ES2856555T3 - Procedimientos y composiciones farmacéuticas para el tratamiento de la fibrosis quística - Google Patents

Abstract

Un inhibidor de miR-9 de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3, en el que el inhibidor de miR-9 de ácido nucleico no se une directamente a miR-9 sino que, en su lugar, se une a un sitio diana del ARNm de miR-9 en la secuencia de ácido nucleico de ANO1.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimientos y composiciones farmacéuticas para el tratamiento de la fibrosis quística

Campo

La presente divulgación se refiere a procedimientos y composiciones farmacéuticas para el tratamiento de la fibrosis quística.

Antecedentes

La fibrosis quística (FQ) es una enfermedad genética provocada por mutaciones en el gen que codifica el canal de Cl de CFTR (Riordan, 1989). La FQ afecta a varios órganos, pero las consecuencias más graves se observan en el pulmón. La patogenia de la neumopatía en la FQ aún no se comprende perfectamente. La pérdida de la función del canal de CFTR en la FQ favorece la colonización de la superficie de las vías respiratorias por bacterias altamente virulentas. Sin embargo, el mecanismo por el que sucede esto es todavía un tema de debate. La actividad del canal de CFTR es, sin duda, un contribuyente importante al aclaramiento mucociliar. El fino equilibrio entre la secreción de Cl- dependiente de CFTR y la absorción de Na+ a través del canal ENaC controla el espesor del líquido periciliar (LPC). En ausencia de CFTR funcional, la absorción de líquidos prevalece sobre la secreción. Este desequilibrio deshidrata la superficie de las vías respiratorias, lo que altera el latido ciliar. El moco inmovilizado se convierte a continuación en un nicho para la supervivencia y proliferación bacterianas. La activación de un canal de cloruro alternativo puede ser una estrategia terapéutica atractiva en la fibrosis quística. Este enfoque podría aplicarse a todos los pacientes independientemente de su genotipo. En cambio, los tratamientos dirigidos a CFTR tienen que ser específicos de la mutación, un enfoque que puede no ser aplicable a todas las clases de mutaciones. La activación de un canal de cloruro alternativo en las vías respiratorias con FQ podría ser beneficiosa al proporcionar una vía para la secreción de cloruro y bicarbonato necesaria para mejorar el aclaramiento mucociliar y restaurar la actividad antimicrobiana. Hace más de 20 años se descubrió que las células epiteliales de las vías respiratorias poseen un segundo tipo de vía secretora de Cl-. Mientras que el CFTR está regulado por AMPc, la segunda vía se activa por el incremento de la concentración de Ca2+ citosólico. La estimulación de los epitelios de las vías respiratorias con agonistas purinérgicos tales como ATP o UTP provoca un estallido fuerte, pero transitorio, de transporte de Cl- transepitelial. Este efecto depende tanto de las liberaciones de Ca2+ desde las reservas intracelulares como de la afluencia de Ca2+ a través de la membrana plasmática. La secreción de Cl activada por Ca2+ es independiente de CFTR, ya que no es defectuosa en pacientes con FQ. De forma interesante, la estimulación de la secreción de Cl- dependiente de Ca2+ tiene un efecto positivo sobre el espesor del LPC. Este efecto sugiere que la estimulación de la vía dependiente de Ca2+ puede compensar el CFTR defectuoso. La proteína huérfana TMEM16A se identificó como un componente del canal de cloruro activado por Ca2+ (CaCC). TMEM16A, también conocida como anoctamina-1 (ANO1), pertenece a una familia de proteínas compuesta por 10 miembros cuya secuencia primaria y estructura predicha (ocho dominios transmembranarios) no tienen similitud con las de otros canales aniónicos. Sin embargo, trabajos anteriores han demostrado que la actividad y expresión de TMEM16A se redujeron en un contexto de FQ por un mecanismo desconocido.

Sumario de la invención

Como se define en las reivindicaciones, la presente invención se refiere a un inhibidor de miR-9 de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3, en el que el inhibidor de miR-9 de ácido nucleico no se une directamente a miR-9 sino que, en su lugar, se une a un sitio diana del ARNm de miR-9 en la secuencia de ácido nucleico de ANO1.

La presente invención también se refiere a un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico de la invención.

La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende la secuencia de ácido nucleico de la invención.

La presente invención también se refiere a un inhibidor de miR-9 de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3 para su uso en el tratamiento de la fibrosis quística en un sujeto que lo necesita, en el que el inhibidor de miR-9 de ácido nucleico no se une directamente a miR-9 sino que, en su lugar, se une a un sitio diana del ARNm de miR-9 en la secuencia de ácido nucleico de ANO1.

Descripción detallada

El objetivo de los autores de la invención fue comprender el origen de la expresión reducida de ANO1 en la FQ al estudiar la función de los miARN que regulan negativamente la expresión génica. Por tanto, los autores de la invención realizaron enfoques bioinformáticos para estudiar los miARN que se podrían dirigir a ANO1 y evaluaron los niveles de expresión de miARN candidatos mediante RT-qPCR en líneas celulares epiteliales bronquiales.

Realizaron experimentos de funcionalidad estudiando los miARN candidatos que se unen a la UTR 3' de los miARN que sobreexpresan ANO1, y cuantificando la expresión de ANO1 en estas condiciones. También evaluaron la tasa de migración celular y la actividad del cloruro de ANO1 que modula un miARN que regula ANO1. Los autores de la invención han identificado diferentes miARN, incluyendo miR-9, como regulador potencial de ANO1. Observaron que el miR-9 se sobreexpresa en las células con FQ y una disminución de la expresión de ANO1 y la actividad luciferasa cuando sobreexpresan miR-9 en células con FQ y sin FQ. Además, los autores de la invención observaron una disminución de la tasa de migración celular y la actividad del cloruro de ANO1 cuando se sobreexpresa miR-9. En conclusión, los resultados mostraron que el miR-9 regula directamente ANO1 al emparejarse con su UTR 3', y que modular el miR-9 permite cambiar la tasa de migración celular y la actividad del cloruro de ANO1.

En consecuencia, la presente divulgación se refiere a un procedimiento para tratar la fibrosis quística en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de miR-9 de ácido nucleico.

Como se usa en el presente documento, el término "sujeto" indica un mamífero. Un sujeto de acuerdo con la divulgación se refiere a cualquier sujeto (preferentemente humano) que padece o que está en riesgo de padecer fibrosis quística. El procedimiento de la divulgación se puede realizar para cualquier tipo de fibrosis quística tal como se revisa en la Clasificación de Fibrosis Quística de la Organización Mundial de la Salud y se selecciona del grupo E84: mucoviscidosis, fibrosis quística con manifestaciones pulmonares, fibrosis quística con manifestaciones intestinales y fibrosis quística con otras manifestaciones.

Como se usa en el presente documento, el término "ANO1" tiene su significado general en la técnica y se refiere a la proteína anoctamina-1, también conocida como TMEM16A. ANO1 pertenece a una familia de proteínas compuesta por 10 miembros cuya secuencia primaria y estructura predicha (ocho dominios transmembranarios) no tienen similitud con las de otros canales aniónicos. Una secuencia de ácido nucleico humana ejemplar es la secuencia de referencia del NCBI NM_018043.5 (SEQ ID NO: 1).

SEQ ID NO:

