ES2871852T3 - Agente de contraste de resonancia magnética basado en manganeso - Google Patents
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Abstract
Un agente de contraste para imágenes de resonancia magnética, comprendiendo el agente de contraste un compuesto de fórmula (Ia), (Ib), (Ic) o (Id): **(Ver fórmula)** o una sal farmacéuticamente aceptable del compuesto, en la que R1 se selecciona del grupo que consiste en alquileno sin sustituir, cicloalquileno sin sustituir, heterocicloalquileno sin sustituir, arileno sin sustituir, heteroarileno sin sustituir, dialquilenareno y dialquilenheteroareno, en la que R2 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, halo, ciano, nitro, hidroxi y alcoxi, en la que n es 2 o 3, y en la que el compuesto opcionalmente incluye agua coordinada con Mn cuando n es 2.
Description
DESCRIPCIÓN
Agente de contraste de resonancia magnética basado en manganeso
Antecedentes de la invención
1. Campo de la invención
La invención se refiere a agentes de contraste para imágenes de resonancia magnética. La invención también se refiere a métodos para preparar los agentes de contraste.
2. Descripción de la técnica relacionada
Cuando una sustancia, tal como tejido humano, se somete a un campo magnético uniforme (campo de polarización B0), los momentos magnéticos individuales de los núcleos excitados intentan alinearse con este campo de polarización, pero experimentan precesión alrededor del mismo en orden aleatorio en su frecuencia de Larmor característica. Si la sustancia, o tejido, se somete a un campo magnético (campo de excitación B1) que están en el plano x-y y que está cerca de la frecuencia de Larmor, el momento alineado neto, Mz, puede rotarse, o "inclinarse", en el plano x-y para producir un momento magnético transverso neto Mt. Se emite una señal por los núcleos excitados o "espines", después de que se termine la señal de excitación B1, y esta señal puede recibirse y procesarse para formar una imagen.
En sistemas de imágenes de resonancia magnética (RM), los espines excitados inducen una señal de onda de seno oscilante en una espiral receptora. La frecuencia de esta señal está cerca de la frecuencia de Larmor, y su amplitud inicial se determina mediante la magnitud del momento magnético transverso Mt. La amplitud, A, de la señal de RMN emitida se desintegra de un modo exponencial con el tiempo, t. La constante de desintegración 1/T*2 depende de la homogeneidad del campo magnético y de T2, que se denomina contante de "relajación de espín-espín", o la constante de "relajación transversa". La constante T2 es inversamente proporcional a la tasa exponencial a la que la precesión alineada de los espines se desfasaría después de la eliminación de la señal de excitación B1 en un campo perfectamente homogéneo. El valor práctico de la constante T2 es de manera que los tejidos tienen diferentes valores de T2 y esto puede explotarse como medio de potenciación del contraste entre dichos tejidos.
Otro factor importante que contribuye a la amplitud A de la señal de RMN se denomina proceso de relajación de la red de espín que se caracteriza por la constante de tiempo T1. Describe la recuperación del momento magnético neto M a su valor de equilibrio a lo largo del eje de polarización magnética (z). La relajación T2 está asociada con una disminución en la coherencia del espín, y la relajación T1 se produce debido a un desplazamiento paramagnético en el sitio de sondeo y posterior intercambio de protones unidos con la masa de agua circundante. La constante de tiempo T1, que se denomina constante de "relajación de la red de espín" o constante de "relajación longitudinal", es mayor que T2, mucho mayor en la mayoría de sustancias de interés médico. Como con la constante T2, la diferencia en T1 entre tejidos puede explotarse proporcionar contraste de imagen.
Los recíprocos de estas constantes de tiempo de relajación se denominan tasas de relajación y se indican R1 y R2 donde R1 = 1/T1 y R2 = 1/T2.
Los agentes de contraste son moléculas o materiales exógenos que pueden alterar las propiedades de relajación del tejido e inducen contraste de imagen. Los agentes de contraste típicamente son materiales paramagnéticos, superparamagnéticos o ferromagnéticos. Los agentes de contraste a veces también se denominan sondas de imagen. El grado al que un agente de contraste dado puede alterar la tasa de relajación se denomina capacidad de relajación. La capacidad de relajación se define como la diferencia en la tasa de relajación de una muestra medida con y sin agente de contraste. Esta diferencia en la tasa de relajación se normaliza entonces a la concentración del agente de contraste. La capacidad de relajación se expresa en letra minúscula "r" con un subíndice "1" o "2" que se refiere a la capacidad de relajación longitudinal o transversa respectivamente. Por ejemplo la capacidad de relajación longitudinal, n, se define como ri = (R1-R10)/C donde R1 es la tasa de relajación en s_1 medida en presencia del agente de contraste, R10 es la tasa de relajación en s_1 medida en ausencia de agente de contraste, y C es la concentración en mM del agente de contraste. La capacidad de relajación tiene unidades de m M 'V 1. Para los agentes de contraste que contienen más de un ion metálico, la capacidad de relajación puede expresarse en términos de la concentración de ion metálico ("por ion" o "capacidad de relajación iónica") o en términos de la concentración molecular ("por molécula" o "capacidad de relajación molecular"). La capacidad de relajación es una propiedad inherente de los agentes de contraste.
En un esfuerzo por provocar contrastes clínicamente deseados, se han desarrollado agentes de contraste de RM que están diseñados para influir en los periodos de relajación. No resulta sorprendente que haya agentes de contraste que se usan clínicamente para ajustar el contraste T1 y los que se usan clínicamente para ajustar el contraste T2.
Las imágenes ponderadas en T1 (T1W) proporcionan contraste de imagen donde tejidos o regiones de la imagen están claras (intensidad de señal aumentada) cuando la T1 del agua en esa región es pequeña. Una manera de aumenta el contraste de imagen es administrar un complejo o material paramagnético basado en gadolinio (Gd), manganeso (Mn) o
hierro. Este agente de contraste paramagnético reduce la Ti de las moléculas de agua que encuentra y produce un contraste de imagen positivo. El grado al que una concentración dada de agente de contraste puede cambiar Ti es la capacidad de relajación como se indica anteriormente. Los compuestos que tienen mayor capacidad de relajación proporcionan una potenciación de la señal Tiw mayor que los compuestos con baja capacidad de relajación; como alternativa, un compuesto con alta capacidad de relajación puede proporcionar potenciación de la señal equivalente a un compuesto de baja capacidad de relajación, pero a una menor concentración que el compuesto de baja capacidad de relajación. Por tanto, los compuestos de alta capacidad de relajación son deseables porque posibilitan mayor potenciación de las lesiones y mejoran la confianza del diagnóstico; como alternativa, pueden usarse a dosis menores y, por tanto, mejoran el margen de seguridad del agente de contraste.
La mayoría de los agentes de contraste de resonancia magnética en uso clínico emplean el ion gadolinio en el estado de oxidación 3. El ion de manganeso en el estado de oxidación 2 también puede servir como agente de relajación de Ti. Mangafodipir (vendido con la marca comercial Teslascan como mangafodipir de trisodio) es un agente de contraste suministrado por vía intravenosa para potenciar el contraste en imágenes de resonancia magnética (RM) del hígado. Incluye iones de manganeso (II) paramagnéticos y el agente quelante fodipir (difosfato de dipiridoxilo). El manganeso reduce el tiempo de relajación longitudinal (Ti), haciendo que el tejido normal aparezca más claro en una imagen de resonancia magnética. También se han descrito agentes basados en Mn que tienen capacidades de relajación tan altas como los agentes de contraste basados en Gd (véase, por ejemplo, Inorg Chem 43: 6313-23, 2004).
Una desventaja de los agentes de contraste de resonancia magnética de gadolinio es que el ion de gadolinio es estable únicamente en el estado de oxidación 3 en condiciones fisiológicas. Además, hay una conexión bien establecida entre el uso de agentes de contraste basados en gadolinio en pacientes con disfunción renal y un trastorno fibrótico infrecuente, pero grave, denominado fibrosis sistémica nefrógena (FSN).
Un mayor avance sobre los agentes de contraste de resonancia magnética basados en manganeso sería de tremenda utilidad en aplicaciones potenciadas por contraste. El manganeso puede determinar numerosos estados de oxidación en condiciones fisiológicas, siendo el estado de oxidación 2 el más adecuado para contraste Ti y T2. Esto puede ser útil en el estudio no invasivo de la dinámica oxidorreductora de los tejidos. Los agentes de contraste basados en manganeso también podrían representar una alternativa viable al gadolinio en grupos de pacientes con riesgo aumentado de FSN.
El documento EP 0308983 se refiere a RMN de relajación de Ti y T2 potenciada con complejos de coordinación de Mn(II) sin quelato, concretamente complejos de coordinación de Mn(II) con aminoácidos solubles en agua.
Sumario de la invención
Los entornos oxidorreductores tanto intracelulares como extracelulares están fuertemente regulados en tejidos sanos y están muy relacionados con el estado fisiológico de la célula. Sin embargo, esta regulación a menudo se altera durante periodos de sobrecarga celular, daño o muerte celular. Aunque la dinámica del estado de oxidorreducción local desempeña una función importante en la mediación de diversos procesos biológicos tales como la progresión del ciclo celular, la respuesta inmunitaria y la curación de heridas, la desregulación persistente del entorno oxidorreductor extracelular se ha ligado a varias patologías, incluyendo inflamación crónica, crecimiento neoplásico y agresividad de células cancerosas. De hecho, la función de la oxidorreducción en la biología tumoral sigue estando en investigación activa y es el centro de muchos profármacos activados por oxidorreducción que están actualmente en desarrollo. Nuevos métodos de imagen ciertamente facilitarán estos esfuerzos, mientras se avanza más en la comprensión básica de la dinámica de oxidorreducción en relación con la enfermedad.
Se ha informado de varias sondas de imagen moleculares activadas por oxidorreducción, de las que cada una emplea un mecanismo único de activación para abordar aspectos específicos del entorno oxidorreductor. Algunas de estas sondas se dirigen a tejidos que son hipóxicos (baja tensión de oxígeno), que puede ser el resultado de una alteración en el aporte de sangre a la zona afectada o vascularización inadecuada, que sucede a veces en tumores. Las sondas de tomografía por emisión de positrones i8F-fluoroisonidazol (i8F-MISO) y 64Cu-diacetil-bis(N4-metiltiosemicarbazona) (64CU-ATSM) se han usado clínicamente para tomar imágenes de hipoxia tumoral. Las sondas de imagen de resonancia paramagnética de electrones (RPE) y de espectroscopia basadas en nitróxidos sensibles a oxidorreducción han demostrado ser eficaces en detectar la abundancia relativa de los tioles, así como otras especies reductoras. También se ha informado de sondas de resonancia magnética (RM). Ejemplos incluyen complejos de Gd(III) en que los ligandos pueden formar enlaces disulfuro reversibles con cadenas laterales de cisteína de proteínas extracelulares, proporcionando de ese modo una visión indirecta de las condiciones oxidorreductoras locales, una Mn(MI)-porfirina que experimenta reducción en una especie de Mn(II) con mayor capacidad de relajación en condiciones hipóxicas y, recientemente, un par de complejos de Eu(III) que pueden activarse en presencia de p-NADH a través de reducción de los brazos laterales de los ligandos.
La RM es una modalidad atractiva para tomar imágenes de la dinámica de oxidorreducción ya que permite examinar organismos opacos, intactos en tres dimensiones a resolución celular (-i0 pm) en sistemas de campo alto y resolución submilimétrica en dispositivos clínicos de exploración. La penetración en tejidos profundos y la alta resolución de RM hacen posible traducir directamente los hallazgos de células a ratones o seres humanos.
Una estrategia para una sonda de RM sensible a oxidorreducción es emplear un ion metálico activo en oxidorreducción. El Gd(III), usado en la mayoría de sondas de RM tiene solamente un estado de oxidación estable en medio acuoso. El manganeso, sin embargo, puede existir de forma estable en varios estados de oxidación dependiendo del campo del ligando. Complejos de Mn(II) de alto espín también puede producir capacidades de relajación que son comparables con los mejores complejos de Gd(III), y se ha trabajado recientemente con complejos de Mn(II) como sondas de RM. En este documento se propone una nueva clase de sondas de RM activadas por oxidorreducción basadas en el par de oxidorreducción de Mn(N)/Mn(NI).
El ion de manganeso puede existir de forma estable o metaestable en diferentes estados de oxidación. Se ha reconocido una ventaja de la capacidad del manganeso de existir en diferentes estados de oxidación. Se demuestra que es posible hacer que los ligandos se unan al manganeso y estabilicen los estados de oxidación tanto 2 como 3. La capacidad de relajación del complejo de Mn(II) es mucho mayor que la del análogo de Mn(III). También se demuestra que es posible modificar el ligando de unión a Mn de maneras que provocan que se prefiera un estado de oxidación. Un beneficio de dichos complejos activos de oxidorreducción es su capacidad de actuar como detectores. Por ejemplo, se demuestra que un complejo de Mn(III) puede reducirse en su complejo de Mn(II) mediante concentraciones fisiológicas de glutatión y esto, a su vez, provoca un aumento en la señal de resonancia magnética. Por tanto, estos complejos pueden actuar como detectores de glutatión u otros reductores biológicos.
También se demuestra que determinados complejos de manganeso pueden cambiar su capacidad de relajación según cambie el pH. Los ligandos tanto fenolato-O como sulfonamida-N son disociables en ácido y modulan la interacción del manganeso con la masa de agua, que influye en la capacidad de relajación. En nuestros ejemplos, la capacidad de relajación aumenta según disminuye el pH y, por tanto, estos compuestos pueden actuar como detectores de pH y acidosis. Los valores de p K tanto de donadores de fenolato como de donadores de sulfonamida son altamente modulares y susceptibles a calibración fina sintética. El bajo pH extracelular es una característica distintiva de la isquemia hística (por ejemplo, apoplejía, cardiopatía isquémica, isquemia renal) y muchos tumores.
También desarrollamos un nuevo ligando denominado CyP3A. Este ligando se diseñó para quelar Mn(II) de una manera termodinámicamente estable y cinéticamente inerte, mientras permitía la interacción directa de Mn(II) con agua. Los datos cinéticos indican que el complejo de manganeso de CyP3A es más inerte a la transmetalación en Zn(II) que el complejo de Mn(II) de CDTA (ácido ciclohexanodiaminatetraacético), que representa los precedentes bibliográficos que muestran el equilibrio óptimo de los rasgos mencionados anteriormente. El donador de piridil-N de CyP3A es modular y producir un medio fácil de fijar otro donador de ligando que pueda ocupar de forma reversible el sitio de coordinación ocupado por el agua. Esta estructura es ideal para posibles aplicaciones de detección de pH.
Además, preparamos un multímero de alto peso molecular (>2000 PM) que contenía seis quelantes de Mn(II). El alto peso molecular provoca una descomposición más lenta de las moléculas en solución y puede potenciar fuertemente la capacidad de relajación del Mn(II).
Un beneficio más de los agentes de contraste basados en Mn es la existencia de isótopos de manganeso emisores de positrones (Mn-51 y Mn-52) que posibilitan el uso de estos complejos como agentes de tomografía por emisión de positrones (TEP). Además, mediante el intercambio de isótopo de Mn-55 natural por un isótopo de TEP, es posible preparar fácilmente sondas dobles de RM-TEP. Dichas sondas podrían emplearse en nuevos dispositivos híbridos de exploración de RM-TEP donde la sonda podría detectarse usando ambas modalidades. Un beneficio de dicha estrategia sería la capacidad de tener medidas cuantitativas más precisas de parámetros fisiológicos tales como pH, potencial de reducción o flujo de iones.
Estos y otros rasgos, aspectos y ventajas de la presente invención llegarán a entenderse mejor tras considerar la siguiente descripción detallada, los dibujos y las reivindicaciones adjuntas.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra que la estructura del ligando influye fuertemente en el potencial de oxidorreducción del par de Mnm/Mn". La conversión de donadores de carboxilato en fenolato desplaza el potencial de media celda en 649 mV en favor del estado de oxidación superior.
La figura 2 muestra: en (a), un voltamperograma cíclico a 100 mV/s para MnII-HBET (25 mM) en tampón TRIS 25 mM (pH = 7,4), KNO3500 mM, como electrolito de soporte. Los potenciales son frente a K4Fe(CN)6/K3Fe(CN)6; y en (b), un diagrama de Cottrell del par de Mn2+/Mn3+ - ia, (línea decreciente) e ic (línea creciente) frente a Vv, donde v = tasa de exploración.
La figura 3 muestra: Izquierda: imagen de RM ponderada en T1 registrada en 4,7 T de tubos que contienen agua pura, Mnm-HBET 0,5 mM y MnII-HBET 0,5 mM en tampón TRIS de pH 7,4. Derecha: relajaciones medidas temperatura ambiente en 4,7 T.
La figura 4 muestra (a) la reducción de Mnm-HBET 0,5 mM en Mn"-HBET por GSH 10 mM en tampón TRIS (pH 7,4, 37 °C) provoca una tasa de relajación de protones aumentada (I/T 1, eje de la izquierda) y una disminución
simultánea en la fracción molar de Mnm-HBET (eje de la derecha) determinada por absorbancia UV característica a 375 nm. (b) Reducción de Mnm-HBET 0,5 mM por GSH 1 mM a 26 °C controlado por CL-EM. No se observan especies intermedias de vida larga en el proceso de reducción.
La figura 5 muestra los agentes de contraste de Mn2+/Mn3+ en un entorno oxidante y un entorno reductor. La figura 6 muestra un esquema para la síntesis completa de ácido 2'-((2-((carboximetil)(2-hidroxibencil)amino)etil)azanodiil)diacético (HBET) (3), ácido 2'-((2-((carboximetil)(2-hidroxi-5-metoxibencil)amino)etil)azanodiil)diacético (HBET-OMe) (8) y ácido 2'-((2-((carboximetil)(2-hidroxi-5-nitrobencil)amino)etil)azanodiil)diacético (HBET-NO2) (12).
La figura 7 muestra (a) el trazado de CL-EM analítico del ligando HBET (3) donde el trazado a 220 nm (línea negra A) indica la alta pureza de la muestra y el ion extraído para m/z = 341 se muestra en la línea roja B que solapa con el trazado anterior; y (b) EM-IEN de 3 que presenta el m/z = 341 correspondiente a [M+H]+.
La figura 8 muestra el trazado de CL-EM analítico de (a) Mn"HBET (4) y (b) MnmHBET (5) en una columna de fase inversa C18; donde el trazado a 220 nm (línea negra A) indica la alta pureza de la muestra y el ion extraído para m/z = 394 y 393 se muestra en la línea roja B.
La figura 9 muestra (a) espectro UV de MnIIHBET (4) en agua; y (b) EM-IEN de MnIIHBET (4) que presenta m/z = 394 correspondiente a [M+3H]+.
La figura 10 muestra (a) espectro UV de MnmHBET (5) en agua; y (b) EM-IEN de MnmHBET (5) que presenta m/z = 393 correspondiente a [M+2H]+.
La figura 11 muestra la relajación de (a) Na[MnmHBET] (5) y (b) Na2[MnIIHBET] (4) en tampón TRIS. 1/T1 frente a [Mn] para (4) y (5) medido en tampón TRIS a pH 7,4, 37 °C. La pendiente de la línea aporta la relajación. La figura 12 muestra un voltamperograma cíclico de MnIIHBET (25 mM) en tampón TRIS (pH = 7,4) que contenía KNO3 como electrolito de soporte a diferentes tasas de exploración que varían de 50 - 600 mV/s.
