IT201900002679A1

IT201900002679A1 - Complessi nanoassemblati di acidi nucleici, avidina e composti biotinilati per l’uso nel trattamento patologie epatiche

Info

Publication number: IT201900002679A1
Application number: IT102019000002679A
Authority: IT
Inventors: Paolo Bigini; Pietro Invernizzi; Margherita Morpurgo
Original assignee: Livera S R L
Priority date: 2019-02-25
Filing date: 2019-02-25
Publication date: 2020-08-25

Description

Deposito della domanda di brevetto per invenzione industriale dal titoloμ “COMPLESSI NANOASSEMBLATI DI ACIDI NUCLEICI, AVIDINA E COMPOSTI BIOTINILATI PER L’USO NEL TRATTAMENTO PATOLOGIE EPATICHE”

DESCRIZIONE CAMPO DELL'INVENZIONE

La presente invenzione ha ad oggetto un complesso nanoassemblato di acidi nucleici, avidina e composti biotinilati, in cui detti composti biotinilati sono legati ad un farmaco per il trattamento di una patologia epatica. Detto complesso nanoassemblato trova applicazione, in particolare, nel trattamento delle patologie epatiche infiammatorie, come ad esempio l'epatite autoimmune.

AMBITO TECNICO

Il fegato è un organo di dimensioni circa pari a quelle di una palla da football americano, posizionato appena al di sotto della gabbia toracica, sul lato destro dell'addome. Il fegato risulta essenziale per la digestione degli alimenti e libera il corpo dalle sostanze tossiche. Le patologie epatiche possono essere ereditate (genetiche) o provocate da una serie di fattori che danneggiano il fegato, come ad esempio virus ed uso di alcol. Anche l'obesità è associata ai danni al fegato.

Nel tempo, i danni al fegato provocano cicatrizzazioni (cirrosi) le quali possono determinare insufficienza epatica, uno stato che mette a repentaglio la vita stessa.

Esistono anche patologie in cui il sistema immunitario attacca il fegato. Esempi di malattie epatiche autoimmuni includono l'epatite autoimmune, la cirrosi biliare primitiva e la colangite sclerosante primitiva.

L'epatite autoimmune (AIH) è una malattia epatica autoimmune rara ma grave, la quale è caratterizzata da alterazioni morfologiche epatiche progressive concomitanti con un aumento di immunoglobulina G, di aminotransferasi e di autoanticorpi in circolazione. I trattamenti clinici fanno affidamento sulla somministrazione cronica di dosaggi elevati dello steroide prednisolone (a volte associato all'azatioprina immunosoppressiva). Tuttavia, gli steroidi iniettati sistematicamente sia interagiscono con le cellule in circolazione del sistema immunitario, sia attraversano facilmente le barriere biologiche. Tale distribuzione diffusa determina l'interruzione della terapia da parte di un numero rilevante di pazienti affetti da AIH, a causa dello sviluppo di gravi complicazioni legate agli steroidi (osteopenia con collasso vertebrale, osteoporosi da diabete, ipertensione, disturbi dell'umore e cognitivi, cambiamenti estetici o obesità). Molto spesso, tali pazienti non dispongono di una terapia affidabile e necessitano di trapianto di fegato negli stadi terminali della malattia. Una possibile soluzione potrebbe essere quella di “concentrare” l'attività farmacologica solamente a livello di fegato, con il doppio obiettivo di ridurre il dosaggio complessivo e di evitare effetti collaterali in altre aree.

Attualmente, si portano avanti terapie finalizzate ai tessuti tramite diverse strategie, le quali spaziano dallo sviluppo/utilizzo di piccole molecole o anticorpi monoclonali in grado di interferire specificamente con le funzioni biologiche correlate alla patologia, alla progettazione di sistemi di rilascio di farmaci (ad es. sistemi basati su polimeri - o coniugati anticorpo-farmaco o nanoparticelle - NP) concepiti allo scopo di somministrare o concentrare il farmaco nell'area del corpo desiderata. In particolare, le NP possono trasportate elevati carichi utili di farmaco e, qualora necessario, la loro dimensione consente il caricamento concomitante di frazioni terapeutiche, diagnostiche e di targetizzazione. Unitamente a tale linea, i vettori su base NP sembrano essere altamente idonei per la targetizzazione epatica. In effetti, la maggior parte delle NP evidenzia un naturale tropismo per tale materiale filtrante, o esse possono essere targetizzate allo stesso all'atto della funzionalizzazione di superficie con i leganti di targetizzazione epatici. In particolare, i macrofagi localizzati nel fegato (Cellule di Kupffer-KC), i quali sono altamente coinvolti nell'inizio e nella progressione della patologia infiammatoria, hanno un'elevata capacità di riconoscere, ingerire e degradare sostanze estranee e possono, quindi, catturare le NP in circolazione di diversa natura, inclusi i nanomateriali duri, i liposomi e le nanoparticelle polimeriche, rendendo tali sistemi i vettori di farmaco ideali per le patologie associate alle KC.

Nella letteratura, sono state proposte (nano) formulazioni a rilascio controllato per i corticosteroidi per diverse finalità. In particolare, i liposomi e l'albumina mannosiomodificata, specificamente progettati per targetizzare il fegato, sono stati anche analizzati relativamente al trattamento degli stati infiammatori epatici, ma i risultati sono stati scarsi e controversi. I liposomi non sono stati in grado di conseguire un rilascio epatico selettivo ed il vettore albumina mannosio-modificata, anche se in grado di trasportare il farmaco in modo selettivo alle KC del fegato, non ha impedito la deposizione del collagene correlato all'infiammazione a causa di una combinazione di eventi di segnalazione delle cellule evocati dall'interazione del vettore con il recettore del mannosio target. L'effetto limitato osservato in tali studi è probabilmente dovuto alla prova che il rilascio degli steroidi nel fegato è una condizione necessaria ma non sufficiente per consentire un approccio terapeutico efficace.

Pertanto, rappresenta uno scopo della presente invenzione quello di fornire un prodotto che sia in grado di superare gli inconvenienti dei trattamenti noti e che, al contempo, aumenti l'efficacia delle terapie volte al trattamento delle patologie epatiche, in particolare delle patologie epatiche infiammatorie.

SOMMARIO DELL'INVENZIONE

Lo scopo di cui sopra è stato conseguito mediante un complesso nanoassemblato, secondo la rivendicazione 1.

In un altro aspetto, l'invenzione ha ad oggetto l'uso di detto complesso nanoassemblato nel trattamento di una patologia epatica.

Così come ivi utilizzato, il termine “patologia” si riferisce ad una qualsiasi malattia o condizione associata ad un danno epatico. L'espressione “patologia associata ad un danno epatico” si riferisce a qualsiasi malattia o condizione clinica caratterizzata da danno, lesione, disfunzione, difetto o anomalia epatici. Pertanto, l'espressione ricomprende, ad esempio, le lesioni epatiche, le malattie autoimmuni, le malattie degenerative e le malattie genetiche, come ad esempio la steatoepatite non alcolica (NASH), la lesione epatica associata al o causata dal consumo di alcol in un mammifero affetto da NASH, l'epatite alcolica, la lesione epatica indotta da farmaci, la colangite sclerosante primitiva, l'epatite virale, la fibrosi epatica, la cirrosi epatica, la cirrosi biliare primitiva, l'epatite autoimmune, l'epatite e l'epatocarcinoma. In determinate forme di realizzazione, le patologie di interesse sono malattie autoimmuni, inclusa l'epatite autoimmune.

Nel contesto dell'invenzione, il termine “trattare” o “trattamento”, così come ivi utilizzato, si riferisce ad un procedimento volto a ritardare o impedire l'insorgenza di una patologia, ad invertire, alleviare, inibire, rallentare o interrompere la progressione, l'aggravamento o il peggioramento dei sintomi della patologia, ad apportare miglioramenti dei sintomi della patologia, e/o a curare la patologia.

In un ulteriore aspetto, la presente invenzione ha ad oggetto un processo di preparazione di detto complesso nanoassemblato.

BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE

Le caratteristiche ed i vantaggi della presente invenzione risulteranno evidenti dalla descrizione dettagliata che segue, dagli esempi operativi riportati per finalità illustrative e dalle allegate figure, in cui:

- la Figura 1 mostra il percorso di sintesi di biotina-PEG-Hz-desametasone (composti 2a e 2b), conformemente agli Esempi,

- la Figura 2 mostra il percorso di sintesi di biotina-Hz-desametasone (composti 7 e 8), conformemente agli Esempi,

- la Figura 3 mostra il percorso di sintesi di biotina-Hz-desametasone (composti 13 e 14), conformemente agli Esempi,

- la Figura 4 mostra il processo di assemblaggio ANANAS-Hz-Dex, conformemente agli Esempi,

- la Figura 5 mostra le proprietà fisicochimiche dei nanoassemblaggi ANANAS-Hz-Dex, conformemente agli Esempi. (A) Copertura area di legame biotina (% su BBS disponibile totale) con biotina-PEG-Hz-Dex quale funzione della quantità del composto 2 in soluzione di assemblaggio. (B) Dimensione dell'assemblaggio quale funzione della copertura BBS con il composto 2. (C) Spettro UV-Vis di ANANAS-Hz-Dex30 (formulazione I). (D) Stabilità colloidale di ANANAS-Hz-Dex30 (formulazione I) sul tempo di stoccaggio nella soluzione a 2,7 mg/ml a 4°C. (E) Schema di rilascio dipendente dal pH del desametasone dalle formulazioni ANANAS-Hz-Dex30. (F) Rilascio del farmaco in vitro a (Δ) pH 7,4, (□) pH 5,0 e (●) pH 4,0 G) Cinetica del rilascio di desametasone ai diversi pH, da diversi biotina-Hz-coniugati quali molecole libere o collegate al nucleo ANANAS,

- la Figura 6 mostra la dimensione dei diversi nanoassemblaggi ANANAS-Hz-Dex conformemente agli Esempi, così come misurata mediante diffusione luminosa dinamica, - la Figura 7 mostra la biodistribuzione e la farmacocinetica in vivo della formulazione I, conformemente agli Esempi. (A) Il segnale fluorescente associato ad ANANAS, ANANAS-Hz-Dex, gocce libere di alexa633 (2,5mg NPs/ml - 4µl/punto – stessa quantità del colorante) [ove “alexa633 libera” o “alexa633” indica Biotinamidoesilamidoalexa633 (B-C6-alexa633, ottenuta accoppiando alexa633-NHS (Alexa Fluor™ 633 NHS Ester, numero Catalogo Thermofisher: A200051) con Biotinamidoesilammina]. L'acqua ed il background sono stati usati quali controlli. (B) Quantificazione del segnale di imaging ottico in vivo correlato all'intero corpo degli animali. (C) Imaging ottico in vivo di topi trattati con alexa633, ANANAS (formulazione 0) o ANANAS-Hz-Dex (formulazione I) e scansionati 30’, 4h e 24h dopo il trattamento. (D) Immagini di imaging ottico ex vivo degli organi asportati dagli animali sacrificati 4 e 24 h dopo la somministrazione di veicolo, alexa633, ANANAS ed ANANAS-Hz-Dex. Li. = fegato, Sp. = milza, Ki. = reni, Lu. = polmoni, Br. = cervello. (E) Quantificazione del segnale di imaging ottico ex vivo. I dati sono riportati quale media ± SE. L'analisi è stata eseguita mediante test t di Student per dati non appaiati. * = ANANAS vs. ANANAS-Hz-Dex nello stesso punto temporale; # = 4h vs.24h dopo trattamento con ANANAS; ° = 4h vs.

24h dopo trattamento con ANANAS-Hz-Dex. * p<0,05, ** p≤0,005, *** p≤0,0005,

- la Figura 8 mostra la co-localizzazione di avidina ed alexa6γγ quale prova di affidabilità della localizzazione delle NP tramite sostanza fluorescente alexa633, conformemente agli Esempi. (A) Sezioni di fegato da topi non trattati sani dopo IF anti-avidina non mostrano alcun segnale aspecifico. (B,C) Basso ed alto ingrandimento di sezioni di fegato da topi sani sacrificati 24 ore dopo la somministrazione di ANANAS. Il segnale blu si riferisce ai nuclei (colorazione Hoechst 33258), il segnale verde corrisponde all'avidina [anticorpo anti-avidina (HRP) più TSA-Fluoresceina], il segnale rosso è associato al colorante alexa633 collegato all'ANANAS. Le fotografie fuse sono rappresentate nelle colonne destre,

- la Figura 9 mostra i livelli di nanoparticelle nei fegati di topi sani (N=3) all'atto di somministrazione intraperitoneale con ANANAS. La titolazione delle NP è stata eseguita mediante analisi dot blot, (tessuto LOQ 3ug/g). I dati sono il risultato di tre test di titolazione indipendenti,

- la Figura 10 mostra la localizzazione di ANANAS (formulazione 0) ed ANANAS-Hz-Dex (formulazione I) all'interno del tessuto epatico di topi sani ed affetti da AIH. Immagini del fegato dei topi mediante microscopia confocale (A e B) da topi sani sacrificati 30’ e 24h dopo la somministrazione di ANANAS (A) ed ANANAS-Hz-Dex (B), conformemente agli Esempi. Il segnale blu si riferisce ai nuclei (colorazione Hoechst 33258), il verde corrisponde al componente lisosomiale dei macrofagi (Anticorpo CD 68), il rosso è associato al colorante alexa633 collegato alle NP. (C) Quantificazione dell'area occupata dall'ANANAS che si sovrappone all'area occupata dalla colorazione CD 68 delle sezioni di fegato dai topi sani. I dati sono riportati quale diagramma di dispersione. L'analisi statistica è eseguita mediante analisi della varianza ad una via seguita da test post hoc di Tukey *** p < 0,0001. (D, E e F) Immagini mediante microscopia a super-risoluzione di sezioni di fegato da topi sani (D ed E) o affetti da AIH (F) sacrificati 24h dopo il trattamento con ANANAS-Hz-Dex,

- la Figura 11 mostra le sezioni di fegato da topo affetti da AIH sacrificati 30 minuti (A-C) e 24 ore (D-I) dopo la somministrazione di ANANAS-Hz-Dex (formulazione I), conformemente agli Esempi. Il segnale blu si riferisce ai nuclei (colorazione Hoechst 33258), il segnale verde corrisponde al componente lisosomiale dei macrofagi (Anticorpo CD 68), il segnale rosso è associato al colorante alexa633 collegato all'ANANAS, - la Figura 12 mostra la quantificazione dell'area occupata dall'ANANAS che si sovrappone all'area occupata dalla colorazione CD 68 delle sezioni di fegato da topi affetti da AIH, conformemente agli Esempi. I dati sono riportati quale diagramma di dispersione,

