ES2843277T3 - Aplicación tópica para un anticuerpo anti-VHS - Google Patents

Abstract

Anticuerpo anti-VHS o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en el tratamiento de una infección aguda de tejido mucoso o epidérmico en un sujeto provocada por VHS-1 o VHS-2 seleccionada del grupo que consiste en herpes simple labial, herpes simple genital, infección por herpes simple cutánea crónica o diseminada, herpes gladiatorum y eccema herpético, en el que dicho anticuerpo va a administrarse por vía tópica, en el que el anticuerpo anti-VHS o el fragmento de unión a antígeno del mismo es capaz de inhibir la propagación de VHS de una célula infectada a una segunda célula no infectada adyacente (propagación célula a célula).

Description

DESCRIPCIÓN

Aplicación tópica para un anticuerpo anti-VHS

La presente invención se refiere a un anticuerpo anti-VHS o a un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en el tratamiento de una infección aguda de tejido mucoso o epidérmico en un sujeto provocada por VHS-1 o VHS-2 seleccionada del grupo que consiste en herpes simple labial, herpes simple genital, infección por herpes simple cutánea crónica o diseminada, herpes gladiatorum y eccema herpético, en el que dicho anticuerpo va a administrarse por vía tópica, en el que el anticuerpo anti-VHS o el fragmento de unión a antígeno del mismo es capaz de inhibir la propagación del VHS de una célula infectada a una segunda célula no infectada adyacente (propagación célula a célula), así como a una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

El virus del herpes simple (VHS) se refiere a dos miembros estrechamente relacionados de la familia herpesviridae, virus del herpes simple tipo 1 (VHS-1) y virus del herpes simple tipo 2 (VHS-2). VHS-1 y VHS-2 se encuentran entre las infecciones virales más comunes en el mundo. Las infecciones por VHS-1 a menudo se adquieren en la primera infancia como infecciones subclínicas, mientras que un subconjunto presenta enfermedad grave. VHS-2 generalmente se adquiere a través de la actividad sexual y provoca principalmente lesiones en la zona genital. La infección con el virus del herpes se clasifica en uno de varios trastornos distintos basándose en el sitio de infección. El herpes oral (herpes simple labial), cuyos síntomas visibles se denominan coloquialmente calenturas o pupas, es una infección de la cara o la boca. El herpes oral es la forma más común de infección. El herpes genital (herpes simple genital) es la segunda forma más común de herpes. Otros trastornos tales como paroniquia, herpes gladiatorum, herpes ocular (herpes simple corneal o queratitis por herpes simple), encefalitis por infección por herpes cerebral, meningitis de Mollaret, herpes neonatal y posiblemente parálisis de Bell están todos provocados por virus del herpes simple.

Después de la infección primaria, el VHS se propaga desde células epiteliales infectadas hasta los axones de neuronas sensoriales que inervan el sitio de la infección primaria seguido por transporte retrógrado a los ganglios de la raíz dorsal respectivos, donde el VHS establece un reservorio latente de por vida. La infección por VHS de las neuronas existe como un estado reversible y pueden producirse episodios de reactivación viral (brotes) de vez en cuando. La reactivación del virus puede desencadenarse por una amplia gama de estímulos de estrés (por ejemplo, inmunodeficiencia, traumatismo, fiebre, menstruación, luz UV y relaciones sexuales) que actúan sobre la neurona, o en un sitio periférico inervado por el ganglio infectado, o sistémicamente. Las reactivaciones intermitentes de VHS dan como resultado la producción de VHS infeccioso a partir de neuronas infectadas de manera latente. Una vez reactivado, el virus se transporta por la neurona de vuelta a las terminales nerviosas en el epitelio.

La patología de las infecciones por VHS está provocada principalmente por un efecto citopático directo del virus, lo que da como resultado lisis celular y necrosis focal de la zona infectada. El herpes simple se transmite lo más fácilmente por contacto directo con una lesión o el líquido corporal de un individuo infectado. El herpes oral se diagnostica fácilmente si el paciente presenta llagas o úlceras visibles. La transmisión también puede producirse a través del contacto piel a piel durante períodos de excreción asintomático. Aunque la mayoría de los individuos infectados con herpes genital son asintomáticos, pueden producirse manifestaciones clínicas graves, especialmente en poblaciones con estados inmunológicos subyacentes. El VHS-2 aumenta el riesgo de contraer VIH en de dos a tres veces, así como la transmisión de VIH en individuos doblemente infectados. Además, el herpes genital puede transmitirse perinatalmente y provocar una infección neonatal por VHS potencialmente mortal. Los métodos de protección de barrera son el método más fiable para prevenir la transmisión del herpes, pero simplemente reducen el riesgo en lugar de eliminarlo.

Aún no se ha desarrollado una cura para el herpes. Una vez infectado, el virus permanece en el cuerpo de por vida. Pueden producirse infecciones recurrentes (brotes) de vez en cuando. Sin embargo, después de varios años, los brotes se vuelven menos graves y más esporádicos, y algunas personas se vuelven perpetuamente asintomáticos y ya no experimentarán brotes, aunque aún pueden ser contagiosos para otros. Los tratamientos con antivirales pueden reducir la excreción viral y aliviar la gravedad de los episodios sintomáticos.

El herpes simple labial (también denominado calenturas, herpes simple labial, herpes labial recurrente o herpes orolabial) es un tipo de herpes simple que se produce en el labio, es decir, una infección provocada por el virus del herpes simple (VHS). Un brote provoca normalmente pequeñas ampollas o llagas en o alrededor de la boca comúnmente conocidas como calenturas o pupas. Las calenturas normalmente se curan en el plazo de 2 a 3 semanas, pero el virus del herpes permanece latente en los nervios faciales, después de la infección orofacial, reactivándose periódicamente (en personas sintomáticas) para crear llagas en la misma zona de la boca o la cara en el sitio de la infección original. La calentura tiene una tasa de frecuencia que varía desde episodios poco comunes hasta 12 o más reapariciones al año. Las personas con el estado normalmente experimentan de uno a tres ataques anuales. La frecuencia y gravedad de los brotes generalmente disminuye a lo largo del tiempo.

El herpes simple genital (o herpes genital) es una infección genital provocada por el virus del herpes simple. Un estudio de 1998 indicó que era la infección de transmisión sexual más común por el número de casos. La mayoría de los individuos portadores de herpes no saben que se han infectado y muchos nunca padecerán un brote, que implica ampollas similares a las calenturas. Aunque no hay cura para el herpes, a lo largo del tiempo los síntomas son cada vez más leves y los brotes son cada vez menos frecuentes. Tal como se mencionó, el VHS se ha clasificado en dos categorías distintas, VHS-1 y VHS-2. Aunque el herpes genital estaba provocado principalmente por VHS-2, las infecciones genitales por VHS-1 están aumentando y ahora provocan hasta el 80 % de las infecciones. Cuando es sintomático, la manifestación típica de una infección genital primaria por VHS-1 o VHS-2 son grupos de úlceras genitales que consisten en vesículas y pápulas inflamadas en la superficie externa de los genitales, que se asemejan a calenturas. Estas aparecen habitualmente 4-7 días después de la exposición sexual a VHS por primera vez. La infección genital por VHS-1 reaparece a una tasa de aproximadamente una sexta parte de la del v HS-2 genital. La queratitis simple herpética es una inflamación del ojo provocada predominantemente por infección recurrente por VHS de la córnea. La infección ocular con VHS puede provocar enfermedad ocular de diferente gravedad, que oscila entre conjuntivitis y queratitis dendrítica hasta edema estromal y queratitis estromal necrotizante. VHS-1 provoca más del 90 % de las infecciones oculares por VHS y es la causa principal de ceguera inducida por virus en los países desarrollados.

Por otra parte, existen otras infecciones por VHS bastante poco comunes del tejido mucoso o epidérmico que se abordarán brevemente a continuación. Se sabe que las infecciones cutáneas crónicas o diseminadas por herpes simple no están restringidas al tracto labial o genital. Principalmente, los pacientes inmunodeficientes se ven afectados por esta enfermedad como, por ejemplo, pacientes con hipogammaglobulinema o pacientes con linfomas cutáneos de células T. El herpes simple cutáneo crónico es una presentación clínica distintiva del virus del herpes simple (VHS) en un huésped comprometido. Esta infección puede definirse como lesiones cutáneas destructivas crónicamente activas que potencialmente pueden progresar a la forma diseminada (sistémica). Mientras que la mayoría de las infecciones por VHS presentan episodios que muestran curación en una o dos semanas, las lesiones del herpes simple cutáneo crónico tienen un transcurso indolente que puede durar varios meses. El herpes simple cutáneo crónico, que es común en pacientes inmunodeprimidos, se caracteriza por lesiones atípicas, crónicas y persistentes, que complican y retrasan el diagnóstico. Esto puede conducir a muerte provocada por complicaciones asociadas. Es de vital importancia que, cuando se evalúan las úlceras crónicas de larga duración, especialmente en niños, se considere la posibilidad de una infección crónica por virus del herpes simple.