La figura 13 muestra la conversión de Mnm-HBET en MnII-HBET en presencia de glutatión, medida por la disminución de la absorbancia a 375 nm (línea de puntos). La línea continua muestra el ajuste de los datos observados a una ecuación de velocidad de primer orden con respecto a Mnm en condiciones se seudoprimer orden (véase la ecuación S1 a continuación).
La figura 14 muestra que en presencia de un gran exceso de glutatión reducido, la reacción de oxidorreducción se comporta de seudoprimer orden con respecto a [MnIII-HBET]. La pendiente de cada línea es igual a -k • [GSH] (véase la ecuación S1 a continuación). a.) La concentración de glutatión se varía en cada reacción mientras la concentración inicial de Mnm-HBET (0,6 mM) no. b.) La concentración inicial de MnIII-HBET se varía mientras la concentración de glutatión (10 mM) se mantiene constante.
La figura 15 muestra un diagrama de la tasa inicial para la reducción de MnIIIHBET como una función de la concentración de MnIIIHBET a tres concentraciones diferentes de glutatión. La pendiente de cada línea (kobs) es igual a -k • [GSH] (véase la ecuación S1 a continuación).
La figura 16 muestra la interconversión entre los dos estados de oxidación con agente reductor (GSH) y agente oxidante (H2O2).
La figura 17 muestra en (a), oxidación de MnII-HBET 0,5 mM en MnIII-HBET con H2O21 mM en tampón TRIS (pH 7,4, 37 °C) seguida de mediciones de la relajación (eje de la izquierda) y espectroscopia de UV-Vis, donde el aumento en la absorbancia UV a 375 nm indica la formación de MnIIIHBET como una función del tiempo (eje de la derecha); y en (b), oxidación de Mn"-HBET 0,5 mM por H2O21 mM a 26 °C controlada por CL-EM.
La figura 18 muestra diagramas representativos de la intensidad de la señal frente al tiempo de inversión (TI) para (a) MnIIHBET 0,5 mM y (b) MnIIIHBET 0,5 mM en tampón TRIS (pH = 7,4). Obsérvese la recuperación de la señal más rápida para MnII-HBET que indican T1 menor y mayor relajación que Mnm-HBET.
La figura 19 muestra un ruta sintética para compuestos de la serie cycHBET de los agentes de contraste de la invención.
La figura 20A muestra la relajación de (a) Na2[MnIIHBET] (4) y (b) Na[MnIIIHBET] (5) en tampón TRIS a pH 7,4, 37 °C. La pendiente de la línea aporta la relajación.
La figura 20B muestra la relajación de Na2[MnIIHBET-OMe] (9) en tampón TRIS a pH 7,4, 37 °C. La pendiente de la línea aporta la relajación.
La figura 20C muestra la relajación de Na2[MnIIHBET-NO2] (13) y Na[MnmHBET-NO2] (14) en tampón TRIS a pH 7.4, 37 °C. La pendiente de la línea aporta la relajación.
La figura 20D muestra la relajación de Na2[MnIIcycHBET] (30) en tampón TRIS a pH 7,4, 37 °C. La pendiente de la línea aporta la relajación.
La figura 20E muestra la relajación de Na2[MnIIcycHBET] (2) y Na[MnIIcycHBET-NO2] (25) en tampón TRIS a pH 7.4, 37 °C. La pendiente de la línea aporta la relajación.
La figura 21 muestra las curvas de valoración del pH para los ligandos y sus correspondientes complejos de manganeso: (a) HBET, (b) HBET-OMe y (c) HBET-NO2.
La figura 22 muestra: (a) espectro UV de Na2[MnIIHBET] (4) controlado como una función del pH. (b) diagrama de la absorbancia a 288 nm como una función del pH. Un aumento en la absorbancia corresponde a la desprotonación del fenol y esto puede ajustarse para dar un pKa de 7,64 para esta ionización del fenol.
La figura 23 muestra: (a) espectro UV de Na2[MnIIHBET-OMe] (9) controlado como una función del pH. (b) diagrama de la absorbancia a 308 nm como una función del pH. Un aumento en la absorbancia corresponde a la desprotonación del fenol y esto puede ajustarse para dar un pKa de 7,91 para esta ionización del fenol. La figura 24 muestra: (a) espectro UV de MnII:HBET-NO21:1 controlado como una función del pH. (b) diagrama de la absorbancia a 396 nm como una función del pH. Un aumento en la absorbancia corresponde a la desprotonación del fenol y esto puede ajustarse para dar un pKa de 4,84 para esta ionización del fenol.
La figura 25 muestra el cambio de la relajación durante la valoración de Mn2+:ligando 1:1 representado como una función del pH para (a) HBET, (b) HBET-OMe y (c) HBET-NO2.
La figura 26 muestra (a) un voltamperograma cíclico a 100 mV/s para MnII-HBET en tampón TRIS 25 mM (pH = 7,4), KNO3500 mM, como electrolito de soporte. Los potenciales son frente a K4Fe(CN)6/K3Fe(CN)6. (b) un diagrama de Cottrell del par de Mn2+/Mn3+ - ia, (línea decreciente) e ic (línea creciente) frente a Vv, donde v = tasa de exploración.
La figura 27 muestra en (a) espectro UV de Na2[MnIIcycHBET] (20) controlado como una función del pH; y en (b) diagrama de la absorbancia a 296 nm como una función del pH. Un aumento en la absorbancia corresponde a la desprotonación del fenol y esto puede ajustarse para dar un pKa de 7,95 para esta ionización del fenol. La figura 28 muestra en (a) espectro UV de Na[Mn(cycHBET-NO2)] (26) controlado como una función del pH; y en (b) diagrama de la absorbancia a 396 nm como una función del pH. Un aumento en la absorbancia corresponde a la desprotonación del fenol y esto puede ajustarse para dar un pKa de 5,01 para esta ionización del fenol.
La figura 29 muestra un voltamperograma cíclico de Na2[Mn"HBET] (4) a pH 7,4; el potencial de media celda es 379 mV frente al electrodo de hidrógeno normal (NHE).
La figura 30 muestra una voltamperograma cíclico de Na2[MnIIHBET-OMe] (9) a pH 7,4; el potencial de media celda es 344 mV frente a NHE.
La figura 31 muestra un voltamperograma cíclico de Na[Mn(HBET-NO2) (14) a pH 7,4; el potencial de media celda es 476 mV frente a NHE.
La figura 32 muestra un voltamperograma cíclico de Na[Mn(CycBET)] (21) a pH 7,4; el potencial de media celda es 365 mV frente a NHE.
La figura 33 muestra un voltamperograma cíclico de Na[Mn(cycHBET-NO2)] (31) a pH 7,4; el potencial de media celda es 488 mV frente a NHE.
La figura 34 muestra un esquema para la síntesis de N-Tos-DTTA (33).
La figura 35 muestra T2 representado como una función de la relación de 33: Mn2+ a pH 7,40.
La figura 36 muestra la interconversión activada por pH entre 351- y 352-La figura 37 muestra la dependencia del pH de los valores de n de 342Y341' a 20 MHz (A) y 60 MHz (B) a 37 °C. La figura 38 muestra la síntesis del quelante de Mn(II) (40) de los agentes de contraste de la invención.
La figura 39 muestra la síntesis del quelante de Mn(II) (45) de los agentes de contraste de la invención.
La figura 40 muestra la síntesis del ligando hexamérico (55) de los agentes de contraste de la invención.
La figura 41 es un diagrama de bloques de un ejemplo de sistema de imágenes de resonancia magnética (RM) para su uso con un agente de contraste de la presente divulgación.
La figura 42 es un diagrama de bloque de un ejemplo de sistema de tomografía de emisión adecuado para su uso con un agente de contraste de la presente divulgación.
Descripción detallada de la invención
Hay varios requisitos para una sonda de RM activada por oxidorreducción útil:
(1) un potencial de media celda de oxidorreducción que es accesible para agentes reductores biológicamente pertinentes como glutatión (GSH); (2) un ligando que estabiliza ambos estados de oxidación de modo que la reducción u oxidación no provoque descomposición; (3) fuerte potenciación de la señal tras la activación; (4) cambio de señal aumentado en presencia de patología, es decir, una sonda de excitación; y (5) cinética que es rápida con respecto a la escala temporal de la toma de imágenes.
Un rasgo de diseño clave de una sonda activa por oxidorreducción es identificar un ligando que estabilice ambos estados de oxidación. El EDTA (ácido etilendiaminatetraacético) forma un complejo de Mn(II) 7-coordinado muy estable con un coligando de agua coordinado, y el estado de oxidación 2+ se favorece fuertemente, véase la figura 1. Por el contrario, cambiar dos donadores de carboxilato a donadores de fenolato como en HBED (ácido N,N'-di(2-hidroxibencil)etilendiamina-N,N'-diacético) o EHPG (N,N'-etilen 6/s[2(o-hidroxifenil)]glicina) favorece fuertemente los complejos de Mn(III) con número de coordinación 6, véase la figura 1.
Se plantea la hipótesis de que HBET (ácido hidroxibenciletilendiaminatriacético) (figura 1) con una estructura de ligando que es intermedia entre EDTA y HBED, que contiene solamente un donador de fenolato, potencialmente podría mostrar metaestabilidad hacia cualquier estado de oxidación. El estado de oxidación preferido de dicha especie, por lo tanto, sería muy sensible a cambios en el entorno oxidorreductor. Para ensayar esta hipótesis, se prepararon complejos de manganeso de HBED, HBET y EDTA para examinar la manera en que el número de grupos fenolato contribuye a los potenciales de media celda del par de oxidorreducción Mn(NI)/Mn(N). La voltamperimetría cíclica de MnII-HBET en tampón TRIS (véase la figura 2) muestra un pico de oxidación reversible a 0,356 V (frente a K4Fe(CN)6/K3Fe(CN)6), que indica el potencial de usar esta molécula como sonda de oxidorreducción. La corriente anódica (ia) y la corriente catódica (ic) son lineales con la raíz cuadrada de la tasa de exploración (v) sobre el intervalo de 50 - 600 mV/s (véase la figura 2b), que indica que este es un proceso controlado por difusión. Por otro lado, MnII-EDTA y Mnm-HBED presentan picos de oxidación irreversible y reducción cuasirreversible con potenciales de media celda (Mn"/Mnm) de 0,633 V y 0,016 V respectivamente. El HBET (ácido hidroxibenciletilendiaminatriacético) se sintetizó a partir de aminación reductora de etilendiamina monoprotegida con BOC con salicilaldehído, seguida de alquilación con ácido t-butil bromoacético, y después desprotección ácida para dar el ligando libre en un rendimiento global de un 45 %. La reacción de un equivalente de ligando con MnCh dio lugar a MnII-HBET en rendimiento aislado de un 84 %. El complejo de Mnm-HBET se sintetizó en un rendimiento de un 38 % por oxidación aérea de MnCh en presencia de un equivalente del ligando en condiciones básicas, seguida de purificación por RP-HPLC. El ligando HBET estabiliza ambos estados de oxidación en la medida en que MnII-HBET y Mnm-HBET pueden separarse fácilmente y aislarse en sus formas puras usando un sistema convencional de RP-HPLC. Ambos complejos también son estable en tampones fosfato y carbonato.
Las capacidades de relajación T1 de los complejos de Mn"-HBET y Mnm-HBET se midieron independientemente en 1,4 T en solución salina tamponada con Tris (TBS: pH 7,4, 37 °C) y los valores fueron 2,76 mM'1 s_1 y 1,05 mM'1 s-1, respectivamente. Esta diferencia en la capacidad de relajación es grande considerando que el estado Mnm aún tiene cuatro electrones desemparejados. En la figura 3, se muestra una imagen de RM ponderada a T1 en 4,7 T de tubos de ensayo que contienen agua pura o Mnm-HBET o M"-HBET equimolar. La presencia de un complejo paramagnético da como resultado una intensidad de señal mayor en comparación con agua pura. La mayor capacidad de relajación de Mn1-HBET es evidente en su imagen más clara. Las mediciones de T1 en 4,7 T revelaron una capacidad de relajación 3,3 veces mayor para la forma MnII-HBET reducida, véase la figura 3.
El complejo de Mnm-HBET se reduce fácilmente al estado Mn1 en presencia de glutatión. Esta conversión parece transcurrir directamente hasta el producto sin la acumulación de ningún intermedio de reacción de vida larga o la formación de subproductos. Esto se demuestra por el experimento de transcurso temporal mostrado en la figura 4b donde la aparición del complejo MnII-HBET se produce simultáneamente con el consumo de Mnm-HBET. El progreso de esta reacción también puede seguirse sobre la marcha por relaxometría (véase la figura 4a) usando condiciones pertinentes para imágenes clínicas (1,4 T, 37 °C). Como la capacidad de relajación del complejo de Mn(II) es mayor de la del complejo de Mn(III), la tasa de relajación longitudinal de los protones de agua (1/T1) aumentará en proporción a la concentración de MnII-HBET en la reacción. La conversión directa del complejo de Mn(III) en el complejo de Mn(II) se evidencia además
por la observación de que la tasa de formación de la especie de Mnm-HBET es eficazmente equivalente a la tasa de consumo de la forma oxidada medida por absorbancia UV (véase la figura 4a).
Se realizó una serie de experimentos cinéticos a 37 °C (pH 7,4) para determinar la ley empírica de velocidad para la reducción de Mnm-HBET por glutatión. El complejo de Mnm-HBET posee una banda de fuerte absorbancia a 375 nm (£ = 1,38 x 103 M-1 cm-1) en agua que no está presente en el espectro UV del complejo de MnII-HBET. Este rasgo nos permitió controlar fácilmente la reducción de Mnm-HBET a lo largo del tiempo. Se midieron las velocidades de reacción iniciales a tres concentraciones diferentes de glutatión (5 mM, 10 mM y 20 mM). Para cada concentración de glutatión, la reacción se realizó a cuatro diferentes concentraciones iniciales de Mm-HBET (0,3 mM, 0,4 mM, 0,5 mM y 0,6 mM). Basándonos en estos experimentos, determinamos que la reacción era de primer orden tanto en [GSH] como en [Mnm-HBET] con una constante de velocidad de segundo orden global de (3,8 ± 0,3)x 10-1 M-1 s-1.
Las propiedades cinéticas de cualquier sonda activable son extremadamente importantes cuando se considera su aplicación en imágenes biomédicas. En el caso de una sonda activada por oxidorreducción, la conversión en el estado activado debe producirse eficazmente dentro de un intervalo de oxidorreducción fisiológicamente pertinente y también debe ser rápida con respecto a la tasa de eliminación de la sonda. Las concentraciones de glutatión reducido dentro de la célula son típicamente 1-10 mM. En ese intervalo, la semivida del complejo de Mnm-HBET es más o menos de 3 a 30 minutos. En comparación, la semivida en plasma sanguíneo, donde los niveles de glutatión son aproximadamente tres órdenes de magnitud inferiores, sería mayor de una semana. Por lo tanto, esperamos que la activación de la sonda se limite principalmente a regiones donde los mecanismos normales responsables de regular la oxidorreducción extracelular se han alterado o sobrepasado mucho.
En conclusión, el par de oxidorreducción de Mnm/Mn"-HBET satisface varios criterios clave requeridos de una sonda útil para imágenes de oxidorreducción. El potencial de media celda de oxidorreducción es accesible para agentes reductores biológicamente pertinentes como glutatión; presenta buena potenciación de la señal tras la conversión al estado activo de RM; y la cinética de activación es rápida con respecto a la escala temporal de la toma de imágenes. Los estudios cinéticos de glutatión confirman que la reducción es rápida en presencia de concentraciones fisiológicas de glutatión. Este sistema tiene un comportamiento extremadamente bueno y la interconversión entre los dos estados de oxidación se produce mediante un proceso de un electrón simple y reversible. La voltamperimetría cíclica confirma que este es un proceso reversible. Además, se aprecia que el ligando HBET podría modificarse fácilmente con sustituyentes arilo apropiados para calibrar el potencial de oxidorreducción, o para incorporar un resto que confiera dirección biológica específica, abriendo nuevas vías en imágenes de RM moleculares.
En un ejemplo de realización de la invención, el agente de contraste se usa en una técnica de imágenes de diagnóstico tal como resonancia magnética (RM) y/o RM y tomografía por emisión de positrones (TEP) simultáneas. Un "sujeto" es un mamífero, preferiblemente un ser humano.
La forma en que el agente de contraste se administra al sujeto no es crucial. Por ejemplo, el agente de contraste de la invención puede administrarse directamente al tejido del que se están tomando imágenes de diagnóstico, a un líquido corporal que entra en contacto con el tejido, o a una ubicación corporal desde la que el agente de contraste puede difundir o transportarse al tejido del que se están tomando imágenes de diagnóstico.
El agente de contraste puede administrarse en solitario o como parte de una composición farmacéuticamente aceptable. Las cantidades relativas del agente de contraste de la invención, un vehículo farmacéuticamente aceptable y cualquier ingrediente activo adicional en una composición farmacéutica de la invención variarán, dependiendo de la identidad, tamaño y estado del sujeto tratado y dependiendo además de la vía por la que se tenga que administrar el agente de contraste. El agente de contraste puede incluir un resto de dirección que puede abordar una región de interés en el sujeto. El resto de dirección puede seleccionarse de proteínas, enzimas, péptidos, anticuerpos y fármacos. Un agente de contraste de la invención, que comprende opcionalmente otros compuestos farmacéuticamente activos, puede administrarse a un sujeto por vía parenteral, por ejemplo, por vía intravenosa, intramuscular, subcutánea, intracerebral o intratecal.
Un ejemplo no limitante de realización de la invención es un agente de contraste para imágenes de resonancia magnética. El agente de contraste comprende un compuesto de fórmula (la), (Ib), (Ic) o (Id):
o una sal farmacéuticamente aceptable del compuesto, en la que Ri se selecciona del grupo que consiste en alquileno sin sustituir, cicloalquileno sin sustituir, heterocicloalquileno sin sustituir, arileno sin sustituir, heteroarileno sin sustituir, dialquilenareno y dialquilenheteroareno, en la que R2 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, halo, ciano, nitro, hidroxi y alcoxi, en la que n es 2 o 3, y en la que el compuesto opcionalmente incluye agua coordinada con Mn cuando n es 2.
En un ejemplo de realización del agente de contraste, el compuesto tiene la fórmula (II):
En otro ejemplo de realización del agente de contraste, el compuesto tiene la fórmula (III):
En otro ejemplo de realización del agente de contraste, el compuesto tiene la fórmula (IV):
En otro ejemplo de realización del agente de contraste, el compuesto tiene la fórmula (V):
En otro ejemplo de realización del agente de contraste, el compuesto tiene la fórmula (Va):
En otro ejemplo de realización del agente de contraste, el compuesto tiene la fórmula (Vb):
En otro ejemplo de realización del agente de contraste, R1 es etileno. En otro ejemplo de realización del agente de contraste, R2 es metoxi. En otro ejemplo de realización del agente de contraste, R2 es nitro. En otro ejemplo de realización del agente de contraste, R1 es ciclohexileno. En otro ejemplo de realización del agente de contraste, al menos uno de R1 y R2 comprende un resto de dirección que puede abordar una región de interés en un sujeto. El resto de dirección puede seleccionarse de proteínas, enzimas, péptidos, anticuerpos y fármacos. En otro ejemplo de realización del agente de contraste, Mn es un isótopo de manganeso emisor de positrones. En un ejemplo de realización del agente de contraste, el agente de contraste tiene una mayor capacidad de relajación cuando n = 2. El compuesto puede ser convertible in vivo por un agente reductor biológico (por ejemplo, glutatión) de la fórmula (I) en la que n = 3 en la fórmula (I) en la que n = 2. Como alternativa, el agente de contraste puede incluirse en un vehículo farmacéuticamente aceptable que también incluye un agente reductor para reducir el compuesto de la fórmula (I) en la que n = 3 en la fórmula (I) en la que n = 2.
