ES2848828T3 - Extracto de Withania para el tratamiento de enfermedades relacionadas con amiloides - Google Patents

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Abstract

Una composición que contiene un extracto de Withania somnifera para su uso para tratar o prevenir enfermedades relacionadas con amiloides en un mamífero, preferiblemente un ser humano, en donde el extracto de Withania somnifera ha sido fermentado mediante su incubación con un hongo filamentoso en un ambiente adecuado.

Description

DESCRIPCIÓN
Extracto de Withania para el tratamiento de enfermedades relacionadas con amiloides
La invención se refiere a una composición a partir de un extracto vegetal de Withania somnifera, para su uso para tratar o prevenir enfermedades relacionadas con amiloides, incluida la enfermedad de Alzheimer.
La amiloidosis se refiere a una afección patológica caracterizada por la presencia de fibrillas amiloides. Amiloide es un término genérico que se refiere a un grupo de depósitos de proteínas diversos pero específicos (intracelulares o extracelulares) que se observan en varias enfermedades diferentes. Aunque diversos en su aparición, todos los depósitos de amiloide tienen propiedades morfológicas comunes, se tiñen con tintes específicos (p. ej., rojo Congo) y tienen un aspecto birrefringente rojo-verde característico en luz polarizada después de la tinción. También comparten características ultraestructurales comunes y difracción de rayos X y espectros infrarrojos comunes. Las enfermedades relacionadas con amiloides pueden restringirse a un órgano o diseminarse a varios órganos. Una vez que se han formado estos amiloides, no existe una terapia o tratamiento conocido y ampliamente aceptado que disuelva significativamente los depósitos de amiloide en el lugar, prevenga una mayor deposición de amiloide o prevenga el inicio de la deposición de amiloide.
La enfermedad de Alzheimer (EA) es un trastorno degenerativo del sistema nervioso central asociado con una pérdida extensa de células neuronales específicas y que se caracteriza clínicamente por una pérdida progresiva de la memoria, la cognición, el razonamiento, el juicio y la estabilidad emocional que conduce gradualmente a un deterioro mental profundo y, en última instancia, a la muerte. Las personas que padecen la enfermedad de Alzheimer desarrollan una demencia progresiva en la edad adulta, acompañada de tres cambios estructurales principales en el cerebro: pérdida difusa de neuronas en múltiples partes del cerebro; acumulación de depósitos de proteínas intracelulares denominados ovillos neurofibrilares; y acumulación de depósitos de proteínas extracelulares denominados placas amiloides o seniles, rodeadas de terminales nerviosas deformadas y microglía activada.
La EA afecta principalmente a personas mayores de 65 años y hasta cuatro millones de personas solo en los Estados Unidos. Hasta la fecha, no existe ningún tratamiento que detenga o revierta la enfermedad y actualmente causa hasta 100 000 muertes al año.
La EA se caracteriza por una producción excesiva de pequeños péptidos hidrófobos llamados péptidos beta amiloides (péptidos Ap), donde el péptido Ap42 es particularmente neurotóxico, lo que conduce a la patogénesis de esta enfermedad. Los cerebros de las personas con EA exhiben degeneración neuronal y lesiones características que se denominan placas amiloides y ovillos neurofibrilares. Actualmente, el único diagnóstico definitivo de EA es la presencia de estas placas en cerebros post-mortem. En casos específicos, las fibrillas amiloides, una vez depositadas, pueden volverse tóxicas para las células circundantes. Por ejemplo, se ha demostrado que estas fibrillas organizadas como placas seniles están asociadas con células neuronales muertas, neuritas distróficas, astrocitosis y microgliosis en pacientes con EA. Cuando se prueba in vitro, se demostró que el péptido oligomérico (soluble) así como fibrilar es capaz de desencadenar un proceso de activación de la microglía (macrófagos cerebrales), lo que explicaría la presencia de microgliosis e inflamación cerebral que se encuentran en el cerebro de pacientes con EA. Tanto los péptidos oligoméricos como los fibrilares también pueden inducir la muerte de las células neuronales. in vitro (MP Lambert et ál., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 6448-53 (1998)).
De acuerdo con la hipótesis científica dominante para la EA, llamada cascada amiloide o hipótesis amiloide, se cree que la deposición cerebral progresiva de péptidos amiloidogénicos particulares, péptidos beta-amiloides (péptidos Ap), juega un papel perjudicial en la patogenia de la EA y puede preceder a los procesos cognitivos. síntomas y aparición de demencia por años o posiblemente incluso décadas (Hardy J y Selkoe D J, Science. (2002) 297 (5580): 353-6).
Por tanto, la prevención de la producción de estos péptidos se ha convertido en el foco principal de los enfoques de la industria farmacéutica para el tratamiento de la EA. Los péptidos Ap se producen como resultado de un procesamiento excesivo de la proteína precursora amiloide (APP), la proteína transmembrana original que se encuentra en las neuronas y otras células (Selkoe, D J. Trends Cell Biol. 1998, 8(11):447-53). Las placas amiloides se componen principalmente de péptidos de 40 y 42 aminoácidos (llamados Ap40 y Ap42, respectivamente) derivados de la proteína precursora amiloide (APP) mediante proteólisis secuencial catalizada por la aspartil proteasa, beta-secretasa, seguida de escisión de gamma-secretasa dependiente de presenilina. El Ap42 es más hidrófobo y menos soluble que el Ap40 y es la especie predominante en las placas amiloides. El Ap42 es más propenso a la agregación y a la deposición y, por tanto, es la causa de neurotoxicidad y pérdida sináptica (Callizot N, et ál., 2013. J Neurosci Res. 91: 706-16).
El mecanismo por el cual los péptidos Ap inducen la muerte de las células neuronales no está claro. Sin embargo, se han propuesto numerosos mecanismos como la acumulación de calcio intracelular, la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y óxido nítrico (NO), la alteración del citoesqueleto y del núcleo y procesos inflamatorios que convergen hacia las vías ubicuas de necrosis o apoptosis. Dado que el cerebro con EA se caracteriza por un proceso inflamatorio crónico continuo, la investigación está dirigida a encontrar la raíz de esta respuesta inflamatoria. Los ovillos neurofibrilares y las placas seniles (agregados formados principalmente por el péptido beta amiloide) son dos lesiones históricas en la enfermedad de Alzheimer. Se ha documentado que estas formas oligoméricas de Ap interactúan con receptores del sistema glutamatérgico como los receptores NMDA, que son responsables de mantener la homeostasis del glutamato (Campos-Peña. V. y M.A. Meraz-Ríos, 2014 Neuroquímica, Dr. Thomas Heinbockel (Ed.), ISBN: 978-953-51-1237-2, InTech, DOI: 10.5772 /57367).
Muchos estudios sugieren que, además de Ap, los receptores NMDA tienen un papel importante en los procesos de aprendizaje y memoria. La plasticidad sináptica se puede regular positiva o negativamente, dependiendo de los niveles y grados de oligomerización de amiloide. El efecto negativo de estas formas oligoméricas puede revertirse por la presencia de antagonistas del receptor de NMDA. En este sentido, se ha informado que el antagonista no competitivo memantina (antagonista del receptor de NMDA) es capaz de bloquear la activación "patológica" del receptor que ejercen estos oligómeros (Kelly et ál., 2006 J. Biol. Chem. 281,28079-28089; Parsons et ál., 2007, Neuropharmacology 53, 699-723, Costa R.O, et ál., 2012. Aging Cell. 11 (5): 823-33).