El herpes gladiatorum se refiere a una infección cutánea por herpes que se produce en la adolescencia entre los luchadores, pero también es común en otros deportes de contacto. Se produce habitualmente en la cabeza, lo más comúnmente en la zona de la mandíbula, el cuello, el pecho, la cara, el estómago y las piernas. El eccema herpético, también conocido como una forma de erupción variceliforme de Kaposi provocada por infección viral, habitualmente con el virus del herpes simple (VHS), es una erupción vesicular cutánea extensa que surge de una enfermedad cutánea preexistente, habitualmente dermatitis atópica (AD). Los niños con AD tienen un mayor riesgo de desarrollar eccema herpético, en el que VHS tipo 1 (VHS-1) es el patógeno más común. El eccema herpético puede ser grave, progresando a infección diseminada y muerte si no se trata.

Las enfermedades provocadas por VHS, en particular el herpes simple labial y el herpes simple genital, representan las enfermedades infecciosas más comunes de la piel.

En la actualidad, es convencional usar agentes virostáticos en la terapia antiviral frente al VHS. Los agentes virostáticos más comunes (por ejemplo, aciclovir, penciclovir, foscarnet, idoxuridina) son análogos de nucleósidos o pirofosfatos cuyo principio activo común se basa en la inhibición de la síntesis de ADN en células infectadas por virus. En otras palabras, estos agentes virostáticos solo son efectivos en células infectadas mientras el virus está replicándose activamente. En un estudio de doble ciego controlado con placebo con 1385 pacientes con infección aguda por herpes simple labial, se ha demostrado que aciclovir (en forma de Zovirax Cream) es capaz de reducir la infección en 0,5 días (es decir, de 5 días a 4,5 días) tras la administración diaria 5 veces durante 4 días en comparación con pacientes tratados con placebo. Además, un tratamiento de este tipo tiene la desventaja de que no puede prevenirse el desarrollo de lesiones que son típicas para el herpes.

Recientemente, se ha descrito un anticuerpo murino y uno correspondientemente humanizado que reconoce específicamente la glicoproteína B (gB) de VHS tipo 1 (VHS-1) y VHS-2. VHS-gB es una parte integral del sistema de fusión de múltiples componentes requerido para la entrada del virus y la fusión célula a célula. Se ha demostrado que este anticuerpo, el anticuerpo monoclonal AcM 2c, neutraliza el virus al suprimir la propagación viral célula a célula, un mecanismo clave por el cual el VHS-1/2 escapa a la vigilancia inmunitaria humoral independientemente de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o de la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); Eis-Hübinger et al., Intervirology 32:351-360 (1991); Eis-Hübinger et al., Journal of General Virology 74:379-385 (1993); documento WO2011/038933 A2; Krawczyk A, et al., Journal of virology (2011);85(4):1793-1803; Krawczyk A, et al., Proc Natl Acad Sci U S A (2013);110(17):6760-6765.

Sin embargo, estos anticuerpos solo se han administrado sistémicamente (es decir, mediante, por ejemplo, administración intravenosa, intramuscular o subcutánea) de acuerdo con la lógica que excluye la administración oral de anticuerpos debido a su tamaño, naturaleza hidrófila y degradación en el estómago. Por tanto, los anticuerpos de la técnica anterior no se han administrado localmente en la superficie de la piel, sino solo sistemáticamente. El documento WO 2005/023303 da a conocer un método para el tratamiento de VHS mediante una administración intravenosa de fracciones de IgA de suero humano o fracciones de IgG de plasma humano, al tiempo que se mencionan una administración tópica así como las enfermedades herpes labial y herpes genital.

Aunque se ha descrito previamente la administración tópica de anticuerpos, una aplicación de este tipo solo se ha sugerido para uso profiláctico en la prevención de enfermedades por VHS-2 de transmisión sexual. Sherwood et al., Nat. Biotechnol. 14(4):468-471 (1996) describen la inmunoprotección profiláctica tópica pasiva de ratones hembra contra el herpes genital en un modelo de ratón de infección por VHS-2 de transmisión vaginal mediante un anticuerpo monoclonal frente a VHS-2. De manera similar, Zeitlin et al., Virology 225(1):213-215 (1996), Zeitlin et al., Contraception 56(5):329-335 (1997), Zeitlin et al., J. Reprod. Immunol. 40(1):93-101 (1998) y Zeitlin et al., Nat. Biotechnol. 16(13):1361-1364 (1998) describen la administración tópica profiláctica de anticuerpos anti-VHS-2 en la prevención de la transmisión sexual del VHS-2.

Además, se ha descrito que el anticuerpo frente a TNF-alfa infliximab mejora la cicatrización de heridas crónicas tras su aplicación tópica (Streit et al., International Wound Journal 3(3):171-179 (2006)), mientras que la aplicación tópica de anticuerpos policlonales y monoclonales contra Pseudomonas aeruginosa se ha descrito previamente (documento US 4.994.269). Además, Clement et al., ARVO, Abstract/Poster 6155/D1015 describen la administración tópica de un anticuerpo que selecciona como diana fosfatidilserina (PS) en un modelo de conejo de queratitis aguda por VHS-1, mientras que Yu et al., Eye Science 12(3):145-150 (1996) describen el uso tópico de anticuerpos monoclonales antiglicoproteína de VHS en queratitis herpética aguda de conejos infectados por VHS-1. El documento WO 2010/128053 describe el uso de un fragmento de anticuerpo que se une al antígeno de superficie viral glicoproteína D que neutraliza VHS-1 y VHS-2 para administración tópica ocular para tratar enfermedades oculares como queratitis ocular.

Por tanto, existe la necesidad de proporcionar medios y métodos mejorados para el tratamiento de infecciones agudas por herpes simple que faciliten los regímenes de administración conocidos en la técnica y prevengan la propagación local de la infección.

La presente invención proporciona un anticuerpo anti-VHS o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en el tratamiento de una infección aguda de tejido mucoso o epidérmico en un sujeto provocada por VHS-1 o VHS-2 seleccionada del grupo que consiste en herpes simple labial, herpes simple genital, infección por herpes simple cutánea crónica o diseminada, herpes gladiatorum y eccema herpético, en el que dicho anticuerpo va a administrarse por vía tópica, en el que el anticuerpo anti-VHS o el fragmento de unión a antígeno del mismo es capaz de inhibir la propagación del VHS de una célula infectada a una segunda célula no infectada adyacente (propagación de célula a célula), así como a una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. Sorprendentemente, la presente invención demuestra que la administración tópica de un anticuerpo anti-VHS humanizado en una infección aguda del tejido de los labios tras la infección por VHS elimina la infección en el plazo de 24 horas, al tiempo que se previene la propagación local de la infección por herpes mediante propagación célula a célula, evitando de ese modo la generación de lesiones. A diferencia de los agentes virostáticos descritos anteriormente usados en el tratamiento de infecciones virales como herpes simple labial, el anticuerpo anti-VHS de la presente invención es capaz de neutralizar rápidamente el virus mediante un mecanismo que es independiente de la replicación viral. Beneficiosamente, se demuestra que el anticuerpo de la invención suprime la ruta lítica del virus, evitando de ese modo lesiones cutáneas.

En vista de la técnica anterior, el problema técnico subyacente a la presente invención es la provisión de medios y métodos mejorados para el tratamiento de infecciones agudas por herpes simple, lo que facilita los regímenes de administración conocidos en la técnica y previene la propagación local de la infección.

El problema técnico se soluciona mediante la provisión de las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

Tal como se mencionó anteriormente, se ha demostrado sorprendentemente en los ejemplos adjuntos que la administración tópica de un anticuerpo anti-VHS humanizado en una infección aguda del tejido de los labios tras la infección por VHS elimina rápidamente la infección en el plazo de 24 horas al tiempo que se previene la propagación local de la infección por herpes a través de la propagación célula a célula, evitando de ese modo la generación de lesiones.