aaaggcgggc cggctggcgt ccaagttcct gaccaggcgc gggccggccc gcgggaccag 61 cagccgggtg gcggcgcgat cggccccgag aggctcaggc gccccccgca tcgagcgcgc 121 gggccgggcg ggccagggcg gcgggcggag cgggaggcgg ccacgtcccc ggcgggcctg 181 ggcgcgggga ggcccggccc cctgcgagcg cgccgcgaac gctgcggtct ccgcccgcag 241 aggccgccgg ggccgtggat ggggagggcg cgccgcccgg cggtcccagc gcacaggcgg 301 ccacgatgag ggtcaacgag aagtactcga cgctcccggc cgaggaccgc agcgtccaca 361 tcatcaacat ctgcgccatc gaggacatcg gctacctgcc gtccgagggc acgctgctga 421 actccttatc tgtggaccct gatgccgagt gcaagtatgg cctgtacttc agggacggcc 481 ggcgcaaggt ggactacatc ctggtgtacc atcacaagag gccctcgggc aaccggaccc 541 tggtcaggag ggtgcagcac agcgacaccc cctctggggc tcgcagcgtc aagcaggacc 601 accccctgcc gggcaagggg gcgtcgctgg atgcaggctc gggggagccc ccgatggact 661 accacgagga tgacaagcgc ttccgcaggg aggagtacga gggcaacctc ctggaggcgg 721 gcctggagct ggagcgggac gaggacacta aaatccacgg agtcgggttt gtgaaaatcc 781 atgccccctg gaacgtgctg tgcagagagg ccgagtttct gaaactgaag atgccgacga 841 agaagatgta ccacattaat gagacccgtg gcctcctgaa aaaaatcaac tctgtgctcc 901 agaaaatcac agatcccatc cagcccaaag tggctgagca caggccccag accatgaaga 961 gactctccta tcccttctcc cgggagaagc agcatctatt tgacttgtct gataaggatt 1021 cctttttcga cagcaaaacc cggagcacga ttgtctatga gatcttgaag agaacgacgt 1081 gtacaaaggc caagtacagc atgggcatca cgagcctgct ggccaatggt gtgtacgcgg 1141 ctgcataccc actgcacgat ggagactaca acggtgaaaa cgtcgagttc aacgacagaa 1201 aactcctgta cgaagagtgg gcacgctatg gagttttcta taagtaccag cccatcgacc 1261 tggtcaggaa gtattttggg gagaagatcg gcctgtactt cgcctggctg ggcgtgtaca 1321 cccagatgct catccctgcc tccatcgtgg gaatcattgt cttcctgtac ggatgcgcca 1381 ccatggatga aaacatcccc agcatggaga tgtgtgacca gagacacaat atcaccatgt 1441 gcccgctttg cgacaagacc tgcagctact ggaagatgag ctcagcctgc gccacggccc 1501 gcgccagcca cctcttcgac aaccccgcca cggtcttctt ctctgtcttc atggccctct 1561 gggctgccac cttcatggag cactggaagc ggaaacagat gcgactcaac taccgctggg 1621 acctcacggg ctttgaagag gaagaggagg ctgtcaagga tcatcctaga gctgaatacg 1681 aagccagagt cttggagaag tctctgaaga aagagtccag aaacaaagag aagcgccggc 1741 atattccaga ggagtcaaca aacaaatgga agcagagggt taagacagcc atggcggggg 1801 tgaaattgac tgacaaagtg aagctgacat ggagagatcg gttcccagcc tacctcacta 1861 acttggtctc catcatcttc atgattgcag tgacgtttgc catcgtcctc ggcgtcatca 1921 tctacagaat ctccatggcc gccgccttgg ccatgaactc ctccccctcc gtgcggtcca 1981 acatccgggt cacagtcaca gccaccgcag tcatcatcaa cctagtggtc atcatcctcc 2041 tggacgaggt gtatggctgc atagcccgat ggctcaccaa gatcgaggtc ccaaagacgg 2101 agaaaagctt tgaggagagg ctgatcttca aggctttcct gctgaagttt gtgaattcct 2161 acacccccat cttttacgtg gcgttcttca aaggccggtt tgttggacgc ccgggcgact 2221 acgtgtacat tttccgttcc ttccgaatgg aagagtgtgc gccagggggc tgcctgatgg 2281 agctatgcat ccagctcagc atcatcatgc tggggaaaca gctgatccag aacaacctgt 2341 tcgagatcgg catcccgaag atgaagaagc tcatccgcta cctgaagctg aagcagcaga 2401 gcccccctga ccacgaggag tgtgtgaaga ggaaacagcg gtacgaggtg gattacaacc 2461 tggagccctt cgcgggcctc accccagagt acatggaaat gatcatccag tttggcttcg 2521 tcaccctgtt tgtcgcctcc ttccccctgg ccccactgtt tgcgctgctg aacaacatca 2581 tcgagatccg cctggacgcc aaaaagtttg tcactgagct ccgaaggccg gtagctgtca 2641 gagccaaaga catcggaatc tggtacaata tcctcagagg cattgggaag cttgctgtca 2701 tcatcaatgc cttcgtgatc tccttcacgt ctgacttcat cccgcgcctg gtgtacctct 2761 acatgtacag taagaacggg accatgcacg gcttcgtcaa ccacaccctc tcctccttca 2821 acgtcagtga cttccagaac ggcacggccc ccaatgaccc cctggacctg ggctacgagg 2881 tgcagatctg caggtataaa gactaccgag agccgccgtg gtcggaaaac aagtacgaca 2941 tctccaagga cttctgggcc gtcctggcag cccggctggc gtttgtcatc gtcttccaga 3001 acctggtcat gttcatgagc gactttgtgg actgggtcat cccggacatc cccaaggaca 3061 tcagccagca gatccacaag gagaaggtgc tcatggtgga gctgttcatg cgggaggagc 3121 aagacaagca gcagctgctg gaaacctgga tggagaagga gcggcagaag gacgagccgc 3181 cgtgcaacca ccacaacacc aaagcctgcc cagacagcct cggcagccca gcccccagcc 3241 atgcctacca cgggggcgtc ctgtagctat gccagcgggg ctgggcaggc cagccgggca 3301 tcctgaccga tgggcaccct ctcccagggc aggcggcttc ccgctcccac cagggcccgg 3361 tgggtcctgg gttttctgca 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El término "miARN" se refiere a moléculas de microARN maduras (ARN pequeños no codificantes) que en general tienen una longitud de 21 a 22 nucleótidos, aunque se ha informado de longitudes de 19 y hasta 23 nucleótidos. Cada miARN se procesa a partir de moléculas de ARN precursoras más largas ("miARN precursor": pri-miARN y pre-miARN). Los pri-miARN se transcriben a partir de genes que no codifican proteínas o están incluidos en genes que codifican proteínas (dentro de intrones o exones no codificantes). Los "miARN precursores" se pliegan en estructuras de horquilla que contienen tallos con emparejamientos de bases imperfectos y se procesan en dos etapas, catalizadas en animales por dos endonucleasas de tipo ribonucleasa III denominadas Drosha y Dicer. Los miARN procesados (también denominados "miARN maduros") se ensamblan en grandes complejos ribonucleoproteínicos (RISC) que se pueden asociar con su ARNm diana para reprimir la traducción. Todos los miARN pertenecientes a la divulgación se conocen per se y sus secuencias están disponibles públicamente en la base de datos http://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna summary.pl?org=hsa. Como se usa en el presente documento, el microARN "miR-9" (homólogo a miR-79), es un gen de ARN no codificante corto implicado en la regulación génica. Los miARN maduros de ~21 nt se procesan a partir de secuencias precursoras de horquilla mediante la enzima Dicer. La secuencia de miARN maduro dominante se procesa a partir de la parte 5' del precursor de miR-9 y de la parte 3' del precursor de mir-79. Se cree que los productos maduros tienen funciones reguladoras a través de la complementariedad con el ARNm. Una secuencia ejemplar de miR-9 se encuentra en la secuencia de referencia de MiRBase MIMAT0000441 (UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGA = SEQ ID NO: 2).

Como se describe en el presente documento, un "inhibidor de miR-9 de ácido nucleico" (es decir, un ácido nucleico que inhibe el miR-9) es cualquier ácido nucleico, por ejemplo, un oligonucleótido, que reduce (es decir, inhibe) la actividad biológica del miR-9. En particular, los inhibidores de miR-9 de ácido nucleico comprenden una secuencia de ácido nucleico que es complementaria a al menos una parte de la secuencia de ácido nucleico del propio miR-9 o de las secuencias de ARNm diana de miR-9; por lo tanto, la inhibición de miR-9 se produce por la unión del inhibidor a miR-9 o su ARNm diana. En ambos casos, se impide que el miR-9 reconozca y se una a su secuencia diana y, por tanto, no puede inducir silenciamiento génico. El inhibidor de miR-9 de ácido nucleico de la divulgación puede comprender una estructura que sea de naturaleza monocatenaria, bicatenaria, parcialmente bicatenaria o de horquilla.

En particular, el inhibidor de miR-9 de ácido nucleico se une al miR-9. Por tanto, en particular, el inhibidor de miR-9 de ácido nucleico se une y secuestra el miR-9, evitando así que se una a sus secuencias de ARNm diana. La unión se produce a través del emparejamiento de bases complementarias entre al menos un nucleótido presente en el inhibidor de miR-9 de ácido nucleico y un nucleótido correspondiente presente en miR-9, de modo que al menos una parte del inhibidor de miR-9 de ácido nucleico y el miR-9 juntos definen una estructura bicatenaria de ácido nucleico con emparejamiento de bases. Dicho emparejamiento de bases complementarias (y, por tanto, la formación de estructuras bicatenarias) se puede producir sobre una región de dos o más nucleótidos contiguos del miR-9 (por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 nucleótidos contiguos). Una estructura bicatenaria de ácido nucleico con emparejamiento de bases formada cuando el inhibidor de miR-9 de ácido nucleico se une a miR-9 (como se describe anteriormente) puede comprender uno o más emparejamientos erróneos. En particular, se forman dos o más regiones de estructura bicatenaria de ácido nucleico con emparejamiento de bases complementarias (por ejemplo, 3, 4, 5 o 6), en las que cada región está separada de la siguiente por uno o más emparejamientos erróneos. Como se usa en el presente documento, el término "complementaria" se refiere a una molécula de ácido nucleico que forma enlaces de hidrógeno con otra molécula de ácido nucleico con emparejamiento de bases de Watson y Crick. El emparejamiento de bases de Watson y Crick se refiere a los siguientes emparejamientos de nucleótidos unidos por enlaces de hidrógeno: A:T y C:G (para ADN); y A:U y C:G (para ARN). Por ejemplo, dos o más hebras de moléculas de ácido nucleico complementarias pueden tener el mismo número de nucleótidos (es decir, tienen la misma longitud y forman una región bicatenaria, con o sin un saliente) o pueden tener un número diferente de nucleótidos (por ejemplo, una hebra puede ser más corta, pero estar completamente contenida dentro de otra hebra o una hebra puede sobresalir de la otra hebra). Se forman emparejamientos erróneos entre dos bases nucleotídicas cualesquiera que, juntas, no forman uno de los pares de bases estándar con enlaces de hidrógeno de Watson y Crick de A:U (en ^a Rⁿ ), A:T (en ADN) y C:G (tanto en ARN como en ADN). En particular, el inhibidor de miR-9 de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico complementaria a al menos una parte de la secuencia del miR-9. El inhibidor de miR-9 de ácido nucleico puede comprender una secuencia de ácido nucleico complementaria a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 nucleótidos contiguos del miR-9.

En particular, el inhibidor de miR-9 de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con una secuencia complementaria (es decir, de antisentido) del miR-9. De acuerdo con la divulgación, una primera secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 70 % de identidad con una segunda secuencia de ácido nucleico significa que la primera secuencia tiene un 70; 71; 72; 73; 74; 75; 76; 77; 78; 79; 80; 81; 82; 83; 84; 85; 86; 87; 88; 89; 90; 91; 92; 93; 94; 95; 96; 97; 98; 99 o 100 % de identidad con la segunda secuencia de ácido nucleico. La identidad de secuencia se mide con frecuencia en términos de porcentaje de identidad (o similitud u homología); cuanto mayor sea el porcentaje, más similares serán las dos secuencias. Los procedimientos de alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. Se describen diversos programas y algoritmos de alineación en: Smith y Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482, 1981; Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443, 1970; Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:2444, 1988; Higgins y Sharp, Gene, 73:237-244, 1988; Higgins y Sharp, CABIOS, 5:151-153, 1989; Corpet et al. Nuc. Acids Res., 16:10881-10890, 1988; Huang et al., Comp. Appls Biosci., 8:155-165, 1992; y Pearson et al., Meth. Mol. Biol., 24:307-31, 1994). Altschul et al., Nat. Genet., 6:119-129, 1994, presenta una consideración detallada de los procedimientos de alineación de secuencias y cálculos de homología. A modo de ejemplo, las herramientas de alineación ALIGN (Myers y Miller, CABIOS4:11-17, 1989) o LFASTA (Pearson y Lipman, 1988) se pueden usar para realizar comparaciones de secuencias (Internet Program® 1996, ^w R Pearson y la Universidad de Virginia, fasta20u63 versión 2.0u63, fecha de lanzamiento diciembre de 1996). ALIGN compara secuencias completas entre sí, mientras que LFASTA compara regiones de similitud local. Estas herramientas de alineación y sus respectivos tutoriales están disponibles en Internet en el sitio web de NCSA, por ejemplo. De forma alternativa, para comparaciones de secuencias de aminoácidos de más de aproximadamente 30 aminoácidos, se puede emplear la función de secuencias Blast 2 usando la matriz BLOSUM62 predeterminada establecida para parámetros predeterminados (coste de existencia de hueco de 11 y un coste de hueco por residuo de 1). Al alinear péptidos cortos (menos de alrededor de 30 aminoácidos), el alineamiento se debe realizar usando la función de secuencias Blast 2, empleando la matriz PAM30 establecida para parámetros predeterminados (penalizaciones de abertura de hueco de 9, de extensión de hueco de 1). El sistema de comparación de secuencias BLAST está disponible, por ejemplo, en el sitio web de NCBI; véase también Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990; Gish. y States, Nature Genet., 3:266-272, 1993; Madden et al. Meth. Enzymol., 266:131-141, 1996; Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997; y Zhang y Madden, Genome Res., 7:649-656, 1997. Por tanto, en particular, el inhibidor de miR-9 de ácido nucleico comprende una secuencia complementaria al miR-9. En particular, el inhibidor de miR-9 de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que difiere de la secuencia complementaria (es decir, de antisentido) del miR-9 en un máximo de 10 (por ejemplo, un máximo de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1) posiciones nucleotídicas. En particular, el inhibidor de miR-9 de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que difiere de la secuencia complementaria (es decir, de antisentido) del miR-9 en un máximo de 5 (por ejemplo, un máximo de 4, 3, 2 o 1) posiciones nucleotídicas. Por tanto, dicha secuencia de ácido nucleico es idéntica a la secuencia complementaria (es decir, de antisentido) del miR-9 excepto por un número limitado de posiciones nucleotídicas. En particular, el inhibidor de miR-9 de ácido nucleico, como se describe anteriormente, tiene una longitud máxima de 60 (por ejemplo, 55, 50, 45, 40, 35, 30 o 25) nucleótidos.

