ES2858355T3 - Composiciones que comprenden aminoácidos para su uso en la prevención y el tratamiento de enfermedades hepáticas - Google Patents
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Abstract
Composición para su uso en la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad hepática en un mamífero, comprendiendo la composición un agente activo, conteniendo dicho agente activo los aminoácidos leucina, isoleucina, valina, treonina, lisina y los ácidos carboxílicos ácido cítrico, ácido succínico, ácido málico.
Description
DESCRIPCIÓN
Composiciones que comprenden aminoácidos para su uso en la prevención y el tratamiento de enfermedades hepáticas
Campo de la invención
La presente descripción se refiere en general a composiciones que comprenden aminoácidos. Más en particular, la descripción se refiere a composiciones que comprenden aminoácidos para su uso en la prevención y/o el tratamiento de enfermedades hepáticas.
Antecedentes de la invención
Las enfermedades del hígado se encuentran entre las enfermedades que ocurren con mayor frecuencia provocadas por diversas condiciones ambientales desfavorables, tales como por ejemplo, parásitos y virus, drogas, sustancias tóxicas, alcoholismo y humo. Con frecuencia son enfermedades crónicas con desarrollo de características clínicas que empeoran. Las enfermedades hepáticas crónicas están caracterizadas por la destrucción gradual del parénquima hepático a lo largo del tiempo, con respuestas inflamatorias y acumulación de grasa, con daño fibrótico y activación de transformaciones celulares que conducen al desarrollo de cáncer en numerosos casos. Por lo tanto, las enfermedades hepáticas pueden incluir esteatosis, fibrosis, cirrosis y carcinoma hepatocelular como alteraciones clínicas progresivas del hígado. La cirrosis es el resultado de una enfermedad hepática aguda y crónica y está caracterizada por la sustitución del tejido hepático por tejido cicatricial fibrótico y nódulos regenerativos que conducen a una pérdida progresiva de la función hepática. La fibrosis y la regeneración nodular dan como resultado la pérdida de la arquitectura lobular microscópica normal del hígado. La fibrosis representa el crecimiento de tejido cicatricial resultante, por ejemplo, de infección, inflamación, lesión e incluso cicatrización. A lo largo del tiempo, el tejido cicatricial fibrótico reemplaza lentamente el tejido hepático funcional normal, lo que da como resultado una disminución de la cantidad de flujo sanguíneo al hígado, lo que deja al hígado incapaz de procesar completamente los nutrientes, hormonas, medicamentos y venenos que se encuentran en el torrente sanguíneo. Las causas más comunes de la cirrosis incluyen alcoholismo, infecciones virales de hepatitis C, ingestión de toxinas y también existen muchas otras causas posibles. Como es mencionado a continuación, el trastorno epidemiológicamente más relevante que evoluciona a cirrosis y posiblemente cáncer es el aumento de grasa corporal y la acumulación de grasa hepática relacionada. Esta acumulación de grasa puede deberse a dos condiciones clínicas principales: el abuso de alcohol y la obesidad.
Un consumo excesivo y crónico de alcohol puede provocar enfermedad hepática alcohólica (EHA), un importante problema de salud mundial. Las características patológicas de la EHA se desarrollan durante períodos prolongados, que incluyen esteatosis hepática, esteatohepatitis, cirrosis hasta el cáncer.
A la patogénesis del etanol contribuyen múltiples factores. Los eventos tempranos, tales como el daño mitocondrial, la generación de especies reactivas de oxígeno (ERO) y la acumulación de grasa parecen ser resultados directos del metabolismo del etanol y son características compartidas entre la EHA y la enfermedad hepática no alcohólica o EHGNA (véase a continuación) (Mantena et al. 2008).
Los mecanismos de defensa celular contra los efectos perjudiciales del alcohol no se conocen bien. Se ha sugerido que la autofagia, que es una importante vía celular degradativa que digiere las proteínas y orgánulos celulares para obtener energía o eliminar las estructuras celulares dañadas, desempeña un papel en la EHA, si bien la comprensión de estos mecanismos aún es fragmentaria (Lin et al. 2015). La autofagia parece desempeñar funciones críticas tanto en los hepatocitos como en las células no parenquimatosas (es decir, macrófagos y células madre hepáticas), influyendo en la sensibilidad a la insulina, la acumulación de lípidos, la lesión hepatocelular y la respuesta inmune innata.
Estudios recientes en ratones y modelos celulares han demostrado que la ingestión aguda de etanol activa la autofagia en el hígado (Ding et al. 2010; Ni et al. 2013; Lin et al. 2013).
Por el contrario, la intoxicación crónica por etanol parece suprimir la autofagia hepática (Thomes et al. 2015; Cho et al. 2014). Ha sido demostrado que la inhibición de la autofagia empeora la esteatosis provocada por el etanol y la lesión hepática en ratones (Ding et al. 2010; Ni et al. 2013; Lin et al. 2013).