Este hallazgo es, en particular, sorprendente e inesperado a la luz de la técnica anterior comentada anteriormente en relación con la administración sistémica tal como se describe en Eis-Hübinger et al., Intervirology 32:351-360 (1991); Eis-Hübinger et al., Journal of General Virology 74:379-385 (1993); documento WO2011/038933 A2; Krawczyk A, et al., Journal of virology (2011);85(4):1793-1803; Krawczyk A, et al., Proc Natl Acad Sci U S A (2013); 110(17):6760-6765; el tratamiento profiláctico tal como se describe en Sherwood et al., Nat. Biotechnol. 14(4):468-471 (1996); Zeitlin et al., Virology 225(1):213-215 (1996); Zeitlin et al., Contraception 56(5):329-335 (1997); Zeitlin et al., J. Reprod. Immunol. 40(1):93-101 (1998) y Zeitlin et al., Nat. Biotechnol. 16(13):1361-1364 (1998); y el tratamiento tópico con un anticuerpo anti-glicoproteína de VHS en la infección aguda por queratitis por herpes simple, tal como se describe en Yu et al., Eye Science 12(3):145-150 (1996) (y Clement et al., ARVO, Abstract/Poster 6155/D1015; así como el documento W o 2010/128053) por los siguientes motivos. En contraste con la técnica anterior, se ha demostrado que la administración tópica de un anticuerpo anti-VHS humanizado en una infección aguda del tejido de los labios tras la infección por VHS elimina rápidamente la infección en el plazo de 24 horas, mientras que la propagación local de la infección por herpes por medio de propagación célula a célula se previene, evitando de ese modo la generación de lesiones. La naturaleza sorprendente de este hallazgo, es decir, que un anticuerpo anti-VHS humanizado o fragmento del mismo pueda usarse en la terapia tópica de infecciones recurrentes por VHS de epitelios de la mucosa o la piel es, en particular, sorprendente e inesperado teniendo en cuenta los conocimientos básicos sobre la estructura de la epidermis. Las capas de epitelio de la piel humana y epitelios de membranas mucosas separan físicamente el organismo de su entorno y sirven como su primera línea de defensa estructural y funcional contra la deshidratación, sustancias químicas, ataques físicos y microorganismos. Células epiteliales altamente polarizadas forman las capas apicales de la epidermis y células menos diferenciadas la región basal, donde residen las células progenitoras epidérmicas. Las uniones ocluyentes, las denominadas uniones herméticas (TJ), ubicadas en las membranas plasmáticas laterales de la capa viva más superficial, el estrato granuloso (Brandner, et al., 2002 Eur J Cell Biol 81, 253-263; Furuse et al., 2002, J Cell Biol 156, 1099-1111) garantizan la función de barrera epidérmica entre la capa apical (estrato córneo) y las capas basolaterales (estrato espinoso, estrato basal y lámina basal). El sitio principal de replicación de VHS y producción de virus de progenie en la piel son los queratinocitos menos diferenciados, en proliferación de la región basal (estrato basal) (Mingo et al., 2012, J Virol 86, 7084-7097; Schelhaas et al., 2003, J Gen Virol 84, 2473-2484). La patogénesis de la infección primaria requiere que el VHS acceda a las células nucleadas permisivas en la epidermis media a basal por medio de brechas microscópicas en la epidermis que se producen, por ejemplo, con el coito. La reactivación del genoma de VHS de la latencia dentro de los ganglios conduce al transporte de viriones recién formados por tráfico hacia abajo de los microtúbulos de los axones para su liberación en terminales sinápticas en la unión dérmico-epidérmica o dentro de la capa media de la epidermis (Diefenbach et al., 2008, Rev Med Virol 18, 35-51). El VHS necesita cruzar el hueco axónico-epitelial para la replicación posterior en la región basal de la epidermis. La inmunidad humoral desempeña un papel importante en el control de la infección por VHS. Se desarrollan anticuerpos séricos circulantes, que pueden unirse a glicoproteínas de la envuelta viral necesarias para la entrada viral, durante la infección (Cohen et al., 1984, Journal of virology 49, 102-108). Se ha mostrado que la presencia de anticuerpos séricos maternos específicos para VHS reduce la transmisión neonatal del VHS-2 (Brown et al., 1991, N Engl J Med 324, 1247-1252). Anticuerpos séricos neutralizantes son capaces de unirse al virus en el hueco entre las terminaciones neuronales y las células epiteliales y limitar la transferencia viral bidireccional entre estos tejidos (Mikloska et al., 1999, Journal of virology 73, 5934-5944). Evidentemente, anticuerpos séricos o anticuerpos aplicados sistémicamente limitan la extensión de la infección por VHS. Sin embargo, las uniones herméticas (TJ), que están restringidas al estrato granuloso, forman una barrera para moléculas más grandes (Helfrich et al., 2007, J Invest Dermatol 127, 782-791; Mertens et al., 2005, J Cell Biol 170, 1029-1037; Yuki et al., 2007, Exp Dermatol 16, 324-330). Por tanto, fue muy sorprendente que la aplicación tópica de una molécula grande como un anticuerpo a la piel externa fuera capaz de erradicar una infección recurrente por VHS de manera eficaz y prevenir la formación de lesiones. Por tanto, por este motivo, fue sorprendente frente a una administración sistémica, que una administración local, tópica elimine rápidamente la infección tal como se ejemplifica en los ejemplos. Por otra parte, aunque la técnica anterior describe la protección de la infección primaria por VHS-2 de transmisión sexual mediante una aplicación profiláctica tópica de anticuerpos anti-VHS, el tratamiento de una infección aguda es sorprendente porque en el entorno experimental de la técnica anterior comentado anteriormente, se aplicaron por vía tópica anticuerpos anti-VHS a la vagina antes de suministrar el inóculo del virus. La carga viral está neutralizándose como en un ensayo bidimensional de neutralización in vitro, donde los anticuerpos neutralizantes evitan la unión de partículas de virus libres a las células diana y la replicación del virus en realidad no tiene lugar. Esto contrasta fuertemente con el tratamiento de una infección aguda que sorprendentemente ha demostrado que elimina rápidamente la infección por la administración tópica de un anticuerpo de la presente invención tal como se ejemplifica en los ejemplos.

Además, aunque la técnica anterior describe el tratamiento tópico con un anticuerpo anti-glicoproteína de VHS en queratitis aguda por herpes simple, un anticuerpo anti-VHS o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en el tratamiento de una infección aguda de tejido mucoso o epidérmico en un sujeto provocada por VHS-1 o VHS-2 seleccionada del grupo que consiste en herpes simple labial, herpes simple genital, infección por herpes simple cutánea crónica o diseminada, herpes gladiatorum y eccema herpético, en el que dicho anticuerpo va a administrarse por vía tópica, es sorprendente por los siguientes motivos. El sitio principal de replicación de VHS y producción de virus de progenie en la piel son los queratinocitos menos diferenciados, en proliferación de la región basal (Mingo et al., 2012, J Virol 86, 7084-7097; Schelhaas et al., 2003, J Gen Virol 84, 2473-2484). Se ha demostrado que las uniones herméticas (TJ), que están restringidas al estrato granuloso, forman una barrera para moléculas más grandes (Helfrich et al., 2007, J Invest Dermatol 127, 782-791; Mertens et al., 2005, J Cell Biol 170, 1029-1037; Yuki et al., 2007, Exp Dermatol 16, 324-330). Por tanto, fue muy sorprendente que la aplicación tópica de una molécula grande como un anticuerpo a la piel externa fuera capaz de erradicar una infección recurrente por VHS de manera eficaz y prevenir la formación de lesiones. En contraste con el epitelio de la piel y los epitelios de las membranas mucosas, la córnea del ojo es un epitelio escamoso estratificado no queratinizado, que es extremadamente delgado y consiste en células de rápido crecimiento y fácilmente regeneradas. Todas las capas del epitelio ocular experimentan constantemente mitosis. El epitelio corneal proporciona una superficie lisa que absorbe el oxígeno y los nutrientes celulares de las lágrimas, luego distribuye estos nutrientes al resto de la córnea. Otra diferencia importante con el epitelio de la piel y los epitelios de las membranas mucosas es algún grado de fuga del endotelio corneal, que es esencial para la difusión de nutrientes. Estudios ulturaestructurales del endotelio corneal confirmaron que existen huecos en proteínas de uniones herméticas específicas y que las uniones herméticas de la córnea son uniones “con fugas” (Barry et al., 1995, Invest Ophthalmol Vis Sci 36, 1115-1124; Noske et al., 1994, Ger J Ophthalmol 3, 253-257; Petroll et al., 1999, Curr Eye Res 18, 10-19). La córnea del ojo es un sitio inmunológicamente privilegiado. La superficie ocular está constantemente cubierta por una película lagrimal, que además consiste en gran parte en agua aunque contiene varias proteínas que tienen actividad antiviral tales como anticuerpos de inmunoglobulina A, lisozima, complemento y amilasa. Se ha demostrado la presencia de anticuerpos anti-VHS en lágrimas (Centifanto et al., 1970, Ann NY Acad Sci 173, 649-656; Fox et al., 1986, The British journal of ophthalmology 70, 584-588; Shani et al., 1985, Curr Eye Res 4, 103-111). Por tanto, la aplicación tópica de anticuerpos recombinantes puede ser beneficiosa para el tratamiento de infecciones por herpes oculares. Sin embargo, por los motivos anteriores, fue inesperado que la aplicación tópica de una molécula grande como un anticuerpo a la piel externa fuera capaz de erradicar una infección recurrente por VHS eficazmente y prevenir la formación de lesiones.

