KR101765452B1 - Ｃｄｃ４５ｌ펩티드 및 이를 포함하는 백신 - Google Patents

Abstract

본 발명은 HLA 항원에 결합하고 세포독성 T 림프구(CTL)을 유도하는 서열번호 18 펩티드를 제공한다. 상기 펩티드는 한 개, 두개 또는 복수의 아미노산 서열의 치환, 결실 또는 첨가가 있는 상기 언급된 아미노산 중 하나를 포함할 수 있다. 또한 본 발명은 이러한 펩티드를 포함하는 약학적 조성물을 포함한다. 본 발명의 펩티드는 암 치료에 이용될 수 있다.

Description

ＣＤＣ４５Ｌ펩티드 및 이를 포함하는 백신{CDC45L PEPTIDES AND VACCINES INCLUDING THE SAME}

우선권

본 출원은 2009년 5월 26일에 출원된 미국 가출원 제 61/217,133호에 대한 우선권을 주장하며, 전체 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명은 생물과학 분야, 보다 구체적으로 암 치료 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 암 백신, 및 종양의 치료 및 예방을 위한 약물로 매우 효과적인 신규한 펩티드에 관한 것이다.

폐암은 1년 당 암의 10,900,000의 새로운 유형 중 13,500,000으로 간주되며 암의 제일 일반적인 형태이다. 이것은 또한 전세계의 암에 연관된 67,000,000 중 11,800,000로 간주되며, 암에 연관된 질병으로부터 사망의 중요한 원인이다(비특허문헌 1). 화학요법 및 분자-표적 치료와 같은 침투성 치료에서 최근의 개선에도 불구하고, 진행중인 폐암 환자의 예측은 여전히 부족하다(비특허문헌 2). 폐암은 수술 후 환자의 50%에서 재발하였고, 환자의 25% 미만이 침투성 화학요법에 대해 반응하였다. 따라서, 더 효과적인 치료 양식은 급히 요구되며, 면역치료는 폐암 치료에 대한 하나의 유망한 접근을 제시한다(비특허문헌 3-5).

치료적 암 백신의 성공은 근본적으로 정상조직에 비해 암에서 과발현되는 면역성 항원의 발견에 의존할 수 있다. 종양 관련 항원(tumor-associated antigen, TAA)의 효과적인 세포 독성 T 림프구 유도는 유망한 결과를 나타냈다(비특허문헌 6-7). 최근에, 게놈(genome) 정보와 함께, cDNA 마이크로어레이 기술의 발달은 악성 세포의 유전자 발현의 종합적인 프로필(profiles)을 제공하였다(비특허문헌 8). cDNA 마이크로어레이 기술과 함께 유전자 발현 프로파일링(profILing)은 암 진단 및 면역치료에 유용한 새로운 TAA의 발견에 대한 효과적인 접근법으로 여겨진다(비특허문헌 9-12).

폐암에서 발현된 몇몇의 TAA 후보가 발표되었지만(비특허문헌 13-14), 더 효과적인 T 세포를 매개하는 암 면역치료를 개발하기 위해 제공된 암에서 과발현하는 다수의 TAA를 찾는 것은 중요하다(비특허문헌 15).

세포 분열 주기 45-유사(cell division cycle 45-like, CDC45L)는 세포주기마다 한 번만 복제되는 염색체 DNA를 보장하는 DNA 복제의 개시 및 연장 모두에서 기능하는 필수적인 세포내 단백질이다(비특허문헌 16-19). CDC45L는 모든 진핵세포 중에서 상당히 보존되어있고, 상기 유전자의 표적 중단은 배아의 치명적임을 야기한다(비특허문헌 20). 성인 인간에서, 세포의 대다수는 분화되었고 세포 분열이 중단되어있으며, 세포의 작은 개체군만이 약간의 자기-재생하는 조직에서 증식하고 있다(비특허문헌 21). 따라서, 장기간 진행이 중단된 최종적으로 분화되고 노화된 인간세포에서 CDC45L이 부재하나, 증식하는 암세포의 세포 주기 동안 존재한다(비특허문헌 18). 그래서, CDC45L 발현은 증식하는 세포 개체군에 강하게 연관되며, 따라서, 암 세포 생물학에서 새로운 증식 마커에 대한 유망한 후보로 여겨진다(비특허문헌 18 및 22). 하지만, 암 면역치료에 대한 표적으로서 CDC45L의 유용함은 아직 완전히 연구되지 않았다.

Parkin DM et al. CA Cancer J Clin 2005;55:74-108 Bunn PA, Jr. et al. Conclusion. Oncologist 2008;13 Suppl 1:37-46 Ruttinger D et al. Surg Oncol Clin N Am 2007;16:901-18 Hirschowitz EA et al. Proc Am Thorac Soc 2009;6:224-32 Romero P et al. Clin Lung Cancer 2008;9 Suppl 1:S28-36 Stevanovic S et al. Nat Rev Cancer 2002;2:514-20 Brichard VG et al. Vaccine 2007;25 Suppl 2:B61-71 Hasegawa S et al. Cancer Res 2002;62:7012-7 Mathiassen S et al. Eur J immunol 2001;31:1239-46 Schmidt SM et al. Cancer Res 2004;64:1164-70 Yamabuki T et al. int J Oncol 2006;28:1375-84 imai K et al. Clin Cancer Res 2008;14:6487-95 Harao M et al. int J Cancer 2008;123:2616-25 Yokomine K et al. int J Cancer 2009;126:2153-63 Fukushima S et al. J immunother 2009;32:219-31 Aparicio T et al. Nucleic Acids Res 2009;37:2087-95 Saha P et al. J Biol Chem 1998;273:18205-9 Pollok S et al. FEBS J 2007;274:3669-84 Bauerschmidt C et al. Genes Cells 2007;12:745-58 Pollok S et al. Biochem Biophys Res Commun 2007;362:910-5 Hall PA et al. Development 1989;106:619-33 Li JN et al. BMC Cancer 2008;8:395

본 발명의 다양한 측면 및 적용은 도면의 간단한 설명 및 본 발명의 상세한 설명 및 하기의 이것의 선호되는 실시태양을 고려시에 당업자에게 자명할 것이다.
[도 1a 내지 d]
도 1은 인간 정상 조직, 암 세포주 및 암 조직에서 발현하는 CDC45L mRNA 분석 결과를 묘사하는 A 내지 F의 일련의 사진으로 구성된다. A, B 부분: 다양한 정상 조직에서 발현하는 CDC45L mRNA의 RT-PCR 및 노던 블랏 분석. C 부분: 다양한 암 세포주에서 발현된 CDC45L mRNA의 RT-PCR 분석. D 부분: 폐암 조직 및 인접한 정상 암 조직에서 발현된 CDC45L mRNA의 RT-PCR 분석.
[도 1e 내지 f]
E 부분: 위, 간담즙성, 유방, 췌장 및 결장암 유래 다양한 암세포주에서 발현하는 CDC45L의 RT-PCR 분석.
F 부분: 선암(adenocarcinoma), 스쿠아마우스 상피성암(squamous carcinoma), 소세포 상피성암(small cell carcinoma), 정상 폐, 고환 및 정상 피부에서 발현하는 CDC45L 단백질의 면역조직화학적 분석(원래 배율 X400). 양성 염색 신호는 갈색으로 보여진다. 스케일 바, 50 micro-m.
[도 2]
도 2는 PBMC 유래 CDC45L 특이적 CTL의 유도에 대한 프로토콜을 나타낸다. PBMC는 기증자로부터 분리하였고, CD8+ T 세포 및 CD14+ 세포는 항-CD8 mAb 또는 항-CD14 mAb가 코팅된 마이크로비드(microbeads)를 이용하여 각각 HLA-A24 양성 건강한 기증자 및 폐암 환자의 상기 PBMC를 분리하였다. DC를 CD14+ 세포로부터 GM-CSF 및 IL-4가 있는데서 5일 동안 배양을 통하여 수득하였다. DC를 베타-2-마이크로글로불린(beta 2-microglobulin)이 있는데서 HLA-A24 결합 펩티드로 2 시간 동안 37 ℃에서 자극하였다. 이러한 펩티드로 자극한 DC를 방사능 처리하였고, 자가유래 CD8+ T세포와 1:20 비율로 펩티드에 반응하는 CTL을 만들기 위해 혼합하였다. 세포를 2% 자가 혈청으로 보충된 AiM-V에서 IL-7과 함께 0일에 배양하였고, 이러한 배양은 2일에 IL-2로 보충하였다. 펩티드가 로드된(loaded) 자가유래 PHA-아세포(PHA-blasts)의 두 번의 추가적인 주 1회의 자극을 7일 및 14일에 수행하였다. CD8+ T 세포의 펩티드 자극 3차 후에 6일에 iNF-감마(iNF-gamma) ELISPOT, CD107a 동원 및 ⁵¹Cr 방출 분석을 수행하였다.
[도 3]
도 3은 건강한 기증자에서 CDC45L 유래 펩티드에 반응하는 CTL을 나타내는 A 내지 C의 일련의 막대 그래프로 구성된다. A, B, C 부분: HLA-A24 양성 건강한 기증자로부터 만들어진 CDC45L 펩티드에 반응하는 CTL의 ELISPOT 분석(A, C 건강한 기증자-1; B, 건강한 기증자-4). CD8+ T 세포를 자가유래 단핵구 유래 DC(0일)로 자극하였고, 자가유래 PHA-아세포(7일 및 14일)를 16 개 후보 펩티드들의 4 개의 혼합물로 자극하였다(서열번호: 1 내지 16). CTL을 20일에 수집하였고, ELISPOT 분
석으로 IFN-감마를 생산하는 CTL을 탐지하였다. 막대는 상기 CTL 세포주를 CDC45L 유래 펩티드로 자극한 C1R-A2402 세포(open bars) 또는 상관없는 HIV-A24 펩티드(closed bars)로 다시 자극하였을 때, IFN-감마 점의 수를 나타낸다. 상기 효과기세포-표적세포 비율은 10:1이다. 데이타는 3회 분석의 평균 ＋／－ 표준편차로 나타낸다. 각각의 기증자에 대한 유사한 결과의 두 개의 독립적인 실험의 대표적인 것이 보여진다.
[도 4]
도 4는 항원 자극 후에 CD8+ T 세포의 세포 표면에 노출된 CD107a의 수준을 나타내는 일련의 패널로 구성된다. 모든 펩티드들을 1 ㎍/㎖의 최종 농도로 사용하였다. 나타낸 사건들은 CD8+ T 세포에 대하여 게이트된다. 위에 있는 패널과 중간 패널: 상기 동족 CDC45L 유래 펩티드로 자극. 아래 패널: 상관없는 HIV-A24 펩티드로 자극. 플랏(plot)안의 숫자는 사분면 특징(CD8+ CD107a+ T 단핵구)과 함께 세포 개체군의 백분율을 나타낸다. 각 레인(lane)은 유사한 결과와 함께 두 개의 독립적인 실험의 대표적인 것이다.
[도 5a-c]
도 5는 HLA-A24 양성 폐암 환자의 PBMC 유래 CDC45L 특이적 인간 CTL의 유도를 나타내는 일련의 A 내지 D 그래프로 구성된다. A 부분: CDC45L-A24-9-109-2 (서열번호 2), CDC45L-A24-9-294-3 (서열번호 3), CDC45L-A24-9-556-4 (서열번호 4), CDC45L-A24-9-370-7 (서열번호 7) 또는 CDC45L-A24-10-556-12 (서열번호 12)펩티드로 자극된 표적 세포와 공배양된 상기 암 환자 유래 유도된 CTL의 ELISPOT 분석. 펩티드 자극된 C1R-A＊2402 세포로 자극된 상기 IFN-감마 생산은 HIV 펩티드 자극된 C1R-A＊2402 세포로 자극된 것보다 현저히 많았다. 막대는 CTL 세포주가 CDC45L 유래 펩티드(open bars) 또는 상관없는 HIV-A24(closed bars)로 자극된 C1R-A2402 세포로 다시 자극되었을 때, IFN-감마 점의 숫자를 나타낸다. 상기 효과기세포-표적세포 비율은 10:1이었다. 데이타는 3회 분석의 평균 ＋／－ 표준편차로 보여진다. B 부분: 상기 동족 CDC45L 유래 펩티드로 자극한 C1R-A2402 세포에 대한 CTL의 세포독성 (흰색 삼각형; CDC45L-A24-9-109-2 (서열번호 2), CDC45L-A24-9-294-3 (서열번호 3), CDC45L-A24-9-556-4 (서열번호 4), CDC45L-A24-9-370-7 (서열번호 7) 또는 CDC45L-A24-10-556-12 (서열번호 12)) 및 상관없는 HIV-A24 펩티드로 자극된 C1R-A2402 세포(검은색 삼각형) 각각의 값은 3회 분석의 평균 값에 기초하여 계산된 특이적 세포 용해의 백분율을 나타낸다. C 부분: 항-CDC45L 항체를 사용한 Lu99 세포 (왼쪽 패널, 레인 1), CDC45L siRNA으로 형질전환된 Lu99 세포 (왼쪽 패널, 레인 2) 또는 대조군 GFP siRNA (왼쪽 패널, 레인 3) 및 EBC-1 세포 (오른쪽 패널, 레인 1), CDC45L siRNA으로 형질전환된 EBC-1 세포 (오른쪽 패널, 레인 2) 또는 대조군 GFP siRNA (오른쪽 패널, 레인 3) 유래 전체 세포 용해물의 웨스턴 블랏(Western blot)분석. 베타-액틴(Beta-actin)을 내재 대조군으로 사용하였다.
[도 5d]
D 부분: Lu99 및 EBC-1 표적세포에서 CDC45L 단백질의 하향조절에 의한 CTL의 CDC45L 특이적 세포 독성 활성의 폐지(CDC45L+, HLA-A＊2402+). Lu99, EBC-1, CDC45L siRNA Lu99, CDC45L siRNA EBC-1, GFP siRNA Lu99, GFP siRNA EBC-1 또는 A549에 대한 CTL의 세포독성 활성이 ⁵¹Cr 방출 분석에 의해 분석되었다. 각각의 값은 3회 분석의 평균 값에 기초하여 계산된 상기 특이적 세포용해의 백분율을 나타낸다.
[도 6]
도 6은 항-HLA 클래스(class) Ⅰ mAb에 의한 CDC45L에 반응하는 CTL반응의 저해를 나타내는 일련의 그래프로 구성된다. Lu99-표적세포를 항-HLA 클래스 Ⅰ mAb (W6/32, IgG2a) 또는 대조군 항-HLA 클래스 Ⅱ mAb (IgG2a)와 1시간 동안 함께 배양한 후에, Lu99 세포를 DC45L-A24-9-109-2 (서열번호 2), CDC45L-A24-9-294-3 (서열번호 3), CDC45L-A24-9-556-4 (서열번호 4) 또는 CDC45L-A24-9-370-7 (서열번호 7) 펩티드로 자극한 건강한 기증자 또는 폐암환자의 CD8+ T 세포로부터 만들어진
상기 CTL과 공배양하였다. CTL에 의해 매개된 IFN-감마 생산(A 부분) 및 세포독성(B 부분)이 보여진다. 흰색 원, Lu99; 검정색 원, Lu99 + W6/32; 흰색 상자, Lu99 + 대조군 mAb. 데이타는 3회 분석의 평균 ＋／－ 표준편차로 제시된다. 통계학적으로 현저한 차이는 별표로 표시된다(＊P <0.05).
[도 7]
도 7은 CDC45L-A2-9-556-4 (서열번호 4, 또한 본 발명에서 CDC45L-A24-9-556-4로 언급된)으로 자극에 의해 HLA-A24 (A＊2402) 및 HLA-A2 (A＊0201) 모두로 제한된 CTL의 유도를 나타내는 A 내지 C의 일련의 그래프로 구성된다. A 부분: CDC45L-A2-9-556-4 (서열번호 4)펩티드로 자극한 T2 세포와 공배양된 HLA-A＊0201 양성 건강한 기증자 유래 CTL의 IFN-감마 ELISPOT 분석. 데이타는 3회 분석의 평균 ＋／－ 표준편차로서 제시된다. B 부분: CDC45L-A2-9-556-4 (서열번호 4) 펩티드로 자극된 T2 세포 (흰색 삼각형), 대조군 HIV-A2 펩티드로 자극한 T2 세포 (검정색 삼각형), 및 CDC45L-A2-9-556-4 (서열번호 4) 펩티드로 자극된 C1R-A2402 세포(검정색 사각형)에 대한 CTL의 세포독성 활성을 ⁵¹Cr 방출 분석으로 분석. C 부분: ⁵¹Cr-방출 분석으로 분석한 항-HLA 클래스 Ⅰ mAb에 의한 CDC45L에 반응하는 CTL 반응의 저해. Panc1-표적 세포(CDC45L+, HLA-A2+, HLA-A24-)를 항-HLA 클래스 Ⅰ mAb (W6/32, IgG2a) 또는 대조군 항-HLA 클래스 Ⅱ mAb (IgG2a)와 함께 1시간 동안 배양한 후, Panc1 세포를 CDC45L-A2-9-556-4 (서열번호 4) 펩티드로 자극한 HLA-A＊0201 양성 건강한 기증자의 CD8+ T세포에서 만들어진 CTL과 함께 공배양하였다. 흰색 원, Panc1 세포; 검정 원, Panc1 + W6/32; 흰색 사각형, Panc1 + 대조군 mAb. 각각의 값은 3회 분석의 평균 값에 기초하여 계산된 특정한 세포용해의 백분율을 나타낸다. 유사한 결과와 함께 3개의 독립적인 실험으로부터 대표적인 데이타가 보여진다.
[도 8a-b]
도 8은 NOD/SCID 마이스(mice)에서 CDC45L에 반응하는 인간 CTL의 생체내 항종양 활성을 나타내는 A 내지 D의 일련의 그래프로 구성된다. A, B, C 부분: 세 개의 CDC45L 유래 펩티드의 혼합물로 자극된 두 명의 건강한 기증자로부터 만들어진 인간 CTL의 펩티드 특이적 세포독성 활성. A 부분: CDC45L-A24-9-109-2 (서열번호 2), CDC45L-A24-9-294-3 (서열번호 3) 또는 CDC45L-A24-9-556-4 (서열번호 4) 펩티드로 각각 자극된 C1R-A2402 세포와 공배양된 CTL의 IFN-감마 ELISPOT 분석. B 부분: ⁵¹Cr 방출 분석에 의해 분석된 항-HLA 클래스 Ⅰ mAb가 없거나(흰색 원) 있는데서(W6/32, 검정색 원) 또는 대조군 항-HLA 클래스 Ⅱ mAb (흰색 사각형)의 Lu99 (CDC45L+, HLA-A24+)에 대한 CTL의 CDC45L 특이적 세포독성.
[도 8c-d]
C 부분: ⁵¹Cr 방출 분석에 의해 분석된 세 개의 CDC45L 유래 펩티드(흰색 원, CDC45L-A24-9-109-2 (서열번호 2); 흰색 사각형, CDC45L-A24-9-294-3 (서열번호 3); 흰색 삼각형, CDC45L-A24-9-556-4 (서열번호 4)) 또는 상관없는 HIV-A24 펩티드(검정색 원) 중 하나로 자극된 C1R-A2402 세포에 대한 CTL 세포독성 활성. D 부분: CDC45L로 유도된 CTLs (검정색 사각형, n = 5), 대조군 CD8+ T 세포 (흰색 마름모, n = 5) 또는 PBS 단독 (흰색 원, n = 5)을 정맥안으로 접종한 NOD/SCID 마이스의 종양. 피하지방으로 종양 이식 후에 7일자에 종양 크기가 약 25 mm2에 도달하였을 때, 세 개의 CDC45L 펩티드의 혼합물에 반응하는 인간 CTL(4 × 10⁶)을 정맥안으로 접종하였다. 상기 CTL 접종은 14일에 반복하였다. 또한, HIV 펩티드로 제한된 상관없는 HLA-A24로 자극한 상기 대조군 CD8+ T 세포는 대조군으로 마이스로 접종되었다. 각 종양 크기는 평방 밀리미터(mILlimeters)로 표현되었다. 각 부호는 마이스의 각 그룹에서 평균 종양 크기를 나타낸다; 막대는 표준편차를 나
타낸다. 양측검정 스튜던트티이검정(Two-taILed Student's t-test)을 42일 자에 두 그룹 사이의 차이의 의미를 확인하기 위해 사용하였다.

발명의 개요

본 발명은 면역치료에 쓰일 수 있는 표적의 발견에 대한 적어도 그의 일부에 기초한다. TAA는 때때로 면역계에 의해 "자기"로 인지되어 종종 면역원성이 없기 때문에 적절한 표적의 발견은 중요하다. 상기 언급한 바와 같이 CDC45L(대표적인 아미노산 서열 및 유전자 서열은 서열번호 18 및 서열번호 17에 각각 제시되며, 또한 상기 서열은 GenBank Accession No. NM_003504로 구할 수 있다)은 고환종양, 췌장암, 방광암, 비소세포폐암, 소세포폐암, 유방암, 식도암, 전립선암, 만성골수성백혈병, 연조직 종양, 위암, 간담즙성암 및 결장암을 포함하지만, 한정하지 않는 암에서 상향-조절되는 것으로 확인되었다. 따라서, CDC45L은 암/종양 면역치료의 표적에 대한 후보이다.

또한, 본 발명은 CDC45L 에 특이적인 CTL을 유도하는 능력을 가지는, CDC45L 의 유전자 산물의 특이적 에피토프(epitope) 펩티드의 확인에 관한 것이다. 아래 기재한 것과 같이, 자극된 건강한 공여자로부터 수득된 말초 혈액 단핵구 세포(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)는 CDC45L 유래 HLA-A＊2402 또는 HLA-A＊0201에 결합하는 후보 단백질로 자극되었다. 각 후보 펩티드에 의해 자극된 상기 HLA-A24 또는 HLA-A2 양성 표적 세포에 대해 특이적 세포독성을 갖는 CTL 세포주가 확립되었다. 이러한 결과는 이러한 펩티드가 CDC45L를 발현하는 세포에 대해 강력하고 특이적 면역반응을 유도할 수 있는 HLA-A24 또는 HLA-A2에 제한적인 에피토프 펩티드임을 증명한다. 또한, 이러한 결과는 CDC45L 은 강한 면역성이 있으며 그것의 에피토프는 암/종양 면역치료에 효과적인 표적임을 증명한다.

따라서, 본 발명의 목적은 분리된 HLA 항원에 결합하는 특히, CDC45L (서열번호 18) 유래 펩티드 또는 이의 면역학적 활성 단편인 분리된 펩티드를 제공하는 것이다. 이러한 펩티드는 CTL 유도성을 갖는 것으로 예상되며, 그들은 체외에서 CTL을 유도하는데 사용하거나 또는 고환종양, 췌장암, 방광암, 비소세포폐암, 소세포폐암, 유방암, 식도암, 전립선암, 만성골수성백혈병, 연조직 종양, 위암, 간담즙성암 및 결장암 및 이와 유사한 암에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 개체에 투여되는 것에 사용될 수 있다. 바람직한 펩티드들은 노나펩티드(nonapeptides) 또는 데카펩티드(decapeptides)이며, 더욱 바람직하게, 서열번호 1 내지 16 중에서 선택되는 아미노산 서열을 가진다. 이들 중에, 상기 펩티드들은 서열번호 2, 3, 4, 7 및 12 중에서 선택되는 아미노산 서열을 가지는 상기 펩티드들은 강한 CTL 유도성을 보이므로, 가장 바람직하다.

본 발명은 서열번호 2, 7, 8, 16, 25, 30 및 31의 아미노산 서열을 가지는 변형된 펩티드에 관한 것이고, 원래의 CTL 유도성을 유지하는 한 이 중, 한 개, 두 개 또는 복수의 아미노산이 치환 또는 첨가될 수 있다.

본 발명의 펩티드는 결과적인 수정된 펩티드들이 원래의 CTL 유도성을 유지하는 한, 이 중, 한 개, 두 개 또는 복수의 아미노산이 교체, 삭제 또는 첨가되는 펩티드들을 포함한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 펩티드 중 어느 것을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드(polynucleotides)를 제공한다. 본 발명의 펩티드와 유사하게, 이러한 폴리뉴클레오티드는 CTL 유도성이 있는 APC를 유도하기 위해 사용되거나 암에 대한 면역반응을 유도하기 위해 개체에 투여될 수 있다.

개체에 투여하였을 경우, 본 발명의 펩티드는 각각의 펩티드를 표적으로 하는 CTL을 유도하기 위해, 바람직하게는 APC의 표면에 제시된다. 따라서, 본 발명의 다른 목적은 본 발명의 하나 또는 그 이상의 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물 또는 물질(substances) 와 같은 CTL을 유도하는 조성물 또는 물질을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명은 암의 치료 및/또는 예방 뿐만 아니라 그것의 수술 후 재발의 예방을 위해 제조된 본 발명의 하나 또는 그 이상의 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드조성물 또는 물질을 고려하며, 고환종양, 췌장암, 방광암, 비소세포폐암, 소세포폐암, 유방암, 식도암, 전립선암, 만성골수성백혈병, 연조직 종양, 위암, 간담즙성암 및 결장암과 같은 암을 포함하나, 한정하지 않는다. 따라서, 또한, 본 발명은 암의 치료 및/또는 재발 및/또는 그것의 수술 후 재발의 예방을 위한 하나 또는 그 이상의 본 발명의 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학적 조성물 또는 물질과 같은 약학적 조성물 또는 물질을 제공한다. 게다가 상기 언급한 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 대신에, 상기 약학적 조성물 또는 물질은 선택적으로 본 발명의 펩티드 중 하나 또는 그 이상을 제시하는 APC 또는 엑소솜을 유효 성분으로 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 HLA항원 및 본 발명의 펩티드의 복합체를 그들의 표면에 제시하는 APC, 예를 들면, 본 발명의 펩티드가 있는 개체 유래 APC를 접촉하거나 APC로 이러한 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 도입함으로써 유도할 수 있다. 이러한 APC는 표적 펩티드에 대하여 높은 CTL 유도성을 가지며, 암 면역치료에 대해 유용하다. 따라서, 본 발명은 CTL 유도성이 있는 APC를 유도하기 위한 방법 및 이러한 방법으로 수득한 APC를 포함한다.

또한, 본 발명은 CD8 양성 세포 및 본 발명의 펩티드를 그것의 표면에 제시하는 APC 및 엑소솜과 공배양하는 단계를 포함하는 CTL을 유도하기 위한 방법을 제공한다. 그 대신에, 상기 방법은 본 발명의 펩티드에 결합할 수 있는 T 세포 수용체(T cell receptor, TCR) 아단위(subunit)에 대해 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자를 도입하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 이러한 방법에 의해 수득된 CTL은 암의 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있으며, 이것의 예로 고환종양, 췌장암, 방광암, 비소세포폐암, 소세포폐암, 유방암, 식도암, 전립선암, 만성골수성백혈병, 연조직 종양, 위암, 간담즙성암 및 결장암을 포함하지만, 한정하지 않는다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 의해 수득된 CTL을 포함한다.

이제 그것이 필요한 개체의 암에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공하기 위한 본 발명의 다른 목적은, 본 발명의 상기 CDC45L 폴리펩티드 또는 그것의 면역학적 활성 단편을 포함하고, 본 발명의 CDC45L 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이러한 CDC45L 폴리펩티드를 제시하는 엑소솜 또는 APC를 포함하는 조성물 또는 물질을 투여하는 단계를 포함하는 방법이다.

특히, 본 발명은 하기의 [1] 내지 [22]를 제공한다;

[1] HLA 항원에 결합하고 세포독성 T 단핵구(cytotoxic T lymphocytes, CTL) 유도성을 갖는 서열번호 18의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드 또는 이의 면역 활성 조각으로 구성된 폴리펩티드로부터 유래된 분리된 펩티드,

[2] 상기 HLA 항원이 HLA-A24 또는 A2인 [1]의 분리된 펩티드,

[3] 하기의 군으로부터 선택된 아미노산을 포함하는 [1] 또는 [2]의 펩티드:

(a) 서열번호 4, 2, 3, 7 및 12; 및

(b) 한 개, 두 개 또는 몇몇의 아미노산이 치환, 삽입, 결실 및/또는 첨가된 서열번호 4, 2, 3, 7 및 12.

