ES2875351T3 - Administración de un inhibidor de la señalización trans de IL-6 selectivo - Google Patents

Abstract

Un dímero polipeptídico que comprende dos monómeros, teniendo cada monómero al menos 90% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1, en donde los monómeros comprenden el dominio D6 de gp130 correspondiente a los aminoácidos en las posiciones 585-595 de SEQ ID NO:1, una región de bisagra del dominio Fc que comprende los aminoácidos en las posiciones 609-612 de SEQ ID NO:1, y los monómeros no comprenden un enlazador entre la porción gp130 y el dominio Fc, para el uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria o un afección mediada por IL-6 en un ser humano, en donde el dímero polipeptídico se administra en una dosis de 60 mg a 1 g.

Description

DESCRIPCIÓN

Administración de un inhibidor de la señalización trans de IL-6 selectivo

REFERENCIA A SOLICITUDES RELACIONADAS

Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de EE. UU. N° 62/086.054, presentada el 1 de diciembre de 2014, cuyo contenido se incorpora en la presente en su totalidad.

ANTECEDENTES

IL-6 es una citocina pleotrópica producida por células hematopoyéticas y no hematopoyéticas, p. ej. en respuesta a infección y daño tisular. IL-6 ejerce sus múltiples actividades biológicas a través de dos rutas de señalización principales, la llamada ruta ligando-receptor clásica a través de IL-6R unido a la membrana presente principalmente sobre hepatocitos y ciertos leucocitos, y una ruta de señalización trans a través de sIL-6R circulatorio que se origina a partir de la escisión proteolítica del IL-6R o de a partir de un empalme alternativo.

En la ruta clásica, IL-6 se une directamente a IL-6R unido a la membrana sobre la superficie de una gama limitada de tipos celulares. El complejo IL-6/IL-6R se asocia con un dímero preformado de la proteína receptora gp130 transductora de señales, provocando cambios estéricos en el homodímero de gp130 e iniciando de ese modo una cascada se señalización intracelular. La señalización clásica es responsable de mecanismos de defensa inflamatorios agudos y funciones fisiológicas cruciales de IL-6, tales como señales de crecimiento y regeneradoras para células epiteliales intestinales.

Los dominios extracelulares de IL-6R y gp130 se pueden generar sin los dominios de anclaje membranario mediante la traducción de ARNms empalmados alternativamente dando como resultado las variantes sIL-6R y sgp130. Adicionalmente, el dominio extracelular de IL-6R se puede desprender mediante proteasas unidas a la membrana de la familia A de desintegrinas y metaloproteasas (ADAM) (en seres humanos, ADAM17) para generar sIL-6R. En el proceso de señalización trans, sIL-6R se une a IL-6, formando un complejo agonista que se une a dímeros de gp130 transmembranarios presentes sobre una multitud de tipos celulares que no expresan IL-6R unido a la membrana; la señalización de IL-6 mediante transductores de señalización y activadores de la transcripción (STATs) se induce a continuación en células que normalmente no responden a IL-6. La actividad del complejo IL-6/sIL-6R es controlada normalmente por los niveles de sgp130 presentes en la circulación que compiten eficazmente con gp130 unida a la membrana. La señalización trans está implicada principalmente en la inflamación crónica y se ha observado que previene que poblaciones de células T mucosas promotoras de enfermedad entren en apoptosis.

Sería deseable tener una molécula que imitara al inhibidor de la señalización trans natural sgp130, pero con una afinidad de unión superior y, por consiguiente, una actividad inhibidora más fuente. Por otra parte, sería deseable tener una molécula que se pudiera administrar a seres humanos con toxicidad y potencial inmunogénico mínimos.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Se ha encontrado ahora que un inhibidor de la señalización trans de IL-6 selectivo se puede administrar a seres humanos sin efectos perjudiciales significativos a lo largo de un gran intervalo de dosis. Por otra parte, se ha encontrado sorprendentemente que la semivida terminal del inhibidor permite la dosificación con una frecuencia semanal, bisemanal (es decir, cada dos semanas), mensual o incluso menor.

En ciertas realizaciones, la invención incluye un inhibidor (p. ej., un dímero polipeptídico como el divulgado en la presente) para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria o una afección mediada por IL-6, en donde el polipéptido se administra en una dosis de 0,5 mg a 5 g. La invención también incluye un método para tratar una enfermedad inflamatoria al administrar el inhibidor (p. ej., un dímero polipeptídico como el divulgado en la presente), donde la dosis de inhibidor es de 0,5 mg a 5 g. La invención incluye además el uso de este inhibidor en la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad inflamatoria a la dosis indicada. Preferiblemente, se trata un ser humano.

En otras realizaciones, la invención incluye un dímero polipeptídico como el divulgado en la presente para tratar una afección mediada por IL-6 sin disminuir significativamente los recuentos de neutrófilos, los recuentos de plaquetas y/o los niveles de proteína C reactiva o sin disminuir los recuentos de neutrófilos, los recuentos de plaquetas y/o los niveles de proteína C reactiva por debajo de un intervalo normal en sujetos sanos o pacientes que sufren una afección mediada por IL-6. La invención también incluye el uso del dímero polipeptídico en un método para tratar una afección mediada por IL-6 al administrar un dímero polipeptídico como el divulgado en la presente, en donde el método no disminuye significativamente los recuentos de neutrófilos, los recuentos de plaquetas y/o los niveles de proteína C reactiva. La invención incluye además el uso de este dímero polipeptídico en la fabricación de un medicamento para tratar una afección mediada por IL-6 sin disminuir significativamente los recuentos de neutrófilos, los recuentos de plaquetas y/o los niveles de proteína C reactiva. Preferiblemente, se trata un ser humano.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La FIG. 1 muestra la ruta de señalización trans de IL-6. sIL-6R generado a partir de ARNm empalmado alternativamente o escisión proteolítica es capaz de unirse a IL-6 para formar un complejo IL-6/sIL-6 que se une a gp130 presente sobre la gran mayoría de los tipos celulares corporales e inducir una cascada de señalización intracelular.

La FIG. 2 muestra que un dímero polipeptídico que comprende dos monómeros de SEQ ID NO: 1 no interfiere con la unión de IL-6 a IL-6R unido a la membrana (señalización clásica), pero se une selectivamente al complejo IL-6/sIL-6R y previene la señalización trans.

La FIG. 3 muestra perfiles después de la infusión i.v. del Péptido 1 (panel izquierdo) a 0,75 mg, 7,5 mg, 75 mg, 150 mg, 300 mg, 600 mg y 750 mg y la inyección s.c. (panel derecho) a 60 mg (2x2 ml).

La FIG. 4 muestra perfiles después de la administración intravenosa con 75 mg, 300 mg y 750 mg en sujetos sanos (panel izquierdo) y pacientes con CD en remisión clínica (panel derecho).

La FIG. 5 muestra perfiles después de la administración intravenosa con 75 mg, 300 mg y 750 mg una vez a la semana durante 4 semanas en sujetos sanos.

La FIG. 6 muestra predicciones modélicas que usan un modelo farmacocinético estructural bicompartimentado (línea sólida) y datos observados (círculos) en el experimento 000115.

La FIG. 7 muestra la secuencia nucleotídica y de aminoácidos de la subunidad gp130-Fc individual.

La FIG. 8 muestra elementos de la secuencia nucleotídica del plásmido de expresión pFER02.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Inhibidores preferidos de la invención incluyen un dímero de dos monómeros de fusión de gp130-Fc (p. ej., dos monómeros de SEQ ID NO:1). En su forma activa, el polipéptido de SEQ ID NO: 1 existe como un dímero conectado por dos enlaces disulfuro en Cys623 y Cys626 (FIG. 2). SEQ ID NO: 2 corresponde a la secuencia de aminoácidos de un monómero de fusión de gp130-Fc que tiene el péptido de señalización endógeno. El péptido de señalización se retira durante la síntesis de proteína, dando como resultado la producción del polipéptido de SEQ ID NO: 1.

Los dímeros polipeptídicos descritos en la presente inhiben selectivamente la señalización trans excesiva (FIG. 1) e induce la apoptosis de las células T perjudiciales implicadas en múltiples enfermedades inflamatorias. El dímero polipeptídico se orienta a y neutraliza complejos IL-6/sIL-6R y por lo tanto se espera que inhiba solamente la señalización trans de IL-6 en las concentraciones terapéuticas deseadas, dejando intactas la señalización clásica y sus muchas funciones fisiológicas, así como sus mecanismos de defensa agudos (FIG. 2). Se cree que el dímero polipeptídico es incapaz de interferir con la señalización clásica de IL-6 debido al impedimento estérico; la porción Fc es incapaz de insertarse en una membrana celular, volviendo la porción gp130 no disponible para la unión al complejo IL-6/sIL-6R unido a la membrana. Así, se espera que el dímero polipeptídico tenga una eficacia similar al bloqueo de IL-6 global (p. ej., tocilizumab, sirukumab) pero con menos efectos secundarios.