- la Figura 13 mostra l'immunoistochimica delle sezioni di fegato di topi sani ed affetti da AIH colorate con A) F4/80 e B) CD11b, conformemente agli Esempi. Il confronto fra tessuto sano e malato rivela un aumento dell'immunoreattività sia F4/80, sia CD11b. Ciò è in linea con le prove precedenti che mostrano le alterazioni morfologiche ed istologiche (ad es. lobi fusi, noduli iperplastici, fibrosi capsulare, epatite di interfaccia, rigonfiamento degli epatociti e necrosi, infiltrazione cellulare massiccia nelle regioni sia periportali, sia parenchimali) che si verificano nel fegato di topi e pazienti affetti da AIH,

- la Figura 14 mostra lo studio della farmacocinetica, conformemente agli Esempi. Livelli di desametasone libero misurati nel plasma (A), cervello (B) e fegato (C) da topi sani e nel fegato (D ed E) da topi affetti da AIH. I topi sono stati sacrificati in diversi punti temporali dopo la somministrazione intraperitoneale di desametasone (barre azzurre) o di ANANAS-Hz-Dex (formulazione I) (barre grigie) (0,4 mg/kg). I dati sono riportati quale media ± SE. È stata eseguita l'analisi della varianza ad una via seguita da test post hoc di Bonferroni. Differenza significativa (* p < 0,05, ** p < 0,005). LoQ = Limite di quantificazione del metodo HPLC MS/MS (cromatografia liquida ad alta prestazionespettrometria di massa): fegato: 0,45 ng/g - cervello:0,8 ng/g - plasma: 1,2 ng/mL, - la Figura 15 mostra il trattamento in vivo del modello dei topi affetti da AIH. (A) Procedura sperimentale nei topi affetti da AIH. (B-C) Colorazione cellulare rispettivamente con collagene I e CD4 T, sulle sezioni di fegato da topi sacrificati 20 giorni dopo l'infezione da virus. (D-E) Livelli plasmatici di ALT e AST (U/L) misurati sei giorni dopo l'infezione. Le linee tratteggiate rappresentano il livello di aminotransferasi da topi non infetti. (F) Livelli di anti-CYP2D6 IgG analizzati nel siero raccolto al momento del sacrificio (giorno 20 post-infezione). I valori misurati sono: nessuna infezione: n.d. (non rilevabile); Veicolo: 12150 (8100-24300); Dex libero: 24300 (8100-72900); ANANAS-Hz-Dex: 1620 (900-2700); ANANAS: 9000 (2700-24300), e - la Figura 16 mostra uno schema ipotetico della destinazione dell'ANANAS-Hz-Dex nel fegato. Allo scopo di riassumere il processo, esso è stato suddiviso in 6 fasi in serie. Tuttavia, è estremamente importante sottolineare che esso è conforme ad un modello gerarchico e non strettamente temporale.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE

Pertanto, l'oggetto dell'invenzione è un complesso nanoassemblato comprendente un nucleo ΝBnAvy, in cui:

NB sono singole basi azotate di un acido nucleico a singolo o doppio filamento, Av è un'unità di avidina tetramerica avente siti di legame per la biotina (BBS), n è un numero intero da 16 a 100.000, e

y è un numero da (0,0001)n a (0,0357)n, a condizione che se (0,0001-0,0357)n è minore di 1, y è uguale a 1,

detto nucleo essendo funzionalizzato da

- primi elementi funzionali biotinilati aventi la formula (I)

in cui:

B-Xa-ΡAb è un agente biotinilato di protezione della superficie, ove B è un residuo di biotina, X è uno spaziatore e PA è un'unità polimerica selezionata da ossido di polietilene o glicole polietilenico (PEO o PEG) facoltativamente sostituito, un copolimero di poliossietilene e poliossipropilene (PEO-PPO), polivinilpirrolidone (PVP), poliacriloilmorfolina (PacM), una polioxamina, un polilattato (PLA), un poliglicolide (PLG), un copolimero di acido lattico e di acido glicolico (PLGA), z è un numero da (0,02)y a (4)y, a condizione che se (0,02-4)y è minore di 1, z, k o entrambi sono uguali a 1,

a è un numero intero da 0 a 5,

b è un numero intero da 0 a λ,

X’ è uno spaziatore uguale a o diverso da X,

c è un numero intero da 0 a 5, e

D è un farmaco legato in modo reversibile per il trattamento di una patologia epatica,

e

- secondi elementi biotinilati aventi la formula (II)

in cui:

è, indipendentemente dal primo elemento funzionale biotinilato, un

agente biotinilato di protezione della superficie, ove B è un residuo di biotina, X è uno spaziatore e PA è un'unità polimerica selezionata da ossido di polietilene o glicole polietilenico (PEO o PEG) facoltativamente sostituito, un copolimero di poliossietliene e poliossipropilene (PEO-PPO), polivinilpirrolidone (PVP), poliacriloilmorfolina (PacM), una polioxamina, un polilattato (PLA), un poliglicolide (PLG), un copolimero di acido lattico e di acido glicolico (PLGA), j è, indipendentemente dal primo elemento funzionale biotinilato, un numero da (0,02)y a (4)y, a condizione che se (0,02-4)y è minore di 1, j è uguale a 1, g è, indipendentemente dal primo elemento funzionale biotinilato, un numero intero da 0 a 5,

h è, indipendentemente dal primo elemento funzionale biotinilato, un numero intero da 0 a λ,

X” è uno spaziatore uguale a o diverso da X, X’,

i è, indipendentemente dai primi elementi funzionali biotinilati, un numero intero da 0 a 5, e

M è un gruppo terminale non funzionale,

ed in cui almeno 10% dei siti di legame per la biotina del nucleo è funzionalizzato da detti primi elementi funzionali biotinilati della formula (I).

I termini “nanocomplessi”, “nanoassemblaggi”, “complessi di nanoassemblaggi”, “Nano-ASsemblaggi-Avidina-Acido-Nucleico” e “ANANAS” sono usati per indicare i composti ottenuti mediante doppio autoassemblaggio fra le basi azotate (NB) di una sequenza di oligonucleotidi e la proteina tetramerica avidina (Av), di seguito anche denominata unità di avidina, e fra l'avidina ed un derivato della biotina (B) di un agente che ricopre il nucleo centrale ottenuto dal primo autoassemblaggio NB:Av. Tali composti sono in forma di nanoparticolato, ragion per cui essi sono ivi anche denominati “nanoparticelle” o brevemente “NP”.

Il termine “avidina” è volto a definire sia la proteina tetramerica nativa derivante dalle uova di gallina o da altre fonti analoghe (uova di uccelli in generale), sia quella ricombinante, ed in forma glicosilata e deglicosilata. Sono anche comprese altre forme di avidina, chimicamente o geneticamente modificate, a condizione che esse siano in grado di assemblarsi su un acido nucleico a singolo o doppio filamento così come definito in precedenza. Il termine "dendrimero" indica un composto macromolecolare simmetrico consistente in ramificazioni ripetute attorno ad un nucleo centrale consistente in una molecola più piccola o in un nucleo polimerico. I gruppi funzionali presenti sull'esterno del dendrimero, il cui numero dipende dal numero delle sue ramificazioni, sono, a loro volta, funzionalizzabili con altre molecole inclusi, ad esempio, i polimeri PA.

Il termine “acido(i) nucleico(i)” è usato per indicare acidi nucleici di DNA o RNA a catena singola o doppia, i quali possono presentarsi in forma lineare o circolare, in stato rilassato, avvolto o superavvolto.

I termini “linker” e “spaziatore” ivi utilizzati devono essere considerati equivalenti per le finalità della presente descrizione dell'invenzione.

Così come riportato, l'avidina (Av) è una proteina tetramerica in grado di legarsi con un'elevata affinità per le molecole di biotina. Tale proprietà rappresenta la base per il suo impiego quale strumento in numerose aree, fra cui l'immunodiagnostica ed il rilascio dei farmaci. Tuttavia, la tecnologia classica avidina-biotina è limitata dal numero massimo (4) di leganti che possono essere riuniti dalla singola unità di avidina. Il nucleo ΝBnAvy supera tale limite, in quanto esso è composto da diverse avidine e, pertanto, esso è caratterizzato da una superiore capacità di caricamento della biotina, ovvero diversi siti di legame per la biotina (BBS).

Nel complesso nanoassemblato dell'invenzione, almeno 20% dei BBS è funzionalizzato da detti primi elementi funzionali biotinilati della formula (I), in cui D è un farmaco per il trattamento di una patologia epatica.

Un adatto farmaco D per il trattamento di una patologia epatica appartiene alle classi terapeutiche seguenti: corticosteroidi, leganti del legante per il recettore farnesoide X ed agenti anticancro del fegato, nonché rispettive combinazioni.

Preferibilmente, detto farmaco D per il trattamento di una patologia epatica è betametasone, cortisone, desametasone, idrocortisone, metilprednisolone, prednisolone, prednisone, triamcinolone, cafestolo, acido chenodesossicolico, acido obeticolico, feraxamina, GW 4064, doxorubicina, calicheamicina, un'amatossina, un maitansinoide o loro miscela.

Nelle forme di realizzazione preferite, detto farmaco D per il trattamento di una patologia epatica è desametasone.

Nelle forme di realizzazione preferite di detti primi elementi funzionali biotinilati, NBn è un acido nucleico, in cui n è da 3.000 a 50.000 e, di conseguenza, y, il quale indica il numero delle unità di avidina Av, è da 30 a 1.785 e z, il quale indica il numero di B-Xa-PAb, è da 43 a 7.140.

Preferibilmente, lo spaziatore

Più preferibilmente, lo spaziatore X

è -NH-CO- o -NH-COO-. Pertanto, il legame fra lo spaziatore X e la biotina B, e quello fra lo spaziatore X e l'unità polimerica PA può essere un legame ammidico, un legame amminico, un legame carbammidico, un legame esterico, un legame chetonico, un legame eterico, un legame tioestere, un legame tioetere, un legame ureico, un legame tioureico, un legame solfonico, un legame solfossido o un legame idrazonico.

Nella formula (I), quando b è maggiore di 1 e, pertanto, PA rappresenta un polimero idrofilo comprendente almeno 2 o più unità polimeriche, queste ultime sono combinate fra di loro mediante un diverso linker X avente un numero di funzionalità derivatizzabili uguale a o maggiore di γ, di cui una si lega ad un primo spaziatore X o direttamente alla biotina B mediante il proprio gruppo carbossilico, quando a è uguale a 0, e le altre si legano alle unità polimeriche PA. Tale diverso linker X può essere selezionato da lisina, acido glutammico, acido aspartico, cisteina ed un dendrimero. Per le finalità della presente invenzione, tale ulteriore linker polifunzionale è preferibilmente lisina. Con riferimento all'unità polimerica PA, devono essere preferiti i polimeri in cui l'unità polimerica presenta un peso molecolare da 400 a 20.000 e più preferibilmente da 1.000 a 5.000. L'unità polimerica maggiormente preferita è glicole polietilenico (PEG), facoltativamente sostituito, o suo copolimero avente un peso molecolare da 2.000 a 5.000 e con b da 2 a 5.

Preferibilmente, lo spaziatore X’ presenta la formula Y-R-Y’, in cui Y e Y’, reciprocamente uguali o diversi, sono -CH2-, -COO-, -NH-, -O-; -SO2-, -S-, -SO-, -CO-, -COS-, -NH-CO-, -NH-COO-, -HN-SO-NH- o -HN-N=CH-, ed R può essere un alchile, un alchenile, un alchinile, un cicloalchile o un arile avente un numero di atomi di carbonio da 1 a 20, e preferibilmente da 3 a 10, facoltativamente sostituito.

Preferibilmente, il legame reversibile fra lo spaziatore X’ ed il farmaco D può essere un legame ammidico, un legame amminico, un legame carbammidico, un legame esterico, un legame chetonico, un legame eterico, un legame tioestere, un legame tioetere, un legame ureico, un legame tioureico, un legame solfonico, un legame disolfuro, un legame sensibile agli enzimi (ad es. B-glucuronico, valina-citrullina autoimmolativa, peptidi sensibili alla catepsina), un legame solfossido o un legame idrazonico.

Il termine “reversibile” si riferisce alla proprietà del legame di essere scisso una volta all'interno della cellula o del tessuto target.

Più preferibilmente, il legame reversibile fra lo spaziatore X’ ed il farmaco D è un legame idrazonico.

Nelle forme di realizzazione preferite, almeno 10% dei siti di legame per la biotina del nucleo sono funzionalizzati da detti secondi elementi funzionali biotinilati della formula (II).

In detti secondi elementi funzionali biotinilati della formula (II), il termine “non funzionale” significa che M non è un farmaco, né un legante nel significato di “L” nei terzi elementi funzionali biotinilati aventi la formula (III) riportata di seguito.

Preferibilmente, M è un gruppo terminale non funzionale selezionato da metossi, ammino, idrossi, carbossi, idrazide, e loro combinazioni.

Nelle forme di realizzazione preferite, 25-85% dei siti di legame per la biotina del nucleo sono funzionalizzati da detti primi elementi funzionali biotinilati della formula (I), e 15-75% dei siti di legame per la biotina del nucleo sono funzionalizzati da detti secondi elementi funzionali biotinilati della formula (II).

Nelle forme di realizzazione preferite, in detti primi elementi funzionali biotinilati, a e b sono 0, cosicché la formula risultante è -(B-X’c-D)z, ovvero la formula (I’).

Preferibilmente, 40-70% dei siti di legame per la biotina del nucleo sono funzionalizzati da detti primi elementi funzionali biotinilati della formula (I’).

Nelle forme di realizzazione preferite, in detti primi elementi funzionali biotinilati, a è 0, cosicché la formula risultante è -(B-ΡAb-X’c-D)z, ovvero la formula (I”).

Preferibilmente, 10-40% dei siti di legame per la biotina del nucleo sono funzionalizzati da detti primi elementi funzionali biotinilati della formula (I”).

In altre forme di realizzazione preferite, il nucleo è funzionalizzato da:

- primi elementi funzionali biotinilati aventi la formula (I’)

e

- primi elementi funzionali biotinilati aventi la formula (I”)

In altre forme di realizzazione p referite, in detti secondi elementi funzionali biotinilati, g ed i sono 0, cosicché la formula risultante è -(B-PAh-M)j, ovvero la formula (II’).

Preferibilmente, 10-50% dei siti di legame per la biotina del nucleo sono funzionalizzati da detti secondi elementi funzionali biotinilati della formula (II’).