Desde este punto de vista, un tratamiento farmacológico precoz con sustancias reductoras de la sobreestimulación del glutamato podría representar una muy buena opción para el tratamiento de pacientes con EA.
Otro tipo de amiloidosis es la angiopatía amiloide cerebral (AAC). La AAC es el depósito específico de fibrillas de amiloide P en las paredes de las arterias, arteriolas y venas leptomeníngeas y corticales. Se asocia comúnmente con la EA, el síndrome de Down y el envejecimiento normal, así como con una variedad de afecciones familiares relacionadas con un accidente cerebrovascular o demencia (Frangione et ál., Amyloid: J. Protein Folding Disord. 8, Supl. 1,36-42 (2001)).
Las terapias actuales tratan uno o más síntomas de la EA, incluida la pérdida de memoria que interrumpe la vida diaria; desafíos para planificar o resolver problemas, dificultad para completar tareas familiares en el hogar, en el trabajo o en el tiempo libre, confusión con el tiempo o el lugar, dificultad para comprender imágenes visuales y relaciones espaciales, nuevos problemas con las palabras al hablar o escribir, perder cosas y perder la capacidad de volver sobre los pasos, disminución o falta de juicio, retirada del trabajo o actividades sociales, cambios de humor y personalidad.
Las terapias disponibles actualmente para el tratamiento de las enfermedades amiloides son casi en su totalidad sintomáticas, y actualmente no se dispone de una terapia farmacológica integral para la prevención o el tratamiento de, por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer (Roberson, E.D. y Mucke, L. (2006). Science, 314, 781-784).
Los estudios han demostrado una correlación entre los niveles de Ap soluble y el grado de pérdida sináptica/gravedad del deterioro cognitivo (Mucke, L. et ál., (2000) J Neurosci; 20:4050). Por tanto, cualquier sustancia que reduzca la neurotoxicidad del Ap puede ser útil como un nuevo agente terapéutico para el tratamiento o la prevención de enfermedades relacionadas con amiloide y en particular EA.
Se ha informado que extractos de Withania somnífera, Emblica officinalis y Bacopa monnieri muestran actividad antiangiogénica. Sin embargo, los extractos de estas plantas no se utilizaron debido a la alta toxicidad relacionada con la obtención de los extractos y, en particular, el extracto de Withania somnifera.
Sorprendentemente, el solicitante ha descubierto que, al afectar la toxicidad de los extractos de la planta Withania somnifera, al combinar un paso de extracción y un paso de fermentación mediante el uso de hongos filamentosos, es posible utilizar el extracto desintoxicado para tratar la EA y otros trastornos neurodegenerativos.
Por tanto, el objeto de la invención es utilizar una composición no tóxica a base de extractos de Withania somnifera, que tiene un efecto protector contra la neurotoxicidad de Ap para tratar o prevenir enfermedades relacionadas con amiloides.
Otros objetos, características, aspectos y ventajas de la invención serán evidentes al leer la descripción y los ejemplos que siguen:
Figura 1: Efecto de Ap1-42 (10 pM, 24 horas) en presencia o ausencia de extracto vegetal WEB-2 o BDNF (50 ng/ml) sobre la supervivencia celular de cultivo cortical primario. Los datos se expresaron en porcentaje de las condiciones de control (sin Ap1-42 = 100 %). Todos los valores se expresaron como media /- SEM (es decir, media) de los 6 pocillos. Los resultados se analizaron estadísticamente mediante ANOVA seguido de la prueba de Dunnett cuando se permitió, mediante el uso del software GraphPad Prism (GraphPad, Estados Unidos). N.° p <0.05 control frente al grupo amiloide B; * p <0.05 frente al grupo amiloide B.
Figura 2: Efecto del extracto vegetal WEB-2 a diferentes concentraciones sobre la red de neuritas (2a) y la supervivencia de las neuronas (2b) después de 3 días de tratamiento. Los datos se expresaron como porcentaje de control como media ± SEM (100 % = sin extracto vegetal). N.° p <0.05 frente a la condición de control (ANOVA unidireccional seguido de la prueba PLSD de Fisher.
Figura 3: Efecto de WEB-2 a diferentes concentraciones sobre la red de neuritas (3a) y la supervivencia de las neuronas (3b) después de 5 días de tratamiento. Los datos se expresaron como porcentaje de control como media ± SEM (100 % = sin extracto vegetal). N.° p <0.05 frente a la condición de control (ANOVA unidireccional seguido de la prueba PLSD de Fisher.
Figura 4: Efecto del glutamato (40 pM, 20 min) sobre la supervivencia de las neuronas (4a) y la red de neuritas (4b) de cultivo cortical primario en presencia o ausencia de pretratamiento con WEB-2 durante una hora. Los datos se expresaron como porcentaje de control como media ± SEM (100 % = sin glutamato). * p <0.05 frente a la condición de glutamato (ANOVA unidireccional seguido de la prueba PLSD de Fisher).
Figura 5: Efecto del glutamato (40 pM, 20 min) sobre la supervivencia de neuronas (5a) y la red de neuritas (5b) del cultivo cortical primario en presencia o ausencia de WEB-2 en cotratamiento con el glutamato. Los datos se expresaron como porcentaje de control como media ± SEM (100 % = sin glutamato). * p <0.05 frente a la condición de glutamato (ANOVA unidireccional seguido de la prueba PLSD de Fisher).
Figura 6: Efecto del glutamato (40 pM, 20 min) sobre la supervivencia de neuronas (6a) y la red de neuritas (6b) de cultivo cortical primario en presencia o ausencia de tratamiento con WEB-2 cuatro horas después del tratamiento con glutamato. Los datos se expresaron como porcentaje de control como media ± SEM (100 % = sin glutamato). * p <0.05 frente a la condición de glutamato (ANOVA unidireccional seguido de la prueba PLSD de Fisher).
Figura 7: Efecto de WEB-1 (concentración diferente) sobre la red de neuritas (7 a) y la supervivencia de las neuronas (7b) después de 3 días de tratamiento. Los datos se expresaron como porcentaje de control como media ± SEM (100 % = sin extracto de planta) * p <0.05 (ANOVA unidireccional seguido de la prueba PLSD de Fisher).
Figura 8: Efecto de WE-2 (concentración diferente) sobre la red de neuritas (8a) y la supervivencia de las neuronas (8b) después de 3 días de tratamiento. Los datos se expresaron como porcentaje de control como media ± SEM (100 % = sin extracto de planta). * p <0.05 (ANOVA unidireccional seguida de prueba PLSD de Fisher).
La invención está dirigida a una composición que contiene un extracto de Withania somnífera fermentado por su incubación con un hongo filamentoso en un ambiente adecuado, para su uso para tratar o prevenir enfermedades relacionadas con amiloides en un mamífero. Preferiblemente, el mamífero es un ser humano.
La planta de Withania somnífera se obtiene de la India. La raíz de esta planta es comercializada por Alp Erbo (Marsella).
El proceso de producción de extractos según la invención se puede encontrar en WO 2014/202469. Brevemente, las plantas se fermentan en presencia de un hongo filamentoso de la familia Cordycipitaceae, preferiblemente el género Beauveria. Más preferiblemente, el hongo filamentoso se deriva de la cepa Beauveria bassiana, más particularmente la cepa que tiene la referencia ATCC 7159.
