiento se investiga por adelantado, lo que permite la selección apropiada de péptidos que tienen altos niveles de afinidad de unión para el antígeno particular, o que tienen inducibilidad de CTL mediante presentación antigénica. Por otra parte, a fin de obtener péptidos que tienen tanto alta afinidad de unión como inducibilidad de CTL, se puede realizar la sustitución de 1 o 2 aminoácidos basándose en la secuencia de aminoácidos del péptido parcial CDC45L presente en la naturaleza.
Cuando se use el antígeno HLA tipo A24 para el exosoma de la presente invención, encuentran uso los péptidos que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 7 y 12.
Alternativamente, cuando se use el antígeno HLA tipo A2 para el exosoma de la presente invención, encuentra uso el péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.
VI. Células que presentan antígenos (APCs)
La presente invención también proporciona células que presentan antígenos (APCs) que presentan complejos formados con antígenos HLA y los péptidos de la presente invención sobre su superficie. Las APCs se pueden derivar de pacientes que están sometidos a tratamiento y/o prevención, y se pueden administrar como vacunas por sí mismas o en combinación con otros fármacos que incluyen los péptidos de la presente invención, exosomas o CTLs.
Las APCs no se limitan a un tipo particular de células e incluyen células dendríticas (DCs), células de Langerhans, macrófagos, células B y células T activadas, que se sabe que presentan antígenos proteínicos sobre su superficie celular de modo que sean reconocidas por linfocitos. Puesto que DC es una APC representativa que tiene la actividad inductora de CTL más fuerte entre las APCs, las DCs encuentran uso como las APCs de la presente invención.
Por ejemplo, las APCs de la presente invención se pueden obtener al inducir DCs procedentes de monocitos de sangre periférica y a continuación ponerlas en contacto (estimularlas) con los péptidos de la presente invención in vitro, ex vivo o in vivo. Cuando los péptidos de la presente invención se administran a los sujetos, APCs que presentan los péptidos de la presente invención se inducen en el cuerpo del sujeto. La expresión "inducir APC" incluye poner en contacto (estimular) una células con los péptidos de la presente invención, o nucleótidos que codifican los péptidos de la presente invención para presentar complejos formados entre antígenos HLA y los péptidos de la presente invención sobre la superficie de las células. Por lo tanto, las APCs de la presente invención se pueden obtener al recoger las APCs del sujeto después de administrar los péptidos de la presente invención al sujeto. Alternativamente, las APCs de la presente invención se pueden obtener al poner en contacto APCs recogidas de un sujeto con el péptido de la presente invención.
Las APCs de la presente invención se pueden administrar a un sujeto para inducir una respuesta inmunitaria contra el cáncer en el sujeto por sí mismas o en combinación con otros fármacos incluyendo los péptidos, exosomas o CTLs de la presente invención. Por ejemplo, la administración ex vivo puede incluir las etapas de:
a: recoger APCs de un primer sujeto,
b: poner en contacto con las APCs de la etapa a con el péptido, y
c: administrar las APCs de la etapa b a un segundo sujeto.
El primer sujeto y el segundo sujeto pueden ser el mismo individuo, o pueden ser individuos diferentes. Las APCs obtenidas mediante la etapa b se pueden usar como una vacuna para el tratamiento y/o la prevención de un cáncer, cuyos ejemplos incluyen pero no se limitan a tumor testicular, cáncer pancreático, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de mama, cáncer esofágico, cáncer de próstata, leucemia mieloide crónica (CML), tumor de tejido blandos, cáncer gástrico, cáncer hepatobiliar y cáncer colorrectal.
La presente invención proporciona la fabricación de una composición farmacéutica que incluye estas células que presentan antígenos inducidas con péptidos de la presente invención. Según un aspecto de la presente invención, las APCs tienen un alto nivel de inducibilidad de CTL. En el término de "alto nivel de inducibilidad de CTL", el alto nivel es relativo al nivel de aquella al poner en contacto APC sin péptido o péptidos, lo que no puede inducir los CTL. Estas APCs que tienen un alto nivel de inducibilidad de CTL se pueden preparar mediante un método que incluye la etapa de transferir un polinucleótido que codifica el péptido de la presente invención a APCs in vitro así como el método mencionado anteriormente. Los genes introducidos pueden estar en la forma de ADNs o ARNs. Ejemplos de métodos para la introducción incluyen, sin limitaciones particulares, diversos métodos realizados convencionalmente en este campo, se puede usan un método tal como lipofección, electroporación y el método del fosfato cálcico. Más específicamente, se puede realizar según se describe en Cancer Res 1996, 56: 5672-7; J Immunol 1998, 161: 5607­ 13; J Exp Med 1996, 184: 465-72; traducción al japonés publicada de la Publicación Internacional N° 2000-509281. Al transferir el gen en APCs, el gen sufre transcripción, traducción y similares en la célula y a continuación la proteína obtenida se procesa mediante MHC Clase I o Clase II, y avanza a través de un ruta de presentación para presentar péptidos parciales.
En realizaciones preferidas, las APCs de la presente invención pueden ser las que presentan complejos formados entre un antígeno HLA-A24 tal como HLA-A*2402 y el péptido de la presente invención sobre su superficie. Alternativamente, las APCs de la presente invención pueden presentar complejos formados entre un antígeno HLA-A2 tal como HLA-A*0201 y el péptido de SEQ ID NO: 4 o su péptido modificado sobre su superficie.
VII. Linfocitos T citotóxicos (CTLs)
Un CTL inducido contra uno cualquiera de los péptidos de la presente invención refuerza la respuesta inmunitaria que se orienta a células cancerosas in vivo y así se pueden usar como vacunas, de un modo similar a los péptidos de por sí. Así, la presente invención proporciona CTLs aislados que son específicamente inducidos o activados por uno cualquiera de los presentes péptidos.
Estos CTLs se pueden obtener al (1) administrar el péptido o los péptidos de la presente invención a un sujeto o (2) poner en contacto (estimular) APCs derivadas del sujeto, y células positivas a CD8, o leucocitos mononucleares de sangre periférica in vitro con el péptido o los péptidos de la presente invención o (3) poner en contacto células positivas a CD8 o leucocitos mononucleares de sangre periférica in vitro con las APCs o los exosomas que presentan un complejo de un antígeno HLA y el péptido sobre su superficie o (4) introducir un gen que incluye un polinucleótido que codifica una subunidad del receptor de células T (TCR) capaz de unirse al péptido de la presente invención. Estos APCs o exosomas se pueden preparar mediante los métodos descritos anteriormente y los detalles del método de (4) se describen posteriormente en la sección "VIII. Receptor de células T (TCR)".
Los CTLs de la presente invención se pueden derivar de pacientes que se someten a tratamiento y/o prevención, y se pueden administrar por sí mismos o en combinación con otros fármacos incluyendo los péptidos de la presente invención o exosomas con el propósito de regular los efectos. Los CTLs obtenidos actúan específicamente contra células diana que presentan los péptidos de la presente invención, por ejemplo, los mismos péptidos usados para la inducción. Las células diana pueden ser células que expresan endógenamente CDC45L, tales como células cancerosas, o células que se transfectan con el gen CDC45L; y células que presentan un péptido de la presente invención sobre la superficie celular debido a la estimulación por el péptido también pueden servir como dianas del ataque por CTLs activados.
VIII. Receptor de células T (TCR)
La presente invención también proporciona una composición que incluye ácidos nucleicos que codifican polipéptidos que son capaces de formar una subunidad de un receptor de células T (TCR), y métodos para usar la misma. Las subunidades de TCR de la presente invención tienen la capacidad de formar TCRs que confieren especificidad a células T contra células tumorales que presentan CDC45L. Al usar los métodos conocidos en la especialidad, se pueden identificar los ácidos nucleicos que codifican las cadenas alfa y beta que constituyen las subunidades de TCR del CTL inducido con uno o más péptidos de la presente invención (documento WO2007/032255 y Morgan y cols., J Immunol, 171, 3288 (2003)). Por ejemplo, los métodos de PCR se prefieren para analizar las secuencias nucleotídicas que codifican subunidades de TCR. Los cebadores de PCR para el análisis pueden ser, por ejemplo, cebadores 5'-R (5'-gtctaccaggcattcgcttcat-3') como cebadores laterales 5' (SEQ ID NO: 23) y cebadores 3-TRa-C (5'-tcagctggaccacagccgcagcgt-3') específicos para la región C de la cadena alfa de TCR (SEQ ID NO: 24), cebadores 3-TRb-C1 (5'-tcagaaatcctttctcttgac-3') específicos para la región C1 de la cadena beta de TCR (SEQ ID NO: 25) o cebadores 3-TRbeta-C2 (5'-ctagcctctggaatcctttctctt-3') específicos para la región C2 de la cadena beta de TCR (SEQ ID NO: 26) como cebadores laterales 3', pero no se limitan a estos. Los TCRs derivados se pueden unir a células diana que exhiben el péptido CDC45L con alta avidez, y opcionalmente median en la destrucción eficaz de células diana que presentan el péptido CDC45L in vivo e in vitro.
Los ácidos nucleicos que codifican las subunidades de TCR se pueden incorporar en vectores adecuados, p. ej., vectores retrovirales. Estos vectores son muy conocidos en la especialidad. Los ácidos nucleicos o los vectores que los incluyen se pueden transferir útilmente a una célula T, por ejemplo, una célula T procedente de un paciente. Ventajosamente, la presente invención proporciona una composición lista para usar que permite una modificación rápida de las propias células T de un paciente (o las de otro mamífero) para producir rápidamente y fácilmente células T modificadas que tienen excelentes propiedades de destrucción del células cancerosas.
El TCR específico es un receptor capaz de reconocer específicamente un complejo de un péptido de la presente invención y una molécula de HLA, dando una actividad específica de células T contra la célula diana cuando el TCR se presenta sobre la superficie de la célula T. Un reconocimiento específico del complejo anterior se puede confirmar mediante métodos conocidos, ejemplos preferidos de los cuales incluyen, pero no se limitan a, análisis de tinción de multímeros de HLA usando moléculas de HLA y péptidos de la presente invención, y ensayo ELISPOT. Al realizar el ensayo ELISPOT, se puede confirmar si una célula T transducida con el ácido nucleico que codifica las subunidades de TCR reconoce una célula que expresa molécula de HLA y CDC45L, y la señal se transmite intracelularmente. También puede confirmar si las subunidades de TCR introducidas en una célula T pueden dar una actividad citotóxica de células T mediante métodos conocidos en la especialidad. Métodos preferidos incluyen, por ejemplo, el ensayo de liberación de cromo usando como células diana células positivas a HLA-A2 y que sobreexpresan CDC45L.
Además, la presente invención proporciona CTLs que se preparan mediante transducción con los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de las subunidades de TCR que se unen al péptido CDC45L de SEQ ID NO: 3 en el contexto de HLA-A24.
Los CTLs transducidos son capaces de trasladarse a células cancerosas in vivo, y se pueden expandir mediante métodos de cultivo in vitro bien conocidos (p. ej., Kawakami y cols., J Immunol., 142, 3452-3461 (1989)). Los CTLs de la presente invención se pueden usar para formar una composición inmunogénica útil en el tratamiento y/o la prevención de un cáncer en un paciente que necesite terapia o protección (Véase el documento WO2006/031221).
IX. Agentes o composiciones farmacéuticos
Puesto que la expresión de CDC45L está específicamente elevada en cánceres, ejemplos de los cuales incluyen pero no se limitan a tumor testicular, cáncer pancreático, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de mama, cáncer esofágico, cáncer de próstata, leucemia mieloide crónica (CML), tumor de tejido blandos, cáncer gástrico, cáncer hepatobiliar y cáncer colorrectal en comparación con tejido normal, los péptidos de la presente invención y los polinucleótidos que codifican estos péptidos encuentran utilidad en el tratamiento y/o la profilaxis del cáncer, y/o la prevención de su recaída posoperatoria. Así, la presente invención proporciona un agente o una composición farmacéuticos para tratar y/o prevenir un cáncer, y/o para prevenir su recaída posoperatoria, incluyendo este agente o composición farmacéuticos como un ingrediente activo uno o más de los péptidos o polinucleótidos de la presente invención. Alternativamente, los presentes péptidos se pueden expresar sobre la superficie de cualquiera de los exosomas o las células precedentes, tales como APCs, para el uso como agentes o composiciones farmacéuticos. Además, los susodichos CTLs que se orientan a uno cualquiera de los péptidos de la presente invención también se pueden usar como el ingrediente activo de los presentes agentes o composiciones farmacéuticos.
Los agentes y las composiciones farmacéuticos (es decir, "agentes farmacéuticos") de la presente invención también encuentran uso como vacunas. En el contexto de la presente invención, la expresión "vacuna" (también denominada una "composición inmunogénica") se refiere a una sustancia que tiene la función de inducir inmunidad antitumoral tras la inoculación en animales.
Los agentes o las composiciones farmacéuticos de la presente invención se pueden usar para tratar y/o prevenir cánceres, y/o la prevención de su recaída posoperatoria en sujetos o pacientes que incluyen ser humano y cualquier otro mamífero incluyendo, pero no limitado a, ratón, rata, cobaya, conejo, gato, perro, oveja, cabra, cerdo, vaca, caballo, mono, babuino y chimpancé, particularmente un animal comercialmente importante o un animal domesticado.
En otra realización, la presente divulgación también proporciona el uso de un ingrediente activo seleccionado de entre:
(a) un péptido de la presente invención;
(b) un ácido nucleico que codifica un péptido tal como el divulgado en la presente en una forma expresable;
(c) una APC o un exosoma que presenta un péptido de la presente invención sobre su superficie; y
(d) una célula T citotóxica de la presente invención
para fabricar una composición o un agente farmacéuticos para tratar o prevenir un cáncer o un tumor.
Alternativamente, la presente invención proporciona un ingrediente activo seleccionado de entre:
(a) un péptido de la presente invención;
(b) un ácido nucleico que codifica un péptido tal como el divulgado en la presente en forma expresable;
(c) una APC o un exosoma que presenta un péptido de la presente invención sobre su superficie; y
(d) una célula T citotóxica de la presente invención
para el uso en el tratamiento o la prevención de un cáncer o tumor.
Alternativamente, la presente divulgación proporciona además un método o procedimiento para fabricar una composición o un agente farmacéuticos para tratar o prevenir un cáncer o tumor, en donde el método o procedimiento incluye la etapa de formular un portador farmacéutica o fisiológicamente aceptable con un ingrediente activo seleccionado de entre:
(a) un péptido de la presente invención;
(b) un ácido nucleico que codifica un péptido tal como el divulgado en la presente en una forma expresable;
(c) una APC o un exosoma que presenta un péptido de la presente invención sobre su superficie; y
(d) una célula T citotóxica de la presente invención
como ingrediente activos.
En otra realización, la presente divulgación también proporciona un método o procedimiento para fabricar una composición o un agente farmacéutico para tratar o prevenir un cáncer o tumor, en donde el método o procedimiento incluye las etapas de mezclar un ingrediente activo con un portador farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable, en donde el ingrediente activo se selecciona de entre:
(a) un péptido de la presente invención;
(b) un ácido nucleico que codifica un péptido tal como el divulgado en la presente en una forma expresable;
(c) una APC o un exosoma que presenta un péptido de la presente invención sobre su superficie; y
(d) una célula T citotóxica de la presente invención.
Según la presente invención, se ha encontrado que un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 son péptidos epitópicos restringidos a HLA-A24 o los candidatos que pueden inducir una respuesta inmunitaria potente y específica. Por lo tanto, los presentes agentes o composiciones farmacéuticos que incluyen cualquiera de estos péptidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ Id NO: 3 son particularmente adecuados para la administración a sujetos cuyo antígeno HLA es HLA-A24. También se ha encontrado que el péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 son péptidos epitópicos restringidos a HLA-A2.
Por lo tanto, los agentes o composiciones farmacéuticos que incluyen un péptido con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 también son adecuados para la administración a sujetos cuyo antígeno HLA es HLA-A2, además de sujetos cuyo antígeno HLA es HLA-A24. Lo mismo se aplica a agentes o composiciones farmacéuticos que contienen polinucleótidos que codifican cualquiera de estos péptidos (es decir, los polinucleótidos de la presente invención).