Otro ejemplo no limitante de realización de la invención es un agente de contraste para imágenes de resonancia magnética. El agente de contraste comprende un compuesto de fórmula (VIa), (VIb) y (VIc):
o una sal farmacéuticamente aceptable del compuesto, en la que Ri se selecciona del grupo que consiste en alquileno sin sustituir, cicloalquileno sin sustituir, heterocicloalquileno sin sustituir, arileno sin sustituir, heteroarileno sin sustituir, dialquilenareno y dialquilenheteroareno, en la que R3 se selecciona del grupo que consiste en alquileno sin sustituir, cicloalquileno sin sustituir, heterocicloalquileno sin sustituir, arileno sin sustituir, heteroarileno sin sustituir, dialquilenareno y dialquilenheteroareno, en la que R4 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, halo, ciano, nitro, hidroxi y alcoxi, en la que X es N o NH, en la que el compuesto opcionalmente incluye agua coordinada con Mn cuando X es Nh , y en la que X se coordina con Mn cuando X es N.
En un ejemplo de realización del agente de contraste, el compuesto tiene la fórmula (VII):
Cuando el agente de contraste se expone a un entorno de pH cambiante, la capacidad de relajación aumenta cuando disminuye el pH. En otro ejemplo de realización del agente de contraste, al menos uno de R1 y R4 comprende un resto de dirección que puede abordar una región de interés en un sujeto. El resto de dirección puede seleccionarse de proteínas, enzimas, péptidos, anticuerpos y fármacos. Mn puede ser un isótopo de manganeso emisor de positrones.
En otro ejemplo de realización del agente de contraste, el compuesto tiene la fórmula (IX):
Mn puede ser un isotopo de manganeso emisor de positrones.
En otro ejemplo de realización del agente de contraste, el compuesto tiene la fórmula (X):
o una sal farmacéuticamente aceptable del compuesto, en la que R5 es una estructura central, y en la que n es un número entero de 1 a 12. La estructura central puede ser cualquier átomo o grupo de átomos que pueda formar uno o más grupos éter con estructura dentro de ( ) de fórmula (X). R5 puede ser una cadena principal cíclica. R5 puede ser un fosfazeno. En una realización, R5 es N3P3. En una realización, n es 6. Mn puede ser un isótopo de manganeso emisor de positrones. En otro ejemplo de realización del agente de contraste, el compuesto tiene la fórmula (XI):
En otro ejemplo de realización del agente de contraste, el compuesto tiene la fórmula (XII):
o una sal farmacéuticamente aceptable del compuesto. Mn puede ser un isótopo de manganeso emisor de positrones.
Cualquiera de los compuestos de fórmulas (I) a (XII) puede tener una capacidad de relajación del ion de permanganeso ri mayor de 0,3 mM-1s-1, o mayor de 0,5 mM-1s-1, o mayor de 1,0 mM-1s-1, o mayor de 1,5 mM-1s-1, o mayor de 2,0 mM-1s-1, o mayor de 2,5 mM-1s-1, o mayor de 3 mM-1s-1, o mayor de 4 mM-1s-1, o mayor de 5 mM-1s-1, o mayor de 6 mM-1s-1, o mayor de 7 mM-1s-1, o mayor de 8 mM-1s-1, o mayor de 9 mM-1s-1, o mayor de 10 mM-1s-1 medida a pH 7,4, 37 °C y 1,4 tesla.
La invención también proporciona un agente de contraste que comprende un compuesto de cualquiera de las fórmulas (I) a (XII) para su uso en un método para imágenes in vivo de un sujeto. Se espera un tiempo suficiente para permitir que el agente de contraste se acumule en un tejido o sitio celular del que se quieren tomar imágenes; y se toman imágenes de las células o tejidos con una técnica de imágenes no invasiva. Las moléculas en el sujeto que se someten al agente de contraste tienen un periodo de relajación longitudinal modificado que se refleja en la imagen. La técnica de imágenes no invasiva puede ser resonancia magnética o tomografía por emisión de positrones con resonancia magnética. Cuando la técnica de imágenes no invasiva es tomografía por emisión de positrones con resonancia magnética, se administra el agente de contraste que tiene un isótopo de manganeso emisor de positrones.
La invención proporciona un agente de contraste que comprende un compuesto de cualquiera de las fórmulas (I) a (XII) para su uso en un método de imágenes de una región de interés de un sujeto. El sujeto se coloca en un sistema de imán configurado para generar un campo magnético de polarización alrededor de al menos una parte del sujeto. Se energiza una pluralidad de espirales de gradiente configuradas para aplicar un campo de gradiente al campo magnético de polarización. Un sistema de radiofrecuencia (RF) configurado para aplicar un campo de excitación al sujeto se controla para adquirir datos de imagen de resonancia magnética (RM) del mismo, y se reconstruye una imagen de la región de interés a partir de los datos de imagen de RM. Cuando el agente de contraste tiene un isótopo de manganeso emisor de positrones, se puede usarse también una pluralidad de detectores para detectar rayos gamma emitidos desde el sujeto y comunicar las señales correspondientes a los rayos gamma detectados. Se reconstruye una serie de imágenes médicas de la región de interés del sujeto a partir de las señales.
La invención también proporciona un agente de contraste que comprende un compuesto de cualquiera de las fórmulas (I) a (Vb) en las que n es 3 (es decir, Mn está en estado de oxidación 3+) para su uso en un método para detectar un reductor biológico en un sujeto. Se espera un tiempo suficiente para permitir que el agente de contraste se acumule en un tejido o sitio celular del que se quieren tomar imágenes; y se toman imágenes de las células o tejidos con una técnica de imágenes no invasiva. Las células o tejidos que incluyen el reductor biológico (por ejemplo, glutatión) que se someten al agente de contraste tienen un periodo de relajación longitudinal modificado que se refleja en la imagen.
La invención también proporciona un agente de contraste que comprende un compuesto de cualquiera de las fórmulas (I) a (IX) para su uso en un método para detectar regiones de interés que tienen diferentes niveles de pH en un sujeto. Se espera un tiempo suficiente para permitir que el agente de contraste se acumule en un tejido o sitio celular del que se quieren tomar imágenes; y se toman imágenes de las células o tejidos con una técnica de imágenes no invasiva. Las regiones de interés en el sujeto que tiene diferentes niveles de pH que se someten al agente de contraste tienen un periodo de relajación longitudinal modificado que se refleja en la imagen. Cuando el agente de contraste se expone a un entorno de pH cambiante, la capacidad de relajación aumenta cuando disminuye el pH.
Con referencia a la figura 41, cualquiera de los agentes de contrastes de las fórmulas (I) a (XII) puede usarse con un sistema de resonancia magnética ("RM") 100. El sistema de RM 100 incluye un puesto de trabajo 102 que tiene una pantalla 104 y un teclado 106. El puesto de trabajo 102 incluye un procesador 108, tal como un equipo programable disponible en el mercado que ejecuta un sistema operativo disponible en el mercado. El puesto de trabajo 102 proporciona al operario una interfaz que posibilita introducir las prescripciones de exploración en el sistema de RM 100. El puesto de trabajo 102 se acopla a cuatro servidores: un servido de secuencia de impulsos 110 ; un servidor de adquisición de datos 112; un servidor de procesamiento de datos 114 y un servidor de almacenamiento de datos 116. El puesto de trabajo 102 y cada servidor 110, 112, 114 y 116 se conectan para que se comuniquen entre sí.
El servidor de secuencia de impulsos 110 funciona en respuesta a instrucciones descargadas desde el puesto de trabajo 102 para manejar el sistema de gradiente 118 y un sistema de radiofrecuencia ("RF") 120. Las formas de onda del gradiente necesarias para realizar la exploración prescrita se producen y aplican al sistema de gradiente 118, que excita las espirales de gradiente en un ensamblaje 122 para producir gradientes de campo magnético Gx, Gy y Gz usados para ubicar las señales de RM codificantes. El ensamble de espirales de gradiente 122 forma parte de un ensamblaje de imán 124 que se prolonga alrededor de un orificio 125 formado a través del mismo e incluye un imán de polarización 126 y una espiral de RF de cuerpo completo 128.
Se aplican formas de onda de excitación de RF a la espiral de RF 128, o una espiral local separada (no mostrada), por parte del sistema de RF 120 para realizar la secuencia de impulsos de resonancia magnética prescrita. Las señales de RM reactivas detectadas por la espiral de RF 128, o una espiral local separada (no mostrada), se reciben por el sistema de RF 120, se amplifican, se desmodulan, se filtran y se digitalizan según la instrucción de comandos producidor por el servidor de secuencia de impulsos 110. El sistema de RF 120 incluye un transmisor de RF para producir una gran diversidad de impulsos de RF usados en las secuencias de impulsos de RM. El transmisor de RF es reactivo a la prescripción de exploración y la instrucción del servidor de secuencia de impulsos 110 para producir impulsos de RF de la frecuencia, fase y forma de onda de amplitud de impulso deseadas. Los impulsos de RF generados pueden aplicarse a la espiral de RF de cuerpo completo 128 o a una o más espirales locales o matrices de espirales.
El sistema de RF 120 también incluye uno o más canales receptores de RF. Cada canal receptor de RF incluye un amplificador de RF que amplifica la señal de RM recibida por la espiral 128 a la que está conectado, y un detector que detecta y digitaliza los componentes de cuadratura I y Q de la señal de RM recibida. La magnitud de la señal de Rm recibida, por tanto, puede determinarse en cualquier punto muestreado por la raíz cuadrada de la suma de los cuadrados de los componentes I y Q:
M 
Ec.{1);
y también puede determinarse la fase de la señal de RM recibida:
El servidor de secuencia de impulsos 110 también recibe opcionalmente datos del paciente desde un controlador de adquisición fisiológica 130. El controlador 130 recibe señales desde varios detectores diferentes conectados al paciente, tales como señales electrocardiográficas ("ECG") desde electrodos, o señales respiratorias desde un expeledor u otro dispositivo de seguimiento respiratorio. Dichas señales se usan típicamente por el servidor de secuencia de impulsos 110 para sincronizar o "seleccionar" el funcionamiento del dispositivo de exploración con el latido cardiaco o respiración del sujeto.
Las muestras de señal de RM digitalizadas producidas por el sistema de RF 120 se reciben por el servidor de adquisición de datos 112. El servidor de adquisición de datos 112 funciona en respuesta a instrucciones descargadas desde el puesto de trabajo 102 para recibir los datos de RM instantáneamente y proporcionar un almacenamiento intermedio, de modo que ningún datos se pierda por sobreproducción de datos. En algunas exploraciones, el servidor de adquisición de datos 112 hace poco más que pasar los datos de RM adquiridos al servidor de procesamiento de datos 114. Sin embargo, en exploraciones que requieren información derivada de datos de RM adquiridos para controlar el rendimiento adicional de la exploración, el servidor de adquisición de datos 112 se programa para producir dicha información y transmitirla al servidor de secuencia de impulsos 110. Por ejemplo, durante preexploraciones, se adquieren datos de RM y se usan para calibrar la secuencia de impulsos realizada por el servidor de secuencia de impulsos 110.
El servidor de procesamiento de datos 114 recibe los datos de RM del servidor de adquisición de datos 112 y los procesa de acuerdo con instrucciones descargadas del puesto de trabajo 102. Las imágenes reconstruidas por el servidor de procesamiento de datos 114 se transmiten de nuevo al puesto de trabajo 102 donde se almacenan. Las imágenes instantáneas se almacenan en una antememoria de base de datos (no mostrada), desde la que se pueden emitir a la pantalla del operario 112 o una pantalla 136 que está ubicada cerca del ensamblaje de imán 124 para su uso por médicos a cargo. Se almacenan imágenes en modo de lotes o imágenes instantáneas seleccionadas en una base de datos central en almacenamiento de disco 138. Cuando dichas imágenes se han reconstruido y transferido al almacenamiento, el servidor de procesamiento de datos 114 avisa al servidor de almacenamiento de datos 116 en el puesto de trabajo 102. El puesto de trabajo 102 puede usarlo un operario para archivar las imágenes, producir películas o enviar las imágenes mediante una red a otras instalaciones.
La figura 42 representa un sistema de TEP 200 que puede usarse junto con el sistema de RM 100. El sistema de TEP 200 incluye un sistema físico de imágenes 210 que incluye un ensamblaje de anillo detector 212 alrededor de un eje
central, u orificio 214. Un puesto de trabajo del operario 216 que incluye un procesador disponible en el mercado que ejecuta un sistema operativo disponible en el mercado se comunica a través de un enlace de comunicaciones 218 con un controlador del túnel 220 para controlar el funcionamiento del sistema físico de imágenes 210.
El ensamblaje de anillo detector 212 está formado por una multitud de unidades detectoras de radiación 222 que producen una señal sensible a la detección de un fotón en la línea de comunicaciones 224 cuando se produce un acontecimiento. Un conjunto de circuitos de adquisición 226 recibe las señales y produce señales que indican las coordenadas del acontecimiento (x, y) y la energía total asociada con los fotones que provocaron el acontecimiento. Estas señales se envían a través de un cable 228 hasta un circuito localizador de acontecimientos 230. Cada circuito de adquisición 226 produce también un impulso de detección de acontecimiento que indica el momento exacto en que tuvo lugar la interacción. Otros sistemas utilizan electrónica digital sofisticada que también puede obtener esta información con respecto al instante preciso en que se produjo el acontecimiento a partir de las mismas señales usadas para obtener la energía y las coordenadas del acontecimiento.
Los circuitos localizadores de acontecimientos 230 en algunos equipamientos forman parte de un sistema de procesamiento de adquisición de datos 232 que muestrea periódicamente las señales producidas por los circuitos de adquisición 226. El sistema de procesamiento de adquisición de datos 232 incluye un controlador general 234 que controla las comunicaciones en una conexión de la tarjeta de circuitos 236 y en la red de comunicaciones general 218. Los circuitos localizadores de acontecimientos 230 reúnen la información con respecto a cada acontecimiento válido en un conjunto de números que indican de manera precisa el momento en que tuvo lugar el acontecimiento y la posición en que se detectó el acontecimiento. Este paquete de datos de acontecimiento se transmite a un detector de coincidencia 238 que también forma parte del sistema de procesamiento de adquisición de datos 232.
El detector de coincidencia 238 aceta los paquetes de datos de acontecimiento procedentes del circuito localizador de acontecimientos 230 y determina si dos cualesquiera de ellos están en coincidencia. La coincidencia se determina por varios factores. En primer lugar, los marcadores de tiempo en cada paquete de datos de acontecimiento deben estar dentro de una ventana de tiempo predeterminada, por ejemplo, 0,5 nanosegundos o incluso hasta picosegundos. En segundo lugar, las ubicaciones indicadas por los dos paquetes de datos de acontecimiento deben recaer sobre una línea recta que pase a través del campo de visión en el orificio de dispositivo de exploración 214. Los acontecimientos que no pueden emparejarse los descarta el detector de coincidencia 238, pero se localizan los pares de acontecimientos coincidentes y se registran como un paquete de datos de coincidencia. Estos paquetes de datos de coincidencia se proporcionan a un clasificador 240. La función del clasificador en muchos sistemas tradicionales de imágenes por TEP es recibir los paquetes de datos de coincidencia y generar direcciones de memoria a partir de los paquetes de datos de coincidencia para el almacenamiento eficaz de los datos de coincidencia. En ese contexto, el conjunto de todos los rayos de proyección que apuntan en la misma dirección (0) y pasan a través del campo de visión (FOV) del dispositivo de exploración es una proyección completa o "representación visual". La distancia (R) entre un rayo de proyección particular y el centro del FOV ubica ese rayo de proyección dentro del FOV. El clasificador 240 cuenta todos los acontecimientos que se producen en un rayo de proyección dado (R, 0) durante la exploración clasificando los paquetes de datos de coincidencia que indican un acontecimiento en los dos detectores que recae sobre este rayo de proyección. Los recuentos de coincidencia se organizan, por ejemplo, como un conjunto de matrices bidimensionales, una por cada plano de imagen axial, y teniendo cada una como una de sus dimensiones el ángulo de proyección 0 y la otra dimensión la distancia R. Este mapa de 0 por R de los acontecimientos medidos es denomina histograma o, más comúnmente, una matriz de sinografía. Son estas sinografías las que se procesan para reconstruir imágenes que indiquen el número de acontecimientos que tuvieron lugar en cada ubicación de píxel de la imagen durante la exploración. El clasificador 240 cuenta todos los acontecimientos que se producen a lo largo de cada rayo de proyección (R, 0) y los organiza en una matriz de datos de imagen.
El clasificador 240 proporciona conjuntos de datos de imagen a un sistema de procesamiento/reconstrucción de imagen 242, por ejemplo, por medio de un enlace de comunicaciones 244 para que se almacenen en una matriz de imagen 246. Las matrices de imagen 246 mantienen los conjuntos de datos respectivos para su acceso por un procesador de imágenes 248 que reconstruye las imágenes. El sistema de procesamiento/reconstrucción de imagen 242 puede comunicarse con y/o integrarse con el puesto de trabajo 216 u otros puestos de trabajo remotos.
La invención se ilustra adicionalmente en los siguientes ejemplos que se presentan con fines de ilustración y no de limitación.
Ejemplos
Ejemplo 1
Parte experimental
General
Materiales e instrumentos. Todos los productos químicos y disolventes se adquirieron comercialmente y se usaron sin purificación adicional. Los espectros de RMN se registraron en espectrómetros Varian de 500 MHz o 400 MHz. Los
desplazamientos químicos se presentan en 8 (ppm). Para los espectros de RMN de 1H y 13C, los picos de disolvente residual se usaron como referencia interna, excepto para la RMN de 13C del ligando donde el ferc-butanol se usó como referencia interna.
