ES2875764T3

ES2875764T3 - Métodos para diagnosticar y tratar autismo

Info

Publication number: ES2875764T3
Application number: ES18199149T
Authority: ES
Inventors: De Water Judy Van; Daniel Braunschweig
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 2009-08-14
Filing date: 2010-08-12
Publication date: 2021-11-11
Anticipated expiration: 2030-08-12
Also published as: US20170191994A1; JP2015180897A; CN105911275B; CN102576022B; DK3444613T3; EP3444613A1; US8383360B2; US10520499B2; JP5823964B2; EP2464976B1; US9529001B2; US20130210037A1; CN102576022A; WO2011019929A1; EP3444613B1; JP6105678B2; EP2464976A1; CA2771102C; CN105911275A; US20110038872A1

Abstract

Un método para determinar el riesgo de una descendencia humana de padecer un trastorno del espectro autista (TEA) que comprende identificar en una muestra biológica de la madre o de la posible madre de la descendencia la presencia de anticuerpos maternos que se unen a un biomarcador proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1), en donde la presencia de anticuerpos maternos que se unen al biomarcador CRMPI indica un mayor riesgo de que la descendencia padezca un TEA.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para diagnosticar y tratar autismo

Declaración sobre los derechos de las invenciones realizadas en el marco de la investigación y desarrollo patrocinados por el gobierno federal

La presente invención se realizó con apoyo gubernamental en virtud de la subvención 1-P01-ES11269-01, otorgada por el NIEHS y la subvención R829388, otorgada por la EPA. El gobierno posee determinados derechos sobre la invención.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos para determinar el riesgo de un trastorno del espectro autista en un feto y agentes para su uso en métodos para el diagnóstico y prevención o inhibición de un trastorno del espectro autista en un feto.

Antecedentes de la invención

Los trastornos del espectro autista (TEA) son un grupo de trastornos del neurodesarrollo heterogéneos que se manifiestan en la infancia y se definen por déficits en la comunicación y la interacción social recíproca y, con frecuencia, están acompañados de comportamientos estereotipados (American Psychiatric Association, Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Cuarta edición ("DSM-IV") 2000, Washington, D.C.). Aunque se han demostrado fuertes vínculos genéticos en numerosos informes (revisados en Ashwood et al., J Leukoc Biol. (2006) 80(1): 1-15), falta una base etiológica clara para los TEA. El papel de la implicación del sistema inmunitario en la aparición de los TEA se ha apoyado en un volumen de bibliografía en constante aumento (Ashwood, supra; Enstrom et al., Curr Opin Investig Drugs. (2009) 10(5):463-73; y Li, et al., J Neuroimmunol. (2009) 207(1-2): 111-6). Se han descrito hallazgos de respuestas inmunitarias anormales, neuroinflamación y activación de la microglía y la presencia de autoanticuerpos maternos contra el tejido cerebral de fetos de roedores y humanos (Vargas et al., Ann Neurol. (2005) 57(1):67-81; y Singer et al., J Neuroimmunol. (2009) 211(1-2):39-48.

Braunschweig et al (2007) Neurotoxicology 29(2):226-231 describen anticuerpos derivados de la madre específicos para proteínas cerebrales fetales en el autismo. Singer et al (2009) J. Neuroinmunology 211(1-2):39-48 describen que la exposición prenatal a anticuerpos de madres de niños con autismo produce alteraciones neuroconductuales en un modelo en ratones. El documento WO 2006/121952 describe biomarcadores de diagnóstico para trastornos del neurodesarrollo. Charrier et al (2003) Molecular Neurobio 28(1):51-63 describen la implicación de proteínas mediadoras de la respuesta a colapsina (CRMP, por sus siglas en inglés) en el desarrollo del sistema nervioso y trastornos neurodegenerativos en adultos.

Anteriormente se describieron asociaciones significativas entre la reactividad de los anticuerpos plasmáticos al tejido cerebral fetal humano entre las madres de niños con un TEA. Véanse, la Patente de los Estados Unidos n.° 7.452.681, los documentos WO 2006/121912 y US 2009/074667. En una cohorte de casos de control de madres de niños con TEA, madres de niños con desarrollo normal y madres de niños sin TEA con retraso del desarrollo (DD, por sus siglas en inglés), se demostró una asociación significativa entre la inmunorreactividad de IgG a las bandas de proteínas en 37 kD y 73 kD. Asimismo, se observó una razón de probabilidades de 5,69 para la banda en 37 kD solo. Véanse, Braunschweig et al., Neurotoxicology. (2008) 29(2):226-31.

Las anomalías en el entorno inmunitario materno durante el embarazo se han relacionado con el TEA en varios estudios (por ejemplo, Singer et al., J. Neuroimmunology (2008) 194:165-172). El paso facilitado de anticuerpos IgG es un fenómeno bien establecido que, en general, se cree que proporciona protección al recién nacido (Simister et al., Vaccine. (2003) 21(24):3365-9). Sin embargo, junto con anticuerpos IgG que son inmunoprotectores, los autoanticuerpos que reaccionan a las autoproteínas fetales también pueden atravesar la placenta. Un informe reciente demostró la reactividad de los anticuerpos IgG maternos frente a las células de Purkinje de roedores en una madre de varios niños con TEA, así como la presencia de déficits de comportamiento en las crías de un ratón inyectado durante la gestación con su suero (Dalton et al., Ann Neurol. (2003) 53(4):533-7). En otro estudio, se encontró que las madres de niños con autismo y sus hijos afectados tenían patrones consistentes de reactividad de anticuerpos contra proteínas cerebrales prenatales (día 18) de rata. En cambio, los niños no afectados y las madres de control tenían patrones alternativos de reactividad (Zimmerman et al., Brain Behav Immun. (2007) 21(3):351-7).

La preponderancia de la evidencia sugiere una etiología prenatal o postnatal temprana para el autismo, implicando potencialmente señales de desarrollo erróneas. Los avances en la comprensión del papel de los componentes del sistema inmunitario durante el desarrollo neurológico fetal combinados con la comunicación entre los sistemas inmunitarios materno y fetal, llevó, a los inventores de la presente invención, a investigar los perfiles de reactividad de autoanticuerpos en madres de niños con autismo y compararlos con perfiles de madres de niños con desarrollo normal y de madres de niños con otros trastornos del desarrollo excluyendo el autismo.

Breve sumario de la invención

En una realización, la presente invención proporciona un método para determinar el riesgo de una descendencia humana de padecer un trastorno del espectro autista (TEA) que comprende identificar en una muestra biológica de la madre o de la posible madre de la descendencia la presencia de anticuerpos maternos que se unen a un biomarcador proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1, por sus siglas en inglés), en donde la presencia de anticuerpos maternos que se unen al biomarcador CRMP1 indica un mayor riesgo de que la descendencia padezca un TEA. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además identificar en una muestra biológica de la madre 0 de la posible madre de la descendencia la presencia de anticuerpos maternos que se unen a uno o más biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en una guanina desaminasa (GDA), una lactato deshidrogenasa (LDH), una proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2), una fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1) y una proteína 1 de unión a caja Y (YBX1), en donde la presencia de anticuerpos maternos que se unen al uno o más biomarcadores indica un mayor riesgo de que la descendencia padezca un TEA. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además detectar la presencia de anticuerpos maternos que se unen a uno o más biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en una subunidad alfa de la proteína Cap Z de unión al extremo barbado de actina (CAPZA2), un factor 1A1 de elongación y traducción eucariota (EEF1A1), una proteína Tau asociada a microtúbulos (MAPT), una proteína 1 similar a la dinamina (DNM1L), una radixina (RDX), una moesina (MSN) y una ezrina (EZR).

También se describen métodos en donde, se determina la presencia de anticuerpos maternos que se unen a uno, dos, tres o todos los biomarcadores seleccionados de lactato deshidrogenasa (LDH), guanina desaminasa (GDA), proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1). En algunos aspectos, se determina la presencia de anticuerpos maternos que se unen a uno, dos o todos los biomarcadores seleccionados de lactato deshidrogenasa desaminasa (GDA), proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1). En algunos aspectos, se determina la presencia de anticuerpos maternos que se unen a uno, dos o todos los biomarcadores seleccionados de guanina desaminasa (GDA), proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1). En algunos aspectos, se determina la presencia de anticuerpos maternos que se unen a una o ambas de lactato deshidrogenasa (LDH) y proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1). En algunos aspectos, se determina la presencia de anticuerpos maternos que se unen a una o ambas de guanina desaminasa (GDA) y proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1). En algunos aspectos, se determina la presencia de anticuerpos maternos que se unen a una o ambas de lactato deshidrogenasa (LDH) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1). En algunos aspectos, se determina la presencia de anticuerpos maternos que se unen a una o ambas de guanina desaminasa (GDA) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1). En algunos aspectos, se determina la presencia de anticuerpos maternos que se unen a la lactato deshidrogenasa (LDH). En algunos aspectos, se determina la presencia de anticuerpos maternos que se unen a la guanina desaminasa (GDA). En algunas realizaciones, se determina la presencia de anticuerpos maternos que se unen a la proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1). En algunos aspectos, se determina la presencia de anticuerpos maternos que se unen a la fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1).

En algunos aspectos, se determina la presencia de anticuerpos maternos que se unen a uno, dos, tres o todos los biomarcadores seleccionados de lactato deshidrogenasa (LDH), guanina desaminasa (GDA), proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1). En algunos aspectos, se determina la presencia de anticuerpos maternos que se unen a uno, dos o todos los biomarcadores seleccionados de lactato deshidrogenasa (LDH), proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1). En algunos aspectos, se determina la presencia de anticuerpos maternos que se unen a uno, dos o todos los biomarcadores seleccionados de guanina desaminasa (GDA), proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1). En algunos aspectos, se determina la presencia de anticuerpos maternos que se unen a una o ambas de lactato deshidrogenasa (LDH) y proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2). En algunos aspectos, se determina la presencia de anticuerpos maternos que se unen a una o ambas de guanina desaminasa (GDA) y proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2). En algunos aspectos, se determina la presencia de anticuerpos maternos que se unen a la proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2).

También se describen en el presente documento métodos para determinar el riesgo para una descendencia, p. ej., feto o niño, de padecer un trastorno del espectro autista (TEA) o para determinar el riesgo de que una madre o una posible madre tenga un hijo que padecerá un trastorno del espectro autista (TEA) identificando en una muestra biológica de la madre de la descendencia la presencia de anticuerpos maternos que se unen a una o más proteínas seleccionadas del grupo que consiste en la proteína 1 de unión a nucleótidos de guanina, gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa, proteína de protección terminal con caperuza de actina F, subunidad alfa-2, uracilo ADN glicosilasa y glutamato deshidrogenasa, en donde la presencia de anticuerpos maternos que se unen a una o más proteínas indica un mayor riesgo de que la descendencia padezca un TEA. La determinación de la presencia de anticuerpos maternos contra una o más proteínas seleccionadas del grupo que consiste en la proteína 1 de unión a nucleótidos de guanina, gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa, proteína de protección terminal con caperuza de actina F, subunidad alfa-2, uracilo ADN glicosilasa se puede realizar junto con o de manera independiente de la determinación de anticuerpos maternos contra el uno o más biomarcadores descritos en el presente documento.

En algunas realizaciones, los métodos para determinar el riesgo de que una descendencia humana padezca un TEA comprenden poner en contacto la muestra biológica con una proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1) sintética o recombinante y uno o más polipéptidos sintéticos o recombinantes seleccionados del grupo que consiste en una guanina desaminasa ( GDA), una lactato deshidrogenasa (LDH), una proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2), una fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1) y una proteína 1 de unión a caja Y (YBX1). El polipéptido o fragmento antigénico del mismo de uno o más biomarcadores puede unirse a un soporte sólido, incluyendo, sin limitación, una placa de múltiples pocillos, una placa ELISA, un chip de micromatrices, una perla, una tira porosa, una membrana de nitrocelulosa.

También se describen métodos en donde la muestra biológica de la madre o de la posible madre se pone en contacto con un polipéptido o fragmento antigénico del mismo o un mimótopo de uno, dos, tres o todos los biomarcadores seleccionados de lactato deshidrogenasa (LDH), guanina desaminasa (GDA), proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1). En algunos aspectos, la muestra biológica de la madre o de la posible madre se pone en contacto con un polipéptido o fragmento antigénico del mismo o un mimótopo de uno, dos o todos los biomarcadores seleccionados de lactato deshidrogenasa (LDH), proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1). En algunos aspectos, la muestra biológica de la madre o de la posible madre se pone en contacto con un polipéptido o fragmento antigénico del mismo o un mimótopo de uno, dos o todos los biomarcadores seleccionados de guanina desaminasa (GDA), proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1). En algunos aspectos, la muestra biológica de la madre o de la posible madre se pone en contacto con un polipéptido o fragmento antigénico del mismo o un mimótopo de una o ambas de lactato deshidrogenasa (LDH) y proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1). En algunos aspectos, la muestra biológica de la madre o de la posible madre se pone en contacto con un polipéptido o fragmento antigénico del mismo o un mimótopo de una o ambas de guanina desaminasa (GDA) y proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1). En algunos aspectos, la muestra biológica de la madre o de la posible madre se pone en contacto con un polipéptido o fragmento antigénico del mismo o un mimótopo de una o ambas de lactato deshidrogenasa (LDH) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1). En algunos aspectos, la muestra biológica de la madre o de la posible madre se pone en contacto con un polipéptido o fragmento antigénico del mismo o un mimótopo de una o ambas de guanina desaminasa (GDA) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1). En algunos aspectos, la muestra biológica de la madre o de la posible madre se pone en contacto con un polipéptido o fragmento antigénico del mismo o un mimótopo de lactato deshidrogenasa (LDH). En algunos aspectos, la muestra biológica de la madre o de la posible madre se pone en contacto con un polipéptido o fragmento antigénico del mismo o un mimótopo de guanina desaminasa (GDA). En algunos aspectos, la muestra biológica de la madre o de la posible madre se pone en contacto con un polipéptido o fragmento antigénico del mismo o un mimótopo de la proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1). En algunos aspectos, la muestra biológica de la madre o de la posible madre se pone en contacto con un polipéptido o fragmento antigénico del mismo o un mimótopo de fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1).

En algunos aspectos, la muestra biológica de la madre o de la posible madre se pone en contacto con un polipéptido 0 fragmento antigénico del mismo o un mimótopo de uno, dos, tres o todos los biomarcadores seleccionados de lactato deshidrogenasa (LDH), guanina desaminasa (GDA), proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1). En algunos aspectos, la muestra biológica de la madre o de la posible madre se pone en contacto con un polipéptido o fragmento antigénico del mismo o un mimótopo de uno, dos o todos los biomarcadores seleccionados de lactato deshidrogenasa (LDH), proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1). En algunos aspectos, la muestra biológica de la madre o de la posible madre se pone en contacto con un polipéptido o fragmento antigénico del mismo o un mimótopo de uno, dos o todos los biomarcadores seleccionados de guanina desaminasa (GDA), proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1). En algunos aspectos, la muestra biológica de la madre o de la posible madre se pone en contacto con un polipéptido o fragmento antigénico del mismo o un mimótopo de una o ambas de lactato deshidrogenasa (LDH) y proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2). En algunos aspectos, la muestra biológica de la madre o de la posible madre se pone en contacto con un polipéptido o fragmento antigénico del mismo o un mimótopo de una o ambas de guanina desaminasa (GDA) y proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2). En algunos aspectos, la muestra biológica de la madre o de la posible madre se pone en contacto con un polipéptido o fragmento antigénico del mismo o un mimótopo de proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2).

En algunas realizaciones, la lactato deshidrogenasa es la subunidad LDH-A, es decir, está codificada por el gen LDHA humano. En algunas realizaciones, la lactato deshidrogenasa es la subunidad LDH-B, es decir, está codificada por el gen LDHB humano. En algunas realizaciones, la lactato deshidrogenasa son las subunidades tanto LDH-A como LDH-B. En algunos aspectos, la lactato deshidrogenasa es un tetrámero compuesto por cuatro subunidades LDH-A o cuatro subunidades LDH-B. En algunos aspectos, la lactato deshidrogenasa es un tetrámero compuesto por combinaciones de subunidades LDH-A y LDH-B. En algunos aspectos, la LDH es LDH humana.

En algunas realizaciones, la descendencia es un recién nacido (es decir, un recién nacido de hasta cuatro semanas de edad). En algunas realizaciones, la descendencia es un feto. En algunas realizaciones, el feto se gesta en la madre. La muestra biológica se puede tomar de la madre en cualquier momento durante el embarazo. La muestra biológica se puede tomar después de que el cerebro fetal haya comenzado a desarrollarse, p. ej., después de la 12a semana de gestación. La muestra biológica se puede tomar durante el segundo trimestre del embarazo. La muestra biológica se puede tomar durante el tercer trimestre del embarazo.

En algunas realizaciones, el feto aún no está concebido. La muestra biológica se puede tomar de cualquier mujer en edad fértil, antes o después de la concepción del feto o después del nacimiento del niño.

En algunos aspectos, la muestra biológica de la madre se selecciona del grupo que consiste en sangre, suero, plasma, líquido amniótico, leche y saliva.

En algunos aspectos, la madre tiene un hijo con TEA. En algunos aspectos, la madre tiene antecedentes familiares de TEA. En algunos aspectos, la madre tiene antecedentes familiares de enfermedad autoinmunitaria.

En algunas realizaciones, la madre es humana.

En algunos aspectos, se detectan los anticuerpos que se unen a uno o más biomarcadores descritos en el presente documento o un fragmento de los mismos, p. ej., mediante transferencia western, transferencia puntual, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas ("ELISA", por sus siglas en inglés), radioinmunoensayo ("RIA", por sus siglas en inglés), inmunoprecipitación, electroquimioluminiscencia, micromatrices o un ensayo basado en múltiples perlas (por ejemplo, un ensayo de perlas Luminex o perlas fluorescentes).

En un aspecto adicional, la invención proporciona uno o más agentes que bloquean la unión de anticuerpos maternos a uno o más biomarcadores fetales que comprenden la proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1), para su uso en un método para prevenir o reducir el riesgo de que un feto padezca un t Ea mediante la administración de dicho uno o más agentes a la madre, en donde dichos uno o más agentes son polipéptidos del uno o más biomarcadores fetales o un fragmento antigénico de los mismos. En algunas realizaciones, el uno o más agentes comprenden además uno o más agentes que bloquean la unión de anticuerpos maternos a uno o más biomarcadores fetales seleccionados del grupo que consiste en lactato deshidrogenasa (LDH), guanina desaminasa (GDA), fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1), subunidad alfa de la proteína Cap Z de unión al extremo barbado de actina (CAPZA2), proteína 1 de unión a caja Y (YBX1), factor 1A1 de elongación y traducción eucariota (EEF1A1), proteína Tau asociada a microtúbulos (MAPT), proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2), proteína similar a dinamina 1 (DNM1L), radixina (RDX), moesina (MSN) y ezrina (EZR, en donde dichos uno o más agentes son polipéptidos del uno o más biomarcadores fetales o un fragmento antigénico de los mismos.

En algunos aspectos, el uno o más agentes bloquean la unión de anticuerpos maternos a uno, dos, tres o todos los biomarcadores seleccionados de lactato deshidrogenasa (LDH), guanina desaminasa (GDA), proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1). En algunos aspectos, el uno o más agentes bloquean la unión de anticuerpos maternos a uno, dos o todos los biomarcadores seleccionados de lactato deshidrogenasa (LDH), proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1). En algunos aspectos, el uno o más agentes bloquean la unión de anticuerpos maternos a uno, dos 0 todos los biomarcadores seleccionados de guanina desaminasa (GDA), proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1). En algunos aspectos, el uno o más agentes bloquean la unión de anticuerpos maternos a una o ambas de lactato deshidrogenasa (LDH) y proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1). En algunos aspectos, el uno o más agentes bloquean la unión de anticuerpos maternos a una o ambas de guanina desaminasa (GDA) y proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1). En algunos aspectos, el uno o más agentes bloquean la unión de anticuerpos maternos a una o ambas de lactato deshidrogenasa (LDH) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1). En algunos aspectos, el uno o más agentes bloquean la unión de anticuerpos maternos a una o ambas de guanina desaminasa (GDA) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1). En algunos aspectos, se administra el uno o más agentes que bloquean la unión de anticuerpos maternos a la lactato deshidrogenasa (LDH). En algunos aspectos, se administra el uno o más agentes que bloquean la unión de anticuerpos maternos a la guanina desaminasa (GDA). En algunos aspectos, se administra el uno o más agentes que bloquean la unión de anticuerpos maternos a la proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1). En algunos aspectos, el uno o más agentes bloquean la unión de anticuerpos maternos a la fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1).

En algunos aspectos, el uno o más agentes bloquean la unión de anticuerpos maternos a uno, dos, tres o todos los biomarcadores seleccionados de lactato deshidrogenasa (LDH), guanina desaminasa (GDA), proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1). En algunos aspectos, el uno o más agentes bloquean la unión de anticuerpos maternos a uno, dos o todos los biomarcadores seleccionados de lactato deshidrogenasa (LDH), proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1). En algunos aspectos, el uno o más agentes bloquean la unión de anticuerpos maternos a uno, dos o todos los biomarcadores seleccionados de guanina desaminasa (GDA), proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1). En algunos aspectos, el uno o más agentes bloquean la unión de anticuerpos maternos a una o ambas de lactato deshidrogenasa (LDH) y proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2). En algunos aspectos, el uno o más agentes bloquean la unión de anticuerpos maternos a una o ambas de guanina desaminasa (GDA) y proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2). En algunos aspectos, el uno o más agentes bloquean la unión de anticuerpos maternos a la proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2).

En algunas realizaciones, el agente es un polipéptido del biomarcador o un fragmento antigénico del mismo.

En algunos aspectos, los anticuerpos maternos se unen al menos a una de LDH-A y LDH-B, p. ej., ya sea como subunidades o como tetrámeros.

También se describen métodos para prevenir o reducir el riesgo de que un feto padezca un TEA que comprenden administrar a la madre del feto un agente que bloquea la unión de anticuerpos maternos a una o más proteínas fetales seleccionadas del grupo que consiste en proteína 1 de unión a nucleótidos de guanina, gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa, proteína de protección terminal con caperuza de actina F, subunidad alfa-2, uracilo ADN glicosilasa y glutamato deshidrogenasa, por lo que el bloqueo de la unión a una o más proteínas fetales de los anticuerpos maternos previene o reduce el riesgo de que el feto padezca un TEA. El bloqueo de la unión de anticuerpos maternos contra una o más proteínas fetales seleccionadas del grupo que consiste en proteína 1 de unión a nucleótidos de guanina, gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa, proteína de protección terminal con caperuza de actina F, subunidad alfa-2, uracilo ADN glicosilasa se puede realizar junto con o de manera independiente del boqueo de la unión de anticuerpos maternos contra el uno o más biomarcadores descritos en el presente documento.

En algunos aspectos, el agente se administra por vía intravenosa. En algunos aspectos, el agente se administra por vía oral.

El agente de bloqueo se puede administrar a la madre en cualquier momento durante el embarazo. El agente de bloqueo se puede administrar después de que el cerebro fetal haya comenzado a desarrollarse, p. ej., después de la 12a semana de gestación. El agente de bloqueo se puede administrar durante el segundo trimestre del embarazo. El agente de bloqueo se puede administrar durante el tercer trimestre del embarazo. El agente de bloqueo se puede administrar durante 4, 8, 12, 16, 20, 24 semanas, según sea necesario.

En un aspecto relacionado, la invención proporciona un método ex vivo de tratamiento del plasma de la madre de un feto que padece un TEA que comprende eliminar los anticuerpos que se unen al biomarcador fetal proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1) del plasma de la madre del feto. También se describen métodos para prevenir o reducir el riesgo de que un feto padezca un TEA que comprenden eliminar los anticuerpos que se unen a uno o más biomarcadores fetales seleccionados del grupo que consiste en lactato deshidrogenasa (LDH), guanina desaminasa (GDA), proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1), fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1), subunidad alfa de la proteína Cap Z de unión al extremo barbado de actina (CAPZA2), proteína 1 de unión a caja Y (YBX1), factor 1A1 de elongación y traducción eucariota (EEF1A1), proteína Tau asociada a microtúbulos (MAPT), proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2), proteína similar a dinamina 1 (DNM1L), radixina (RDX), moesina (MSN) y ezrina (EZR, de la madre del feto.

En algunos aspectos, se eliminan los anticuerpos que se unen a uno, dos, tres o todos los biomarcadores seleccionados de lactato deshidrogenasa (LDH), guanina desaminasa (GDA), proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1). En algunos aspectos, se eliminan los anticuerpos que se unen a uno, dos o todos los biomarcadores seleccionados de lactato deshidrogenasa (LDH), proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1). En algunos aspectos, se eliminan los anticuerpos que se unen a uno, dos o todos los biomarcadores seleccionados de guanina desaminasa (GDA), proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1). En algunos aspectos, se eliminan los anticuerpos que se unen a una o ambas de lactato deshidrogenasa (LDH) y proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1). En algunos aspectos, se eliminan los anticuerpos que se unen a una o ambas de guanina desaminasa (GDA) y proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1). En algunos aspectos, se eliminan los anticuerpos que se unen a una o ambas de lactato deshidrogenasa (LDH) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1). En algunos aspectos, se eliminan los anticuerpos que se unen a una o ambas de guanina desaminasa (GDA) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1). En algunos aspectos, se eliminan los anticuerpos que se unen a lactato deshidrogenasa (LDH). En algunos aspectos, se eliminan los anticuerpos que se unen a guanina desaminasa (GDA). En algunos aspectos, se eliminan los anticuerpos que se unen a proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1). En algunos aspectos, se eliminan los anticuerpos que se unen a fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1).

En algunos aspectos, se eliminan los anticuerpos que se unen a uno, dos, tres o todos los biomarcadores seleccionados de lactato deshidrogenasa (LDH), guanina desaminasa (GDA), proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1). En algunos aspectos, se eliminan los anticuerpos que se unen a uno, dos o todos los biomarcadores seleccionados de lactato deshidrogenasa (LDH), proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1). En algunos aspectos, se eliminan los anticuerpos que se unen a uno, dos o todos los biomarcadores seleccionados de guanina desaminasa (GDA), proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1). En algunos aspectos, se eliminan los anticuerpos que se unen a una o ambas de lactato deshidrogenasa (LDH) y proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2). En algunos aspectos, se eliminan los anticuerpos que se unen a una o ambas de guanina desaminasa (GDA) y proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2). En algunos aspectos, se eliminan los anticuerpos que se unen a la proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2).