Los cánceres que se van a tratar mediante los agentes o composiciones farmacéuticos de la presente invención no están limitados e incluyen cualquier cáncer en el que esté implicado (p. ej., se sobreexpresa) CDC45L, incluyendo, por ejemplo, tumor testicular, cáncer pancreático, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de mama, cáncer esofágico, cáncer de próstata, leucemia mieloide crónica (CML), tumor de tejido blandos, cáncer gástrico, cáncer hepatobiliar y cáncer colorrectal.
Los presentes agentes o composiciones farmacéuticos pueden contener, además de los susodichos ingredientes activos, otros péptidos que tienen la capacidad para inducir CTLs contra células cancerosas, otros polinucleótidos que codifican los otros péptidos, otras células que presentan los otros péptidos, o similares. En la presente, los otros péptidos que tienen la capacidad para inducir CTLs contra células cancerosas se ejemplifican por antígenos específicos del cáncer (p. ej., TAAs identificados), pero no se limitan a estos.
Si es necesario, los agentes o composiciones farmacéuticos de la presente invención pueden incluir opcionalmente otras sustancias terapéuticas como un ingrediente activo, con la condición de la sustancia no inhiba el efecto antitumoral del ingrediente activo, p. ej., cualquiera de los presentes péptidos. Por ejemplo, las formulaciones pueden incluir agentes o composiciones antiinflamatorios, analgésicos, agentes quimioterapéuticos y similares. Además de otras sustancias terapéuticas en el propio medicamento, los medicamentos de la presente invención también se pueden administrar secuencialmente o simultáneamente con el otro o más agentes o composiciones farmacológicos. La cantidad de medicamento y agente o composición farmacológico depende, por ejemplo, de qué tipo de agente o agentes o composición o composiciones farmacológicos se usen, la enfermedad que se trate y la planificación y las vías de administración.
Se debe entender que además de los ingredientes mencionados particularmente en la presente, los agentes o composiciones farmacéuticos de la presente invención pueden incluir otros agentes o composiciones convencionales en la especialidad teniendo en cuenta el tipo de formulación en cuestión.
En una realización de la presente invención, los presentes agentes o composiciones farmacéuticos se pueden incluir en artículos de fabricación y estuches que contienen materiales útiles para tratar las afecciones patológicas de la enfermedad que se vaya a tratar, p. ej., cáncer.
El artículo de fabricación puede incluir un recipiente de cualquiera de las sustancias o composiciones farmacéuticas presentes con una etiqueta. Recipientes adecuados incluyen botellas, viales y tubos de ensayo. Los recipientes pueden estar formados por una variedad de materiales, tales como vidrio o plástico. La etiqueta en el recipiente debe indicar la sustancia o composición que se usa para el tratamiento o la prevención de una o más afecciones de la enfermedad. La etiqueta también puede indicar directrices para la administración, etc.
Además del recipiente descrito anteriormente, un estuche que incluye un agente o composición farmacéuticos de la presente invención puede incluir además opcionalmente un segundo recipiente que contiene un diluyente farmacéuticamente aceptable. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos con instrucciones de uso.
Si se desea, las composiciones farmacéuticas se pueden presentar en un envase o dispositivo dosificador que puede contener una o más formas de dosificación que contienen el ingrediente activo. El envase puede incluir, por ejemplo, una lámina de metal o plástico, tal como un blíster. El envase o dispositivo dosificador puede estar acompañado por instrucciones para la administración.
(1) Agentes o composiciones farmacéuticos que contienen los péptidos como el ingrediente activo
Los péptidos de la presente invención se pueden administrar directamente como un agente o composición farmacéuticos, o, si es necesario, formulados mediante métodos de formulación convencionales. En el último caso, además de los péptidos de la presente invención, se pueden incluir portadores, excipientes y similares que se usan normalmente para fármacos, según sea apropiado, sin limitaciones particulares. Ejemplos de estos portadores son agua esterilizada, solución salina fisiológica, tampón de fosfato, fluido de cultivo y similares. Por otra parte, los agentes o composiciones farmacéuticos pueden contener, según sea necesario, estabilizantes, suspensiones, conservantes, tensioactivos y similares. Los agentes o composiciones farmacéuticos de la presente invención se pueden usar con propósitos anticancerosos.
Los péptidos de la presente invención se pueden preparar como una combinación compuesta por dos o más de los péptidos de la presente invención, para inducir CTL in vivo. La combinación de péptidos puede tomar la forma de un cóctel o pueden conjugarse entre sí usando técnicas estándar. Por ejemplo, los péptidos se pueden conectar químicamente o expresar como una sola secuencia de polipéptido de fusión que puede tener uno o varios aminoácidos como un conector (p. ej., Lysine linker: K. S. Kawamura y cols. J. Immunol. 2002, 168: 5709-5715). Los péptidos de la combinación pueden ser iguales o diferentes. Al administrar los péptidos de la presente invención, los péptidos son presentados en alta densidad por los antígenos HLA sobre APCs, a continuación se inducen CTLs que reaccionan específicamente hacia el complejo formado entre el péptido exhibido y el antígeno HLA. Alternativamente, APCs (p. ej., DCs) se retiran de los sujetos y a continuación se estimulan mediante los péptidos de la presente invención para obtener APCs que presentan cualquiera de los péptidos de la presente invención sobre su superficie celular. Estas APCs se readministran a los sujetos para inducir CTLs en los sujetos y, como resultado, se puede incrementar la agresividad hacia el endotelio asociado al tumor.
Los agentes o composiciones farmacéuticos para el tratamiento y/o la prevención del cáncer que contienen como un ingrediente activo un péptido de la presente invención también pueden incluir un adyuvante conocido por establecer eficazmente inmunidad celular. Alternativamente, las sustancias farmacéuticas o la composición se pueden administrar con otros ingrediente activos, y se pueden administrar mediante la formulación en gránulos. Un adyuvante se refiere a cualquier compuesto, sustancia o composición que potencie la respuesta inmunitaria contra la proteína cuando se administre junto (o sucesivamente) con la proteína que tiene actividad inmunológica. Adyuvantes contemplados en la presente incluyen los descritos en la bibliografía (Clin Microbiol Rev 1994, 7: 277-89). Ejemplos de adyuvantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, alumbre, toxina del cólera, toxina de la salmonella, adyuvante incompleto de Freund (IFA), adyuvante completo de Freund (CFA), ISCOMatrix, GM-CSF, CpG, una emulsión de aceite en agua, y similares, pero no se limitan a estos.
Por otra parte, se pueden usar convenientemente formulaciones liposómicas, formulaciones granulares en las que el péptido está unido a cuentas de unos pocos micrómetros de diámetro y formulaciones en las que un lípido está unido al péptido.
En otra realización de la presente invención, los péptidos de la presente invención también se pueden administrar en la forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de sales preferidas incluyen sales con un metal alcalino, sales con un metal, sales con una base orgánica, sales con un ácido orgánico y sales con un ácido inorgánico.
En algunas realizaciones, los agentes o composiciones farmacéuticos de la presente invención pueden incluir además un componente que cebe CTL. Los lípidos se han identificado como agentes o composiciones capaces de cebar CTL in vivo contra antígenos virales. Por ejemplo, los residuos de ácido palmítico se pueden ligar a los grupos amino épsilon y alfa de un residuo de lisina y a continuación conectarse a un péptido de la presente invención.
A continuación, el péptido lipidado se puede administrar bien directamente en una micela o partícula, bien incorporado en un liposoma o bien emulsionado en un adyuvante. Como otro ejemplo de lípido cebador de respuestas de CTL, lipoproteínas de E. coli, tales como tripalmitoil-S-glicerilcisteinil-seril-serina (P3CSS), se pueden usar para cebar CTL cuando estén ligadas covalentemente a un péptido apropiado (véase, p. ej., Deres y cols., Nature 1989, 342: 561-4).
El método de administración puede ser oral, inyección intradérmica, subcutánea, intravenosa, o similares, y administración sistémica o administración local a la proximidad de las zonas elegidas. La administración se puede realizar mediante una sola administración o reforzada por múltiples administraciones. La dosis de los péptidos de la presente invención se puede ajustar apropiadamente según la enfermedad que se vaya a tratar, la edad del paciente, el peso, el método de administración y similares, y es normalmente de 0,001 mg a 1.000 mg, por ejemplo, de 0,001 mg a 1.000 mg, por ejemplo, de 0,1 mg a 10 mg, y se puede administrar una vez en de unos pocos días a unos pocos meses. Un experto en la especialidad puede seleccionar apropiadamente una dosis adecuada.
(2) Agentes o composiciones farmacéuticos que contienen polinucleótidos como ingrediente activo
Los agentes o composiciones farmacéuticos de la presente invención pueden contener ácidos nucleicos que codifican el péptido o los péptidos divulgados en la presente en una forma expresable. En la presente, la expresión "en una forma expresable" significa que el polinucleótido, cuando se introduce en una célula, se expresará in vivo como un polipéptido que induce inmunidad antitumoral. En una realización ejemplificada, la secuencia de ácido nucleico del polinucleótido de interés incluye elementos reguladores necesarios para la expresión del polinucleótido. El polinucleótido o los polinucleótidos pueden estar equipados a fin de alcanzar una inserción estable en el genoma de la célula diana (véase, p. ej., Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12 para una descripción de vectores de casetes de recombinación homólogos. Véase además, p. ej., Wolff y cols., Science 1990, 247: 1465-8; las Patentes de EE. UU. N° 5.580.859, 5.589.466, 5.804.566, 5.739.118, 5.736.524, 5.679.647 y el documento WO 98/04720). Ejemplos de tecnologías de aporte basadas en ADN incluyen "ADN desnudo", aporte facilitado (bupivacaína, polímeros, mediado por péptidos), complejos lipídicos catiónicos y aporte mediado por partículas ("pistola génica") o mediado por presión (véase, p. ej., la Patente de EE. UU. N° 5.922.687).
Los péptidos de la presente invención también pueden ser expresados por vectores virales o bacterianos. Ejemplos de vectores de expresión incluyen hospedadores virales atenuados, tales como variolovacuna o viruela aviar. Este enfoque implica el uso de virus variolovacunal, p. ej., como un vector para expresar secuencias nucleotídicas que codifican el péptido. Tras la introducción en un hospedador, el virus variolovacunal recombinante expresa el péptido inmunogénico, y de ese modo provoca una respuesta inmunitaria. Vectores variolovacunales y métodos útiles en protocolos de inmunización se describen, p. ej., en la Patente de EE. UU. N° 4.722.848. Otro vector es BCG (bacilo Calmette Guerin). Vectores de BCG se describen en Stover y cols., Nature 1991, 351: 456-60. Será evidente una amplia variedad de otros vectores útiles para administración terapéutica o inmunización, p. ej., vectores de adenovirus y virus adenoasociados, vectores retrovirales, vectores de Salmonella typhi, vectores de toxina del carbunco destoxificada, y similares. Véanse, p. ej., Shata y cols., Mol Med Today 2000, 6: 66-71; Shedlock y cols., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806; Hipp y cols., In Vivo 2000, 14: 571-85.
El aporte de un polinucleótido a un paciente puede ser bien directo, en donde el paciente es expuesto directamente a un vector que soporta polinucleótido, o bien indirecto, en donde las células se transforman en primer lugar con el polinucleótido de interés in vitro, a continuación las células se trasplantan al paciente. Estos dos enfoques se conocen, respectivamente, como terapias génicas in vivo y ex vivo.
Para revisiones generales de los métodos de terapia génica, véanse Goldspiel y cols., Clinical Pharmacy 1993, 12: 488-505; Wu y Wu, Biotherapy 1991, 3: 87-95; Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993, 33: 573-96; Mulligan, Science 1993, 260: 926-32; Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993, 62: 191-217; Trends in Biotechnology 1993, 11(5): 155-215). También se pueden usar para la presente invención métodos comúnmente conocidos en la especialidad de la tecnología de ADN recombinante. Véanse, por ejemplo, Ausubel y cols., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1993; y Krieger, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, Ny , 1990.
El método de administración puede ser oral, inyección intradérmica, subcutánea, intravenosa, o similares, y encuentran uso la administración sistémica o la administración local a la proximidad de las zonas elegidas. La administración se puede realizar mediante una sola administración o reforzada mediante múltiples administraciones. La dosis del polinucleótido en el portador adecuado o las células transformadas con el polinucleótido que codifica los péptidos de la presente invención se puede ajustar apropiadamente según la enfermedad que se vaya a tratar, la edad del paciente, el peso, el método de administración y similares, y normalmente es de 0,001 mg a 1000 mg, por ejemplo, de 0,001 mg a 1000 mg, por ejemplo, de 0,1 mg a 10 mg, y se puede administrar de una vez cada pocos días a una vez cada pocos meses. Un experto en la especialidad puede seleccionar apropiadamente la dosis adecuada.
X. Métodos que usan los péptidos, exosomas, APCs y CTLs
Los péptidos y polinucleótidos de la presente invención se pueden usar para preparar o inducir APCs y CTLs. Los exosomas y las APCs de la presente invención también se pueden usar para inducir CTLs. Los péptidos, polinucleótidos, exosomas y APCs se pueden usar en combinación con cualesquiera otros compuestos con la condición de que los compuestos no inhiban su inducibilidad de CTL. Así, cualquiera de los susodichos agentes o composiciones farmacéuticos de la presente invención se pueden usar para inducir CTLs y, además de eso, los que incluyen los péptidos y polinucleótidos también se pueden usar para inducir APCs según se analiza con mayor detalle posteriormente.
(1) Método para inducir células que presentan antígenos (APCs)
La presente invención proporciona métodos para inducir APCs con alta inducibilidad de CTL usando los péptidos o polinucleótidos de la presente invención.
Los métodos de la presente invención incluyen la etapa de poner en contacto APCs con los péptidos de la presente invención in vitro, ex vivo o in vivo. Por ejemplo, el método de poner en contacto APCs con los péptidos ex vivo o in vitro puede incluir las etapas de:
a: recoger APCs de un sujeto, y
b: poner en contacto las APCs de la etapa a con el péptido.
Las APCs no se limitan a un tipo particular de células e incluyen DCs, células de Langerhans, macrófagos, células B y células T activadas, que se sabe que presentan antígenos proteínicos sobre su superficie celular de modo que puedan ser reconocidas por linfocitos. Preferiblemente, se pueden usar DCs ya que tienen la inducibilidad de CTL más fuerte entre las APCs. Cualesquiera péptidos de la presente invención se pueden usar por sí mismos o con otros péptidos de la presente invención.
Por otra parte, cuando los péptidos de la presente invención se administran a un sujeto, las APCs se ponen en contacto con los péptidos in vivo, por consiguiente, las APCs con alta inducibilidad de CTL se inducen en el cuerpo del sujeto. Así, la presente invención incluye administrar los péptidos de la presente invención a un sujeto. De forma similar, cuando los polinucleótidos de la presente invención se administran a un sujeto en una forma expresable, los péptidos de la presente invención se expresan y se ponen en contacto con APCs in vivo, por consiguiente, las APCs con alta inducibilidad de CTL se inducen en el cuerpo del sujeto. Así, la presente invención también puede incluir administrar los polinucleótidos de la presente invención a un sujeto. "Forma expresable" se describe anteriormente en la sección "IX. Agentes o composiciones farmacéuticos, (2) Agentes o composiciones farmacéuticos que contienen polinucleótidos como el ingrediente activo".
La presente invención también puede incluir la etapa de introducir el polinucleótido de la presente invención en una APCs a fin de inducir APCs con inducibilidad de c Tl . Un ejemplo ilustrativo de este método puede incluir las etapas de:
a: recoger APCs de un sujeto, y
b: introducir un polinucleótido que codifica el péptido de la presente invención.
La etapa b se puede realizar según se describe anteriormente en la sección "VI. Células que presentan antígenos".
Alternativamente, la presente invención proporciona un método para preparar una célula que presenta antígenos (APC) que induce específicamente actividad de CTL contra CDC45L, en donde el método puede incluir una de las siguientes etapas:
poner en contacto una APC con un péptido de la presente invención in vitro, ex vivo o in vivo; y
(b) introducir un polinucleótido que codifica un péptido de la presente invención en una APC.