Los dímeros polipeptídicos descritos en la presente comprenden preferiblemente monómeros de gp130-Fc que tienen la secuencia correspondiente a SEQ ID NO:1. En ciertas realizaciones, los monómeros tienen la secuencia correspondiente a SEQ ID NO:2. En ciertas realizaciones, los dímeros polipeptídicos descritos en la presente comprenden polipéptidos que tienen al menos 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o 99,5% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 o s Eq ID NO:2. Preferiblemente, el polipéptido comprende el dominio D6 de gp130 (en particular los aminoácidos TFTTPKFAQGE: posiciones de aminoácidos 585-595 de SEQ ID NO:1), AEGA en la región de bisagra del dominio Fc (posiciones de aminoácidos 609-612 de SEQ ID NO:1) y no comprende un conector entre la porción gp130 y el dominio Fc. En una realización preferida, la divulgación proporciona un dímero polipeptídico que comprende dos monómeros que tienen una secuencia de aminoácidos al menos 90% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1, en donde la secuencia de aminoácidos comprende el dominio D6 de gp130, AEGA en la región de bisagra del dominio Fc y no hay conector presente entre la porción gp130 y el dominio Fc. En una realización preferida, la divulgación proporciona un dímero polipeptídico que comprende dos monómeros que tienen una secuencia de aminoácidos al menos 90% identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2, en donde la secuencia de aminoácidos comprende el dominio D6 de gp130, AEGA en la región de bisagra del dominio Fc, y no hay conector presente entre la porción gp130 y el dominio Fc.

Es deseable que los polipéptidos estén sustancialmente libres de restos de galactosa-alfa-1,3-galactosa, ya que estos están asociados con una respuesta inmunogénica. Sorprendentemente, se encontró que los dímeros de la invención tienen bajos niveles de estos restos. En realizaciones preferidas, el dímero polipeptídico no contiene más de 6% de galactosa-alfa-1,3-galactosa por mol de polipéptido. Preferiblemente, el dímero polipeptídico no contiene más de 4% en moles, 3% en moles, 2% en moles, 1% en moles, 0,5% en moles, 0,2% en moles, 0,1% en moles o incluso un nivel indetectable de galactosa-alfa-1,3-galactosa (p. ej., según se mide por WAX-HPLC, NP-HPLC o WAX, preferiblemente según se determina por WAX-HPLC). En otras realizaciones, el dímero polipeptídico contiene menos de 6%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,2% o incluso 0,1% de galactosa-alfa-1,3-galactosa, con relación a la cantidad total de glicanos, bien en masa o bien sobre una base molar.

También es deseable que un polipéptido de la invención esté sialilado. Esto tiene la ventaja de incrementar la semivida de los polipéptidos de la invención. Cada cadena del dímero polipeptídico contiene 10 sitios de N-glicosilación; nueve sitios de N-glicosilación están situados en la porción gp130 y un sitio de N-glicosilación está situado en la porción Fc. Por lo tanto, el polipéptido contiene un total de 20 sitios de glicosilación. En ciertas realizaciones, una media de al menos 52% o al menos 54% de los glicanos en el polipéptido incluyen un residuo de ácido siálico, tal como una media de 52-65% (p. ej., según se mide por WAX-HPLC, NP-HPLC o WAX, preferiblemente según se determina por WAX-HPLC). Preferiblemente, el polipéptido de la invención tiene un peso molecular aproximado de 220 kDa; teniendo cada 93 kDa un peso molecular de ~20 kDa adicional derivado de 10 cadenas de N-glicosilación.

También es deseable minimizar la extensión hasta la que se agregan los polipéptidos, que se denomina en la presente oligomerización que da como resultado agregados oligoméricos. "Agregados oligoméricos'', según se usa en la presente, no se refiere al péptido dimerizado activo. En cambio, el término se refiere a al menos un dímero de dímeros activos. Sorprendentemente, se encontró que los dímeros peptídicos de la invención presentan bajos niveles de agregación. En ciertas realizaciones, menos de 5%, menos de 4%, menos de 3%, menos de 2%, menos de 1,5% o incluso menos de 1,0% del polipéptido está presente como un oligómero. El contenido de oligómero se puede medir, por ejemplo, mediante cromatografía de exclusión por tamaño-dispersión de luz multiangular (SEC-MALS) o SEC-UV.

Preferiblemente, el dímero polipeptídico está presente en forma de longitud total (p. ej., incluye dos monómeros de longitud total, p. ej., de SEQ ID NO:1). Sin embargo, el cultivo celular puede producir una variante truncada denominada en la presente la forma gp130 simple (SGF). SGF es una molécula de dos cadenas unidas covalentemente, comprendiendo una cadena un monómero de gpl30-Fc de longitud completa (p. ej., de SEQ ID NO:1) y comprendiendo una segunda cadena un monómero de gp130-Fc truncado (p. ej., un truncamiento de SEQ ID NO:1), segunda cadena que incluye el dominio Fc y carece de la mayoría o la totalidad del dominio gp130 (p. ej., terminado antes de la secuencia conectora con la región Fc). Los estudios hasta la fecha han demostrado que la SGF no tiene un extremo amino heterogéneo. La SGF se puede formar a niveles constantes en un biorreactor y, una vez formada, los niveles de SGF no se cambian fácilmente durante condiciones de purificación, procesamiento o almacenamiento acelerado. Los niveles de SGF pueden ser difíciles de retirar durante la purificación debido a propiedades fisicoquímicas similares a la forma de longitud completa del dímero polipeptídico; así, los esfuerzos para retirar SGF pueden dar como resultado una reducción significativa en el rendimiento. Sorprendentemente, se encontró que los dímeros polipeptídicos de la invención son casi siempre de longitud completa. En ciertas realizaciones, la composición de la invención comprende dímeros polipeptídicos que comprenden no más de 4,0% en peso, 3,0% en peso, 2,0% en peso o incluso 1,5% en peso de polipéptidos que son una variación truncada del polipéptido de SEQ ID NO: 1 con respecto a polipéptidos de SEQ ID NO: 1. En ciertas realizaciones, la composición de la invención comprende no más de 4,0% en peso, 3,0% en peso, 2,0% en peso o incluso 1,5% en peso de polipéptidos que son una variación truncada del polipéptido de SEQ ID NO: 2 con respecto a polipéptidos de SEQ ID NO: 2.

Dosificación

Las dosis descritas en la presente representan un intervalo de dosis que se cree que son seguras y tolerables, basándose en los datos en Fase I. Otros compuestos que se orientan a IL-6R o IL-6 han presentado a menudo, en experimentos clínicos previos, una disminución en los recuentos de neutrófilos y plaquetas y niveles inferiores de proteína C reactiva (CRP) tanto en sujetos sanos como en pacientes con RA. Sin embargo, los niveles observados en los recuentos de neutrófilos y plaquetas en sujetos sanos dosificados con el polipéptido de la invención todavía estaban dentro del intervalo normal. Parece, a partir de los resultados procedentes del programa en Fase I, que el polipéptido de la invención no presenta los mismos efectos sobre biomarcadores que los compuestos que se orientan a IL-6R o IL-6.

En los dos experimentos con los dímeros polipeptídicos que comprenden monómeros de SEQ ID NO: 1, se empleó un ensayo ex vivo que mide el nivel de activación de STAT 3 al estimular muestras de sangre entera procedentes de los sujetos con hiper-IL-6, como una determinación de la actividad del fármaco. Se cree que los niveles de concentración del polipéptido que comprende monómeros de SEQ ID NO: 1 por encima de 1 pg/ml están relacionados con una supresión de la señal hasta el valor de referencia en el ensayo del mensajero secundario (STAT3). El nivel de concentración de los dímeros polipeptídicos que comprenden monómeros de s Eq ID NO: 1 correspondería a los niveles máximos de la dosis de 7,5 mg. Se ha mostrado que una dosis de 75 mg administrada como una infusión i.v. tiene una concentración por encima de 1 pg/ml en estado estacionario para un intervalo de dosificación de una semana.

La dosis correspondiente administrada cada dos semanas es 300 mg. Se cree que 60 mg administrados como una inyección subcutánea dan como resultado el mismo estado estacionario que para la dosificación todas las semanas.

En ciertas realizaciones, la dosis es de 0,5 mg a 5 g de dímero polipeptídico. Por ejemplo, la dosis puede ser de 5 mg a 3 g, de 10 mg a 2 g, de 60 mg a 1 g o preferiblemente de 60 mg a 750 mg.