Se realizó cromatografía de líquidos-espectrometría de masas por electronebulización (CL-EM) usando un aparato Agilent 1100 Series con una trampa de CL/DSM y detector dinodal de conversión Daly con detección UV a 220, 254 y 280 nm. Los métodos usados en este sistema son los siguientes: (a) columna Luna C18 (100 x 2 mm); eluyente A: H2O/ácido fórmico al 0,1 %, B: MeCN/ácido fórmico al 0,1 %; gradiente: 5 % de B a 95 % de B en 9 minutos; caudal 0,8 ml/min (usado para la caracterización de compuestos orgánicos), y (b) columna Kromasil C18 (250 x 4,6 mm); eluyente C: MeCN al 95 %/acetato amónico 10 mM al 5 %, D: acetato de amonio 10 mM; gradiente de 5 % de C a 8 % de C en 14 minutos; caudal 0,8 ml/min (usado para la caracterización de complejos de manganeso). La purificación semipreparativa en fase inversa se realizó en un sistema de HPLC Rainin Dynamax con detección UV a 254 nm usando una columna Polaris C18. El método usado para la purificación es de la siguiente manera: La fase móvil A era tampón acetato de amonio 50 mM, pH 6,5 y la fase móvil B era una mezcla de tampón acetato de amonio 50 mM al 5 %, pH 6,5/MeCN al 95 %. Partiendo de 5 % de B, la fracción de B aumentó hasta 8 % en 23 minutos. La columna se lavó con 100 % de B durante 2 minutos y después se desniveló hasta 5 % de B. El sistema se volvió a equilibrar a 5 % de B durante 3 minutos. Las mediciones de la capacidad de relajación se realizaron en un Bruker mq60 Minispec en 1,4 T y 37 °C. Las concentraciones de manganeso se determinaron usando un sistema de EM-PAI Agilent 7500a. Todas las muestras se diluyeron con Triton X-100 al 0,1 % en ácido nítrico al 5 % que contenía 20 ppmm de Lu (como patrón interno). La relación de Mn (54,94)/Lu(174,97) se usó para cuantificar la concentración de manganeso. Se generó una curva de calibración lineal que variaba de 0,1 ppmm a 200 ppmm diariamente para la cuantificación. Los espectros de UV-Vis se registraron en un espectrofotómetro SpectraMax M2 usando cubeta de cuarzo con una longitud de trayecto de 1 cm. La voltamperimetría de MnIIHBET, MnIIEDTA y MnmHBET se registró usando un potenciostato Nuvant EZstat pro en tampón TRIS (pH = 7,4), que contenía KNO30,5 M como electrolito de soporte, a una tasa de exploración de 100 mVs-1. Se usó carbono vítreo como electrodo de trabajo, Ag/AgCl sirvió como electrodo de referencia y se usó hilo de Pt como electrodo auxiliar. El par de K4FeCN6/K3FeCN6 se usó como patrón interno.
Estudio relaxométrico. T1 se midió con una secuencia de impulsos de recuperación de inversión que soporta 10 tiempos de inversión. La capacidad de relajación se determinó a partir de la pendiente de un diagrama de 1/T1 frente a la concentración en tampón TRIS, pH = 7,4 a 37 °C. La concentración de manganeso en cada solución de reserva se determinó usando EM-PAI.
Estequiometría de Mn:ligando: La composición de TFA de la especie de ligando y la cantidad de ligando necesaria para quelar completamente todo el Mn(II) en solución se determinó de acuerdo con el siguiente ejemplo: a muestras de 500 pl de MnCl20,91 mM en tampón de pH 7,40 (TRIS 25 mM) (0,45 pmol presentes en cada una), se añadieron pociones cada vez más grandes de 341,45 mM (de 0 a 675 pl en incrementos de 75 pl; 1,09 pmol presentes en cada porción de 75 pl). El valor de T2 de cada muestra se midió posteriormente y se representó la relajación como una relación de ligando a metal (figura 35). El punto de consumo total de Mn se determinó en el punto donde r2 dejaba de disminuir con ligando añadido.
Para sondear la especiación de los complejos de manganeso en solución, se realizaron valoraciones de pH de Mn2+:ligando 1:1 usando a NaOH 1 N en atmósfera de N2 (figura 21).
Para determinar la especie que existe en estos dos intervalos de pH se controló el espectro UV como una función del pH (véanse las figuras 22-24). La desprotonación del resto fenol para formar ion de fenóxido produce bandas UV características que indican que Mn-HBET y Mn-HBET-OMe se protonan a menor pH y la protonación se produce en el fenol. Según se aumenta el pH, se desprotona el fenol y se coordina con el centro de manganeso.
La especiación en solución también se controló midiendo la relajación de los protones de agua en 1,4 T. La figura 24 muestra el cambio de relajación frente al pH para los tres sistemas de ligando. El cambio en la relajación es coherente con la especiación dependiente del pH como se observa en los estudios de UV.
Experimentos cinéticos para la reacción de reducción. Se realizó esta serie de experimentos cinéticos a 37 °C (pH 7,4) para determinar la ley empírica de velocidad para la reducción de MnIII-HBET por glutatión. El complejo de MnIII-HBET posee una banda de fuerte absorbancia a 375 nm (£ = 1,38 *103 M-1 cm'1) en agua que no está presente en el espectro UV del complejo de MnII-HBET. Este rasgo se usó para controlar la reducción de MnIII-HBET a lo largo del tiempo. Se midieron las velocidades de reacción iniciales a tres concentraciones diferentes de glutatión (5 mM, 10 mM y 20 mM). Adicionalmente, para cada concentración de glutatión, la reacción se realizó a cuatro diferentes concentraciones iniciales de MnIII-HBET (0,3 mM, 0,4 mM, 0,5 mM y 0,6 mM). Usando un gran exceso de glutatión en estos experimentos, se descubrió que la reacción se comportaba de seudoprimer orden con respecto al complejo de MnIII-HBET como se expresa en la ecuación S1.
Aquí, la constante de velocidad observada (kobs) es simplemente el producto de la constante de velocidad real (k) y [GSH], t es el tiempo, y los subíndices "t" y "o" se refieren a la concentración en el tiempo "t" o la concentración inicial,
respectivamente. La figura 14 muestra dos conjuntos de experimentos cinéticos en que se ha representado el log natural de [Mnm-HBET]f como una función del tiempo. De esta manera, la pendiente de cada línea es igual a - ^[GSH] y la intersección es /n[Mnm-HBET]o. Basándonos en estos experimentos, determinamos que la reacción era de primer orden tanto en [GSH] como en [Mnm-HBET] con una constante de velocidad de segundo orden global de (3,8 ± 0,3)*10'1 m-1 s i
Oxidación de MnIIHBET con peróxido de hidrógeno. Se hizo seguimiento de la oxidación de MnIIHBET con H2O2 (1 mM) en tampón TRIS (pH = 7,4) usando espectroscopia UV-Vis, mediciones de la capacidad de relajación y CL-EM. A diferencia de la reducción de MnmHBET con glutatión, parece que la reacción de oxidación alcanza el equilibrio después de una conversión del 70 % en MnmHBET calculada a partir de los datos de CL-EM.
Imágenes de RM. Se tomaron imágenes de RM usando un sistema Bruker Biospec 4,7 T. Se colocaron tres muestras (~500 |jl) en un portamuestras casero y se tomaron imágenes usando una espiral de volumen. Matriz de adquisición = 64 x 256 para resolución en el plano de 0,234 x 0,312 mm2; grosor del corte = 5 mm. Se obtuvieron imágenes ponderadas a Ti con una secuencia de ecos en gradiente de disparo rápido de bajo ángulo (FLASH): TR/TE/FA= 20/5,44/40° con 8 promedios. T1 se determinó usando una secuencia de recuperación de inversión de eco de reenfoque de adquisición rápida 2D (RARE): TR = 3200 ms, TE = 9,7 ms. Tiempos de inversión (TI): 5, 45, 85, 165, 325, 645, 1285, 1925 y 3205 ms. T1 se obtuvo a partir de un ajuste de mínimos cuadrados no lineal de la curva de la intensidad de la señal (SI(t)) frente a TI donde T1, SI(0) y a son parámetros ajustables, ecuación S2.
Estabilidad de complejos de MnIIHBET y MnIIIHBET. La estabilidad de los complejos de manganeso se midió en diferentes tampones usando concentraciones similares a las encontradas en el plasma sanguíneo (tampón fosfato 1 mM, tampón bicarbonato de sodio 25 mM y tampón citrato 0,1 mM). Se incubó una solución, 0,5 mM, del complejo de manganeso en los tampones respectivos a 37 °C (pH = 7,4) y entonces las especies se cuantificaron en CL-EM usando el método que se describe anteriormente. Los complejos de manganeso (0,5 mM) también se trataron con EDTA (0,5 mM) en tampón TRIS (pH = 7,4) y se incubaron a 37 °C durante 1 hora. Entonces las especies se cuantificaron en CL-EM usando el método que se describe anteriormente.
Cinética de transmetalación en Zn(II). El desplazamiento de Mn(II) por Zn(II) se midió controlando la evolución de la concentración de Mn(II) libre por relaxometría de T2. Se expuso un complejo de Mn(II) 1 mM a Zn(OTf)225 mM en tampón MES 50 mM (pH 6,00). Los datos de r2 se ajustaron a la siguiente ecuación
Síntesis
Materiales e instrumentos. Todos los productos químicos y disolventes se adquirieron comercialmente y se usaron sin purificación adicional. Los espectros de RMN se registraron en espectrómetros Varian de 500 MHz o 400 MHz. Los desplazamientos químicos se presentan en 8 (ppm). Para los espectros de RMN de 1H y 13C, los picos de disolvente residual se usaron como referencia interna, excepto para la RMN de 13C del ligando donde el butanol terciario se usó como referencia interna. Se realizó cromatografía de líquidos-espectrometría de masas por electronebulización (CL-EM) usando un aparato Agilent 1100 Series con una trampa de CL/DSM y detector dinodal de conversión Daly con detección UV a 220, 254 y 280 nm. Los métodos usados en este sistema son los siguientes: (a) columna Luna C18 (100 x 2 mm); eluyente A: H2O/ácido fórmico al 0,1 %, B: MeCN/ácido fórmico al 0,1 %; gradiente: 5 % de B a 95 % de B en 9 minutos; caudal 0,8 ml/min (usado para la caracterización de compuestos orgánicos), y (b) columna Kromasil C18 (250 x 4,6 mm); eluyente C: MeCN al 95 %/acetato amónico 10 mM al 5 %, D: acetato de amonio 10 mM; gradiente de 5 % de C a 8 % de C en 14 minutos; caudal 0,8 ml/min (usado para la caracterización de complejos de manganeso). La purificación semipreparativa en fase inversa se realizó en el sistema de HPLC Rainin Dynamax con detección UV a 254 nm usando una columna Polaris C18. El método usado para la purificación es de la siguiente manera: La fase móvil A era tampón acetato de amonio 50 mM, pH 6,5 y la fase móvil B era una mezcla de tampón acetato de amonio 50 mM al 5 %, pH 6,5/MeCN al 95 %. Partiendo de 5 % de B, la fracción de B aumentó hasta 8 % en 23 minutos. La columna se lavó con 100 % de B durante 2 minutos y después se desniveló hasta 5 % de B. El sistema se volvió a equilibrar a 5 % de B durante 3 minutos. Las mediciones de la capacidad de relajación se realizaron en un Bruker mq60 Minispec en 1,4 T y 37 °C. Las concentraciones de manganeso se determinaron usando un sistema de EM-PAI Agilent 7500a. Todas las muestras se diluyeron con Triton X-100 al 0,1 % en ácido nítrico al 5 % que contenía 20 ppmm de Lu (como patrón interno). La relación de Mn (54,94)/Lu (174,97) se usó para cuantificar la concentración de manganeso. Se generó una curva de calibración lineal que variaba de 0,1 ppmm a 200 ppmm diariamente para la cuantificación. Los espectros de UV-Vis se registraron en un espectrofotómetro SpectraMax m 2 usando cubeta de cuarzo con una longitud de trayecto de 1 cm. El pH se midió usando un pehachímetro ThermoOrion conectado a un electrodo vítreo VWR Symphony.
La síntesis de ácido 2'-((2-((carboximetil)(2-hidroxibencil)amino)etil)azanodiil)diacético (HBET) (3) se muestra en la figura 6.
(2-((2-Hidroxibencil)amino)etil)carbamato de ferc-butilo (1): A una solución de salicilaldehído (12 mmol, 1,465 g) en 90 ml de metanol, se le añadió una solución de N-(2-aminoetil)carbamato de ferc-butilo (12 mmol, 1,923 g) en metanol (30 ml) y la solución se agitó durante 1 hora. A esta solución en agitación se le añadió NaBH4 sólido (24 mmol, 0,908 g). Se observó evolución rápida de gas y la solución se volvió incolora desde un amarillo pálido. Después de agitar durante 3 horas, todos los volátiles se retiraron a presión reducida, y se obtuvo un sólido blanco. El residuo se disolvió en 200 ml de CH2Cl2, se extrajo con 200 ml de solución saturada de NaHCO3. La capa acuosa se extrajo con CH2Ch (2 x 100 ml). Todos los orgánicos se combinaron, se lavaron con salmuera (200 ml) y se secaron sobre MgSO4 anhidro. El disolvente se evaporó a presión reducida para obtener 1 como un sólido amarillo pálido (2,116 g, 97 %). 1H RMN (500 MHz, CDCh) 8 (ppm): 7,16 (t, J = 7,65 Hz, 1H), 6,99 (d, J = 7,48 Hz, 1H) 6,83 (d, J= 8,13 Hz, 1H), 6,77 (t, J = 7,41 Hz, 1 H), 4,01 (s, 2H), 3,30 (m, 2H2,79 (t, J= 5,82 Hz, 2H), 1,44 (s, 9H). 13C{1H} RMN (100 MHz, CDCla) 8 (ppm): 157,9,156,2, 128,5, 128,3, 122.4, 118,9, 116,1,79,2, 52,1, 48,2, 39,8, 28,3 Peso molecular para C14H22N2O3: 266,34. EM (IEN) m/z: calculado: 267,17 (M+H)+ observado: 267,1.
2,2'(2-((2-(ferc-Butoxi)-2-oxoetil)(2-((ferc-butil-dimetilsilil)oxi)-bencil)amino)etil)azanodiil)diacetato de di-ferc-butilo (2): Se disolvió 1 (7,94 mmol, 2 116 g) en CH2Ch (100 ml) seguido de la adición de 50 ml de ácido trifluoroacético. La reacción se agitó durante 5 horas, y después los volátiles se retiraron a presión reducida. El residuo se disolvió en agua (40 ml) y se lavó con éter (3 x 40 ml). La fracción acuosa se liofilizó para producir la amina libre cuantitativamente como un sólido blanco, que se usó en la reacción posterior sin purificación adicional.
El matraz de fondo redondo que contenía la amina se cargó con nitrógeno, se añadió CH2Ch seco (80 ml) y se enfrió en un baño de hielo. En contraflujo de argón se añadió N,N-diisopropiletilamina (39,70 mmol, 6,91 ml), seguido de la adición de cloruro de ferc-butildimetilsililo (8,73 mmol, 1,315 g) como una solución en CH2Ch (10 ml). La solución se dejó calentar hasta temperatura ambiente y se agitó durante 5 horas. La reacción se enfrió de nuevo hasta 0 °C y se añadió gota a gota bromoacetato de ferc-butilo (24,61 mmol, 3,63 ml) y la reacción se agitó durante 18 horas en atmósfera de nitrógeno. La solución se diluyó con CH2Ch (200 ml) y se lavó con NaHCO3 saturado (3 x 200 ml) y salmuera (1 x 200 ml). Todos los orgánicos se combinaron y se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro y se evaporaron a presión reducida para obtener aceite amarillo en bruto. El producto se purificó como un aceite incoloro (1,234 g, 25 %) usando cromatografía en columna (eluyente - hexano/acetato de etilo, 9:1). 1H RMN (400 MHz, CDCh) 8 (ppm): 7,43 (dd, Ji = 1,31 Hz, J2 = 7,57, 1 H), 7,04 (dt, Ji = 1,71 Hz, J2 = 7,80, 1 H), 6,88 (t, J = 7,51 Hz, 1 H), 6,72 (d, J = 7,93 Hz, 1 H), 3,76 (s, 2H), 3,40 (s, 4H), 3,29 (s, 2H), 2,81 (m, 4H), 1,41 (s, 9H), 1,40 (s, 18H), 0,98 (s, 9H), 0,18 (s, 6H). 13C{1H} RMN (100 MHz, CDCh) 8 (ppm): 171,1, 170,7, 153,7, 130,1, 129,8, 127,4, 121,1, 118,4, 80,6, 80,4, 56,1, 55,9, 52, 52,4, 28,2, 25,9, 18,3, 4,1. Peso molecular para C33H58SN2OySi: 622,91. MS (ESI) m/z: Calculado: 623,41 (M+H)+ observado: 623,4.
Ácido 2,2'-((2-((carboximetil)(2-hidroxibencil)amino)etil)azanodiil)diacético (HBET) (3): Se disolvió 2 (1,98 mmol, 1,234 g) en ácido trifluoroacético (40 ml) seguido de la adición de triisopropilsilano (2,35 ml), 1-dodecanotiol (2,35 ml) y agua (2,35 ml). La reacción se agitó durante 5 horas, y después los volátiles se retiraron a presión reducida. El residuo se disolvió en agua (40 ml) y se lavó con éter (3 x 40 ml). La fracción acuosa se liofilizó para producir (3) cuantitativamente como un sólido blanco. 1H RMN (500 MHz, D20) 8 (ppm): 7,44 (m, 2H, Ar-H), 7,03 (m, 2H) 4,57 (s, 2H), 4,04 (s, 2H), 3,66 (s, 4H), 3,54 (t, J = 6,09 Hz, 2H), 3,35 (t, J = 5,9 Hz, 2H). 13C{1H} RMN (125 MHz, D20) 8 (ppm): 174,1, 169,9, 156,3, 133,6, 133,0, 121.5, 116,6, 116,3, 55,6, 54,8, 52,0, 49,9. Peso molecular para C15H20N2O7: 340,33. MS (ESI) m/z: Calculado: 341,13 (M+H)+; observado: 341,1.
Na2[MnIIHBET] (4): Se disolvió 3 (0,26 mmol, 0,089 g) en 5 ml de agua. El pH se ajustó a 8 usando solución de hidróxido de sodio 1 N. Después se añadió M n C h ^ ^ O (0,26 mmol, 0,051 g) a la solución y el pH se ajustó cuidadosamente hasta 5. La reacción se agitó durante 1 hora, se filtró y se liofilizó para producir un sólido blanco. El complejo se inyectó en una columna C18 (Polaris) en fase inversa y se desaló usando el método que se describe anteriormente. Las fracciones se recogieron y se liofilizaron para producir 4 como un sólido blanco (0,095 g, 84 %). Peso molecular para C15H1sMnN2O7: 393,25. MS (ESI) m/z: Calculado: 394,26 (M+3H)+ observado: 394,1.
Na[MnmHBET] (5): Se disolvió 3 (0,15 mmol, 0,05 g) en 5 ml de agua. El pH se ajustó a 8 usando solución de hidróxido de sodio 1 N. Después se añadió M n C h ^ ^ O (0,15 mmol, 0,030 g) a la solución y el pH se ajustó hasta 12. La solución se dejó en agitación durante 1 hora. La solución después se filtró a través de un filtro de 0,45 pm para retirar el MnO2, el pH se ajustó hasta 11 y la solución se agitó durante 18 horas. Se hizo seguimiento de la reacción usando CL-EM analítica y la reacción se detuvo cuando se observó conversión del 70 % en la especie de Mnm. La mezcla se inyectó en una columna C18 (Polaris) en fase inversa y se purificó usando el método que se describe anteriormente. Las fracciones se recogieron y se liofilizaron para producir 5 como un sólido pardo (0,023 g, 38 %). Peso molecular para C-isH-i/Mn^Oy: 392,24. MS (ESI) m/z: Calculado: 393,25 (M+2H)+ observado: 393,1.