[4] 하기 특성 중 하나 또는 둘 다를 갖는 [1] 내지 [3] 중 어느 하나의 분리된 펩티드:

(a) N-말단으로부터 두 번째 아미노산이 페닐알라닌(phenylalanine), 티로신(tyrosine), 메티오닌 (methionine)및 트립토판(tryptophan)으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산으로 변경된 분리된 펩티드: 및

(b) C-말단 아미노산이 페닐알라닌, 루신(leucine), 이소루신(isoleucine), 트립토판 및 메티오닌으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산으로 변경된 분리된 펩티드,

[5] 하기 특성 중 하나 또는 둘 다를 갖는 [1] 내지 [3] 중 어느 하나의 분리된 펩티드:

(a) N-말단으로부터 두 번째 아미노산이 루신 및 메티오닌으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산으로 변경된 분리된 펩티드: 및

(b) C-말단 아미노산이 발린(valine) 및 루신으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산으로 변경된 분리된 펩티드,

[6] 펩티드가 노나펩티드(nonapeptide) 또는 데카펩티드(decapeptide)인 [1] 내지 [5] 중 어느 하나의 분리된 펩티드,

[7] [1] 내지 [6] 중 어느 하나의 펩티드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드,

[8] [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 하나 또는 그 이상의 펩티드 또는 [7]에 기재된 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드로 구성된 CTL을 유도하는 조성물,

[9] 암의 치료 및/또는 예방, 및/또는 그것의 수술후 재발의 예방을 위한 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 하나 또는 그 이상의 펩티드 또는 [7]에 기재된 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드로 구성된 약학적 조성물,

[10] HLA 항원이 HLA-A24 또는 HLA-A2 인 개체에 투여하기 위해 제조된 [9]의 약학적 조성물,

[11] 암의 치료를 위해 제조된 [9] 또는 [10] 의 약학적 조성물,

[12] 하기로 구성된 군으로부터 선택된 단계를 포함하는 CTL 유도가능성이 있는 항원 제시 세포(antigen-presenting cell, APC)를 유도하는 방법:

(a) APC를 [1] 내지 [6] 중 어느 하나의 펩티드와 시험관 내, 체외 또는 생체 내에서 접촉하는 단계,

(b) [1] 내지 [6] 중 어느 하나의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 APC로 도입하는 단계,

[13] 하기로 구성된 군으로부터 선택된 단계로 구성된 CTL 유도 방법:

(a) HLA 항원 및 [1] 내지 [6] 중 어느 하나의 펩티드의 복합체를 그들의 표면에 제시하는 APC를 CD8 양성 T 세포와 공배양하는 단계;

(b) HLA 항원 및 [1] 내지 [6] 중 어느 하나의 펩티드의 복합체를 그들의 표면에 제시하는 엑소솜을 CD8 양성 T 세포와 공배양하는 단계;및

(c) [1] 내지 [6] 중 어느 하나의 펩티드에 결합할 수 있는 T 세포 수용체(T cell receptor, TCR) 아단위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 유전자를 T 세포에 도입하는 단계,

[14] HLA 및 [1] 내지 [6] 중 어느 하나의 펩티드의 복합체를 그것의 표면에 제시하는 분리된 APC,

[15] [12]의 방법에 의해 유도된 [14]의 상기 APC,

[16] [1] 내지 [6] 의 펩티드 중 어느 하나를 표적으로 하는 분리된 CTL,

[17] [13]의 방법에 의해 유도된 [16]의 상기 CTL,

[18] 하나 또는 그 이상의 [1] 내지 [6]의 펩티드, 하나 또는 그 이상의 그것의 면역학적 활성 단편 또는 하나 또는 그 이상의 상기 펩티드 또는 그것의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하는 개체의 암에 대한 면역반응을 유도하는 방법,

[19] [1] 내지 [6] 의 펩티드 중 어느 하나에 대한 항체 또는 그것의 단편,

[20] [1] 내지 [6]의 펩티드 중 어느 하나를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터(vector),

[21] [20]에 따른 발현 벡터에 형질전환되거나 형질도입된 숙주세포, 및

[22] [1] 내지[6]의 펩티드 중 어느 하나, [7]의 뉴클레오티드(nucleotide) 또는 [19]의 항체로 구성된 진단 키트.

본 발명의 적용가능성은 CDC45L이 과발현과 관련하거나 유발하는 많은 질환 중 어느 하나를 포함하며, 예로써 고환종양, 췌장암, 방광암, 비소세포폐암, 소세포폐암, 유방암, 식도암, 전립선암, 만성골수성백혈병, 연조직 종양, 위암, 간담즙성암 및 결장암과 같은 암을 포함하지만, 한정하지 않는다.

상기에 더하여, 본 발명의 다른 목적 및 특징은 동행하는 도면 및 실시예와 함께 하기의 상세한 설명에서 더 완전히 분명해질 것이다. 하지만, 상기 발명의 개요 및 하기의 상세한 설명은 모두 예시적인 실시태양이며, 본 발명 또는 본 발명의 다른 대체적인 실시태양에 한정하지 않는다. 특히, 본 발명이 다수의 특정한 실시태양에 대한 참조와 함께 본 문서에 기재되었지만, 이것은 본 발명의 구체적인 설명이고 본 발명을 제한하는 바로 구성되지 않음이 인식될 것이다. 다양한 수식 및 적용은 첨부된 청구항에 의해 기재되는 발명의 범위로부터 벗어남이 없이 당업계의 당업자에 의해 일어날 수 있다. 이와 같이, 다른 목적, 특징, 이익 및 본 발명의 장점은 이러한 요약 및 하기에 기재된 특정한 실시태양으로부터 분명할 것이며, 당업계의 당업자에 의해 쉽게 분명할 것이다. 이러한 목적, 특징, 이익 및 장점은 상기와 함께 동행된 실시예, 데이터, 도면 및 모든 그것으로부터 이끌어낸 합리적인 추론, 단독 또는 본 발명에 혼합된 참조의 조합으로부터 분명할 것이다.

본 문서에 기재된 것들에 유사하거나 같은 어떤 방법 및 재료들이 본 발명의 실시태양의 수행 또는 시험에서 이용될 수 있지만, 가능한 방법, 기구 및 재료를 하기에 기재하였다. 그러나, 본 재료 및 방법이 기재되기 이전에, 본 발명은 명세서에 기재된 특정 사이즈, 모양, 부피, 재료, 방법, 프로토콜 등에 한정되지 않으며, 이들은 통상적인 실험 및/또는 최적화에 부합하여 변형될 수 있다. 또한 본 발명의 상세한 설명에서 사용되는 용어는 특정한 버전 또는 내용을 기술하기 위한 목적이나, 오직 첨부된 청구항으로 제한되는 본 발명의 범위로 제한하려는 의도는 아니다.

본 명세서에서 언급된 공개, 특허 또는 특허 출원의 내용은 그 전체가 명세서에 참조로서 통합된다. 하지만 기존 발명에 의한 선행하는 이러한 공개는 본 발명에서 권리를 인정하지 않는다.

Ⅰ. 정의

본 발명에서 사용되는 용어 "a", "an", 및 "the"는 따로 명시되지 않는 한, "적어도 1개"를 의미한다.

본 발명에서 호환적으로 사용되는 용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 의미한다. 상기 용어는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기들이 변형된 잔기들, 또는 천연 아미노산들에 대응하는 인공 화학적 모방체들과 같은 비천연적 잔기들 및 천연 아미노산 중합체들일 수 있는 아미노산 중합체에 적용된다.

본 발명에서 사용되는 용어 "아미노산"은 천연 아미노산과 합성 아미노산, 및 천연 아미노산과 마찬가지로 기능하는 아미노산 유사체(analog) 및 아미노산 모방체(mimetic)를 의미한다. 아미노산은 L- 아미노산 또는 D-아미노산일 수 있다.

천연 아미노산은 유전 코드에 의해 암호화되는 아미노산 및 세포에서 번역 후 변형된 아미노산[예를 들면, 하이드록시프롤린(hydroxyproline), 감마-카르복시글루탐산(gamma-carboxyglutamate) 및 O-포스포세린(O-phosphoserine)]이다. 상기 용어 "아미노산 유사체"는 천연 아미노산과 같은 기본적인 화학 구조(수소, 카복실기, 아미노기 및 R기(R group)에 결합하는 알파(alpha) 탄소를 가지고 있지만, 하나 또는 그 이상의 변형된 R기들 또는 변형된 골격을 가지는 화합물을 의미한다[예를 들면, 호모세린(homoserine), 노르루신(norleucine), 메티오닌(methionine), 설폭사이드(sulfoxide), 메티오닌 메틸 설포니움(methionine methyl sulfonium)]. 상기 용어 "아미노산 모방체"는 서로 다른 구조이지만, 일반적인 아미노산과 비슷한 기능이 있는 화학적 화합물을 의미한다.

아미노산은 IUPAC-IUB 생화학 명명위원회가 권장하는, 일반적으로 알려진 3문자 상징 또는 1문자 상징에 의해 불린다.

본 발명에서 사용된 용어 "유전자", "폴리뉴클레오티드", "뉴클레오티드" 및 "핵산"은 따로 명시되지 않는 한, 호환적으로 사용되며 일반적으로 인정되는 1문자 코드에 의해 불린다.

본 발명에서 사용된 상기 용어 “조성물”은 명시된 양의 명시된 성분 및 명시된 양의 명시된 성분의 직접적 또는 간접적 조합으로부터 만들어지는 어떤 생산물을 포함하는 생산물을 포함하는 것을 의미한다. 이러한 용어와 관련된 “약학적 조성물”은 유효 성분들 및 운반체를 구성하는 어떤 불활성 성분 및 어떤 두 개 또는 그 이상의 성분들의 직접 또는 간접적으로 조합, 복합화 또는 집합으로부터 또는 하나 또는 그 이상의 성분의 분해, 또는 하나 또는 그 이상의 성분의 다른 유형의 반응 또는 상호작용으로부터 만들어지는 어떤 생산물을 포함하는 생산물을 포함하는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명의 맥락에서 상기 구 “약학적 조성물”은 본 발명의 복합체를 혼합함으로써 만들어지는 어떤 조성물 및 약학적 또는 생리학적으로 허용가능한 운반체를 포함한다. 본 발명에서 사용된 용어 “약학적으로 허용가능한 운반체” 또는 “생리학적으로 허용가능한 운반체”는 약학적 또는 생리학적으로 허용가능한 재료, 조성물, 물질(substance) 또는 운반체를 의미하며, 액체 또는 고체 충전제, 희석액, 첨가제, 용액 또는 유효 성분을 하나의 기관 또는 몸의 일부로부터 다른 기관 또는 몸의 일부까지 이동하거나 운반하는 것에 관련된 봉입 재료를 포함하지만, 한정하지 않는다.

별도로 명시하지 않는 한, 상기 용어 “암”은 CDC45L 유전자가 과발현된 암 또는 종양에 관한 것이며, 예로서 고환종양(testicular tumor), 췌장암(pancreatic cancer), 방광암(bladder cancer), 비소세포폐암(non-small cell lung cancer), (small cell lung cancer), 유방암(breast cancer), 식도암(esophageal cancer), 전립선암(prostate cancer), 만성골수성백혈병(chronic myeloid leukemia, CML), 연조직 종양(soft tissue tumor), 위암(gastric cancer), 간담즙성암(hepatobILiary cancer) 및 결장암(colorectal cancer)를 포함하지만, 한정하지 않는다.

별도로 명시되지 않는 한, 상기 용어 "세포독성 T 림프구", "세포독성 T 세포" 및 "CTL"은 호환되어 쓰이며 따로 명시되지 않는 한, 특히 비자기 세포(예를 들면 종양/암 세포, 바이러스에 감염된 세포)를 인식하고 이러한 세포의 사멸을 유도할 수 있는 T 림프구의 하위집단(sub-group)을 나타낸다.

별도로 명시되지 않는 한, 상기 용어 “HLA-A24”는 HLA-A＊2402와 같은 아형(subtypes)을 포함하는 상기 HLA-A24 유형에 관한 것이다.

별도로 명시되지 않는 한, 본 발명에서 사용된 용어 “HLA-A2”는 HLA-A＊0201 및 HLA-A＊0206과 같은 아형을 대표적으로 나타낸다.

별도로 명시되지 않는 한, 본 발명에서 사용된 용어 “키트”는 시약 및 다른 재료의 조합에 관하여 사용된다. 상기 키트는 마이크로어레이(microarray), 칩(chip), 마커(marker) 등을 포함할 수 있는 것이 고려된다. 상기 용어 “키트”는 특정한 시약 및/또는 재료의 조합에 대해 한정되지 않는다.

암의 “치료”의 맥락에서 본 발명의 방법 및 조성물이 유용하다고 여겨지는 정도에 대해, CDC45L 유전자의 발현 감소 또는 개체의 암의 크기, 전파 또는 전이 가능성 감소와 같은 임상적 혜택을 유도할 때, 치료는 “효과적”으로 간주된다. 병을 예방하기 위해 치료를 적용할 때, “효과적”은 암을 형성하는 것을 지체시키거나 예방하거나 암의 임상적 증상을 예방하거나 완화하는 것을 의미한다. 효과성은 특정한 암 유형을 진단 또는 치료하기 위한 어떤 알려진 방법으로 확인된다.

암의 “예방” 및 “방지”의 맥락에서 유용하다고 여겨지는 본 발명의 방법 및 조성물의 정도에 대해, 이러한 용어는 본 발명에서 호환적으로 질환으로부터 사망률 또는 질병률의 부담을 감소시키는 어떠한 활동을 언급하는 것에 사용된다.

예방 및 방지는 “초기에, 2차 및 3차 예방 수준”에 발생할 수 있다. 초기 예방 및 방지는 질환의 발달을 피하는 것이지만, 예방 및 방지의 2차 및 3차 수준은 질환의 발달 및 증상의 발생의 예방 및 방지 및 기능 회복에 의한 이미 수립된 질환의 부정적 효과를 감소시키고, 질환이 연관된 합병증을 감소시키는 것를 목표로 하는 활동을 포함한다. 그 대신에, 예방 및 방지는 특정 질환의 괴로움을 완화시키는 것을 목표로 하는 광범위한 예방 치료, 예를 들면 종양의 증식 및 전이를 감소시키는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 맥락에서, 상기 암의 치료 및/또는 예방 및/또는 그것의 수술 후 재발의 예방은 암 세포의 수술적 제거, 암 세포의 생장의 저해, 종양의 퇴화 또는 퇴행, 암의 발생의 감소 및 억제 유도, 종양 퇴행 및 전이의 감소 및 저해와 같은 단계 중 어떤 것을 포함한다. 암의 효과적인 치료 및/또는 예방은 사망률을 감소시키며, 암을 가지는 개인의 예후를 개선시키며, 혈액내의 종양 마커의 수준을 감소시키고, 암과 수반하는 탐지가능한 증상을 완화시킨다. 예를 들면, 증상의 감소 또는 개선은 효과적인 치료 및/또는 예방이 10%, 20%, 30% 또는 그 이상의 감소, 또는 안정한 질환을 포함하는 것으로 여겨진다.

본 발명의 맥락에서, 상기 용어 “항체”는 특히 지정된 단백질 또는 그것의 펩티드에 반응하는 면역글로불린(immunoglobulin) 및 그것의 단편을 나타낸다. 항체는 인간항체, 영장류화된 항체, 카이메릭 항체, 이중특이성 항체, 인간화 항체, 다른 단백질에 융합된 항체 또는 방사성 동위원소가 표지된 및 항체 단편을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 가장 넓은 의미에서 사용되고, 특히 온전한 모노클로날(monoclonal) 항체, 폴리클로날(polyclonal) 항체, 적어도 두개의 온전한 항체로부터 형성되는 다중특이성 항체(예를 들면, 이중특이성 항체) 및 바라는 생물학적 활성을 나타내는 한 항체의 단편을 포함한다. “항체”는 모든 클래스(classes)를 나타낸다(예를 들면, igA, igD, igE, IgG 및 igM).

별도로 명시되지 않는 한, 본 발명에서 사용되는 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다.

Ⅱ . 펩티드( Peptides )

CDC45L 유래 펩티드가 CTL에 의해 인식되는 항원으로서 역할을 한다는 것을 증명하기 위하여, CDC45L (서열번호 18)유래 펩티드가 보통 HLA 대립유전자에 보여지는 HLA-A24 또는 A2에 의해 제한되는 항원 에피토프인지를 확인하기 위하여 CDC45L 유래 펩티드를 분석하였다(Date Y et al., Tissue Antigens 47:93-101, 1996; Kondo A et al., J immunol 155:4307-12, 1995; Kubo RT et al., J immunol 152:3913-24, 1994).

HLA-A24에 결합하는 CDC45L 유래 펩티드 후보를 HLA-A24에 대한 그들의 결합 친화성에 기초하여 동정하였다. 하기 펩티드들은 면역치료에 대한 후보 펩티드로 여겨진다.

CDC45L-A24-9-237-1 (서열번호 1),

CDC45L-A24-9-109-2 (서열번호 2),

CDC45L-A24-9-294-3 (서열번호 3),

CDC45L-A24-9-556-4 (서열번호 4),

CDC45L-A24-9-328-5 (서열번호 5),

CDC45L-A24-9-396-6 (서열번호 6),

CDC45L-A24-9-370-7 (서열번호 7),

CDC45L-A24-9-192-8 (서열번호 8),

CDC45L-A24-9-541-9 (서열번호 9),

CDC45L-A24-9-364-10 (서열번호 10),

CDC45L-A24-10-109-11 (서열번호 11),

CDC45L-A24-10-556-12 (서열번호 12),

CDC45L-A24-10-271-13 (서열번호 13),

CDC45L-A24-10-313-14 (서열번호 14),

CDC45L-A24-10-21-15 (서열번호 15), 및

CDC45L-A24-10-459-16 (서열번호 16).

또한, 이러한 펩티드들로 자극한 수지상 세포(dendritic cells, DCs)에 의한 시험관 내 T 세포의 자극 후, 하기 각각의 펩티드를 이용하여 CTL을 성공적으로 수립하였다:

CDC45L-A24-9-109-2 (서열번호 2),

CDC45L-A24-9-294-3 (서열번호 3),

CDC45L-A24-9-556-4 (서열번호 4),

CDC45L-A24-9-370-7 (서열번호 7), 및

CDC45L-A24-10-556-12 (서열번호 12).

이러한 수립된 CTL은 각각의 펩티드에 의해 자극받은 표적 세포에 대해 강력한 특이적 CTL 활성을 나타냈다. 본 발명의 상기 결과는 CDC45L가 CTL들에 의해 인식되는 항원이며, 상기 펩티드들은 HLA-A24에 제한되는 CDC45L의 에피토프 펩티드임을 나타낸다.

또한, 이러한 펩티드들 중에서 CDC45L-A24-9-556-4 (서열번호 4) 는 HLA-A2 에 결합하는 펩티드의 후보로서 확인되었다. 본 발명에서, 또한, CDC45L-A24-9-556-4 (서열번호 4)는 HLA-A2에 제한된 펩티드의 맥락에서 CDC45L-A24-9-556-4 (서열번호 4) 로서 언급되었다. 상기 펩티드를 이용하여, CDC45L 및 HLA-A2를 발현하는 표적세포에 대한 CTL을 성공적으로 수립하였다. 따라서 CDC45L-A24-9-556-4 (서열번호 4)는 HLA-A24에 제한된 에피토피(epitope) 펩티드일 뿐만 아니라 HLA-A24에 의해 제한된 에피토프 펩티드이다.

상기 CDC45L 유전자는 예로서 고환종양, 췌장암, 방광암, 비소세포폐암, 소세포폐암, 유방암, 식도암, 전립선암, 만성골수성백혈병, 연조직 종양, 위암, 간담즙성암 및 결장암을 포함하는 암 세포 및 조직에서 과발현되고, 대부분의 정상 기관에서는 발현하지 않으므로, 이것은 암 면역치료에 대한 우수한 표적을 대표한다. 따라서, 본 발명은 CDC45L 유래 CTL-인식되는 에피토프에 대응하는 노나펩티드(nonapeptides)(아홉 개의 아미노산으로 구성된 펩티드)와 데카펩티드(decapeptides)(열 개의 아미노산으로 구성된 펩티드)를 제공한다. 또는, 본 발명은 서열번호 18의 아미노산 서열을 가지며, HLA항원과 결합하며 CTL 활성을 유도하는 분리된 펩티드 또는 이의 면역 활성 단편을 제공한다. 본 발명의 특히 바람직한 예는 서열번호 2, 3, 4, 7 및 12를 가지는 이러한 펩티드를 포함한다.

일반적으로, Parker KC et al. (J immunol 1994 Jan 1,152(1):163-75), 및 Nielsen M et al., Protein Sci 2003; 12: 1007-17에 기재되어 있는 것과 같이, 인터넷상에서 현재 사용가능한 소프트웨어 프로그램을 이용하여 컴퓨터 상(in sILico)에서 다양한 펩티드와 HLA 항원 사이의 결합 친화성을 산출할 수 있다. 예를 들면, Parker KC et al., J immunol 1994 Jan 1, 152(1):163-75, Kuzushima K et al., Blood 2001, 98(6):1872-81, Larsen MV et al. BMC Bioinformatics. 2007 Oct 31; 8: 424, Buus S et al. Tissue Antigens., 62:378-84, 2003, Nielsen M et al., Protein Sci 2003; 12: 1007-17 및 Nielsen M et al. PLoS ONE 2007; 2: e796는 예를 들면 Lafuente EM et al., Current Pharmaceutical Design, 2009, 15, 3209-3220에 요약되어 있으며, 기재되어 있는 것에 따라, HLA 항원과의 결합 친화성을 측정할 수 있다. 결합 친화성을 결정하는 방법은, 예를 들면, 상기 Journal of immunological Methods, 1995, 185:181-190 및 Protein Science, 2000, 9:1838-1846에 기재되어 있다. 따라서, 이러한 소프트웨어 프로그램을 이용하여 HLA 항원과 높은 결합 친화성을 가진 CDC45L 유래 단편이 선택될 수 있다. 따라서, 본 발명은 이러한 공지된 프로그램에 의해 HLA항원과 결합하는 CDC45L로부터 유래하고 어떠한 단편으로 구성되는 펩티드를 포함한다. 또한, 이러한 펩티드는 CDC45L의 전장으로 구성된 펩티드를 포함할 수 있다.

본 발명의 노나펩티드 및 데카펩티드는 상기 펩티드가 CTL 유도성을 유지하는 한 부가적 아미노산 잔기를 인접시킬 수 있다. 상기 부가적인 아미노산 잔기는 원래 펩티드의 CTL 유도성을 손상시키지 않는 한, 어떤 유형의 아미노산으로 구성될 수 있다. 따라서, 본 발명은 HLA 항원에 결합 친화성이 있는 CDC45L 유래 펩티드를 포함하는 펩티드를 포함한다. 이러한 펩티드들은, 예를 들면 약 40 아미노산 미만, 흔히 20 아미노산 미만 및 보통 약 15 아미노산 미만이다.

일반적으로, 어떠한 펩티드 중 한 개 또는 그 이상의 아미노산의 변형은 상기 단백질의 기능에 영향을 미치지 않으며, 어떠한 경우에는 원래 단백질의 원하는 기능을 촉진할 수 있다. 실제로, 변형된 펩티드(즉, 원래의 참조 서열에 대하여 한 개, 두 개 또는 복수의 아미노산 잔기가 치환, 첨가, 결실 및/또는 삽입함으로써 변형된 아미노산 서열로 구성되는 펩티드)가 원래의 펩티드의 생물 활성을 유지한다는 것이 알려져 있다(Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81:5662-6; Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10:6487-500; Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982,79:6409-13). 따라서, 하나의 실시태양에 있어서, 본 발명의 상기 펩티드는 CTL 유도성을 가지는 본 발명의 펩티드는 한 개, 두 개 또는 복수의 아미노산이 첨가, 결실 및/또는 치환된 서열번호 2, 3, 4, 7 및 12에서 선택되는 아미노산 서열을 가진다.

당업자는 단일 아미노산 또는 적은 비율의 아미노산이 변한 아미노산 서열에 대한 개개의 첨가, 결실 또는 치환이 원래 아미노산 서열의 특성의 보존하는 결과를 야기하는 경향이 있는 것을 알고 있다. 예컨대, 그들은 "보존적 치환(conservative substitution)" 또는 "보존적 변형(conservative modification)"이라고 나타내며, 단백질의 변화로 변형된 단백질은 원래 단백질과 유사 기능을 가지게 된다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환표는 당업계에 잘 알려져 있다. 아미노산 측쇄의 특성의 예로는 소수성 아미노산(A, i, L, M, F, P, W, Y, V), 친수성 아미노산(R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), 및 하기 작용기 또는 공통적 특징을 가지는 측쇄가 있다: 지방족 측쇄(G, A, V, L, i, P); 수산기를 포함하는 측쇄(S, T, Y); 황 원자를 포함하는 측쇄(C, M); 카복실산 및 아미드를 포함하는 측쇄(D, N, E, Q); 염기를 포함하는 측쇄(R, K, H); 및 방향족 군을 포함하는 측쇄(H, F, Y, W). 또한, 하기 8개 군은 서로 보존적 치환으로서 당업계에서 서로 허용될 수 있는 아미노산을 포함한다:

(1) 알라닌(A), 글리신(G);

(2) 아스파라긴산(D), 글루탐산(E);

(3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q);

(4) 아르기닌(R), 리신(K);

(5) 이소 류신(I), 루신(L), 메티오닌(M), 발린(V);

(6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W);

(7) 세린(S), 트레오닌(T); 및

(8) 시스테인(C), 메티오닌(M)(예를 들면, Creighton, Proteins 1984 참조)

이러한 보존적으로 변형된 펩티드 또한 본 발명의 펩티드로 간주한다. 그러나, 본 발명의 펩티드는 그들에 한정되지 않고, 상기 변형된 펩티드가 원래 펩티드의 CTL 유도성을 가지는 한, 비보존적인 변형도 포함할 수 있다. 또한, 변형된 펩티드는 다형성 변종, 종간 상동체(homologue) 및 CDC45L의 대립 유전자의 CTL 유도 가능한 펩티드를 제외하지 않아야 한다.

필요한 CTL 유도성을 계속 유지하기 위하여 소수의(예를 들면, 한 개, 두 개 또는 복수) 또는 낮은 비율의 아미노산을 변형(즉, 삽입, 결실, 첨가 및/또는 치환)할 수 있다. 본 발명에서, 상기 용어 "복수"는 다섯 개 또는 그 이하, 예를 들면 네 개 또는 세 개 또는 그 이하를 의미한다. 변형되는 아미노산의 비율은 바람직하게는 20% 또는 그 이하, 더욱 바람직하게는, 15% 또는 그 이하, 및 가장 바람직하게는 10% 또는 그 이하 또는 1 내지 5%일 수 있다.

암 면역치료에 사용했을 경우, 본 발명의 펩티드는 구체적으로 HLA 항원과 복합체로서 세포 또는 엑소솜의 표면에 제시된다. 따라서, CTL을 유도하는 것 뿐만 아니라 HLA 항원에 높은 결합 친화성을 갖는 펩티드를 선택하는 것이 바람직하다. 그 목적을 달성하기 위해서, 개선된 결합 친화성을 가지는 변형된 펩티드를 생산하기 위해, 상기 펩티드들은 아미노산 잔기의 치환, 삽입 및/또는 첨가함으로써 변형될 수 있다. 자연적으로 드러난 펩티드와 더불어, HLA 항원에 결합함으로써 드러난 펩티드 서열의 규칙성은 이미 공지되었으므로(J immunol 1994, 152:3913; immunogenetics 1995, 41:178; J immunol 1994, 155:4307), 이와 같은 규칙성에 근거한 변형은 본 발명의 면역원성 펩티드에 도입될 수 있다.

예를 들면, HLA-A24 결합 친화성을 높이기 위해 N-말단으로부터 2번째 아미노산이 페닐알라닌, 티로신, 메티오닌 또는 트립토판으로 및/또는 C-말단 아미노산이 페닐알라닌, 루신, 이소 류신, 트립토판, 또는 메티오닌으로 치환하는 것일 수 있다. 따라서, N-말단으로부터 2번째 아미노산 서열이 페닐알라닌, 티로신, 메티오닌 또는 트립토판으로 치환된 또는 C-말단 아미노산이 페닐알라닌, 루신, 이소 류신, 트립토판, 또는 메티오닌으로 치환된 서열번호 2, 3, 4, 7 및 12 중에서 선택되는 아미노산 서열을 가진 펩티드는 본 발명에 포함된다.