En particular, el inhibidor de miR-9 de ácido nucleico es un antagomiR de miR-9. Como se usa en el presente documento, un "antagomiR" es un oligómero de ácido nucleico que está diseñado para que se una a un microARN diana específico por medio del emparejamiento de bases complementarias (por ejemplo, como se describe anteriormente). Un antagomiR puede tener una secuencia que sea total o parcialmente complementaria a la secuencia diana del microARN. Los antagomiR pueden tener una estructura monocatenaria, bicatenaria, parcialmente bicatenaria o de horquilla. Los antagomiR pueden comprender además nucleótidos modificados químicamente (por ejemplo, como se describe a continuación). Los procedimientos para diseñar y crear antagomiR son conocidos en la técnica.

En particular, el inhibidor de miR-9 de ácido nucleico es una esponja de microARN miR-9. Como se usa en el presente documento, la expresión "esponja de microARN" es un ácido nucleico que comprende múltiples (por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5 o 6) sitios de unión para un microARN diana específico. Por tanto, una esponja de microARN se puede unir a y secuestrar múltiples moléculas de microARN diana. Una esponja de microARN puede comprender un ARNm expresado a partir de un vector (por ejemplo, un vector vírico o vector plasmídico). La presencia en una esponja de microARN de múltiples sitios de unión para el microARN diana permite que los microARN se adsorban de una manera análoga a una esponja que se empapa de agua. Una esponja de microARN se puede unir a microARN diana por medio del emparejamiento de bases complementarias (por ejemplo, como se describe anteriormente). Por tanto, una esponja de microARN puede comprender múltiples (por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5 o 6) secuencias de ácido nucleico, siendo cada secuencia complementaria a al menos una parte de la secuencia diana del microARN. Una esponja de microARN puede comprender múltiples (por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5 o 6) secuencias de ácido nucleico, en la que cada secuencia es complementaria a la secuencia diana del microARN. Los procedimientos para diseñar y crear esponjas de microARN son conocidos en la técnica. En particular, el inhibidor de miR-9 de ácido nucleico que comprende dos o más secuencias de ácido nucleico, en el que cada una de dichas dos o más secuencias de ácido nucleico tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con la secuencia complementaria (es decir, de antisentido) de miR-9 es una esponja de microARN miR-9.

Por tanto, en particular, el inhibidor de miR-9 de ácido nucleico no se une directamente a miR-9, sino que, en su lugar, se une a un sitio diana del ARNm de miR-9 en la secuencia de ácido nucleico de ANO1. Esto tiene el efecto de bloquear dicho sitio diana (por ejemplo, por interferencia estérica), evitando su reconocimiento y unión por el miR-9 e inhibiendo, por tanto, el miR-9 y sus acciones. A diferencia de la unión del miR-9 a un sitio diana del ARNm, la unión del inhibidor de miR-9 de ácido nucleico de la divulgación a un sitio diana del ARNm de miR-9 no induce silenciamiento génico (por ejemplo, por degradación de ARNm o represión traduccional) de dicho ARNm diana. En particular, el sitio diana del ARNm de miR-9 está localizado en una UTR 3' de ANO1. En particular, el inhibidor de miR-9 es un bloqueador de sitios diana (TSB - del inglés Target Site Blocker). La unión del inhibidor de miR-9 de ácido nucleico a un sitio diana del ARNm de miR-9 se puede producir por medio del emparejamiento de bases complementarias, como se describe anteriormente. Por tanto, en particular, la unión entre el inhibidor de miR-9 de ácido nucleico y el sitio diana del ARNm de miR-9 se produce por medio del apareamiento de bases complementarias entre al menos un nucleótido presente en el inhibidor de miR-9 de ácido nucleico y un nucleótido correspondiente presente en el sitio diana del ARNm de miR-9, de modo que al menos una parte del inhibidor de miR-9 de ácido nucleico y el sitio diana del ARNm de miR-9 definen juntos una estructura bicatenaria de ácido nucleico con emparejamiento de bases. Dicho emparejamiento de bases complementarias (y, por tanto, la formación de estructuras bicatenarias) se puede producir sobre una región de dos o más nucleótidos contiguos del sitio diana del ARNm de miR-9 (por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 nucleótidos contiguos). Una estructura bicatenaria de ácido nucleico con emparejamiento de bases formada cuando el inhibidor de miR-9 de ácido nucleico se une a la diana del ARNm de miR-9 (como se describe anteriormente) puede comprender uno o más emparejamientos erróneos. En particular, se forman dos o más regiones de estructura bicatenaria de ácido nucleico con emparejamiento de bases complementarias (por ejemplo, 3, 4, 5 o 6), en las que cada región está separada de la siguiente por uno o más emparejamientos erróneos. En particular, el sitio diana del ARNm está localizado en la UTR (región no traducida) 3' del ARNm de ANO1 diana. En particular, cuando el inhibidor de miR-9 de ácido nucleico compite con el miR-9 por la unión a un sitio diana del ARNm de miR-9, el ácido nucleico comprende la secuencia de ácido nucleico TTTTCTCCGTCTTTGGGACCT (SEQ ID NO: 3). Por tanto, dicha secuencia de ácido nucleico se unirá al sitio diana del ARNm de miR-9 en ANO1 por medio de la unión complementaria en la localización a la que se dirige la región de inicio del miR-9, evitando, por tanto, que se una el miR-9.

En particular, el inhibidor de miR-9 de ácido nucleico es un ARN interferente pequeño (ARNip) que está dirigido contra el miR-9. Como se usa en el presente documento, el término "ARNip" tiene su significado general en la técnica y se refiere a un ARN interferente bicatenario. El ARNip útil en los presentes procedimientos comprende ARN bicatenario corto de aproximadamente 17 nucleótidos a aproximadamente 29 nucleótidos de longitud, preferentemente de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos de longitud. El ARNip comprende una hebra de ARN de sentido y una hebra de ARN de antisentido complementaria hibridadas juntas mediante interacciones estándar de emparejamiento de bases de Watson y Crick (a continuación en el presente documento, "con emparejamiento de bases"). La hebra de sentido comprende una secuencia de ácido nucleico que es sustancialmente idéntica a una secuencia de ácido nucleico contenida dentro del miARN diana. Como se usa en el presente documento, una secuencia de ácido nucleico en un ARNip que es "sustancialmente idéntica" a una secuencia diana contenida dentro del ARNm diana es una secuencia de ácido nucleico que es idéntica a la secuencia diana, o que difiere de la secuencia diana en uno o dos nucleótidos. Las hebras de sentido y de antisentido del ARNip pueden comprender dos moléculas de ARN monocatenarias complementarias, o pueden comprender una sola molécula en la que dos partes complementarias están con emparejamiento de bases y están unidas covalentemente por una sección de "horquilla" monocatenaria. El ARNip también puede ser ARN alterado que difiere del ARN de origen natural por la adición, deleción, sustitución y/o alteración de uno o más nucleótidos. Dichas alteraciones pueden incluir la adición de material no nucleotídico, tal como en el o los extremos del ARNip o en uno o más nucleótidos internos del ARNip, o modificaciones que hacen que el ARNip sea resistente a la digestión con nucleasas, o la sustitución de uno o más nucleótidos en el ARNip con desoxirribonucleótidos. Una o ambas hebras del ARNip también pueden comprender un saliente 3. Como se usa en el presente documento, un "saliente 3'" se refiere a al menos un nucleótido desemparejado que se extiende desde el extremo 3' de una hebra de ARN en estructura bicatenaria. Por tanto, en particular, el ARNip comprende al menos un saliente 3' de 1 a aproximadamente 6 nucleótidos (que incluye ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos) de longitud, preferentemente de 1 a aproximadamente 5 nucleótidos de longitud, más preferentemente de 1 a aproximadamente 4 nucleótidos de longitud y, de forma particularmente preferente de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 nucleótidos de longitud. En particular, el saliente 3' está presente en ambas hebras del ARNip y tiene 2 nucleótidos de longitud. Por ejemplo, cada hebra del ARNip puede comprender salientes 3' de ácido ditimidílico ("TT") o ácido diuridílico ("uu").

El inhibidor de miR-9 de ácido nucleico de la divulgación puede ser un ácido ribonucleico (ARN) o un ácido desoxirribonucleico (ADN), o puede comprender tanto ARN como ADN. Por tanto, en cierto modo, un inhibidor de miR-9 de ácido nucleico (como se describe anteriormente) comprende ARN. En particular, un inhibidor de miR-9 de ácido nucleico (como se describe anteriormente) comprende ADN. A menos que se indique específicamente de otro modo, las secuencias de ácido nucleico en el presente documento están escritas en la dirección 5'-3'. Como entendería un experto en la técnica, las secuencias de ácido nucleico escritas como ARN y que contienen el nucleótido U se pueden escribir igualmente como ADN sustituyendo U por T. Una referencia a uno o más ácidos nucleicos y/o nucleótidos abarca uno o más ácidos nucleico modificados y nucleótidos modificados. Por ejemplo, un ácido nucleico o nucleótido se puede modificar para incrementar la estabilidad de dicho ácido nucleico o nucleótido, por ejemplo, mejorando la resistencia a la degradación por nucleasa. En particular, un ácido nucleico modificado comprende un nucleótido de ácido nucleico bloqueado (ANB). Con más detalle, el resto de ribosa de un nucleótido de ANB se modifica con un puente adicional que conecta el oxígeno 2' y el carbono 4'. El puente "bloquea" la ribosa en la conformación 3'-endo (Norte), que a menudo se encuentra en las estructuras bicatenarias de ácidos nucleicos en forma A-. Los nucleótidos de ANB se pueden mezclar con residuos de ADN o ARN en un oligonucleótido siempre que se desee. La conformación de ribosa bloqueada potencia el apilamiento de la base y la preorganización de la cadena principal. Esto incrementa significativamente las propiedades de hibridación (temperatura de fusión) de los oligonucleótidos. Otros ejemplos de nucleótidos modificados incluyen 2'-metoxietoxi (MOE) nucleótidos; 2'-metil-tio-etil, 2'-desoxi-2'-fluoro nucleótidos. 2'-desoxi-2'-cloro nucleótidos, 2'-azido nucleótidos y 2'-O-metil nucleótidos. Una molécula de ácido nucleico de la divulgación también se puede conjugar con uno o más restos de colesterol. Por tanto, en particular, el inhibidor de miR-9 de ácido nucleico se conjuga con al menos un resto de colesterol (por ejemplo, 1, 2, 3 o 4). Se puede construir un inhibidor de miR-9 de ácido nucleico de la divulgación de modo que todos sus nucleótidos sean nucleótidos modificados. Por tanto, en particular, el inhibidor de miR-9 de ácido nucleico consiste en nucleótidos modificados. En particular, dichos nucleótidos modificados consisten en nucleótidos de ANB, o nucleótidos 2'-O-metilmodificados, o nucleótidos 2'-O-metoxietilmodificados, o nucleótidos 2'-fluoromodificados. En particular, el inhibidor de miR-9 de ácido nucleico es un oligonucleótido sintético de 2'-O-metil ARN, y que compite con los ARNm diana de miR-9 con una unión más fuerte al complejo de silenciamiento génico asociado a miARN. Los análogos de ácido nucleico están compuestos de tres partes: una cadena principal de fosfato, un glúcido pentosa en forma de pliegue, ribosa o desoxirribosa, y una de las cuatro bases nucleotídicas. Un análogo puede tener cualquiera de estas alterada. Típicamente, las bases nucleotídicas análogas confieren, entre otras cosas, propiedades de emparejamiento de bases y apilamiento de bases diferentes. Ejemplos incluyen bases universales, que se pueden emparejar con las cuatro bases canónicas, y análogos de la cadena principal de fosfato-glúcido, tal como APN, que afectan a las propiedades de la cadena. Los ácidos nucleicos artificiales incluyen ácido peptidonucleico (APN), morfolino y ANB, así como ácido glicolnucleico (AGN) y ácido treosanucleico (ATN). Cada uno de estos se distingue del ADN o el ARN de origen natural por cambios en la cadena principal de la molécula. Por tanto, en particular, el inhibidor de miR-9 de ácido nucleico (como se describe anteriormente) es un análogo de ácido nucleico seleccionado de: un ácido peptidonucleico (APN), un ácido glicolnucleico (AGN), un ácido treosanucleico (ATN) y un morfolino. El inhibidor de miR-9 de ácido nucleico (como se describe anteriormente) puede comprender al menos un enlace fosfodiéster modificado (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 o 20). En particular, el enlace fosfodiéster modificado es un enlace fosforotioato. En particular, todos los enlaces fosfodiéster son enlaces fosfodiéster modificados.