Los dímeros polipeptídicos se pueden administrar a una frecuencia apropiada para la afección indicada. En ciertas realizaciones, el dímero polipeptídico se dosifica una vez cada 7-60 días. Por ejemplo, los dímeros polipeptídicos se pueden dosificar una vez cada 7-30 días o 7-20 días. En realizaciones preferidas, la dosis se presenta semanalmente (una vez cada 7 días) o bisemanalmente (una vez cada 14 días). Las dosis también se pueden presentar con una base diaria o dos o tres veces por semana. Una dosis se refiere a un solo episodio de dosificación, ya sea la dosis una forma de dosificación unitaria o formas de dosificación unitaria múltiples tomadas conjuntamente (p. ej., ingestión de dos o más píldoras, recepción de dos o más inyecciones). Según se analiza posteriormente, esta frecuencia de dosis no se podría predecir a partir de estudios en animales. Experimentos clínicos en seres humanos encontraron una semivida media de 4,6 días a 5,5 días. En contraste, los macacos de Java tenían una semivida de solo 0,7 días cuando se administraban los dímeros polipeptídicos intravenosamente y 1,4-1,5 días subcutáneamente.

Típicamente, el dímero polipeptídico de la invención se administra parenteralmente, tal como intravenosamente o subcutáneamente. La administración se puede producir según una de las frecuencias de dosificación divulgadas en la presente.

En ciertas realizaciones, el dímero polipeptídico se administra intravenosamente, dosificado una vez cada 7-60 días con una dosis de 60 mg a 1 g.

En ciertas de estas realizaciones, el dímero polipeptídico se administra intravenosamente, dosificado una vez cada 7­ 30 días con una dosis de 60 mg a 1 g.

En una realización ejemplar, el dímero polipeptídico se administra intravenosamente, dosificado semanalmente con una dosis de 60 mg a 1 g.

En otra realización ejemplar, el dímero polipeptídico se administra intravenosamente, dosificado bisemanalmente con una dosis de 60 mg a 1 g.

En ciertas realizaciones, el dímero polipeptídico se administra subcutáneamente, dosificado una vez cada 7-60 días con una dosis de 60 mg a 600 g.

En ciertas realizaciones, el dímero polipeptídico se administra subcutáneamente, dosificado una vez cada 7-30 días con una dosis de 60 mg a 600 g.

En una realización ejemplar, el dímero polipeptídico se administra subcutáneamente, dosificado una vez a la semana con una dosis de 60 mg a 600 g.

En otra realización ejemplar, el dímero polipeptídico se administra subcutáneamente, dosificado una vez cada dos semanas con una dosis de 60 mg a 600 g.

Seguridad

El dímero polipeptídico que comprende monómeros de SEQ ID NO: 1 se ha administrado hasta 750 mg como una sola dosis y 600 mg una vez a la semana durante 4 semanas. El perfil de seguridad del polipéptido era favorable, produciéndose pocos casos adversos en todos los grupos de tratamiento, incluyendo el grupo del placebo, siendo todos leves o moderados. No se observaron tendencias relacionadas con la dosis evidentes en la incidencia o la frecuencia de casos adversos. No había tendencias relacionadas con la dosis o cambios relacionados con el tratamiento evidentes en los signos vitales, ECG o parámetros de la química clínica. Se producían tres casos de reacciones a la infusión, todos eran leves/moderados con síntomas cutáneos como urticaria e hinchazón, y se resolvían rápidamente sin secuelas.

En general, el dímero polipeptídico que comprende monómeros de SEQ ID NO: 1 era seguro y bien tolerado cuando se administraba i.v. hasta 600 mg una vez a la semana durante 4 semanas y hasta 750 mg como una sola dosis.

El riesgo potencial del polipéptido que comprende monómeros de SEQ ID NO: 1 en seres humanos también se puede abordar indirectamente al analizar los estudios clínicos que investigan compuestos similares que se orientan a IL-6R o IL-6. Hasta la fecha, no existe un compuesto aprobado que bloquee la misma ruta de señalización que este dímero polipeptídico, es decir, se oriente a y neutralice el complejo IL-6/sIL-6R para inhibir la ruta de señalización trans, sin interacción bien con IL-6 o bien con IL-6R individualmente. Sin embargo, existen experiencias con compuestos que se orientan a receptores de IL-6. Uno de estos compuesto es tocilizumab, que ha sido aprobado en Europa y los Estados Unidos. El tocilizumab se une específicamente a receptores de IL-6 tanto solubles como unidos a la membrana y se ha mostrado que inhibe la señalización mediada por sIL-6R y mIL-6R.

Las reacciones farmacológicas adversas más comunes presentadas en pacientes con RA tratados con tocilizumab (que se presentan en >5%) eran infecciones de tracto respiratorio superior, nasofaringitis, cefalea, hipertensión e incremento de ALT. Las reacciones farmacológicas adversas más graves eran infecciones graves, complicaciones de diverticulitis y reacciones de hipersensibilidad. Se han producido disminuciones en los recuentos de neutrófilos y plaquetas después del tratamiento con tocilizumab. Se producían disminuciones en los recuentos de neutrófilos por debajo de 109/l en 3,4% de los pacientes tratados con 8 mg/ kg de tocilizumab más fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad (DMARDs). Aproximadamente la mitad de los pacientes que desarrollaban un ANC <109/l lo hacían en las 8 semanas después de iniciar la terapia. Se presentaron disminuciones por debajo de 5x108/l en 0,3% de los pacientes que recibían 8 mg/kg de tocilizumab y DMARDs. La neutropenia intensa se puede asociar con un incremento en el riesgo de infecciones graves, aunque hasta la fecha no ha habido una asociación clara entre las disminuciones en los neutrófilos y la presencia de infecciones graves en experimentos clínicos con tocilizumab. Los casos presentados durante la infusión eran principalmente episodios de hipertensión; casos presentados en las 24 horas desde la finalización de una infusión eran cefalea y reacciones cutáneas (erupciones, urticaria). Estos casos no eran limitativos del tratamiento. Se presentaron reacciones de hipersensibilidad clínicamente significativas asociadas con tocilizumab y que requerían la interrupción del tratamiento en un total de 13 de 3.778 pacientes (0,3%) tratados con tocilizumab durante los estudios clínicos controlados y abiertos. Estas reacciones se observaban generalmente durante las infusiones de segunda a quinta de tocilizumab. Se han presentado perforaciones gastrointestinales, principalmente en pacientes con antecedentes de diverticulitis, como casos raros, tanto en experimentos clínicos de tocilizumab como después de la comercialización. La etiología no está clara, pero los pacientes con RA tienen un riesgo generalmente incrementado de perforaciones del tracto GI tanto superior como inferior (independientemente de la terapia con DMARD); el riesgo es el más alto en pacientes con RA que siguen terapia con glucocorticoides, NSAIDs o con antecedentes de diverticulitis. Se ha presentado anafilaxis letal después de la autorización de la comercialización durante el tratamiento con tocilizumab. Se debe apuntar que los pacientes con RA pueden tener otras enfermedades de fondo como factores desconcertantes.

Debido a que el dímero polipeptídico que comprende monómeros de SEQ ID NO: 1 es una proteína de fusión primera en su clase, las comparaciones con los diferentes productos de anticuerpos monoclonales con diferentes mecanismos de acción es de valor limitado. En contraste con otros productos que bloquean completamente la actividad de IL-6, se cree que este dímero polipeptídico solo interfiere con el complejo IL-6/sIL-6R, dejando accesible la ruta de IL-6 unida a la membrana.

La IL-6 tiene una amplia implicación en las respuestas inmunitarias e inflamatorias del cuerpo. Cuando se bloquea el IL-6R tanto soluble como unido a la membrana, existe potencialmente un incremento en el riesgo de infecciones y otras enfermedades inmunodependientes así como una respuesta inflamatoria menos prominente. Aunque sin querer limitarse por una teoría, se cree que el tratamiento con el dímero polipeptídico que comprende monómeros de SEQ ID NO: 1, que solo se orienta al complejo IL-6/sIL-6R, evitaría la perpetuación de la inflamación intestinal crónica en la IBD y conservaría la respuesta inflamatoria en fase aguda activada por la señalización clásica de IL-6, disminuyendo de ese modo el riesgo de infecciones oportunistas. Sin embargo, no se podría predecir si existe una concentración de dímero polipeptídico de la invención por encima de la cual se vería afectada la señalización clásica de IL-6. Así, los datos de la presente demuestran sorprendentemente que existe menos impacto sobre la señalización clásica de IL-6 con relación a otros tratamiento que se orientan a la actividad de IL-6.