그 대신에, 이것은 N-말단으로부터 두 번째 아미노산이 루신 또는 메티오닌, 및/또는 C-말단이 발린 또는 루신으로 치환된 것이 HLA-A2 결합 친화성을 증가시키기 위해 바람직할 수 있다. 따라서, N-말단으로부터 두 번째 아미노산이 루신 또는 메티오닌, 및/또는 C-말단이 발린 또는 루신으로 치환된 서열번호 4 중에서 선택되는 아미노산 서열을 가지는 펩티드는 본 발명에 의해 포함된다.

치환은 말단 아미노산뿐만 아니라 펩티드의 인식에 잠재력있는 T 세포 수용체(T cell receptor , TCR) 의 부위에 도입될 수 있다. 몇몇의 연구는, 아미노산 치환이 있는 펩티드가 원래의 그것에 비해 동등하거나 더 나은 기능을 가질 수 있다는 것을, 예를 들면 CAP1, p53 (264-272), Her-2/neu (369-377) 또는 gp100 (209-217) (Zaremba et al. Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997, T. K. Hoffmann et al. J immunol. (2002) Feb 1;168(3):1338-47., S. O. Dionne et al. Cancer immunol immunother. (2003) 52: 199-206 and S. O. Dionne et al. Cancer immunology, immunotherapy (2004) 53, 307-314), 증명하였다.

또한, 본 발명은 상기 제시된 펩티드의 N 및/또는 C-말단에 한 개, 두 개 또는 복수의 아미노산이 또한 추가될 수 있는 첨가를 고려한다. 높은 HLA 항원 결합 친화성을 가지며, CTL 유도성을 유지하고 있는 이러한 변형된 펩티드 또한 본 발명에 포함된다.

그러나, 펩티드 서열이 서로 다른 기능을 가지는 내인성 또는 외인성 단백질의 아미노산 서열의 한 부분과 동일할 경우, 특이적 물질에 대한 자가면역장애 또는 특정 물질에 대한 알레르기 증상 등의 부작용이 유발될 가능성이 있다. 따라서, 상기 펩티드 서열이 다른 단백질의 아미노산 서열과 일치하는 상황을 피하기 위해서, 사용가능한 데이터베이스를 이용하여 상동성 검색을 실시하는것 일 수 있다. 목표 펩티드와 한 개 또는 두 개의 아미노산 차이가 있는 펩티드마저도 존재하지 않는다는 것이 상동성 검색에서 드러날 경우, 어떠한 부작용의 위험 없이 HLA 항원과 결합 친화성, 및/또는 CTL 수송 능력을 증강시키기 위해, 상기 목표 펩티드를 변형시킬 수 있다.

상기와 같이, HLA 항원에 대해 높은 결합 친화성을 가지는 펩티드는 매우 효과적일 것이라고 기대되지만, 높은 결합 친화성의 존재에 따라 지표로서 선택된 후보 펩티드는 CTL 유도성의 존재에 대해 한층 더 검토된다. 본 발명에서, 상기 용어 "CTL 유도성"은 APC 상에 제시될 경우에 세포독성 림프구(cytotoxic lymphocytes, CTL)을 유도하는 펩티드의 능력을 의미한다. 또한, "CTL 유도성"은 펩티드의 CTL 활성화, CTL 증식 유도, CTL에 의한 표적세포의 용해 촉진 및 CTL의 IFN-감마 생산을 증가시키는 능력을 포함한다.

CTL 유도성의 확인은 인간 MHC 항원을 보유하는 APC{예를 들면, B-림프구, 마크로파지(macrophage) 및 수지상세포(dendritic cell, DC)}, 또는 더욱 구체적으로는 인간 말초 혈액 단핵 백혈구(human peripheral blood mononuclear leukocytes) 유래 수지상세포를 유도하고, 펩티드를 사용하여 자극, CD8 양성 세포와 혼합한 후, 그 후에 표적세포에 대한 CTL에 의해 생산 및 방출되는 IFN-감마를 측정하여 수행할 수 있다. 반응계로서, 인간 HLA 항원을 발현하도록 제작된 형질전환 동물(예를 들면, BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum immunol 2000 Aug, 61(8):764-79, Related Articles, Books, Linkout induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A＊0201/DR1 transgenic mice dependent on MHC (HLA) class Ⅱ restricted T (H) response에 기재된 것)을 사용할 수 있다. 예를 들면, 상기 표적세포를 ⁵¹Cr 등으로 방사 표지할 수 있고, 상기 표적세포로부터 방출된 방사능으로부터 세포독성 활성을 산출할 수 있다. 다른 방법으로, 고정화된 펩티드를 가진 APC의 존재하에 CTL에 의해 생산 및 방출되는 IFN-감마를 측정함으로써 조사될 수 있고, 항-IFN-감마 단일클론항체를 사용한 배지에서 저해 영역을 가시화함으로써, CTL 유도성을 측정할 수 있다.

상기와 같이, 상기 펩티드의 CTL 유도성을 검사한 결과, 서열번호 2, 3, 4, 7 및 12 중에서 선택되는 노나펩티드 또는 데카펩티드는, HLA 항원에 대한 높은 결합 친화성뿐만 아니라 특히 높은 CTL 유도성을 보였다. 따라서, 이러한 펩티드는 본 발명의 구체적인 실시태양으로서 예시된다.

또한, 상동성 분석의 결과는 이러한 펩티드들이 어떠한 다른 알려진 인간 유전자 산물 유래 펩티드와 현저한 상동성을 갖지 않음을 보인다. 따라서, 면역치료에 사용하였을 때, 알려지지 않거나 또는 원하지 않은 면역반응의 가능성이 낮아진다. 따라서, 또한 이러한 측면으로부터 역시, 이러한 펩티드들은 CDC45L 에 대한 암 환자의 면역성을 제거하는데 쓰인다. 따라서, 본 발명의 펩티드들은, 서열번호 2, 3, 4, 7 및 12 중에서 선택되는 아미노산 서열을 가지는 펩티드일 수 있다.

상기 기재된 변형에 더하여, 결과로 초래된 연결된 펩티드가 원래의 펩티드의 필요한 CTL 유도성을 유지하는 한 본 발명의 펩티드들은 다른 펩티드에 연결될 수 있다. 적합한 펩티드의 예는 포함한다: 본 발명의 펩티드 또는 다른 TAA들 유래 CTL을 유도할 수 있는 펩티드. 적합한 펩티드내 링커(linkers) 당업계에 잘 알려져 있으며, 예로서 AAY (P. M. DaftaRIAn et al., J Trans Med 2007, 5:26), AAA, NKRK (R. P. M. Sutmuller et al., J immunol. 2000, 165: 7308-7315) 또는 K (S. Ota et al., Can Res. 62, 1471-1476, K. S. Kawamura et al., J immunol. 2002, 168: 5709-5715)를 포함한다.

예를 들면, 또한, CDC45L 이 없는 종양 관련된 항원 펩티드는 HLA 클래스(class) Ⅰ 및/또는 클래스(class) Ⅱ를 통한 면역 반응을 증가시키기 위해 주로 동시에 이용될 수 있다. 암 세포가 하나의 종양 관련된 유전자 보다 발현할 수 있는 것이 잘 수립되었다.

따라서, 당업계의 일반적인 기술 중의 하나에 대한 통상적인 실험의 범위 내에, 특정한 개체가 부가적인 종양 관련 유전자를 발현하는지 확인한 후에 HLA 클래스 Ⅰ 및/또는 클래스 Ⅱ에 결합하는 본 발명에 따른 CDC45L 조성물 또는 백신에서 이러한 유전자의 발현 산물로부터 유래하는 펩티드를 포함하는 것에 있다.

HLA 클래스(class) Ⅰ 및 HLA 클래스(class) Ⅱ 에 결합하는 펩티드는 당업계의 당업자에게 잘 알려져 있으며, 공개된 본 발명과 같은 방식으로 발명에서 사용될 수 있다. 따라서, 당업계의 당업자는 하나 또는 그 이상의 CDC45L 펩티드 및 하나 또는 그 이상의 CDC45L가 아닌 펩티드, 또는 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 폴리펩티드를 분자생물학의 표준절차를 이용하여 쉽게 제조할 수 있다.

상기의 이러한 연결된 펩티드는 본 발명에서 “폴리토프(polytopes)”로 언급된다, 즉, 두 개 또는 그 이상의 군이 잠재적으로 면역성이 있거나 면역 반응을 자극하는 다양한 배열에서 함께 결합될 수 있는 펩티드(예를 들면, 연결, 중복). 상기 폴리토프(또는 폴리토프를 암호화하는 핵산)는 표준 면역화 절차에 따라, 예를 들면 동물에 자극, 개선 및/또는 면역반응 유발에서 상기 폴리토프의 유효성을 시험하기 위해 투여될 수 있다.

상기 펩티드는 함께 직접적으로 또는 폴리토프를 형성하는 측면에 있는 서열의 사용을 통해 결합될 수 있으며, 상기 백신(vaccine)으로서 폴리토프의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다(참조, 예를 들면, Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92(13):5845-5849, 1995; GILbert et al., Nature Biotechnol. 15(12):1280-1284, 1997; Thomson et al., J immunol. 157(2):822-826, 1996; Tarn et al., J Exp. Med. 171(l):299-306, 1990).

다양한 수 및 에피토프의 조합을 포함하는 폴리토프는 제조될 수 있고, CTL에 의한 인식 및 면역 반응을 증가시키는 효과에 대해 시험될 수 있다.

또한, 원래의 펩티드의 필요한 CTL 유도성을 결과로 초래된 연결된 펩티드가 유지하는 한, 본 발명의 펩티드는다른 물질에 연결될 수 있다: 펩티드, 지질, 당 및 당 측쇄, 아세틸기, 천연 및 합성 폴리머 등. 상기 제공된 변형은 원래 펩티드의 생물 활성을 파괴하지 않으며, 당화(glycosylation), 측쇄 산화, 또는 인산화 등의 변형을 포함할 수 있다. 이러한 종류의 변형은 추가적인 기능(예를 들어, 표적 기능 및 전달 기능)을 제공하기 위해 또는 상기 폴리펩티드를 안정시키기 위해 수행될 수 있다.

예를 들면, 폴리펩티드의 생체 내 안정성을 증대시키기 위해, D-아미노산, 아미노산 모방체, 또는 비천연 아미노산을 도입하는 것은 당업계에서 잘 알려져 있으며; 이 개념은 또한 본 발명의 폴리펩티드에 맞춰질 수 있다. 폴리펩티드의 안정성은 여러 가지 방법으로 분석할 수 있다. 예를 들면, 펩티다제(peptidases) 및 인간 혈장 및 혈청과 같은 다양한 생물학적 배지는 안정성 시험에 사용될 수 있다(예를 들면, Verhoef et al., Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986,11:291-302 참조).

또한, 상기에 기재한 바와 같이, 한 개, 두 개 또는 복수의 아미노산 잔기가 치환, 결실 및/또는 첨가되어 변형된 펩티드 중 원래의 펩티드에 비해 같거나 더 높은 활성을 갖는 펩티드들이 선별되거나 선택될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 원래 펩티드에 비해 같거나 더 높은 활성을 갖는 변형된 펩티드들을 선별하거나 선택하는 방법을 제공한다. 실례가 되는 방법은 다음 단계로 구성할 수 있다:

a: 본 발명의 펩티드의 적어도 하나의 아미노산 잔기가 치환, 결실 또는 첨가되는 단계;

b:상기 단계 (a)에서 만들어진 상기 펩티드의 활성을 확인하는 단계, 및

c: 원래의 펩티드에 비해 같거나 더 높은 활성을 갖는 상기 펩티드를 선별하는 단계.

본 발명에서, 측정되는 상기 활성은 결합 친화성, APC 또는 CTL 유도성 및 세포독성 활성을 포함할 수 있다. 바람직하게, 측정되는 상기 활성은 CTL 유도성 이며, 이러한 활성은 “실시예”에 기재된 방법을 이용하여 측정될 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서, 본 발명의 펩티드는 "CDC45L 펩티드(들)" 또는 " CDC45L 폴리펩티드(들)"로 기재될 수 있다.

Ⅲ. CDC45L 펩티드의 제조

본 발명의 펩티드는 잘 알려진 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 상기 펩티드는 재조합형 DNA 기술 또는 화학 합성에 의해 합성적으로 제조할 수 있다. 본 발명의 펩티드는 개별적으로, 또는 두 개 또는 이상의 펩티드를 포함하는 더 긴 폴리펩티드로 합성할 수 있다. 상기 펩티드는 분리될 수 있는데, 즉, 자연에 존재하는 다른 숙주세포 단백질 및 이의 단편, 또는 다른 어떠한 화학물질을 실질적으로 포함하지 않도록 정제 또는 분리될 수 있다.

본 발명의 펩티드는 당화, 측쇄 산화 또는 인산화와 같은 원래의 펩티드의 생물학적 활성을 손상시키지 않는 제공된 변형을 포함할 수 있다. 다른 실례가 되는 변형은 예를 들면 펩티드의 혈청 반감기를 증가시키기 위해 사용될 수 있는 D-아미노산의 결합 또는 다른 아미노산 모방체의 삽입을 포함한다.

본 발명의 펩티드는 선택된 아미노산 서열을 기반으로 화학 합성을 통해 얻을 수 있다. 합성에 적용될 수 있는 일반적인 펩티드 합성의 예는 하기를 포함한다:

(ⅰ) Peptide Synthesis, interscience, New York, 1966;

(ⅱ) The Preteins, Vol 2, Academic Press, New York, 1976;

(ⅲ) Peptide Synthesis(일본어),Maruzen Co, 1975;

(ⅳ) Basics and Experiment of Peptide Synthesis(일본어), Maruzen Co, 1985;

(ⅴ) Development of Pharmaceuticals(제 2판)(일본어), Vol. 14(peptide synthesis), Hirokawa, 1991；

(ⅵ) WO99/67288; 및

(ⅶ) Barany G. & Merrifield RB, Peptides Vol. 2, "Solid Phase Peptide Synthesis,"Academic Press, New York, 1980, 100-118.

또는, 본 발명의 펩티드는 펩티드를 제작하기 위한 임의의 잘 알려진 유전자 공학 방법을 사용해서 얻을 수 있다(예를 들면, Morrison J, J Bacteriology 1977, 132:349-51; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology(Wu et al. 판) 1983, 101:347-62). 예를 들면, 우선, 목표 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현 가능한 형태(예를 들면, 프로모터 서열에 해당하는 조절 서열의 아래부분(downstream))로 포함하여 적절한 벡터를 제조하고 적절한 숙주 세포에 형질전환한다. 또한, 이러한 벡터 및 숙주 세포는 본 발명에 의해 제공된다. 그 다음에, 상기 숙주 세포를 원하는 펩티드를 제작하기 위해 배양한다. 또한 상기 펩티드는 시험관 내(in vitro) 번역 시스템을 선정하여 시험관 내에서 제조될 수도 있다.

ⅠⅤ. 폴리뉴클레오티드( polynucleotids )

본 발명은 상기 언급한 펩티드 중 하나를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이들은 자연에 존재하는 CDC45L 유전자(GenBank Accession No. NM_003504 (예를 들면, 서열번호 17))에서 유래한 폴리뉴클레오티드 및 이의 보존적으로 변형된 뉴클레오티드 서열로부터 유래한 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명에서, 상기 용어 "보존적으로 변형된 뉴클레오티드 서열"은 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 서열을 의미한다. 유전자 코드의 축퇴로 인하여, 많은 수의 기능적으로 동일한 핵산은 모든 주어진 단백질을 암호화한다. 예를 들면, 코돈 GCA, GCC, GCU및 GCG은 모두 알라닌(alanine) 아미노산을 암호화한다. 따라서, 코돈에 의해 결정되는 알라닌의 모든 위치에서, 암호화되는 폴리펩티드의 변경없이, 상기 코돈은 상응하는 코돈 중 어느 하나로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이를 "침묵 변이(sILent vaRIAtions)"라 하고, 보존적으로 변형된 변종의 한 종류이다. 펩티드를 암호화하는 본 발명의 모든 핵산 서열은 상기 핵산의 모든 가능한 침묵 변종도 나타낸다. 당업자는 핵산의 각 코돈(보통 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG, 및 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG은 제외)이 기능적으로 동일한 분자를 얻기 위해 변형될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 따라서, 펩티드를 암호화하는 핵산의 각각의 침묵 변이는 공개된 각 서열에서 암시적으로 기재되어 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 DNA, RNA 또는 이의 유도체들로 구성될 수 있다. 당업계에 잘 알려져 있는, DNA는 자연히 발생하는 A, T, C 및 G 등의 염기로 구성되고, T는 RNA에서는 U로 대체된다. 당업자는 자연히 발생하지 않는 염기 또한 폴리뉴클레오티드에 포함되는 것을 알 것이다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 개재 아미노산 서열의 유무를 불문하고 본 발명의 다양한 펩티드를 암호화할 수 있다. 예를 들면, 상기 개재 아미노산 서열은 폴리뉴클레오티드 또는 번역된 펩티드의 절단 부위(예를 들면, 효소 인식 서열)를 제공할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 펩티드를 암호화하는 코딩 서열에 대한 어떠한 추가적인 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 펩티드의 발현에 필요한 조절 서열을 포함하는 재조합형 폴리뉴클레오티드일 수 있고 또는 마커 유전자등을 가지는 발현 벡터(플라스미드)일 수도 있다. 일반적으로, 이러한 재조합 폴리뉴클레오티드는, 예를 들면, 폴리머라제 (polymerase)및 엔도뉴클레아제(endonuclease)를 이용한 종래의 재조합 기술을 통해 폴리뉴클레오티드를 조작하여 제조할 수 있다.

재조합 기술 및 화학 합성 기술은 모두 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 제작하는 데 사용할 수 있다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드는 반응능(competent) 세포에 형질전환되어 발현하는 적절한 벡터 내에 삽입하여 제작할 수 있다. 또는, PCR 기술 또는 적절한 숙주에서의 발현을 사용하여 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있다(예를 들면, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989). 또는, Beaucage SL & iyer RP, Tetrahedron 1992, 48: 2223-311; Matthes et al., EMBO J 1984, 3: 801-5에 기재되어 있는 것과 같이, 고체상 기술을 이용하여 폴리뉴클레오티드를 합성할 수 있다.

V. 엑소솜( exosomes )

또한, 본 발명은 본 발명의 펩티드와 HLA 항원 사이에 형성된 복합체를 그 표면에 제시하는 엑소솜이라는 세포내 소낭을 제공한다. 엑소솜은 예를 들면, 일본 특허출원 제 11-510507호 및 WO99/03499에 설명된 방법을 사용하여 제조할 수 있고, 치료 및/또는 예방의 표적이 되는 환자에게서 얻어진 APC를 사용하여 제조할 수 있다. 본 발명의 상기 엑소솜은 본 발명의 상기 펩티드와 마찬가지로 백신으로써 접종할 수 있다.

복합체에 포함된 HLA 항원의 형태는 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 개체의 HLA 항원의 형태와 일치해야 한다. 예를 들면, 일본인에 대하여, HLA-A24 및 HLA-A2특히, HLA-A＊2402 및 HLA-A＊0201 및 HLA-A＊0206는 가장 일반적이므로, 일본인 환자의 치료를 위해 적절할 것이다. 일본인과 백인에게서 높게 발현되는 A24 및 A2 형태는 효과적인 결과를 얻기 위해 도움이 되며, 또한, A＊2402, A＊0201 및 A＊0206 와 같은 아형이 이용된다. 일반적으로, 임상에서는, 치료를 필요로 하는 환자의 HLA 항원의 형태는 미리 검사되고 있어, 특정 항원에 대해 높은 수준의 결합 친화성을 갖거나, 항원제시에 의한 세포독성 T 세포(CTL) 유도성을 가지는 펩티드를 적절하게 선택하는 것이 가능하게 된다. 또한, 높은 결합 친화성 및 CTL 유도성을 나타내는 펩티드를 얻기 위하여, 자연에 존재하는 CDC45L 부분적 펩티드의 아미노산 서열을 바탕으로 한 개, 두 개 또는 복수의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 및/또는 첨가를 실시할 수 있다.

본 발명의 상기 엑소솜에 대하여 A24 형태의 HLA 항원을 사용할 경우, 서열번호 2, 3, 4, 7 및 12 중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드가 사용된다.

그 대신에, A2 형태의 HLA 항원을 본 발명의 엑소솜에 사용할 경우, 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 펩티드가 사용된다.

VⅠ. 항원제시세포( antigen - presenting cells , APC )

또한, 본 발명은 HLA 항원과 본 발명의 펩티드와 함께 형성된 복합체를 그 표면에 제시하는 항원제시세포(antigen-presenting cells, APC)를 제공한다. 본 발명의 펩티드를 접촉시키는 것에 의해, 또는 본 발명의 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드를 발현 가능한 형태로 도입함으로써 얻을 수 있는 APC는 치료 및/또는 예방의 표적이 되는 환자에게서 유래할 수 있고, 그 자체로 또는 본 발명의 펩티드, 엑소솜 또는 세포독성 T 세포(CTL)를 포함하는 다른 약물과 조합하여 투여할 수 있다.

상기 APC는 특정한 종류의 세포에 한정되지 않고, 림프구에 의해 인식되기 위하여, 세포 표면에 단백질성 항원을 제시하는 것이 알려져 있는 수지상세포(dendritic cells, DC), 랑게르한스(Wrangel Hans) 세포, 마크로파지(macrophage), B세포 및 활성화 T 세포를 포함한다. 수지상세포는 강력한 CTL를 유도하는 활성을 가지는 APC 중 하나이므로, 수지상세포는 본 발명의 APC로서 사용할 수 있다.

예를 들면, 말초혈액단핵세포로부터 수지상세포를 유도한 다음 그것들을 시험관 내, 생체 내 또는 체외에서 본 발명의 펩티드와 접촉(자극)시켜 APC를 얻을 수 있다. 본 발명의 펩티드를 개체에 투여하면, 본 발명의 펩티드가 제시된 APC가 개체의 체내에서 유도된다. 상기 구절 “ APC 유도”는 세포의 표면에 HLA 항원 및 본 발명의 펩티드의 사이에 형성된 복합체를 제시하기 위해 본 발명의 펩티드 또는 본 발명의 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드와 세포를 접촉(자극)하는 것을 포함한다. 따라서 본 발명의 APC는 본 발명의 펩티드를 개체에 주입한 후 개체에서 수집할 수 있다. 또는, 본 발명의 상기 APC는 본 발명의 상기 펩티드가 주입된 개체로부터 수집한 APC와 접촉함으로써 얻을 수 있다.

본 발명의 상기 APC는 개체 내의 암에 대한 면역반응을 유도하기 위해 그것들 자체 또는 본 발명의 상기 펩티드, 엑소솜 또는 본 발명의 CTL을 포함하는 다른 약품과의 조합으로 개체에 투여될 수 있다. 예를 들면, 체외 투여는 하기 단계를 포함할 수 있다:

a: 첫번째 개체로부터 APC를 수집하는 단계;

b: 단계 a의 APC와 상기 펩티드를 접촉하는 단계; 및

c; 단계 b의 APC를 두번째 개체에 투여하는 단계.

첫번째 개체와 두번째 개체는 같은 개체일 수 있고, 또는 다른 개체일 수 있다. 단계 b에서 얻어진 상기 APC는 암 치료 및/또는 예방을 위한 백신으로 사용될 수 있으며, 암의 예로써 고환종양, 췌장암, 방광암, 비소세포폐암, 소세포폐암, 유방암, 식도암, 전립선암, 만성골수성백혈병, 연조직 종양, 위암, 간담즙성암 및 결장암을 포함하지만, 한정하지 않는다.

상기 본 발명은 본 발명의 펩티드로 유도한 이러한 항원 제시세포를 포함하는 약학적 조성물의 제조에 대해 제공한다.

본 발명의 하나의 측면에 따르면, APC는 높은 수준의 CTL 유도성을 가지고 있다. "높은 수준의 CTL 유도성"이라는 용어에 있어서, 상기 높은 수준은 펩티드와 접촉시키지 않는 APC 또는 CTL을 유도할 수 없는 펩티드와 접촉시킨 APC의 CTL 유도성 수준과 비교한 CTL 유도성 수준이다. 높은 수준의 세포독성 T 세포 유도성을 가지는 이러한 APC는 본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 유전자를 시험관 내에서 APC에 도입하는 단계를 포함하는 방법으로 제조할 수 있다. 상기 도입 유전자는 DNA 또는 RNA 형태일 수 있다. 도입 방법으로는, 특별한 제한 없이, 본 기술분야에서 일반적으로 실시되는 다양한 방법, 예를 들면, 리포펙션(lipofection), 전기천공법 (electroporation) 또는 인산칼슘법이 사용될 수 있다. 더욱 구체적으로는, 이는 Cancer Res 1996, 56: 5672-7; J immunol 1998, 161: 5607-13; J Exp Med 1996, 184: 465-72; 특허공보 제 2000-509281호에 기재된 것에 따라 실시할 수 있다. 유전자를 APC로 도입함으로써, 상기 유전자는 세포 안에서 전사 및 번역을 겪고, 이렇게 얻어진 단백질은 MHC 클래스 Ⅰ 또는 클래스 Ⅱ에 의해 처리되고, 제시 경로를 거쳐 부분적인 펩티드가 제시된다.

바람직한 실시태양에서, 본 발명의 상기 APC는 HLA-A＊2402와 같은 HLA-A24 항원 및 본 발명의 펩티드 사이에 형성된 복합체를 그것의 표면에 제시하는 것일 수 있다. 그 대신에, 본 발명의 APC는 HLA-A＊0201와 같은 HLA-A2 항원 및 서열번호 4의 펩티드 사이에 형성된 복합체를 그것의 표면에 제시할 수 있다.

VⅡ . 세포독성 T 세포 ( Cytotoxic T lymphocytes , CTLs )

본 발명의 어느 하나의 펩티드에 대해 유도된 세포독성 T 세포(CTL)는 생체 내에서 종양 관련 내피를 표적으로 하는 면역반응을 증강하고 그로 인하여 상기 펩티드와 같이 백신으로서 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 어느 하나의 펩티드에 의해 특이적으로 유도 또는 활성화된 분리된 세포독성 T 세포를 제공한다.

이러한 CTL은 (1) 본 발명의 펩티드를 개체에 투여 또는 (2) 개체 유래 APC와 CD8 -양성 T 세포, 또는 본 발명의 펩티드와 함께 시험관 내에서 말초혈액단핵림프구 접촉(자극) 또는 (3) CD8-양성 T 세포 또는 말초혈액단핵림프구와 시험관 내에서 그것의 표면에 HLA 항원과 펩티드 복합체를 제시하는 상기 APC 또는 엑소솜을 접촉 또는 (4) 본 발명의 펩티드에 결합할 수 있는 T 세포 수용체 아단위(subnit)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자의 도입으로 얻어질 수 있다. 이러한 APC 또는 엑소솜은 상기 기재한 방법으로 준비될 수 있으며, (4)의 상세한 방법은 아래 "ⅤⅡⅠ. T 세포 수용체 (TCR)" 부분에서 기재된다.

본 발명의 CTL은 치료 및/또는 예방의 표적이 되는 개체로부터 유래할 수 있고, 그 자체, 또는 조Ⅰ절 효과의 목적을 위한 본 발명의 펩티드 또는 엑소솜을 포함하여 다른 약물과 조합하여 투여할 수 있다. 상기 얻어진 세포독성 T 세포는 본 발명의 펩티드, 예를 들어, 유도를 위해 사용한 것과 동일한 펩티드를 제시하는 표적 세포에 대해 특이적으로 작용한다. 상기 표적 세포는 암세포와 같은 CDC45L을 내생적으로 발현하는 세포, 또는 CDC45L 유전자가 형질전환된 세포이고; 본 발명의 펩티드에 의한 자극에 의해 세포 표면에 상기 펩티드를 제시하는 세포도 활성화된 CTL 공격의 표적이 될 수 있다.

