ES2871779T3 - Procedimiento y dispositivo para detectar parámetros en cultivos líquidos - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la determinación de los parámetros del proceso mediante espectroscopia de fluorescencia 2D en cultivos líquidos en varios microrreactores (2a) de al menos una placa de microtitulación, que se agita continuamente con un agitador orbital (5) al menos hasta el final del cultivo en todos los microrreactores, en donde los espectros de fluorescencia 2D de los cultivos líquidos se registran durante el cultivo con al menos un dispositivo de medición desacoplado del movimiento de agitación de la placa de microtitulación con los siguientes pasos: 1.1 generación de luz de excitación monocromática, cuya longitud de onda de excitación se modifica gradualmente, 1.2 aplicación sucesiva de luz de excitación con diferentes longitudes de onda de excitación en el cultivo líquido en uno de los microrreactores, 1.3 transferencia de los espectros de emisión del cultivo líquido en el microrreactor a un elemento óptico, que descompone el espectro de emisión en cada longitud de onda de excitación en las diferentes longitudes de onda y las reproduce sobre una matriz de sensores (7) con sensores sensibles a la luz, 1.4 registro del espectro de fluorescencia 2D detectando la intensidad de las diferentes longitudes de onda para cada espectro de emisión utilizando la matriz de sensores, y 1.5 registro de los espectros de fluorescencia 2D de los cultivos líquidos en otros microrreactores de la al menos una placa de microtitulación con los pasos 1.1 -1.4.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento y dispositivo para detectar parámetros en cultivos líquidos

La invención se refiere a un procedimiento y un dispositivo para detectar los parámetros del proceso mediante espectroscopia de fluorescencia 2D en cultivos líquidos en una pluralidad de microrreactores de al menos una placa de microtitulación, que se agita continuamente con un agitador orbital al menos hasta la finalización de la reacción en todos los microrreactores.

Los procedimientos y dispositivos para registrar los parámetros del proceso en cultivos microbianos en una pluralidad de microrreactores de una placa de microtitulación, que se agita continuamente con un agitador orbital al menos hasta la finalización de la reacción en todos los microrreactores, se conocen a partir del documento EP 1 730 494 B1. El procedimiento conocido es especialmente adecuado para el registro automatizado de los parámetros del proceso de los cultivos microbianos, que se agitan continuamente hasta la finalización de la reacción en todos los microrreactores. Por ejemplo, la fluorescencia de las proteínas fluorescentes o los aminoácidos y la retrodispersión de la luz como medida de la concentración de biomasa se registran como parámetros del proceso.

El dispositivo para llevar a cabo el procedimiento, que se conoce a partir del documento EP 1730 494 B1, tiene una plataforma de microrreactores que está conectada a un agitador orbital y sobre la que se dispone una placa de microtitulación con una base transparente, que se agita continuamente de forma orbital en todos los microrreactores hasta que se completa la reacción. Los parámetros del proceso se detectan mediante un sensor óptico que comprende un sensor fotosensible, una fuente de luz y al menos una guía de ondas. Un extremo de la guía de ondas se traslada de microrreactor a microrreactor utilizando una unidad de posicionamiento x-y por debajo de la placa de microtitulación. En el extremo de la guía de ondas, que tiene preferiblemente forma de Y, se acopla la luz de una fuente luminosa, mientras que un sensor de luz se acopla al otro ramal de la guía de ondas en forma de Y. La guía de ondas no se mueve durante la adquisición de los parámetros del proceso, por lo que los microrreactores agitados se mueven con respecto a la guía de ondas óptica. El movimiento relativo resultante entre los microrreactores y la guía de ondas, que es estacionaria para la medición, no es problemático siempre que la radiación electromagnética se aplique exclusivamente en uno solo de los microrreactores y la radiación electromagnética (emisión), emitida desde el microrreactor como resultado de la radiación electromagnética introducida (luz de excitación), sea detectada exclusivamente por el sensor de luz de la óptica del sensor. La radiación electromagnética aplicada se aplica con una longitud de onda de excitación específica. En consecuencia, el procedimiento conocido sólo puede detectar los parámetros de proceso de las sustancias, que muestran actividad de fluorescencia sobre la radiación electromagnética irradiada o retrodispersión.

David A Ullisch, "A Fundamental Research of Growth, Metabolism and Product Formation of Tobacco Suspension Cells at Different Scales", 2 de enero de 2012 (2012-01-02), páginas 1-141, URL:http://darwin.bth.rwthaachen.de/opus3/volltexte/2012/4301/pdf/4301.pdf divulga cómo se determinan los niveles de GFP e YFP en las suspensiones de células vegetales. Tanto la ^g F^p como la YFP se miden fuera de línea en placas de microtitulación. La medición offline de YFP tiene un máximo de excitación a 525 nm y un máximo de emisión a 538 nm. Se eligió una frecuencia de agitación de sólo 500 rpm para resuspender las células. Para la medición se utilizó un Horiba Fluoromax 4P para escanear una banda de onda muy estrecha de 500 - 550 nm alrededor del máximo de excitación. E1Horiba Fluoromax 4P cuenta con una fuente de luz y un monocromador giratorio, que permite hacer pasar luz de diferentes longitudes de onda a través de una cubeta. En el lado de la emisión, el Horiba Fluoromax 4P dispone igualmente de un monocromador giratorio que dirige la longitud de onda deseada a un sensor de luz (fotomultiplicador) (véase " FluoroMax-4 & FluoroMax-4P con USB (extracto)", Manual de instrucciones, número de pieza J810005 rev. D, 30 de junio de 2012 (2012-06-30), URL:http://www.horiba.com/fileadmin/uploads/Scientific/Downlo ads/UserArea/Fluorescence/Manuals/FluoroMax4_4P_Manual_USB.pd f). La medición de YFP fuera de línea se realizó con una única longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 520 nm, utilizando un instrumento BioLector descrito en el documento EP 1730494 B1, reconocido al principio.

0005] KENSY FRANK ET AL: "Scale-up from microtiter plate to laboratory fermenter: evaluation by online monitoring techniques of growth and protein expression in Escherichia coli and Hansenula polymorpha fermentations", MICROBIAL CELL FACTORIES, vol. 8, No. 1, 22 de diciembre de 2009 (2009-12-22), Page 68, XP021067676, ISSN: 1475-2859 también describen una fermentación en un BioLector con una longitud de onda de excitación fija de 485 nm y una frecuencia de agitación de 995 rpm. Además, se divulga la posibilidad básica de instalar un sensor de fluorescencia en un BioLector, que se describe en el EP 1730494 B1 reconocido al principio.

STEFAN MAROSE ET AL: "Two-Dimensional Fluorescence Spectroscopy: A New Tool for On-Line Bioprocess Monitoring", BIOTECHNOLOGY PROGR, AMERICAN INSTITUTE OF CHEMICAL ENGINEERS, US, vol. 14, No. 1, 2 de enero de 1998 (1998-01-02), páginas 63-74, XP008146825, ISSN: 8756-7938 , revelan un sensor para una espectroscopia de fluorescencia 2D en un recipiente de agitación estacionario como biorreactor.

Partiendo de este estado de la técnica, la invención se basa en la tarea de crear un procedimiento que permita la detección de los parámetros del proceso incluso de sustancias que no presentan actividad fluorescente por sí mismas. Además, el procedimiento pretende permitir la determinación del estado fisiológico del cultivo líquido, así como de las tasas de transferencia de sustancia con relativamente poco esfuerzo y en poco tiempo. Por último, se pretende especificar un dispositivo para llevar a cabo el procedimiento.

La solución de esta tarea se basa en la idea de registrar los espectros de fluorescencia 2D en una variedad de cultivos líquidos, en particular diferentes, en microrreactores de placas de microtitulación agitadas.

En detalle, la tarea se resuelve mediante un procedimiento con las características de la reivindicación 1, así como mediante un dispositivo con las características de la reivindicación 27.

Con un espectrómetro de fluorescencia convencional, se tarda hasta 25 minutos en adquirir un único espectro de fluorescencia 2D, en un rango de longitud de onda de luz de excitación de 250-730 nm con una amplitud de paso de excitación de 10 nm.