Basándose en los datos presentado aquí, una ventaja del dímero polipeptídico de la invención es que puede tener un efecto menor sobre los recuentos de neutrófilos, los recuentos de plaquetas y/o los niveles de proteína C reactiva que otros compuestos que inhiben IL-6. En ciertas realizaciones, el dímero polipeptídico de la invención no disminuye significativamente los recuentos de neutrófilos, los recuentos de plaquetas y/o los niveles de proteína C reactiva o sin disminución en los recuentos de neutrófilos, los recuentos de plaquetas y/o los niveles de proteína C reactiva por debajo de un intervalo normal en sujetos sanos o pacientes que sufren una afección mediada por IL-6. Por ejemplo, la administración del dímero polipeptídico en una cantidad de dosis descrita en la presente mantiene los recuentos de neutrófilos, los recuentos de plaquetas y/o los niveles de proteína C reactiva dentro de un intervalo fisiológico normal. En ciertas realizaciones, los recuentos de neutrófilos, los recuentos de plaquetas y/o los niveles de proteína C reactiva son no más de 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10% o 5% menores que el límite inferior del intervalo fisiológico normal. La medida de los recuentos de neutrófilos, los recuentos de plaquetas y/o los niveles de proteína C reactiva se puede producir inmediatamente después del tratamiento, un día después, tres días después del tratamiento, una semana después del tratamiento, dos semanas después del tratamiento, un mes después del tratamiento, tres meses después del tratamiento, seis meses después del tratamiento o un año después del tratamiento.

La determinación de los recuentos de neutrófilos, los recuentos de plaquetas y los niveles de proteína C reactiva se puede realizar mediante cualquier número de ensayos bien conocidos en la técnica. El recuento de neutrófilos, también denominado recuento absoluto de neutrófilos (ANC), es una medida del número de granulocitos neutrófilos presentes en sangre (véase, p. ej., Al-Gwaiz LA, Babay HH (2007). “The diagnostic value of absolute neutrophil count, band count and morphologic changes of neutrophils in predicting bacterial infections”. Med Princ Pract 16 (5): 344-7). Los valores fisiológicos normales para proteína C reactiva en hombres y mujeres adultos son 0-5,00 mg/l (p. ej., a través de turbidimetría). Los valores fisiológicos normales para neutrófilos en mujeres adultas son 1,61 -6,45 x 109 por l (valor absoluto, p. ej., a través de citometría de flujo laser) o 37,9-70,5% (calculado); en hombres adultos, los valores correspondientes son 1,46-5,85 x 109 por l y 38,2-71,5%. Los valores fisiológicos normales para plaquetas en mujeres adultas son 173-369 x 109 por l (p. ej., a través de medida de impedancia a alta frecuencia); en hombres adultos, los valores correspondientes son 155-342 x 109 por l.

Preferiblemente, el dímero polipeptídico de la invención no induce significativamente la formación de anticuerpos (p. ej., anticuerpos para el dímero polipeptídico) en seres humanos. Aún más preferiblemente, los anticuerpos no son anticuerpos neutralizantes. En ciertas realizaciones, los anticuerpos contra el dímero polipeptídico de la invención son detectables en menos de 5%, 2%, 1%, 0,5%, 0,2%, 0,1% o 0,01% de sujetos o pacientes tratados. Típicamente, el límite de detección es aproximadamente 9 ng/ml de suero.

Indicaciones

En la inflamación aguda, se ha observado que IL-6 induce la respuesta en fase aguda en el hígado que conduce a la liberación de la cascada de proteínas en fase aguda, en particular CRP. Al formar un complejo con sIL-6R desprendido por neutrófilos apoptóticos en la zona de inflamación y unión del complejo de señalización trans resultante IL-6/sIL-6R al transductor de señalización gp130 sobre células endoteliales, IL-6 induce la expresión de quimiocinas tales como proteína quimiotáctica de monocitos (MCP)-1 y atrae células mononucleares. Esto conduce a la resolución de la inflamación aguda y al inicio de una respuesta inmunitaria adaptiva. Así, en la inflamación aguda, el complejo de IL-6 con sIL-6R soporta la transición entre el estadio predominantemente neutrofílico temprano de inflamación y el aflujo de células mononucleares más sostenido conduciendo también finalmente a la resolución de la inflamación.

La inflamación crónica, tal como enfermedad de Crohn (CD), colitis ulcerativa (UC), artritis reumatoide (RA) o psoriasis, está asociada histológicamente con la presencia de células mononucleares, tales como macrófagos y linfocitos, persistiendo en el tejido después de haberse adquirido para la resolución de la fase inflamatoria aguda. En modelos de enfermedades inflamatorias crónicas, la IL-6 parece tener un papel perjudicial que favorece la acumulación de células mononucleares en la zona de la lesión, a través de la inducción de secreción continua de MCP-1, angioproliferación y las funciones antiapoptóticas sobre células T.

La enteropatía inflamatoria (IBD), a saber CD o UC, es una inflamación crónica que se presenta en el intestino de individuos sensibles que se cree que es independiente de un patógeno específico. Las alteraciones en la barrera de la mucosa epitelial con un incremento de la permeabilidad intestinal conducen a una mejora en la exposición del sistema inmunitario mucoso a antígenos luminales, que provoca una activación inapropiada del sistema inmunitario intestinal en pacientes. La activación descontrolada de linfocitos T CD4+ mucosos con la liberación excesiva consecutiva de citocinas proinflamatorias induce la inflamación gastrointestinal patogénica y el daño tisular. Existe un consenso de que las principales células inmunitarias activadas implicadas en la patogénesis de la IBD son células T y macrófagos intestinales.

Se muestra que la IL-6 es una citocina fundamental en la IBD en seres humanos. Se ha encontrado que los pacientes con CD y UC producen un incremento en los niveles de IL-6 en comparación con controles, correlacionándose los niveles de IL-6 con la actividad clínica. También se ha encontrado que los pacientes con CD tienen un incremento en los niveles de sIL-6R y, por consiguiente, el complejo IL-6/sIL-6R en suero. Las células mononucleares de la lámina propia obtenidas de especímenes quirúrgicos de colon procedentes de pacientes con CD y UC mostraban que tanto las células T CD4+ como los macrófagos producían un incremento en las cantidades de IL-6 en comparación con controles. Se encontró que sIL-6R se liberaba a través del desprendimiento de la superficie de macrófagos y células mononucleares con un incremento en la producción asociado con niveles elevados de IL-6. En pacientes con CD, las células T mucosas mostraban una fuerte evidencia para la señalización trans de IL-6 con activación de STAT3, bcl-2 y bcl-xl. El bloqueo de la señalización trans de IL-6 provocaba la apoptosis de células T, indicando que el sistema IL-6/sIL-6R media en la resistencia de células T a la apoptosis en la CD.

Así, en pacientes con IBD, la acumulación adquirida de células T CD4+ promotoras de enfermedad en la lámina propia que conduce a la perpetuación de la inflamación depende críticamente de la señalización trans de IL-6/sIL-6R antiapoptótica. Se cree que al actuar sobre el complejo IL-6/sIL-6R, el dímero polipeptídico divulgado en la presente es útil para tratar la CD y otras enfermedades inflamatorias.

Así, el dímero polipeptídico de la invención puede tratar una afección mediada por IL-6s. Afecciones mediadas por IL-6 incluyen una enfermedad inflamatoria o un cáncer. A este respecto, los polipéptidos y las composiciones descritos en la presente se pueden administrar a un sujeto que tiene una enfermedad inflamatoria, tal como artritis idiopática juvenil, enfermedad de Crohn, colitis (p. ej., colitis no asociada con IBD, incluyendo colitis por radiación, colitis diverticular, colitis isquémica, colitis infecciosa, enfermedad celiaca, colitis autoinmunitaria o colitis resultante de alergias que afectan al colon), dermatitis, psoriasis, uveítis, diverticulitis, hepatitis, síndrome del intestino irritable (IBS), lupus eritematoso, nefritis, enfermedad de Parkinson, colitis ulcerativa, esclerosis múltiple (MS), enfermedad de Alzheimer, artritis, artritis reumatoide, asma y diversas cardiovasculopatías tales como aterosclerosis y vasculitis. En ciertas realizaciones, la enfermedad inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en diabetes, gota, síndrome periódico asociado a criopirina y trastorno pulmonar obstructivo crónico.

Preferiblemente, la enfermedad inflamatoria o afección mediada por IL-6 es enteropatía inflamatoria, preferiblemente en donde el tratamiento induce la remisión de la enteropatía inflamatoria. Preferiblemente, la enteropatía inflamatoria es enfermedad de Crohn o colitis ulcerativa, preferiblemente en donde el tratamiento mantiene la remisión de la enteropatía inflamatoria. Preferiblemente, la enfermedad inflamatoria o afección mediada por IL-6 es artritis reumatoide, psoriasis, uveítis o aterosclerosis. Preferiblemente, la enfermedad inflamatoria o afección mediada por IL-6 es colitis no asociada con enteropatía inflamatoria, preferiblemente en donde la colitis es colitis por radiación, colitis diverticular, colitis isquémica, colitis infecciosa, enfermedad celiaca, colitis autoinmunitaria o colitis resultante de alergias que afectan al colon.

Para una enfermedad inflamatoria tal como enteropatía inflamatoria, el tratamiento puede incluir la remisión de la afección, el mantenimiento de la afección, el mantenimiento de la remisión de la afección o ambos.

