ES2870849T3 - Polímeros catiónicos conjugados conformacionalmente flexibles - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende un polímero conjugado conformacionalmente flexible, enlazado a o asociado con por lo menos un miembro de un par enlazante que comprende una molécula de sensor y una molécula objetivo o el complejo que forman, en el que el polímero comprende por lo menos un agente angular de enlace que tiene enlace con sus dos unidades poliméricas adyacentes que forman un ángulo de menos de 155 ° respecto una a otra, en el que el agente angular de enlace es una molécula aromática opcionalmente sustituida seleccionada de entre el grupo que consiste en 1,2-benceno, 1,3-benceno, 1,2-naftaleno, 1,3-naftaleno, 1,6-naftaleno, 1,7-naftaleno, 1,8- naftaleno, 1,2-antraceno, 1,3-antraceno, 1,6-antraceno, 1,7-antraceno, 1,8-antraceno, 1,9-antraceno, 2,3-bifenilo, 2,4- bifenilo, 2,6-bifenilo, 3,3'-bifenilo, 3,4-bifenilo, 3,5-bifenilo, 2,2'-bifenilo, 2,3'-bifenilo, 2,4'-bifenilo, y 3,4'-bifenilo, teniendo por lo menos dos enlaces separados con otros componentes de polímero que forma ángulos respecto uno a otro; en el que los dos enlaces con otros componentes poliméricos son coplanares, y el ángulo es determinado por líneas que se extienden representando aquellos enlaces al punto en el cual se intersecan, y luego midiendo el ángulo entre ellas; o en el que los dos enlaces con otros componentes poliméricos no son coplanares, y el ángulo es determinado como sigue: se traza una primera línea entre los dos átomos de anillo al cual se unen los enlaces; se trazan dos líneas de enlace, una que se extiende desde cada átomo de anillo en la dirección de su respectivo enlace hasta el otro componente polimérico al cual está unido; se fija el ángulo entre cada línea de enlace y la primera línea; y luego los dos átomos de anillo son unidos en un punto individual encogiendo la primera línea hasta una longitud cero; el ángulo así resultante entre las dos líneas de enlace es el ángulo que el agente angular de enlace imparte al polímero conjugado; y en el que el polímero tiene la estructura: **(Ver fórmula)** CP1, CP2, CP3 y CP4 son estructuras oligoméricas o segmentos de polímero conjugado opcionalmente sustituidos, y pueden ser los mismos o diferentes uno de otro; LU1 y LU2 son cada uno un agente angular de enlace que forma un ángulo de enlace de menos de 155° con dos unidades poliméricas adyacentes, y son cada uno un grupo arilo mono- o policíclico opcionalmente sustituido que tiene 5 a 20 átomos, seleccionado de entre el grupo que consiste en 1,2-benceno, 1,3-benceno, 1,2-naftaleno, 1,3-naftaleno, 1,6-naftaleno, 1,7-naftaleno, 1,8-naftaleno, 1,2-antraceno, 1,3-antraceno, 1,6-antraceno, 1,7-antraceno, 1,8- antraceno, 1,9-antraceno, 2,3-bifenilo, 2,4-bifenilo, 2,6-bifenilo, 3,3'-bifenilo, 3,4-bifenilo, 3,5-bifenilo, 2,2'-bifenilo, 2,3'- bifenilo, 2,4'-bifenilo, y 3,4'-bifenil; m y n son independientemente 0 a 10,000, en los que m+n>1; b y e son independientemente 0 a 250, en los que b+e>1; a, c, d y f son independientemente 0 a 250; y G y G1 son unidades de protección y pueden ser los mismos o diferentes, y son seleccionados de entre unidades activadas que permiten reacción química adicional para extender la cadena de polímero, y unidades de terminación no activadas.

Description

DESCRIPCIÓN

Polímeros catiónicos conjugados conformacionalmente flexibles

Declaración respecto a investigación patrocinada federalmente

El trabajo que conduce a esta invención fue ejecutado bajo número de concesión GM62958-01 del National Institutes of Health, número de concesión DMR-0097611 del National Science Foundation y número de concesión N00014-98-1-0759 del Office de Naval Research. El gobierno de los EEUU puede tener derechos limitados en esta invención.

Campo técnico

Esta invención se refiere a métodos, artículos y composiciones que involucran polímeros catiónicos conjugados ("CCPs").

Antecedente de la invención

Los polímeros conjugados (CPs) son moléculas que colectan la luz de manera eficiente, con propiedades deseables para una variedad de aplicaciones. Los polímeros conjugados pueden servir como materiales para recolectar luz y como transductores de señal en aplicaciones de biosensor fluorescente.¹² Estas moléculas pueden detectar, transducir y/o amplificar información química, biológica o física hasta señales ópticas y/o eléctricas.^{3 4} Los CPs pueden suministrar la ventaja de respuesta colectiva respecto a moléculas pequeñas que no interactúan.^5,6 Esta respuesta colectiva influye en las propiedades optoelectrónicas, tales como transferencia de energía de resonancia de Forster (FRET), conductividad eléctrica y eficiencia de fluorescencia, propiedades que pueden ser usadas para reportar, o "transducir," la presencia de analito objetivo.⁶

La solubilidad en agua de los CPs, un prerrequisito para la interrogación de sustratos biológicos, es lograda usualmente mediante grupos cargados unidos al armazón de CP.⁷ Sin embargo, a la fecha la mayoría de los polímeros iónicos conjugados disponibles son polianiones que contienen funcionalidades sulfonato o carboxilato.

Los polímeros conjugados toman frecuentemente la forma de estructuras de bastón rígido, que tienen flexibilidad limitada y en consecuencia tienen una habilidad limitada para adaptarse a formas tridimensionales particulares, limitando así su habilidad para ajustarse a la forma de moléculas derivadas biológicamente. Por ejemplo, las proteínas y ácidos nucleicos, aunque son también poliméricos, no forman típicamente estructuras de bastón extendido sino más bien se pliegan en formas tridimensionales de orden superior, a las cuales los CPs no pueden ajustarse típicamente.

Todos los polímeros conjugados catiónicos solubles en agua disponibles actualmente tienen generalmente armazones de polímero lineales "de bastón rígido" y por ello experimentan un limitado ángulo de torsión entre las unidades de monómero, a lo largo de la cadena principal de polímero. Una consecuencia de esta restricción en la torsión es que el polímero tiene una estructura de "bastón rígido" con limitadas conformaciones y habilidad para adaptarse a las estructuras secundarias de biomoléculas. Adicionalmente, cuando los polímeros catiónicos conjugados son usados como moléculas para la recolección de luz, pueden exhibir de manera dañina autoextinción de la fluorescencia cuando se acumulan cerca a biomoléculas cargadas negativamente.

Existe una necesidad en la técnica por CCPs novedosos, por métodos para prepararlos y usarlos, y por composiciones y artículos de manufactura que comprendan tales compuestos.

Resumen de la invención

Se suministran métodos, composiciones y artículos de manufactura que involucran polímeros catiónicos conjugados conformacionalmente flexibles. Se suministra un método para la síntesis de polímeros catiónicos solubles en agua, con enlaces a lo largo de la estructura de cadena principal del polímero, que alteran la habilidad de los polímeros para formar estructuras de bastón extendido. Tales polímeros pueden servir en la fabricación de novedosos dispositivos optoelectrónicos y en el desarrollo de biosensores altamente eficientes. La invención se refiere adicionalmente a la aplicación de estos polímeros en métodos de ensayo.

Ventajosamente, los métodos permiten la modificación de la forma de los polímeros, y pueden suministrar la habilidad para controlar sus propiedades de emisión. Se suministran polímeros catiónicos conjugados que pueden adaptarse mejor a la estructura secundaria de sustratos biológicos, exhiben un reducido empaque de cadena y/o exhiben reducida autoextinción en solución. Los polímeros suministrados pueden emitir a diferentes longitudes de onda, lo cual puede ser útil en biosensores unidos a la superficie u homogéneos múltiples.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra los espectros de absorción de polímeros catiónicos solubles en agua (M¹⁰⁰P⁰⁺, M^g0P¹⁰⁺ , M⁷⁵P²⁵⁺, M⁵⁰P⁵⁰⁺, M²⁵P⁷⁵⁺, M⁰P¹⁰⁰⁺) en agua.

La Figura 2 presenta los espectros de emisión de polímeros catiónicos solubles en agua (M¹⁰⁰P⁰⁺, M^g0Pⁱ⁰ , M⁷⁵P²⁵⁺, M⁵⁰P⁵⁰⁺, M²⁵P⁷⁵⁺, M⁰P¹⁰⁰⁺) en agua.

La Figura 3 representa los espectros de emisión de M⁵⁰P⁵⁰⁺ y M^oP^{io o} , y el espectro de absorción de ds-ADN-C* (C* = fluoresceina) en agua. La longitud de onda de excitación es 360 nm para M⁵⁰P⁵⁰⁺, y 380 nm para M⁰P¹⁰⁰⁺.

La Figura 4 representa los espectros de emisión de soluciones que contienen M¹⁰⁰P⁰⁺ (345 nm), M⁹⁰P¹⁰⁺ (345 nm), M⁷⁵P²⁵⁺ (353 nm), M⁵⁰P⁵⁰⁺ (360 nm), M²⁵P⁷⁵⁺ (375 nm), M⁰P¹⁰⁰⁺ (380 nm) y ds-ADN-C* en amortiguador de fosfato 50 mmol (pH = 8.0) ([ds-ADN-C*] = 2.0 E-8 M, [unidad repetida en el polímero] = 5.0 E-7 M). La longitud de onda de excitación está en paréntesis.

La Figura 5 presenta una representación esquemática de la interacción de polímeros catiónicos conjugados solubles en agua, con diferente forma de los polímeros, con ds-ADN-C*.

Figura 6. Comparación de la intensidad de C*para M⁵⁰P⁵⁰⁺/ds-ADN-C* y M⁰P¹⁰⁰⁺/ds-ADN-C* en amortiguador de fosfato 50 mmol (pH = 8.0) con concentración de polímero que varía de 1.0 E-7 M a 1.0 E-6 M o concentración de ds-ADN-C* de 2.0 E-8 M. La longitud de onda de excitación es 363 nm para M⁵⁰P⁵⁰⁺ y para M⁰P¹⁰⁰⁺.

Figura 7. Ilustración esquemática de un ensayo de ADN de cuerda específica, a base de un polímero conjugado catiónico soluble en agua (en negro) juntamente con una muestra óptica de ss-ADN-C*específico (en rojo) para detectar una secuencia de ss-ADN complementario (en azul). El ss-ADN no complementario es mostrado en verde.

La Figura 8. Espectros de emisión de soluciones que contienen M⁵⁰P⁵⁰⁺, ds-ADN-C* complementario y ss-ADN-C*/ADN no complementario y M⁰P¹⁰⁰⁺, ds-ADN-C* complementario y ss-ADN-C*/ADN no complementario en amortiguador de fosfato 50 mmol (pH = 8.0, [ds-ADN-C*] = [ss-ADN-C*] = 2.0 E-8 M, [unidad repetida en el polímero] = 4.2 E-7 M). La longitud de onda de excitación es 360 nm para M⁵⁰P⁵⁰+ y 380 nm para M⁰P¹⁰⁰⁺. Para cada polímero, los espectros de emisión del polímero fueron normalizados para comparación.

La Figura 9. Espectros de emisión de soluciones que contienen M⁵⁰P⁵⁰⁺, ds-PNA-C*/ADN complementario (PNA = ácido péptido nucleico) y ss-PNA-C*/ADN no complementario en amortiguador de fosfato 50 mmol (pH = 6.0, [ds-PNA-C*/ADN] = [ss-PNA-C*/ADN] = 2.0 E-8 M, [M⁵⁰P⁵⁰⁺ unidad repetida] = 2.5 E-7 M). La longitud de onda de excitación es 360 nm. Los espectros fueron normalizados respecto a la emisión de polímero.

La Figura 10. Comparación de la intensidad de emisión de EB (EB = bromuro de etidio) para polímero/ds-ADN/EB en amortiguador de fosfato 50 mmol (pH = 7.4) con [ds-ADN] = 1.0 E-8 M, [polímero UR] = 2.0 E-7 M, [EB] = 1.1 E-6 M. la intensidad de emisión fue normalizada respecto al valor £ a la longitud de onda de excitación.

Descripción detallada de la invención

Los inventores han suministrado polímeros catiónicos conjugados (CCPs) que comprenden monómeros que perturban la habilidad del polímero para formar estructuras de bastón rígido, permitiéndoles formar un intervalo más amplio de estructuras tridimensionales. Los monómeros son moléculas aromáticas que tienen puntos de unión a las subunidades adyacentes del polímero, que forman un ángulo mayor a aproximadamente 25 °. Los monómeros pueden introducir un giro de torsión en el polímero conjugado, perturbando de ese modo además la habilidad del polímero para formar una estructura de bastón rígido.

También se suministra un método de síntesis para la producción de CCPs con un intervalo de regioquímicas de armazón. Tales CCPs exhiben transferencia de energía superficial entre los segmentos de polímero, lo cual da como resultado propiedades similares de emisión y función de FRET, a pesar de las diferencias estructurales que afectan el promedio de longitud de conjugación. Además, los CCPs flexibles pueden ser donadores de excitación más eficientes respecto a biomoléculas particulares y, bajo ciertas condiciones, estos materiales pueden mostrar desempeño mejorado cuando son usados en bioensayos que toman ventaja de la amplificación óptica de polímeros conjugados solubles en agua.

En un aspecto, se suministra una pluralidad de CCPs con diferentes estructuras, que pueden estar en la forma de una biblioteca. Los CCPs pueden ser probados respecto a cualquier propiedad de interés. Pueden probarse objetivos biológicos particulares de interés, contra una pluralidad de diferentes CCPs que comprenden tales subunidades, para hallar CCPs particulares con propiedades deseables para uso con el objetivo. Por ejemplo, pueden probarse los CCPs respecto a la unión al objetivo y/o a la transferencia de energía al objetivo, al incremento en la eficiencia fluorescente, a la disminución de la autoextinción, al incremento en el desplazamiento de Stoke y a la longitud de onda de emisión.

También se suministran métodos de uso de los CCPs en bioensayos para biomoléculas de objetivo. Los CCPs pueden ser suministrados en forma de solución y/o de kit, que pueden ser adaptados para la ejecución de métodos de ensayo específicos. Se suministran también complejos y soluciones de detección que comprenden un CCP, como son complejos de detección que comprenden un CCP, un sensory un cromóforo de señalización. También se suministran artículos de manufactura que comprenden el CCP. En esta memoria se discuten adicionalmente otros aspectos de la invención.

En un aspecto, se suministra un método que comprende el contacto de una muestra de la que se sospecha comprende un objetivo, con una solución que comprende un CCP flexible, una biomolécula de sensor, y un cromóforo luminiscente de señalización. el CCP y el cromóforo de señalización (C*) son elegidos de modo que las bandas de absorción de las dos especies tienen mínima superposición y de modo que los espectros de emisión luminiscente de las dos especies están a diferentes longitudes de onda. Un cambio detectable en la emisión de luz con longitud de onda característica del cromóforo de señalización indica la presencia del objetivo, que se une al sensor y forma un complejo de detección en la muestra. Mediante el uso de biomoléculas múltiples de sensor, cada una con una diferente especificidad de unión, pueden detectarse independientemente múltiples objetivos. Puede introducirse un componente adicional, tal como un pigmento, para mejorar la selectividad mediante la transferencia adicional de energía desde el cromóforo de señalización al pigmento.

Adicionalmente al método descrito, la invención suministra una solución predominantemente acuosa que comprende un CCP, una" biomolécula de sensor" y un cromóforo de señalización.

