ES2875459T3 - Complejos nanoensamblados de ácidos nucleicos, avidina y compuestos biotinilados para el uso como portadores de fármacos - Google Patents

Complejos nanoensamblados de ácidos nucleicos, avidina y compuestos biotinilados para el uso como portadores de fármacos Download PDF

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Abstract

Complejos nanoensamblados que comprenden un núcleo que consiste de una secuencia oligonucleotídica y una o más unidades de avidina autoensambladas por medio de interacciones de alta afinidad entre avidina y una o más nucleobases de la secuencia oligonucleotídica, y compuestos biotinilados ensamblados en sitios de unión a biotina en la avidina del núcleo por interacciones de alta afinidad entre avidina y biotina representadas por la Fórmula general (I) NBnAvy(BC)z (I) en donde: - NB son las nucleobases individuales de la secuencia oligonucleotídica de un ácido nucleico monocatenario o bicatenario y n es un número mayor que 16 y hasta 100 000; - Av es una unidad de avidina tetramérica y es un número entero mayor o igual que 1 y que al estar en relación con n está en un intervalo comprendido de (0,0001)-n a (0,0454)-n con la condición de que si el valor en el intervalo de (0,0001)·n a (0,0454)·n es menor que 1, y es igual a 1; - BC son compuestos biotinilados seleccionados de compuestos de Fórmula: - B-Xa-PAb (II) donde B es un residuo de biotina, X es un enlazador que tiene al menos dos residuos funcionalizables y PA es una unidad polimérica de un polímero hidrófilo que tiene al menos dos residuos funcionalizables, uno de los cuales se une al residuo de biotina B con un enlace covalente ya sea directamente o a través del enlazador X por medio de su grupo funcional carboxílico y el segundo está libre o protegido con grupos protectores o se une a fluoróforos o moléculas orientadoras, a es un número comprendido de 0 a 10, b es un número comprendido de 1 a 20; - B-Xa-PAb (III) donde B es un residuo de biotina, X es un enlazador que tiene al menos dos residuos funcionalizables y PA es una unidad polimérica de un polímero hidrófilo que tiene al menos dos residuos funcionalizables, uno de los cuales se une al residuo de biotina B con un enlace covalente ya sea directamente o a través del enlazador X por medio de su grupo funcional carboxílico y el segundo está funcionalizado con un residuo de hidrazina seleccionado de -R-C(=O)-NHNH2, -R-O-C(=O)-NHNH2, -R-NH-(C=O)-NHNH2 -R-NH- (C=S)-NHNH2 y -R-(C6H4)-NHNH2 donde R es un residuo alquilo C1-C10 lineal o ramificado, a es un número comprendido de 0 a 10, b es un número comprendido de 1 a 20; - B-Xa (IV) donde B es un residuo de biotina, X es un enlazador que tiene al menos dos residuos funcionalizables, uno de los cuales se une al residuo de biotina B con un enlace covalente directamente por medio de su grupo funcional carboxílico y el segundo está funcionalizado con un residuo de hidrazina seleccionado de -R-C(=O)- NHNH2, -R-O-C(=O)-NHNH2, -R-NH-(C=O)-NHNH2 -R-NH-(C=S)-NHNH2 y -R-(C6H4)-NH-NH2 donde R es un residuo alquilo C1-C10 lineal o ramificado, a es un número en el intervalo comprendido de 1 a 10, z es un número entero mayor o igual a 1 y que al estar en relación con y está en un intervalo comprendido de (0,02)-y a (4)-y con la condición de que si el valor en el intervalo de (0,02)·y a (4)·y es menor que 1, z es igual a 1, con la condición de que los sitios de unión a biotina en la avidina del núcleo NBnAvy estén saturados al menos un 5 % con compuestos biotinilados de Fórmula B-Xa-PAb (III), y en donde los compuestos biotinilados de Fórmula (III) y/o (IV) se conjugan con un enlace de hidrazona con moléculas bioactivas que tienen al menos un grupo carbonilo a través de dicho grupo carbonilo.

Description

DESCRIPCIÓN
Complejos nanoensamblados de ácidos nucleicos, avidina y compuestos biotinilados para el uso como portadores de fármacos
Campo de la invención
La invención se refiere a complejos nanoensamblados de secuencias de oligonucleótidos de ácidos nucleicos, avidina y compuestos biotinilados, estos últimos funcionalizados para transportar y liberar fármacos unidos a los mismos mediante un enlace reversible.
Estado de la técnica
El desarrollo de tecnologías basadas en diferentes tipos de nanopartículas está abriendo importantes aplicaciones tanto en el campo terapéutico como en el diagnóstico.
El objetivo que se persigue con las últimas investigaciones es desarrollar nanosistemas de transporte multifuncionales que puedan suministrar moléculas con diferentes funciones (es decir, moléculas bioactivas y/o trazadoras) específicamente al sitio anatómico deseado y de una manera más eficiente. El problema técnico no solo está relacionado con la capacidad de cargar los diversos compuestos que se entregarán en las nanopartículas, sino también de controlar su carga útil individual de una manera reproducible y conveniente. Particularmente interesantes en este contexto son los nanocomplejos basados en la interacción de alta afinidad entre avidina y biotina.
Desde el punto de vista práctico, de hecho, la propiedad de la avidina de tener una afinidad alta y múltiple por la biotina representa la base para su uso como herramienta molecular para una serie de aplicaciones biotecnológicas. Debido a estas propiedades, la avidina puede actuar de hecho como un puente molecular para unir diferentes unidades biológicas o químicas de manera estable, con la condición de que estas últimas estén unidas covalentemente a una molécula de biotina (Wilchek M y Bayer EA, 1988; Wilchek M y Bayer EA, 1990).
Las aplicaciones más habituales de la tecnología avidina-biotina se encuentran dentro del campo analítico, más precisamente en los sistemas de detección y cuantificación que suelen basarse en la posibilidad de unión de un anticuerpo, o cualquier otra molécula que tenga alta afinidad por el analito (ligando/antígeno), con un sistema de señalización (un fluoróforo, una enzima capaz de emitir luz/color, un radionúclido, etc.). Otras aplicaciones incluyen la funcionalización de superficies con entidades químicas/bioquímicas específicas, un procedimiento que a menudo se realiza explotando el puente molecular que consiste en el complejo avidina:biotina.
En otra aplicación, los fármacos o elementos de diagnóstico, administrados por vía parenteral, se dirigen a sitios anatómicos específicos (Goldenberg DM y otros, 2006).
Uno de los principales límites de la tecnología tradicional avidina:biotina, sin embargo, es el número máximo, igual a cuatro, de biotinas que pueden unirse a una sola molécula de avidina, que constituye el "núcleo" central del sistema, siendo esta conocido como una proteína tetramérica. La posibilidad de tener un núcleo central capaz de unir más moléculas de biotina aumentaría teóricamente el potencial del sistema.
Esta capacidad aumentada se puede lograr uniendo más moléculas de avidina en una unidad definible como unidad de poliavidina.
El impulso sustancial al desarrollo de una tecnología de poliavidina derivó del descubrimiento de la capacidad de la avidina para unirse también a ácidos nucleicos con interacciones de alta afinidad con las nucleobases de los mismos (Morpurgo M, y otros 2004). Esto condujo al desarrollo de nanocomplejos formados por ácidos nucleicos/avidina/biotina autoensamblados alrededor de un núcleo central formado por un ácido nucleico y múltiples unidades de avidina en una relación estequiométrica entre la avidina y los pares de bases nucleicas igual a 1 (avidina) y 28 (nucleobases). La avidina ensamblada por afinidad en el ácido nucleico conserva su capacidad para unirse a biotina con una relación estequiométrica de 1:4 (unidades de avidina:biotina), la unidad de avidina consta de 4 subunidades. De hecho, las interacciones ácido nucleico:avidina involucran regiones específicas de la proteína, pero no involucran el sitio de unión de la biotina que, por lo tanto, permanece libre para unirse a otros compuestos biotinilados, es decir, compuestos derivados de la conjugación covalente con biotina, de acuerdo con la conocida tecnología avidina:biotina antes mencionada, mediante enlaces de alta afinidad.
El problema sustancial de estos nanocomplejos ensamblados, sin embargo, es su escasa estabilidad con la formación de agregados en un ambiente salino acuoso, como el fisiológico.
Para obviar este problema técnico, que en realidad inutiliza estas nanopartículas para aplicaciones terapéuticas y/o diagnósticas, las nanopartículas derivadas de esta doble interacción ácido nucleico:avidina y avidina:biotina, en la que la biotina que se une por medio de un enlace covalente a un polímero hidrófilo capaz de asegurar la protección de la superficie de estos nanocomplejos, se ha desarrollado. Estos complejos nanoensamblados están representados por la fórmula general NBnAvy(B-Xa-PAb)z (NB = nucleobase; Av = avidina; B = biotina; X = enlazador; PA = polímero hidrófilo) (Morpurgo M y otros, 2009; Pignatto M y otros, 2010).