Otras realizaciones proporcionan un método para tratar, reducir la gravedad de o prevenir un cáncer, incluyendo, pero no limitado a, mieloma múltiple, leucemia de células plasmáticas, carcinoma de células renales, sarcoma de Kaposi, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, melanoma, leucemia, linfoma, glioma, glioblastoma multiforme, cáncer de pulmón (incluyendo pero no limitado a cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC; tanto adenocarcinoma como carcinoma escamoso)), linfoma no hodgkiniano, enfermedad de Hodgkin, plasmocitoma, sarcoma, timoma, cáncer de mama, cáncer de próstata, carcinoma hepatocelular, cáncer de vejiga urinaria, cáncer uterino, cáncer pancreático, cáncer esofágico, cáncer de cerebro, cánceres de cabeza y cuello, cáncer ovárico, cáncer de cuello uterino, cáncer testicular, cáncer de estómago, cáncer esofágico, hepatoma, leucemia linfoblástica aguda (ALL), T-ALL, leucemia mielógena aguda (AML), leucemia mielógena crónica (CML) y leucemia linfocítica crónica (CLL), carcinomas salivares, u otros cánceres.

Realizaciones adicionales de la presente divulgación proporcionan un método para tratar, reducir la gravedad de o prevenir una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en sepsis, resorción ósea (osteoporosis), caquexia, fatiga relacionada con cáncer, psoriasis, artritis idiopática juvenil de inicio sistémico, lupus eritematoso sistémico (SLE), glomerulonefritis proliferativa mesangial, hipergammaglobulinemia, enfermedad de Castleman, gammopatía IgM, mixoma cardíaco y diabetes insulinodependiente autoinmunitaria.

Según se usa en la presente, los términos “tratamiento”, “tratar” y “tratando” se refieren a revertir, aliviar, retrasar el inicio de o inhibir el progreso de una enfermedad o trastorno, o uno o más de sus síntomas, según se describe en la presente. En algunas realizaciones, el tratamiento se puede administrar después de que se hayan desarrollado uno o más síntomas. En otras realizaciones, el tratamiento se puede administrar en ausencia de síntomas. Por ejemplo, el tratamiento se puede administrar a un individuo sensible antes del inicio de los síntomas (p. ej., a la luz de los antecedentes de síntomas y/o a la luz de factores genéticos y otros factores de sensibilidad). El tratamiento también se puede continuar después de que los síntomas se hayan resuelto, por ejemplo para prevenir o retrasar su recaída.

El dímero polipeptídico de la invención se puede administrar junto con un segundo agente activo. El segundo agente activo puede ser uno o más de ácido 5-aminosalicílico, azatioprina, 5-mercaptopurina y un corticosteroide. Los regímenes para la administración de ácido 5-aminosalicílico, azatioprina, 5-mercaptopurina y corticosteroides son muy conocidos por un experto.

Los dímeros polipeptídicos se pueden producir, por ejemplo, al expresar los monómeros, p. ej. monómeros que comprenden SEQ ID NO: 1, en células. En una realización ejemplar, un vector que comprende un ácido nucleico que codifica SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO:2 se transfecta en células. El diseño del vector de expresión, incluyendo la selección de secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedadora que se vaya a transformar, el nivel de expresión de proteína deseado, etc. Secuencias reguladoras para la expresión de células hospedadoras de mamífero incluyen elementos virales que dirigen altos niveles de expresión proteínica en células de mamífero, tales como promotores y/o potenciadores derivados de LTRs retrovirales, citomegalovirus (CMV) (tal como el promotor/potenciador CMV), virus símico 40 (SV40) (tal como el promotor/potenciador SV40), adenovirus, (p. ej., promotor tardío principal adenoviral (AdMLP)), polioma y promotores fuertes de mamífero tales como promotores de inmunoglobulina y actina naturales. La célula hospedadora puede ser una célula de mamífero, insecto, planta, bacteria o levadura, preferiblemente la célula es una célula de mamífero tal como una célula CHO.

Las células transfectadas se cultivan para permitir que las células expresen la proteína deseada. A continuación, las células y los medios de cultivo se recogen y los dímeros polipeptídicos se purifican, p. ej., mediante etapas en columna cromatográfica (p. ej., MAbSelect Sure, SP Sepharose, Capto Q). El dímero también se puede concentrar y/o tratar con etapas de reducción/inactivación viral. A continuación, los dímeros resultantes se pueden usar para preparar composiciones, preferiblemente composiciones farmacéuticas útiles para terapia.

EJEMPLIFICACIÓN

Ejemplo 1

Estudios en Animales

Ejemplo 1a

Farmacocinética en Ratones

Cuatro grupos con 54 ratones (27 machos y 27 hembras) que pesaban 25 - 38 g recibieron una sola dosis del polipéptido de SEQ ID NO: 1 en su forma dimerizada activa (“Péptido 1”) mediante inyección bien i.v. (3 mg/animal) o bien s.c. (0,3, 3 y 30 mg/animal).

La biodisponibilidad era aproximadamente 60%, y la linealidad de dosis aparente se observaba para AUC, AUCt y C^máx. El t^máx de 8-24 horas era como se esperaba para una proteína. El Péptido 1 se depuraba lentamente de la circulación sistémica con una depuración de 142 ml/día/kg. Los volúmenes de distribución estimados por la curva de la fase de eliminación (Vz) y del primer momento (Vss) eran 397 ml/kg y 284 ml/kg, respectivamente, indicando que el Péptido 1 estaba distribuido fuera del lecho vascular. La semivida terminal variaba de 1,3 - 2,3 días.

Ejemplo 1b

Farmacocinética en Ratas

Administración de una sola dosis

La farmacocinética de una sola dosis de Péptido 1 se investigó después de la administración i.v. y s.c. en dos razas diferentes de ratas, Sprague Dawley (8 ratas/grupo) y Wistar (24 ratas/grupo), que muestran resultados algo diferentes. La depuración (57 y 93 ml/kg/día, respectivamente) y el volumen de distribución parecían ser inferiores en la rata Sprague Dawley, con una biodisponibilidad 2 veces superior, 60%, en comparación con aproximadamente 30% para la rata Wistar. Se observó un T^máx 0,5 - 1,5 días después de la administración s.c., y la semivida terminal era aproximadamente 2 días, variando de 1,7 - 2,7 días, con solo pequeñas diferencias entre las dos vías de administración.

Administración de dosis repetidas

Administración intravenosa

Las ratas (n=18) recibían dosis en embolada i.v. 10, 30 y 100 mg/kg/ocasión dos veces por semana durante 2 semanas. El incremento en la C^máx y la AUC después de la primera administración parecía ser aproximadamente lineal con la dosis. Sin embargo, la exposición parecía ser coherentemente superior en machos que en hembras a todos los niveles de dosis. El grupo de 100 mg/kg/ocasión alcanzaba niveles de C^máx de 2100 gg/ml para ratas macho y 1740 gg/ml para ratas hembra. Los valores de AUCt eran 942 y 642 díaxgg/ml.

Después de dos semanas, la exposición sistémica al Péptido 1 en ratas disminuía para los grupos de dosis de 10 mg/kg y 30 mg/kg. Como las respuestas de anticuerpo antifármaco (ADA) se confirmaban en todos los animales para la Semana 8 del estudio, las disminuciones en la exposición esperada a lo largo del tiempo se puede atribuir a depuración mediada por ADA de Péptido 1.

Administración subcutánea

En estudios s.c. de dosis repetidas de 2 y 4 semanas, la C^máx y la AUC después de la primera administración parecía incrementarse aproximadamente linealmente con la dosis. Sin embargo, a la última dosis, se observó una exposición al fármaco notablemente inferior, posiblemente debido a la formación de anticuerpos; todos los animales probados mostraban anticuerpos hacia el Péptido 1.

Ejemplo 1c

Farmacocinética en Macacos de Java

Administración de una sola dosis

La farmacocinética de una sola administración de Péptido 1 se investigó en macacos de Java macho y hembra a dosis de 0,1 - 100 mg/kg s.c. (n=4) y 1,0 mg/kg i.v (n=4). La biodisponibilidad era aproximadamente 60% después de la administración s.c. con un t^máx de 6 - 24 horas. La depuración era 98 ml/día/kg, y el volumen de distribución aproximadamente 70-90 ml/kg. La semivida determinada después de la administración i.v. era 0,68 días, y aproximadamente 1,5 días después de la administración s.c.

Administración de dosis repetidas

Los macacos de Java fueron dosificados s.c. con 2 (n=4), 10 (n=4), 50 (n=2) o 100 (n=2) mg/kg de Péptido 1 dos veces por semana durante 2 semanas, y con 10 (n=4), 30 (n=4) o 100 (n=4) mg/kg de Péptido 1 dos veces por semana durante 4 semanas. La exposición por medio de C^máx y AUC se incrementaba aproximadamente linealmente con la dosis, y se observaban una exposición y una concentración máxima similares entre la primera y la última dosis a las dosis superiores después de 2 semanas. Sin embargo, después de 4 semanas, la última dosis administrada mostraba una exposición inferior al fármaco en comparación con la primera administración, posiblemente debido a la formación de anticuerpos. La semivida media del Péptido 1 variaba de 1,0 - 1,8 días para la primera administración en los diferentes grupos de tratamiento con una semivida más corta después de la última administración.