Para una placa de microtitulación que comprende 48 microrreactores (pocillos), una medición, es decir, un espectro de fluorescencia 2D, sólo podría adquirirse cada 20,2 horas para cada microrreactor. Este intervalo de tiempo es claramente demasiado largo para controlar los cultivos paralelos en placas de microtitulación en línea.

Con la ayuda del procedimiento según la presente invención, así como un dispositivo para llevar a cabo el procedimiento, la adquisición de un espectro de fluorescencia 2D completo en el rango de excitación de 250-730 nm con una amplitud de paso de excitación de 10 nm puede reducirse a 24 segundos por microrreactor. Por lo tanto, la presente invención puede medir una placa de microtitulación completa que comprende 48 microrreactores en 30 minutos.

En la siguiente tabla, se comparan los tiempos de adquisición requeridos para los espectros de fluorescencia 2D para una placa de microtitulación de 48 pocillos así como para una placa de microtitulación de 96 pocillos entre la técnica anterior y la presente invención:

En una conformación ventajosa de la invención, la luz de excitación monocromática cuya longitud de onda de excitación se cambia gradualmente se genera, a partir de la luz incidente de una fuente de luz, utilizando un monocromador automáticamente sintonizable para aislar espectralmente diferentes longitudes de onda. La transmisión y la aplicación de la luz de excitación en los microrreactores individuales, así como la transmisión del espectro de emisión desde el microrreactor al elemento óptico, se realiza con la ayuda de un sistema de guiado de haces. El sistema de guiado de haces comprende un acoplador óptico, al menos una guía de ondas y, opcionalmente, otros elementos ópticos, como por ejemplo espejos semitransparentes. El acoplador óptico, dispuesto para aplicar la luz de excitación en el cultivo líquido de un microrreactor, así como para acoplar el espectro de emisión del cultivo líquido en el sistema de guiado de haces, puede estar formado, por ejemplo, por un extremo de una o más guías de ondas ópticas alineadas con el microrreactor. Alternativamente, lentes o disposiciones de lentes pueden formar el acoplador óptico. Durante la adquisición del espectro de fluorescencia 2D, el acoplador no se mueve, de modo que el microrreactor se mueve con respecto al acoplador óptico. Tras capturar el espectro de fluorescencia 2D, el acoplador óptico se traslada a otro microrreactor. Para garantizar una circulación regular del fluido durante la agitación, los microrreactores no tienen preferiblemente fuertes perturbaciones de corriente ni una sección transversal redonda.

Para aumentar el número de cultivos paralelos, se pueden montar múltiples placas de microtitulación sobre una plataforma de microrreactores, en donde los microrreactores de todas las placas de microtitulación se miden secuencialmente con un dispositivo de medición. El acoplador del dispositivo de medición se desplaza con la unidad de posicionamiento x-y no sólo por debajo de una sola placa de microtitulación, de microrreactor a microrreactor, sino por debajo de múltiples placas de microtitulación. Por ejemplo, si cuatro placas de microtitulación con 48 microrreactores están fijadas a una plataforma de microrreactores, se puede realizar un total de 192 cultivos paralelos.

Sin embargo, el intervalo de tiempo entre dos mediciones del mismo microrreactor aumenta con el número de cultivos paralelos. Por lo tanto, para aumentar la frecuencia de medición, en una conformación de la invención, se prevén múltiples dispositivos de medición para permitir la adquisición simultánea de espectros de fluorescencia 2D en diferentes microrreactores. Cuando los acopladores ópticos de los múltiples dispositivos de medición se trasladan con una unidad de posicionamiento entre los microrreactores de una o más placas de microtitulación, los diferentes microrreactores pueden acercarse de forma sincronizada y la alineación de cada acoplador por debajo de la placa de microtitulación puede realizarse de forma concordante. En esta conformación de la invención, los espectros de fluorescencia 2D pueden adquirirse simultáneamente en múltiples microrreactores de una o más placas de microtitulación.

Otra forma de reducir el tiempo requerido para medir los cultivos líquidos de una placa de microtitulación completa es medir múltiples microrreactores sin reposicionar el acoplador. Para ello, el diámetro de agitación del agitador orbital se ajusta, de forma que varios microrreactores giren sucesivamente sobre el acoplador óptico durante una rotación del agitador orbital, en donde los espectros de fluorescencia registrados se asignan a los microrreactores que giran sobre el acoplador óptico.

Para mejorar los resultados de la medición, en una realización ventajosa de la invención, el momento de medición y la posición del agitador están sincronizados. La posición del cultivo líquido en el microrreactor depende de la posición del agitador. Para esta sincronización, la aplicación de la luz de excitación se interrumpe en función de la posición del agitador orbital. En particular, la interrupción se realiza mediante un obturador. El obturador es un elemento opaco, deplazable mecánicamente, para interrumpir la trayectoria óptica de la luz de excitación. Sin embargo, como alternativa, la fuente de luz para generar la luz de excitación puede ser sincronizada en función de la posición del agitador. La posición del agitador orbital se determina mediante un transmisor de posición. Por ejemplo, un sensor Hall y un imán fijado al árbol del agitador orbital pueden considerarse para determinar la posición. Como alternativa, se puede utilizar una barrera de luz. Una ventaja significativa de la aplicación de la luz de excitación sincronizada con la posición del agitador orbital es que se pueden medir zonas claramente definidas del microrreactor, por ejemplo la media luna de líquido del cultivo líquido que se configura durante el movimiento de agitación.

Durante la adquisición de espectros de fluorescencia 2D con un dispositivo de medición según la invención, la luz de excitación reflejada es inevitablemente recogida por la matriz de sensores durante cada medición. En particular, a altas densidades celulares en un cultivo líquido, puede producirse una fuerte retrodispersión de la luz de excitación aplicada, lo que provoca una sobrecarga de los sensores individuales de la matriz de sensores. Esta sobrecarga puede provocar errores de medición en los sensores adyacentes de la matriz. En una conformación ventajosa de la invención, por lo tanto, la longitud de onda de excitación en el espectro de emisión se diafragma. Preferiblemente, la longitud de onda de excitación que cambia continuamente puede dirigirse más allá de la matriz de sensores cambiando selectivamente la posición del elemento óptico de aquella zona del espectro de emisión, cuya longitud de onda es menor o igual a la longitud de onda de excitación. Como alternativa, se puede utilizar un diafragma móvil entre el elemento óptico y la matriz de sensores para diafragmar la longitud de onda de excitación. La diafragmación de la longitud de onda de excitación prevista según la invención permite intensidades más altas de la luz de excitación. La mayor intensidad de excitación conduce a espectros de emisión con señales de fluorescencia más fuertes y, en última instancia, a valores medidos mejorados (espectros de fluorescencia 2D).

Con el fin de aumentar la densidad de energía de la luz de excitación, se prevé en una conformación ventajosa que la luz de excitación es paralelizada o enfocada antes de la aplicación en el cultivo líquido. En particular, un colimador puede considerarse como una lente para paralelizar la luz de excitación. El nivel de energía más alto de la luz de excitación es particularmente ventajoso, si se va a registrar un espectro de fluorescencia 2D durante una revolución del agitador orbital por medio de un dispositivo de medición en una pluralidad de microrreactores que orbitan por encima del acoplador. Además, el espectro de emisión que se va a acoplar al sistema de guiado de haces, en particular la guía de ondas, puede ser enfocado.

En una conformación ventajosa de la invención, la retrodispersión de la luz de excitación irradiada en el cultivo líquido es detectada por un sensor sensible a la luz separado del dispositivo de medición. A partir de la retrodispersión, se puede obtener información sobre el comportamiento del crecimiento o la morfología de los microorganismos durante la reacción en el medio de cultivo del cultivo líquido. La dispersión de la luz se transmite preferiblemente al sensor sensible a la luz a través de otra guía de ondas.