Por el contrario, la promoción farmacológica de la autofagia parece aliviar la esteatosis hepática provocada por el etanol y la lesión hepática (Lin et al. 2013). Como resultado, la autofagia se considera un mecanismo protector contra los efectos citotóxicos del etanol y se ha convertido en un objetivo para el desarrollo de agentes terapéuticos para la EHA.
Como fue mencionado con anterioridad, la segunda causa principal de trastorno hepático es la obesidad, ampliamente difundida en los países desarrollados y que está aumentando epidemiológicamente también en los países en desarrollo, y que provoca la denominada enfermedad del hígado graso no alcohólico o EHGNA. La progresión hacia la esteatohepatitis, la cirrosis y el hepatocarcinoma representa una aparición creciente en todo el mundo. Los mecanismos bioquímicos y moleculares implicados en esta condición son superponibles a los descritos
de manera típica en EHA.
Al ser un metabolismo de aminoácidos alterado un sello distintivo de las enfermedades hepáticas, vinculadas tanto al consumo de alcohol como al desarrollo de la obesidad, que está caracterizado de manera específica por niveles reducidos de aminoácidos de cadena ramificada (BCAA, por su sigla en inglés) circulantes (Charlton, 2006), existe un creciente interés en el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos basados en la suplementación con aminoácidos como terapia para las enfermedades hepáticas.
Sumario de la invención
La presente descripción tiene como objetivo proporcionar nuevas composiciones a base de aminoácidos eficaces en la prevención y el tratamiento de enfermedades hepáticas.
De acuerdo con la presente descripción, el objeto anterior es logrado gracias al objeto de manera específica remarcado en las siguientes reivindicaciones, que son entendidas como parte integrante de esta divulgación.
Una realización de la presente divulgación proporciona una composición para su uso en el tratamiento de una enfermedad hepática en un mamífero, la composición que comprende un agente activo, dicho agente activo contiene los aminoácidos leucina, isoleucina, valina, treonina, lisina y los ácidos carboxílicos ácido cítrico, ácido succínico, ácido málico.
En una o más realizaciones, el agente activo de la composición además contiene uno o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en histidina, fenilalanina, metionina, triptófano, cisteína y tirosina.
En una realización preferente, la enfermedad hepática se puede seleccionar en el grupo que consiste en enfermedad hepática alcohólica (EHA), enfermedad hepática no alcohólica (EHGNA), lipodistrofia, hepatitis, cirrosis, carcinoma hepatocelular (CHC).
Una realización adicional de la presente divulgación proporciona un procedimiento para el tratamiento de enfermedades hepáticas en mamíferos, el procedimiento comprende la selección de una composición que comprende un agente activo, dicho agente activo contiene los aminoácidos leucina, isoleucina, valina, treonina, lisina y los ácidos carboxílicos ácido cítrico, ácido succínico y ácido málico, la administración de la composición para tratar una enfermedad hepática en mamíferos.
Breve descripción de los dibujos
La invención será descrita a continuación, solo a modo de ejemplo, con referencia a las figuras adjuntas, en las que: - La Figura 1 muestra la expresión génica mostrada como niveles de ARNm en células HepG2 tratadas con diferentes composiciones basadas en aminoácidos y etanol (EtOH) durante 9 días (* valor de P < 0,05 y ** P < 0,01 frente a células CTRL).
- La Figura 2 muestra el nivel de proteína p62 en células HepG2 tratadas con diferentes composiciones a base de aminoácidos y EtOH durante 9 días (* valor de P < 0,05 y ** P < 0,01 frente a células CTRL; valor de # P < 0,05 frente a células tratadas con EtOH).
Descripción detallada de realizaciones preferentes
En la siguiente descripción, son presentados numerosos detalles específicos para proporcionar una comprensión completa de las realizaciones. Las realizaciones pueden ser practicadas sin uno o más de los detalles específicos, o con otros procedimientos, componentes, materiales, etc. En otros casos, las estructuras, materiales u operaciones muy conocidos no son mostrados o describen en detalle para evitar oscurecer aspectos de las realizaciones.
La referencia a lo largo de esta memoria descriptiva a “una realización” significa que una característica, estructura o característica particular descrita en relación con la realización está incluida en al menos una realización. Por lo tanto, las apariciones de las frases “en una realización” en diversos lugares a lo largo de esta memoria descriptiva no se refieren necesariamente a la misma realización. Además, las características, estructuras o rasgos particulares pueden ser combinados de cualquier manera adecuada en una o más realizaciones. Los títulos proporcionados en la presente memoria son solo por conveniencia y no interpretan el alcance o el significado de las realizaciones.
La enfermedad hepática alcohólica (EHA) y la enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA) son un importante problema de salud mundial caracterizado por características patológicas que son desarrolladas durante períodos prolongados, que incluyen esteatosis hepática, esteatohepatitis, cirrosis, hasta el cáncer.