In altre forme di realizzazione preferite, il nucleo è funzionalizzato da almeno due elementi fraμ

- primi elementi funzionali biotinilati aventi la formula (I’)

- primi elementi funzionali biotinilati aventi la formula (I”)

e

- secondi elementi funzionali biotinilati aventi la formula (II’)

In alcune forme di realizzazione, il nucleo è altresì funzionalizzato dai terzi elementi funzionali biotinilati aventi la formula (III)

in cui:

B-Χd-ΡAe è, indipendentemente da B-Χa-ΡAb e B-Χg-ΡAh, un agente biotinilato di protezione della superficie, ove B è un residuo di biotina, X è uno spaziatore e PA è un'unità polimerica selezionata da ossido di polietilene o glicole polietilenico (PEO o PEG) facoltativamente sostituito, un copolimero di poliossietliene e poliossipropilene (PEO-PPO), polivinilpirrolidone (PVP), poliacriloilmorfolina (PacM), una polioxamina, un polilattato (PLA), un poliglicolide (PLG), un copolimero di acido lattico e di acido glicolico (PLGA),

k è un numero da (0,02)y a (4)y, a condizione che se (0,02-4)y è minore di 1, z, k o entrambi sono uguali a 1,

d è un numero intero da 0 a 5,

e è un numero intero da 0 a 9,

X’” è, indipendentemente da X’ e X”, uno spaziatore uguale a o diverso da X, f è un numero intero da 0 a 5,

L è un legante di antigene di superficie legato in modo covalente, e

in cui fino a 40% dei siti di legame per la biotina del nucleo è funzionalizzato da detti terzi elementi funzionali biotinilati della formula (III).

Per le finalità della presente invenzione, il termine “legante” o “L” indica un anticorpo, un inibitore della tirosin-chinasi, un peptide, una proteina, un aptamero di acido nucleico in grado di legarsi ad uno specifico recettore transmembrana, o una rispettiva miscela. Preferibilmente, L è un anticorpo.

Gli anticorpi utilizzabili nella presente invenzione possono essere anticorpi monoclonali o policlonali, preferibilmente anticorpi monoclonali.

Ancora più preferibilmente, detti anticorpi monoclonali possono essere scelti fra i seguentiμ anticorpi murini, anticorpi umanizzati, anticorpi chimerici, anticorpi ricombinanti, anticorpi coniugati, frammenti scFv (diabody, triabody e tetrabody), frammenti Fab e frammenti F (ab’) 2.

Il termine “anticorpo policlonale” si riferisce ad una miscela di anticorpi che sono geneticamente diversi, in quanto prodotti da diverse cellule plasmatiche, e che riconoscono un diverso epitopo dello stesso antigene.

Il termine “anticorpo monoclonale” si riferisce ad un insieme di anticorpi che sono tutti identici, in quanto prodotti da linee cellulari derivanti solamente da un tipo di cellula immune (ovvero un clone cellulare).

Il termine “anticorpo umanizzato” si riferisce ad un anticorpo di origine umana, la cui regione ipervariabile è stata sostituita dalla regione omologa degli anticorpi monoclonali non umani.

Il termine “anticorpo chimerico” si riferisce ad un anticorpo contenente porzioni derivate da diversi anticorpi.

Il termine “anticorpo ricombinante” si riferisce ad un anticorpo ottenuto usando metodi DNA ricombinanti.

Il termine “anticorpo coniugato” si riferisce ad anticorpi coniugati con farmaci, tossine, sostanze radioattive o altri agenti.

Il termine “frammento scFv” (frammento variabile a catena singola) si riferisce a frammenti di immunoglobulina in grado di legarsi solamente all'antigene interessato. I frammenti ScFv possono essere anche sintetizzati in dimeri (diabody), trimeri (triabody) e tetrameri (tetrabody) utilizzando linker peptidici.

I termini “frammento Fab” (frammento di legame antigene) e “frammento Fab2” si riferiscono a frammenti di immunoglobulina consistenti un una catena leggera collegata al frammento Fc della catena pesante adiacente, e tali frammenti sono anticorpi monovalenti. Quando le porzioni Fab sono in coppie, il frammento è denominato Fab2. Il termine “ibridoma” si riferisce ad una cellula che produce anticorpi monoclonali. Gli anticorpi preferiti sono anticorpi anti-CD133, anticorpi anti CD133/2, anticorpi anti-CD44, anticorpi recettori del fattore di crescita anti-epatociti (cMET), anticorpi anticitocheratina19 (CK19), anticorpi anti FGF19, anticorpi anti EpCAM e rispettive miscele. Preferibilmente, L è un anticorpo selezionato da AC133, 292C3, AC141, IM7, peptide LQNAPRS, aptamero anti-CD133, anti-CD44, peptide P7 FNLPLPSRPLLR, edrecolomab, adecatumumab, MT110, catumaxomab e rispettive miscele.

Preferibilmente, nel complesso nanoassemblato dell'invenzione, fino a 35% del BBS è funzionalizzato da detti terzi elementi funzionali biotinilati della formula (III); più preferibilmente, fino a 25% del BBS è funzionalizzato da detti terzi elementi funzionali biotinilati della formula (III).

In un aspetto aggiuntivo, la presente invenzione riguarda la preparazione del complesso nanoassemblato, detta preparazione comprendendo le fasi di:

a) preparare il nucleo autoassemblato ΝǺnǹvy, miscelando avidina Av con acido nucleico in rapporti molari stechiometrici predefiniti avidina / basi azotate NB; e

b) miscelare i primi elementi funzionali biotinilati aventi la formula (I)

ed i secondi elementi biotinilati aventi la formula (II)

con il nucleo autoassemblato preparato in precedenza, in tal modo ottenendo il complesso nanoassemblato.

In un altro aspetto, l'invenzione riguarda l'uso di detto complesso nanoassemblato nel trattamento di una patologia epatica.

Così come riportato in precedenza, il termine “patologia” si riferisce ad una qualsiasi malattia o condizione associata ad un danno epatico. L'espressione “patologia associata ad un danno epatico” si riferisca a qualsiasi malattia o condizione clinica caratterizzata da danno, lesione, disfunzione, difetto o anomalia epatici. Quindi, il termine ricomprende, ad esempio, le lesioni epatiche, le malattie autoimmuni, le malattie degenerative e le malattie genetiche, come ad esempio la steatoepatite non alcolica (NASH), la lesione epatica associata o causata dal consumo di alcol in un mammifero affetto da NASH, l'epatite alcolica, la lesione epatica indotta da farmaci, la colangite sclerosante primitiva, l'epatite virale, la fibrosi epatica, la cirrosi epatica, la cirrosi biliare primitiva, l'epatite autoimmune, l'epatite e l'epatocarcinoma.

In determinate forme di realizzazione, le patologie di interesse sono malattie autoimmuni che includono epatite autoimmune, cirrosi biliare primitiva e colangite sclerosante primitiva.

Così come sarà osservato dagli Esempi che seguono, una terapia efficace è stata ottenuta tramite una nanoformulazione che veicola desametasone, basata sui Nano-ASsemblaggi-Avidina-Acido-Nucleico (ANANAS), in un modello murino di AIH. Così come descritto in precedenza, gli ANANAS sono NP su base poli-avidina che si generano dall'interazione ad elevata affinità fra la proteina dell'albume dell'uovo, l'avidina, ed un filamento di acido nucleico. Tali nanoparticelle, le quali sono composte da componenti morbidi biodegradabili e biocompatibili e sono scarsamente immunogeniche, possono essere considerate "super-avidine", con potenziali diagnostici e terapeutici che espandono quelli della singola proteina avidina, incluso il rilascio targetizzato del farmaco. In modo interessante, gli ANANAS mantengono alcune caratteristiche che li rendono particolarmente idonei quali vettori di farmaci per il trattamento di un'ampia gamma di patologie epatiche. Oltre alla somministrazione sistemica, gli ANANAS circolano liberamente nel flusso sanguigno per oltre due ore e si accumulano progressivamente nel parenchima epatico prima di essere eliminati entro 24h-48h. Da un punto di vista tecnico, grazie all'elevata affinità (Kd =10-15M) fra avidina e biotina, tali NP possono essere caricate facilmente con agenti bioattivi o di contrasto a stechiometria controllata. La totalità di tali caratteristiche ha consentito un controllo stringente di ogni parametro fisicochimico durante la sintesi, necessario per un passaggio futuro dal lato preclinico al lato clinico.

Negli Esempi che seguono, lo steroide desametasone (Dex) è stato coniugato agli ANANAS, conformemente alla presente invenzione. Dopo una serie di caratterizzazioni in vitro, sono stati effettuati studi in vivo allo scopo di valutare la sua cinetica ed efficacia nei topi. Il Dex è stato selezionato quale agente attivo in quanto, fra tutti i farmaci corticosteroidi, esso evidenzia l'efficacia antinfiammatoria diretta massima - circa 7,5 volte superiore rispetto al prednisolone - e la durata di azione maggiormente estesa. Il farmaco è stato legato agli ANANAS mediante un linker-biotina-PEG utilizzando un legame idrazonico reversibile acido, il quale dovrebbe garantire stabilità in corrispondenza del pH neutro del plasma e consentire il rilascio del farmaco nell'ambiente acido endosoma/lisosoma.

I test eseguiti hanno dimostrato che la nanoformulazione ANANAS-Hz-Dex è più efficace del farmaco libero nel controllo della malattia nel modello animale. Tale risultato, combinato con il fatto che la nanoformulazione non libera lo steroide in aree del corpo diverse dal fegato, suggerisce che tale vettore rappresenta un valido strumento per il controllo delle condizioni infiammatorie epatiche. Tale risultato deriva dalla combinazione di diverse caratteristiche della formulazione: a) il tropismo della cellula target (KC), b) il percorso corretto dell'ingresso cellulare, c) il meccanismo di rilascio del farmaco mediato da idrazone labile agli acidi e d) la lenta degradazione del nanoassemblaggio in corrispondenza dell'area epatica. Tali caratteristiche combinate generano una disponibilità di durata relativamente lunga del farmaco libero in corrispondenza dell'area relativa, ove anche una concentrazione ridotta di Dex è in grado di controllare le caratteristiche della malattia.

Risulta opportuno notare che, nonostante le ripetute somministrazioni, l'ANANAS privo di farmaco non determina alcun effetto negativo misurabile sulla funzionalità epatica, come ad esempio fibrosi epatica o livelli di AST ed ALT. Ciò suggerisce che il vettore stesso non é né tossico, né pro-infiammatorio. In effetti, la composizione dell'assemblaggio è tale per cui la sua degradazione determina solamente elementi altamente tollerati. In effetti, anche se l'avidina è una proteina esogena ed anticorpi antiavidina a bassa affinità sono stati dimostrati negli esseri umani, è stata anche dimostrata la tolleranza a tale proteina, probabilmente quale conseguenza del consumo di prodotti derivanti dalle uova nella dieta quotidiana.

Un aspetto correlato dell'invenzione riguarda, pertanto, un procedimento di trattamento di un soggetto affetto da una patologia epatica, detto procedimento comprendente una fase di somministrazione al soggetto di una quantità efficace del complesso nanoassemblato descritto in precedenza. Così come ivi utilizzato, il termine “soggetto” si riferisce ad un mammifero, preferibilmente un essere umano, che può essere affetto da una patologia associata al danno epatico, ma può o meno presentare la patologia.

È da intendersi che tutti gli aspetti identificati come preferiti e vantaggiosi relativamente al complesso nanoassemblato devono essere considerati come analogamente preferiti e vantaggiosi anche relativamente alla preparazione ed agli usi del medesimo.

È da intendersi anche che tutte le combinazioni di aspetti preferiti del complesso nanoassemblato dell'invenzione, così come della preparazione e degli usi del medesimo, così come sopra riportati, devono essere considerati come ivi divulgati.

Di seguito sono riportati esempi operativi della presente invenzione per finalità illustrative.

ESEMPI

Reagenti e strumentazione

Biotina-PEG5KDa-Succinimidilcarbonato (biotina-PEG5KDa-SC) α-biotina, ω-metossi-PEG5KDa (MPEG-biotina) e Biotina-PEG5KDa-Succinimidilvalerato (biotina-PEG5KDa-SVA) provengono da Laysan Bio (Arab, AL, USA); Trietilammina (TEA, cat. n. 15791) proveniente da Acros Organics; Etanolo assoluto (EtOH), proveniente da reagenti Carlo Erba, (Italia). Acetato di etile (EtOAc) AnalaR Normapur fornito da WVR (Radnor, Pennsylvania, US). Acido 2-(4-idrossifenilazo)benzoico (HABA, cat. n.54793) tert-butil carbazato (BOC-Hz, cat. n. B91005); acido 2,4,6-trinitrobenzenesolfonico (TNBSA, cat. n. 92823), desametasone (cat. n. 1756), acido trifluoroacetico (TFA, cat. n. T6508), diclorometano (DCM), dimetilsolfossido (DMSO) e tutti gli altri reagenti sono stati ottenuti da Sigma-Aldrich (Italia). Tutta l'acqua utilizzata era di tipo bidistillato (dd-H2O). Le colonne a gravità NAP-10 monouso, preconfezionate con Sephadex G-25 DNA Grade, sono state fornite da GE-Healthcare. Le analisi spettroscopiche sono state condotte con uno spettrofotometro UV-Vis Varian Cary<® >50. La fluorescenza è stata determinata tramite uno spettrofluorimetro Jasco FP-6200. Le analisi di risonanza magnetica nucleare (NMR) sono state effettuate con spettrometri NMR Bruker AMX da 300 e 400 MHz; gli spettri NMR sono stati analizzati mediante software TopSpin<TM >di Bruker. Le analisi di cromatografia a permeazione di gel sono state condotte mediante un sistema AKTA Purifier (GE Healthcare) di cromatografia liquida veloce delle proteine (FPLC) associato ad un (rilevatore di indice di rifrazione) Waters 2414 RI ed integrato con una colonna Superose 6 10/300 GL (GE Healthcare). Le analisi di Cromatografia Liquida ad Alta Prestazione a Fase Inversa (RP-HPLC) sono state effettuate con un sistema di Cromatografia Agilent (USA), modello 1220 Infinity LC, dotato di rivelatore a serie di diodi, utilizzando una colonna Phenomenex Kinetex CI 8 5 μm (4,6x 250 mm). Le misurazioni delle dimensioni delle nanoparticelle sono state effettuate mediante diffusione luminosa dinamica (DLS) utilizzando lo Zetasizer Nano ZS (Malvern, Malvem UK). La massa dei composti PEG è stata misurata usando l'Analizzatore AB SCIEX 4800 MALDI TOF/TOF™ (SCIEX, Toronto, Canada). Per la rilevazione della massa dei composti a basso peso molecolare, è stato impiegato lo spettrometro di massa XEVO G2-S ESI-TOF (Waters, Milford, MA, USA).