En un aspecto relacionado, también se divulgan en el presente documento métodos para prevenir o reducir el riesgo de que un feto padezca un TEA que comprenden eliminar los anticuerpos que se unen a una o más proteínas fetales seleccionadas del grupo que consiste en proteína 1 de unión a nucleótidos de guanina, gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa, proteína de protección terminal con caperuza de actina F, subunidad alfa-2, uracilo ADN glicosilasa y glutamato deshidrogenasa de la madre del feto. La eliminación de anticuerpos maternos contra una o más proteínas fetales seleccionadas del grupo que consiste en proteína 1 de unión a nucleótidos de guanina, gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa, proteína de protección terminal con caperuza de actina F, subunidad alfa-2, uracilo ADN glicosilasa y glutamato deshidrogenasa se pueden realizar junto con o de manera independiente de la eliminación de la unión de los anticuerpos maternos contra el uno o más biomarcadores descritos en el presente documento.

En algunos aspectos, los anticuerpos que se unen a uno o más biomarcadores se eliminan de la sangre, suero, plasma o leche.

En algunos aspectos, los anticuerpos que se unen a uno o más biomarcadores se eliminan del plasma mediante plasmaféresis.

En algunos aspectos, la sangre, suero, plasma o leche de la madre se pone en contacto con uno o más polipéptidos, fragmentos antigénicos de los mismo o mimótopos de los mismos de uno o más biomarcadores fetales seleccionados del grupo que consiste en lactato deshidrogenasa (LDH), guanina desaminasa (GDA), proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1), fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1), subunidad alfa de la proteína Cap Z de unión al extremo barbado de actina (CAPZA2), proteína 1 de unión a caja Y (YBX1), factor 1A1 de elongación y traducción eucariota (EEF1A1), proteína Tau asociada a microtúbulos (MAPT), proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2), proteína similar a dinamina 1 (DNM1L), radixina (RDX), moesina (MSN) y ezrina (EZR, unidos a un soporte sólido. En algunos aspectos, la sangre, suero, plasma o leche de la madre se pone en contacto con uno o más mimótopos de uno o más biomarcadores unidos a un soporte sólido.

En algunos aspectos, los polipéptidos o fragmentos antigénicos de los mismos, de uno, dos, tres o todos los biomarcadores seleccionados de lactato deshidrogenasa (LDH), guanina desaminasa (GDA), proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1) se unen a un soporte sólido y se ponen en contacto con sangre, suero, plasma o leche de la madre. En algunos aspectos, los polipéptidos, fragmentos antigénicos de los mismos o mimótopos de los mismos de uno, dos o todos los biomarcadores seleccionados de lactato deshidrogenasa (LDH), proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1) se unen a un soporte sólido y se ponen en contacto con sangre, suero, plasma o leche de la madre. En algunos aspectos, los polipéptidos, fragmentos antigénicos de los mismos o mimótopos de los mismos de uno, dos 0 todos los biomarcadores seleccionados de guanina desaminasa (GDA), proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1) se unen a un soporte sólido y se ponen en contacto con sangre, suero, plasma o leche de la madre. En algunos aspectos, los polipéptidos, fragmentos antigénicos de los mismos o mimótopos de los mismos de una o ambas de lactato deshidrogenasa (LDH) y proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1) se unen a un soporte sólido y se ponen en contacto con sangre, suero, plasma o leche de la madre. En algunos aspectos, los polipéptidos, fragmentos antigénicos de los mismos o mimótopos de los mismos de una o ambas de guanina desaminasa (GDA) y proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1) se unen a un soporte sólido y se ponen en contacto con sangre, suero, plasma o leche de la madre. En algunos aspectos, los polipéptidos, fragmentos antigénicos de los mismos o mimótopos de los mismos de una o ambas de lactato deshidrogenasa (LDH) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1) se unen a un soporte sólido y se ponen en contacto con sangre, suero, plasma o leche de la madre. En algunos aspectos, los polipéptidos, fragmentos antigénicos de los mismos o mimótopos de los mismos de una o ambas de guanina desaminasa (GDA) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1) se unen a un soporte sólido y se ponen en contacto con sangre, suero, plasma o leche de la madre. En algunos aspectos, los polipéptidos, fragmentos antigénicos de los mismos o mimótopos de los mismos de lactato deshidrogenasa (LDH) se unen a un soporte sólido y se ponen en contacto con sangre, suero, plasma o leche de la madre. En algunos aspectos, los polipéptidos, fragmentos antigénicos de los mismos o mimótopos de los mismos de guanina desaminasa (GDA) se unen a un soporte sólido y se ponen en contacto con sangre, suero, plasma o leche de la madre. En algunos aspectos, los polipéptidos, fragmentos antigénicos de los mismos o mimótopos de los mismos de la proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1) se unen a un soporte sólido y se ponen en contacto con sangre, suero, plasma o leche de la madre. En algunos aspectos, los polipéptidos, fragmentos antigénicos de los mismos o mimótopos de los mismos de fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1) se unen a un soporte sólido y se ponen en contacto con sangre, suero, plasma o leche de la madre.

En algunos aspectos, los polipéptidos, fragmentos antigénicos de los mismos o mimótopos de los mismos de uno, dos, tres o todos los biomarcadores seleccionados de lactato deshidrogenasa (LDH), guanina desaminasa (GDA), proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1) se unen a un soporte sólido y se ponen en contacto con sangre, suero, plasma o leche de la madre. En algunos aspectos, los polipéptidos, fragmentos antigénicos de los mismos o mimótopos de los mismos de uno, dos o todos los biomarcadores seleccionados de lactato deshidrogenasa (LDH), proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1) se unen a un soporte sólido y se ponen en contacto con sangre, suero, plasma o leche de la madre. En algunos aspectos, los polipéptidos, fragmentos antigénicos de los mismos o mimótopos de los mismos de uno, dos o todos los biomarcadores seleccionados de guanina desaminasa (GDA), proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1) se unen a un soporte sólido y se ponen en contacto con sangre, suero, plasma o leche de la madre. En algunos aspectos, los polipéptidos, fragmentos antigénicos de los mismos o mimótopos de los mismos de una o ambas de lactato deshidrogenasa (LDH) y proteína similar a dihidropirimidinasa 2 (DPYSL2) se unen a un soporte sólido y se ponen en contacto con sangre, suero, plasma o leche de la madre. En algunos aspectos, los polipéptidos, fragmentos antigénicos de los mismos o mimótopos de los mismos de una o ambas de guanina desaminasa (GDA) y proteína similar a dihidropirimidinasa 2 (DPYSL2) se unen a un soporte sólido y se ponen en contacto con sangre, suero, plasma o leche de la madre. En algunos aspectos, los polipéptidos, fragmentos antigénicos de los mismos o mimótopos de los mismos de proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2) se unen a un soporte sólido y se ponen en contacto con sangre, suero, plasma o leche de la madre.

En algunos aspectos, la LDH es al menos una de LDH-A y LDH-B.

Los anticuerpos que se unen a uno o más biomarcadores descritos en el presente documento pueden eliminarse de la madre en cualquier momento durante el embarazo. Los anticuerpos que se unen a uno o más biomarcadores descritos en el presente documento pueden eliminarse después de que el cerebro fetal haya comenzado a desarrollarse, p. ej., después de la 12a semana de gestación. Los anticuerpos que se unen a uno o más biomarcadores descritos en el presente documento pueden eliminarse durante el segundo trimestre del embarazo. Los anticuerpos que se unen a uno o más biomarcadores descritos en el presente documento pueden eliminarse durante el tercer trimestre del embarazo. Los anticuerpos que se unen a uno o más biomarcadores descritos en el presente documento pueden eliminarse durante 4, 8, 12, 16, 20, 24 semanas, según sea necesario.

En el presente documento se describen realizaciones adicionales de la invención.

Definiciones

A menos que definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la materia a la que pertenece la presente invención. Generalmente, la nomenclatura utilizada en el presente documento y los procedimientos de laboratorio en cultivo celular, genética molecular, química orgánica y química e hibridación de ácidos nucleicos descritos a continuación, son los bien conocidos y comúnmente empleados en la técnica. Para la síntesis de ácidos nucleicos y péptidos se utilizan técnicas convencionales. Generalmente, las reacciones enzimáticas y las etapas de purificación se realizan de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Las técnicas y procedimientos se realizan generalmente de acuerdo con métodos convencionales de la técnica y varias referencias generales (véanse, en general Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3a ed. (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. y Ausubel, ed., Current Protocols in Molecular Biology, 1990-2008, John Wiley Interscience), que se proporcionan a lo largo del presente documento. La nomenclatura utilizada en el presente documento y los procedimientos de laboratorio en química analítica y síntesis orgánica descritos a continuación son los bien conocidos y comúnmente empleados en la técnica. Se utilizan técnicas convencionales o modificaciones de las mismas, para síntesis químicas y análisis químicos.

Las expresiones "trastorno del espectro del autismo", "trastorno del espectro autista", "autismo" o "TEA" se refieren indistintamente a un espectro de trastornos del neurodesarrollo que se caracterizan por una interacción y comunicación social deteriorada acompañada de un comportamiento repetitivo y estereotipado. El autismo incluye un espectro de interacción social y comunicación deterioradas, sin embargo, el trastorno se puede clasificar aproximadamente en "autismo de alto funcionamiento" o "autismo de bajo funcionamiento", dependiendo del grado de deterioro de la interacción social y de la comunicación. Las personas diagnosticadas con "autismo de alto funcionamiento" tienen una interacción social y deficiencias de comunicación mínimas pero identificables (es decir, Síndrome de Asperger). Se puede encontrar información adicional sobre los trastornos del espectro autista en, por ejemplo, Autism Spectrum Disorders: A Research Review for Practitioners, Ozonoff, et al., eds., 2003, American Psychiatric Pub; Gupta, Autistic Spectrum Disorders in Children, 2004, Marcel Dekker Inc; Hollander, Autism Spectrum Disorders, 2003, Marcel Dekker Inc; Handbook of Autism and Developmental Disorders, Volkmar, ed., 2005, John Wiley; Sicile-Kira y Grandin, Autism Spectrum Disorders: The Complete Guide to Understanding Autism, Asperger's Syndrome, Pervasive Developmental Disorder, and Other ASDs, 2004, Perigee Trade; y Duncan, et al., Autism Spectrum Disorders [Two Volumes]: A Handbook for Parents and Professionals, 2007, Praeger.

Las expresiones "lactato deshidrogenasa" o "LDH" se refieren indistintamente a una enzima que cataliza la interconversión de piruvato y lactato con la interconversión concomitante de NADH y NAD+. Las lactato deshidrogenasas existen en cuatro clases distintas de enzimas. Dos de ellas son enzimas dependientes del citocromo c y cada una actúa sobre D-lactato (EC 1.1.2.4) o L-lactato (EC 1.1.2.3). Las otras dos son enzimas dependientes de nA d (P) y cada una actúa sobre D-lactato (EC 1.1.1.28) o L-lactato (EC 1.1.1.27). La enzima LDH está compuesta de 4 subunidades, en donde las subunidades son "M" o "H". El gen LDHA codifica la subunidad M, conocida indistintamente como LDH-M o LDH-A. El gen LDHB codifica la subunidad H, conocida indistintamente como LDH-H o LDH-B. Hay cinco isoenzimas de LDH, conteniendo cada una cuatro subunidades. La isoenzima de LDH principal del músculo esquelético y el hígado, LDH-5 (M4), tiene cuatro subunidades de músculo (M); mientras que la LDH-1 (H4) es la principal isoenzima del músculo cardíaco en la mayoría de las especies, conteniendo 4 subunidades de corazón (H). Las otras variantes contienen ambos tipos de subunidades, p. ej., LDH-2 (H3M1) - en el sistema reticuloendotelial, LDH-3 (H2M2) - en los pulmones y LDH-4 (H1M3) - en los riñones. LDH-2 es la forma predominante en el suero. La LDHA también se conoce como LDH1, La subunidad de músculo de LDH, LDH-M, EC 1.1.1.27, antígeno de carcinoma renal NY-REN-59, proteína del gen 19 inductor de la proliferación celular, PIG19 y cadena A de L-lactato deshidrogenasa; LDHB también se conoce como LDH2 o LDH-H o TRG-5; LDHC es específica de testículo.

Estructuralmente, una secuencia de aminoácidos de LDH-A tiene al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos, p. ej., de n.° de registro de GenBank AAP36496.1; BAD96798.1; NM_005566.3 ^ NP 005557.1 (isoforma 1);NM_001135239.1 ^ NP 001128711.1 (isoforma 2); NM_001165414.1 ^ NP 001158886.1 (isoforma 3); NM_001165415.1 ^ NP 001158887.1 (isoforma 4); o NM_001165416.1 ^ NP 001158888.1 (isoforma 5) en una longitud de secuencia de al menos 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 aminoácidos o en la longitud completa del polipéptido. Estructuralmente, una secuencia de un ácido nucleico de LDH-A tiene al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia del ácido nucleico, p. ej., de n.° de registro de GenBank BC067223; CR604911; BC051361; X02152.1; NM 005566.3 ^ NP_005557.1 (isoforma 1); NM 001135239.1 ^ NP_001128711.1 (isoforma 2); NM 001165414.1 ^ NP_001158886.1 (isoforma 3); NM 001165415.1 ^ NP_001158887.1 (isoforma 4); o NM 001165416.1 ^ NP_001158888.1 (isoforma 5) en una longitud de secuencia de al menos 300, 500, 750, 1000 ácidos nucleicos o en la longitud completa del polinucleótido. Las alineaciones de secuencia se pueden realizar utilizando cualquier algoritmo de alineación conocido en la técnica, p. ej., BLAST, ALIGN, establecidos en la configuración predeterminada.

Estructuralmente, una secuencia de aminoácidos de LDH-B tiene al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos, p. ej., de n.° de registro de GenBank no. NM_002300.6 ^ NP 002291.1 (variante 1); o NM_001174097.1 ^ NP 001167568.1 (variante 2) en una longitud de secuencia de al menos 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 aminoácidos o en la longitud completa del polipéptido. Estructuralmente, una secuencia de un ácido nucleico de LDH-B tiene al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia del ácido nucleico, p. ej., de n.° de registro de GenBank BC002361.1; Y00711.1; NM 002300.6 ^ NP_002291.1 (variante 1); o NM 001174097.1 ^ NP_001167568.1 (variante 2) en una longitud de secuencia de al menos 300, 500, 750, 1000 ácidos nucleicos o en toda la longitud del polinucleótido. Las alineaciones de secuencia se pueden realizar utilizando cualquier algoritmo de alineación conocido en la técnica, p. ej., BLAST, ALIGN, establecidos en la configuración predeterminada.

Las expresiones "proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina" o "CRMP1" (también conocida como DRP1; DRP-1; CRMP-1; DPYSL1; ULIP-3) se refieren a una fosfoproteína citosólica que se sabe que actúa en la diferenciación neuronal y en el guiado axonal. CRMP1 es un miembro de una familia de fosfoproteínas citosólicas expresadas exclusivamente en el sistema nervioso. Se cree que la proteína codificada es parte de la vía de transducción de señales de semaforina implicada en el colapso del cono de crecimiento inducido por semaforina durante el desarrollo neural. El corte y empalme alternativo da como resultado múltiples variantes de transcritos. Estructuralmente, una secuencia de aminoácidos de CRMP1 tiene al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos, p. ej., de n.° de registro de GenBank. NM_001014809.1 ^ NP 001014809.1 (isoforma 1) o NM_001313.3 ^ NP 001304.1 (isoforma 2), en una longitud de secuencia de al menos 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 aminoácidos o en la longitud completa del polipéptido. Estructuralmente, una secuencia de un ácido nucleico de CRMP1 tiene al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia del ácido nucleico, p. ej., de n.° de registro de GenBank NM 001014809.1 ^ NP_001014809.1 (isoforma 1) o NM 001313.3 ^ NP_001304.1 (isoforma 2), en una longitud de secuencia de al menos 300, 500, 750, 1000 ácidos nucleicos o en la longitud completa del polinucleótido. Las alineaciones de secuencia se pueden realizar utilizando cualquier algoritmo de alineación conocido en la técnica, p. ej., BLAST, ALIGN, establecidos en la configuración predeterminada.

Las expresiones "fosfoproteína 1 inducida por estrés" o "STIP1" (también conocida como proteína organizadora de Hsp70/Hsp90 (HOP1), STI1, STIL1, IEF-SSP-3521 y P60) se refiere a una proteína adaptadora que ayuda en el plegamiento de HSP70 y HSP90. STIP1 también estimula la actividad ATPasa de HSP70, mientras inhibe la actividad ATPasa de HSP90, sugiriendo un papel regulador. Asimismo, STIP1 se une a la proteína priónica celular PrPc y regula la consolidación de la memoria a corto y largo plazo. Estructuralmente, una secuencia de aminoácidos de STlP1 tiene al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos, p. ej., de n.° de registro de GenBank NM_006819.2 ^ NP 006810.1, en una longitud de secuencia de al menos 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 aminoácidos o en la longitud completa del polipéptido. Estructuralmente, una secuencia de un ácido nucleico de STIP1 tiene al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia del ácido nucleico, p. ej., de n.° de registro de GenBank NM 006819.2 ^ NP_006810.1, en una longitud de secuencia de al menos 300, 500, 750, 1000 ácidos nucleicos o en la longitud completa del polinucleótido. Las alineaciones de secuencia se pueden realizar utilizando cualquier algoritmo de alineación conocido en la técnica, p. ej., BLAST, ALIGN, establecidos en la configuración predeterminada.

Las expresiones "guanina desaminasa" y "GDA" (también conocida como cipina, guanasa, KIAA1258, MGC9982 y nedasina) se refiere a una enzima que cataliza la desaminación hidrolítica de la guanina, produciendo xantina y amoniaco. También se ha demostrado que la GDA regula el direccionamiento postsináptico de PSD-95. Estructuralmente, una secuencia de aminoácidos de GDA tiene al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos, p. ej., de n.° de registro de GenBank NM_004293.3 ^ NP 004284.1, en una longitud de secuencia de al menos 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 aminoácidos o en la longitud completa del polipéptido. Estructuralmente, una secuencia de un ácido nucleico de GDA tiene al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia del ácido nucleico, p. ej., de n.° de registro de GenBank NM 004293.3 ^ NP_004284.1, en una longitud de secuencia de al menos 300, 500, 750, 1000 ácidos nucleicos o en la longitud completa del polinucleótido. Las alineaciones de secuencia se pueden realizar utilizando cualquier algoritmo de alineación conocido en la técnica, p. ej., BLAST, ALIGN, establecidos en la configuración predeterminada.

Las expresiones "proteína 2 similar a dihidropirimidinasa" o "DPYSL2" (también conocida como CRMP-2 o CRMP2) se refieren a una proteína implicada en el guiado axonal mediando el efecto repulsivo de Sema3A en los axones durante la especificación axonal. Estructuralmente, una secuencia de aminoácidos de DPYSL2 tiene al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos, p. ej., de n.° de registro de GenBank NM_001386.4 ^ NP 001377.1 o BAD92432, en una longitud de secuencia de al menos 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 aminoácidos o en la longitud completa del polipéptido. Estructuralmente, una secuencia de un ácido nucleico de DPYSL2 tiene al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia del ácido nucleico, p. ej., de n.° de registro de GenBank NM 001386.4 ^ NP_001377.1, en una longitud de secuencia de al menos 300, 500, 750, 1000 ácidos nucleicos o en la longitud completa del polinucleótido. Las alineaciones de secuencia se pueden realizar utilizando cualquier algoritmo de alineación conocido en la técnica, p. ej., BLAST, ALIGN, establecidos en la configuración predeterminada.

Las expresiones "subunidad alfa de la proteína Cap Z de unión al extremo barbado de actina" o "proteína de protección terminal con caperuza (filamento de actina) en la línea Z del músculo, alfa 2 "o" CAPZA2 "(también conocida como CAPPA2, CAPZ) se refieren a un miembro de la familia de la subunidad alfa de las proteínas de protección terminal con caperuza de F-actina. CAPZA2 es la subunidad alfa de la proteína Cap Z de unión al extremo barbado de actina. Al proteger terminalmente con caperuza el extremo barbado de los filamentos de actina, Cap Z regula el crecimiento de los filamentos de actina en el extremo barbado. Estructuralmente, una secuencia de aminoácidos de CAPZA2 tiene al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos, p. ej., de n.° de registro de GenBank NM_006136.2 ^ NP 006127.1, en una longitud de secuencia de al menos 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 aminoácidos o en la longitud completa del polipéptido. Estructuralmente, una secuencia de un ácido nucleico de CAPZA2 tiene al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia del ácido nucleico, p. ej., de n.° de registro de GenBank NM 006136.2 ^ NP_006127.1, en una longitud de secuencia de al menos 300, 500, 750, 1000 ácidos nucleicos o en la longitud completa del polinucleótido. Las alineaciones de secuencia se pueden realizar utilizando cualquier algoritmo de alineación conocido en la técnica, p. ej., BLAST, ALIGN, establecidos en la configuración predeterminada.

Las expresiones "proteína 1 de unión a caja Y" o "YBX1" (también conocida como BP-8, CSDA2, CSDB, DBPB, MDR-NF1, MGC104858, MGC110976, MGC117250, NSEP-1, NSEP1, YB-1 e YB1) se refiere a una proteína que media en la regulación del corte y empalme alternativo de pre-ARNm. YBX1 se une a los sitios de corte y empalme en el pre-ARNm y regula la selección del sitio de corte y empalme; se une y estabiliza el ARNm citoplásmico; contribuye a la regulación de la traducción modulando la interacción entre el ARNm y los factores de iniciación eucariotas; se une a los promotores que contienen una caja Y (5-CTGATTGGCCAA-3'), p. ej., que se encuentra en genes HLA de clase II; y promueve la separación de cadenas de ADN que contienen desapareamientos o están modificadas por cisplatino. Estructuralmente, una secuencia de aminoácidos de YBX1 tiene al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos, p. ej., de n.° de registro de GenBank NM_004559.3 ^ NP 004550.2, en una longitud de secuencia de al menos 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 aminoácidos o en la longitud completa del polipéptido. Estructuralmente, una secuencia de un ácido nucleico de YBX1 tiene al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia del ácido nucleico, p. ej., de n.° de registro de GenBank NM 004559.3 ^ NP_004550.2, en una longitud de secuencia de al menos 300, 500, 750, 1000 ácidos nucleicos o en la longitud completa del polinucleótido. Las alineaciones de secuencia se pueden realizar utilizando cualquier algoritmo de alineación conocido en la técnica, p. ej., BLAST, ALIGN, establecidos en la configuración predeterminada.

Las expresiones "factor 1A1 de elongación y traducción eucariota" y "EEF1A1" se refieren a una isoforma de la subunidad alfa del complejo factor 1 de elongación que transporta los aminoacil ARNt al ribosoma. La isoforma 1A1 se expresa en el cerebro, placenta, pulmón, hígado y páncreas y es un autoantígeno en el 66 % de los casos de síndrome de Felty. El síndrome de Felty se caracteriza por una combinación de artritis reumatoide, esplenomegalia y neutropenia. Estructuralmente, una secuencia de aminoácidos de EEF1A1 tiene al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos, p. ej., de n.° de registro de GenBank NM_001402.5 ^ NP 001393.1, en una longitud de secuencia de al menos 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 aminoácidos o en la longitud completa del polipéptido. Estructuralmente, una secuencia de un ácido nucleico de EEF1A1 tiene al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia del ácido nucleico, p. ej., de n.° de registro de GenBank NM 001402.5 ^ NP_001393.1, en una longitud de secuencia de al menos 300, 500, 750, 1000 ácidos nucleicos o en la longitud completa del polinucleótido. Las alineaciones de secuencia se pueden realizar utilizando cualquier algoritmo de alineación conocido en la técnica, p. ej., BLAST, ALIGN, establecidos en la configuración predeterminada.

Las expresiones "proteína Tau asociada a microtúbulos" y "MAPT" (también conocida como DDPAC, FLJ31424, MAPTL, MGC138549, MSTD, MTBT1, MTBT2, PPND y TAU) se refieren a una proteína cuya transcripción experimenta un corte y empalme regulado alternativo complejo que da lugar a una variedad de diferentes transcritos de ARNm de MAPT que se encuentran en las neuronas según el estado de maduración y el tipo de neurona. Las mutaciones o variantes de corte y empalme perjudiciales están asociadas con enfermedades neurodegenerativas, incluida la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Pick, demencia frontotemporal, degeneración corticobasal y parálisis supranuclear progresiva. Estructuralmente, una secuencia de aminoácidos de MAPT tiene al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos, p. ej., de n.° de registro de GenBank NM_016835.4 ^ NP 058519.3 (isoforma 1); NM_005910.5 ^ NP 005901.2 (isoforma 2); NM_016834.4 ^ NP 058518.1 (isoforma 3); NM_016841.4 ^ NP 058525.1 (isoforma 4); NM_001123067.3 ^ NP 001116539.1 (isoforma 5); o NM_001123066.3 ^ NP 001116538.2 (isoforma 6), en una longitud de secuencia de al menos 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 aminoácidos o en la longitud completa del polipéptido. Estructuralmente, una secuencia de un ácido nucleico de MAPT tiene al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia del ácido nucleico, p. ej., de n.° de registro de GenBank NM 016835.4 ^ NP_058519.3 (isoforma 1); NM 005910.5 ^ NP_005901.2 (isoforma 2); NM 016834.4 ^ NP_058518.1 (isoforma 3); NM 016841.4 ^ NP_058525.1 (isoforma 4); NM 001123067.3 ^ NP_001116539.1 (isoforma 5); o NM 001123066.3 ^ NP_001116538.2 (isoforma 6), en una longitud de secuencia de al menos 300, 500, 750, 1000 ácidos nucleicos o en la longitud completa del polinucleótido. Las alineaciones de secuencia se pueden realizar utilizando cualquier algoritmo de alineación conocido en la técnica, p. ej., BLAST, ALIGN, establecidos en la configuración predeterminada.