(2) Método para inducir CTLs
Por otra parte, la presente invención proporciona métodos para inducir CTLs usando los péptidos, polinucleótidos, exosomas o APCs de la presente invención.
La presente invención también proporciona métodos para inducir CTLs usando un polinucleótido que codifica un polipéptido que es capaz de formar una subunidad de receptor de células T (TCR) que reconoce un complejo de los péptidos de la presente invención y antígenos HLA. Preferiblemente, los métodos para inducir CTLs pueden incluir al menos una etapa seleccionada del grupo que consiste en:
a) poner en contacto una célula T positiva a CD8 con una célula que presenta antígenos y/o un exosoma que presenta sobre su superficie un complejo de un antígeno HLA y un péptido de la presente invención; y
b) introducir un polinucleótido que codifica un polipéptido que es capaz de formar una subunidad de TCR que reconoce un complejo de un péptido de la presente invención y un antígeno HLA en una célula positiva a CD8.
Cuando los péptidos, los polinucleótidos, las APCs o los exosomas de la presente invención se administran a un sujeto, se inducen CTLs en el cuerpo del sujeto, y se potencia la fuerza de la respuesta inmunitaria que se orienta a las células cancerosas. Así, los métodos de la presente invención incluyen la etapa de administrar a un sujeto los péptidos, los polinucleótidos, las APCs o los exosomas de la presente invención.
Alternativamente, los CTLs también se pueden inducir al usarlos ex vivo o in vitro, y después de inducir CTL, los CTLs activados se pueden devolver al sujeto. Por ejemplo, el método puede incluir las etapas de:
a: recoger APCs de un sujeto;
b: poner en contacto con las APCs de etapa a, con el péptido; y
c: cocultivar las APCs de la etapa b con células positivas a CD8.
Las APCs que se van a cocultivar con las células positivas a CD8 en la etapa c anterior también se pueden preparar al transferir un gen que incluye un polinucleótido de la presente invención en APCs como las descritas anteriormente en la sección "VI. Células que presentan antígenos", aunque la presente invención no se limita a estas, y por lo tanto pueden abarcar cualesquiera APCs que presenten eficazmente sobre su superficie un complejo de un antígeno HLA y un péptido de la presente invención.
En lugar de estas APCs, también se pueden usar los exosomas que presentan sobre su superficie un complejo de un antígeno HLA y el péptido de la presente invención. A saber, la presente invención puede incluir la etapa de cocultivar exosomas que presentan sobre su superficie un complejo de un antígeno HLA y el péptido de la presente invención. Estos exosomas se pueden preparar mediante los métodos descritos anteriormente en la sección "V. Exosomas".
Por otra parte, los CTL se pueden inducir al introducir un gen que incluye un polinucleótido que codifica la subunidad de TCR que se une al péptido de la presente invención en células positivas a CD8. Esta transducción se puede realizar según se describe anteriormente en la sección "VIII. Receptor de células T (TCR)".
Además, la presente invención proporciona un método o procedimiento para fabricar una sustancia o composición farmacéutica que induce CTLs, en donde el método incluye la etapa de mezclar o formular el péptido de la presente invención con un portador farmacéuticamente aceptable.
(3) Método para inducir una respuesta inmunitaria
Por otra parte, la presente invención proporciona métodos para inducir una respuesta inmunitaria contra enfermedades relacionadas con CDC45L. Enfermedades adecuadas incluyen cáncer, ejemplos del cual incluyen, pero no se limitan a, tumor testicular, cáncer pancreático, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de mama, cáncer esofágico, cáncer de próstata, leucemia mieloide crónica (CML), tumor de tejido blandos, cáncer gástrico, cáncer hepatobiliar y cáncer colorrectal.
Los métodos de la presente invención pueden incluir la etapa de administrar un agente o agentes o una composición o composiciones que contienen cualquiera de los péptidos de la presente invención o polinucleótidos que los codifican. Los métodos de la invención también contemplan la administración de exosomas o APCs que presentan cualquiera de los péptidos de la presente invención. Para detalles, véase el punto de "IX. Agentes o composiciones farmacéuticos", particularmente la parte que describe el uso de los agentes o composiciones farmacéuticos de la presente invención como vacunas. Además, los exosomas y las APCs que se pueden emplear para los presentes métodos para inducir una respuesta inmunitaria se describen con detalle bajo los puntos de "V. Exosomas", "VI. Células que presentan antígenos (APCs)", y (1) y (2) de "X. Métodos que usan los péptidos, exosomas, APCs y CTLs", anteriormente.
La presente invención también proporciona un método o procedimiento para fabricar un agente o composición farmacéuticos que inducen una respuesta inmunitaria, en donde el método puede incluir la etapa de mezclar o formular el péptido de la presente invención con un portador farmacéuticamente aceptable.
Alternativamente, el método de la presente invención puede incluir la etapa de administrar una vacuna o un agente o composición farmacéuticos, que contiene:
(a) un péptido de la presente invención;
(b) un ácido nucleico que codifica un péptido tal como el divulgado en la presente en una forma expresable;
(c) una APC o un exosoma que presenta un péptido de la presente invención sobre su superficie; o
(d) una célula T citotóxica de la presente invención.
En el contexto de la presente invención, un cáncer que sobreexpresa CDC45L se puede tratar con estos ingredientes activos. Ejemplos de estos cánceres incluyen, pero no se limitan a, tumor testicular, cáncer pancreático, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de mama, cáncer esofágico, cáncer de próstata, leucemia mieloide crónica (CML), tumor de tejido blandos, cáncer gástrico, cáncer hepatobiliar y cáncer colorrectal. Según esto, antes de la administración de las vacunas o los agentes o las composiciones farmacéuticos que incluyen los ingredientes activos, es preferible confirmar si el nivel de expresión de CDC45L en las células o los tejidos que se van a tratar se potencia en comparación con células normales del mismo órgano. Así, en una realización, la presente invención proporciona un método para tratar un cáncer que (sobre)expresa CDC45L, método que puede incluir las etapas de:
i) determinar el nivel de expresión de CDC45L en células o tejido o tejidos obtenidos de un sujeto con el cáncer que se va a tratar;
ii) comparar el nivel de expresión de CDC45L con un nivel de control normal; y
iii) administrar al menos un componente seleccionado del grupo que consiste en (a) a (d) descritos anteriormente a un sujeto con un cáncer que sobreexpresa CDC45L en comparación con un control normal.
Alternativamente, la presente invención puede proporcionar una vacuna o un agente o composición farmacéuticos que incluyen al menos un componente seleccionado del grupo que consiste en (a) a (d) descritos anteriormente, para el uso en la administración a un sujeto que tiene un cáncer que sobreexpresa CDC45L. En otras palabras, la presente invención proporciona además un método para identificar a un sujeto que se va a tratar con un polipéptido CDC45L de la presente invención, incluyendo este método la etapa de determinar un nivel de expresión de c Dc 45L en células o tejido o tejidos derivados del sujeto, en donde un incremento del nivel en comparación con un nivel de control normal del gen indica que el sujeto puede tener un cáncer que puede ser tratado con el polipéptido CDC45L de la presente invención. Métodos para tratar un cáncer de la presente invención se describen con más detalle posteriormente.
Cualquier célula o tejido derivados del sujeto se pueden usar para la determinación de la expresión de CDC45L con la condición de que incluya el producto de transcripción o traducción buscado de CDC45L. Ejemplos de muestras adecuadas incluyen, pero no se limitan a, tejidos y fluidos corporales, tales como sangre, esputos y orina. Preferiblemente, la muestra de células o tejido derivada del sujeto contienen una población celular que incluye una célula epitelial, más preferiblemente una célula epitelial cancerosa o una célula epitelial derivada de tejido que se sospecha que es canceroso. Además, si es necesario, la célula se puede purificar a partir de los tejidos y fluidos corporales obtenidos, y a continuación usarse como la muestra derivada del sujeto.
En el contexto de la presente invención, un nivel de control determinado a partir de una muestra biológica que se sabe que no es cancerosa se denomina un "nivel de control normal". Por otra parte, si el nivel de control se determina a partir de una muestra biológica cancerosa, se denomina un "nivel de control canceroso". La diferencia entre un nivel de expresión de muestra y un nivel de control se puede normalizar a nivel de expresión de ácidos nucleicos de control, p. ej., genes constitutivos, cuyos niveles de expresión se sabe que no difieren dependiendo del estado canceroso o no canceroso de la célula. Genes de control ejemplares incluyen, pero no se limitan a, beta-actina, gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa y proteína ribosómica P i.
Un sujeto que va a ser tratado mediante el presente método es preferiblemente un mamífero. Mamíferos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, p. ej., ser humano, primate no humano, ratón, rata, perro, gato, caballo y vaca.
Según la presente invención, se puede determinar el nivel de expresión de CDC45L en células o tejidos obtenidos de un sujeto. El nivel del expresión se puede determinar a nivel del producto de transcripción (ácido nucleico), usando métodos conocidos en la especialidad. Por ejemplo, el ARNm de CDC45L se puede cuantificar usando sondas mediante métodos de hibridación (p. ej., hibridación Northern). La detección se puede llevar a cabo en un chip, una micromatriz o similares. El uso de una micromatriz puede ser preferible para detectar el nivel de expresión de CDC45L. Los expertos en la especialidad pueden preparar estas sondas utilizando la información de secuencia de CDC45L. Por ejemplo, el ADNc de CDC45L se puede usar como las sondas. Si es necesario, las sondas se pueden marcar con un marcador adecuado, tal como colorantes, sustancias fluorescentes e isótopos, y el nivel de expresión del gen se puede detectar como la intensidad de los marcadores hibridados.
Por otra parte, el producto de transcripción de CDC45L (p. ej., SEQ ID NO: 17) se puede cuantificar usando cebadores mediante métodos de detección basados en la amplificación (p. ej., RT-PCR). Estos cebadores se pueden preparar basándose en la información de secuencia disponible del gen.
Específicamente, una sonda o un cebador usados para el presente método se hibrida bajo condiciones rigurosas, moderadamente rigurosas o poco rigurosas al ARNm de CDC45L. Según se usa en la presente, la expresión "condiciones (de hibridación) rigurosas" se refiere a condiciones bajo las que una sonda o un cebador se hibridará a su secuencia diana, pero no a otras secuencias. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y serán diferentes bajo circunstancias diferentes. La hibridación específica de secuencias más largas se observa a temperaturas superiores que para secuencias más cortas. Generalmente, la temperatura de una condición rigurosa se selecciona para que sea aproximadamente 5 grados C inferior que el punto de fusión térmica (Tm) para una secuencia específica a una fuerza iónica y un pH definidos. El Tm es la temperatura (bajo una fuerza iónica, un pH y una concentración de ácido nucleico definidos) a la que 50% de las sondas complementarias a su secuencia diana se hibridan a la secuencia diana en equilibrio. Puesto que las secuencias diana generalmente están presentes en exceso, a Tm, 50% de las sondas están ocupadas en equilibrio. Típicamente, condiciones rigurosas serán aquellas en las que la concentración de sal sea menor de aproximadamente 1,0 M de ion sodio, típicamente aproximadamente de 0,01 a 1,0 M de ion sodio (u otras sales) a pH de 7,0 a 8,3 y la temperatura es al menos aproximadamente 30 grados C para sondas o cebadores cortos (p. ej., de 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60 grados C para sondas o cebadores más largos. Las condiciones rigurosas también se pueden alcanzar con la adición de sustancias desestabilizantes, tales como formamida.
Alternativamente, el producto de traducción se puede detectar para el diagnóstico de la presente invención. Por ejemplo, se puede determinar la cantidad de proteína CDC45L (SEQ ID NO: 18) o su fragmento inmunológico. Métodos para determinar la cantidad de la proteína como el producto de traducción incluyen métodos de inmunoensayo que usan un anticuerpo que reconoce específicamente la proteína. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. Por otra parte, se puede usar cualquier fragmento o modificación (p. ej., anticuerpo quimérico, scFv, Fab, F(ab')2, Fv, etc.) del anticuerpo para la detección, con la condición de que el fragmento o anticuerpo modificado retenga la capacidad de unión a la proteína CDC45L. Estos anticuerpos contra los péptidos de la presente invención y sus fragmentos también son proporcionados por la presente invención.
Como otro método para detectar el nivel de expresión del gen CDC45L basado en su producto de traducción, se puede medir la intensidad de tinción a través de análisis inmunohistoquímico usando un anticuerpo contra la proteína CDC45L. A saber, en esta medida, una tinción fuerte indica un incremento en la presencia/el nivel de la proteína y, al mismo tiempo, un alto nivel de expresión del gen CDC45L.
Se puede determinar que el nivel de expresión de un gen diana, p. ej., el gen CDC45L, en células cancerosas se incrementa si el nivel se incrementa desde el nivel de control (p. ej., el nivel en células normales) del gen diana en, por ejemplo, 10%, 25% o 50%; o se incrementa hasta más de 1,1 veces, más de 1,5 veces, más de 2,0 veces, más de 5,0 veces, más de 10,0 veces, o más.
El nivel de control se puede determinar al mismo tiempo que las células cancerosas, al usar una muestra o muestras previamente recogidas y almacenadas de un sujeto o sujetos cuyo estado o estados patológicos (cancerosos o no cancerosos) se conocen. Además, células normales obtenidas de regiones no cancerosas de un órgano que tiene el cáncer que se va a tratar se pueden usar como control normal. Alternativamente, el nivel de control se puede determinar mediante un método estadístico basado en los resultados obtenidos al analizar un nivel o niveles de expresión de gen CDC45L previamente determinados en muestras procedentes de sujetos cuyos estados patológicos se conocen. Por otra parte, el nivel de control se puede derivar de una base de datos de patrones de expresión procedentes de células previamente probadas. Por otra parte, según un aspecto de la presente invención, el nivel de expresión de gen CDC45L en una muestra biológica se puede comparar con múltiples niveles de control determinados a partir de múltiples muestras de referencia. Se prefiere usar un nivel de control determinado a partir de una muestra de referencia derivada de un tipo de tejido similar al de la muestra biológica derivada del sujeto. Por otra parte, se prefiere usar el valor estándar de los niveles de expresión de gen CDC45L en una población con el estado patológico conocido. El valor estándar se puede obtener mediante cualquier método conocido en la especialidad. Por ejemplo, un intervalo de media /- 2 S.D. o media /- 3 S.D. se puede usar como el valor estándar.
Cuando el nivel de expresión de gen CDC45L se incrementa en comparación con el nivel de control normal, o es similar/equivalente al nivel de control canceroso, el sujeto puede ser diagnosticado del cáncer que se va a tratar. La presente divulgación también proporciona un método para (i) diagnosticar si un sujeto que se sospecha que tiene cáncer que se va a tratar, y/o (ii) seleccionar a un sujeto para el tratamiento de cáncer, método que puede incluir las etapas de:
a) determinar el nivel de expresión de CDC45L en células o tejido o tejidos obtenidos de un sujeto que se sospecha que tiene el cáncer que se va a tratar;
b) comparar el nivel de expresión de CDC45L con un nivel de control normal;
c) diagnosticar que el sujeto tiene el cáncer que se va a tratar, si el nivel de expresión de CDC45L se incrementa en comparación con el nivel de control normal; y
d) seleccionar al sujeto para el tratamiento del cáncer, si se diagnostica que el sujeto tiene el cáncer que se va a tratar, en la etapa c).
Alternativamente, este método puede incluir las etapas de:
a) determinar el nivel de expresión de CDC45L en células o un tejido o tejidos obtenidos a partir de un sujeto que se sospecha que tiene el cáncer que se va a tratar;
b) comparar el nivel de expresión de CDC45L con un nivel de control canceroso;
c) diagnosticar que el sujeto tiene el cáncer que se va a tratar, si el nivel de expresión de CDC45L es similar o equivalente al nivel de control canceroso; y
d) seleccionar al sujeto para el tratamiento del cáncer, si se diagnostica que el sujeto tiene el cáncer que se va a tratar, en la etapa c).