Las moléculas de ácido nucleico de la divulgación se pueden preparar usando cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica. Por tanto, las moléculas de ácido nucleico se pueden preparar usando técnicas de síntesis química. De forma alternativa, las moléculas de ácido nucleico de la divulgación se pueden preparar usando técnicas de biología molecular.

En un aspecto, la divulgación proporciona un vector de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de miR-9 de ácido nucleico como se describe anteriormente. Por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico de la presente divulgación se pueden administrar a una célula diana usando un vector vírico. El vector vírico puede ser cualquier virus que pueda servir como vector vírico. Los virus adecuados son aquellos que infectan las células diana, se pueden propagar in vitro y se pueden modificar por tecnología de nucleótidos recombinantes conocida en la técnica. Por tanto, en un aspecto, la divulgación proporciona un vector vírico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de miR-9 de ácido nucleico (como se describe anteriormente), para su uso en la prevención o tratamiento de la fibrosis quística en un sujeto. Vectores víricos adecuados para su uso en la presente divulgación incluyen vectores poxvíricos (tales como vectores poxvíricos no replicantes), vectores adenovíricos y vectores víricos adenoasociados (AAV). Como se usa en el presente documento, un "vector vírico no replicante" es un vector vírico que carece de la capacidad de replicarse productivamente después de la infección de una célula diana. Por tanto, la capacidad de un vector vírico no replicante de producir copias de sí mismo después de la infección de una célula diana (tal como una célula diana humana en un individuo que se somete a vacunación con un vector vírico no replicante) está altamente reducida o ausente. Dicho vector vírico también se puede denominar atenuado o de replicación insuficiente. La causa puede ser la pérdida/deleción de genes esenciales para la replicación en la célula diana. Por tanto, un vector vírico no replicante no puede producir copias de sí mismo de forma eficaz tras la infección de una célula diana. Por tanto, los vectores víricos no replicantes pueden tener de forma ventajosa un perfil de seguridad mejorado en comparación con los vectores víricos replicación suficiente. Un vector vírico no replicante puede conservar la capacidad de replicarse en células que no son células diana, lo que permite la producción del vector vírico. A modo de ejemplo, un vector vírico no replicante (por ejemplo, un vector poxvírico no replicante) puede carecer de la capacidad de replicarse productivamente en una célula diana, tal como una célula de mamífero (por ejemplo, una célula humana), pero conservar la capacidad de replicarse (y, por tanto, permitir la producción de vectores) en una célula aviar (por ejemplo, un fibroblasto de embrión de pollo, o célula CEF). En particular, el vector poxvírico no replicante se selecciona de: un vector de virus variolovacunal modificado Ankara (MVA), un vector de virus variolovacunal NYVAC, un vector de virus de la viruela del canario (ALVAC) y un vector de virus de la viruela aviar (FPV). El MVA y NYVAC son ambos derivados atenuados del virus variolovacunal. En comparación con el virus variolovacunal, el MVA carece de aproximadamente 26 de los aproximadamente 200 marcos abiertos de lectura. En particular, el vector adenovírico es un vector adenovírico no replicante (en el que no replicante se define como anteriormente). Los adenovirus pueden convertirse en no replicantes mediante la deleción de las regiones génicas El o tanto E1 como E3. En particular, el vector adenovírico se selecciona de: un vector adenovírico humano, un vector adenovírico de simio, un vector adenovírico del grupo B, un vector adenovírico del grupo C, un vector adenovírico del grupo E, un vector adenovírico 6, un vector PanAd3, un vector adenovírico C3, un vector ChAdY25, un vector AdC68 y un vector Ad5.

De acuerdo con la divulgación, el inhibidor de miR-9 de ácido nucleico se administra al sujeto usando cualquier procedimiento adecuado que permita que el inhibidor de miR-9 de ácido nucleico llegue a los pulmones. El inhibidor de miR-9 de ácido nucleico (como se describe anteriormente) se puede administrar a un sujeto por cualquier medio adecuado conocido en la técnica. En particular, el inhibidor de miR-9 de ácido nucleico (como se describe anteriormente) se administra al sujeto sistémicamente (es decir, por medio de administración sistémica). Por tanto, en particular, el inhibidor de miR-9 de ácido nucleico (como se describe anteriormente) se administra al sujeto de modo que se introduzca en el sistema circulatorio y se distribuya por todo el cuerpo. En particular, el inhibidor de miR-9 de ácido nucleico (como se describe anteriormente) se administra al sujeto mediante administración local, por ejemplo, mediante administración local a los pulmones.

En particular, el inhibidor de miR-9 de ácido nucleico se administra mediante cualquier dispositivo adaptado para introducir una o más composiciones terapéuticas en las vías respiratorias superiores y/o inferiores. Los dispositivos se pueden adaptar para administrar las composiciones terapéuticas de la divulgación en forma de una bruma finamente dispersa de líquido, espuma o polvo. El dispositivo puede usar un efecto piezoeléctrico o vibración ultrasónica para expulsar el polvo adherido a una superficie, tal como una cinta, para generar una bruma adecuada para la inhalación. Los dispositivos pueden usar cualquier sistema propulsor conocido por los expertos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, bombas, gas licuado, gas comprimido y similares. Los dispositivos de la presente divulgación típicamente comprenden un recipiente con una o más válvulas a través de las que viaja el flujo de la composición terapéutica y un accionador para controlar el flujo. Los dispositivos adecuados para administrar las construcciones de la divulgación incluyen inhaladores y nebulizadores. Se encuentran disponibles comercialmente diversos diseños de inhaladores y se pueden emplear para administrar los medicamentos de la divulgación. Estos incluyen los dispositivos Accuhaler, Aerohaler, Aerolizer, Airmax, Autohaler, Clickhaler, Diskhaler, inhalador Easi-Breathe, Fisonair, Integra, inhalador Jet, Miat-haler, inhalador Novolizer, inhalador Pulvinal, Rotahaler, Spacehaler, Spinhaler, inhalador Syncroner y Turbohaler. Por tanto, en particular, la administración se realiza por medio de un nebulizador u otro dispositivo de aerosolización siempre que se mantenga la integridad del inhibidor de miR-9 de ácido nucleico.

El inhibidor de miR-9 de ácido nucleico se puede administrar al sujeto en una sola administración, tal como una administración por inyección intravenosa rápida. De forma alternativa, el inhibidor de miR-9 de ácido nucleico se puede administrar al sujeto usando una técnica de administración continua, tal como una infusión de liberación mantenida. El inhibidor de miR-9 de ácido nucleico se puede administrar usando una pauta de administración repetida, por ejemplo, cada hora, diaria o semanalmente. Las dosificaciones de inhibidor de miR-9 de ácido nucleico se pueden lograr mediante una sola administración o múltiples administraciones. A modo de ejemplo, el inhibidor de miR-9 de ácido nucleico se puede administrar al sujeto en una pauta que consiste en una sola administración. De forma alternativa, el inhibidor de miR-9 de ácido nucleico se puede administrar al sujeto en una pauta que comprende múltiples administraciones. Por ejemplo, una pauta de administración puede comprender múltiples administraciones al día o administraciones diarias, semanales, quincenales o mensuales. Una pauta de ejemplo comprende una administración inicial seguida de múltiples administraciones posteriores a intervalos semanales o quincenales. Otra pauta de ejemplo comprende una administración inicial seguida de múltiples administraciones posteriores a intervalos mensuales o bimensuales. De forma alternativa, la administración del inhibidor de miR-9 de ácido nucleico se puede guiar supervisando los síntomas de FQ en el sujeto. Por tanto, una pauta de ejemplo comprende una administración inicial seguida de múltiples administraciones posteriores llevadas a cabo de forma irregular según se determina supervisando los síntomas de FQ en el sujeto. Los procedimientos para administrar ácidos nucleicos son conocidos en la técnica y resultarán habituales para una persona experta. A modo de ejemplo, los procedimientos de administración de ácidos nucleicos adecuados incluyen ionoforesis, microesferas (por ejemplo, microesferas bioadhesivas), nanopartículas, polímeros dendríticos, liposomas, hidrogeles, ciclodextrinas y vectores proteínicos.

Por una "cantidad terapéuticamente eficaz" del inhibidor de miR-9 de ácido nucleico como se describe anteriormente se entiende una cantidad suficiente del inhibidor para alcanzar un efecto terapéutico. Sin embargo, se entenderá que el médico especialista decidirá el uso diario total de los compuestos y composiciones de la presente divulgación dentro del alcance del criterio médico razonable. El nivel de dosis específico terapéuticamente eficaz para cualquier sujeto particular dependerá de una variedad de factores que incluyen el trastorno que se está tratando y la gravedad del trastorno; la actividad del compuesto específico empleado; la composición específica empleada, la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo y la dieta del sujeto; el momento de administración, la vía de administración y la tasa de excreción del compuesto específico empleado; la duración del tratamiento; fármacos usados en combinación o en coincidencia con el inhibidor específico usado; y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas. Por ejemplo, está muy dentro de las destrezas de la técnica comenzar con dosis del compuesto a niveles más bajos que los requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado e incrementar gradualmente la dosificación hasta que se logre el efecto deseado. Sin embargo, la dosificación diaria de los productos se puede variar sobre un amplio intervalo de 0,01 a 1.000 mg por adulto al día. Típicamente, las composiciones contienen 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, 50,0, 100, 250 y 500 mg del ingrediente activo para el ajuste sintomático de la dosificación al sujeto a tratar. Un medicamento típicamente contiene de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 500 mg del ingrediente activo, preferentemente de 1 mg a aproximadamente 100 mg del ingrediente activo. Normalmente se suministra una cantidad eficaz del fármaco a un nivel de dosificación de 0,0002 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal al día, especialmente de aproximadamente 0,001 mg/kg a 7 mg/kg de peso corporal al día.