Las expresiones "proteína similar a dinamina 1" y "DNM1L" (también conocida como DLP1, DRP1, DVLP, DYMPLE, HDYNIV y VPS1) se refieren a un miembro de la familia dinamina de GTPasas que desempeña un papel en la regulación de la morfología mitocondrial controlando las distribuciones de los túbulos mitocondriales en el citoplasma. El gen DNM1L produce tres variantes cortadas y empalmadas de manera alternativa que están poliadeniladas de manera alternativa. Estructuralmente, una secuencia de aminoácidos de DNM1L tiene al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos, p. ej., de n.° de registro de GenBank NM_012062.3 ^ NP 036192.2 (isoforma 1); NM_012063.2 ^ NP 036193.2 (isoforma 2); NM_005690.3 ^ NP 005681.2 (isoforma 3), en una longitud de secuencia de al menos 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 aminoácidos o en la longitud completa del polipéptido. Estructuralmente, una secuencia de un ácido nucleico de DNM1L tiene al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia del ácido nucleico, p. ej., de n.° de registro de GenBank NM 012062.3 ^ NP_036192.2 (isoforma 1); NM 012063.2 ^ NP_036193.2 (isoforma 2); NM 005690.3 ^ NP_005681.2 (isoforma 3), en una longitud de secuencia de al menos 300, 500, 750, 1000 ácidos nucleicos o en la longitud completa del polinucleótido. Las alineaciones de secuencia se pueden realizar utilizando cualquier algoritmo de alineación conocido en la técnica, p. ej., BLAST, ALIGN, establecidos en la configuración predeterminada

Las expresiones "neurofilamento, polipéptido ligero "y" NEFL "(también conocido como CMT1F, CMT2E, NF-L y NFL) se refieren a heteropolímeros de filamentos intermedios de tipo IV compuestos de cadenas ligeras, medianas y pesadas. NEFL es un componente del axoesqueleto y actúa para mantener la morfología neuronal y puede desempeñar un papel en el transporte intracelular a axones y dendritas. Las mutaciones en NEFL causan enfermedades de Charcot-Marie-Tooth de tipos IF (CMT1F) y 2E (CMT2E), ambos trastornos del sistema nervioso periférico. NEFL también se ha asociado con la enfermedad de Parkinson y la esclerosis lateral amiotrófica (ELA). Estructuralmente, una secuencia de aminoácidos de NEFL tiene al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos, p. ej., de n.° de registro de GenBank NM_006158.3 ^ NP 006149.2, en una longitud de secuencia de al menos 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 aminoácidos o en la longitud completa del polipéptido. Estructuralmente, una secuencia de un ácido nucleico de NEFL tiene al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia del ácido nucleico, p. ej., de n.° de registro de GenBank NM 006158.3 ^ NP_006149.2, en una longitud de secuencia de al menos 300, 500, 750, 1000 ácidos nucleicos o en la longitud completa del polinucleótido. Las alineaciones de secuencia se pueden realizar utilizando cualquier algoritmo de alineación conocido en la técnica, p. ej., BLAST, ALIGN, establecidos en la configuración predeterminada.

Los términos "radixina" o "RDX" (también conocida como DFNB24) se refieren a una proteína citoesquelética implicada en la unión de la actina a la membrana plasmática. RDX tiene una alta identidad de secuencia con ezrina y moesina. Estructuralmente, una secuencia de aminoácidos de RDX tiene al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos, p. ej., de n.° de registro de GenBank NM_002906.3 ^ NP 002897.1, en una longitud de secuencia de al menos 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 aminoácidos o en la longitud completa del polipéptido. Estructuralmente, una secuencia de un ácido nucleico de RDX tiene al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia del ácido nucleico, p. ej., de n.° de registro de GenBank NM 002906.3 ^ NP_002897.1, en una longitud de secuencia de al menos 300, 500, 750, 1000 ácidos nucleicos o en la longitud completa del polinucleótido. Las alineaciones de secuencia se pueden realizar utilizando cualquier algoritmo de alineación conocido en la técnica, p. ej., BLAST, ALIGN, establecidos en la configuración predeterminada.

Las expresiones "moesina" y "MSN" y "proteína espiga de extensión organizadora de la membrana" se refieren a un miembro de la familia ERM que incluye ezrina y radixina. Las proteínas ERM actúan como reticuladores entre las membranas plasmáticas y los citoesqueletos basados en actina. La moesina se localiza en filopodios y otras protuberancias membranosas que son importantes para el reconocimiento y señalización de células celulares y para el movimiento celular. Estructuralmente, una secuencia de aminoácidos de MSN tiene al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos, p. ej., de n.° de registro de GenBank NM_002444.2 ^ NP 002435.1, en una longitud de secuencia de al menos 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 aminoácidos o en la longitud completa del polipéptido. Estructuralmente, una secuencia de un ácido nucleico de MSN tiene al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia del ácido nucleico, p. ej., de n.° de registro de GenBank NM 002444.2 ^ NP_002435.1, en una longitud de secuencia de al menos 300, 500, 750, 1000 ácidos nucleicos o en la longitud completa del polinucleótido. Las alineaciones de secuencia se pueden realizar utilizando cualquier algoritmo de alineación conocido en la técnica, p. ej., BLAST, ALIGN, establecidos en la configuración predeterminada.

Los términos "ezrina" y "EZR" (también conocida como CVL; CVIL; VIL2; MGC1584; FLJ26216; DKFZp762H157) se refieren a una proteína de membrana periférica citoplasmática que actúa como un sustrato de proteínas tirosina cinasa en microvellosidades. Como miembro de la familia de la proteína ERM, esta proteína sirve como intermediario entre la membrana plasmática y el citoesqueleto de actina. La proteína EZR desempeña un papel en la adhesión, migración y organización de la estructura de la superficie celular y ha estado implicada en diversos cánceres humanos. Estructuralmente, una secuencia de aminoácidos de EZR tiene al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos, p. ej., de n.° de registro de GenBank NM_003379.4 ^ NP 003370.2 (isoforma 1) o NM_001111077.1 ^ NP 001104547.1 (isoforma 2), en una longitud de secuencia de al menos 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 aminoácidos o en la longitud completa del polipéptido. Estructuralmente, una secuencia de un ácido nucleico de EZR tiene al menos aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia del ácido nucleico, p. ej., de n.° de registro de GenBank NM 003379.4 ^ NP_003370.2 (isoforma 1) o NM 001111077.1 ^ NP_001104547.1 (isoforma 2), en una longitud de secuencia de al menos 300, 500, 750, 1000 ácidos nucleicos o en la longitud completa del polinucleótido. Las alineaciones de secuencia se pueden realizar utilizando cualquier algoritmo de alineación conocido en la técnica, p. ej., BLAST, ALIGN, establecidos en la configuración predeterminada.

El término "aislado", cuando se aplica a un ácido nucleico o proteína, indica que el ácido nucleico o la proteína están esencialmente libres de otros componentes celulares con los que están asociados en su estado natural. Preferentemente se encuentra en un estado homogéneo. Puede estar en una solución seca o acuosa. La pureza y la homogeneidad se suelen determinar usando técnicas de química analítica, tales como electroforesis en gel de poliacrilamida o cromatografía de líquidos de alto rendimiento. Un proteína que es la especie predominante presente en una preparación está sustancialmente purificada. En particular, un gen aislado se separa de los marcos de lectura abiertos que flanquean el gen y codifican una proteína distinta del gen de interés. El término "purificado/a" indica que un ácido nucleico o proteína da lugar esencialmente a una banda en un gel electroforético. De manera particular, significa que el ácido nucleico o la proteína es al menos 85 % puro, más preferentemente al menos 95 % puro y lo más preferentemente al menos 99 % puro.

La expresión "ácido nucleico" o "polinucleótido" se refiere a un ácidos desoxirribonucleicos (ADN) o ácidos ribonucleicos (ARN) y polímeros de los mismos en forma mono- o bicatenaria. A menos que esté específicamente limitado, el término abarca ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de unión similares al ácido nucleico de referencia y se metabolizan de manera similar a los nucleótidos de origen natural. A menos que se indique lo contrario, una secuencia particular del ácido nucleico también abarca implícitamente variantes modificadas de manera conservativa de la misma (por ejemplo, sustituciones de codones degenerados), alelos, ortólogos, SNP y secuencias complementarias, así como la secuencia explícitamente indicada. Específicamente, las sustituciones de codones degenerados pueden lograrse mediante la generación de secuencias en las que la tercera posición de uno o más (o todos) codones seleccionados se sustituyen con restos de base mixta y/o de desoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); y Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a un polímero de restos de aminoácidos o un ensamblaje de múltiples polímeros de restos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en donde uno o más restos de aminoácidos son un mimético químico artificial de un aminoácido correspondiente de origen natural, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural y a polímeros de aminoácidos de origen no natural.

El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos de origen natural y sintéticos, así como a análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que actúan de manera similar a la de los aminoácidos de origen natural. Los aminoácidos de origen natural son los codificados por el código genético, así como aquellos aminoácidos que se modifican posteriormente, p. ej., hidroxiprolina, Y-carboxiglutamato y O-fosfoserina. Análogos de aminoácidos se refieren a los compuestos que tienen la misma estructura química básica que la de un aminoácido de origen natural, es decir, un carbono a que está unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, p. ej., homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metil sulfonio de metionina. Dichos análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o cadenas principales peptídicas modificadas, pero conservan la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural. Miméticos de aminoácidos se refiere a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que actúan de manera similar a un aminoácido de origen natural.

La expresión "variantes modificadas de forma conservativa" se aplica a secuencias tanto de aminoácidos como del ácido nucleico. Con respecto a secuencias de los ácidos nucleicos concretas, las variantes modificadas de forma conservativa se refieren a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas o si el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, a dos secuencias esencialmente idénticas. A causa de la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos diferentes puede codificar cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican, todos ellos, el aminoácido alanina. Por lo tanto, en cada posición donde una alanina se especifica mediante un codón, el codón puede alterarse a cualquiera de los codones descritos correspondientes sin alterar el polipéptido codificado. Dichas variaciones de ácido nucleico son "variaciones silenciosas", que son un tipo de variaciones modificadas de manera conservativa. Cada secuencia de un ácido nucleico en el presente documento que codifica un polipéptido también describe todas y cada una de las posibles variaciones silenciosas del ácido nucleico. Un experto reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que normalmente es el único codón para metionina, y TGG, que normalmente es el único codón para triptófano) puede modificarse para producir una molécula funcionalmente idéntica. En consecuencia, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita.

Como en las secuencias de aminoácidos, un experto reconocerá que las sustituciones, eliminaciones o adiciones individuales a una secuencia de un ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína que altera, añade o elimina un único aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante modificada de manera conservativa" donde la alteración da como resultado la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustituciones conservativas que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Dichas variantes modificadas de manera conservativa son adicionales a, y no excluyen, las variantes polimórficas, homólogos interespecíficos y alelos de la invención.

Los ocho grupos siguientes contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí:

1) alanina (A), glicina (G);

2) ácido aspártico (D), ácido glutámico (E);

3) asparagina (N), glutamina (Q);

4) arginina (R), lisina (K);

5) isoleucina (I), leucina (L), metionina (M), valina (V);

6) fenilalanina (F), tirosina (Y), triptófano (W);

7) serina (S), treonina (T); y

8) cisteína (C), metionina (M) (véase, p.ej, Creighton, Proteins (1984)).

El "porcentaje de identidad de secuencia" se determina al comparar dos secuencias alineadas de manera óptima a lo largo de una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia (por ejemplo, un polipéptido de la invención), que no incluye adiciones o eliminaciones, para una alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las cuales se encuentran las bases de ácidos nucleicos o los restos de aminoácidos idénticos en ambas secuencias para producir el número de posiciones apareadas, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia.

Las expresiones "idéntico" o porcentaje de "identidad", en el contexto de dos o más secuencias de los ácidos nucleicos o polipéptidos, ser refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son las mismas secuencias. Dos secuencias son "sustancialmente idénticas" si dos secuencias tienen un porcentaje específico de restos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales (es decir, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad en una región especificada o, cuando no se especifica, en toda la secuencia de una secuencia de referencia), cuando se compara y alinea para correspondencia máxima en una ventana de comparación o región designada como medida utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o mediante alineación manual e inspección visual. La invención proporciona polipéptidos o polinucleótidos que son sustancialmente idénticos a los polipéptidos o polinucleótidos, respectivamente, ejemplificados en el presente documento (por ejemplo, un biomarcador seleccionado del grupo que consiste en lactato deshidrogenasa (LDH), guanina desaminasa (GDA), proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1), fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1), subunidad alfa de la proteína Cap Z de unión al extremo barbado de actina (CAPZA2), proteína 1 de unión a caja Y (YBX1), factor 1A1 de elongación y traducción eucariota (EEF1A1), proteína Tau asociada a microtúbulos (MAPT), proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2), proteína similar a dinamina 1 (DNM1L), radixina (RDX), moesina (MSN) y ezrina (EZR), y fragmentos antigénicos de los mismos). Opcionalmente, la identidad existe en una región que tiene al menos aproximadamente 15, 25 o 50 nucleótidos de longitud o más preferentemente en una región que tiene de 100 a 500 o 1000 o más nucleótidos de longitud o en la longitud completa de la secuencia de referencia. Con respecto a las secuencias de aminoácidos, la identidad o identidad sustancial puede existir en una región que tiene al menos 5, 10, 15 o 20 aminoácidos de longitud, opcionalmente, al menos aproximadamente 25, 30, 35, 40, 50, 75 o 100 aminoácidos de longitud, opcionalmente, al menos aproximadamente 150, 200 o 250 aminoácidos de longitud o en toda la longitud de la secuencia de referencia. Con respecto a las secuencias de aminoácidos más cortas, p. ej., secuencias de aminoácidos de 20 o menos aminoácidos, existe una identidad sustancial cuando uno o dos restos de aminoácidos están sustituidos de forma conservativa, de acuerdo con las sustituciones conservativas definidas en el presente documento.

Para la comparación de secuencias, normalmente una secuencia actúa como secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y de referencia se introducen en un ordenador, se designan las coordenadas de subsecuencia, si fuera necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de secuencias. Se pueden usar los parámetros predeterminados del programa o se pueden designar parámetros alternativos. A continuación, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad de secuencia para las secuencias de prueba respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa.

Una "ventana de comparación", como se usa en el presente documento, incluye la referencia a un segmento de una cualquiera del número de posiciones contiguas seleccionadas del grupo que consiste en de 20 a 600, habitualmente, de aproximadamente 50 a aproximadamente 200, más habitualmente, de aproximadamente 100 a aproximadamente 150 en el que se puede comparar una secuencia con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas una vez alineadas las dos secuencias de manera óptima. Se conocen bien en la técnica procedimientos de alineación de secuencias para comparación. La alineación óptima de secuencias para la comparación puede realizarse, p. ej., mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c, mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, mediante implementaciones informatizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete informático de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) o mediante alineación manual e inspección visual (véase, p. ej., Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)).

Dos ejemplos de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLASt 2.0, que se describen en Altschul et al. (1977) Nuc. Acids Res.

25:3389-3402 y Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, respectivamente. El programa informático para realizar análisis de BLAST está disponible públicamente a través del National Center for Biotechnology Information. Este algoritmo implica identificar en primer lugar pares de secuencias de alta puntuación (HSP, por sus siglas en inglés) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que coincide o satisface algún valor umbral de valor positivo T cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T se refiere al umbral de la puntuación de palabra vecina (Altschul et al. supra). Estos aciertos de palabra vecina iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP más largas que los contengan. Los aciertos de palabra se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia todo el tiempo que pueda aumentarse la puntuación de alineación acumulativa. Los valores acumulativos se calculan usando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de restos coincidentes; siempre > 0) y N (puntuación de penalización para restos no coincidentes; siempre < 0). Para las secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de valores para calcular la puntuación acumulativa. La prolongación de los aciertos de palabra en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineación acumulativa se sitúa fuera por una cantidad X de su valor máximo conseguido; la puntuación acumulativa llega a cero o por debajo, debido a la acumulación de una o más alineaciones de restos con valor negativo; o se alcanza el final de una de las secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLASTn (para secuencias de nucleótidos) usa como valores predeterminados una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) o 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa como valores predeterminados una longitud de palabra de 3, y una expectativa (E) de 10 y las alineaciones (B) de la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:10915) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N =-4 y una comparación de ambas cadenas.

El algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, p.ej, Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787). Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la que se produciría una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos por casualidad. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es menos de aproximadamente 0,2, más preferentemente menos de aproximadamente 0,01 y, lo más preferentemente, menos de aproximadamente 0,001.

Una indicación de que dos secuencias de unos ácidos nucleicos o polipéptidos son sustancialmente idénticas es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico es inmunitariamente reactivo con los anticuerpos generados contra el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, como se describe a continuación. Por lo tanto, normalmente un polipéptido es sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos difieren solamente por sustituciones conservativas. Otra indicación de que dos secuencias de unos ácidos nucleicos son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas o sus complementos se hibridan entre sí en condiciones estrictas, como se describe a continuación. Otra indicación más de que dos secuencias de unos ácidos nucleicos son sustancialmente idénticas es que pueden usarse los mismos cebadores para amplificar la secuencia.

La expresión "fragmento antigénico" se refiere a una subsecuencia contigua de un polipéptido que se une a un anticuerpo. Un fragmento antigénico puede ser inmunogénico o no, es decir, puede inducir o no una respuesta inmunitaria.

La expresión "fragmento antigénico conformacional" se refiere a una región espacialmente contigua de un polipéptido o tetrámero que puede estar formada o no por una subsecuencia contigua. Un fragmento antigénico conformacional puede ser inmunogénico o no.

El término "epítopo"o "determinante antigénico" se refiere a un sitio en un polipéptido al que responden linfocitos B y/o T. Los epítopos de linfocitos B pueden formarse tanto a partir de aminoácidos contiguos como a partir de aminoácidos no contiguos yuxtapuestos mediante el plegamiento terciario o cuaternario de una proteína. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos normalmente se conservan frente a la exposición a disolventes desnaturalizantes mientras que los epítopos formados por el plegamiento terciario o cuaternario (es decir, determinados de manera conformacional) normalmente se pierden en el tratamiento con disolventes desnaturalizantes. Un epítopo normalmente incluye al menos 3, y más habitualmente, al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única. Los métodos para determinar la conformación espacial de los epítopos incluyen, por ejemplo, cristalografía de rayos x y resonancia magnética nuclear en 2 dimensiones. Véase, p. ej., Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996). Los anticuerpos que reconocen el mismo epítopo pueden identificarse en un inmunoensayo sencillo que muestra la capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno diana (p. ej., un ensayo de electroquimioluminiscencia, un ELISA competitivo, un radioinmunoensayo en fase sólida (SPRIA, por sus siglas en inglés) o una transferencia western de bloqueo). Los linfocitos T reconocen epítopos continuos de aproximadamente nueve aminoácidos para las células CD8 o aproximadamente 13-15 aminoácidos para las células CD4. Los linfocitos T que reconocen el epítopo pueden identificarse mediante ensayos in vitro que miden la proliferación dependiente de antígeno, según lo determinado por la incorporación de 3H-timidina por linfocitos T cebados en respuesta a un epítopo (Burke et al., J. Inf. Dis. 170, 1110 19 (1994)), por muerte dependiente de antígeno (ensayo de linfocitos T citotóxicos, Tigges et al., J. Immunol. (1996) 156:3901-3910) o por secreción de citocinas. Los epítopos de la lactato deshidrogenasa específica de testículo humano se han deducido a partir de una secuencia de ADNc. Véase, Millan, et al., Proc. Natl Acad Sci (1987) 84(15):5311-5315.

Las expresiones "se une/n específicamente" o "específicamente dirigido/s contra" se refieren a la asociación preferencial entre receptores de linfocitos T y/o anticuerpos, en su totalidad o en parte, con un polipéptido diana o un fragmento antigénico del mismo en comparación con otros polipéptidos. Se reconoce, por supuesto, que puede producirse un cierto grado de interacción no específica entre un anticuerpo o receptor de linfocitos T y un polipéptido no diana. No obstante, la unión específica, se puede distinguir como mediada por el reconocimiento específico del polipéptido diana o un fragmento antigénico del mismo. Normalmente, la unión específica o una respuesta inmunitaria específicamente dirigida da como resultado una asociación mucho más fuerte entre el polipéptido diana y un anticuerpo contra el polipéptido diana o receptor de linfocitos T que entre un anticuerpo contra el polipéptido diana o receptor de linfocitos T y un polipéptido no diana. La unión específica normalmente da como resultado un aumento de más de aproximadamente 10 veces y más preferentemente de más de 100 veces en la cantidad de anticuerpo unido (por unidad de tiempo) contra el polipéptido diana a una célula o tejido que lleva el polipéptido diana en comparación con una célula o tejido que carece de un epítopo del polipéptido diana. La unión específica entre el polipéptido diana y un anticuerpo contra el polipéptido diana generalmente significa una afinidad de al menos 106 M-1. Se prefieren afinidades mayores de 108 M-1. La unión específica se puede determinar usando cualquier ensayo de unión de anticuerpos conocido en la técnica, incluyendo, sin limitación, transferencia western, transferencia puntual, ELISA, citometría de flujo, electroquimioluminiscencia, ensayo de perlas múltiples (p. ej., utilizando microperlas Luminex o fluorescentes), inmunohistoquímica. Los linfocitos T dirigidos específicamente contra un epítopo de un polipéptido diana normalmente presentan una proliferación inducida por antígeno en respuesta al polipéptido diana que es mayor de aproximadamente 2 veces y más preferentemente mayor de aproximadamente 5 veces o 10 veces que la proliferación inducida por antígeno. proliferación en respuesta a un polipéptido no diana. Los ensayos de proliferación de linfocitos T que se conocen en la técnica se pueden medir mediante incorporación de 3H-timidina.

El término "título", cuando se usa para referirse a anticuerpos maternos que se unen específicamente a un biomarcador diana (por ejemplo, como se describe en el presente documento), indica una medida que combina la concentración y la especificidad de los anticuerpos en la muestra biológica, donde se puede alcanzar un título umbral de anticuerpos contra un biomarcador diana a través de una alta concentración de anticuerpos con una constante de unión o constante de disociación moderada o una concentración más baja de anticuerpos con una constante de unión alta o una constante de disociación baja.

La expresión "mayor riesgo de padecer un TEA" se refiere a una mayor posibilidad o probabilidad de que un feto o niño expuesto a anticuerpos que se unen a uno o más biomarcadores descritos en el presente documento (p.ej., seleccionados de lactato deshidrogenasa (LDH), guanina desaminasa (GDA), proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1), fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1), subunidad alfa de la proteína Cap Z de unión al extremo barbado de actina (CAPZA2), proteína 1 de unión a caja Y (YBX1), factor 1A1 de elongación y traducción eucariota (EEF1A1), proteína Tau asociada a microtúbulos (MAPT), proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2), proteína similar a dinamina 1 (DNM1L), radixina (RDX), moesina (MSN) y ezrina (EZR)) o a niveles de anticuerpos contra el uno o más de los biomarcadores por encima de un nivel de umbral predeterminado padezca síntomas de un TEA en comparación con el riesgo, posibilidad o probabilidad de un feto o niño que no se haya expuesto a anticuerpos contra el uno o más biomarcadores o a niveles de anticuerpos contra el uno o más biomarcadores que estén por debajo de un nivel umbral predeterminado.

La expresión "riesgo reducido de padecer un TEA" se refiere a la menor posibilidad o probabilidad de que un feto o niño expuesto a anticuerpos contra uno o más biomarcadores descritos en el presente documento (p.ej., seleccionados de lactato deshidrogenasa (LDH), guanina desaminasa (GDA), proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1), fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1), subunidad alfa de la proteína Cap Z de unión al extremo barbado de actina (CAPZA2), proteína 1 de unión a caja Y (YBX1), factor 1A1 de elongación y traducción eucariota (EEF1A1), proteína Tau asociada a microtúbulos (MAPT), proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2), proteína similar a dinamina 1 (DNM1L), radixina (RDX), moesina (MSN) y ezrina (EZR)) o a niveles de anticuerpos contra el uno o más de los biomarcadores por encima de un nivel de umbral predeterminado, y cuya madre haya recibido intervención terapéutica, p. ej., para bloquear, inactivar o eliminar los anticuerpos que se unen a los biomarcadores, padezca síntomas de un TEA en comparación con la posibilidad o probabilidad de que un feto o niño expuesto a anticuerpos anti biomarcador o a niveles de anticuerpos contra el uno o más biomarcadores por encima de un nivel de umbral predeterminado y cuya madre no haya recibido intervención terapéutica padezca síntomas de un TEA.

El término "mimótopo" se refiere a péptidos o polipéptidos del uno o más biomarcadores descritos en el presente documento (p. ej., seleccionados de lactato deshidrogenasa (LDH), guanina desaminasa (GDA), proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1), fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1), subunidad alfa de la proteína Cap Z de unión al extremo barbado de actina (CAPZA2), proteína 1 de unión a caja Y (YBX1), factor 1A1 de elongación y traducción eucariota (EEF1A1), proteína Tau asociada a microtúbulos (MAPT), proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2), proteína similar a dinamina 1 (DNM1L), radixina (RDX), moesina (MSN) y ezrina (EZR)) que imitan un epítopo (p. ej., unido por un anticuerpo contra el biomarcador), aunque puede que no exista una homología clara entre la estructura o secuencia de tales mimótopos y el epítopo del antígeno natural (p. ej., el uno o más biomarcadores descritos en el presente documento). En cambio, el mimetismo de un mimótopo se basa en similitudes en las propiedades fisicoquímicas y en una organización espacial similar. La exploración y la construcción de mimótopos se conocen en la técnica. Por ejemplo, los mimótopos pueden obtenerse de epítopos conocidos mediante modificación de secuencia o crearse de novo utilizando bibliotecas de péptidos combinatorias para péptidos, p. ej., que se unen a anticuerpos contra el uno o más biomarcadores. Véanse, p. ej., Yip y Ward, Comb Chem High Throughput Screen (1999) 2(3): 125-128; Sharav, et al, Vaccine (2007) 25(16):3032-37; y Knittelfelder, et al., Expert Opin Biol Ther (2009) 9(4):493-506.

La expresión "antecedentes familiares" se refiere a la presencia de una patología (por ejemplo, un TEA o una enfermedad autoinmunitaria) en un miembro de la familia. El miembro de la familia puede ser de linaje directo, p. ej., un padre, un hijo o un abuelo o un pariente cercano, p. ej., un hermano, una tía o un tío, un primo. Normalmente, el miembro de la familia es un pariente consanguíneo con una herencia genética común.

La expresión "cantidad terapéuticamente aceptable" o "dosis terapéuticamente eficaz" se refiere indistintamente a una cantidad suficiente para lograr el resultado deseado (es decir, una cantidad suficiente de agente para bloquear la unión de anticuerpos contra el biomarcador al biomarcador diana), sin efectos secundarios o con efectos secundarios mínimos. En algunos aspectos, una cantidad terapéuticamente aceptable no induce ni provoca efectos secundarios indeseables. Se puede determinar una cantidad terapéuticamente aceptable administrando primero una dosis baja y después aumentando gradualmente esa dosis hasta que se logre el efecto deseado. Una "dosis profilácticamente eficaz" y una "dosis terapéuticamente eficaz", de un agente de bloqueo de anticuerpos antibiomarcador de la invención puede prevenir la aparición de o dar como resultado una disminución en la gravedad de, respectivamente, un TEA. Una "dosis profilácticamente eficaz" y una "dosis terapéuticamente eficaz", también puede prevenir o mejorar, respectivamente, el deterioro o discapacidad debidos a los trastornos y enfermedades resultantes de la actividad de los anticuerpos antibiomarcador maternos.