Ejemplo 2

Experimento Clínico 000067 (Una Sola Dosis)

Diseño

Este era un experimento de aumento a escala de la dosis de grupos paralelos, de una sola dosis, controlado por placebo, de un solo enmascaramiento, aleatorizado con la dosis. Este experimento se efectuó en dos partes, donde la Parte 1 incluía sujetos sanos y la Parte 2 incluía pacientes con CD en remisión clínica. El objetivo era examinar la seguridad y la tolerabilidad y, si fuera posible, obtener signos de efectos farmacológicos, después de dosis individuales de Péptido 1.

En la Parte 1, se incluyeron 64 sujetos, de los que 48 (44 hombres, 4 mujeres) recibían tratamiento activo y 16 (todos hombres) recibían placebo. Se investigaron siete dosis y se administraron como una infusión i.v. a lo largo de 30 minutos (0,75 mg, 7,5 mg, 75 mg) o 1 hora (150 mg, 300 mg, 600 mg y 750 mg). Además, 6 sujetos recibían una dosis s.c. de 60 mg de Péptido 1 y 2 sujetos recibía una dosis s.c. de placebo. El Péptido 1 se administró en 15 mg/ml en histidina 25 mM, sacarosa 200 mM y 0,1 mg/ml de polisorbato 20.

En la Parte 2, se incluyeron 24 pacientes, de los que 18 (11 hombres, 7 mujeres), recibían tratamiento activo (75 mg, 300 mg y 750 mg) y 6 (4 hombres, 2 mujeres) recibían placebo, todos administrados mediante i.v.

Resultados

La evaluación farmacocinética después de administraciones i.v. de Péptido 1 mostraba una proporcionalidad con la dosis tanto para AUC como para Cmáx en el intervalo 0,75 mg a 750 mg, variando las concentraciones Cmáx en plasma de 0,2 a 170 pg/ml (FIG. 3). La depuración era aprox. 0,13 l/h, la semivida terminal media aprox. 4,5 días y el volumen de distribución aprox. 20 l, indicando el último algo de distribución extravascular. La administración s.c. de 60 mg de Péptido 1 mostraba una Cmáx de 1,1 pg/ml a los 2,3 días, y una semivida de 5,0 días. Se calculó que la biodisponibilidad después de la administración s.c. de Péptido 1 era aprox. 50%. No existía indicación de disposición de fármaco mediada por la diana.

La administración i.v. de 75, 300 y 750 mg a pacientes con CD en remisión mostraba resultados muy similares que para los sujetos sanos (FIG. 4). La AUC y la Cmáx eran proporcionales a la dosis con concentraciones Cmáx de 16, 76 y 186 pg/ml (16, 77 y 161 pg/ml para sujetos sanos). La depuración era aprox. 0,13 l/h, la semivida terminal media aprox. 4,6 días y el volumen de distribución aprox. 22 l.

El perfil de seguridad del Péptido 1 era favorable con pocos casos adversos que se producían en todos los grupos de tratamiento, incluyendo el grupo del placebo, siendo todos leves o moderados. No se observaban tendencias relacionadas con la dosis evidentes en la incidencia o la frecuencia de casos adversos. Las infusiones se interrumpieron en dos sujetos, uno debido a reacciones a la infusión leves (Parte 1, grupo de 300 mg) y uno debido a reacciones a la infusión moderadas (Parte 2, grupo de 75 mg).

No existían tendencias relacionadas con la dosis o cambios relacionados con el tratamiento evidentes en los signos vitales, ECG o los parámetros de la química clínica (incluyendo recuentos de neutrófilos, recuentos de plaquetas o niveles de proteína C reactiva).

Un sujeto sano en el grupo de 300 mg mostraba anticuerpos anti-Péptido 1 emergentes del tratamiento no neutralizantes en la visita de seguimiento 5-6 semanas después de la administración.

En general, el Péptido 1 era seguro y bien tolerado cuando se administraba intravenosamente hasta 750 mg como una sola dosis i.v. y en 60 mg como una sola dosis s.c.

Ejemplo 3

Experimento Clínico 000115 (Dosis Ascendente Múltiple)

Diseño

Este era un experimento de grupos paralelos controlado por placebo, con doble enmascaramiento, aleatorizado dentro de grupos de dosis, con el objetivo de investigar la seguridad, tolerabilidad y farmacocinética de múltiples dosis ascendentes de Péptido 1. Las dosis investigadas eran 75, 300 y 600 mg de Péptido 1 administrados una vez a la semana, durante 4 semanas, mediante infusión i.v. a lo largo de 30 minutos (75 mg) o 1 hora (300 mg y 600 mg).

Se incluyeron veinticuatro (24) sujetos sanos, de los que 18 (11 hombres y 7 mujeres) recibían tratamiento activo y 6 (2 hombres y 4 mujeres) recibían placebo.

Resultados

La evaluación farmacocinética mostraba características muy cercanas los días de tratamiento primero y último, y similares a los resultados del estudio de una sola dosis. La AUC y la Cmáx eran proporcionales a la dosis después de la primera y la cuarta dosificación con concentraciones Cmáx de 19, 78 y 148 pg/ml después de la primera dosis, y 19, 79 y 142 pg/ml después de la cuarta dosis (16, 77 y 161 pg/ml para una sola dosis en sujetos sanos; FIG. 5). Los valores mínimos correspondientes eran 0,66, 2,68, 4,56 pg/ml y 0,98, 3,95 y 7,67 pg/ml para los niveles de tres dosis. La semivida terminal media que se calculaba después de la última dosis era aprox. 5,5 días.

El perfil de seguridad del Péptido 1 era favorable, produciéndose pocos casos adversos en todos los grupos de tratamiento, incluyendo el grupo del placebo, siendo todos leves o moderados. No se observaban tendencias relacionadas con la dosis evidentes en la incidencia o la frecuencia de casos adversos. Un sujeto (grupo de 600 mg) se retiraba del estudio debido a reacciones a la infusión leves.

No existían tendencias relacionadas con la dosis o cambios relacionados con el tratamiento evidentes en los signos vitales, ECG o parámetros de la química clínica (incluyendo recuentos de neutrófilos, recuentos de plaquetas o niveles de proteína C reactiva).

No se detectaron anticuerpos anti-Péptido 1 en ninguno de los sujetos.

En general, el Péptido 1 era seguro y bien tolerado cuando se administraba i.v. hasta 600 mg una vez por semana durante 4 semanas.

Ejemplo 4

Modelado de Datos Farmacocinéticos

Los datos farmacocinéticos procedentes del experimento 000115 se pueden describir adecuadamente usando un modelo estructural bicompartimentado. Los perfiles predichos de 75, 300 y 600 mg de Péptido 1 y los datos observados se representan en la FIG. 6 y los parámetros farmacocinéticos medios estimados se listan en la Tabla 1.

Tabla 1 Estimaciones Modélicas para el Péptido 1 Usando Farmacocinética Estructural Bicompartimentada

Parámetro Estimación SE CV%

V 1,7 l 0,08 4,8

V2 8,8 l 0,32 3,6

CL 3,2 l/día 0,06 1,8

CL2 16,4 l/día 0,24 14,4

El Péptido 1 tiene una afinidad de unión en seres humanos de 130 pM para el complejo IL-6/sIL-6R. A dosis de 75­ 600 mg, el nivel de ocupación no es mayor de 90% a niveles en estado estacionario estimados de Péptido 1 usando la afinidad de unión (k D; 130 pM) y los niveles de IL-6/sIL-6R (C^objetivo; 2,0 nM basado en sIL-6R).

Ejemplo 5

Preparación del Péptido 1

Clonación y Expresión del Péptido 1 en Células CHO / dhfr -

Se obtuvieron células CHO /dhfr de la European collection of cell cultures (ECACC, N° 9406067). Las células CHO /dhfr- adherentes son deficientes en dihidrofolato reductasa (DHFR), una enzima que cataliza la reducción de folato en dihidrofolato y a continuación en tetrahidrofolato. Así, las células CHO / dhfr- presentan sensibilidad al fármaco antifolato, metotrexato (MTX).

La línea celular CHO/dhfr- está bien caracterizada y probada. La seguridad de la línea celular parental CHO /dhfr- como un sustrato celular para la producción de productos biofarmacéuticos para uso en seres humanos se confirmó mediante ECACC (Porton Down, Reino Unido) con respecto a esterilidad microbiana, micoplasma y virus casuales según 21 CFR.