Los eventos tempranos en la patogénesis del etanol, tales como por ejemplo el daño mitocondrial, la generación de especies reactivas de oxígeno (ERO) y la acumulación de grasa, son características compartidas entre EHA y EHGNA.
Además, ha sido demostrado que una alteración del metabolismo de los aminoácidos es una característica distintiva
de la enfermedad hepática, caracterizada por niveles bajos de aminoácidos de cadena ramificada (BCAA) circulantes, y la suplementación con BCAA parece estar asociada con una menor frecuencia de complicaciones de la cirrosis cuando es prescrita como terapia de mantenimiento (Charlton 2006).
El inventor de la presente solicitud descubrió que por medio de la adición de ácidos carboxílicos específicos a una composición que comprende una combinación de leucina, isoleucina, valina, treonina y lisina, puede ser lograda una alta eficacia para contrarrestar enfermedades hepáticas, tales como por ejemplo EHA y EHGNA.
La composición desvelada en la presente memoria, que comprende como agente activo los aminoácidos leucina, isoleucina, valina, treonina, lisina en combinación con tres ácidos carboxílicos, que son sustratos del ciclo del ácido tricarboxílico, que incluyen ácido cítrico, ácido succínico y ácido málico en cantidades específicas, ha sido demostrado que restaura el metabolismo de los aminoácidos alterado inducido por el etanol y, en consecuencia, previene la autofagia. El ciclo del ácido tricarboxílico (ciclo de TCA), también denominado ciclo de Krebs y ciclo del ácido cítrico, que es llevada a cabo en la matriz de las mitocondrias, es la segunda etapa de la respiración celular, el proceso de tres etapas por medio del cual las células vivas descomponen las moléculas de combustible orgánico en presencia de oxígeno para recolectar la energía que necesitan para crecer y dividirse.
Las composiciones que comprenden el agente activo indicado con anterioridad así como también las composiciones que comprenden el agente activo indicado con anterioridad que incluyen otros aminoácidos específicos (enumerados en la Tabla 1 a continuación) son significativamente más efectivas que una composición de aminoácidos similar libre de dichos ácidos carboxílicos específicos.
En una o más realizaciones, en la composición desvelada en la presente memoria, la proporción en peso entre la cantidad total de ácido cítrico, ácido succínico y ácido málico y la cantidad total de aminoácidos leucina, isoleucina, valina, treonina, lisina está comprendida entre 0,05 y 0,3, preferentemente entre 0,1 y 0,25.
En una o más realizaciones, el agente activo además puede comprender uno o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en histidina, fenilalanina, metionina, triptófano, cisteína y tirosina.
En una o más realizaciones, los ácidos carboxílicos contenidos en la composición consisten en ácido cítrico, ácido succínico y ácido málico.
En una realización adicional, el agente activo de la composición desvelada en la presente memoria también puede incluir ácido aspártico y/o L-alfa cetoglutarato de ornitina (OKG, por su sigla en inglés).
De acuerdo con una realización, la composición comprende un agente activo, el agente activo consiste en leucina, isoleucina, valina, treonina, lisina, histidina, fenilalanina, metionina, triptófano, cisteína y de manera opcional tirosina, así como también ácido cítrico, ácido succínico, y ácido málico, dichos aminoácidos son los únicos aminoácidos contenidos en la composición. El ácido cítrico, el ácido succínico y el ácido málico pueden ser los únicos ácidos carboxílicos contenidos en la composición.
En una realización adicional, la composición puede comprender los aminoácidos isoleucina, leucina y valina en una cantidad entre 35% y 65% en peso, preferentemente entre 42% y 56% en peso, con respecto al peso del agente activo.
En una o más realizaciones, la proporción en peso entre leucina y ácido cítrico está comprendida entre 5 y 1, preferentemente entre 2,50 y 3,50.
En una realización adicional, el peso o la cantidad molar de ácido cítrico es superior al peso o la cantidad molar de cada ácido málico y ácido succínico. Preferentemente, el peso o la cantidad molar de ácido cítrico es superior al peso o la cantidad global molar de ácido málico más ácido succínico. En otra realización, la proporción en peso entre ácido cítrico y la suma de ácido málico y ácido succínico está comprendida entre 1,0 y 4,0, preferentemente entre 1,5 y 2,5. En una realización preferente, la proporción en peso de ácido cítrico:ácido málico:ácido succínico está comprendida entre 10:1:1 y 2:1,5:1,5, preferentemente entre 7:1:1 y 1,5:1:1, más preferentemente entre 5:1:1 y 3:1:1. En una realización preferente, la proporción en peso de ácido cítrico: ácido málico: ácido succínico es 4:1:1. De acuerdo con algunas realizaciones de la presente divulgación, la proporción molar isoleucina:leucina preferente está comprendida en el intervalo de 0,2 a 0,7, preferentemente en el intervalo de 0,30 a 0,60 y/o la proporción en peso preferente de valina:leucina está comprendida en el intervalo de 0,2 a 0,70, preferentemente en el intervalo de 0,30 a 0,65.