La presente invención también proporciona un estuche de diagnóstico para diagnosticar o determinar a un sujeto que se sospecha que sufre cáncer que se puede tratar con el polipéptido CDC45L de la presente invención, que también puede encontrar uso en la evaluación del pronóstico de un cáncer y/o comprobar la eficacia o la aplicabilidad de una terapia contra el cáncer particular, más particularmente una inmunoterapia contra el cáncer. Ejemplos ilustrativos de cánceres adecuados incluyen, pero no se limitan a, tumor testicular, cáncer pancreático, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de mama, cáncer esofágico, cáncer de próstata, leucemia mieloide crónica (CML), tumor de tejido blandos, cáncer gástrico, cáncer hepatobiliar y cáncer colorrectal. Más particularmente, el estuche puede incluir preferiblemente al menos un reactivo para detectar la expresión del gen CDC45L en una célula derivada de un sujeto, seleccionándose este reactivo del grupo de:
(a) un reactivo para detectar ARNm del gen CDC45L;
(b) un reactivo para detectar la proteína CDC45L o su fragmento inmunológico; y
(c) un reactivo para detectar la actividad biológica de la proteína CDC45L.
Ejemplos de reactivos adecuados para detectar ARNm del gen CDC45L pueden incluir ácidos nucleicos que se unen específicamente a o identifican el ARNm de CDC45L, tales como oligonucleótidos que tienen un secuencia complementaria a una porción del ARNm de CDC45L. Estos tipos de oligonucleótidos son ejemplificados por cebadores y sondas que son específicos para el ARNm de CDC45L. Estos tipos de oligonucleótidos se pueden preparar basándose en métodos muy conocidos en la especialidad. Si fuera necesario, el reactivo para detectar el ARNm de CDC45L se puede inmovilizar sobre una matriz sólida. Por otra parte, se puede incluir en el estuche más de un reactivo para detectar el ARNm de CDC45L.
Por otra parte, ejemplos de reactivos adecuados para detectar la proteína CDC45L o su fragmento inmunológico pueden incluir anticuerpos para la proteína CDC45L o su fragmento inmunológico. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. Por otra parte, cualquier fragmento o modificación (p. ej., anticuerpo quimérico, scFv, Fab, F(ab')2, Fv, etc.) del anticuerpo se puede usar como el reactivo, con la condición de que el fragmento o el anticuerpo modificado retenga la capacidad de unión a la proteína CDC45L o su fragmento inmunológico. Métodos para preparar estos tipos de anticuerpos para la detección de proteínas se conocen en la especialidad, y cualquier método se puede emplear en la presente invención para preparar estos anticuerpos y sus equivalentes. Por otra parte, el anticuerpo se puede marcar con moléculas generadoras de señales a través de conexión directa o una técnica de marcaje indirecto. Los marcadores y los métodos para marcar anticuerpos y detectar la unión de los anticuerpos a sus dianas son muy conocidos en la especialidad, y cualesquiera marcadores y métodos se pueden emplear para la presente invención. Por otra parte, se puede incluir en el ensayo más de un reactivo para detectar la proteína CDC45L.
El estuche puede contener más de uno de los susodichos reactivos. El estuche puede incluir además una matriz sólida y un reactivo para la unión a una sonda contra un gen CDC45L o un anticuerpo contra un péptido CDC45L, un medio y un recipiente para cultivar células, reactivos de control positivo y negativo y un anticuerpo secundario para detectar un anticuerpo contra un péptido CDC45L. Por ejemplo, muestras de tejido obtenidos de sujetos sin cáncer o que sufren cáncer pueden servir como reactivos de control útiles. Un estuche de la presente invención puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos (p. ej., escritos, cinta, CD-ROM, etc.) con instrucciones de uso. Estos reactivos pueden estar contenidos en un recipiente con una etiqueta. Recipientes adecuados pueden incluir botellas, viales y tubos de ensayo. Estos recipientes pueden estar formados por una variedad de materiales, tales como vidrio o plástico.
Como una realización de la presente invención, cuando el reactivo es una sonda contra el ARNm de CDC45L, el reactivo puede estar inmovilizado sobre una matriz sólida, tal como una tira porosa, para formar al menos un sitio de detección. La región de medida o detección de la tira porosa puede incluir una pluralidad de sitios, conteniendo cada uno un ácido nucleico (sonda). Una tira de prueba también puede contener sitios para controles negativos y/o positivos. Alternativamente, los sitios de control pueden estar situados sobre una tira separada de la tira de prueba. Opcionalmente, los diferentes sitios de detección pueden contener diferentes cantidades de ácidos nucleicos inmovilizados, es decir, una cantidad superior en el primer sitio de detección y cantidades menores en sitios posteriores. Tras la adición de una muestra de prueba, el número de sitios que exhiben una señal detectable proporciona una indicación cuantitativa de la cantidad de ARNm de CDC45L presente en la muestra. Los sitios de detección se pueden configurar en cualquier conformación adecuadamente detectable y típicamente están en la conformación de una barra o punto que abarca la anchura de una tira de prueba.
El estuche de la presente invención puede incluir además una muestra de control positivo o una muestra estándar de CDC45L. La muestra de control positivo de la presente invención se puede preparar al recoger muestras positivas a CDC45L y a continuación ensayar sus niveles de CDC45L. Alternativamente, una proteína o polinucleótido CDC45L purificados se pueden añadir a células que no expresan CDC45L para formar la muestra positiva o la muestra estándar de CDC45L. En la presente invención, CDC45L purificado puede ser una proteína recombinante. El nivel de CDC45L de la muestra de control positivo es, por ejemplo, mayor que el valor de corte.
En una realización, la presente invención proporciona además un estuche de diagnóstico que incluye una proteína o una de sus proteínas parciales capaz de reconocer específicamente el anticuerpo de la presente invención o uno de sus fragmentos inmunogénicos.
Ejemplos de péptidos parciales y fragmentos inmunogénicos de proteínas de la presente invención contemplados en la presente incluyen polipéptidos compuestos por al menos 8, preferiblemente 15 y más preferiblemente 20 aminoácidos contiguos en la secuencia de aminoácidos de la proteína de la presente invención. El cáncer se puede diagnosticar al detectar un anticuerpo en una muestra (p. ej., sangre, tejido) usando una proteína o un péptido (polipéptido) de la presente invención. Métodos para preparar un péptido o una proteína de la presente invención son como los descritos anteriormente.
El método para diagnosticar el cáncer de la presente divulgación se puede realizar al determinar la diferencia entre la cantidad de anticuerpo anti-CDC45L y aquella en la muestra de control correspondiente según se describe anteriormente. Se sospecha que el sujeto sufre cáncer si las células o los tejidos del sujeto contienen anticuerpos contra los productos de expresión (CDC45L) del gen y se determina que la cantidad del anticuerpo anti-CDC45L es mayor en nivel que el valor de corte en comparación con la del control normal.
En otra realización, un estuche de diagnóstico de la presente invención puede incluir el péptido de la presente invención y una molécula de HLA que se une al mismo. Ya se ha establecido un método adecuado para detectar CTLs específicos de antígenos usando péptidos antigénicos y moléculas de HLA (por ejemplo, Altman JD y cols., Science.
1996, 274(5284): 94-6). Así, el complejo del péptido de la presente invención y la molécula de HLA se puede aplicar al método de detección para detectar CTLs específicos de antígenos tumorales, permitiendo de ese modo la detección temprana, la recaída o la y/o metástasis del cáncer. Además, se puede emplear para la selección de sujetos aplicables con los productos farmacéuticos que incluyen el péptido de la presente invención como un ingrediente activo, o la evaluación del efecto del tratamiento de los productos farmacéuticos.
Particularmente, según el método conocido (véase, por ejemplo, Altman JD y cols., Science. 1996, 274(5284): 94-6), se puede preparar el complejo oligomérico, tal como el tetrámero, de la molécula de HLA radiomarcada y el péptido de la presente invención. El complejo se puede usar para cuantificar los CTLs específicos de péptido antigénico en los linfocitos de sangre periférica derivados del sujeto que se sospecha que sufre cáncer.
La presente divulgación proporciona además métodos y agentes de diagnóstico para evaluar la respuesta inmunológica de un sujeto usando epítopos peptídicos como los descritos en la presente. En una realización de la invención, péptidos restringidos por HLA como los descritos en la presente se pueden usar como reactivos para evaluar o predecir una respuesta inmunitaria de un sujeto. La respuesta inmunitaria que se va a evaluar se puede inducir al poner en contacto un inmunógeno con células inmunocompetentes in vitro o in vivo. En ciertas realizaciones, las sustancias o composiciones empleadas como el reactivo pueden ser cualquier sustancia o composición que pueda dar como resultado la producción de CTLs específicos de antígeno que reconocen y se unen al epítopo o los epítopos peptídicos. Los reactivos peptídicos no necesitan ser usados como el inmunógeno. Sistemas de ensayo que se usan para este análisis incluyen desarrollos técnicos tales como tetrámeros, tinción con respecto a linfocinas intracelulares y ensayos de liberación de interferones o ensayos ELISPOT. En una realización preferida, las células inmunocompetentes que se van a poner en contacto con reactivo peptídico pueden ser células que presentan antígenos incluyendo células dendríticas.
Por ejemplo, los péptidos de la presente invención se pueden usar en ensayos de tinción de tetrámeros para valorar células mononucleares de sangre periférica con respecto a la presencia de CTLs específicos de antígeno después de la exposición a un antígeno de células tumorales o un inmunógeno. El complejo tetrámero de HLA se puede usar para visualizar directamente CTLs específicos de antígeno (véanse, p. ej., Ogg y cols., Science 279: 2103-2106, 1998; y Altman y cols, Science 174 : 94-96, 1996) y determinar la frecuencia de la población de CTL específicos de antígeno en una muestra de células mononucleares de sangre periférica. Un reactivo tetrámero que use un péptido de la invención se puede generar según se describe posteriormente.
Un péptido que se une a una molécula de HLA se repliega en presencia de la cadena pesada de HLA correspondiente y microglobulina beta 2 para generar un complejo trimolecular. En el complejo, el extremo carboxilo de la cadena pesada se biotinila en un sitio que previamente se manipulaba en la proteína. A continuación, se añade estreptavidina al complejo para formar un tetrámero que consiste en el complejo trimolecular y estreptavidina. Por medio de estreptavidina marcada fluorescentemente, el tetrámero se puede usar para teñir células específicas de antígeno. A continuación, las células se pueden identificar, por ejemplo, mediante citometría de flujo. Este análisis se puede usar con propósitos de diagnóstico o pronóstico. Las células identificadas por el procedimiento también se pueden usar con propósitos terapéuticos.
La presente divulgación también proporciona reactivos para evaluar respuestas de recuerdo inmunitario (véanse, p. ej., Bertoni y cols, J. Clin. Invest. 100: 503-513, 1997 y Penna y cols., J Exp. Med. 174: 1565-1570, 1991) que incluyen péptidos de la presente invención. Por ejemplo, muestras de PBMCs de paciente procedentes de individuos con cáncer que se va a tratar se pueden analizar con respecto a la presencia de CTLs específicos de antígeno usando péptidos específicos. Una muestra de sangre que contiene células mononucleares se puede evaluar al cultivar las PBMCs y estimular las células con un péptido de la invención. Después de un período de cultivo apropiado, la población celular expandida se puede analizar, por ejemplo, con respecto a la actividad de CTL.
Los péptidos también se pueden usar como reactivos para evaluar la eficacia de una vacuna. PBMCs obtenidas de un paciente vacunado con un inmunógeno se pueden analizar usando, por ejemplo, cualquiera de los métodos descritos anteriormente. Se tipa el HLA del paciente, y los reactivos epitópicos peptídicos que reconocen las moléculas específicas del alelo presentes en el paciente se seleccionan para el análisis. La inmunogenicidad de la vacuna puede estar indicada por la presencia de CTLs específicos de epítopo en la muestra de PBMC. Los péptidos de la invención también se pueden usar para elaborar anticuerpos, usando técnicas muy conocidas en la especialidad (véanse, p. ej., CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY; y Antibodies A Laboratory Manual, Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), que pueden encontrar uso como reactivos para diagnosticar, detectar o comprobar el cáncer. Estos anticuerpos pueden incluir los que reconocen un péptido en el contexto de una molécula de HLA, es decir, anticuerpos que se unen a un complejo péptido-MHC.
Los péptidos y las composiciones de la presente invención tienen un número de usos adicionales, algunos de los cuales se describen en la presente. A modo de ejemplo, la presente divulgación proporciona un método para diagnosticar o detectar un trastorno caracterizado por la expresión de un polipéptido inmunogénico CDC45L. Estos métodos implican determinar la expresión de un péptido de se une a CDC45L h La , o un complejo de un péptido que se une a CDC45L HLA y una molécula de HLA clase I en una muestra biológica. La expresión de un péptido o complejo de péptido y molécula de HLA clase I se puede determinar o detectar al ensayar con un socio de unión para el péptido o complejo. En una realización preferida, un socio de unión para el péptido o complejo puede ser un anticuerpo reconoce y se une específicamente al péptido. La expresión de CDC45L en una muestra biológica, tal como una biopsia tumoral, también se puede probar mediante protocolos de amplificación por PCR usando cebadores de CDC45L. Un ejemplo de expresión tumoral se presenta aquí y una divulgación adicional de condiciones y cebadores ejemplares para la amplificación de CDC45L se puede encontrar en el documento WO2003/27322.
Los métodos de diagnóstico implican poner en contacto una muestra biológica aislada de un sujeto con un agente específico para el péptido que se une a CDC45L HLA para detectar la presencia del péptido que une a CDC45L HLA en una muestra biológica. Según se usa en la presente, "poner en contacto" significa poner la muestra biológica en proximidad suficiente con el agente y bajo las condiciones apropiadas de, p. ej., concentración, temperatura, tiempo, fuerza iónica, para permitir la interacción específica entre el agente y el péptido que se une a CDC45L HLA que están presentes en la muestra biológica. En general, las condiciones para poner en contacto el agente con la muestra biológica son condiciones conocidas por los expertos normales en la especialidad para facilitar una interacción específica entre una molécula y su cognado (p. ej., una proteína y su cognado receptor, un anticuerpo y su cognado antigénico proteínico, un ácido nucleico y su cognado de secuencia complementaria) en una muestra biológica. Condiciones ejemplares para facilitar una interacción específica entre una molécula y su cognado se describen en la Patente de EE. UU. N° 5.108.921, concedida a Low y cols.
Los métodos de diagnóstico de la presente divulgación se pueden realizar en cualquiera o ambos de in vivo e in vitro. Según esto, la muestra biológica puede estar situada in vivo o in vitro en la presente invención. Por ejemplo, la muestra biológica puede ser un tejido in vivo y el agente específico para el polipéptido inmunogénico de CDC45L se puede usar para detectar la presencia de estas moléculas en el tejido. Alternativamente, la muestra biológica se puede recoger o aislar in vitro (p. ej., una muestra de sangre, una biopsia tumoral, un extracto tisular). En una realización particularmente preferida, la muestra biológica puede ser una muestra que contiene células, más preferiblemente una muestra que contiene células tumorales recogidas de un sujeto que se va a diagnosticar o tratar.
Alternativamente, el diagnóstico se puede realizar usando un método que permite la cuantificación directa de células T específicas de antígeno al teñir con complejos multímeros de HLA marcados con fluoresceína (p. ej., Altman, J. D. y cols., 1996, Science 274 : 94; Altman, J. D. y cols., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 : 10330). También se han proporcionado la tinción con respecto a linfocinas intracelulares y ensayos de liberación de interferón gamma o ensayos ELISPOT. La tinción del multímero, la tinción de linfocinas intracelulares y los ensayos ELISPOT parecen ser todos al menos 10 veces más sensibles que ensayos más convencionales (Murali-Krishna, K. y cols., 1998, Immunity 8: 177; Lalvani, A. y cols., 1997, J. Exp. Med. 186: 859; Dunbar, P. R. y cols., 1998, Curr. Biol. 8: 413). También se pueden usar pentámeros (p. ej., documento US 2004-209295A), dextrámeros (p. ej., documento WO 02/072631) y estreptámeros (p. ej., Nature medicine 6. 631-637 (2002)).