Esto permitió obtener nanopartículas, constituidas por estos nanocomplejos, que son solubles y estables en medio acuoso y que tienen una composición muy definida, siendo obtenibles mediante interacciones de alta afinidad basadas en relaciones estequiométricas entre nucleobase:avidina:biotina.
Estos nanocomplejos se han comparado con complejos similares basados en la interacción tradicional avidina:biotina en un estudio analítico in vitro basado en inmunodetección y demostró ser mucho más eficiente en la determinación del analito (Morpurgo M y otros, 2012).
Estudios recientes llevados a cabo con nanopartículas que se unen covalentemente a dos fluoróforos han demostrado que las mismas tras su administración in vivo circulan libremente en el torrente sanguíneo, tienen una capacidad de internalización en las células dependiente del tiempo y se eliminan eficazmente de 24-48 horas. Estas nanopartículas también han mostrado poca inmunogenicidad (Bigini P y otros, 2014). Estos resultados hacen que estas nanopartículas sean interesantes no solo para el uso en el campo diagnóstico sino también terapéutico para la administración de fármacos el documento WO2015/011675 sugiere usar las nanopartículas mencionadas anteriormente para transportar moléculas para uso diagnóstico y moléculas bioactivas para uso terapéutico, unidas al polímero hidrófilo.
De hecho, una necesidad profundamente sentida en la industria farmacéutica es desarrollar tecnologías avanzadas de suministro específico de sitio y liberación controlada de fármacos con el fin de mejorar el índice terapéutico de los mismos.
Por tanto, un objeto de la presente invención es desarrollar un sistema para la administración y liberación controlada de fármacos basado en el uso de nanopartículas constituidas por ácidos nucleicos/avidina/compuestos biotinilados nanoensamblados.
Resumen
Para este propósito, los inventores han creado nanopartículas de complejos nanoensamblados de ácidos nucleicos/avidina/compuestos biotinilados en los que el fármaco se une a compuestos biotinilados que interactúan con el sitio de unión de la biotina en la avidina, de modo que puedan ser administrados y posteriormente liberados por las mismas nanopartículas. Por tanto, la unión entre los compuestos biotinilados de los complejos nanoensamblados y el fármaco a suministrar no puede ser un enlace estable de tipo covalente sino reversible, aunque suficientemente estable para permitir que las nanopartículas suministren el fármaco. A este respecto, el enlace de hidrazona parece particularmente interesante.
Por tanto, en un aspecto, la presente invención se refiere a complejos nanoensamblados que comprenden:
a) un núcleo que consiste de una secuencia oligonucleotídica y una o más unidades de avidina autoensambladas por medio de interacciones de alta afinidad entre avidina y una o más nucleobases de la secuencia oligonucleotídica, y b) compuestos biotinilados ensamblados en sitios de unión a biotina en la avidina del núcleo mediante interacciones de alta afinidad entre avidina y biotina representadas por la fórmula general (I)
NB„Avy(BC)z (I)
en donde:
- NB son nucleobases individuales de la secuencia oligonucleotídica de un ácido nucleico monocatenario o bicatenario y n es un número superior a 16 y hasta 100000;
- Av es una unidad de avidina tetramérica y es un número entero mayor o igual que 1 y está en relación con n que está en un intervalo entre (0,0001)^n y (0,0454)^n con la condición de que si el valor en el intervalo de (0,0001)n a (0,0454)n es menor que 1, y es igual a 1;
- BC son compuestos biotinilados seleccionados de compuestos de Fórmula:
- B-Xa-PAí, (II) donde B es un residuo de biotina, X es un enlazador que tiene al menos dos residuos funcionalizables y PA es una unidad polimérica de un polímero hidrófilo que tiene al menos dos residuos funcionalizables, uno de los cuales se une al residuo de biotina B con un enlace covalente ya sea directamente o a través del enlazador X por medio de su grupo funcional carboxílico y el segundo está libre o protegido con grupos protectores o se une a fluoróforos o moléculas orientadoras, a es un número comprendido de 0 a 10, b es un número comprendido de 1 a 20; - B-Xa-PAb (III) donde B es un residuo de biotina, X es un enlazador que tiene al menos dos residuos funcionalizables y PA es una unidad polimérica de un polímero hidrófilo que tiene al menos dos residuos funcionalizables, uno de los cuales se une al residuo de biotina B con un enlace covalente ya sea directamente o a través del enlazador X por medio de su grupo funcional carboxílico y el segundo está funcionalizado con un residuo de hidrazina seleccionado de -R-C(=O)-NHNH2, -R-O-C(=O)-NHNH2, -R-NH-(C=O)-NHNH2 -R-NH-(C=S)-NHNH2 y e- -R-(CaH4)-NHNH donde R es un residuo alquilo C1-C10 lineal o ramificado, a es un número comprendido de 0 a 10, b es un número comprendido - B-Xa (IV) donde B es un residuo de biotina, X es un enlazador que tiene al menos dos residuos funcionalizables, uno de los cuales se une al residuo de biotina B con un enlace covalente directamente por medio de su grupo funcional carboxílico y el segundo está funcionalizado con un residuo de hidrazina seleccionado de -R-C(=O)-NHNH2, -R-O-C(=O)-NHNH2, -R-NH-(C=O)-NHNH2 -R-NH-(C=S)-NHNH2 y -R-(CaH4)-NH-NH donde R es un residuo alquilo C1-C10 lineal o ramificado, a es un número comprendido de 1 a 10, y
z es un número entero mayor o igual a 1 y que al estar en relación con y comprende de (0,02)^y hasta (4)^y con la condición de que si el valor en el intervalo de (0,02)y a (4 )y es menor que 1, z es igual a 1, con la condición de que los sitios de unión a biotina en la avidina del núcleo NBnAvy estén saturados al menos un 5 % con compuestos biotinilados de Fórmula B-Xa-PAí, (III), y en donde los compuestos biotinilados de Fórmula (III) y/o (IV) se conjugan con un enlace de hidrazona -NH-N= con moléculas bioactivas que tienen al menos un grupo carbonilo a través de dicho grupo carbonilo.
Por tanto, en otro aspecto, como objeto adicional de la invención, se proporcionan los conjugados hidrazónicos de nanocomplejos de Fórmula general (I), en los que se conjugan los compuestos biotinilados de Fórmula (III) y/o (IV) funcionalizados con residuos de hidrazina por un enlace de hidrazona con moléculas bioactivas que tienen un grupo carbonilo a través de dicho grupo carbonilo.
En otro aspecto más, otro objeto de la invención se refiere al uso de complejos nanoensamblados de Fórmula general (I) como portador para suministrar moléculas bioactivas.
Las ventajas proporcionadas por la presente invención resultarán fácilmente evidentes para un experto en la técnica a partir de la siguiente descripción detallada de las modalidades particulares, dada a modo de ejemplo no limitativo, y con referencia a las siguientes figuras.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. La Figura muestra el esquema de ensamblaje de nanopartículas a partir de los diferentes componentes (avidina, ácido nucleico y agentes de recubrimiento y funcionalización biotinilados), y el mecanismo modular de liberación del fármaco dependiente del pH a partir del enlace hidrazina.
Figura 2. La Figura muestra los compuestos biotinilados indicados en los ejemplos 2-9.
Figura 3. La Figura muestra los resultados de la cinética de liberación de dexametasona a partir de los complejos nanoensamblados de los ejemplos 2, 3, 4, en función del tiempo y del pH.
Figura 4. La Figura muestra los resultados de la cinética de liberación de doxorrubicina a partir de los complejos nanoensamblados del ejemplo 7, en función del tiempo y del pH.
Descripción detallada de la invención
Definiciones
Los términos "nanocomplejos", "nanoensamblados" y "compuestos nanoensamblados" se utilizan para designar los complejos obtenidos por un autoensamblaje dual. El primer autoensamblaje se produce por interacciones de alta afinidad entre las nucleobases (NB) de una secuencia oligonucleotídica de un ácido nucleico monocatenario o bicatenario y una o más unidades de la proteína tetramérica avidina (Av), en adelante también denominada unidad de avidina, y conduce a la formación de un núcleo central NBnAvy. El segundo autoensamblaje es entre la avidina del núcleo central NBnAvy obtenido del primer autoensamblaje NB:Avy biotina (B) de uno o más compuestos biotinilados BC que se autoensamblan en el núcleo NbnAvy por interacciones de alta afinidad en los sitios de unión a biotina a avidina. Dichos complejos autoensamblados están en forma de nanopartículas toroidales, por lo que también se denominan en la presente descripción "nanopartículas" (abreviado NP).