La expresión "inhibe o inhiben específicamente" se refiere a la capacidad de un agente o ligando para inhibir la unión de anticuerpos contra el uno o más biomarcadores (p.ej., seleccionados de lactato deshidrogenasa (LDH), guanina desaminasa (GDA), proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1), fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1), subunidad alfa de la proteína Cap Z de unión al extremo barbado de actina (CAPZA2), proteína 1 de unión a caja Y (YBX1), factor 1A1 de elongación y traducción eucariota (EEF1A1), proteína Tau asociada a microtúbulos (MAPT), proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2), proteína similar a dinamina 1 (DNM1L), radixina (RDX), moesina (MSN) y ezrina (EZR)) a el uno o más biomarcadores. La inhibición específica normalmente da como resultado al menos aproximadamente una inhibición 2 veces mayor que la del fondo, por ejemplo, aproximadamente 10 veces, 20 veces,50 veces mayor que la inhibición de la unión de anticuerpos contra el biomarcador al biomarcador diana, por ejemplo, comparando la unión de los anticuerpos antibiomarcador en ausencia del agente. En algunos aspectos, la unión de los anticuerpos antibiomarcador al biomarcador diana está completamente inhibida. Normalmente, la inhibición específica es una reducción estadísticamente significativa en la unión del anticuerpo antibiomarcador al biomarcador diana (p. ej., p < 0,05) utilizando una prueba estadística adecuada.

El término "agente", como se usa en el presente documento, se refiere a polipéptidos (p. ej., ligandos, anticuerpos), peptidomiméticos, ácidos nucleicos, pequeños compuestos orgánicos y similares.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 ilustra una transferencia con Ponceau y western con Prep Cell. (a) Membrana de nitrocelulosa teñida con ponceau que contiene muestras de cada sexta fracción recogida de la separación de la proteína cerebral fetal de Rhesus con Prep Cell. (b) Transferencias western de las membranas en (a) sondadas con plasma materno reactivo contra antígenos de 37 kDa, 39 kDa y 73 kDa.

La figura 2 ilustra imágenes de transferencia western y gel 2-D. Las fracciones de proteína cerebral fetal de Rhesus (RFB) de las dianas que contienen los anticuerpos maternos se marcaron con fluorescencia y se separaron en geles 2-D. A) Imagen de fluorescencia de proteínas de 37 kD, 39 kD o 73 kD marcadas después de la separación 2-D. B) Imagen quimioluminiscente de transferencia western 2-D sondada con plasma diluido de madres reactivas contra cada uno de los antígenos. Los círculos representan puntos de reactividad entre anticuerpos maternos y antígenos afines en la transferencia 2-D que se utilizaron para guiar la selección de puntos de un gel 2-D duplicado. La figura 3 ilustra una transferencia western de LDH recombinante o purificada. a) Transferencia western representativa de LDH humana purificada sondada con plasma materno diluido 1:400 de AUM (A) o TDM (T). La tira 1 se sonda con anti-LDH humana de cabra diluida 1:2000 y la tira 2 se sonda con anti-LDHB humana de conejo diluida 1:2000. b) Transferencia western de LDHA (A) etiquetada con GST humana recombinante, LDHB (B) etiquetada con GST humana recombinante o la LDH humana natural purificada (Enz) se sondó con plasma materno diluido 1:400, demostrando reactividad variable a las subunidades de LDH.

La figura 4 ilustra una transferencia western representativa que usa eritrocitos humanos purificados que contienen LDHA y B. La LDH que se usó para transferencia western y ELISA se purificó a partir de eritrocitos humanos y contiene las subunidades tanto A como B. Las transferencias western con LDHA o LDHB puras recombinantes demostraron que las madres pueden mostrar reactividad de IgG a una o ambas subunidades.

La figura 5 ilustra una transferencia western representativa que usa eritrocitos humanos purificados que contienen LDHA y B. La LDH que se usó para transferencia western y ELISA se purificó a partir de eritrocitos humanos y contiene las subunidades tanto A como B, que comparten un 90 % de homología de secuencia. Las transferencias western con LDHA o LDHB puras recombinantes demostraron que las madres pueden mostrar reactividad de IgG a una o ambas subunidades. Aproximadamente el 30 % de las madres de niños con autismo son positivas para los anticuerpos que se unen tanto a LDHA como a LDHB o a ambas. Entre las madres positivas, todas reaccionaron a las subunidades tanto A como B.

La figura 6 ilustra una transferencia western representativa de sujetos positivos y negativos que mostraron reactividad a una banda a 39 kDa por transferencia de cerebro de mono fetal. Hay dos proteínas que parecen estar asociadas con el TEA que fueron identificadas por bandas de aproximadamente 39 kDa. Estas fueron guanina desaminasa ("GDA") y proteína 1 de unión a caja Y (YBX1). Todos los individuos positivos a GDA tenían bandas de 39 kDa. Sin embargo, no todos los individuos positivos de 39 kDa eran positivos para GDA. Aproximadamente el 26 % de las madres de niños con autismo son positivas para IgG dirigida a GDA.

La figura 7 ilustra una transferencia western representativa de sujetos positivos y negativos que mostraron reactividad a una banda a 39 kDa por transferencia de cerebro de mono fetal. Todos los individuos positivos a YBX1 tenían bandas a 39 kDa. Sin embargo, no todos los individuos positivos de 39 kDa eran positivos para YBX1. Aproximadamente el 11 % de las madres de niños con autismo son positivas para YBX1. Otras proteínas que tienen un peso molecular aparente de 39 kDa y unidas por anticuerpos maternos incluyen el factor 1A1 de elongación y traducción eucariota ("EEF1A1") y la proteína Tau asociada a microtúbulos ("MAPT").

La figura 8 ilustra una transferencia western representativa de sujetos positivos y negativos que mostraron reactividad a una banda a 73 kDa por transferencia de cerebro de mono fetal. Hay 2 bandas dentro de la región de 73 kDa que, con frecuencia, se ven por análisis de transferencia western del cerebro de mono fetal cuando se tiñen con anticuerpos maternos. Las bandas forman un doblete muy apretado como se ve en el recuadro. Se ha determinado que la banda superior de este doblete es fosfoproteína 1 inducida por estrés ("STIP1"). Se determinó que la banda inferior era la proteína mediadora de respuesta a colapsina 1 ("CRMP1"). Un anticuerpo anti-STIPI positivo de una fuente comercial muestra bandas con un PM aparente de 63 kDa. Aproximadamente el 32 % de las madres de niños con autismo son positivas para anticuerpos contra CRMP1 y aproximadamente el 59 % de las madres de niños con autismo son positivas para anticuerpos contra STIP1.

La figura 9 ilustra una transferencia western representativa de sujetos positivos y negativos que mostraron reactividad a una banda a 73 kDa por transferencia de cerebro de mono fetal. El anticuerpo anti-CRMP1 positivo de una fuente comercial muestra bandas en un PM aparente de 60 kDa y 63 kDa. Otras proteínas que tienen un peso molecular aparente de 73 kDa y unidas por anticuerpos maternos incluyen la proteína 2 similar a dihidropirimidinasa ("DPYSL2"), proteína similar a dinamina 1 ("DNM1L"), neurofilamento, polipéptido ligero ("NEFL") y radixina ("RDX").

La figura 10 ilustra una transferencia western representativa de DPYSL2. Esta banda se encuentra solamente en unos pocos individuos.

La figura 11 ilustra una transferencia western combinada representativa que contiene LDH pura, STIP1 y CRMP1. Las formas purificadas de las proteínas diana se procesaron juntas como sustrato para la transferencia western y se sondaron con varias muestras. El carril uno es un control de anticuerpos secundarios solamente y la banda en la parte inferior de cada tira es IgG humana residual que está presente en la preparación de LDH. Los carriles 2-4 se sondaron con antisueros comerciales de control positivo para las proteínas correspondientes. El carril 5 (AU 153) es el control de plasma positivo que se utilizó para identificar las proteínas diana. Este individuo tiene reactividad para los 3 antígenos, tanto con la transferencia western original de versiones de cerebro de mono fetal en bruto (FMB) como con las más purificadas. El individuo 4618 AU es débilmente positivo para la banda de 37 kDa por FMB y se une principalmente a proteínas con pesos moleculares aparentes de 37 kDa y 73 kDa. El sujeto 4618 también es positivo para GDA (la banda de 39 kDa). También se ilustran aquí varias otras configuraciones de banda.

Descripción detallada

1. Introducción

Los trastornos del espectro autista (TEA) son trastornos graves del neurodesarrollo que afectan hasta a 1 de cada 150 niños. La presencia de anticuerpos IgG maternos con especificidad para proteínas cerebrales fetales humanas con pesos moleculares de aproximadamente 37 kDa, 39 kDa y 73 kDa se ha descrito en un subconjunto de madres de niños con TEA. Véase, p. ej., la patente de los Estados Unidos n.° 7.452.681. La presente invención se basa, en parte, en la identidad de los biomarcadores unidos por anticuerpos maternos que son indicativos de un mayor riesgo de que un feto padezca un TEA. Los biomarcadores con un peso molecular aparente de 37 kDa incluyen la lactato deshidrogenasa (LDH) y la subunidad alfa de la proteína Cap Z de unión al extremo barbado de actina (CAPZA2). Los biomarcadores con un peso molecular aparente de 39 kDa incluyen la guanina desaminasa (GDA), la proteína 1 de unión a caja Y (YBX1), el factor 1A1 de elongación y traducción eucariota (EEF1A1) y la proteína Tau asociada a microtúbulos (MAPT). Los biomarcadores con un peso molecular aparente de 73 kDa incluyen la proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1), la fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1), la proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2), la proteína similar a dinamina 1 (DNM1L), la radixina (RDX), la moesina (MSN)) y la ezrina (EZR). La presencia de anticuerpos maternos contra uno o más de los biomarcadores fetales identificados en una muestra biológica de la madre o de la posible madre es indicativo de un mayor riesgo de que el feto padezca un TEA.

2. Pacientes sujetos a diagnóstico o tratamiento

Los métodos se pueden realizar en cualquier mamífero, por ejemplo, un ser humano, un primate no humano, un mamífero de laboratorio (p. ej., un ratón, una rata, un conejo, un hámster), un mamífero doméstico (p. ej., un gato, un perro) o un mamífero agrícola (p.ej, bovino, ovino, porcino, equino). En algunas realizaciones, el paciente es una mujer y un ser humano.

Cualquier mujer capaz de tener un hijo puede beneficiarse de los métodos de la presente invención. El niño puede ser concebido o no, es decir, la mujer puede estar embarazada, pero no tiene por qué estarlo. En algunos aspectos, la mujer tiene un hijo que es un recién nacido. En algunos aspectos, la mujer está en edad fértil, es decir, ha comenzado a menstruar y no ha llegado a la menopausia.

En algunos aspectos, los métodos de diagnóstico y prevención y/o tratamiento se realizan en una mujer que tiene un feto(es decir, que está embarazada). Los métodos se pueden realizar en cualquier momento durante el embarazo. En algunos aspectos, los métodos de diagnóstico y prevención y/o tratamiento se realizan en una mujer que tiene un feto cuyo cerebro ha comenzado a desarrollarse. Por ejemplo, el feto puede tener alrededor de las 12 semanas de gestación o más. En algunos aspectos, la mujer sometida a tratamiento o diagnóstico se encuentra en el segundo o tercer trimestre de embarazo. En algunos aspectos, la mujer sometida a tratamiento o diagnóstico se encuentra en el primer trimestre de embarazo. En algunos aspectos, la mujer está en el posparto, p. ej., dentro de los 6 meses posteriores al parto. En algunos aspectos, la mujer está en el posparto y amamantando.

Las mujeres que se beneficiarán de los métodos de diagnóstico y prevención y/o tratamiento actuales pueden tener antecedentes familiares de un TEA o una enfermedad autoinmunitaria, pero no es necesario. Por ejemplo, la mujer puede tener un TEA o tener un familiar (p.ej., un padre, un hijo, un abuelo) con un TEA. En algunos aspectos, la mujer padece una enfermedad autoinmunitaria o tiene un familiar (p. ej., un padre, un hijo, un abuelo) que padece una enfermedad autoinmunitaria.

En algunos aspectos, los métodos de diagnóstico o prevención/tratamiento comprenden la etapa de determinar que los métodos de diagnóstico y/o prevención/tratamiento son apropiados para el paciente, p. ej., basándose en antecedentes médicos o antecedentes médicos familiares o estado de embarazo o cualquier otro criterio relevante.

3. Métodos para determinar el riesgo de padecer un trastorno del espectro autista

La presente divulgación proporciona métodos para determinar la probabilidad de que un feto o niño padezca un trastorno del espectro autista (TEA) que comprende identificar en una muestra biológica de la madre del feto o del niño la presencia de anticuerpos maternos que se unen a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o más, de los biomarcadores descritos en el presente documento (p. ej., seleccionados de lactato deshidrogenasa (LDH), guanina desaminasa (GDA), proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1), fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1), subunidad alfa de la proteína Cap Z de unión al extremo barbado de actina (CAPZA2), proteína 1 de unión a caja Y (YBX1), factor 1A1 de elongación y traducción eucariota (EEF1A1), proteína Tau asociada a microtúbulos (MAPT), proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2), proteína similar a dinamina 1 (DNM1L), radixina (RDX), moesina (MSN) y ezrina (EZR), en donde la presencia de anticuerpos maternos que se unen específicamente al uno o más biomarcadores indica una mayor probabilidad de que el feto o niño padezca un TEA.

Con respecto a la muestra biológica tomada de la madre, se puede utilizar cualquier muestra de fluido que contenga anticuerpos. Por ejemplo, la muestra biológica puede ser sangre, suero, plasma, líquido amniótico, orina, leche o saliva. Por supuesto, se pueden evaluar uno o más fluidos corporales diferentes en busca de anticuerpos que se unan específicamente a el uno o más biomarcadores.

La muestra biológica se evalúa para determinar la presencia de anticuerpos que se unen específicamente a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o más, de los biomarcadores (p. ej, seleccionados de lactato deshidrogenasa (LDH), guanina desaminasa (GDA), proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1), fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1), subunidad alfa de la proteína Cap Z de unión al extremo barbado de actina (CAPZA2), proteína 1 de unión a caja Y (YBX1), factor 1A1 de elongación y traducción eucariota (EEF1A1), proteína Tau asociada a microtúbulos (MAPT), proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2), proteína similar a dinamina 1 (DNM1L), radixina (RDX), la moesina (MSN)) y la ezrina (EZR).

En algunas realizaciones, la detección de la presencia de anticuerpos antibiomarcador (frente a la ausencia de detección de anticuerpos antibiomarcador) indica una mayor probabilidad de que el feto tenga o padezca un TEA.

En algunos aspectos, el nivel o título de anticuerpos antibiomarcador en la muestra biológica se compara con un nivel o título umbral. Un nivel o título de anticuerpos antibiomarcador en la muestra biológica que es mayor que el nivel o título umbral indica una mayor probabilidad de que el feto tenga o padezca un TEA. Del mismo modo, un nivel o título de anticuerpos antibiomarcador en la muestra biológica que es menor que el nivel o título umbral no indica una mayor probabilidad (es decir, indica que no hay una mayor probabilidad) de que el feto tenga o padezca un TEA. El nivel o título umbral de anticuerpos antibiomarcador en un fluido biológico particular se puede determinar evaluando los niveles de anticuerpos antibiomarcador en poblaciones de mujeres embarazadas y comparando los niveles o título de antibiomarcadores en el fluido biológico de la madre cuando el niño padecía un TEA y a los niveles o títulos de anticuerpos antibiomarcador en el fluido biológico de la madre cuando el niño no padecía un TEA. Los niveles o título umbral también se pueden determinar en diferentes momentos durante el embarazo, p. ej., cada cuatro semanas, cada dos semanas o cada semana durante la gestación del feto. Los niveles o el título umbral de antibiomarcadores se pueden medir después del nacimiento del niño, p. ej., en las primeras cuatro semanas después del nacimiento y/o mientras la madre está amamantando al niño.

La presencia o ausencia de anticuerpos antibiomarcador o los niveles cuantificados de anticuerpos antibiomarcador se pueden determinar antes, durante o después del embarazo. Cuando se determina durante el embarazo, la detección de anticuerpos antibiomarcador se puede realizar una, dos, tres, cuatro o más veces, según sea apropiado, en cualquier momento durante el embarazo. Por ejemplo, la detección de anticuerpos antibiomarcador se puede realizar en uno o más del primer, segundo y/o tercer trimestre del embarazo. En algunos aspectos, la detección de anticuerpos antibiomarcador se realiza en una muestra biológica de una mujer que tiene un feto cuyo cerebro ha comenzado a desarrollarse, p. ej., después de aproximadamente 12 semanas de gestación. En algunos aspectos, la presencia o ausencia de anticuerpos antibiomarcador o los niveles cuantificados de anticuerpos antibiomarcador se evalúan una o más veces después del parto, p. ej., en las primeras cuatro semanas después del nacimiento y/o mientras la madre está amamantando al niño. En algunos aspectos, la presencia o ausencia de anticuerpos antibiomarcador o los niveles cuantificados de anticuerpos antibiomarcador se evalúan una o más veces antes del embarazo o en cualquier mujer que no esté embarazada.

La presencia de anticuerpos antibiomarcador se puede determinar una vez o más de una vez, según sea necesario o deseado. En algunos aspectos, la presencia o ausencia de anticuerpos antibiomarcador o los niveles cuantificados de anticuerpos antibiomarcador se evalúan cada cuatro semanas, cada dos semanas o cada semana durante el embarazo o con mayor o menor frecuencia, según sea apropiado.

En algunos aspectos, la muestra de prueba se compara con un control. El control puede ser del mismo individuo en un momento diferente. Por ejemplo, la muestra de prueba se puede tomar durante el embarazo y la muestra de control se puede tomar de la misma paciente antes del embarazo. En algunos ejemplos, la muestra de prueba se tomará relativamente más tarde en el término del embarazo y la muestra de control se tomará de la misma paciente antes del término del embarazo. En este caso, si el nivel de anticuerpos antibiomarcador maternos es mayor en la muestra de prueba que en la muestra de control, entonces el feto o niño tiene un mayor riesgo de padecer un TEA. Si se evalúan varias muestras durante el transcurso de un embarazo, los niveles o títulos elevados de anticuerpos antibiomarcador durante el embarazo indican un mayor riesgo de que el feto o niño padezca un TEA. De manera similar, los niveles o títulos ausentes o reducidos de anticuerpos antibiomarcador durante el término del embarazo indican un riesgo bajo o reducido de que el feto o niño padezca un TEA.

El control también puede ser de un individuo diferente con un estado conocido de presencia de anticuerpos antibiomarcador. El control también puede ser un valor calculado de una población de individuos con un estado conocido de la presencia de anticuerpos antibiomarcador. Un control puede ser un control positivo o un control negativo.

En algunos aspectos, el control es un control negativo de otro individuo o de una población de individuos. Si el estado conocido de la muestra de control es negativo para anticuerpos antibiomarcador, entonces, un nivel más alto de anticuerpos antibiomarcador maternos en la muestra de prueba que en la muestra de control negativo indica que el feto o niño tiene un mayor riesgo de padecer un TEA. Un nivel similar de anticuerpos antibiomarcador maternos en la muestra de prueba que en la muestra de control negativo indica que el feto o niño no tiene un mayor riesgo, es decir, tienen un riesgo bajo o reducido, de padecer un TEA.

En algunos aspectos, el control es un control positivo de otro individuo o de una población de individuos o el control refleja un nivel umbral predeterminado de anticuerpos antibiomarcador. Si el estado conocido de la muestra de control es positivo para anticuerpos antibiomarcador, entonces, un nivel similar o más alto de anticuerpos antibiomarcador maternos en la muestra de prueba que en la muestra de control positivo indica que el feto o niño tiene un mayor riesgo de padecer un TEA. Un nivel más bajo de anticuerpos antibiomarcador maternos en la muestra de prueba que en la muestra de control indica que el feto o niño no tiene un mayor riesgo o tienen un riesgo bajo o reducido de padecer un TEA.

Las diferencias entre la muestra o el valor de control y la muestra de prueba solamente necesitan ser suficientes para detectarse. En algunos aspectos, un mayor nivel de anticuerpos antibiomarcador en la muestra de prueba y, por lo tanto, un mayor riesgo de un TEA, se determina cuando los niveles de antibiomarcadores son al menos, p. ej., 10 %, 25 %, 50 %, 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces o más en comparación con un control negativo o medido previamente.

A efectos de diagnosticar la mayor probabilidad de que un feto o niño padezca un TEA, se puede determinar la presencia de anticuerpos maternos contra cualquier subtipo, isoforma o isoenzima de uno o más biomarcadores (p.ej., seleccionados de lactato deshidrogenasa (LDH), guanina desaminasa (GDA), proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1), fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1), subunidad alfa de la proteína Cap Z de unión al extremo barbado de actina (CAPZA2), proteína 1 de unión a caja Y (YBX1), factor 1A1 de elongación y traducción eucariota (EEF1A1), proteína Tau asociada a microtúbulos (MAPT), proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2), proteína similar a dinamina 1 (DNM1L), radixina (RDX), moesina (MSN)) y ezrina (EZR). Por ejemplo, se puede determinar la presencia o ausencia de anticuerpos antibiomarcador o los niveles cuantificados de anticuerpos contra uno o ambos LDH-A y/o LDH-B. En algunos aspectos, se determinan la presencia o ausencia de anticuerpos antibiomarcador o los niveles cuantificados de anticuerpos contra una o más de las isoenzimas LDH-1, LDH-2, l DH-3, LDH-4 y/o LDH-5.

Los anticuerpos antibiomarcador pueden detectarse usando cualquier método conocido en la técnica. Métodos ilustrativos incluyen, sin limitación, transferencia western, transferencia puntual, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), electroquimioluminiscencia, ensayo de perlas múltiples (p. ej., utilizando microperlas Luminex o fluorescentes).

El antígeno puede ser un polipéptido biomarcador o un fragmento antigénico del mismo. El polipéptido biomarcador o el fragmento antigénico puede purificarse o purificarse sustancialmente a partir de una fuente natural o producirse de forma recombinante o sintética. En la técnica se conocen métodos para la producción recombinante de polipéptidos. Véanse, p. ej., Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press; y Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology, 1987-2009, John Wiley Interscience. Como se analiza anteriormente, las secuencias de ADNc de los biomarcadores descritos en el presente documento son conocidas y pueden expresarse de manera recombinante en E. coli. Las secuencias de ADNc de LDH-A y LDH-B son conocidas y se han expresado de forma recombinante en E. coli y se encontró que mantienen las mismas propiedades funcionales y combinatorias que las isoenzimas aisladas de tejido humano. Véase, p. ej., Barstow, et al., Biochim Biophys Acta. (1990): 1087(1):73-9. La identificación de fragmentos antigénicos de un polipéptido también es bien conocida en la técnica. Por ejemplo, se pueden construir fragmentos de longitud parcial de los polipéptidos biomarcadores que tengan al menos 10 aminoácidos de longitud. Se pueden construir péptidos solapantes, p. ej., de 10, 20 o 30 aminoácidos de longitud e identificar los epítopos inmunodominantes de los polipéptidos biomarcadores.

En algunos aspectos, los fragmentos de longitud parcial de los polipéptidos biomarcadores tienen al menos aproximadamente el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % de la longitud total del polipéptido biomarcador. En algunos aspectos, los fragmentos de longitud parcial de los polipéptidos biomarcadores tienen una longitud de aproximadamente 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250 o 300 aminoácidos. Los fragmentos de longitud parcial pueden tener el extremo N o el extremo C del polipéptido biomarcador eliminado o parte tanto del extremo N como del extremo C eliminado. Los fragmentos de longitud parcial de los polipéptidos biomarcadores que se utilizan de forma detectable y específica están unidos por anticuerpos antibiomarcador de una muestra biológica de una madre o posible madre, p. ej., como se detecta por cualquier inmunoensayo. La unión de un polipéptido biomarcador de longitud parcial o fragmento antigénico se puede comparar con la unión del polipéptido biomarcador de longitud completa. El polipéptido biomarcador puede ser de la misma o diferente especie que el paciente, siempre que pueda unirse a los anticuerpos maternos. En algunos aspectos, el polipéptido biomarcador es humano.

En algunos aspectos, el polipéptido biomarcador o fragmento antigénico del mismo tiene al menos aproximadamente un 90 %, 93 %, 95 %, 97 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con un polipéptido biomarcador como se describe en el presente documento, p. ej., con una secuencia de aminoácidos de LDHA de número de registro de GenBank AAP36496.1; BAD96798.1; NP_005557.1 (isoforma 1); NP_001128711.1 (isoforma 2); NP_001158886.1 (isoforma 3); NP_001158887.1 (isoforma 4); o NP_001158888.1 (isoforma 5); con una secuencia de aminoácidos de LDHB de número de registro de GenBank NP_002291.1 (variante 1); o NP_001167568.1 (variante 2); con una secuencia de aminoácidos de CRMP1 de número de registro de GenBank NP_001014809.1 (isoforma 1) o NP_001304.1 (isoforma 2); con una secuencia de aminoácidos de STIP1 de número de registro de GenBank NP_006810.1; con una secuencia de aminoácidos de GDA de número de registro de GenBank NP_004284.1; con una secuencia de aminoácidos de DPYSL2 de número de registro de GenBank NP_001377.1 o BAD92432; con una secuencia de aminoácidos de CAPZA2 de número de registro de GenBank NP_006127.1; con una secuencia de aminoácidos de YBX1 de número de registro de GenBank NP_004550.2; con una secuencia de aminoácidos de EEF1A1 de número de registro de GenBank NP_001393.1; con la secuencia de aminoácidos de MAPT de número de registro de GenBank NP_058519.3 (isoforma 1); NP_005901.2 (isoforma 2); NP_058518.1 (isoforma 3); NP_058525.1 (isoforma 4); NP_001116539.1 (isoforma 5); o NP_001116538.2 (isoforma 6); con una secuencia de aminoácidos de DNM1L de número de registro de GenBank NP_036192.2 (isoforma 1); NP_036193.2 (isoforma 2); NP_005681.2 (isoforma 3); con una secuencia de aminoácidos de NEFL de número de registro de GenBank NP_006149.2; con una secuencia de aminoácidos de RDX de número de registro de GenBank NP_002897.1; con una secuencia de aminoácidos de MSN de número de registro de GenBank NP_002435.1; o con una secuencia de aminoácidos de EZR de número de registro de GenBank NP_003370.2 (isoforma 1) o NP_001104547.1 (isoforma 2).

En algunos aspectos, el antígeno utilizado para detectar anticuerpos antibiomarcador en una muestra biológica de una madre o posible madre es un mimótopo del biomarcador. El mimótopo de biomarcador puede proceder de un epítopo antigénico conocido del biomarcador, con uno o más aminoácidos sustituidos, eliminados o añadidos. El mimótopo de biomarcador puede diseñarse o identificarse de novo, explorando una biblioteca de péptidos para determinar mimótopos que se unen a anticuerpos antibiomarcador.