XI. Anticuerpos
La presente invención proporciona además anticuerpos que se unen a péptidos de la presente invención. Los anticuerpos preferidos se unen específicamente a péptidos de la presente invención y no se unirán (o se unirán débilmente) a un péptido que no sea de la presente invención. Alternativamente, los anticuerpos se unen a péptidos de la invención así como sus homólogos. Los anticuerpos contra péptidos de la invención pueden encontrar uso en ensayos para el diagnóstico y el pronóstico del cáncer y metodologías de obtención de imágenes. De forma similar, estos anticuerpos pueden encontrar uso en el tratamiento, el diagnóstico y/o el pronóstico de otros cánceres, en la medida que CDC45L también se exprese o sobreexprese en un paciente con cáncer. Por otra parte, anticuerpos (p. ej., anticuerpos monocatenarios) expresados intracelularmente pueden encontrar uso terapéuticamente en el tratamiento de cánceres en los que está implicada la expresión de CDC45L, ejemplos de los cuales incluyen, pero no se limitan a, tumor testicular, cáncer pancreático, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de mama, cáncer esofágico, cáncer de próstata, leucemia mieloide crónica (CML), tumor de tejido blandos, cáncer gástrico, cáncer hepatobiliar y cáncer colorrectal.
La presente divulgación también proporciona diversos ensayos inmunológicos para la detección y/o la cuantificación de la proteína CDC45L (SEQ ID NO: 18) o sus fragmentos incluyendo un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Estos ensayos pueden incluir uno o más anticuerpos anti-CDC45L capaces de reconocer y unirse a una proteína CDC45L o sus fragmentos, según sea apropiado. En el contexto de la presente invención, los anticuerpos anti-CDC45L que se unen a polipéptido CDC45L reconocen preferiblemente un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Una especificidad de unión de anticuerpo se puede confirmar con una prueba de inhibición. Esto es, cuando la unión entre un anticuerpo que se va a analizar y la longitud completa de polipéptido CDC45L se inhibe bajo la presencia de cualesquiera polipéptidos fragmentarios que consisten en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID n O: 3, se muestra que este anticuerpo se une específicamente al fragmento. En el contexto de la presente invención, estos ensayos inmunológicos se realizan dentro de diversos formatos de ensayo inmunológico muy conocidos en la especialidad, incluyendo, pero no limitados a, diversos tipos de radioinmunoensayos, una técnica de inmunocromatografía, ensayos de enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), enzimoinmunoanálisis fluorescente (ELIFA) y similares.
Ensayos inmunológicos pero no basados en anticuerpos relacionados de la divulgación también pueden incluir ensayos de inmunogenicidad de células T (inhibidores o estimulantes) así como ensayos de unión al MHC. Además, la presente divulgación contempla métodos inmunológicos de obtención de imágenes capaces de detectar cánceres que expresan CDC45L, ejemplos de los cuales incluyen, pero no se limitan a, métodos de obtención de imágenes radioescintigráficos que usan anticuerpos marcados de la presente divulgación. Estos ensayos encuentran uso clínico en la detección, la comprobación y el pronóstico de cánceres que expresan CDC45L, ejemplos de los cuales incluyen, pero no se limitan a, tales como tumor testicular, cáncer pancreático, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de mama, cáncer esofágico, cáncer de próstata, leucemia mieloide crónica (CML), tumor de tejido blandos, cáncer gástrico, cáncer hepatobiliar y cáncer colorrectal.
La presente divulgación también proporciona anticuerpos que se unen a los péptidos de la invención. Un anticuerpo de la divulgación se puede usar en cualquier forma, por ejemplo como un anticuerpo monoclonal o policlonal, y puede incluir además antisuero obtenido al inmunizar a un animal tal como un conejo con el péptido de la invención, todas las clases de anticuerpos policlonales y monoclonales, anticuerpos humanos y anticuerpos humanizados producidos mediante recombinación genética.
Un péptido de la invención usado como un antígeno para obtener un anticuerpo se puede derivar de cualquier especie de animal, pero preferiblemente se deriva de un mamífero tal como un ser humano, un ratón o una rata, más preferiblemente de un ser humano. Un péptido derivado de ser humano se puede obtener a partir de las secuencias nucleotídicas o de aminoácidos divulgadas en la presente.
Según la presente divulgación, el péptido que se va a usar como un antígeno de inmunización puede ser una proteína completa o un péptido parcial de la proteína. Un péptido parcial puede incluir, por ejemplo, el fragmento amino (N)-terminal o carboxi (C)-terminal de un péptido de la presente invención.
En la presente, un anticuerpo se define como una proteína que reacciona bien con la longitud completa o bien con un fragmento de un péptido CDC45L. En una realización preferida, un anticuerpo de la presente divulgación puede reconocer péptidos fragmentarios de CDC45L que consisten en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Métodos para sintetizar un oligopéptido son muy conocidos en las especialidades. Después de la síntesis, los péptidos se pueden purificar opcionalmente antes del uso como inmunógeno. En el contexto de la presente invención, el oligopéptido (p. ej., 9 o 10mero) se puede conjugar o conectar con portadores para potenciar la inmunogenicidad. La hemocianina de lapa californiana (k Lh ) es muy conocida como el portador. También se conocen en las especialidades métodos para conjugar KLH y péptido.
Alternativamente, un gen que codifica un péptido de la invención o su fragmento se puede insertar en un vector de expresión conocido, que a continuación se usa para transformar una célula hospedadora según se describe en la presente. El péptido o su fragmento deseado se puede recuperar del exterior o el interior de células hospedadoras mediante cualquier método estándar, y posteriormente se puede usar como un antígeno. Alternativamente, se pueden usar como el antígeno células enteras que expresan el péptido o sus lisados o un péptido sintetizado químicamente.
Cualquier animal mamífero se puede inmunizar con el antígeno, pero preferiblemente se tiene en cuenta la compatibilidad con células originales usadas para la fusión celular. En general, se pueden usar animales de Rodentia, Lagomorpha o Primates. Animales de la familia Rodentia incluyen, por ejemplo, ratón, rata y hámster. Animales de la familia Lagomorpha incluyen, por ejemplo, conejo. Animales de la familia Primate incluyen, por ejemplo, un mono de Catarrhini (mono del viejo mundo) tal como Macaca fascicularis, macaco de la India, babuino sagrado y chimpancés.
Se conocen en la especialidad métodos para inmunizar animales con antígenos. La inyección intraperitoneal o la inyección subcutánea de antígenos es un método estándar para la inmunización de mamíferos. Más específicamente, los antígenos se pueden diluir y suspender en una cantidad apropiada de solución salina tamponada con fosfato (PBS), solución salina fisiológica, etc. Si se desea, la suspensión de antígeno se puede mezclar con una cantidad apropiada de un adyuvante estándar, tal como adyuvante completo de Freund, emulsionar y a continuación administrar a mamíferos. Preferiblemente, es seguido por varias administraciones de antígeno mezclado con una cantidad apropiada de adyuvante completo de Freund cada de 4 a 21 días. También se puede usar para la inmunización un portador apropiado. Después de una inmunización como anteriormente, el suero se puede examinar mediante un método estándar para un incremento en la cantidad de anticuerpos deseados.
Anticuerpos policlonales contra los péptidos de la presente invención se pueden preparar al recoger sangre del mamífero inmunizado examinado con respecto al incremento de anticuerpos deseados en el suero, y al separar el suero de la sangre mediante cualquier método convencional. Los anticuerpos policlonales pueden incluir suero que contiene los anticuerpos policlonales, así como la fracción que contiene los anticuerpos policlonales se puede aislar del suero. Se puede preparar inmunoglobulina G o M a partir de una fracción que reconoce solamente el péptido de la presente invención usando, por ejemplo, una columna de afinidad acoplada con el péptido de la presente invención, y purificando adicionalmente esta fracción usando una columna de proteína A o proteína G.
Para preparar anticuerpos monoclonales, se recogen células inmunitarias del mamífero inmunizado con el antígeno y se comprueban con respecto al incremento del nivel de anticuerpos deseados en el suero según se describe anteriormente, y se someten a fusión celular. Las células inmunitarias usadas para la fusión celular se pueden obtener preferiblemente del bazo. Otras células progenitoras preferidas que se van a fusionar con el inmunocito anterior incluyen, por ejemplo, células de mieloma de mamíferos, y más preferiblemente células de mieloma que tienen una propiedad adquirida para la selección de células fusionadas mediante fármacos.
El inmunocito y las células de mieloma anteriores se pueden fusionar según métodos conocidos, por ejemplo, el método de Milstein y cols. (Galfre y Milstein, Methods Enzymol 73: 3-46 (1981)).
Los hibridomas resultantes obtenidos mediante fusión celular se pueden seleccionar al cultivarlos en un medio de selección estándar, tal como medio HAT (medio que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina). Típicamente, el cultivo celular se continúa en el medio HAT durante de varios días a varias semanas, el tiempo que sea suficiente para permitir que todas las otras células, con la excepción del hibridoma deseado (células no fusionadas), mueran. A continuación, se puede realizar la dilución limitativa estándar para cribar y clonar una célula de hibridoma que produce el anticuerpo deseado.
Además del método anterior, en el que un animal no humano se inmuniza con un antígeno para preparar un hibridoma, linfocitos humanos tales como los infectados por virus EB se pueden inmunizar con un péptido, células que expresan péptido o sus lisados in vitro.
A continuación, los linfocitos inmunizados se fusionan con células de mieloma derivadas de ser humano que son capaces de dividirse indefinidamente, tales como U266, para dar un hibridoma que produce un anticuerpo humano deseado que es capaz de unirse al péptido se pueden obtener (Solicitud de Patente Japonesa Publicada No Examinada N° Sho 63-17688).
Los hibridomas obtenidos se trasplantan posteriormente a la cavidad abdominal de un ratón y las ascitis se extraen. Los anticuerpos monoclonales obtenidos se pueden purificar, por ejemplo, mediante precipitación con sulfato amónico, una columna de proteína A o proteína G, cromatografía de intercambio iónico en DEAE o una columna de afinidad a la que se acopla el péptido de la presente invención. El anticuerpo de la presente divulgación se puede usar no solo para la purificación y la detección del péptido de la presente invención, sino también como un candidato para agonistas y antagonistas del péptido de la presente invención. Alternativamente, una célula inmunitaria, tal como un linfocito inmunizado, que produce anticuerpos se pueden inmortalizar mediante un oncogén y usar para preparar anticuerpos monoclonales.
Los anticuerpos monoclonales así obtenidos también se pueden preparar recombinantemente usando técnicas de manipulación genética (véase, por ejemplo, Borrebaeck y Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies, publicado en el Reino Unido por MacMillan Publishers LTD (1990)). Por ejemplo, un ADN que codifica un anticuerpo se puede clonar a partir de una célula inmunitaria, tal como un hibridoma o un linfocito inmunizado que produce el anticuerpo, insertar en un vector apropiado e introducir en células hospedadoras para preparar un anticuerpo recombinante. La presente divulgación también proporciona anticuerpos recombinantes preparados según se describe anteriormente.
Por otra parte, un anticuerpo de la presente divulgación puede ser un fragmento de un anticuerpo o anticuerpo modificado, con la condición de que se una a uno o más de los péptidos de la invención. A modo de ejemplo, el fragmento de anticuerpo puede ser Fab, F(ab')2, Fv o Fv monocatenario (scFv), en los que fragmentos Fv procedentes de cadenas H y L están ligados mediante un conector apropiado (Huston y cols., Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-83 (1988)). Más específicamente, un fragmento de anticuerpo se puede generar al tratar un anticuerpo con una enzima, tal como papaína o pepsina. Alternativamente, un gen que codifica el fragmento de anticuerpo se puede construir, insertar en un vector de expresión y expresar en una célula hospedadora apropiada (véanse, por ejemplo, Co y cols., J Immunol 152: 2968-76 (1994); Better y Horwitz, Methods Enzymol 178: 476-96 (1989); Pluckthun y skerra, Methods Enzymol 178: 497-515 (1989); Lamoyi, Methods Enzymol 121: 652-63 (1986); Rousseaux y cols., Methods Enzymol 121: 663-9 (1986); Bird y Walker, Trends Biotechnol 9: 132-7 (1991)).
Un anticuerpo se puede modificar mediante conjugación con una variedad de moléculas, tales como polietilenglicol (PEG). La presente divulgación proporciona estos anticuerpos modificados. El anticuerpo modificado se puede obtener al modificar químicamente un anticuerpo. Estos métodos de codificación son convencionales en este campo.
Alternativamente, un anticuerpo de la presente divulgación se puede obtener como un anticuerpo quimérico, entre una región variable derivada de un anticuerpo no humano y la región constante derivada de un anticuerpo humano, o como un anticuerpo humanizado, que incluye la región determinante de la complementariedad (CDR) derivada de un anticuerpo no humano, la región marco (FR) y la región constante derivada de un anticuerpo humano. Estos anticuerpos se pueden preparar según una tecnología conocida. La humanización se puede realizar al sustituir CDRs de roedor o secuencias de CDR para las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano (véase, p. ej., Verhoeyen y cols., Science 239:1534-1536 (1988)). Según esto, estos anticuerpos humanizados son anticuerpos quiméricos, en los que sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente procedente de una especie no humana.
También se pueden usar anticuerpos totalmente humanos que incluyen regiones variables humanas además de regiones marco y constantes humanas. Estos anticuerpos se pueden producir usando diversas técnicas conocidas en la especialidad. Por ejemplo, los métodos in vitro implican el uso de bibliotecas recombinantes de fragmentos de anticuerpo humano exhibidos sobre un bacteriófago (p. ej., Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991). De forma similar, se pueden elaborar anticuerpos humanos mediante la introducción de locus de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, p. ej., ratones en los que los genes de inmunoglobulina endógenos se han inactivado parcialmente o completamente. Este enfoque se describe, p. ej., en las Patentes de EE. UU. N° 6.150.584, 5.545.807, 5.545.806, 5.569.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016.
Los anticuerpos obtenidos como anteriormente se pueden purificar hasta homogeneidad. Por ejemplo, la separación y la purificación del anticuerpo se puede realizar según los métodos de separación y purificación usados para proteínas generales. Por ejemplo, el anticuerpo se puede separar y aislar mediante el uso apropiadamente seleccionado y combinado de cromatografías en columna, tales como cromatografía de afinidad, filtración, ultrafiltración, desalado, diálisis, electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS y enfoque isoeléctrico (Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow y David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), pero no se limitan a estos. Una columna de proteína A y una columna de proteína G se puede usar como la columna de afinidad. Columnas de proteína A ejemplares que se van a usar incluyen, por ejemplo, Hyper D, POROS y Sepharose F.F. (Pharmacia).
La cromatografía ejemplar, con la excepción de la afinidad, incluye, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba, filtración en gel, cromatografía en fase inversa, cromatografía de adsorción y similares (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak y cols., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)). Los procedimientos cromatográficos se pueden llevar a cabo mediante cromatografía en fase líquida, tal como HPLC y FPLC.
Por ejemplo, la medida de la absorbancia, el ensayo de enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), el inmunoensayo enzimático (EIA), el radioinmunoensayo (RIA) y/o la inmunofluorescencia se pueden usar para medir la actividad de unión antigénica del anticuerpo de la divulgación. En el ELISA, el anticuerpo de la presente divulgación se inmoviliza sobre una placa, un péptido de la invención se aplica a la placa y a continuación se aplica una muestra que contiene un anticuerpo deseado, tal como un sobrenadante de cultivo de células productoras de anticuerpo o anticuerpos purificados. A continuación, se aplica un anticuerpo secundario que reconoce el anticuerpo primario y está marcado con una enzima, tal como fosfatasa alcalina, y la placa se incuba. Posteriormente, después del lavado, se añade a la placa un sustrato de enzima, tal como fosfato de p-nitrofenilo, y se mide la absorbancia para evaluar la actividad de unión antigénica de la muestra. Un fragmento del péptido, tal como un fragmento C-terminal o N-terminal, se puede usar como el antígeno para evaluar la actividad de unión del anticuerpo. BIAcore (Pharmacia) se puede usar para evaluar la actividad del anticuerpo según la presente divulgación.