La fermentación controlada desintoxica el extracto Withania Somnifera por una serie de biocatálisis de diversas moléculas contenidas en este extracto y, más particularmente, de la familia química de withanólido agliconas, las sustancias principalmente responsables de la toxicidad del extracto.
El término "desintoxicación" se usa para significar la eliminación por el microorganismo de moléculas potencialmente tóxicas en el medio.
Preferiblemente, después de la fermentación, filtración, el medio se somete luego a etapas de esterilización, preferiblemente por ultrafiltración, para obtener la solución que constituye el extracto vegetal.
El extracto vegetal de la invención contiene Withania somnifera pero también puede contener al menos uno de los siguientes extractos Emblica officinalis, originarios de la India y comercializados por Infrag, Bengalore), Bacopa monnieri (India) comercializado por Alp Erbo (Marsella), Punica granatum (China) (Shanghai Brightol International Co, Ltd (Shanghai), Curcuma longa (India) (Omnipharm, Chambery), Piperlongum (Tailandia) (Omnipharm, Chambery), o Calendula officinalis (China) (Shanghai Brightol International Co, Ltd (Shanghai), mediante el uso del mismo procedimiento), mediante pasos de extracción independientes para cada extracto vegetal utilizado en la realización de dicho preparado.
Ventajosamente, la composición utilizada en esta invención incluye, en peso, entre 5 y 100 g/L de Withania somnifera, preferiblemente 20 g/L. Preferiblemente, esta composición también incluye uno de los siguientes extractos, expresado en peso:
entre 5 y 100 g/L de Emblica officinalis, preferiblemente 15 g/L,
entre 5 y 100 g/L de Bacopa monnieri, preferiblemente 15 g/L,
entre 5 y 50 g/L de Punica granatum, preferiblemente 10 g/L,
entre 5 y 250 g/L de Curcuma longa, preferiblemente 20 g/L,
entre 20 y 50 mg/L de Piper longum, preferiblemente 30 mg/L,
entre 5 y 50 g/L de Calendula officinalis, preferiblemente 10 g/L,
Preferiblemente, la composición utilizada en esta invención comprende un extracto vegetal de Withania somnifera, Emblica officinalis y Bacopa monnieri. Más preferiblemente, la composición según la invención comprende una cantidad en peso de Withania somnífera a una concentración de 20 g/L, de Emblica officinalis a una concentración de 15 g/L y de Bacopa monnieri a una concentración de 15 g/L.
Las composiciones según la invención se utilizan para tratar o prevenir la enfermedad de Alzheimer, la angiopatía amiloide cerebral, la miositis por cuerpos de inclusión o el síndrome de Down.
En determinadas realizaciones de la invención, las composiciones reducen la evolución de la EA en particular, y en algunas realizaciones las composiciones de la invención son eficaces para tratar un espectro más amplio de pacientes con EA. En ciertos casos, la invención es eficaz para individuos que tienen EA familiar o de aparición temprana. En algunas realizaciones, la composición de la invención se usa para tratar una enfermedad relacionada con amiloide en un individuo.
Las enfermedades relacionadas con amiloide comprenden la enfermedad de Alzheimer, la angiopatía amiloide cerebral, la miositis por cuerpos de inclusión o el síndrome de Down.
En algunas realizaciones, la composición de la invención está destinada a reducir o inhibir la formación o deposición de fibrillas de amiloide, se reduce o inhibe la neurodegeneración o la toxicidad celular.
La composición de la invención provoca en un paciente de Alzheimer una estabilización de la función cognitiva, la prevención de una disminución adicional de la función cognitiva o la prevención, ralentización o detención de la evolución de la enfermedad.
La composición para su uso según la invención se formula para administración oral o parenteral.
Un experto en la técnica de la formulación farmacéutica implementará las diversas formas útiles para la administración de las composiciones y/o suplementos de la invención. Las composiciones pueden estar en forma líquida, de gel, emulsión, sólida o inyectable.
La composición utilizada puede incluir adicionalmente suspensiones, emulsiones, jarabes que contengan diluyentes inertes usados convencionalmente y posiblemente otras sustancias tales como agentes humectantes, edulcorantes, conservantes, espesantes, colorantes o cualquier otra sustancia conocida por un experto en la técnica adecuada para administración oral. en particular ((sorbato de sodio (E201) (Sigma-Aldrich), antocianina (E163) (FBC Industries, EE. UU.), metabisulfito de sodio (E223) (Sigma-Aldrich), alfa-tocoferol (E307) (Fb C Industries, EE. UU.).
La composición utilizada también puede comprender disolventes u otros excipientes como agua, propilenglicol, aceites vegetales u otros disolventes orgánicos adecuados.
El término "excipiente" se usa para significar cualquier compuesto que no interfiera con la eficacia de la actividad biológica de la composición según la invención y que no sea tóxico para el hospedador al que se le administra. La composición utilizada también puede contener adyuvantes, tales como agentes humectantes, agentes isotonantes, emulsionantes, sales o cualquier otra sustancia conocida por un experto en la técnica que pueda usarse como adyuvantes (polidimetilsiloxano, alcohol polivinílico (PVA), hidrogeles (Carbopol), polivinilpirrolidona, hidroxipropilcelulosa (HPC), poloxámero 188, EDTA, clorobutanol) (Lubrizol, Francia, Dow Corning, EE. UU.).
De manera ventajosa, la composición puede comprender otras sustancias como vitaminas, sales minerales, un vector farmacéuticamente aceptable, estabilizadores, antioxidantes o cualquier otra sustancia conocida por un experto en la técnica y destinada a integrarse en un fármaco.
Preferiblemente, la composición es líquida, administrable por vía oral y contiene al menos un extracto no tóxico de Whitania somnifera, algunos conservantes, vitaminas, agua y sal.
Más preferiblemente, los conservantes son sorbato o benzoato de potasio. La vitamina puede ser riboflavina (vitamina B2). La composición terapéutica utilizada en el método de la invención se administra en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
El término "vehículo farmacéuticamente aceptable" se usa para significar cualquier vehículo que no interfiera con la eficacia de la actividad biológica de la composición según la invención y que no sea tóxico para el hospedador al que se le administra.
La composición obtenida se puede utilizar como producto medicinal para un mamífero y, más particularmente, para un ser humano, para ayudar en el tratamiento o prevención de trastornos o enfermedades vinculadas a enfermedades relacionadas con amiloides y en particular EA.
El término "producto medicinal" se usa para significar un producto que contiene una dosis exacta de dicha preparación según la directiva europea 65/65/EC, es decir, cualquier sustancia o composición descrita como poseedora de propiedades curativas o preventivas con respecto a enfermedades en seres humanos o animales. Por ejemplo, el producto medicinal que contiene dicha preparación a dosis terapéuticas puede administrarse por vía oral como una cápsula o comprimido, o inyectarse por cualquier otra vía para conferir los efectos beneficiosos.
Una dosis apropiada de la composición terapéutica puede ser determinada por un experto en la técnica, teniendo en cuenta los hallazgos descritos en este documento junto con factores típicos tales como la masa corporal del paciente, la condición física del paciente, etc. La dosis debe contener la composición terapéutica en una cantidad que sea eficaz para tratar enfermedades relacionadas con amiloides, incluida la EA.