ⅤⅢ. T 세포 수용체(T cell receptor , TCR )

또한, 본 발명은 T 세포 수용체(T cell receptor, TCR)의 아단위(subunit)를 형성할 수 있는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 조성물 및 이를 이용한 방법을 제공한다. 본 발명의 상기 TCR 아단위(subunit)는 CDC45L을 제시하는 종양세포에 대한 특이성을 T 세포에 부여하는 TCR 형성 능력을 가진다. 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여, 본 발명의 한 개 또는 복수 펩티드로 유도된 CTL의 TCR 아단위로 여겨지는 알파(alpha) 측쇄 및 베타(beta) 측쇄를 암호화하는 핵산을 동정할 수 있다(WO2007/032255 및 Morgan et al., J immunol, 171, 3288, 2003). 예를 들면, PCR 방법은 상기 TCR 아단위를 암호화하는 핵산 서열을 분석하는 것에 바람직하다. 상기 분석을 위한 PCR 프라이머는, 예를 들어, 5' 사이드(side) 프라이머로서 5'-R 프라이머 (5'- gtctaccaggcattcgcttcat-3') (서열번호 23) 및 TCR 알파 사슬(alpha chain) C 부위에 특이적인 3-TRa-C 프라이머 (5'- tcagctggaccacagccgcagcgt-3') (서열번호 24), TCR 베타 사슬(beta chain) C1 부위에 특이적인 3-TRb-C1 프라이머 (5'- tcagaaatcctttctcttgac-3') (서열번호 25) 또는 3' 사이드(side) 프라이머로서 TCR 베타 사슬 C2 부위에 특이적인 3-TRbeta-C2 프라이머 (5'-ctagcctctggaatcctttctctt-3') (서열번호 26)일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 상기 TCR 유도체는 CDC45L를 제시하는 표적세포에 높은 결합력으로 결합할 수 있고, 상기 CDC45L 펩티드를 제시하는 표적세포의 효과적인 사멸을 생체 내 또는 시험관 내에서 선택적으로 매개할 수 있다.

TCR 아단위를 암호화하는 핵산은 적절한 벡터, 예를 들면, 레트로바이러스 벡터와 같은 적합한 벡터에 삽입할 수 있다. 이러한 벡터들은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 핵산 또는 이를 포함하는 벡터는 T 세포, 예를 들면, 환자 유래의 T 세포 내에 효율적으로 도입될 수 있다. 유용하게는, 본 발명은 환자 자신의 T 세포(또는 다른 포유 동물의 T 세포)의 빠른 변경에 의해, 뛰어난 암 세포 사멸 특성을 갖는 변경된 T 세포를 빠르고 쉽게 제작하는 것을 가능하게 하는 즉시 사용가능한(off-the-shelf) 조성물을 제공한다.

상기 특이적 TCR은 본 발명의 펩티드 및 HLA 분자의 복합체를 특이적으로 인지할 수 있는 수용체이며, T 세포의 표면에 TCR이 제시될 때, T세포에 표적세포에 대해 특이적 활성을 준다. 상기 복합체의 특이적 인식은 임의의 알려진 방법으로 확인될 수 있으며, 바람직한 예는, 본 발명의 HLA 분자 및 펩티드를 이용한 HLA 다량체 염색 분석 및 ELISPOT 분석을 포함하나, 한정하지 않는다. ELISPOT 분석을 수행함으로써, 세포 표면에 TCR을 발현하는 T 세포가 TCR로 세포를 인식하는 것이 확인될 수 있으며, 상기 신호는 세포내로 전달된다. ELISPOT 분석을 수행함으로써, 상기 TCR 아단위를 암호화하는 핵산이 형질도입된 T 세포가 HLA 분자 및 CDC45L를 발현하는 세포를 인식하는 것과, 상기 신호가 세포내로 전달되는 것이 확인될 수 있다. 또한, 당업계에 알려진 방법으로 T 세포 안으로 도입된 TCR 아단위가 T 세포 세포독성 활성을 줄 수 있는지가 확인될 수 있다. 예를 들면, 바람직한 방법은 표적세포로서 HLA-A2 양성 및 CDC45L 과발현하는 세포를 이용한 크로미움 방출 분석(chromium release assay)를 포함한다.

또한, 본 발명은, 예를 들어, HLA-A24에 제한된 서열번호 4 및 서열번호 2, 3, 4, 7 및 12의 펩티드인 CDC45L 펩티드에 결합하는 TCR 아단위 폴리펩티드를 암호화하는 핵산으로 형질전환하여 제조된 CTL을 제공한다. 상기 형질전환된 CTL은 생체 내에서 암세포로 홈밍(homing)할 수 있으며, 잘 알려진 시험관 내 배양 방법으로 증식시킬 수 있다(예를 들면, Kawakami et al., J immunol., 142, 3452-3461 (1989)). 본 발명의 상기 CTL은 치료나 보호를 필요로 하는 환자의 암의 치료 및/또는 예방에 유용한 면역학적 조성물을 구성하는데 쓰일 수 있다(참조 WO2006/031221 내용은 본 발명에 참조로서 포함된다).

ⅠX. 약학적 물질 또는 조성물

CDC45L 발현은 암에서, 예로서 고환종양, 췌장암, 방광암, 비소세포폐암, 소세포폐암, 유방암, 식도암, 전립선암, 만성골수성백혈병, 연조직 종양, 위암, 간담즙성암 및 결장암을 포함하지만, 한정되지 않으며, 정상조직에 비해 특이적으로 증가되어 있기 때문에, 본 발명의 펩티드 및 이러한 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 암의 치료 및/또는 예방, 및/또는 이의 수술 후 재발 예방에서 사용된다. 따라서, 본 발명은 암 치료 및/또는 예방, 및/또는 그것의 수술후 재발 예방을 위한, 유효성분으로서 하나 또는 그 이상의 본 발명의 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학적 물질 또는 조성물 상기약학적 물질 또는 조성물을 제공한다.

대안적으로, 본 발명의 펩티드는 상기 엑소솜 또는 약학적 물질 또는 조성물로서 사용되는 APC와 같은 세포의 임의의 표면에서 발현될 수 있다. 추가로, 상기 언급한 본 발명의 어느 하나의 펩티드를 표적으로 하는 세포독성 T 세포는 또한 본 발명의 약학적 물질 또는 조성물의 유효 성분으로서 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 약학적 물질 및 조성물(즉, “약학적 물질”)은 백신으로 사용한다. 본 발명의 맥락에서, 상기 용어 “백신”(또한 “면역성 조성물”로 언급된)은 동물에 접종할 때 항-종양 면역력을 유도하는 기능을 갖는 물질(substance)를 나타낸다.

본 발명의 상기 약학적 물질 또는 조성물은 인간 및 어떤 다른 동물, 마우스(mouse), 랫(rat), 기니피그(guinea-pig), 토끼, 고양이, 개, 양, 염소, 돼지, 소, 말, 원숭이, 개코원숭이(baboon) 및 침팬지(chimpanzee), 특히 상업적으로 중요한 동물 또는 가축을 포함하지만, 한정하지 않는 개체 또는 환자의 암의 치료 및/또는 예방, 및/또는 그것의 수술 후 재발을 예방하는데 사용될 수 있다.

다른 실시태양에서, 또한 본 발명은 암 또는 종양을 치료하기 위한 약학적 조성물 또는 물질을 제조하는데 있어서, 하기 선택되는 유효 성분의 용도를 제공한다:

(a) 본 발명의 펩티드;

(b) 발현할 수 있는 형태로 본 명세서에 공개된 펩티드를 암호화하는 핵산;

(c) 본 발명의 펩티드를 그것의 표면에 제시하는 APC 또는 엑소솜; 및

(d) 본 발명의 CTL.

그 대신에, 본 발명은 추가적으로 종양의 암 치료에 사용을 위한 하기 중에서 선택되는 유효성분을 제공한다:

(a) 본 발명의 펩티드;

(b) 발현할 수 있는 형태로 본 명세서에 공개된 펩티드를 암호화하는 핵산;

(c) 본 발명의 펩티드를 그것의 표면에 제시하는 APC 또는 엑소솜; 및

(d) 본 발명의 CTL.

또는, 본 발명은 추가적으로 암 또는 종양을 치료 또는 예방하기 위한 약학적 조성물 또는 물질을 제조하기 위한 방법 또는 과정을 제공하며, 상기 방법 또는 과정은 유효성분으로서 하기로부터 선택되는 약학적으로 또는 생리활성적으로 허용가능한 유효 성분이 있는 운반체를 제형화하는 단계를 포함한다:

(a) 본 발명의 펩티드;

(b) 발현할 수 있는 형태로 본 명세서에 공개된 이러한 펩티드를 암호화하는 핵산;

(c) 본 발명의 펩티드를 그것의 표면에 제시하는 APC 또는 엑소솜;및

(d) 본 발명의 CTL.

다른 실시태양에서, 본 발명은 또한 종양 또는 암을 치료 또는 예방하기 위한 약학적 조성물 또는 물질 제조 방법 또는 과정을 제공하며, 상기 방법 또는 과정은 하기로부터 선택되는 유효성분이 있는 약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능한 운반체를 혼합하는 단계를 포함한다:

(a) 본 발명의 펩티드;

(b) 발현할 수 있는 형태로 본 명세서에 공개된 이러한 펩티드를 암호화하는 핵산;

(c) 본 발명의 펩티드를 그것의 표면에 제시하는 APC 또는 엑소솜;및

(d) 본 발명의 CTL.

본 발명에 따르면, 서열번호 2, 3, 4, 7 및 12의 상기 아미노산 서열을 가지는 펩티드들은 강력하고, 특정한 면역 반응을 유도할 수 있는 HLA-A24에 제한된 에피토프 펩티드 또는 상기 후보인 것이 확인되었다. 따라서, 서열번호 2, 3, 4, 7 및 12의 아미노산 서열이 있는 이러한 펩티드 중 어느 것을 포함하는 상기 약학적 물질 또는 조성물은 특이적으로 HLA 항원이 HLA-A24인 개체의 투여에 대해 적합하다.

또한, 서열번호 4의 아미노산을 가지는 상기 펩티드는 HLA-A2 에 제한적인 에피토프 펩티드인 것이 확인되었다. 따라서, 또한, 서열번호 4의 아미노산 서열이 있는 펩티드를 포함하는 상기 약학적 물질 또는 조성물은 HLA 항원이 HLA-A2인 개체에 더하여, HLA 항원이 HLA-A24인 개체에 투여하는 것이 적합하다. 이러한 펩티드들 중 어느 것을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학적 물질 또는 조성물을 적용한다(즉, 본 발명의 상기 폴리뉴클레오티드).

본 발명의 약학적 물질 또는 조성물에 의해 치료된 암은 한정되지 않으나, CDC45L 가 관련된(예를 들면, 과발현된), 포함된 어떠한 암, 예를 들어, 고환종양, 췌장암, 방광암, 비소세포폐암, 소세포폐암, 유방암, 식도암, 전립선암, 만성골수성백혈병, 연조직 종양, 위암, 간담즙성암 및 결장암을 포함한다.

상기 약학적 물질 또는 조성물은 상기 기재한 유효 성분에 더하여, 암 세포에 대해 CTL을 유도하는 능력이 있는 다른 펩티드, 상기 다른 펩티드를 암호화하는 다른 폴리뉴클레오티드, 상기 다른 펩티드들을 제시하는 다른 세포를 포함할 수 있다. 본 발명에서 암세포에 대해 CTL을 유도하는 능력을 가지는 다른 펩티드들도 암 특이적 항원(예를 들어, 확인된 TAA들)에 의해 증폭되나 이에 한정하지 않는다.

상기 물질은, 예를 들면 본 발명의 펩티드들 중 어느 하나, 유효 성분의 항 종양 효과를 저해하지 않는 한, 본 발명의 약학적 물질 또는 조성물은 유효 성분으로서 다른 치료적 물질을 선택적으로 포함할 수 있다. 예를 들면, 제제는 항염증 물질 또는 조성물, 진통효과, 화학요법제 및 기타 같은 종류의 것을 포함할 수 있다. 그것의 약물 안에 다른 치료적 물질에 더하여, 또한, 본 발명의 약물은 하나 또는 그 이상의 다른 약학적 물질 또는 조성물과 단계적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 약물 및 약학적 물질 또는 조성물의 양은, 예를 들면, 쓰이는 약학적 물질 또는 조성물의 유형, 치료되는 질환, 투여의 일정과 방법에 달려있다.

본 명세서에서 특히 언급한 성분에 더하여, 본 발명의 약학적 물질 또는 조성물은 논의가 되고 있는 형태의 제형을 갖는 종래의 다른 물질 또는 조성물을 포함할 수 있다.

본 발명의 한 실시태양에서, 상기 제시된 약학적 물질 또는 조성물은, 예를 들어 암과 같은, 질환의 병리학 조건을 치료하는데, 유용한 물질을 포함하는 제품 및 키트에 포함될 수 있다. 상기 제품은 라벨이 있는 상기 약학적 물질 또는 조성물 중 어느 하나의 용기를 포함할 수 있다. 적합한 용기는 병, 바이알 및 테스트 튜브를 포함한다. 상기 용기는 병 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 만들어질 수 있다. 상기 용기의 라벨은 상기 질환의 한 개 또는 그 이상의 조건의 치료 또는 예방에 쓰이는 물질(substance) 또는 조성물인 것을 나타내야 한다. 또한 라벨은 투여 지시 및 기타의 것에 대해 나타낼 수 있다.

상기 기재한 용기에 더하여, 또한 본 발명의 약학적 물질 또는 조성물을 포함한 키트는 선택적으로 약학적으로 허용할 수 있는 희석액을 보관하는 두 번째 용기를 포함할 수 있다. 또한 이것은 상업적 및 사용자의 관점으로부터 구체적인 다른 물질, 다른 버퍼, 희석액, 필터, 니들, 주사기 및 사용설명서를 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 유효 성분이 포함된 한 개 또는 그 이상의 구성 단위 제형을 포함할 수 있는 팩 또는 용기 장치에 존재할 수 있다. 상기 팩은, 예를 들어, 금속 또는 블리스터(blister) 포장같은 금속 또는 플라스틱 호일을 포함할 수 있다. 상기 팩 또는 디스펜서(dispenser) 장치는 투여에 대한 지시에 의해 수반될 수 있다.

(1)상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 약학적 물질 또는 조성물.

본 발명의 펩티드들은 약학적 물질 또는 조성물로 직접적으로 투여될 수 있으며, 또는 필요하다면, 종래의 제조 방법에 의해 제조될 수 있다. 후자의 경우, 본 발명의 펩티드들에 더하여, 운반체, 부형약 및 이러한 것이 특이적 제한 없이 포함될 수 있다. 이러한 운반체들의 예는 멸균된 물, 생리학적 염분, 인산 완충액, 배양 유액 등이다. 또한, 상기 약학적 물질 또는 조성물은 필요하다면, 안정제, 현탁액, 보존료, 계면활성제등을 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 물질 또는 조성물은 항암 목적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 펩티드들은 생체 내에서 CTL을 유도하기 위해 본 발명의 펩티드들 중 두 개 또는 그 이상으로 구성된 조합으로 준비될 수 있다. 상기 펩티드 조합은 혼합제의 형태를 가질 수 있고, 또는 표준 기술을 이용하여 각각 다른 것이 접합될 수 있다. 예를 들면, 상기 펩티드는 화학적으로 연결될 수 있거나, 링커로서 몇몇의 아미노산을 가질 수 있는 단독 융합 폴리펩티드 서열로 발현될 수 있다 (예를 들면, Lysine linker: K. S. Kawamura et al. J. immunol. 2002, 168: 5709-5715).

상기 조합의 펩티드들은 같거나 다를 수 있다. 본 발명의 펩티드들을 투여함으로써, 펩티드들은 APC에 HLA 항원에 의해 높은 밀도에서 제시되며, 그 후에 제시된 펩티드 및 HLA 항원으로 구성된 복합체에 대해 특이적으로 반응하는 CTL은 유도된다. 또는, 본 발명의 임의의 펩티드를 그것의 세포 표면에 제시하는 APC는 본 발명의 상기 펩티드로 개체로부터 유래된 APC(예를 들면, 수지상 세포)를 자극함으로써 수득할 수 있고, 상기 개체에 투여되고, 그 결과, CTL은 상기 개체에서 유도되고 상기 암 세포에 대한 침해성이 증가할 수 있다.

또한, 본 발명의 펩티드를 유효성분으로 포함하는 암 또는 종양의 치료 및/또는 예방에 대한 상기 약학적 물질 또는 조성물은 세포 면역을 효과적으로 수립하는 알려진 보조약을 포함할 수 있다.

대안적으로, 상기 약학적 물질 또는 조성물은 다른 유효 성분과 함께 투여될 수 있으며, 그들은 과립제(granules) 제형으로 투여될 수 있다. 보조약은 면역학적으로 활성이 있는 단백질과 함께 (또는 연속적으로)투여하였을 때, 단백질에 대해 면역반응을 증가시키는 어떤 화합물, 물질(substance) 또는 조성물을 나타낸다. 본 명세서에서 고려한 보조약은 문헌에 기재되어 있는 것들을 포함한다(Clin Microbiol Rev 1994, 7: 277-89). 적합한 보조약의 예들은 알루미늄 인산염(aluminum phosphate), 알루미늄 수산화물(aluminum hydroxide), 백반(alum), 콜레라 독소(cholera toxin), 살모넬라 독소(salmonella toxin), 불완전한 Freund의 보조약( incomplete Freund's adjuvant, iFA), 완전한 Freund의 보조약 (Complete Freund's adjuvant, CFA), iSCOMatrix, GM-CSF, CpG, O/W 유화액등을 포함하지만, 이에 한정하지 않는다.

또한, 리포좀(liposome) 제형, 미세한 마이크로미터 지름의 비드(bead)가 결합된 펩티드가 있는 과립제 제형 및 지질(lipid)이 결합되는 펩티드 제형이 편리하게 쓰일 수 있다.

본 발명의 다른 실시태양에서, 또한 본 발명의 펩티드들은 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 투여될 수 있다. 염의 바람직한 예는 알카리 메탈(alkali metal)이 있는 염, 메탈이 있는 염, 유기 염기가 있는 염, 유기산이 있는 염 및 무기산이 있는 염을 포함한다.

몇몇의 실시태양에서, 또한 본 발명의 약학적 물질 또는 조성물은 CTL을 준비하는 구성요소를 포함할 수 있다. 지질은 바이러스 항원에 대해 생체 내에서 CTL을 준비시킬 수 있는 물질 또는 조성물로 확인되었다. 예를 들면, 팔미트 산 잔기(palmitic acid residues)는 라이신(lysine) 잔기의 엡실론-아미노(epsILon-amino) 및 알파-아미노(alpha-amino) 그룹에 붙여질 수 있으며, 그 후에 본 발명의 펩티드들과 연결될 수 있다. 지질화 펩티드들은 리포좀으로 도입 또는 보조약 안에 유화되어 마이셀(micelle) 또는 입자 안에 직접적으로 투여될 수 있다. CTL 반응을 준비시키는 지질의 또 다른 예로, 적절한 펩티드들에 공유적으로 붙일 때, 트리팔미토일-S-글리세릴시스테인리세릴-세린(tripalmitoyl-S-glycerylcysteinlyseryl-serine, P3CSS)과 같은 E. coli 지단백질(lipoproteins)이 CTL을 준비하는 것에 사용될 수 있다(참조, 예를 들어, Deres et al., Nature 1989, 342: 561-4).

투여 방법은 경구, 피내, 피하, 정맥 주사, 또는, 및 전신 투여 또는 표적하는 장소 부근에 국소적 투여일 수 있다. 상기 투여는 단독 투여로 수행될 수 있으며 또는 다수의 투여로 신장시킬 수 있다. 본 발명의 펩티드의 복용량은 치료되기 위한 질환, 환자의 연령, 몸무게, 투여 방법 등에 알맞게 적용될 수 있으며, 보통 0.001 mg 내지 1,000 mg, 예를 들면, 0.001 mg 내지 1,000 mg, 예를 들면, 0.1 mg 내지 10 mg이며, 며칠에서 몇 달에 한 번 투여될 수 있다.

(2)폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 약학적 물질 또는 조성물

또한, 본 발명의 약학적 물질 또는 조성물은 발현할 수 있는 형태로 본 명세서에서 공개된 펩티드를 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다. 본 명세서에서, 상기 용어 “발현할 수 있는 형태”로 세포 안으로 상기 폴리뉴클레오티드가 도입되었을 때, 생체 내에서 폴리뉴클레오티드가 항종양 면역을 유도하는 폴리펩티드로 발현될 것임을 의미한다. 예시된 실시태양에서, 관심있는 폴리뉴클레오티드의 핵산 서열은 폴리뉴클레오티드의 발현에 대해 필요한 조절 요소를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 표적세포의 유전체로 안정한 삽입을 향상시키기 위해 준비될 수 있다(참조, 예를 들어, Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12 for a description of homologous recombination cassette vectors. 또한, 참조, 예를 들어, Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8; U.S. Patent Nos. 5,580,859; 5,589,466; 5,804,566; 5,739,118; 5,736,524; 5,679,647; 및 WO 98/04720)를 참조한다. DNA-기반의 전달 기술의 예로서 "네이키드 DNA(naked DNA)" 용이한 전달(부피바카인(bupivacaine), 폴리머, 펩티드-매개), 양이온 지질 복합체 및 입자-매개("유전자 총")또는 압력-매개 전달을 포함한다(참조, 예를 들어, U.S. Patent No. 5,922,687).

또한, 본 발명의 펩티드는 바이러스(virus) 또는 세균 벡터(vector)로 발현될 수 있다. 발현 벡터의 예로 백시니아(vaccinia) 또는 계두(fowlpox)와 같은 강화된 바이러스 숙주를 포함한다. 이러한 접근은 백시니아 바이러스(vaccinia virus)의 사용, 예를 들어, 상기 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 발현하는 벡터를 포함한다. 숙주에 도입하였을 때, 상기 재조합 백시니아 바이러스는 면역성 펩티드를 발현함으로써 면역 반응을 유도한다. 면역법 프로토콜에서 유용한 백시니아 벡터 및 방법은, 예를 들어, U.S. Patent No. 4,722,848에 기재되어 있다. 다른 벡터는 BCG(BacILle Calmette Guerin)이다. BCG 벡터는 Stover et al., Nature 1991, 351: 456-60에 기재되어 있다. 치료상의 투여 또는 면역법에 대한 유용한 다양한 다른 벡터들, 예를 들어, 아데노(adeno) 및 아데노-관련 바이러스 벡터, 레트로바이럴 벡터(retroviral vector), 살모넬라 타이피 벡터(salmonella typhi vectors), 독성이 없는 탄저균 독소 벡터, 기타 같은 종류의 것이 분명할 것이다. 참조, 예를 들어, Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71; Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806; Hipp et al., in Vivo 2000, 14: 571-85.

환자에 폴리뉴클레오티드의 전달은 각각 폴리뉴클레오티드를 운반하는 벡터에 직접적으로 환자를 노출시키는 것인 직접적인 것 또는 세포를 시험관 내에서 관심있는 폴리뉴클레오티드로 먼저 형질전환하고, 그 후에 상기 세포를 환자에 이식하는 것인 간접적인 것일 수 있다. 이러한 두 가지 접근법은 각각 생체 내 및 체외에서 유전자 치료로 알려져있다.

유전자 치료의 상기 방법의 일반적인 리뷰는 (참조 Clinical Pharmacy 1993, 12: 488-505; Wu and Wu, Biotherapy 1991, 3: 87-95; Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 1993, 33: 573-96; Mulligan, Science 1993, 260: 926-32; Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993, 62: 191-217; Trends in Biotechnology 1993, 11(5): 155-215)를 참조한다. 또한, 재조합 DNA 기술의 당업계에 일반적으로 알려진 방법은 본 발명에 이용될 수 있다. 예를 들면 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John WILey & Sons, NY, 1993; and Krieger, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990 참조.

투여 방법은 경구, 피내, 피하, 정맥 주사, 또는, 및 전신 투여 또는 표적하는 장소 부근에 국소적 투여일 수 있다. 상기 투여는 단독 투여로 수행될 수 있으며 또는 다수의 투여로 신장시킬 수 있다. 적절한 담체에 포함된 상기 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명의 상기 펩티드를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 세포의 용량은 치료되기 위한 질환, 환자의 연령, 몸무게, 투여 방법 등에 알맞게 적용될 수 있으며, 그리고 보통 0.001 mg 내지 1000 mg, 예를 들면, 0.001 mg 내지 1000 mg, 예를 들면, 0.1 mg 내지 10 mg이며, 몇 일에서 몇 달에 한 번 투여될 수 있다. 당업자는 적합한 용량을 적절히 선택할 수 있다.

Ⅹ. 펩티드, 엑소솜 , APC 및 CTL 을 이용하는 방법

본 발명의 펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 APC와 CTL을 제조 및 유도에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 엑소솜 및 APC는 CTL을 유도하는데 사용될 수 있다. 상기 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 엑소솜 및 APC는 화합물이 그들의 CTL 유도성을 저해하지 않는 한 어떠한 다른 화합물의 조합으로 사용될 수 있다. 따라서, 상기에 언급한 본 발명의 약학적 물질 또는 조성물 중 어떤 것은 CTL을 유도하는데 사용될 수 있으며, 그것에 더하여, 또한 이러한 펩티드 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것은 하기에 더 자세히 기재된 바와 같이 APC를 유도하는데 사용될 수 있다.

(1) 항원제시세포(antigen-presenting cells, APC) 유도 방법

본 발명은 본 발명의 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 높은 CTL 유도성이 있는 APC를 유도하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 시험관 내, 체외 또는 생체 내에서 본 발명의 펩티드를 APC와 접촉하는 하기 단계를 포함한다. 예를 들어, 체외에서 및 시험관 내에서 펩티드와 APC를 접촉하는 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다:

a: 개체로부터 APC를 수집하는 단계; 및

b: 펩티드와 단계 a의 APC를 접촉하는 단계.

APC는 특정한 종류의 세포에 한정되지 않으며, 림프구에 의해 인식되기 위해서 단백질성의 항원을 그들의 세포 표면에 발현하는 것으로 알려져 있는 수지상세포, 랑게르한스 세포, 대식세포, B 세포 및 활성화된 T 세포를 포함한다. 바람직하게는, 수지상세포는 APC들 사이에서 그들이 제일 강한 CTL 유도성을 가지므로 쓰일 수 있다. 본 발명 중 어떤 펩티드는 단독 또는 본 발명의 다른 펩티드들과 함께 사용될 수 있다.

반면에, 개체로 본 발명의 펩티드가 투여될 때, 상기 APC는 생체내에서 펩티드와 접촉될 수 있으며, 그 결과, 높은 CTL 유도성이 있는 상기 APC가 개체의 몸안에 도입된다.

따라서, 본 발명은 개체에 본 발명의 펩티드를 투여하는 것을 포함한다.

또한, 생체 내에서 본 발명의 펩티드들이 발현되고 APC와 접촉하여, 결과적으로 높은 CTL 유도성을 가지는 APC를 유도하도록, 본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 개체에 표현할 수 있는 형태로 투여하는 것이 가능하다. 유사하게, 발현할 수 있는 형태로 개체에 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 투여하였을 때, 본 발명의 펩티드는 발현되고, 생체내에서 APC와 접촉하였으며, 따라서, 높은 CTL 유도성이 있는 상기 APC가 개체의 몸안에서 유도된다.

따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 개체로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 상기 용어 "발현 할 수 있는 형태"는 상기 부분 "ⅠX. 약학적 물질 및 조성물, (2) 유효 성분으로 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학적 물질 또는 조성물."에서 기재된다.

또한, 본 발명은 CTL 유도성이 있는 APC를 유도하기 위해 APC 내로 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 방법의 실례가 되는 예는 단계를 포함할 수 있다:

a: 개체로부터 APC의 수집하는 단계; 및

b: 본 발명의 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계.

단계 b는 상기 부분 "Vi. 항원 제시 세포"에 기재한 것과 같이 수행될 수 있다.

또는, 본 발명은 CDC45L에 대해 특이적으로 CTL 활성을 유도하는 항원제시세포 (antigen-presenting cell, APC)를 준비하는 방법을 제공하며, 이는 하기 단계 중 하나를 포함할 수 있다:

(a) APC와 본 발명의 펩티드를 시험관 내, 체외 또는 생체 내에서 접촉시키는 단계; 및

(b) APC로 본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계.