Los métodos anteriores permiten la detección o la medida de un péptido de la invención, al exponer un anticuerpo de la divulgación a una muestra que se supone que contiene un péptido de la invención, y detectar o medir el complejo inmunitario formado por el anticuerpo y el péptido.
Debido a que el método de detección o medida del péptido según la invención puede detectar o medir específicamente un péptido, el método puede encontrar uso en una variedad de experimentos en los que se use el péptido.
XII. Vectores y células hospedadoras
La presente invención también proporciona un vector y una célula hospedadora en los que se introduce un nucleótido que codifica el péptido de la presente invención. Un vector de la presente invención se puede usar para mantener un nucleótido, especialmente un ADN, de la presente invención en una célula hospedadora, para expresar un péptido de la presente invención, o para administrar un nucleótido de la presente invención para la terapia génica.
Cuando E. coli es una célula hospedadora y el vector se amplifica y se produce en una gran cantidad en E. coli (p. ej., JM109, DH5 alfa, HB101 o XL1Blue), el vector debe tener "ori" para que se amplifique en E. coli y un gen marcador para seleccionar E. coli transformada (p. ej., un gen de resistencia a fármaco seleccionado por un fármaco tal como ampicilina, tetraciclina, kanamicina, cloranfenicol o similares). Por ejemplo, se pueden usar vectores de la serie M13, vectores de la serie pUC, pBR322, pBluescript, pCR-Script, etc. Además, también se pueden usar pGEM-T, pDIRECT y pT7 para subclonar y extraer ADNc así como los vectores descritos anteriormente. Cuando se usa un vector para producir la proteína de la presente invención, puede encontrar uso un vector de expresión. Por ejemplo, un vector de expresión que se va a expresar en E. coli debe tener las características anteriores para ser amplificado en E. coli. Cuando se usan E. coli, tal como JM109, DH5 alfa, HB101 o XL1 Blue, como una célula hospedadora, el vector debe tener un promotor, por ejemplo, promotor lacZ (Ward y cols., Nature 341: 544-6 (1989); Fa Se B J 6: 2422-7 (1992)), promotor araB (Better y cols., Science 240: 1041-3 (1988)), promotor T7 o similares, que puede expresar eficazmente el gen deseado en E. coli. A este respecto, se pueden usar pGEX-5X-1 (Pharmacia), "QIAexpress system" (Qiagen), pEGFP y pET (en este caso, el hospedador es preferiblemente BL21 que expresa ARN polimerasa de T7), por ejemplo, en lugar de los vectores anteriores. Adicionalmente, el vector también puede contener una secuencia de señalización para la secreción de péptidos. Una secuencia de señalización ejemplar que dirige el péptido que se va a secretar al periplasma de la E. coli es la secuencia de señalización pelB (Lei y cols., J Bacteriol 169: 4379 (1987)). Medios para la introducción de los vectores en las células hospedadoras diana incluyen, por ejemplo, el método del cloruro cálcico y el método de electroporación.
Además de E. coli, por ejemplo, se pueden usar para producir el polipéptido de la presente invención vectores de expresión derivados de mamíferos (por ejemplo, pcDNA3 (Invitrogen) y pEGF-BOS (Nucleic Acids Res 18(17): 5322 (1990)), pEF, pCDM8), vectores de expresión derivados de células de insecto (por ejemplo, "Bac-to-BAC baculovirus expression system" (GIBCO BRL), pBacPAK8), vectores de expresión derivados de plantas (p. ej., pMH1, pMH2), vectores de expresión derivados de virus de animales (p. ej., pHSV, pMV, pAdexLcw), vectores de expresión derivados de retrovirus (p. ej., pZIpneo), vector de expresión derivado de levadura (p. ej., "Pichia Expression Kit" (Invitrogen), pNV11, SP-Q01) y vectores de expresión derivados de Bacillus subtilis (p. ej., pPL608, pKTH50).
A fin de expresar el vector en células animales, tales como células CHO, COS o NIH3T3, el vector debe tener un promotor necesario para la expresión en estas células, por ejemplo, el promotor SV40 (Mulligan y cols., Nature 277: 108 (1979)), el promotor MMlV-LTR, el promotor EF1 alfa (Mizushima y cols., Nucleic Acids Res 18: 5322 (1990)), el promotor CMV y similares, y preferiblemente un gen marcador para seleccionar transformantes (por ejemplo, un gen de resistencia a fármaco seleccionado por un fármaco (p. ej., neomicina, G418)). Ejemplos de vectores conocidos con estas características incluyen, por ejemplo, pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOp Rs V y pOP13.
Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar la presente invención y ayudar a un experto normal a elaborar y usar la misma.
Materiales y Métodos
Análisis en micromatriz de ADNc.
Se generaron perfiles de expresión génica mediante análisis en micromatriz de ADNc, según se describe previamente (Nakamura T y cols., Oncogene 2004;23:2385-400, Taniwaki M y cols., Int J Oncol 2006;29:567-75). Los datos brutos del análisis en micromatriz están disponibles por petición al Profesor Y. Nakamura (Univ. Tokyo, Inst. Med. Sci.). Las muestras tisulares de cánceres de pulmón y tejidos pulmonares normales no cancerosos adyacentes se obtuvieron de especímenes quirúrgicos, y todos los pacientes proporcionaban su consentimiento informado por escrito para participar en este estudio.
Ratones.
Ratones hembra de seis semanas de edad diabéticos no obesos (NOD)/con inmunodeficiencia combinada grave (SCID) se adquirieron de Charles River Laboratories Japón. Los ratones se mantuvieron en the Center for Animal Resources and Development of Kumamoto University, y se manejaron según las directrices de cuidado de animales de la Kumamoto University.
Líneas celulares y expresión de HLA.
Las líneas celulares de cáncer de pulmón humano positivas a CDC45L y HLA-A*2402, EBC-1 y Lu99, fueron suministradas amablemente por the Health Science Research Resources Bank (Tsukuba, Japón). Las células C1R-A2402, un transfectante HLA-A*2402 de la línea celular linfoblastoide B humana C1R que expresa una cantidad vestigial de molécula de HLA clase I intrínseca (Karaki S, Kariyone A, Kato N, Kano K, Iwakura Y, Takiguchi M. HLA-B51 transgenic mice as recipients for production of polymorphic HLA-A, B-specific antibodies. Immunogenetics 1993;37:139-42)26, eran una generosa donación del Dr. Masafumi Takiguchi (Kumamoto University, Kumamoto, Japón). La línea celular de cáncer pancreático humano positiva a CDC45L, PANC1 (HLA-A*0201+, HlA-A*2402-) y la línea celular deficiente en TAP y positiva a HLA-A*0201, T2, se adquirieron de Riken Cell Bank. La expresión de HLA-A2 y HLA-A24 se examinó mediante citometría de flujo con un anticuerpo monoclonal (mAb) anti-HLA-A2, BB7.2 (One Lambda, Inc., Canoga Park, CA) y mAb anti-HLA-A24 (One Lambda, Inc.), respectivamente, a fin de seleccionar los donantes de sangre positivos a HLA-A24 y HLA-A2 para los ensayos. Estas células se mantuvieron in vitro en medio RPMI 1640 complementado con 10% de FCS en una atmósfera de CO2 al 5% a 37 grados C.
Pacientes, muestras de sangre y tejidos tumorales.
El protocolo de investigación para recoger y usar PBMCs procedentes de donantes fue aprobado por the Institutional Review Board of Kumamoto University. Las muestras de sangre o los tejidos cancerosos y tejidos no cancerosos adyacentes se obtuvieron de pacientes de Kumamoto University Hospital durante procedimientos de diagnóstico habituales después de obtener el consentimiento informado por escrito. También se obtuvieron muestras de sangre de donantes sanos después de recibir su consentimiento informado por escrito. Todas las muestras se codificaron aleatoriamente para encubrir sus identidades y las muestras de sangre se almacenaron a -80 grados C hasta el uso.
Análisis por transcripción inversa-PCR y transferencia Northern
El análisis por transcripción inversa-PCR (RT-PCR) de líneas celulares y tejidos normales o cancerosos se realizó como se describe previamente (Nakatsura T y cols., Biochem Biophys Res Commun 2001;281:936-44). Las secuencias cebadoras de CDC45L eran 5'-CTGGTGTTGCACAGGCTGTCATGG-3' (SEQ ID NO: 19) (sentido) y 5'-CGCACACGGTTAGAAGAGGAG-3' (SEQ ID NO: 20) (antisentido). Después de la normalización mediante ARNm de beta-actina como un control, se comparó la expresión de ARNm de CDC45L en todos los tejidos y líneas celulares. Se realizó un análisis de transferencia Northern según se describe previamente usando una sonda de ADNc específica del gen CDC45L (correspondiente a de 1245 a 1867 bp) (Nakatsura T y cois., Biochem Biophys Res Commun 2003;306:16-25).
Tinción inmunohistoquímica.
El examen inmunohistoquímico de CDC45L humano se realizó como se describe previamente con alguna modificación (Nakatsura T y cols., Biochem Biophys Res Commun 2001;281:936-44). Brevemente, después de la desparafinación y la rehidratación de secciones tisulares, el peróxido endógeno se desactivó con peróxido de hidrógeno al 0,3% en metanol durante 15 min, y la unión inespecífica se redujo mediante incubación con reactivo libre de suero de bloqueo proteínico (Dako) durante 10 min. Después de lavar con solución tamponadora (Tween 20 al 0,1% y NaCl 0,5 M en tampón de Tris-HCl 0,05 M), el anticuerpo primario (anticuerpo anti-CDC45L humano producido en conejo, dilución 1:100, HPA000614, purificado por afinidad, Sigma-Aldrich) diluido en Can Get Signal (R) immunostain Solution A (Toyobo Co., Osaka, Japón) se incubo con las muestras durante la noche a 4 grados C. Posteriormente, las secciones se enjuagaron cuidadosamente con solución tamponadora y se incubaron con un anticuerpo secundario (Labeled Polymer-HRP, anticuerpo contra inmunoglobulinas de ratón y contra inmunoglobulinas de conejo, Dako) a temperatura ambiente. Después de estos tres lavados con solución tamponadora, la reacción de tinción se realizó mediante incubación con solución de 3,3'-diaminobencidina (Liquid DAB+ Substrate Chromogen System, Dako). A continuación, los cortes se tiñeron por contraste ligeramente con hematoxilina, se deshidrataron en etanol y se depuraron en xileno. Se usaron secciones de testículo que se sabía que expresan CDC45L como controles positivos para el anticuerpo anti-CDC45L humano. Para los controles negativos, se reemplaza el anticuerpo primario por IgG de conejo normal.
Péptidos.
Péptidos derivados de CDC45L humano, que soportaban motivos de unión para moléculas codificadas por HLA-A*2402, se seleccionaron usando el programa informático BIMAS (Bioinformatics and Molecular Analysis Section, Center for Information Technology, NlH, Bethesda, MD), y se sintetizaron 16 péptidos (10 nonámeros y 6 decámeros, pureza >95%) (AnyGen, Gwangju, Corea) (Tabla 1). Los péptidos se disolvieron en dimetilsulfóxido a la concentración de 20 microgramos/ml y se almacenaron a -80 grados C. Dos péptidos de VIH, péptido RYLRDQQLL (SEQ ID NO: 21) restringido por HLA-A24 (HIV-A24) y péptido SLYNTYATL (SEQ ID NO: 22) restringido por HLA-A2 (HIV-A2), se usaron como controles negativos (Komori H y cols., Clin Cancer Res 2006;12:2689-97).
[Tabla 1]
Posibles péptidos derivados de CDC45L humano que se predice que se unen a HLA-A24 (A *2402)
Listado de residuos de subsecuencias (SEQ ID Puntuación de unión a Péptido Posición NO:) HLA-A24 *
CDC45L-A24-9-237-1 237-245 KYVTDVGVL (1) 600
CDC45L-A24-9-109-2 109-117 VYNDTQIKL (2) 396
CDC45L-A24-9-294-3 294-302 SYTAARFKL (3) 220
CDC45L-A24-9-556-4 556-564 KFLDALISL (4) 72
CDC45L-A24-9-328-5 328-336 KFQAMDISL (5) 60
CDC45L-A24-9-396-6 396-404 HFIQALDSL (6) 30
CDC45L-A24-9-370-7 370-378 KFLASDVVF (7) 30
CDC45L-A24-9-192-8 192-200 EYHGTSSAM (8) 25
CDC45L-A24-9-541-9 541-549 HFDLSVIEL (9) 22
CDC45L-A24-9-364-10 364-372 HFGFKHKFL (10) 20 CDC45L-A24-10-109-11 109-118 VYNDTQIKLL (11) 360 CDC45L-A24-10-556-12 556-565 KFLDALISLL (12) 86 CDC45L-A24-10-271-13 271-280 SFEYDLRLVL (13) 36 CDC45L-A24-10-313-14 313-322 EFLADMGLPL (14) 30 CDC45L-A24-10-21-15 21-30 LFVASDVDAL (15) 30 CDC45L-A24-10-459-16 459-468 LFSRPASLSL (16) 20
*Las puntuaciones de unión se calcularon al usar el programa BIMAS (http://bimas.dcrt.nih.gov/cgibin/molbio/ken_parker_comboform).
Generación de CTLs humanos reactivos con CDC45L y ensayos de respuestas de CTL.
Se aislaron PBMCs de donantes sanos y pacientes con cáncer de pulmón japoneses positivos a HLA-A24 o HLA-A2, y las células dendríticas (DCs) derivadas de monocitos periféricos se generaron según se describe previamente (Harao M y cois., Int J Cáncer 2008;123:2616-25, Naito K y cois., Int J Oncol 2006;28:1481-9). Las DCs se impulsaron con 20 microgramos/ml de los posibles péptidos en presencia de 4 microgramos/ml de microglobulina beta 2 (Sigma-Aldrich) durante 2 h a 37 grados C en AIM-V (Invitrogen) complementado con 2% de plasma autólogo termoinactivado. A continuación, las células se irradiaron (40 Gy) y se incubaron con las células T CD8+ aisladas según se describe previamente (Imai K y cols., Clin Cancer Res 2008;14:6487-95, Harao M y cols., Int J Cancer 2008;123:2616-25). Se realizaron dos estimulaciones adicionales con blastos de PHA autólogos cargados con péptido los días 7 y 14. Los blastos de PHA se generaron según se describe previamente (Inoue M y cols., Immunol Lett 2009;126:67-72), y estos blastos de PHA (5 X 105) se impulsaron con 20 microgramos/ml de péptidos durante 3 h, se irradiaron (100 Gy) y se cultivaron con las 2X106 células T CD8+ en presencia de 10 ng/ml de IL-7 recombinante humana (Wako, Osaka, Japón). Después de 2 días, los cultivos se complementaron con 20 IU/ml de IL-2 recombinante humana (PeproTec, Inc.).
Seis días después de la última estimulación, se investigaron las respuestas específicas de antígeno de los CTLs inducidos. Se llevaron a cabo dos estimulaciones semanales adicionales con blastos de PHA autólogos cargados con péptido el día 7 y 14. Células CD14'CD8‘ autólogas enriquecidas con células T CD4+ se cultivaron con PHA (2 microgramos/ml) e IL-2 recombinante humana (100 IU/ml) durante 2 días, y las células se lavaron con PBS y se cultivaron con IL-2 recombinante humana (100 IU/ml) durante tres días adicionales. Estos blastos de PHA (5 X 105) se impulsaron con 50 microgramos/ml de péptidos durante 2 horas a 37 grados C en AIM-V (Invitrogen) complementado con 2% de plasma autólogo termoinactivado. A continuación, las células se irradiaron (100 Gy) y se incubaron con las 2X106 células T CD8+. Estos cultivos se prepararon en placas de 24 pocillos usando el medio complementado con 5 ng/ml de IL-7, IL-2 y IL-15 recombinantes humanas. Seis días después de la última estimulación, las respuestas específica de antígeno de los CTLs inducidos se investigaron mediante un ensayo ELISPOT de IFN-gamma, un ensayo de movilización de CD107a y un ensayo de liberación 51Cr según se describe previamente (Komori H y cols. Clin Cancer Res 2006; 12: 2689-97) y posteriormente.