Como se demuestra en los ejemplos, la amplificación óptica suministrada por un CCP flexible puede ser usada para detectar la hibridación de polinucleótido a un polinucleótido sensor. La amplificación puede ser mejorada usando CCPs de agua de peso molecular más alto. La invención puede ser suministrada en un formato homogéneo que utiliza la facilidad de los métodos de detección de florescencia. Los métodos pueden ser usados para detectar polinucleótidos objetivo amplificados o, debido a la gran amplificación de la señal, como un ensayo autónomo, sin necesidad de amplificación de polinucleótido.

Todos los métodos de la invención pueden ser ejecutados en formatos múltiples. Puede usarse una pluralidad de diferentes biomoléculas de sensor, para detectar diferentes biomoléculas de objetivo correspondientes en una muestra, a través del uso de diferentes cromóforos de señalización conjugados con las respectivas biomoléculas de sensor. Se suministran métodos múltiples empleando 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 400 o más diferentes biomoléculas de sensor, que pueden ser usada simultáneamente para probar diferentes biomoléculas de objetivo correspondientes.

Los métodos pueden estar preformados sobre un sustrato, así como en solución, aunque se espera que el formato de solución sea más rápido debido a asuntos de difusión. Así, el ensayo puede ser ejecutado, por ejemplo, en un formato de arreglo sobre un sustrato, el cual puede ser un biosensor. Esto puede ser logrado mediante anclaje o incorporación de otro modo de un componente de ensayo sobre el sustrato, por ejemplo la biomolécula de sensor, el CCP, o ambos. Estos sustratos pueden ser superficies de vidrio, silicio, papel, plástico o las superficies de semiconductores optoelectrónicos (tales como, pero no limitados a, nitruro de galio dopado con indio o polianilinas poliméricas, etc.) empleados como transductores optoelectrónicos. La ubicación de una biomolécula de sensor dada puede ser conocida o determinable en un formato de arreglo, y el formato de arreglo puede ser microdireccionable o nanodireccionable. En una variación, una o más muestras, que pueden contener un producto de amplificación, pueden ser unidas al sustrato, y el sustrato puede ser puesto en contacto con una o más biomoléculas de sensor etiquetadas y el CCP.

Definiciones

En la descripción de la presente invención, se emplearán los siguientes términos, y se pretende que sean definidos como se indica abajo.

"Alquilo" se refiere a un grupo hidrocarburo saturado ramificado, no ramificado o cíclico, de 1 a 24 átomos de carbono, opcionalmente sustituido en una o más posiciones, e incluye compuestos policíclicos. Los ejemplos de grupos alquilo incluyen grupos metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, s-butilo, t-butilo, n-pentilo, isopentilo, neopentilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo, n-decilo, hexiloctilo, tetradecilo, hexadecilo, eicosilo, tetracosilo opcionalmente sustituidos, y similares, así como grupos cicloalquilo tales como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, cicloctilo, adamantilo, y norbornilo. El término "alquilo menor" se refiere a un grupo alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, preferiblemente 1 a 4 átomos de carbono. Los sustituyentes ejemplares sobre grupos alquilo sustituidos incluyen hidroxilo, ciano, alcoxi, =O, =S, -NO², halógeno, haloalquilo, heteroalquilo, carboxialquilo, amina, amida, tioéter y - SH.

"Alcoxi" se refiere a un grupo "-O alquilo", en donde alquilo es como se definió anteriormente. Un grupo "alcoxi menor" pretende ser un grupo alcoxi que contiene de uno a seis, más preferiblemente de uno a cuatro, átomos de carbono.

"Alquenilo" se refiere a un grupo hidrocarburo ramificado, no ramificado o cíclico de 2 a 24 átomos de carbono, que contiene por lo menos un enlace doble carbono-carbono sustituido opcionalmente en una o más posiciones. Los ejemplos de grupos alquenilo incluyen etenilo, 1-propenilo, 2-propenil (alilo), 1 -metilvinilo, ciclopropenilo, 1 -butenilo, 2-butenilo, isobutenilo, 1,4-butadienilo, ciclobutenilo, 1-metilbut-2-enilo, 2-metilbut-2-en-4-ilo, prenilo, pent-1-enilo, pent-3-enilo, 1,1-dimetilalilo, ciclopentenilo, hex-2-enilo, 1 -metil-1-etilalilo, ciclohexenilo, heptenilo, cicloheptenilo, octenilo, cicloctenilo, decenilo, tetradecenilo, hexadecenilo, eicosenilo, tetracosenilo y similares. Los grupos alquenilo preferidos en este caso contienen 2 a 12 átomos de carbono. El término "alquenilo menor" pretende ser un grupo alquenilo de 2 a 6 átomos de carbono, preferiblemente 2 a 4 átomos de carbono. El término "cicloalquenilo" pretende ser un grupo alquenilo cíclico de 3 a 8, preferiblemente 5 o 6, átomos de carbono. Los sustituyentes ejemplares sobre grupos alquenilo sustituidos incluyen hidroxilo, ciano, alcoxi, =O, =S, -NO², halógeno, haloalquilo, heteroalquilo, amina, tioéter y -SH.

"Alqueniloxi" se refiere a un grupo "-O alquenilo", en el que alquenilo es como se definió anteriormente.

"Alquilanlo" se refiere a un grupo alquilo que está unido de manera covalente a un grupo arilo. Preferiblemente, el alquilo es un alquilo menor. Los grupos ejemplares de alquilarilo incluyen bencilo, fenetilo, fenopropilo, 1-benciletilo, fenobutilo, 2-bencilpropilo y similares.

"Alquilariloxi" se refiere a un grupo "-O alquilarilo", en el que alquilarilo es como se definió anteriormente.

"Alquinilo" se refiere a un grupo hidrocarburo ramificado o no ramificado de 2 a 24 átomos de carbono, que contiene por lo menos un enlace -C=C- triple, opcionalmente sustituido en una o más posiciones. Los ejemplos de grupos alquinilo incluyen etinilo, n-propinilo, isopropinilo, propargilo, but-2-inilo, 3-metilbut-1-inilo, octinilo, decinilo y similares. Los grupos alquinilo preferidos en este caso contienen 2 a 12 átomos de carbono. El término "alquinilo menor" pretende ser un grupo alquinilo de 2 a 6, preferiblemente 2 a 4, átomos de carbono, y un enlace -C=C- triple. Los sustituyentes ejemplares sobre grupos alquinilo sustituidos incluyen hidroxilo, ciano, alcoxi, =O, =S, -NO² , halógeno, haloalquilo, heteroalquilo, amina, tioétery-SH.

"Amida" se refiere a -C(O)NR'R", en la que R' y R" son seleccionados independientemente de entre hidrógeno, alquilo, arilo, y alquilarilo.

"Amina" se refiere a un grupo -N(R')R", en el que R' y R" son seleccionados independientemente de entre hidrógeno, alquilo, arilo, y alquilarilo.

"Arilo" se refiere a un grupo aromático que tiene por lo menos un anillo que tiene un sistema de electrón pi conjugado e incluye grupos arilo carbocíclicos, heterocíclicos, de puente y/o policíclicos, y puede estar sustituido opcionalmente en una o más posiciones. Los grupos arilo típicos contienen 1 a 5 anillos aromáticos, que pueden estar fusionados y/o enlazados. Los grupos arilo ejemplares incluyen fenilo, furanilo, azolilo, tiofuranilo, piridilo, pirimidilo, pirazinilo, triazinilo, bifenilo, indenilo, benzofuranilo, indolilo, naftilo, quinolinilo, isoquinolinilo, quinazolinilo, piridopiridinilo, pirrolopiridinilo, purinilo, tetralinilo y similares. Los sustituyentes ejemplares sobre grupos arilo opcionalmente sustituidos incluyen alquilo, alcoxi, alquilocarboxi, alquenilo, alqueniloxi, alquenilocarboxi, arilo, ariloxi, alquilarilo, alquilariloxi, anillos saturados o insaturados fusionados opcionalmente sustituidos, halógeno, haloalquilo, heteroalquilo, -S(O)R, sulfonilo, -SO³R, -SR, -NO² , -NRR', -OH, -CN, -C(O)R, -OC(O)R, - NHC(O)R, -(CH²)ⁿCO²R o -(CH²)ⁿCONRR' en las que n es 0-4, y en las que R y R' son independientemente H, alquilo, arilo o alquilarilo.

"Ariloxi" se refiere a un grupo "-O arilo", en el que arilo es como se definió anteriormente.

"Carbocíclico" se refiere a un compuesto opcionalmente sustituido que contiene por lo menos un anillo y en el que todos los átomos del anillo son carbono, y puede ser saturado o insaturado.

"Arilo carbocíclico" se refiere a un grupo arilo opcionalmente sustituido, en el que los átomos del anillo son carbono.

"Halo" o "halógeno" se refiere a flúor, cloro, bromo o yodo. "Haluro" se refiere a una de las formas aniónicas de los halógenos.

"Haloalquilo" se refiere a un grupo alquilo sustituido en una o más posiciones con un halógeno, e incluye grupos alquilo sustituidos con solamente un tipo de átomos de halógeno, así como grupos alquilo sustituidos con una mezcla de diferentes tipos de átomos de halógeno. Los grupos haloalquilo ejemplares incluyen grupos trihalometilo, por un ejemplo trifluorometilo.

"Heteroalquilo" se refiere a un grupo alquilo en el que uno o más átomos de carbono y átomo(s) asociado(s) de hidrógeno está(n) reemplazado(s) por un heteroátomo opcionalmente sustituido, e incluye grupos alquilo sustituidos con sólo un tipo de heteroátomo, así como grupos alquilo sustituidos con una mezcla de diferentes tipos de heteroátomos. Los heteroátomos incluyen oxígeno, azufre y nitrógeno. Como se usa en esta memoria, heteroátomos de nitrógeno y heteroátomos de azufre incluyen cualquier forma oxidada de nitrógeno y azufre, y cualquier forma de nitrógeno que tenga cuatro enlaces covalentes, incluyendo las formas protonadas. Un heteroátomo opcionalmente sustituido se refiere al reemplazo de uno o más hidrógenos unidos a un átomo de nitrógeno, con alquilo, arilo, alquilarilo o hidroxilo.

"Heterocíclico" se refiere a un compuesto que contiene por lo menos un anillo saturado o insaturado que tiene por lo menos un heteroátomo y opcionalmente sustituido en una o más posiciones. Los grupos heterocíclicos típicos contienen 1 a 5 anillos que pueden estar fusionados y/o enlazados, en los que los anillos contienen cada uno cinco o seis átomos. Los ejemplos de grupos heterocíclicos incluyen piperidinilo, morfolinilo y pirrolidinilo. Los sustituyentes ejemplares para grupos heterocíclicos opcionalmente sustituidos son como para alquilo y arilo en los carbonos del anillo y como para heteroalquilo en los heteroátomos.

"Arilo heterocíclico" se refiere a un grupo arilo que tiene por lo menos 1 heteroátomo en por lo menos un anillo aromático. Los grupos arilo heterocíclicos ejemplares incluyen furanilo, tienilo, piridilo, piridazinilo, pirrolilo, N-alquilo menor-pirrolo, pirimidilo, pirazinilo, triazinilo, tetrazinilo, triazolilo, tetrazolilo, imidazolilo, bipiridilo, tripiridilo, tetrapiridilo, fenazinilo, fenantrolinilo, purinilo y similares.

"Hidrocarbilo" se refiere a sustituyentes hidrocarbilo que contienen 1 a aproximadamente 20 átomos de carbono, incluyendo especies ramificadas, no ramificadas y cíclicas así como especies saturadas e insaturadas, por ejemplo grupos alquilo, grupos alquilidenilo, grupos alquenilo, grupos alquilarilo, grupos arilo y similares. El término "hidrocarbilo menor" pretende ser un grupo hidrocarbilo de uno a seis átomos de carbono, preferiblemente uno a cuatro átomos de carbono.

Un "sustituyente" se refiere a un grupo que reemplaza uno o más hidrógenos unidos a un carbono o nitrógeno. Los sustituyentes ejemplares incluyen alquilo, alquilidenilo, alquilcarboxi, alcoxi, alquenilo, alquenilcarboxi, alqueniloxi, arilo, ariloxi, alquilarilo, alquilariloxi, -OH, amida, carboxamida, carboxi, sulfonilo, =O, =S, -NO², halógeno, haloalquilo, anillos saturados o insaturados fusionados opcionalmente sustituidos, -S(O)R, -SO³R, -SR, -NRR', -OH, - CN, -C(O)R, -OC(O)R, -NHC(O)R, -(CH²)ⁿCO²R o -(CH²)ⁿCONRR' en las que n es 0-4, y en las que R y R' son independientemente H, alquilo, arilo o alquilarilo. Los sustituyentes incluyen también el reemplazo de un átomo de carbono y uno o más átomos de hidrógeno asociados, con un heteroátomo opcionalmente sustituido.

"Sulfonilo" se refiere a -S(O)²R, en la que R es alquilo, arilo, -C(CN)=C-arilo, -CH²CN, alquilarilo, o amina.

"Tioamida" se refiere a -C(S)NR'R", en la que R' y R" son seleccionados independientemente de hidrógeno, alquilo, arilo, y alquilarilo.

"Tioéter" se refiere a -SR, en la que R es alquilo, arilo, o alquilarilo.

Como se usa en esta memoria, el término "anticuerpo" incluye anticuerpos obtenidos de preparaciones policlonales y monoclonales así como: moléculas de anticuerpo híbrido (quimérico) (véase, por ejemplo, Winter et al. (1991) Nature 349:293-299; y patente de EEUU No. 4,816,567); fragmentos F(ab')2 y F(ab); moléculas Fv (heterodímeros no covalentes, véase, por ejemplo, Inbar et al. (1972) Proc Natl Acad Sci Us a 69:2659-2662; y Ehrlich et al. (1980) Biochem 19:4091-4096); moléculas Fv de cadena individual (sFv) (véase, por ejemplo, Huston et al. (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85:5879-5883); estructuras diméricas y triméricas de fragmento de anticuerpo; cuerpos en miniatura (véase, por ejemplo, Pack et al. (1992) Biochem 31:1579-1584; Cumber et al. (1992) J Immunology 149B:120-126); moléculas de anticuerpo humanizado (véase, por ejemplo, Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534-1536; y publicación de patente del Reino Unido No. GB 2,276,169, publicada el 21 de septiembre de 1994); y cualesquier fragmentos funcionales obtenidos a partir de tales moléculas, en los que tales fragmentos retienen las propiedades específicas de unión de la molécula progenitora de anticuerpo.

Como se usa en esta memoria, el término "anticuerpo monoclonal" se refiere a una composición de anticuerpo que tiene una población homogénea de anticuerpo. El término no está limitado respecto a las especies o fuente del anticuerpo, ni se pretende que esté limitado a la manera en la cual es preparado. Así, el término abarca anticuerpos obtenidos a partir de hibridomas de murina, así como anticuerpos monoclonales humanos obtenidos usando hibridomas humanos o a partir de hibridomas de murina preparados a partir de genes de cadena de inmunoglobulina humana de expresión de ratones o porciones de ellos. Por ejemplo, véase Cote, et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, 1985, p. 77.

Los términos "polinucleótido," "oligonucleótido", "ácido nucleico" y "molécula de ácido nucleico" son usados en este caso de manera intercambiable, para referirse a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, y pueden comprender ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, análogos de ellos o mezclas de ellos. Estos términos se refieren solamente a la estructura primaria de la molécula. Así, los términos incluyen ácido desoxirribonucleico ("ADN") de cuerda triple, doble y sencilla, así como ácido ribonucleico ("ARN") de cuerda triple, doble y sencilla. También incluye las formas modificadas, por ejemplo mediante alquilación, y/o mediante protección, y formas no modificadas del polinucleótido.

Sea modificado o no modificado, cuando se usa un polinucleótido como una molécula de sensor en métodos como los descritos en esta memoria, el polinucleótido sensor puede ser aniónico (por ejemplo, ARN o ADN), o el polinucleótido sensor puede tener un armazón no cargado (por ejemplo, PNA). En principio, el polinucleótido objetivo puede estar cargado o no cargado, aunque típicamente se espera que sea aniónico, por ejemplo ARN o ADN.