En una realización adicional, la proporción molar treonina:leucina está comprendida en el intervalo de 0,10 a 0,90, preferentemente en el intervalo de 0,20 a 0,70 y/o la proporción en peso de lisina:leucina está comprendida en el intervalo de 0,20 a 1,00, preferentemente en el intervalo de 0,40 a 0,90.
En una realización preferente, la proporción entre la cantidad molar global de ácido cítrico, ácido málico, ácido succínico y la cantidad molar global de metionina, fenilalanina, histidina y triptófano es superior a 1,35.
En una o más realizaciones, la proporción en peso entre la suma de ácido cítrico, ácido málico, ácido succínico y la
suma de los aminoácidos de cadena ramificada leucina, isoleucina, valina está comprendida entre 0,1 y 0,4, preferentemente entre 0,15 y 0,35.
En una realización adicional, la cantidad en peso total de los aminoácidos de cadena ramificada leucina, isoleucina, valina más treonina y lisina es superior a la cantidad en peso total de tres ácidos carboxílicos, tales como ácido cítrico, ácido málico y ácido succínico. Preferentemente, la cantidad en peso del ácido carboxílico individual (ácido cítrico, ácido succínico o ácido málico) es menor que la cantidad en peso de cada uno de los aminoácidos leucina, isoleucina, valina, treonina y lisina.
En una realización adicional, la cantidad molar global de lisina y treonina es superior a la cantidad molar global de los tres ácidos carboxílicos ácido cítrico, ácido succínico, ácido málico. Preferentemente, la proporción entre la cantidad molar global de los tres ácidos carboxílicos ácido cítrico, ácido succínico, ácido málico y la cantidad molar global de lisina y treonina está comprendida entre 0,1 y 0,7, preferentemente entre 0,15 y 0,55.
En una o más realizaciones, la composición desvelada en la presente memoria además comprende vitaminas, preferentemente seleccionadas del grupo de vitaminas B, tales como vitamina B1 y/o vitamina B6.
En una realización adicional de la presente divulgación, la composición puede incluir carbohidratos, aditivos y/o sustancias aromatizantes.
En una realización preferente, la composición está dirigida a la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad hepática seleccionada en el grupo que consiste en enfermedad del hígado graso, lipodistrofia, hepatitis, cirrosis, carcinoma hepatocelular (CHC).
En una o más realizaciones, la enfermedad del hígado es una enfermedad del hígado graso. La enfermedad del hígado graso puede ser provocada por el consumo de alcohol (enfermedad del hígado graso alcohólico, EHA). En una o más realizaciones, la enfermedad del hígado graso es una enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA).
En una o más realizaciones, la enfermedad del hígado graso puede ser debido a fármacos o toxinas, tales como, por ejemplo, amiodarona, metotrexato, diltiazem, terapia antirretroviral altamente activa, glucocorticoides, tamoxifeno, intoxicación por hongos.
Además, en particular cuando son preparadas las composiciones de acuerdo con la presente divulgación, y de manera específica el agente activo, preferentemente es evitado el aminoácido arginina. Además, otros aminoácidos que preferentemente son evitados por medio de la composición desvelada en la presente memoria pueden ser serina, prolina, alanina. Dichos aminoácidos pueden ser contraproducentes o incluso perjudiciales en algunas concentraciones o proporciones estequiométricas dentro de la composición.
Los aminoácidos desvelados en la presente solicitud pueden ser reemplazados por los respectivos derivados aceptables para uso farmacéutico, a saber, sales.
Como será observado claramente en adelante en la presente memoria, la administración de las composiciones de acuerdo con la presente divulgación es en particular eficaz en la prevención y/o el tratamiento de enfermedades hepáticas.
En una realización preferente, las composiciones desveladas pueden ser usadas en el tratamiento de la enfermedad hepática alcohólica (EHA).
De acuerdo con una realización adicional, las composiciones de aminoácidos pueden comprender excipientes aceptables para uso farmacéutico, como por ejemplo proteínas, vitaminas, carbohidratos, edulcorantes naturales y artificiales y/o sustancias aromatizantes. En una realización preferente, los excipientes aceptables para uso farmacéutico pueden ser seleccionados de proteínas de suero, maltodextrinas, fructosa, caseinato de calcio, aceite de pescado, sucralosa, ésteres de sacarosa, vitamina D3, vitaminas del grupo B.
Para su uso oral, las composiciones de acuerdo con la descripción pueden estar en forma de tabletas, cápsulas, gránulos, gel, polvo gelificable o polvo.
Otras especificaciones, en términos de cantidades y proporciones entre los diversos aminoácidos proporcionados por las composiciones, están contenidas en las reivindicaciones adjuntas, que forman parte integral de la enseñanza técnica proporcionada en la presente memoria en relación con la invención.