Las infecciones de tejido mucoso o epidérmico que va a tratarse con el anticuerpo anti-VHS o un fragmento de unión a antígeno que están provocadas por VHS-1 o VHS-2, es decir, las infecciones seleccionadas del grupo que consiste en herpes simple labial, herpes simple genital, infección por herpes simple cutánea crónica o diseminada, herpes gladiatorum y eccema herpético las conocen bien los expertos en la técnica y representan enfermedades bien definidas. Tal como ya se mencionó anteriormente, el herpes simple labial (también denominado calenturas, herpes simple labial, herpes labial recurrente o herpes orolabial) es un tipo de herpes simple que se produce en el labio, es decir, una infección por el virus del herpes simple (VHS). Un brote provoca normalmente pequeñas ampollas o llagas en o alrededor de la boca comúnmente conocidas como calenturas o pupas. Las calenturas normalmente se curan en el plazo de 2 a 3 semanas, pero el virus del herpes permanece latente en los nervios faciales, después de la infección orofacial, reactivándose periódicamente (en personas sintomáticas) para crear llagas en la misma zona de la boca o la cara en el sitio de la infección original. La calentura tiene una tasa de frecuencia que varía desde episodios poco comunes hasta 12 o más reapariciones al año. Las personas con el estado normalmente experimentan de uno a tres ataques anuales. La frecuencia y gravedad de los brotes generalmente disminuye a lo largo del tiempo. El herpes simple genital (o herpes genital) es una infección genital provocada por el virus del herpes simple. Un estudio de 1998 indicó que era la infección de transmisión sexual más común por el número de casos. La mayoría de los individuos portadores de herpes no saben que se han infectado y muchos nunca padecerán un brote, que implica ampollas similares a las calenturas. Aunque no hay cura para el herpes, a lo largo del tiempo los síntomas son cada vez más leves y los brotes son cada vez menos frecuentes. Tal como se mencionó, el VHS se ha clasificado en dos categorías distintas, VHS-1 y VHS-2. Aunque el herpes genital estaba provocado principalmente por VHS-2, las infecciones genitales por VHS-1 están aumentando y ahora provocan hasta el 80 % de las infecciones. Cuando es sintomático, la manifestación típica de una infección genital primaria por VHS-1 o VHS-2 son grupos de úlceras genitales que consisten en vesículas y pápulas inflamadas en la superficie externa de los genitales, que se asemejan a calenturas. Estas generalmente aparecen 4-7 días después de la exposición sexual a VHS por primera vez. La infección genital por VHS-1 reaparece a una tasa de aproximadamente una sexta parte de la del VHS-2 genital. Se sabe que las infecciones cutáneas crónicas o diseminadas por herpes simple no están restringidas al tracto labial o genital. Principalmente, los pacientes inmunodeficientes se ven afectados por esta enfermedad como, por ejemplo, pacientes con hipogammaglobulinema o pacientes con linfomas cutáneos de células T. El herpes simple cutáneo crónico es una presentación clínica distintiva del virus del herpes simple (VHS) en un huésped comprometido. Esta infección puede definirse como lesiones cutáneas destructivas crónicamente activas que potencialmente pueden progresar a la forma diseminada (sistémica). Mientras que la mayoría de las infecciones por VHS presentan episodios que muestran curación en una o dos semanas, las lesiones del herpes simple cutáneo crónico tienen un transcurso indolente que puede durar varios meses. El herpes simple cutáneo crónico, que es común en pacientes inmunodeprimidos, se caracteriza por lesiones atípicas, crónicas y persistentes, que complican y retrasan el diagnóstico. Esto puede conducir a muerte provocada por complicaciones asociadas. Es de vital importancia que, cuando se evalúan úlceras crónicas de larga duración, especialmente en niños, se considere la posibilidad de una infección crónica por virus del herpes simple. El herpes gladiatorum es una infección cutánea por herpes que se produce en la adolescencia entre los luchadores, pero también es común en otros deportes de contacto. Se produce habitualmente en la cabeza, lo más comúnmente en la zona de la mandíbula, el cuello, el pecho, la cara, el estómago y las piernas. El eccema herpético, también conocido como una forma de erupción variceliforme de Kaposi provocada por infección viral, habitualmente con el virus del herpes simple (VHS), es una erupción vesicular cutánea extensa que surge de una enfermedad cutánea preexistente, habitualmente dermatitis atópica (AD). Los niños con AD tienen un mayor riesgo de desarrollar eccema herpético, en el que VHS tipo 1 (VHS-1) es el patógeno más común. El eccema herpético puede ser grave, progresando a infección diseminada y muerte si no se trata.

El anticuerpo o fragmento del mismo usado en el contexto de la presente invención para su uso en el tratamiento de una infección aguda de tejido mucoso o epidérmico en un sujeto provocada por VHS-1 o VHS2 no está particularmente limitado siempre que se trate de un anticuerpo anti-VHS o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Por tanto, el anticuerpo puede ser cualquier anticuerpo que se une específicamente a o reconoce específicamente o interacciona con un VHS, es decir, un dominio o un antígeno de un VHS.

El término “que se une a” tal como se usa en el contexto de la presente invención define una unión (interacción) de al menos dos “sitios de interacción con el antígeno” entre sí. El término “sitio de interacción con el antígeno” define, según la presente invención, un motivo de un polipéptido, es decir, una parte del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la presente invención, que muestra la capacidad de interacción específica con un antígeno específico o un grupo específico de antígenos del VHS. Dicha unión/interacción también se entiende que define un “reconocimiento específico”. El término “que reconoce específicamente” significa, según esta invención, que el anticuerpo es capaz de interaccionar con y/o unirse específicamente a al menos dos aminoácidos de cada uno de un VHS tal como se define en el presente documento. Los anticuerpos pueden reconocer, interaccionar y/o unirse a diferentes epítopos en un VHS. Este término se refiere a la especificidad de la molécula de anticuerpo, es decir, a su capacidad para discriminar entre las regiones específicas de un VHS.

El término “interacción específica”, tal como se usa según la presente invención, significa que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención no reacciona o no reacciona de manera cruzada esencialmente con (poli)péptidos de estructuras similares. En consecuencia, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención se une a/interacciona con específicamente estructuras de un VHS, preferiblemente VHS-1 o VHS-2. A continuación se facilitan en el presente documento ejemplos específicos de tales moléculas contra las cuales está dirigido un primer y segundo dominio derivado de Ig.

La reactividad cruzada de un panel de anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos en investigación puede someterse a prueba, por ejemplo, evaluando la unión de dicho panel de anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos en condiciones convencionales (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988) y Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1999)) al (poli)péptido de interés, así como a varios (poli)péptidos más o menos (estructural y/o funcionalmente) relacionados de manera estrecha. Solo aquellos constructos (es decir, anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno de los mismos y similares) que se unen a la determinada estructura del VHS, por ejemplo, un epítopo específico o (poli)péptido/proteína del VHS, pero que no se unen o no se unen esencialmente a ninguno de los demás epítopos o (poli)péptidos del mismo VHS, se consideran específicos para el epítopo o (poli)péptido/proteína de interés y se seleccionan para estudios adicionales según el método proporcionado en el presente documento. Estos métodos pueden comprender, entre otros, estudios de unión, estudios de bloqueo y competición con moléculas estructural y/o funcionalmente relacionadas de manera estrecha. Estos estudios de unión también comprenden análisis de FACs , resonancia de plasmones superficiales (SPR, por ejemplo, con BIAcore®), ultracentrifugación analítica, calorimetría de titulación isotérmica, anisotropía de fluorescencia, espectroscopia de fluorescencia o mediante ensayos de unión de ligandos radiomarcados.

El término “que se une a” no solo se refiere a un epítopo lineal, sino que también puede referirse a un epítopo conformacional, un epítopo estructural o un epítopo discontinuo que consiste en dos regiones de las moléculas diana humanas o partes de las mismas. En el contexto de esta invención, un epítopo conformacional se define por dos o más secuencias diferenciadas de aminoácidos separados en la secuencia primaria que se juntan en la superficie de la molécula cuando el polipéptido se pliega a la proteína nativa (Sela, Science 166 (1969), 1365 y Laver, Cell 61 (1990), 553-536). Además, el término “que se une a” se usa indistintamente en el contexto de la presente invención con los términos “que interacciona con” o “que reconoce”.

En consecuencia, la especificidad puede determinarse experimentalmente por métodos conocidos en la técnica y métodos descritos en el presente documento. Tales métodos comprenden, pero no se limitan a inmunotransferencias de tipo Western, pruebas de ELISA, RIA, ECL, IRMA y escaneos de péptidos.

El tratamiento de la presente invención se refiere al tratamiento de infecciones agudas. “Agudo” en este sentido significa que el sujeto muestra síntomas de la enfermedad. En otras palabras, el sujeto que va a tratarse necesita realmente un tratamiento y el término “tratamiento agudo” en el contexto de la presente invención se refiere a las medidas adoptadas para tratar realmente la enfermedad después del inicio o el brote de la enfermedad. El término “agudo” mencionado en el contexto de la presente invención se opone a un tratamiento profiláctico o preventivo, es decir, medidas adoptadas para prevenir la enfermedad, por ejemplo, con el fin de prevenir la infección y/o el inicio/brote de la enfermedad. Más específicamente, tratamiento profiláctico puede entenderse de una manera que impide la unión de partículas de virus libres (desde fuera del cuerpo) a las células diana y, a su vez, impide la replicación del virus. Por el contrario, en una infección aguda (que podría ser una infección primaria o recurrente) se ha generado virus de progenie tras la replicación de VHS. Por tanto, el “tratamiento agudo” mencionado en la presente invención no se refiere explícitamente al tratamiento profiláctico o preventivo de una infección provocada por VHS-1 o VHS-2. El tejido mucoso que puede presentar una infección aguda se refiere a tejidos de las membranas mucosas que son revestimientos de origen principalmente endodérmico, cubiertos de epitelio, que están implicados en la absorción y secreción. Revisten cavidades que están expuestas al entorno externo y a los órganos internos. Están en varios lugares contiguos a la piel: por ejemplo, en las fosas nasales, los labios de la boca, los párpados, las orejas, la zona genital y el ano. El tejido epidérmico que puede presentar una infección aguda se refiere a tejidos de la epidermis, es decir, las capas más externas de células de la piel, que junto con la dermis forma el cutis. La epidermis es un epitelio escamoso estratificado compuesto por queratinocitos suprabasales diferenciados y basales en proliferación que actúa como la principal barrera del cuerpo contra un entorno inhóspito, evitando la entrada de patógenos, convirtiendo la piel en una barrera natural frente a la infección. También regula la cantidad de agua liberada del cuerpo a la atmósfera a través de pérdida de agua transepidérmica.