Más particularmente, los términos "polinucleótido," "oligonucleótido," "ácido nucleico" y "molécula de ácido nucleico" incluyen polidesoxirribonucleótidos (que contienen 2-desoxi-D-ribosa), polirribonucleótidos (que contienen D-ribosa), incluyendo tARN, rARN, hARN, y mARN, sean empalmados o no empalmados, cualquier otro tipo de polinucleótido que es un N- o C-glicósido de una base de purina o pirimidina, y otros polímeros que contienen un fosfato u otro armazón polianiónico, y otros polímeros sintéticos de ácido nucleico con especificidad de secuencia, que cuidan que los polímeros contengan nucleobases en una configuración que permite el paremiento de las bases y el apilamiento de las bases, tal como se encuentra en ADN y ARN. No se pretende hacer distinción en longitud entre los términos "polinucleótido," "oligonucleótido," "ácido nucleico" y "molécula de ácido nucleico" y en esta memoria estos términos son usados de manera intercambiable. Estos términos se refieren solamente a la estructura primaria de la molécula. Así, estos términos incluyen, por ejemplo, 3'-desoxi-2',5'-ADN, oligodesoxirribonucleótido N3' P5'fosforamidatos, ARN sustituido en 2'-O-alquilo, ADN de cuerda doble y sencilla, así como ARN de cuerda doble y sencilla, e híbridos de ellos incluyendo por ejemplo híbridos entre ADN y ARN, y también incluye tipos conocidos de modificaciones, por ejemplo, etiquetas, alquilación, "protecciones", sustitución de uno o más de los nucleótidos con un análogo, modificaciones de internucleótido tales como, por ejemplo, aquellas con enlaces cargados negativamente (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquellos que contienen fragmentos colgantes, tales como, por ejemplo, proteínas (incluyendo enzimas (por ejemplo nucleasas), toxinas, anticuerpos, péptidos de señal, poli-L-lisina, etc.), aquellos con intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), aquellos que contienen quelatos (de, por ejemplo, metales, metales radioactivos, boro, metales oxidativos, etc.), aquellos que contienen alquiladores, aquellos con enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), así como formas no modificadas del polinucleótido u oligonucleótido.

Se notará ahora que, como se usan en esta memoria, los términos "nucleósido" y "nucleótido" incluirán aquellos fragmentos que contienen no sólo las bases conocidas purina y pirimidina, sino también otras bases heterocíclicas que han sido modificadas. Tales modificaciones incluyen purinas o pirimidinas metiladas, purinas o pirimidinas aciladas, u otros heterociclos. Los nucleósidos o nucleótidos modificados pueden incluir también modificaciones sobre el fragmento de azúcar, por ejemplo, en las que uno o más de los grupos hidroxilo son reemplazados con halógeno, grupos alifáticos, o tienen grupos funcionales como éteres, aminas, o similares. Se pretende que el término "unidad nucleotídica" abarque nucleósidos y nucleótidos.

Además, las modificaciones a unidades nucleotídicas incluyen el nuevo arreglo, anexión, sustitución por o de otro modo alteración de grupos funcionales sobre las bases purina o pirimidina, que forman enlaces de hidrógeno a una pirimidina o purina complementaria respectiva. La unidad nucleotídica resultante modificada puede formar opcionalmente un par de base con otras unidades nucleotídicas modificadas así, pero no con A, T, C, G o U. Pueden incorporarse sitios abásicos, que no evitan la función del polinucleótido; preferiblemente, el polinucleótido no comprende sitios abásicos. Algunos o todos los residuos en el polinucleótido pueden estar opcionalmente modificados de una o más maneras.

Los pares A-T y G-C estándar de bases se forman bajo condiciones que permiten la formación de enlaces de hidrógeno entre el N3-H y C4-oxi de timidina y el N1 y C6-NH² , respectivamente, de adenosina y entre el C2-oxi, N3 y C4-NH², de citidina y el C2-NH², N'-H y C6-oxi, respectivamente, de guanosina. Así, por ejemplo, puede modificarse guanosina (2-amino-6-oxi-9-p-D-ribofuranosil-purina) para formar isoguanosina (2-oxi-6-amino-9-p-D-ribofuranosil-purina). Tal modificación da como resultado una base de nucleósido que ya no formará efectivamente un par estándar de bases con citosina. Sin embargo, la modificación de citosina (1-p-D-ribofuranosil-2-oxi-4-amino-pirimidina) para formar isocitosina (1-p-D-ribofuranosil-2-amino-4-oxi-pirimidina) da como resultado un nucleótido modificado que no generará efectivamente un par de bases con guanosina, pero formará un par de bases con isoguanosina. La isocitosina está disponible de Sigma Chemical Co. (San Luis, MO); la isocitidina puede ser preparada mediante el método descrito por Switzer et al. (1993) Biochemistry 32:10489-10496 y las referencias citadas allí; la 2'-desoxi-5-metil-isocitidina puede ser preparada mediante el método de Tor et al. (1993) J. Am. Chem. Soc. 115:4461-4467 y las referencias citadas allí; y los nucleótidos de isoguanina pueden ser preparados usando el método descrito por Switzer et al. (1993), arriba, y Mantsch et al. (1993) Biochem. 14:5593-5601, o mediante el método descrito en la patente de EEUU No. 5,780,610 de Collins et al. Otros pares de bases no naturales pueden ser sintetizados mediante el método descrito por en Piccirilli et al. (1990) Nature 343:33-37 para la síntesis de 2,6-diaminopirimidina y su complemento (1-metilpirazolo-[4,3]pirimidina-5,7-(4H,6H)-diona). Se conocen otras unidades nucleotídicas modificadas de ese modo, que forman pares únicos de bases, tales como aquellas descritas en Leach et al. (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:3675-3683 y Switzer et al., arriba.

"Enlace preferencial" o "hibridación preferencial" se refiere al incremento de la propensión de una biomolécula para enlazarse con un asociado de enlace en una muestra, comparada con otro componente de la muestra.

Las condiciones de hibridación incluirán típicamente concentraciones de sal de menos de aproximadamente 1 M, más usualmente menos de aproximadamente 500 mM y preferiblemente menos de aproximadamente 200 mM. En el caso de la hibridación entre un ácido péptido nucleico y un polinucleótido, la hibridación puede ser realizada en soluciones que contienen poca sal o no la contienen. Las temperaturas de hibridación pueden ser tan bajas como 5 °C, pero típicamente son mayores que 22 °C, más típicamente son mayores que aproximadamente 30 °C, y preferiblemente en exceso de aproximadamente 37 °C. Los fragmentos más largos pueden requerir temperaturas de hibridación más altas, para la hibridación específica. Otros factores pueden afectar la severidad de la hibridación, incluyendo la composición de bases y la longitud de las cuerdas complementarias, presencia de solventes orgánicos y extensión de la disparidad de bases, y la combinación de parámetros usados es más importante que la medición absoluta de uno cualquiera solo. Las condiciones adecuadas de hibridación para un formato dado de ensayo pueden ser determinadas por alguien experto en la técnica; los parámetros no limitantes que pueden ser ajustados incluyen concentraciones de componentes del ensayo, sales usadas y su concentración, fuerza iónica, temperatura, tipo y concentración del amortiguador, pH de la solución, presencia y concentración de reactivos de bloqueo para disminuir el enlace de fondo, tal como secuencias repetidas o soluciones de proteína de bloqueo, tipo(s) y concentraciones de detergente, moléculas tales como polímeros, que incrementan la concentración relativa de los polinucleótidos, ion(es) de metal y su(s) concentración(es), agente(s) quelante(s) y sus concentraciones, y otras condiciones conocidas en la técnica.

"Polipéptido" y "proteína" son usados de manera intercambiable en esta memoria e incluyen una cadena molecular de aminoácidos enlazados a través de enlaces péptido. Los términos se refieren a una longitud específica el producto. Así, "péptidos," "oligopéptidos," y "proteínas" están incluidos dentro de la definición de polipéptido. Los términos incluyen polipéptidos que contienen modificaciones del polipéptido, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones, y sulfataciones. Adicionalmente, los fragmentos de proteína, análogos (incluyendo amino ácidos no codificados por el código genético, por ejemplo homocisteina, ornitina, D-amino ácidos, y creatina), mutantes o variantes naturales o artificiales o combinaciones de ellos, proteínas de fusión, y proteínas que comprenden residuos transformados en derivados (por ejemplo alquilación de grupos amina, acetilaciones u otras esterificaciones de grupos carboxilo) y similares, están incluidos dentro del significado de polipéptido.

En esta memoria, "múltiple" se refiere a un ensayo u otro método analítico en el cual pueden realizarse simultáneamente múltiples analitos.

"Opción" u "opcionalmente" indica que el evento o circunstancia descrito a continuación puede o no ocurrir, y que la descripción incluye casos en los que dicho evento o circunstancia ocurre de manera individual o múltiple, y casos en los que no ocurre en absoluto. Por ejemplo, la frase "alquilo opcionalmente sustituido" indica un fragmento alquilo que puede o no estar sustituido y la descripción incluye alquilos no sustituidos, monosustituidos y polisustituidos.

El polímero conformacionalmente flexible

Los inventores han suministrado polímeros catiónicos conjugados (CCPs) conformacionalmente flexibles que comprenden agentes angulares de enlace con un patrón de sustitución (o regioquímica) capaz de alterar la habilidad del polímero para formar estructuras de bastón rígido, permitiendo que los CCPs tengan un mayor intervalo de estructuras tridimensionales. Los CCPs comprenden por lo menos tres subunidades con por lo menos un agente angular de enlace, que puede ser interno y/o una unidad terminal, y puede comprender por lo menos 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 25 o más subunidades. Los CCPs pueden comprender hasta aproximadamente 100, 200, 300, 500, 1000, 2000, 5000, 10000, 20000, 50000 o más subunidades.

El(los) agente(s) angular(es) de enlace son moléculas aromáticas opcionalmente sustituidas, que tienen por lo menos dos enlaces separados con otros componentes de polímero (por ejemplo, monómeros, polímeros de bloque, grupos terminales) que son capaces de formar mutuamente ángulos, lo cual altera la habilidad global del polímero para formar una estructura extendida de bastón rígido (aunque pueden permanecer regiones significativas que exhiben tal estructura). Los agentes angulares de enlace pueden ser bivalentes o polivalentes.

El ángulo que los agentes angulares de enlace son capaces de impartir a la estructura polimérica es determinado como sigue. Donde los dos enlaces con otros componentes poliméricos son coplanares, el ángulo puede ser determinado extendiendo líneas que representan aquellos enlaces hasta el punto en el cual se intersecan, y luego midiendo el ángulo entre ellas. Donde los dos enlaces con otros componentes poliméricos no son coplanares, el ángulo puede ser determinado como sigue: se dibuja una primera línea entre los dos átomos de anillo a los cuales se unen los enlaces; se dibujan dos líneas de enlace, una extendiéndose desde cada átomo de anillo en la dirección de su respectivo enlace hasta el otro componente polimérico al cual está unido; se fija el ángulo entre cada línea de enlace y la primera línea; y luego se unen los dos átomos de anillo en un punto individual encogiendo la primera línea hasta una longitud cero; el ángulo resultante entonces entre las dos líneas de enlace es el ángulo impartido por el agente angular de enlace al CCP.

El ángulo que el agente angular de enlace es capaz de impartir al polímero es típicamente de menos de aproximadamente 155 °, y puede ser de menos de aproximadamente 150 °, menos de aproximadamente 145 °, menos de aproximadamente 140 °, menos de aproximadamente 135 °, menos de aproximadamente 130 °, menos de aproximadamente 125 °, menos de aproximadamente 120 °, menos de aproximadamente 115 °, menos de aproximadamente 110 °, menos de aproximadamente 105 °, menos de aproximadamente 100 °, menos de aproximadamente 95 °, menos de aproximadamente 90 °, menos de aproximadamente 85 °, menos de aproximadamente 80 °, menos de aproximadamente 75 °, menos de aproximadamente 70 °, menos de aproximadamente 65 °, menos de aproximadamente 60 °, menos de aproximadamente 55 °, o menos de aproximadamente 50 °. El agente angular de enlace puede formar un ángulo con sus unidades poliméricas adyacentes de aproximadamente 25 °, 30 °, 35 °, 40 °, 45 °, 50 °, 60 ° o más. El agente angular de enlace puede introducir un giro de torsión en el polímero conjugado, alterando adicionalmente con ello la habilidad del polímero para formar una estructura de bastón rígido. Para agentes angulares de enlace que tienen un enlace que puede rotar internamente, tal como bifenilo polisustituido, el agente angular de enlace tiene que ser capaz de impartir un ángulo de menos de aproximadamente 155 ° en por lo menos una orientación.

Para anillos de seis miembros, tales ángulos pueden ser logrados a través de enlaces orto o meta con el resto del polímero. Para anillos de cinco miembros, los agentes adyacentes caen dentro de este intervalo. Para anillos de ocho miembros, los enlaces que se extienden desde átomos adyacentes de anillo, desde átomos alternos de anillos (separados por un átomo anillo), y desde átomos de anillo separados por otros dos átomos de anillo, caen dentro de este intervalo. Pueden usarse sistemas de anillo con más de ocho átomos de anillo. Para estructuras policíclicas, puede lograrse ángulos incluso más diversos.

Las unidades ejemplares de enlace que satisfacen estas limitaciones incluyen derivados de benceno incorporados dentro del polímero en las posiciones 1,2 o 1,3; los derivados de naftaleno incorporados dentro del polímero en las posiciones 1,2, 1,3, 1,6, 1,7, 1,8; derivados de antraceno incorporados dentro del polímero de las posiciones 1,2, 1,3, 1,6, 1,7, 1,8, y 1,9; derivados de bifenilo incorporados dentro del polímero en las posiciones 2,3, 2,4, 2,6, 3,3', 3,4, 3,5, 2,2-, 2,3', 2,4-, y 3,4'; y correspondientes heterociclos. Los números de posición son dados respecto anillos a base de carbono no sustituidos, pero en anillos sustituidos y/o heterociclos se abarcan las mismas posiciones relativas de incorporación en el polímero, si su distribución de sustituyentes cambia la numeración del anillo.

El CCP contiene preferiblemente por lo menos aproximadamente 0.01 % molar del agente angular de enlace, y puede contener por lo menos aproximadamente 0.02 % molar, por lo menos aproximadamente 0.05 % molar, por lo menos aproximadamente 0.1 % molar, por lo menos aproximadamente 0.2 % molar, por lo menos aproximadamente 0.5 % molar, por lo menos aproximadamente 1 % molar, por lo menos aproximadamente 2 % molar, por lo menos aproximadamente 5 % molar, por lo menos aproximadamente 10 % molar, por lo menos aproximadamente 20 % molar, o por lo menos aproximadamente 30 % molar. el CCP puede contener hasta 100 % molar del agente angular de enlace, y puede contener aproximadamente 99 % molar o menos, aproximadamente 90 % molar o menos, aproximadamente 80 % molar o menos, aproximadamente 70 % molar o menos, aproximadamente 60 % molar o menos, aproximadamente 50 % molar o menos, o aproximadamente 40 % molar o menos.

El CCP puede ser un copolímero y puede ser un copolímero de bloque, un copolímero injerto, o ambos. El agente angular de enlace puede estar incorporado dentro del CCP aleatoriamente, de modo alterno, periódicamente y/o en bloques. En un aspecto, el agente angular de enlace puede ser seleccionado de entre estructuras aromáticas o heteroaromáticas, en las cuales el enlace más corto entre las posiciones de enlace con el polímero, involucra un número par de átomos enlazados uno a otro.

Los CCPs que recolectan luz pueden transferir eficientemente energía a especies luminiscentes cercanas (por ejemplo, "cromóforos de señalización"). Los mecanismos para la transferencia de energía incluyen, por ejemplo, transferencia de energía resonante (transferencia de energía por resonancia Forster (o fluorescencia), FREt ), intercambio de carga cuántica (transferencia de energía de Dexter) y similares. Sin embargo, típicamente, estos mecanismos de transferencia de energía tienen intervalo relativamente corto; es decir, para la transferencia eficiente de energía se requiere proximidad cercana del CCP al cromóforo de señalización.