En algunos aspectos, el antígeno utilizado para detectar anticuerpos antibiomarcador, p. ej., un polipéptido biomarcador o fragmento antigénico del mismo o un mimótopo de biomarcador, puede inmovilizarse sobre un soporte sólido. El soporte sólido puede ser, por ejemplo, una placa de múltiples pocillos, un chip de micromatrices, una perla, una tira porosa, un filtro de nitrocelulosa. La inmovilización puede realizarse mediante unión covalente o no covalente. En algunos aspectos, la inmovilización se realiza a través de un anticuerpo de captura que se une específicamente al biomarcador diana. Se han creado anticuerpos monoclonales contra LDH e inmunoensayos de captura de antígenos para LDH. Véanse, p. ej., Wang y Smith, J Food Science (1995) 60(2):253; y Druilhe, et al., Am J Trop Med Hyg (2001) 64(5,6)233-241. Se pueden utilizar anticuerpos policlonales disponibles comercialmente para LDH (Abcam, Cambridge, MA), g Da (Sigma), YBX1 (Abcam), CRMP1 (Abcam) STIP1 (Abcam) y ezrina/radixina/moesina (señalización celular) para crear ensayos de captura de antígenos. Se pueden inmovilizar las proteínas humanas LDH natural purificada (Cell Sciences, Canton, MA), GDA recombinante de longitud completa (Abnova, Taipei, Taiwán), YBX1 recombinante de longitud completa (Abnova), CAPZA2 recombinante de longitud completa (Abnova), DPYSL2 recombinante de longitud completa (Novus Biologicals), DNM1L recombinante de longitud completa (Abnova), EEF1A1 recombinante de longitud completa (Abnova), MAPT recombinante de longitud completa (Abnova), NEFL recombinante de longitud completa (Abnova), CRMP1 recombinante de longitud completa (OriGene, Rockville, MD) y STIP1 recombinante de longitud completa (Abnova) en un soporte sólido y utilizarse como ensayo de anticuerpos antibiomarcador.

Para la detección de anticuerpos antibiomarcador maternos, se incuba una muestra con un polipéptido biomarcador, fragmentos antigénicos del mismo o un mimótopo de biomarcador en condiciones (es decir, tiempo, temperatura, concentración de muestra) suficientes para permitir la unión específica de cualquier anticuerpo o autoanticuerpo presente en la muestra. El polipéptido biomarcador, los fragmentos antigénicos del mismo o el mimótopo de biomarcador pueden unirse a un soporte sólido. Por ejemplo, el polipéptido biomarcador, los fragmentos antigénicos del mismo o el mimótopo de biomarcador se pueden exponer a una muestra durante aproximadamente 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0 horas o durante la noche, aproximadamente 8, 10 o 12 horas. Sin embargo, el tiempo de incubación puede ser mayor o menor dependiendo de, p. ej., la composición del antígeno, la dilución de la muestra y la temperatura de incubación. Las incubaciones que utilizan muestras menos diluidas y temperaturas más altas se pueden realizar durante períodos de tiempo más cortos. Las incubaciones se realizan habitualmente a temperatura ambiente (aproximadamente 25 °C) o a temperatura biológica (aproximadamente 37 °C), y se pueden realizar en un refrigerador (aproximadamente 4 °C). El lavado para eliminar la muestra no unida antes de la adición de un anticuerpo secundario se realiza de acuerdo con métodos de inmunoensayo conocidos.

Los anticuerpos secundarios marcados se utilizan generalmente para detectar anticuerpos o autoanticuerpos en una muestra que se ha unido a uno o más polipéptidos biomarcadores, fragmentos antigénicos de los mismos o mimótopos de biomarcadores. Los anticuerpos secundarios se unen a las regiones constantes o "C" de diferentes clases o isotipos de inmunoglobulinas-IgM, IgD, IgG, IgA e IgE. Habitualmente, en los presentes métodos se usa un anticuerpo secundario contra una región constante de IgG. Anticuerpos secundarios contra las subclases de IgG, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, también se utilizan en los presentes métodos. Los anticuerpos secundarios se pueden marcar con cualquier residuo detectable directa o indirectamente, incluyendo un fluoróforo (es decir, fluoresceína, ficoeritrina, punto cuántico, perla Luminex, perla fluorescente), una enzima (es decir, peroxidasa, fosfatasa alcalina), un radioisótopo (es decir, 3H, 32P, 125I) o un residuo quimioluminiscente. Las señales de marcado se pueden amplificar utilizando un complejo de biotina y un residuo de unión a biotina (es decir, avidina, estreptavidina, neutravidina). Los anticuerpos anti-IgG humana marcados con fluorescencia están disponibles comercialmente en Molecular Probes, Eugene, OR. Los anticuerpos anti-IgG humana marcados con enzimas están disponibles comercialmente en Sigma-Aldrich, St. Louis, MO and Chemicon, Temecula, CA.

El método de detección de la presencia o ausencia o presencia diferencial, de anticuerpos o autoanticuerpos en una muestra se corresponderá con la elección del marcador del anticuerpo secundario. Por ejemplo, si el polipéptido biomarcador o fragmentos antigénicos del mismo se transfieren a un sustrato de membrana adecuado para inmunotransferencia, las señales detectables (es decir, manchas de transferencia) se pueden cuantificar usando un generador de imágenes digital si se usa marcado enzimático o un revelador de película de rayos X si se usa marcado con radioisótopos. En otro ejemplo, si el polipéptido biomarcador o fragmentos antigénicos del mismo se transfieren a una placa de múltiples pocillos, las señales detectables se pueden cuantificar utilizando un lector de placas automático capaz de detectar y cuantificar señales fluorescentes, quimioluminiscentes y/o colorimétricas. Dichos métodos de detección son bien conocidos en la técnica.

Las técnicas generales de inmunoensayos son bien conocidas en la técnica. Se puede encontrar orientación para la optimización de parámetros en, por ejemplo, Wu, Quantitative Immunoassay: A Practical Guide for Assay Establishment, Troubleshooting, and Clinical Application, 2000, AACC Press; Principles and Practice of Immunoassay, Price y Newman, eds., 1997, Groves Dictionaries, Inc.; The Immunoassay Handbook, Wild, ed., 2005, Elsevier Science Ltd.; Ghindilis, Pavlov y Atanassov, Immunoassay Methods and Protocols, 2003, Humana Press; Harlow y Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, 1998, Cold Spring Harbor Laboratory Press; e Immunoassay Automation: An Updated Guide to Systems, Chan, ed., 1996, Academic Press.

La presencia o mayor presencia de anticuerpos antibiomarcador maternos se indica mediante una señal detectable (es decir, una mancha de transferencia, fluorescencia, quimioluminiscencia, color, radiactividad) en un inmunoensayo, donde la muestra biológica de la madre o de la posible madre se pone en contacto con un polipéptido biomarcador, fragmento antigénico del mismo o un mimótopo. Esta señal detectable se puede comparar con la señal de una muestra de control o con un valor umbral. En algunos aspectos, se detecta mayor presencia y se indica un mayor riesgo de TEA, cuando la señal detectable de anticuerpos antibiomarcador en la muestra de prueba es al menos aproximadamente un 10 %, 20 %, 30 %, 50 %, 75 % mayor en comparación con la señal de anticuerpos antibiomarcador en la muestra de control o con el valor umbral predeterminado. En algunos aspectos, se detecta una mayor presencia y se indica un mayor riesgo de TEA, cuando la señal detectable de anticuerpos antibiomarcador en la muestra de prueba es al menos aproximadamente 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces o más, mayor en comparación con la señal de anticuerpos antibiomarcador en la muestra de control o con el valor umbral predeterminado.

En algunos aspectos, los resultados de las determinaciones de anticuerpos antibiomarcador se registran en un medio tangible. Por ejemplo, se pueden registrar los resultados de los presentes ensayos de diagnóstico (por ejemplo, la observación de la presencia o mayor presencia de anticuerpos antibiomarcador) y el diagnóstico de si se determina o no un mayor riesgo de TEA, p. ej., en papel o en medios electrónicos (p. ej., cinta de audio, un disco de ordenador, un CD, una unidad flash, etc.).

En algunos aspectos, los métodos comprenden además la etapa de proporcionar el diagnóstico al paciente de si existe o no un mayor riesgo de que el feto o niño padezca un TEA basándose en los resultados de las determinaciones de anticuerpos antibiomarcador.

En algunos aspectos, los métodos comprenden además la etapa de administrar a la madre o posible madre un régimen terapéutico o preventivo de uno o más agentes de bloqueo para reducir, inhibir o prevenir la unión de anticuerpos antibiomarcador a 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o más, de los biomarcadores descritos en el presente documento (p. ej., seleccionados de lactato deshidrogenasa (LDH), guanina desaminasa (GDA), proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1), fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1), subunidad alfa de la proteína Cap Z de unión al extremo barbado de actina (CAPZA2), proteína 1 de unión a caja Y (YBX1), factor 1A1 de elongación y traducción eucariota (EEF1A1), proteína Tau asociada a microtúbulos (MAPT), proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2), proteína similar a dinamina 1 (DNM1L), radixina (RDX), la moesina (MSN)) y la ezrina (EZR).

En un aspecto adicional, la divulgación proporciona métodos para determinar el riesgo para una descendencia, p. ej., feto o niño, de padecer un trastorno del espectro autista (TEA) o para determinar el riesgo de que una madre o una posible madre tenga un hijo que padecerá un trastorno del espectro autista (TEA) identificando en una muestra biológica de la madre de la descendencia la presencia de anticuerpos maternos que se unen específicamente a una o más proteínas seleccionadas del grupo que consiste en la proteína 1 de unión a nucleótidos de guanina, gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa, proteína de protección terminal con caperuza de actina F, subunidad alfa-2, uracilo ADN glicosilasa y glutamato deshidrogenasa, en donde la presencia de anticuerpos maternos que se unen específicamente a una o más proteínas indica un mayor riesgo de que la descendencia padezca un TEA. La determinación de la presencia de anticuerpos maternos contra una o más proteínas seleccionadas del grupo que consiste en la proteína 1 de unión a nucleótidos de guanina, gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa, proteína de protección terminal con caperuza de actina F, subunidad alfa-2, uracilo ADN glicosilasa y glutamato deshidrogenasa se pueden realizar junto con o independientemente de la determinación de anticuerpos maternos contra uno o más de los biomarcadores descritos en el presente documento. Otros aspectos de los métodos de diagnóstico son como se describen en el presente documento.

Métodos para reducir el riesgo mediante la administración de agente o agentes de bloqueo de anticuerpos antibiomarcador

También se describen métodos para prevenir y/o reducir el riesgo de padecer un TEA en un feto o niño mediante la administración in vivo a la madre de un agente o una pluralidad de agentes que bloquean la unión de anticuerpos maternos a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o más, de los biomarcadores descritos en el presente documento (p. ej., seleccionados de lactato deshidrogenasa (LDH), guanina desaminasa (GDA), proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1), fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1), subunidad alfa de la proteína Cap Z de unión al extremo barbado de actina (CAPZA2), proteína 1 de unión a caja Y (YBX1), factor 1A1 de elongación y traducción eucariota (EEF1A1), proteína Tau asociada a microtúbulos (MAPT), proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2), proteína similar a dinamina 1 (DNM1L), radixina (RDX), la moesina (MSN)) y la ezrina (EZR).

Los métodos de prevención y/o tratamiento que utilizan un agente o una pluralidad de agentes de bloqueo de anticuerpos antibiomarcador pueden proporcionarse a una mujer antes, durante o después del embarazo. En algunos aspectos, el o los agentes de bloqueo de anticuerpos antibiomarcador pueden administrarse una, dos, tres, cuatro o más veces, según sea apropiado, en cualquier momento durante el embarazo. Por ejemplo, el o los agentes de bloqueo de anticuerpos antibiomarcador pueden administrarse en uno o más del primer, segundo y/o tercer trimestre del embarazo. En algunos aspectos, el o los agentes de bloqueo de anticuerpos antibiomarcador se administran a una mujer que tiene un feto cuyo cerebro ha comenzado a desarrollarse, p. ej., después de aproximadamente 12 semanas de gestación. En algunos aspectos, el o los agentes de bloqueo de anticuerpos antibiomarcador se administran una o más veces después del parto, p. ej., en las primeras cuatro semanas después del nacimiento y/o mientras la madre está amamantando al niño. En algunos aspectos, el o los agentes de bloqueo de anticuerpos antibiomarcador se administran una o más veces antes del embarazo, por ejemplo, en una mujer cuyo resultado ha dado positivo en la prueba de anticuerpos antibiomarcador y que está intentando quedarse embarazada.

El o los agentes de bloqueo de anticuerpos antibiomarcador pueden ser un polipéptido biomarcador o un fragmento antigénico del mismo. El polipéptido biomarcador o el fragmento antigénico pueden purificarse o purificarse sustancialmente a partir de una fuente natural o producirse de forma recombinante o sintética, como se analiza anteriormente. Por ejemplo, pueden administrarse fragmentos de longitud parcial del uno o más polipéptidos biomarcadores que tienen al menos 10 aminoácidos de longitud y que se unen a anticuerpos antibiomarcador. En algunos aspectos, los fragmentos de longitud parcial del uno o más biomarcadores que se administran tienen al menos aproximadamente el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % de la longitud total del polipéptido biomarcador. En algunos aspectos, los fragmentos de longitud parcial del biomarcador tienen una longitud de aproximadamente 50, 100, 150, 200, 250 o 300 aminoácidos. Los fragmentos de longitud parcial pueden tener el extremo N o el extremo C del polipéptido biomarcador eliminado o parte tanto del extremo N como del extremo C eliminado. Los fragmentos de longitud parcial del uno o más polipéptidos biomarcadores que se utilizan se unen a anticuerpos antibiomarcador en la madre o en la posible madre. En algunos aspectos, se administra uno o más de un polipéptido de LDH-A y/o LDH-B.

En algunos aspectos, se administran una o más isoenzimas de una LDH-1, LDH-2, LDH-3, LDH-4 y/o LDH-5. En algunos aspectos, el polipéptido de LDH o fragmento antigénico del mismo tiene al menos aproximadamente un 90 %, 93 %, 95 %, 97 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con un polipéptido de LDH como se describe en el presente documento, p. ej., con una secuencia de aminoácidos de número de registro de GenBank NP_001128711, NP_005557.1, AAP36496.1, BAD96798.1 o NP_002291.1.

En algunos aspectos, el polipéptido biomarcador o fragmento antigénico del mismo administrados tiene al menos aproximadamente un 90%, 93 %, 95 %, 97 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con un polipéptido biomarcador como se describe en el presente documento, p. ej., con una secuencia de aminoácidos de LDHA de número de registro de GenBank AAP36496.1; BAD96798.1; NP_005557.1 (isoforma 1); NP_001128711.1 (isoforma 2); NP_001158886.1 (isoterma 3); NP_001158887.1 (isoterma 4); o NP_001158888.1 (isoterma 5); con una secuencia de aminoácidos de LDHB de número de registro de GenBank NP_002291.1 (variante 1); o NP_001167568.1 (variante 2); con una secuencia de aminoácidos de CRMP1 de número de registro de GenBank NP_001014809.1 (isoterma 1) o NP_001304.1 (isoterma 2); con una secuencia de aminoácidos de STIP1 de número de registro de GenBank NP_006810.1; con una secuencia de aminoácidos de GDA de número de registro de GenBank NP_004284.1; con una secuencia de aminoácidos de DPYSL2 de número de registro de GenBank NP_001377.1 o BAD92432; con una secuencia de aminoácidos de CAPZA2 de número de registro de GenBank NP_006127.1; con una secuencia de aminoácidos de YBX1 de número de registro de GenBank NP_004550.2; con una secuencia de aminoácidos de EEF1A1 de número de registro de GenBank NP_001393.1; con la secuencia de aminoácidos de MAPT de número de registro de GenBank NP_058519.3 (isoforma 1); NP_005901.2 (isoforma 2); NP_058518.1 (isoforma 3); NP_058525.1 (isoforma 4); NP_001116539.1 (isoforma 5); o NP_001116538.2 (isoforma 6); con una secuencia de aminoácidos de DNM1L de número de registro de GenBank NP_036192.2 (isoforma 1); NP_036193.2 (isoforma 2); NP_005681.2 (isoforma 3); con una secuencia de aminoácidos de NEFL de número de registro de GenBank NP_006149.2; con una secuencia de aminoácidos de RDX de número de registro de GenBank NP_002897.1; con una secuencia de aminoácidos de MSN de número de registro de GenBank NP_002435.1; o con una secuencia de aminoácidos de EZR de número de registro de GenBank NP_003370.2 (isoforma 1) o NP_001104547.1 (isoforma 2).

En algunos aspectos, se administran una pluralidad de agentes que comprenden dos o más epítopos antigénicos de los biomarcadores descritos en el presente documento. La pluralidad de agentes se puede administrar por separado o juntos. La pluralidad de agentes puede ser una combinación de péptidos individuales. En algunos aspectos, dos o más péptidos de diferentes epítopos de biomarcadores están unidos químicamente. Los múltiples epítopos antigénicos pueden ser del mismo o diferentes polipéptidos biomarcadores. En este caso, el enlace químico puede ser mediante enlace directo de los epítopos de biomarcadores o enlace mediante el uso de un armazón químico o enlazador. En algunos aspectos, dos o más péptidos de diferentes epítopos de biomarcadores se fusionan entre sí. Las fusiones de epítopos pueden expresarse de forma recombinante o sintetizarse químicamente.

En algunos aspectos, el o los agentes de bloqueo de anticuerpos antibiomarcador pueden ser una molécula pequeña no peptídica, es decir, una "molécula orgánica pequeña", que interfiere con o se une a anticuerpos antibiomarcador. Esta molécula pequeña puede actuar directamente sobre el anticuerpo antibiomarcador o indirectamente facilitando el aclaramiento específico de anticuerpos antibiomarcador ya unidos a otro u otros agentes, incluyendo péptidos antigénicos.

En algunos aspectos, el o los agentes de bloqueo de anticuerpos antibiomarcador son uno o más mimótopos del biomarcador o de los biomarcadores diana. El mimótopo de biomarcador puede proceder de epítopo o epítopos antigénicos conocidos del uno o más biomarcadores, con uno o más aminoácidos sustituidos, eliminados o añadidos. El mimótopo de biomarcador puede diseñarse o identificarse de novo, o seleccionando una biblioteca de péptidos o moléculas pequeñas para determinar mimótopos que se unen a anticuerpos contra el uno o más biomarcadores.

En algunos aspectos, se administran polipéptidos o mimótopos que bloquean la unión de anticuerpos maternos a uno, dos, tres o todos los biomarcadores seleccionados de lactato deshidrogenasa (LDH), guanina desaminasa (GDA), proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1). En algunos aspectos, se administran polipéptidos o mimótopos que bloquean la unión de anticuerpos maternos a uno, dos o todos los biomarcadores seleccionados de lactato deshidrogenasa (LDH), proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1). En algunos aspectos, se administran polipéptidos o mimótopos que bloquean la unión de anticuerpos maternos a uno, dos o todos los biomarcadores seleccionados de guanina desaminasa (GDA), proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1). En algunos aspectos, se administran polipéptidos o mimótopos que bloquean la unión de anticuerpos maternos a una o ambas de lactato deshidrogenasa (LDH) y proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1). En algunos aspectos, se administran polipéptidos o mimótopos que bloquean la unión de anticuerpos maternos a una o ambas de guanina desaminasa (GdA) y proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1). En algunos aspectos, se administran polipéptidos o mimótopos que bloquean la unión de anticuerpos maternos a una o ambas de lactato deshidrogenasa (LDH) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1). En algunos aspectos, se administran polipéptidos o mimótopos que bloquean la unión de anticuerpos maternos a una o ambas de guanina desaminasa (GDA) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1). En algunos aspectos, se administran polipéptidos o mimótopos que bloquean la unión de anticuerpos maternos a la lactato deshidrogenasa (LDH). En algunos aspectos, se administran polipéptidos o mimótopos que bloquean la unión de anticuerpos maternos a la guanina desaminasa (GDA). En algunos aspectos, se administran polipéptidos o mimótopos que bloquean la unión de anticuerpos maternos a la proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1). En algunos aspectos, se administran polipéptidos o mimótopos que bloquean la unión de anticuerpos maternos a la fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1).

En algunos aspectos, se administran polipéptidos o mimótopos que bloquean la unión de anticuerpos maternos a uno, dos, tres o todos los biomarcadores seleccionados de lactato deshidrogenasa (LDH), guanina desaminasa (GDA), proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1). En algunos aspectos, se administran polipéptidos o mimótopos que bloquean la unión de anticuerpos maternos a uno, dos o todos los biomarcadores seleccionados de lactato deshidrogenasa (LDH), proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1). En algunos aspectos, se administran polipéptidos o mimótopos que bloquean la unión de anticuerpos maternos a uno, dos o todos los biomarcadores seleccionados de guanina desaminasa (GDA), proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1). En algunos aspectos, se administran polipéptidos o mimótopos que bloquean la unión de anticuerpos maternos a una o ambas de lactato deshidrogenasa (LDH) y proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2). En algunos aspectos, se administran polipéptidos o mimótopos que bloquean la unión de anticuerpos maternos a una o ambas de guanina desaminasa (GDA) y proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2). En algunos aspectos, se administran polipéptidos o mimótopos que bloquean la unión de anticuerpos maternos a la proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2).

Los agentes polipéptidos o moléculas pequeñas de bloqueo de anticuerpos antibiomarcador administrados pueden contener modificaciones para reducir o minimizar su inmunogenicidad. Las modificaciones de los aminoácidos en los polipéptidos biomarcadores y fragmentos antigénicos de los mismos o mimótopos de biomarcadores incluyen, pero sin limitación, un residuo amida o un residuo de piroglutamilo o la adición de cadenas de polietilenglicol (PEGilación). Estas modificaciones pueden contribuir a disminuir la propensión a formar una conformación de lámina p o pueden contribuir a la estabilidad, solubilidad y disminución de la inmunogenicidad de los péptidos. Se desea un péptido más estable, soluble y menos inmunogénico. Muchos péptidos modificados en el extremo C con un grupo CONH2 (amida) parece ser resistente al ataque de las carboxipeptidasas y muchos péptidos que tienen un resto de piroglutamilo en el extremo N son más resistentes al ataque de las aminopeptidasas de amplia especificidad. Se ha demostrado que los péptidos PEGilados tienen una semivida plasmática aumentada y una inmunogenicidad reducida en comparación con los péptidos no modificados. Asimismo, el análisis de la secuencia de los agentes de bloqueo permitirá la minimización de los epítopos de linfocitos T conocidos mediante modificaciones conservativas. También se incluyen como péptidos de la presente divulgación los péptidos cíclicos que son resistentes al ataque tanto de carboxipeptidasas como de aminopeptidasas. Adicionalmente, la administración oral del agente de bloqueo puede ayudar a minimizar la inmunogenicidad.

En algunos aspectos, los métodos de prevención y/o tratamiento incluyen la etapa de determinar primero la presencia o mayor presencia de anticuerpos que se unen al uno o más biomarcadores en la madre o en la posible madre, como se describe en el presente documento. Una mujer cuyo resultado sea positivo o a un nivel por encima del nivel umbral para la presencia de anticuerpos antibiomarcador es candidata para recibir un o unos agentes que bloqueen la unión de los anticuerpos antibiomarcador maternos al uno o más biomarcadores diana. Una mujer cuyo resultado sea negativo o a un nivel por debajo del nivel umbral para la presencia de anticuerpos antibiomarcador no necesita recibir un o unos agentes que bloqueen la unión de los anticuerpos antibiomarcador maternos a uno o más biomarcadores diana.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para su uso en la presente invención incluyen composiciones en donde los principios activos se encuentran en una cantidad terapéuticamente eficaz. La cantidad de composición administrada dependerá, por supuesto, del sujeto que se esté tratando, del peso del sujeto, la gravedad de la afección, la forma de administración y el criterio del médico prescriptor. La determinación de una cantidad eficaz está dentro de las capacidades de los expertos en la materia, especialmente a la luz de la divulgación detallada proporcionada en el presente documento. Generalmente, se determina una cantidad eficaz o efectiva de uno o más agentes de bloqueo de anticuerpos antibiomarcador administrando primero una dosis baja o pequeña cantidad de un agente de bloqueo de anticuerpos antibiomarcador y aumentando, después, gradualmente la dosis o dosificaciones administradas, y/o añadiendo un o unos segundos agentes de bloqueo de anticuerpos antibiomarcador según sea necesario, hasta que se observa en un sujeto tratado, un efecto deseado de, p. ej., eliminación o reducción de la presencia de anticuerpos antibiomarcador libres o no unidos por debajo de un nivel umbral predeterminado, con mínimos o nulos efectos secundarios tóxicos o indeseables. Los métodos aplicables para determinar una dosis y programación de dosificación apropiadas para la administración de una composición farmacéutica de la presente invención se describen, por ejemplo, en Goodman y Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 11a Ed., Brunton, et al., Eds., McGraw-Hill (2006) y en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a Ed., University of the Sciences in Philadelphia (USIP), 2OO5 , Lippincott, Williams y Wilkins.

La cantidad y el intervalo de dosificación se pueden ajustar individualmente para proporcionar niveles en plasma o tejido del o de los agentes de bloqueo de anticuerpos antibiomarcador suficientes para mantener un efecto terapéutico. Se pueden realizar administraciones únicas o múltiples de las composiciones que comprenden una cantidad eficaz de uno o más agentes de bloqueo de anticuerpos antibiomarcador con niveles y patrones seleccionados por el médico tratante. La dosis y el programa de administración se pueden determinar y ajustar, p. ej., basándose en los niveles de anticuerpos antibiomarcador en la madre o en la posible madre, que se puede monitorizar a lo largo del curso del tratamiento de acuerdo con los métodos comúnmente practicados por los médicos o los descritos en el presente documento. En algunos aspectos, los niveles terapéuticos se lograrán al administrar dosis únicas diarias. En otros aspectos, el programa de dosificación puede incluir múltiples programas de dosis diarias. En otros aspectos más, se incluyen en la divulgación dosificaciones cada dos días, quincenales o semanales.

Por ejemplo, el o los agentes de bloqueo de anticuerpos antibiomarcador pueden administrarse mensualmente, quincenalmente, semanalmente o diariamente, según sea necesario. En algunos aspectos, se monitorizan los niveles de anticuerpos antibiomarcador en la madre y se administran el o los agentes de bloqueo si los anticuerpos antibiomarcador están presentes o están presentes en niveles por encima de un nivel umbral predeterminado. El o los agentes de bloqueo de anticuerpos antibiomarcador se pueden administrar durante un período de tiempo de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 10, 12, 15, 20, 24, 30, 32, 36 semanas o más o menos, según sea apropiado. Por ejemplo, la administración del o de los agentes de bloqueo de anticuerpos antibiomarcador puede interrumpirse si el nivel de anticuerpos antibiomarcador se sitúa por debajo del nivel umbral predeterminado. El o los agentes de bloqueo de anticuerpos antibiomarcador pueden administrarse durante todo el embarazo o durante uno o más del primero, segundo o tercer trimestre del embarazo. La administración puede comenzar antes de la concepción y puede continuar después del nacimiento, por ejemplo, mientras la madre amamanta al niño.