Tal como se mencionó, el anticuerpo anti-VHS o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en el tratamiento de una infección aguda de tejido mucoso o epidérmico en un sujeto provocado por VHS-1 o VHS-2 seleccionada del grupo que consiste en herpes simple labial, herpes simple genital, infección por herpes simple cutánea crónica o diseminada, herpes gladiatorum y eccema herpético va a administrarse por vía tópica.

El término “administración tópica” según la presente invención se refiere a un medicamento, aplicación o administración que se aplica a superficies corporales tales como la piel o las membranas mucosas para tratar la infección mencionada anteriormente por medio de una amplia gama de clases de formas de administración, incluyendo pero sin limitarse a, cremas, espumas, geles, lociones y pomadas. En una realización preferida, la administración tópica se entiende que es epicutánea, lo que significa que el anticuerpo anti-VHS o un fragmento de unión a antígeno del mismo se aplica directamente a la piel. Sin querer restringirse a la teoría y para proporcionar algunos ejemplos adicionales no limitantes, la aplicación tópica también puede ser inhalatoria, tales como medicamentos para el asma, o aplicarse a la superficie de tejidos distintos de la piel, tales como gotas para los ojos aplicadas a la conjuntiva, o gotas para los oídos colocadas en el oído, o medicamentos aplicados a la superficie de un diente. Como vía de administración, la administración tópica se contrasta con la entérica (en el tracto digestivo) e intravascular/intravenosa (inyectada en el sistema circulatorio). En su sentido más amplio, un efecto tópico puede entenderse de un modo que se refiere a, en el sentido farmacodinámico, una diana local, en vez de sistémica, de un medicamento.

En una realización preferida, el anticuerpo anti-VHS o el fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según la presente invención es un anticuerpo monoclonal o policlonal. En una realización preferida adicional, el anticuerpo anti-VHS o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según la presente invención es un anticuerpo humanizado o totalmente humano. En una realización preferida adicional, el anticuerpo anti-VHS o el fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según la presente invención es un anticuerpo murino.

El término “anticuerpo monoclonal” tal como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que se producen de manera natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos contra un solo sitio antigénico. Los anticuerpos monoclonales son ventajosos ya que pueden sintetizarse mediante un cultivo de hibridoma, esencialmente no contaminados por otras inmunoglobulinas. El modificador “monoclonal” indica que el carácter del anticuerpo se encuentra entre una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse en el sentido de que requiera la producción del anticuerpo por ningún método particular. Tal como se mencionó anteriormente, los anticuerpos monoclonales que van a usarse según la presente invención pueden prepararse mediante el método del hibridoma descrito por Kohler, Nature 256 (1975), 495.

El término “anticuerpo policlonal” tal como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo producido entre o en presencia de uno o más de otros anticuerpos no idénticos. En general, los anticuerpos policlonales se producen a partir de un linfocito B en presencia de varios otros linfocitos B que produjeron anticuerpos no idénticos. Habitualmente, se obtienen anticuerpos policlonales directamente de un animal inmunizado.

El término “anticuerpo totalmente humano” tal como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo que comprende secuencias de proteínas de inmunoglobulina humana solamente. Un anticuerpo totalmente humano puede contener cadenas de hidratos de carbono murinos si se produce en un ratón, en una célula de ratón o en un hibridoma derivado de una célula de ratón. De manera similar, “anticuerpo de ratón” o “anticuerpo murino” se refiere a un anticuerpo que comprende secuencias de proteínas de inmunoglobulina murina/de ratón solamente. Alternativamente, un “anticuerpo totalmente humano” puede contener cadenas de hidratos de carbono de rata si se produce en una rata, en una célula de rata o en un hibridoma derivado de una célula de rata. De manera similar, el término “anticuerpo de rata” se refiere a un anticuerpo que comprende secuencias de inmunoglobulina de rata solamente. También pueden producirse anticuerpos completamente humanos, por ejemplo, mediante presentación en fagos que es una tecnología de examen ampliamente usada que permite la producción y el examen de anticuerpos totalmente humanos. También pueden usarse anticuerpos de fagos en el contexto de esta invención. Se describen métodos de presentación en fagos, por ejemplo, en los documentos US 5.403.484, US 5.969.108 y US 5.885.793. Otra tecnología que permite el desarrollo de anticuerpos totalmente humanos implica una modificación de la tecnología de hibridoma de ratón. Los ratones se hacen transgénicos para que contengan el locus de inmunoglobulina humana a cambio de sus propios genes de ratón (véase, por ejemplo, el documento US 5.877.397).

El término “anticuerpos quiméricos” se refiere a un anticuerpo que comprende una región variable de la presente invención fusionada o quimerizada con una región de anticuerpo (por ejemplo, región constante) de otra especie humana o no humana (por ejemplo, ratón, caballo, conejo, perro, vaca, pollo).

El término anticuerpo también se refiere a anticuerpos humanos recombinantes, anticuerpos heterólogos y anticuerpos heterohíbridos. El término “anticuerpo humano recombinante” incluye todos los anticuerpos de secuencia humana preparados, expresados, creados o aislados por medios recombinantes, tales como anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana; anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante transfectado a una célula huésped, anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos humanos recombinante, combinatoria, o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique el corte y empalme de secuencias de genes de inmunoglobulinas humanas con otras secuencias de a Dn . Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes (si están presentes) derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Tales anticuerpos pueden, sin embargo, someterse a mutagénesis in vitro (o, cuando se usa un animal transgénico para secuencias de Ig humanas, mutagénesis somática in vivo) y por tanto las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, si bien derivadas de y relacionadas con secuencias de VH y VL de línea germinal humana, pueden no existir de manera natural dentro del repertorio de línea germinal de anticuerpos humanos in vivo.

Un “anticuerpo heterólogo” se define en relación con el organismo transgénico no humano que produce un anticuerpo de este tipo. Este término se refiere a un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos o una secuencia de ácido nucleico codificante correspondiente a la encontrada en un organismo que no consiste en el animal no humano transgénico, y generalmente de una especie distinta de la del animal no humano transgénico.

El término “anticuerpo heterohíbrido” se refiere a un anticuerpo que tiene cadenas ligeras y pesadas de diferentes orígenes de organismos. Por ejemplo, un anticuerpo que tiene una cadena pesada humana asociada con una cadena ligera murina es un anticuerpo heterohíbrido. Ejemplos de anticuerpos heterohíbridos incluyen anticuerpos quiméricos y humanizados.

El término anticuerpo también se refiere a anticuerpos humanizados. Formas “humanizadas” de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos o de conejo) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de anticuerpos de unión a antígeno) que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. A menudo, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que residuos de una región determinante de complementariedad (CDR) del receptor se reemplazan por residuos de un CDR de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata o conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, se reemplazan residuos de entramado de Fv de inmunoglobulina humana por residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos, que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias de CDR o entramado importadas. Estas modificaciones se realizan para refinar y optimizar adicionalmente el rendimiento de los anticuerpos. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y normalmente dos dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de un secuencia de consenso de inmunoglobulina. El anticuerpo humanizado también puede comprender al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, véase: JonesNature 321 (1986), 522-525; Reichmann Nature 332 (1998), 323-327 y Presta Curr Op Struct Biol 2 (1992), 593-596.

Un método popular para humanizar anticuerpos implica el injerto de CDR, donde un sitio de unión de antígeno funcional de un anticuerpo “donador” no humano se injerta sobre un anticuerpo “aceptor” humano. En la técnica se conocen métodos de injerto de CDR y se describen, por ejemplo, en los documentos US 5.225.539, US 5.693.761 y US 6.407.213. Otro método relacionado es la producción de anticuerpos humanizados a partir de animales transgénicos que se modifican por ingeniería genética para contener uno o más locus de inmunoglobulina humanizados uno que son capaces de experimentar reordenamiento génico y conversión génica (véase, por ejemplo, el documento US 7.129.084).

En consecuencia, en el contexto de la presente invención, el término “anticuerpo” se refiere a moléculas de inmunoglobulina completas, así como a partes de tales moléculas de inmunoglobulina (es decir, “fragmento de unión a antígeno de las mismas”). Además, el término se refiere, tal como se comentó anteriormente, a moléculas de anticuerpos alteradas y/o modificadas. El término también se refiere a anticuerpos generados/sintetizados de manera recombinante o sintética. El término también se refiere a anticuerpos intactos, así como a fragmentos de anticuerpos de los mismos, como cadenas ligeras y pesadas separadas, Fab, Fv, Fab', Fab'-SH, F(ab')2. El término anticuerpo también comprende, pero no se limita a anticuerpos completamente humanos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos injertados con CDR y constructos de anticuerpos, como Fv de una cadena sencilla (scFv) o proteínas de fusión de anticuerpos.

En una realización preferida, el anticuerpo anti-VHS para su uso en el tratamiento de una infección aguda de tejido mucoso o epidérmico en un sujeto provocada por VHS-1 o VHS-2 seleccionada del grupo que consiste en herpes simple labial, herpes simple genital, infección por herpes simple cutánea crónica o diseminada, herpes gladiatorum y eccema herpético, en el que dicho anticuerpo va a administrarse por vía tópica, es un anticuerpo completo, es decir, una molécula de inmunoglobulina completa que a menudo también se denomina anticuerpo completo.