Los CCPs de la presente invención pueden suministrar deseablemente un mayor rendimiento cuántico y/o un incremento en la transferencia de energía a ADN de cuerda doble etiquetado con fluorescencia, en comparación con un copolímero de dibromuro de poli[9,9-bis(6'-N,N,N-trimetilamonio)hexilfluoreno-co-1,4-fenileno]. Así, los CCPs pueden suministrar un incremento de por lo menos dos veces en la transferencia de energía a dsADN etiquetado, y puede suministrar un incremento de tres veces o más en la transferencia de energía a dsADN etiquetado.

Los CCPs son policatiónicos, y cualquiera o todas las subunidades del polímero pueden comprender uno o más grupos catiónicos, incluyendo el(los) agente(s) angular(es) de enlace. Cualesquier grupos catiónicos adecuados pueden ser incorporados en los CCPs. Los grupos catiónicos ejemplares que pueden ser incorporados incluyen grupos amonio, grupos guanidinio, histidinas, poliaminas, grupos piridinio y grupos sulfonio.

De manera deseable, los CCPs descritos en esta memoria son solubles en soluciones acuosas y otros solventes polares, y preferiblemente son solubles en agua. Se entiende por "soluble en agua", que el material exhibe solubilidad en una solución predominantemente acuosa que, aunque comprende más de 50% en volumen de agua, no excluye otras sustancias de aquella solución, incluyendo sin limitación amortiguadores, agentes de bloqueo, cosolventes, sales, iones de metal y detergentes.

En una realización, un CCP ejemplar es representado por la fórmula A:

en la que:

CP¹, CP² , CP³, y CP⁴ son segmentos de polímero o estructuras oligoméricas conjugados, opcionalmente sustituidos, y pueden ser los mismos o diferentes uno de otro. CP¹, CP², CP³ , y CP⁴ pueden ser unidades aromáticas repetidas, y pueden ser seleccionadas de entre el grupo que consiste en benceno, naftaleno, antraceno, fluoreno, tiofeno, furano, piridina, y oxadiazoles, cada una opcionalmente sustituida. En la Tabla 1 abajo se muestran unidades aromáticas repetidas típicas, y en la Tabla 2 se muestran segmentos poliméricos y estructuras oligoméricas representativos.

La fórmula contiene unidades LU¹ y LU² de agente de enlace que son agentes angulares de enlace como se describió anteriormente, y pueden ser grupos arilo mono- o policíclicos opcionalmente sustituidos que tienen 5 a 20 átomos. Las unidades de agente de enlace pueden estar distribuidas uniforme o aleatoriamente a lo largo de la cadena principal de polímero. Los anillos aromáticos particularmente adecuados son aquellos que producen también una torsión espacial de la cadena principal de polímero, evitando que el polímero conjugado forme un plano a través de la unidad de agente de enlace.

CP¹, CP² , CP³ , CP⁴, LU¹ y LU² están cada uno opcionalmente sustituidos en una o más posiciones con uno o más grupos seleccionados de -R¹-A, -R²-B, -R³-C y -R⁴-D, que pueden estar unidos a través de grupos funcionales de puente -E- y -F-, con la condición de que el polímero como un todo tiene que estar sustituido con una pluralidad de grupos catiónicos.

R¹, R² , R³ y R⁴ son seleccionados independientemente de entre alquilo, alquenilo, alcoxi, alquinilo, y arilo, alquilarilo, arilalquilo, y oxido de polialquileno, cada uno opcionalmente sustituido, que puede contener uno o más heteroátomos, o puede no estar presente. R¹, R², R³ y R⁴ pueden ser seleccionados independientemente de entre alquilo C¹-²², alcoxi C¹-²², éster C¹-²², oxido de polialquileno que tiene de 1 a aproximadamente 22 átomos de carbono, éter de corona cíclica que tiene de 1 a aproximadamente 22 átomos de carbono, o no está presente. Preferiblemente, R¹, R², R³ y R⁴ pueden ser seleccionados de entre grupos alquilo rectos o ramificados que tienen 1 a aproximadamente 12 átomos de carbono, o grupos alcoxi con 1 a aproximadamente 12 átomos de carbono. Debe entenderse que más de un grupo funcional puede estar añadido a los anillos, según se indica en las fórmulas, en una o más posiciones.

A, B, C y D son seleccionados independientemente de entre H, -SiR'R"R"', -N+R'R"Rm, un grupo guanidinio, histidina, una poliamina, un grupo piridinio y un grupo sulfonio. R', R" y R''' son seleccionados independientemente de entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C^1-12 y alcoxi C^1-12 y cicloalquilo C^3-10. Se prefiere que R', R" y R'" sean grupos alquilo menor o alcoxi menor.

E y F son seleccionados independientemente de entre no presente, -O-, -S-, -C(O)-, -C(O)O-, - C(R)(R')-, -N(R')-, y -Si(R')(R"), en los que R' y R" son como se definió anteriormente.

X es O, S, Se, -N(R')- o -C(R')(R")-, y Y y Z son seleccionados independientemente de -C(R)= y -N=, en los que R, R' y R" son como se definió anteriormente.

m y n son independientemente 0 a aproximadamente 10,000, en donde m n > 1. Preferiblemente m y n son cada uno independientemente 0 a aproximadamente 20 y más preferiblemente de 0 a aproximadamente 10. Cada repetición de m y n puede ser la misma o diferente a los de repeticiones de ella.

b y e son independientemente 0 a aproximadamente 250, en donde b e > 1.

a, c, d y f son independientemente 0 a aproximadamente 250.

G y G1 son unidades de protección y pueden ser las mismas o diferentes. Las unidades de protección pueden ser unidades activadas que permiten reacción química adicional para extender la cadena de polímero, o pueden ser unidades de terminación no activadas. G y G1 pueden ser seleccionados independientemente de entre hidrógeno, arilo opcionalmente sustituido, arilo sustituido con halógeno, arilo sustituido con ácido borónico, y arilo sustituido con radical boronato.

Tabla i. Unidades aromáticas repetidas típicas para la construcción de segmentos conjugados y estructuras oligoinéricas

En una realización, se logró la modificación de la forma de polímero a través de la incorporación fraccionaria de enlaces meta y para sobre unidades de fenileno adyacentes a las unidades de monómero de fluorenilo. La relación meta/para es controlada durante la reacción de polimerización usando ácido 1,3-fenilenbisborónico y ácido 1,4-fenilenbisborónico en relaciones apropiadas. Los polímeros correspondientes pueden tener relaciones de enlaces meta a para que varían de 0 a 100%. La introducción del enlace meta no sólo permite el control de la forma, sino que también suministra la posibilidad de transferencia de energía a lo largo de la cadena principal de polímero, o entre diferentes segmentos de polímero, dado que los fragmentos que contienen una mayor fracción de enlaces para son de menor nivel de energía, y se comportan como trampas de energía baja. La aproximación de síntesis es como sigue. Primero se forma un polímero neutro mediante el acoplamiento de Suzuki de ácido 1,3-fenilenbisborónico y ácido 1,4-fenilenbisborónico que tienen una relación objetivo, con 2,7-dibromo-9,9-bis(6'-bromohexil)fluoreno. La conversión a polímeros catiónicos solubles en agua es lograda mediante adición de trimetilamina condensada. Véanse los ejemplos suministrados abajo.

Artículos de manufactura

Los CCPs pueden ser incorporados dentro de cualquiera de diferentes artículos de manufactura, incluyendo dispositivos optoelectrónicos o electrónicos, biosensores, fotodiodos, diodos que emiten luz ("LEDs"), chips semiconductores optoelectrónicos, películas delgadas de semiconductor, y chips, y pueden ser usados en microarreglo. El polímero puede ser incorporado dentro de un fotointerruptor polimérico. El polímero puede ser incorporado dentro de un interconectador óptico o un transductor, para convertir una señal de luz en un impulso eléctrico. Los CCPs pueden servir como materiales de cristal líquido. Los CCPs, que suministran un incremento en el desplazamiento de Stoke resultante de transferencia de energía inter- e intramolecular, pueden servir como materiales que funcionan como láser. Los CCPs flexibles que presentan disminución en la autoextinción pueden ser usados en dispositivos optoelectrónicos, que requieren emisión más intensa.

El polímero puede ser incorporado dentro de artículos de manufactura mediante cualquier técnica adecuada, incluyendo mediante recubrimiento por giro, fusión secuencial por giro, formación de películas de Langmuir-Blodgett o técnicas de absorción electrostática.8 Los artículos pueden ser fabricados mediante deposición paso a paso de capas de polielectrolito; la solubilidad en agua de ciertos CCPs flexibles suministrados en este caso permite la deposición secuencial de capas de diferentes materiales con diferentes solubilidades, suministrando ciertas ventajas durante la manufactura, incluyendo la deposición de capas delgadas de material.

Métodos de uso de los polímeros conformacionalmente flexibles

Los CCPs pueden ser usados en métodos que discriminan los CCPs respecto a alguna propiedad de interés. Por ejemplo, los CCPs pueden ser probados respecto al enlace a un objetivo, respecto a la transferencia de energía a un cromóforo, respecto al incremento en la eficiencia de la florescencia, respecto a la disminución de la autoextinción, respecto a la longitud de onda de absorbancia, y/o respecto a la longitud de onda de emisión. Pueden probarse objetivos particulares de interés, que incluyen biomateriales y compuestos químicos, contra una pluralidad de diferentes CCPs que comprenden tales agentes angulares de enlace, para encontrar CCPs particulares con propiedades deseables para el uso con un objetivo dado.

Una molécula de sensor que es específica para el objetivo puede ser usada en conjugación con el CCP, como puede un cromóforo de señalización al cual puede transferirse energía desde el CCP. Preferiblemente el CCP interactúa con el objetivo y/o el sensor a través de interacciones electrostáticas. Preferiblemente, se usa un sensor de estructura conocida, para determinar la presencia y/o cantidad del objetivo en la muestra. El sensor puede suministrar una señal específica a su objetivo complementario en cualquiera de diferentes vías, incluyendo a través de incorporación de un cromóforo de señalización específico que puede recibir energía del CCP, o a través de una posición definida y/o determinable sobre un sustrato. El cromóforo de señalización puede ser incorporado dentro del sensor, dentro de un sustrato, o puede ser reclutado para un complejo formado por el sensor y el objetivo. La formación de tal complejo da como resultado un incremento en la transferencia de energía desde un CCP, por excitación, hasta el cromóforo de señalización, el cual puede ser detectado directa o indirectamente para suministrar información respecto al objetivo.

En principio puede usarse cualquier molécula objetivo y cualquier molécula de sensor que puedan enlazarse mutuamente, con la condición de que el CCP tiene que enlazarse a o asociarse de otro modo con por lo menos un miembro de aquel par de enlace o el complejo que forman; esto puede ser logrado a través de interacción electrostática con grupos cargados negativamente sobre él, o mediante proximidad física por incorporación dentro de un dispositivo tal como un sensor que también se enlaza a o está asociado con uno o más miembros del complejo, llevando de ese modo al CCP a yuxtaposición de señalización con el cromóforo de señalización.

La molécula objetivo puede ser una biomolécula, por ejemplo un péptido o proteína, un polinucleótido tal como ADN o ARN, y un anticuerpo. El objetivo puede ser un compuesto químico, y los CCPs pueden ser incorporados dentro de sensores químicos para detectar cualquier especie de interés, por ejemplo un explosivo, por ejemplo trinitrotolueno.

De modo similar, moléculas ejemplares de sensor incluyen compuestos químicos y biomoléculas. Las biomoléculas ejemplares de sensor incluyen un polinucleótido con un armazón aniónico, tal como ADN o ARN, un polinucleótido con un armazón no cargado, tal como un ácido péptido nucleico (PNA), un anticuerpo, y un péptido o proteína, la cual puede ser una proteína que enlaza polinucleótido (PBP).

Cuando la biomolécula de sensor es un polinucleótido, el polinucleótido de sensor puede ser ramificado, multimérico o circular, pero típicamente es lineal, y puede contener bases no naturales. Los polinucleótidos de sensor pueden ser preparados con cualquier secuencia deseada de bases. Los métodos químicos para la unión de un cromóforo de señalización a biomoléculas de sensor son conocidos en la técnica.9 pueden prepararse a la medida estructuras de polinucleótido de sensor específico, incluyendo estructuras conjugadas con cromóforos, usando fuentes comerciales o mediante síntesis química.

Cualquier proteína que pueda enlazarse con un polinucleótido objetivo de interés, puede ser empleada como una PBP. Los métodos químicos para unir el cromóforo de señalización a la PBP de sensor son conocidos. Pueden prepararse a la medida estructuras de PBP de sensor específico, incluyendo estructuras conjugadas con cromóforos, usando fuentes comerciales o mediante síntesis química. Los ejemplos no limitantes de PBPs incluyen cualesquier proteínas que enlazan ADN, incluyendo factores de transcripción, factores de empalme, proteínas poli(A) de unión, componentes de cromatina, proteínas virales, proteínas que detectan infección viral, factores de replicación, y proteínas involucradas en división celular mitótica y/o meiótica. Las interacciones de proteína-ARN median procesos celulares importantes incluyendo transcripción, modificaciones postranscripcionales, empalme de ARN, y traslación10111213. El ciclo de replicación de muchos virus patógenos, tales como el virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (HIV-1)14, picornavirus15 y virus de la influenza16, descansan en interacciones específicas de proteína ARN. La especificidad de tales interacciones puede ser usada como la base para sensores específicos de secuencia, para uso en diagnóstico médico y estudios genómicos. Las proteínas ejemplares de unión de polinucleótido incluyen proteínas de dedo de zinc, proteínas de homeodominio, proteínas de hélice con alas (cabeza de horquilla), proteínas de cremallera de leucina, proteínas de hélice-corte-hélice, proteínas de hélice-giro-hélice, y proteínas similares a histona. Las PBPs pueden ser aisladas de una fuente celular, o pueden ser producidas in vitro, por ejemplo a través de métodos in vitro de transcripción/traslación a través de métodos completamente sintéticos. Las PBPs pueden ser proteínas que ocurren de modo natural, mutantes de proteínas que ocurren de modo natural, proteínas producidas aleatoriamente, por ejemplo, mediante métodos de evolución molecular, o proteínas sospechosas de enlazarse con polinucleótido, de especificidad de enlace desconocida. Los ejemplos de PBP's específicas que pueden ser usadas incluyen Tat que se unen al Elemento de Respuesta Rev de virus de inmunodeficiencia humana (HIV), la proteína M1 de matriz que se une a ARN de virus de influenza tipo A, y proteína hnRNP U que se une a ARN prerribosomal.

En algunos casos puede ser deseable añadir un solvente orgánico, por ejemplo un solvente orgánico miscible en agua, tal como etanol, a un ensayo que utiliza un CCP para disminuir las interacciones hidrófobo entre el CCP y otro componente del ensayo, y de ese modo disminuir la señal de fondo.

Cuando el objetivo está presente en una muestra biológica, la porción de una muestra que comprende o de la que se sospecha comprende el objetivo, puede ser cualquier fuente de material biológico que puede ser obtenida directa o indirectamente de un organismo vivo, incluyendo células, tejido o fluido, y los depósitos dejados por aquel organismo, incluyendo virus, micoplasma, y fósiles. La muestra puede comprender un polinucleótido objetivo preparado total o parcialmente a través de medios sintéticos. Típicamente, la muestra es obtenida como o dispersada en un medio predominantemente acuoso. Los ejemplos no limitantes de la muestra incluyen sangre, orina, semen, leche, esputo, moco, un frotis vocal, un frotis vaginal, un frotis rectal, un producto de aspiración, una biopsia de aguja, una sección de tejido obtenida por ejemplo por cirugía o autopsia, plasma, suero, fluido espinal, fluido de linfa, las secreciones externas de la piel, los tractos respiratorio, intestinal, y genitourinario, lágrimas, saliva, tumores, órganos, muestras de constituyentes de cultivo celular in vitro (incluyendo pero no limitado a medio acondicionador resultante del crecimiento de células en el medio de cultivo celular, células infectadas viralmente de modo putativo, células recombinantes, y componentes de célula), y una biblioteca recombinante que comprende secuencias de polinucleótido. La muestra puede ser presentada sobre un sustrato como se describe en esta memoria. El sustrato puede ser una lámina que comprende la muestra, tal como se usa en florescencia de hibridación in situ (FISH).