(2) CTL을 유도하는 방법

또한, 본 발명은 본 발명의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 엑소솜 또는, APC를 이용하여 CTL을 유도하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 CTL을 유도하는 방법을 제공하며, 이 방법은 본 발명의 펩티드와 HLA 항원 복합체를 인식하는 T 세포 수용체(TCR) 아단위(subunit)를 형성함으로써 가능하다. 구체적으로, CTL을 유도하기 위한 상기 방법은, 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 한 단계를 포함할 수 있다:

a) CD8 양성 T 세포를 그것의 표면에 HLA 항원 및 본 발명의 펩티드의 복합체를 제시하는 APC 및/또는 엑소솜과 접촉시키는 단계; 및

b) 본 발명의 펩티드 및 HLA 항원폴리펩티드 복합체를 인식하는 TCR 아단위를 형성할 수 있는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 CD8 양성 세포로 도입하는 단계.

본 발명의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, APC 또는 엑소솜이 개체로 투여될 때, CTL은 개체의 몸에서 유도되고, 표적하는 암세포에 대한 면역 반응의 강도는 향상된다. 따라서, 본 발명의 방법은 또한 본 발명의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, APC 또는 엑소솜을 개체에 투여하는 단계를 포함한다.

그 대신에, 또한 CTL은 체외에서 또는 시험관 내에서 그들을 이용함으로써 유도될 수 있으며, CTL 유도 후에, 상기 활성화된 CTL은 개체로 되돌려질 수 있다. 예를 들면, 상기 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다:

a : 개체로부터 APC를 수집하는 단계;

b : 펩티드와 단계 a의 APC를 접촉하는 단계; 및

c : CD8 양성 세포와 단계 b)의 APC와 공배양하는 단계.

상기 단계 c에서 CD8 양성 세포와 공배양된 APC는 상기 "Vi. 항원제시세포" 부분에서 기재한 것과 같이 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자를 APC에 형질전환함으로써 준비될 수 있으나, 본 발명이 한정되지 않으며, 따라서, HLA항원 및 본 발명의 펩티드의 복합체를 그것의 표면에 효과적으로 제시하는 어떤 APC를 포함할 수 있다.

이러한 APC 대신에, 본 발명의 펩티드 및 HLA 항원의 복합체를 그것의 표면에 제시하는 엑소솜도 역시 사용될 수 있다. 다시 말해서, 본 발명은 그것의 표면에 HLA항원과 본 발명의 펩티드의 복합체를 제시하는 엑소솜을 공배양하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 엑소솜은 상기 "V. 엑소솜" 부분에서 기재한 방법에 의해 준비될 수 있다.

또한, CTL은 본 발명의 펩티드에 결합하는 TCR 아단위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자를 CD8 양성 세포에 도입함으로써 유도될 수 있다. 이러한 형질 도입은 상기 "ⅤⅡⅠ. T세포 수용체 (TCR)" 부분에 기재된 것과 같이 수행될 수 있다.

또한, 본 발명은 CTL을 유도하는 약학적 물질 또는 조성물을 제조하는 방법 또는 과정을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 펩티드와 약학적으로 허용가능한 운반체를 혼합 또는 제조하는 단계를 포함한다.

(3)면역반응을 유도하는 방법

또한, 본 발명은 CDC45L에 관련된 질환에 대해 면역반응을 유도 방법을 제공한다. 적합한 질환들은, 예를 들어 고환종양, 췌장암, 방광암, 비소세포폐암, 소세포폐암, 유방암, 식도암, 전립선암, 만성골수성백혈병, 연조직 종양, 위암, 간담즙성암 및 결장암을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 방법은 본 발명의 펩티드들 중 어느 것 또는 그들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 물질(들) 또는 조성물(들)을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 역시 본 발명의 펩티드들 중 어느 것을 제시하는 엑소솜 또는 APC의 투여를 고려한다. 상세하게는, "iX. 약학적 물질 또는 조성물"의 항목을 참조하고, 특히 본 발명의 약학적 물질 또는 조성물이 백신으로 사용된 것을 기재한 부분을 참조하라. 또한, 상기 엑소솜과 APC는 "V. 엑소솜", "Vi. 항원제시세포" 및 "Ⅹ. 펩티드, 엑소솜, APC 및 CTL을 사용한 방법"의 (1) 및 (2)의 항목 하에 세부항목에 기재된 면역 반응을 유도하는 방법에 대해 적용될 수 있다.

또한, 본 발명은 면역반응을 유도하는 약학적 물질 또는 조성물을 제조하는 방법 또는 과정을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 펩티드와 약학적으로 허용가능한 운반체를 혼합 또는 제조하는 단계를 포함할 수 있다.

또는, 본 발명의 방법은 하기를 포함하는, 백신 또는 약학적 물질 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다:

(a) 본 발명의 펩티드;

(b) 발현할 수 있는 형태로 본 명세서에 공개된 이러한 펩티드를 암호화하는 핵산;

(c) 본 발명의 펩티드를 그것의 표면에 제시하는 APC 또는 엑소솜; 또는

(d) 본 발명의 CTL.

본 발명의 맥락에서, CDC45L 가 과발현하는 암은 이러한 유효 성분으로 치료될 수 있다. 암은 고환종양, 췌장암, 방광암, 비소세포폐암, 소세포폐암, 유방암, 식도암, 전립선암, 만성골수성백혈병, 연조직 종양, 위암, 간담즙성암 및 결장암을 포함하지만, 이에 한정하지 않는다. 따라서, 백신 또는 유효 성분을 포함하는 약학적 물질 또는 조성물의 투여에 앞서, 치료되는 세포 또는 조직에서 CDC45L 발현 수준이 같은 기관의 정상 세포에 비해 증가되었는지 확인하는 것이 바람직하다. 따라서, 하나의 실시태양에서, 본 발명은 하기 단계를 포함할 수 있는 CDC45L 을 (과)발현하는 암을 치료하는 방법을 제공한다:

i) 치료되기 위한 암이 있는 개체로부터 얻어지는 세포들 또는 조직(들)에서 CDC45L 의 발현 수준을 확인하는 단계;

ⅱ) 정상 대조군 수준과 상기 CDC45L 의 발현 수준을 비교하는 단계; 및

ⅲ) (a) 내지 (d)로 구성된 상기 기재된 군으로부터 적어도 한 가지 선택되는 구성요소를 정상 대조군에 비해 CDC45L가 과발현하는 암이 있는 개체에 투여하는 단계.

또는, 본 발명은 또한, CDC45L가 과발현하는 암이 있는 개체로 투여하는데 이용하기 위하여, 상기 기재된 (a) 내지 (d)로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 한 가지 구성요소를 포함하는 백신 또는 약학적 물질 또는 조성물을 제공할 수 있다. 다시 말해서, 또한, 본 발명은 본 발명의 CDC45L 폴리펩티드가 처리되는 개체를 확인하는, 유전자의 정상 대조군 수준에 비해 수준의 증가가 개체가 본 발명의 CDC45L 폴리펩티드로 처리될 수 있는 암을 가진 것을 나타내는, 개체 유래 세포 또는 조직(들)에서 CDC45L의 발현 수준을 확인하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명의 암 치료 방법은 하기에 더 자세히 기재된다.

어떤 개체 유래 세포 또는 조직은 이것이 CDC45L의 실재하는 전사 또는 번역 산물을 포함하는 한 CDC45L 발현 확인에 사용될 수 있다. 적절한 시료의 예로서 신체 조직 및 혈액, 가래 및 소변과 같은 체액을 포함하지만, 한정되지 않는다. 바람직하게, 상기 개체 유래 세포 또는 조직시료는 상피 세포를 포함하는 세포 개체군을 포함하며, 더 바람직하게, 암의 상피 세포 또는 암으로 추측되는 조직 유래 상피 세포이다. 또한, 필요하다면, 상기 수득된 세포는 신체 조직 및 체액으로부터 정제될 수 있으며, 그 후 개체 유래 시료로서 이용될 수 있다.

본 발명의 맥락에서, 암이 아닌 것으로 알려진 생물 시료로부터 확인된 대조군 수준은 “정상 대조군 수준”으로 나타낸다. 한편, 만약 대조군 수준이 암의 생물 시료로부터 확인되면, 이를 “암 대조군 수준”으로 나타낸다. 시료 발현 수준 및 대조군 수준 사이의 차이는 대조군 핵산의 발현 수준, 예를 들면 세포의 암 또는 암이 아닌 상태에 따라 발현 수준이 다르지 않다고 알려진 하우스키핑 유전자(housekeeping genes)으로 정상화 될 수 있다. 예시적인 대조군 유전자는 베타-액틴(beta-actin), 글리세르알데히드 3 포스페이트 탈수소효소(glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase) 및 리보솜 단백질 P1(ribosomal protein P1)를 포함하지만, 한정하지 않는다.

상기 방법으로 치료되는 개체는 구체적으로 포유동물일 수 있다. 예시적인 포유동물은, 예를 들면, 인간, 인간이 아닌 영장류, 마우스(mouse), 랫(rat), 개, 고양이, 말, 소를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따르면, 개체로부터 얻어진 세포들 또는 조직들에서 CDC45L의 발현 수준이 결정될 수 있다. 상기 발현 수준은 당업계에 알려진 방법을 이용하여 전사(핵산) 생산물 수준에서 결정될 수 있다. 예를 들면, CDC45L의 mRNA는 혼성화 방법으로 탐침을 이용하여 정량될 수 있다(예를 들어, Northern hybridization). 탐지는 칩, 어레이(array) 또는 그와 같이 수행될 수 있다. 어레이의 사용이 CDC45L의 발현 수준을 탐지하는데 바람직할 수 있다. 당업자들은 이러한 CDC45L의 서열정보를 이용하여 탐침을 제조할 수 있다. 예를 들면, CDC45L의 cDNA는 탐침으로 사용될 수 있다. 만약 필요하다면, 상기 탐침은 염료, 형광 물질 및 동위원소와 같은, 적절한 표지로 표지될 수 있으며, 유전자의 발현 수준은 혼성화된 표지의 강도로 탐지될 수 있다.

또한, CDC45L(예를 들면, 서열번호 17)의 전사 생산물은 증폭-기반 탐지 방법에 의해 프라이머를 사용하여 정량될 수 있다(예를 들면, RT-PCR). 이러한 프라이머는 상기 유전자의 이용가능한 서열 정보를 기반으로 준비될 수 있다.

특히, 상기 제시된 방법에 대해 사용된 탐침 또는 프라이머는 엄격한 상태, 적절하게 엄격한 상태 또는 낮게 엄격한 상태하에서 CDC45L의 mRNA와 혼성화된다. 본 명세서에 사용되었던, 상기 용어 "엄격한 (혼성화) 조건" 탐침 또는 프라이머가 그것의 표적 서열에 혼성화하는 조건을 나타내지만, 다른 서열에는 혼성화되지 않는다. 엄격한 조건은 서열-의존적이며, 다른 환경하에서 달라질 것이다. 더 긴 서열의 특이적 혼성화는 짧은 서열에 비해 높은 온도에서 관찰된다. 일반적으로, 엄격한 조건의 온도는 정의된 이온 강도 및 pH에서 특이적 서열에 대해 열융해점(Thermal melting point, Tm)보다 약 5℃ 낮게 선택된다. 상기 Tm은 (정의된 이온 강도, pH 및 핵산 농도 하에) 50%의 상기 탐침이 상보적으로 상기 표적 서열에 동등하게 혼성화되는 온도이다. 상기 표적 서열이 일반적으로 과다하게 존재하므로, Tm에서 상기 탐침의 50%는 동등하게 점유된다. 일반적으로, 엄격한 조건은 염 약 1.0 M 소듐 이온 미만인 농도일 수 있으며, 일반적으로, pH 7.0 내지 8.3에서 약 0.01 내지 1.0 M 소듐 이온 (또는 다른 염들) 온도는 짧은 탐침 또는 프라이머에 대해 적어도 약 30℃이고, (예를 들면, 10 내지 50 뉴클레오티드) 긴 탐침 또는 프라이머에 대해서는 적어도 약 60℃이다. 엄격한 조건은 포름아마이드(formamide)와 같은 불안정하제의 첨가로 얻을 수 있다.

또는, 번역 생산물은 본 발명의 진단에 대해 탐지될 수 있다. 예를 들면, CDC45L 단백질(서열번호 18) 또는 이의 면역학적 단편의 양은 결정될 수 있다. 번역 산물로서 단백질의 양을 결정하는 방법은 상기 단백질을 인식하는 특이적 항체를 사용한 면역분석 방법을 포함한다. 상기 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있다.. 또한, 상기 단편 또는 변형된 항체가 CDC45L 단백질에 결합하는 능력을 유지하는 한, 항체의 어떤 단편 또는 변형(예를 들어, 카이메릭(chimeric) 항체, scFv, Fab, F(ab')2, Fv, 등)은 탐지를 위해 쓰일 수 있다. 또한, 본 발명의 펩티드 및 이의 단편에 대한 상기 항체는 본 발명에 의해 제공된다. 단백질의 탐지를 위해 상기 유형의 항체를 준비하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 어떤 방법은 본 발명에서 상기 항체 및 그들의 등가물을 준비하는 것에 적용될 수 있다.

CDC45L 유전자 발현 수준을 탐지하기 위한 다른 방법은 그것의 번역 산물에 기초하기 때문에, 염색의 강도는 CDC45L 단백질에 대한 항체를 이용한 면역조직학적 분석을 통해 측정될 수 있다. 다시 말해서, 이러한 측정에서, 강한 염색은 증가된 단백질의 존재/수준 및, 동시에, CDC45L 유전자의 높은 발현수준을 나타낸다.

암세포에서의 CDC45L 유전자를 포함한 표적유전자의 발현 수준은, 예를 들어, 10%, 25%, 또는 50% 또는 1.1배 이상, 1.5배 이상, 2.0배 이상, 5.0배 이상, 10.0배 이상 또는 그 이상과 같이, 상기 표적 유전자의 상기 대조군 수준으로부터 수준이 증가된 것에 따라 확인될 수 있다(예를 들면, 정상 세포의 상기 수준).

상기 대조군 수준은 질환 상태(암성 또는 비암성)라고 알려진 개체(들)로부터 이전에 수집되고 저장된 샘플을 이용함으로써 상기 암세포로서 동시에 확인될 수 있다. 또한, 치료되기 위한 암을 가지는 조직의 암이 없는 부분에서 얻어진 정상 세포는 정상 대조군으로 사용될 수 있다. 또는, 상기 대조군 수준은 이전에 질환 상태에 있다고 알려진 개체 유래 샘플에서 확인된 CDC45L 유전자의 발현 수준을 분석함으로써 얻어진 상기 결과를 기반으로 하는 통계학적인 방법으로 확인될 수 있다. 또한, 이전에 시험된 세포의 발현 패턴 데이터베이스로부터 대조군 수준은 유래될 수 있다. 또한, 본 발명의 측면에 따르면, 상기 생물 시료 안의 CDC45L 유전자의 발현 수준은 복수 참조 시료로부터 확인된 복수 대조군 수준과 비교할 수 있다. 개체 유래 생물 시료의 그것과 유사한 조직 유래 참조 시료로부터 확인된 대조군 수준을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 질환 상태로 알려진 개체군 안의 CDC45L 유전자의 발현 수준의 표준 값을 이용하는 것이 바람직하다. 표준 값은 당업계에 알려진 어떤 방법에 의해 얻을 수 있다. 예를 들면, 평균 ＋／－ 2 S.D. 또는 평균 ＋／－ 3 S.D. 의 범위는 표준 값으로 쓰일 수 있다.

CDC45L 유전자의 발현 수준이 정상 대조군 수준에 비해 증가되었을 때 또는 암 대조군 수준에 유사하거나/동등할 때, 상기 개체는 치료되기 위한 암으로 진단될 수 있다.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 (i) 치료되기 위한 암을 가지는 것으로 예측된 개체를 진단, 및/또는 (ⅱ) 암 치료에 대한 개체를 선택하는 방법을 제공하며, 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다:

a) 치료되기 위한 암을 가진 것으로 의심되는 개체로부터 얻어지는 세포 또는 조직에서 CDC45L의 발현 수준을 확인하는 단계;

b) 정상 대조군 수준과 CDC45L 발현 수준의 비교하는 단계;

c) 만약 CDC45L 의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 증가되었다면, 치료되기 위한 암을 가지는 개체로 진단하는 단계 ; 및

d) 만약 개체가 단계 c)에서 치료될 암을 가지고 있다고 진단되었다면, 암 치료에 대한 개체로 선택하는 단계.

또는, 이러한 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다:

a) 치료되기 위한 암이 있다고 의심되는 개체로부터 얻어진 세포 또는 조직에서 CDC45L의 발현 수준을 확인하는 단계;

b) 암 대조군 수준과 CDC45L의 발현 수준 비교하는 단계;

c) 만약 CDC45L의 발현 수준이 암 대조군 수준과 유사하거나 또는 동등하다면, 치료되기 위한 암을 가진 개체로 진단하는 단계;및

d) 만약 단계 c)에서 치료될 암을 가진 것으로 진단되었다면, 암 치료에 대한 개체로 선택하는 단계.

또한, 본 발명은 개체 또는 암의 예측의 평가 및/또는 효과를 관측 또는 특정한 치료의 이용가능성, 더 특정하게 암 면역치료에 이용될 수 있는, 본 발명의 CDC45L 폴리펩티드로 치료될 수 있는 암으로부터 고통받는 것으로 의심되는 개체를 진단하거나 확인하기 위한 진단 키트를 제공한다.

적합한 암의 실례가 되는 예는 고환종양, 췌장암, 방광암, 비소세포폐암, 소세포폐암, 유방암, 식도암, 전립선암, 만성골수성백혈병, 연조직 종양, 위암, 간담즙성암 및 결장암을 포함하지만, 한정되지 않는다.

더욱 특히, 상기 키트는 구체적으로 개체 유래 세포안의 CDC45L 유전자의 발현을 탐지하기 위한 적어도 한 가지 시약을 포함할 수 있으며, 상기 시약은 하기의 군으로부터 선택된다:

(a) CDC45L 유전자의 mRNA 탐지를 위한 시약;

(b) CDC45L 단백질 또는 그것의 면역학적 단편의 탐지를 위한 시약; 및

(c) CDC45L 단백질의 생물학적 활성을 탐지하기 위한 시약.

CDC45L 유전자의 mRNA를 탐지하기 위한 적절한 시약의 예는 CDC45L mRNA의 부분에 상보적인 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드와 같은 CDC45L mRNA에 특이적으로 결합하거나 확인하는 핵산을 포함할 수 있다. 이러한 유형의 올리고뉴클레오티드는 CDC45L mRNA에 특이적인 프라이머 및 탐침으로 증폭될 수 있다. 이러한 유형의 올리고뉴클레오티드는 당업계에 잘 알려진 방법에 기초하여 준비될 수 있다. 만약 필요하다면, CDC45L mRNA를 탐지하기 위한 시약은 고체 매트릭스에 고정화될 수 있다. 또한, CDC45L mRNA를 탐지하기 위한 하나 이상의 시약은 키트 안에 포함될 수 있다.

한편, CDC45L 단백질 또는 그것의 면역학적 단편을 탐지하기 위한 적절한 시약의 예는 CDC45L 단백질 또는 그것의 면역학적 단편에 대한 항체를 포함할 수 있다. 상기 항체는 모노클로날(monoclonal) 또는 폴리클로날(polyclonal)일 수 있다. 또한, 어떤 단편 또는 변형된 항체가 CDC45L 단백질 또는 그것의 면역학적 단편에 결합하는 능력을 유지하는 한, 상기 항체의 어떤 단편 또는 변형 (예를 들어, 카이메릭 항체, scFv, Fab, F(ab')2, Fv등)은 시약으로 사용될 수 있다. 단백질 탐지를 위한 이러한 유형의 항체를 준비하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 어떤 방법은 이러한 항체 및 그것의 등가물을 준비하는 방법도 본 발명에서 적용될 수 있다. 또한, 항체는 직접적인 연결 또는 간접적인 표지 기술을 통해 신호 발생 분자로 표지될 수 있다. 표지 및 항체 표지에 대한 방법 및 그들의 표적으로 상기 항체의 결합을 탐지하는 것은 당업계에 잘 알려져 있으며, 어떤 표지 및 방법은 본 발명에 적용될 수 있다. 또한, CDC45L 단백질을 탐지하기 위한 하나 이상의 시약은 키트 안에 포함될 수 있다.

상기 키트는 상기 언급한 시약의 하나 이상을 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 CDC45L 유전자에 대한 결합하는 탐침(probe) 또는 CDC45L 펩티드에 대한 항체에 대한 고체 매트릭스 및 시약, 배지 및 세포 배양을 위한 용기, 양성 및 음성 대조군 시약, 및 CDC45L 펩티드에 대한 항체를 탐지하는 2차 항체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 암이 없는 개체 또는 암으로부터 고통받는 개체로부터 수득된 조직 시료는 유용한 대조군 시약으로 쓰일 수 있다. 본 발명의 키트는 또한 구체적으로 상업적 및 사용자의 관점으로부터, 버퍼, 희석액, 필터, 니들, 주사기 및 사용설명서(예를 들어, 문서, 테잎, CD-ROM)를 포함하는 다른 물질을 포함할 수 있다. 이러한 시약 및 이러한 것들은 라벨이 있는 상태로 컨테이너(container)에 함유될 수 있다. 적절한 컨테이너는 병, 바이알 및 테스트 튜브를 포함한다. 상기 컨테이너는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로부터 제조될 수 있다.

본 발명의 실시태양로서, CDC45L mRNA에 대한 탐침이 시약일 때, 상기 시약은 탐지 부위가 적어도 한 개로 구성되는 다공성 스트립과 같은 고체 메트릭스에 고정화될 수 있다. 다공성 스트립의 측정 또는 탐지는 각각의 구성하는 핵산(탐침)부위의 많은 수를 포함할 수 있다. 시험 스트립은 또한 음성 및/또는 양성 대조군에 대한 부위를 포함할 수 있다. 또는, 대조군 부위는 시험 스트립으로부터 분리된 스트립에 위치할 수 있다. 선택적으로 다른 탐지 부위는 고정화된 핵산의 다른 양, 즉, 첫번째 탐지 부위의 높은 양 및 다음 부위 안의 적은 양을 포함할 수 있다. 시험 시료를 더했을 때, 탐지가능한 신호를 제시하는 부위의 수는 시료 안에 존재하는 CDC45L mRNA의 양의 정량적 지표를 제공한다. 상기 탐지 부위는 어떠한 적절하게 탐지가능한 모양으로 구성될 수 있으며, 일반적으로 시험 스트립의 바 또는 닷 스패닝(dot spanning) 상기 너비 안에 있다.

또한, 본 발명의 키트는 양성 대조군 시료 또는 CDC45L 표준 시료을 포함한다. 상기 본 발명의 양성 대조군 시료는 CDC45L 양성 시료를 수집하고, 그 후에 그들의 CDC45L 수준을 분석함으로써 준비될 수 있다. 그 대신에, 정제된 CDC45L 단백질 또는 폴리뉴클레오티드는 양성 시료를 형성하기 위해 CDC45L을 발현하지 않는 세포 또는 상기 CDC45L 표준 시료에 더해질 수 있다. 본 발명에서, 정제된 CDC45L는 재조합 단백질일 수 있다. 상기 양성 대조군 시료의 CDC45L 수준은, 예를 들면, 상기 컷 오프 수준(cut off value) 그 이상이다. 하나의 실시태양에서, 또한, 본 발명은 본 발명의 상기 항체 또는 그것의 면역학적 단편을 특이적으로 인식할 수 있는 단백질 또는 그것의 부분적 단백질을 포함하는 진단 키트를 제공한다.

본 발명에서 고려하는 본 발명의 단백질의 부분적 펩티드 및 면역 단편의 예는 본 발명의 단백질의 아미노산 서열에서 적어도 8 개, 바람직하게 15개, 및 더 바람직하게 20 개의 인접한 아미노산으로 구성된 폴리펩티드를 포함한다. 암은 본 발명의 단백질 또는 펩티드(폴리펩티드)를 사용하여 시료(예를 들면, 혈액, 조직)안에서 항체를 탐지함으로써 진단될 수 있다. 본 발명의 펩티드 또는 단백질 제조 방법은 상기와 같이 기재되어있다.

본 발명의 암 진단 방법은 항-CDC45L 항체의 양 및 상기에 기재된 바와 같은 해당하는 대조군 시료에서 그것 사이의 차이를 확인함으로써 수행될 수 있다. 만약 개체의 세포 또는 조직이 상기 유전자의 발현 산물(CDC45L)에 대한 항체를 포함하고 있고, 항- CDC45L 항체의 양이 정상 대조군의 그것에 비해 컷 오프 수준보다 많다고 측정되면, 상기 개체는 암으로부터 고통받는 것이 의심된다.

하나의 실시태양에서, 본 발명의 진단 키트는 본 발명의 펩티드 또는 HLA 분자에 결합하는 그것을 포함할 수 있다. 항원의 펩티드 및 HLA 분자를 이용한 특정한 CTL 항원을 탐지하는 적합한 방법은 이미 수립되었다(예를 들면, Altman JD et al., Science. 1996, 274(5284): 94-6). 따라서, 본 발명의 펩티드 및 HLA 분자의 복합체는 종양 항원에 특정한 CTL을 탐지하는, 그렇게 함으로써 암의 재발 및/또는 전이, 초기의 발견을 가능하게 하는 탐지 방법에 적용될 수 있다. 따라서, 유효성분으로 본 발명의 펩티드를 포함하는 약을 적용할 수 있는 개체의 선별 및 약의 치료 효과의 평가에 이를 적용할 수 있다.

특히, 알려진 방법에 따르면(참조, 예를 들면, Altman JD et al., Science. 1996, 274(5284), 테트라머(tetramer)와 같은 방사선표지된 HLA 분자 및 본 발명의 펩티드의 상기 올리고머 복합체가 제조될 수 있다. 상기 복합체는 암으로부터 고통받는 것이 의심되는 개체 유래 말초 혈액 림프구 안의 항원-펩티드 특이적 CTL을 정량하는 것에 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에서 기재한 바와 같이 펩티드 에피토프를 이용한 개체의 면역 반응을 평가하는 방법 및 진단 시약을 제공한다. 본 발명의 하나의 실시태양에 있어, 본 발명에 기재된 바와 같은 HLA 제한된 펩티드는 개체의 면역 반응을 평가 또는 예상하는 시약으로 이용될 수 있다. 평가된 상기 면역반응은 시험관 내 또는 생체 내에서 면역능력이 있는 세포와 면역원을 접촉함으로써 유도될 수 있다. 특정한 실시태양에서, 시약으로서 적용된 상기 물질(substances) 또는 조성물은 상기 펩티드 에피토프를 인식하고 결합하는 항원 특이적 CTL의 생산으로 초래할 수 있는 어떤 물질(substances) 또는 조성물일 수 있다. 상기 펩티드 시약은 면역원으로 사용되지 않아야 한다. 상기 분석에 사용된 분석 시스템은 테트라머, 세포내의 림포카인 및 인터페론 방출 분석에 대한 염색 또는 ELISPOT 분석같은 비교적 최근의 기술적 발달을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 펩티드 시약에 접촉되는 면역생성 능력이 있는 세포는 수지상 세포를 포함한 항원 제시 세포일 수 있다.

예를 들면, 본 발명의 펩티드는 종양 세포 항원 또는 면역원에 노출한 후에 항원 특이적 CTL의 존재에 대한 말초 혈액 단핵구 세포를 측정하는 테트라머 염색 분석에 이용될 수 있다. 상기 HLA 테트라머 복합체는 항원 특이적 CTL을 가시화하고(참조, 예를 들면, Ogg et al., Science 279: 2103-2106, 1998; and Altman et al, Science 174 : 94-96, 1996), 말초 혈액 단핵구 세포의 시료 안에 항원 특이적 CTL의 빈도를 확인하는 것에 직접적으로 이용될 수 있다. 본 발명의 펩티드를 이용한 테트라머 시약은 하기에 기재된 바와 같이 만들어 질 수 있다.