El fármaco se puede administrar diariamente, semanalmente o de forma intermitente. Por ejemplo, el fármaco se puede administrar durante tres semanas, seguido de una semana de descanso, o dos semanas de descanso, seguido de una semana de descanso, o bajo otros programas de dosificación que puedan determinar los expertos en la materia. La dosis particular seleccionada dependerá del modo de administración y régimen de dosificación seleccionados. Un programa preferido es un programa de dosificación oral una vez al día. Cuando se prescriben períodos de tiempo más prolongados entre cada aplicación (típicamente el caso de la administración i.v.), cada dosis unitaria puede ser mayor que cuando se proporcionan dosis diarias.
La dosis diaria de las composiciones utilizadas puede variar según las necesidades y gravedad de los síntomas del paciente y según la vía. Por lo general, la dosis diaria es de entre 10 mg/mL y 300 mg/mL de la solución después de la fermentación.
Preferiblemente, la dosis diaria para un ser humano adulto está entre 30 y 100 mg/ml de la solución después de la fermentación.
La presente invención se explicará con más detalle mediante ejemplos no limitativos a continuación, que hacen referencia a los dibujos adjuntos. Los siguientes métodos se utilizaron en los experimentos descritos en los ejemplos que siguen a la descripción de los métodos.
Ejemplo comparativo 1: composición WEB-1 antes de la fermentación
La composición WEB-1 contiene un extracto comercial de Withania Somnífera a una concentración de 20 g/L, de Emblica officinalis a una concentración de 15 g/L, de Bacopa monnieri a una concentración de 15 g/L.
Se prepara una solución de 100 mL en agua. Después de la liofilización se obtienen 3.8 g de un polvo beige.
Ejemplo 2: cepa de hongo filamentoso Beauveria bassiana
La cepa Beauvaria Bassiana (referencia ATCC 7159) se ha cultivado en un medio que contiene 0.5 g/L de KH2PO4 ; 1 g/L KH2PO4 ; 1 g/L de MgSO4; 2 g/L de NaNO3; 0.5 g/L de KCl; 0.02 g/L FeSO4; 30 g/L de glucosa (todos los reactivos de Sigma-Aldrich, Francia) y 10 g/L de licor de maceración de maíz (Roquette, Francia).
A continuación, se agitó el cultivo a 200 rotaciones por minuto, durante 72 horas a 27 °C. Luego se filtró por métodos no estériles en un papel de filtro para separar la biomasa fúngica del medio de cultivo. A continuación, la biomasa fúngica se lavó minuciosamente con agua.
Ejemplo 3: composición WEB-2 utilizada en la invención
La composición WEB-1 como en el ejemplo 1 se añade a la biomasa fúngica fresca del ejemplo 2 mediante el uso de 60 g de biomasa por litro de composición WEB-1 que contiene 50 g de glucosa.
Después de la incubación, esta composición sembrada se agitó a 200 rpm durante 5 días a una temperatura de 27 °C. Después de 5 días, el medio de incubación se filtró sobre un papel de filtro, las muestras para el ensayo de HPLC también se filtraron mediante el uso de un filtro de 0.45 micrómetros (Ait-France, ref: SFNY 013045N).
Se obtuvo la solución pardusca que luego se liofilizó durante 5 días para producir un polvo beige seco.
Ejemplo 4: composición WE-2 utilizada en la invención
La composición WE-1 contiene un extracto comercial de Withania Somnifera a una concentración de 20 g/L, y de Emblica officinalis a una concentración de 15 g/L.
A 100 mL de tal solución, se agregan 5 g de glucosa y 6 g de biomasa del ejemplo 2.
Después de haber tratado y liofilizado la solución como en el ejemplo 3, se obtienen 4.13 g de un polvo beige.
Los marcadores identificados en la composición WE-2 fueron Withanoside IV, Withanoside VI y ácido gálico.
Ejemplo 5: composición WB-2 utilizada en la invención
La composición WB-1 contiene un extracto de Withania Somnífera a una concentración de 20 g/L, y de Bacopa Monnieri a una concentración de 15 g/L.
A 100 mL de tal solución, se agregan 5 g de glucosa y 6 g de biomasa del ejemplo 2.
Después de haber tratado y liofilizado la solución como en el ejemplo 3, se obtienen 2.62 g de un polvo beige.
Los marcadores identificados en la composición WB-2 fueron Withanoside IV, Withanoside VI, Bacoside A3, Bacopaside X y Bacopasaponin C.
Ejemplo 6: composición BE-2 utilizada en la invención
La composición BE-2 contiene un extracto de Bacopa Monnieri a una concentración de 15 g/L, y de Emblica officinalis a una concentración de 15 g/L.
A 100 mL de tal solución, se agregan 5 g de glucosa y 6 g de biomasa del ejemplo 2.
Después de haber tratado y liofilizado la solución como en el ejemplo 3, se obtienen 2.62 g de un polvo beige.
Los marcadores identificados en la composición BE-2 fueron Bacopaside X, Bacopasaponin C y ácido gálico.
Ejemplo 7: composición WEB-4 según la invención
La composición WBE-4 contiene un extracto de Withania Somnifera a una concentración de 40 g/L, de Bacopa Monnieri a una concentración de 15 g/L, y de Emblica officinalis a una concentración de 15 g/L.
A 100 mL de tal solución, se agregan 5 g de glucosa y 6 g de biomasa del ejemplo 2.
Después de haber tratado y liofilizado la solución como en el ejemplo 3, se obtienen 4.23 g de un polvo beige.
Ejemplo 8: composición WEB-6 utilizada en la invención
La composición WEB-6 contiene un extracto de Withania Somnifera a una concentración de 20 g/L, de Bacopa Monnieri a una concentración de 15 g/L, y de Emblica officinalis a una concentración de 30 g/L.
A 100 mL de tal solución, se agregan 5 g de glucosa y 6 g de biomasa del ejemplo 2.
Después de haber tratado y liofilizado la solución como en el ejemplo 3, se obtienen 4.22 g de un polvo beige.
Ejemplo 9: composición WEB-8 utilizada en la invención
La composición WEB-8 contiene un extracto de Withania Somnifera a una concentración de 20 g/L, de Bacopa Monnieri a una concentración de 30 g/L, y de Emblica officinalis a una concentración de 15 g/L.
A 100 mL de tal solución, se agregan 5 g de glucosa y 6 g de biomasa del ejemplo 2.
Después de haber tratado y liofilizado la solución como en el ejemplo 3, se obtienen 3.76 g de un polvo beige.
Ejemplo 10: efecto neuroprotector sobre un modelo in vitro de la enfermedad de Alzheimer
Los cerebros de los pacientes con enfermedad de Alzheimer tienen un gran número de placas (depósitos extracelulares) que contienen péptidos beta amiloides (Ap) que se cree que desempeñan un papel fundamental en la patología de la EA. Estos péptidos contribuyen a las lesiones cerebrovasculares y son neurotóxicos. Este estudio investigó el efecto neuroprotector del extracto vegetal de la invención en cultivos corticales primarios de rata después de la exposición a Ap1-42 en un modelo in vitro de EA (Callizot. N., et ál., 2013).
a) Cultivo de neuronas corticales
Las neuronas corticales de rata se cultivaron como se describe por Singer C.A., et ál., 1999. J Neurosci 19: 2455-2463 y Callizot. N., et ál., 2013 J Neurosci Res. 91: 706-16.