El término "ácido(s) nucleico(s)" se refiere a ácidos nucleicos monocatenarios o bicatenarios que consisten en cualquier secuencia de un ácido desoxirribonucleico (ADN) monocatenario o bicatenario, cualquier secuencia de un ácido ribonucleico (ARN) como un de cadena o hibridación con una cadena de ARN o ADN complementaria, o una secuencia de estos ácidos nucleicos en la que una porción o todas las bases han sido modificadas químicamente que pueden estar en forma lineal o circular, en estado relajado, enrollado o superenrollado.
El término avidina denota la proteína tetramérica, tanto nativa de huevos de gallina u otra fuente similar (huevos volátiles en general) como recombinante tanto en la forma glicosilada como desglicosilada. También se contemplan otras formas de avidina modificada química o genéticamente, con la condición de que sean capaces de autoensamblarse en una secuencia oligonucleotídica de ácido nucleico monocatenario y bicatenario como se definió anteriormente.
Por dendrímero se entiende un compuesto macromolecular simétrico que consiste de ramificaciones repetidas alrededor de un núcleo central que consiste de una molécula más pequeña con múltiples grupos funcionales, o un núcleo polimérico. Los grupos funcionales presentes en la superficie del dendrímero, cuyo número depende del número de ramificaciones del mismo, son a su vez funcionalizables con otras moléculas que incluyen, por ejemplo, los polímeros PA.
En los complejos nanoensamblados de la presente invención, las unidades poliméricas PA son polímeros biocompatibles e hidrófilos y son polímeros conocidos (Owens DE y Peppas NA, 2006). Dichas unidades poliméricas se seleccionan del grupo que consiste en óxido de polietileno o polietilenglicol (PEO o PEG) opcionalmente también sustituido, un copolímero de polioxietileno y polioxipropileno (PEO-PPO), polivinilpirrolidona (PVP), poliacriloilmorfolina (PacM), una polioxamina, un copolímero de ácido poliláctico (PLA), poliglicólico (PLG), ácido láctico y ácido glicólico (PLGA).
Los términos "aglutinante", "enlazador" y "espaciador" usados en la presente descripción deben considerarse equivalentes para los propósitos de la presente descripción de la invención.
Incluso cuando no se indique específicamente, el término "agente de recubrimiento" o "agente protector" debe entenderse como compuestos biotinilados BC, en los que el polímero PAestá presente con el propósito de salvaguardar la estabilidad de los complejos en ambiente salino independientemente de su funcionalización en el segundo grupo funcional. Estos compuestos biotinilados pueden ser compuestos de Fórmula B-Xa-PAb (II) y/o (III).
El término "elemento orientador" se refiere a moléculas capaces de dirigir las nanopartículas funcionalizadas dirigiéndolas hacia el sitio diana para el tratamiento terapéutico. Por tanto, el término incluye ligandos para receptores o antígenos específicos, como anticuerpos para un antígeno específico, ácido fólico para su receptor o azúcares como galactosa para sus receptores hepáticos.
Descripción
Los complejos nanoensamblados de Fórmula general (I) NBnAvy(BC)z, donde NB, Av, BC y n, y z tienen los significados mencionados anteriormente, tienen una composición bien definida basada en las relaciones estequiométricas entre NB:Av:B y están en forma de nanopartículas discretas en términos de tamaño, en las que la protección y la estabilidad en un ambiente salino, como el fisiológico, del núcleo central NBnAvy están aseguradas por los polímeros hidrófilos presentes en la superficie.
En comparación con la técnica anterior, estos complejos nanoensamblados NBnAvy(BC)z mencionados anteriormente tienen la particularidad de comprender en todos los casos compuestos biotinilados de Fórmula (III) y/o (IV), ambos respectivamente iguales o diferentes entre sí, caracterizados porque tienen un residuo de hidrazina seleccionado de: una hidrazida -R-C(=O)-NHNH2, una hidracina carboxilada -R-O-C(=o )-NHNH2, una semicarbazida -R-NH-C(=O)-NHNH2, una tiosemicarbazida -R-NH-C(=S)-NHNH2 y una arilhidrazina -R-(C6^ )-N H N H 2, en donde R es un residuo de alquilo C1-C10 lineal o ramificado.
Por tanto, los compuestos biotinilados BC pueden seleccionarse de compuestos de Fórmula (III) B-Xa-PAb cuando la funcionalización es sobre un polímero PA, o de Fórmula (IV) B-Xa cuando la funcionalización de la hidracina está en un espaciador que se une a la biotina. Independientemente de si dicha funcionalización diferente está en un segundo grupo funcional del polímero hidrófilo PA o en un espaciador al menos bifuncional que une una biotina por su carboxilo, esto permite la conjugación por un enlace de hidrazona de una molécula bioactiva que tiene al menos un aldehído. o cetona carbonilo de acuerdo con la reacción:
Figure imgf000005_0001
El enlace de hidrazona es reversible, ya que puede someterse a un proceso de hidrólisis de doble enlace a pH ácido y también hasta pH fisiológico en torno a 7,4.
En cualquier caso, sin embargo, para garantizar la estabilidad de estos nanoensamblados, el requisito de que al menos el 5 % de los sitios de unión a biotina en la avidina del núcleo NBnAvy están saturados con compuestos biotinilados que llevan un polímero PA de fórmula B-Xa-PAb, iguales o diferentes entre sí independientemente de la funcionalización del polímero PA, es un requisito esencial en lo que respecta a la estabilidad del nanocomplejo en medio salino acuoso. Por tanto, en una primera modalidad, los nanocomplejos de Fórmula general (I) tienen compuestos biotinilados de Fórmula (III) B-Xa-PAb, iguales o diferentes entre sí, donde el polímero hidrófilo de PA está funcionalizado con residuos de hidrazina, también son, independientemente de la funcionalización del mismo, agentes protectores de superficie. Se asume que la unidad polimérica PA es un polietilenglicol (PEG), polímero que para los fines de la presente invención es preferible junto con su copolímero con polioxipropileno (PEG-PPO), cuando el polímero PA tiene una funcionalización de hidrazina, dependiendo de esta funcionalización el compuesto biotinilado puede ser de Fórmula:
B-C(=O)-Xa-(CH2CH2-O)m-R-C(=O)-NHNH2 (V),
B-C(=O)-Xa-(CH2CH2-O)m-R-O-C(=O)-NHNH2 (VI),
B-C(=O)-Xa-(CH2CH2-O)m-R-NH-C(=O)-NHNH2 (VII),
B-C(=O)-Xa-(CH2CH2-O)m-R-NH-C(=S)-NHNH2 (VIII),
B-C(=O)-Xa-(CH2CH2-O)m-R-(CaH4)-NHNH2 (IX).
Los compuestos biotinilados de Fórmula (V) y (VI) se prefieren para los propósitos de la presente invención y preferentemente R está entre 2 y 10 y más preferentemente está entre 2 y 6.
Dichos compuestos biotinilados pueden suministrar moléculas iguales o diferentes, seleccionadas de moléculas bioactivas para uso terapéutico, que tienen un grupo carbonilo de cetona o aldehído, unidas por un enlace de hidrazona al polímero PA del agente de recubrimiento B-Xa-PA*.
El compuesto biotinilado de fórmula B-Xa-PA* conjugado con un enlace de hidrazona a un fármaco Z por lo tanto puede representarse mediante las Fórmulas generales:
B-C(=O)-Xa-(CH2CH2-O)m-R-C(=O)-NHN=Z (Va),
B-C(=O)-Xa-(CH2CH2-O)m-R-O-C(=O)-NHN=Z (VIa),
B-C(=O)-Xa-(CH2CH2-O)m-R-NH-C(=O)-NHN=Z (VIIa),
B-C(=O)-Xa-(CH2CH2-O)m-R-NH-C(=S)-NHN=Z (VIIIa),
B-C(=O)-Xa-(CH2CH2-O)m-R-(C6H4)-NHN=Z (IXa).
Sin embargo, una característica significativa de estas nanopartículas está relacionada con el hecho de que los sitios de unión a biotina presentes en las unidades de avidina del núcleo central (NB)nAvy no puede ser completamente saturados por el agente protector de superficie biotinilado B-Xa-PA* de Fórmula (II) y/o (III) por razones que surgen de elecciones tanto físicas como preparativas.
En el primer caso, la saturación incompleta de los sitios de unión a biotina sobre avidina es una consecuencia directa de las relaciones estequiométricas entre las unidades de avidina y las biotinas del agente protector utilizado en la preparación de los compuestos nanoensamblados y, por tanto, es una condición que se persigue en el preparación de las mismas nanopartículas.
En el segundo caso, en cambio, la presencia de sitios de unión a biotina libres en las unidades de avidina del núcleo central puede ser una consecuencia de los efectos estéricos de los polímeros de los agentes de recubrimiento presentes en la superficie de las nanopartículas, que pueden bloquear el acceso de otros agentes de recubrimiento B-Xa-PA* para lo mismo.