HLA 분자에 결합하는 펩티드는 3분자의 복합체를 만드는 상기 해당하는 HLA 중쇄 및 베타 2-마이크로글로불린의 존재 하에 재접힘된다. 복합체 내에서, 중쇄의 카르복실 말단은 기존에 단백질로 조작된 부위에서 비오틴 잔기가 결합된다. 그 후에, 스트렙트아비딘(streptavidin)을 3분자의 복합체 및 스트렙트아비딘으로 구성된 4분자체를 형성하는 복합체에 더하였다. 형광표지된 스트렙트아비딘의 도움으로, 상기 4분자체는 항원 특이적 세포를 염색하는 것에 사용될 수 있다. 그 후에 상기 세포는, 예를 들면 유동 세포 분석법으로 확인될 수 있다. 상기 분석은 진단 또는 예측 목적을 위해 사용될 수 있다. 또한, 상기 절차에 의해 확인된 세포는 치료적 목적을 위해 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 펩티드들 포함하는 면역 회상 반응 (참조, 예를 들면, Bertoni et al, J. Clin. invest. 100: 503-513, 1997 and Penna et al., J Exp. Med. 174: 1565-1570, 1991) 을 평가하는 시약을 제공한다. 예를 들면, 치료되는 암이 있는 개인 유래 환자 말초 혈액 단핵구 세포 시료는 항원-특이적 CTL의 존재를 위해 특이적 펩티드를 이용하여 분석될 수 있다. 단핵구 세포를 포함하는 혈액 시료는 말초 혈액 단핵구 세포를 배양하고, 본 발명의 펩티드로 자극함으로써 평가될 수 있다. 적절한 배양 기간 후에, 상기 증식된 세포 개체군이, 예를 들면 CTL 활성에 대해 분석될 수 있다.

또한, 상기 펩티드가 백신의 효능을 평가하기 위해 시약으로 이용될 수 있다. 면역원으로 예방된(vaccinated) 환자로부터 수득된 말초 혈액 단핵구 세포는, 예를 들면, 상기 기재된 방법 중 어느 하나를 이용하여 분석될 수 있다. 상기 환자는 HLA 유형이며, 환자의 상기 대립 형질 유전자 특이적 분자를 인식하는 펩티드 에피토프 시약은 분석을 위해 선별된다.

상기 백신의 면역원성은 말초혈액단핵구세포 시료안의 에피토프-특이적 CTL의 존재에 의해 제시될 수 있다. 또한, 상기 본 발명의 펩티드는 당업계에 잘 알려진 기술(참조, 예를 들면, CURRENTPROTOCOLSiNiMMUNOLOGY, WILey/Greene, NY; and Antibodies A Laboratory Manual, Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)을 이용하여 암 진단, 탐지 또는 관측에 대해 시약으로 사용될 수 있는 항체 제작에 쓰일 수 있다. 상기 항체는 HLA 분자에 제한되는 펩티드를 인식하는 것을, 즉, 펩티드-MHC 복합체에 결합할 수 있는 항체를 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 펩티드 및 조성물은 이들 중 일부가 본 발명에 기재된 다수의 추가적인 사용을 가진다. 예를 들면, 본 발명은 CDC45L 면역원성 폴리펩티드의 발현으로 특징화되는 질환을 진단 또는 탐지하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 생물 시료에서 HLA 펩티드에 결합하는 CDC45L 또는 HLA 펩티드에 결합하는 CDC45L 및 HLA 클래스 Ⅰ 분자의 복합체의 발현을 확인하는 것을 포함한다. 펩티드 또는 펩티드 및 HLA 클래스 Ⅰ 분자의 복합체의 발현은 상기 펩티드 또는 복합체에 대해 결합 파트너(partner)와 함께 분석함으로써 진단 또는 탐지될 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 상기 펩티드 또는 복합체에 대한 결합 파트너는 상기 펩티드에 특이적으로 인식하고 결합하는 항체일 수 있다. 또한, 종양 생검과 같은 생물 시료에서 CDC45L의 발현은 CDC45L 프라이머를 이용한 표준 PCR 증폭 절차로 시험될 수 있다. 종양 발현의 예는 본 발명에 제시되며, 또한, 모범적인 CDC45L 증폭 조건 및 프라이머의 공개는 WO2003/27322에서 확인될 수 있다.

바람직한 진단 방법은 생물시료에서 HLA에 결합하는 CDC45L 펩티드의 존재를 탐지하기 위해 HLA에 결합하는 CDC45L 펩티드에 대하여 특정한 물질과 개체로부터 분리된 생물 시료를 접촉하는 것을 포함한다. 본 발명에서 사용된 것과 같이, “접촉”은 물질 및 생물시료에 존재하는 HLA에 결합하는 CDC45L 펩티드 사이의 특이한 상호작용을 허용하기 위해, 예를 들면, 농도, 온도, 시간, 이온 강도의 적절한 조건하에 상기 물질에 충분한 근접에서 상기 생물 시료를 두는 것을 의미한다. 일반적으로, 상기 물질 및 생물 시료를 접촉을 위한 조건은 생물시료 안의 분자 및 이의 동족체(cognate)(예를 들면, 단백질 및 이의 수용체 동족체, 항체 및 이의 단백질 항원 동족체, 핵산 및 이의 상보적 서열 동족체)사이의 특정한 상호작용을 가능하게 하는 당업계의 일반적인 기술로 알려진 조건이다.

분자 및 이의 동족체 사이의 특이적 상호작용을 가능하게 하는 모범적인 조건은 U. S. Patent No. 5,108,921, issued to Low et al에 기재된다.

생체 내 및 시험관내 각각 또는 둘 다에서 본 발명의 진단 방법이 수행될 수 있다. 따라서, 본 발명에서 생물 시료는 생체내에서 또는 시험관내에 위치될 수 있다. 예를 들면, 상기 생물 시료는 생체 내 조직에 있을 수 있고, 상기 CDC45L 면역원성 폴리펩티드에 대해 특이적인 물질은 조직내에서 이러한 분자의 존재를 탐지하는 것에 사용될 수 있다. 그 대신에, 상기 생물 시료는 시험관내에서 수집될 수 있거나 분리될 수 있다(예를 들면, 혈액 시료, 종양 생검, 조직 추출물). 바람직한 실시태양에서, 상기 생물 시료는 세포를 포함하는 시료일 수 있고, 더 바람직하게 진단되고 치료되는 개체로부터 수집되는 종양 세포를 포함하는 시료일 수 있다.

그 대신에, 상기 진단은 형광 표지된 HLA 다량체 복합체를 염색함으로써 항원 특이적인 T 세포의 직접적인 정량화를 허용하는 방법을 이용하여 수행될 수 있다(예를 들면, Altman, J. D. et al., 1996, Science 274 : 94; Altman, J. D. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 : 10330). 또한, 세포내 림포카인(lymphokines) 염색 및 인터페론-감마(interferon-gamma) 방출 분석 또는 ELISPOT 분석은 제공된다. 다량체 염색, 세포내 림포카인 염색 및 ELISPOT 모두는 기존 분석 보다 적어도 10 배 더 민감한 것으로 나타난다(Murali-Krishna, K. et al., 1998, immunity 8: 177; Lalvani, A. et al., 1997, J. Exp. Med. 186: 859; Dunbar, P. R. et al., 1998, Curr. Biol. 8: 413). 또한, 펜타머(Pentamers)(예를 들면, US 2004-209295A), 덱스트라머(dextramers)(예를 들면, WO 02/072631), 및 스트렙타머(streptamers)(예를 들면, Nature medicine 6. 631-637 (2002))가 사용될 수 있다.

ⅩⅠ. 항체

또한, 본 발명은 본 발명에 결합하는 항체를 제공한다. 바람직한 항체는 특히 본 발명의 펩티드에 결합하고, 본 발명의 펩티드가 아닌 것에 결합하지 않을 것이다(또는 약하게 결합할 것이다).

그 대신에, 항체는 본 발명의 펩티드 및 이의 동족체(homologs)에도 결합한다. 본 발명의 펩티드에 대한 항체는 암 진단 및 예측 분석, 및 방법을 이미지화하는 것에 이용될 수 있다. 유사하게, 이러한 항체는 암 환자에서 발현되거나 과발현되는 CDC45L 정도에 대한 암의 치료, 진단, 및/또는 예후에서 이용될 수 있다. 또한, 세포내 발현된 항체(예를 들면, 단독 사슬 항체)는 CDC45L 발현이 연관된 암 치료에 치료적으로 이용할 수 있으며, 암의 예로써 고환종양, 췌장암, 방광암, 비소세포폐암, 소세포폐암, 유방암, 식도암, 전립선암, 만성골수성백혈병, 연조직 종양, 위암, 간담즙성암 및 결장암을 포함하지만 한정하지 않는다.

또한, 본 발명은 서열번호 2, 3, 4, 7 및 12로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드를 포함하는 CDC45L 단백질(서열번호 18) 또는 이의 단편의 탐지 및/또는 정량화를 위한 다양한 면역 분석을 제공한다. 이러한 분석은 CDC45L 단백질 또는 이의 단편을 인식하고, 결합할 수 있는 하나 또는 그 이상의 항- CDC45L 항체를 적절히 포함할 수 있다. 본 발명의 맥락에서 항- CDC45L 항체는 바람직하게, CDC45L 폴리펩티드에 결합하는 항- CDC45L 항체는 서열번호 2, 3, 4, 7 및 12로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드를 인식한다. 항체의 결합 특이성은 저해 시험으로 확인될 수 있다. 서열번호 2, 3, 4, 7 및 12의 아미노산 서열로 구성되는 어떤 단편 폴리펩티드의 존재하에 분석된 항체 및 CDC45L 폴리펩티드 전장 사이의 결합이 저해될 때, 이 항체는 특히 단편에 결합하는 것을 나타낸다. 본 발명의 맥락에서, 상기 면역 분석은 당업계에 잘 알려진 다양한 면역 분석 형태에서 수행되며, 방사선면역분석(radioimmunoassays)의 다양한 유형, 면역-크로마토그래프(immuno-chromatograph) 기술, 효소-연결 면역흡착 분석(enzyme-linked immunosorbent assays, ELISA), 효소-연결 면역형광 분석(enzyme-linked immunofluorescent assays, ELiFA) 및 이와 유사한 것을 포함하지만 한정하지 않는다.

또한, 본 발명의 면역학적으로 관련되지만, 항체가 아닌 분석은 T 세포 면역원성 분석(저해하거나 또는 자극하는) 및 MHC 결합 분석을 포함할 수 있다. 게다가, 본 발명은 CDC45L를 발현하는 암을 탐지할 수 있는 면역 영상화 방법을 고려하며, 예로서 본 발명의 표지된 항체를 이용하여 방사성 동위원소 영상화 방법을 포함하지만, 한정되지 않는다. 상기 분석은 CDC45L 를 발현하는 암의 탐지, 관측 및 예후에서 임상적 이용으로 여겨지며 암으로써 고환종양, 췌장암, 방광암, 비소세포폐암, 소세포폐암, 유방암, 식도암, 전립선암, 만성골수성백혈병, 연조직 종양, 위암, 간담즙성암 및 결장암을 포함하지만 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 본 발명의 펩티드에 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 어떤 형태로, 예를 들면 모노클로날(monoclonal) 또는 폴리클로날(polyclonal) 항체로 사용될 수 있고, 또한 본 발명의 펩티드, 모든 종류의 폴리클로날 및 모노클로날 항체, 인간 항체 및 유전학적 재조합에 의한 인간화 항체가 있는 토끼와 같은 동물을 면역화하여 수득한 항혈청을 포함할 수 있다. 항체를 수득하기 위해 항원으로 이용된 본 발명의 펩티드는 어떤 동물 종으로부터 유래될 수 있지만 바람직하게 사람, 쥐 또는 랫(rat)에서 유래될 수 있고, 더욱 바람직하게 사람으로부터 유래될 수있다. 인간 유래 펩티드는 본 발명에서 공개된 핵산 또는 아미노산으로부터 수득될 수 있다.

본 발명에 따르면, 면역원성 항원으로 이용된 상기 펩티드는 단백질 또는 단백질의 부분적 펩티드로 완성될 수 있다. 부분적 펩티드는 예를 들면, 본 발명의 펩티드의 상기 아미노(amino, N)-말단 또는 카르복실(carboxy, C)-말단 단편을 포함할 수 있다. 본 발명에서, 항체는 CDC45L 펩티드의 전장 또는 단편 각각과 반응하는 단백질로 정의된다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 항체는 2, 3, 4, 7 및 12로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성된 CDC45L 의 단편 펩티드를 인식할 수 있다. 올리고펩티드(oligopeptide)를 합성하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 합성 후에, 펩티드는 면역원으로 사용되기 전에 선택적으로 정제될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 상기 올리고펩티드(예를 들면, 9머(9mer) 또는 10머(10mer))는 면역원성을 향상시키기 위한 운반체에 접합되거나 연결될 수 있다. Keyhole-limpet hemocyanin (KLH)는 운반체로서 잘 알려져있다. 또한, KLH를 접합하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.

그 대신에, 본 발명의 펩티드 또는 이의 단편을 암호화하는 유전자는 알려진 발현 벡터에 삽입될 수 있으며, 그 후에 본 발명에 기재된 숙주세포를 형질전환 하는 것에 사용된다. 상기 바람직한 펩티드 또는 이의 단편은 어떤 표준 방법에 의해 숙주세포의 외부 또는 내부에서 회수될 수 있으며, 그 후에 항원으로 이용될 수 있다. 어떤 포유 동물은 항원으로 면역화될 수 있으나, 바람직하게 세포 융합에 대한 사용된 상기 모세포의 호환성이 고려된다. 일반적으로, 쥐목(Rodentia), 토끼목(Lagomorpha) 또는 영장류(Primates)의 동물이 이용될 수 있다. 쥐목 계열의 동물은 , 예를 들면, 마우스(mouse), 랫(rat), 및 햄스터(hamster)를 포함한다. 토끼목 계열의 동물은, 예를 들면 토끼를 포함한다. 영장류 계열의 동물은, 예를 들면 필리핀원숭이(Macaca fascicularis), 붉은털 원숭이(rhesus monkey), 망토개코원숭이(sacred baboon) 및 침팬지(chimpanzees) 와 같은 협비원류(Catarrhini)(구세계 원숭이(old world monkey)) 원숭이를 포함한다.

항원으로 동물을 면역화하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 항원의 복강내 투여 또는 피하 투여는 포유동물의 면역화에 대한 표준 방법이다. 더욱 특별히, 항원은 희석될 수 있으며, 적절한 양의 인산염 완충 식염수(phosphate buffered saline, PBS), 생리 식염수 등에 부유될 수 있다. 필요하다면, 상기 항원 부유물은 적절한 양의 Freund의 완전 보조약(Freund's complete adjuvant)과 같은 표준 보조약과 혼합될 수 있으며, 유액으로 만든 후에 포유 동물에 투여될 수 있다. 바람직하게, 각각의 항원의 투여 후에 매 4 내지 21 일 마다 Freund 의 불완전 보조약(Freund's incomplete adjuvant)의 양을 적절하게 혼합한다. 또한, 적절한 운반체는 면역화에 이용될 수 있다. 상기와 같이 면역화 후에, 혈청은 원하는 항체의 양에서 증가에 대한 표준 방법에 의해 시험될 수 있다.

본 발명의 펩티드에 대한 폴리클로날 항체는 혈청에 원하는 항체의 증가에 대해 시험한 면역화된 포유동물로부터 혈액을 수집하고, 어떤 기존의 방법으로 혈액으로부터 혈청을 분리함으로써 준비될 수있다. 폴리클로날 항체는 폴리클로날 항체를 포함하는 혈청 및 혈청으로부터 분리될 수 있는 폴리클로날 항체를 포함하는 분획물을 포함할 수 있다. 면역글로불린(immunoglobulin) G 또는 M은 본 발명의 펩티드만 인식하는 분획물로부터, 예를 들면, 본 발명의 펩티드가 결합된 친화성 컬럼 및 추가적으로 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼을 이용하여 이러한 분획물을 정제하여 제조될 수 있다.

모노클로날 항체를 제조하기 위해, 항원으로 면역화된 포유동물로부터 면역 세포를 수집하였고, 상기 기재된 혈청에서 원하는 항체의 증가된 수준에 대해 확인하였다. 바람직하게, 세포 융합에 대해 사용된 상기 면역 세포는 비장으로부터 수득될 수 있다. 상기 면역세포와 함께 융합된 다른 바람직한 모세포는, 예를 들어, 포유동물의 골수종(myeloma) 세포 및 더 바람직하게 약에 의해 융합된 세포의 선별에 대해 획득된 속성을 가지는 골수종 세포를 포함한다.

상기 면역세포 및 골수종 세포는 알려진 방법, 예를 들면 MILstein et al(Galfre and MILstein, Methods Enzymol 73: 3-46 (1981))의 방법에 따라 융합될 수 있다.

상기 세포 융합에 의해 수득된 결과적인 하이브리도마(hybridomas)는 HAT 배지 (히포크산틴 (hypoxanthine), 아미노프테린(aminopterin) 및 티미딘(thymidine)을 포함하는 배지)와 같은 표준 선별 배지에서 그들을 배양함으로써 선택될 수 있다. 상기 세포 배양은 일반적으로 HAT 배지에서 며칠 또는 몇 주 동안 원하는 하이브리도마의 제외와 함께(융합되지 않은 세포) 모든 다른 세포들을 허용하는 시간에서, 지속된다. 그 후에 상기 표준 제한하는 희석은 원하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 선별하고 복제하기 위해 수행될 수 있다.

상기 방법에 더하여, 하이브리도마, EB 바이러스에 감염된 것과 같은 인간 림프구를 제조하기 위한 항원에 면역화된 인간이 아닌 동물은 시험관 내에서 펩티드, 펩티드를 발현하는 세포 또는 그들의 용해물로 면역화될 수 있다. 그 후에, 본 발명의 펩티드에 결합할 수 있는 원하는 인간 항체를 생산하는 하이브리도마를 생산하기 위한, U266와 같은 무기한으로 분열할 수 있는 인간 유래 골수종 세포와 융합된 상기 면역화된 림프구가 수득될 수 있다(미심사 공개 일본 특허 출원 번호. Sho 63-17688).

상기 수득된 하이브리도마는 그 후에 쥐의 뱃속으로 이식되며 복수는 추출되었다. 상기 수득된 모노클로날 항체는, 예를 들면 본 발명의 펩티드가 연결된 황산 암모늄 침강, 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼(column), DEAE 이온 교환 크로마토그래피 또는 친화성 컬럼으로 정제될 수 있다. 본 발명의 항체는 본 발명의 펩티드의 정제 및 탐지뿐만아니라 본 발명의 펩티드의 경쟁자 및 적대자(antagonists)에 대한 후보로서 사용될 수 있다. 그 대신에 면역화된 림프구와 같은 항체를 생산하는 면역 세포는 암유전자로 불멸화될 수 있고, 모노클로날 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있다.

따라서, 또한, 수득된 모노클로날 항체는 유전 공학 기술을 이용하여 재조합형으로 제조될 수 있다(참조, 예를 들면, Borrebaeck and Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies, published in the United Kingdom by MacMILlan Publishers LTD (1990)). 예를 들면, 항체를 암호화하는 DNA는 항체를 생산하는 하이브리도마 또는 면역화된 림프구와 같은 면역세포로부터 클로닝될 수 있고, 적절한 벡터를 삽입할 수 있으며, 재조합 항체를 제조하는 숙주세포로 도입될 수 있다. 또한, 본 발명은 상기에 기재한 바와 같이 제조된 재조합 항체를 제공한다.

또한, 본 발명의 항체는 그것이 본 발명의 펩티드의 하나 또는 그 이상에 결합하는 한, 항체의 단편 또는 변형된 항체일 수 있다. 예를 들면, 상기 항체 단편은 Fab, F(ab')2, Fv 또는 적절한 링커(linker)에 의해 연결된 중쇄 및 경쇄 유래 Fv 단편인 단독 사슬 Fv (sigle chain, scFv)일 수 있다(Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-83 (1988)).

더욱 특히, 항체 단편은 파파인 또는 펩신과 같은 효소를 항체에 처리함으로써 만들어질 수 있다. 그 대신에, 상기 항체 단편ㅇ르 암호화하는 유전자는 구축될 수 있으며, 발현 벡터로 삽입될 수 있고, 적절한 숙주세포에서 발현될 수 있다(참조, 예를 들면, Co et al., J immunol 152: 2968-76 (1994); Better and Horwitz, Methods Enzymol 178: 476-96 (1989); Pluckthun and Skerra, Methods Enzymol 178: 497-515 (1989); Lamoyi, Methods Enzymol 121: 652-63 (1986); Rousseaux et al., Methods Enzymol 121: 663-9 (1986); Bird and Walker, Trends Biotechnol 9: 132-7 (1991)).

항체는 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol, PEG)과 같은 다양한 분자와 함께 접합되어 변형될 수 있다. 본 발명은 상기 변형된 항체를 제공한다. 상기 변형된 항체는 화학적으로 항체를 변형함으로써 수득될 수 있다. 이러한 변형 방법은 당업계에서 일반적이다.

그 대신에, 본 발명의 항체는 인간이 아닌 항체 유래 가변 부위 및 인간 항체 유래 보존 부위 사이의 카이메릭(chimeric) 항체 또는 인간이 아닌 항체 유래 상기 상보적 결정 부위(complementarity determining region, CDR), 인간 항체 유래 골격 부위(frame work region, FR) 및 보존 부위를 포함하는 인간화된 항체로 수득될 수 있다. 상기 항체는 알려진 기술에 따라 제조될 수 있다. 인간화는 쥐 CDR 또는 인간 항체의 대응하는 서열에 대한 CDR 서열을 치환함으로써 수행될 수 있다(참조, 예를 들면, Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)). 따라서, 상기 인간화된 항체는 주로 온전한 가변 도메인 내에 인간이 아닌 종 유래 대응하는 서열에 의해 치환된 카이메릭 항체이다.

또한, 인간 골격(framework) 및 보존 부위에 더하여 인간 가변 부위를 포함하는 완전한 인간 항체가 이용될 수 있다. 예를 들면 시험관 내 방법은 박테리오파지(bacteriophage)에 표지된 인간 항체 단편의 재조합 라이브러리(libraries)의 사용을 포함한다(예를 들면, Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991). 유사하게, 인간 항체는 형질전환 동물, 예를 들면 부분적으로 또는 완전하게 불활성화된 내생적 면역글로불린 유전자를 가지는 마이스에 인간 면역글로불린 좌위(loci)의 도입으로 제작될 수 있다. 이 접근법은 예를 들면 U.S. Patent Nos. 6,150,584, 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016. 에 기재된다.

상기와 같이 수득된 항체는 균질성있게 정제될 수 있다. 예를 들면, 상기 항체의 분리 및 정제는 일반적인 단백질에 쓰이는 구분 및 정제 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들면, 상기 항체는 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography), 여과장치(fILter), 한외여과(ultrafILtration), 염석(salting-out), 투석(dialysis), SDS 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동(SDS polyacrylamide gel electrophoresis) 및 등전점전기영동(isoelectric focusing)(Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)와 같은 컬럼 크로마토그래피(column chromatographies)의 사용을 적절히 선택되고 조합함으로써 구분 및 분리될 수 있으나 이에 한정하지 않는다. 단백질 A 컬럼 및 단백질 G 컬럼은 친화성 컬럼에서 사용될 수 있다. 모범적인 사용되는 단백질 A 컬럼은, 예를 들면 Hyper D, POROS 및 Sepharose F.F. (Pharmacia)를 포함한다.

친화성 제외와 함께 모범적인 크로마토그래피는, 예를 들면 이온-교환 크로마토그래피(ion-exchange chromatography), 소수성 크로마토그래피(hydrophobic chromatography), 젤 여과(gel fILtration), 역상 크로마토그래피(reverse phase chromatography), 흡착 크로마토그래피(adsorption chromatography) 및 이와 유사한 것을 포함한다(Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)). 상기 크로마토그래피 절차는 HPLC 및 FPLC과 같은 액상 크로마토그래피에 의해 수행될 수 있다.

예를 들면, 흡착의 측정, 효소-연결 면역흡착 분석(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 효소 면역분석(enzyme immunoassay, EIA), 방사선면역분석(radioimmunoassay, RIA) 및/또는 면역형광 검사를 본 발명의 항체의 항원 결합 활성을 측정하는데 이용될 수 있다.

ELISA에서, 본 발명의 항체는 플레이트(plate)에 고정되고, 플레이트에 본 발명의 펩티드가 적용되며 그 후에 항체를 생산하는 세포의 배양 상청액 또는 정제된 항체와 같은 원하는 항체를 포함하는 시료가 적용된다.

그 후 상기 1차 항체를 인식하고 알칼리 포스파타제(alkaline phosphatase )와 같은 효소로 표지된 2차 항체가 적용되고, 상기 플레이트는 배양된다. 다음으로 세척한 후 p- 나이트로페닐 인산염(p-nitrophenyl phosphate)과 같은 효소기질이 플레이트에 첨가되고 상기 빛 흡수율이 시료의 항원 결합 활성을 평가하기 위해 측정된다. C-말단 또는 N-말단 단편과 같은 펩티드의 단편이 항체의 결합 활성을 평가하기 위한 항원으로 쓰일 수 있다. BiAcore (Pharmacia)는 본 발명에 따라 항체의 활성을 평가하기 위해 사용될 수 있다.

상기 방법은 본 발명의 펩티드를 포함하는 것이 당연하게 여겨지는 시료에 본 발명의 항체를 노출하고, 항체 및 펩티드에 의해 형성된 상기 면역 복합체를 탐지하고 측정함으로써 본 발명의 펩티드의 탐지 또는 측정을 감안한다. 본 발명에 따른 펩티드의 탐지 또는 측정방법이 특히 펩티드를 탐지 또는 측정할 수 있기 때문에, 상기 방법은 상기 펩티드가 사용된 다양한 실험에서 사용될 수 있다.

ⅩⅡ. 벡터( Vectors ) 및 숙주세포( host cells )

또한, 본 발명은 본 발명의 펩티드를 암호화하는 핵산이 도입된 벡터 및 숙주세포를 제공한다. 본 발명의 벡터는 숙주세포 안에 본 발명의 핵산, 특히 DNA, 을 보관, 본 발명의 펩티드를 발현 또는 유전자 치료에 대한 본 발명의 뉴클레오티드(nucleotide)를 주입하는 것에 이용될 수 있다.

E. coli가 숙주세포이고, 상기 벡터가 E. coli (예를 들면, JM109, DH5 alpha, HB101 또는 XL1Blue)에서 다량 증폭되고 생산될 때, 상기벡터는 E. coli에서 증폭되기 위한 "ori" 및 형질전환된 E. coli에서 선별을 위한 마커 유전자를 가져야 한다(예를 들면, 암피실린(ampicILlin), 테트라사이클린(tetracycline), 카나마이신(kanamycin), 클로람페니콜(chloramphenicol) 또는 이와 유사한 것과 같은 약에 의해 선별되는 약-저항성 유전자). 예를 들면 M13-series vectors, pUC-series vectors, pBR322, pBluescript, pCR-Script 등이 사용될 수 있다. 게다가, 또한, pGEM-T, pDiRECT 및 pT7은 서브클로닝(subcloning) 및 cDNA 및 상기에 기재된 벡터 추출에 사용될 수 있다. 벡터가 본 발명의 단백질을 생산하는 것에 이용될 때, 발현 벡터를 사용할 수 있다. 예를 들면, E. coli에서 발현되는 발현벡터는 E. coli에서 증폭되기 위해 상기 특성을 가져야 한다. JM109, DH5 alpha, HB101 또는 XL1 Blue과 같은 E. coli가 숙주세포로서 사용될 때, 상기 벡터는 E. coli에서 원하는 유전자를 효과적으로 발현할 수 있는 프로모터, 예를 들면 lacZ 프로모터 (Ward et al., Nature 341: 544-6 (1989); FASEB J 6: 2422-7 (1992)), araB 프로모터 (Better et al., Science 240: 1041-3 (1988)), T7 프로모터 또는 이와 유사한 것을 가져야 한다. 그 점에 있어서, 예를 들면 pGEX-5X-1 (Pharmacia), "QiAexpress system" (Qiagen), pEGFP 및 pET(이러한 경우에, 바람직하게는 상기 숙주세포는 T7 RNA 폴리머라제(polymerase)를 발현하는 BL21이다)는 상기 벡터 대신에 사용될 수 있다. 또한, 상기 벡터는 펩티드 분비에 대한 신호 서열을 포함할 수 있다. E. coli의 주변세포질로 분비되는 상기 펩티드로 보내는 모범적인 신호 서열은 pelB 신호 서열이다(Lei et al., J Bacteriol 169: 4379 (1987)). 표적 숙주 세포안으로 벡터를 도입하는 것은, 예를 들면 염화칼슘(calcium chloride) 방법 및 전기영동 방법을 포함한다.