La guía de ondas para la aplicación de la luz de excitación y la guía de ondas adicional para la transmisión de la retrodispersión están preferiblemente dispuestas una respecto de la otra en el acoplador del sistema de guiado de haces, de tal manera que el foco de ambas guías de ondas se encuentra en un punto. Esta disposición tiene la ventaja de que no es necesario realinear el acoplador para medir la retrodispersión y, por tanto, ambas mediciones pueden realizarse en intervalos de tiempo más cortos. Alternativamente, la guía de ondas puede estar dispuesta de tal manera, que la luz dispersa guiada más allá de la matriz de sensores por medio del elemento óptico móvil o la luz dispersa reflejada por el diafragma se acopla en un extremo de la guía de ondas.

El sistema de guiado de haces puede ser implementado usando dos guías de ondas separadas, una para la luz de excitación y otra para el espectro de emisión o una guía de ondas y con fibras separadas para la luz de excitación y el espectro de emisión. En una conformación alternativa del sistema de guiado de haces, la luz de excitación es redirigida por un espejo semitransparente y aplicada en el cultivo líquido a través de una guía de ondas de fibra única. El espectro de emisión se transmite en el sistema de guiado de haces a través de la guía de ondas y el espejo semitransparente al elemento óptico, que despliega el espectro de emisión en la matriz de sensores. Dado que la luz de excitación y el espectro de emisión son guiados por una sola fibra en comparación con el sistema de guiado de haces con guía de ondas y, el radio de la guía de ondas única puede reducirse en general en comparación con la guía de ondas y de dos fibras y, por lo tanto, la radiación de excitación puede enfocarse mejor. Se puede evitar la diafonía con microrreactores adyacentes.

Al integrar un robot de pipeteo en el dispositivo, se pueden tomar automáticamente muestras del cultivo líquido de los microrreactores individuales en diferentes momentos de la reacción con la ayuda del robot de pipeteo, y estas muestras pueden ser analizadas fuera de línea con respecto a ciertos parámetros del proceso. Además, es posible una adición de sustancias.

Para calibrar el proceso, se pueden crear modelos quimiométricos a partir de los espectros de fluorescencia 2D registrados en los diferentes momentos de muestreo, con un pequeño consumo de tiempo. Como parte de la modelización quimiométrica, se determinan relaciones matemáticas y/o estadísticas entre los parámetros del proceso analizados fuera de línea y los espectros de fluorescencia 2D de los cultivos líquidos en los microrreactores individuales, registrados en los diferentes momentos de muestreo. El modelo quimiométrico permite determinar a continuación los parámetros del proceso del cultivo líquido a partir de un espectro de fluorescencia 2D.

Cuando las reacciones de los cultivos líquidos bajo condiciones coincidentes ocurren en paralelo en múltiples microrreactores, la densidad de datos puede incrementarse adquiriendo y analizando los espectros de fluorescencia 2D registrados desplazados en el tiempo de los cultivos líquidos en estos microrreactores sobre un vector de tiempo.

En una conformación de la invención, con el fin de eliminar completamente la necesidad de realizar análisis fuera de línea de muestras individuales para la calibración del procedimiento, se propone que las reacciones en los cultivos líquidos tengan lugar en condiciones coincidentes en múltiples microrreactores, donde los valores iniciales del parámetro del proceso que se va a detectar, por ejemplo las concentraciones de nutrientes o productos (secundarios), son diferentes en los múltiples microrreactores. La influencia de los diferentes valores iniciales en los espectros de fluorescencia 2D registrados se utiliza para desarrollar el modelo quimiométrico.

Otra forma de crear un modelo quimiométrico sin análisis fuera de línea de las muestras de los cultivos líquidos es hacer que las reacciones en los cultivos se ejecuten en condiciones coincidentes en varios microrreactores, por lo que en diferentes momentos se añade un analito a los cultivos líquidos en cada uno de los microrreactores mencionados, lo que cambia el parámetro del proceso a detectar en el cultivo de una manera definida, de modo que, por ejemplo, se producen saltos de concentración conocidos. Esto hace que las reacciones en los diferentes microrreactores ya no se produzcan en las mismas condiciones. La influencia del cambio definido del parámetro del proceso en el espectro de fluorescencia 2D registrado del respectivo cultivo líquido se utiliza entonces para crear el modelo quimiométrico.

Otra forma de evitar el análisis fuera de línea de los parámetros del proceso para la calibración es que la relación funcional, que subyace al cambio de un parámetro del proceso en uno de los cultivos líquidos, se describa mediante un modelo mecanicista-matemático. Al principio de la reacción, se asumen los parámetros del modelo mecanicistamatemático, que se permite que sean erróneos. Los parámetros del proceso determinados sobre la base del modelo matemático se comparan con los espectros de fluorescencia 2D registrados en diferentes momentos de la reacción y los parámetros del modelo se corrigen continuamente en función de la comparación. Como resultado, el proceso puede representarse mejor con cada espectro de fluorescencia 2D medido. Al final de la calibración, se dispone de un modelo mecanístico-matemático, además de un modelo quimiométrico, que describe bien el proceso.

Con el procedimiento según la invención, no sólo se puede determinar la concentración de sustancias individuales, sino también la actividad respiratoria, por ejemplo la tasa de transferencia de oxígeno (OTR), sobre la base de los espectros de fluorescencia 2D registrados con la ayuda de modelos quimiométricos. No es necesario el equipo que habitualmente se requiere para la determinación de las actividades respiratorias y la actividad respiratoria puede determinarse directamente a partir de los espectros de fluorescencia 2D, registrados en el respectivo cultivo sobre la base de un modelo quimiométrico previamente determinado por calibración.

A continuación, el procedimiento según la invención y un dispositivo para llevar a cabo el procedimiento se explican con más detalle con referencia a las figuras. Aquí muestran:

la figura 1: un diagrama esquemático de un dispositivo según la invención para la determinación de los parámetros del proceso mediante espectroscopia de fluorescencia 2D (medición) en cultivos líquidos, en varios microrreactores de una placa de microtitulación agitada,

la figura 2: una representación esquemática de un sistema óptico para registrar un espectro de fluorescencia 2D en un dispositivo según la figura 1,

la figura 3 A, B: dos representaciones respectivamente de un segmento de medición dentro de un microrreactor, la figura 4 A-C: una medición en múltiples microrreactores sin reposicionar un acoplador de un sistema de guiado de haces del dispositivo de la figura 1,

la figura 5 A,B: dos formas de realización de una óptica según la figura 2, que están dispuestas para diafragmar una retrodispersión,

la figura 6 A,B: el uso de componentes ópticamente activos para mejorar la sensibilidad de las mediciones,

la figura 7: una representación esquemática de una disposición de guías de ondas para la detección simultánea de un espectro de emisión y de la retrodispersión por debajo de la placa de microtitulación,

la figura 8: una representación esquemática del dispositivo según la figura 1 con un sistema de guiado de haces diferente,

la figura 9: una estructura esquemática de un dispositivo según la invención para la determinación simultánea de los parámetros del proceso, mediante espectroscopia de fluorescencia 2D en cultivos líquidos en varios microrreactores, estando los microrreactores dispuestos en diferentes placas de microtitulación,

la figura 10 A,B: una comparación de la medición de un solo cultivo líquido a la vez sobre una placa de microtitulación (A) y la medición simultánea de varios cultivos líquidos en diferentes microrreactores sobre una placa de microtitulación (B) ,

la figura 11: un diagrama esquemático que ilustra el aumento de la densidad de datos a partir de las mediciones de reacciones coincidentes en diferentes microrreactores,

la figura 12: otro diagrama esquemático que ilustra el aumento de la densidad de datos de las mediciones de reacciones coincidentes en diferentes microrreactores, omitiendo las mediciones en microrreactores vacíos,

la figura 13: una comparación de un modo de proceder convencional para elaborar un modelo quimiométrico basado en espectros de fluorescencia 2D en fermentadores de recipiente de agitación individuales (A), con el modo de proceder para elaborar un modelo quimiométrico según la invención (B),

la figura 14: ilustra la elaboración de un modelo quimiométrico basado en los espectros de fluorescencia 2D en placas de microtitulación agitadas continuamente, añadiendo analitos de interés en diferentes momentos del cultivo,

la figura 15: muestra los espectros de fluorescencia 2D registrados durante el cultivo de Escherichia coli en un medio mínimo, con una concentración inicial de glucosa de 8 g L-1 y una concentración inicial de sorbitol de 1,5 g L-1 en una placa de microtitulación,

la figura 16: muestra la evolución de la concentración de glucosa, sorbitol y biomasa, así como el valor del pH del cultivo según la figura 15.