Ejemplos
La Tabla 1 muestra dos composiciones diferentes basadas en aminoácidos probadas in vitro en hepatocitos (células HepG2) e in vivo en ratas que consumen etanol, como es desvelado a continuación.
La composición denominada “BCAAem” a continuación comprende un agente activo que contiene los aminoácidos
leucina, lisina, isoleucina, valina, treonina, cisteína, histidina, fenilalanina, metionina, tirosina, triptófano.
La composición denominada “alfa 5m (a5m)” comprende un agente activo que contiene los mismos aminoácidos más ácido cítrico, ácido succínico y ácido málico.
Tabla 1
Las composiciones de la Tabla 1 anterior pueden ser preparadas primero por medio del tamizado todos los componentes con una malla de 0,8. Para obtener una premezcla, cada componente (en una cantidad < 10% en peso de la cantidad total) es montado en una bolsa de polietileno junto con una porción de L-lisina HCl para obtener el 10% del peso de la composición total. A continuación, la bolsa es agitada de manera manual durante 5 minutos. A continuación, la premezcla es cargada en un mezclador (Planetaria) junto con el resto de los componentes y es mezclada durante un período de 15 minutos a 120 rpm para obtener una composición final homogénea.
Procedimientos
Animales y tratamientos
El protocolo experimental fue aprobado y llevado a cabo de acuerdo con la Directiva del Consejo de las Comunidades Europeas del 24 de noviembre de 1986 (86/609/EEC) y el Ministerio de Salud de Italia, y cumplió con las Directrices Nacionales de Protección Animal.
Fueron usadas ratas Wistar macho (3 meses de edad) de Charles River (Calco, Como, Italia) para el análisis experimental desvelado en adelante en la presente memoria.
Los animales fueron alojados por separado en jaulas de polipropileno limpias y fueron divididos en seis grupos: 1) el grupo alimentado por parejas (CTRL alimentado por parejas, n = 6) fue alimentado con una dieta líquida de
control, en la que el etanol (EtOH) fue reemplazado por dextrano de maltosa isocalórico;
2) el grupo EtOH (EtOH, n = 7) fue alimentado con una dieta líquida Lieber-DeCarli que contenía EtOH ad libitum [aumentando gradualmente la cantidad de EtOH, alcanzando el 36% de la ingesta calórica después de 1 semana, correspondiente a una concentración final del 6,2% (vol./vol.)];
3) el grupo BCAAem (BCAAem, n = 6) fue alimentado con una dieta líquida de control, en la que el EtOH fue reemplazado por dextrano de maltosa isocalórico y complementado con la composición de aminoácidos de cadena ramificada (“BCAAem” en la Tabla 1) que proporcionó 1,5 g/kg/día de BCAAem;
4) el grupo alfa 5 (a5m, n = 6) fue alimentado con una dieta líquida de control, en la que el EtOH fue reemplazado por dextrano de maltosa isocalórico y complementado con la composición de aminoácidos (“a5m” en la Tabla 1) que proporcionó 1,5 g/kg/día;
5) el grupo EtOH más BCAAem (EtOH BCAAem, n = 7) fue alimentado con una dieta líquida Lieber-DeCarli que contiene EtOH y una composición de BCAAem ad libitum; y
6) el grupo EtOH más a5m (EtOH a5m, n = 7), fue alimentado con una dieta líquida Lieber-DeCarli que contiene EtOH y una composición de a5m ad libitum.
Preparación de la muestra
El hígado fue pesado (n = 4 animales/grupo), homogeneizado en metanol frío:agua (v/v, 1:1) y extraído de acuerdo con Want et al. (Want et al. 2013). Las muestras secadas al vacío fueron suspendidas en 120 pl/50 mg de tejido de metanol:TDFHA 1 mM = 1:1 y centrifugadas a 16.000 g durante 10 minutos a 4 °C. Dos pl de sobrenadante fueron cargados directamente en el espectrómetro de masas UPLC y analizados como es indicado a continuación. Fueron llevadas a cabo cuatro réplicas técnicas para cada muestra por el uso de los tres procedimientos diferentes.
Cromatografía y cuantificación de aminoácidos en hígado
Los aminoácidos estándar fueron adquiridos de Sigma (Milán, Italia). Cada solución madre de aminoácidos fue preparada a 1 mg/ml en agua, diluida hasta la concentración final de 3 pmol/pl, e infundida directamente con una jeringa a 10 pl/min en el espectrómetro de masas TripleTOF 5600+ (AB Sciex, Milán, Italia). Por lo tanto, el potencial de desagrupamiento (DP, por su sigla en inglés) y la energía de colisión (CE, por su sigla en inglés) fueron optimizados para cada aminoácido.