Para la administración a un sujeto, el inhibidor de miR-9 de ácido nucleico (o un vector vírico que codifique dicho inhibidor de miR-9 de ácido nucleico) se puede formular como una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de miR-9 de ácido nucleico (como se describe anteriormente) o un vector (como se describe anteriormente) (como ingrediente activo). Dicha composición farmacéutica se puede formular de acuerdo con procedimientos conocidos para preparar composiciones farmacéuticas, tal como combinando un inhibidor de miR-9 de ácido nucleico o un vector vírico con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Ejemplos no limitantes de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen agua, solución salina y solución salina tamponada con fosfato. La composición farmacéutica, además de un vehículo farmacéuticamente aceptable, se puede combinar además con uno o más de sal, excipiente, diluyente, albúmina, agente inmunorregulador y/o compuesto antimicrobiano. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales de adición de ácido formadas con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico o fosfórico, o con ácidos orgánicos tales como ácido acético, oxálico, tartárico, maleico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también se pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxido de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína y similares. Son excipientes adecuados, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, las composiciones farmacéuticas pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes y/o agentes de tamponación del pH. Ejemplos de agentes de tamponación incluyen, pero no se limitan a, succinato de sodio (pH 6,5) y solución salina tamponada con fosfato (PBS; pH 6,5 y 7,5). Por tanto, en un aspecto, la divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de miR-9 de ácido nucleico (como se describe anteriormente) o un vector vírico (como se describe anteriormente) y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede contener de un 5 % a un 95 % de inhibidor de miR-9 de ácido nucleico o vectores víricos, tal como al menos un 10 %, al menos un 25 %, al menos un 40 % o al menos un 50, 55, 60, 70 o 75 %.

La divulgación se ilustrará además por las siguientes figuras y ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos y figuras no se deben interpretar de ninguna manera como limitantes del alcance de la presente divulgación.

Figuras

Figura 1: La regulación por disminución del ARNm de ANO1 y la regulación por incremento del miR-9 están correlacionadas en las líneas celulares epiteliales bronquiales humanas. a/ Niveles de expresión relativa de ARNm de ANO1 en células epiteliales bronquiales humanas sin FQ (16HBE14o-; n = 5) y con FQ (CFBE41o-; n = 6). Los datos se cuantifican mediante qRT-PCR y se representan como factor de cambio en comparación con los controles normalizados. b/ Expresión de miR-9 en líneas celulares epiteliales bronquiales sin FQ y con FQ medida por qRT-PCR. Los niveles de expresión relativa se normalizaron a RNU6B. Los datos se representan como la media /- DE y se compararon mediante prueba de la t. Todos los experimentos de qRT-PCR se realizaron por triplicado. c/ Correlación negativa entre los niveles de expresión de ARNm de miR-9 y ANO1 en líneas celulares epiteliales bronquiales sin FQ y con FQ (análisis de correlación de Pearson p = 0,012).

Figura 2: El miR-9 regula la expresión de ANO1, la actividad del cloruro de ANO1 y la tasa de migración de células sin FQ. Se transfectaron células sin FQ (16HBE14o-) con un imitador de miR-9 (30 nM) o un control negativo durante 48 h. a/ La expresión de ARNm de ANO1 se analizó por RT-qPCR y se normalizó a GAPDH (n = 3). b/ La expresión de la proteína ANO1 se analizó mediante inmunoelectrotransferencia usando anticuerpo anti-ANO1 y se normalizó a p-actina (n = 3). c/ Actividad del canal de cloruro ANO1 evaluada por extinción de I- de la proteína YFP-H148q/I152L sensible a haluro. Trazos representativos y originales de la actividad del cloruro de ANO1 (izquierda) y cuantificación (derecha) de células sin FQ transfectadas con un imitador de miR-9 o control negativo (n = 8 por triplicado). d/ Imágenes representativas tomadas durante 4 h de cierre de heridas de células sin FQ transfectadas con un imitador de miR-9 o un control negativo (izquierda) y cuantificación de las tasas de migración durante la reparación (n = 5).

Figura 3: El miR-9 se dirige directamente a la UTR 3' de ANO1 en células sin FQ y con FQ. a/ Actividad luciferasa relativa en células sin FQ (16HBE14o-) transfectadas transitoriamente con un vector de luciferasa-UTR 3' de ANO1 o un vector de luciferasa-UTR 3' de ANO1 mutado para sitios de unión de miR-9 y cotransfectadas con un imitador de miR-9 (imita miR-9) o un control negativo (control). La actividad luciferasa de luciérnaga se normalizó a la actividad luciferasa de Renilla (n = 3 con 8 repeticiones). b/ Actividad luciferasa relativa en células con FQ (CFBE41o-) transfectadas transitoriamente con un vector de luciferasa-UTR 3' de ANO1 o un vector de luciferasa-UTR 3' de ANO1 mutado para sitios de unión de miR-9 y cotransfectadas con un inhibidor de miR-9 (inh. miR-9) o un control negativo (control). La actividad luciferasa de luciérnaga se normalizó a la actividad luciferasa de Renilla (n = 3 con 8 repeticiones). Los histogramas representan el valor promedio /- DE y se compararon mediante prueba de la t.

Figura 4: TSB específico permite incrementar la expresión de ANO1, la actividad del cloruro y la tasa de migración de células con FQ. Se transfectaron células con FQ (CFBE41o-) con un ANB de control (control) o TSB de ANO1 durante 24 h. a/ La expresión de la proteína ANO1 se analizó y se cuantificó por inmunoelectrotransferencia usando anticuerpo anti-ANO1 y se normalizó a p-actina (n = 4). b/ Cinética de extinción de la proteína YFP-H148Q/I152L después de la inyección de I- en el medio. A las 24 h después de la transfección con el plásmido de YFP-H148Q/I152L, las células se microinyectan selectivamente con el control o TSB de ANO1 como se indica en las imágenes. Barra de escala de 5 pm. c/ Trazos representativos y originales de la actividad del cloruro de ANO1 (izquierda) y cuantificación (derecha) de células epiteliales bronquiales con FQ transfectadas con TSB de ANO1 o un control negativo (n = 8 por triplicado) y en comparación con células sin FQ (16HBE14o-). d/ Tasas de migración durante la reparación de células con FQ. Se tomaron imágenes representativas durante 4 h de cierre de heridas de las células con FQ (izquierda) y cuantificación (derecha) (n = 5). Barra de escala de 10 pm. Los histogramas representan el valor promedio /- DE y se compararon mediante prueba de la t.

Figura 5: TSB específico permite incrementar la expresión de ANO1, la actividad del cloruro y la tasa de migración de células con FQ primarias. Se transfectaron células epiteliales bronquiales humanas primarias (hAECB) y cultivos en interfase de aire-líquido bronquiales humanos completamente diferenciados, aislados de biopsias bronquiales de pacientes con FQ (F508del/F508del) con un ANB de control (control) o TSB de ANO1 todos los días durante 3 días: a/ Análisis microscópico confocal de TSB conjugado con fluoresceína transfectado en las células bronquiales humanas aisladas de un paciente con FQ (verde). El núcleo se tiñó con DAPI (azul) y se muestran imágenes combinadas. Barras de escala de 10 pm. b/ La expresión de la proteína ANO1 se analizó y se cuantificó mediante inmunoelectrotransferencia usando anticuerpo anti-ANO1 y se normalizó a p-actina (n = 6). c/ Trazos representativos y originales de la actividad del cloruro de ANO1 (izquierda) y cuantificación (derecha) de células hAECB con FQ transfectadas con TSB de ANO1 o un control negativo (n = 4). d/ Tasas de migración durante la reparación de células primarias con FQ. Se tomaron fotografías representativas durante 4 h de cierre de heridas de las células con FQ (izquierda) y cuantificación (derecha) (n = 4). Barra de escala de 20 pm. e/ Efecto del control o TSB de ANO1 sobre la dinámica del moco después de 30 días de transfección. Se cuantificaron los movimientos de 100 microesferas para cada condición y se determinó la velocidad promedio en pm/ms. Barra de escala de 40 pm. Los histogramas representan el valor promedio /- DE y se compararon mediante prueba de la t.

Figura 6: El uso de TSB específico se tolera bien en ratones e incrementa la actividad del cloruro de ANO1 en ratones con FQ. a/ Trazos representativos y originales de la actividad del cloruro de ANO1 (izquierda) y cuantificación (derecha) de células MLE15 transfectadas con un ANB de control (control) o TSB de ANO1. b/ Plan del experimento para ratones con FQ. La instilación intranasal de un control o TSB de ANO1 se realizó en los días 7 y 14 después de la recepción y los ratones se sacrificaron en el día 21. c/ Curvas de crecimiento de los ratones desde el día de la recepción. Las flechas representan la instilación intranasal. d/ Trazos representativos y originales de la actividad del cloruro de ANO1 (izquierda) y cuantificación (derecha) de células aisladas de ratones con FQ instilados con TSB de ANO1 o un control negativo.

Figura 7: El TSB específico incrementa la actividad del cloruro de ANO1 de las células de la glándula bronquial humana con fibrosis quística. Se transfectaron células de la glándula bronquial humana con fibrosis quística (KM4) con un ANB de control (control) o TSB de ANO1 durante 24 h. Trazos representativos y originales de la actividad del cloruro de ANO1 (izquierda) y cuantificación (derecha) de las células de la glándula bronquial con FQ. La cuantificación se obtuvo de 3 experimentos diferentes con 24 pocillos/experimento/condición.

Ejemplo

Material y procedimientos

Análisis bioinformático de miARN se dirige a genes

La función de los miARN en la regulación de la expresión de ANO1 se ha examinado usando estudios informáticos que demostraron que se predice que la UTR 3' de ANO1 contiene numerosas regiones de inicio reconocidas por una variedad de miARN. Los supuestos miR predichos para el ARNm de ANO1 se identificaron y compararon usando el algoritmo de predicción de dianas en línea: Targetscan (http://www.targetscan.org), Pictar (http://pictar.mdc-berlin.de), miRDB (http://mirdb.org/miRDB) y miRANDA (http://www.microrna.org). Los navegadores de genoma de NCBI y Ensembl (http://www.ensembl.org/index.html) proporcionaron información del gen ANO1 humano (NM_018043; ENST00000355303).

Cultivo celular

Las líneas celulares epiteliales bronquiales humanas 16HBE14o-(sin FQ) y CFBE41o-(con FQ) se obtuvieron como obsequio del Dr. D.C. Gruenert (San Francisco, CA, EE. UU.) y se cultivaron en MEM que contenía suero de crecimiento bovino al 10 % y penicilina/estreptomicina al 1 %. Los cultivos celulares se hicieron crecer y se mantuvieron a 37 °C en una estufa de incubación humidificada con CO2 al 5 %. Las células epiteliales bronquiales humanas primarias (hAECB) son cultivos en interfase de aire-líquido bronquiales humanos completamente diferenciados (MucilAir™), aislados de biopsias bronquiales de pacientes con FQ (F508del/F508del), se adquirieron de Epithelix SARL (Ginebra, Suiza) y se cultivaron de acuerdo con las recomendaciones del proveedor.