Brevemente, hembras Wistar preñadas (Janvier Labs, Francia) a los 15 días de gestación se sacrificaron por dislocación cervical. Los fetos se recolectaron y se colocaron inmediatamente en medio Leibovitz L15 helado (lote: 4290114, Pan Biotech, Alemania) con una solución de penicilina al 2 % (10000 U/mL) y estreptomicina (10 mg/mL) (lote PS: 7500912; Pan Biotech) y albúmina de suero bovino al 1 % (lote BSA: K030913; Pan Biotech). La corteza se trató durante 20 min a 37 °C con una solución de tripsina-EDTA (lote: 7310713, Pan Biotech) a una concentración final de tripsina al 0.05 % y EDTA al 0.02 %. La disociación se detuvo mediante la adición de medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con 4.5 g/L de glucosa (lote: 9710913, Pan Biotech), que contenía ADNasa I grado II a la concentración final de 0.5 mg/ml (lote: H131108, Pan Biotech) y suero fetal bovino al 10 % (lote: 41Q7218K, Invitrogen, Francia). Las células se disociaron mecánicamente mediante tres pasos forzados a través de la punta de una pipeta de 10 mL. A continuación, las células se centrifugaron a 515 g durante 10 min a 4 °C. El sobrenadante se descartó y el sedimento se resuspendió en un medio de cultivo definido que consistía en medio Neurobasal (lote: 1576979, Invitrogen) con una solución al 2 % de suplemento de B27 (lote: 1589889, Invitrogen), 2 mmol/L de L- glutamina (lote: 5030513, Pan Biotech), 2 % de solución de PS y 10 ng/mL de factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) (lote: H140108, Pan Biotech). Las células viables se contaron en un citómetro Neubauer, mediante el uso de la prueba de exclusión con azul de tripano. A continuación, las células se sembraron a una densidad de 30000 por pocillo en placas de 96 pocillos recubiertas previamente con poli-L-lisina (lote: 3102256, Corning Biocoat, Estados Unidos) y se cultivaron a 37 °C en una incubadora con aire (95 %) y CO2 (5 %) en medio B27. El medio se cambió cada 2 días. Las neuronas corticales se intoxicaron con soluciones de péptidos beta amiloides después de 11 días de cultivo.
b) Preparación de soluciones
La preparación del péptido beta amiloide 1-42 (Ap1-42) se realizó siguiendo el procedimiento descrito por Callizot. N., et ál., 2013 J Neurosci Res. 91: 706-16. Brevemente, se disolvió péptido Ap1 -42 (lote: APN09080-1-1, Abcam, Reino Unido) en el medio de cultivo definido B27 mencionado anteriormente, desprovisto de suero, a una concentración inicial de 40 pmol/L. Esta solución se agitó suavemente durante 3 días a 37 °C en la oscuridad y se usó inmediatamente después de diluirse adecuadamente en medio de cultivo.
El extracto vegetal WEB-2 del ejemplo 2 (5 mg/mL, 500, 50, 5 pg/mL, 500 y 50 ng/mL) y factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF, Sigma Aldrich France) (50 ng/mL) se resolvieron o diluyeron en medio de cultivo y luego se preincubaron con neuronas corticales primarias en placas de 96 pocillos a 6 pocillos por condición durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego se añadió la preparación de Ap1-42 hasta una concentración final de 10 pM diluida en medio, o en presencia de extracto vegetal WEB-2 a diferentes concentraciones o BDNF.
Se sabe que el BDNF actúa sobre ciertas neuronas del sistema nervioso central y del sistema nervioso periférico, mediante lo cual ayudan a sustentar la supervivencia de las neuronas existentes y estimulan el crecimiento y la diferenciación de nuevas neuronas y sinapsis.
c) Marcado de anticuerpos
Después de 24 horas, las células se fijaron mediante una solución fría de etanol al 95 % (lote: SZBD1470V, Sigma) y ácido acético al 5 % (lote: SZBD1760V, Sigma) durante 5 min a -20 °C. Después de la permeabilización con 0.1 % de saponina (lote: BCBJ8417V, Sigma), las células se incubaron durante 2 h con:
1) Anticuerpo monoclonal de ratón anti proteína 2 asociada a microtúbulos (MAP-2; lote: 063M4802, Sigma) a una dilución de 1/400 en PBS (lote: 7750514, Pan Biotech) que contenía suero bovino fetal al 1 % (lote: 41Q7218K, Invitrogen) y 0.1 % de saponina a temperatura ambiente. Este Ab de MAP-2 tiñó específicamente las neuronas.
2) Anticuerpo de conejo anti proteína ácida fibrilar glial (GFAP) (lote: 083M4830, Sigma) a una dilución de 1/400 en PBS que contenía 1 % de suero bovino fetal y 0.1 % de saponina a temperatura ambiente. Este anticuerpo tiñó específicamente los cuerpos celulares de las células gliales mediante lo cual se pudo cuantificar la muerte celular de estas células.
Estos 2 anticuerpos se revelaron con IgG anti-ratón de cabra Alexa Fluor 488 (lote: 1397999, Molecular Probe, Francia) y IgG anti-conejo de cabra Alexa Fluor 568 (lote: 1180090, Molecular Probe) a la dilución de 1/400 en PBS que contenía 1 % de suero bovino fetal y 0.1 % de saponina durante 1 hora a temperatura ambiente.
d) Análisis del número total de células (neuronales y gliales)
Los cultivos inmunomarcados se examinaron automáticamente con ImageXpress equipado con un LED con un aumento de x20 (Molecular Devices, Reino Unido). Para cada condición (6 pocillos de cultivo), se analizaron 30 campos por pocillo (que representan aproximadamente el 80 % de la superficie total del pocillo). La supervivencia total se analizó automáticamente mediante el uso del software MetaXpress (Molecular Devices)
e) Resultados
La figura 1 muestra el efecto de los diferentes componentes utilizados sobre las lesiones de p amiloide.
Los resultados muestran que Ap1-42 (10 pM - 24 h) indujo una muerte celular significativa (> 30 %) como se mostró previamente en la bibliografía (Callizot et ál., 2013). En presencia de extracto vegetal (500 pg/mL), se observó un efecto protector significativo. Curiosamente, el efecto neuroprotector persistió a la concentración más baja (500 ng/mL). A la concentración más alta (5 mg/mL), el extracto de la planta mostró un gran efecto tóxico.
En este estudio, se utiliza BNDF (50 ng/mL) como compuesto de referencia. Como conclusión:
• Ap1-42 (10 pM - 24 h) aplicado sobre cultivo de neuronas corticales primarias indujo una muerte celular significativa como se describió previamente.
• El extracto vegetal, probado a 500 pg/ml, mostró un efecto neuroprotector claro y significativo sobre las lesiones inducidas por Api -42.
• El intervalo de dosis más activas parece rondar los 500 pg/mL.
Ejemplo 11: efecto de un extracto vegetal sobre la neuritogénesis en neuronas corticales primarias.