Sintesi dei coniugati della biotina

Biotina-PEG5KDa-SC-Idrazide e Biotina-PEG5KDa-SVA-Idrazide (composti 1a e 1b; Figura 1)

La biotina-PEGskDa-SC o la biotina-PEG5KDa-SVA sono state miscelate con 1,2 equivalenti di BOC-Hz in una miscela di DCM/EtOAc (1:1) seguiti da 1 equivalente di TEA. Dopo 3 ore, il prodotto (biotina-PEG5kDa-SC-Hz-Boc, composto la o biotina-PEG5KDa-SVA-Hz-BOC, composto lb) è stato precipitato con Et20 freddo, recuperato mediante filtrazione con imbuto di Gooch ed essiccato in vacuo. L'analisi 1H-NMR (DMSO, 300MHz) (6= 3,504 ppm, m, catena principale 454 H-PEG; δ = 1,396, m s, 9-H BOC) ha confermato l'identità del prodotto. Il BOC-Hz in eccesso è stato rimosso tramite diversi cicli di EtOAc caldo e di Et20 freddo. Il gruppo BOC è stato rimosso mediante trattamento di 1h in TFA al 95% ed il prodotto è stato isolato in forma di sostanza solida tramite precipitazione e lavaggio estensivo con Et20 freddo asciutto. La caratterizzazione del prodotto è stata confermata tramite analisi 1H-NMR, TNBSA e HABA.

Biotina-PEG5KDa-SC-Hz-Desametasone e Biotina-PEG5KDa-SVA-Hz-Desametasone (composti 2a e 2b; Figura 1)

La biotina-PEG5kDa-SC-Hz o la biotina-PEG5kDa-SVA-Hz (composti 1a o 1b) sono state miscelate con 10 equivalenti di Desametasone in DMF e vi è stata aggiunta una quantità catalitica di CH3COOH. Dopo 100 h, la conversione completa dei gruppi idrazinici è stata verificata mediante analisi TNBSA (Snyder). Il prodotto è stato isolato mediante precipitazione a freddo con Et20 e purificato dal desametasone in eccesso mediante lavaggi estensivi con Et20 freddo, recuperato mediante filtrazione con imbuto di Gooch ed essiccato in vacuo. Il rapporto molare desametasone:PEG nei prodotti è stato calcolato tramite analisi 1H-NMR (composto 2a, Figura 1) e tramite titolazione di una soluzione acquosa relativamente al contenuto di PEG e di desametasone rilasciabile utilizzando, rispettivamente, la prova dello iodio e l'analisi RP-HPLC dopo 4 ore di idrolisi a 50°C in 0,1M di HC1.

Sintesi del composto 3

La funzione amminica dell'acido 6-amminoesanoico è stata protetta con un residuo Fmoc mediante 3h di reazione a temperatura ambiente con FmocOSu in diossano/acqua (1:1) in presenza di K2C03. Il prodotto (composto 3, Figura 2) è stato precipitato tramite l'aggiunta di KHS04 solido ed estratto con EtO Ac/acqua.

1H-NMR (400 MHz, DMSO): δ = 1,20-1,54 (m, 6H, RHN-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH), 2,20 (t, 2H, CH2-COOH, J = 7,4 Hz), 2,97 (dt, 2H, RHN-CH2), 4,21 (t, IH, Fmoc-CH-CH2, J = 6,8 Hz), 4,29 (t, IH, Fmoc-CH-CH2, J = 6,8 Hz) 7.26 (t, IH, CONH, J = 5,8), 7,30-7,92 (m, 8H, Fmoc-Ar-H), 11,98 (s, IH, COOH).

Sintesi del composto 4

L'acido carbossilico del composto 3 è stato attivato mediante una reazione di Ih con TBTU e DIPEA sospesi in cloroformio secco. La miscela è stata poi aggiunta, goccia a goccia, ad una soluzione raffreddata con ghiaccio di idrato di idrazina in cloroformio. Dopo Ih, la miscela è stata lavata con acqua deionizzata allo scopo di eliminare i sali. Successivamente all'evaporazione del solvente organico, il prodotto (composto 4, Figura 2) è stato ottenuto in forma di sostanza solida elettrostatica bianca (570 mg, 91 %). 1H-NMR (400 MHz, DMSO): δ = 1,15-1,54 (m, 6H, RHN-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH), 2,00 (t, 2H, CH2-CONHNH2, J = 7,4 Hz), 2,96 (dt, 2H, RHN-CH2), 4,13 (sbr, 2H, CONHNH2), 4,21 (t, IH, Fmoc-CH-CH2, J = 6,8 Hz), 4,29 (t, IH, Fmoc-CH-CH2, J = 6,8 Hz), 7.25 (t, IH, CONH, J = 5,8), 7,30-7,92 (m, 8H, Fmoc-Ar-H), 8,90 (s, IH, CONHNH2).

HR-MS (ESI): Cale, per [C21H25N303 H]+: m/z 368.190. Trovato: m/z 368.200. Sintesi del composto 5

Il composto 5 è stato ottenuto facendo reagire il composto 4 con desametasone in MeOH, in presenza di TFA, a 40°C. Dopo 16h, la miscela è stata fatta evaporare a pressione ridotta, con EtOH assoluto, allo scopo di rimuovere l'acqua, così ottenendo una sostanza solida giallo chiaro. Il prodotto (composto 5, Figura 2) è stato purificato tramite cromatografia flash a fase inversa (ACN/acqua) su una cartuccia Biotage SNAPKP-C18-HS, ottenendo un olio molto denso giallo chiaro che, all'atto della triturazione con Et20, è diventato una sostanza solida gialla.

1H-NMR (400 MHz, DMSO): δ = 0,78 (d, 3H, desa-CZH3), 0,85 (s, 3H, desa-CYH3), 1,06 (m, IH, desa-CXH), 1,20-1,66 (m, 15H), 2,00-2,40 (m, 6H), 2,90-3,00 (m, 3H), 4,07 (d, IH, desa-CKH, J = 19,6 Hz), 4,07-4,16 (m, IH), 4,21 (t, IH, Fmoc-CH-CH2, J = 6,8 Hz), 4,29 (t, IH, Fmoc-CH-CH2, J = 6,8 Hz), 4,49 (d, IH, desa-CGH, J = 19,6 Hz), 5,94 (s, 0,16H, anti-desa-CCH), 6,00 (s, 0.26H, anti-desa-CCH), 6,20 (d, 0,32H, sin-desa-CBH), 6,27 (d, 0,27H, sin-desa-CBH), 6,39 (d, 0,23H, sin-desa-CAH), 6,47 (d, 0,27H, sin-desa-CAH), 6,57 (d, 0,14H, anti-desa-CBH),6,66(d,H, anti-desa-CBH),6,69 (s, 0,39H, sin-desa-CCH), 6,79 (s, 0,25H, sin-desa-CCH), 6,94 (d, 0,1 IH, anti-desa-CAH), 7,03 (d, 0,13H, anti-desa-CAH), 7,25 (m, IH, CONH), 7,29-7,95 (m, 8H, Fmoc-Ar-H), 10,50 (s, 0,18H, CONHN-desa), 10,59 (s, 0,07H, CONHN-desa).

HR-MS (ESI): Cale, per [C43H52FN307 H]+: m/z 742.379. Trovato: m/z 742.388. Sintesi del composto 6

Il composto 6 (Figura 2) è stato ottenuto dal composto 5 all'atto della rimozione del gruppo Fmoc mediante un trattamento di 2h con piperidina in DMF, poi isolato tramite precipitazione in Et20 e filtrazione.

1 H-NMR (400 MHz, DMSO): δ = 0,78 (d, 3H, desa-CZH3), 0,85 (s, 3H, desa-CYH3), 1,20-1,80 (m, 12H), 2,00-2,40 (m, 5H), 2,66 (m, IH), 2,92 (m, IH), 4,07 (d, IH, desa-CKH, J = 19,6 Hz), 4,07-4,16 (m, IH), 4,49 (d, IH, desa-CGH, J = 19,6 Hz), 4,94 (sbr, 0,6H, desa-OEH), 5,14 (m, 0,7H,desa-ODH), 5,94 (s, 0,16H, anti-desa-CCH), 6,00 (s, 0,26H, anti-desa-CCH), 6,19 (d, 0,32H, sin-desa-CBH), 6,25 (d, 0,27H, sin-desa-CBH), 6,40 (d, 0,23H, sin-desa-CAH), 6,45 (d, 0,27H, sin-desa-CAH), 6,58 (d, 0,14H, anti-desa-CBH), 6,65 (d,H, anti-desa-CBH), 6,69 (s, 0,39H, sin-desa-CCH), 6,79 (s, 0,25H, sindesa-CCH), 6,94 (d, 0,1 IH, anti-desa-CAH), 7,03 (d, 0,13H, anti-desa-CAH), 10,46 (sbr, CONHN-desa).

HR-MS (ESI): Cale, per [C28H42FN305 H]+: m/z 520.312. Trovato: m/z 520.323.

Sintesi del composto 7

La biotina è stata attivata in DMF mediante 1 reazione con TBTU in presenza di DIPEA, poi vi è stata aggiunta una soluzione del composto 6 in DMF. Dopo 3h, N2 è stato risciacquato per far evaporare la miscela fino a quasi totale secchezza. Il prodotto (composto 7, Figura 2) è stato isolato, successivamente a precipitazione, tramite l'aggiunta di acqua fredda, filtrato e lavato con acqua deionizzata, poi essiccato all'aria ottenendo una sostanza solida biancastra.

1H-NMR (400 MHz, DMSO): δ = 0,78 (d, 3 H, desa-CZH3), 0,85 (s, 3 H, desa-CYH3), 1,20-1,80 (m, 26 H), 2,05 (t, 2 H, biotina-CDH2CONHCH2, J = 7,4 Hz), 2,08-2,40 (m, 7 H), 2,60 (d, 2 H, biotina-CEH2), 2,93 (m, 1 H), 3,02 (dt, 2H, biotina-CONHCH2R-desa), 3,10 (m, 1 H, biotina-CFH), 4,08 (d, 1 H, desa-CKH), 4,08-4,18 (m, 4 H), 4,49 (d, 1 H, desa-CGH, J = 19,6 Hz), 4,68 (t, 1 H, desa-OH), 4,94 (sbr, 0,8 H, desa-OEH), 5,14 (m, 0,7 H,desa-ODH), 5,96 (s, 0,10 H, anti-desa-CCH), 6,00 (s, 0,05 H, anti-desa-CCH), 6,19 (d, 0,12 H, sin-desa-CBH), 6,25 (d, 0,16 H, sin-desa-CBH), 6,34 (sbr, 1 H, biotina-NIH), 6,41 (sbr, 1 H, biotina-NJH), 6,57 (d, anti-desa-CBH), 6,64 (d,H, anti-desa-CBH), 6,68 (s, 0,15 H, sin-desa-CCH), 6,78 (s, 0,1 OH, sin-desa-CCH), 6,93 (d, anti-desa-CAH), 7,03 (d, 0,13 H, anti-desa-CAH), 7,74 (m, 1 H, biotina-CONHR), 10,40-10,60 (m, desa-N-NH-R),

HR-MS (ESI): Cale, per [C38H56FN507S H]+: m/z 746,396. Trovato: m/z 746.397. Sintesi del composto 8

Il composto 6 è stato miscelato con biotina-PEG-SVA (5K) (MW 5200, Laysan Bio) in DMF secco in presenza di TEA e DCC. Successivamente ad una reazione per tutta la notte a temperatura ambiente, il prodotto (composto 8, Figura 2) è stato isolato tramite precipitazione in Et20 secco e filtrato. L'accoppiamento è stato confermato mediante prova TNBSA ed il rapporto desametasone:PEG (mole:mole 0,9:1) nel prodotto è stato calcolato dallo spettro 1H -ΝΜΒ.

Sintesi del composto 9

La funzione amminica del 6-amminoesanolo è stata protetta con un residuo Fmoc mediante una reazione di 3h a temperatura ambiente con FmocOSu in diossano/acqua (1:1) in presenza di K2CO3. Successivamente ad evaporazione di metà del volume, il prodotto (composto 9, Figura 3) è stato estratto con EtOAc, la fase organica è stata lavata con acqua, poi fatta evaporare a pressione ridotta, ottenendo una sostanza solida bianca.

Sintesi del composto 10

Il composto 9 e difosgene sono stati sospesi in ACN. La miscela è stata agitata per 5 h a temperatura ambiente, fino ad ottenere una miscela di aspetto omogeneo e la TLC (cromatografia su strato sottile) (DCM/MeOH 90/10) ha mostrato una conversione completa; la soluzione è stata poi fatta evaporare a pressione ridotta allo scopo di rimuovere l'eccesso di difosgene. La sostanza solida (composto 10, Figura 3) ottenuta è stata ri disciolta in 5 mL di ACN ed aggiunta, goccia a goccia, ad una soluzione raffreddata con ghiaccio di idrato di idrazina in CAN. Dopo 10 minuti, il bagno di ghiaccio è stato rimosso e la miscela è stata agitata fino a completamento. Alla soluzione è stato aggiunto acetato di etile e la fase organica è stata lavata con acqua deionizzata, poi fatta evaporare a pressione ridotta ottenendo una sostanza solida bianca.

1 H-NMR (400 MHz, DMSO): δ (ppm) = 1,18-1,60 (m, 8 H, RHNCH2CH2CH2CH2CH2CH2O), 2,97 (dt, 2 H, RNHCH2), 3,95 (t, 2 H, CH2OCONHNH2, J = 6,6 Hz), 4,00 (sbr, NHNH2), 4,21 (t, 1 H, Fmoc-CHCH2, J = 6,9 Hz), 4,30 (d, 2 H, Fmoc-CHCH2, J = 6,9 Hz), 7,25 (t, IH, Fmoc-NH, J = 5,5 Hz) 7,28-7,92 (m, 8 H, Fmoc-Ar-H), 8,07 (sbr, IH, CONHNH2).

Sintesi del composto 11

Il composto 10 è stato miscelato con desametasone in MeOH acido per TFA e la miscela è stata agitata a 40 °C. Dopo una reazione di 24h, la miscela è stata fatta evaporare a pressione ridotta con EtOH assoluto per rimuovere l'acqua, ottenendo una sostanza solida giallo chiaro. Il prodotto (composto 11, Figura 3) è stato purificato tramite cromatografia flash a fase inversa (ACN/acqua, da 5 % a 90 %) su una cartuccia Biotage SNAP KP-C18-HS.