La figura 1 muestra un diagrama esquemático de un dispositivo según la invención para determinar los parámetros del proceso, como la concentración de sustrato, proteína y biomasa, así como las tasas de transferencia de masa, mediante espectroscopia de fluorescencia 2D en una variedad de diferentes cultivos líquidos en microrreactores de una placa de microtitulación agitada.

El dispositivo comprende una plataforma de microrreactores (4) conectada a un agitador orbital (5), sobre la que se dispone al menos una placa de microtitulación (2) que comprende una pluralidad de microrreactores (2a). Al menos las superficies inferiores de los microrreactores (2a) de la placa de microtitulación son transparentes a la radiación electromagnética, emitida y recibida por un dispositivo de medición. El dispositivo de medición comprende una fuente de luz (8) y un monocromador (15) sintonizable automáticamente. El monocromador (15) está dispuesto para aislar espectralmente diferentes longitudes de onda de la luz incidente de la fuente de luz (8), para producir una luz de excitación monocromática, cuya longitud de onda de excitación se cambia automáticamente por etapas. El dispositivo de medición comprende además un sistema de guiado de haces (3), que en el ejemplo de realización ilustrado está formado por una guía de ondas en forma de y (3a) y un acoplador (3b). Las fibras ópticas de los dos ramales de la guía de ondas en forma de y (3a) convergen en la zona del acoplador (3b).

El sistema de guiado de haces (3) transmite la luz de excitación desde el monocromador (15) al cultivo líquido, en cada uno de los microrreactores (2a) de la placa de microtitulación (2), y el espectro de emisión desde el cultivo líquido en el microrreactor respectivo (2a) a un elemento óptico (13), por ejemplo un prisma o una rejilla. El elemento óptico (13) divide el espectro de emisión (16) en cada longitud de onda de excitación en las diferentes longitudes de onda y reproduce el espectro de emisión desplegado (extendido) sobre una matriz de sensores (7), que está diseñada en particular como un sensor CCD. Las señales registradas de la matriz de sensores se evalúan mediante un ordenador (6).

El acoplador (3b) del sistema de suministro de haces (3) está dispuesto en un ángulo agudo de, por ejemplo, 35 grados con respecto a la vertical en una unidad de posicionamiento x-y (1) y está dirigido a las superficies inferiores transparentes de los microrreactores individuales (2a).

Además, entre la fuente de luz (8) y el monocromador sintonizable (15) hay un obturador (14), dispuesto para una interrupción de la luz de excitación controlada por el ordenador (6) o la cámara CCD que comprende la matriz de sensores (7), dependiendo de la posición de la plataforma de microrreactores (4). La posición de la plataforma de microrreactores (4) se detecta mediante un sensor de posición (11), que en el ejemplo de realización ilustrado está formado por un imán (11b) dispuesto en el árbol del agitador orbital y un sensor Hall (11a). Por supuesto, también se pueden considerar otras técnicas para controlar la posición del agitador, en particular las mediciones de posición ópticas o inductivas.

La figura 2 ilustra cómo el espectro de emisión (16) de la guía de ondas (3a) se acopla al elemento óptico (13). El elemento óptico (13) separa el espectro de emisión (16) en sus longitudes de onda individuales y lo reparte por la matriz de sensores (7). Esta disposición óptica crea bandas en la matriz de sensores (7) para las distintas longitudes de onda y la intensidad del espectro de emisión en las distintas longitudes de onda puede determinarse mediante la matriz de sensores (7). La estructura formada por el elemento óptico (13) y la matriz de sensores (7) ilustrada en la figura 2 permite el registro simultáneo de un espectro de emisión completo, tras la excitación del cultivo líquido mediante una radiación de excitación con una longitud de onda de excitación. El registro simultáneo de las intensidades de las diferentes longitudes de onda de cada espectro de emisión supone un considerable ahorro de tiempo durante la medición.

El registro de los espectros de fluorescencia 2D se sincroniza con la posición de la plataforma de microrreactores (4) y, por tanto, con el cultivo de líquido en el respectivo microrreactor (2a) mediante el obturador (14) de forma asistida por ordenador. Dependiendo de la posición del agitador/líquido con respecto a la posición del acoplador óptico (3a), la trayectoria óptica de la luz de excitación se libera durante un período de tiempo definido con la ayuda del obturador mecánico (14). La sincronización garantiza que la luz de excitación caiga en el microrreactor (2a), que gira por encima del acoplador estacionario (3b), en un momento y posición definidos durante la medición. Tras la detección del espectro de emisión (16), es decir, tras la finalización de la medición, la trayectoria del haz óptico de la luz de excitación se cierra de nuevo mediante el obturador mecánico (14), de modo que no pueda entrar más radiación de excitación en el microrreactor (2a). Una ventaja significativa de la sincronización es que se puede examinar un segmento de medición definido (18) del microrreactor (2a), como se muestra esquemáticamente en la figura 3, y así, por ejemplo, se puede tener en cuenta específicamente la media luna de líquido (17) del cultivo líquido que gira en el microrreactor (2a). El segmento de medición (18) es la zona en la que la luz de excitación se acopla, de forma controlada en posición, en uno de los microrreactores (2a) de una placa de microtitulación agitada (2) al medir un espectro de emisión.

La figura 3 muestra dos segmentos de medición (18). Mediante un retardo ajustable del inicio de la medición utilizando la información del sensor de posición, la medición puede iniciarse específicamente en cualquier posición durante la rotación del microrreactor (2a) por encima del acoplador (3b). Variando el tiempo de integración de los segmentos de la señal de medición de la matriz de sensores (7), se pueden investigar las señales de medición de diferentes longitudes dentro de cada microrreactor (2a). En la figura 3A, el segmento de medición (18) se extiende desde el microrreactor vacío (2a) hasta la media luna de líquido (17), lo que puede distorsionar el espectro de emisión. Según la figura 3B, el segmento de medición (18) se encuentra exclusivamente dentro de la media luna de líquido (17), de modo que durante la medición sólo se registra el espectro de emisión del cultivo líquido, lo cual es deseable.

Para reducir el tiempo necesario para registrar los espectros de emisión (16) de los cultivos líquidos en todos los microrreactores (2a) de una placa de microtitulación (2), en una conformación de la invención se puede examinar una pluralidad de microrreactores (2a) sin reposicionar el acoplador (3b). La ventaja de tiempo se debe a que se requiere menos tiempo para reposicionar el acoplador (3b) por debajo de los microrreactores (2a). En este principio de medición, es ventajoso colocar el acoplador (3b) por debajo de la placa de microtitulación (2), de manera que la luz de excitación incida verticalmente en cada microrreactor (2a). Esta estructura se muestra esquemáticamente en la Figura 4A. Además, la posición del acoplador (3b) con respecto a la placa de microtitulación agitada (2) se elige de manera que el centro del movimiento de rotación de la placa de microtitulación (2) se encuentre exactamente entre una pluralidad de microrreactores (2a), como se muestra en la figura 4B para dos microrreactores y en la figura 4C para cuatro microrreactores. Dado que la radiación electromagnética (19) de la luz de excitación se aplica sucesivamente en una pluralidad de microrreactores (2a) por cada revolución del agitador orbital (5) en un dispositivo configurado según la figura 4, se puede medir una pluralidad de microrreactores (2a) sin necesidad de reposicionar el acoplador (3b). Por lo tanto, para medir todos los microrreactores (2a) de una placa de microtitulación (2), se requieren menos movimientos del acoplador (3b) mediante la unidad de posicionamiento x-y (1), lo que puede acelerar sustancialmente la medición. Por ejemplo, si el acoplador (3b) se coloca en el centro de cuatro microrreactores adyacentes (2a), como se muestra en la figura 4c , sólo es necesario abordar 24 posiciones en lugar de 96 mediante la unidad de posicionamiento x-y (1), para medir todos los microrreactores de una placa de microtitulación de 96 pocillos. Esto ahorra una cantidad considerable de tiempo al medir todos los microrreactores (2a) de la placa de microtitulación (2). La asignación de los espectros de emisión de los respectivos microrreactores (2a) durante una rotación de la plataforma de microrreactores (4) puede realizarse mediante el uso el transmisor de posición (11). El transmisor de posición (11) detecta qué microrreactor (2a) está en el foco del acoplador (3b) y en qué momento de la rotación. Otra ventaja de los microrreactores múltiples (2a), que orbitan por encima de un acoplador óptico, (3b) es que se pueden utilizar diámetros de agitador más grandes (preferiblemente 6 mm, 9 mm, 12,5 mm o más). Los diámetros de agitación más grandes permiten que las velocidades de rotación del agitador orbital (5) sean menores, para crear una media luna de líquido en rotación (17) en los microrreactores (2a). Además, los diámetros de agitación más grandes son especialmente adecuados para la investigación de cultivos de líquidos con mayor viscosidad, como los que pueden surgir en el cultivo de biopolímeros u organismos filamentosos.