La muestra puede ser una muestra de control positivo de la que se conoce contiene el objetivo o un sustituto del mismo. Puede usarse también una muestra de control negativo que, aunque no se espera que contenga el objetivo, es sospechosa de contenerlo (vía la contaminación de uno o más de los reactivos) u otro componente capaz de producir un falso positivo, y es probada con objeto de confirmar la ausencia de contaminación de los reactivos usados por el objetivo en un ensayo dado, así como para determinar si un conjunto dado de condiciones de ensayo produce falsos positivos (una señal positiva incluso en ausencia del objetivo en la muestra).

La muestra puede ser diluida, disuelta, suspendida, sometida a extracción o tratada de otro modo para solubilizar y/o purificar cualquier objetivo presente o para hacerlo accesible, por ejemplo a los reactivos que son usados como un esquema de amplificación o a los reactivos de detección. Donde la muestra contiene células, las células pueden ser lisadas o permeabilizadas para liberar los polinucleótidos dentro de las células. Pueden usarse amortiguadores de permeabilización de un paso para lisar células, lo cual permite que se ejecuten pasos posteriores después de la lisis, por ejemplo una reacción de cadena de polimerasa.

Detección de polinucleótidos objetivo. Donde se usa polímero conformacionalmente flexible para detectar un polinucleótido objetivo en una muestra, el polinucleótido objetivo puede tener cuerda individual, cuerda doble o de mayor orden, y puede ser lineal o circular. Los polinucleótidos ejemplares objetivo de cuerda individual incluyen genomas virales de mARN, rARN, tARN, hnARN, ssARN o ssADN, aunque estos polinucleótidos pueden contener internamente secuencias complementarias y estructura secundaria significativa. Los polinucleótidos objetivo ejemplares de cuerda doble incluyen ADN genómico, ADN mitocondrial, ADN de cloroplasto, dsARN o genoma viral de dsADN, plásmidos, fagos, y viroides. El polinucleótido objetivo puede ser preparado de modo sintético o purificado a partir de una fuente biológica. El polinucleótido objetivo puede ser purificado para retirar o disminuir de la muestra, uno o más componentes indeseados, o para concentrar el polinucleótido objetivo. A la inversa, donde el polinucleótido objetivo está demasiado concentrado para el ensayo particular, el polinucleótido objetivo puede ser diluido.

A continuación de la colección de la muestra y opcional extracción de ácido nucleico, puede someterse la porción de ácido nucleico de la muestra que comprende el polinucleótido objetivo, a una o más reacciones preparativas. Éstas reacciones preparativas pueden incluir transcripción in vitro (IVT), etiquetado, fragmentación, amplificación y otras reacciones. El mARN puede ser tratado primero con transcriptasa inversa y un cebador para crear cADN antes de la detección y/o amplificación; esto puede ser realizado in vitro con mARN purificado o in situ, por ejemplo en células o tejidos fijados a una lámina. Para el uso es adecuada una variedad de métodos de amplificación; los ejemplos no limitantes de reacciones adecuadas de amplificación incluyen el método de reacción de cadena de polimerasa (PCR), la reacción de cadena de ligasa (LCR), replicación de secuencia autosostenida (3SR), amplificación a base de secuencia de ácido nucleico (NASBA), el uso de Q Beta replicasa, transcripción inversa, traslación con corte, y similares.

El polinucleótido objetivo puede ser amplificado típicamente mediante contacto de una o más cuerdas del polinucleótido objetivo con un cebador y una polimerasa que tiene actividad adecuada para extender el cebador y copiar el polinucleótido objetivo, para producir un polinucleótido complementario de longitud total o una porción más pequeña del mismo. Puede usarse cualquier enzima que tenga una actividad de polimerasa que pueda copiar el polinucleótido objetivo, incluyendo polimerasas de ADN, polimerasas de ARN, transcriptasas inversas, enzimas que tienen más de un tipo de actividad de polimerasa, y la enzima puede ser termolábil o termoestable. También pueden usarse mezclas de enzimas.

Se eligen condiciones adecuadas de reacción para permitir la amplificación del polinucleótido objetivo, incluyendo pH, amortiguador, fuerza iónica, presencia y concentración de una o más sales, presencia y concentración de reactivos y cofactores tales como nucleótidos y magnesio y/u otros iones metálicos (por ejemplo, manganeso), cosolventes opcionales, temperatura, perfil de formación térmica de ciclo para esquemas de amplificación que comprenden una reacción de cadena de polimerasa, y puede depender en parte de la polimerasa que es usada, así como de la naturaleza de la muestra. Los cosolventes incluyen formamida (típicamente a aproximadamente 2 a aproximadamente 10 %), glicerol (típicamente a aproximadamente 5 a aproximadamente 10 %), y DMSO (típicamente a aproximadamente 0.9 a aproximadamente 10 %). Pueden usarse técnicas en el esquema de amplificación con objeto de minimizar la producción de falsos positivos o artefactos producidos durante la amplificación. Éstas incluyen PCR de "touchdown", técnicas de inicio caliente, uso de cebadores anidados, o diseño de cebadores de PCR de modo que forman estructuras de corte-tallo en el evento de formación de dímero de cebador, y así no son amplificados. Pueden usarse técnicas para acelerar la PCR, por ejemplo PCR centrífuga, que permite mayor convección dentro de la muestra, y comprende pasos de calentamiento infrarrojo para calentamiento y enfriamiento rápidos de la muestra. Puede ejecutarse uno o más ciclos de amplificación.

Los polinucleótidos objetivo amplificados pueden ser sometidos a tratamientos de postamplificación. Por ejemplo, en algunos casos, puede ser deseable fragmentar el polinucleótido objetivo antes de la hibridación, con objeto de suministrar segmentos que son más fácilmente accesibles. La fragmentación de los ácidos nucleicos puede ser llevada a cabo por cualquier método que produce fragmentos de un tamaño útil en el ensayo que se está ejecutando; en la técnica se conocen métodos físicos, químicos y enzimáticos adecuados.

Una reacción de amplificación puede ser ejecutada bajo condiciones que permiten la hibridación de un polinucleótido sensor, al producto de amplificación, durante por lo menos parte de un ciclo de amplificación. Cuando el ensayo es ejecutado de esta manera, puede tener lugar detección en tiempo real de este evento de hibridación, mediante seguimiento a un cambio en la emisión de luz desde el cromóforo de señalización, que ocurre por tal hibridación durante el esquema de amplificación.

Cromóforos de señalización. Los cromóforos útiles en los métodos descritos en esta memoria incluyen cualquier sustancia que pueda absorber energía de un CCP flexible y emitir luz. Los métodos químicos para la unión de un cromóforo de señalización a una molécula de sensor u otro componente de ensayo, son conocidos.17 Para ensayos múltiples, puede usarse una pluralidad de diferentes cromóforos de señalización con espectros de emisión detectables de modo diferente. El cromóforo puede ser un lumóforo o un fluoróforo. Los fluoróforos típicos incluyen pigmentos fluorescentes, nanocristales de semiconductor, quelatos de lantánidos, pigmentos específicos de polinucleótido y proteína fluorescente verde.

Los pigmentos fluorescentes ejemplares incluyen fluoresceina, 6-FAM, rodamina, rojo Texas, tetrametilrrodamina, carboxirrodamina, carboxirrodamina 6G, carboxirrodol, carboxirrodamina 110, azul Cascada, amarillo Cascada, cumarina, Cy2®, Cy3®, Cy3.5®, Cy5®, Cy5.5®, Cy-Chrome, ficoeritrina, PerCP (proteína de peridinin clorofila -a), PerCP-Cy5.5, JOE (6-carboxi-4',5'-dicloro-2',7'-dimetoxifluoresceina), NED, ROX (5-(y -6)-carboxi-X-rodamina), HEX, amarillo Lucifer, azul Marino, verde Oregon 488, verde Oregon 500, verde Oregon 514, Alexa Fluor® 350, Alexa Fluor® 430, Alexa Fluor® 488, Alexa Fluor® 532, Alexa Fluor® 546, Alexa Fluor® 568, Alexa Fluor® 594, Alexa Fluor® 633, Alexa Fluor® 647, Alexa Fluor® 660, Alexa Fluor® 680, ácido 7-amino-4-metilcumarin-3-acético, BODIPY® FL, BODIPY® FL-Br2, BODIPY® 530/550, BODIPY® 558/568, BODIPY® 564/570, BODIPY® 576/589, BODIPY® 581/591, BODIPY® 630/650, BODIPY® 650/665, BODIPY® R6G, BODIPY® TMR, BODIPY® TR, conjugados de los mismos, y combinaciones de los mismos. Los quelatos ejemplares de lantánidos incluyen quelatos de europio, quelatos de terbio y quelatos de samario.

En la técnica se conoce una amplia variedad de nanocristales fluorescentes de semiconductor ("SCNCs"); en: la publicación de PCT No. WO 99/26299 publicada el 27 de mayo de 1999, inventores Bawendi et al.; USPN 5,990,479 emitida en 23 de noviembre de 1999 por Weiss et al.; y Bruchez et al., Science 281:2013, 1998 se describen métodos para la producción y uso de nanocristales de semiconductor. Los nanocristales de semiconductor pueden ser obtenidos con bandas de emisión muy estrechas, con longitudes de onda de pico de emisión bien definidas, permitiendo que en el mismo ensayo se use un gran número de diferentes de SCNCs como cromóforos de señalización, opcionalmente en combinación con otros tipos no SCNC de cromóforos de señalización.

Los pigmentos ejemplares específicos de polinucleótido incluyen naranja de acridina, acridina homodímero, actinomicina D, 7-aminoactinomicina D (7-AAD), 9-amino-6-cloro-2-metoxiacridina (ACMA), 1-yoduro de BOBOMR (462/481), 3-yoduro de BOBOMR (570/602), 1-yoduro de BO-PROMR (462/481), 3-yoduro de BO-PROMR (575/599), diclorhidrato de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), diclorhidrato de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), 4',6-diamidino-2-fenilindole, dilactato (DAPI, dilactato), dihidroetidio (hidroetidina), dihidroetidio (hidroetidina), dihidroetidio (hidroetidina), bromuro de etidio, cloruro de etidio diazida, etidio homodímero-1 (EtD-1), etidio homodímero-2 (EtD-2), bromuro de etidio monoazida (EMA), yoduro de hexidio, Hoechst 33258, Hoechst 33342, Hoechst 34580, Hoechst S769121, hidroxiestilbamidina, metanosulfonato, 1-yoduro de JOJOMR (529/545), 1-yoduro de JO-PROMR (530/546), 1-yoduro de LOLOMR (565/579), 1-yoduro de LO-PROMR (567/580), NeuroTraceMR 435/455, NeuroTraceMR 500/525, NeuroTraceMR 515/535, NeuroTraceMR 530/615, NeuroTraceMR 640/660, OliVerde, PicoVerde® ssADN, PicoVerde® dsADN, 1-yoduro de POPOMR (434/456), 3-yoduro de POPOMR (534/570), 1-yoduro de PO-PROMR (435/455), 3-yoduro de PO-PROMR (539/567), yoduro de propidio, RiboVerde®, SlowFade®, SlowFade® Light, SYb R® verde I, SYBR® Verde II, SYBR® Gold, SYBR® 101, SYBR® 102, SYBR® 103, SYBR® DX, TO-PRO®-1, TO-PRO®-3, TO-PRO®-5, TOTO®-1, TOTO®-3, YO-PRO®-1 (amarillo oxazol), YO-PRO®-3, YOYO®-1, YOYO®-3, TO, SYTOX® Azul, SYTOX® Verde, SYTOX® Naranja, SYTO® 9, SYTO® BC, SYTO® 40, SYTO® 41, SYTO® 42, SYTO® 43, SYTO® 44, SYTO® 45, SYTO® Azul, SYTO® 11, SYTO® 12, SYTO® 13, SYTO® 14, SYTO® 15, SYTO® 16, SYTO® 20, SYTO® 21, SYTO® 22, SYTO® 23, SYTO® 24, SYTO® 25, SYTO® Verde, SYTO® 80, SYTO® 81, SYTO® 82, SYTO® 83, SYTO® 84, SYTO® 85, SYTO® Naranja, SYTO® 17, SYTO® 59, SYTO® 60, SYTO® 61, SYTO® 62, SYTO® 63, SYTO® 64, SYTO® rojo, netropsina, distamicina, acridina naranja, 3,4-benzopireno, tiazol naranja, TOMEHE, daunomicina, acridina, pentil-TOTAB, y butil-TOTIN. Pueden usarse pigmentos de cianina asimétrica como el pigmento específico de polinucleótido. Otros pigmentos de interés incluyen aquellos descritos por Geierstanger, B.H. y Wemmer, D.E., Annu. Rev. Vioshys. Biomol. Struct. 1995, 24, 463-493, por Larson, C.J. y Verdín, G.L., Bioorganic Chemistry: Nucleic Acids, Hecht, S.M., Ed., Oxford University Press: Nueva York, 1996; pp 324-346, y por Glumoff, T. y Goldman, A. Nucleic Acids in Chemistry and Biology, 2a ed., Blackburn, G.M. y Gait, M.J., Eds., Oxford University Press: Oxford, 1996, pp 375-441. Los pigmentos específicos de polinucleótido pueden ser un pigmento de intercalación, y pueden ser específicos para polinucleótidos de doble cuerda. En www.probes.com (Molecular Probes, Inc.) se describen otros pigmentos y flúoróforos.

El término "proteína fluorescente verde" se refiere a la proteína fluorescente verde de Aequorea nativa y de versiones mutadas, de las que se han identificado exhiben características alteradas de fluorescencia, incluyendo máximos de excitación y emisión alterados, así como espectros de excitación y emisión de diferentes formas (Delagrave, S. et al. (1995) Bio/Technology 13:151-154; Heim, R. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:12501-12504; Heim, R. et al. (1995) Nature 373:663-664). Delagrave et al. aislaron mutantes de Aequorea victoria GFP clonada que tenían espectros de excitación con desplazamiento al rojo. Heim, R. et al. reportaron un mutante (Tyr66 a His) que tiene una fluorescencia azul.

En una variación, se usa un segundo cromóforo de señalización, que puede estar unido directa o indirectamente a otro de los componentes del ensayo y/o a un sustrato, para recibir energía desde el cromóforo inicial de señalización. En aplicaciones particulares, esto puede aportar una selectividad adicional significativa. Por ejemplo, puede usarse un pigmento específico de polinucleótido bien sea como el inicial o el segundo cromóforo de señalización, y puede ser específico para secuencias de cuerda doble. Luego la energía puede ser transferida desde el CCP conformacionalmente flexible excitado al cromóforo inicial de señalización, el cual a continuación transfiere energía al segundo cromóforo de señalización, en un formato total que es selectivo para el objetivo. Esta cascada de cromóforos de señalización puede ser extendida, en principio, para usar varios cromóforos de señalización con perfiles compatibles de absorción y emisión. En una realización de esta variación, como el segundo cromóforo de señalización se usa un pigmento de intercalación que es específico para polinucleótidos de cuerda doble, y un cromóforo inicial de señalización que es capaz de transferir energía al segundo cromóforo de señalización está conjugado con un polinucleótido de sensor. El pigmento de intercalación suministra el requerimiento selectivo añadido según el cual los polinucleótidos objetivo y de sensor se hibridan antes de que sea reclutado para el complejo de detección. En presencia del objetivo se forma el dúplex, se recluta el pigmento, y la excitación del multicromóforo conduce a señalización desde el segundo cromóforo de señalización.