E. coli에 더하여, 예를 들면, 포유동물 유래 발현 벡터(예를 들면, pcDNA3 (invitrogen) and pEGF-BOS (Nucleic Acids Res 18(17): 5322 (1990)), pEF, pCDM8), 곤충 유래 발현벡터(예를 들면, "Bac-to-BAC baculovirus expression system" (GiBCO BRL), pBacPAK8), 식물 유래 발현 벡터(예를 들면, pMH1, pMH2), 동물 바이러스 유래 발현 벡터(예를 들면, pHSV, pMV, pAdexLcw), 레트로바이러스(retroviruse) 유래 발현 벡터(예를 들면, pZipneo), 효모 유래 발현 벡터(예를 들면, "Pichia Expression Kit" (invitrogen), pNV11, SP-Q01), 및 바실러스 서브틸리스(BacILlus subtILis) 유래 발현벡터(예를 들면, pPL608, pKTH50)는 본 발명의 폴리펩티드 생산에 이용될 수 있다.

CHO, COS 또는 NIH3T3 세포와 같은 동물 세포에서 벡터를 발현하기 위해, 이러한 세포안에서 발현에 필요한 프로모터를, 예를 들면, SV40 프로모터 (Mulligan et al., Nature 277: 108 (1979)), MMLV-LTR 프로모터, EF1 alpha 프로모터 (Mizushima et al., Nucleic Acids Res 18: 5322 (1990)), CMV 프로모터 및 이와 유사한 것, 및 바람직하게 형직전환주 선별을 위한 마커 유전자를 가져야한다(예를 들면, 약에 의해 선별되는 약 저항성 유전자(예를 들면, 네오마이신(neomycin), G418)). 이러한 특성이 있는 알려진 벡터의 예는, 예를 들면, pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV 및 pOP13를 포함한다.

본 발명의 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료를 본 발명의 실행 또는 시험에 사용할 수 있지만, 적절한 방법 및 재료가 기재된다. 본 발명에서 언급한 모든 공개, 특허 출원, 특허 및 다른 참조는 그들의 전체의 참조로서 본 발명에 포함된다. 분쟁이 있을 경우, 정의를 포함하여 본 명세서가 조정할 것이다. 더하여, 상기 재료, 방법 및 실시예는 오직 실례가 되는 것이며, 한정하려는 것이 아니다.

하기 실시예는 본 발명을 설명하고 동일한 것을 사용하고 이용하는 당업자를 돕기 위해 제시되는 것이다. 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 않는 한 어떤 방법에서 의도되지 않는다.

[ 실시예 ]

재료 및 방법

cDNA 마이크로어레이(microarray) 분석.

유전자 발현 프로파일을 기존에 기재된 바와 같이(Nakamura T et al., Oncogene 2004;23:2385-400, Taniwaki M et al., int J Oncol 2006;29:567-75) 마이크로어레이 분석으로 만들었다. 상기 마이크로어레이 분석의 원래 데이터는 Y. Nakamura 교수(Univ. Tokyo, inst. Med. Sci.)에게 요청이 가능하다. 폐암 및 암이 아닌 인접한 정상 폐 조직 유래 상기 조직 시료를 수술적 시료로부터 수득하였고, 모든 환자들은 본 연구에 참여하는 그들의 고지에 입각한 서면 동의를 제공하였다.

쥐(Mice).

6 주령 암컷 비만이 없는 당뇨병(nonobese diabetic, NOD)/ 중증 복합형 면역 부전증(severe combined immunodeficiency, SCiD) 쥐를 Charles River Laboratories Japan 로부터 구입하였다.

상기 쥐를 쿠마모토 대학의 동물 재료 및 발달 센터(Center for Animal Resources and Development of Kumamoto University)에서 유지하였고, 쿠마모토 대학의 동물 사육 가이드라인에 따라 다루었다.

세포주 및 HLA 발현.

상기 CDC45L 및 HLA-A＊2402 양성 인간 폐암 세포주 EBC-1 및 Lu99는 Health Science Research Resources Bank (Tsukuba, Japan)에 의해 친절히 제공되었다.

고유한 HLA class Ⅰ 분자의 소량을 발현하는 인간 B 림프구아세포주 C1R의 HLA-A＊2402 형질전환주(transfectant)인 C1R-A2402 세포는(Karaki S, Kariyone A, Kato N, Kano K, iwakura Y, Takiguchi M. HLA-B51 transgenic mice as recipients for production of polymorphic HLA-A, B-specific antibodies. immunogenetics 1993;37:139-42)26 Masafumi Takiguchi 박사(Kumamoto University, Kumamoto, Japan) 로부터 받았다. 상기 CDC45L 양성 인간 췌장 암세포주 PANC1(HLA-A＊0201+, HLA-A＊2402-) 및 상기 TAP가 결핍되고 HLA-A＊0201 양성인 세포주 T2는 Riken Cell Bank 로부터 구입하였다. 분석을 위해 HLA-A24 및 HLA-A2 양성 혈액 기증자를 선별하기 위해 HLA-A24 및 HLA-A2의 발현을 각각 항-HLA-A2 모노클로날 항체(mAb), BB7.2 (One Lambda, inc., Canoga Park, CA) 및 HLA-A24 mAb (One Lambda, inc.)로 세포 유동분석법으로 조사하였다. 이러한 세포들을 시험관 내에서 10% FCS 가 보충된 RPMi 1640 배지에서 5% CO₂ 대기 37 ℃에서 유지하였다.

환자, 혈액 시료 및 종양 조직.

기증자로부터 말초혈액단핵구 세포를 수집하고 이용하는 상기 연구 절차를 쿠마모토대학의 기관감사위원회에 의해 인가받았다. 상기 혈액 시료 또는 암 조직 및 인접한 암이 아닌 조직을 쿠마모토 대학 병원의 환자로부터 통상적인 진단 절차 동안 고지에 입각한 서면 동의를 얻은 후에 수득하였다. 또한, 혈액 시료는 그들의 고지에 입각한 서면 동의를 받은 후에 건강한 기증자로부터 수득하였다. 모든 시료는 그들의 신원을 가리기 위해 무작위적으로 암호화되었고, 혈액시료는 사용할 때까지 -80 ℃에 보관하였다.

역전사-PCR 및 노던 블랏 분석(Northern blot analysis).

세포주 및 정상 또는 암 조직의 상기 역전사-PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR) 분석을 기존에 기재한 바와 같이 수행하였다(Nakatsura T et al., Biochem Biophys Res Commun 2001;281:936-44). 상기 CDC45L 프라이머 서열은 5'-CTGGTGTTGCACAGGCTGTCATGG-3' (서열번호 19) 센스(sense) 및 5'-CGCACACGGTTAGAAGAGGAG-3' (서열번호 20) 안티센스(antisense)였다. 대조군으로 베타-액틴(beta-actin) mRNA에 의한 정상화(normalization) 후에, 상기 조직들 및 세포주안의 CDC45L mRNA 의 발현을 비교하였다. 노던 블랏 분석을 기존에 기재한 바와같이 CDC45L 유전자 특이적 cDNA 탐침(probe)를 이용하여 수행하였다(1245 내지 1867 bp에 대응하는) (Nakatsura T et al., Biochem Biophys Res Commun 2003;306:16-25).

면역조직화학적 염색.

인간 CDC45L 의 면역조직화학적 염색을 기존에 기재한 바와 같이 조금의 변형과 함께 수행하였다(Nakatsura T et al., Biochem Biophys Res Commun 2001;281:936-44).

요약하면, 조직 절편의 탈파라핀 및 재수화 후에, 내생적 과산화물(peroxide)을 메탄올 안의 0.3% 과산화수소(hydrogen peroxide)로 15분 동안 캔치하였고(quenched), 비특이적 결합을 단백질 차단 무혈청 시약(Dako)과 함께 10분 동안 배양하여 감소시켰다. 완충액으로 세척 후에, Can Get Signal (R) 면역 용액 A(Toyobo Co., Osaka, Japan)에 희석된 상기 1차 항체(토끼에서 생산된 항-인간 CDC45L 항체, 1:100 희석, HPA000614, affinity purified, Sigma-Aldrich)를 시료와 하룻밤 동안 4 ℃에서 배양하였다.

그 후에, 절편을 완충액으로 조심스럽게 세척하였고, 2차 항체(폴리머-HRP(Polymer-HRP)로 표지된 항-마우스 및 항-토끼 항체, Dako) 와 상온에서 배양하였다. 완충액으로 3회 세척한 후, 상기 염색 반응을 3,3′-디아미노벤지딘(3,3′-diaminobenzidine solution) (Liquid DAB+ Substrate Chromogen System, Dako)과 배양하여 수행하였다. 슬라이드를 헤마톡실린(hematoxylin)으로 가볍게 대조염색하였고, 에탄올(ethanol)로 탈수하였으며, 크실렌(xylene)으로 깨끗이 하였다. CDC45L 발현이 알려진 고환 절편을 항-인간 CDC45L 항체에 대한 양성 대조군으로 사용하였다. 음성대조군을 위해, 1차 항체 대신에 정상 토끼 IgG를 대체하였다.

펩티드(Peptides).

HLA-A＊2402 를 암호화하는 분자에 대한 결합 모티프(motifs)를 수반하는 인간 CDC45L 유래 펩티드를 BIMAS software program (Bioinformatics and Molecular Analysis Section, Center for information Technology, NIH, Bethesda, MD)를 이용하여 선별하였고, 16개의 펩티드(10 개 노나머(nonamers) 및 6 개 디카머(decamers), 순도 〉95%) 를 합성하였다(AnyGen, Gwangju, Korea)(표 1). 펩티드를 20 ㎍/mL 농도의 디메틸술폭시드(dimethylsulfoxide)에 용해하였고, -80 ℃에 보관하였다.

두 개의 펩티드, HLA-A24 제한된 RYLRDQQLL (서열번호 21) 펩티드 (HIV-A24) 및 HLA-A2 제한된 SLYNTYATL (서열번호 22) 펩티드 (HIV-A2) 를 음성대조군으로 사용하였다(Komori H et al., Clin Cancer Res 2006;12:2689-97).

인간 CTL에 활성있는 CDC45L 의 제작 및 CTL 반응의 분석.

말초혈액단핵구 세포(PBMCs)를 HLA-A24 또는 HLA-A2 양성 일본의 건강한 기증자 및 폐암 환자로부터 분리하였고, 상기 말초 단핵구 유래 수지상 세포(dendritic cells, DCs)를 기재된 바와 같이 만들었다(Harao M et al., int J Cancer 2008;123:2616-25, Naito K et al., int J Oncol 2006;28:1481-9). 상기 DC를 4 ㎍/mL 베타 2-마이크로글로불린(beta 2-microglobulin)(Sigma-Aldrich)의 존재하에 20 ㎍/mL 후보 펩티드로 2 시간 동안 37 ℃ 에서 2% 열-불활성화된 자가유래 혈장으로 보충된 AiM-V (invitrogen)에서 자극하였다. 그 후에, 상기 세포를 조사하였고(40 Gy) , 기존에 기재된 바와 같이 분리된 CD8+ T 세포와 함께 배양하였다(imai K et al., Clin Cancer Res 2008;14:6487-95, Harao M et al., int J Cancer 2008;123:2616-25). 펩티드가 로드된(loaded) 자가유래 PHA-아세포(PHA-blasts)로 두 번의 부가적인 자극을 7일 및 14일에 수행하였다. 상기 PHA-아세포를 기존에 기재된 것과 같이 만들었고(inoue M et al., immunol Lett 2009;126:67-72), 이러한 PHA-아세포(5 × 10⁵) 를 3 시간 동안 20 ㎍/mL 펩티드로 자극하였고, 조사하였으며(100 Gy), 10 ng/mL 인간 재조합형 IL-7 (Wako, Osaka, Japan)의 존재하에 2×10⁶ CD8+ T 세포와 배양하였다. 2일 후에, 상기 배양에 20 iU/mL 인간 재조합형 IL-2 (PeproTec, inc.)를 보충하였다.

마지막 자극후 6일에, 유도된 CTL의 항원특이적 반응을 조사하였다. 펩티드가 로드된(loaded) 자가유래 PHA-아세포(PHA-blasts)로 두 번의 부가적인 주간 자극을 7일 및 14일에 수행하였다. CD4+ T 세포가 풍부한 자가유래 CD14- CD8- 세포를 PHA (2 ㎍/mL) 및 인간 재조합형 IL-2 (100 iU/mL)와 함께 2일 동안 배양하였으며, 세포를 PBS로 세척하였고, 인간 재조합형 IL-2 (100 iU/mL) 와 함께 부가적인 3일 동안 배양하였다. 이러한 PHA-아세포(5 × 10⁵) 를 50 ㎍/mL 펩티드로 2 시간 동안 37 ℃ 에서 2% 열-불활성화된 자가유래 혈장으로 보충된 AiM-V (invitrogen)에서 자극하였다. 그 후에, 상기 세포를 조사하였고(100 Gy), 2×10⁶ CD8+ T 세포와 배양하였다. 이러한 배양은 5 ng/mL 인간 재조합형 IL-7, IL-2, 및 IL-15로 보충된 배지를 사용하여 24웰-플레이트에서 수립하였다. 마지막 자극 후 6일에, IFN-감마(gamma) ELISPOT 분석, CD107a 동원(mobILization) 분석 및 ⁵¹Cr 방출 분석으로 유도된 CTL의 항원-특이적 반응을 기존에 기재된 것 및 하기와 같이 조사하였다(Komori H et al. Clin Cancer Res 2006; 12: 2689-97).

CD107a 동원(mobILization) 분석.

에피토프 펩티드로 자극한 CD8+ T 림프구 탈과립을 확인하기 위해, 세포 표면에 노출된 CD107a 를 유동 세포분석기로 분석하였다(Rubio V et al., Nat Med 2003;9:1377-82, Betts MR et al., J immunol Methods 2003;281:65-78). CD107a 동원 분석을 면역세포 CD107a 진단 키트(MBL, Nagoya, Japan)로 제조업자의 지시에 따라 수행하였다. 상기 유도된 CTL을 2% 열-불활성화된 자가유래 혈장으로 보충된 AiM-V의 최종 농도 2×10⁶ 세포/mL에서 부유하였고, 세포 현탁액 150 ㎕를 각 둥근 바닥 마이크로 플레이트인 96-웰(well)에 첨가하였다. 상기 CDC45L 유래 펩티드 또는 대조군 HIV 펩티드(1 ㎍/ml) 를 자극제로서 첨가하였으며, 각 웰에 FITC-표지된 항-인간 CD107a mAb 또는 FITC-표지된 아이소타입(isotype) 대조군 마우스(mouse) IgG1 및 모넨신(monensin)을 첨가하였다. 세포를 5 시간 동안 37 ℃ 에서 배양하였다. 배양 후에, 상기 세포를 PE-가 접합된 항-인간 CD8a (Biolegend)으로 염색하였으며, 유동 세포분석기(FACScan; BD Biosciences)로 분석하였다.

CDC45L 결핍 세포 제작.

폐암 세포에서 CDC45L의 발현을 결핍시키고자, CDC45L 작은 간섭(small interfering, si) RNAs (인간 Cdc45 siRNA, sc-35044: a pool of three target-specific 20-25 nt siRNAs; Santa Cruz) 을 40-60% 세포에 150 nM 최종 농도로 첨가하였다. 리포펙타민 Lipofectamine (TM) 2000 (invitrogen) 을 세포로 siRNAs 를 형질도입(transfect)시키는 것에 제조업자의 지시에 따라 사용하였다. GFP siRNAs를 무관한 대조군으로 사용하였다. 상기 처리된 세포를 PBS로 한번 세척하였고, 부착된 세포를 형질도입(transfection) 후 72 시간에 수집하였고 ⁵¹Cr-방출 분석에 대한 표적 세포로 사용하였다. CDC45L 발현을 억제하는 siRNA의 능력을 조사하고자, 웨스턴 블랏 분석을 기존에 기재된 바와 같이 수행하였다(Nakatsura T et al., Biochem Biophys Res Commun 2003;306:16-25). 암세포를 형질도입 후 48시간에 PBS로 세척하였고, 부착된 세포들을 수집하였으며, CDC45L 발현 수준을 음성 대조군 세포의 그것에 대해 비교 분석하기 위해 용해하였다. 베타-액틴(Beta-actin)을 내재 대조군으로 사용하였다. CDC45L 에 반응하는 토끼 폴리클로날(polyclonal) 항체(sc-20685, Santa Cruz Biotechnology) 를 1차 항체로 사용하였다.

암 세포주에 대한 인간 CTL 반응.

Lu99 세포(1×10⁴/웰)로 자극된 1×10⁵ CTL 당 인터페론(interferon)(IFN)-감마(gamma)를 생산하는 세포의 빈도 또는 펩티드로 자극된 C1R-A2402 및 T2세포(1×10⁴/웰)를 기존에 기재된 바와 같이 ELISPOT 분석으로 분석하였다(Komori H et al., Clin Cancer Res 2006;12:2689-97, Bourgault Vi et al., Cancer Res 2004;64:8761-6). 상기 CTL을 제시된 효과기-표적 비율에서 표적세포로서 암세포 또는 펩티드 자극된 C1R-A2402 및 T2 와 함께 배양하였고, 기존에 기재된 바와 같이 ⁵¹Cr-표준 방출 분석을 수행하였다(Yokomine K et al., int J Cancer 2009;126:2153-63, Monji M et al., Clin Cancer Res 2004;10:6047-57). 항-인간 HLA 클래스 Ⅰ mAb, W6/32 (IgG2a, Santa Cruz Biotechnology)에 의한 HLA-클래스 Ⅰ 차단 또는 항-인간 HLA-DR mAb (IgG2a, BD Biosciences)에 의한 HLA-클래스 Ⅱ 차단을 기존에 기재된 바와 같이 수행하였다(Komori H et al., Clin Cancer Res 2006;12:2689-97, Makita M et al., Clin Cancer Res 2002;8:2626-31).

입양(Adoptive) 면역치료 모델.

실험적 입양 면역치료를 기존에 기재된 바와 같이 수행하였다(imai K et al., Clin Cancer Res 2008;14:6487-95, Komori H et al., Clin Cancer Res 2006;12:2689-97). 요약하면, 내생적 CDC45L 및 HLA-A24 둘 다에 대해 양성 Lu99 세포 (3X106 세포/마우스(mouse))를 NOD/SCID 쥐의 오른쪽 측면에 피하로 접종하였다. 7일에 종양 크기가 약 25 mm² 에 도달하였을 때, CDC45L-A24-9-109-2 (서열번호 2), CDC45L-A24-9-294-3 (서열번호 3) 및 CDC45L-A24-9-556-4 (서열번호 4) 펩티드의 혼합물로 시험관내에서 자극한 두 명의 건강한 기증자로부터 유도된 상기 CDC45L 특이적 CTL 세포주 또는 무관한 HLA-A24 제한적인 HIV 펩티드로 자극하여 유도된 CTL 세포주를 100 ㎕ PBS에 부유하였고, 정맥내로 주입하였다(4×10⁶ 세포/마우스). 상기 CTL의 정맥내 주입은 14일에 반복하였다. 상기 종양 크기를 두 개의 수직적인 지름을 측정하기 위해 캘리퍼(calipers)를 이용하여 한 주에 2회 평가하였다.

통계학적 분석.

Two-tailed Student's t-test를 ELISPOT 데이터의 차이의 통계학적 유의성 및 처리군 간의 종양 크기를 평가하기 위해 사용하였다. 0.05 미만 P 값은 통계학적으로 유의하다고 여겨진다. 상기 통계학적 분석을 상업적 통계 소프트웨어 팩키지로 수행하였다(StatView 5.0, Abacus Concepts, Calabasas, CA).

결과

폐암에서 CDC45L 유전자 과발현의 확인은 cDNA 마이크로어레이 분석에 기초하였다. 27,648 유전자를 포함하는 게놈-와이드(Genome-wide) cDNA 마이크로어레이를 18개 폐 암 시료 및 이들의 인접한 정상 부합하는 것의 유전자 발현 프로필(profiles)을 조사하기 위해 사용하였다. cDNA 마이크로어레이 분석은 작은 세포 폐 암 환자(평균 상대적인 발현 비율: 163,087; 범위: 81,204-369,309)의 모든 12 개 및 작은 세포가 아닌 폐암 환자(NSCLC)(평균 상대적인 발현 비율: 15,170; 범위: 0.08-40,131)의 6 개 중 4개의 폐암 조직에서 현저히 증가된 CDC45L 유전자를 나타냈다(표 2).

따라서, CDC45L은 특정화된 폐암의 새로운 TAA로서 선택되었다. 또한, CDC45L 유전자의 발현 수준은 cDNA 마이크로어레이 분석에 기초하여 전립선암, 유방암, 및 방광암을 포함하는 대부분의 몇몇의 다른 악성종양에서 증가하였다(표 2).

정상 조직, 암 세포주 및 폐암 조직에서 CDC45L mRNA 의 발현.

RT-PCR 및 노던 블랏 분석을 이용하여 정상 조직안에 CDC45L 유전자의 mRNA 수준에서의 CDC45L 유전자 발현을 분석하였다. 정상 조직에서 CDC45L의 반정량적 RT-PCR 분석은 이것이 고환 및 유방에서만 희미하게 발현하는 것이 나타났다(도 1a). CDC45L cDNA를 탐침으로 이용한 정상조직에서 노던 블랏 분석은 고환을 제외한 22개의 주요한 기관에서 발현하지 않는 것을 RT-PCR 분석에 부합하여 나타났다(도 1b). 이와 대조적으로, CDC45L 유전자의 발현은 RT-PCR 분석을 이용하여 9 개의 암세포주에서 모두 탐지되었다(도 1c). 그 후에, CDC45L 유전자의 발현을 RT-PCR 분석을 이용하여 상기 폐암 환자 조직에서 분석하였다. NSCLC 환자 8 명 중 7명에서, CDC45L mRNA은 암 조직에서 강하게 발현하였다(도 1d 위). 게다가, 상기 수술적으로 절제된 암 조직 및 이의 인접한 정상 부합하는 것에서 CDC45L 유전자의 발현을 RT-PCR 분석을 이용하여 측정하였다. CDC45L 유전자의 발현은 4 개의 폐암 조직 모두에서 탐지되었으나, 이의 정상 부합하는 것에서 소규모의 발현이 탐지되었다(도 1d 아래). 또한, 위암(gastric cancer), 간담즙성 암(hepatobILiary cancer), 유방암(breast cancer), 전립선암(prostate cancer) 및 결장암(colorectal cancer)에서 유래된 다양한 암 세포주의 RT-PCR 분석은 CDC45L 유전자가 많은 암 세포주에서 발현되는 것을 나타냈다(도 1e).

단백질 수준에서 CDC45L 발현을 조사하기 위하여, 폐암 조직 및 정상 조직의 면역조직화학적 분석을 수행하였다. 12개 선암(adenocarcinomas)(12 개 중 7 개는 세기관지암(bronchioalveolar carcinomas)) , 8개 편평 상피 세포 상피성 암 및 6 개 작은 세포 상피성 암으로 구성된 26 개 폐암 조직을 연구하였다.

모든 26개의 시료는 CDC45L의 강한 핵 염색 및 약한 세포질 염색을 나타냈다(도 1f). 염색이 없거나 매우 약한 염색을 정상과 인접한 폐 조직에서 관찰하였다(도 1f). CDC45L은 고환에서 발현하였으나, 뇌, 심장, 간, 신장, 위, 소장, 결장, 췌장, 피부, 비장 및 흉선를 포함하는 정상 성인 인간 조직의 다른 유형에서 염색이 없거나 매우 약한 염색이 관찰되었다(도 1f 및 데이터가 보여지지 않음). 총괄하여, 인간 폐암에서 상기 CDC45L 단백질 발현 수준은 고환을 제외하고, 분명히 정상 성체 조직의 그것에 비해 더 높았다. 이러한 결과는 RT-PCR 및 노던 블랏 분석으로부터 결과에 일관된다 (도 1a, b 및 d).

건강한 기증자에서 CDC45L 유래되고 HLA-A24 에 제한된 CTL 에피토프의 확인.

HLA-A24 제한되고, CDC45L 유래된 CTL 에피토프를 확인하고자, NIH BIMAS 에 의해 제공되는 HLA-페티드 결합 예측 소프트웨어에 따라 HLA-A24 에 높은 결합 친화성을 가지는 것으로 예측되는 16 개의 후보 펩티드를 선택하였다(표 1). 펩티드에 반응하는CTL를 유도할 수 있는 펩티드를 시험하기 위해, 건강한 기증자의 PBMC로부터 분류된 상기 CD8+ T 세포를 이러한 16개 CDC45L 펩티드로부터 선택되는 4 개의 펩티드의 혼합물로 자극된 자가유래 단핵구 유래 DC와 함께 배양하였다. 펩티드 로드된(loaded) 자가유래 PHA-아세포로 주 2 회 부가적인 자극 후에, 상기 펩티드로 자극된 C1R-A＊2402 세포에 대한 세포독성 활성을 IFN-감마 ELISPOT 분석으로 확인하였다(도 2). 두 개의 HLA-A24 양성 건강한 기증자의 PBMC로부터 분류된 CD8+ T 세포를 16 개의 CDC45L 펩티드 중 4 개의 혼합물로 자극한 자가유래 단핵구 유래 DC로 자극하였다. 결과적인 CTL 세포주에서 CDC45L 유래 펩티드에 대해 특정한 CD8+ T 세포의 빈도를 IFN-감마 ELISPOT 분석으로 확인하였다(도 3). 배경 대조군을 무관한 HIV-A24 펩티드로 자극한 세포로 자극하였다. 상기 발생된 CTL 세포주는 CDC45L-A24-9-109-2 (SEQ iD NO: 2), ¹⁰⁹VYNDTQIKL¹¹⁷, CDC45L-A24-9-294-3 (SEQ iD NO: 3), ²⁹⁴SYTAARFKL³⁰², CDC45L-A24-9-556-4 (SEQ iD NO: 4), ⁵⁵⁶KFLDALISL⁵⁶⁴, CDC45L-A24-9-370-7 (SEQ iD NO: 7), ³⁷⁰KFLASDVVF³⁷⁸ 또는 CDC45L-A24-10-556-12 (SEQ iD NO: 12), ⁵⁵⁶KFLDALISLL⁵⁶⁵ 펩티드로 자극된 C1R-A2402 세포로 자극시 많은 양의 IFN-감마를 생산하였다. 이러한 결과는 이러한 5 개 CDC45L 유래 펩티드가 면역원성이 있는 것을 제시한다.

추가적으로 이러한 5 개 면역원성 펩티드의 CTL을 자극하는 능력을 분석하고자, CTL에 의한 세포 융해의 과립 함량의 항원 특이적 분비를 평가하는 CD107a 동원(mobILization) 분석을 수행하였다(Rubio V et al., Nat Med 2003;9:1377-82, Betts MR et al. J immunol Methods 2003;281:65-78). 이러한 5 개의 면역원성 펩티드 중의 하나로 자극하여 만들어진 상기 CTL 세포주가 그들의 동족체 펩티드로 재자극될 때, 무관한 HIV-A24 펩티드의 재자극에 비해, CD8+ T 세포의 상당히 더 높은 부분이 항-CD107a mAb에 의해 염색되었다(도 4).

폐암 환자에서 CDC45L 유래 펩티드에 특정한 CTL 세포주의 수립.