Este estudio investiga el efecto del extracto vegetal WEB-2 a diferentes concentraciones sobre la neuritogénesis en el cultivo de neuronas corticales primarias. Se realizó un tratamiento crónico durante 3 y 5 días y se evaluó el efecto sobre el crecimiento de neuritas en estos dos puntos de tiempo.
a) Cultivo de neuronas corticales
• Las neuronas corticales de rata se cultivaron como se describe por Singer C.A. et ál., 1999. J Neurosci. 1 de abril de 1999; 19 (7): 2455-63 y Callizot N., et ál., 2013. J Neurosci Res. mayo de 2013; 91 (5): 706-16.
Brevemente, los fetos se recolectaron e inmediatamente se colocaron en medio L15 Leibovitz helado (Pan Biotech) con una solución de penicilina al 2 % (10000 U/mL) y estreptomicina (10 mg/mL) (PS; Pan Biotech, lote: 1451013) y Albúmina de suero bovino al 1 % (Lote: K180713, Pan Biotech). La corteza se trató durante 20 min a 37 °C con una solución de tripsina-EDTA (lote: 7310713, Pan Biotech) a una concentración final de 0.05 % de tripsina y 0.02 % de EDTA. La disociación se detuvo mediante la adición de medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con 4.5 g/L de glucosa (lote: 9710913, Pan Biotech), que contenía ADNasa I grado II a una concentración final de 0.5 mg/ml; (lote: H130919, Pan Biotech) y suero bovino fetal al 10 % (Lote: 41Q7218K, Invitrogen). Las células se disociaron mecánicamente mediante tres pasos forzados a través de la punta de una pipeta de 10 mL. A continuación, las células se centrifugaron a 515 x g durante 10 min a 4 °C. Se descartó el sobrenadante y se resuspendió el sedimento en un medio de cultivo definido que consistía en medio Neurobasal (Lote: 1625353, Invitrogen) con una solución al 2 % de suplemento B27 (lote: 1618508, Invitrogen), 2 mmol/L de L-glutamina (lote: 6620314, Pan Biotech), 2 % de solución de PS y 10 ng/mL de factor neurotrófico derivado del cerebro (lote: H140108, Pan Biotech). Las células viables se contaron en un citómetro Neubauer, mediante el uso de la prueba de exclusión con azul de tripano. Las células se sembraron a una densidad de 30000 por pocillo en placas de 96 pocillos recubiertas previamente con poli-L-lisina (lote: 3102256, Biocoat) y se cultivaron a 37 °C incubadora con aire (95 %) y CO2 (5 %). El medio se cambió cada 2 días. Las células se incubaron inmediatamente con o sin extracto vegetal.
b) Soluciones de extracto vegetal
El extracto vegetal WEB-2 se resolvió en medio de cultivo y luego se preincubó con neuronas después del cultivo en placa celular. Se probaron las siguientes concentraciones en los pocillos de cultivo: 50, 100, 500 ng/mL, 1,5, 10, 50, 100 y 500 pg/mL. El extracto vegetal WEB-2 así como el BDNF (50 ng/mL) se probaron en placas de 96 pocillos (6 pocillos por condición).
c) Desarrollo de neuritas y evaluación de supervivencia neuronal
En los días 3 y 5 de cultivo, las neuronas corticales se fijaron mediante una solución fría de etanol al 95 % lote: SZBD1470V, Sigma) y ácido acético al 5 % (lote: SZBD1760V, Sigma) durante 5 min. Después de la permeabilización con 0.1 % de saponina, las células se incubaron durante 2 horas con un anticuerpo monoclonal anti-proteína asociada a microtúbulos 2 (lote: 063M4802, Sigma) a una dilución de 1/400 en PBS que contenía 1 % de suero bovino fetal y 0.1 % de saponina. Este anticuerpo tiñe específicamente los cuerpos celulares y las neuritas de las neuronas (MAP-2), lo que permite el estudio de la supervivencia de las neuronas y la evaluación de las neuritas en el cultivo. Una neurita se refiere a cualquier proyección del cuerpo celular de una neurona.
Este anticuerpo se reveló con IgG anti-ratón de cabra Alexa Fluor 488 (lote: 1397999, Molecular Probes) a la dilución de 1/400 en PBS que contenía suero bovino fetal al 1 % y saponina al 0.1 % durante 1 hora a temperatura ambiente.
Los cultivos inmunomarcados se examinaron automáticamente con ImageXpress (Molecular Devices) equipado con un LED con un aumento de x20. Para cada condición, se tomaron 30 fotografías (que representan aproximadamente el 80 % de la superficie total del pocillo) por pocillo. Todas las imágenes fueron tomadas con las mismas condiciones. El número de células MAP-2 positivas y las neuritas de las células MAP-2 positivas se analizaron automáticamente mediante el uso del editor de módulo personalizado (Molecular Devices). La supervivencia total y la red de neuritas se analizaron automáticamente mediante el uso del software MetaXpress (Molecular Devices).
Los datos se expresaron en porcentaje de las condiciones de control (sin extracto vegetal = 100 %). Todos los valores se expresaron como media /- SEM (es decir, media) de los 6 pocillos. Se realizan análisis estadísticos sobre las diferentes condiciones (ANOVA seguido de la prueba de Dunnett cuando se permite, mediante el uso del software GraphPad Prism).
d) Resultados
Las dosis más altas (500, 100 y 50 pg/mL) fueron tóxicas después de 2 días de cultivo, no se realizó ningún análisis de estas condiciones.
Los resultados se muestran en la Figura 2. El tratamiento con extracto vegetal WEB-2 (100, 500 ng/mL y 1 gg/mL) mostró un aumento significativo de la red de neuritas después de 3 días de tratamiento. El extracto fue capaz de inducir un crecimiento significativo de neuritas de neuronas corticales. No se observó ningún efecto para las 2 dosis más altas (5 y 10 gg/mL) y para la dosis más baja (50 ng/mL).
Además, el número total de neuronas corticales aumentó significativamente después de 3 días de tratamiento con WEB-2 (50, 100, 500 ng/mL, 1 gg/mL). Este efecto probablemente se debió a un efecto preventivo del extracto contra la apoptosis espontánea observada en cultivo y después de la siembra (Horisberger 2006. In Vitro Cell Dev Biol Anim. mayo-junio; 42 (5-6): 143-8.). Nuevamente, las 2 dosis más altas no fueron significativamente activas.
En el día 5, el tratamiento con WEB-2 (todas las dosis) mostró un aumento significativo de la red de neuritas (ver Figura 3). Curiosamente, el efecto disminuyó ligeramente con la dosis (a la dosis más alta, el extracto vegetal mostró menos eficacia). El extracto fue capaz de inducir un crecimiento significativo de neuritas de neuronas corticales. De manera similar, se observó un gran efecto significativo sobre el número total de neuronas corticales. Se observó nuevamente un efecto protector para todas las dosis. Este efecto probablemente se debió a un efecto preventivo del extracto contra la apoptosis espontánea observada en cultivo y después de la siembra. Una vez más, el efecto pareció depender de la dosis.
f) Conclusión
Después de la observación de neuronas, las neuronas tratadas con WEB-2 (todas las dosis y especialmente 500 gg/ml) mostraron una red de neuritas más larga e importante que la observada con el compuesto de prueba de referencia BDNF. La composición de WEB-2 parecía actuar sobre el crecimiento de neuritas al crear y mejorar la red de neuritas
Ejemplo 12: efecto de la composición de la invención sobre la exposición al glutamato
Este estudio investigó el efecto neuroprotector de la composición WEB-2 en cultivos corticales primarios de rata después de la exposición a glutamato (40 gM, aplicación de 20 min), un modelo in vitro de EA.
a) Cultivo de neuronas corticales
Las ratas hembra Wistar preñadas (JanvierLabs, Francia) a los 15 días de gestación fueron sacrificadas por dislocación cervical. Los fetos se prepararon como en el ejemplo 11.