Transfección celular: imitador, inhibidor y bloqueador de sitios diana

Se transfectaron líneas celulares sin FQ y con FQ con imitador de miR-9, inhibidor de miR-9 o control negativo (Thermo Fischer Scientific, Francia) usando HiPerfect (Qiagen, Francia) a 30 nM de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células se lisaron para la extracción de los miARN y los ARN o la extracción de proteínas. Las líneas celulares con FQ se transfectaron con oligonucleótidos potenciados con ANB diseñados para que se superpongan al sitio diana de miR-9 en la UTR 3' de ANO1 (TSB de ANO1) o con un control negativo de inhibidor de microARN de ANB (ácido nucleico bloqueado) miRCURY (control de ANB) (Exiqon, Dinamarca) usando Interferin (Polyplus, Ozyme, Francia). A las 24 h después de la transfección, las células se lisaron para la extracción de proteínas, o se realizaron experimentos para la actividad del cloruro o ensayos de migración. Se transfectaron células hAECB añadiendo medio que contenía ANB de control o TSB de ANO1 sin ningún reactivo de transfección al compartimento superior de células en ALI (interfase de aire-líquido). Después de 2 h a 37 °C, se retiró el medio del compartimento superior para restablecer la condición de ALI. Se añadieron controles de ANB recién preparados o TSB de ANO1 todos los días durante tres días y se evaluó la expresión de ANO1, la actividad del cloruro de ANO1 y la migración 24 horas después del tratamiento.

Ensayo de luciferasa

Para estos experimentos, se usó el plásmido de luciferasa ANO1-3'UTR-pMirTarget Vector (Origene Technologies, Rockville, EE. UU.) y un vector ANO1 3'UTR-pMir mutado mutagenizado en la región de inicio de miR-9 (MIMAT0000441). Se sembraron células con FQ y sin FQ en placas de 24 pocillos y se transfectaron al día siguiente con 0,5 pg de vector pMir y 0,1 pg de vector de luciferasa de Renilla usando Exgen 500 (Euromedex, Francia). Las células se cotransfectaron con 30 nM de imitador de miR-9, un inhibidor de miR-9 o un control negativo (Thermo Fischer Scientific, Francia). Los lisados se prepararon 48 horas después de la transfección y se analizaron para luciferasa tanto de luciérnaga como de Renilla usando un sistema de ensayo de luciferasa (Promega, Francia). La actividad luciferasa de luciérnaga se normalizó a la actividad luciferasa de Renilla.

Extracción de ARN y miARN y análisis por RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR)

Los ARN y miARN se extrajeron usando el kit Macherey-Nagel (Düren, Alemania). La retrotranscripción (RT) para miR-9 y RNU6B humanos se llevó a cabo con el kit de ensayo de microARN TaqMan (Thermo Fischer Scientific) usando una muestra de miARN de 20 ng. La RT para ANO1 y GAPDH se realizó usando un kit de retrotranscripción de ADNc de alta capacidad (Thermo Fischer Scientific) usando una muestra de ARN de 1 pg. La PCR cuantitativa se realizó utilizando un ABI StepOnePlus™ (Thermo Fischer Scientific) y tecnología TaqMan. Para la cuantificación relativa, el nivel de ARNm de ANO1, calculado usando el procedimiento 2-AACt, se normalizó a GAPDH y los niveles de expresión de los respectivos modelos sin FQ y el nivel de miR-9 se normalizaron para RNU6B. Cada muestra se evaluó por triplicado para garantizar la calidad del experimento. Análisis por inmunoelectrotransferencia

Como se detalla previamente, se redujeron 20 pg de extracto de proteínas totales y se separaron por tamaño en geles de poliacrilamida con SDS al 8 % y a continuación se transfirieron a membranas de PVDF (Bio-Rad, Marnes-la-Coquette, Francia), bloqueadas en BSA al 5 % (PAA, Les Mureaux, Francia). A continuación, las membranas se incubaron con anticuerpos primarios específicos contra ANO1 (Abcam, París, Francia) y p-actina (Sigma, Saint Quentin Fallavier, Francia). Las proteínas de interés se detectaron, se tomaron imágenes y se cuantificaron como se describe previamente.

Ensayos de migración

Los ensayos de migración se realizaron usando cámaras de ensayo de heridas específicas (Ibidi, Biovalley, Marne la Vallée, Francia) que proporcionaron heridas uniformes entre dos monocapas. Se sembró un número constante de células que producían una capa confluyente en 72 h en cada pocillo de los insertos de cultivo de silicona Ibidi®. Las células se incubaron a 37 °C y CO2 al 5 %. Después de 24 h, las células se transfectaron con un imitador de miR-9 o un control negativo (Life Technologies, Saint Aubin, Francia) o un TSB de ANO1/control de ANB (Exiqon). El inserto de cultivo se retiró 48 h después, dejando un huevo sin células (o herida) para la colonización celular. Para las células hAECB, las heridas se realizaron usando una punta empapada en nitrógeno líquido. Se observó el cierre de heridas durante 4 h bajo un microscopio Axiovert 200 con una cámara para mantenerlas a 37 °C y CO2 al 5 %. Se evaluaron las tasas medias de migración durante el cierre de heridas en tres zonas del hueco. En cada punto temporal y en cada campo, se midieron cinco longitudes usando el programa informático AxioVision Rel (Zeiss).

Actividad del cloruro de ANO1

La actividad del Cl- de ANO1 se evaluó por extinción de I- de proteína YFP-H148Q/I152L sensible a haluro (Thermo Fischer Scientific). La sonda se transfectó en las células y, después de 48 h de cultivo, se estimuló la conductancia con UTP (10 pM). Se añadió solución de I-(140 mM) y se registró la fluorescencia en un lector de placas como se describe previamente. La tasa de afluencia de I- inicial después de la adición de cada solución se calcula a partir de los cambios en los datos de fluorescencia de YFP usando regresión no lineal y representa los trazos originales y representativos. Para el análisis cuantitativo, la pendiente para la extinción de la fluorescencia se realizó usando regresión lineal y se correlaciona con el tamaño de la conductancia de cloruro (asimilación de I-). La tasa de cambio (AF/min) se usa para la representación del gráfico de barras.

Experimentos de microinyección

Las células se sembraron en placas Ibidi con fondo de vidrio 24 h después de la transfección con la proteína YFP-H148Q/I152L sensible a haluro, se microinyectaron ANO1TSB o TSB de control en células con FQ usando un micromanipulador Xenowork y un microinyector digital (Sutter Instrument, CA, EE. UU.). Para discriminar las diferentes transfecciones, se microinyectó TSB de ANO1 con Dextran Texas Red neutro (Thermo Fischer Scientific). A las 4 h después de la microinyección, la activación de las células por I- se realizó mediante un sistema de microperfusión (Valvelink de Automate Scientific, CA, EE. UU.) y se registró con una lente de aumento x63 en un microscopio Axiovert 200 (Zeiss). La cuantificación se realizó con el programa informático ImageJ (Institutos Nacionales de Salud estadounidenses, ML, EE. UU.).

Animales

Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con nuestro Departamento Institucional de Cuidado y Uso de Animales (aprobación 20150511145844v3 del Comité Ético para el Cuidado de Animales de Laboratorio Charles Darwin Francia). El estudio se llevó a cabo en ratones macho Cftrtm1Eur de modelo de ratón de FQ homocigóticos para la mutación F5058del en el acervo genético exogámico de 129/FVB F508del-CFTR y sus hermanos de camada normales. Los animales se mantuvieron en la instalación de ratones sin patógenos específicos de París 6 con acceso a comida y agua a demanda y se registró el peso todos los días. Los ratones se obtuvieron de CDTA-CNRS (Orleans, Francia) después del destete a las 8 semanas de edad. Para minimizar la obstrucción intestinal, se suministró continuamente un laxante osmótico disponible comercialmente que contenía polietilenglicol (PEG-3350) y electrolitos (Movicol®) al 6 % en el agua para beber10. Antes de la instilación, los ratones se anestesiaron con isoflurano al 2,5 % administrado en O2 (2 l/min). La administración intranasal de cada dosis de exposición (una a la semana durante 2 semanas) de TSB (10 mg/kg) se realizó pipeteando la solución sobre el borde exterior de cada orificio nasal de los ratones. Los ratones que recibieron anestesia con isoflurano se retiraron de la cámara de inducción y se realizó la instilación inmediatamente. Después de 7 días desde la última exposición, los ratones se sacrificaron con una dosis mortal de CO2. Después de la exanguinación, se abrió la pared torácica y se aisló la tráquea. El procedimiento del sensor de haluro Premo se realizó en una sección de la tráquea de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y la actividad del cloruro se registró como se describe previamente.

Análisis estadístico

Todos los datos se describen como media ± DE. En las leyendas de las figuras, n indica el número de experimentos repetidos. Las diferencias entre grupos se sometido a prueba usando la prueba de la t de Student. Los valores de p inferiores a 0,05 se consideraron significativos; en las figuras se indican diferencias estadísticamente significativas con p <0,05 (*), p <0,01 (**) y p <0.001 (***).

Resultados

La regulación por disminución de ANO1 y la regulación por incremento de miR-9 están correlacionadas en líneas celulares epiteliales bronquiales humanas.

Previamente demostramos que la expresión y la actividad de ANO1 se disminuyeron en el contexto de FQ en comparación con ausencia de FQ, pero todavía se desconocen los mecanismos involucrados en estas disminuciones. Estamos interesados en microARN (miARN) que son ARN no codificantes pequeños que regulan la expresión génica postranscripcionalmente. Entonces, usamos varias bases de datos con diferentes algoritmos: Targetscan, miRDB, miRANDA y Pictar para predecir miARN que se podrían dirigir a ANO1 y encontramos cuatro miARN en los que se ha predicho que se dirigen a ANO1: miR-9; miR-19a; miR-19b y miR-144. Después de experimentos preliminares, centramos nuestra atención en miR-9, y los demás resultados se incluyeron en los datos complementarios del artículo. La expresión de miR-9 se estudió mediante qRT-PCR usando ensayos de miARN TaqMan y se encontró que estaba aumentada en líneas celulares epiteliales bronquiales con FQ en comparación con las que no tienen FQ (CFBE41o- frente a 16HBE14o-) en contraposición a la expresión de ANO1 (fig.1a y 1b). De forma interesante, usando la prueba de correlación de Pearson, demostramos que los transcritos de ANO1 se asociaron significativamente con los niveles de expresión de miR-9 (p = 0,012) (fig. 1c).