A continuación, fueron preparadas tres mezclas de aminoácidos en base a los valores de DP y CE: MEZCLA 1, que contenía treonina, asparagina, tirosina y serina, y fue analizada con DP: 30 V, CE: 15 V; MEZCLA 2, que contenía glicina, alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, histidina, metionina, ácido aspártico, glutamina y fenilalanina, y fue analizada con DP: 40 V, CE: 15 V; y MEZCLA 3, que contenía ácido glutámico, lisina, arginina y triptófano y fue analizada con DP: 80 V, CE: 18 V.
Los parámetros de origen fueron: gas 1: 33 psi, gas 2: 58 psi, gas de cortina: 25 psi, temperatura: 500 °C e ISVF (voltaje flotante de lonSpray): 5500 V.
A fin de obtener las curvas de calibración, fueron inyectados cuadriplicados técnicos de diferentes cantidades (10, 33, 50, 100, 200, 400 pmol) de las tres mezclas en el espectrómetro de masas después de la separación por UPLC, por el uso del UPLC 1290 (Agilent Technologies Italia, Cernusco sul Naviglio, Milán, Italia). La columna cromatográfica era de Waters, Acquity HSS T3 C182,1 x 100 mm, 1,7 pm, mientras que la fase móvil fue A: TDFHA (ácido tridecafluoroheptanoico) 1 mM en agua; B: TDFHA 1 mM en acetonitrilo. Fue usado un gradiente de B del 12,5% al 26,5% en 4 min, seguido por una rampa del 26,5 al 92% en 3,5 min para separar todos los aminoácidos, con un caudal de 0,35 ml/min y una temperatura de columna de 65 °C como es descrito (Le et al., 2014).
El automuestreador fue fijado a 4 °C. Las curvas de calibración fueron trazadas por el uso de áreas pico cromatográficas y una regresión ponderada (1/x para todos los compuestos excepto asparagina, tirosina, valina y ácido glutámico, que fueron ajustados a 1/x2) por medio del software MultiQuant versión 2.1 (SCIEX). Los valores cuantitativos para cada aminoácido (pmol) en las muestras de hígado de rata fueron obtenidos por medio de la relación entre las áreas de los picos cromatográficos y las derivadas de los estándares de calibración ejecutados externamente y normalizados al tejido (mg).
Cultivo y tratamiento celular
Las células CHC HepG2 humanas fueron adquiridas de la American Type Culture Collection (HB-8065; ATCC, Manassas, VA). Las células fueron cultivadas de manera rutinaria en un medio RPMI-1640, suplementadas con suero bovino fetal al 10%, penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 pg/mL), en una atmósfera con 5% de CO2 a 37 °C. Fueron sembradas dos millones de células HepG2 por matraz de 75 cm2 (Corning Inc., Corning, NY).
Seis hs después de la siembra, fueron añadidos EtOH 75 mM (0,34%) y BCAAem al 1% o a5m, solos o en combinación. Las células no tratadas fueron sembradas como controles. Cada 24 hs, los medios fueron reemplazados tanto en matraces de control como de tratamiento, con medios frescos, con o sin EtOH y BCAAem o a5m, respectivamente. Cuatro días después de la siembra, las células fueron tripsinizadas y sembradas en nuevos
matraces, a 2 millones de células viables por matraz, con cambios diarios de medio, como fue descrito con anterioridad (Pochareddy et al. 2012). Cinco días después del proceso de división (un total de 9 días con o sin EtOH, BCAAem o a5m, o EtOH más BCAAem o a5m), las células fueron recolectadas como es indicado a continuación para los diferentes ensayos.
Análisis cuantitativo de RT-PCR
Las reacciones cuantitativas de RT-PCR fueron llevadas a cabo como es descrito (Tedesco et al. 2008) y ejecutadas con el iQ SybrGree-nl SuperMix (Bio-Rad; Segrate, Italia) en un sistema de detección iCycler iQ Real-Time PCR (Bio-Rad).
Brevemente, el ARN fue aislado del tejido por el uso del mini kit RNeasy® Tissue (Qiagen, Milán, Italia). El ADNc se sintetizó por el uso de el kit de síntesis de ADNc iScriptTM (Bio-Rad Laboratories, Segrate, Italia).
Los cebadores fueron diseñados por el uso del software Beacon Designer 2.6 de Premier Biosoft International (las secuencias son indicadas en la Tabla 2 a continuación). El número de ciclo en el que fueron detectadas las diversas transcripciones (ciclo de umbral, CT) fue comparado con el de TBP, denominado como ACT. Los niveles relativos del gen fueron expresados como 2-(AACT), en el que AACT es igual a ACT de rata tratada con EtOH o BCAAem o mezcla de CAA (o células HepG2 tratadas) menos ACT de la rata de control (o células HepG2 no tratadas).