En cualquier caso, esto deja los sitios de unión a biotina en la avidina libres para otras interacciones de alta afinidad entre las unidades de avidina y otros compuestos biotinilados, diferentes del agente protector B-Xa-PA*, capaz de penetrar las nanopartículas, a pesar de la presencia de los polímeros de los agentes de recubrimiento en la superficie. Este segundo compuesto biotinilado puede ser incluido en las nanopartículas mediante procesos de adsorción facilitados por la alta afinidad entre avidina y biotina del complejo nanoensamblado NBnAvy(BC)z.
Esto, por lo tanto, permite suministrar moléculas, iguales o diferentes entre sí, seleccionadas de moléculas bioactivas para uso terapéutico uniéndolas mediante un enlace de hidrazona a un espaciador funcionalizado de una biotina adicional diferente de la del agente de recubrimiento.
Por tanto, en una segunda modalidad de estas nanopartículas utilizables como portadores, los sitios de unión a biotina libre pueden saturarse con compuestos biotinilados de Fórmula (IV), en donde la biotina puede unir a través de un enlazador X un residuo con función hidrazina a través del cual se conjuga con un moléculas bioactivas del enlace de hidrazona para uso terapéutico, que tienen un grupo carbonilo cetona o aldehído, iguales o diferentes entre sí. Estos compuestos biotinilados se pueden representar, por ejemplo, mediante las Fórmulas generales:
B-C(=O)-Xa-R-C(=O)-NHNH2 X),
B-C(=O)-Xa-R-O-C(=O)-NHNH2 (XI),
B-C(=O)-Xa-R-NH-C(=O)-NHNH2 (XII),
B-C(=O)-Xa-R-NH-C(=S)-NHNH2 (XIII),
B-C(=O)-Xa-R-(C6H4)-NHNH2 (XIV)
y sus compuestos conjugados con un enlace de hidrazona a un fármaco Z con las Fórmulas generales:
B-C(=O)-Xa-R-C(=O)-NHN=Z (Xa),
B-C(=O)-Xa-R-O-C(=O)-NHN=Z (Xla),
B-C(=O)-Xa-R-NH-C(=O)-NHN=Z (XIIa),
B-C(=O)-Xa-R-NH-C(=S)-NHN=Z (XIIIa),
B-C(=O)-Xa-R-(CaH4)-NHN=Z (XIVa).
También en este caso, los compuestos biotinilados de Fórmula (X) y (XI) son preferidos para los propósitos de la presente invención y preferentemente R está entre 2 y 10 y más preferentemente está entre 2 y 6.
En esta segunda modalidad, el agente de recubrimiento biotinilado puede ser de Fórmula (II) y o (III). En este último caso, el compuesto biotinilado tiene tanto la función de protección de la superficie de las nanopartículas como la de transportar moléculas bioactivas conjugadas unidas por un enlace de hidrazona.
Esta característica es muy importante para fines de aplicación terapéutica, ya que permite diseñar y preparar nanopartículas de acuerdo con las necesidades terapéuticas que se persiguen con una liberación modulada y controlada de fármacos conjugados a los compuestos biotinilados, ya sea el agente protector de superficie u otros compuestos biotinilados que no se unen a los polímeros.
De hecho, si el fármaco se conjuga con el polímero PA del agente protector de superficie B-Xa-PA*, dado que se expone en la superficie de la nanopartícula, se someterá a procesos hidrolíticos más rápidamente en comparación con un fármaco conjugado con compuestos biotinilados representados por la Fórmula general (IV) desprovista del polímero de recubrimiento superficial PA, y por tanto internalizado en la nanopartícula.
En este caso, de hecho, además de proteger las nanopartículas, el agente de recubrimiento B-Xa-PA*, también puede proteger los compuestos biotinilados conjugados al fármaco de acuerdo con una de las Fórmulas (Xa) a (XIVa) y permitir una liberación sostenida de los mismos en el tiempo, mientras que el fármaco conjugado al polímero de acuerdo con una de las Fórmulas (Va) a (IXa) puede someterse a una liberación rápida. De hecho, como se muestra en la Figura 3 (segundo y tercer panel) y la tabla 1, inesperadamente encontramos que cuando las nanopartículas se funcionalizaron solo con el derivado biotina-hidrazona de la dexametasona de Fórmula (VIa), o con una mezcla de dos biotina hidrazonas de Fórmulas (VIa) y (Xa), la cinética de liberación del fármaco, expresada como % de dexametasona liberada sobre el fármaco de dexametasona total en la NP, fue diferente. En particular, la liberación fue más rápida (15,4 % de liberación después de 72 h a pH 4,0) cuando se probaron las NP con el derivado (VIa) (Dex:NP = 530) en comparación con el uso de la mezcla (Vla):(Xa):NP 530:320:1 (10,6 % de liberación a las 72 h). Esta diferencia solo puede explicarse por el hecho de que las dos hidrazonas de la dexametasona tienen una estabilidad hidrolítica diferente. Dado que el derivado de dexametasona (VIa) tiene el mismo átomo en la posición alfa de la función hidrazona que el derivado (Xa), lo que conduce a NP menos estables hidrolíticamente (Figura 3, panel 1), la diferencia inesperada observada entre la cinética del panel 2 y 3 de la Figura 3 probablemente se deba a la diferente proximidad de las funciones de hidrazona al núcleo de la NP. Este último probablemente genera un entorno químico diferente y provoca la desaceleración inesperada de la cinética de liberación.
De hecho, y de nuevo inesperadamente, al comparar los derivados de la hidrazona del fármaco de Fórmula (III) encontramos que la naturaleza del átomo adyacente (en alfa) a la unidad de hidrazida del enlazador de biotina influye en la estabilidad hidrolítica del enlace fármaco-hidrazona, por lo que, por ejemplo, es posible generar diferentes cinéticas de liberación a partir de las nanopartículas cargándolas con reactivos de Fórmula (Va) o (VIa) o (VIIa) o (VIIIa). De hecho, al comparar los paneles 1 y 2 de la Figura 3, observamos que la liberación de dexametasona a partir de nanopartículas formuladas con la hidrazona de Fórmula (Va) (ejemplo 2) es más rápida (28 % de liberación a 72 h a pH 4,0) que la obtenida a partir de nanopartículas formuladas con hidrazona de Fórmula (VIa) (ejemplo 3) (15 % de liberación después de 72 h a pH 4,0). Los datos se resumen en la Tabla 1. Además, como se muestra en la Figura 4, la liberación de doxorrubicina (ejemplo 7) de NP formuladas con el derivado de fármaco hidrazona de Fórmula (Va) es más rápida (liberación del 40 % después de 5 h a pH 7,4), especialmente a pH 7,4, que la de la formulación obtenida con el derivado (VIa) (liberación del 0 % después de 5 h a pH 7,4). También es importante señalar que, de nuevo inesperadamente, no pudimos identificar una regla única que dictara la estabilidad hidrolítica relativa de las hidrazonas en función de la naturaleza del átomo en la posición alfa de la biotina-hidrazida libre de fármaco. Por ejemplo, el derivado de dexametasona de (Va) es menos estable hidrolíticamente que el derivado (VIa), mientras que el derivado de doxorrubicina de (Va) es más estable que el derivado (VIa).
En esta segunda modalidad, las nanopartículas se pueden usar como portadores de liberación múltiples y/o diferenciados de moléculas bioactivas unidas al polímero del agente protector o directamente mediante un enlazador a una biotina, respectivamente. De hecho, dado que las moléculas bioactivas unidas al polímero están expuestas en la superficie de la nanopartícula, pueden someterse más fácil y rápidamente a procesos de degradación, mientras que para las moléculas directa o indirectamente a través de un enlazador unido a biotina y ensambladas sobre la avidina del núcleo central, se puede contemplar una cinética de liberación más lenta.
En otra modalidad se pueden preparar nanopartículas NBnAvy(BC)z donde los compuestos biotinilados son compuestos de Fórmula (II) y, por lo tanto, el polímero PA no está conjugado con moléculas para uso terapéutico y solo tiene funciones de protección de la superficie de la nanopartícula, y en donde los sitios de unión a biotina no están saturados por estos agentes de recubrimiento B-Xa-P í^>. En este caso, la función de liberación de nanopartículas se cumple mediante compuestos biotinilados conjugados con moléculas para uso terapéutico que pueden representarse mediante las Fórmulas generales (Xa) a (XIVa).
En modalidades adicionales, el polímero PAde los compuestos biotinilados de Fórmula (II) también puede unirse mediante enlaces covalentes con fluoróforos y/o elementos orientadores que permiten orientar el fármaco al sitio (como células tumorales) y/o verificar la distribución del fármaco después de la administración.