En aspectos en los que el o los agentes de bloqueo son un polipéptido, las dosis típicas pueden variar desde aproximadamente 0,1 pg/kg de peso corporal hasta e incluyendo aproximadamente 1 g/kg de peso corporal, por ejemplo, entre aproximadamente 1 pg/kg de peso corporal y aproximadamente 500 mg/kg de peso corporal. En algunos aspectos, la dosis de polipéptido es aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/kg de peso corporal.

En aspectos en los que el o los agentes son un compuesto orgánico pequeño, las dosis típicas pueden variar desde aproximadamente 0,1 pg/kg de peso corporal hasta e incluyendo aproximadamente 1 g/kg de peso corporal, por ejemplo, entre aproximadamente 1 pg/kg de peso corporal y aproximadamente 500 mg/kg de peso corporal. En algunos aspectos, la dosis de compuesto orgánico pequeño es de aproximadamente 0,1, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/kg de peso corporal.

La dosis exacta dependerá de una variedad de factores como se analiza anteriormente, incluyendo el inhibidor en particular, la gravedad de la enfermedad y la vía de administración. La determinación de la dosis terapéuticamente eficaz exacta puede determinarse por un médico sin experimentación indebida y puede incluir cualquier dosis incluida dentro de los intervalos descritos anteriormente.

El o los agentes de bloqueo de anticuerpos antibiomarcador se administran por una vía de administración de manera que el o los agentes se unen al anticuerpo antibiomarcador y evitan la unión del anticuerpo a biomarcadores endógenos asociados con el riesgo de padecer TEA y se minimizan esas respuestas al agente. Normalmente, el o los agentes se administran por vía sistémica. En algunos aspectos, el o los agentes se administran por vía parenteral, p. ej., por vía intravenosa o intraamniótica (es decir, directamente en el saco amniótico). Adicionalmente, el anticuerpo de bloqueo antibiomarcador puede administrarse por vía oral.

Los compuestos se pueden formular para administración parenteral mediante inyección, p. ej., mediante inyección en bolo o infusión continua. Para inyección, un o unos agentes de bloqueo de anticuerpos antibiomarcador pueden formularse en preparaciones disolviendo, suspendiendo o emulsionando los mismos en un disolvente acuoso o no acuoso, tal como aceites vegetales u otros similares, glicéridos de ácidos alifáticos sintéticos, ésteres de ácidos alifáticos superiores o propilenglicol; y si se desea, con aditivos convencionales, tales como solubilizantes, agentes isotónicos, agentes de suspensión, agentes emulsionantes, estabilizantes y conservantes. En algunos aspectos, una combinación de la divulgación se puede formular en soluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles, tales como solución de Hanks, solución de Ringer o tampón salino fisiológico. Las formulaciones para inyección se pueden presentar en forma de dosificación unitaria, p. ej., en ampollas o envases multidosis, con un conservante añadido. Las composiciones pueden adoptar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos y pueden contener agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión.

Las formulaciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas del o de los agentes de bloqueo de anticuerpos antibiomarcador en forma soluble en agua. Adicionalmente, las suspensiones del o de los agentes de bloqueo de anticuerpos antibiomarcador se pueden preparar como suspensiones para inyección aceitosas apropiadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato de etilo o triglicéridos o liposomas. Las suspensiones para inyección acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tal como carmelosa sódica, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión puede contener también estabilizantes o agentes adecuados que aumenten la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones muy concentradas. Como alternativa, el principio activo se puede encontrar en forma de polvo para su constitución con un vehículo adecuado, p. ej., agua estéril exenta de pirógenos, antes de su uso.

El tratamiento con el o los agentes de bloqueo de anticuerpos antibiomarcador se considera eficaz si los niveles o títulos de anticuerpos antibiomarcador que se unen activamente al uno o más biomarcadores se reducen o eliminan en una muestra biológica de una paciente después de recibir una o más administraciones. del agente de bloqueo, en comparación con antes de la administración del agente de bloqueo. Por ejemplo, una reducción de anticuerpos de anticuerpos antibiomarcador que se unen activamente al uno o más biomarcadores diana en una muestra de al menos aproximadamente un 10 %, 25 %, 50 %, 75 % o 100 % después de una o más administraciones del bloqueante indica que la administración del agente de bloqueo fue eficaz. Cuando se haya establecido un nivel de umbral, el tratamiento con el o los agentes de bloqueo de anticuerpos antibiomarcador se considera eficaz si los niveles o títulos de anticuerpos antibiomarcador que se unen activamente al uno o más biomarcadores se reducen por debajo del nivel umbral. Los anticuerpos antibiomarcador que se unen activamente al uno o más biomarcadores pueden medirse usando cualquier método conocido en la técnica, incluyendo aquellos descritos en el presente documento.

En algunos aspectos, el o los agentes de bloqueo de anticuerpos antibiomarcador se administran conjuntamente con otra terapia inmunosupresora. La terapia inmunosupresora administrada conjuntamente puede ser específica de antígeno (p. ej., vacunación con ADN inmunosupresor) o no específica de antígeno (p. ej., glucocorticoides, anticuerpos contra CD20, CTLA-4, LFA-1). En algunos aspectos, el agente de bloqueo de anticuerpos antibiomarcador se administra junto con un anticuerpo anti-CD20, útil en el agotamiento selectivo de las poblaciones de linfocitos B. Se encuentran disponibles anticuerpos anti-CD20 clínicamente útiles para el agotamiento de linfocitos B, incluyendo, por ejemplo, rituximab, ocrelizumab y ofatumumab.

En un aspecto adicional, la divulgación proporciona métodos para prevenir o reducir el riesgo de que un feto padezca un TEA que comprenden administrar a la madre del feto un agente que bloquea la unión de anticuerpos maternos a una o más proteínas fetales seleccionadas del grupo que consiste en proteína 1 de unión a nucleótidos de guanina, gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa, proteína de protección terminal con caperuza de actina F, subunidad alfa-2, uracilo ADN glicosilasa y glutamato deshidrogenasa, por lo que el bloqueo de la unión a una o más proteínas fetales de los anticuerpos maternos previene o reduce el riesgo de que el feto padezca un TEA. El bloqueo de la unión de anticuerpos maternos contra una o más proteínas fetales seleccionadas del grupo que consiste en proteína 1 de unión a nucleótidos de guanina, gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa, proteína de protección terminal con caperuza de actina F, subunidad alfa-2, uracilo ADN glicosilasa se puede realizar junto con o de manera independiente del boqueo de la unión de anticuerpos maternos contra el uno o más biomarcadores. Otros aspectos de los métodos de bloqueo se describen en el presente documento.

4. Métodos para reducir el riesgo de TEA mediante la vacunación con ADN inmunosupresor

En un aspecto alternativo, uno o más polinucleótidos que codifican un polipéptido biomarcador, fragmentos antigénicos de los mismos o mimótopos de los mismos, se administran para efectuar vacunación supresora. El polinucleótido se puede expresar a partir de un vector, p. ej., un vector plásmido, que tiene un número bajo de dinucleótidos CG para reducir o minimizar la actividad inmunoestimuladora. Se ha descrito la vacunación inmunosupresora para contrarrestar una respuesta autoinmunitaria, p. ej., en las Patentes de los Estados Unidos N.° 7.030.098 y 7.544.669.

El polinucleótido puede codificar un polipéptido biomarcador o un fragmento antigénico del mismo. Por ejemplo, se administran polinucleótidos que codifican fragmentos de longitud parcial de los polipéptidos biomarcadores que tienen al menos 10 aminoácidos de longitud y que están unidos por anticuerpos antibiomarcador. En algunos aspectos, se administran polinucleótidos que codifican fragmentos de longitud parcial de los polipéptidos biomarcadores que tienen al menos aproximadamente el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % de la longitud total del polipéptido biomarcador. En algunos aspectos, se administran polinucleótidos que codifican fragmentos de longitud parcial del uno o más biomarcadores que tienen una longitud de aproximadamente 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250 o 300 aminoácidos. Los fragmentos de longitud parcial pueden tener el extremo N o el extremo C del polipéptido biomarcador eliminado o parte tanto del extremo N como del extremo C eliminado. Se utilizan polinucleótidos que codifican fragmentos de longitud parcial de uno o más polipéptidos biomarcadores que se unen a anticuerpos antibiomarcador.

En algunos aspectos, se administra un polinucleótido que codifica una o más de una LDH-A y/o una LDH-B. En algunos aspectos, se administran polinucleótidos que codifican una o más isoenzimas de una LDH-1, LDH-2, LDH-3, LDH-4 y/o LDH-5. En algunos aspectos, se administra un polinucleótido que codifica un polipéptido de LDH o fragmento antigénico del mismo que tiene al menos aproximadamente un 90 %, 93 %, 95 %, 97 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con un polipéptido de LDH como se describe en el presente documento, p. ej., con una secuencia de aminoácidos de número de registro de GenBank NP_001128711, NP_005557.1, AAP36496.1, BAD96798.1 o NP_002291.1.

En algunos aspectos, el polinucleótido administrado codifica un polipéptido biomarcador o un fragmento antigénico del mismo que tiene al menos aproximadamente un 90 %, 93 %, 95 %, 97 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con un polipéptido biomarcador como se describe en el presente documento, p. ej., con una secuencia de aminoácidos de LDHA de número de registro de GenBank AAP36496.1; BAD96798.1; NP_005557.1 (isoforma 1); NP_001128711.1 (isoforma 2); NP_001158886.1 (isoforma 3); NP_001158887.1 (isoforma 4); o NP_001158888.1 (isoforma 5); con una secuencia de aminoácidos de l Dh B de número de registro de GenBank NP_002291.1 (variante 1); o NP_001167568.1 (variante 2); con una secuencia de aminoácidos de CRMP1 de número de registro de GenBank NP_001014809.1 (isoforma 1) o NP_001304.1 (isoforma 2); con una secuencia de aminoácidos de STIP1 de número de registro de GenBank NP_006810.1; con una secuencia de aminoácidos de GDA de número de registro de GenBank NP_004284.1; con una secuencia de aminoácidos de DPYSL2 de número de registro de GenBank NP_001377.1 o BAD92432; con una secuencia de aminoácidos de CAPZA2 de número de registro de GenBank NP_006127.1; con una secuencia de aminoácidos de YBX1 de número de registro de GenBank NP_004550.2; con una secuencia de aminoácidos de EEF1A1 de número de registro de GenBank NP_001393.1; con la secuencia de aminoácidos de MAPT de número de registro de GenBank NP_058519.3 (isoforma 1); NP_005901.2 (isoforma 2); NP_058518.1 (isoforma 3); NP_058525.1 (isoforma 4); NP_001116539.1 (isoforma 5); o NP_001116538.2 (isoforma 6); con una secuencia de aminoácidos de DNMIL de número de registro de GenBank NP_036192.2 (isoforma 1); NP_036193.2 (isoforma 2); NP_005681.2 (isoforma 3); con una secuencia de aminoácidos de NEFL de número de registro de GenBank NP_006149.2; con una secuencia de aminoácidos de RDX de número de registro de GenBank NP_002897.1; con una secuencia de aminoácidos de MSN de número de registro de GenBank NP_002435.1; o con una secuencia de aminoácidos de EZR de número de registro de GenBank NP_003370.2 (isoforma 1) o NP_001104547.1 (isoforma 2).

En algunos aspectos, el polinucleótido codifica un mimótopo de biomarcador que se une a anticuerpos antibiomarcador. El mimótopo de biomarcador puede proceder de un epítopo antigénico conocido del uno o más biomarcadores, con uno o más aminoácidos sustituidos, eliminados o añadidos. El mimótopo de biomarcador puede diseñarse o identificarse de novo, explorando una biblioteca de péptidos para determinar mimótopos que se unen a anticuerpos contra el uno o más biomarcadores.

El polinucleótido se administra a través de una vía para efectuar la vacunación supresora, p. ej., por vía intramuscular, por vía intravenosa, por vía subcutánea o por vía intranasal. Habitualmente, el polinucleótido se administra por vía intramuscular.

En primer lugar, se analiza a la madre o a la posible madre para determinar la presencia de anticuerpos antibiomarcador o la presencia de anticuerpos antibiomarcador por encima de un nivel umbral predeterminado. A continuación, puede iniciarse un régimen de inmunización supresora. El régimen de vacunación inmunosupresora se puede iniciar antes, durante o después del embarazo, según sea apropiado.

Un vector con CpG minimizadas o eliminadas y que codifica el uno o más de los polipéptidos biomarcadores, el fragmento antigénico de los mismos o el mimótopo de biomarcador se puede administrar una, dos, tres, cuatro o más veces según sea necesario para suprimir selectivamente la respuesta inmunitaria de la madre contra el uno o más biomarcadores. El vector con bajo contenido en CpG se puede administrar, p. ej., mensualmente durante 6-12 meses, y después cada 3-12 meses como dosis de mantenimiento. Se pueden formular regímenes de tratamiento alternativos que pueden variar desde administración diaria, hasta semanalmente, hasta quincenalmente, hasta cada dos meses, hasta anualmente, hasta una única dependiendo de la gravedad de la enfermedad, la edad del paciente, el uno o más polipéptidos biomarcadores o fragmentos antigénicos que se administran y otros factores que serían considerados por el médico tratante habitual. Un curso de inmunización supresora puede comenzar con administraciones más frecuentes y continuar después con refuerzos de seguimiento.

Las cantidades terapéuticamente eficaces del vector con bajo contenido en CpG están en el intervalo de aproximadamente 0,001 microgramos a aproximadamente 1 gramo. Una cantidad terapéutica preferida de vector está en el intervalo de aproximadamente 10 microgramos a aproximadamente 5 miligramos. Una cantidad terapéutica más preferida de autovector está en el intervalo de aproximadamente 0,025 mg a 5 mg.

La vacunación inmunosupresora se considera eficaz si los niveles o títulos de anticuerpos antibiomarcador que se unen activamente al uno o más biomarcadores se reducen o eliminan en una muestra biológica de una paciente después de recibir una o más administraciones del vector que codifica el uno o más polipéptidos biomarcadores. o fragmentos antigénicos, en comparación con antes de la administración del vector. Por ejemplo, una reducción de anticuerpos antibiomarcador que se unen activamente al uno o más biomarcadores en una muestra de al menos aproximadamente un 10 %, 25 %, 50 %, 75 % o 100 % después de una o más administraciones del vector que codifica el polipéptido biomarcador o el fragmento antigénico indica que la administración del vector fue eficaz. Cuando se haya establecido un nivel de umbral, el tratamiento con el vector que comprende un polinucleótido que codifica el uno o más polipéptidos biomarcadores o fragmentos antigénicos se considera eficaz si los niveles o títulos de anticuerpos antibiomarcador que se unen activamente al uno o más polipéptidos biomarcadores se reducen por debajo del nivel umbral. Los anticuerpos antibiomarcador que se unen activamente al uno o más polipéptidos biomarcadores se pueden medir usando cualquier método conocido en la técnica, incluyendo aquellos descritos en el presente documento.

En algunos aspectos, el vector con bajo contenido en CpG contiene un polinucleótido que codifica una o más proteínas fetales seleccionadas del grupo que consiste en proteína 1 de unión a nucleótidos de guanina, gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa, proteína de protección terminal con caperuza de actina F, subunidad alfa-2, uracilo ADN glicosilasa y glutamato deshidrogenasa. El polinucleótido que codifica la una o más proteínas fetales se puede administrar al mismo tiempo o independientemente de un polinucleótido que codifica un polipéptido biomarcador o un fragmento antigénico del mismo, como se describe en el presente documento. En el presente documento se describen aspectos adicionales para la administración de los polinucleótidos que codifican las proteínas fetales.

5. Métodos para reducir el riesgo mediante la eliminación de anticuerpos antibiomarcador

El riesgo de que el feto o niño padezca un TEA se puede reducir o eliminar eliminando los anticuerpos antibiomarcador maternos de un fluido biológico de la madre ex vivo, y devolviendo después el fluido biológico, con niveles reducidos o eliminados de anticuerpos antibiomarcador, a la madre.

La eliminación ex vivo de anticuerpos antibiomarcador se puede realizar en una mujer antes, durante o después del embarazo. En algunos aspectos, los anticuerpos antibiomarcador se eliminan del fluido biológico, dos, tres, cuatro o más veces, según sea apropiado, en cualquier momento durante el embarazo. Por ejemplo, los anticuerpos antibiomarcador pueden eliminarse en uno o más del primer, segundo y/o tercer trimestre del embarazo. En algunos aspectos, los anticuerpos antibiomarcador se eliminan de una mujer que tiene un feto cuyo cerebro ha comenzado a desarrollarse, p. ej., después de aproximadamente 12 semanas de gestación. En algunos aspectos, los anticuerpos antibiomarcador se eliminan una o más veces después del parto, p. ej., en las primeras cuatro semanas después del nacimiento y/o mientras la madre está amamantando al niño. En algunos aspectos, los anticuerpos antibiomarcador se eliminan una o más veces antes del embarazo, por ejemplo, en una mujer cuyo resultado ha dado positivo en la prueba de anticuerpos antibiomarcador y que está intentando quedarse embarazada.

El proceso de eliminación de anticuerpos contra biomarcadores ex vivo se puede realizar una, dos, tres, cuatro o más veces, según sea necesario para eliminar o reducir los anticuerpos antibiomarcador de la madre. La eliminación de los anticuerpos antibiomarcador ex vivo se puede realizar a diario, semanalmente, quincenalmente, mensualmente, bimensualmente, según sea apropiado. En algunos aspectos, se monitorizan los niveles de anticuerpos antibiomarcador en la madre y la eliminación de anticuerpos antibiomarcador ex vivo se realiza si la presencia de anticuerpos antibiomarcador está por encima de un nivel umbral predeterminado. La eliminación de anticuerpos antibiomarcador ex vivo se puede llevar a cabo durante un período de tiempo de 1, 2, 3, 4, 5, 10, 12, 15, 20, 25, 35, 36 semanas o más o menos, según sea apropiado. Por ejemplo, la eliminación de anticuerpos antibiomarcador ex vivo puede interrumpirse si el nivel de anticuerpos antibiomarcador se sitúa por debajo del nivel umbral predeterminado. La eliminación de anticuerpos antibiomarcador ex vivo se puede realizar durante todo el embarazo o durante uno o más del primer, segundo o tercer trimestre del embarazo. La eliminación de anticuerpos antibiomarcador puede comenzar antes de la concepción y puede continuar después del nacimiento, por ejemplo, mientras la madre amamanta al niño.

El fluido biológico contendrá anticuerpos antibiomarcadores maternos. Habitualmente, el fluido biológico es sangre, suero, plasma o leche. En algunos aspectos, el líquido biológico es líquido amniótico.

El fluido biológico materno que contiene anticuerpos antibiomarcador se pone en contacto con uno o más de los polipéptidos biomarcadores o fragmentos antigénicos de los mismos. El uno o más polipéptidos biomarcadores o fragmentos antigénicos pueden purificarse o purificarse sustancialmente a partir de una fuente natural o producirse de forma recombinante o sintética, como se analiza anteriormente. Por ejemplo, los fragmentos de longitud parcial del uno o más polipéptidos biomarcadores que tienen al menos 10 aminoácidos de longitud y que están unidos por anticuerpos antibiomarcador pueden ponerse en contacto con el fluido biológico. En algunos aspectos, los fragmentos de longitud parcial del uno o más polipéptidos biomarcadores que tienen al menos aproximadamente el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % de la longitud total de los polipéptidos biomarcadores puede ponerse en contacto con el fluido biológico. En algunos aspectos, los fragmentos de longitud parcial del uno o más polipéptidos biomarcadores tienen una longitud de aproximadamente 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250 o 300 aminoácidos. Los fragmentos de longitud parcial pueden tener el extremo N o el extremo C del polipéptido biomarcador eliminado o parte tanto del extremo N como del extremo C eliminado. Los fragmentos de longitud parcial del uno o más polipéptidos biomarcadores que se utilizan están unidos por anticuerpos antibiomarcador.

En algunos aspectos, el fluido biológico se pone en contacto con uno o más de una LDH-A y/o una LDH-B. En algunos aspectos, el fluido biológico se pone en contacto con una o más isoenzimas de una LDH-1, LDH-2, LDH-3, LDH-4 y/o LDH-5. En algunos aspectos, el polipéptido de LDH o fragmento antigénico del mismo tiene al menos aproximadamente un 90 %, 93 %, 95 %, 97 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con un polipéptido de LDH como se describe en el presente documento, p. ej., con una secuencia de aminoácidos de número de registro de GenBank NP_001128711, NP_005557.1, AAP36496.1, BAD96798.1 o NP_002291.1.

En algunos aspectos, el fluido biológico se pone en contacto con uno o más polipéptidos biomarcadores o fragmentos antigénicos de los mismos que tienen al menos aproximadamente un 90 %, 93 %, 95 %, 97 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con un polipéptido biomarcador como se describe en el presente documento, p. ej., con una secuencia de aminoácidos de Ld HA de número de registro de GenBank AAP36496.1; BAD96798.1; NP_005557.1 (isoforma 1); NP_001128711.1 (isoforma 2); NP_001158886.1 (isoforma 3); NP_001158887.1 (isoforma 4); o NP_001158888.1 (isoforma 5); con una secuencia de aminoácidos de LDHB de número de registro de GenBank NP_002291.1 (variante 1); o NP_001167568.1 (variante 2); con una secuencia de aminoácidos de CRMP1 de número de registro de GenBank NP_001014809.1 (isoforma 1) o NP_001304.1 (isoforma 2); con una secuencia de aminoácidos de STIP1 de número de registro de GenBank NP_006810.1; con una secuencia de aminoácidos de GDA de número de registro de GenBank NP_004284.1; con una secuencia de aminoácidos de DPYSL2 de número de registro de GenBank NP_001377.1 o BAD92432; con una secuencia de aminoácidos de CAPZA2 de número de registro de GenBank NP_006127.1; con una secuencia de aminoácidos de YBX1 de número de registro de GenBank NP_004550.2; con una secuencia de aminoácidos de EEF1A1 de número de registro de GenBank NP_001393.1; con la secuencia de aminoácidos de MAPT de número de registro de GenBank NP_058519.3 (isoforma 1); NP_005901.2 (isoforma 2); NP_058518.1 (isoforma 3); NP_058525.1 (isoforma 4); NP_001116539.1 (isoforma 5); o NP_001116538.2 (isoforma 6); con una secuencia de aminoácidos de DNM1L de número de registro de GenBank NP_036192.2 (isoforma 1); NP_036193.2 (isoforma 2); NP_005681.2 (isoforma 3); con una secuencia de aminoácidos de NEFL de número de registro de GenBank NP_006149.2; con una secuencia de aminoácidos de RDX de número de registro de GenBank NP_002897.1; con una secuencia de aminoácidos de MSN de número de registro de GenBank NP_002435.1; o con una secuencia de aminoácidos de EZR de número de registro de GenBank NP_003370.2 (isoterma 1) o NP_001104547.1 (isoterma 2).

En algunos aspectos, el agente de eliminación de anticuerpos antibiomarcador es un mimótopo de un biomarcador. El mimótopo de biomarcador puede proceder de un epítopo antigénico conocido del biomarcador diana, con uno o más aminoácidos sustituidos, eliminados o añadidos. El mimótopo de biomarcador puede diseñarse o identificarse de novo, explorando una biblioteca de péptidos para determinar mimótopos que se unen a anticuerpos contra el uno o más biomarcadores.

En algunos aspectos, el fluido biológico de la madre o de la posible madre se pone en contacto con un polipéptido biomarcador o un fragmento antigénico del mismo inmovilizado sobre un soporte sólido. El soporte sólido, puede ser, por ejemplo, una perla, una columna, un filtro. La inmovilización puede realizarse mediante unión covalente o no covalente. En algunos aspectos, la inmovilización se realiza a través de un anticuerpo de captura que se une específicamente al biomarcador diana. El polipéptido biomarcador o fragmentos antigénicos del mismo o el mimótopo de biomarcador unidos al soporte sólido es una fase estacionaria que captura los anticuerpos antibiomarcador en el fluido biológico permitiendo separar el fluido biológico con niveles reducidos o eliminados de anticuerpos antibiomarcador del soporte sólido, es decir, como la fase móvil y devolverlo a la madre o a la posible madre.

En algunas realizaciones, el fluido biológico que se procesa ex vivo es plasma, y los anticuerpos antibiomarcador se eliminan por plasmaféresis, un proceso bien conocido en la técnica. El plasma se pone en contacto con un soporte sólido con uno o más polipéptidos biomarcadores o fragmentos antigénicos de los mismos inmovilizados. Los anticuerpos antibiomarcador en el plasma se unen a los polipéptidos biomarcadores o fragmentos antigénicos de los mismos inmovilizados. El plasma con niveles reducidos o eliminados de anticuerpos antibiomarcador se devuelve a continuación a la madre o a la posible madre.

En un aspecto relacionado, se describen en el presente documento métodos para prevenir o reducir el riesgo de que un feto padezca un TEA que comprenden eliminar los anticuerpos que se unen específicamente a una o más proteínas fetales seleccionadas del grupo que consiste en proteína 1 de unión a nucleótidos de guanina, gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa, proteína de protección terminal con caperuza de actina F, subunidad alfa-2, uracilo ADN glicosilasa y glutamato deshidrogenasa de la madre del feto. La eliminación de anticuerpos maternos contra una o más proteínas fetales seleccionadas del grupo que consiste en proteína 1 de unión a nucleótidos de guanina, gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa, proteína de protección terminal con caperuza de actina F, subunidad alfa-2, uracilo ADN glicosilasa y glutamato deshidrogenasa se puede realizar junto con o de manera independiente de la eliminación de la unión de los anticuerpos maternos contra el uno o más biomarcadores. Los métodos adicionales para la eliminación de los anticuerpos maternos son como se describe en el presente documento.

6. Kits

La invención también proporciona el uso de un kit que comprende un soporte sólido que comprende una o más subunidades o uno o más isotipos de los biomarcadores proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1) o fragmentos antigénicos de los mismos, para determinar si un feto o niño tiene un mayor riesgo de padecer un TEA o si una madre o una posible madre tiene un mayor riesgo de tener un hijo que padecerá un TEA. En algunas realizaciones, el soporte sólido comprende además una o más subunidades o uno o más isotipos de uno o más biomarcadores o fragmentos antigénicos de los mismos, en donde el uno o más biomarcadores se seleccionan del grupo que consiste en una lactato deshidrogenasa (LDH) y una guanina desaminasa (GDA). También se describe, por ejemplo, un soporte sólido que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o más biomarcadores seleccionados de lactato deshidrogenasa (LDH), guanina desaminasa (GDA), proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1), fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1), subunidad alfa de la proteína Cap Z de unión al extremo barbado de actina (CAPZA2), proteína 1 de unión a caja Y (YBX1), factor 1A1 de elongación y traducción eucariota (EEF1A1), proteína Tau asociada a microtúbulos (MAPT), proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2), proteína similar a dinamina 1 (DNM1L), radixina (RDX), moesina (MSN)) y ezrina (EZR).