<1>H-NMR (400 MHz, DMSO): δ (ppm) = 0,78 (d, 3H, desa-CZH3), 0,85 (s, 3H, desa-CYH3), 1,06 (m, 1H, desa-CXH), 1,20-1,66 (m, 18H), 2,00-2,40 (m, 8 H), 2,90-3,00 (m, 4 H), 4,00-4,16 (m, 6 H), 4,21 (t, 1 H, Fmoc-CH-CH2, J = 6,8 Hz), 4,30 (t, 1 H, Fmoc-CH-CH2, J = 6,8 Hz), 4,49 (dd, 1 H, desa-CGH, J1 = 19,6 Hz, J2 = 5,8 Hz), 4,66 (t, 1 H, desa-OFH, J = 5,58 Hz), 4,94 (sbr, 1 H, desa-OEH), 5,12 (sbr, desa-ODH), 5,96 (s, 0,39 H, anti-desa-CCH), 6,01 (s, 0,12 H, anti-desa-CCH), 6,22 (d, 0,64 H, sin-desa-CBH), 6,37 (d, 0,54 H, sin-desa-CAH), 6,56 (d, 0,37 H, anti-desa-CAH), 6,73 (s, 0,61 H, sin-desa-CCH), 6,96 (d, 0,35 H, anti-desa-CBH), 7,25 (m, IH, CONH), 7,29-7,95 (m, 8H, Fmoc-Ar-H), 10,20 (s, 0,32 H, CONHN-desa), 10,26 (s, 0,15 H, CONHN-desa).

Sintesi del composto 12

Il composto 12 (Figura 3) è stato ottenuto dal composto 11 all'atto della rimozione del gruppo Fmoc mediante trattamento di 12h con piperidina in DMF, poi isolato tramite precipitazione in Et20 e filtrazione.

1H-NMR (400 MHz, DMSO): δ (ppm) = 0,78 (d, 3H, desa-CZH3), 0,85 (s, 3H, desa-CYH3), 1,06 (m, IH, desa-CXH), 1,20-1,80 (m, 20 H), 2,00-2,40 (m, 5 H), 2,90-3,00 (m, 2 H), 4,00-4,16 (m, 4 H), 4,49 (d, 1 H, desa-CGH, J1 = 19,6 Hz), 4,66 (sbr, 1 H, desa-OFH), 4,93 (sbr, 1 H, desa-OEH), 5,12 (sbr, desa-ODH), 5,95 (s, 0,39 H, anti-desa-CCH), 6,01 (s, 0,12 H, anti-desa-CCH), 6,22 (d, sin-desa-CBH), 6,37 (d, sin-desa-CAH), 6,56 (d, anti-desa-CAH), 6,73 (s, sin-desa-CCH), 6,96 (d, anti-desa-CBH), 10,24 (m, CONHN-desa).

HR-MS (ESI): Cale, per [C29H44FN306 H]+: m/z 550.329. Trovato: m/z 550.333. Sintesi del composto 13

La biotina è stata attivata in DMF mediante 1 reazione con TBTU in presenza di DIPEA, poi vi è stata aggiunta una soluzione del composto 12 in DMF. Dopo 3h, N2 è stato risciacquato per far evaporare la miscela fino a quasi totale secchezza. Il prodotto (composto 13, Figura 3) è stato isolato, successivamente alla precipitazione, tramite l'aggiunta di acqua fredda, filtrato e lavato con acqua deionizzata, poi essiccato all'aria ottenendo una sostanza solida biancastra.

1H-NMR (400 MHz, DMSO): δ = 0,78 (d, 3 H, desa-CZH3), 0,85 (s, 3 H, desa-CYH3), 1,20-1,80 (m, 26 H), 2,05 (t, 2 H, biotina-CDH2CONHCH2, J = 7,4 Hz), 2,08-2,40 (m, 7 H), 2,60 (d, 2 H, biotina-CEH2), 2,83 (dd, 1 H, J1 = 12,14, J2 = 5,34 Hz), 3,03 (m, 2 H, biotina-CONHCH2R-desa), 3,10 (m, 1 H, biotina-CFH), 4,07 (t, 1 H, desa-CKH, J = 6,7 Hz), 4,09-4,17 (m, 3 H), 4,49 (d, 1 H, desa-CGH, J = 19,6 Hz), 4,65 (t, 0,8 H, desa-OH), 4,94 (sbr, 0,7 H, desa-OEH), 5,11 (m, 0,8 H, desa-ODH), 5,95 (sbr, 0,44 H, anti-desa-CCH), 6,22 (d, 0,90 H, sin-desa-CBH), 6,37 (s, 2 H, biotina-NI,JH), 6,37 (d, 1 H, sindesa-CCH), 6,56 (d, 0,68 H, anti-desa-CBH), 6,73 (sbr, 0,75 H, anti-desa-CCH), 6,97 (d, anti-desa-CAH), 7,75 (m, 1 H, biotina-CONHR), 10,17-10,32 (m, desa-N-NH-R).

HR-MS (ESI): Cale, per [C39H58FN506S H]+: m/z 776,407. Trovato: m/z 776.408. Sintesi del composto 14

Il composto 12 è stato miscelato con biotina-PEG-SVA (5K) (MW 5200, Laysan Bio) in DMF secco, in presenza di TEA e DCC. Dopo una reazione per tutta la notte a temperatura ambiente, il prodotto (composto 14, Figura 3) è stato isolato mediante precipitazione in Et20 secco e filtrato. L'accoppiamento è stato confermato mediante prova ed il rapporto desametasone:PEG (mole:mole 0,94:1) nel prodotto è stato calcolato dallo spettro 1 H-NMR.

Formulazioni ANANAS-PEG-Hz-Dex

Sono state generate diverse formulazioni (Tabella 1), iniziando da un nucleo ANANAS contenente la quantità minima di 5KD metossi-PEG (12,5% BBS) per garantire una solubilità del tampone, le quali sono state preparate conformemente a Pignatto 2010 e liofilizzate dopo la purificazione. Le nanoparticelle sono state ricostituite in tampone PBS e vi sono stati aggiunti diversi composti biotinilati al rapporto molare biotina:BBS desiderato. Le formulazioni prive di desametasone sono state generate usando metossi-PEG-biotina in luogo del composto 2. Qualora necessario, è stata anche aggiunta biotinaalexa633 ad un rapporto molare biotina:BBS = 0,2.

Tabella 1.

Titolazione del desametasone rilasciabile da ANANAS-PEG-Sc-Hz-Dex

I campioni di ANANAS-PEG-SC-Hz-desametasone sono stati generati miscelando il nucleo ANANAS con un'ampia eccedenza del composto 2a. Il campione è stato purificato mediante cromatografìa a permeazione di gel e le NP purificate sono state trattate in 0,1M di HCl a 37°C per 4 h; la soluzione è stata analizzata relativamente al contenuto di desametasone libero mediante analisi HPLC (RP-HPLC) a fase inversa (eluente A: H2O TFA 0,1%, eluente B 5% A in ACN; gradiente da 5% a 90% B in 40 min); anteriormente all'analisi HPLC, la frazione di proteina è stata rimossa dalla soluzione mediante precipitazione di CH3CN a freddo.

Studi sul rilascio del desametasone

Il rilascio del desametasone dai diversi derivati della biotina, in forma di molecole libere o qualora legato alle NP, è stato valutato in corrispondenza di tre pH (100 mM di fosfato, pH 7.4, 100 mM di NaAcetato, pH 5,0 e 100 mM di NaAcetato, pH 4,0). I campioni (10 μg/mL in desametasone) sono stati incubati nel tampone selezionato a 37°C e nei momenti temporali programmati, la concentrazione di desametasone libero nella soluzione è stata misurata mediante RP-HPLC, così come descritto in precedenza.

Titolazione delle nanoparticelle sul tessuto epatico mediante dot blot

Ai tessuti epatici è stato aggiunto l'1% di SDS caldo in ddH20, con rapporto peso/volume 1:5 ed essi sono stati alterati utilizzando un omogeneizzatore potter, sonicati a temperatura ambiente per 60 secondi e riscaldati per 10’ a 100°C. Il supernatante è stato isolato tramite centrifugazione e vi è stata aggiunta, per 1/5 del proprio volume, una soluzione 5X GSMT (glicerolo: 1,5M TRIS : SDS : β-mercaptoetanolo = 630: 330: 150:22,2 rapporto peso:peso), poi esso è stato riscaldato a 100°C per Ih. I campioni sono stati poi diluiti 1:10 con PBS e disposti a punti (2 μΐ/punto) su un foglio di nitrocellulosa. Successivamente al bloccaggio (3% BSA in PBST, Ih, temperatura ambiente), è stata effettuata la quantificazione dei punti all'atto dell'incubazione con IgG anti-avidina di coniglio (Abcam, P.N. n. ab6675, diluizione 1:2500 con PBST+0,1% BSA, Ih, temperatura ambiente), seguita da IgG anti-coniglio di capra coniugato HRP (Millipore, AP307P, diluizione 1:5000 in PBST/BSA 0,1%, 45’, temperatura ambiente), e sviluppo di ECL (GE Healthcare RPN2232). Per la lettura dell'ECL, è stato usato un lettore a luminescenza Versadoc 4000MP (Biorad) e la quantificazione dell'intensità dei punti è stata ottenuta mediante ImageJ Fiji. Allo scopo di consentire la quantificazione, i campioni sono stati analizzati in parallelo con soluzioni calibrate ottenute trattando nello stesso modo campioni di fegato di animali non trattati con quantità note di avi dina (0, 3, 9, 26, 77 μg di avidina/g di tessuto).

Modelli animali

Gli esperimenti riguardanti i topi sani e le rispettive cure sono stati condotti conformemente alle linee guida istituzionali dell'IRCCS (Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifìco)-Istituto di Ricerca Farmacologica “Mario Negri”, ai sensi delle leggi e politiche nazionali (Decreto Legislativo n. 26, 4 marzo 2014; Autorizzazione n,19/2008-A del 6 marzo 2008, promulgata dal Ministero della Sanità italiano) ed intemazionali (Direttiva del Consiglio CEE 2010/63, 6 agosto 2013; Direttive per la Cura e l'Utilizzo degli Animali da Laboratorio, Consiglio di ricerca Nazionale Statunitense (U.S. National Research Council), Dichiarazione di Conformità A5023-01, 28 ottobre 2008). Tale attività è stata revisionata dall'IRCCS-IRFMN Commissione per la Cura e l'Utilizzo degli Animali (IACUC) e poi approvata daH'“Istituto Superiore di Sanità” italiano (codice: 42/2016-PR). Topi maschi C57BL/6J di otto settimane di vita sono stati utilizzati e mantenuti in specifiche condizioni di assenza di patogeni presso le Strutture di Cura degli Animali dell'Istituto; essi hanno ricevuto cibo ed acqua a piacere e sono stati periodicamente controllati da un veterinario iscritto all'albo, responsabile della supervisione del benessere degli animali e della revisione del protocollo sperimentale. Allo scopo di indurre la AIH, i topi C57BL/6J della stessa figliata sono stati infettati con la codifica di adenovirus 3 x 10<8 >pfu (intraperitoneale ed endovenoso) per gli esseri umani CYP2D6 (Ad-2D6), così come descritto in precedenza per i topi FVB. Tutte le procedure sperimentali eseguite con i topi Ad-2D6 infetti sono state approvate dal Ethics Animal Review Board (Consiglio di Revisione Etica Sugli Animali) locale, Darmstadt, Germania (V54-19c20/15-FU/1094).

I gruppi sperimentali usati per le analisi in vivo ed ex vivo sono stati riportati nella Tabella 2:

Tabella 2. Animali coinvolti in tale studio, con i rispettivi programma di trattamento e tipo di analisi

Imaging a fluorescenza in vivo ed ex vivo

Relativamente allo studio della biodistribuzione, è stato utilizzato un totale di 27 animali C57BL/6J. Dodici topi per ogni gruppo sperimentale sono stati scelti e trattati, a livello intraperitoneale, con una soluzione di ANANAS, al dosaggio di 40 mg/kg, e con ANANAS-Hz-Dex alla stessa quantità di NP caricate, con 0,4 mg/kg di Dex. I tre animali restanti sono stati trattati con PBS e sono stati usati quali controlli, mentre i topi trattati con alexa633 sono stati scelti per il confronto fra il segnale del fluoroforo libero e quello osservato per le NP fluorescenti.

Allo scopo di ridurre lo sfondo di fluorescenza, i topi sono stati alimentati con una dieta priva di erba medica AIN-76A (Mucedola srl) per due settimane prima dell'analisi. L'imaging ottico in vivo è stato condotto 30’, 4h e 24h dopo il trattamento. Le immagini di fluorescenza sono state acquisite con un sistema di imaging IVIS Lumina ΙΠ (Perkin Elmer). Sono stati usati i parametri di acquisizione seguenti: intervallo filtro di eccitazione: 680 - 740nm, filtro di emissione: 790nm, tempo di esposizione: 2”, fattore di binning 4, e f/Stop: 2.

Al termine dello studio, i topi sono stati sacrificati 4 e 24 ore dopo il trattamento, mediante un'overdose di ketamina (150 mg/kg) e di medetomidina (2 mg/kg). Il fegato, i reni, la milza, i polmoni e il cervello sono stati rimossi e scansionati per finalità di imaging ex vivo. Gli organi sono stati raccolti in assenza di perfusione degli animali, di modo che il segnale registrato tenga anche conto della porzione associata ai loro vasi sanguigni. L'unmixing spettrale, l'elaborazione delle immagini e le analisi sono stati eseguiti utilizzando il software Living Image 4.3.1 (Perkin Elmer).

Raccolta ed immunofluorescenza dei tessuti

All'atto del sacrificio, i fegati provenienti sia dai topi sani, sia dai topi affetti da AIH, trattati con ANANAS ed ANANAS-Hz-Dex, sono stati raccolti, postfissati in paraformaldeide al 4% per 24h e trasferiti in una soluzione di saccarosio al 20% fino alla macchiatura da immunofluorescenza. Sezioni di criostati sono state tagliate a 10pm e montate su vetrini. I vetrini sono stati lavati tre volte in soluzione salina con tampone di fosfato (PBS) per 5’, incubati per Ih con una soluzione di bloccaggio (PBS-NGS 10%-Triton X-1000,1%) e poi lavati nuovamente con PBS. Relativamente alla localizzazione subcellulare, l'anticorpo anti-CD68 (specifico delle membrane lisosomiali ed endosomiali dei macrofagi) è stato impiegato come segue: anticorpo anti-CD68 del ratto monoclonale primario (1:200, Serotec, Kidlington, UK) Triton X-100 0,1% NGS 3% in PBS O/N a 4°C. Successivamente al lavaggio, l'anticorpo coniugato alexa488 secondario (Invitrogen) (1:500) è stato incubato per Ih a temperatura ambiente in una soluzione all'1% di PBS-NGS. Al termine dell'incubazione, i vetrini sono stati lavati ed i nuclei sono stati macchiati con Hoechst 33258 (1 pg/mL in PBS, per 10’).