Una vez obtenidas, las células se sembraron a una densidad de 30000 por pocillo en placas de 96 pocillos recubiertas previamente con poli-L-lisina (lote: 3102256, Corning Biocoat) y se cultivaron a 37 °C en incubadora con aire (95 %) y CO2 (5 %). El medio se cambió cada 2 días. Las neuronas corticales se intoxicaron con solución de glutamato.
b) Intoxicación con glutamato
El día 13 después del cultivo, se añadió glutamato (lote: 061M0030V, Sigma) al cultivo celular hasta una concentración final de 40 gM diluido en medio de control durante 20 min. Después de 20 min, las células se lavaron y se añadió nuevo medio fresco que contenía o no WEB-2 durante 48 h más.
WEB-2 (500 ng/mL, 1, 5, 10, 50, 100 y 500 gg/mL y 1 mg/mL) se resolvió y diluyó en medio de cultivo y luego se preincubó con neuronas corticales primarias durante 1 hora antes de la aplicación de glutamato, se añadió en coincubación, o 4, 8 y 12 h después de la aplicación de glutamato.
Se evaluaron las siguientes condiciones:
• Control (medio de cultivo)
• glutamato (40 gM, 20 min)
• glutamato (40 gM, 20 min) WEB-2 (en cada concentración)
c) Inmunotinción: supervivencia neuronal
Después de 48 horas de intoxicación por glutamato, las células se fijaron mediante una solución fría de etanol al 95 % (lote: SZBD1470V, Sigma) y ácido acético al 5 % (lote: SZBD1760V, Sigma) durante 5 min a -20 °C. Después de la permeabilización con 0.1 % de saponina (lote: BCBJ8417V, Sigma), las células se incubaron durante 2 h con anticuerpo monoclonal de ratón anti-proteína 2 asociada a microtúbulos (MAP-2) (lote: 063M4802; Sigma) a una dilución de 1/400 en PBS que contenía 1 % de suero bovino fetal y 0.1 % de saponina.
Este anticuerpo se reveló con IgG anti-ratón de cabra Alexa Fluor 488 a la dilución de 1/400 en PBS que contenía suero bovino fetal al 1 % y saponina al 0.1 % durante 1 h a temperatura ambiente.
d) Análisis de la red de neuritas
Los cultivos inmunomarcados se examinaron automáticamente con ImageXpress equipado con un LED con un aumento de x20. Para cada condición (6 pocillos de cultivo), se analizaron automáticamente 30 campos por pocillo (que representan aproximadamente el 80 % de la superficie total del pocillo). El número total de neuronas y la longitud de las neuritas se analizaron automáticamente mediante el uso del software MetaXpress.
e) Resultados
El glutamato (40 pM - 20 min) aplicado en cultivo de neuronas corticales primarias indujo una muerte neuronal significativa y una pérdida de la red de neuritas.
WEB-2, probado a 100 y 500 pg/mL mostró un efecto neuroprotector claro y significativo tanto en la supervivencia de las neuronas como en la red de neuritas cuando se agregó en el pretratamiento (1 h antes de la aplicación de glutamato) (figura 4).
De manera similar, a 500 pg/mL agregados en la coaplicación con glutamato, WEB-2 aún pudo proteger las neuronas y la red de neuritas de la lesión por glutamato (figura 5). La dosis más activa de WEB-2 fue de 500 pg/mL. A esta concentración, la red de neuritas estaba completamente protegida de la lesión por glutamato.
Sin embargo, la composición WEB-2 fue incapaz de rescatar neuronas cuando se aplicó 4 horas o más después de las agresiones de glutamato (figura 6).
Ejemplo 13: estudio de la toxicidad de los extractos de plantas hacia neuritas
El objetivo de este estudio fue probar 2 extractos diferentes (WEB-1 y WE-2 a diferentes concentraciones: 500 ng/mL, 1, 5, 10, 50, 100, 500 pg/mL y 1 mg/mL) sobre neuritogénesis y supervivencia de neuronas en cultivo de neuronas corticales primarias después de 3 días de incubación.
a) Cultivo de neuronas corticales
Las ratas hembra Wistar preñadas (JanvierLabs, Francia) a los 15 días de gestación fueron sacrificadas por dislocación cervical. Los fetos se prepararon como en el ejemplo 11.
Una vez obtenidas, las células se sembraron a una densidad de 30000 por pocillo en placas de 96 pocillos recubiertas previamente con poli-L-lisina (lote: 3102256, Corning Biocoat) y se cultivaron a 37 °C en incubadora con aire (95 %) y CO2 (5 %). El medio se cambió cada 2 días. Las células se incubaron inmediatamente con o sin WEB-1 o WE-2 (6 pocillos por condición).
b) Condiciones de las pruebas
Los extractos (500 ng/mL, 1, 5, 10, 50, 100, 500 pg/mL y 1 mg/mL) se resolvieron y diluyeron en medio de cultivo y luego se preincubaron con neuronas inmediatamente después del cultivo en placa.
Se evaluaron las siguientes condiciones:
Placa 1 para la evaluación del día 3
• Control
• WEB-1 (en cada concentración)
Placa 2 para la evaluación del día 3
• Control
• WE-2 (en cada concentración)
c) Inmunotinción: supervivencia neuronal
El día 3 de cultivo, las células se fijaron mediante una solución fría de etanol al 95 % (lote: SZBD1470V, Sigma) y ácido acético al 5 % (lote: SZBD1760V, Sigma) durante 5 min a -20°C. Después de la permeabilización con 0.1 % de saponina (lote: BCBJ8417V, Sigma), las células se incubaron durante 2 h con anticuerpo monoclonal de ratón antiproteína 2 asociada a microtúbulos (MAP-2) (lote: 063M4802; Sigma) a una dilución de 1/400 en PBS que contenía 1 % de suero bovino fetal y 0.1 % de saponina.
Este anticuerpo se reveló con IgG anti-ratón de cabra Alexa Fluor 488 a la dilución de 1/400 en PBS que contenía suero bovino fetal al 1 % y saponina al 0.1 % durante 1 ha temperatura ambiente.
d) Análisis del crecimiento de neuritas y evaluación de la supervivencia neuronal
Los cultivos inmunomarcados se examinaron automáticamente con ImageXpress equipado con un LED con un aumento de x20. Para cada condición (6 pocillos de cultivo), se analizaron automáticamente 30 campos por pocillo (que representan aproximadamente el 80 % de la superficie total del pocillo). El número de células positivas para MAP-2 y las neuritas de células positivas para MAP-2 se analizaron automáticamente mediante el uso del editor de módulo personalizado. (Molecular Devices). La supervivencia total y la red de neuritas se analizaron automáticamente mediante el uso del software MetaXpress (Molecular Devices).
Los datos se expresaron en porcentaje de las condiciones de control (sin extracto de planta = 100 %). Todos los valores se expresaron como media /- SEM (es decir, media) de los 6 pocillos. Se realizan análisis estadísticos sobre las diferentes condiciones (ANOVA seguido de la prueba de Dunnett, mediante el uso del software GraphPad Prism). e) resultados
Los resultados se muestran en las figuras 7 y 8.