Debido a la estructura mostrada en la Figura 1, la luz de excitación reflejada (luz dispersa) se registra inevitablemente durante cada medición. En particular, las elevadas densidades celulares del cultivo líquido provocan una fuerte retrodispersión, que puede dar lugar a errores de medición al registrar el espectro de emisión mediante la matriz de sensores (7). Para evitar estos errores de medición, se puede trabajar con un elemento óptico móvil (13), como se muestra en la figura 5A. El elemento óptico móvil (13) permite excluir de la medición del espectro de emisión la porción de radiación electromagnética del espectro de emisión con una longitud de onda menor o igual a la longitud de onda de excitación. Debido a la posición variable del elemento óptico (13), la radiación menor o igual a la longitud de onda de excitación puede ser guiada selectivamente más allá de la matriz de sensores (7). Como resultado, se puede aumentar la intensidad de la luz de excitación y, por tanto, la intensidad del espectro de emisión y, en última instancia, se puede mejorar la sensibilidad del dispositivo de medición. El elemento óptico (13) se mueve en función de la longitud de onda de excitación de la luz de excitación introducida. La asignación de la longitud de onda a la posición (píxel) sobre la matriz de sensores (7) debe recalcularse con la longitud de onda de la luz de excitación en este procedimiento.

La figura 5B muestra una forma de realización alternativa para reducir la retrodispersión. En este caso, entre el elemento óptico (13) y la matriz de sensores (7) se dispone un diafragma (20) para diafragmentar la luz de la respectiva longitud de onda de excitación, de modo que ésta no incida en la matriz de sensores (7). El diafragma (20) se desplaza preferiblemente por medio de un motor paso a paso al aplicar cada longitud de onda de excitación, de forma que la trayectoria óptica de la longitud de onda de excitación quede bloqueada entre el elemento óptico (13) y la matriz de sensores (7). Esta estructura permite una mayor intensidad de la luz de excitación y, por tanto, una mayor intensidad del espectro de emisión, lo que da lugar a señales de fluorescencia más fuertes y, en última instancia, a mejores valores de medición.

La figura 6B ilustra el uso de componentes ópticamente activos adicionales, como un colimador (21), para paralelizar la radiación electromagnética (19) de la luz de excitación. El colimador (21) se coloca en el extremo de la guía de ondas (3a) en la zona del acoplador (3b). La paralización permite aplicar la luz de excitación en los cultivos líquidos con una mayor intensidad energética. Además, el colimador (21) puede enfocar el espectro de emisión acoplado (16), para recoger mayores cantidades del espectro de emisión. La reducción del segmento de medición mediante el colimador (21), aumentando al mismo tiempo la intensidad de la luz de excitación, puede ser especialmente ventajosa si el acoplador (3b) se coloca, según la figura 4, de forma que durante una revolución del agitador orbital (5) se registren los espectros de fluorescencia de los cultivos líquidos en varios microrreactores (2a). El segmento de medición (18), más pequeño y definido, permite una mayor selección de diferentes diámetros de agitación y segmentos de medición más largos en la dirección circunferencial.

Las medidas explicadas en la figura 5 evitan casi por completo la retrodispersión de la luz de excitación sobre la matriz de sensores (7). Sin embargo, a partir de la retrodispersión se puede obtener información útil, por ejemplo, sobre el comportamiento del crecimiento o la morfología de los microorganismos durante el cultivo. La figura 7 muestra un dispositivo en el que la retrodispersión de la radiación electromagnética (19) irradiada en el cultivo líquido de un microrreactor (2a) es detectada por un sensor sensible a la luz separado, que no se muestra en la figura 7. La luz de excitación retrodispersada es suministrada al sensor fotosensible por otra guía de ondas (3c). Para recoger la luz retrodispersada, la guía de ondas adicional (3c) se alinea con un ángulo de ataque de, por ejemplo, 35 grados con respecto a la vertical en el acoplador (3b). En este caso, el ángulo de ataque de la guía de onda (3a) para la medición de fluorescencia es de 0 grados con respecto a la vertical. Esta alineación de la guía de onda óptica (3a) en el acoplador (3b) mejora el enfoque y el registro del espectro de emisión. Además, en la figura 7 se puede observar que las guías de ondas (3a, 3c) en el acoplador (3b) están alineadas de tal forma, que el foco de ambas guías de ondas está situado en un punto. De forma correspondiente, el foco puede alinearse exactamente en la misma posición dentro del microrreactor (2a). Esto tiene la ventaja de que no es necesario reposicionar el acoplador (3b) por debajo de la placa de microtitulación para la medición de la retrodispersión y, por lo tanto, la medición de la retrodispersión no implica un aumento del tiempo de medición.

Con la estructura mostrada en la figura 7, los espectros de fluorescencia pueden ser registrados con una alta intensidad de la luz de excitación y la retrodispersión puede ser determinada de manera óptima.

La figura 8 muestra un dispositivo para llevar a cabo el procedimiento según la figura 1, pero con un sistema de guiado de haces (3) de construcción diferente. La luz de excitación procedente de la fuente de luz (8) es desviada por un espejo semitransparente (22) y aplicada en el cultivo líquido en uno de los microrreactores (2a) a través de una guía de onda (23) con una sola fibra. El espectro de emisión (16) del cultivo líquido se transmite a través de la guía de ondas (23) y el espejo semitransparente (22) al elemento óptico (13) y, finalmente, a la matriz de sensores (7). La fibra única de la guía de ondas (23) es más gruesa en comparación con las fibras del haz de fibras de la guía de ondas (3a) mostrada en la figura 1. El resultado es una reducción global del radio de la guía de ondas (23) (y, por tanto, del radio de la radiación electromagnética) y, por tanto, un mejor enfoque de la radiación. El mejor enfoque evita la diafonía con los microrreactores adyacentes.

Para aumentar aún más el número de cultivos paralelos, se pueden disponer varias placas de microtitulación (2) juntas sobre una plataforma de microrreactores (4), en donde los microrreactores (2a) de todas las placas de microtitulación (2) se miden secuencialmente. El acoplador (3b) ya no se desplaza simplemente por debajo de una placa de microtitulación (2) de microrreactor (2a) a microrreactor (2a), sino por debajo de varias placas de microtitulación (2). Si, por ejemplo, se disponen cuatro placas de microtitulación de 48 pocillos sobre la plataforma de microrreactores (4), se pueden realizar y medir un total de 192 cultivos paralelos.