En algunos aspectos, el soporte sólido comprende uno, dos, tres o todos los biomarcadores seleccionados de lactato deshidrogenasa (LDH), guanina desaminasa (GDA), proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1). En algunos aspectos, el soporte sólido comprende uno, dos o todos los biomarcadores seleccionados de lactato deshidrogenasa (LDH), proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1). En algunos aspectos, el soporte sólido comprende uno, dos o todos los biomarcadores seleccionados de guanina desaminasa (GDA), proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1). En algunos aspectos, el soporte sólido comprende una o ambas de lactato deshidrogenasa (LDH) y proteína 1 mediadora de la respuesta de colapsina (CRMP1). En algunos aspectos, el soporte sólido comprende una o ambas de guanina desaminasa (GDA) y proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1). En algunos aspectos, el soporte sólido comprende una o ambas de lactato deshidrogenasa (LDH) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1). En algunos aspectos, el soporte sólido comprende una o ambas guanina desaminasa (GDA) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1). En algunos aspectos, el soporte sólido comprende lactato deshidrogenasa (LDH). En algunos aspectos, el soporte sólido comprende guanina desaminasa (GDA). En algunos aspectos, el soporte sólido comprende proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1). En algunos aspectos, el soporte sólido comprende fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1).

En algunos aspectos, el soporte sólido comprende uno, dos, tres o todos los biomarcadores seleccionados de lactato deshidrogenasa (LDH), guanina desaminasa (GDA), proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1). En algunos aspectos, el soporte sólido comprende uno, dos o todos los biomarcadores seleccionados de lactato deshidrogenasa (LDH), proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1). En algunos aspectos, el soporte sólido comprende uno, dos o todos los biomarcadores seleccionados de guanina desaminasa (GDA), proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1). En algunos aspectos, el soporte sólido comprende una o ambas de lactato deshidrogenasa (LDH) y proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2). En algunos aspectos, el soporte sólido comprende una o ambas de guanina desaminasa (GDA) y proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2). En algunos aspectos, el soporte sólido comprende proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2).

El soporte sólido, puede ser, por ejemplo, una placa de múltiples pocillos, una placa ELISA, un chip de micromatrices, una perla, una tira porosa, un filtro de nitrocelulosa. La inmovilización puede realizarse mediante unión covalente o no covalente. En algunos aspectos, la inmovilización se realiza a través de un anticuerpo de captura que se une específicamente al uno o más biomarcadores. Los soportes sólidos de los kits se proporcionan preparados con uno o más polipéptidos biomarcadores, fragmentos antigénicos de los mismos o mimótopos de biomarcadores inmovilizados.

En algunos aspectos, el uno o más polipéptidos biomarcadores o fragmentos antigénicos de los mismos se inmovilizan sobre el soporte sólido. El polipéptido biomarcador o el fragmento antigénico pueden purificarse o purificarse sustancialmente a partir de una fuente natural o producirse de forma recombinante o sintética, como se analiza anteriormente. Por ejemplo, se pueden inmovilizar uno o más fragmentos de longitud parcial del uno o más biomarcadores que tienen al menos 10 aminoácidos de longitud y que están unidos por anticuerpos antibiomarcador. En algunos aspectos, los fragmentos de longitud parcial del uno o más biomarcadores que están inmovilizados tienen al menos aproximadamente el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % de la longitud total del polipéptido biomarcador. En algunos aspectos, los fragmentos de longitud parcial del uno o más polipéptidos biomarcadores tienen una longitud de aproximadamente 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250 o 300 aminoácidos. Los fragmentos de longitud parcial pueden tener el extremo N o el extremo C del biomarcador eliminados o parte tanto del extremo N como del extremo C eliminados. Los fragmentos de longitud parcial del uno o más biomarcadores que se utilizan están unidos por anticuerpos antibiomarcador.

En algunos aspectos, una o más de una LDH-A y/o una LDH-B están inmovilizadas sobre el soporte sólido. En algunos aspectos, una o más isoenzimas de una LDH-1, LDH-2, LDH-3, LDH-4 y/o LDH-5 se inmovilizan sobre el soporte sólido. En algunos aspectos, el polipéptido de LDH o fragmento antigénico del mismo tiene al menos aproximadamente un 90 %, 93 %, 95 %, 97 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con un polipéptido de LDH como se describe en el presente documento, p. ej., con una secuencia de aminoácidos de número de registro de GenBank NP_001128711, NP_005557.1, AAP36496.1, BAD96798.1 o NP_002291.1.

En algunos aspectos, el soporte sólido comprende uno o más polipéptidos biomarcadores o fragmentos antigénicos de los mismos que tienen al menos aproximadamente un 90 %, 93 %, 95 %, 97 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con un polipéptido biomarcador como se describe en el presente documento, p. ej., con una secuencia de aminoácidos de LDhA de número de registro de GenBank AAP36496.1; BAD96798.1; NP_005557.1 (isoforma 1); NP_001128711.1 (isoforma 2); NP_001158886.1 (isoforma 3); NP_001158887.1 (isoforma 4); o NP_001158888.1 (isoforma 5); con una secuencia de aminoácidos de LDHB de número de registro de GenBank NP_002291.1 (variante 1); o NP_001167568.1 (variante 2); con una secuencia de aminoácidos de CRMP1 de número de registro de GenBank NP_001014809.1 (isoforma 1) o NP_001304.1 (isoforma 2); con una secuencia de aminoácidos de STIP1 de número de registro de GenBank NP_006810.1; con una secuencia de aminoácidos de GDA de número de registro de GenBank NP_004284.1; con una secuencia de aminoácidos de DPYSL2 de número de registro de GenBank NP_001377.1 o BAD92432; con una secuencia de aminoácidos de CAPZA2 de número de registro de GenBank NP_006127.1; con una secuencia de aminoácidos de YBX1 de número de registro de GenBank NP_004550.2; con una secuencia de aminoácidos de EEF1A1 de número de registro de GenBank NP_001393.1; con la secuencia de aminoácidos de MAPT de número de registro de GenBank NP_058519.3 (isoforma 1); NP_005901.2 (isoforma 2); NP_058518.1 (isoforma 3); NP_058525.1 (isoforma 4); NP_001116539.1 (isoforma 5); o NP_001116538.2 (isoforma 6); con una secuencia de aminoácidos de DNMIL de número de registro de GenBank NP_036192.2 (isoforma 1); NP_036193.2 (isoforma 2); NP_005681.2 (isoforma 3); con una secuencia de aminoácidos de NEFL de número de registro de GenBank NP_006149.2; con una secuencia de aminoácidos de RDX de número de registro de GenBank NP_002897.1; con una secuencia de aminoácidos de MSN de número de registro de GenBank NP_002435.1; o con una secuencia de aminoácidos de EZR de número de registro de GenBank NP_003370.2 (isoforma 1) o NP_001104547.1 (isoforma 2).

En algunos aspectos, el soporte sólido comprende uno o más mimótopos de biomarcadores que se unen a un anticuerpo antibiomarcador. El mimótopo de biomarcador puede proceder de un epítopo antigénico conocido del biomarcador, con uno o más aminoácidos sustituidos, eliminados o añadidos. El mimótopo de biomarcador puede diseñarse o identificarse de novo, explorando una biblioteca de péptidos para determinar mimótopos que se unen a anticuerpos contra el biomarcador.

En algunos aspectos, los kits también comprenden anticuerpos secundarios marcados que se utilizan para detectar anticuerpos o autoanticuerpos en una muestra que se han unido a uno o más polipéptidos biomarcadores, fragmentos antigénicos de los mismos o mimótopos de biomarcadores. Los anticuerpos secundarios se unen a las regiones constantes o "C" de diferentes clases o isotipos de inmunoglobulinas - IgM, IgD, IgG, IgA e IgE. Habitualmente, en los kits se incluye un anticuerpo secundario contra una región constante de IgG, por ejemplo, un anticuerpo secundario contra una de las subclases de IgG, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Los anticuerpos secundarios se pueden marcar con cualquier residuo detectable directa o indirectamente, incluyendo un fluoróforo (es decir, fluoresceína, ficoeritrina, punto cuántico, perla Luminex, perla fluorescente), una enzima (es decir, peroxidasa, fosfatasa alcalina), un radioisótopo (es decir, 3H, 32P, 125I) o un residuo quimioluminiscente. Las señales de marcado se pueden amplificar utilizando un complejo de biotina y un residuo de unión a biotina (es decir, avidina, estreptavidina, neutravidina). Los anticuerpos anti-IgG humana marcados con fluorescencia están disponibles comercialmente en Molecular Probes, Eugene, OR. Los anticuerpos anti-IgG humana marcados con enzimas están disponibles comercialmente en Sigma-Aldrich, St. Louis, MO and Chemicon, Temecula, CA.

Los kits comprenden además instrucciones para poner en contacto los soportes sólidos con una muestra biológica de una madre o posible madre, y para correlacionar la presencia de anticuerpos antibiomarcador maternos o niveles de anticuerpos antibiomarcador maternos por encima de un nivel umbral con mayor probabilidad del feto o niño de padecer un TEA.

En algunos aspectos, los kits también contienen muestras de control positivo y negativo para la detección de anticuerpos antibiomarcador. En algunos aspectos, los kits contienen muestras para la preparación de una curva titulada de anticuerpos antibiomarcador en una muestra, para ayudar en la evaluación de niveles cuantificados de anticuerpos antibiomarcador en una muestra biológica de prueba.

Los kits se utilizan para proporcionar un diagnóstico o pronóstico a cualquier mujer en edad fértil. Se puede determinar un diagnóstico o pronóstico antes, durante o después del embarazo. Como se analiza anteriormente, la detección de anticuerpos antibiomarcador se puede realizar en uno o más del primer, segundo y/o tercer trimestre del embarazo. En algunos aspectos, la detección de anticuerpos antibiomarcador se realiza en una muestra biológica de una mujer que tiene un feto cuyo cerebro ha comenzado a desarrollarse, p. ej., después de aproximadamente 12 semanas de gestación. En algunos aspectos, la presencia o ausencia de anticuerpos antibiomarcador o los niveles cuantificados de anticuerpos antibiomarcador se evalúan una o más veces después del parto, p. ej., en las primeras cuatro semanas después del nacimiento y/o mientras la madre está amamantando al niño. En algunos aspectos, la presencia o ausencia de anticuerpos antibiomarcador o los niveles cuantificados de anticuerpos antibiomarcador se evalúan una o más veces antes del embarazo o en cualquier mujer que no esté embarazada.

En algunos aspectos, los kits contienen un soporte sólido con una o más proteínas inmovilizadas seleccionadas del grupo que consiste en una o más proteínas fetales seleccionadas del grupo que consiste en proteína 1 de unión a nucleótidos de guanina, gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa, proteína de protección terminal con caperuza de actina F, subunidad alfa-2, uracilo ADN glicosilasa y glutamato deshidrogenasa, incluyendo fragmentos antigénicos o mimótopos de las mismas. El soporte también puede tener un polipéptido biomarcador, fragmento antigénico del mismo o mimótopo del mismo inmovilizados. También pueden incluirse en el kit instrucciones para correlacionar la presencia de anticuerpos maternos contra la una o más proteínas fetales, así como muestras de control positivo y negativo. Otros aspectos de los kits se describen en el presente documento.

7. Exploración de agentes de bloqueo

La identificación de agentes que inhiben la unión de anticuerpos antibiomarcador al biomarcador diana se puede evaluar utilizando una variedad de ensayos in vitro, incluyendo aquellos descritos en el presente documento. Dichos ensayos se pueden utilizar para probar inhibidores de anticuerpos antibiomarcador (p. ej., contra 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o más, biomarcadores seleccionados de lactato deshidrogenasa (lDh ), guanina desaminasa (GDA), proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1), fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1), subunidad alfa de la proteína Cap Z de unión al extremo barbado de actina (CAPZA2), proteína 1 de unión a caja Y (YBX1), factor 1A1 de elongación y traducción eucariota (EEF1A1), proteína Tau asociada a microtúbulos (MAPT), proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2), proteína similar a dinamina 1 (DNM1L), radixina (RDX), moesina (MSN) y ezrina (EZR)), y en consecuencia agentes que se utilizan para prevenir, reducir o inhibir la aparición de un TEA.

En algunos aspectos, los ensayos de exploración emplean un antígeno de biomarcador, p. ej., un polipéptido biomarcador o un fragmento antigénico del mismo. El polipéptido biomarcador o el fragmento antigénico pueden purificarse o purificarse sustancialmente a partir de una fuente natural o producirse de forma recombinante o sintética, como se analiza anteriormente. Por ejemplo, se utilizan uno o más fragmentos de longitud parcial del uno o más biomarcadores que tienen al menos 10 aminoácidos de longitud y que están unidos por anticuerpos antibiomarcador. En algunos aspectos, se utilizan fragmentos de longitud parcial del uno o más biomarcadores de al menos aproximadamente el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95% de la longitud total del polipéptido biomarcador. En algunos aspectos, los fragmentos de longitud parcial del uno o más polipéptidos biomarcadores tienen una longitud de aproximadamente 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250 o 300 aminoácidos. Los fragmentos de longitud parcial pueden tener el extremo N o el extremo C del polipéptido biomarcador eliminado o parte tanto del extremo N como del extremo C eliminado. Los fragmentos de longitud parcial de los polipéptidos biomarcadores que se utilizan están unidos por anticuerpos antibiomarcador.

En algunos aspectos, se utilizan una o más de una LDH-A y/o una LDH-B. En algunos aspectos, se utilizan una o más isoenzimas de una LDH-1, LDH-2, LDH-3, LDH-4 y/o LDH-5. En algunos aspectos, el polipéptido de LDH o fragmento antigénico del mismo tiene al menos aproximadamente un 90 %, 93 %, 95 %, 97 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con un polipéptido de LDH como se describe en el presente documento, p. ej., con una secuencia de aminoácidos de número de registro de GenBank NP_001128711, NP_005557.1, AAP36496.1, BAD96798.1 o NP_002291.1. El antígeno LDH también puede ser un mimótopo de LDH.

En algunos aspectos, los ensayos de exploración emplean uno o más polipéptidos biomarcadores o fragmentos antigénicos de los mismos que tienen al menos aproximadamente un 90 %, 93 %, 95 %, 97 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con un polipéptido biomarcador como se describe en el presente documento, p. ej., con una secuencia de aminoácidos de Ld HA de número de registro de GenBank AAP36496.1; BAD96798.1; NP_005557.1 (isoforma 1); NP_001128711.1 (isoforma 2); NP_001158886.1 (isoforma 3); NP_001158887.1 (isoforma 4); o NP_001158888.1 (isoforma 5); con una secuencia de aminoácidos de LDHB de número de registro de GenBank NP_002291.1 (variante 1); o NP_001167568.1 (variante 2); con una secuencia de aminoácidos de CRMP1 de número de registro de GenBank NP_001014809.1 (isoforma 1) o NP_001304.1 (isoforma 2); con una secuencia de aminoácidos de STIP1 de número de registro de GenBank NP_006810.1; con una secuencia de aminoácidos de GDA de número de registro de GenBank NP_004284.1; con una secuencia de aminoácidos de DPYSL2 de número de registro de GenBank NP_001377.1 o BAD92432; con una secuencia de aminoácidos de CAPZA2 de número de registro de GenBank NP_006127.1; con una secuencia de aminoácidos de YBX1 de número de registro de GenBank NP_004550.2; con una secuencia de aminoácidos de EEF1A1 de número de registro de GenBank NP_001393.1; con la secuencia de aminoácidos de MAPT de número de registro de GenBank NP_058519.3 (isoforma 1); NP_005901.2 (isoforma 2); NP_058518.1 (isoforma 3); NP_058525.1 (isoforma 4); NP_001116539.1 (isoforma 5); o NP_001116538.2 (isoforma 6); con una secuencia de aminoácidos de DNMIL de número de registro de GenBank NP_036192.2 (isoforma 1); NP_036193.2 (isoforma 2); NP_005681.2 (isoforma 3); con una secuencia de aminoácidos de NEFL de número de registro de GenBank NP_006149.2; con una secuencia de aminoácidos de RDX de número de registro de GenBank NP_002897.1; con una secuencia de aminoácidos de MSN de número de registro de GenBank NP_002435.1; o con una secuencia de aminoácidos de EZR de número de registro de GenBank NP_003370.2 (isoforma 1) o NP_001104547.1 (isoforma 2).

Los ensayos para identificar compuestos que inhiben la unión de anticuerpos antibiomarcador a uno o más de los biomarcadores pueden ser en estado sólido o solubles. Preferentemente, un polipéptido biomarcador, fragmento antigénico del mismo o mimótopo de biomarcador se inmoviliza sobre un soporte sólido, ya sea covalente o no covalentemente. Los ensayos de exploración in vitro pueden ser bien competitivos o no competitivos. Las técnicas para detectar la unión de un anticuerpo o grupo de anticuerpos a un antígeno son conocidas en la técnica e incluyen aquellas que emplean un anticuerpo antibiomarcador o un antígeno de biomarcador (es decir, un polipéptido del uno o más biomarcadores, un fragmento antigénico del mismo, un mimótopo del mismo) que contiene un marcador o región detectable, y aquellos que implican la inmunoprecipitación o "bajada" de anticuerpos antibiomarcador que se unen al biomarcador diana. Las referencias para realizar inmunoensayos se describen anteriormente.

Numerosos formatos de ensayo que se pueden emplear incluyen análisis FACS, ensayos de centelleo de proximidad ("SPA", por sus siglas en inglés) y ensayos de anticuerpos de tipo sándwich. De igual manera, los soportes sólidos recubiertos de membrana (por ejemplo, perlas y superficies de matriz) se utilizan en la exploración de compuestos que inhiben la unión entre un anticuerpo antibiomarcador y el biomarcador diana. Véanse, p. ej., Baksh, et al., Nature (2004) 427:139; Winter and Groves, Anal Chem (2006) 78:17-80; Moura y Carmona-Ribeiro, Cell Biochem Biophys (2006) 44:446-52; y la patente de los Estados Unidos N.° 6.228.326. Dichas superficies recubiertas de membrana se utilizan en métodos de exploración de alto rendimiento.

Las técnicas para realizar un SPA son bien conocidas en la técnica. El SPA se puede realizar usando una perla o una placa recubierta con un fluido centelleante y una molécula radiomarcada. La proximidad de la molécula radiomarcada al fluido centelleante estimula la emisión de luz. El SPA se puede utilizar para medir la unión de un anticuerpo antibiomarcador a un biomarcador diana mediante, por ejemplo, la unión de un anticuerpo antibiomarcador o polipéptido biomarcador o fragmento antigénico del mismo a una perla de SPA, el radiomarcado del compañero de unión, es decir, el polipéptido biomarcador o fragmento antigénico del mismo o el anticuerpo antibiomarcador, respectivamente, y la medición de la capacidad de un compuesto de prueba para inhibir la producción de luz a partir del polipéptido radiomarcado.

En un aspecto, un inmunoensayo en fase sólida, p. ej., ELISA, electroquimioluminiscencia, se utiliza para explorar inhibidores de anticuerpos antibiomarcador que se unen a uno o más de los biomarcadores de TEA. En algunos inmunoensayos en fase sólida, se pueden recubrir las microesferas o placas de múltiples pocillos (p. ej., 96 pocillos, 384 pocillos, 1536 pocillos) directa o indirectamente con al menos uno de los anticuerpos antibiomarcador de una muestra biológica, un anticuerpo monoclonal antibiomarcador, un polipéptido biomarcador o fragmentos antigénicos del mismo o un mimótopo de biomarcador. El anticuerpo puede ser un anticuerpo intacto o fragmentos de anticuerpos, p. ej., un Fab o una región variable de cadena sencilla. El anticuerpo o antígeno se recubre directamente sobre la placa de múltiples pocilios o se recubre indirectamente a través de un anticuerpo de captura. A continuación, el anticuerpo o antígeno inmovilizados se expone a un compuesto de bloqueo candidato. En ensayos de competición, un compañero de unión marcado (p. ej., una enzima, un radioisótopo, un fluoróforo, etc.) que no estaba inmovilizado, p. ej., un antígeno de biomarcador o un anticuerpo antibiomarcador, se utiliza, después, para detectar si el agente de bloqueo candidato inhibió la unión entre el anticuerpo y el antígeno. En un ensayo no competitivo, el agente de bloqueo candidato puede marcarse y evaluarse para determinar la unión directa bien a un anticuerpo antibiomarcador inmovilizado o a un antígeno de biomarcador inmovilizado.

En un aspecto, las interacciones de unión directa entre un anticuerpo antibiomarcador y un antígeno de biomarcador se miden utilizando un ensayo FRET. FRET es una interacción dependiente de la distancia entre los estados excitados electrónicos de dos moléculas de colorante en la que la excitación se transfiere de una molécula donante a una molécula aceptora sin emisión de un fotón. La transferencia de excitación depende de la distancia y puede utilizarse para determinar la proximidad de dos macromoléculas marcadas con colorante. Para que se produzca la transferencia de energía, las moléculas donante y aceptora deben estar muy próximas (normalmente 10-100 A). De igual manera, el espectro de absorción del aceptor debe solaparse al espectro de emisión de fluorescencia del donante, por lo que es necesario utilizar pares de colorantes compatibles para el marcado de macromoléculas, por ejemplo, Cy3/Cy5 y Cy5/Cy5.5. En la práctica, la interacción de pares de proteínas tales como un anticuerpo antibiomarcador y un antígeno de biomarcador se puede determinar marcando individualmente el antibiomarcador con un primer colorante en el par compatible y el antígeno de biomarcador con un segundo colorante en el par compatible, y después puede detectarse FRET mediante la emisión de fluorescencia del aceptor o desactivando la fluorescencia del donante cuando las proteínas se mezclan en un ensayo. Si el anticuerpo antibiomarcador marcado y el antígeno de biomarcador muestran un FRET medible, esto indica una interacción directa entre el anticuerpo antibiomarcador y el antígeno de biomarcador. El formato de ensayo FRET también se puede llevar a cabo con un bloqueador candidato marcado y un anticuerpo antibiomarcador marcado o un antígeno de biomarcador marcado.

Exploración de alto rendimiento para inhibidores de anticuerpos antibiomarcador

Los métodos de exploración de los bloqueadores de la unión de un anticuerpo antibiomarcador a un antígeno de biomarcador se pueden llevar a cabo de forma conveniente utilizando métodos de alto rendimiento.

En algunos aspectos, los métodos de exploración de alto rendimiento implican proporcionar una biblioteca química o de péptidos combinatoria que contiene un gran número de compuestos terapéuticos potenciales (compuestos moduladores o ligandos potenciales). A continuación, dichas "bibliotecas químicas combinatorias" o "bibliotecas de ligandos" se exploran en uno o más ensayos, como se describe en el presente documento, para identificar aquellos miembros de la biblioteca (especies o subclases químicas particulares) que presentan una actividad característica deseada. Los compuestos identificados de este modo pueden servir como "compuestos principales" convencionales o pueden usarse ellos mismos como agentes terapéuticos potenciales o reales.

Una biblioteca química combinatoria es una colección de diversos compuestos químicos generados por síntesis química o síntesis biológica, mediante la combinación de una serie de "componentes básicos" químicos tales como reactivos. Por ejemplo, una biblioteca química combinatoria lineal tal como una biblioteca de polipéptidos se forma combinando un conjunto de componentes básicos químicos (aminoácidos) de todas las formas posibles para una longitud de compuesto dada (es decir, el número de aminoácidos en un compuesto polipeptídico). Se pueden sintetizar millones de compuestos químicos a través de dicha mezcla combinatoria de componentes básicos químicos.

La preparación y exploración de bibliotecas químicas combinatorias son bien conocidos por los expertos en la materia. Dichas bibliotecas químicas combinatorias incluyen, pero sin limitación, bibliotecas de péptidos (véase, p. ej., la patente de los Estados Unidos 5.010.175, Furka, Int. J. Pept. Prot. Res. 37:487-493 (1991) y Houghton et al., Nature 354:84-88 (1991)). También se pueden usar otros compuestos químicos para generar bibliotecas de diversidad química. Dichos compuestos químicos incluyen, pero sin limitación: peptoides (p. ej., publicación PCT n.° WO 91/19735), péptidos codificados (p. ej., publicación PCT WO 93/20242), biooligómeros aleatorios (p. ej., publicación PCT n° Wo 92/00091), benzodiazepinas (p. ej., patente de los Estados Unidos N.° 5.288.514), diversómeros tales como hidantoínas, benzodiazepinas y dipéptidos (Hobbs et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90:6909-6913 (1993)), polipéptidos vinílogos (Hagihara et al., J. Amer. Chem. Soc. 114:6568 (1992)), peptidomiméticos no peptídicos con armazón de glucosa (Hirschmann et al., J. Amer. Chem. Soc. 114:9217-9218 (1992)), síntesis orgánicas análogas de pequeñas bibliotecas de compuestos (Chen et al., J. Amer. Chem. Soc. 116:2661 (1994)), oligocarbamatos (Cho et al., Science 261:1303 (1993)) y/o fosfonatos de peptidilo (Campbell et al., J. Org. Chem. 59:658 (1994)), bibliotecas de ácidos nucleicos (véase Ausubel, Berger y Sambrook, todos supra), bibliotecas de ácidos nucleicos peptídicos (véase, p. ej., la patente de los Estados Unidos 5.539.083), bibliotecas de anticuerpos (véanse, p. ej., Vaughn et al., Nature Biotechnology, 14(3):309-314 (1996) y PCT/US96/10287), bibliotecas de carbohidratos (véanse, p. ej., Liang et al., Science, 274:1520-1522 (1996) y la patente de los Estados Unidos 5.593.853), bibliotecas de moléculas orgánicas pequeñas (véanse, p. ej., benzodiazepinas, Baum C&EN, enero de 18, página 33 (1993); isoprenoides, patente de los Estados Unidos N.° 5.569.588; tiazolidinonas y metatiazanonas, patente de los Estados Unidos N.° 5.549.974; pirrolidinas, patentes de los Estados Unidos 5.525.735 y 5.519.134; compuestos de morfolino, patente de los Estados Unidos N.° 5.506.337; benzodiazepinas, 5.288.514 y similares).

Los dispositivos para la preparación de bibliotecas combinatorias están disponibles comercialmente (véase, p. ej., 357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA, 433A Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050 Plus, Millipore, Bedford, MA). Adicionalmente, numerosas bibliotecas combinatorias están disponibles comercialmente (véase, p. ej., ComGenex, Princeton, N.J., Tripos, Inc., St. Louis, MO, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD, etc.).