El miR-9 regula ANO1

La expresión incrementada de miR-9 en células con FQ nos llevó a plantear la hipótesis de que ANO1 es una diana directa de miR-9. Por lo que hemos transfectado células sin FQ (16HBE14o-) con un imitador de miR-9, y hemos verificado la eficacia de transfección mediante RT-PCR y usando el procedimiento Smartflare para la expresión de miR (véase los datos complementarios del artículo). También verificamos que la sobreexpresión de miR-9 después de la transfección del imitador de miR-9 es específica para cuantificar otros miR (miR-19a, por ejemplo, datos complementarios). A continuación, se evaluaron los efectos de la sobreexpresión de miR-9 sobre el ARNm de ANO1 y su proteína. Se transfectaron células sin FQ con imitador de miR-9 o un control negativo. En consecuencia a la transfección, la figura 2a muestra que la sobreexpresión de miR-9 (imitador de miR-9) disminuyó significativamente la expresión de ARNm de ANO1 en un promedio de un 60 % en células 16HBE14o-. La expresión de la proteína ANO1 examinada por inmunoelectrotransferencia e inmunocitoquímica también disminuyó significativamente después de la transfección del imitador de miR-9 (fig. 2b). Por tanto, llegamos a la conclusión de que el miR-9 regulaba la expresión de ANO1.

El miR-9 regula la actividad del cloruro de ANO1 y la tasa de migración de las células Posteriormente, quisimos evaluar los efectos de la sobreexpresión de miR-9 sobre la actividad del cloruro de ANO1. La figura 2c muestra que la sobreexpresión de miR-9 da lugar a una disminución de la actividad del cloruro de ANO1. También estudiamos los efectos de la presencia de miR-9 sobre la tasa de migración, ya que nuestro grupo ha demostrado previamente que ANO1 está involucrado en la migración celular. La figura 2n muestra que la sobreexpresión de miR-9 disminuye significativamente la tasa de migración de células sin FQ. Estos resultados demuestran que el miR-9 permite cambiar la actividad del cloruro de ANO1 y la tasa de migración de las células.

El miR-9 regula directamente ANO1

Para probar si el miR-9 reprime la expresión de ANO1 al unirse a su UTR 3', se transfectaron células 16HBE14ocon un vector indicador de luciferasa que contenía la UTR 3' de ANO1 WT (WT-ANO1-3'UTR) o un indicador de control negativo con mutaciones en los sitios de unión predichos para miR-9 (mut-ANO1-3'UTR). La cotransfección con el imitador de miR-9 dio como resultado una disminución significativa en la expresión del gen de luciferasa desde WT-ANO1-3'UTR en comparación con mut-ANO1-3'UTR, lo que demuestra la interacción directa de miR-9-ANO1 en células sin FQ (fig. 3a). Hemos realizado el mismo experimento usando un inhibidor de miR-9 en células CFBE41o_ (fig. 3b) y observamos un incremento significativo en la actividad luciferasa cuando las células con FQ se transfectan con el inhibidor de miR-9 en comparación con el control, mientras no se observaba una diferencia significativa con el plásmido mutado. Por tanto, llegamos a la conclusión de que el miR-9 regula directamente ANO1 en células con FQ.

El uso de TSB específico permite incrementar la expresión de ANO1, la actividad del cloruro y la tasa de migración de las células con FQ

En el contexto de FQ, sería interesante incrementar la expresión de ANO1 para incrementar la actividad del cloruro de ANO1. Como miR-9 tiene muchas dianas en las células, los inhibidores de miR-9 no son específicos, por lo que se diseñó un bloqueador de sitios diana específico (TSB de ANO1) que se unirá a la UTR 3' de ANO1 y evitará la fijación del miR-9. Hemos transfectado células con FQ con control o TSB de ANO1 durante 24 h y después hemos cuantificado la expresión de la proteína ANO1 y hemos observado que la expresión de la proteína ANO1 incrementa significativamente cuando las células se transfectan con TSB de a NO1 (fig. 4a). Mediante experimentos de microinyección asociados a microscopia, podemos observar en el mismo campo una sola célula microinyectada con el control de TSB y otra célula microinyectada con TSB de ANO1 (fig. 4b). En este enfoque, la fluorescencia disminuida asociada con la descarga de cloruro es completamente diferente en las dos células. Es más, mediante un procedimiento más clásico, también cuantificamos la actividad del cloruro de ANO1 usando el procedimiento del sensor de haluro Premo y, sorprendentemente, observamos un incremento significativo en la actividad del cloruro de ANO1 cuando las células se transfectan con TSB de ANO1 (fig. 4c). Es interesante destacar que, en este caso, cuando las células se transfectan con TSB de ANO1, observamos la misma actividad del cloruro que en las células sin FQ. Finalmente, analizamos la migración y encontramos un incremento significativo en la tasa de migración de las células cuando las células se transfectan con TSB de ANO1 en comparación con el control.

El uso de TSB específico permite incrementar la expresión de ANO1, la actividad del cloruro y la tasa de migración de las células con FQ primarias

Para imitar el epitelio in vivo, decidimos transfectar células epiteliales bronquiales humanas primarias (hAECB) y cultivos en interfase de aire-líquido (ALI) bronquiales humanos completamente diferenciados aislados de biopsias bronquiales de pacientes con FQ (F508del/F508del) con control o el TSB de ANO1. Transfectamos con éxito las células añadiendo medio que contenía TSB de ANO1 o control sin ningún reactivo de transfección a la cara apical de las células en ALI (fig. 5a). Después de 2 h a 37 °C, se retiró el medio de la cara apical para restaurar las condiciones de ALI. Se añadieron oligonucleótidos de control recién preparados o TSB de ANO1 durante tres días y se observaron los efectos de la transfección 24 h después del tratamiento. Los resultados de la inmunoelectrotransferencia demostraron que incrementamos significativamente la expresión de ANO1 cuando las células primarias se transfectan con t Sb de ANO1 en comparación con el control (fig. 5b). Además, después de la transfección, observamos un incremento significativo en la actividad del cloruro de ANO1 (fig. 5) y la tasa de migración (fig. 5d) de las células con FQ primarias con TSB de ANO1. También hemos analizado la frecuencia de latido ciliar utilizando microesferas fluorescentes y, de forma interesante, hemos observado un incremento en la tasa promedio de las microesferas con TSB de ANO1. La utilización de TSB de ANO1 en células primarias permite modular los parámetros insuficientes de las células con FQ mejorando la actividad del cloruro de ANO1, la tasa de migración de las células y la frecuencia del latido ciliar.

Análisis

En este estudio, presentamos el primer informe, hasta donde sabemos, sobre una correlación directa entre la expresión de miARN y ANO1, especialmente en FQ. Por tanto, encontramos que el miR-9 se sobreexpresa significativamente en las células epiteliales bronquiales con FQ y que miR-9 regula directamente ANO1. Usando un bloqueador de sitios diana, especialmente diseñado para evitar la fijación de miR-9 en el ARNm de UTR 3' de ANO1 (TSB de ANO1), hemos demostrado que se puede incrementar la expresión de ANO1 y la actividad del cloruro de ANO1 en líneas celulares con FQ, en células primarias con FQ cultivadas en una interfase de airelíquido, pero también en ratones con FQ. Es interesante destacar que, cuando las células se transfectaron con TSB de ANO1, tenemos el mismo nivel de actividad del cloruro que en las células sin FQ. Hemos estudiado la regulación de ANO1 por miR-9 usando un enfoque de gen candidato basado en análisis in silico. Hemos analizado las predicciones de varios algoritmos de interacción de miARN-diana y nos hemos centrado en su confluencia. Se predijo sólidamente que cuatro miARN se dirigen al ARNm de ANO1: miR-9; miR-19a; miR-19b y miR-144. Después de experimentos preliminares, observamos que el miR-19a y el miR-19b no regulan ANO1 y que el miR-144 regula ANO1, pero no directamente (datos complementarios del artículo). Por ejemplo, planteamos la hipótesis de que el miR-144 podría regular la actividad de ANO1 por medio de la interacción con CFTR, pero este resultado necesita mayor investigación. De hecho, algunos estudios ya han demostrado que el miR-144 regula CFTR, y otro estudio ha demostrado que existe una colocalización entre CFTR y ANO1, incluso si una interacción sigue sin estar clara. En este estudio, obtuvimos información sobre la sobreexpresión del miR-9 en células con FQ en comparación con las que no tienen FQ y, lo que es más, hemos demostrado que los niveles de expresión de miR-9 y ANO1 están correlacionados en células con FQ y sin FQ. Por tanto, validamos ANO1 como una diana de miR-9 usando una estrategia única para demostrar que la expresión disminuida de ANO1 en las células con FQ está provocada por la represión de ANO1 por el miR-9, pero sigue sin conocerse la manera en que la mutación en CFTR induce la desregulación de miR-9 en la FQ. Galietta et al. han demostrado previamente que la expresión de ANO1 se estimula por IL-411, por lo que hemos estimulado nuestras células por IL-4 para ver si cambia la expresión de miR-9, pero no hay diferencia entre las condiciones sin estimular y la estimulación con IL-4 (datos no mostrados).

Conjuntamente, nuestros resultados proporcionan evidencia de que los miARN dirigidos al mRNA de ANO1 se pueden considerar una diana terapéutica potencial en la FQ, y el TSB una alternativa real. Desde que se descubrió ANO1 en 2008, esta proteína se considera una diana terapéutica en la FQ12, ya que se define como un canal de cloruro, pero también porque ANO1 está involucrado en otros parámetros desregulados en la FQ como la secreción de HCO3-, la migración y la proliferación7. Además, abordar ANO1 parece ser una diana prometedora, ya que es independiente de las mutaciones de CFTR, pero hasta ahora no se dispone ni se sugiere ningún tratamiento con fármacos eficaz. En 1991, algunos grupos descubrieron que el 5'-trifosfato de uridina puede estimular la secreción de cloruro en el epitelio respiratorio con FQ13. Este nucleótido activa una señal al unirse a un receptor purinérgico para liberar calcio intracelular y activar CaCC indefinidos distintos de CFTR14. Los estudios de histocultivo de FQ in vitro han demostrado que el UTP puede restablecer el transporte de líquidos, potenciar la viscosidad del moco traqueal, la frecuencia del latido ciliar, inhibir la absorción de sodio e incrementar la hidratación de las vías respiratorias, lo que debería ser beneficioso en el tratamiento de la FQ1516. Estos resultados prometedores han permitido el desarrollo de nuevos fármacos denominados INS365 e INS37217 (posteriormente denominados denufosol®). Estos fármacos son más resistentes a la degradación enzimática que el UTP17. En base a estos datos, el denufosol (Inspire Pharmaceuticals) se llevó a ensayos clínicos usando nebulización para un procedimiento de administración. Después de algunos resultados prometedores obtenidos en los primeros ensayos clínicos, se completó un ensayo clínico internacional de fase 3 que incluyó a 466 pacientes. Este ensayo no ha podido demostrar ningún beneficio para los pacientes con FQ y la empresa perdió 400.000.000 dólares americanos en un solo día. Más allá de estos resultados, muchos puntos podrían explicar este resultado y se detallaron bien en un artículo del Pr. Moss de la Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford18. En primer lugar, la identidad molecular del CaCC se descubrió después de los ensayos de fase 3, y los efectos exactos del denufosol fueron solo empíricos y muy transitorios. Por tanto, está bien admitido que la administración de UTP a la superficie apical del epitelio se une al receptor P2Y2 y provoca un rápido incremento de la concentración de calcio libre citosólico con una elevación de la descarga de cloruro en un segundo a algunos minutos11. En segundo lugar, la estabilidad de este fármaco en el contexto de FQ siguió siendo muy problemática con una semivida muy corta de 3 horas en el epitelio nasal, 17 min en el pulmón de los pacientes con FQ y 30 s en la sangre debido a las nucleosidasas1719. En tercer lugar, se podrían discutir los criterios de selección clave para pacientes jóvenes con FQ (edad media de 14,2 años) con un deterioro inicial leve o nulo de FEV1 (92 % del previsto) para validar la eficacia de un fármaco. En este caso, muchos fármacos demostraron criterios de valoración clínicamente beneficiosos para los pacientes que no mejoran el FEV12021. Sin embargo, aunque abordar CaCC es prometedor, aún no se han logrado beneficios clínicos, por eso hemos centrado nuestro estudio en un enfoque farmacológico más objetivo.