Sustratos. Los métodos descritos en esta memoria pueden ser ejecutados sobre un sustrato en cualquiera de una variedad de formatos. Uno o más de los componentes de ensayo pueden ser incorporados en, añadidos a, o de otro modo, asociados con el sustrato, directa o indirectamente. El sustrato puede comprender un amplio intervalo de materiales, sean biológicos, no biológicos, orgánicos, inorgánicos, o una combinación de cualquiera de estos. Por ejemplo, el sustrato puede ser una película polimerizada de Langmuir Blodgett, vidrio funcionalizado, Si, Ge, GaAs, GaP, SiO2, SiN4, silicio modificado, o uno cualquiera de una amplia variedad de geles o polímeros, tales como (poli)tetrafluoroetileno, (poli)vinilidendifluoruro, poliestireno, poliestireno entrecruzado, ácido poliacrílico, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, poli(lactida coglicolida), polianhídridos, poli(metil metacrilato), poli(etilen-co-vinil acetato), polisiloxanos, sílice polimérica, látex, polímeros de dextrano, epoxis, policarbonatos, agarosa, poli(acrilamida) o combinaciones de ellos. Pueden usarse polímeros conductores y materiales fotoconductores.

Los sustratos pueden ser sustratos cristalinos planos, tales como sustratos a base de sílice (por ejemplo vidrio, cuarzo o similares), o sustratos cristalinos usados en, por ejemplo, las industrias de semiconductores y microprocesadores, tales como silicio, arseniuro de galio, GaN dopado con indio y similares, e incluye nanocristales semiconductores.

El sustrato puede tomar la forma de un fotodiodo, un sensor optoelectrónico tal como un chip semiconductor optoelectrónico o semiconductor optoelectrónico de película delgada, o un biochip. La(s) ubicación(es) del(los) sensor(es) individual(es) sobre el sustrato pueden ser direccionables; esto puede ser hecho en formatos altamente densos, y la(s) ubicación(es) pueden ser microdireccionables o nanodireccionables.

Como sustratos pueden usarse también aerogeles de sílice, y pueden ser preparados mediante métodos conocidos en la técnica. Los sustratos de aerogel pueden ser usados como sustratos independientes o como cobertura de superficie para otro material de sustrato.

El sustrato puede tomar cualquier forma y típicamente es un platillo, lámina, perla, pella, disco, partícula, micropartícula, nanopartícula, cuerda, precipitado, gel opcionalmente poroso, lámina, tubo, esfera, contenedor, capilar, paleta, lámina, película, chip, plato o platillo con múltiples pozos, fibra óptica, etc. El sustrato puede ser de cualquier forma que es rígida o semirrígida. El sustrato puede contener regiones elevadas o deprimidas sobre las cuales se localiza una molécula de sensor y/u otro componente de ensayo. La superficie del sustrato puede ser erosionada usando técnicas bien conocidas, para suministrar rasgos superficiales deseados, por ejemplo zanjas, muescas en v, estructuras mesa, o similares.

Las superficies sobre el sustrato pueden estar compuestas del mismo material que el sustrato, o pueden estar hechas de un material diferente, y pueden ser acopladas al sustrato mediante medios químicos o físicos. Tales superficies acopladas pueden estar compuestas de cualquiera de una amplia variedad de materiales, por ejemplo, polímeros, plásticos, resinas, polisacáridos, sílice o materiales a base de sílice, carbón, metales, vidrios inorgánicos, membranas o cualquiera de los materiales sustrato listados anteriormente. La superficie puede ser ópticamente transparente y puede tener funcionalidades Si-OH de superficie, tales como aquellas halladas en las superficies de sílice.

El sustrato y/o su superficie opcional son elegidos para suministrar características ópticas apropiadas para los métodos de síntesis y/o detección usados. El sustrato y/o superficie pueden ser transparentes para permitir la exposición del sustrato a la luz aplicada desde múltiples direcciones. Al sustrato y/o superficie pueden suministrarse estructuras reflectivas de "espejo" para incrementar la recuperación de luz.

El sustrato y/o su superficie son generalmente resistentes a, o son tratados para resistir, las condiciones a las cuales van a exponerse en uso, y pueden ser tratados opcionalmente para retirar cualquier material resistente, después de la exposición a tales condiciones.

Las moléculas de sensor pueden ser fabricadas sobre o unidas al sustrato mediante cualquier método adecuado, por ejemplo los métodos descritos en el documento de patente de EEUU no. 5,143,854, publicación de PCT No. WO 92/10092, solicitud de patente de EEUU Ser. No. 07/624,120, registrada el 6 de diciembre de 1990 (ahora abandonada), Fodor et al., Science, 251: 767-777 (1991), y PCT Publ. No. WO 90/15070). Las técnicas para la síntesis de estos arreglos que usan estrategias de síntesis mecánica son descritas, por ejemplo, en la publicación PCT No. WO 93/09668 y la patente de EEUU no. 5,384,261.

Las técnicas todavía adicionales incluyen técnicas a base de perlas, tales como aquellas descritas en la solicitud de PCT No. PCT/US93/04145 y métodos a base de barras, tales como aquellos descritos en la patente de EEUU no.

5,288,514.

En la solicitud de patente de EEUU Ser. No. 07/980,523, registrada el 20 de noviembre de 1992, y la patente de EEUU no. 5,384,261 se describen métodos adicionales de canal de flujo o formación de manchas, aplicables a la unión de moléculas de sensor al sustrato. Los reactivos son entregados al sustrato mediante (1) flujo dentro de un canal definido sobre regiones predeterminadas o (2) "formación de manchas" sobre regiones predefinidas. Puede usarse una cobertura protectora tal como una cobertura hidrofílica o hidrófoba (dependiendo de la naturaleza del solvente), sobre porciones del sustrato que va a ser protegido, algunas veces en combinación con materiales que facilitan la humectación por la solución de reactivo en otras regiones. De esta manera, se evita adicionalmente que las soluciones que fluyen pasen fuera de sus rutas de flujo designadas.

Los dispensadores típicos incluyen una micropipeta controlada opcionalmente mediante robot, una impresora de chorro de tinta, una serie de tubos, un distribuidor, un arreglo de pipetas, o similares, de modo que los diferentes reactivos pueden ser entregados a las regiones de reacción, secuencial o simultáneamente.

Excitación y detección de los cromóforos

Para la excitación puede usarse cualquier instrumento que suministra una longitud de onda que puede excitar al CCP conformacionalmente flexible y es más corta que las longitudes de onda de emisión que va a ser detectada. Preferiblemente la fuente de excitación no excita significativamente de manera directa al cromóforo de señalización. La fuente puede ser: una fuente de luz UV de banda ancha, tal como una lámpara de deuterio con un filtro apropiado, la salida de una fuente de luz blanca tal como una lámpara de xenón o una lámpara de deuterio, después de pasar a través de un monocromador para extraer las longitudes de onda deseadas, un gas láser de onda continua (cw), un láser de diodo de estado sólido, o cualquiera de los láser con pulso. La luz emitida desde el cromóforo de señalización puede ser detectada a través de cualquier dispositivo o técnica adecuados; en la técnica se conocen muchas aproximaciones adecuadas. Por ejemplo, puede usarse un fluorómetro o espectrofotómetro, para detectar si la muestra de prueba emite luz de una longitud de onda característica del cromóforo de señalización, por excitación del CCP.

Kits

También se suministran kits que comprenden reactivos útiles para la ejecución de los métodos de la invención. En una realización, un kit comprende una molécula de sensor que puede unirse a una molécula objetivo de interés y a un CCP conformacionalmente flexible. La molécula de sensor puede estar conjugada con un cromóforo de señalización. En presencia del objetivo en la muestra, el sensor se une al objetivo dando como resultado un incremento en la emisión de energía desde el cromóforo de señalización, el cual puede ser detectado.

Los componentes del kit son retenidos por una carcasa. Con la carcasa pueden suministrarse instrucciones para el uso del kit, para la ejecución de un método de la invención, y pueden ser suministradas en cualquier medio fijo. Las instrucciones pueden estar localizadas dentro de la carcasa o fuera de la carcasa, y pueden estar impresas en el interior o exterior de cualquier superficie que forma la carcasa, que las haga legibles las instrucciones. El kit puede estar en forma múltiple, conteniendo pluralidades de una o más diferentes moléculas de sensor que pueden unirse a correspondientes diferentes moléculas objetivo.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos son descritos para suministrar a aquellos de destreza ordinaria en la técnica, una descripción completa de cómo hacer y usar la presente invención, y no se pretende limitar el alcance de lo que es considerado como la invención. Se han hecho esfuerzos para asegurar la exactitud respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero debería tenerse en cuenta algún error experimental y desviación. A menos que se indique de otro modo, las partes son partes en peso, la temperatura es grados centígrados y la presión está en o cerca de la atmosférica, y todos los materiales están disponibles comercialmente.

En una realización, se sintetizaron polímeros catiónicos conjugados solubles en agua conformacionalmente flexibles, a través de la reacción de acoplamiento de Suzuki y un paso de cuaternización pospolimerización. Los ejemplos de síntesis son dados respecto a los polímeros específicos bajo la Fórmula 1. En el Esquema 1 se muestran las rutas de síntesis.

Esquema L Procedimiento de síntesis para polímeros catiónicos solubles en agua

Una vista general del método es como sigue. Se obtuvo 1,3-bis(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan)fenileno (1) con rendimiento de 46 % mediante tratamiento de 1,3-diyodobenceno con bis(pinacolato)diborano en presencia de PdCh(dppf) y acetato de potasio en DMSO. Se obtuvo 2,7-dibromo-9,9-bis(6'-bromohexil)fluoreno (2) mediante el tratamiento de 2,7-dibromofluoreno con KOH al 50%, seguido por adición de un exceso de 1,6-dibromohexano en rendimiento de 85 %. El acoplamiento de un equivalente del monómero de dibromuro con un equivalente neto de ácido diborónico o éster diborónico, bajo condiciones de acoplamiento de Suzuki usando PdCh(dppf) en reflujo con THF/H2O durante 24 h, seguido por purificación, dio los polímeros deseados en rendimiento de 39 % a 88 %. Se lavaron meticulosamente los productos con metanol y acetona, y luego se secaron al vacío durante 24 h. La formación de los polímeros solubles en agua fue lograda mediante agitación del polímero en trimetilamina condensada en una mezcla solvente de THF/H2O durante 24 h.

Ejemplo 1. 1,3-bis(4,4,5,5,-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan)fenileno (1).

Se retiró el gas durante 15 minutos un matraz cargado con 1,3-diyodobenceno (1.0 g, 3 mmol), bis(pinacolato)diborano (2.3 g, 9 mmol), acetato de potasio (2.1 g, 21 mmol), PdCh(dppf) (150 mg, 0.18 mmol), y 15 ml de DMSO anhidro. Se agitó la mezcla a 80 °C durante 12 h, se enfrió a temperatura ambiente y luego se colocó dentro de 100 ml de agua con hielo. Se realizó extracción a la mezcla con CHCh, y sobre MgSO4 anhidro se secaron las capas orgánicas combinadas. Después de evaporar el solvente, se purificó el residuo mediante cromatografía usando gel de sílice (hexano:CHCl3 = 1:1) y luego se recristalizó desde etanol para ofrecer 1 (460 mg, 46 %) como un sólido blanco. 1H RMN (200 MHz, CDCh): 8 8.28 (s, 1H), 7.91-7.89 (d, 2H), 7.38 (t, 1H), 1.35 (s, 24H). 13C RMN (50 MHz, CDCh): 8 141.4, 137.8, 127.3, 83.9, 25.1.

Ejemplo 2. 2,7-dibromo-9,9-bis(6'-bromohexil)fluoreno (2).

A una mezcla de bromuro de tetrabutilamonio (300 mg, 9.3 mmol), hidróxido de potasio acuoso (100 ml, 50 %) y 1,6-dibromohexano (22.6 g, 92.6 mmol) se añadió 2,7-dibromofluoreno a 75 °C. Después de 15 minutos, se enfrió la mezcla hasta temperatura ambiente, y se realizó extracción con CH2Cl2. Se lavó la capa orgánica con agua, HCl acuoso, agua y salmuera, se secó sobre MgSO4, y luego se concentró. Se separó por destilación el 1,6-dibromohexano que no reaccionó. Se purificó el residuo mediante cromatografía en columna de gel de sílice (hexano:CHCh = 9:1) y se recristalizó desde etanol para dar 2 (4.8 g, 80 %) como un sólido blanco. 1H RMN (200 MHz, CDCh): 87.2-7.4 (m, 6H), 3.12 (t, 4H), 1.75 (t, 4H), 1.5 (m, 4H), 1.0 (m, 8H), 0.4 (m, 4H). 13C RMN (50 MHz, CDCh): 8 152.3, 139.2, 130.5, 126.2, 121.7, 121.4, 55.7, 40.2, 34.1, 32.8, 29.1, 27.9, 23.6.

Ejemplo 3. Poli(9,9-bis(6'-bromohexil)fluoreno-co-alt-1,3 -fenileno) (M100P0).

Se colocaron en un matraz redondo de 25 ml 2,7-dibromo-9,9-bis(6'-bromohexil)fluoreno (325 mg, 0.5 mmol), 1,3-bis(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan)fenileno (166 mg, 0.5 mmol), Pd(PPh3)4 (8 mg) y carbonato de potasio (830 mg, 6 mmol). Al matraz se añadió una mezcla de agua (3 ml) y tolueno (5 ml). Después de eliminar el gas, se realizó reflujo a la mezcla a 85 °C durante 20 h, y luego se precipitó dentro de metanol. Se filtró el polímero y se lavó con metanol y acetona, y luego se acercó al vacío durante 24 h para ofrecer M100P0 (251 mg, 88 %) como un sólido amarillo pálido. 1H RMN (200 MHz, CDCla): 8 7.9-7.6 (m, 10H), 3.3-3.2 (t, 4H), 2.1 (m, 4H), 1.7-1.6 (m, 4H), 1.3-1.2 (m, 8H), 0.8 (m, 4H). 13C RMN (50 MHz, CDCh): 8 152.1, 142.9, 140.9, 130.1, 129.5, 128.0, 126.8, 122.5, 120.9, 55.9, 40.9, 34.5, 33.3, 29.7, 28.5, 24.3. GPC (THF, estándar de poliestireno), Mw: 40,250 g/mol; Mn: 14,980 g/mol; PDI: 2.8. UV-vis (CHCh): Amax = 337 nm; PL (cHch): Amax = 363 nm.

Ejemplo 4. Poli(9,9-bis(6'-bromohexil)fluoreno-co-alt-1,4-fenileno) (M0P100).

Se colocaron en un matraz redondo de 25 ml 2,7-dibromo-9,9-bis(6'-bromohexil)fluoreno (325 mg, 0.5 mmol), ácido 1.4- fenilenbisborónico (82.9 mg, 0.5 mmol), Pd(dppf)Ch (7 mg) y carbonato de potasio (830mg, 6 mmol). Se añadió al matraz una mezcla de agua (3 ml) y THF (6 ml) y se eliminó el gas. Se realizó reflujo a la mezcla a 85 °C durante 24 h, y luego se precipitó dentro de metanol. Se filtró el polímero y se lavó con metanol y acetona, y luego se secó al vacío durante 24 h para ofrecer M0P100 (220 mg, 78 %) como un sólido blancuzco. 1H Rm N (200 Mh z , CDCh): 87.8 (m, 5H), 7.7-7.6 (m, 4H), 7.5 (m, 1H), 3.3 (t, 4H), 2.1 (m, 4H), 1.7 (m, 4H), 1.3-1.2 (m, 8H), 0.8 (m, 4H). 13C RMN (50 MHz, CDCh): 8 151.9, 140.9, 140.7, 140.2, 128.1, 126.6, 121.8, 120.8, 55.7, 40.9, 34.5, 33.2, 29.6, 28.3, 24.2. GPC (THF, estándar de poliestireno), Mw: 25,850 g/mol; Mn: 12,840 g/mol; PDI: 2.0. UV-vis (CHCh): Amax = 372 nm; PL (CHCl3): Amax = 408 nm.