Ensayos solubles y en fase sólida de alto rendimiento

En ensayos de alto rendimiento de la divulgación, es posible explorar hasta varios miles de moduladores o ligandos diferentes en un solo día. En particular, se puede utilizar cada pocillo de una placa de microtitulación para ejecutar un ensayo separado contra un posible modulador seleccionado o, si se van a observar los efectos de la concentración o del tiempo de incubación, cada 5-10 pocillos pueden analizar un solo agente de prueba. Por lo tanto, una sola placa de microtitulación convencional puede determinar aproximadamente 100 (por ejemplo, 96) moduladores. Si se usan placas de 1536 pocillos, entonces una sola placa puede determinar fácilmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 1500 compuestos diferentes. Es posible determinar muchas placas diferentes por día; son posibles exploraciones de ensayo de hasta aproximadamente 6.000-20.000 compuestos diferentes utilizando los sistemas integrados de la divulgación. Más recientemente, se han creado enfoques de microfluidos para la manipulación de reactivos.

La molécula de interés puede unirse al componente en estado sólido, directa o indirectamente, a través de un enlace covalente o no covalente, p. ej., mediante una etiqueta. La etiqueta puede ser cualquiera de una diversidad de componentes. En general, una molécula que se une a la etiqueta (un aglutinante de etiqueta) se fija a un soporte sólido, y la molécula de interés etiquetada (por ejemplo, un anticuerpo antibiomarcador o un antígeno de biomarcador) se une al soporte sólido mediante la interacción de la etiqueta y un aglutinante de etiqueta.

Se pueden usar varias etiquetas y aglutinantes de etiqueta, basándose en interacciones moleculares conocidas, bien descritas en la bibliografía. Por ejemplo, cuando una etiqueta tiene un aglutinante natural, por ejemplo, biotina, proteína A o proteína G, puede usarse junto con aglutinantes de etiqueta adecuados (avidina, estreptavidina, neutravidina, la región Fc de una inmunoglobulina, etc.). Los anticuerpos contra moléculas con aglutinantes naturales tal como la biotina también están ampliamente disponibles (véase, SIGMA Immunochemicals 1998 catálogo SIGMA, St. Louis MO).

De manera similar, se puede usar cualquier compuesto hapténico o antigénico en combinación con un anticuerpo adecuado para formar un par etiqueta/aglutinante de etiqueta. Miles de anticuerpos específicos están disponibles comercialmente y muchos anticuerpos adicionales se describen en la bibliografía. Por ejemplo, en una configuración común, la etiqueta es un primer anticuerpo y el aglutinante de etiqueta es un segundo anticuerpo que reconoce el primer anticuerpo. Además de las interacciones anticuerpo-antígeno, las interacciones receptor-ligando también son adecuadas como pares de etiqueta y etiqueta-aglutinante, tales como agonistas y antagonistas de los receptores de membrana celular (p. ej., interacciones receptor-ligando celular tal como transferrina, c-kit, ligandos de receptores víricos, receptores de citocinas, receptores de quimiocinas, receptores de interleucinas, receptores de inmunoglobulinas y anticuerpos, la familia de la cadherina, la familia de la integrina, la familia de la selectina y similares; véase, p. ej., Pigott & Power, The Adhesion Molecule Facts Book I (1993)). De manera similar, toxinas y venenos, epítopos víricos, hormonas (por ejemplo, opiáceos, esteroides, etc.), receptores intracelulares (p. ej., que median los efectos de diversos ligandos pequeños, incluidos esteroides, hormona tiroidea, retinoides y vitamina D; péptidos), fármacos, lectinas, azúcares, ácidos nucleicos (configuraciones de polímero tanto lineal como cíclico), oligosacáridos, proteínas, fosfolípidos y anticuerpos pueden interactuar todos con varios receptores celulares.

Los enlazadores comunes tales como péptidos, poliéteres y similares también pueden servir como etiquetas e incluyen secuencias polipeptídicas, tales como secuencias poli Gly de entre aproximadamente 5 y 200 aminoácidos. Dichos enlazadores flexibles son conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, los enlazadores de poli(etilenglicol) están disponibles de Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, Alabama. Estos enlazadores tienen opcionalmente enlaces amida, enlaces sulfhidrilo o enlaces heterofuncionales.

Los aglutinantes de etiqueta se fijan a sustratos sólidos usando cualquiera de una diversidad de métodos actualmente disponibles. Los sustratos sólidos se derivatizan o funcionalizan comúnmente exponiendo la totalidad o una porción del sustrato a un reactivo químico que fija un grupo químico a la superficie que es reactivo con una porción del aglutinante de etiqueta. Por ejemplo, los grupos que son adecuados para unirse a una porción de cadena más larga incluyen grupos aminas, hidroxilo, tiol, y carboxilo. Los aminoalquilsilanos e hidroxialquilsilanos pueden utilizarse para funcionalizar una diversidad de superficies, tales como superficies de vidrio. La construcción de tales matrices de biopolímeros en fase sólida está bien descrita en la bibliografía (véase, p. ej., Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963) (que describe la síntesis en fase sólida de, por ejemplo, péptidos); Geysen etal., J. Immun. Meth. 102:259-274(1987) (que describe la síntesis de componentes en fase sólida sobre pasadores); Frank y Doring, Tetrahedron 44:60316040 (1988) (que describe la síntesis de diversas secuencias peptídicas sobre discos de celulosa); Fodor et al., Science, 251:767-777 (1991); Sheldon et al., Clinical Chemistry 39(4):718-719 (1993); y Kozal et al., Nature Medicine 2(7):753759 (1996) (que describen todos matrices de biopolímeros fijados a sustratos sólidos). Los enfoques no químicos para fijar aglutinantes de etiqueta a sustratos incluyen otros métodos comunes, tal como calor, reticulación por radiación UV, y similares.

La divulgación proporciona ensayos in vitro para identificar, en un formato de alto rendimiento, compuestos que pueden modular la interacción de un anticuerpo antibiomarcador y un antígeno de biomarcador. Las reacciones de control que miden la interacción de un anticuerpo antibiomarcador y un antígeno de biomarcador, en ausencia de un posible modulador o en presencia de un modulador conocido, son opcionales, ya que los ensayos son muy uniformes. Sin embargo, tales reacciones de control opcionales pueden ser apropiadas y aumentar la fiabilidad del ensayo.

Ensayos basados en ordenador

Otro ensayo más para determinar compuestos que modulan la interacción de un anticuerpo antibiomarcador y un antígeno de biomarcador implica el diseño de fármacos asistido por ordenador, en el que se utiliza un sistema informático para generar una estructura tridimensional de un polipéptido biomarcador basándose en la información estructural codificada por su secuencia de aminoácidos. La secuencia de aminoácidos de entrada interactúa directa y de manera activa con un algoritmo preestablecido en un programa informático para producir modelos estructurales secundarios, terciarios y cuaternarios de la proteína. Se pueden realizar análisis similares en los sitios de unión de un anticuerpo antibiomarcador. A continuación, se examinan los modelos de la estructura de proteínas para identificar las regiones de la estructura que tienen la capacidad de unirse a anticuerpos antibiomarcador o un antígeno de biomarcador, según sea apropiado. Estas regiones se usan después para identificar polipéptidos u otras moléculas que se unen a un anticuerpo antibiomarcador o un antígeno de biomarcador. Los programas adecuados para el análisis de estructuras incluyen Pyol Molecular Graphic Systems, publicado por Delano Scientific, Palo Alto, c A.

En algunos aspectos, los agentes que bloquean la unión de anticuerpos maternos a una o más proteínas fetales seleccionadas del grupo que consiste en proteína 1 de unión a nucleótidos de guanina, gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa, proteína de protección terminal con caperuza de actina F, subunidad alfa-2, uracilo ADN glicosilasa y glutamato deshidrogenasa se identifican mediante los métodos de exploración descritos en el presente documento. La exploración de agentes que bloquean la unión de anticuerpos maternos a una o más proteínas fetales seleccionadas del grupo que consiste en proteína 1 de unión a nucleótidos de guanina, gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa, proteína de protección terminal con caperuza de actina F, subunidad alfa-2, uracilo ADN glicosilasa y glutamato deshidrogenasa se puede realizar al mismo tiempo o independientemente de la exploración de agentes que bloquean la unión de anticuerpos maternos a uno o más de los biomarcadores descritos en el presente documento.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no para limitar la invención reivindicada.

Ejemplo 1: Identificación de antígenos cerebrales fetales adicionales

Este ejemplo resume la identificación de antígenos cerebrales fetales con pesos moleculares aparentes de 37 kDa, 39 kDa y 73 kDa unidos por anticuerpos maternos.

Materiales y métodos

Sujetos de estudio

Las madres que dieron su consentimiento se inscribieron a través del Center for Children's Environmenta1Health (CCEH) como parte del estudio CHARGE (por sus siglas en inglés, riesgos de autismo infantil de la genética y el medio ambiente) en curso en el M.I.N.D. Institute en la Universidad de California en Davis como se describe anteriormente (Hertz-Picciotto, et al., Environ Health Perspect, (2006) 114(7): 1119-25). La población del estudio CHARGE se tomó como muestra de tres estratos: niños que se considera que tienen autismo o trastornos del espectro autista (TEA), niños seleccionados de la población general que tenían un desarrollo típico (TD, por sus siglas en inglés) y niños con discapacidades del desarrollo sin autismo (d D, por sus siglas en inglés). Se reclutaron familias para este estudio sin sesgo por ningún factor médico o demográfico. El diagnóstico de todos los niños inscritos se confirmó en UC Davis M.I.N.D. Institute como se describe anteriormente (Hansen, et al., Ambul Pediatr, (2008) 8(1):25-31).

Recogida de muestras

La sangre materna se recogió en tubos de dextrosa con citrato de ácido de tapa amarilla (BD Diagnostic, Franklin Lakes, NJ). El plasma se separó de las células, se codificó y se dividió en alícuotas para minimizar los ciclos de congelación/descongelación y se almacenó a -80 °C hasta su uso.

Preparación de antígenos

El cerebro fetal de macaco Rhesus (152 días de gestación) se adquirió del California National Primate Research Center y se utilizó para preparar un extracto de proteínas. El tejido se homogeneizó en un tampón detergente que contenía un cóctel inhibidor de fosfatasa y proteasa (Roche Complete) y se sometió a sonicación. El material insoluble se eliminó mediante centrifugación y se realizó un intercambio de tampón a Tris-HCl 50 mM que contenía LDS al 1 %. La concentración de proteínas se determinó utilizando la reacción del ácido bicinconínico (BCA) (Pierce, Rockford, IL) y se ajustó a 4,5 mg/ml.

Transferencia western

Para el exploración inicial de muestras de plasma materno, se separaron 300 |jg de proteína fetal cerebral de Rhesus (FRB) preparada en condiciones reductoras en un mini gel de SDS-PAGE con gradiente de 4-12 % de pocillo de preparación (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se transfirió electroforéticamente a nitrocelulosa de tamaño de poro de 0,2 jm . El marcador de peso molecular MagicMark (Invitrogen) se cargó en el carril de marcador único permitiendo la visualización quimioluminiscente de las bandas de marcador. Las manchas se tiñeron con Ponceau S (MP Biomedicals, Solon, Ohio) para verificar la carga, migración y transferencia uniformes de proteínas. La membrana de nitrocelulosa se cortó después en tiras de 3 mm de ancho y se sondaron con plasma materno diluido 1:400. Después del lavado, las tiras se incubaron con anti-IgG humana de cabra conjugada con HRP diluida 1:20.000 (Invitrogen). Después se lavaron las tiras, se incubaron con sustrato quimioluminiscente SuperSignal West (Thermo Scientific) y se alinearon en una placa de vidrio para la obtención de imágenes. Las imágenes quimioluminiscentes se adquirieron con un generador de imágenes FluorChem 8900 utilizando el programa informático AlphaEaseFC (Alpha Innotech, San Leandro, CA). Las madres que reaccionaban contra FRB se utilizaron posteriormente para la identificación de antígenos.

Prep Cell

Se separaron 100 mg de FRB por peso molecular utilizando un aparato Prep Cell (Bio Rad, Hercules, CA). Brevemente, La FRB se sometió a electroforesis a través de un gel de poliacrilamida al 10 % cilíndrico de 28 mm durante 17 horas a 12 vatios. Una bomba peristáltica unida a una cámara debajo del gel extrae las proteínas que han migrado del gel a un colector de fracciones que comienza a recogerse cuando el frente del colorante llega a la cámara. Se recogió un total de 110 fracciones a intervalos de 5 minutos a un caudal de 0,75 ml/min. Las fracciones se concentraron a 5 mg/ml usando Amicon Ultra-4 con membranas Ultracel-10k (Millipore, Co. Cork, Irlanda) y se analizó mediante transferencia western para determinar el peso molecular y verificar la reactividad con antígeno (figura 1). La tinción de Ponceau de las membranas de transferencia western confirmó un enriquecimiento sustancial de proteínas por peso molecular, produciendo fracciones con intervalos de aproximadamente 5 kDa que facilitaron el análisis posterior. Las fracciones que contenían proteínas de 37 kDa, 39 kDa o 73 kDa se seleccionaron para la identificación de proteínas.

Electroforesis 2-D

Las fracciones de proteínas derivadas de la separación con Prep Cell que se enriquecieron en antígenos reconocidos por anticuerpos maternos se separaron mediante electroforesis 2-D. Se marcaron 30 jg de cada una de las fracciones de 37 kDa, 39 kDa o 73 kDa con Cy2 (GE Life Sciences) y se prepararon para realizar electroforesis en gel 2-D. Todos los geles 2-D se realizaron por duplicado. Se cargaron 15 jg de cada muestra en cada una de las dos tiras de enfoque isoeléctrico (Amersham BioSciences) de pH 3-10 y se separaron hasta alcanzar el equilibrio. A continuación, las tiras se aclararon y se cargaron en geles de poliacrilamida al 10,5 % (37 kD y 39 kD) o al 8,5 % (73 kD) (Amersham BioSciences) para realizar electroforesis bidimensional. Tras la electroforesis, se adquirieron imágenes de fluorescencia de los geles y se verificó su consistencia utilizando el programa informático Image Quant (versión 6.0, Amersham BioSciences). Uno de los geles se transfirió electroforéticamente a una membrana de nitrocelulosa de poros de 0,2 jm (Whatman). Se realizó una transferencia western en la membrana transferida usando muestras de plasma materno que son positivas para la muestra de antígenos usada en la transferencia y se adquirió una imagen quimioluminiscente de la transferencia resultante usando un generador de imágenes FluorChem 8900 (Alpha Innotech). El tamaño de imagen se ajustó utilizando marcadores internos para que coincida de manera idéntica con el otro, gel 2-D no transferido para alineación de selección de puntos. Los puntos identificados en la imagen de transferencia western se recogieron del gel 2 D usando un Ettan Spot Picker (Amersham BioSciences).

Espectrometría de masas

Los puntos se identificaron por transferencia western y se seleccionaron de nuevo y recogieron del gel 2-D duplicado y se lavaron y digirieron con tripsina (Promega). Los péptidos trípticos se desalaron utilizando un Zip-tip C18 (Millipore), se eluyeron del Zip-tip y se aplicaron en puntos en la placa MALDI (modelo ABI 01-192-6-AB). Se realizaron MS MALDI-TOF MS y m S en tándem con t Of/TOF en un espectrómetro de masas ABI 4700 (Applied Biosystems, Framingham, MA). Se adquirieron espectros de masas MALDI-TOF y espectros de fragmentación Ms en tándem con TOF/TOF para cada muestra, realizando el promedio de 4000 disparos láser por espectro de fragmentación en cada uno de los 10 iones más abundantes presentes en cada muestra. Tanto la masa peptídica resultante como los espectros de fragmentación asociados se analizaron mediante una estación de trabajo GPS Explorer equipada con el motor de búsqueda MASCOT (Matrix science) y se utilizaron para consultar la base de datos del National Center for Biotechnology Information nonredundant (NCBInr). Las búsquedas se realizaron sin limitar el peso molecular o el punto isoeléctrico de las proteínas, con carbamidometilación variable de cisteína y oxidación de restos de metionina y con una escisión omitida también permitida en los parámetros de búsqueda. Los candidatos con una puntuación de % de IC de proteínas o % de IC de iones superior a 95 se consideraron significativos.

Verificación de antígeno

T ransferencias western

Se pueden inmovilizar las proteínas humanas LDH natural purificada (Cell Sciences, Canton, MA), CYP recombinante de longitud completa (Abnova, Taipei, Taiwán), YBX1 recombinante de longitud completa (Abnova), CRMP1 recombinante de longitud completa (OriGene, Rockville, MD) y las proteínas humanas recombinantes de longitud completa STIP1 (Abnova) se analizaron individualmente mediante transferencia western utilizando plasma materno con reactividad a la proteína RFB como el anticuerpo primario. Se utilizaron anticuerpos policlonales disponibles comercialmente para LDH (Abcam, Cambridge, MA), Cy P (Sigma), YBX1 (Abcam), CRMP1 (Abcam) y STIP1 (Abcam) como controles positivos.

Estudios de bloqueo

Las muestras de plasma materno que mostraron reactividad a LDH, así como muestras de plasma de control, se diluyeron 1:400 y se incubaron durante 20 horas a 4 °C en tampón solo o en tampón que contenía 100 |jg de LDH purificada. Estas muestras se utilizaron después para sondar tiras de transferencia western que contenían RFB (figura 4). Entre las madres positivas para reactividad a LDH, la intensidad de la banda se redujo sustancialmente entre las muestras incubadas previamente con proteína LDH. La incubación previa con LDH no afectó la reactividad del plasma materno a otros antígenos.

ELISA

Se diluyó LDH derivada de eritrocitos humanos purificada en tampón de recubrimiento de carbonato y se añadió un total de 2 jg de LDH a cada pocillo de una placa de 96 pocillos y se incubó 16 horas a 4 °C. Después, la placa se enjuagó y bloqueó con albúmina de suero bovino al 5 % y se incubó con plasma materno diluido 1:600 durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, las placas se lavaron y se incubaron con anti-IgG humana de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante (Invitrogen) diluida 1:25000 durante 1 hora. Después se lavaron las placas, se incubaron con sustrato Ultra TMB-ELISA (Thermo Scientific) y se leyeron a 450 nm.

Inhibición de la enzima LDH

Se utilizó la disminución de la absorbancia a 340 nm en un espectrofotómetro BioSpec 1600 (Shimadzu) para monitorizar el efecto de los anticuerpos maternos sobre la función de la enzima LDH. Se incubaron 40 jg de anticuerpos IgG maternos purificados, de madres con reactividad a LDH, así como controles, durante 30 minutos a temperatura ambiente con 1,5 jg de LDH humana purificada. Las mezclas de anticuerpo/enzima se añadieron a una cubeta que contenía 100 j l de dinucleótido de nicotinamida adenina (Sigma) reducido 6,6 mM y 100 j l de piruvato sódico (Sigma) 30 mM diluido en 2,8 ml de Tris-HCl 0,125 M pH 8,0 en una cubeta acrílica de 3 ml (Sarstedt). Se utilizó como blanco una cubeta que contenía Tris-HCl. Se registró el cambio de absorbancia durante 2 minutos para cada muestra.

Resultados

Identificación de antígenos

Se realizaron transferencias western 2-D separadas para las fracciones de Prep Cell que contenían antígenos de 37 kDa, 39 kDa o 73 kDa (figura 2). Cada punto se probó con plasma materno diluido 1:400 de un AUM seleccionado al azar que muestra reactividad a la banda correspondiente. Se observaron múltiples puntos en cada transferencia western 2-D, y todos los puntos claramente definidos se seleccionaron para espectrometría de masas. El análisis de los datos de espectrometría de masas arrojó proteínas para cada punto y se seleccionaron aquellas con un IC del 100 % para su verificación (tabla 1).

Tabla 1. Resultados de^ la es ectrometría de masas

continuación

Verificación de antígeno

Lactato deshidrogenasa

Se usaron LDH natural purificada y subunidades de LDHA y LDHB recombinantes de longitud completa para la verificación de la reactividad de IgG materna mediante transferencia western (figura 3). Las subunidades LDHA y LDHB comparten aproximadamente un 90 % de homología de secuencia y, aunque se observó alguna variación en la reactividad a las subunidades A y B, todos los anticuerpos maternos que eran reactivos a LDH reconocieron ambas subunidades. Por tanto, el exploración de todas las muestras de plasma materno se llevó a cabo con LDH purificada

que contiene ambas subunidades.

Análisis

Las anomalías en el medio inmunitario materno durante el embarazo se han relacionado con AU en varios estudios. Entre ellos destacan los informes de anticuerpos maternos que reaccionan contra las proteínas fetales. El paso facilitado de anticuerpos IgG es un fenómeno bien establecido que, en general, se cree que proporciona protección al recién nacido (Garty, et al., Clin Diagn Lab Immunol, (1994) 1(6): 667-9); y se sabe que tales anticuerpos persisten hasta seis meses después del nacimiento (Heininger, et al., Vaccine, (2006) 24(16):3258-60). Sin embargo, junto con anticuerpos IgG que son inmunoprotectores, los autoanticuerpos que reaccionan a las autoproteínas fetales también pueden atravesar la placenta. Un informe reciente demostró la reactividad de los anticuerpos IgG maternos frente a las células de Purkinje de roedores en una madre de varios niños con TEA, así como la presencia de déficits de comportamiento en las crías de un ratón inyectado durante la gestación con su suero (Dalton, et al., Ann Neurol, (2003) 53(4):533-7). En otro estudio, se encontró que las madres de niños con autismo y sus hijos afectados tenían patrones consistentes de reactividad de anticuerpos contra proteínas cerebrales prenatales (día 18) de rata. En cambio, los niños no afectados y las madres de control tenían patrones alternativos de reactividad (Zimmerman, et al., Brain Behav Immun, (2007) 21(3):351-7).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para determinar el riesgo de una descendencia humana de padecer un trastorno del espectro autista (TEA) que comprende identificar en una muestra biológica de la madre o de la posible madre de la descendencia la presencia de anticuerpos maternos que se unen a un biomarcador proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1), en donde la presencia de anticuerpos maternos que se unen al biomarcador CRMPI indica un mayor riesgo de que la descendencia padezca un TEA.

2. El método de la reivindicación 1, que comprende además identificar en una muestra biológica de la madre o de la posible madre de la descendencia la presencia de anticuerpos maternos que se unen a uno o más biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en una guanina desaminasa (GDA), una lactato deshidrogenasa (LDH), una proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2), una fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIPI) y una proteína 1 de unión a caja Y (YBX1), en donde la presencia de anticuerpos maternos que se unen al uno o más biomarcadores indica un mayor riesgo de que la descendencia padezca un TEA.

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde se detectan la presencia de anticuerpos maternos que se unen al biomarcador CRMP1 y uno o más biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en GDA, LDH y STIP1.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además la detección de la presencia de anticuerpos maternos que se unen a uno o más biomarcadores seleccionados del grupo que consiste en una subunidad alfa de la proteína Cap Z de unión al extremo barbado de actina (CAPZA2), un factor 1 Al de elongación y traducción eucariota (EEF1Al), una proteína Tau asociada a microtúbulos (MAPT), una proteína 1 similar a la dinamina (DNM1L), una radixina (RDX), una moesina (MSN) y una ezrina (EZR).

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el método comprende poner en contacto la muestra biológica con una proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1) sintética o recombinante y uno o más polipéptidos sintéticos o recombinantes seleccionados del grupo que consiste en una guanina desaminasa (GDA), una lactato deshidrogenasa (LDH), una proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2), una fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1) y una proteína 1 de unión a caja Y (YBX1).

6. Uno o más agentes que bloquean la unión de anticuerpos maternos a uno o más biomarcadores fetales que comprenden la proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMP1), para su uso en un método para prevenir o reducir el riesgo de que un feto padezca un TEA mediante la administración de dicho uno o más agentes a la madre, en donde dichos uno o más agentes son polipéptidos del uno o más biomarcadores fetales o un fragmento antigénico de los mismos.

7. El uno o más agentes para su uso en un método para prevenir o reducir el riesgo de que un feto padezca un TEA de acuerdo con la reivindicación 6, que comprende además uno o más agentes que bloquean la unión de anticuerpos maternos a uno o más biomarcadores fetales seleccionados del grupo que consiste en una guanina desaminasa (GDA), una lactato deshidrogenasa (LDH), una proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2), una fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIPl), una proteína 1 de unión a caja Y (YBX1), una subunidad alfa de la proteína Cap Z de unión al extremo barbado de actina (CAPZA2), un factor 1AI de elongación y traducción eucariota (EEF1Al), una proteína Tau asociada a microtúbulos (MAPT), una proteína similar a dinamina 1 (DNMlL), una radixina (RDX), una moesina (MSN) y una ezrina (EZR), en donde dichos uno o más agentes son polipéptidos del uno o más biomarcadores fetales o un fragmento antigénico de los mismos.

8. El uno o más agentes para su uso en un método para prevenir o reducir el riesgo de que un feto padezca un TEA de acuerdo con la reivindicación 6 o 7, en donde el feto se está gestando en la madre o en donde el uno o más agentes deben administrarse antes del embarazo.

9. El biomarcador fetal proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMPl) para su uso en un método para prevenir o reducir el riesgo de que un feto padezca un TEA, en donde el método comprende eliminar los anticuerpos que se unen al biomarcador fetal CRMP1 del plasma de la madre del feto.

10. Un método ex vivo de tratamiento del plasma de la madre de un feto que padece un TEA que comprende eliminar los anticuerpos que se unen al biomarcador fetal proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMPI) del plasma de la madre del feto.

11. El método de la reivindicación 10, en donde el método comprende además eliminar anticuerpos ex vivo que se unen a uno o más biomarcadores fetales seleccionados del grupo que consiste en una guanina desaminasa (GDA), una lactato deshidrogenasa (LDH), una proteína 2 similar a dihidropirimidinasa (DPYSL2), una fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIPl) y una proteína 1 de unión a caja Y (YBX1) del plasma de la madre del feto.

12. El método de la reivindicación 10 u 11, en donde el plasma de la madre se pone en contacto con un polipéptido del uno o más biomarcadores unido a un soporte sólido.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en donde el feto se está gestando en la madre o los anticuerpos se eliminan antes del embarazo.

14. El uso de un kit que comprende un soporte sólido que comprende una o más subunidades o uno o más isotipos de los biomarcadores proteína 1 mediadora de la respuesta a colapsina (CRMPI) y fosfoproteína 1 inducida por estrés (STIP1) o fragmentos antigénicos de los mismos, para determinar si un feto o niño tiene un mayor riesgo de padecer un trastorno del espectro autista (TEA) o si una madre o una posible madre tiene un mayor riesgo de tener un hijo que padecerá un TEA.

15. El uso del kit de la reivindicación 14, en donde el soporte sólido comprende además una o más subunidades o uno o más isotipos de uno o más biomarcadores o fragmentos antigénicos de los mismos, en donde el uno o más biomarcadores se seleccionan del grupo que consiste en una lactato deshidrogenasa (LDH) y una guanina desaminasa (GDA).

16. El uso del kit de la reivindicación 14 o 15, en donde el soporte sólido se selecciona del grupo que consiste en una placa de múltiples pocillos, una placa de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), una micromatriz, una perla, una tira porosa y un filtro de nitrocelulosa.