Relativamente alla macchiatura da avidina, i fegati provenienti dai topi sani trattati con ANANAS sono stati raccolti, surgelati con azoto liquido e rispettive sezioni di criostati sono state tagliate a 10pm e montate su vetrini. I vetrini sono stati fissati in paraformaldeide al 4% per 30’, lavati tre volte in PBS per 5’ ed incubati con una soluzione di bloccaggio (15’ con 3% di H2O2 per il bloccaggio della perossidasi ed Ih con PBS-NGS 10%-Triton X-100 1% per il bloccaggio non specifico). Si sono utilizzati l'anticorpo anti-avidina (HRP) (1 : 100, Abcam) 2% NGS 0,5% Triton-X 100 in PBS O/N a 4°C. Successivamente al lavaggio (TBS 0,05% di Tween-20), TSA-Fluoresceina (1:50) (Perkin Elmer, Ine.) è stata incubata per 8’ a temperatura ambiente in un diluente di amplificazione proveniente dallo stesso kit. Al termine dell'incubazione, i vetrini sono stati lavati, ed i nuclei sono stati macchiati con Hoechst 33258 (1 μg/mL in PBS, per 10 min).

Microscopia confocale ed a super risoluzione

Laser specifici λexc =405 nm, λexc = 488 nm e λexc = 640 nm sono stati impiegati per visualizzare il segnale rispettivamente correlato ad Hoechst 33258 (nuclei), alexa488/Fluoresceina (CD 68/macchiatura avi dina) ed alexa633 (ANANAS). I campioni sono stati acquisiti utilizzando Microscopi Nikon A1 Confocal e Nikon N-SIM e sono stati pseudocolorati (blu per Hoechst 33258, verde per alexa488/Fluoresceina e rosso per alexa633). Le immagini confocali sono state raccolte utilizzando obiettivi CFI SR HP Apochromat TIRF 100XC Oil 20x e 100x. Nelle acquisizioni confocali 20x, i campi di stitching sono stati ottenuti automaticamente durante l'acquisizione mediante il Software Nikon NIS-Element. Nell'acquisizione confocale 100x, lo spessore di stack varia fra i diversi campioni, da 0,12μm a 0,96μm. Relativamente alle acquisizioni a super risoluzione N-SIM, è stato usato un obiettivo CFI SR HP Apochromat TIRF 100XC Oil 100x. Le immagini sono state acquisite in modalità 3D-SIM. La ricostruzione in super risoluzione e la resa 3D sono state ottenute mediante Software Nikon NIS-Element. La quantificazione delle immagini è stata effettuata mediante il software Fiji (ImageJ). Per ogni gruppo sperimentale, sono state utilizzate 10 acquisizioni.

Studio della farmacocinetica

Gruppi sperimentali. Allo scopo di quantificare i livelli di desametasone, plasma, sono stati usati il cervello ed il fegato provenienti dal gruppo di topi sani C57BL/6J summenzionato, trattati con ANANAS-Hz-Dex (formulazione I). In aggiunta, agli altri dodici animali è stato iniettato a livello intraperitoneale Dex libero (0,4 mg/kg) ed essi sono stati sacrificati negli stessi punti temporali.

Relativamente a tale analisi, sono stati considerati anche i topi infetti da Ad-2D6. 28 giorni dopo l'infezione virale, dodici animali per entrambi i gruppi sperimentali (rispettivamente ANANAS-Hz-Dex e Dex) sono stati trattati e sacrificati seguendo la stessa procedura programmata.

Preparazione ed estrazione dei campioni. Quale prima fase dei procedimenti analitici, lo standard interno, fludrocortisone (10ng) è stato aggiunto al campione proveniente dai topi trattati, mentre desametasone (0-100ng) e fludrocortisone (20ng) sono stati inclusi per la curva di taratura.

Fette di fegato e di cervello sono state trattate con metanolo (1 :2 p/v) ed acetonitrile (1 : 1 p/v), agitate e sonicate per 20’. E stata poi aggiunta acqua (1:10 p/v) ed è stato ripetuto il passaggio di agitazione e sonicazione. I campioni risultanti sono stati centrifugati a 7000g per 15’ a 4°C. Il supematante è stato ulteriormente pulito mediante estrazione in fase solida, usando Cartucce Sep-Pak C18 1 cc Vac, le quali sono state precedentemente trattate con lmL di metanolo, seguito da un 1mL d'acqua. I campioni sono stati caricati nelle colonne SPE e fatti passare attraverso le stesse goccia a goccia. In seguito, le cartucce sono state risciacquate con 1mL di acqua:acetone (80:20) e poi con 1mL d'acqua prima dell'essicazione delle colonne sotto vuoto per 5’. I campioni sono stati eluiti con 1,8mL di acetonitrile in fiale di vetro. Relativamente alle aliquote di plasma, esse sono state eluite direttamente con acetonitrile (1:4v/v) e centrifugate a 7000g per 15’ a 4°C. Tutti i campioni ottenuti sono stati fatti evaporare allo scopo di rimuovere la fase organica. Appena prima dell'analisi, essi sono stati sospesi in 100μL di acido acetico allo 0,05%: acetonitrile (80:20) in provette autocampionatrici.

Cromatografia liquida (HPLC) e spettrometria di massa tandem (MS/MS). Tutti gli esperimenti sono stati effettuati su un sistema HPLC serie Agilent 1200 interfacciato ad uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo Agilent 6410 dotato di fonte di ionizzazione elettrospray (Agilent Corporation, MA, USA). Tutti i dati sono stati acquisiti ed analizzati utilizzando il software di elaborazione dati Agilent 6410 Quantitative Analysis. La separazione è stata eseguita usando una colonna Superspher® 100 RP-18 (2,1 x100mm, Merck, Darmstadt, Germania), mantenuta a 30°C. I solventi di eluizione erano acido acetico allo 0,05% in acqua (fase mobile A, MP-A) ed acetonitrile (fase mobile B, MP-B). Il volume di iniezione era 10μL e la portata era 200μL/min. La temperatura dell'autocampionatore era pari a 6°C. L'eluizione è iniziata con 80% di MP-A e 20% MP-B per 2’, seguita da un gradiente lineare di 12’ al 60% di MP-B, da un gradiente lineare di 2 al 99% di MP-B, mantenuto per 4’ e da un gradiente lineare di 1' all'80% di MP-A, mantenuto per 6’ allo scopo di equilibrare la colonna. Il desametasone ed il fludrocortisone sono stati analizzati usando elettrospray in modalità di ionizzazione negativa, con la tensione dello spray impostata a 2000 V. Azoto è stato usato quale gas nebulizzatore ad una pressione di 35 psi. Il gas di desolvatazione (azoto) è stato riscaldato a 250°C ed erogato ad una portata di 7,5L/min. I dati dell'analisi sono stati acquisiti in modalità di monitoraggio di reazione multipla (MRM). La Tabella 3 mostra i parametri MRM ottimizzati per ogni componente:

Tabella 3: Parametri MRM ottimizzati per desametasone e fludrocortisone (IS)

Trattamenti cronici e risultati patologici

Allo scopo di valutare l'efficacia terapeutica della nanoformul azione, sono stati utilizzati topi affetti da Ad-2D6. Gli animali hanno ricevuto 6 iniezioni intraperitoneali in serie di PBS (n=3), ANANAS (40 mg/kg, n=6), Dex (0,4 mg/kg, n=5), ANANAS-Hz-Dex formulazione I (40 mg/kg di NP e 0,4 mg/kg di farmaco, n=5). I tre topi restanti non erano infettati e sono stati usati quale controllo. Le iniezioni sono state somministrate nei giorni -1, 3, 7, 10, 14 e 17 dopo l'infezione da Ad-2D6. Il sangue è stato prelevato nei giorni 6, 13 e 20 post-infezione allo scopo di determinare i livelli di alanina aminotransferasi (ALT) e di aspartato aminotransferasi (AST) nel siero, mentre i livelli di IgG anti-CYP2D6 sono stati analizzati esclusivamente nel giorno 20. Al momento del sacrifìcio, i fegati sono stati raccolti, fissati in formalina ed inseriti in paraffina.

Determinazione dell'aminotransferasi sierica e dell'anticorpo anti-CYP2D6

I campioni di sangue sono stati raccolti con capillari rivestiti di eparina ed il siero è stato stoccato a -80°C fino all'ulteriore analisi. I livelli di ALT ed AST sono stati misurati con il sistema di analisi ematica Reflotron Plus (Roche Diagnostics, Mannheim, Germania). Relativamente alla valutazione degli anticorpi anti-CYP2D6, piastre per microtitolazione a 96 pozzetti sono state rivestite, per tutta la notte, a 4°C, con 100μl di CYP2D6 umano ricombinante 0,25μg/ml (Invitrogen) in 100 nM di tampone carbonato (pH 9.6) e le piastre sono state bloccate con FCS al 2% in PBS per 90’ a temperatura ambiente. I sieri sono stati aggiunti in PBS contenente FCS al 2% e sono stati incubati per 90’ a 37°C. La serie di diluizione è iniziata a 1 : 100, seguita da fasi di diluizione 1 :3 fino ad una diluizione di 1/72.900. Un anticorpo IgG anti-topo di capra marcato fosfatasi alcalina (1:2000, Southern Biotech, Birmingham, USA) è stato aggiunto per 90’ e la reazione è stata sviluppata tramite l'aggiunta di un substrato ECF (GE Healthcare Bio-Sciences). L'intensità della fluorescenza è stata determinata utilizzando un riproduttore di immagini molecolare Pharos FX (Bio-Rad).

Immunoistochimica delle sezioni di fegato

I topi sono stati sacrificati, ed i fegati sono stati perfusi con 5 mi di PBS in situ. I fegati sono stati asportati, immersi in Tissue-Tek OCT (Bayer), e surgelati in modalità rapida su ghiaccio secco. Utilizzando un criomicrotomo e vetrini Superfrost Plus rivestiti di sialina (Fisher Scientific), sono state tagliate sezioni di tessuto di 7μm. Le sezioni sono state poi fissate con etanolo a -20°C e, successivamente al lavaggio in PBS, è stata inclusa una fase di bloccaggio avidina/biotina (Vector Laboratories). Gli anticorpi primari e secondari biotinilati (Vector Laboratories) sono stati fatti reagire con le sezioni rispettivamente per 120 min. e 60 min., ed è stata ottenuta la reazione cromatica tramite incubazione sequenziale con coniugato di avidina-perossidasi (Vector Laboratories) e perossido di dia-minobenzidina-idrogeno. Gli anticorpi primari usati erano: CD4 antitopo di ratto (BD Biosciences), CDllb anti-topo di ratto (eBioscience), F4/80 anti-topo di ratto (Serotec), e collagene I anti-topo di coniglio (Merck-Millipore). Gli anticorpi secondari biotinilati erano: anti-coniglio e IgG anti-ratto (entrambi da Vector Laboratories).

Statistica

Tutti i dati sono stati analizzati mediante l'utilizzo del software GraphPad Prism (versione 7). Le differenze nell'intensità della fluorescenza durante l'imaging ottico ex vivo sono state valutate usando il test t di Student per dati non appaiati (* p<0,05, ** p<0,005, *** p<0,0005). I dati sono stati riportati quale media ± SE. Durante la valutazione di CD68 e NP, è stata eseguita l'analisi della varianza ad una via di co-localizzazione, seguita dal test post hoc di Tukey (*** p < 0,0001). I dati sono stati riportati quale diagramma di dispersione. Relativamente alla farmacocinetica, è stata eseguita l'analisi della varianza ad una via seguita dal test post hoc di Bonferroni (* p < 0,05, ** p < 0,005). I dati sono stati riportati quale media ± SE.

Razionale alla base della parte sperimentale

Il presente studio è stato volto a fornire una terapia efficace basata su una nanoformul azione innovativa che veicola desametasone, sulla base dei Nano-ASsemblaggi-Acidi-Nucleici-Avidina (ANANAS), in un modello murino di AIH. Gli ANANAS sono NP basate su poliavidina che si generano dall'interazione ad elevata affinità fra la proteina dell'albume, l'avidina, ed un filamento di acido nucleico (Figura 4). Tali nanoparticelle, le quali sono composte da componenti teneri biodegradabili e biocompatibili e sono scarsamente immunogeniche, possono essere considerate "superavidine", con potenziali diagnostici e terapeutici che ampliano quelli della singola proteina avidina, incluso il rilascio targetizzato del farmaco. In modo interessante, gli ANANAS mantengono alcune caratteristiche che li rendono particolarmente idonei quali vettori di farmaci per il trattamento di un'ampia gamma di disturbi epatici. Si è recentemente dimostrato che, oltre alla somministrazione sistemica, gli ANANAS circolano liberamente nel flusso sanguigno per oltre due ore e si accumulano progressivamente nel parenchima epatico prima di essere eliminati entro 24h-48h. Da un punto di vista tecnico, grazie all'elevata affinità (Kd =10<-15>M) fra avidina e biotina, tali NP possono essere caricate facilmente con agenti bioattivi o di contrasto a stechiometria controllata. La totalità di tali caratteristiche ha consentito un controllo stringente di ogni parametro fisicochimico durante la sintesi, necessario per un passaggio futuro dal lato preclinico al lato clinico.

Nel presente lavoro, lo steroide desametasone (Dex) è stato coniugato agli ANANAS. Dopo una serie di caratterizzazioni in vitro, sono stati effettuati studi in vivo allo scopo di valutare le rispettive cinetica ed efficacia nei topi. Il dex è stato selezionato quale agente attivo in quanto, fra tutti i farmaci corticosteroidi, esso evidenzia l'efficacia antinfiammatoria diretta massima - superiore di circa 7,5 volte rispetto al prednisolone -e la durata di azione maggiormente estesa. In effetti, il dex è ampiamente utilizzato (a livello sia orale, sia parenterale) in diverse applicazioni cliniche antinfiammatorie, inclusi i disturbi correlati a questioni immunitarie, grazie alla sua capacità di inibire la funzione dei linfociti, dei macrofagi e delle altre cellule immunitarie.

Il farmaco è stato legato agli ANANAS mediante un linker biotina-PEG, utilizzando un legame idrazonico reversibile acido, il quale dovrebbe garantire stabilità in corrispondenza del pH neutro del plasma e consentire il rilascio del farmaco nell'ambiente acido endosoma/lisosoma (Figura 5E-F).