Sin embargo, con el número de cultivos realizados en paralelo, el tiempo entre dos mediciones en el mismo microrreactor aumenta. Para aumentar la frecuencia de medición, la figura 9 muestra un dispositivo con el que se pueden registrar simultáneamente los espectros de fluorescencia 2D de los cultivos líquidos en diferentes microrreactores (2a) de varias placas de microtitulación (2) con varios dispositivos de medición. Las guías de ondas (3a) para la medición de la fluorescencia y las guías de ondas (3c) para la medición de la retrodispersión están dispuestas en brazos móviles de una unidad de posicionamiento x-y (1), de tal manera que los microrreactores (2a) sobre diferentes placas de microtitulación (2) pueden ser medidos simultáneamente. Mediante la fijación de las guías de ondas (3a,3c) a una unidad de posicionamiento x-y (1), los microrreactores (2a) de diferentes placas de microtitulación (2) se aproximan de forma sincrónica y simultánea. Es decir, después de cada posicionamiento, se miden simultáneamente tres microrreactores (2a) en el ejemplo ilustrado, estando los microrreactores en las diferentes placas de microtitulación (2) en posiciones coincidentes. Dado que todas las placas de microtitulación (2) están situadas sobre la plataforma de microrreactores (4) de un agitador orbital (5), las mediciones pueden iniciarse simultáneamente y sincronizarse mediante un único transmisor de posición (11).

La figura 10 muestra otra forma de aumentar la velocidad de registro de los espectros de fluorescencia para una placa de microtitulación (2a). Los acopladores ópticos (3b) de una pluralidad de dispositivos de medición se fijan al brazo de una unidad de posicionamiento (1), a una distancia idéntica de los centros de los microrreactores (2a) y pueden trasladarse entre los microrreactores (2a) de una única placa de microtitulación (2). Con la estructura mostrada en la figura 10, suponiendo un número adecuado de acopladores (3b) y dispositivos de medición, se pueden medir simultáneamente filas o columnas completas de microrreactores (2a) de una placa de microtitulación (2). Además, en este caso la unidad de posicionamiento sólo tiene que mover los acopladores (3b) en una dirección, para medir completamente una placa de microtitulación.

Con la ayuda de las seis guías de ondas para medir la retrodispersión (3c) y las seis guías de ondas para medir la fluorescencia (3a), mostradas en la figura 10, la fluorescencia y/o la retrodispersión pueden medirse simultáneamente en una fila completa de la placa de microtitulación (2). En el caso de una placa de microtitulación de 48 pocillos (2), las guías de ondas (3a,3c) sólo tienen que moverse en una dimensión por medio de la unidad de posicionamiento (1). El ahorro de tiempo que ello supone conlleva un aumento de la frecuencia de las mediciones y de la densidad de datos.

0051] En una conformación ventajosa de la invención, el dispositivo comprende un robot de pipeteo, para tomar automáticamente muestras de los cultivos líquidos de los microrreactores (2a) o para añadir agua o soluciones que contengan, por ejemplo, nutrientes o (subproductos) en diferentes momentos del cultivo. La combinación del procedimiento según la invención con el muestreo automático permite una elaboración acelerada de modelos quimiométricos. A partir del cultivo en curso, se pueden tomar automáticamente muestras del cultivo líquido, en diferentes momentos, para su análisis fuera de línea. Se pueden crear modelos quimiométricos a partir de los parámetros de proceso analizados fuera de línea de las muestras y de los espectros de fluorescencia 2D registrados en los diferentes momentos de muestreo o adición.

Para obtener una mayor densidad de datos temporal al considerar las reacciones coincidentes en los cultivos líquidos, la figura 11 ilustra esquemáticamente una conducción del procedimiento, en el que los cultivos líquidos en condiciones de coincidencia ocurren en múltiples microrreactores (pocillo 1 a pocillo 3). Los espectros de fluorescencia 2D (medición) de cada uno de los cultivos líquidos mencionados en los pocillos 1-3 se registran con un desplazamiento en el tiempo. Por ejemplo, para el microrreactor (pocillo 1), las mediciones 1.1 a 1.3; para el microrreactor (pocillo 2), las mediciones 2.1 a 2.3; y para el microrreactor (pocillo 3), las mediciones 3.1 a 3.3. Los espectros de fluorescencia 2D 1.1 a 3.3 registrados en los pocillos 1 a 3 de forma desplazada en el tiempo se fusionan de tal forma, que los espectros de fluorescencia 2D de los diferentes pocillos 1 a 3 se adquieren sobre un vector de tiempo común. Aunque esto supone una pérdida de la resolución de las mediciones referida a los pocillos, los intervalos de tiempo entre dos mediciones pueden reducirse considerablemente.

El procedimiento ilustrado en la Figura 11 es particularmente ventajoso para crear modelos quimiométricos. Para cada pocillo 1 a 3, se muestran tres mediciones, es decir, la adquisición de tres espectros de fluorescencia 2D. Del pocillo 1 se extrae todo el cultivo líquido después del segundo ciclo de medición, es decir, después de 3,13 minutos, para realizar, por ejemplo, análisis fuera de línea con esta muestra. El total de nueve mediciones individuales, respectivamente tres mediciones por microrreactor (pocillos 1 a 3), se combinan para formar una curva de reacción a lo largo del eje de tiempos. Para el desarrollo del modelo quimiométrico, se puede utilizar un total de ocho mediciones durante la reacción. La medición 1.3 no se tiene en cuenta para la elaboración, ya que durante esta medición no quedaba líquido de reacción en el microrreactor (pocillo 1) y, por tanto, no se pueden determinar valores de medición significativos.

La figura 12 muestra una conducción de procedimiento según la figura 11, en la que se puede lograr un aumento adicional de la densidad de datos al no medir el microrreactor (aquí: pocilio 1), después de la extracción del líquido de reacción. En lugar de una medición superflua en el microrreactor (pocillo 1) tras la retirada del líquido de reacción, en esta conducción del procedimiento se realiza una medición directamente en el microrreactor (pocillo 2). De este modo, se puede realizar otra medición (medición 2.4) en el pocillo 2 dentro de los 5,63 minutos. En consecuencia, se dispone de nueve mediciones valorables para la elaboración del modelo quimiométrico.

La figura 13B ilustra, en contraste con el modo de proceder convencional para la elaboración de modelos quimiométricos basados en espectros de fluorescencia 2D, en fermentadores de recipiente de agitación individuales (figura 13A), un procedimiento en el que los cultivos en los cultivos líquidos discurren en varios microrreactores (2a) de una placa de microtitulación (2) bajo condiciones coincidentes, en donde los valores iniciales del parámetro del proceso a detectar (por ejemplo, la concentración de la fuente de C, productos o subproductos) son diferentes en los cultivos líquidos de los microrreactores individuales. Esta conducción del procedimiento está asociada a unos costes experimentales y de tiempo inaceptables, cuando se utiliza la espectroscopia de fluorescencia 2D con fermentadores individuales convencionales. Sin embargo, el cultivo paralelo en los microrreactores de placa de microtitulación según la presente invención hace que este enfoque no sea problemático. Las influencias de las diferencias de concentración de los analitos de interés en los espectros de fluorescencia 2D se utilizan en línea para desarrollar modelos quimiométricos, que se desarrollan durante el experimento. En esta variante del procedimiento, la calibración tiene lugar durante la determinación de los parámetros del proceso mediante espectroscopia de fluorescencia 2D.

La figura 14 ilustra un procedimiento alternativo para elaborar modelos quimiométricos basados en espectros defluorescencia 2D. Se realizan múltiples cultivos con condiciones de partida coincidentes en paralelo en microrreactores de una placa de microtitulación agitada, y se monitorizan mediante el registro de espectros de fluorescencia 2D. En diferentes momentos, en el ejemplo mostrado en la figura 14 después de 3, 5 y 8 horas, se añade un analito a los microrreactores seleccionados, lo que da lugar a saltos de concentración conocidos. Esto hace que las reacciones en los microrreactores seleccionados ya no se produzcan en las mismas condiciones. Estos cambios se detectan mediante el registro continuo de los espectros de fluorescencia 2D en los microrreactores de la placa de microtitulación. La influencia de los cambios definidos en los espectros de fluorescencia 2D registrados se utiliza para desarrollar modelos quimiométricos. Sin embargo, los efectos de dilución derivados de la adición de agua también pueden utilizarse para desarrollar modelos quimiométricos. La adición de agua al caldo de cultivo también provoca los conocidos descensos de concentración, que se detectan mediante los espectros de fluorescencia 2D.