(2-((2-Hidroxi-5-metoxibencil)aminoetil)carbamato de ferc-butilo (6): A una solución de 2-hidroxi-5-metoxibenzaldehído (12 mmol, 1,826 g) en 90 ml de metanol, se le añadió una solución de N-(2-aminoetil)carbamato de ferc-butilo (12 mmol, 1,923 g) en metanol (30 ml) y la solución se agitó durante 1 hora. A esta solución en agitación se le añadió NaBH4 sólido (24 mmol, 0,908 g). Se observó evolución rápida de gas y la solución se volvió incolora desde un amarillo pálido. Después de agitar durante 3 horas, todos los volátiles se retiraron a presión reducida, y se obtuvo un sólido blanco. El residuo se disolvió en 200 ml de CH2Ch, se extrajo con 200 ml de solución saturada de NaHCO3. La capa acuosa se extrajo con CH2Cl2 (2 x 100 ml). Todos los orgánicos se combinaron, se lavaron con salmuera (200 ml) y se secaron sobre MgSO4
anhidro. El disolvente se evaporó a presión reducida para obtener 6 como un sólido amarillo pálido (3,485 g, 98 %). 1H RMN (500 MHz, CDCh) 8 (ppm): 6,76 (m, 1H) 6,72 (m, 1H), 6,57 (d, J = 2,91 Hz, 1 H), 5,30 (s, 1 H), 3,97 (s, 2H), 3,73 (s, 3H), 3,28 (m, 2H), 2,78 (t, J = 5,72 Hz, 2H), 1,44 (s, 9H). 13C{1H} RMN (100 MHz, CDCh) 8 (ppm): 156,2, 152,3, 151,7, 123,1, 116,5, 114,2, 113,5, 79,3, 55,6, 52,2, 48,3, 39,9, 28.. Peso molecular para C15H24N2O4: 296,36. MS (ESI) m/z: Calculado: 297,37 (M+H)+; observado: 297,4.
2,2'-((2-((2-(ferc-Butoxi)-2-oxoetil)(2-((ferc-butil-dimetilsilil)oxi)-5-metoxibencil)amino)etil)azanodiil)diacetato de di-fercbutilo (7): Se disolvió 6 (8,00 mmol, 2,371 g) en CH2Ch (100 ml) seguido de la adición de 50 ml de ácido trifluoroacético. La reacción se agitó durante 5 horas, y después los volátiles se retiraron a presión reducida. El residuo se disolvió en agua (40 ml) y se lavó con éter (3 x 40 ml). La fracción acuosa se liofilizó para producir la amina libre cuantitativamente como un sólido amarillo pálido, que se usó en la reacción posterior sin purificación adicional.
El matraz de fondo redondo que contenía la amina se cargó con nitrógeno, se añadió CH2Ch seco (80 ml) y se enfrió en un baño de hielo. En contraflujo de argón se añadió N,N-diisopropiletilamina (40,00 mmol, 6,97 ml), seguido de la adición de cloruro de ferc-butildimetilsililo (8,80 mmol, 1,326 g) como una solución en CH2Ch (10 ml). La solución se dejó calentar hasta temperatura ambiente y se agitó durante 5 horas. La reacción se enfrió de nuevo hasta 0 °C y se añadió gota a gota bromoacetato de ferc-butilo (24,80 mmol, 3,66 ml) y la reacción se agitó durante 18 horas en atmósfera de nitrógeno. La solución se diluyó con CH2Ch (200 ml) y se lavó con NaHCO3 saturado (3 x 200 ml) y salmuera (1 x 200 ml). Todos los orgánicos se combinaron y se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro y se evaporaron a presión reducida para obtener aceite amarillo en bruto. El producto se purificó como un aceite incoloro (1,462 g, 28 %) usando cromatografía en columna (eluyente - hexano/acetato de etilo, 9:1). 1H RMN (400 MHz, CDCh) 8 (ppm): 7,04 (d, J = 3,26 Hz, 1 H), 6,62 (m, 1 H), 6,57 (m, 1 H), 3,71 (s, 2H), 3,70 (s, 3H), 3,40 (s, 4H,), 3,27 (s, 2H), 2,79 (m, 4H), 1,40 (s, 9H), 1,37 (s, 18H), 0,94 (s, 9H), 0,13 (s, 6H). 13C{1H} RMN (100 MHz, CDCh) 8 (ppm): 171., 170,8, 154,1, 147,4, 130,8, 119,2, 114,7, 113,0, 80,8, 80,6, 56,3, 56,1, 55,6, 53,1, 52,8, 52,7, 28,3, 28,2, 26,0, 18,4. Peso molecular para C34H60N2OaSi: 652,93. MS (ESI) m/z: Calculado: 653,94 (M+H)+; observado: 653,9.
Ácido 2,2'-(2-((carboximetil)(2-hidroxi-5-metoxibencil)amino)etil)azanodiil)diacético (HBET-OMe) (8): Se disolvió 7 (2,24 mmol, 1,462 g) en ácido trifluoroacético (40 ml) seguido de la adición de triisopropilsilano (2,35 ml), 1-dodecanotiol (2,35 ml) y agua (2,35 ml). La reacción se agitó durante 5 horas, y después los volátiles se retiraron a presión reducida. El residuo se disolvió en agua (40 ml) y se lavó con éter (3 x 40 ml). La fracción acuosa se liofilizó para producir 8 cuantitativamente como un sólido blanco. 1H RMN (500 MHz, D2O) 8 (ppm): 7,02 (m, 2H) 6,95 (m, 1H) 4,52 (5, 2H), 4,09 (s, 2H), 3,80 (s, 3H), 3,58 (s, 4H), 3,48 (m, 2H), 3,26 (m, 2H). 13C{1H} RMN (125 MHz, D2O) 8 (ppm): 173,6, 169,0, 152,5, 149,6, 117,9, 117,6, 117,0, 116,4, 55,9, 54,8, 51,5, 49,0. Peso molecular para C16H22N2O8: 370,35. MS (ESI)m/z: Calculado: 371 36 (M+H)+ observado: 371,4.
Na2[MnIIHBET-OMe] (9): Se disolvió 8 (0,23 mmol, 0,085 g) en 5 ml de agua. El pH se ajustó a 8 usando solución de hidróxido de sodio 1 N. Después se añadió M n C h ^ ^ O (0,23 mmol, 0,046 g) a la solución y el pH se ajustó cuidadosamente hasta 5. La reacción se agitó durante 1 hora, se filtró y se liofilizó para producir un sólido blanco. El complejo se inyectó en una columna C18 (Polaris) en fase inversa y se desaló usando el método que se describe anteriormente. Las fracciones se recogieron y se liofilizaron para producir 9 como un sólido blanco (0,090 g, 81 %). Peso molecular para C16H22MnN2Os: 423,28. MS (ESI) m/z: Calculado: 424,28 (M+3H)+; observado: 424,3.
(2-((2-Hidroxi-5-nitrobencil)amino)etil)carbamato de ferc-butilo (10): A una solución de 2-hidroxi-5-nitrobenzaldehído (3,51 mmol, 0,587 g) en 60 ml de metanol, se le añadió una solución de N-(2-aminoetil)carbamato de ferc-butilo (3,51 mmol, 0,562 g) en metanol (30 ml) y la solución se agitó durante 1 hora. A esta solución en agitación se le añadió NaBH4 sólido (7,02 mmol, 0,266 g). Se observó evolución rápida de gas y la solución se volvió incolora desde un amarillo pálido. Después de agitar durante 3 horas, todos los volátiles se retiraron a presión reducida, y se obtuvo un sólido blanco. El residuo se disolvió en una mezcla de disolventes de 10 ml de metanol y 200 ml de CH2Ch y se extrajo con 200 ml de solución saturada de NaHCO3. La capa acuosa se extrajo con CH2Ch (2 x 100 ml). Todos los orgánicos se combinaron, se lavaron con salmuera (200 ml) y se secaron sobre MgSO4 anhidro. El disolvente se evaporó a presión reducida para obtener 10 como un sólido amarillo (1,01 g, 93 %). 1H RMN (500 MHz, (CDa^SO) 8 (ppm): 8,01 (d, J = 3,0 Hz, 1 H) 7,92 (dd, Ji = 3,00 Hz, J2 = 9,2 Hz, 1 H), 6,92 (t, J = 5,8 Hz, 1 H), 6,46 (d, J = 9,2 Hz, 1 H), 3,93 (s, 2H), 3,14 (m, 2H), 2,75 (t, J = 6,3 Hz, 2H), 1,38 (s, 9H). 13C{1H} RMN (100 MHz, CDCla) 8 (ppm): 172,1, 155,7, 133,6, 126,1, 126,0, 121,9, 117,3, 77,9, 48,7, 46,7, 37,9, 28,2. Peso molecular para C14H21N3O5: 311,33. MS (ESI) m/z: Calculado: 312,34 (M+H)+; observado: 312,4.
2,2'-((2-((2-(ferc-Butoxi)-2-oxoetil)(2-((ferc-butil-dimetilsilil)oxi)-5-nitrobencil)amino)etil)azanodiil)diacetato de di-ferc-butilo (11): Se disolvió 10 (3,24 mmol, 1,01 g) en CH2Ch (100 ml) seguido de la adición de 50 ml de ácido trifluoroacético. La reacción se agitó durante 5 horas, y después los volátiles se retiraron a presión reducida. El residuo se disolvió en agua (40 ml) y se lavó con éter (3 x 40 ml). La fracción acuosa se liofilizó para producir la amina libre cuantitativamente como un sólido amarillo pálido, que se usó en la reacción posterior sin purificación adicional.
El matraz de fondo redondo que contenía la amina se cargó con nitrógeno, se añadió dimetilformamida seca (40 ml) y se enfrió en un baño de hielo. En contraflujo de argón se añadió N,N-diisopropiletilamina (16,2 mmol, 2,82 ml), seguido de la adición de cloruro de ferc-butildifenilsililo (3,56 mmol, 0,979 g) como una solución en dimetilformamida (5 ml). La solución se dejó calentar hasta temperatura ambiente y se agitó durante 5 horas. La reacción se enfrió de nuevo hasta
0 °C y se añadió gota a gota bromoacetato de ferc-butilo (10,04 mmol, 1,48 ml) y la reacción se agitó durante 18 horas en atmósfera de nitrógeno. La solución se diluyó con CH2Cl2 (200 ml) y se lavó con NaHCO3 saturado (3 x 200 ml) y salmuera (1 x 200 ml). Todos los orgánicos se combinaron y se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro y se evaporaron a presión reducida para obtener aceite amarillo en bruto. El producto se purificó como un aceite incoloro (0,615 g, 24 %) usando cromatografía en columna (eluyente - hexano/acetato de etilo, 9:1). 1H RMN (400 MHz, CDCh) 8 (ppm): 8,50 (d , J = 2,9 Hz, 1 H), 7,67 (m, 5H), 7,45 (m, 1H), 7,39 (m, 5H), 6,40 (d , 2H, J = 2,9 Hz, 1 H), 4,08 (s, 2H), 3,48 (s, 4H), 3,44 (s, 2H), 2,93 (s, 4H), 1,48 (s, 9H), 1,43 (s, 18H), 1,1194 (s, 9H). 13C{1H} RMN (100 MHz, CDCh) 8 (ppm): 170,8, 159,0, 142,1, 135,3, 131,4, 130,5, 128,2, 125,6, 123,3, 118,7, 81,1, 81,0, 56,5, 56,2, 53,0, 52,8, 52,7, 28,2, 26,5, 19,7. Peso molecular para C43H6-iN3OgSi: 792,04. MS (ESI) m/z.Calculado: 793,05 (M+H)+, observado: 793,1.
Ácido 2,2-((2-((carboximetil)(2-hidroxi-5-nitrobencil)amino)etil)azanodiil)diacético (HBET-NO2) (12): Se disolvió 11 (0,776 mmol, 0,615 g) en ácido trifluoroacético (40 ml) seguido de la adición de triisopropilsilano (2,35 ml), 1-dodecanotiol (2,35 ml) y agua (2,35 ml). La reacción se agitó durante 5 horas, y después los volátiles se retiraron a presión reducida. El residuo se disolvió en agua (40 ml) y se lavó con éter (3 x 40 ml). La fracción acuosa se liofilizó para producir 12 cuantitativamente como un sólido blanco. 1H RMN (500 MHz, D2O) 8 (ppm): 8,33 (m, 1H), 8,22 (m, 1H), 7,06 (d, J = 9,0 Hz, 1 H), 4,57 (s, 2H), 4,07 (s, 2H), 3,60 (s, 4H), 3,49 (m, 2H), 3,27 (m, 2H). 13C{1H} RMN (125 MHz, D2O) 8 (ppm): 173,5, 169,1, 162,2, 140,1, 129,1, 128,0, 116,7, 116,0, 54,8, 54,0, 51,9, 49,2. Peso molecular para C15H19N3O9: 385,33. MS (ESI) m/z.Calculado: 386,33 (M+H)+; observado: 386,4.
Na2[MnIIHBET-NO2] (13): Se disolvió 12 (0,25 mmol, 0,096 g) en 5 ml de agua. El pH se ajustó a 8 usando solución de hidróxido de sodio 1 N. Después se añadió M n C h ^ ^ O (0,25 mmol, 0,049 g) a la solución y el pH se ajustó cuidadosamente hasta 5. La reacción se agitó durante 1 hora, se filtró y se liofilizó para producir un sólido blanco. El complejo se inyectó en una columna C18 (Polaris) en fase inversa y se desaló usando el método que se describe anteriormente. Las fracciones se recogieron y se liofilizaron para producir 13 como un sólido amarillo claro (0,102 g, 82 %). Peso molecular para C15H17MnN3O9: 438,25. MS (ESI) m/z: Calculado: 439,26 (M+3H)+; observado: 439,4.
Na[MnmHBET-NO2] (14): Se añadió MnF3 (0,006 g, 0,054 mmol) a 12 (0,021 g, 0,054 mmol) agitando en 5 ml de H2O a pH 8. La solución roja anaranjada resultante se inyectó en una columna C18 (Polaris) en fase inversa y se purificó usando el método que se describe anteriormente. Las fracciones se recogieron y se liofilizaron para producir 14 como un sólido pardo (0,012 g, 0,026 mmol, 48 %). Peso molecular para C19H21MnN3O9: 436,23. MS (ESI) m/z: Calculado: 436,02 (M)_; observado: 436
Cloruro de trans-1,2 diaminociclohexanaminio (15): A una solución de frans-1,2 diaminociclohexano (48 mmol, 5,523 g) en 200 ml de éter, se le añadió gota a gota 20,4 ml de HCI 2 M en éter en contraflujo de nitrógeno. La reacción se dejó en agitación durante 2 horas, durante ese tiempo se formó el producto como un precipitado blanco. El precipitado se recogió y se lavó con cantidades copiosas de éter. Rendimiento: 97 % (7,05 g). 1H RMN (500 MHz, CD3OD) 8 (ppm): 2,67 (m), 2,04 (m, 2H1,78 (m, 2H), 1,35 (m, 4H). Peso molecular para C6H14N2: 114,19. MS (ESI) m/z.Calculado: 115,2 (M+H)+; observado: 115,4. 13C{1H} RMN (125 MHz, CD3OD) 8 (ppm): 56,1, 33,7, 25,6. Peso molecular para C6H14N2: 114,19. MS (ESI) m/z: Calculado: 115,2 (M+H)+; observado: 115,4.
Cloruro de frans-2-((ferc-butoxicarbonil)amino)ciclohexanaminio (16) (véase la figura 19): A una solución de 15 (10 mmol, 1,507 g) en 90 ml de metanol, se le añadió gota a gota una solución de dicarbonato de di-terc-butilo (9,1 mmol, 1,986 g) en metanol (30 ml) durante 1 hora. Después de agitar durante 18 horas, todos los volátiles se retiraron a presión reducida, y se obtuvo el producto como un sólido blanco amarillento. El sólido se lavó con cantidades copiosas de diclorometano, para retirar cualquier material de partida sin reaccionar. Rendimiento: 97 % (2,21 g). 1H RMN (500 MHz, CD3OD) 8 (ppm): 3,07 (s, 1H), 2,40 (s, 1H), 1,91 (m, 2H), 1,70 ((m, 2H), 1,44 (s, 9H), 1,28 (m, 2H), 1,19 (m, 2H). 13C{1H} RMN (125 MHz, CD3OD) 8 (ppm): 156,7, 79,3, 54,3, 52,4, 31,6, 29,7, 27,4, 24., 23,6. Peso molecular para C11H22N2O2: 214,30. MS (ESI) m/z: Calculado: 215,3 (M+H)+; observado: 215,4.Peso molecular para C11H22N2O2: 214,30. MS (ESI) m/z: Calculado: 21 5,3 (M+H)+; observado: 215,4.
(trans-2-((2-Hidroxibencil)amino)ciclohexil)carbamato de ferc-butilo (17): A una solución de 16 (3,99 mmol, 1,001 g) en 90 ml de MeOH, se le añadió NEt3 (4,39 mmol, 0,6 ml) y la reacción se agitó durante 30 minutos. A la mezcla anterior se le añadió una solución de salicilaldehído (3,99 mmol, 0,487 g) en metanol (30 ml). Después de agitar durante 1 hora, se añadió NaBH4 sólido (8,38 mmol, 0,317 g) y la reacción se agitó durante 3 horas. Todos los volátiles se retiraron a presión reducida, para producir un sólido amarillo pálido. El residuo se disolvió en 200 ml de CH2Ch, se extrajo con 200 ml de solución saturada de NaHCO3. La capa acuosa se extrajo con CH2Ch (2 x 100 ml). Todos los orgánicos se combinaron, se lavaron con salmuera (200 ml) y se secaron sobre MgSO4 anhidro. El disolvente se evaporó a presión reducida para obtener 17 como un sólido amarillo pálido (1,231 g, 96 %). 1H RMN (500 MHz, CDCh) 8 (ppm): 7,15 (m, 1H), 6,96 (m, 1H), 6,81 (m, 1H), 6,75 (m, 1H), 4,43 (s, 1H), 4,05 (d, 1 H), 3,93 (d, 1H), 3,41 (s, 1H), 2,31 (m, 1H) 2,17 (m, 1 H), 1,99 (m, 1H), 1,70 (m, 2H), 1,46 (s, 9H), 1,31 (m, 1 H), 1,17 (m, 2H). 13C{1H} RMN (125 MHz, CDCh) 8 (ppm): 158,3, 156,0, 128,4, 128,0, 123,1, 118,7, 116,3, 79,4, 60,9, 53,9, 49,8, 33,0, 31,2, 28,3, 24,9, 24,5. Peso molecular para C18H28N2O3: 320,43. MS (ESI) m/z: Calculado: 321,43 (M+H)+; observado: 321,5.
2,2'-((frans-2-((2-(ferc-Butoxi)-2-oxoetil)(2-hidroxibencil)amino)ciclohexil)azanodiil)diacetato de di-terc-butilo (18): Se disolvió 17 (3,15 mmol, 1,01 g) en CH2Ch (100 ml) seguido de la adición de 50 ml de ácido trifluoroacético. La reacción se agitó durante 5 horas, y después los volátiles se retiraron a presión reducida. El residuo se disolvió en agua (40 ml) y
se lavó con éter (3 x 40 ml). La fracción acuosa se liofilizó para producir la amina libre cuantitativamente como un sólido amarillo pálido, que se usó en la reacción posterior sin purificación adicional.
Al matraz de fondo redondo que contenía la amina, se le añadió KI (6,3 mmol, 1,04 g) y el sistema se purgó con nitrógeno. En contraflujo de nitrógeno, se añadió dimetilformamida seca (2 ml) seguida de la adición de N,N-diisopropiletilamina (15,75 mmol, 2,74 ml) y la adición gota a gota de bromoacetato de ferc-butilo (9,765 mmol, 1,90 g). La reacción se agitó durante 18 horas y después se repartió entre NaHCO3(ac.) saturado y Et2O. La capa de Et2O se separó y se lavó con varios cambios de H2O para retirar la DMF antes de secar sobre Na2SO4 y concentración hasta 1,0 g de aceite amarillo. Peso molecular para C31H50N2O7: 562,74. MS (ESI) m/z: Calculado: 563,75 (M+H)+; observado: 563,8. El producto en bruto se llevó a la siguiente etapa sin purificación adicional.