Ejemplo 5. Copolímero M25P75 aleatorio.

Se colocaron en un matraz redondo de 25 ml 2,7-dibromo-9,9-bis(6'-bromohexil)fluoreno (325 mg, 0.5 mmol), ácido 1.4- fenilenbisborónico (62.2 mg, 0.375 mmol), ácido 1,3-fenilenbisborónico (20.7 mg, 0.125 mmol), Pd(dppf)Ch (7 mg) y carbonato de potasio (830mg, 6 mmol). Se añadió al matraz una mezcla de agua (3 ml) y THF (6 ml) y se eliminó el gas. Se realizó reflujo a la mezcla a 85 °C durante 24 h, y luego se precipitó dentro de metanol. Se filtró el polímero y se lavó con metanol y acetona, y luego se secó al vacío durante 24 h para ofrecer M25P75 (248 mg, 88 %) como un sólido blancuzco. 1H RMN (200 MHz, CDCh): 87.9-7.6 (m, 10H), 3.3-3.2 (t, 4H), 2.1 (m, 4H), 1.7-1.6 (m, 4H), 1.3-1.2 (m, 8H), 0.8 (m, 4H). GPC (THF, estándar de poliestireno), Mw: 29,000 g/mol; Mn: 14,720 g/mol; PDI: 1.9. UV-vis (CHCl3): Amax = 365 nm; PL (CHCl3): Amax = 407 nm.

Ejemplo 6. Copolímero M50P50 aleatorio.

Se colocaron en un matraz redondo de 25 ml 2,7-dibromo-9,9-bis(6'-bromohexil)fluoreno (325 mg, 0.5 mmol), ácido 1.4- fenilenbisborónico (41.5 mg, 0.25 mmol), ácido 1,3-fenilenbisborónico (41.5 mg, 0.25 mmol), Pd(dppf)Ch (7 mg) y carbonato de potasio (830mg, 6 mmol). Se añadió al matraz una mezcla de agua (3 ml) y THF (6 ml) y se eliminó el gas. Se realizó reflujo a la mezcla a 85 °C durante 24 h, y luego se precipitó dentro de metanol. Se filtró el polímero y se lavó con metanol y acetona, y luego se secó al vacío durante 24 h para ofrecer M50P50 (220 mg, 78 %) como un sólido blancuzco. ¹H RMN (200 MHz, CDCI³): 51.9-1.6 (m, 10H), 3.3-3.2 (t, 4H), 2.1 (m, 4H), 1.7-1.6 (m, 4H), 1.3-1.2 (m, 8H), 0.8 (m, 4H). GPC (THF, estándar de poliestireno), M^w : 17,340 g/mol; Mⁿ: 10,080 g/mol; PDI: 1.7. UV-vis (CHCI³): A^max = 351 nm; PL (CHCh): A^max = 405 nm.

Ejemplo 1. Copolímero M15P25 aleatorio.

Se colocaron en un matraz redondo de 25 ml 2,1-dibromo-9,9-bis(6'-bromohexil)fluoreno (325 mg, 0.5 mmol), acido 1,4-fenilenbisborónico (20.1 mg, 0.125 mmol), ácido 1,3-fenilenbisborónico (62.2 mg, 0.315 mmol), Pd(dppf)Ch (1 mg) y carbonato de potasio (830mg, 6 mmol). Se añadió al matraz una mezcla de agua (3 ml) y THF (6 ml). Después de eliminar el gas, se realizó reflujo a la mezcla a 85 °C durante 24 h, y luego se precipitó dentro de metanol. Se filtró el polímero y se lavó con metanol y acetona, y luego se secó al vacío durante 24 h para ofrecer M¹⁵P²⁵ (130 mg, 46 %) como un sólido blancuzco. ¹H RMN (200 MHz, CDC^h ): 51.9-1.6 (m, 10H), 3.3-3.2 (t, 4H), 2.1 (m, 4H), 1.1-1.6 (m, 4H), 1.3- 1.2 (m, 8H), 0.8 (m, 4H). GPC (THF, estándar de poliestireno), M^w : 13,000 g/mol; Mⁿ: 8,100 g/mol; PDI: 1.4. UV-vis (CHCl³): A^max = 342 nm; PL (CHCl³): A^max = 400 nm.

Ejemplo 8. Copolímero M⁹⁰P¹⁰ aleatorio.

Se colocaron en un matraz redondo de 25 ml 2,1-dibromo-9,9-bis(6'-bromohexil)fluoreno (325 mg, 0.5 mmol), ácido 1.4- fenilenbisborónico (8 mg, 0.05 mmol), ácido 1,3-fenilenbisborónico (15 mg, 0.45 mmol), Pd(dppf)Ch (1 mg) y carbonato de potasio (830mg, 6 mmol). Se añadió al matraz una mezcla de agua (3 ml) y THF (6 ml) y se eliminó el gas. Se realizó reflujo a la mezcla a 85 °C durante 24 h, y luego se precipitó dentro de metanol. Se filtró el polímero y se lavó con metanol y acetona y luego se secó al vacío durante 24 h para ofrecer M⁹⁰P¹⁰ (110 mg, 39 %) como un sólido blancuzco. ¹H RMN (200 MHz, CDCl^a): 51.9-1.6 (m, 10H), 3.3-3.2 (t, 4H), 2.1 (m, 4H), 1.1-1.6 (m, 4H), 1.3-1.2 (m, 8H), 0.8 (m, 4H). GPC (THF, estándar de poliestireno), M^w : 8,400 g/mol; Mⁿ: 5,800 g/mol; PDI: 1.4. UV-vis (CHC^h ): A^max = 338 nm; PL (CHCl³): A^max = 400 nm.

Ejemplo 9. Dibromuro de poli(9,9-bis(6'-N,N,N,-trimetilamonio)hexil)fluoreno-co-alt-1,3-fenileno) (M¹⁰⁰P⁰⁺).

Se añadió gota a gota trimetilamina condensada (2 ml) a una solución del polímero neutro M¹⁰⁰P⁰ (60 mg) en THF (10 ml) a -18 °C. Se permitió que la mezcla calentara hasta temperatura ambiente. Se disolvió nuevamente el precipitado mediante la adición de agua (10 ml). Después se enfrió la mezcla hasta -18 °C, se añadió trimetilamina (2 ml) adicional y se agitó la mezcla durante 24 h a temperatura ambiente. Después de retirar la mayoría del solvente, se añadió acetona al precipitado M¹⁰⁰P⁰⁺ (63 mg, 18 %) como un polvo amarillo pálido. ¹H RMN (500 MHz, CD³OD): 58.1-1.1 (m, 10H), 3.3-3.2 (t, 4H), 3.1 (s, 18H), 2.3 (br, 4H), 1.6 (br, 4H), 1.3 (br, 8H), 0.8 (br, 4H). ¹³C RMN (125 MHz, CD³OD): 5 151.9, 142.4, 140.9, 140.6, 129.11, 126.5, 126.1, 125.6, 121.6, 120.5, 66.1, 55.1, 52.5, 40.1, 29.2, 25.8, 23.8, 22.6. UV-vis (H²O): A^max = 334 nm; PL (H²O): A^max = 369 nm. £ = 3.69*10⁴ M^{' 1}cirr¹ por unidad de monómero.

Ejemplo 10. Dibromuro de poli(9,9-bis(6'-N,N,N,-trimetilamonio)hexil)fluoreno-co-alt-1,4 -fenileno) (M⁰P¹⁰⁰⁺).

Se añadió gota a gota trimetilamina condensada (2 ml) a una solución del polímero neutro M⁰P¹⁰⁰ (60 mg) en THF (10 ml) a -18 °C. Se permitió que la mezcla calentara hasta temperatura ambiente. Se disolvió nuevamente el precipitado mediante la adición de agua (10 ml). Después se enfrió la mezcla hasta -18 °C, se añadió trimetilamina (2 ml) adicional y se agitó la mezcla durante 24 h a temperatura ambiente. Después de retirar la mayoría del solvente, se añadió acetona al precipitado M⁰P¹⁰⁰⁺ (12 mg, 89 %) como un polvo blancuzco. ¹H RMN (500 MHz, CD³OD): 5 8.0-1.8 (m, 10H), 3.3-3.2 (t, 4H), 3.1 (s, 18H), 2.3 (br, 4H), 1.6 (br, 4H), 1.3 (br, 8H), 0.8 (br, 4H). ¹³C RMN (125 MHz, CD³OD): 5 151.8, 140.9, 140.4, 140.0, 121.6, 126.1, 121.2, 120.5, 66.1, 55.1, 52.5, 40.2, 29.2, 25.8, 23.1, 22.5. UV-vis (H²O): A^max = 382 nm; PL (H²O): A^max = 411 nm. £ = 4.56*10⁴ M^{' 1}cirr¹ por unidad de monómero.

Ejemplo 11. Polímero catiónico soluble en agua (M²⁵P¹⁵⁺).

Se añadió gota a gota trimetilamina condensada (2 ml) a una solución del polímero neutro M²⁵P¹⁵ (60 mg) en THF (10 ml) a -18 °C. Se permitió que la mezcla calentara hasta temperatura ambiente. Se disolvió nuevamente el precipitado mediante la adición de agua (10 ml). Después se enfrió la mezcla hasta -18 °C, se añadió trimetilamina (2 ml) adicional y se agitó la mezcla durante 24 h a temperatura ambiente. Después de retirar la mayoría del solvente, se añadió acetona al precipitado M²⁵P¹⁵⁺ (12 mg, 89 %) como un polvo blancuzco. ¹H RMN (500 MHz, CD³OD): 5 8.0-1.5 (m, 10H), 3.3 (br, 4H), 3.1 (s, 18H), 2.3 (br, 4H), 1.6 (br, 4H), 1.2 (br, 8H), 0.9 (br, 4H). UV-vis (H²O): A^max = 316 nm; PL (H²O): A^max = 411 nm. £ = 4.22*10⁴ M^{' 1}cirr¹ por unidad de monómero.

Ejemplo 12. Polímero catiónico soluble en agua (M⁵⁰P⁵⁰⁺).

Se añadió gota a gota trimetilamina condensada (2 ml) a una solución del polímero neutro M⁵⁰P⁵⁰ (60 mg) en THF (10 ml) a -18 °C. Se permitió que la mezcla calentara hasta temperatura ambiente. Se disolvió nuevamente el precipitado mediante la adición de agua (10 ml). Después se enfrió la mezcla hasta -18 °C, se añadió trimetilamina (2 ml) adicional y se agitó la mezcla durante 24 h a temperatura ambiente. Después de retirar la mayoría del solvente, se añadió acetona al precipitado M⁵⁰P⁵⁰⁺ (68 mg, 84 %) como un polvo blancuzco. ¹H RMN (500 MHz, CD³OD): 5 8.1-1.1 (m, 10H), 3.3 (br, 4H), 3.1 (s, 18H), 2.3 (br, 4H), 1.6 (br, 4H), 1.3 (br, 8H), 0.8 (br, 4H). UV-vis (H²O): A^max = 331 nm; PL (H²O): A^max = 403 nm. £ = 3.15*10⁴ M^{' 1}cirr¹ por unidad de monómero.

Ejemplo 13. Polímero catiónico soluble en agua (M⁷⁵P²⁵⁺).

Se añadió gota a gota trimetilamina condensada (2 ml) a una solución del polímero neutro M⁷⁵P²⁵ (60 mg) en THF (10 ml) a -78 °C. Se permitió que la mezcla calentara hasta temperatura ambiente. Se disolvió nuevamente el precipitado mediante la adición de agua (10 ml). Después de enfriarla hasta -78 °C, se añadió trimetilamina (2 ml) adicional y se agitó la mezcla durante 24 h a temperatura ambiente. Después de retirar la mayoría del solvente, se añadió acetona al precipitado M⁷⁵P²⁵⁺ (70 mg, 87 %) como un polvo blancuzco. ¹H RMN (500 Mh z , CD³OD): 88.0-7.7 (m, 10H), 3.3 (br, 4H), 3.1 (s, 18H), 2.3 (br, 4H), 1.6 (br, 4H), 1.3 (br, 8H), 0.8 (br, 4H). UV-vis (H²O): A^max = 347 nm; PL (H²O): A^max = 410 nm. £ = 2.98*10⁴ M^{' 1}cirr¹ por unidad de monómero.

Ejemplo 14. Polímero catiónico soluble en agua (M⁹⁰P¹⁰⁺).

Se añadió gota a gota trimetilamina condensada (2 ml) a una solución del polímero neutro M⁹⁰P¹⁰ (60 mg) en THF (10 ml) a -78 °C. Se permitió que la mezcla calentara hasta temperatura ambiente. Se disolvió nuevamente el precipitado mediante la adición de agua (10 ml). Después se enfrió la mezcla hasta -78 °C, se añadió trimetilamina (2 ml) adicional y se agitó la mezcla durante 24 h a temperatura ambiente. Después de retirar la mayoría del solvente, se añadió acetona al precipitado M⁹⁰P¹⁰⁺ (61 mg, 75 %) como un polvo blancuzco. ¹H RMN (500 MHz, CD³OD): 8 8.0-7.7 (m, 10H), 3.3 (br, 4H), 3.1 (s, 18H), 2.3 (br, 4H), 1.6 (br, 4H), 1.3 (br, 8H), 0.8 (br, 4H). UV-vis (H²O): A^max = 362 nm; PL (H²O): A^max = 421 nm. £ = 3.24*10⁴ M^{' 1}cirr¹ por unidad de monómero.

Ejemplo 15. Los espectros de absorción de los polímeros catiónicos (M¹⁰⁰P⁰⁺, M⁹⁰P¹⁰⁺, M⁷⁵P²⁵⁺, M⁵⁰P⁵⁰⁺, M²⁵P⁷⁵⁺, M⁰P¹⁰⁰⁺). Hay un claro desplazamiento al azul (desde 380 nm para M⁰P¹⁰⁰⁺ hasta 337 nm para M¹⁰⁰P⁰⁺) con incremento en la fracción de enlaces meta en los copolímeros aleatorios. Tal desplazamiento espectral hacia el azul es esperado sobre la base de la conjugación menos efectiva a través del enlace meta a lo largo de la cadena principal de polímero. En la Figura 1 se muestran los espectros representativos de absorción.

Ejemplo 16. Los espectros de emisión de los polímeros catiónicos solubles en agua (M¹⁰⁰P⁰⁺, M⁹⁰P¹⁰⁺, M⁷⁵P²⁵⁺, M⁵⁰P⁵⁰⁺, M²⁵P⁷⁵⁺, M⁰P¹⁰⁰⁺). Hay un desplazamiento al rojo en la emisión de los polímeros, con incremento de la fracción de enlaces para. Sin embargo, el máximo de la emisión satura más rápidamente, comparado con los espectros de absorción. Ocurre transferencia eficiente de energía intramolecular, dado que la introducción de 10 % de enlaces para desplaza la emisión del polímero desde 369 nm (todos los enlaces meta) hasta 400 nm. Debido a la transferencia eficiente de energía intramolecular, los polímeros de 50 % o más de enlaces para tienen espectros de emisión muy similares. En la Figura 2 se muestran espectros representativos de emisión.