Il potenziale terapeutico dell'ANANAS-Hz-Dex sull'AIH è stato valutato nel consolidato modello di citocromo P450 2D6 (CYP2D6) dei topi, il quale riflette numerosi aspetti dell'AIH umano, fra cui livelli elevati di aminotransferasi sierica e di γ-globuline, generazione di anticorpi specifici di CYP2D6 e cellule T, così come infiltrazione epatica e fibrosi. Nel modello CYP2D6, l'induzione di una patologia simile all'AIH tramite iniezione di un adenovirus che codifica l'autoantigene principale del fegato nell'AIH umano di tipo 2, CYP2D6 umano, presenta il vantaggio secondo cui i processi immunopatogeni possono essere valutati in momenti precisi successivamente all'induzione. E' stato eseguito uno studio iniziale in vitro per verificare la stabilità differenziale del linker farmaco-idrazo in corrispondenza di un pH neutro ed acido. In seguito, sono stati eseguiti imaging ottico e microscopia confocale e a super-risoluzione allo scopo di localizzare ANANAS marcati a fluorescenza nell'intero corpo e nelle sezioni di fegato, nonché HPLC MS/MS allo scopo di misurare il livello di farmaco libero nel plasma e nei diversi organi. Infine, i segnali clinici dei topi affetti da AIH sono stati valutati mediante prove biochimiche ed istologiche.

RISULTATI E DISCUSSIONE

Configurazione e caratterizzazione di ANANAS-Hz-Dex

La Figura 4 riassume il processo di assemblaggio del Dex con gli ANANAS. Ogni nanoparticella contiene circa 350 avidine, le quali sono disponibili per il docking con qualsiasi tipo di frazione biotinilata grazie all'elevata affinità fra avidina e biotina (Kd =10<-15>M). Nei lavori precedenti, si è dimostrato che, qualora a stretto contatto con le cellule, gli ANANAS erano internalizzati attraverso un percorso endocitico e tale fenomeno si verifica anche a livello di parenchima epatico successivamente alla somministrazione endovenosa. Pertanto, si è deciso di impiegare il legame idrazonico reversibile a pH basso per promuovere il rilascio del farmaco solamente all'atto dell'intemalizzazione cellulare. Allo scopo di massimizzare lo strato PEG necessario per la protezione della superficie in concomitanza al caricamento del Dex, uno spaziatore 5KDa poli(etilenglicole) è stato introdotto fra la biotina e la frazione farmaco - idrazo (biotina-PEG-Hz-Dex, composto 2, Figura 1)

NP supportanti Dex sono state preparate miscelando tale reagente a nanoparticelle (vuote) del nucleo precedentemente ottenute in forma liofilizzata. Queste ultime contengono la quantità minima di biotina-metossi-PEG, allo scopo di garantire stabilità colloidale durante i processi di preparazione e di liofilizzazione. Tale formulazione può essere funzionalizzata in una reazione one-pot con i reagenti della biotina, senza la necessità di ulteriori fasi di purificazione, a meno che i siti di legame per la biotina (BBS) o l'area di superficie disponibile siano saturi. La capacità di caricamento massima delle NP per il derivato del desametasone è stata, pertanto, valutata negli esperimenti preliminari. Le miscele di NP del nucleo e di biotina-PEG-Hz-Dex sono state generate in tampone PBS con rapporti molari biotinaBBS da 0,25 a 0,8 e sono state analizzate, relativamente al loro contenuto di reagente PEG non legato, mediante cromatografia a permeazione di gel. Può essere caricato un massimo di 410 unità di biotina-PEG-Hz-Dex/nanoparticella, così come confermato anche dalla titolazione HPLC del desametasone rilasciabile dagli assemblaggi purificati. Tale quantità corrisponde ad una copertura di BBS pari a circa il 30% (Figura 5A). Sulla base di tale informazione, ANANAS-Hz-Dex sono stati preparati, in seguito, miscelando biotina-PEG-Hz-Dex e le nanoparticelle del nucleo ad una copertura di BBS del 30% (ANANAS-Hz-Dex30) ed usati in assenza di purificazione. All'atto dell'aggiunta del reagente supportante il Dex, la dimensione della nanoparticella è aumentata da 125,8+/- 1,2 nm a 132,9+/-2,9 nm, conformemente alla formazione di uno strato PEG attorno alla particella del nucleo. Anche esperimenti di diffusione luminosa dinamica hanno mostrato che le formulazioni caricate con il Dex sono stabili, a livello colloidale, almeno per 48h successivamente alla loro preparazione (Figura 5 e Figura 6). La capacità degli ANANAS-Hz-Dex30 di rilasciare in modo selettivo Dex libero con pH acido è stata dimostrata in esperimenti in vitro. Con pH neutro, il farmaco rimane legato stabilmente al linker della biotina, mentre con pH inferiore a 6,0, il rilascio del farmaco si verifica con una cinetica che aumenta all'aumentare dell'acidità dell'ambiente (Figura 5E-F).

ANANAS e ANANAS-Hz-Dex si concentrano nel parenchima epatico dei topi sani Uno degli obiettivi principali del rilascio del farmaco dipendente dalle NP è quello di aumentare il tropismo nei confronti dell'organo target. La biodistribuzione sia degli ANANAS, sia di ANANAS-Hz-Dex successivamente ad una somministrazione intraperitoneale (i.p.), è stata anzitutto analizzata in topi sani, immunocompetenti e privi di patogeni specifici, allo scopo di valutare il loro comportamento in condizioni fisiologiche. Relativamente a tale parte delle analisi, le due formulazioni sono state marcate a fluorescenza con biotina-alexa633 legata in modo covalente agli ANANAS, allo scopo di consentire la tracciatura longitudinale per ogni singolo topo mediante imaging ottico (IVIS Lumina XRMS). Dato che variazioni minime sulla composizione delle NP - incluso il collegamento ad uno steroide - possono alterare l'interazione con i tessuti ospiti, è stato eseguito un confronto approfondito fra le due formulazioni.

Una tracciatura longitudinale dell'intero corpo (30’, 4h e 24h) delle NP marcate a fluorescenza ha mostrato un profilo simile per le due formulazioni in merito alla permanenza nel corpo ed alla biodistribuzione (Figura 7). Il segnale associato alle due formulazioni rimane per un lungo periodo all'interno della cavità addominale (circa il 40% del segnale registrato 30’ dopo la somministrazione è ancora presente dopo 24h). Allo scopo di escludere la correlazione del segnale alla libera circolazione del colorante che si stacca dagli ANANAS dopo la somministrazione, è stata somministrata la stessa concentrazione di biotina-alexa633 a peso molecolare ridotto e la destinazione del colorante è stata confrontata con quella delle due nanoformulazioni fluorescenti. Il segnale correlato al fluoroforo libero, nonostante la propria superiore fluorescenza intrinseca (Figura 7A), è scomparso rapidamente nel tempo (Figura 7 B-C). D'altro lato, il segnale associato ai topi trattati con gli ANANAS, indipendentemente dalla formulazione, decadeva più lentamente, in tal modo confermando la permanenza maggiormente prolungata delle nanoparticelle nel corpo rispetto al colorante, così come già osservato all'atto della somministrazione endovenosa. Gli esperimenti di colocalizzazione fra alexa633 ed un anticorpo diretto contro favi dina (Figura 8) ulteriormente confermano l'affidabilità dei nostri risultati e, di conseguenza, la stabilità del nostro nanoassemblaggio.

L'analisi ex vivo (Figura 7D-E) ha dimostrato che, quattro ore dopo la somministrazione, il segnale fluorescente associato agli ANANAS è rilevabile chiaramente in tutti gli organi selezionati, polmoni e cervello inclusi. Di converso, un giorno dopo il trattamento, il modello di fluorescenza ha evidenziato un tropismo quasi selettivo verso il fegato e la milza (vedere anche la Figura 9) e fortemente ridotto negli altri organi. Tali dati suggeriscono che, nonostante la loro dimensione e la natura idrofila, entrambe le formulazioni NP sono in grado di raggiungere la circolazione sanguigna dall'area pelvica e poi di seguire una destinazione equivalente a quella osservata all'atto della loro somministrazione endovenosa, in cui la libera circolazione è seguita dalla sequestrazione di fegato e milza. Tuttavia, la somministrazione intraperitoneale ha determinato un accumulo epatico più lento ma maggiormente prolungato rispetto ad altri percorsi di iniezione. Quest'ultimo punto è estremamente importante in termini di farmacocinetica, in quanto esso consente una permanenza più lunga degli ANANAS, e di conseguenza del Dex, nel corpo dei soggetti trattati.

Il caricamento del desametasone accelera il tropismo degli ANANAS nei confronti delle Cellule di Kupffer epatiche

Il tessuto epatico è composto per l'80% di epatociti (cellule parenchimali) e per il 6,5% di cellule non parenchimali (cellule endoteliali sinusoidali, cellule di Kupffer e cellule epatiche stellate). Le KC sono macrofagi tissutali con capacità endocitica e fagocitarla marcata. Esse giocano un ruolo essenziale nella difesa immunitaria congenita. Esse possono secernere diversi mediatori della risposta infiammatoria e, quindi, controllano la fase precoce dell'infiammazione epatica. In effetti, l'attivazione anomala delle KC può scatenare l'infiammazione che contribuisce sia all'inizio, sia alla progressione della malattia. Grazie al loro effetto antinfiammatorio, i macrofagi possono essere considerati target terapeutici cellulari nell'AIH.

Allo scopo di meglio comprendere se le formulazioni ANANAS possono interagire in modo selettivo con il tipo di cellule epatiche, sono stati utilizzati laser confocali e microscopia a super-risoluzione per analizzare il tessuto epatico dei topi trattati con NP, e la misura delle NP, nonché la co-localizzazione delle KC, sono state valutate usando un marcatore fluorescente per macrofagi (anti-CD68). Tale esperimento è stato effettuato su modelli di topi sia sani, sia affetti da AIH (Figure 10, 11, 12), allo scopo di valutare se la destinazione delle NP varia quando il fegato è infiammato. A tal fine, è stato usato il modello di topo CYP2D6. Pertanto, topi C57BL/6 di tipo selvatico sono infettati con un adenovirus che codifica l'autoantigene epatico principale nell'AIH umano di tipo 2, il citocromo P4502D6 (CYP2D6). I topi infetti evidenziano diverse caratteristiche dell'AIH umana, inclusa l'epatite da interfaccia con infiltrazione cellulare del sistema immunitario congenito ed adattivo, la generazione di anticorpi di tipo LKM-1 e cellule T specifiche di CYP2D6, così come fibrosi (Figura 13).

Così come rappresentato nella Figura 10, i nanoassemblaggi sono internalizzati in modo efficiente dalle KC. Tale tropismo selettivo degli ANANAS non è stato influenzato dalla patologia o dal caricamento degli steroidi.

Trenta minuti dopo la somministrazione, il segnale fluorescente rosso associato agli ANANAS privi di farmaco (Figura 10A, a sinistra) è principalmente confinato all'interno di una regione ristretta che circonda i vasi e che non si sovrappone al marcatore dei macrofagi CD68 (verde). Al contrario, la formulazione supportante il Dex determina un tropismo più veloce, relativamente alle KC, rispetto a quella priva di ANANAS nello stesso punto temporale. In modo interessante, il segnale di ANANAS-Hz-Dex è diffuso in modo omogeneo nel parenchima epatico, e si sovrappone quasi esclusivamente al segnale CD68 (Figura 10B, a sinistra). La differenza fra le due formulazioni in corrispondenza dei due punti temporali è stata quantificata misurando la percentuale di co-localizzazione di segnale associata a NP e CD68 (Figura 10C). I risultati ottenuti hanno ulteriormente confermato l'analisi qualitativa.

D'altro lato, ventiquattro ore dopo il trattamento (Figura 10A-B, al centro e a destra) il segnale alexa633 correlato ad entrambe le formulazioni è stato associato in modo stringente a quello delle KC (CD68). Nonostante non possa essere esclusa un'interazione precoce e transitoria fra le nanoparticelle e le altre popolazioni cellulari (ad es. celle sinusoidali, endoteliali e B), tali risultati indicano che le cellule CD68 positive giocano un ruolo chiave sulla sequestrazione degli ANANAS, indipendentemente dalla natura del carico di NP. Risulta difficile spiegare la ragione per cui la presenza del Dex sulla superficie delle NP accelera la loro capacità di assorbimento da parte delle KC, una possibilità è data dal fatto che esso facilita l'interazione delle NP con la membrana cellulare, grazie alla sua natura idrofoba o dirottando un'interazione con i recettori degli steroidi.

La sub-localizzazione delle nanoparticelle all'interno delle cellule è stata altresì analizzata mediante microscopia a super-risoluzione (Figura 10D-E-F). Tale strumento di imaging ad alta risoluzione è stato selezionato in quanto è considerato il più idoneo per l'analisi dei materiali teneri, poiché evita la generazione di artefatti (agglomerazione, deformazione, collasso) che possono diversamente verificarsi durante il processo di essiccazione necessario per il microscopio elettronico a trasmissione (TEM). Considerando la stabilità dipendente da pH del legame idrazonico adattato a legare il desametasone agli ANANAS (Figura 5), il raggiungimento della porzione lisosomiale acida matura è fondamentale affinché il farmaco sia rilasciato dagli ANANAS. In effetti, le NP appaiono raggruppate all'interno dei singoli lisosomi dei macrofagi epatici dei topi sia sani, sia affetti da AIH, mantenendo la promessa secondo cui il rilascio del farmaco possa verificarsi, in effetti, anche in vivo.

ANANAS-Hz-Dex rilascia il desametasone libero solamente a livello del fegato ma non in altri tessuti dei modelli sani ed affetti da AIH

Allo scopo di valutare la capacità di ANANAS-Hz-Dex di rilasciare in modo selettivo lo steroide a livello del fegato, è stato eseguito uno studio di farmacocinetica in cui i livelli di farmaco libero sono stati monitorati nel plasma e negli organi target principali dei topi sia sani, sia affetti da AIH. In effetti, anche se si è dimostrato in vitro (Figura 5F) che il linker idrazonico è stabile con pH neutro, il mezzo chimico nel corpo è più complesso di un tampone di soluzione salina ed una prova diretta del livello di desametasone negli organi risulta necessaria allo scopo di escludere il rischio di rilascio del farmaco prima che esso raggiunga il fegato.

La Figura 14 visualizza i risultati dello studio di farmacocinetica eseguito nei topi trattati a livello i.p. con ANANAS-Hz-Dex o il farmaco libero (0,4mg desametasone/kg).