De hecho, para ser más exactos que con el enfoque de antagomiR o de esponjas de ARN para silenciar el miARN, hemos usado bloqueadores de sitios diana (TSB) para bloquear el uno o más sitios diana del uno o más miARN en la UTR 3' de ^a NO1 para evitar la inhibición del miARN9. Estudiamos la regulación de ANO1 por miR-9 en líneas celulares y cultivos primarios con FQ obtenidos de pacientes homocigotos para F508del, la mutación más actual a nivel mundial. En estas células, con TSB de ANO1, logramos incrementar la expresión de ANO1, la actividad del cloruro y la migración celular. De forma interesante, observamos un incremento en la tasa de migración de las células cuando se transfectaban líneas celulares y cultivos primarios con FQ diferenciados en la interfase de aire-líquido con TSB de ANO1. La migración forma parte del proceso de reparación, por lo que planteamos la hipótesis de que tratar a los pacientes con FQ con TSB de ANO1 podría mejorar la reparación del epitelio bronquial. Nuestros datos destacan el potencial terapéutico del uso de nuestro bloqueador de sitios diana para el tratamiento de la fibrosis quística. La base de esta estrategia es innovadora, ya sea en lo que hace, o en cómo lo hace, en relación con el tratamiento propuesto a los pacientes con FQ. A diferencia del denufosol, hemos usado nuestros conocimientos de biología molecular para diseñar una estrategia nueva y específica para incrementar la expresión de una proteína diana específica usando miARN. El desafío era crear una molécula muy específica que pudiera inducir una fuerte actividad de ANO1 incluso en un sistema complejo como la FQ. Después de ponderarlo más, hemos decidido usar TSB modificado con ANB para la estabilidad y la especificidad para controlar la expresión de un gen. De manera que este enfoque es independiente de las mutaciones de CFTR y ahora está surgiendo el uso de un sitio diana de miARN artificial. Teniendo en cuenta que la FQ está provocada por más de 1900 mutaciones diferentes, hemos intentado determinar una nueva diana, independiente de CFTR, tal como ANO1. Incluso si los miARN son estables en los diversos líquidos del cuerpo humano2223, la degradación del fármaco sigue siendo un punto crucial en el caso del contexto de la FQ, ya que la estrategia del denufosol fracasó. Una valiosa adición a las herramientas de miARN provino del a Nb (ácido nucleico bloqueado), un análogo bicíclico de ARN de alta afinidad en el que el anillo de ribosa está bloqueado químicamente en una conformación de tipo N (C3'-endo). Esta modificación es esencial porque los oligonucleótidos modificados con ANB poseen una alta estabilidad térmica cuando se hibridan con el ARNm diana2425. Miravirsen, un inhibidor de miR-122 basado en ácido nucleico bloqueado (ANB), se encuentra actualmente en ensayos clínicos para el tratamiento de infecciones víricas de hepatitis C. La función del miR-122 específico de hígado es algo inusual; en lugar de dirigirse la UTR 3' y provocar la represión de la señal, se une a la UTR 5' del ARN del virus de la hepatitis C y promueve su replicación. Los efectos de Miravirsen se han probado en chimpancés y han demostrado que los anti-miARN modificados con ANB son exactos, atóxicos y muy estables porque se han detectado 8 semanas después del final del tratamiento y hasta la semana 25. Además, los efectos de Miravirsen sobre los niveles de ARN del VHC también se prolongaron al final del tratamiento26. Para nuestro estudio, el éxito de Miravirsen nos sirve de inspiración y ejemplo para proponer una estrategia clínica potencial en el caso de la FQ. En nuestro caso, nuestro TSB puede corregir los diferentes parámetros analizados en las vías respiratorias incluso en modelo de ratones. En nuestro estado, podemos observar una activación de la descarga de cloruro siete días después de la última instilación. La estabilidad y la actividad fisiológica es clave en nuestro fármaco. Por supuesto, el procedimiento de administración del fármaco en las vías respiratorias se debe optimizar para su uso en pacientes con FQ.

El esfuerzo por desarrollar fármacos que activen la descarga de cloruro para el tratamiento de la patología de fibrosis quística está en curso, pero está limitado por las diferentes mutaciones de CFTR presentes en los pacientes con FQ. Hasta donde sabemos, esta es la primera demostración de que se propone un tratamiento alternativo para corregir de forma precisa un canal de cloruro alternativo como ANO1. En el presente estudio, el uso de TSB dirigido a la región de inicio de miR-9 demuestra los beneficios potenciales del tratamiento de ANO1 para el tratamiento de pacientes con fibrosis quística. Los otros resultados importantes del presente estudio son que el tratamiento a corto plazo dirigido a ANO1 puede corregir diferentes factores fenotípicos desregulados en el epitelio de pacientes con fibrosis quística. Creemos que este enfoque que usa TSB dirigido a ANO1 tiene el potencial de proporcionar un tratamiento alternativo para pacientes con FQ. Tomados conjuntamente, estos resultados destacan que una mejor comprensión de la fisiología es esencial para los pacientes.

Referencias

A lo largo de la presente solicitud, diversas referencias describen el estado de la técnica al que pertenece la presente divulgación.

1. Pittman, J.E. y Ferkol, T.W. The Evolution of Cystic Fibrosis Care. Chest 148, 533-542 (2015).

2. Riordan, J.R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: cloning and characterization of complementary DNA [las erratas publicadas aparecen en Science 29 de septiembre de 1989; 245(4925):1437]. Science 245, 1066-1073 (1989).

3. Van Goor, F., et al. Rescue of CF airway epithelial cell function in vitro by a CFTR potentiator, VX-770. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 18825-18830 (2009).

4. Wainwright, C.E., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR. N Engl J Med (2015).

5. Nilius, B. y Droogmans, G. Amazing chloride channels: an overview. Acta Physiol Scand 177, 119-147 (2003).

6. Jia, L., Liu, W., Guan, L., Lu, M. y Wang, K. Inhibition of Calcium-Activated Chloride Channel ANO1/TMEM16A Suppresses Tumor Growth and Invasion in Human Lung Cancer. PLoS One 10, e0136584 (2015).

7. Stanich, J.E., et al. Ano1 as a regulator of proliferation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 301, G1044-1051 (2011).

8. Ruffin, M., et al. Anoctamin 1 dysregulation alters bronchial epithelial repair in cystic fibrosis. Biochim Biophys Acta 1832, 2340-2351 (2013).

9. Sonneville, F., et al. New Insights about miRNAs in Cystic Fibrosis. Am J Pathol (2015).

10. Bonvin, E., et al. Congenital tracheal malformation in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator-deficient mice. J Physiol 586, 3231-3243 (2008).

11. Galietta, L.J., et al. IL-4 is a potent modulator of ion transport in the human bronchial epithelium in vitro. J Immunol 168, 839-845 (2002).

12. Caputo, A., et al. TMEM16A, a membrane protein associated with calcium-dependent chloride channel activity. Science 322, 590-594 (2008).

13. Knowles, M.R., Clarke, L.L. y Boucher, R.C. Activation by extracellular nucleotides of chloride secretion in the airway epithelia of patients with cystic fibrosis. N Engl J Med 325, 533-538 (1991).

14. Lazarowski, E.R. y Boucher, R.C. Purinergic receptors in airway epithelia. Curr Opin Pharmacol 9, 262­ 267 (2009).

15. Kellerman, D., Evans, R., Mathews, D. y Shaffer, C. Inhaled P2Y2 receptor agonists as a treatment for patients with Cystic Fibrosis lung disease. Adv Drug Deliv Rev 54, 1463-1474 (2002).

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17. Yerxa, B.R., et al. Pharmacology of INS37217 [P(1)-(uridine 5')-P(4)-(2'-deoxycytidine 5')tetraphosphate, tetrasodium salt], a next-generation P2Y(2) receptor agonist for the treatment of cystic fibrosis. J Pharmacol Exp Ther 302, 871-880 (2002).

18. Moss, R.B. Pitfalls of drug development: lessons learned from trials of denufosol in cystic fibrosis. J Pediatr 162, 676-680 (2013).

19. DJ, K., M, M.-W. y C, J. Pharmacokinetics of INS37217 after inhaled and intravenous administration in healthy volunteers. En Pediatr Pulmonol Vol. 38 (Supl. 27) 348 (North American cystic fibrosis conference, 2004).20

20. Saiman, L., et al. Effect of azithromycin on pulmonary function in patients with cystic fibrosis uninfected with Pseudomonas aeruginosa: a randomized controlled trial. Jama 303, 1707-1715 (2010).

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un inhibidor de miR-9 de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3, en el que el inhibidor de miR-9 de ácido nucleico no se une directamente a miR-9 sino que, en su lugar, se une a un sitio diana del ARNm de miR-9 en la secuencia de ácido nucleico de ANO1.

   2. Un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1.

   3. Una composición farmacéutica que comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1.

   4. Un inhibidor de miR-9 de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3 para su uso en el tratamiento de la fibrosis quística en un sujeto que lo necesita, en el que el inhibidor de miR-9 de ácido nucleico no se une directamente a miR-9 sino que, en su lugar, se une a un sitio diana del ARNm de miR-9 en la secuencia de ácido nucleico de ANO1.

   5. El inhibidor de miR-9 de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3 para su uso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el sitio diana del ARNm de miR-9 está localizado en una UTR 3' de ANO1.

   6. El inhibidor de miR-9 de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3 para su uso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el inhibidor de miR-9 de ácido nucleico es un bloqueador de sitios diana (TSB).

   7. El inhibidor de miR-9 de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3 para su uso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el inhibidor de miR-9 de ácido nucleico comprende nucleótidos de ANB, o morfolinonucleótidos, o nucleótidos 2'-O-metilmodificados, o nucleótidos 2'-O-metoxietilmodificados o nucleótidos 2'-fluromodificados.

   8. El inhibidor de miR-9 de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3 para su uso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el inhibidor de miR-9 de ácido nucleico se administra usando un vector vírico.

   9. El inhibidor de miR-9 de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3 para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el vector es un vector AAV.

   10. El inhibidor de miR-9 de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3 para su uso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el inhibidor de miR-9 de ácido nucleico se administra al sujeto usando cualquier procedimiento adecuado que permita que el inhibidor de miR-9 de ácido nucleico llegue a los pulmones.