De estos ejemplos de posibles modalidades de estas nanopartículas, de las que la Figura 1 muestra una representación gráfica ilustrativa, se puede inferir la extrema versatilidad y sencillez de preparación de las mismas.
Para los fines de la presente invención, se prefieren las nanopartículas con composiciones predeterminadas, en las que los componentes NBn, Avy y BCz tienen los significados que se especifican a continuación.
En una modalidad preferida, NBn es un ácido nucleico donde n está comprendido de 30 a 50 000 y, en consecuencia, y está comprendido de 1 a 1785 y z está comprendido de 1 a 7140. Con mayor preferencia, n está comprendido de 3000 a 20 000 y, en consecuencia, y está comprendido de 30 a 714 y z está comprendido de 120 a 2850. Preferentemente, y está comprendido de (0,01)^n a (0,0454^n y z está comprendido de (0,4)^y a (4)^y.
En los compuestos biotinilados BC, a está comprendido preferentemente de 0 a 5 para compuestos biotinilados de Fórmula (II) o (III) y de 1 a 5 para compuestos biotinilados de Fórmula (IV) y cuando a es diferente de 0, y por tanto el enlazador X presente, este enlazador X es un espaciador de Fórmula general (XV) YR1-Y', en donde:
- Y, Y' iguales o diferentes entre sí son -COO-, -NH-, -O-; -SO2-, -S-, -SO-, -CO-, -COS-; -NH-CO-, -NH-COO-, -HN-SO-NH-;
- R1 es alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo y arilo, con un número de átomos de carbono comprendido de 1 a 20, y preferentemente de 5 a 10, opcionalmente sustituido.
Por lo tanto, el enlace entre el enlazador X y la biotina B y el enlace entre el enlazador X y el polímero hidrófilo PA puede ser sin distinción un enlace amida, un enlace amina, un enlace carbamida, un enlace éster, un enlace cetona, un enlace éter, un enlace tioéster, un enlace tioéter, un enlace urea, una tiourea, un enlace sulfónico y un enlace sulfóxido.
Con mayor preferencia, el enlazador X es un grupo espaciador en donde Y e Y' son -NH-CO- y -NH-COO- y R1 es un alquilo lineal con 6-8 átomos de carbono.
Cuando el enlazador X tiene más de dos grupos funcionales, y en particular un número de grupos funcionales igual o superior a 3 (> 3) de los cuales uno está unido a biotina y el otro libre para diferentes conjugaciones, estos grupos funcionales adicionales pueden ser funcionalizado con residuos de hidrazina, en el caso de compuestos biotinilados de Fórmula (IV) o unir múltiples unidades poliméricas, en el caso de compuestos biotinilados de Fórmula (II) y/o (III).
De hecho, cuando b es mayor que 1 y entonces PA representa un polímero hidrófilo que consiste de al menos 2 o más unidades poliméricas, estas últimas están unidas por un enlazador X diferente que tiene un número de funcionalidades derivables igual o superior a 3 (> 3), de los cuales uno se une a la biotina y los otros grupos funcionales se unen a las unidades poliméricas PA cuando a es diferente de 0 o, cuando a es igual a 0 y luego el enlazador X no está presente, una primera unidad polimérica PA se une directamente a la biotina B a través de su grupo carboxi y las restantes unidades poliméricas PA se unen a la primera unidad polimérica que se une a la biotina.
Un enlazador X diferente de este tipo se puede seleccionar entre lisina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, un dendrímero. En el sentido de la presente invención, este engarce polifuncional adicional es preferentemente lisina.
Con referencia al polímero hidrófilo PA, para los fines de la presente invención, los polímeros preferidos se seleccionan de polietilenglicol (PEG), también opcionalmente sustituido, o un copolímero del mismo con polioxipropileno (PPO) y la unidad polimérica PA tiene un peso molecular comprendido de 400 a 20 000 y con mayor preferencia entre 1000 y 5000 y b está comprendido preferentemente de 1 a 10.
Con respecto a las moléculas o fármacos bioactivos que pueden conjugarse con compuestos biotinilados de Fórmula (III) o (IV), deben tener al menos un grupo carbonilo aldehído o cetona disponible para la conjugación con el residuo hidrazina de los compuestos biotinilados. Entre ellos, se prefieren agentes antiinflamatorios corticosteroides y no esteroides, anticancerígenos, antibióticos y agentes antigotosos. Los agentes antiinflamatorios corticosteroides se seleccionan preferentemente de hidrocortisona, dexametasona, triamcinolona, acetónido de triamcinolona, diacetónido de triamcinolona, prednisolona, metil prednisolona y sales de los mismos. Los agentes antiinflamatorios no esteroideos se seleccionan preferentemente de droxicam, tenoxicam, lornoxicam, ketoprofeno, tolmetina, nabumetona, ketorolaco y sales de los mismos.
Entre los agentes anticancerígenos, estos se seleccionan preferentemente de doxorrubicina, daunomicina, epirrubicina, idarrubicina, paclitaxel, docetaxel, carbazitaxel, ciproterona y sales de los mismos.
Los antibióticos se seleccionan preferentemente de doxiciclina, clortetraciclina, eritromicina, oleandomicina, claritromicina, fluritromicina y sales de los mismos. Entre los agentes antigotosos, se selecciona preferentemente la colchicina y sales de los mismos.
Los derivados conjugados de acuerdo con la invención pueden usarse para el tratamiento de enfermedades electivas de la molécula bioactiva administrada. Preferentemente, estas enfermedades son enfermedades caracterizadas por procesos inflamatorios agudos y crónicos, y preferentemente estas son enfermedades osteoarticulares como artritis y osteoartritis y enfermedades autoinmunitarias de diferente etiología y que afectan a diferentes áreas anatómicas u órganos, cáncer o enfermedades infecciosas y gota.
Las nanopartículas de acuerdo con la invención han mostrado un excelente perfil de biocompatibilidad y, por tanto, pueden utilizarse para la preparación de composiciones en combinación con diluyentes y/o excipientes conocidos y/o nuevos aceptables para tratamientos terapéuticos. Las vías de administración utilizables para estos tratamientos terapéuticos son todas las conocidas, generales o específicas del sitio local, y utilizadas en la práctica clínica, típicas para el fármaco administrado y la enfermedad a tratar. En particular, para las patologías osteoarticulares tratadas con agentes antiinflamatorios, la vía de administración preferida es la intraarticular y las nanopartículas conjugadas de acuerdo con la invención pueden incorporarse en composiciones en combinación con polisacáridos como ácido hialurónico, ácido algínico, quitosano y oligosacárido derivados de los mismos o mezclas de los mismos.
Dichas composiciones pueden usarse solas o en combinación con composiciones que comprenden los fármacos administrados por las nanopartículas y tal como, específicamente no administrados por las nanopartículas, de acuerdo con el régimen terapéutico necesario para tratar la enfermedad.
A continuación se describen algunos ejemplos de preparación de los compuestos nanoensamblados de acuerdo con la invención con fines ilustrativos no limitativos, que para mayor claridad se muestran en la Figura 2, y su caracterización para la cinética de liberación de derivados conjugados con un enlace de hidrazona.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Síntesis de compuestos biotinilados de biotina-PEG-VA-hidrazida (5KDa) y biotina-PEG-C-hidrazida (5KDa y 3,4KDA)
Los tres derivados de PEG biotinilados se obtuvieron a partir de biotina-PEG-succinimidil-valerato (5 KDa) o biotina-PEG-succinimidil carbonato (5 KDa o 3,4 KDa) (Laysan Bio) respectivamente, mezclando los ésteres activos con 4 equivalentes de terc-butil carbazato (BOC-Hz, Sigma-Aldrich) en una mezcla de acetato de etilo anhidro 1:1 y diclorometano, seguido de 1 equivalente de trietilamina. Después de 1 hora, los productos de conjugación se aislaron por precipitación en éter etílico y se purificaron del exceso de carbazato de terc-butilo mediante una serie de redisoluciones y precipitaciones con acetato de etilo y éter etílico. La conjugación del residuo carboxílico de los diversos derivados con BOC-hidrazida fue confirmada por 1análisis de H-NMR. A continuación, se eliminó el grupo protector BOC mediante tratamiento ácido con TFA al 95 % en agua y se aislaron los productos mediante cristalización en éter etílico anhidro frío. La eliminación completa de BOC fue confirmada por 1análisis de H-NMR.
Ejemplo 2. Síntesis de nanopartículas con compuestos biotinilados de Fórmula B-Xa-PA* (III) funcionalizado con dexametasona a través l enlazador PEG5KDa-valerato-hidrazona (PEG5KDa-VA-Hz-Dex).