Il farmaco libero penetra rapidamente nel flusso sanguigno e poi segue il profilo di farmacocinetica classico del desametasone (t/2 = 1,8-3,5h negli esseri umani) (reference.medscape.com), raggiungendo tutti i tessuti principali, inclusi fegato e cervello, ed essendo completamente eliminato 24 h dopo la somministrazione.

In particolare, più del 10% del livello misurato nel plasma è stato ritrovato nel cervello, il tessuto in cui l'accumulo di steroidi è legato agli effetti collaterali psichiatrici/neurologici.

contrario, quando i topi sono stati trattati con ANANAS-Hz-Dex, il farmaco libero è stato ritrovato solamente nel fegato. Nei modelli sia sani sia affetti da AIH, la cinetica del farmaco in tale tessuto è in linea con quanto atteso da un rilascio lento dal vettore. In effetti, i livelli di farmaco sono aumentati durante le prime ore dopo la somministrazione e poi sono diminuiti lentamente. In particolare, i livelli di desametasone diminuiscono più velocemente di quelli delle nanoparticelle (Figura 7 e Figura 9), suggerendo che, in vivo, il rilascio del farmaco si verifica più velocemente della degradazione delle nanoparticelle. Risulta anche interessante notare che la cinetica registrata nel fegato dei topi affetti da AIH è minore di quella degli animali sani, sia nei processi di accumulo, sia in quelli di eliminazione. Ad esempio, ventiquattro ore dopo la somministrazione, la quantità di farmaco libero era pari al 8,6% ed al 52,1% di quella misurata, a 4 ore, rispettivamente negli animali sani ed in quelli affetti da AIH. Ciò è probabilmente dovuto ad un metabolismo alterato o ad una diversa biodisponibilità collegati alle variazioni patologiche verificatesi durante la progressione della malattia. Indipendentemente dalla causa, una permanenza maggiormente prolungata del farmaco nel tessuto può determinare un vantaggio farmacologico, dato che essa può ridurre la frequenza di trattamenti in serie nei pazienti. A livello complessivo, tali risultati sono promettenti sia relativamente alla sicurezza, sia all'efficacia potenziale del trattamento nel fegato. Tuttavia, allo scopo di ottenere una prova di tale effetto potenziale, è stato effettuato un trattamento subcronico nei topi affetti dalla patologia, utilizzando gli stessi dosaggi utilizzati per la farmacocinetica (Figura 15).

Il trattamento con ANANAS-Hz-Dex è più efficace del farmaco libero nel controllo della patologia AIH nel modello animale

La Figura 16 schematizza la cinetica ipotetica di ANANAS-Hz-Dex (riquadro 1) successivamente alla somministrazione intraperitoneale.

La nostra analisi della farmacocinetica ha dimostrato che (almeno relativamente alla finestra sperimentale di 24h) il desametasone rimane fissato al nanoassemblaggio sia nel flusso sanguigno (riquadro 2), sia negli organi fuori target. ANANAS-Hz-Dex può migrare all'interno del fegato entro le prime ore successive alla somministrazione (riquadro 3) ed interagire in modo interattivo con le cellule CD68 positive localizzate nel parenchima (riquadro 4). Una volta all'interno di tali cellule, ANANAS-Hz-Dex non penetra nel nucleo ma entra, in modo efficiente, nelle vescicole lisosomiali CD68 positive (riquadro 5). E' probabile che il pH minore all'interno di tali vescicole possa indurre il rilascio del farmaco dal linker idrazo sensibile all'acido (riquadro 6). Grazie alla natura lipofila del desametasone, esso è potenzialmente in grado di attraversare le membrane biologiche (lisosomiale, piasmatica ma anche nucleare) e di raggiungere il target allo scopo di svolgere la propria attività immunomodulatrice.

Allo scopo di valutare il potenziale terapeutico di ANANAS-Hz-Dex sull'AIH, è stato eseguito un trattamento subcronico sul modello di topi Ad-2D6 affetti da AIH. In breve, i topi infettati da Ad-2D6 hanno ricevuto 6 somministrazioni intraperitoneali di desametasone nanoformulato o quale farmaco libero (dosaggio di 0,4 mg di Dex/kg). La somministrazione del farmaco è iniziata (giorno -1) il giorno prima dell'infezione virale (giorno 0) ed è stata ripetuta nei giorni 3, 7, 10, 14 e 17 successivamente all'infezione. I risultati (Figura 15) mostrano chiaramente che ANANAS-Hz-Dex risulta efficace e maggiormente efficiente del farmaco libero nel controllo della risposta immunitaria epatica in tale modello affetto da AIH. In effetti, nonostante la concentrazione minore di farmaco che raggiunge il fegato (Figura 14) nel caso della nanoformul azione, gli effetti istopatologici generati dai due trattamenti erano equivalenti. In entrambi i gruppi sperimentali, la deposizione del collagene interlobulare I (marcatore dell'inizio della fibrosi) è stata significativamente inferiore rispetto agli animali di controllo trattati con la formulazione ANANAS priva di farmaco (Figura 15B) o il PBS - (non mostrato). L'esame istologico dell'infiltrazione dei linfociti nel parenchima epatico riportato nella Figura 15C non mostra alcun effetto dei trattamenti sulle quantità di cellule T CD4 (Quantificazione di diverse sezioni CD4 e collagene I). Tuttavia, risulta importante sottolineare che, contrariamente ai topi del ceppo FVB, i topi C57BL/6 evidenziano solamente un'infiltrazione marginale, anche in presenza di una patologia epatica significativa.

Tuttavia, la formulazione ANANAS-Hz-Dex è stata maggiormente efficace del farmaco libero nel controllo degli altri parametri infiammatori epatici. Ad esempio, i livelli di plasma ALT ed AST, i quali aumentano anche in funzione dell'infezione da adenovirus, sono stati ridotti all'atto della somministrazione di Dex ed ANANAS-Hz-Dex, ma tale effetto è stato molto più accentuato nel gruppo trattato con NP (Figure 15D e 15E). In aggiunta, ANANAS-Hz-Dex è risultato anche più efficace del farmaco libero nel controllo dei livelli dei marcatori specifici dell'AIH, in particolare l'ampiezza degli autoanticorpi anti-CYP2D6 in circolazione (Figura 15F). In effetti, nonostante il desametasone libero non abbia influenzato tale marcatore, negli animali trattati con ANANAS-Hz-Dex esso è stato minore di dieci volte.

CONCLUSIONI

Nel complesso, tale insieme di prove dimostra che la nanoformul azione ANANAS-Hz-Dex risulta maggiormente efficace del farmaco libero nel controllo della malattia nel modello animale. Tale risultato, combinato con il fatto che la nanoformul azione non libera gli steroidi in qualsiasi area del corpo diversa dal fegato, suggerisce che tale vettore è un valido strumento per il controllo degli stati infiammatori cronici del fegato. Tale risultato deriva dalla combinazione di diverse caratteristiche di formulazione: a) il tropismo delle cellule target (KC), b) il percorso corretto dell'ingresso delle cellule c) il meccanismo di rilascio del farmaco mediato da idrazone labile agli acidi e d) la degradazione lenta del nanoassemblaggio a livello del fegato. Tali caratteristiche combinate generano una disponibilità di durata relativamente estesa del farmaco libero nel relativo punto, ove anche una concentrazione ridotta di Dex è in grado di controllare le caratteristiche della malattia.

Occorre notare che, nonostante le somministrazioni ripetute, l' ANANAS privo di farmaco non determina alcun effetto negativo misurabile sulla funzionalità epatica, come ad esempio la fibrosi epatica o i livelli di AST e di ALT. Ciò suggerisce che il vettore stesso non è né tossico, né pro-infiammatorio. In effetti, la composizione dell'assemblaggio è tale per cui la sua degradazione determina solamente elementi altamente tollerati. In effetti, anche se l'avidina è una proteina esogena ed anticorpi anti-avidina a bassa affinità sono stati dimostrati negli esseri umani, è stata anche dimostrata la tolleranza a tale proteina, probabilmente quale conseguenza del consumo di prodotti derivanti dalle uova nella dieta quotidiana.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Complesso nanoassemblato comprendente un nucleo NBnAvy, in cui: NB sono singole basi azotate di un acido nucleico a singolo o doppio filamento, Av è un'unità di avidina tetram erica avente siti di legame per la biotina (BBS), n è un numero intero da 16 a 100.000, e y è un numero da (0,0001)n a (0,0357)n, a condizione che se (0, 0001-0, 0357)n è minore di 1, y è uguale a 1, detto nucleo essendo funzionalizzato da - primi elementi funzionali biotinilati aventi la formula (I) in cui:

B-Xa-PAb è un agente biotinilato di protezione della superficie, ove B è un residuo di biotina, X è uno spaziatore, e PA è un'unità polimerica selezionata da ossido di polietilene o glicole polietilenico (PEO o PEG) facoltativamente sostituito, un copolimero di poliossietliene e poliossipropilene (PEO-PPO), polivinilpirrolidone (PVP), poliacriloilmorfolina (PacM), una polioxamina, un polilattato (PLA), un poliglicolide (PLG), un copolimero di acido lattico e di acido glicolico (PLGA), z è un numero da (0,02)y a (4)y, a condizione che se (0,02-4)y è minore di 1, z, k o entrambi sono uguali a 1, a è un numero intero da 0 a 5, b è un numero intero da 0 a 9, X’ è uno spaziatore uguale a o diverso da X, c è un numero intero da 0 a 5, e D è un farmaco legato in modo reversibile per il trattamento di una patologia epatica, e - secondi elementi biotinil ati aventi la formula (II) in cui: è, indipendentemente dal primo elemento funzionale biotinilato, un agente biotinilato di protezione della superficie, ove B è un residuo di biotina, X è uno spaziatore e PA è un'unità polimerica selezionata da ossido di polietilene o glicole polietilenico (PEO o PEG) facoltativamente sostituito, un copolimero di poliossietliene e poliossipropilene (PEO-PPO), polivinilpirrolidone (PVP), poliacriloilmorfolina (PacM), una polioxamina, un polilattato (PLA), un poliglicolide (PLG), un copolimero di acido lattico e di acido glicolico (PLGA), j è, indipendentemente dal primo elemento funzionale biotinilato, un numero da (0,02)y a (4)y, a condizione che se (0,02-4)y è minore di 1, j è uguale a 1, g è, indipendentemente dal primo elemento funzionale biotinilato, un numero intero da 0 a 5, h è, indipendentemente dal primo elemento funzionale biotinilato, un numero intero da 0 a 9, X” è uno spaziatore uguale a o diverso da X, X’, i è, indipendentemente da primi elementi funzionali biotinilati, un numero intero da 0 a 5, e M è un gruppo terminale non funzionale, ed in cui almeno 10% dei siti di legame per la biotina del nucleo è funzionalizzato da detti primi elementi funzionali biotinilati della formula (I).
2. Il complesso nanoassemblato di rivendicazione 1, in cui almeno 20% dei BBS è funzionalizzato da detti primi elementi funzionali biotinilati della formula (I).
3. Il complesso nanoassemblato di rivendicazioni 1 o 2, in cui detto farmaco D per il trattamento di una patologia epatica appartiene alle classi terapeutiche seguenti: corticosteroidi, leganti del legante per il recettore famesoide X ed agenti anticancro del fegato, e loro combinazioni.
4. Il complesso nanoassemblato di rivendicazione 3, in cui detto farmaco D per il trattamento di una patologia epatica è betametasone, cortisone, desametasone, idrocortisone, metilprednisolone, prednisolone, prednisone, triamcinolone, cafestolo, acido chenodesossicolico, acido obeticolico, feraxamina, GW 4064, doxorubicina, calicheamicina, amatossina, maitansinoide, o loro miscela, preferibilmente desametasone.
5. Il complesso nanoassemblato di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4, in cui almeno 10% dei siti di legame per la biotina del nucleo è funzionalizzato da detti secondi elementi funzionali biotinilati della formula (II).
6. Il complesso nanoassemblato di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5, in cui - in detti primi elementi funzionali biotinilati, a e b sono 0, così ottenendo la formula o - in detti primi elementi funzionali biotinilati, a è 0, così ottenendo la formula

-(B-PAb-X’c-D)z, o - in detti secondi elementi funzionali biotinilati, g ed i sono 0, così ottenendo la formula (II’):
7. Il complesso nanoassemblato di rivendicazione 6, in cui il nucleo è funzionalizzato da almeno due elementi dei: - primi elementi funzionali biotinilati aventi la formula - primi elementi funzionali biotinilati aventi la formula

e - secondi elementi funzionali biotinilati aventi la formula
8. Il complesso nanoassemblato di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-7, in cui il nucleo è ulteriormente funzionalizzato da terzi elementi funzionali biotinilati aventi la formula

in cui:

B-Xd-PAe è, indipendentemente da B-Xa-PAb e da B-Xg-PAh, un agente biotinilato di protezione della superficie, ove B è un residuo di biotina, X è uno spaziatore e PA è un'unità polimerica selezionata da ossido di polietilene o glicole polietilenico (PEO o PEG) facoltativamente sostituito, un copolimero di poliossietliene e poliossipropilene (PEO-PPO), polivinilpirrolidone (PVP), poliacriloilmorfolina (PacM), una polioxamina, un polilattato (PLA), un poliglicolide (PLG), un copolimero di acido lattico e di acido glicolico (PLGA), k è un numero da (0,02)y a (4)y, a condizione che se (0,02-4)y è minore di 1, z, k o entrambi sono uguali a 1, d è un numero intero da 0 a 5, e è un numero intero da 0 a 9, X’” è, indipendentemente da X’ e X”, uno spaziatore uguale a o diverso da X, f è un numero intero da 0 a 5, L è un legante di antigene di superfìcie legato in modo covalente, e in cui fino a 40% dei siti di legame per la biotina del nucleo è funzionalizzato da detti terzi elementi funzionali biotinilati della formula (III),
9. Il complesso nanoassemblato di rivendicazione 8, in cui il legante L è un anticorpo, un inibitore della tirosin-chinasi, un peptide, una proteina, un aptamero di acido nucleico in grado di legare un recettore transmembrana specifico, o loro miscela.
10. Il complesso nanoassemblato di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-9 per l’uso nel trattamento di una patologia epatica, in cui detta patologia epatica comprende lesioni epatiche, malattie autoimmuni, malattie degenerative e malattie genetiche, come steatoepatite non alcolica (NASH), lesione epatica associata a o provocata da consumo di alcol in un mammifero affetto da NASH, epatite alcolica, lesione epatica indotta da farmaci, colangite sclerosante primitiva, epatite virale, fibrosi epatica, cirrosi epatica, cirrosi biliare primitiva, epatite autoimmune, epatite ed epatocarcinoma.