Tabla 2
Análisis de Western Blot
Los extractos de proteínas fueron obtenidos del hígado con el reactivo de extracción de proteínas de mamíferos T-PER (Pierce, Thermo-Scientific, Rockford, EE. UU.) como fue descrito por el fabricante, en presencia de un cóctel inhibidor de proteasa y fosfatasa (Sigma Aldrich, Milán, Italia). El contenido de proteína fue medido por medio del ensayo de proteína de ácido bicinconínico (BCA, Pierce, Euroclone, Milán, Italia) y 50 |jg de proteínas fueron procesados en SDS-PAGE en condiciones reductoras. Las proteínas separadas fueron transferidas luego de manera electroforética a una membrana de nitrocelulosa (Laboratorios Bio-Rad, Segrate, Italia). Las proteínas de interés fueron reveladas con anticuerpos específicos: anti-p62 y anti-a-actina (todos de Cell Signalling, Euroclone, Milán, Italia), a una dilución 1:1000 cada uno. La inmunotinción fue detectada por el uso de inmunoglobulina anti-conejo o anti-ratón conjugada con peroxidasa de rábano picante durante 1 hora a temperatura ambiente. La cantidad de proteína fue medida por el uso del sustrato SuperSignal (Pierce, Euroclone, Milán, Italia) y fue cuantificada por densitometría con el analizador de imágenes de software IMAGEJ.
Análisis estadístico
Para todos los datos de expresión génica, fueron usadas pruebas t de muestras pareadas de dos caras para comparar los valores entre las células de control y las tratadas. Un valor de P < 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
RESULTADOS
La composición a5m es más efectiva que la composición de BCAAem para restaurar la biogénesis y la función mitocondrial hepática deteriorada por el consumo de EtOH
Fue evaluada la capacidad de las composiciones de BCAAem y a5m para mejorar la biogénesis y función mitocondrial deteriorada debido a la exposición al EtOH. A fin de investigar los mecanismos moleculares implicados en los efectos ejercidos por las composiciones de BCAAem y a5m, fue usado un modelo in vitro de toxicidad hepática por EtOH.
Para ello, fueron expuestas células HepG2 hepáticas a EtOH 75 mM, con o sin composiciones de BCAAem a5m, durante 9 días. El coactivador del receptor y activado por proliferador 1a (PGC-1a), el factor respiratorio nuclear 1 (NRF-1), el factor de transcripción del ADN mitocondrial A (Tfam) y los niveles de ARNm de cyt c no cambiaron o fueron ligeramente inferiores en las células HepG2 expuestas a 75 mM EtOH durante 9 días, que en las células de control sin tratar (Fig. 1).
Sin embargo, la administración de la composición de BCAAem y a5m durante 9 días aumentó los niveles de ARNm de PGC-1a y Tfam con respecto a las células tratadas con EtOH y sin tratar (Fig. 1).
En particular, la eficacia de la composición de a5m para mejorar los marcadores de biogénesis mitocondrial hepática fue estadísticamente superior a la de BCAAem.
Análisis de autofagia
El flujo autofágico puede ser inferido por medio de la combinación de diversos marcadores, incluidos los niveles de proteína de p62/SQSTM1 además de la relación LC3II/LC3I, Beclin1 y Atg7, y la fosforilación de 4EBP1 (Klionsky et al., 2016). Ha sido demostrado que p62/SQSTM1 está incorporada en los autofagosomas y se degrada en los autolisosomas. Por lo tanto, un nivel de proteína p62/SQSTM1 reducido es indicativo de un aumento de la autofagia (Klionsky et al. 2016).
Como es mostrado en la FIG. 2 de la presente solicitud, el nivel de proteína p62 fue menor en las células HepG2 expuestas a EtOH 75 mM durante 9 días que en las células de control sin tratar.
Sin embargo, después de 9 días de administración de las composiciones de BCAAem o a5m, el nivel de proteína p62 era mayor con respecto al nivel de p62 de las células tratadas con EtOH y sin tratar.
También en este caso, la eficacia de la composición de a5m fue estadísticamente superior a la de la composición de BCAAem.
Cuantificación de aminoácidos hepáticos
Como fue desvelado con anterioridad, un metabolismo de aminoácidos alterado, de manera específica niveles bajos de BCAA circulantes, ha demostrado ser una característica distintiva de la enfermedad hepática alcohólica (Charlton, 2006).
Los datos proporcionados a continuación se refieren a los efectos de las composiciones de BCAAem o a5m sobre el metabolismo de los aminoácidos en el hígado de ratas que consumen EtOH de manera crónica.
Con este fin, fueron medidos los niveles de aminoácidos libres por el uso de análisis cromatográfico en tejido hepático de ratas que consumían EtOH solo o en combinación con las composiciones ensayadas.
Como es informado en la Tabla 3, la suplementación de las composiciones de BCAAem y a5m fue ineficaz en el nivel de Arginina, Leucina y Triptófano. Por el contrario, el consumo de EtOH condujo a una reducción de los niveles de estos aminoácidos en el hígado.
Curiosamente, la administración de las composiciones de BCAAem y a5m en las ratas que consumían EtOH previno las reducciones de Arginina, Leucina y Triptófano.