Los fragmentos de anticuerpos de “Fv de cadena sencilla” o “scFv” tienen, en el contexto de la invención, los dominios Vh y Vl de un anticuerpo, en los que estos dominios están presentes en una sola cadena polipeptídica. Generalmente, el polipéptido de scFv comprende además un ligador polipeptídico entre los dominios Vh y Vl que permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno. Se describen técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla, por ejemplo, en Plückthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Rosenburg and Moore eds Springer-Verlag, N.Y. (1994), 269-315.

Un fragmento “Fab” tal como se usa en el presente documento se compone de una cadena ligera y las regiones Ch1 y variable de una cadena pesada. La cadena pesada de una molécula de Fab no puede formar un enlace disulfuro con otra molécula de cadena pesada.

Una región “Fc” contiene dos fragmentos de cadena pesada que comprenden los dominios Ch2 y Ch3 de un anticuerpo.

Los dos fragmentos pesados de cadena se mantienen unidos entre sí mediante dos o más enlaces disulfuros y por interacciones hidrófobas de los dominios Ch3.

Un “fragmento Fab'” contiene una cadena ligera y una porción de una cadena pesada que contiene el dominio Vh y el dominio Ch1 y también la región entre los dominios Ch1 y Ch2 , de manera que puede formarse un enlace disulfuro intercatenario entre las dos cadenas pesadas de dos fragmentos Fab' para formar una molécula de F(ab')².

Un “fragmento F(ab')²” contiene dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que contienen una porción de la región constante entre los dominios Ch1 y Ch2 , de manera que se forma un enlace disulfuro intercatenario entre las dos cadenas pesadas. Un fragmento F(ab^')2 se compone por tanto de dos fragmentos Fab' que se mantienen unidos entre sí mediante un enlace disulfuro entre las dos cadenas pesadas.

La “región Fv” comprende las regiones variables de tanto las cadenas pesadas como las ligeras, pero carece de las regiones constantes.

Los anticuerpos, constructos de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, derivados de anticuerpos (todos derivados de Ig) que van a emplearse según la invención o su(s) correspondiente(s) cadena(s) de inmunoglobulina pueden modificarse adicionalmente usando técnicas convencionales conocidas en la técnica, por ejemplo, usando deleción/deleciones, inserción/inserciones, sustitución/sustituciones, adición/adiciones y/o recombinación/recombinaciones de aminoácidos y/o cualquier otra modificación conocida en la técnica, ya sea sola o en combinación. Los métodos para introducir tales modificaciones en la secuencia de ADN subyacente a la secuencia de aminoácidos de una cadena de inmunoglobulina los conoce bien el experto en la técnica; véase, por ejemplo, Sambrook (1989), loc. cit. El término “dominio derivado de Ig” se refiere particularmente a constructos de (poli)péptidos que comprenden al menos una CDR. Los fragmentos o derivados de los dominios derivados de Ig mencionados definen (poli)péptidos que son partes de las moléculas de anticuerpos anteriores y/o que se modifican por métodos químicos/bioquímicos o de biología molecular. En la técnica se conocen métodos correspondientes y se describen, entre otros, en manuales de laboratorio (véase Sambrook etal., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a edición (1989) y 3a edición (2001); Gerhardt et al., Methods for General and Molecular Bacteriology ASM Press (1994); Lefkovits, Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques; Academic Press (1997); Golemis, Protein-Protein Interactions: A Molecular Cloning Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press (2002)).

El anticuerpo o fragmento del mismo tal como se usa en el contexto de la presente invención para su uso en el tratamiento de una infección aguda de tejido mucoso o epidérmico en un sujeto provocada por VHS-1 o VHS-2 seleccionada del grupo que consiste en herpes simple labial, herpes simple genital, infección por herpes simple cutánea crónica o diseminada, herpes gladiatorum y eccema herpético, en el que dicho anticuerpo va a administrarse por vía tópica, no está particularmente limitado siempre que se trate de un “anticuerpo anti-VHS o un fragmento de unión a antígeno del mismo”. Por tanto, el anticuerpo puede ser cualquier anticuerpo que se une específicamente a o reconoce específicamente o interacciona con un VHS, es decir, un dominio, un antígeno, preferiblemente un antígeno de superficie de un VHS. El experto está fácilmente en condiciones de generar un anticuerpo de este tipo dirigido a un dominio dado (es decir, un antígeno, preferiblemente un antígeno de superficie de un VHS) y determinar si un anticuerpo respectivo es capaz de detectar/unirse a un dominio dado, un antígeno, preferiblemente un antígeno de superficie de un VHS, preferiblemente VHS-1 y/o VHS-2 basándose en el conocimiento general común del experto en la técnica y los métodos descritos anteriormente. En una realización preferida, el anticuerpo de la invención se une a/reconoce las glicoproteínas del antígeno viral D, B, C, H, L, E o I (es decir, gD, gB, gC, gH, gL, gE, gI). Las glicoproteínas D, B, C, H, L, E e I son proteínas de superficie o de la envuelta de VHS-1 y/o VHS-2. Estas proteínas no solo pueden encontrarse en la superficie o en la estructura de la envuelta de VHS-1 y/o VHS-2, es decir, en la superficie de partículas infecciosas liberadas (es decir, la envoltura de viriones libres), sino que también pueden estar presentes en la superficie de células infectadas, es decir, en la superficie de células. Sin embargo, en una realización más preferida, el anticuerpo de la invención se une a/reconoce la glicoproteína de antígeno de superficie viral D, B, C, H, L, E o I (es decir, gD, gB, gC, gH, gL, gE o gl) de la envuelta de VHS-1 y/o VHS-2. En una realización preferida, el anticuerpo anti-VHS o el fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según la presente invención reconoce la glicoproteína de superficie B (gB) de la envuelta de VHS-1 y/o VHS-2, preferiblemente un epítopo de la misma. La glicoproteína B de VHS-1 y/o VHS-2 está bien caracterizada y, sin estar unida a secuencias específicas, se muestran ejemplos de secuencias de diversas cepas de VHS-1 y VHS-2, respectivamente, en SEQ ID NO:11 a 16. SEQ ID NO:11 muestra la secuencia de la glicoproteína B de la cepa de VHS-1 F, SEQ ID NO:12 muestra la secuencia de la glicoproteína B de la cepa de VHS-1 KOS, SEQ ID NO:13 muestra la secuencia de la glicoproteína B de la cepa de VHS-1 GC-39-R6, SEQ ID NO:14 muestra la secuencia de la glicoproteína B de la cepa de VHS-2 HG52, s Eq ID NO:15 muestra la secuencia de la glicoproteína B de la cepa de VHS-2333 y SEQ ID NO:16 muestra la secuencia de la glicoproteína B de la cepa de VHS-2 MMA. Una alineación de secuencias de estas secuencias de aminoácidos de glicoproteína B muestra que la homología global de aminoácidos de gB de VHS-1 y VHS-2 es del 85 %, mientras que las secuencias están menos conservadas en las regiones N- y C-terminales de la proteína. El anticuerpo anti-VHS o el fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en el tratamiento de una infección aguda de tejido mucoso o epidérmico en un sujeto provocada por VHS-1 o VHS-2 seleccionada del grupo que consiste en herpes simple labial, herpes simple genital, infección por herpes simple cutánea crónica o diseminada, herpes gladiatorum y eccema herpético, en el que dicho anticuerpo va a administrarse por vía tópica, es capaz de inhibir la propagación del VHS de una célula infectada a una segunda célula no infectada adyacentes (propagación célula a célula).

La propagación célula a célula es la capacidad del virus del herpes para propagarse a una segunda célula no infectada adyacente sin liberar partículas libres de células. Reducir o eliminar la capacidad del virus del herpes para propagarse a una célula adyacente tiene el efecto beneficioso de evitar la generación de lesiones. Con el fin de examinar si un anticuerpo es capaz de inhibir la propagación del VHS de una célula infectada a una segunda célula no infectada adyacente (propagación célula a célula), pueden usarse métodos bien conocidos por el experto en la técnica. Como ejemplo, puede usarse el siguiente ensayo: células de Vero hechas crecer hasta la confluencia sobre cubreobjetos de vidrio en placas de cultivo tisular de 24 pocillos se infectan durante 4 h a 37°C con una cantidad constante de virus de 400 TCIDso/pocillo. Una dosis infecciosa mediana de cultivo tisular (1 TCID⁵⁰) es la cantidad de un agente citopatógeno, tal como un virus, que producirá un efecto citopático en el 50 % de los cultivos celulares inoculados. Posteriormente se elimina el inóculo del virus, las células se lavan dos veces con PBS y se incuban adicionalmente durante 2 días a 37°C en 1 ml de DMEM, FCS al 2 %, pen./estrep. que contiene un exceso de diferentes anticuerpos anti-VHS o suero de control policlonal anti-VHS con el fin de evitar la propagación viral a través del sobrenadante. Los antígenos virales de las células infectadas por VHS se detectan con un suero anti-VHS de cabra policlonal marcado con fluorescencia (BETHYL Laboratories, Montgomery, TX EE. UU., n.° de catálogo A190-136F, lote n.° A190-136F-2). Preferiblemente, un anticuerpo inhibe la propagación célula a célula si menos del 20 % de las células adyacentes están infectadas, preferiblemente en las que menos del 15 %, menos del 10 %, menos del 5 %, más preferiblemente menos del 3 % y lo más preferiblemente menos del 1 % de las células adyacentes están infectadas en el ensayo anterior.