Ejemplo 17. Los espectros de emisión de polímeros catiónicos solubles en agua M⁵⁰P⁵⁰⁺ y M⁰P¹⁰⁰⁺ y el de ds-ADN-C* (C* = fluoresceina) (mostrado en la Figura 3). El ds-ADN-C* fue preparado mediante alineación de cebadores de la sonda de ss-ADN-C* (secuencia 5'-C*-ATC Tt G ACT ATG TGG GTG CT, SEQ ID NO: 1) a 2 °C por debajo de su punto de fusión (59.5 °C) en presencia de una cantidad equimolar de su par 20 de bases complementario (5'-AGC ACC CAC ATA Gt C AAG AT, SEQ ID NO: 2) durante 20 min. Los datos muestran que, a pesar de sus diferentes estructuras moleculares, existe superposición casi idéntica entre la emisión de los polímeros y la absorción de ds-ADN-C*. Igualmente, los requerimientos ópticos para la transferencia de energía de Forster son satisfechos por ambos materiales.

Ejemplo 18. Comparación de transferencia de energía entre los polímeros catiónicos solubles en agua (M¹⁰⁰P⁰⁺, M⁹⁰P¹⁰⁺, M⁷⁵P²⁵⁺, M⁵⁰P⁵⁰⁺, M²⁵P⁷⁵⁺, M⁰P¹⁰⁰⁺) y ds-ADN-C*. Se preparó el ds-ADN-C*mediante alineación de cebadores de la sonda de ss-ADN-C*(secuencia 5'-C*-At C TTG ACT a Tg TGG GTG CT, SEQ ID NO: 1) a 2 °C por debajo de su punto de fusión (59.5 °C) en presencia de una cantidad equimolar de su par 20 de bases complementario (5'-AGC ACC CAC ATA Gt C AAG AT, s Eq ID NO: 2) durante 20 minutos. Las mediciones son llevadas a cabo en una solución con amortiguador (amortiguador de fosfato 50 mmol pH = 8.0) y a una concentración fija de ds-ADN-C* (2.0 E-8 M). La Figura 4 muestra una comparación directa de la emisión de C*por excitación de los polímeros en presencia de ds-ADN-C*. La longitud de onda de excitación es la máxima absorción de cada polímero. A una concentración de polímero de 5.0 E-7 M en unidades repetidas, la emisión desde ds-ADN-C* (por excitación de los polímeros) es mayor para los copolímeros aleatorios, comparada con el polímero rígido de bastón todo para. En la Figura 5 se muestra una ilustración esquemática de la diferencia en formación de complejos de polímero/ds-ADN-C*.

Ejemplo 19. La Figura 6 muestra una comparación directa de la emisión de C* contra la concentración polímero en amortiguador, por excitación de M⁵⁰P⁵⁰⁺ o M⁰P¹⁰⁰⁺. Las mediciones son llevadas a cabo en amortiguador (amortiguador de fosfato 50 mmol pH = 8.0), a una concentración fija de ds-ADN-C* ([ds-ADN-C*] = 2.0 E-8 M), con variación de la concentración de polímero desde 1.0 E-7 M hasta 1.0 E-6 M. La longitud de onda de excitación para ambos polímeros fue elegida en 363 nm, donde la densidad óptica para ambos polímeros es casi idéntica. Teniendo en cuenta que se genera un número igual de excitaciones de polímero, la emisión de C*es dos veces más intensa para M⁵⁰P⁵⁰⁺/ds-ADN-C*que para M⁰P¹⁰⁰⁺/ds-ADN-C*a cada concentración de polímero.

Ejemplo 20. En la Figura 7 se muestra un esquema para el uso de un polímero catiónico conjugado soluble en agua con una sonda óptica específica de ss-ADN-C*, para detectar una secuencia complementaria de ss-ADN.² En un ensayo homogéneo, se excita el polímero conjugado y se compara la emisión del pigmento (C*) unido a la sonda de ss-ADN (mostrada en un rojo) con la del polímero conjugado (mostrada en negro). Las propiedades ópticas de los componentes son elegidas de modo que sólo el polielectrolito conjugado absorbe a la frecuencia de excitación, y la absorción de C* se superpone a la emisión del polielectrolito conjugado. La hibridación de la cuerda de sonda de ss-ADN-C* a su cuerda complementaria (mostrada en azul) da como resultado una relación (A) FRET más eficiente que cuando en la solución (B) está presente una cuerda no complementaria (mostrada en verde).

Ejemplo 21. Comparación de la emisión de C* por excitación de M⁵⁰P⁵⁰⁺ o M^qP¹⁰⁰⁺ en presencia de (i) ds-ADN-C* y (ii) ss-ADN-C*/ ss-ADN no complementario (Figura 8). Se realizó alineación de cebadores de la sonda de ADN-C* con una secuencia específica 5'-C*-ATC Tt G ACT a Tg TGG GTG CT) 2 °C por debajo su punto de fusión (59.5 °C) durante 20 minutos en presencia de una cantidad equimolar de su par 20 de bases complementario (5'-AGC ACC CAC ATA GTC AAG a T) y de manera idéntica con una base 20 no complementaria de ss-ADN (5'-g Ac TCA ATG GCG TTA GAC TG, SEQ ID NO: 3). Se llevaron a cabo mediciones en amortiguador (amortiguador de fosfato 50 mmol pH = 8.0) con [ds-ADN-C*] = [ss-ADN-C*] = 2.0E-8 M.

A una concentración de 4.2E-7 M de unidad repetida en el polímero, se observan dos diferencias importantes. Primero, la emisión de ds-ADN-C* es más intensa para el M⁵⁰P⁵⁰⁺ que M⁰P¹⁰⁰⁺; segundo, la relación de intensidad de emisión de C* para ds-ADN-C*/(ss-ADN-C*+ss-ADN) es mayor para M⁵⁰P⁵⁰⁺. Por ello, el uso de M50P50+ da como resultado señal más intensa y menor emisión de señal de fondo que M⁰P¹⁰⁰⁺, lo cual suministra un ensayo de ADN que es más discriminativo.

Ejemplo 22. Un ejemplo de uso de M⁵⁰P⁵⁰⁺ como un donador de transferencia de energía para un ensayo de ADN específico de cuerda, que toma ventaja de cuerdas de sonda de ácido péptido nucleico (PNA) etiquetado con cromóforo (C*). En los PNAs, los enlaces de fosfato cargados negativamente en ADN son reemplazados por enlaces amida peptomiméticos. De manera consecuente, las interacciones electrostáticas no específicas entre polímeros catiónicos solubles en agua y la sonda de PNA-C* serán reducidas de manera importante, comparadas con la misma situación donde se usa ss-ADN-C* como una sonda.¹ De modo similar al método descrito en el Ejemplo 17 para alineación de cebadores con ADN, la sonda de PNA-C* ([PNA-C*] = 2.0E-8 M, secuencia 5'-C*-CAG Tc C AGT GAT ACG-3', SEQ ID NO: 4) tuvo alineación de cebadores 2 °C debajo de su punto de fusión (72 °C) en presencia de una cantidad equimolar de su par 15 de bases complementario de ss-ADN (5'-CGT ATC Ac T GGA Ct G-3', SEQ ID NO: 5) y de manera idéntica con una base 15 no complementaria de ss-ADN (5'-ACT GAC GAT AGA CTG-3', SEQ ID NO: 6) . Las mediciones son llevadas a cabo en amortiguador (amortiguador de fosfato 50 mmol pH = 6.0) y a una concentración fija de PNA-C* de 2.0E-8M. La Figura 9 muestra datos representativos para este tipo de ensayo usando el copolímero de M⁵⁰P⁵⁰⁺.

Ejemplo 23. En la Tabla 3 se resumen los espectros UV-vis y de fluorescencia para un intervalo de composiciones. Hay un progresivo desplazamiento al azul en absorción con incremento en el contenido de meta, consistente con la más efectiva deslocalización electrónica a través de los enlaces para. Los valores £ son los más bajos para polímeros con composiciones intermedias porque la distribución aleatoria de segmentos conjugados da como resultado bandas de absorción más amplias.

Tabla 3. Propiedades ópticas de los polímeros.

La Figura 2 muestra el espectro de fluorescencia en agua como una función de la composición de polímero. El incremento en el contenido de para, pasada la relación 50:50 no altera los máximos de emisión. La transferencia rápida de energía, sea por mecanismos dentro de la cadena o entre las cadenas, localiza excitaciones sobre los segmentos más largos de conjugación dentro del periodo de vida del estado excitado.18 La Tabla 3 muestra que hay poca variación en el rendimiento cuántico de fluorescencia (O □ en la Tabla 3).

La Ecuación 1 describe cómo cambia la tasa de FRET como una función de la distancia (r) donador-aceptador, el factor (k) de orientación, y la integral (J) de superposición.

k ^ c c — y • k 2 • JQ-) (1)

r

aO

./(?0 °^rD(X)£A(^ )^ 4^

o

Dado que M⁵⁰P⁵⁰⁺ y M^oP^{io o} tienen frecuencias similares de emisión, el valor de J usando un pigmento aceptador común, debería ser casi idéntico entre los dos polímeros. Los periodos de vida de fluorescencia de los dos polímeros son similares (400 ± 50 ps). Por ello, de las diferencias en las eficiencias de FRET para un cromóforo aceptador común puede extraerse información relevante para el promedio de distancia de polímero/cromóforo aceptador y la orientación de los momentos de transición.

Para examinar el efecto de la estructura de polímero sobre las interacciones con un sustrato biológico, se examinó el FRET de M⁵⁰P⁵⁰⁺ o M⁰P¹⁰⁰⁺ para un ADN de cuerda doble, que contiene fluoresceina (C*), en la posición 5' (dsADN-C*). La Figura 6 muestra la intensidad de emisión de C* como una función de la concentración de polímero, por excitación de M⁵⁰P⁵⁰⁺ o M⁰P¹⁰⁰⁺ a 363 nm. Se eligió esta longitud de onda porque no hay absorción C* significativa y los dos polímeros tienen valores similares de £. Así, la excitación conduce a un número similar de estados excitados a base de polímero. También se confirmó que el valor de O □ □ para C* es el mismo en los dos conjuntos de soluciones. Los datos en la Figura 6 muestran un FRET de M⁵⁰P⁵⁰⁺ más eficiente, consistente con una distancia más corta a dsADN-C*, y/o con orientación más variable de los momentos de transición (k mejorado).

Un segundo conjunto de experimentos involucró FRET desde los CCPs hasta ds-ADN con bromuro de etidio intercalado (EB).1920 La emisión de EB ocurre sólo desde FRET hasta los fragmentos intercalados, por excitación de los CCPs. La Figura 10 muestra que no se probó la transferencia más eficiente en la serie M⁰P¹⁰⁰⁺ ^ M²⁵P⁷⁵⁺ ^ M⁵⁰P⁵⁰⁺ ^ M⁷⁵P²⁵⁺ (M¹⁰⁰P⁰⁺ porque su espectro de emisión no se superpone de manera significativa a los espectros de absorción de EB (A^max,.abs = 530 nm)). Por ello, tiene lugar una clara mejora en FRET con el incremento en el contenido de meta en el polímero.

Referencias

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1 E. V. Pilipenko et al., Genes Dev. 14, 2028 (2000).

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende un polímero conjugado conformacionalmente flexible, enlazado a o asociado con por lo menos un miembro de un par enlazante que comprende una molécula de sensor y una molécula objetivo o el complejo que forman, en el que el polímero comprende por lo menos un agente angular de enlace que tiene enlace con sus dos unidades poliméricas adyacentes que forman un ángulo de menos de 155 ° respecto una a otra,

en el que el agente angular de enlace es una molécula aromática opcionalmente sustituida seleccionada de entre el grupo que consiste en 1,2-benceno, 1,3-benceno, 1,2-naftaleno, 1,3-naftaleno, 1,6-naftaleno, 1,7-naftaleno, 1,8-naftaleno, 1,2-antraceno, 1,3-antraceno, 1,6-antraceno, 1,7-antraceno, 1,8-antraceno, 1,9-antraceno, 2,3-bifenilo, 2,4-bifenilo, 2,6-bifenilo, 3,3'-bifenilo, 3,4-bifenilo, 3,5-bifenilo, 2,2'-bifenilo, 2,3'-bifenilo, 2,4'-bifenilo, y 3,4'-bifenilo, teniendo por lo menos dos enlaces separados con otros componentes de polímero que forma ángulos respecto uno a otro;

en el que los dos enlaces con otros componentes poliméricos son coplanares, y el ángulo es determinado por líneas que se extienden representando aquellos enlaces al punto en el cual se intersecan, y luego midiendo el ángulo entre ellas; o

en el que los dos enlaces con otros componentes poliméricos no son coplanares, y el ángulo es determinado como sigue: se traza una primera línea entre los dos átomos de anillo al cual se unen los enlaces; se trazan dos líneas de enlace, una que se extiende desde cada átomo de anillo en la dirección de su respectivo enlace hasta el otro componente polimérico al cual está unido; se fija el ángulo entre cada línea de enlace y la primera línea; y luego los dos átomos de anillo son unidos en un punto individual encogiendo la primera línea hasta una longitud cero; el ángulo así resultante entre las dos líneas de enlace es el ángulo que el agente angular de enlace imparte al polímero conjugado; y

en el que el polímero tiene la estructura:

CP¹, CP², CP³ y CP⁴ son estructuras oligoméricas o segmentos de polímero conjugado opcionalmente sustituidos, y pueden ser los mismos o diferentes uno de otro;

LU¹ y LU² son cada uno un agente angular de enlace que forma un ángulo de enlace de menos de 155° con dos unidades poliméricas adyacentes, y son cada uno un grupo arilo mono- o policíclico opcionalmente sustituido que tiene 5 a 20 átomos, seleccionado de entre el grupo que consiste en 1,2-benceno, 1,3-benceno, 1,2-naftaleno, 1,3-naftaleno, 1,6-naftaleno, 1,7-naftaleno, 1,8-naftaleno, 1,2-antraceno, 1,3-antraceno, 1,6-antraceno, 1,7-antraceno, 1,8-antraceno, 1,9-antraceno, 2,3-bifenilo, 2,4-bifenilo, 2,6-bifenilo, 3,3'-bifenilo, 3,4-bifenilo, 3,5-bifenilo, 2,2'-bifenilo, 2,3-bifenilo, 2,4'-bifenilo, y 3,4'-bifenil;

m y n son independientemente 0 a 10,000, en los que m+n>1;

b y e son independientemente 0 a 250, en los que b+e>1;

а, c, d y f son independientemente 0 a 250; y

G y G1 son unidades de protección y pueden ser los mismos o diferentes, y son seleccionados de entre unidades activadas que permiten reacción química adicional para extender la cadena de polímero, y unidades de terminación no activadas.

2. La composición de la reivindicación 1, en la que el por lo menos un miembro del par enlazante es una molécula de sensor.

3. La composición de la reivindicación 2, en la que la molécula de sensor es seleccionada de entre el grupo que consiste en un polinucleótido con un armazón aniónico, preferiblemente ADN o ARN, un polinucleótido con un armazón no cargado, preferiblemente ácido péptido nucleico (PNA), un anticuerpo, y un péptido o proteína, preferiblemente una proteína de enlace a polinucleótido (PBP).

4. La composición de la reivindicación 2, que comprende además un cromóforo de señalización al cual puede transferirse energía desde el polímero conjugado conformacionalmente flexible.

5. La composición de cualquier reivindicación precedente, en la que el polímero exhibe amplificación óptica.

б. La composición de la reivindicación 5, en la que la amplificación óptica aumenta con el polímero de mayor peso molecular.

7. La composición de la reivindicación 1, en la que al menos un miembro del par enlazante está ubicado sobre un sustrato.

8. La composición de la reivindicación 1, en la que el objetivo es obtenido a partir de una muestra biológica, opcionalmente de células, y en la que el objetivo es opcionalmente un péptido, proteína, polinucleótido o anticuerpo.

9. Uso de la composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8 para la detección de una biomolécula objetivo.

10. Uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que se usa una pluralidad de diferentes biomoléculas de sensor para la detección de una pluralidad de biomoléculas objetivo en un formato múltiple, en la que las diferentes moléculas de sensor están conjugadas con diferentes cromóforos de señalización.

11. Un bioensayo que comprende el uso de un polímero conjugado flexible soluble en agua que exhibe amplificación óptica para la detección de una biomolécula objetivo.