Ácido 2,2'-((trans-2-((carboximetil)(2-hidroxibencil)amino)ciclohexil)azanodiil)diacético (19): El producto en bruto (17) de la etapa previa se disolvió en ácido trifluoroacético (40 ml) seguido de la adición de triisopropilsilano (2,35 ml), 1-dodecanotiol (2,35 ml) y agua (2,35 ml). La reacción se agitó durante 5 horas, y después los volátiles se retiraron a presión reducida. El residuo se disolvió en agua (40 ml) y se lavó con éter (3 x 40 ml). La fracción acuosa se liofilizó para producir 19 en bruto. El producto entonces se purificó mediante HPLC preparativa usando una columna Polaris C18; eluyente A: H2O/TFA al 0,1 %, B: MeCN/TFA al 0,1 %; gradiente de 5 % a 50 % de B durante 25 minutos; caudal: 15 ml/min. Las fracciones se recogieron y se liofilizaron para producir 19 como un sólido blanco (0,510 g, 72 %). 1H RMN (500 MHz, D2O) 8 (ppm): 7,45 (m, 1 H), 7,37 (m, 1H), 6,98 (m, 2H), 4,42 (s, 2H), 4,17 (d, 1H), 3,90 (d, 1H), 3,51 (a, 2H), 3,35 (a, 1 H), 3,24 (a, 1 H), 3,00 (a, 1 H), 2,91 (a, 1 H), 2,33 - 1,12 (8H). 13C{1H} RMN (125 MHz, D2O) 8 (ppm): 174,5, 170,4, 156,1, 133,3, 132,9, 121,9, 117,1, 116,6, 62,0, 59,6, 53,8, 52,3, 51,0, 48,3, 24,4. Peso molecular para C19H26N2O7: 394,42. MS (ESI) m/z: Calculado: 395,43 (M+H)+; observado: 395,5.
Na2[MnIIcycHBET] (20): Se disolvió 19 (0,26 mmol, 0,103 g) en 5 ml de agua. El pH se ajustó a 8 usando solución de hidróxido de sodio 1 N. Después se añadió M n C h ^ ^ O (0,26 mmol, 0,051 g) a la solución y el pH se ajustó cuidadosamente hasta 5. La reacción se agitó durante 1 hora, se filtró y se liofilizó para producir un sólido blanco. El complejo se inyectó en una columna C18 (Polaris) en fase inversa y se desaló usando el método descrito anteriormente. Las fracciones se recogieron y se liofilizaron para producir 20 como un sólido blanco (0,106 g, 80 %). Peso molecular para C-i9H24MnN2O7447,34. MS (ESI) m/z: Calculado: 448,35 (M+3H)+; observado: 448,4.
Na[MnmcycHBET] (21): Se disolvió 18 (0,15 mmol, 0,06 g) en 5 ml de agua. El pH se ajustó a 8 usando solución de hidróxido de sodio 1 N. Después se añadió M n C h ^ ^ O (0,15 mmol, 0,030 g) a la solución y el pH se ajustó hasta 12. La solución se dejó en agitación durante 1 hora. La solución después se filtró a través de un filtro de 0,45 pm para retirar el MnO2, el pH se ajustó hasta 11 y la solución se agitó durante 18 horas. Se hizo seguimiento de la reacción usando CL-EM analítica y la reacción se detuvo cuando se observó conversión del 70 % en la especie de Mnm. La mezcla se purificó por HPLC prep. como se describe anteriormente. Las fracciones se recogieron y se liofilizaron para producir 21 como un sólido pardo (0,023 g, 31 %). Peso molecular para C-i9H23MnN2O7: 446,33. m S (ESI) m/z: Calculado: 447,34 (M+2H)+; observado: 447,4.
(2-((2-Hidroxi-5-metoxibenciliden)amino)ciclohexil)carbamato de ferc-butilo (22): Se agitaron trans-2-((terc-butoxicarbonil)amino)ciclohexano (1,30 mmol, 0,279 g) y 2-hidroxi-5-metoxibenzaldehído (1,35 mmol, 0,206 g) juntos en 12 ml de MeOH a TA. En minutos, cayó un precipitado copioso desde la solución amarilla brillante. Después de 90 min de agitación, se añadieron 30 ml de H2O a la mezcla y se aislaron 0,342 g (0,98 mmol, 76 %) de 22 por filtración. 1H RMN (500 MHz, CDCh) 8 (ppm): 12,78 (s, 1H), 8,28 (s, 1H), 6,90 (d, 1H), 6,76 (d), 4,63 (s, 1H), 3,73 (s, 3H) 3,57 (s, 1H), 3,03 (s, 1H), 2,06 (m, 1H), 1,90 (m, 3H), 1,76 (t, 2H), 1,68 (c, 1H), 1,41 (m, 2H), 1,30 (s, 9H). 13C{1H} RMN (125,7 MHz, CDCh) 8 (ppm): 163,3, 155,4, 155,3, 151,9, 119,3, 118,5, 117,8, 115,0, 79,3, 72,7, 56,1, 54,2, 33,3, 31,6, 28,2, 24,8, 24,0. Peso molecular para C19H28N2O4: 348,44. MS (ESI) m/z: Calculado: 349,21 (M+H)+; observado: 349,2
frans(2-((2-Hidroxi-5-metoxibencil)amino)ciclohexil)carbamato de terc-butilo (23) (véase la figura 19): Se añadió en porciones NaBH4 (51 mg, 1,35 mmol) a 22 (0,342 g, 0,98 mmol) agitando en 20 ml de MeOH a TA. En minutos, el color amarillo de la solución se decoloró hasta pajizo claro. Después de 2 h, la solución se concentró a sequedad, se recogió en CH2Cl2 y se lavó minuciosamente con H2O y salmuera. La porción orgánica se lavó, se secó sobre MgSO4 y se concentró en 23, aislado como un sólido pajizo (0,179 g, 0,51 mmol, 52 %). 1H RMN (500 MHz, CDCh) 8 (ppm): 6,72 (m, 2H), 6,54 (s, 1H), 4,53 (s a, 1H), 3,94 (dd, 2H), 3,38 (s a, 1H), 2,30 (m, 1H), 2,13 (m, 1H), 1,97 (m ,1H), 1,69 (m, 2H), 1,45 (s, 9H), 1,31-1,15 (m, 4H). Peso molecular para C19H30N2O4: 350,22. MS (ESI) m/z: Calculado: 351,23 (M+H)+; observado: 351,3.
2-(((frans-2-Aminociclohexil)amino)metil)-4-metoxifenol (24): Se disolvió 23 (0,179 g, 0,51 mmol) en 5 ml de cada uno de CH2Cl2/TFA durante 5 horas. La solución entonces se concentró a sequedad, se disolvió en 50 ml de CH2Cl2 y se agitó sobre un exceso de K2CO3(s) durante 12 horas. El K2CO3 se retiró por filtración y las aguas madre se concentraron en 24 como un aceite amarillo pálido con rendimiento cuantitativo. 1H RMN (500 MHz, CDCh) 8 (ppm): 6,70 (m, 2H), 6,56 (s, 1H), 3,91 (dd, 2H), 3,72 (s, 3H), 2,39 (a t, 1H), 2,10 (m, 2H), 1,79 (m, 1H), 1,66 (m, 2H), 1,28-1,06 (m, 4H) 13C{1H} RMN (125,7 MHz, CDCh) 8 (ppm): 152,4, 152,0, 124,5, 116,7, 114,0, 113,3, 63,8, 55,9, 55,8, 50,3, 37,0, 30,9, 25,3, 24,9. Peso molecular para C14H22N2O2: 250,34. MS (ESI) m/z: Calculado: 251,37 (M+H)+; observado: 251,1.
2,2'-((frans-2-((2-(ferc-Butox¡)-2-oxoet¡l)(2-h¡drox¡-5-metox¡benc¡l)am¡no)c¡clohex¡l)azanod¡¡l)d¡acetato (25): A 24 (0,161 g, 0,64 mmol) en ag¡tac¡ón en 3 ml de DMF con yoduro de potas¡o (0,078 g, 0,47 mmol) y d¡¡soprop¡let¡lam¡na (0,432 g, 3,34 mmol) se le añad¡ó bromoacetato de (Bu (0,399 g, 2,05 mmol) a TA. La soluc¡ón parda pál¡da desarrolló ráp¡damente un prec¡p¡tado blanco. Después de 4 horas de ag¡tac¡ón, la soluc¡ón se d¡luyó con 100 ml de Et2O, se lavó con Na2CO3(ac.), H2O cop¡osa y salmuera. La capa orgán¡ca se concentró a sequedad y se pur¡f¡có usando una columna C18 (Polar¡s) en fase ¡nversa: eluyente A: H2O/TFA al 0,1 %, B: MeCN/TFA al 0,1 %; grad¡ente de 60 % a 95 % de B durante 25 m¡n; caudal: 20 ml/m¡n. Las fracc¡ones se l¡of¡l¡zaron, después se recog¡eron en 50 ml de CH2Ch y se ag¡taron sobre K2CO3(s) durante 6 h. El f¡ltrado se concentró para produc¡r 25. (0,095 g, 0,17 mmol, 26 %). 1H RMN (500 MHz, CDCl3) 8 (ppm): 9,53 (s a, 1H), 6,73 (m, 2H), 6,57 (d, 1H), 4,21 (d, 1H), 3,72 (s, 3H), 3,67 (d, 1H), 3,44 (m, 5H), 3,24 (d, 1H), 2,77 (t, 1H), 2,59 (t, 1H), 2,03 (m, 2H), 1,68 (m, 2H), 1,44 (2 s, 18H y 9H), 1,23 (m, 1H), 1,03 (m, 3H). 13C{1H} RMN (125,7 MHz, CDCh) 8 (ppm): 171,7, 171,3, 152,2, 151,9, 123,5, 116,7, 115,6, 113,7, 81,4, 80,8, 63,7, 59,6, 55,8, 55,5, 52,8, 28,2, 28,1, 25,8, 25,6 (Un C no pudo encontrarse en estos espectros, probablemente es co¡nc¡dente con otro p¡co). Peso molecular para C32H52N2O8: 592,76. MS (ESI) m/z: Calculado: 593,4 (M+H)+; observado: 593,5.
Ác¡do 2,2'-((2-((carbox¡met¡l)(2-h¡drox¡-5-metox¡benc¡l)am¡no)c¡clohex¡l)azanod¡¡l)d¡acét¡co (26): Se d¡solv¡ó 25 (0,095 g, 0,224 mmol) en 3 ml de cada uno de CH2Ch:TFA. Después de 6 h de ag¡tac¡ón, la mezcla de reacc¡ón se concentró para produc¡r 26 como un sól¡do blanco. Peso molecular para C20H28N2O8: 424,44 MS (ESI) m/z: Calculado: 425,19 (M+H)+; observado: 425,2.
(frans-2-((2-N¡trobenc¡l)am¡no)c¡clohex¡l)carbamato de ferc-but¡lo (27): A una soluc¡ón de 16 (3,99 mmol, 1,001 g) en 90 ml de MeOH, se le añad¡ó NEt3 (4,39 mmol, 0,6 ml) y la reacc¡ón se ag¡tó durante 30 m¡n. A la mezcla anter¡or se le añad¡ó una soluc¡ón de 2-h¡drox¡-5-n¡trobenzaldehído (3,99 mmol, 0,667 g) en metanol (30 ml). Después de ag¡tar durante 1 h, se añad¡ó NaBH4 sól¡do (8,38 mmol, 0,317 g) y la reacc¡ón se ag¡tó durante 3 horas. Todos los volát¡les se ret¡raron a pres¡ón reduc¡da, para produc¡r un sól¡do amar¡llo pál¡do. El res¡duo se d¡solv¡ó en 200 ml de CH2Ch, se extrajo con 200 ml de soluc¡ón saturada de NaHCO3. La capa acuosa se extrajo con CH2Ch (2 x 100 ml). Todos los orgán¡cos se comb¡naron, se lavaron con salmuera (200 ml) y se secaron sobre MgSO4 anh¡dro. El d¡solvente se evaporó a pres¡ón reduc¡da para obtener 27 como un sól¡do amar¡llo pál¡do (1,231 g, 96 %). 1H RMN (500 MHz, CD3OD) 8 (ppm): 8,05 (m, 1H), 7,91 (m, 1H), 6,81 (m, 1H), 4,48 (d, 1H), 4,08 (m, 2H), 3,42 (d, 1H), 2,31 (m, 1H), 2,13 (m, 1H), 1,98 (m, 1H), 1,75 (m, 2H), 1,45 (s, 9H), 1,17 (m, 3H). Peso molecular para C18H27N3O5: 365,42. MS (ESI) m/z: Calculado: 366,42 (M+H)+; observado: 366,5.
2,2'-((frans-2-((2-(ferc-Butox¡)-2-oxoet¡l)(2-h¡drox¡-5-n¡trobenc¡l)am¡no)c¡clohex¡l)azanod¡¡l)d¡acetato de d¡-ferc-but¡lo (28) (véase la f¡gura 19): Se d¡solv¡ó 27 (3,15 mmol, 1,15 g) en CH2Ch (100 ml) segu¡do de la ad¡c¡ón de 50 ml de ác¡do tr¡fluoroacét¡co. La reacc¡ón se ag¡tó durante 5 h, y después los volát¡les se ret¡raron a pres¡ón reduc¡da. El res¡duo se d¡solv¡ó en agua (40 ml) y se lavó con éter (3 x 40 ml). La fracc¡ón acuosa se l¡of¡l¡zó para produc¡r la am¡na l¡bre cuant¡tat¡vamente como un sól¡do amar¡llo pál¡do, que se usó en la reacc¡ón poster¡or s¡n pur¡f¡cac¡ón ad¡c¡onal.
Al matraz de fondo redondo que contenía la am¡na, se le añad¡ó KI (6,3 mmol, 1,04 g) y el s¡stema se purgó con n¡trógeno. En contraflujo de n¡trógeno, se añad¡ó d¡met¡lformam¡da seca (2 ml) segu¡da de la ad¡c¡ón de N,N-d¡¡soprop¡let¡lam¡na (15,75 mmol, 2,74 ml) y la ad¡c¡ón gota a gota de bromoacetato de ferc-but¡lo (9,765 mmol, 1,90 g). La reacc¡ón se ag¡tó durante 18 horas y después se repart¡ó entre NaHCO3(ac.) saturado y Et2O. La capa de Et2O se separó y se lavó con var¡os camb¡os de H2O para ret¡rar la DMF antes de secar sobre Na2SO4 y concentrac¡ón hasta 0,73 g de ace¡te amar¡llo. Peso molecular para C31H49N3O9: 607,74. MS (ESI) m/z: Calculado: 608,74 (M+H)+; observado: 608,9. El producto en bruto se llevó a la s¡gu¡ente etapa s¡n pur¡f¡cac¡ón ad¡c¡onal.
Ác¡do 2,2'-((frans-2-((carbox¡met¡l)(2-h¡drox¡-5-n¡trobenc¡l)am¡no)c¡clohex¡l)azanod¡¡l)d¡acét¡co (29): El producto en bruto (28) de la etapa prev¡a se d¡solv¡ó en ác¡do tr¡fluoroacét¡co (40 ml) segu¡do de la ad¡c¡ón de tr¡¡soprop¡ls¡lano (2,35 ml), 1-dodecanot¡ol (2,35 ml) y agua (2,35 ml). La reacc¡ón se ag¡tó durante 5 h, y después los volát¡les se ret¡raron a pres¡ón reduc¡da. El res¡duo se d¡solv¡ó en agua (40 ml) y se lavó con éter (3 x 40 ml). La fracc¡ón acuosa se l¡of¡l¡zó para produc¡r 29 en bruto. El producto entonces se pur¡f¡có med¡ante HPLC preparat¡va usando una columna Polar¡s C18; eluyente A: H2O/TFA al 0,1 %, B: MeCN/TFA al 0,1 %; grad¡ente de 5 % a 50 % de B durante 25 m¡n; caudal: 15 ml/m¡n. Las fracc¡ones se recog¡eron y se l¡of¡l¡zaron para produc¡r 24 como un sól¡do blanco (0,497 g, 70 %). 1H RMN (500 MHz, D2O) 8 (ppm): 8,37 (d, J = 2,58 Hz, 1H), 8,20 (m, 1H), 7,06 (d, J = 9,10 Hz, 1H), 4,40 (s, 2H), 4,10 (d, 1H), 3,84 (d, 1H), (d, 1H), 3,56 (a, 1H), 3,44 (a, 1H), 3,19 (a, 2H), 3,04 (a, 2H), 2,35 (m, 1H), 1,89 (m, 1H), 1,78 (m, 1H), 1,53 (m, 1H), 1,24 (a, 4H). 13C{1H} RMN (125 MHz, D2O) 8 (ppm): 173,8, 171,4, 162,8, 141,1, 129,8, 128,5, 119,0, 117,1, 72,1, 71,7, 63,3, 60,0, 55,0, 43,2, 24,7, 24,5, 24,3. Peso molecular para C19H25N3O9: 439,42. MS (ESI) m/z: Calculado: 440,42 (M+H)+; observado: 440,5.
Na2[MnIIcycHBET-NO2)] (30): Se d¡solv¡ó 29 (0,26 mmol, 0,114 g) en 5 ml de agua. El pH se ajustó a 8 usando soluc¡ón de h¡dróx¡do de sod¡o 1 N. Después se añad¡ó M n C h ^ ^ O (0,26 mmol, 0,051 g) a la soluc¡ón y el pH se ajustó cu¡dadosamente hasta 5. La reacc¡ón se ag¡tó durante 1 h, se f¡ltró y se l¡of¡l¡zó para produc¡r un sól¡do blanco. El complejo se ¡nyectó en una columna C18 (Polar¡s) en fase ¡nversa y se desaló usando el método descr¡to anter¡ormente. Las fracc¡ones se recog¡eron y se l¡of¡l¡zaron para produc¡r 30 como un sól¡do blanco (0,102 g, 80 %). Peso molecular para C-i9H23MnN3O9: 493,35. MS (ESI) m/z: Calculado: 494,35 (M+3H)+; observado: 494,4.
Na[MnIIIcycHBET-NO2] (31): Se añad¡ó MnF3 (0,011 g, 0,08 mmol) a 24 (0,043 g, 0,08 mmol) ag¡tando en 5 ml de H2O a pH 8. La soluc¡ón roja anaranjada resultante se pur¡f¡có usando una columna C18 (Polar¡s) en fase ¡nversa: eluyente A:
H2O (acetato de amonio 10 mM), B: MeCN; gradiente de 5 % a 60 % de B durante 25 min; caudal: 20 ml/min. Las fracciones se recogieron y se liofilizaron para producir 26 como un sólido pardo (0,024 g, 0,05 mmol, 62%). Peso molecular para C1gH21MnN3Og: 490,32. MS (ESI) m/z: Calculado: 490,07 (M)-; observado: 490,2.
Tabla 1. Relaación de compleos de man aneso a pH 7,4, 37 °C, 1,4 tesla.
Ejemplo 2
Síntesis
Puede encontrarse un esquema sintético para el ejemplo 2 en la figura 34.