La biotina-PEG-VA-hidrazo-dexametasona (B-PEG5KDaVA-Hz-DEX) se obtuvo mezclando biotina-PEG5KDa-VA-hidrazida (ejemplo 1) en presencia de dos equivalentes de dexametasona (DEX) en dimetilsulfóxido anhidro, ácido por ácido acético. La formación de la hidrazona fue seguida por titulación de los grupos hidrazida libres con el reactivo trinitrobencenosulfónico (TNBS). Cuando se completó la reacción, el producto se aisló mediante precipitación en éter etílico. El exceso de DEX se eliminó mediante lavados sucesivos con éter etílico y el producto se secó al vacío. La identidad del producto (hidrazona en C3 de DEX) fue confirmada por 1H-NMR.
Los nanoensamblados (NP) que consisten en avidina plásmido pEGFp se obtuvieron mezclando los dos reactivos en un medio acuoso y estabilizados en presencia de a-biotina, £-metoxi PEG5KDa para saturar el 12,5 % de los sitios de unión a biotina. Después de la purificación mediante filtración en gel (columna Superose, en el sistema FPLC Akta Purifier) en eluyente de tampón de fosfato 10 mM, NaCl 0,15 M, el nanoensamblado NB:Av:B-£-metoxiPEG5KDa (en lo sucesivo, ANANAS) se mezcló con B-PEG5KDa-VA-Hz-DEX en una relación de 1:1 con los sitios de unión a biotina. Después de 1 hora, la mezcla se purificó de nuevo mediante filtración en gel. Para valorar el número de moléculas DEX/NP, el ensamblado se trató con HCl 0,1 M durante 3 h a 50 °C y la DEX liberada se cuantificó mediante análisis de HPLC (columna C18, eluyentes agua/acetonitrilo/TFA). Los ensamblados (ANANAS:B-PEG5KDa-VA-Hz-DEX) contenía 522 moléculas DEX/NP.
Ejemplo 3. Síntesis de nanopartículas con compuestos biotinilados de Fórmula B-Xa-PAb (III) funcionalizados con dexametasona vía PEG5KDa-carbonato-hidrazona (PEG5KDa-C-Hz-DEX) enlazador.
La biotina-PEG-C-hidrazo-dexametasona (B-PEG5KDa-C-Hz-DEX) se obtuvo el conjugado mezclando biotina-hidrazida (ejemplo 1) en presencia de dos equivalentes de dexametasona (DEX) en dimetilsulfóxido anhidro, ácido por ácido acético. La formación de la hidrazona fue seguida por titulación de los grupos hidrazida libres con el reactivo trinitrobencenosulfónico (TNBS). Cuando se completó la reacción, el producto se aisló mediante precipitación en éter etílico. El exceso de DEX se eliminó mediante lavados sucesivos con éter etílico y el producto se secó al vacío. La identidad del producto (hidrazona en C3 de DEX) fue confirmada por 1H-NMR.
Un nanoensamblado (NP) que consiste de avidina plásmido pEGFp y a-biotina, £-metoxi PEG5KDa (12,5 % de los sitios de unión para biotina-BBS) se obtuvo y se purificó como se indica en el ejemplo 2, y se mezcló con B-PEG5KDa-C-Hz-Dex conjugado en la relación de 0,5:1 con los sitios de unión a biotina. Después de 1 hora, la mezcla se purificó de nuevo mediante filtración en gel. Para valorar el número de moléculas DEX/NP, el ensamblado se trató con HCl 0,1 M durante 3 h a 50 °C y la DEX liberada se cuantificó mediante análisis de HPLC (columna C18, eluyentes agua/acetonitrilo/TFA). Los ensamblados (ANANAS:B-PEG5KDa-C-Hz-DEX) contenía 530 moléculas DEX/NP.
Ejemplo 4. Síntesis de nanopartículas con doble funcionalización, utilizando compuestos biotinilados de Fórmula B-Xa-PA* (III) funcionalizado con dexametasona (DEX) a través del enlazador PEG5KDa carbonato-hidrazona (PEG5KDa-C-Hz-DEX) y de Fórmula B-Xa (IV) a través del enlazador de hidrazona EZ-LC (EZ-LC-Hz-DEX).
El conjugado biotina-EZ-LC-Hz-DEX se obtuvo mezclando biotina-EZ-LC-hidrazida (Pierce) en presencia de 1,2 equivalentes de dexametasona (DEX) en ácido dimetilsulfóxido anhidro para obtener ácido acético. La formación de la hidrazona fue seguida por titulación de los grupos hidrazida libres con el reactivo trinitrobencenosulfónico (TNBS). Cuando se completó la reacción, el producto se aisló mediante precipitación en éter etílico. La identidad del producto (hidrazona en C3 de DEX) fue confirmada por 1H-NMR.
Las ANANAS ensambladas:B-PEG5KDa-C-Hz-DEX se obtuvieron como se indica en el ejemplo 3. Los nanoensamblados se añadieron luego al derivado de biotina-EZ-LC-Hz-DEX en una relación molar de sitios de unión biotina:biotina de 0,4:1. Después de 1 hora, la mezcla se purificó de nuevo mediante filtración en gel. Para valorar el número de moléculas DEX/NP, el ensamblado se trató con HCl 0,1 M durante 3 h a 50 °C y la DEX liberada se cuantificó mediante análisis de HPLC (columna C18, eluyentes agua/acetonitrilo/TFA). Los ensamblados (ANANAS:B-PEG5KDa-VA-Hz-C-DEX:B-EZ-LC-Hz-DEX) contenía aproximadamente 850 moléculas DEX/NP.
Ejemplo 5. Síntesis de nanopartículas con compuestos biotinilados de Fórmula B-Xa-PA* (III) funcionalizado con acetónido de triamcinolona a través del enlazador PEG3,4KDa-carbonato-hidrazona (PEG3,4KDa C-Hz-TA).
El acetónido de biotina-PEG-C-hidrazo-triamcinolona (B-PEG3,4 KDaC-Hz-TA) se ha obtenido mezclando biotina-PEG3,4 KDa-C-hidrazida (ejemplo 1) en presencia de dos equivalentes de acetónido de triamcinolona (TA) en dimetilsulfóxido anhidro, ácido por ácido acético. La formación de la hidrazona fue seguida por titulación de los grupos hidrazida libres con el reactivo trinitrobencenosulfónico (TNBS). Cuando se completó la reacción, el producto se aisló mediante precipitación en éter etílico. El exceso de TA se eliminó mediante sucesivas recristalizaciones en acetato de etilo caliente/frío y se lavó con éter etílico, y el producto se secó al vacío. La identidad del producto (hidrazona en C3 de TA) fue confirmada por 1H-NMR.
Un nanoensamblado (NP) que consiste de avidina plásmido pEGFp y a-biotina, £-metoxi PEG5KDa (12,5 % de los sitios de unión para biotina-BBS) se obtuvo y se purificó como se indica en el ejemplo 2, y se mezcló con B-PEG3,4KDa C-Hz-TA derivado en una relación de 1:1 con los sitios de unión a biotina. Después de 1 hora, la mezcla se purificó mediante filtración en gel. Para valorar el número de moléculas de TA/NP, el ensamblado se trató con HCl 0,1 M durante 3 h a 50 °C y el TA liberado se cuantificó mediante análisis de HPLC (columna C18, eluyentes agua/acetonitrilo/TFA). Los ensamblados (ANANAS:B-PEG3,4KDa-C-Hz-TA) contenía aproximadamente 790 moléculas de TA/NP.
Ejemplo 6. Síntesis de nanopartículas con compuestos biotinilados de Fórmula B-Xa-PA* (III) funcionalizado con acetónido de triamcinolona (TA) a través del enlazador PEG5KDa-valerato-hidrazona (PEG5KDa-VA-Hz-TA).
El acetónido de biotina-PEG-VA-hidrazo-triamcinolona (B-PEG5KDa-VA-Hz-TA) se obtuvo mezclando biotina-PEG5KDa-VA-hidrazida (ejemplo 1) en presencia de dos equivalentes de TA en dimetilsulfóxido anhidro, ácido por ácido acético. La formación de la hidrazona fue seguida por titulación de los grupos hidrazida libres con el reactivo trinitrobencenosulfónico (TNBS). Cuando se completó la reacción, el producto se aisló mediante precipitación en éter etílico. El exceso de TA se eliminó mediante sucesivas recristalizaciones en acetato de etilo caliente/frío y se lavó con éter etílico, y el producto se secó al vacío. La identidad del producto (hidrazona en C3 de TA) fue confirmada por 1H-NMR.