El tratamiento con WEB-1 no mostró ningún efecto sobre el crecimiento de neuritas (figuras 7a y 7b). Todas las concentraciones probadas mostraron toxicidad en la red de neuritas (especialmente para las dosis más altas). Las mismas observaciones ocurren para la supervivencia de las neuronas, a las 5 dosis más altas, la toxicidad inducida por WEB-1 para las neuronas.
Las dosis más bajas no mostraron ningún efecto sobre la supervivencia de las neuronas (figura 7b) y fueron tóxicas en la red de neuritas (figura 7a).
WE-2 aplicado en neuronas durante 3 días mostró a las dosis más altas toxicidad en la red de neuritas, así como en la supervivencia de las neuronas (Figura 8a y 8b). Por el contrario, entre concentraciones de 500 ng/mL y 10 pg/mL, se observó un efecto significativo en la red de neuritas. No se observó ningún efecto sobre la supervivencia de las neuronas. En conclusión, WEB-1 indujo una gran toxicidad para neuritas y neuronas, especialmente a altas concentraciones. WE-2 fue eficaz al inducir el crecimiento de neuritas y promover la supervivencia de las neuronas.
Ejemplo 14: estudio de dos extractos vegetales hacia neuritas
El objetivo de este estudio fue probar 2 extractos diferentes (WEB-1 y WEB-2, respectivamente antes y después del tratamiento desintoxicante) a diferentes concentraciones: 500 ng/mL, 1, 5, 10, 50, 100, 500 pg/mL y 1 mg/ml) sobre la neuritogénesis y supervivencia de neuronas en cultivo de neuronas corticales primarias después de 3 días de incubación. f) Cultivo de neuronas corticales
Las ratas hembra Wistar preñadas (JanvierLabs, Francia) a los 15 días de gestación fueron sacrificadas por dislocación cervical. Los fetos se prepararon como en el ejemplo 13.
Una vez obtenidas, las células se sembraron a una densidad de 30000 por pocillo en placas de 96 pocillos recubiertas previamente con poli-L-lisina (Lote: 3102256, Corning Biocoat) y se cultivaron a 37 °C en incubadora con aire (95 %) y CO2 (5 %). El medio se cambió cada 2 días. Las células se incubaron inmediatamente con o sin WEB-1 o WEB-2 (6 pocillos por condición).
g) Condiciones de las pruebas
Los extractos (500 ng/mL, 1, 5, 10, 50, 100, 500 pg/mL y 1 mg/mL) se resolvieron y diluyeron en medio de cultivo y luego se preincubaron con neuronas inmediatamente después del cultivo en placa.
Se evaluaron las siguientes condiciones:
Placa 1 para la evaluación del día 3
• Control
• WEB-1 (en cada concentración)
Placa 2 para la evaluación del día 3
• Control
• WEB-2 (en cada concentración)
h) Inmunotinción: supervivencia neuronal
Este paso se ha realizado como en el ejemplo 13.
i) Análisis del crecimiento de neuritas y evaluación de la supervivencia neuronal
Los cultivos inmunomarcados se examinaron como se describe en el ejemplo 13.
j) Resultados
Los resultados se muestran en las figuras 9a y 9b.
La comparación entre WEB-1, es decir, una composición que contiene un extracto de Withania somnífera antes de la desintoxicación (según el ejemplo 1) y WEB-2, es decir, una composición que contiene un extracto de Withania somnífera después de la etapa de fermentación según el ejemplo 2, revela que el tratamiento con WEB-1 no mostró ningún efecto sobre el crecimiento de neuritas y que todas las concentraciones ensayadas mostraron toxicidad en la red de neuritas.
Por el contrario, el tratamiento con la composición WEB-2 muestra un efecto sobre el crecimiento de neuritas y sobre la red de neuritas, lo cual demuestra que la composición WEB-2, tratada según la invención mediante la combinación de una etapa de extracción y una etapa de fermentación carece de toxicidad hacia células y es capaz de tratar la EA y otros trastornos neurodegenerativos.

Claims (10)

  1. REIVINDICACIONES
    I. Una composición que contiene un extracto de Withania somnífera para su uso para tratar o prevenir enfermedades relacionadas con amiloides en un mamífero, preferiblemente un ser humano, en donde el extracto de Withania somnífera ha sido fermentado mediante su incubación con un hongo filamentoso en un ambiente adecuado.
  2. 2. La composición para su uso según la reivindicación 1, en donde la fermentación se realiza con un hongo filamentoso de la familia Cordycipitaceae, preferiblemente del género Beauveria y, más particularmente, Beauveria bassiana.
  3. 3. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que además contiene al menos un extracto de las siguientes plantas: Emblica officinalis, Bacopa monnieri, Púnica granatum, Curcuma longa, Piper longum, o Calendula officinalis.
  4. 4. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que además contiene un extracto de Emblica officinalis y un extracto de Bacopa monnieri.
  5. 5. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende una cantidad en peso de Withania somnifera de entre 5 y 100 g/L de Withania somnifera, y preferiblemente 20 g/L.
  6. 6. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende una cantidad en peso de Withania somnifera a una concentración de 20 g/L, de Emblica officinalis a una concentración de 15 g/L y de Bacopa monnieri a una concentración de 15 g/L.
  7. 7. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para tratar o prevenir la enfermedad de Alzheimer, la angiopatía amiloide cerebral, la miositis por cuerpos de inclusión o el síndrome de Down.
  8. 8. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde se reduce o inhibe la formación o deposición de fibrillas de amiloide, la neurodegeneración o la toxicidad celular.
  9. 9. La composición para su uso según la reivindicación 7, en donde dicha composición provoca en un paciente de Alzheimer una estabilización de la función cognitiva, prevención de un deterioro adicional de la función cognitiva o prevención, ralentización o detención de la evolución de la enfermedad.
  10. 10. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la composición se administra por vía oral.
    I I . La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde dicha composición se administra en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6936151B2 (ja) * 2015-04-13 2021-09-15 エトノディーヌ α−シヌクレイノパチーの治療のためのアシュワガンダ抽出物の使用
IT202000006094A1 (it) * 2020-03-23 2021-09-23 A M Italy S R L Composizione per l’uso nella terapia, in particolare per la cura dell’alzheimer

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2511195A1 (en) * 2002-12-20 2004-07-08 Council Of Scientific And Industrial Research Ayurvedic herbal soft drink
US20110274680A1 (en) 2009-10-02 2011-11-10 Mazed Mohammad A Chemical composition and its delivery for lowering the risks of alzheimer's, cardiov ascular and type-2 diabetes diseases
US8017147B2 (en) 2008-04-07 2011-09-13 Mazed Mohammad A Nutritional supplement for the prevention of cardiovascular disease, alzheimer's disease, diabetes, and regulation and reduction of blood sugar and insulin resistance
EP2318025A2 (en) 2008-07-28 2011-05-11 National Brain Research Centre Withania somnifera plant extract and method of preparation thereof
CN102329837A (zh) * 2011-09-01 2012-01-25 安徽农业大学 具有酪氨酸酶抑制剂和抗氧化剂作用的白僵菌提取物的制备方法
FR3007039B1 (fr) 2013-06-17 2016-07-22 Ethnodyne Procede d'obtention d'un extrait de plante et compositions associees

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