Además, las concentraciones de Isoleucina, Serina, Tirosina y Valina fueron menores en el hígado de los ratones expuestos a una dieta que contenía EtOH.
Si bien la suplementación con BCAAem no pudo prevenir su declive, la suplementación con a5m, por el contrario, también fue eficaz para prevenir la reducción de isoleucina y valina inducida por EtOH.
Las concentraciones de los aminoácidos restantes no fueron estadísticamente diferentes entre los grupos.
Estos resultados son consistentes con la capacidad específica de la composición de a5m en comparación con la composición de BCAAem para volver a normalizar los niveles de BCAA en muestras de hígado de ratas que consumen EtOH.
Tabla 3
Los valores son informados como medias ± DE (pmol/mg de tejido), n = 4 animales/grupo; * P < 0,05 frente al grupo de CTRL;
* valor de P < 0,05 frente al grupo de EtOH.
En resumen, los resultados in vitro e in vivo muestran que la suplementación dietética con una composición que comprende un agente activo, el agente activo que contiene una combinación de leucina, isoleucina, valina, treonina, lisina, ácido cítrico, ácido succínico y ácido málico es significativamente eficaz en la prevención del daño mitocondrial de los hepatocitos expuestos a EtOH.
Este efecto también va acompañado de una reducción de la autofagia (es decir, aumento de los niveles de proteína p62) que aumenta (es decir, disminución de los niveles de proteína p62) por la exposición a EtOH.
El EtOH per se puede potenciar la autofagia para compensar la toxicidad del EtOH y, en particular, el daño mitocondrial que es evidente en los hepatocitos expuestos al alcohol y en el hígado de animales que consumen alcohol.
De hecho, la autofagia es un mecanismo celular destinado a eliminar los orgánulos defectuosos, incluidas las mitocondrias. Cuando los hepatocitos están expuestos al alcohol y la función mitocondrial es reducido, una autofagia aumentada, como también es desvelado en la presente solicitud, es útil para eliminar las mitocondrias que funcionan mal.
Las composiciones de aminoácidos desveladas en la presente memoria, que comprenden una combinación de
Claims (14)
1. Composición para su uso en la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad hepática en un mamífero, comprendiendo la composición un agente activo, conteniendo dicho agente activo los aminoácidos leucina, isoleucina, valina, treonina, lisina y los ácidos carboxílicos ácido cítrico, ácido succínico, ácido málico.
2. Composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la proporción en peso entre la cantidad total de ácido cítrico, ácido málico, ácido succínico y la cantidad total de leucina, isoleucina, valina, lisina, treonina está comprendida entre 0,05 y 0,3, preferentemente entre 0,1 y 0,25.
3. Composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la proporción en peso entre la cantidad total de ácido cítrico, ácido málico, ácido succínico y la cantidad total de leucina, isoleucina, valina está comprendida entre 0,1 y 0,4, preferentemente entre 0,15 y 0,35.
4. Composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la proporción en peso entre ácido cítrico y la suma de ácido málico y ácido succínico está comprendida entre 1,0 y
4,0, preferentemente entre 1,5 y 2,5.
5. Composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la proporción en peso ácido cítrico: ácido málico: ácido succínico está comprendida entre 10:1:1 y 2:1,5:1,5, preferentemente entre 7:1:1 y 1,5:1:1, más preferentemente entre 5:1:1 y 3:1:1.
6. Composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho agente activo además comprende al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en histidina, fenilalanina, metionina, triptófano, tirosina, cisteína.
7. Composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho agente activo además comprende histidina, fenilalanina, metionina, triptófano, cisteína y de manera opcional tirosina.
8. Composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la proporción entre la cantidad molar total de ácido cítrico, ácido málico, ácido succínico y la cantidad molar total de metionina, fenilalanina, histidina y triptófano es superior a 1,35.
9. Composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la proporción entre la cantidad molar total de los tres ácidos carboxílicos ácido cítrico, ácido succínico, ácido málico y la cantidad molar total de lisina y treonina está comprendida entre 0,10 y 0,70, preferentemente entre 0,15 y
0,55.
10. Composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el peso o la cantidad molar de ácido cítrico es superior al peso total o la cantidad molar tanto del ácido málico como del ácido succínico.
11. Composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la proporción en peso entre leucina y ácido cítrico está comprendida entre 5 y 1, preferentemente entre 2,50 y 3,50.
12. Composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la composición además comprende una o más vitaminas, preferentemente seleccionadas del grupo de vitaminas B, más preferentemente vitamina B1 y/o vitamina B6.
13. Composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la enfermedad hepática es seleccionada del grupo que consiste en enfermedad del hígado graso, lipodistrofia, hepatitis, cirrosis, carcinoma hepatocelular (CHC).
14. Composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 13, en el que la enfermedad hepática es seleccionada entre la enfermedad hepática alcohólica (EHA) y la enfermedad del hígado graso no alcohólico (EHGNA).
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