Los nanoensamblados (NP) que consisten en avidina plásmido pEGFp se obtuvieron mezclando los dos reactivos en un medio acuoso y estabilizados en presencia de B-PEG5KDa-VA-Hz-TA para saturar el 100 % de los sitios de unión a biotina. El nanoensamblado se purificó mediante filtración en gel (columna Superose, en sistema FPLC Akta Purifier) en eluyente de tampón de fosfato 10 mM, NaCl 0,15 M. Para valorar el número de moléculas de TA/NP, el ensamblado se trató con HCl 0,1 M durante 3 h a 50 °C y el TA liberado se cuantificó mediante análisis de HPLC (columna C18, eluyentes agua/acetonitrilo/TFA). El ensamblado, en el que los compuestos biotinilados son todos B-PEG5KDa-VA-Hz-TA, se encontró que contenía aproximadamente 670 moléculas de TA/NP.
Ejemplo 7. Síntesis de nanopartículas con compuestos biotinilados de Fórmula B-Xa-PA* (III) funcionalizado con Doxorrubicina (DOX) a través de PEG5KDa-valerato-hidrazona (B-PEG5KDa-VA-Hz-DOX) o enlazador PEG5KDa-carbonatohidrazona (B-PEG5KDa-C-Hz-DOX).
El B-PEG5KDa-VA-Hz-DOX y B-PEG5KDa-C-Hz-DOX se obtuvieron conjugados mezclando biotina-PEG5KDa-VA-hidrazida o biotina-PEG5KDa-C-hidrazida (ejemplo 1) en presencia de dos equivalentes de doxorrubicina en dimetilsulfóxido anhidro, ácido por ácido acético. La formación de hidrazonas se siguió analizando las mezclas de reacción mediante cromatografía de filtración en gel (columna de péptidos Superdex, en sistema FPLC Akta Purifier de GE). Una vez completada la reacción, los productos se aislaron mediante precipitación en éter etílico, se resolubilizaron en diclorometano y se volvieron a precipitar en éter. La identidad de los productos conjugados (carbono 13 hidrazona de doxorrubicina) fue confirmada por 1H-NMR. Nanoensamblado (NP) que consiste de avidina plásmido pEGFp y a-biotina, £-metoxi PEG5KDa (12,5 % de los sitios de unión para biotina-BBS) se obtuvieron y purificaron como se indica en el ejemplo 2, y se mezclaron con B-PEG .5KDa-VA-Hz-DOXo B-PEG5KDa-C-Hz-DOX derivado en una relación de 0,5:1 con los sitios de unión a biotina. Después de 1 hora, las mezclas se purificaron de nuevo mediante filtración en gel. El número de moléculas DOX/NP en los dos ensamblados se calculó sobre la base del espectro de absorción UV-Vis del producto, teniendo en cuenta la contribución de la absortividad a 480 nm y 280 nm de la doxorrubicina y las nanopartículas no cargadas con el fármaco. Los productos ensamblados (ANANAS:B-PEG5KDa-VA-Hz-DOX y ANANAS:B-PEG5KDa-C-Hz-DOX) contenían aproximadamente 530 y 400 moléculas de doxorrubicina/NP respectivamente.
Ejemplo 8. Síntesis de nanopartículas con compuestos biotinilados de Fórmula B-Xa-PA* (III) funcionalizado con doxorrubicina a través del enlazador PEG 5KDa-valerato-hidrazona (B-PEG5KDa-VA-Hz-DOX), y de Fórmula B-Xa-PA* (II) funcionalizado con anticuerpo antifactor de crecimiento epidérmico (EGFr).
El anticuerpo anti EGFr (cetuximab) se ha conjugado con 2 moléculas de biotina/IgG por reacción con a-biotina, w-N-hidroxisuccinimida PEG5KDa (Laysan bio) en tampón de fosfato, pH 7,4. El exceso de biotina-PEG se eliminó mediante ultrafiltración (corte de 30 kDa). El B-PEG5KDa-VA-Hz-DOX conjugado se obtuvo como se describe en el ejemplo 7. Se obtuvieron productos nanoensamblados (NP) que consistían en avidina plásmido pEGFp y biotina-metoxi PEG-5KDa como se indica en el ejemplo 2. Estos se añadieron al compuesto biotinilado funcionalizado con el anticuerpo anti-EGFr en una relación IgG/NP = 10/1. Después de 1h, la mezcla se añadió con B-PEG.5KDa-VA-Hz-DOX en una relación de 0,5:1 con los sitios de unión a biotina. Después de 1 hora, la mezcla se purificó mediante filtración en gel. El número de moléculas de DOX/NP se calculó sobre la base del espectro de absorción UV-Vis del producto, teniendo en cuenta la contribución de la absortividad a 480 nm y 280 nm de los diferentes constituyentes del sistema. El ensamblado (ANANAS:B-anti-EGFr:B-PEG5KDa-VA-Hz-DOX) contenía 450 moléculas de Do X/NP. Ejemplo 9. Síntesis de nanopartículas con compuestos biotinilados de Fórmula B-Xa-PA* (III) funcionalizado con metil-prednisolona a través del enlazador PEG5KDa-valerato-hidrazona (PEG5KDa-VA-Hz-MP).
La biotina-PEG-VA-hidrazo-metil-prednisolona (B-PEG5KDaVA-Hz-MP) se obtuvo mezclando biotina-PEG5KDa -VA-hidrazida (ejemplo 1) en presencia de dos equivalentes de metil-prednisolona (MP) en ácido dimetilsulfóxido anhidro para ácido acético. La formación de la hidrazona fue seguida por titulación de los grupos hidrazida libres con el reactivo trinitrobencenosulfónico (TNBS). Cuando se completó la reacción, el producto se aisló mediante precipitación en éter etílico. El exceso de MP se eliminó mediante lavados sucesivos con éter etílico y el producto se secó al vacío. La identidad del producto (hidrazona en C3 de MP) fue confirmada por 1H-NMR.
Los productos nanoensamblados (NP) que consisten en avidina plásmido pEGFp y a-biotina, £-metoxi PEG-PEG5KDa se obtuvieron y purificaron como se indica en el ejemplo 2. El nanoensamblado se agregó con B-PEG5KDa VA-Hz-MP en una relación de 1:1 con los sitios de unión para biotina. Después de 1 hora, la mezcla se purificó de nuevo mediante filtración en gel. Para valorar el número de moléculas de MP/NP, el ensamblado se trató con HCl 0,1 M durante 3 h a 50 °C y la MP liberada se cuantificó mediante análisis de HPLC (columna C18, eluyentes de agua/acetonitrilo/TFA). Los ensamblados (ANANAS:B-PEG5KDa-VA-Hz-MP) contenía alrededor de 500 moléculas de MP/NP.
Ejemplo 10. Liberar la cinética de la dexametasona de a) nanopartículas con B-Xa-PA* compuestos biotinilados conjugados con el enlazador PEG5KDa-carbonato-hidrazona (PEG5KDaC-Hz-DEX), b) nanopartículas con el enlazador PEGsKDa-valerato-hidrazona (PEG5KDa VA-Hz-DEX) y c) nanopartículas con B-Xa-PA* compuestos biotinilados conjugados con PEG5KDa-carbonato-hidrazona (PEG5KDa C-Hz-DEX) compuesto biotinilado B-Xa con enlazador EZ-LC-hidrazona (EZ-LC-Hz-DEX). Las nanopartículas preparadas de acuerdo con el ejemplo 2, ejemplo 3 y ejemplo 4, se colocaron en diálisis (corte 10 KDa) a 37 °C frente a tampón de fosfato sódico 100 mM, pH 7,4 o tampón de acetato amónico 100 mM, pH 5,0 o tampón de acetato amonio 100 mM, pH 4,0. En momentos predeterminados, la cantidad de dexametasona liberada en las soluciones aceptoras se cuantificó mediante HPLC (C18, eluyentes CH3CN/H2O/TFA). La Figura 3 muestra los resultados obtenidos. Los tres productos nanoensamblados muestran cinéticas de liberación diferentes de acuerdo con el tipo y grado de su hidrazona conjugada utilizada en la carga del ensamblaje.
Ejemplo 11. Liberación de la cinética de la doxorrubicina a partir de nanopartículas con B-Xa-PA* compuestos biotinilados conjugados con PEG5KDa-carbonato-hidrazona (PEG5KDa C-Hz-DOX) y nanopartículas con enlazador PEG5KDa-valeratohidrazona (PEG5KDa VA-Hz-DOX).
Los productos nanoensamblados preparados de acuerdo con el ejemplo 7 se colocaron en diálisis a 37 °C frente a tampón de fosfato sódico 100 mM, pH 7,4 o tampón citrato sódico 100 mM, pH 5,0 o HCl 0,1 M. En momentos predeterminados, las soluciones aceptoras y las en diálisis fueron analizadas por espectrofluorimetría o RP-HPLC (C18, eluyentes CH3CN/H2O) para cuantificar la doxorrubicina liberada. La Figura 4 muestra la liberación de los resultados obtenidos, expresada en % de doxorrubicina liberada en función del tiempo (Mt) con respecto a la cantidad total de la misma presente en la muestra (Mtot). Los dos productos nanoensamblados liberan el fármaco con cinéticas diferentes, de acuerdo con el tipo de conjugado de hidrazona utilizado en el ensamblaje.