La propagación célula a célula también puede someterse a ensayo de la siguiente manera: La presencia de anticuerpos neutralizantes no impide necesariamente la propagación célula a célula de herpesviridae. Para comparar anticuerpos con respecto a la alteración de la propagación célula a célula de VHS-1 y VHS-2, este modo de diseminación particular puede imitarse in vitro usando métodos de prueba convencionales. Por ejemplo: Para infectar células individuales, se incuban inicialmente monocapas confluentes de células Vero con VHS-1 o VHS-2 a una baja MOI (por ejemplo, 100 TCID⁵⁰), respectivamente. Después de 4 h de adsorción a 37°C, tiene que retirarse el inóculo viral. Para promover la transmisión directa célula a célula a partir de células infectadas de manera individual, pero prevenir la propagación viral a través de partículas virales por el sobrenadante de cultivo celular, las monocapas de células Vero se tratan con un exceso de anticuerpos anti-gB neutralizantes, controles o medio solo. Después de 48 h, puede detectarse la propagación del virus mediante inmunotinción con un anticuerpo monoclonal de ratón específico para un epítopo común en glicoproteína D de VHS-1 y VHS-2 (por ejemplo, Acris Antibodies, San Diego, CA, EE. UU.) y anticuerpos secundarios conjugados con fluorescencia. Pueden adquirirse imágenes de inmunofluorescencia con un microscopio de fluorescencia con un aumento de 100 o 400 veces.

Además, en una realización preferida, el anticuerpo anti-VHS de la presente invención es capaz de neutralizar VHS. “Neutralizar” en el presente documento significa que el anticuerpo opsoniza el virus de modo que no pueda infectar a ninguna célula adicional. Un ensayo para someter a prueba si un anticuerpo en una concentración de, por ejemplo, 20 nM como máximo es capaz de neutralizar una cantidad definida de VHS de, por ejemplo, 100 TCID⁵⁰ Eis-Hübinger et al., Intervirology 32:351-360 (1991); Eis-Hübinger et al., Journal of General Virology 74:379-385 (1993) y en los ejemplos 1 y 2 del documento WO2011/038933 A2. Por tanto, en una realización preferida, el anticuerpo de la invención en una concentración de como máximo 20 nM, preferiblemente de como máximo 16 nM, más preferiblemente de como máximo 12 nM, como máximo 10 nm, por ejemplo, como máximo 8 nM o como máximo 6 nM, y lo más preferiblemente de como máximo 4 nM es capaz de neutralizar una cantidad definida de VHS de 100 TCID⁵⁰ hasta más del 80 %, preferiblemente en más del 90 %, tal como más del 95 %, más preferiblemente el 96 %, por ejemplo, más del 97 %, y lo más preferiblemente más del 98 %, por ejemplo, más del 99 % o incluso el 100 %.

Por tanto, en una realización preferida, la presente invención también se refiere a un anticuerpo anti-VHS o el fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en el tratamiento de una infección aguda de tejido mucoso o epidérmico en un sujeto provocada por VHS-1 o VHS-2 seleccionada del grupo que consiste en herpes simple labial, herpes simple genital, infección por herpes simple cutánea crónica o diseminada, herpes gladiatorum y eccema herpético, en el que dicho anticuerpo va a administrarse por vía tópica, en el que el anticuerpo es capaz de inhibir la propagación célula a célula independientemente de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Dado que los ensayos descritos anteriormente para someter a prueba la capacidad de si un anticuerpo es capaz de inhibir la propagación célula a célula no contienen células efectoras citotóxicas y/o del complemento, los mismos ensayos pueden usarse con el fin de determinar si un anticuerpo es capaz de inhibir la propagación célula a célula independientemente de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).

En una realización preferida, el anticuerpo anti-VHS o el fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según la presente invención comprende las regiones determinantes de complementariedad VhCDR1 que comprende SEQ ID NO: 1, VhCDR2 que comprende SEQ ID NO: 2, VhCDR3 que comprende SEQ ID NO: 3, VlCDr 1 que comprende SEQ ID NO: 4, VlCDr 2 que comprende SEQ ID NO: 5 y VlCDR3 que comprende SEQ ID NO:6.

El término “CDR” tal como se emplea en el presente documento se refiere a una “región determinante de complementariedad”, que se conoce bien en la técnica. Las CDR son partes de inmunoglobulinas que determinan la especificidad de dichas moléculas y hacen contacto con un ligando específico. Las CDR son la parte más variable de la molécula y contribuyen a la diversidad de estas moléculas. Hay tres regiones CDR, CDR1, CDR2 y CDR3 en cada dominio V. CDR-H representa una región CDR de una cadena pesada variable y CDR-L se refiere a una región CDR de una cadena ligera variable. VH significa la cadena pesada variable y VL significa la cadena ligera variable. Las regiones CDR de una región derivada de Ig pueden determinarse tal como se describe en Kabat “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, 5a edición, publicación de los NIH n.° 91-3242 U.S. Department of Health and Human Services (1991); Chothia J. Mol. Biol. 196 (1987), 901-917 o Chothia Nature 342 (1989), 877-883.

En consecuencia, en el contexto de la presente invención, la molécula de anticuerpo descrita anteriormente en el presente documento se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo completo (inmunoglobulina, como una IgG1, una IgG2, una IgG2a, una IgG2b, una IgGA1, una IgGA2, una IgG3, una IgG4, una IgA, una IgM, una IgD o una IgE), fragmento F(ab), Fab'-SH, Fv, Fab', F(ab')2, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo injertado con CDR, un anticuerpo totalmente humano, un constructo de anticuerpo bivalente, una proteína de fusión de anticuerpo, un anticuerpo sintético, un anticuerpo de cadena sencilla bivalente, un anticuerpo de cadena sencilla trivalente y un anticuerpo de cadena sencilla multivalente.

En la técnica se conocen bien “enfoques de humanización” y se describen en particular para moléculas de anticuerpos, por ejemplo, moléculas derivadas de Ig. El término “humanizado” se refiere a las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) o fragmentos de los mismos (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab'), scFv u otras secuencias parciales de unión a antígeno de anticuerpos) que contienen alguna porción de la secuencia derivada de un anticuerpo no humano. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas en las que residuos de una región determinante de complementariedad (CDR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por residuos de una CDR de una especie no humana tal como ratón, rata o conejo que tiene la especificidad de unión, afinidad y capacidad deseadas. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y generalmente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de un secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá óptimamente al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana; véase, entre otros, Jones et al., Nature 321 (1986),522-525, Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 (1992),593-596. En la técnica se conocen bien métodos para humanizar anticuerpos no humanos. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más aminoácidos introducidos en el mismo de una fuente que no es humana que todavía conserva la actividad de unión original del anticuerpo. Se detallan adicionalmente métodos de humanización de anticuerpos/moléculas de anticuerpos en Jones et al., Nature 321 (1986), 522-525; Reichmann et al., Nature 332 (1988), 323-327; y Verhoeyen et al., Science 239 (1988), 1534-1536. En la técnica se conocen ejemplos específicos de anticuerpos humanizados, por ejemplo anticuerpos dirigidos contra EpCAM, véanse por ejemplo (Lobuglio, Proceedings of the American Society of Clinical Oncology Abstract (1997), 1562 y Khor, Proceedings of the American Society of Clinical Oncology Abstract (1997), 847).

En consecuencia, en el contexto de esta invención, se proporcionan moléculas de anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos de los mismos, que se humanizan y pueden emplearse con éxito en composiciones farmacéuticas.

Además, en una realización preferida, el anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a la glicoproteína B (gB) de VHS-1 y/o VHS-2 que comprende o consiste en el dominio VH (región variable de cadena pesada) y el dominio VL (región variable de cadena ligera), es decir, la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de un anticuerpo tal como se representa en SEQ ID NO:9 y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de un anticuerpo tal como se representa en SEQ ID NO:10.

Sin embargo, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se usa en la presente invención no se limita particularmente a tales regiones variables de cadena pesada y cadena ligera, sino que también puede ser un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a la glicoproteína B (gB) de la envuelta de VHS-1 y/o VHS-2 que comprende o consiste en el dominio VH y dominio VL con una homología de secuencia de al menos el 95 %, 90 %, 85 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 % o 50 % con las secuencias de SEQ ID NO: 9 y 10, respectivamente, siempre que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno tenga la capacidad de tener un efecto en el tratamiento de una infección aguda de tejido mucoso o epidérmico en un sujeto provocada por VHS-1 o VHS-2 en cuanto a la presente invención o sea capaz de inhibir la propagación de VHS de una célula infectada a una segunda célula no infectada adyacente (propagación célula a célula) o sea capaz de inhibir la propagación célula a célula independientemente de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), tal como se describe en el presente documento anteriormente y a continuación. Además, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es una molécula que comprende los dominios VH y VL que tiene hasta 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más sustituciones de aminoácidos conservativas con referencia a las secuencias de SEQ ID NO: 9 y 10. Además, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es un fragmento de anticuerpos seleccionado del grupo que consiste en Fab, Fab', Fab'-SH, FV, scFv, F(ab')2 y un diacuerpo.