Además de las concentraciones de las sustancias individuales de los cultivos líquidos, la OTR, por ejemplo, también puede determinarse sobre la base de los espectros de fluorescencia 2D registrados con la ayuda de modelos quimiométricos. El procedimiento según la invención y el dispositivo para llevar a cabo el procedimiento permiten así, por primera vez, medir la tasa de transferencia de oxígeno resuelta según los microrreactores individuales de una placa de microtitulación sobre la base de espectros de fluorescencia 2D. Además, el pH puede determinarse mediante espectros de fluorescencia 2D en combinación con modelos quimiométricos. El estado de la técnica para determinar el pH es el uso de optodos o colorantes en placas de microtitulación. Para la determinación del pH con la presente invención no se requieren optodos o colorantes.

Ejemplos

La figura 15 muestra los espectros de fluorescencia 2D de un cultivo de Escherichia coli en un medio mínimo con una concentración inicial de glucosa de 8 g L-1 y una concentración inicial de sorbitol de 1,5 g L-1.

Además del aumento de la fluorescencia biogénica (excitación: 350-500 nm / emisión: 500-600 nm), se observa claramente un aumento en el rango de los aminoácidos aromáticos como el triptófano y la tirosina (excitación: 270-320 nm / emisión: 300-370 nm) con el tiempo. A partir de estos espectros de fluorescencia 2D, se puede determinar el curso de los diferentes parámetros del proceso con la ayuda de modelos quimiométricos. Dado que numerosos pares de longitudes de onda en los espectros de fluorescencia muestran naturalmente un curso similar, una regresión basada en una regresión de mínimos cuadrados parciales (PLSR) o un análisis de componentes principales (PCA) es particularmente útil aquí. Ambos procedimientos permiten reducir el elevado número de pares de longitudes de onda (30 longitudes de onda de excitación ■ 1.024 longitudes de onda de emisión = 30.720 pares de longitudes de onda por espectro de fluorescencia 2D) a un número mucho menor de combinaciones lineales significativas. Como ejemplo, en la Figura 16 se muestra una PLSR para la determinación de las curvas de concentración de glucosa, sorbitol y biomasa, así como para la curva de pH durante el cultivo. Los símbolos negros rellenos indican la concentración y el pH determinados fuera de línea, respectivamente. Las líneas de trazo continuo se determinaron a partir de los espectros de fluorescencia 2D utilizando modelos quimiométricos.

El cultivo se inició en 15 pocillos en paralelo bajo las mismas condiciones. Se extrajo todo el cultivo líquido de un pocillo cada hora, para analizar las muestras mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Es decir, al cabo de una hora, el cultivo líquido de un pocillo se retiró por completo, de modo que se siguieron realizando 14 cultivos en paralelo. Al cabo de dos horas, se retiró el cultivo líquido completo del siguiente pocillo, de modo que el cultivo continuó sin alteraciones en 13 pocillos. Este procedimiento se repitió diez veces, de modo que al final estaban disponibles todavía 5 señales en línea.

A partir del ejemplo presentado, está claro que es posible monitorizar los cultivos con espectros de fluorescencia 2D en placas de microtitulación continuamente agitadas. El E. coli es uno de los microorganismos de mayor crecimiento utilizados en biotecnología. Incluso con esta alta velocidad de crecimiento, se puede generar una densidad de datos suficientemente alta con el sistema presentado, para poder seguir las progresiones de diferentes concentraciones relevantes para el proceso, así como el valor del pH.

Claims (38)

REIVINDICACIONES

1. - Procedimiento para la determinación de los parámetros del proceso mediante espectroscopia de fluorescencia 2D en cultivos líquidos en varios microrreactores (2a) de al menos una placa de microtitulación, que se agita continuamente con un agitador orbital (5) al menos hasta el final del cultivo en todos los microrreactores, en donde los espectros de fluorescencia 2D de los cultivos líquidos se registran durante el cultivo con al menos un dispositivo de medición desacoplado del movimiento de agitación de la placa de microtitulación con los siguientes pasos:

1.1 generación de luz de excitación monocromática, cuya longitud de onda de excitación se modifica gradualmente,

1.2 aplicación sucesiva de luz de excitación con diferentes longitudes de onda de excitación en el cultivo líquido en uno de los microrreactores,

1.3 transferencia de los espectros de emisión del cultivo líquido en el microrreactor a un elemento óptico, que descompone el espectro de emisión en cada longitud de onda de excitación en las diferentes longitudes de onda y las reproduce sobre una matriz de sensores (7) con sensores sensibles a la luz,

1.4 registro del espectro de fluorescencia 2D detectando la intensidad de las diferentes longitudes de onda para cada espectro de emisión utilizando la matriz de sensores, y

1.5 registro de los espectros de fluorescencia 2D de los cultivos líquidos en otros microrreactores de la al menos una placa de microtitulación con los pasos 1.1 -1.4.

2. - Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la aplicación de la luz de excitación y la transmisión de los espectros de emisión tienen lugar a través de una superficie transparente a la luz de excitación y a los espectros de emisión en la parte inferior de cada microrreactor.

3. - Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la luz de excitación se genera con un monocromador (15) sintonizable automáticamente para el aislamiento espectral de diferentes longitudes de onda de la luz incidente de una fuente de luz (8).

4. - Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque la transmisión de la luz de excitación desde el monocromador al cultivo líquido y la transmisión del espectro de emisión desde el cultivo líquido al elemento óptico se realizan mediante un sistema de guiado de haces (3) que comprende un acoplador óptico (3b), en el que el acoplador óptico está alineado con el microrreactor que contiene el cultivo líquido para introducir la luz de excitación en el cultivo líquido y para acoplar el espectro de emisión en el sistema de guiado de haces.

5. - Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque el acoplador óptico no se mueve durante la adquisición del espectro de fluorescencia 2D, de modo que los microrreactores agitados se mueven con respecto al acoplador óptico.

6. - Procedimiento según la reivindicación 4 ó 5, caracterizado porque, tras el registro del espectro de fluorescencia 2D, el acoplador óptico se desplaza con una unidad de posicionamiento (1) entre los microrreactores de la(s) placa(s) de microtitulación.

7. - Procedimiento según una de las reivindicaciones 3 a 6, caracterizado porque el diámetro de agitación del agitador orbital se ajusta de tal manera que la luz de excitación se aplica exclusivamente en el cultivo líquido de uno de los microrreactores, durante el registro del espectro de fluorescencia, y el espectro de emisión de este cultivo líquido se aplica exclusivamente en el acoplador óptico.

8. - Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque los espectros de fluorescencia 2D de los cultivos líquidos se registran simultáneamente en diferentes microrreactores utilizando varios dispositivos de medición.

9. - Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque los acopladores ópticos de la pluralidad de dispositivos de medición pueden trasladarse con una unidad de posicionamiento común entre los microrreactores de la(s) placa(s) de microtitulación.

10. - Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado porque el diámetro de agitación del agitador orbital se ajusta de tal manera, que varios microrreactores orbitan sucesivamente por encima del acoplador óptico de un dispositivo de medición durante una revolución del agitador orbital, asignándose los espectros de fluorescencia registrados a los microrreactores que orbitan por encima del acoplador óptico.

11. - Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la aplicación de la luz de excitación se interrumpe en función de la posición del agitador orbital.

12. - Procedimiento según la reivindicación 11, caracterizado porque la posición del agitador orbital se determina con un transmisor de posición.

13. - Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque la longitud de onda de excitación en el espectro de emisión está diafragmada.

14. - Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque, al cambiar selectivamente la posición del elemento óptico, se guía la zona del espectro de emisión más allá de la matriz de sensores cuya longitud de onda es menor o igual que la longitud de onda de excitación.

15. - Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque la longitud de onda de excitación se diafragmiza con un diafragma móvil entre el elemento óptico y la matriz de sensores.

16. - Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque la luz de excitación se paraleliza o enfoca y/o el espectro de emisión se enfoca antes de la aplicación en el cultivo líquido.

17. - Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque la retrodispersión de la luz de excitación irradiada en el cultivo líquido es detectada por un sensor sensible a la luz separado del dispositivo de medición.