Ensayo de movilización de CD107a.
Para identificar linfocitos T CD8+ desgranulantes estimulados con péptidos epitópicos, el CD107a expuesto sobre la superficie celular se analizó mediante citometría de flujo (Rubio V y cols., Nat Med 2003;9:1377-82, Betts MR y cols., J Immunol Métodos 2003;281:65-78). Se realizó un ensayo de movilización de CD107a con un estuche de detección de CD107a en inmunocitos (MBL, Nagoya, Japón) según las instrucciones del fabricante. Los CTLs inducidos se suspendieron en una concentración final de 2X106 células/ml de AIM-V complementado con 2% de plasma autólogo termoinactivado, y 150 microlitros de la suspensión celular se añadieron a cada pocillo de una microplaca de fondo redondo de 96 pocillos. El péptido derivado de CDC45L o el péptido de VIH de control (1 microgramo/ml) se añadió como un estimulante, y se añadieron a cada pocillo mAb anti-CD107a humano marcado con FITC o IgG1 de ratón de control isotípico marcada con FITC y monensina. Las células se cultivaron durante 5 h a 37 grados C. Después del cultivo, las células se tiñeron con anti-CD8a humano conjugado a PE (Biolegend) y se analizaron mediante citometría de flujo (FACScan; BD Biosciences).
Generación de células con expresión reducida de CDC45L.
Para reducir la expresión de CDC45L en células de cáncer de pulmón, se añadieron ARNs interferentes pequeños (si) de CDC45L (ARNsi de Cdc45 humano, sc-35044: una reunión de tres ARNs si de 20-25 nt específicos de la diana; Santa Cruz) en una concentración final de 150 nM hasta 40-60% de células confluentes. Se usó Lipofectamine (TM) 2000 (Invitrogen) para transfectar los ARNs si en células, según las instrucciones del fabricante. Se usaron ARNs si de GFP como un control irrelevante. Las células tratadas se lavaron una vez con PBS, y las células adherentes se recogieron a las 72 h después de la transfección y se usaron como células diana para la liberación de 51Cr. Para investigar la capacidad del ARNsi para suprimir la expresión de CDC45L, se realizó un análisis de transferencia Western según se describe previamente (Nakatsura T y cols., Biochem Biophys Res Commun 2003;306:16-25). Las células cancerosas se lavaron una vez con PBS a las 48 h después de la transfección, y las células adherentes se recogieron y se sometieron a lisis para analizar los niveles de expresión de CDC45L para la comparación con los de células de control negativo. Se uso beta-actina como en control interno. Se usó anticuerpo policlonal de conejo reactivo a CDC45L (sc-20685, Santa Cruz Biotechnology) como el anticuerpo primario.
Respuestas de CTLs humanos contra líneas celulares cancerosas.
La frecuencia de células que producen interferón (IFN)-gamma por 1X105 CTLs tras la estimulación con células Lu99 (1X104/pocillo) o células C1R-A2402 y T2 impulsadas con péptido (1X104/pocillo) se analizó mediante un ensayo ELISPOT (Human IFN-gamma ELISPOt kit, BD Biosciences) según se describe previamente (Komori H y cols., Clin Cancer Res 2006;12:2689-97, Bourgault VI y cols., Cancer Res 2004;64:8761-6). Los CTLs se cocultivaron con células cancerosas o células C1R-A2402 y T2 impulsadas con péptido como células diana (5X103/pocillo) a la relación efector a diana indicada, y se realizó un ensayo de liberación de 51Cr estándar según se describe previamente (Yokomine K y cols., Int J Cancer 2009;126:2153-63, Monji M y cols., Clin Cancer Res 2004;10:6047-57). El bloqueo de HLA-clase I por mAb anti-HLA clase I humano, W6/32 (IgG2a, Santa Cruz Biotechnology), o HLA-clase II por mAb anti-HLA-DR humano (IgG2a, BD Biosciences), se realizó según se describe previamente (Komori H y cols., Clin Cancer Res 2006;12:2689-97, Makita M y cols., Clin Cancer Res 2002;8:2626-31).
Modelo de inmunoterapia adoptiva.
Se realizó una inmunoterapia adoptiva experimental según se describe previamente (Imai K y cois., Clin Cancer Res 2008;14:6487-95, Komori H y cols., Clin Cancer Res 2006;12:2689-97). Brevemente, células Lu99 (3X106 células/ratón) positivas tanto para CDC45L como para HLA-A24 endógenos se inocularon subcutáneamente en los costados derechos de ratones NOD/SCID. Cuando el tamaño del tumor alcanzaba aproximadamente 25 mm2 el día 7, las líneas de CTLs específicos para CDC45L inducidas a partir de dos donantes sanos mediante estimulación in vitro con una mezcla de péptidos CDC45L-A24-9-109-2 (SEQ ID NO: 2), CDC45L-A24-9-294-3 (SEQ ID NO: 3) y CDC45L-A24-9-556-4 (s Eq ID NO: 4) o líneas de Ct Ls inducidas mediante estimulación con péptido de VIH restringido a HLA-A24 irrelevante se suspendieron en 100 microlitros de PBS y se inyectaron intravenosamente (4X106 células/ratón). La inyección intravenosa de CTLs se repitió el día 14. El tamaño del tumor se evaluó dos veces a la semana usando calibres para medir dos diámetros perpendiculares.
Análisis estadístico.
Se usó una prueba de la t de Student de dos colas para evaluar la significación estadística de diferencias en datos de ELISPOT y tamaños de los tumores entre grupos de tratamiento. Se consideraba que valores de P menores de 0,05 eran estadísticamente significativos. El análisis estadístico se realizó con un programa informático estadístico comercial (StatView 5.0, Abacus Concepts, Calabasas, CA).
Resultados
Identificación de la sobreexpresión del gen CDC45L en cáncer de pulmón basada en análisis en micromatriz de ADNc.
Se usó una micromatriz de ADNc de genoma completo que contenía 27.648 genes para examinar los perfiles de expresión génica de 18 tejidos de cáncer de pulmón y sus homólogos normales adyacentes. El análisis en micromatriz de ADNc revelaba una expresión marcadamente potenciada del gen CDC45L en tejidos de cáncer de pulmón en los 12 pacientes con cáncer de pulmón microcítico (relación de expresión relativa promedio: 163.087; intervalo: 81.204­ 369.309) y 4 de los 6 pacientes con cáncer de pulmón no microcítico (relación de expresión relativa promedio: 15.170; intervalo: 0,08-40.131) (Tabla 2). Por lo tanto, CDC45L se seleccionó por estar caracterizado como un nuevo TAA del cáncer de pulmón. El nivel de expresión del gen CDC45L también se potenciaba en la mayoría de varias otras enfermedades malignas, incluyendo cánceres de próstata, mama y vejiga urinaria, basándose en los análisis en micromatrices de ADNc (Tabla 2).
[Tabla 2]
S o b r e e x p r e s ió n d e l g e n CDC45L e n c á n c e r d e p u lm ó n y d iv e r s a s e n fe r m e d a d e s m a lig n a s in v e s t ig a d a m e d ia n te a n á l is is e n m ic r o m a t r iz d e A D N c .
Tejido canceroso n Grado positivo * (%) Relación de expresión relativa (media) Cáncer de pulmón microcítico 12 100 % 163,087
Cáncer de próstata 3 100 % 36,985
Cáncer de mama 8 75 % 8,648
Cáncer de vejiga urinaria 13 69 % 2,194
Cáncer de pulmón no microcítico 6 67 % 15,170
CML 3 33 % 8,606
Tumor de tejido blandos 4 25 % 9,258
Esófago 25 16 % 2,378 Cáncer gástrico 3 0 % 1
*Se consideraba que una relación de expresión relativa (cáncer/tejido normal) > 5 era positiva.
Expresión de ARNm de CDC45L en tejidos normales, líneas celulares cancerosas y tejidos de cáncer de pulmón.
Se analizó la expresión del gen CDC45L en tejidos normales a nivel del ARNm usando RT-PCR y un análisis por transferencia Northern. Un análisis semicuantitativo de RT-PCR de CDC45L en los tejidos normales revelaba que se expresaba débilmente solo en los testículos y la mama (Fig. 1A). Un análisis de transferencia Northern en tejidos normales usando ADNc de CDC45L como una sonda revelaba que no se expresaba en veintidós órganos vitales excepto los testículos (Fig. IB), según los resultados del análisis de RT-PCR. En contraste, la expresión del gen CDC45L se detectaba en las nueve líneas celulares de cáncer de pulmón usando un análisis de RT-PCR (Fig. 1C). Posteriormente, se analizó la expresión del gen CDC45L al usar un análisis de RT-PCR en los tejidos con cáncer de pulmón. En 7 de 8 pacientes con NSCLC, ARNm de CDC45L se expresaba fuertemente en tejidos cancerosos (Fig. ID superior). Además, la expresión del gen CDC45L se analizó usando un análisis de RT-PCR en los tejidos cancerosos y sus homólogos normales adyacentes, que se resecaron quirúrgicamente. La expresión del gen CDC45L se detectó en los 4 tejidos con cáncer de pulmón, pero se detectó poca expresión en sus homólogos normales (Fig. ID inferior). Por otra parte, los análisis por RT-PCR de diversas líneas celulares cancerosas derivadas de cánceres gástrico, hepatobiliar, de mama, de próstata y colorrectal revelaba que el gen CDC45L también se expresa en muchas de estas líneas celulares cancerosas (Fig. IE).
Para investigar la expresión de CDC45L a nivel proteínico, se realizó un análisis inmunohistoquímico de tejidos con cáncer de pulmón y tejidos normales. Se estudiaron 26 muestras de tejidos con cáncer de pulmón, que consistían en 12 adenocarcinomas (7 de los 12 eran carcinomas bronquioalveolares), 8 carcinomas escamosos y 6 carcinomas microcíticos. Las 26 muestras exhibían una fuerte tinción nuclear de CDC45L y una débil tinción citoplásmica (Fig. IF). No se observaba tinción o se observaba una tinción muy débil en tejidos pulmonares adyacentes normales (Fig. IF). CDC45L se expresaba en testículos, pero no se observaba tinción o se observaba una tinción muy débil en otros tipos de tejido humanos de adulto normales, incluyendo cerebro, corazón, hígado, riñón, estómago, intestino delgado, colon, páncreas, piel, bazo y timo (Fig. IF y datos no mostrados). Colectivamente, los niveles de expresión proteínica de CDC45L en cánceres de pulmón humanos eran evidentemente muy superiores que en tejidos de adulto normales, con la excepción de los testículos. Estos resultados son coherentes con los resultados procedentes de análisis de RT-PCR y transferencia Northern (Figs. 1A, B y D).
Identificación de epítopos de CTLs derivados de CDC45L y restringidos por HLA-A24 en donantes sanos.
Para identificar epítopos de CTL restringidos por HLA-A24 y derivados de CDC45L, 16 posibles péptidos que se predecía que tenían alta afinidad de unión para HLA-A24 se seleccionaron según el programa de predicción de la unión de péptidos a HLA proporcionado por the NIH BIMAS (Tabla 1). Para probar qué péptido podría inducir CTLs reactivos a péptido, las células T CD8+ clasificadas a partir de las PBMCs de donantes sanos se incubaron con las DCs derivadas de monocitos autólogas impulsadas con la mezcla de cuatro péptidos seleccionados de estos 16 péptidos CDC45L. Después de dos estimulaciones semanales adicionales con blastos de PHA autólogos cargados con péptido, la actividad citotóxica contra las células C1R-A*2402 impulsadas con péptido se examinó mediante un ensayo ELISPOT de IFN-gamma (Fig. 2). Las células T CD8+ clasificadas a partir de las PBMCs de dos donantes sanos positivos a HLA-A24 se estimularon con DCs derivadas de monocitos autólogas impulsadas con una mezcla de 4 de los 16 péptidos CDC45L. La frecuencia de células T CD8+ específicas para los péptidos derivados de CDC45L en las líneas de CTL resultantes se examinó mediante un ensayo ELISPOT de IFN-gamma (Fig. 3). Los controles de fondo se estimularon con células C1R-A2402 impulsadas con péptido HIV-A24 irrelevante. Las líneas de CTL generadas producían reproduciblemente una gran cantidad de IFN-gamma tras la estimulación con células C1R-A2402 impulsadas con péptidos CDC45L-A24-9-109-2 (SEQ ID NO: 2), 109VYNDTQIKL117, CDC45L-A24-9-294-3 (SEQ ID NO: 3), 294SYTAARFKL302, CDC45L-A24-9-556-4 (SEQ ID NO: 4), 556KFLDALISL564, CDC45L-A24-9-370-7 (SEQ ID NO: 7), 370KFLASDVVF378 o CDC45L-A24-10-556-12 (SEQ ID NO: 12), 556KFLDALISLL565. Estos resultados sugieren que estos cinco péptidos derivados de CDC45L son inmunogénicos.
Para analizar adicionalmente la capacidad estimulante de CTL de estos cinco péptidos inmunogénicos, se realizó un ensayo de movilización de CD107a para evaluar la secreción específica para antígeno del contenido de gránulos citolíticos por CTLs (Rubio V y cols., Nat Med 2003;9:1377-82, Betts MR y cols. J Immunol Métodos 2003;281:65-78). Una proporción significativamente superior de células T CD8+ se teñía mediante mAb anti-CD107a cuando las líneas de CTL generadas mediante estimulación con uno de estos cinco péptidos inmunogénicos se reestimulaban con sus péptidos cognados, en comparación con la reestimulación con un péptido HIV-A24 irrelevante (Fig. 4).
Establecimiento de líneas de CTLs específicas para péptidos derivados de CDC45L en pacientes con cáncer de pulmón.
Se generaron CTLs específicos de CDC45L a partir de las PBMCs de pacientes con cáncer de pulmón positivos para HLA-A24 mediante estimulación con el péptido CDC45L-A24-9-109-2 (SEQ ID NO: 2), CDC45L-A24-9-294-3 (SEQ ID NO: 3), CDC45L-A24-9-556-4 (SEQ ID NO: 4), CDC45L-A24-9-370-7 (SEQ ID NO: 7) o CDC45L-A24-10-556-12 (SEQ ID NO: 12). Estas líneas de CTL producían una cantidad significativamente grande de IFN-gamma en respuesta a péptidos derivados de CDC45L en ensayos ELISPOT de IFN-gamma (Fig. 5A). Además, estas líneas de CTL exhibían actividad citotóxica contra células C1R-A2402 impulsadas con los cinco péptidos derivados de CDC45L, pero no contra células C1R-A2402 impulsadas con péptido HIV-A24 irrelevante, en ensayos de liberación de 51Cr (Fig. 5B). Estos resultados indican que estos CTLs tenían una actividad citotóxica específica del péptido.
Procesamiento natural de epítopos de CTL CDC45L en células cancerosas.