CDC45L-A24-9-109-2 (서열번호 2), CDC45L-A24-9-294-3 (서열번호 3), CDC45L-A24-9-556-4 (서열번호 4), CDC45L-A24-9-370-7 (서열번호 7) 또는 CDC45L-A24-10-556-12 (서열번호 12) 펩티드로 자극하여 CDC45L 특이적 CTL을 HLA-A24에 대해 양성 폐암 환자의 PBMC로부터 만들었다. 이러한 CTL 세포주는 IFN-감마 ELISPOT 분석에서 CDC45L 유래 펩티드에 대하여 상당히 많은 양의 IFN-감마를 생산하였다(도 5a). 게다가, 이러한 CTL 세포주는 ⁵¹Cr 방출 분석에서 무관한 HIV-A24 펩티드로 자극한 C1R-A2402 세포가 아닌, 5 개의 CDC45L 유래 펩티드로 자극한 C1R-A2402 세포에 대한 세포독성 활성을 나타냈다(도 5b). 이러한 결과는 이러한 CTL이 펩티드 특이적 세포독성 활성을 가지는 것을 나타낸다.

암세포에서 CDC45L CTL 에피토프의 자연처리.

자연적으로 CDC45L 및 HLA-A24 둘 다를 발현하는 인간 폐암 세포주를 살해하는 이러한 CTL의 능력을 조사하였다.

Lu99 및 EBC-1 세포 (CDC45L+, HLA-A24+), CDC45L 특이적 siRNAs로 형질도입된(transfected) Lu99 및 EBC-1 세포(CDC45L-, HLA-A24+), 대조군 GFP siRNAs로 형질도입된 Lu99 및 EBC-1 세포(CDC45L+, HLA-A24+)(도 5c) 및 A549 세포(CDC45L+, HLA-A24-)를 표적세포로 사용하였다. 도 5d와 같이, CDC45L-A24-9-109-2 (서열번호 2) 및 CDC45L-A24-9-556-4 (서열번호 4) 펩티드로 자극한 건강한 기증자-4(바닥 패널, 왼쪽) 및 폐암 환자-18(바닥 패널, 오른쪽)으로부터 만들어진 상기 CTL 세포주는 CDC45L 특이적 siRNA로 형질도입된 Lu99 세포(바닥 패널) 및 A549(바닥 패널, 왼쪽) 세포가 아닌, Lu99 세포 및 대조군 GFP siRNA으로 형질도입된 Lu99 세포에 대해 각각 세포독성을 나타냈다.

유사하게, 상기 CDC45L-A24-9-294-3 (서열번호 3) 펩티드로 자극한 폐암 환자-1로부터 만들어진 CTL은 CDC45L 특이적 siRNA로 형질도입된 EBC-1 및 A549 세포(위의 패널, 왼쪽)가 아닌, EBC-1 및 GFP siRNAs로 형질도입된 EBC-1세포에 대해 세포독성을 나타냈다. 또한, 상기 CDC45L-A24-9-370-7 (서열번호 7)로 자극한 폐암환자 3 및 8로부터 만들어진 CTL은 CDC45L 특이적 siRNAs 로 형질도입된 EBC-1 세포 및 A549 세포가 아닌, EBC-1 세포 및 GFP siRNAs로 형질도입된 EBC-1 세포에 대해 세포독성을 나타냈다(위의 패널, 중간, 오른쪽). 5 개 면역원성의 CDC45L 유래 펩티드 중에서, 3개, CDC45L-A24-9-109-2 (서열번호 2), CDC45L-A24-9-294-3 (서열번호 3) 및 CDC45L-A24-9-556-4 (서열번호 4)는 CDC45L 및 HLA-A24 둘 다를 자연적으로 발현하는 폐암세포를 효과적으로 용해할 수 있는 CDC45L 특이적 CTL을 유도하였다. 이러한 결과는 이러한 3 개의 CDC45L 유래 펩티드가 자연적으로 처리될 수 있고, 암세포에서 HLA-A24 분자에 제한되어 제시될 수 있음을 제시한다.

HLA-클래스 Ⅰ에 제한되는 방식으로 표적세포를 인식하는 3 개의 CDC45L 유래 펩티드에 대해 특이적인 CTL을 확인하기 위해, HLA-클래스 i(W6/32) 에 특이한 mAb를 CTL의 인식 차단에 사용하였다. IFN-감마 생산 및 세포독성은 항-HLA-클래스 Ⅱ mAb가 아닌 HLA-클래스 Ⅰ에 대한 mAb로 차단함으로써 현저히 저해되었다(도 6a 및 b). 이러한 결과는 HLA-클래스 Ⅰ에 제한되는 방식으로 내생적 CDC45L을 발현하는 표적세포를 인식하는 이러한 유도된 CTL을 분명히 나타낸다.

CDC45L-9-556-4 (서열번호 4), ⁵⁵⁶KFLDALiSL⁵⁶⁴ 펩티드는 HLA-A2 (A＊0201) 및 HLA-A24 (A＊2402) 둘 다에 제한적인 CTL을 유도할 수있다. CDC45L-A2-9-556-4 (서열번호 4, 본 발명에서 CDC45L-A24-9-556-4로 언급된), ⁵⁵⁶KFLDALiSL⁵⁶⁴는 HLA-A24 (A＊2402) 뿐만 아니라 HLA-A2 (A＊0201)에도 높은 결합 친화성을 가지는 것이 HLA-펩티드 결합 예측 소프트웨어 SYFPEITHI (institute for immunology, University of Tubingen, Tubingen, Germany, www.syfpeithi.de/)따라 예측되었다. HLA-A＊2402는 일본인에서 가장 빈번한 HLA 클래스 Ⅰ 대립 형질이며, HLA-A＊0201는 아시아인, 아프리카인, 아프리카계 미국인 및 백인을 포함한 다양한 인종 집단에서 가장 일반적인 HLA 대립 형질 중의 하나이다(Browning M et al. immunol Today 1996;17:165-70). 따라서, 상기 CDC45L-A2-9-556-4 (서열번호 4)펩티드는 HLA-A2 및 HLA-A24 둘 다에 제한되는 일반적인 CTL 에피토프 후보인 것이 가정된다. CDC45L-A2-9-556-4 (서열번호 4) 펩티드가 HLA-A2에 결합할 수 있는지 확인하기 위해, HLA-A2 안정화 분석을 T2 세포와 함께 기존에 기재된 바와 같이 수행하였다(Yokomine K et al., int J Cancer 2009;126:2153-63).

상기 CDC45L-A2-9-556-4 (서열번호 4) 펩티드는 HIV-A2 펩티드에 비해 HLA-A2 분자에 안정하게 결합하는 능력을 있으며, 상기 양성 대조군으로 사용되었다. 따라서, HLA-A2에 실제 결합 펩티드로 확인되었다.

다음으로, HLA-A2 (A＊0201)에 대해 양성인 건강한 기증자의 PBMC로부터 CDC45L-A2-9-556-4 (서열번호: 4)특이적 CTL을 CDC45L-A2-9-556-4 (서열번호 4) 펩티드로 자극함으로써 만들었다. 상기 HLA-A2 양성 건강한 기증자로부터 만들어지는 CTL은 펩티드로 자극된 T2 세포로 재-자극에 대하여 특별히 IFN-감마를 생산하였다(도 7a). 게다가, 상기 만들어진 CTL 세포주는 무관한 HIV-A2 펩티드가 로드된(loaded) T2 세포 또는 CDC45L-A2-9-556-4 (서열번호 4) 펩티드가 로드된C1R-A2402 세포가 아닌, CDC45L-A2-9-556-4 (서열번호 4) 펩티드로 자극된 T2 세포에 대해 세포독성을 나타냈다(도 7b). 이러한 결과는 HLA-A2에 제한되는 방식으로 이러한 CTL이 중개하는 펩티드 특이적 세포독성을 나타낸다. 또한, 상기 만들어진 CTL 세포주는 HLA-A24가 아닌 CDC45L 및 HLA-A2 (A＊0201)분자를 내재적으로 발현하는 Panc1 세포를 효과적으로 용해할 수 있고, 상기 세포독성은 ⁵¹Cr-방출 분석으로 확인된 바와 같이 항-HLA-클래스 Ⅱ mAb 에 의한 조절이 아닌 HLA-클래스 Ⅰ (W6/32) 에 대한 mAb로 차단함으로써 상당히 저해된다(도 7c).

이러한 결과는 분명히 CDC45L-A2-9-556-4 (서열번호 4) 펩티드가 자연적으로 CDC45L 단백질로부터 처리되었고, CDC45L-A2-9-556-4 (서열번호 4) 펩티드로 유도된 CTL에 의해 인식되는 HLA-A24에 제한되는 것 뿐만 아니라 HLA-A2에 제한되어 제시되는 것을 나타낸다(도 5d, 6 및 도 7). 따라서, CDC45L-A2-9-556-4 (서열번호 4)는 HLA-A2 및 HLA-A24 둘 다에 의해 제한되는 일반적인 CTL 에피토프이고, 이러한 펩티드는 CDC45L를 발현하는 암을 가진 일본인 환자의 80% 이상에 면역치료에 적용될 수 있다.

NOD/SCID 쥐(mice)에서 CDC45L 활성있는 인간 CTL의 생체내 항종양 활성.

CDC45L 양성 인간 폐암 세포가 이식된 면역손상 쥐로 CDC45L 활성 CTL 주입의 치료적 효과를 평가하기 위해, Lu99 세포를 NOD/SCID 쥐에 피하로 주입하였다. 7일 후에, 상기 종양의 지름이 약 5 × 5 mm에 도달하였을 때, 쥐 정맥내로 자가유래 단핵구 유래 DC(0 일) 및 CDC45L-A24-9-109-2 (서열번호 2), CDC45L-A24-9-294-3 (서열번호 3) 및 CDC45L-A24-9-556-4 (서열번호 4) 펩티드의 복합체 또는 무관한 HIV-A24 펩티드로 자극한 자가유래 PHA-아세포로 CD8+ T 세포를 자극하여 만든 인간 CTL를 주입하였다.

CTL을 쥐에 주입하기 전에, 상기 CTL의 펩티드 특이적 세포독성 활성을 평가하였다(도 8). 건강한 기증자 5에서 CDC45L-A24-9-294-3 (서열번호 3)펩티드를 제외하고, 펩티드로 자극된 C1R-A2402 세포로 재자극에 대한 반응으로 특히 IFN-감마를 생산하는 HLA-A24 양성인 상기 CTL 세포주를 두 명의 건강한 기증자로부터 만들었다(도 8a)

두 명의 건강한 기증자 유래 상기 CTL 세포주는 HLA-A24 양성이고, 펩티드로 자극된 C1R-A2402 세포로 재자극에 대해 특별히 IFN-감마를 생산하는 만들어졌다.

게다가, CDC45L 펩티드의 혼합물은 Lu99 세포를 효과적으로 용해시킬 수 있고, 51Cr-방출 분석에서 HLA-클래스 Ⅰ 에 특이적인 mAb로 차단함으로써 세포독성이 상당히 저해되는 CTL을 유도하였다(도 8b). 한편, 상기 CTL 세포주는 건강한 기증자 4 및 5 둘 다에서 CDC45L-A24-9-294-3 (서열번호 3), CDC45L-A24-9-556-4 (서열번호 4) 또는 무관한 HIV-A24 펩티드로 자극된 C1R-A2402가 아닌, CDC45L-A24-9-109-2 (서열번호 2) 펩티드로 자극된 C1R-A2402에 대해 특이적 세포의 용해를 나타냈다(도 8c).

CDC45L로 자극된 CTL이 주입된 쥐의 암은(n=5; 평균 ＋／－ 표준 편차[SD], 108 ＋／－ 65 mm²) Lu99 세포의 주입 후 42 일에 대조군 HIV 펩티드로 유도된 CD8+ T 세포(n=5; 평균 ＋／－ SD, 271 ＋／－ 94 mm²) 또는 PBS 단독(n=5; 평균 ＋／－ SD, 297 ＋／－ 44 mm²) 으로 주입된 쥐들의 그것보다 현저히 작았다(two-tailed Student's t-test, ＊P 〈 0.05, ＊＊P 〈 0.01; 도 8d). 상기 결과는 NOD/SCID 쥐에 CDC45L 양성 인간 종양에 대한 CDC45L 특이적 인간 CTL의 입양(adoptive) 이동 치료의 효과를 분명히 나타낸다. 결과적으로, CDC45L 항원은 높은 면역원성이 있고, 자가면역 현상을 야기하지 않으며, 폐암의 펩티드 기반 면역치료에 대한 유망한 표적인 것이 제시된다.

고찰

최근의 연구에서, 새로운 TAA, 세포 분열 주기 45-유사(Cell division cycle 45-like, CDC45L)를 폐암의 cDNA 마이크로어레이 분석을 이용하여 확인하였다.

상기 마이크로어레이 데이터는 CDC45L이 전립선암, 유방암 및 방광암 및 폐암에서 과발현되는 것을 나타냈다. 폐암 조직에서 CDC45L 유전자 발현의 cDNA 마이크로어레이 분석으로부터 수득된 데이터와 일관되게, 상기 CDC45L 유전자 발현은 그들의 정상 부합하는 것이 아닌, 모든 4 개의 폐암 조직에서 탐지되었다. 또한, 정상조직에서 상기 RT-PCR 및 노던 블랏 분석에서 CDC45L 발현은 고환을 제외한 많은 주요 기관에서 겨우 탐지가능하였다. 이러한 결과는 CDC45L를 표적으로 하는 것이 자가면역 질환 유발 없는 이러한 암에 대해 새로운 면역요법 접근법이 될 수 있음을 제시한다.

또한, CDC45L 유래 면역원성의 펩티드 CDC45L-A24-9-109-2, CDC45L-A24-9-204-3 및 CDC45L-A24-9-556-4가 불완전한 Freund 보조약(incomplete Freund adjuvant)에서 유화된 펩티드로 면역화된 BALB/c 쥐에서 에피토프 특이적 CTL을 유도할 수 있는 것을 확인하였다(데이터는 보여지지 않음). 상기 CDC45L 유래 및 H2-Kd-제한된 펩티드, CDC45L-A24-9-109-2 및 CDC45L-A24-9-204-3로 면역화된 BALB/c 쥐는 장시간 관찰 기간 동안 림프구 침입 또는 조직 파괴 및 몸무게 감소, 설사 및 피부 비정상화와 같은 자가면역 질환의 사인이 나타내지 않는다(미공개 데이터). 또한, 이러한 결과는 생체 내에서, 쥐에서 자가면역 질환을 유발하지 않고, CDC45L 유래 펩티드가 펩티드에 활성있는 CTL을 유도할 수 있음을 나타낸다.

CDC45L이 DNA 복제의 초기 및 연장 단계에서 중요한 역할을 가지는 것이 잘 알려져 있으므로, CDC45L 의 손실은 암 세포에서 일어나는 것이 어렵다. 기존의 연구에서, Pollok 등은 상기 CDC45L 단백질 수준이 지속적으로 초기 인간 세포에 비해 인간 암 유래 세포에서 높았으며, CDC45L 발현이 세포 개체군의 증식에 강하게 연관된 것을 제시하였다(Pollk S, et al. FEBS J 2007; 274: 3669-3684). 부가적인 기존의 연구는 CDC45L 의 상향조절이 형성장애 등급(dysplasia grade) 및 림프절 상태에 의존하는 것을 제시한다(Li JN, et al. BMC Cancer 2008, 395: 1-8). 또한, 최근에 Feng 등은 Hela 및 HepG2 세포와 같은 암 세포주의 생장을 저해하는 특정한 si-RNA에 의해 CDC45L 유전자 발현의 하향조절을 보고하였으며, CDC45L이 항암 치료에 대해 유용한 표적인 것을 제시하였다(Feng D, et al. Cancer Res 2003; 63: 7356-7364.). 최근의 보고는 임상 시도에서 암백신의 표적하는 반응률이 낮은 것을 요약하였다(2.6%) (Rosenberg S A, et al. Nat Med 2004;10: 909-15.). 하나의 가능한 이유는 면역 선별 주도의 치료적 결과로서 TAA의 결실, 돌연변이 또는 하향조절의 결과로 암세포의 면역회피이다. 종양 세포가 종양형성에 필요한 항원을 잃을 수 없는 관점에 기초하여, CDC45L는 항암 면역치료에 유용한 잠재력있는 후보 TAA로 여겨진다. 본 발명에서, 하기 펩티드로 시험관 내에서 자극으로 HLA-A24에 제한된 인간 CTL를 만들 수 있는 5 개 HLA-A24-제한된 CDC45L 에피토프, CDC45L-A24-9-109-2, CDC45L-A24-9-294-3, CDC45L-A24-9-556-4, CDC45L-A24-9-370-7 및 CDC45L-A24-10-556-12를 확인하였다. 또한, 이러한 5 개 펩티드로 자극된 폐암 환자 유래 PBMC 로부터 만들어질 수 있는 CDC45L 에 반응하는 CTL을 확인하였다. 4 개의 CDC45L 에피토프 펩티드에서, CDC45L-A24-9-109-2, CDC45L-A24-9-294-3, CDC45L-A24-9-556-4 및CDC45L-A24-9-370-7, 상기 펩티드 유도된 CTL은 동족체 펩티드로 자극된 C1R-A＊2402 세포를 살해할 수 있을 뿐 만 아니라, HLA-A24에 제한된 방식에서 CDC45L를 발현하는 암세포주를 살해할 수 있다. 이러한 데이터는 이러한 CDC45L 펩티드가 자연적으로 암세포 내에서 CDC45L 단백질로부터 처리되고, CTL에 의해 인식되는 HLA-A24 분자에 제한되어 세포 표면에 제시되는 것을 제시한다. 60%의 정도의 항원 빈도와 함께, HLA-A24 (A＊2402)는 일본인에서 대부분 일반적인 HLA-대립형질 중 하나로 알려져 있으며, 또한, 10%의 정도의 항원 빈도와 함께 백인에서 제시된다. 또한, HLA-A24에 제한되고, CDC45L에서 유래된 CTL 에피토프의 확인은 폐암이 있는 많은 환자의 면역치료에 특히 전세계의 아시아인에서 유용한 것으로 제시된다(Date, Y., et al. Tissue Antigens, 1996; 47: 93-101).

결과적으로, 본 발명에서 공개된 상기 결과는 CDC45L 및 HLA-A24 둘 다를 발현하는 암세포를 죽일 수 있는 CTL을 유도할 수 있는 에피토프 펩티드의 새로운 TAA는 CDC45L 인 것을 제시한다. 폐 암, 전립선 암, 유방암 및 방광암을 포함하는 몇몇 종류의 인간 악성종양에서 CDC45L가 강하게 발현하므로, 따라서 CDC45L은 다른 자가면역 현상을 유발하는 것 없이 상기 기재된 악성종양에 대한 펩티드 기반의 면역치료의 유망한 표적이 되는 것이 제시된다.

본 발명은 강력하고 특이적인 항-종양 면역 반응을 유도할 수 있고, 매우 다양한 암 유형에 적용가능성이 있는 특히 CDC45L 유래한 펩티드인, 새로운 TAA를 제공한다. 이러한 TAA들은 CDC45L이 연관된 질환, 예를 들면, 암(cancer), 고환종양(testicular tumor), 췌장암(pancreatic cancer), 방광암(bladder cancer), 비소세포폐암(non-small cell lung cancer), 소세포폐암 (small cell lung cancer), 유방암(breast cancer), 식도암(esophageal cancer), 전립선암(prostate cancer), 만성골수성백혈병(chronic myeloid leukemia, CML), 연조직 종양(soft tissue tumor), 위암(gastric cancer), 간담즙성암(hepatobILiary cancer) 및 결장암(colorectal cancer)을 포함할 수 있지만, 한정하지 않으며, 이에 대한 펩티드 백신으로 유용할 수 있다.

본 발명에 인용된 모든 특허, 특허 공개 및 공개는 본 발명에 그들의 전체의 참조로서 포함된다.

또한, 본 발명은 본 명세서에 자세한 설명과 그것의 특정 실시태양에 대한 참고문헌이 기재되어 있지만, 앞서 언급된 설명이 본질적으로 예시 및 설명하기 위한 것이며, 본 발명 및 구체적인 실시태양을 설명하기 위한 것임으로 이해될 수 있다. 일반적인 실험을 통하여, 당업자들은 다양한 변화 및 변형이 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고 만들어질 수 있으며, 본 발명의 목적 및 한계는 첨부된 청구항에 의해서 정의된다는 것을 용이하게 인식할 수 있을 것이다.

<110> ONCOTHERAPY SCIENCE, INC. <120> CDC45L PEPTIDES AND VACCINES INCLUDING THE SAME <130> 2011fpi-11-003 <150> US 61/217,133 <151> 2009-05-26 <160> 26 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 1 Lys Tyr Val Thr Asp Val Gly Val Leu 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 2 Val Tyr Asn Asp Thr Gln Ile Lys Leu 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 3 Ser Tyr Thr Ala Ala Arg Phe Lys Leu 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 4 Lys Phe Leu Asp Ala Leu Ile Ser Leu 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 5 Lys Phe Gln Ala Met Asp Ile Ser Leu 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> 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170 175 Trp Glu Ala Arg Arg Arg Asp Ile Leu Phe Asp Tyr Glu Gln Tyr Glu 180 185 190 Tyr His Gly Thr Ser Ser Ala Met Val Met Phe Glu Leu Ala Trp Met 195 200 205 Leu Ser Lys Asp Leu Asn Asp Met Leu Trp Trp Ala Ile Val Gly Leu 210 215 220 Thr Asp Gln Trp Val Gln Asp Lys Ile Thr Gln Met Lys Tyr Val Thr 225 230 235 240 Asp Val Gly Val Leu Gln Arg His Val Ser Arg His Asn His Arg Asn 245 250 255 Glu Asp Glu Glu Asn Thr Leu Ser Val Asp Cys Thr Arg Ile Ser Phe 260 265 270 Glu Tyr Asp Leu Arg Leu Val Leu Tyr Gln His Trp Ser Leu His Asp 275 280 285 Ser Leu Cys Asn Thr Ser Tyr Thr Ala Ala Arg Phe Lys Leu Trp Ser 290 295 300 Val His Gly Gln Lys Arg Leu Gln Glu Phe Leu Ala Asp Met Gly Leu 305 310 315 320 Pro Leu Lys Gln Val Lys Gln Lys Phe Gln Ala Met Asp Ile Ser Leu 325 330 335 Lys Glu Asn Leu Arg Glu Met Ile Glu Glu Ser Ala Asn Lys Phe Gly 340 345 350 Met Lys Asp Met Arg Val Gln Thr Phe Ser Ile His Phe Gly Phe Lys 355 360 365 His Lys Phe Leu Ala Ser Asp Val Val Phe Ala Thr Met Ser Leu Met 370 375 380 Glu Ser Pro Glu Lys Asp Gly Ser Gly Thr Asp His Phe Ile Gln Ala 385 390 395 400 Leu Asp Ser Leu Ser Arg Ser Asn Leu Asp Lys Leu Tyr His Gly Leu 405 410 415 Glu Leu Ala Lys Lys Gln Leu Arg Ala Thr Gln Gln Thr Ile Ala Ser 420 425 430 Cys Leu Cys Thr Asn Leu Val Ile Ser Gln Gly Pro Phe Leu Tyr Cys 435 440 445 Ser Leu Met Glu Gly Thr Pro Asp Val Met Leu Phe Ser Arg Pro Ala 450 455 460 Ser Leu Ser Leu Leu Ser Lys His Leu Leu Lys Ser Phe Val Cys Ser 465 470 475 480 Thr Lys Asn Arg Arg Cys Lys Leu Leu Pro Leu Val Met Ala Ala Pro 485 490 495 Leu Ser Met Glu His Gly Thr Val Thr Val Val Gly Ile Pro Pro Glu 500 505 510 Thr Asp Ser Ser Asp Arg Lys Asn Phe Phe Gly Arg Ala Phe Glu Lys 515 520 525 Ala Ala Glu Ser Thr Ser Ser Arg Met Leu His Asn His Phe Asp Leu 530 535 540 Ser Val Ile Glu Leu Lys Ala Glu Asp Arg Ser Lys Phe Leu Asp Ala 545 550 555 560 Leu Ile Ser Leu Leu Ser 565 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 19 ctggtgttgc acaggctgtc 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Claims (22)

1. 삭제
2. 삭제
3. 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocytes, CTL) 유도성을 가지는, 서열번호: 4, 2, 3, 7 및 12로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성되는 분리된 펩티드.
   
4. 서열번호: 4, 2, 3, 7 및 12로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성되는 펩티드에 있어서, 하기의 (a) 및 (b)로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 두 개 모두의 치환을 가지는, 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocytes, CTL) 유도성을 가지는 분리된 펩티드:
   (a) 서열번호 4, 2, 3, 7 또는 12의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 두번째 아미노산이 페닐알라닌(phenylalanine), 티로신(tyrosine), 메티오닌(methionine) 및 트립토판(tryptophan)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산으로 변형; 및
   (b) 서열번호 4, 2, 3, 7 또는 12의 아미노산 서열의 C-말단 아미노산이 페닐알라닌(phenylalanine), 루신(leucine), 이소루신(isoleucine), 트립토판(tryptophan) 및 메티오닌(methionine)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산으로 변형.
   
5. 서열번호: 4의 아미노산 서열로 구성되는 펩티드에 있어서, 하기의 (a) 및 (b)로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 두 개 모두의 치환을 가지는, 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocytes, CTL) 유도성을 가지는 분리된 펩티드:
   (a) 서열번호 4의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 두번째 아미노산이 루신 및 메티오닌으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산으로 변형; 및
   (b) 서열번호 4의 아미노산 서열의 C-말단 아미노산이 발린(valine)으로 변형.
   
6. 삭제
7. 제 3항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 펩티드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
   
8. 제 3항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 기재된 한 개 또는 그 이상의 펩티드, 또는 그 펩티드를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 시험관 내에서(in vitro) CTL을 유도하는 조성물.
   
9. 제 3항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 기재된 하나 또는 그 이상의 펩티드, 또는 상기 펩티드를 암호화하는 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 암 치료 또는 예방, 또는 이의 수술 후 재발 방지용 약학적 조성물.
   
10. 제 9항에 있어서, HLA 항원이 HLA-A24 또는 HLA-A2인 개체에 투여하기 위해 제형화되는 약학적 조성물.
11. 제 9항에 있어서, 암의 치료를 위해 제형화되는 약학적 조성물.
12. 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 단계를 포함하는, CTL 유도성을 가지는 항원제시세포(antigen-presenting cell, APC) 유도 방법:
    (a) 제 3항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 상기 펩티드와 APC를 시험관 내(in vitro) 또는 체외(ex vivo)에서 접촉시키는 단계; 및
    (b) 제 3항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 상기 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 시험관 내(in vitro) 또는 체외(ex vivo)에서 APC 내로 도입하는 단계.
    
13. 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 단계를 포함하는 CTL 유도 방법:
    (a) CD8 양성 T 세포를 HLA 항원과 제 3항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 상기 펩티드의 복합체를 그것의 표면에 제시하는 APC와 공배양하는 단계;
    (b) CD8 양성 T 세포를 HLA 항원과 제 3항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 상기 펩티드의 복합체를 그것의 표면에 제시하는 엑소솜과 공배양하는 단계; 및
    (c) 제 3항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 상기 펩티드에 결합할 수 있는 T 세포 수용체(T cell receptor, TCR) 아단위(subunit) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자를 시험관 내(in vitro) 또는 체외(ex vivo)에서 T세포로 도입하는 단계.
    
14. 제 3항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 상기 펩티드와 HLA 항원의 복합체를 그것의 표면에 제시하는 분리된 APC.
    
15. 제 12항의 방법으로 유도되는 분리된 APC.
    
16. 제 3항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 상기 펩티드를 표적으로 하는 분리된 CTL.
    
17. 제 13항의 방법으로 유도되는 분리된 CTL.
    
18. 개체에 암에 대한 면역 반응을 유도하는 조성물을 제조하기 위해, 제 3항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 한 개 또는 그 이상의 펩티드(들), 또는 상기 펩티드를 암호화하는 한 개 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드(들)를 이용하는 방법.
    
19. 제 3항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 상기 펩티드에 대한 항체 또는 이의 단편.
    
20. 제 3항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 상기 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드(nucleotide) 서열을 포함하는 벡터(vector).
    
21. 제 20항에 따른 상기 벡터로 형질전환(transformed)되거나 형질도입된(transfected) 숙주 세포.
    
    
    
    
22. 삭제

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