18. - Procedimiento según una de las reivindicaciones 4 a 17, caracterizado porque la luz de excitación y el espectro de emisión se transmiten en el sistema de guiado de haces a través de guías de ondas separadas o de una guía de ondas en Y con fibras separadas para la luz de excitación y el espectro de emisión.

19. - Procedimiento según una de las reivindicaciones 4 a 17, caracterizado porque en el sistema de guiado del haz.

- la luz de excitación es desviada por un espejo semitransparente y se aplica en el cultivo líquido a través de una guía de ondas de una sola fibra, y

- el espectro de emisión se transmite a través de la guía de ondas y el espejo semitransparente al elemento óptico.

20. - Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque, durante el cultivo, se toman automáticamente muestras del cultivo líquido en uno de los microrreactores en diferentes momentos con la ayuda de un robot de pipeteo, cuyas muestras se analizan fuera de línea con respecto a parámetros específicos del proceso y/o se añaden automáticamente sustancias y/o líquidos al cultivo líquido en diferentes momentos con la ayuda del robot de pipeteo.

21. - Procedimiento según la reivindicación 20, caracterizado porque los parámetros de proceso de las muestras analizadas por el análisis fuera de línea y los espectros de fluorescencia 2D, registrados en los diferentes momentos del muestreo, se utilizan para elaborar modelos quimiométricos.

22. - Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque

- en varios microrreactores, los cultivos líquidos se llevan a cabo en condiciones coincidentes,

- los espectros de fluorescencia 2D se registran en cada uno de los cultivos líquidos mencionados respectivamente desplazados en el tiempo, y

- los espectros de fluorescencia 2D registrados en la pluralidad de microrreactores, rspectivamente con un desfase de tiempo, se combinan de forma que los espectros de fluorescencia de los citados microrreactores se registran a través de un vector de tiempo.

23. - Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque los cultivos de los líquidos tienen lugar en varios microrreactores en condiciones coincidentes, siendo los valores iniciales del parámetro del proceso a detectar en los cultivos de líquidos diferentes en los microrreactores, y la influencia de los diferentes valores iniciales en los espectros de fluorescencia 2D registrados se utiliza para desarrollar modelos quimiométricos.

24. - Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque los cultivos de líquidos tienen lugar en una pluralidad de microrreactores en condiciones coincidentes, en donde en diferentes momentos se añade una sustancia y/o un líquido a los cultivos de líquidos de cada uno de los microrreactores mencionados, cuya sustancia y/o líquido cambia(n) el parámetro del proceso que debe detectarse en los cultivos de líquidos de una manera definida, y la influencia de los cambios definidos en los espectros de fluorescencia 2D registrados se utiliza para desarrollar modelos quimiométricos.

25. - Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque

- la relación funcional que subyace al cambio de un parámetro del proceso en uno de los cultivos líquidos se describe mediante un modelo mecanístico-matemático,

- los parámetros para el modelo matemático se asumen al principio del cultivo,

- los parámetros del proceso determinados a partir del modelo matemático se comparan con los espectros de fluorescencia 2D, registrados en diferentes momentos del cultivo de este líquido, y

- los parámetros del modelo se corrigen en función de la comparación.

26. - Procedimiento según una de las reivindicaciones 21 a 25, caracterizado porque los modelos quimiométricos se utilizan para determinar al menos un parámetro del proceso basado en un espectro de fluorescencia 2D, registrado a partir de un cultivo líquido.

27. - Dispositivo para la detección de parámetros de proceso mediante espectroscopia de fluorescencia 2D en cultivos líquidos, en varios microrreactores de una placa de microtitulación agitada, que comprende

- una plataforma de microrreactores (4) conectada a un agitador orbital (5), sobre la que se dispone al menos una placa de microtitulación con varios microrreactores,

- una fuente de luz (8),

- un monocromador (15) sintonizable automáticamente para aislar espectralmente diferentes longitudes de onda de la luz incidente de la fuente de luz, estando el monocromador diseñado para generar luz de excitación monocromática y para variar su longitud de onda de excitación de forma escalonada,

- un sistema de guiado de haces (3) que comprende un elemento óptico (13) y un acoplador óptico (3b), que está diseñado para transmitir la luz de excitación del monocromador al cultivo líquido y para transmitir el espectro de emisión del cultivo líquido al elemento óptico durante un movimiento continuo de agitación de la plataforma de microrreactores mediante el agitador orbital,

- en donde el acoplador óptico para aplicar la luz de excitación en el cultivo líquido, así como para acoplar el espectro de emisión en el sistema de guiado de haces, está alineado con una sección del microrreactor que es transparente a la radiación electromagnética, y

- en donde el elemento óptico divide y despliega el espectro de emisión en cada longitud de onda de excitación en las diferentes longitudes de onda,

- una matriz de sensores (7) con sensores sensibles a la luz, que están dispuestos de tal manera que el elemento óptico reproduce el espectro de emisión desplegado sobre la matriz de sensores,

- en donde el conjunto de sensores está diseñado para registrar un espectro de fluorescencia 2D, detectando la intensidad de las diferentes longitudes de onda para cada espectro de emisión.

28. - Dispositivo según la reivindicación 27, caracterizado porque el acoplador óptico con una unidad de posicionamiento (1) puede trasladarse entre los microrreactores de la(s) placa(s) de microtitulación.

29. - Dispositivo según la reivindicación 27 ó 28, caracterizado porque

- el dispositivo comprende una pluralidad de dispositivos de medición que incluyen una fuente de luz, un monocromador sintonizable automáticamente, un sistema de guiado de haces, un elemento óptico y una matriz de sensores,

- y los espectros de fluorescencia 2D de los cultivos líquidos en diferentes microrreactores se registran simultáneamente con los múltiples dispositivos de medición.

30. - Dispositivo según la reivindicación 29, caracterizado porque los acopladores ópticos de la pluralidad de dispositivos de medición pueden trasladarse con una unidad de posicionamiento común entre los microrreactores de la(s) placa(s) de microtitulación.

31. - Dispositivo según una de las reivindicaciones 27 a 30, caracterizado porque el dispositivo comprende un obturador dispuesto en la trayectoria óptica de la luz de excitación, que está diseñado para interrumpir la luz de excitación en función de la posición del agitador orbital.

32. - Dispositivo según la reivindicación 31, caracterizado porque en el agitador orbital está dispuesto un transmisor de posición para detectar la posición del agitador orbital y un controlador para procesar las señales de posición detectadas del sensor de posición, y para interrumpir la luz de excitación en función de las señales de posición por medio del obturador.

33. - Dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 32, caracterizado porque entre el elemento óptico y la matriz de sensores está dispuesta un diafragma móvil para diafragmar la longitud de onda de excitación.

34. - Dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 33, caracterizado porque en el acoplador está dispuesta una lente para colimar o enfocar la luz de excitación.

35. - Dispositivo según una de las reivindicaciones 27 a 34, caracterizado porque el dispositivo comprende un sensor fotosensible dispuesto, que está diseñado para detectar la retrodispersión de la luz de excitación irradiada en el cultivo líquido.

36. - Dispositivo según una de las reivindicaciones 27 a 35, caracterizado porque el sistema de guiado de haces comprende guías de ondas separadas o una guía de ondas en Y con fibras separadas.

37. - Dispositivo según una de las reivindicaciones 27 a 35, caracterizado porque el sistema de guiado de haces comprende como componentes ópticos un espejo semitransparente y una guía de ondas con solo una fibra, estando los componentes ópticos dispuestos uno respecto del otro de manera, que la luz de excitación es desviada por el espejo semitransparente y se introduce en el cultivo líquido microbiano a través de la guía de ondas y el espectro de emisión se transmite al elemento óptico a través de la guía de ondas y el espejo semitransparente.

38.- Dispositivo según una de las reivindicaciones 27 a 37, caracterizado porque el dispositivo comprende un robot de pipeteo, diseñado para tomar automáticamente muestras del cultivo líquido microbiano de un microrreactor o añadir sustancias y/o líquidos en diferentes momentos del cultivo.