N-Tosil dietilentriamina (32). A un lote de 8,480 g (81,71 mmol) de dietilentriamina en agitación en 120 ml de MeCN a 0 °C se le añadió 1,768 g (9,27 mmol) de cloruro de p-toluenosulfonilo. Se formó instantáneamente una solución heterogénea blanca y la solución se calentó hasta temperatura ambiente y se dejó en agitación durante 16 horas. La solución posteriormente se concentró en un aceite blanco, se recogió en 30 ml de H2O, el pH se ajustó hasta >10 y se lavó 2x con Et2O. La capa acuosa entonces se concentró en un residuo blanco mediante liofilización. El residuo resultante se recogió en 30 ml de H2O y el pH se ajustó hasta 7 mediante adición cuidadosa de ácido trifluoroacético (TFA). El producto entonces se purificó mediante HPLC preparativa usando una columna Restek Ultra Aqueous C18 (10 mm x 250 mm); eluyente A: H2O/TFA al 0,1 %, B: MeCN/TFA al 0,1 %; gradiente de 5 % a 95% de B durante 23 minutos; caudal: 5 ml/min. Las fracciones que contenían el producto se combinaron y se retiró el MeCN y el TFA mediante evaporación rotatoria. La solución acuosa resultante entonces se ajustó hasta pH 9 por valoración cuidadosa de NaOH(ac.) 1 M, esta etapa se realizó para generar la amina libre de pequeñas cantidades de dietilentriamina (gran exceso, sin detección de UV) que posiblemente puede eluir con el producto, se espera que las cantidades restantes residuales se evaporen durante la liofilización. La solución acuosa se concentró mediante liofilización hasta 3,142 g (5,94 mmol, 64 %) de aceite amarillo compuesto de 32 2 equiv. de trifluoroacetato de sodio. El producto posteriormente se hizo reaccionar sin purificación adicional. 1H RMN (500 MHZ, D2O, 8 del disolvente protio): 7,78 (d , 2H), 7,59 (d, 2H), 3,08-2,02 (m, 4H), 2,87 (t, 2H), 2,73 (t, 2H), 2,45 (s, 3H). 13C{1H} (125,7 MHz, D2O, 8 del tBuOH): 145,77, 135,60, 130,77, 127,40, 47,84, 45,92, 42,27, 39,10, 21,32. ESI-MS: m/z 258,1 (M+H)+; calculado. 258,4.
N-Tosil-N',N",N"-dietilentriaminatritbutilacetato (33): A un lote de 2,876 g (5,43 mmol) de 21 2 equiv. de trifluoroacetato de sodio, 6,615 g (51,18 mmol) de diisopropiletilamina y 1,739 g (10,48 mmol) de yoduro de potasio en agitación en 20 ml de DMF a temperatura ambiente se le añadió gota a gota 5,038 g (23,83 mmol) de bromoacetato de ‘butilo en 5 ml de DMF durante 20 minutos. La mezcla de reacción se dejó en agitación durante 16 horas antes del reparto entre NaHCO3(ac.) sat. y Et2O. La capa de Et2O se separó y se lavó con varios cambios de H2O para retirar la DMF antes de secar sobre Na2SO4 y concentración hasta 4,535 g de aceite pardo. La cromatografía sobre gel de sílice de 4:1 de hexano:acetato de etilo a 2:1 de hexano:acetato de etilo produjo 2,346 g (3,91 mmol, 72 %) de 33 como un aceite amarillo claro. 1H RMN (500 MHZ, CDgCl, 8 del TMS): 7,80 (d, 2H), 7,27 (d, 2H), 6,63 (a, t, NH), 3,42 (s, 4H), 3,16 (s, H), 2,91 (c, 2H), 2,75-2,70 (m, 6H), 2,41 (s, 3H), 1,46 (s, 18H), 1,43 (s, 9H). 13C{1H} RMN (125,7 MHZ, CDgCl, 8 del TMS): 171,17, 170,69, 142,79, 137,63, 129,53, 127,44, 81,35, 81,16, 55,73, 52,61, 52,12, 51 77, 41 .41, 28,32, 28,28, 21,60, 20,80. ESI-MS: m/z 600,8 [M+H]+; calculado.: 600,3.
N-Tosil-N',N",N"-dietilentriaminatriacetato-2TFA (N-tos-DTTA2TFA) (34). Un lote de 0,957 g (1,60 mmol) 33 se agitó en 40 ml de TFA:n-dodecanotiol:triisopropilsilano: H2O 85:5:5:5 durante 16 horas. La mezcla de reacción posteriormente se concentró a sequedad, se recogió en H2O y se lavó con Et2O. La capa acuosa se purificó en porciones mediante HPLC preparativa usando una columna Kromasil 100-10-C4 en fase inversa (21,2 mm x 250 mm); eluyente A: H2O/TFA al 0,1 %, B: MeCN/TFA al 0,1 %; gradiente de 5 % a 70 % de B durante 17 minutos; caudal: 20 ml/min. Las fracciones que contenían el producto se combinaron y se concentraron hasta 0,894 g (1,29 mmol, 81 %) de 23 como un sólido blanco. 1H RMN (500 MHZ, D2O, 8 del disolvente protio): 7,80 (d, 2H), 7,50 (d, 2H), 3,98 (s, 2H), 3,82 (s, 4H), 3,51 (t, 2H), 3,43 (t, 2H), 3,36 (t, 2H), 3,31 (t, 2H), 2,46 (s, 3H). 13C{1H} (125,7 MHz, D2O, 8 del ‘BuOH): 173,98, 170,31, 146,48, 135,05, 131,10, 127,76, 56,27, 55,54, 54,80, 53,31, 50,78, 38,62, 21,37. ESI-MS: m/z 432,2 [M+H]+; calculado.: 432,5.
Na[Mn(N-tos-DTTA)] (35). Un lote de 81,5 mg (0,12 mmol) de 34 se disolvió en 2 ml de H2O y el pH se ajustó hasta 6,40 mediante la adición cuidadosa de NaOH 1 M. A esto se le añadió 23,5 mg (0,12 mmol) de MnCh como un sólido y el pH se ajustó cuidadosamente hasta 6,60. La solución resultante se liofilizó en un polvo blanco antes de la purificación mediante HPLC preparativa usando una columna Restek Ultra Aqueous C18 (10 mm x 250 mm); eluyente A: acetato de amonio 50 mM en agua, B: MeCN; gradiente de 5 % a 95 % de B durante 20 minutos; caudal: 5 ml/min. Las porciones que contenían producto se liofilizaron repetidamente para retirar cualquier resto de acetato de amonio, produciendo finalmente 35 como 63 mg (0,12 mmol, 100 %) de sólidos blancos. EM-|En : m/z 484,0 [M-Na- H2O)- calc.: 483,4.
Se determinó una relación de unión 1:1 de 34 a Mn2+ de la siguiente manera: A muestras de 500 pl de MnCh 0,91 mM en tampón de pH 7,30 (TRIS 25 mM) (0,45 pmol presentes en cada una), se añadieron pociones cada vez más grandes de
34 1,45 mM (de 0 a 675 |jl en incrementos de 75 jl; 1,09 |jmol presentes en cada porción de 75 |jl). El valor de T2 de cada muestra se midió posteriormente y se representó la relajación como una relación de ligando a metal (véase la figura 28). El punto de consumo total de Mn se determinó en el punto donde r2 dejaba de disminuir con ligando añadido. La concentración de cada muestra se determinó por EM-PAI.
Ejemplo 3
Síntesis
Pueden encontrarse esquemas sintéticos para el ejemplo 3 en las figuras 38 y 39.
N-Bencil-1,2-diaminociclohexano (36). A un lote de 7,113 g (62,29 mmol) de 1,2-diaminociclohexano en MeCN 50 ml se le añadió gota a gota 1,093 g (6,39 mmol) de bromuro de bencilo en 10 ml de MeCN a temperatura ambiente durante el transcurso de 1 hora. Después de 16 horas, la solución heterogénea blanca resultante se concentró a sequedad y se repartió entre CH2Ch y Na2CO3(ac.) sat. Las capas se separaron y la fase orgánica se lavó de nuevo con Na2CO3(ac.) sat., después salmuera, se secó sobre Na2SO4 y se concentró hasta 1,280 g (6,26 mmol, 98 %) de 36 como un aceite amarillo claro. 1H RMN (500 MHZ, CDCh, 8 del TMS): 7,36-7,22 (m, 5H), 3,94 (d, 1H), 3,69 (d, 1H), 2,38 (m, 1H), 2,09 (m, 2H), 1,90 (m, 1H), 1,73 (m, 2H), 1,32.-1,09 (m, 4H). ESI-MS: m/z = 205 [M+H]+; calculado.: 205,3.
N'-Bencil-N',N",N"-tritbutilacetato-1,2-ciclohexilendiamina (37): A 1,133 g (5,55 mmol) de 36, 4,194 g (32,35 mmol) de diisopropiletilamina y 0,966 g (5,82 mmol) de yoduro de potasio en 5 ml de DMF se le añadió 5,340 g (27,38 mmol) de bromoacetato de ‘butilo a temperatura ambiente. La solución heterogénea de color bronceado resultante se agitó durante 6 horas antes de la dilución con Et2O seguido de lavado con K2CO3(ac.) sat., varios cambios de agua y salmuera, secado sobre Na2SO4 y concentración hasta 5,468 g de aceite pardo. La cromatografía ultrarrápida (gel de sílice, 19:1 a 4:1 de hexano:EtOAc) produjo 36 puro como 1,949 g (3,57 mmol, 64 %) de aceite amarillo claro. 1H RMN (500 MHZ, CDCh, 8 del TMS): 7,45 (d, 1H), 7,30 (t, 1H), 7,23 (d, 1H), 4,0 (d, 1H), 3,69 (d, 1H), 3,47-3,38 (m, 5H), 3,28 (d, 1H), 2,71 (t, 1H), 2,55 (t, 1H), 2,04 (t, 2H), 1,68 (m, 2H), 1,44 (s, 18H), 1,42 (s, 9H), 1,31-1,25 (m, 4H). 13C{1H} RMN (125,7 MHZ, CDaCl, 8 del TMS): 171,95, 171,66, 139,91, 129,35, 128,05, 126,82, 80,30, 63,39, 59,95, 54,79, 53,18, 52,62, 29,41, 28,14, 28,12, 25,83, 25,68. ESI: m/z = 547,0 [M+H]+; calculado.: 547,4.
N, N,N'-trans-1,2-Diaminociclohexano-tri-terc-butilacetato (38) Se agitó 37 (0,757 g, 1,38 mmol) sobre Pd/C (96 mg, 13 % en peso) en MeOH en 1 atm. de H2®. Después de 16 h, el Pd/C se retiró por filtración y las aguas madre se concentraron en 38 (601 mg, 1,32 mmol, 95 %) como un aceite pajizo. Este producto se llevó a las siguientes etapas sin purificación adicional. 1H RMN (500 MHZ, CDCh, 8 del TMS): 3,49-3,23 (m, 7H), 2,35 (m, 2H), 2,00 (m, 1H), 1,93 (m, 1H), 1,72 (m, 1H), 1,65 (m, 1H), 1,44 (s, 27H), 1,18-1,00 (m, 4H). 13C{1H} RMN (125,7 MHZ, CDaCl, 8 del TMS): 171,7 (dos C coincidentes), 80,6, 80,5, 67,3, 57,6, 52,8, 48,7, 31,4, 28,3, 28,2, 27,1, 25,9, 24,5. ESI: m/z = 457,3 [M+H]+; calculado.: 457,3.
N'-(2-Picolil)-N',N'',N''-tritbutilacetato-1,2-ciclohexilendiamina (39): Se añadió clorhidrato de cloruro de picolilo (0,079 g, O, 48 mmol) a 38 (0,250 g, 0,55 mmol), yoduro de potasio (0,076 g, 0,48 mmol) y diisopropiletilamina (0,320 g, 2,48 mmol) en agitación en 3 ml de DMF. Después de 16 horas de agitación, la solución amarilla pálida y turbia se diluyó con 50 ml de Et2O, se lavó con K2CO3(ac.) sat., agua copiosa y salmuera, se secó sobre Na2SO4 y se concentró hasta 0,303 g de aceite de color bronceado. El producto en bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida (gel de sílice, hexano:EtOAc 9:1 con TEA al 1 %) para producir 39 (0,150 g, 0,27 mmol, 50 %) como un aceite incoloro. 1H RMN (500 MHZ, CDCh, 8 del TMS): 8,46 (d, 1H), 7,86 (d, 1H), 7,64 (t, 1H), 7,11 (m, 1H), 4,11 (d, 1H), 3,79 (d, 1H), 3,48-3,32 (m, 5H), 3,29 (d, 1H), 2,71 (m, 1H), 2,61-2,52 (m, 2H), 2,06 (m, 2H), 1,69 (m, 2H), 1,40 (s, 27H), 1,32-1,24 (m, 3H). 13C{1H} RMN (125,7 MHZ, CD3C 8 del TMS): 171,8, 166,2, 162,5, 146,8, 137,3, 127,0, 123,5, 80,4 (dos señales coincidentes), 66,6, 63,3, 62,8, 59,0, 37,4, 291, 28,3, 28,1, 26,0, 24,9, 22,7. ESI: m/z = 548,4 [M+H]+; calculado.: 548,4.
N'-Picolil-N',N'',N''-trans-1,2-ciclohexilendiaminatriacetato (40): Se agitó 39 (150 mg, 0,27 mmol) en 5 ml de cada uno de CH2Ch/TFA. Después de 12 h, la solución se concentró en 40^3TFA (0,15 mmol, 56 %) como 104 mg de sólidos blancos.
1H RMN (500 MHZ, D2O, 8 del disolvente protio): 8,80 (s a, 1H), 8,59 (s, 1H), 8,07 (s a, 1H), 8,02 (s a, 1H), 4,49-2,94 (m, 10 H), 2,32-2,19 (m, 2H), 1,91 (m, 2H), 1,53-1,28 (m, 4H). ESI: m/z = 380,2 [M+H]+; calculado. 379,2.
[Mn(CyP3A)] (41): 40 se une a Mn" en una relación 1:1. Este complejo se preparó y se caracterizó in situ. Mn" se valoró cuidadosamente en 40 y se controló la estequiometría de Mn:40 por CL-EM o relaxometría de T2 como se describe anteriormente. Las soluciones de 41 son indefinidamente estables a temperatura ambiente. m/z = 433,1 [M+2H]+; calc.
433,1.
N'-((6-(Met¡len)p¡r¡d¡n-2-¡l)met¡l)¡so¡ndol¡n-1,3-d¡ona)-N',N'',N''-tr¡‘but¡lacetato-1,2-c¡clohex¡lend¡am¡na (42). Un lote de 468 mg (0,86 mmol) de 37 y 62 mg de Pd al 10 % sobre carbono (13 % en peso) se agitó en 1 atm. de H2(g) durante 16 horas tras lo que se confirmó conversión completa en N'',N'',N''-terc-butilacetato-1,2-ciclohexilendiamina (42) se confirmó por análisis de CL-EM (IEN: m/z = 457,0 [M+H]+; calc.: 457,3). El catalizador de paladio se retiró por filtración y las aguas madre se concentraron al vacío. El residuo resultante se recogió inmediatamente en 3 ml de DMF y a esto se le añadió 186 mg (15,20 mmol) de diisopropiletilamina seguida de 275 mg (0,83 mmol) de 2-((6-(bromometil)piridin-2-il)metil)isoindolin-1,3-diona (véase J. Org. Chem. 1997, 62, 5156). Después de 6 horas, la mezcla de reacción se diluyó
con Et2O seguido de lavado con NaHCO3(ac.) sat., varios cambios de agua y salmuera y secado sobre Na2SO4. Después de la eliminación de Na2SO4 por filtración, la solución se concentró a sequedad y se trituró con hexano dejando detrás 241 mg de aceite amarillo pálido. La cromatografía ultrarrápida (gel de sílice, 100 % de CH2Ch a 100 % de MeOH) produjo 42 puro como 77 mg (0,11 mmol, 13 %) de residuo blanco. 1H RMN (500 MHZ, CDCh, 8 del TMS): 7,88 (m, 2H), 7,72 (m, 3H), 7,58 (t, 1H), 7,03 (d, a, 1H), 4,98 (s, 2H) 3,97 (d, 1H), 3,70 (d, 1H), 3,41 (m, 5H), 3,24 (d, 1H), 2,65 (t, a, 1H), 2,53 (t, a, 1H), 1,99 (m, 2H), 1,636 (m, 2H), 1,40 (s, 27H), 1,37 (m, 4H). 13C{1H} RMN (125,7 MHZ, CDaCl, 8 del TMS): 171,87, 171,79, 168,21, 161,15, 153,97, 137,15, 134,12, 132,36, 123,53122,71, 118,99, 80,48, 80,34, 77,36, 63,50, 61,57, 56,18, 53,77, 53,26, 43,11, 28,22 (dos coincidentes), 25,97, 25,73. ESI: m/z = 707,0 [M+H]+; calculado.: 707,4.
N'-6-(Aminometil)piridin-2-il)metil-N',N",N"-tritbutilacetato-1,2-ciclohexilendiamina (43). Un lote de 77 mg (0,11 mmol) de 42 y 68 mg de hidrazina monohidrato (1,70 mmol) se calentaron a reflujo juntos en 8 ml de EtOH. Después de 90 minutos, la mezcla de reacción se concentró a sequedad, se recogió en C ^ C h y se lavó con NaHCO3(ac.) y salmuera, se secó sobre Na2SO4 y se concentró hasta 65 mg (0,11 mmol, 100 %) de 43 como un aceite incoloro pálido. 1H RMN (500 MHZ, CDCl3, 8 del TMS): 7,67 (d, 2H), 7,60 (t, 1H), 7,08 (d, 1H, 4,09 (d, 1H) 3,92 (s, 2H), 3,81 (d, 1H), 3,54-3,43 (m, 5H), 3,30 (d, 1H), 2,71 (t, a, 1H), 2,60 (t, a, 1H), 2,17 (d, 2H), 1,89 (m, 2H), 1,43 (s, 18H), 1,43 (s, 9H), 1,26 (m, 4H). 13C{1H} RMN (125,7 MHZ, CDaCl, 8 fdel TMS): 172,0 (dos señales coincidentes), 171,8, 160,7, 137,0, 122,0, 119,3, 80,51, 80,50, 63,6, 61,6, 56,5, 53,7, 53,3, 47,9, 28,3 (dos señales coincidentes), 26,0, 25,89. ESI: m/z = 577,0 [M+H]+; calculado.: 577,4
N-6-((4-Nitrofenilsulfonamido)metil)piridin-2-il)metil-N',N",N"-tritbutilacetato-1,2-ciclohexilendiamina (44). A 65 mg (0,11 mmol) de 43 y 33 mg (0,32 mmol) de trietilamina en agitación en 5 ml de CH2Ch se le añadió 28 mg (0,13 mmol) de cloruro de 4-nitrobencenosulfonilo a 0 °C durante 30 minutos. Después de 16 horas, la mezcla de reacción se lavó con NaHCO3(ac.) y salmuera, se secó sobre Na2SO4 y se concentró a sequedad. El análisis por CL-EM reveló la aminobis-sulfona correspondiente como el producto principal. Se aisló 44 puro como 4 mg (0,05 mmol, 5 %) de residuo oleoso después de HPLC preparativa usando una columna Phenomenex C18 (10 mm x 250 mm); eluyente A: H2O/TFA al 0,1 %, B: MeCN/TFA al 0,1 %; gradiente de 5 % a 70 % de B durante 27 minutos; caudal: 5 ml/min. IEN: m/z = 762,0 [M+H]+; calc.: 762,4.