Selección y Construcción de la Secuencia de ADNc

La secuencia de ADNc de un monómero de Péptido 1 (la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 1) fue sintetizada como un solo fragmento de ADN por GeneArt AG (Regensburg, Alemania) usando la secuencia para el dominio extracelular de gp130 (IL6ST, ID Gen NCBI ID 3572, variante del transcrito 1 (NP_002175), aminoácidos 23-617) y el dominio Fc de IgGI humana (IGHG1, ID Gen NCBI 3500, aminoácidos 221-447 según la numeración de EU de Kabat). La secuencia se optimizó con respecto a la utilización óptima de codones en células CHO. Se introdujeron tres mutaciones puntuales bien caracterizadas en la región de bisagra inferior de la parte Fc.

La secuencia de ADNc se modificó adicionalmente al reemplazar el péptido de señalización gp130 original con un péptido de señalización de la cadena pesada de IgG de ratón de eficacia conocida en sistemas de expresión de células CHO. El péptido de señalización se escinde durante la síntesis de proteínas. La presencia de la secuencia Cys-Pro-Pro-Cys de IgG 1 en la región Fc da como resultado la dimerización de dos subunidades gp130-Fc idénticas a través de los residuos de sulfhidrilo sobre la región Fc, que conjuntamente forman el Péptido 1.

La FIG. 7 presenta la secuencia nucleotídica y de aminoácidos de la subunidad gp130-Fc usada para la formación del Péptido 1.

Construcción del Plásmido de Expresión para la Selección del Banco Celular Maestro (MCB)

El ADNc del monómero se clonó en un vector de expresión pANTVhG1 (Antitope) que contiene el gen dhfr para la selección de transfectantes con MTX como sigue: En primer lugar, el vector de expresión se digirió con las enzimas de restricción MluI y EagI para permitir la inserción de ADNc del Péptido 1. En segundo lugar, la región codificante del monómero se amplificó por PCR usando los cebadores OL1425 y OL1426 (Tabla 2) y se digirió con las enzimas de restricción MluI y EagI. En tercer lugar, los fragmentos digeridos se purificaron en gel y se ligaron entre sí para generar el vector de expresión pFER02. El ADNc del monómero se insertó bajo el control del promotor de citomegalovirus (CMV).

La Tabla 3 presenta la función de los elementos de expresión de pFER02. La FIG. 8 presenta las secuencias nucleotídicas de los elementos de expresión de pFER02.

Tabla 2 Secuencias Oligonucleotídicas Usadas para Amplificar la Región Codificante del Monómero para la Clonación en pANTVhGl

Cebador Secuencia (5'-3')*

OL1425 ctgttgctacgcgtgtccactccGAGCTGCTGGATCCTTGCGGC

OL1426 gcgggggcttgccggccgtggcactcaCTTGCCAGGAGACAGAGACAG

* Las secuencias específicas del monómero 1 se muestran en mayúsculas, las secuencias específicas del vector se muestran en minúsculas y los sitios de restricción están subrayados

Tabla 3 Elementos de Expresión de pFER02

Característica Función

Promotor de CMV Promotor/mejorador temprano inmediato. Permite una expresión eficaz de alto nivel de la proteína recombinante

poliA hIgG1 Secuencia de poliadenilación de IgG humana

Gen de resistencia a Ampicilina Selección de vector en E. coli

(p-lactamasa)

Promotor temprano y origen de Permite una expresión eficaz de alto nivel del gen de resistencia a neomicina y la SV40 replicación episómica en células que expresan el antígeno T grande de SV40 DHFR Selección de transfectantes estables en células CHO dhfr-Señal de poliadenilación de Terminación de la transcripción y poliadenilación de ARNm eficaces

SV40

Procedimiento de Selección de Líneas Celulares que Conduce al Clon Productor del Péptido 1 Final

El vector pFER02 se linealizó con la enzima de restricción de extremos romos SspI, que tiene un solo sitio de reconocimiento situado en el gen de beta-lactamasa. El plásmido linealizado se transfectó en 5 x 106 células CHO/dhfr usando transfección mediada por lípido. Veinticuatro horas después de la transfección, las células transfectadas se seleccionaron en medio complementado con suero de ternero fetal (FCS) dializado al 5% y metotrexato (MTX) 100 nM. Las células transfectadas se diluyeron en este medio a diversas densidades y se distribuyeron en placas de cultivo tisular de fondo plano de 96 pocillos. A continuación, las células se incubaron en una atmósfera humidificada en CO² al 5% y a 37°C. Se añadió medio de selección de MTX reciente a intervalos regulares durante el tiempo de incubación para asegurar que los niveles de MTX y los niveles de nutrientes permanecieran constantes.

Selección Inicial de Líneas Celulares con Selección con MTX

Durante varias semanas después de la transfección, las placas de cultivo tisular se examinaron usando un aparato para obtener imágenes Genetix CloneSelect® y se observó que >2.000 pocillos tenían colonias que crecían activamente. Sobrenadantes procedentes de estos pocillos se muestrearon y se ensayaron con respecto al título de Péptido 1 mediante ELISA. Basándose en los resultados de este ensayo, un total de 105 de los pocillos de mejor expresión se expandió en placas de 48 pocillos. Se seleccionó un total de 83 líneas celulares con respecto a la expansión en placas de 6 pocillos o matraces T-25; el sobrenadante procedente de cada una de las líneas celulares se muestreó y se ensayó con respecto al título de Péptido 1 (ELISA). Basándose en estos resultados, 54 de las líneas celulares de mejor expresión con características de crecimiento óptimas se seleccionaron con respecto a la expansión en matraces T-75 o T-175; los sobrenadantes procedentes de los matraces confluentes se muestrearon y se cuantificaron los títulos de Péptido 1 (ELISA). La comparación de los niveles de expresión entre las líneas celulares permitía la identificación de las 38 mejores líneas celulares que se seleccionaron con respecto al análisis de productividad. La productividad se determinó como sigue:

Productividad (pg/célula/día) = ((Th-Ti)/((Vh+Vi)/2))/tiempo

Donde:

Th es el título de recolección [pg/ml]

Ti es el título inicial [pg/ml]

Vh es el recuento de células viables en la recolección [x 106 células/ml]

Vi es el recuento de células viables inicial [x 106 células/ml]

Tiempo es el tiempo transcurrido (días) entre Ti y Th

Basándose en los resultados de productividad (pg/célula/día), se seleccionaron 13 líneas celulares con respecto a la amplificación génica.

Amplificación Génica Conducida por MTX para la Selección de Líneas Celulares del Péptido 1

Las 13 líneas celulares seleccionadas se eligieron con respecto a la primera ronda de amplificación génica mediante presión selectiva bajo concentraciones crecientes de MTX (0,1-50 M). Después de 7-10 días, el sobrenadante procedente de cada pocillo de cada una de las 13 líneas celulares se muestreó y se ensayó con respecto al título de Péptido 1 (ELISA). Los pocillos de cada línea celular con altos niveles de expresión de Péptido 1 se ensayaron con respecto a la productividad (pg/célula/día). Se inició una segunda ronda de amplificación génica con un total de 16 pocillos de las líneas celulares que mostraban incrementos significativos en la productividad.

La segunda ronda de amplificación génica se efectuó en presencia de concentraciones de MTX incrementadas; los sobrenadantes procedentes de cada cultivo se ensayaron con respecto al título de Péptido 1 (ELISA). Pocillos seleccionados de cada línea celular se expandieron y se ensayó la productividad (pg/célula/día); se identificaron cinco líneas celulares con incremento en la productividad en respuesta a un incremento en la presión de selección con MTX. Estas cinco líneas celulares se hicieron progresar hasta una tercera ronda de amplificación génica usando presión de selección bajo concentraciones de MTX incrementadas; los sobrenadantes procedentes de cada pocillo se ensayaron con respecto al título de Péptido 1 (ELISA). Pocillos seleccionados para cada línea celular se expandieron y se ensayó la productividad (pg/célula/día); se seleccionaron cinco líneas celulares que mostraban alta expresión de Péptido 1.

Dilución Limitativa de Clones

Se realizó clonación con dilución limitativa sobre las cinco líneas celulares que mostraban expresión de Péptido 1. Después de una semana de incubación, las placas se examinaron usando un aparato para obtener imágenes Genetix CloneSelect® y se identificaron colonias individuales. Se apreció que las velocidades de crecimiento de dos líneas celulares durante la clonación con dilución eran particularmente lentas y así estas líneas celulares se interrumpieron. En total, de las tres líneas celulares restantes, se seleccionaron 58 colonias clonales con respecto a la expansión, en primer lugar en placas de 48 pocillos y a continuación se expandieron sucesivamente a través de placas de 12 pocillos, matraces T-25 y matraces y T-75 en ausencia de MTX. A continuación, cada uno de los 58 clones seleccionados se ensayó con respecto a la productividad (pg/célula/día); 16 clones se seleccionaron con respecto a la adaptación a la suspensión y la adaptación al crecimiento en un medio químicamente definido.