Se examinó la capacidad de estos CTLs para destruir líneas celulares de cáncer de pulmón humano que expresaban naturalmente tanto CDC45L como HLA-A24. Células Lu99 y EBC-1 (CDC45L+, h La -A24+), células Lu99 y EBC-1 transfectadas con ARNs si específicos de CDC45L (CDC45L-, HLA-A24+), células Lu99 y EBC-1 transfectadas con ARNs si de GFP de control (CDC45L+, HLA-A24+) (Fig. 5C) y células A549 (CDC45L+, HLA-A24-) se usaron como células diana. Según se muestra en la Fig. 5D, las líneas de c Tl generadas a partir del donante sano 4 (panel inferior, izquierda) y el paciente con cáncer de pulmón 18 (panel inferior, derecha) mediante estimulación con péptidos CDC45L-A24-9-109-2 (SEQ ID NO: 2) y CDC45L-A24-9-556-4 (SEQ ID NO: 4), respectivamente, exhibían citotoxicidad contra células Lu99 y células Lu99 transfectadas con ARNs si de GFP de control, pero no contra células Lu99 transfectadas con ARNs si específicos de CDC45L (paneles inferiores) ni células A549 (panel inferior, izquierda). De forma similar, los CTLs generados a partir del paciente con cáncer de pulmón 1 mediante estimulación con péptido CDC45L-A24-9-294-3 (SEQ ID NO: 3) exhibían citotoxicidad para células EBC-1 y EBC-1 transfectadas con A r Ns si, pero no para células EBC-1 transfectadas con ARNs si específicos de CDC45L ni células A549 (panel superior, izquierda). Además, los CTLs generados a partir de los pacientes con cáncer de pulmón 3 y 8 estimulados con péptido c Dc 45L-A24-9-370-7 (SEQ ID NO: 7) exhibían citotoxicidad para células EBC-1 y EBC-1 transfectadas con A r Ns si de GFP, pero no para células EBC-1 transfectadas con ARNs si específicos de CDC45L ni células A549 (panel superior, medio, derecha). Entre los cinco péptidos derivados de CDC45L inmunogénicos, tres, CDC45L-A24-9-109-2 (SEQ ID NO: 2), CDC45L-A24-9-294-3 (SEQ ID NO: 3) y CDC45L-A24-9-556-4 (SEQ ID NO: 4), producían CTLs específicos de CDC45L que podrían someter a lisis eficazmente células de cáncer de pulmón que expresaban naturalmente tanto CDC45L como HLA-A24. Estos resultados sugieren que estos tres péptidos derivados de CDC45L se podrían procesar naturalmente y presentarse en el contexto de moléculas de HLA-A24 en células cancerosas.
Para confirmar que los CTLs específicos para estos péptidos derivados de CDC45L reconocen las células diana de un modo restringido al HLA clase I, se usó un mAb específico para HLA class I (W6/32) para bloquear el reconocimiento por CTLs. La producción de IFN-gamma y la citotoxicidad eran inhibidas significativamente por el mAb de bloqueo contra HLA clase I, pero no por mAb anti-HLA clase II de control (Figs. 6A y B). Estos resultados indican claramente que estos CTLs inducidos reconocen las células diana que expresan CDC45L endógeno de un modo restringido a HLA clase I.
El péptido CDC45L-9-556-4 (SEQ ID NO: 4), 556KFLDALISL564, puede inducir CTLs restringidos tanto por HLA-A2 (A*0201) como por HLA-A24 (A*2402)
Se predijo que el péptido CDC45L-A2-9-556-4 (SEQ ID NO: 4, también denominado en la presente CDC45L-A24-9-556-4), 556KFLDALISL564, tenía una alta afinidad de unión no solo para HLA-A24 (A*2402) sino también para HLA-A2 (A*0201), según el programa de predicción de unión de péptidos a HLA SYFPEITHI (Institute for Immunology, University of Tubingen, Tubingen, Alemania, www.syfpeithi.de/). HLA-A*2402 es el alelo de HLA clase I más frecuente en la población japonesa, y HLA-A*0201 es uno de los alelos de HLA más comunes en diversos grupos étnicos, incluyendo asiático, africano, afroamericano y caucasiano (Browning M y cols. Immunol Today 1996;17:165-70). Así, se estableció como hipótesis que el péptido CDC45L-A2-9-556-4 (SEQ ID NO: 4) es un posible epítopo de CTL común restringido tanto por HLA-A2 como por HLA-A24. Para determinar si el péptido CDC45L-A2-9-556-4 (SEQ ID NO: 4) se puede unir a moléculas de HLA-A2, se realizó un ensayo de estabilización de HLA-A2 con células T2, según se describe previamente (Yokomine K y cols., Int J Cancer 2009;126:2153-63). El péptido CDC45L-A2-9-556-4 (SEQ ID NO: 4) se unía a moléculas de HLA-A2 con una capacidad superior para estabilizar HLA-A2 en comparación con el péptido HIV-A2, que se usaba como el control positivo (datos no mostrados). Así, se confirmaba la unión real del péptido a HLA-A2.
Posteriormente, se generaron CTLs específicos de CDC45L-A2-9-556-4 (SEQ ID NO: 4) a partir de las PBMCs de un donante sano positivo para HLA-A2 (A*0201) mediante estimulación con el péptido CDC45L-A2-9-556-4 (SEQ ID NO: 4). Las líneas de CTL generadas a partir del donante sano positivo a HLA-A2 producían IFN-gamma específicamente en respuesta a la reestimulación con células T2 impulsadas con el péptido (Fig. 7A). Además, las líneas de CTL generadas exhibían citotoxicidad contra células T2 impulsadas con el péptido CDC45L-A2-9-556-4 (SEQ ID NO: 4), pero no contra células T2 cargadas en el péptido HIV-A2 irrelevante o células C1R-A2402 cargadas con el péptido CDC45L-A2-9-556-4 (SEQ ID NO: 4) (Fig. 7B). Estos resultados indican que estos CTLs mediaban en la citotoxicidad específica para péptido de un modo restringido por HLA-A2. Por otra parte, las líneas de CTL generadas podrían someter a lisis eficazmente células Panc1 que expresaban moléculas de CDC45L y HLA-A2 (A*0201) endógenas pero no HLA-A24, y la citotoxicidad se inhibía significativamente mediante mAb de bloqueo contra HLA clase I (W6/32) pero no mediante mAb anti-HLA clase II de control, según se determina por un ensayo de liberación de 51Cr (Fig. 7C).
Estos resultados indican claramente que el péptido CDC45L-A2-9-556-4 (SEQ ID NO: 4) se procesaba naturalmente a partir de proteína CDC45L y se presentaba que no solo en el contexto de HLA-A24 sino también en el contexto de h La -A2 era reconocido por CTLs inducidos por péptido CDC45L-A2-9-556-4 (SEQ ID NO: 4) (Figs. 5D, 6 y Fig. 7). Así, CDC45L-A2-9-556-4 (SEQ ID NO: 4) es un epítopo de CTL común restringido tanto a HLA-A2 como a HLA-A24, y este péptido será aplicable a inmunoterapia para más de 80% de los pacientes japoneses con cáncer que exprese CDC45L.
Actividad antitumoral in vivo de CTLs humanos reactivos con CDC45L en ratones NOD/SCID.
Para valorar la eficacia terapéutica de la inoculación de CTLs reactivos con CDC45L en ratones inmunocomprometidos con células de cáncer de pulmón humano positivas a CDC45L implantadas, células Lu99 se inocularon subcutáneamente en ratones NOD/SCID. Después de 7 días, cuando los diámetros de los tumores alcanzaban aproximadamente 5 X 5 mm, los ratones fueron inyectados intravenosamente con CTLs humanos generados mediante la estimulación de células T CD8+ con DCs derivadas de monocitos autólogas (día 0) y blastos de PHA autólogos (días 7 y 14) impulsados con una mezcla de péptidos CDC45L-A24-9-109-2 (SEQ ID NO: 2), CDC45L-A24-9-294-3 (SEQ ID NO: 3) y CDC45L-A24-9-556-4 (SEQ ID NO: 4) o un péptido HIV-A24 irrelevante. Antes de la inoculación de CTLs en los ratones, se valoró la actividad citotóxica específica para el péptido de los CTLs (Fig. 8). Las líneas de CTL generadas a partir de dos donantes sanos que eran positivos a HLA-A24 producían IFN-gamma específicamente en respuesta a la reestimulación con células C1R-A2402 impulsadas con los péptidos, excepto para el péptido CDC45L-A24-9-294-3 (SEQ ID NO: 3) en el donante sano 5 (Fig. 8a ). Además, la mezcla de péptidos CDC45l producía CTLs que podrían someter a lisis eficazmente células Lu99, y la citotoxicidad se inhibía significativamente mediante mAb de bloqueo específico para HLA clase I en un ensayo de liberación de 51Cr (Fig. 8B). Por otra parte, las líneas de CTL exhibían lisis específica contra C1R-A2402 impulsado con péptido CDC45L-A24-9-109-2 (Se Q ID NO: 2), pero no contra C1R-A2402 impulsado con péptido CDC45L-A24-9-294-3 (SEQ ID NO: 3), CDC45L-A24-9-556-4 (SEQ ID NO: 4) o HIV-A24 irrelevante en el donante sano tanto 4 como 5 (Fig. 8C).
Los tumores en los ratones inoculados con los CTLs estimulados con CDC45L (n=5; media /desviación estándar [SD], 108 /- 65 mm2) eran significativamente menores que los de ratones inoculados con las células T CD8+ inducidas con péptido de VIH de control (n=5; media /- SD, 271 /- 94 mm2) o con PBS sola (n=5; media /- SD, 297 /- 44 mm2) el día 42 después de la inoculación de células Lu99 (prueba de la t de Student de dos colas, *P < 0,05, **P < 0,01; Fig. 8D). Los resultados indican claramente la eficacia de la terapia de transferencia adoptiva de CTLs humanos específicos de CDC45L contra tumores humanos positivos a CDC45L en ratones NOD/SCID.
En conclusión, se sugiere que el antígeno CDC45L es altamente inmunogénico y una diana prometedora para la inmunoterapia basada en péptidos del cáncer de pulmón sin provocar fenómenos autoinmunitarios.
Análisis
En el estudio actual, se identificó un nuevo TAA, similar al ciclo de división celular 45 (CDC45L), usando un análisis en micromatriz de ADNc del cáncer de pulmón. Los datos de la micromatriz mostraban que CDC45L se sobreexpresaba en cánceres de próstata, mama y vejiga urinaria así como en cáncer de pulmón. Según los datos obtenidos a partir del análisis en micromatriz de ADNc de la expresión del gen CDC45L en tejidos con cáncer de pulmón, la expresión del gen CDC45L se detectaba en los 4 tejidos con cáncer de pulmón, pero no en sus homólogos normales. Por otra parte, la expresión de CDC45L era escasamente detectable en muchos órganos vitales excepto los testículos en los análisis de RT-PCR y transferencia Northern en tejidos normales. Estos resultados sugieren que la orientación a CDC45L podría ser un nuevo enfoque inmunoterapéutico para estos cánceres, sin provocar enfermedades autoinmunitarias.
También se encontró que péptidos inmunogénicos derivados de CDC45L, CDC45L-A24-9-109-2, CDC45L-A24-9-204-3 y CDC45L-A24-9-556-4 podían inducir CTLs específicos de epítopo en ratones BALB/c inmunizados con péptidos emulsionados en adyuvante incompleto de Freund (datos no mostrados). Los ratones BALB/c inmunizados con los péptidos derivados de CDC45L y restringidos por H2-Kd, CDC45L-A24-9-109-2 y CDC45L-A24-9-204-3 no exhibían cambios patológicos, tales como infiltración de linfocitos o destrucción tisular, y no tenían signos de enfermedades autoinmunitarias, tales como pérdida de peso, diarrea y anormalidades cutáneas, durante un período de observación a largo plazo (datos no publicados). Estos resultados también indican que los péptidos derivados de CDC45L podrían inducir CTLs reactivos con péptido in vivo sin provocar enfermedades autoinmunitaria en ratones.
Se sabe bien que CDC45L tiene un papel crítico en las etapas de inicio y elongación de la replicación de ADN, por lo tanto, es difícil que se produzca pérdida de CDC45L en células cancerosas. En un estudio previo, Pollok y cols. mostraron que el nivel de proteína CDC45L era consecuentemente superior en células derivadas de cánceres humanos en comparación con células humanas primarias, y la expresión de CDC45L está estrechamente asociada con poblaciones celulares proliferativas (Pollk S, y cols. FEBS J 2007; 274: 3669-3684.). Estudios previos adicionales sugirieron que la regulación al alza de CDC45L dependía del grado de displasia y el estado de los nódulos linfáticos (Li JN, y cols. BMC Cancer 2008, 395: 1-8.). Por otra parte, Feng y cols. presentaron recientemente que la regulación a la baja de la expresión del gen CDC45L por el ARN si específico inhibía marcadamente el crecimiento de líneas celulares cancerosas tales como células Hela y HepG2 sugiriendo que CDC45L era una diana útil para la terapia contra el cáncer (Feng D, y cols. Cancer Res 2003; 63: 7356-7364.). Un informe reciente resume que el grado de respuesta objetiva de una vacuna contra el cáncer en experimentos clínicos era bajo (2,6%) (Rosenberg S A, y cols. Nat Med 2004;10:909-15.). Una posible razón es que el escape inmunitario de células cancerosas atribuido a la eliminación, la mutación o una regulación a la baja de los the TAAs se produce como consecuencia de la selección inmunitaria conducida terapéuticamente. Basándose en el punto de vista de que las células tumorales no pueden perder antígenos que se requieren para la tumorigénesis, CDC45L se considera un posible candidato de TAA útil para inmunoterapia contra el cáncer. En la presente invención, se identificaron cinco péptidos epitópicos de CDC45L restringidos por HAL-A24, CDC45L-A24-9-109-2, CDC45L-A24-9-294-3, CDC45L-A24-9-556-4, CDC45L-A24-9-370

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un péptido aislado de menos de 15 aminoácidos que tiene inducibilidad de linfocitos T citotóxicos (CTLs), en donde dicho péptido es un fragmento inmunológicamente activo de un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 o uno de sus péptidos modificados, y en donde dicho péptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:
(a) SEQ ID NOs: 3; y
(b) SEQ ID NO: 3, en la que están sustituidos 1 o 2 aminoácidos.
2. El péptido aislado según la reivindicación 1, en donde dicho péptido tiene una o ambas de las siguientes características:
(a) el segundo aminoácido desde el extremo N en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 está sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en fenilalanina, metionina y triptófano; y (b) el aminoácido C-terminal en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 está sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en fenilalanina, isoleucina, triptófano y metionina.
3. El péptido aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde dicho péptido es un nonapéptido o un decapéptido.
4. El péptido aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho péptido consiste en la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:
(a) SEQ ID NO: 3; y
(b) SEQ ID NO: 3, en la que están sustituidos 1 o 2 aminoácidos.
5. Un polinucleótido aislado que codifica el péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el polinucleótido consiste en menos de 45 nucleótidos.
6. Una composición para inducir un CTL, en donde la composición comprende uno o más de los péptidos indicados en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o uno o más de los polinucleótidos indicados en la reivindicación 5.
7. Una composición farmacéutica para el uso en el tratamiento y/o la profilaxis de cánceres, y/o la prevención de su recaída posoperatoria, en donde la composición farmacéutica comprende uno o más de los péptidos indicados en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o uno o más de los polinucleótidos según la reivindicación 5.
8. La composición farmacéutica para el uso según la reivindicación 7, que está formulada para la administración a un sujeto cuyo antígeno HLA es HLA-A24.
9. Un método in vitro o ex vivo para inducir una célula que presenta antígenos (APC) con inducibilidad de CTL, en donde el método comprende una etapa seleccionada del grupo que consiste en:
(a) poner en contacto una APC con el péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 in vitro o ex vivo, y
(b) introducir un polinucleótido que codifica el péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en una APC in vitro o ex vivo.
10. Un método in vitro o ex vivo método para inducir un CTL, en donde el método comprende una etapa seleccionada del grupo que consiste en:
(a) cocultivar una célula T positiva a CD8 con una APC, que presenta sobre su superficie un complejo de un antígeno HLA y el péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4;
(b) cocultivar una célula T positiva a CD8 con un exosoma, que presenta sobre su superficie un complejo de un antígeno HLA y el péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4; y
(c) introducir un polinucleótido que codifica una subunidad de receptor de células T (TCR) capaz de unirse al péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en una célula T.
11. Una APC aislada que presenta sobre su superficie un complejo de un antígeno HLA y el péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
12. Un CTL aislado que se orienta al péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
13. Una composición para el uso en un método para inducir una respuesta inmunitaria contra el cáncer en un sujeto, en donde la composición comprende uno o más péptidos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o uno o más polinucleótidos que codifican el péptido.
14. Un anticuerpo que se une específicamente al péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 3.
15. Un vector que comprende una secuencia nucleotídica que codifica el péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde en cuanto al ácido nucleico que codifica el péptido, la molécula de ácido nucleico consiste en menos de 45 nucleótidos.
16. Una célula hospedadora transformada o transfectada con un vector de expresión según la reivindicación 15.
17. Un estuche de diagnóstico que comprende el péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, el polinucleótido según la reivindicación 5 o el anticuerpo según la reivindicación 14.
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