N-6-((4-Nitrofenilsulfonamido)metil)piridin-2-il)metil-N',N",N"-triacetato-1,2-ciclohexilendiamina (45). Unos 2 mg (2,63 |jmol) en agitación de 44 en TFA mostraron conversión completa en 45 sin subproductos detectables por análisis por CL-EM. IEN: m/z = 594,0 [M+H]+; calc.: 594,2.
Tabla 2. Relaaciones n en m M 'V de compuestos de fórmula IX a 37 °C en tampón Tris pH 7,4
Tabla 3. Tasas (s_1) y t-i/2 (s_1) de desplazamiento de Mn(II) (1 mM) por Zn(II) 25 mM a partir de compuestos de fórmula IX [Mn CDTA ]2- a 37 °C en tampón MES pH 6,0.
Ejemplo 4
Síntesis
Puede encontrarse un esquema sintético para el ejemplo 4 en la figura 40.
Fmoc-Ty(OBn)-CONH2: (46): A 0 °C, se añadió isobutil cloroformo (1,52 g, 11,2 mmol) a la mezcla de Fmoc-Ty(OBzl)-COOH (4,93 g, 10,0 mmol), N-metilmorfolina (NMM, 2,10 g, 20 mmol) en THF (100 ml) y se agitó a 0 °C durante 0,5 horas. Se añadió amoniaco acuoso (30 %, 1,2 ml) y la mezcla de reacción se agitó durante 1 hora a 0 °C (la solución de reacción es turbia). El precipitado (producto y sales de NMM^HCl) se retiró por filtración y al filtrado se le añadió 1,2 ml adicionales de amoniaco acuoso con agitación durante otras 0,5 horas a temperatura ambiente. Los sólidos recogidos se suspendieron en EtOAc (200 ml) y se calentaron a reflujo durante 10 min. Los sólidos insolubles se filtraron y el filtrado se concentró al vacío hasta que la solución se volvió turbia. Después, se añadió n-hexano (50 ml) al precipitado 40 como 2,48 g de sólidos blancos. Después se añadió n-hexano (80 ml) al filtrado para precipitar otros 2,04 g del producto (4,52 g total, 92 %). 1H RMN (500 MHZ, CD3C 8 del TMS): 7,76 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,54 (t, J = 8,1 Hz, 2H), 7,41-7,36 (m, 5H), 7,35 - 7,29 (m, 3H), 7,12 (s, a, 2H), 6,91 (d, J = 7,7 Hz, 2H), 5,56 (s,a, 1H), 5,29 (s, a, 2H), 5,02 (s, 2H), 4,45-4,39 (m, 2H), 4,19 (t, J = 6,4 Hz, 1H), 3,07 -2,99(m, 2H). 13C{1H} RMN (125,7 MHZ, CD3C 8 del TMS): 172,96, 157,93, 143,69, 143,64, 141,32, 136,86, 130,36, 128,58, 128,00, 127,75, 127,48, 127,09, 124,98, 120,00, 115,12, 77,26, 77,00, 76,75, 70,02, 66,91, 53,61, 47,19, 37,54. ESI: m/z 493,4 [M+H]+; calculado.: 493,2.
NH2-Ty(OBn)-CONH2 (47): Se disolvió 46 (3,60 g, 7,3 mmol) en una solución de piperidina al 20 % en DMF (40 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. El disolvente se retiró al vacío y el residuo se volvió a disolver en EtOAc y
se precipitó mediante la adición de n-hexano para obtener un sólido blanco: 1,9 g (99 %). 1H RMN (500 MHZ, CD3CI, 8 del TMS): 7,43-7,31 (m, 5H), 7,15 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 7,08(s, 1H), 6,94 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 5,37 (s, 1H), 5,05 (s, 1H), 3,58 (dd, J = 9,3, 4,1 Hz, 1H), 3,19 (dd, J = 13,9, 4,0 Hz, 1H), 2,69 (dd, J = 13,9, 9,3 Hz, 1H). 13C{1H} RMN (125,7 MHZ, CD3Cl, 8 del TMS): 177,33, 157,82, 136,98, 130,32, 129,95, 128,60, 127,99, 127,46, 115,12, 70,05, 56,56, 40,07. ESI: m/z 271,3 [M+H]+; calculado.: 271,1.
NH2-Ty(OBn)-amina (48): Se suspendió 47 (1,86 g, 6,88 mmol) en THF seco (10 ml) y se le añadió B^^THF (1,0 M, 26 ml). La solución de reacción se calentó a reflujo durante 12 horas en atmósfera de nitrógeno. La solución se enfrió en un baño de hielo y se añadió lentamente metanol para interrumpir la reacción. Después de que el disolvente se retirara por evaporación, el residuo amarillo se volvió a disolver en HCI (1,0 M, 40 ml) y Et2O (50 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de retirar la capa orgánica, la solución acuosa se puso en un baño de hielo y el pH se elevó hasta 12 mediante la adición de NaOH. Esta solución básica se extrajo con CH2Ch (3 x 50 ml) y el CH2Ch entonces se evaporó para obtener un sólido amarillo claro (1,39 g, 79 %). 1H RMN (500 MHZ, cDaCl, 8 del TMS): 7,44-7,31 (m, 5H), 7,11 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 6,92 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 5,05 (s, 2H), 2,96 - 2,88 (m, 1H), 2,80-2,72 (m, 2H), 2,53-2,43 (m, 2H).
13C{1H} RMN (125,7 MHZ, CD3Cl, 8 del TMS): 157,36, 137,10, 131,51, 130,14, 128,56, 127,92, 127,45, 114,87, 70,05, 55,25, 48,21, 41,41. ESI: m/z 257,3 [M+H]+; calculado.: 257,4.
Acetato de N,N,N',N'-3-(4-(benciloxi)fenil)propano-1,2-diamina-tetra-terc-butilo (49): A una mezcla de 48 (1,39 g, 5,46 mmol), KI (906 mg, 5,46 mmol) y DIPEA (5,64 g, 43,7 mmol) en DMF seca (30 ml) se le añadió bromoacetato de terc-butilo (8,52 g, 43,7 mmol) y después se agitó durante 42 horas a 50 °C, con control de la reacción por CL-EM. Después de un periodo de refrigeración, la DMF se retiró al vacío y al residuo se le añadió H2O (40 ml) y EtOAc (80 ml). La capa orgánica se separó, se lavó con agua y salmuera, y se evaporó. El residuo se purificó por cromatografía en columna (SO 2, Et3N al 1 % en hexano/EtOAc = 2/1) para producir el producto como un aceite amarillo pálido (3,65 g, 93 %). 1H RMN (500 MHZ, CDaCl, 8 del TMS): 7,41 - 7,22 (m, 5H), 7,06 (d, J = 7,6 Hz, 2H), 6,80 (m, 2H), 4,95 (s, 2H), 4,66 (s, 1H), 4,52 (m, 1H), 3,43 (s, 4H), 3,36 (s, 4H), 3,23 (m, 1H), 3,02 (m, 1H), 2,78 (m, 1H), 2,51 (m, 1H), 1,44 - 1,27 (m, 36H). 13C{1H} RMN (125,7 MHZ, CD3Cl, 8 del TMS): 171,72, 170,80, 154,25, 131,20, 130,1, 115,35, 81,20, 81,05, 63,40, 56,30, 55,20, 53,65, 35,65, 28,20. ESI: m/z 713,5 [M+H]+; calculado.: 713,4.
Acetato de N,N,N',N'-4-(2,3-diaminopropil)fenol-tetra-terc-butilo (50): Se añadió Pd/C (10 %, 250 mg) a una solución de 49 (600 mg, 0,84 mmol) en MeOH (20 ml). La mezcla de reacción se desgasificó con un globo de H2 durante tres veces y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas con control de la reacción por CL-EM. La mezcla se filtró y el filtrado se concentró para dar un aceite amarillo claro que se purificó adicionalmente por cromatografía en columna: DCM/EtOAc (Et3N al 1 %, 0-20 %, v/v). Aceite incoloro: 460 mg (74 %). 1H RMN (500 MHZ, CD3Cl, 8 del TMS): 7,07 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 6,71 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 4,02 (s, 1H), 3,49 (d, J = 3,1 Hz, 4H), 3,43 (d, J = 3,3 Hz, 4H), 3,12 - 3,03 (m, zH), 2,89 (dd, J = 13,4, 7,2 Hz, 2H), 2,82 (dd, J = 13,8, 5,6 Hz, 2H), 2,62 - 2,51 (m, 2H), 1,45 (s, 18H), 1,41 (s, 18H). 13C{1H} RMN (125,7 MHZ, CD3Cl, 8 del TMS): 171,39, 170,95, 153,78, 132,35, 130,31, 115,07, 82,56, 80,69, 63,38, 56,27, 55,20, 53,59, 35,97, 28,14. ESI: m/z 623,4 [M+H]+; calculado.: 623,4.
N, N,N',N'-4-(2,3-diaminopropil)fenol-tetraacetato (51): Se disolvió 50 (200 mg, 0,32 mmol) en una mezcla de TFA, agua y triisopropilsilano (TIPS) en una relación de 92,5:2,5:5 y la reacción se agitó durante 2 horas con control por CL-EM. El disolvente se retiró a presión reducida y el residuo se purificó por HPLC preparativa para producir un sólido blanco (100 mg, 78 %). 1H RMN (500 MHZ, D2O, 8): 7,02 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 6,73 (d, J = 7,6 Hz, 2H), 3,78-3,42 (m, 9H), 3,10 (m, 2H), 2,91 (m, 1H), 2,49 (m, 1H). 13C{1H} RMN (125,7 MHZ, D2O, 8): 173,25, 170,85, 154,43, 130,40, 128,09, 115,72, 60,83, 55,29, 54,46, 52,54, 31,64. ESI: m/z 399,3 [M+H]+; calculado.: 399,2.
Na[Mn(TyOH-EDTA)] (52): Este complejo se preparó in situ. En primer lugar, una solución de 51 (8,3 mg) en 2,0 ml de tampón HEPES (100 mM, pH = 7,4) se preparó junto con una solución 4,19 mM de MnCh en HEPES. Estas soluciones se mezclaron en diferentes relaciones y el T2 del disolvente agua se midió en 1,4 T. A partir de un diagrama de 1/T2 frente a [Mn], se determinó la concentración de ligando exacta. en este diagrama, 1/T2 aumenta linealmente con [Mn] hasta [Mn] = [ligando] y después la pendiente aumenta en un factor de 10. Para este ejemplo, la [ligando] fue 2,16 mM. Después, se mezcló una alícuota de esta solución de ligando normalizada con 0,95 equiv. de MnCh en tampón HEPES y se midió la concentración por EM-PAI.
N3P3-(TyOH-EDTA)6 protegido con terc-butilo (53): Se añadieron 51 (547 mg, 0,83 mmol) y carbonato de cesio (318 mg, O, 97 mmol) a 0 °C a una solución de hexaclorociclotrifosfazeno (45,6 mg, 0,131 mmol) en acetonitrilo seco reciente (20 ml) en atmósfera de N2. La mezcla de reacción se agitó a 45 °C durante 2 días y se usó RMN de 1H (presencia de pico orto H a 8 = 6,90 para el producto frente a 8 = 6,73 para el material de partida) y RMN de 31P (aparición de pico 5 = 7,81) para controlar la reacción. Después de enfriar la mezcla hasta temperatura ambiente, las sales se retiraron por centrifugación, y la solución transparente se concentró a presión reducida y se sometió a cromatografía ultrarrápida (Et3N al 1 %, DCM/EtOAc) para producir éster terc-butílico hexamérico como un aceite amarillo pálido (420 mg, 82 %). 1H RMN (500 MHZ, CD3Cl, 8 del TMS): 7,07 (d, J = 8,3 Hz, 12H), 6,90 (d, J = 8,6 Hz, 12H), 3,47 (d, J = 8,3 Hz, 24H), 3,43 (d, J = 4,9 Hz, 24H), 3,11-3,07 (m, 6H), 2,93-2,83 (m, 12H), 2,63-2,53 (m, 12H), 1,43 (s, 108H), 1,39 (s, 108H). 13C{1H} RMN (125,7 MHZ, CD3Cl, 8 del TMS): 171,31, 170,94, 130,15, 120,69, 80,66, 80,56, 63,42, 56,35, 55,40, 53,65, 28,26, 28,24.
31P RMN (202 MHZ, CD3Cl, 8): 7,81. ESI: m/z 1934,0 [M+2H]2+; calculado.: 1933,6.
N3P3-(TyOH-EDTA)6 (54): Se disolvió 53 (410 mg, 0,11 mmol) en una mezcla de TFA, agua, tioanisol, fenol y etanoditiol en una relación de 82,5:5:5 y la solución de reacción se agitó durante 12 horas a temperatura ambiente con control de la reacción por CL-EM. La solución se enfrió en un baño de hielo y se añadió éter dietílico (50 ml) frío para precipitar el producto. El producto precipitado se aisló por centrifugación y se lavó tres veces con éter para obtener un sólido blanco (195 mg, 77 %). 1H RMN (500 MHZ, D2O, 8): 7,15 (d, J = 8,2 Hz, 12H), 6,84 (d, J = 8,2 Hz, 12H), 3,69 (d, J = 16,7 Hz, 12H), 3,55 (m, 24H), 3,45 (d, J = 16,7 Hz, 12H), 3,29 (m, 6H), 3,11 (m, 12H), 2,78 - 2,60 (m, 6H). 13C{1H} RMN (125,7 MHZ, D2O, 8): 174,12, 171,36, 163,06, 162,78, 148,66, 133,63, 130,78, 121,30, 117,43, 115,11,61,16, 57,08, 54,88, 54,61, 31,71. 31P RMN (202 MHZ, D2O, 8): 8,57.
Mn6[N3P3-(TyOH-EDTA)6] (55): Este complejo se preparó in situ. En primer lugar, una solución de 54 (11,3 mg) en 2,0 ml de tampón HEPES (100 mM, pH = 7,4) se preparó junto con una solución 4,19 mM de MnCh en HEPES. Estas soluciones se mezclaron en diferentes relaciones y el T2 del disolvente agua se midió en 1,4 T para determinar la concentración del ligando hexamérico como se describe para el compuesto 48. Como el ligando hexamérico contiene 6 restos de EDTA, un ligando hexamérico se unirá a 6 equivalentes de Mn. En función de este resultado, se mezclaron entonces 60 mg de ligando hexamérico con 24,3 mg de MnC^4H2O en 2,0 ml de agua desionizada y el pH se ajustó cuidadosamente hasta 7,4 con adición de NaOH 0,2 M. Esto representa un ligero (2 %) exceso de MnCh para garantizar quelación total. El exceso de Mn2+ se separó del complejo hexamérico aniónico pasando la solución a través de una columna de intercambio catiónico (Alltech, IC-Na) para retirar el exceso de Mn2+. El producto final se obtuvo por liofilización como un sólido blanco (60 mg, 85 %).
Las capacidades de relajación de los compuestos para las fórmulas (XI) y (XII) se determinaron a diferentes fuerzas de campo a 37 °C en tampón HEPES pH 7,4. La capacidad de relajación se obtuvo de la pendiente de un diagrama de 1/T1 frente a [Mn] para diferentes concentraciones de Mn. Como la fórmula (XI) contiene 6 Mn por molécula, las relajaciones iónica (por Mn) y molecular (por molécula) se dan a continuación.
Tabla 4. Relajaciones (n en m M 'V ) de compuestos de las fórmulas (XI) y (XII) medidas a diferentes fuerzas de campo a 37 °C en tampón HEPES pH 7,4.
Por tanto, la invención proporciona agentes de contraste para imágenes de resonancia magnética, y métodos para preparar los agentes de contraste.
Aunque la presente invención se ha descrito en detalle con referencia a determinadas realizaciones, un experto en la materia apreciará que la presente invención puede ponerse en práctica mediante otras realizaciones distintas de las descritas, que se han presentado con fines de ilustración y no de limitación. Por lo tanto, el alcance de las reivindicaciones adjuntas no debe limitarse a la descripción de las realizaciones contenidas en este documento.
Claims (1)
- REIVINDICACIONES1. Un agente de contraste para imágenes de resonancia magnética, comprendiendo el agente de contraste un compuesto de fórmula (Ia), (Ib), (Ic) o (Id):
o una sal farmacéuticamente aceptable del compuesto,en la que R1 se selecciona del grupo que consiste en alquileno sin sustituir, cicloalquileno sin sustituir, heterocicloalquileno sin sustituir, arileno sin sustituir, heteroarileno sin sustituir, dialquilenareno y dialquilenheteroareno,en la que R2 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, halo, ciano, nitro, hidroxi y alcoxi,en la que n es 2 o 3, yen la que el compuesto opcionalmente incluye agua coordinada con Mn cuando n es 2.2. El agente de contraste de la reivindicación 1, en el que el compuesto tiene fórmula (II):
o el compuesto tiene fórmula (III):
o el compuesto tiene fórmula (Vb):
4. El agente de contraste de la reivindicación 1, en el que R2 es metoxi o nitro.5. El agente de contraste de la reivindicación 1, en el que al menos uno de R1 y R2 comprende un resto de dirección que puede abordar una región de interés en un sujeto, donde el resto de dirección se selecciona, preferiblemente, de proteínas, enzimas, péptidos, anticuerpos y fármacos.6. El agente de contraste de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el agente de contraste tiene una mayor capacidad de relajación cuando n = 2.7. El agente de contraste de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6en el que el compuesto es convertible in vivo de la fórmula (Ia), (Ib), (Ic) o (Id) en la que n = 3 en la fórmula (Ia), (Ib), (Ic) o (Id) en la que n = 2, oen el que el compuesto es convertible in vivo por un agente reductor biológico de la fórmula (Ia), (Ib), (Ic) o (Id) en la que n = 3 en la fórmula (Ia), (Ib), (Ic) o (Id) en la que n = 2.8. El agente de contraste de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable incluyendo un agente reductor para reducir el compuesto de la fórmula (Ia), (Ib), (Ic) o (Id) en la que n = 3 en la fórmula (Ia), (Ib), (Ic) o (Id) en la que n = 2.. Un agente de contraste para imágenes de resonancia magnética, comprendiendo el agente de contraste un compuesto e fórmula (VIa), (VIb) o (V ic):
una sal farmacéuticamente aceptable del compuesto,en la que R1 se selecciona del grupo que consiste en alquileno sin sustituir, cicloalquileno sin sustituir, heterocicloalquileno sin sustituir, arileno sin sustituir, heteroarileno sin sustituir, dialquilenareno y dialquilenheteroareno,en la que R3 se selecciona del grupo que consiste en alquileno sin sustituir, cicloalquileno sin sustituir, heterocicloalquileno sin sustituir, arileno sin sustituir, heteroarileno sin sustituir, dialquilenareno y dialquilenheteroareno,en la que R4 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, halo, ciano, nitro, hidroxi y alcoxi,en la que X es N o NH,en la que el compuesto opcionalmente incluye agua coordinada con Mn cuando X es NH, yen la que X se coordina con Mn cuando X es N.10. Un agente de contraste para imágenes de resonancia magnética, comprendiendo el agente de contraste un compuesto de fórmula (IX):
11. Un agente de contraste para imágenes de resonancia magnética, comprendiendo el agente de contraste un compuesto de fórmula (X):
o una sal farmacéuticamente aceptable del compuesto,en la que R5 es una estructura central, yen la que n es un número entero de 1 a 12.12. Un agente de contraste para imágenes de resonancia magnética, comprendiendo el agente de contraste un compuesto de fórmula (XII):
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