Adaptación de Líneas Celulares al Cultivo en Suspensión en Medio Químicamente Definido

Las 16 líneas celulares se adaptaron al cultivo en suspensión en un medio químicamente definido como sigue: líneas celulares seleccionadas en cultivo adherente se adaptaron en primer lugar a la suspensión tanto en medio de crecimiento en suspensión para CHO (DMEM alto contenido de glucosa, que incluye L-glutamina y piruvato sódico, 5% de FCS dializado, 20 mg/l de L-prolina, 1 x penicilina/estreptomicina, 1% de pluronic F68) como a continuación en medio de crecimiento en suspensión químicamente definido (CD Opti-CHO® de Life Technologies Ltd. (Paisley, Reino Unido), 2,5% de FCS dializado, 0,1 x penicilina/estreptomicina, Glutamax® 8 mM).

Una vez adaptadas al cultivo en suspensión, las líneas celulares se retiraron, en fases, a un medio de crecimiento en suspensión químicamente definido libre de suero (CD Opti-CHO®, 0,1 x penicilina/estreptomicina, Glutamax® 8 mM). El MTX se omitió de todos los cultivos en suspensión. Las líneas adaptadas se expandieron y se prepararon bancos celulares seminales. Brevemente, las células se expandieron hasta 300 ml de volumen total y se recolectaron cuando la densidad celular superaba 0,85 x 106 células/ml y la viabilidad era >90%. Se sembraron 3 x 107 células adicionales en un matraz reciente que contenía 70 ml de medio de crecimiento en suspensión para el análisis del crecimiento y la productividad. Las células restantes se recolectaron mediante centrifugación y se resuspendieron en un volumen apropiado de medio de congelación para dar una suspensión celular con 1 x 107 células/ml. Los viales se congelaron hasta -80°C. A continuación, el banco celular se transfirió a nitrógeno líquido para el almacenamiento a largo plazo.

Las 16 líneas celulares se refinaron adicionalmente hasta 5 clones después de la adaptación libre de suero. Los 5 clones se ensayaron con respecto al crecimiento (densidad celular y tiempo de doblamiento celular) y la productividad (pg/célula/día), después de lo cual se seleccionaron 3 clones. Un clon se seleccionó para formar un banco celular maestro.

Se llevó a cabo la preparación del banco celular maestro (MCB) y el banco celular de trabajo (WCB). Se usó un vial procedente de la solución de reserva anterior a la siembra para la preparación de un MCB de 200 viales, y un vial del MCB se usó para preparar un WCB de 200 viales. En cada caso, un vial se descongeló y el medio de crioconservación se retiró mediante centrifugación. Las células se resuspendieron y se propagaron en volumen en medio de crecimiento (CD OptiCHO® / L-glutamina 4 mM). Se realizaron cuatro pases durante la creación del MCB y se realizaron seis pase durante la creación del WCB.

Cuando se obtenían suficientes células, las células se dividieron en partes alícuotas en medio de crioconservación (92,5% de CD OptiCHO® / 7,5% de DMSO) en viales de polipropileno (cada uno de los cuales contenía aproximadamente 1,5 x 107 células viables) y se crioconservaron al reducir la temperatura hasta -100°C a lo largo de un período de al menos 60 minutos en un procedimiento de congelación gradual. Los viales se almacenan en un recipiente autorrellenable con nitrógeno líquido en fase de vapor en una zona de controlada por GMP.

Descripción del Procedimiento de Fabricación de Sustancias Farmacológicas (SF)

Una breve descripción del procedimiento de fabricación de la SF de Péptido 1 es como sigue. Células procedentes de un vial de WCB se reviven y se expanden progresivamente usando medio libre de proteínas antes de la inoculación en un biorreactor de producción. Al terminar el cultivo celular, las células y el residuo celular se retiran mediante filtración del cultivo.

La purificación consiste en tres etapas en columna cromatográfica (MAbSelect Sure, SP Sepharose, Capto Q o Sartobind Phenyl), una etapa de concentración y diafiltración e incluye dos etapas de reducción / inactivación viral específicas; tratamiento con Triton X-100 (inactivación de virus envueltos) y una etapa de nanofiltración (retirada de virus envueltos y no envueltos).

Después de la concentración y la diafiltración, se añaden excipientes para la formulación de la SF. El Péptido 1 formulado se filtra con filtro de 0,22 pm en recipientes.

Descripción y Composición del Producto Farmacológico (PF)

El PF es una solución estéril que se ha de administrar mediante infusión i.v. El PF consiste en Péptido 1 a una concentración de 15 mg/ml en solución isotónica que contiene L-histidina 25 mM, sacarosa 200 mM y 0,1 mg de polisorbato 20/ml a pH 7,6. Los viales se cubrieron con nitrógeno para la protección contra la oxidación. El producto está destinado a un solo uso y almacenamiento a -20°C hasta la descongelación para la administración clínica.

Composición y Fórmula del Lote

La fórmula del lote para el producto farmacológico se presenta en la Tabla 4.

Tabla 4 Composición del Lote de PF

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un dímero polipeptídico que comprende dos monómeros, teniendo cada monómero al menos 90% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1, en donde los monómeros comprenden el dominio D6 de gp130 correspondiente a los aminoácidos en las posiciones 585-595 de SEQ ID NO:1, una región de bisagra del dominio Fc que comprende los aminoácidos en las posiciones 609-612 de SEQ ID NO:1, y los monómeros no comprenden un enlazador entre la porción gp130 y el dominio Fc, para el uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria o un afección mediada por IL-6 en un ser humano, en donde el dímero polipeptídico se administra en una dosis de 60 mg a 1 g.

2. Un dímero polipeptídico que comprende dos monómeros, teniendo cada monómero al menos 90% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1, en donde los monómeros comprenden el dominio D6 de gp130 correspondiente a los aminoácidos en las posiciones 585-595 de SEQ ID NO:1, una región de bisagra del dominio Fc que comprende los aminoácidos en las posiciones 609-612 de SEQ ID NO:1, y los monómeros no comprenden un conector entre la porción gp130 y el Fc, para el uso en el tratamiento de una afección mediada por IL-6 en un ser humano sin disminuir significativamente los recuentos de neutrófilos, los recuentos de plaquetas y/o los niveles de proteína C reactiva o sin disminuir los recuentos de neutrófilos, los recuentos de plaquetas y/o los niveles de proteína C reactiva por debajo de un intervalo normal en sujetos sanos o pacientes que sufren una afección mediada por IL-6, en donde el dímero polipeptídico se administra cada 7-20 días, preferiblemente en donde el dímero polipeptídico se administra en una dosis de 60 mg a 1 g.

3. El dímero polipeptídico para el uso en el método según la reivindicación 1 o 2, en donde los monómeros tienen SEQ ID NO: 1.

4. El dímero polipeptídico para el uso en el método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, en donde la dosis es de 60 mg a 600 mg.

5. El dímero polipeptídico para el uso en el método según la reivindicación 1, en donde el dímero polipeptídico se administra cada 7-60 días, preferiblemente cada 7-30 días.

6. El dímero polipeptídico para el uso en el método según la reivindicación 5, en donde el dímero polipeptídico se administra cada 7-20 días.

7. El dímero polipeptídico para el uso en el método según la reivindicación 1 o 2, en donde el dímero polipeptídico se administra cada 7 días o cada 14 días.

8. El dímero polipeptídico para el uso en el método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el dímero polipeptídico se administra parenteralmente, preferiblemente intravenosamente o subcutáneamente.

9. El dímero polipeptídico para el uso en el método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la enfermedad inflamatoria o afección mediada por IL-6 es enteropatía inflamatoria, preferiblemente en donde la enteropatía inflamatoria es enfermedad de Crohn o colitis ulcerativa.

10. El dímero polipeptídico para el uso en el método según la reivindicación 9, en donde el tratamiento induce o mantiene la remisión de la enteropatía inflamatoria.

11. El dímero polipeptídico para el uso en el método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde la enfermedad inflamatoria o afección mediada por IL-6 es artritis reumatoide, psoriasis, uveítis o aterosclerosis.

12. El dímero polipeptídico para el uso en el método según la reivindicación 9, en donde la enfermedad inflamatoria o afección mediada por IL-6 es colitis no asociada con enteropatía inflamatoria.

13. El dímero polipeptídico para el uso en el método según la reivindicación 12, en donde la colitis es colitis por radiación, colitis diverticular, colitis isquémica, colitis infecciosa, enfermedad celiaca, colitis autoinmunitaria o colitis resultante de alergias que afectan al colon.

14. El dímero polipeptídico para el uso en el método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde los recuentos de neutrófilos, los recuentos de plaquetas y/o los niveles de proteína C reactiva se mantienen dentro de un intervalo fisiológicamente normal después de la administración del dímero polipeptídico.

15. El dímero polipeptídico para el uso en el método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el tratamiento comprende además la administración de un segundo agente activo, preferiblemente en donde el segundo agente activo es ácido 5-aminosalicílico, azatioprina, 5-mercaptopurina o un corticosteroide.