Ejemplo 12. Liberación de la cinética de triamcinolona de a) nanopartículas con B-Xa-PA* compuestos biotinilados conjugados con enlazador PEG5KDa-carbonato-hidrazona (PEG3,4KDaC-Hz-TA), b) nanopartículas con enlazador PEG5KDavalerato-hidrazona (PEG5KDa VA-Hz-TA)
Las nanopartículas preparadas de acuerdo con el ejemplo 5, ejemplo 6, se colocaron en diálisis (corte de 10 KDa) a 37 °C contra tampón de fosfato de sodio 100 mM, pH 7,4 o tampón de acetato amónico 100 mM, pH 5,0 o tampón de acetato de amonio 100 mM, pH 4,0. En momentos predeterminados, la cantidad de acetónido de triamcinolona liberada en las soluciones aceptoras se cuantificó mediante HPLC (C18, eluyentes CH3CN/H2O/TFA). La Tabla 1 resume los resultados obtenidos. Los dos productos nanoensamblados muestran cinéticas de liberación diferentes de acuerdo con el tipo de hidrazona conjugada utilizada en la carga del ensamblaje.
En la siguiente Tabla 1 se resumen los resultados de liberación de los fármacos conjugados mediante un enlace de hidrazona a la nanopartícula de los complejos nanoensamblados DE LOS EJEMPLOS (Ta = acetónido de triamcinolona; DEX = dexametasona; DOX = doxorrubicina).
Tabla 1
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Referencias
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Morpurgo M, Facchin S, Pignatto M, Silvestri D, Casarin E, Realdon N, Analytical Chemistry, 2012, 84, 3433-3439. Bigini P, Previdi S., Casarin E, Silvestri D, Violatto MB, Facchin S, Sitia L, Rosato, Zuccolotto G, Realdon N, Fiordaliso F, Salmona M y Morpurgo M. ACS Nano American Chemical Society, 2014, 8, 175-187.
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Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    i. Complejos nanoensamblados que comprenden un núcleo que consiste de una secuencia oligonucleotídica y una o más unidades de avidina autoensambladas por medio de interacciones de alta afinidad entre avidina y una o más nucleobases de la secuencia oligonucleotídica, y compuestos biotinilados ensamblados en sitios de unión a biotina en la avidina del núcleo por interacciones de alta afinidad entre avidina y biotina representadas por la Fórmula general (I)
    NB„Avy(BC)z (I)
    en donde:
    - NB son las nucleobases individuales de la secuencia oligonucleotídica de un ácido nucleico monocatenario o bicatenario y n es un número mayor que 16 y hasta 100000;
    - Av es una unidad de avidina tetramérica y es un número entero mayor o igual que 1 y que al estar en relación con n está en un intervalo comprendido de (0,0001)^n a (0,0454)^n con la condición de que si el valor en el intervalo de (0,0001)n a (0,0454)n es menor que 1, y es igual a 1;
    - BC son compuestos biotinilados seleccionados de compuestos de Fórmula:
    - B-Xa-PAb (II) donde B es un residuo de biotina, X es un enlazador que tiene al menos dos residuos funcionalizables y PA es una unidad polimérica de un polímero hidrófilo que tiene al menos dos residuos funcionalizables, uno de los cuales se une al residuo de biotina B con un enlace covalente ya sea directamente o a través del enlazador X por medio de su grupo funcional carboxílico y el segundo está libre o protegido con grupos protectores o se une a fluoróforos o moléculas orientadoras, a es un número comprendido de 0 a 10, b es un número comprendido de 1 a 20;
    - B-Xa-PAb (III) donde B es un residuo de biotina, X es un enlazador que tiene al menos dos residuos funcionalizables y PA es una unidad polimérica de un polímero hidrófilo que tiene al menos dos residuos funcionalizables, uno de los cuales se une al residuo de biotina B con un enlace covalente ya sea directamente o a través del enlazador X por medio de su grupo funcional carboxílico y el segundo está funcionalizado con un residuo de hidrazina seleccionado de -R-C(=O)-NHNH2, -R-O-C(=O)-NHNH2, -R-NH-(C=O)-NHNH2 -R-NH-(C=S)-NHNH2 y -R-(C6H4)-NHNH2 donde R es un residuo alquilo C1-C10 lineal o ramificado, a es un número comprendido de 0 a 10, b es un número comprendido de 1 a 20;
    - B-Xa (IV) donde B es un residuo de biotina, X es un enlazador que tiene al menos dos residuos funcionalizables, uno de los cuales se une al residuo de biotina B con un enlace covalente directamente por medio de su grupo funcional carboxílico y el segundo está funcionalizado con un residuo de hidrazina seleccionado de -R-C(=O)-NHNH2, -R-O-C(=O)-NHNH2, -R-NH-(C=O)-NHNH2 -R-NH-(C=S)-NHNH2 y -R-(CaH4)-NH-NH2 donde R es un residuo alquilo C1-C10 lineal o ramificado, a es un número en el intervalo comprendido de 1 a 10, z es un número entero mayor o igual a 1 y que al estar en relación con y está en un intervalo comprendido de (0,02)^y a (4)^y con la condición de que si el valor en el intervalo de (0,02) y a (4)y es menor que 1, z es igual a 1, con la condición de que los sitios de unión a biotina en la avidina del núcleo NBnAvy estén saturados al menos un 5 % con compuestos biotinilados de Fórmula B-Xa-PAb (III), y en donde los compuestos biotinilados de Fórmula (III) y/o (IV) se conjugan con un enlace de hidrazona con moléculas bioactivas que tienen al menos un grupo carbonilo a través de dicho grupo carbonilo.
  2. 2. Complejos nanoensamblados de acuerdo con la reivindicación 1, en donde n está en el intervalo comprendido de 30 a 50000.
  3. 3. Complejos nanoensamblados de acuerdo con la reivindicación 1, en donde y está en el intervalo comprendido de (0,01)^n a (0,0454)^n.
  4. 4. Complejos nanoensamblados de acuerdo con la reivindicación 1, en donde z está en el intervalo comprendido de (0,4)^y a (4)^y.
  5. 5. Complejos nanoensamblados de acuerdo con la reivindicación 1, en donde a es un número comprendido de 0 a 5 para compuestos biotinilados de Fórmula (II) o (III) y comprendido de 1 a 5 para compuestos biotinilados de Fórmula (IV).
  6. 6. Complejos nanoensamblados de acuerdo con la reivindicación 1, en donde b para los compuestos biotinilados de Fórmula (II) o (III) es un número comprendido de 1 a 10.
  7. 7. Complejos nanoensamblados de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la unidad polimérica PA se selecciona de polietilenglicol y un copolímero del mismo con polioxipropileno.
  8. 8. Complejos nanoensamblados de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la unidad polimérica PA tiene un peso molecular comprendido de 400 a 20000.
  9. 9. Complejos nanoensamblados de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el enlazador X del compuesto biotinilado de Fórmula (II) y de Fórmula (III) es un compuesto bifuncional representado por la Fórmula general (XV) Y -R 1-Y' (XV)
    en donde
    Y, Y' iguales o diferentes entre sí, se seleccionan de -COO-, -NH-, -O-, -SO2-, -S-, -SO-, -CO -, -CO S-, -NH-CO-, -NH-COO-, -HN-SO-NH-;
    R1 se selecciona de alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo y arilo, con un número de átomos de carbono comprendido de 1 a 20, opcionalmente sustituido.
  10. 10. Complejos nanoensamblados de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el enlazador X del compuesto biotinilado de Fórmula (II) y de Fórmula (III) es un enlazador polifuncional y tiene al menos 3 grupos funcionales.
  11. 11. Complejos nanoensamblados de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el enlazador polifuncional se selecciona del grupo que consiste en lisina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína y un dendrímero.
  12. 12. Complejos nanoensamblados de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el residuo de hidrazina para los compuestos biotinilados de Fórmula (III) y (IV) se selecciona de -R-C(=O)-NHNH2, -R-O-C(=O)-NHNH2.
  13. 13. Complejos nanoensamblados de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las moléculas bioactivas se seleccionan de agentes antiinflamatorios esteroideos y no esteroideos, anticancerosos, antibióticos y antigotosos.
  14. 14. Complejos nanoensamblados de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-13 para el uso en el tratamiento terapéutico de enfermedades seleccionadas de patologías de tipo inflamatorio, enfermedades cancerosas, infecciones y gota.
  15. 15. Complejos nanoensamblados para el uso de acuerdo con la reivindicación 14, en donde las patologías de tipo inflamatorio son patologías osteoarticulares y autoinmunitarias agudas o crónicas.
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