Con el fin de determinar si una secuencia de aminoácidos tiene un cierto grado de identidad con las secuencias de SEQ ID NO: 9 y 10, el experto puede usar medios y métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo alineaciones, o bien manualmente o bien usando programas informáticos conocidos por el experto en la técnica. Una alineación de este tipo puede hacerse, por ejemplo, con medios y métodos conocidos por el experto, por ejemplo, usando un algoritmo informático conocido tal como el método de Lipman-Pearson (Science 227 (1985), 1435) o el algoritmo CLUSTAL. Se prefiere que en tal alineación se asigne una homología máxima a los residuos de aminoácidos conservados presentes en las secuencias de aminoácidos. En una realización preferida, se usa ClustalW2 para la comparación de secuencias de aminoácidos. En el caso de comparaciones/alineaciones por parejas, se eligen preferiblemente los siguientes parámetros: Matriz de peso de proteínas: BLOSUM 62; hueco abierto: 10; extensión de hueco: 0,1. En el caso de comparaciones/alineaciones múltiples, se eligen preferiblemente los siguientes parámetros: Matriz de peso de proteínas: BLOSUM 62; hueco abierto: 10; extensión de hueco: 0,2; distancia de hueco: 5; sin hueco de extremo.

Según la presente invención, el término “idéntico” o “porcentaje de identidad” en el contexto de dos o más secuencias de ácido nucleico o aminoácidos, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales, o que tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales (por ejemplo, el 60 % o el 65 % de identidad, preferiblemente, el 70-95 % identidad, más preferiblemente al menos el 95 % de identidad con las secuencias de ácido nucleico o con las secuencias de aminoácidos descritas anteriormente que son capaces de unirse a gB de VHS-1 o VHS-2 y que tienen la capacidad de tratar una infección aguda de tejido mucoso o epidérmico en un sujeto provocada por el VHS-1 o el VHS-2 en cuando a la presente invención o son capaces de inhibir la propagación de VHS de una célula infectada a una segunda célula no infectada adyacente (propagación célula a células) o son capaces de inhibir la propagación célula a célula independientemente de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) tal como se describe en el presente documento anteriormente y a continuación), cuando se comparan y se alinean para lograr una correspondencia máxima a lo largo de una ventana de comparación, o a lo largo de una región designada como medida usando un algoritmo de comparación de secuencias tal como se conoce en la técnica, o mediante alineación manual e inspección visual. Las secuencias que tienen, por ejemplo, del 60 % al 95 % o mayor identidad de secuencia se consideran sustancialmente idénticas. Una definición de este tipo también se aplica al complemento de una secuencia de prueba. Preferiblemente, la identidad descrita existe a lo largo de una región que tiene al menos de aproximadamente 15 a 25 aminoácidos o nucleótidos de longitud, más preferiblemente, a lo largo de una región de 50 a 100 aminoácidos o nucleótidos de longitud. Los expertos en la técnica sabrán cómo determinar el porcentaje de identidad entre secuencias usando, por ejemplo, algoritmos tales como los basados en el programa informático CLUSTALW (Thompson Nucl. Acids Res.2 (1994), 4673-4680) o FASTDB (Brutlag Comp. App. Biosci. 6 (1990), 237-245), tal como se conoce en la técnica.

Aunque el algoritmo FASTDB normalmente no considera adiciones o deleciones internas no coincidentes en secuencias, es decir, huecos, en su cálculo, esto puede corregirse manualmente para evitar una sobreestimación del % de identidad. Sin embargo, CLUSTALW sí tiene en cuenta los huecos de secuencia en sus cálculos de identidad. También están disponibles para los expertos que tienen habilidad en esta técnica los algoritmos BLAST y BLAST 2.0 (Altschul, (1997) Nucl. Acids Res. 25:3389-3402; Altschul (1993) J. Mol. Evol. 36:290-300; Altschul (1990) J. Mol. Biol., 215:403-410). El programa BLASTN para secuencias de ácido nucleico usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M=5, N=4, y una comparación de ambas hebras. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa por defecto una longitud de palabra (W) de 3 y una expectativa (E) de 10. La matriz de puntuación BLOSUM62 (Henikoff (1989) PNAS 89:10915) usa alineaciones (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=4, y una comparación de ambas hebras.

Preferiblemente, la(s) sustitución/sustituciones de aminoácidos son “sustitución/sustituciones conservativa(s)”, lo que se refiere a sustituciones de aminoácidos en una proteína por otros aminoácidos que tienen similares características (por ejemplo, carga, tamaño de cadena lateral, hidrofobicidad/hidrofilicidad, conformación y rigidez de la columna vertebral, etc.), de manera que los cambios pueden hacerse frecuentemente sin alterar la actividad biológica de la proteína. Los expertos en esta técnica reconocen que, en general, sustituciones de aminoácidos individuales en regiones no esenciales de un polipéptido no alteran sustancialmente la actividad biológica (véase, por ejemplo, Watson Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co. 4a ed. (1987), 224. Además, sustituciones de aminoácidos estructural o funcionalmente similares tienen menos probabilidades de alterar la actividad biológica. Dentro del contexto de la presente invención, los compuestos/anticuerpos de unión de la presente invención comprenden cadenas polipeptídicas con secuencias que incluyen hasta 0 (sin cambios), 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20 o más sustituciones de aminoácidos conservativas en comparación con las secuencias de aminoácidos específicas dadas a conocer en el presente documento, por ejemplo, SEQ ID NO: 9 (en referencia a la región variable de la cadena pesada de anticuerpo del anticuerpo) y 10 (en referencia a la variable de la cadena ligera del anticuerpo). Tal como se usa en el presente documento, la frase “hasta X” sustituciones de aminoácidos conservativas incluye 0 sustituciones y cualquier número de sustituciones hasta 10 e incluyendo 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 sustituciones.

Tales sustituciones a modo de ejemplo se hacen preferiblemente de conformidad con las expuestas en la tabla 1 de la siguiente manera:

a a

Sustituciones de aminoácidos conservativas a modo de ejemplo

Además, en una realización preferida, el anticuerpo anti-VHS o el fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos el 70 % con los residuos de aminoácidos mostrados en las posiciones 1 a 30, 38 a 51,68 a 99 y 112 a 122 de SEQ ID NO: 7 y en las posiciones 1 a 23, 41 a 55, 63 a 94 y 104 a 114 de SEQ ID NO: 8.

En una realización preferida adicional, el anticuerpo anti-VHS o el fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos con al menos el 75 %, al menos el 80 %, más preferiblemente al menos el 85 %, al menos el 90 %, incluso más preferiblemente al menos al menos el 95 % y lo más preferiblemente el 98 % de identidad de secuencia global en las regiones de entramado en comparación con los residuos de aminoácidos mostrados en las posiciones 1 a 30, 38 a 51,68 a 99 y 112 a 122 de SEQ ID NO: 7 y en las posiciones 1 a 23, 41 a 55, 63 a 94 y 104 a 114 de SEQ ID NO: 8. Tales anticuerpos son adecuados para los usos médicos de la presente invención, siempre que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se una a gB de VHS-1 o VHS-2 y tenga la capacidad de tener un efecto en el tratamiento de una infección aguda de tejido mucoso o epidérmico en un sujeto provocada por VHS-1 o VHS-2 en cuanto a la presente invención o sea capaz de inhibir la propagación de VHS de una célula infectada a una segunda célula no infectada adyacente (propagación célula a célula) o sea capaz de inhibir la propagación célula a célula independientemente de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) tal como se describe en el presente documento anteriormente y a continuación.

Por tanto, en una realización preferida, el anticuerpo anti-VHS o el fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que tiene las regiones variables anteriores de las cadenas ligera y pesada (es decir, las CDR definidas anteriormente, es decir, VhCDR1 que comprende SEQ ID NO: 1, VhCDR2 que comprende SEQ ID NO: 2, VhCDR3 que comprende SEQ ID NO: 3, VlCDR1 que comprende SEQ ID NO: 4, VLCDR2 que comprende SEQ ID NO: 5 y VLCDR3 que comprende SEQ ID NO:6) mientras que la secuencia de aminoácidos tiene una variabilidad en la región de entramado con al menos el 75 %, al menos el 80 %, más preferiblemente al menos el 85 %, al menos el 90 %, incluso más preferiblemente al menos el 95 % y lo más preferiblemente el 98 % de identidad de secuencia global en las regiones de entramado en comparación con los residuos de aminoácidos mostrados en las posiciones 1 a 30, 38 a 51,68 a 99 y 112 a 122 de SEQ ID NO: 7 y en las posiciones 1 a 23, 41 a 55, 63 a 94 y 104 a 114 de SEQ ID NO: 8.

En este contexto, un polipéptido tiene “al menos una identidad de secuencia del X %” en las regiones de entramado con SEQ ID NO:7 u 8 si SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO: 8 se alinea con la mejor secuencia coincidente de un polipéptido de interés y la identidad de aminoácidos entre esas dos secuencias alineadas es al menos el X % a lo largo de las posiciones 1 a 30, 38 a 51,68 a 99 y 112 a 122 de SEQ ID NO: 7 y las posiciones 1 a 23, 41 a 55, 63 a 94, y 104 a 114 de SEQ ID NO: 8. Tal como se mencionó anteriormente, una alineación de secuencias de aminoácidos de este tipo puede realizarse usando, por ejemplo, programas de homología informáticos disponibles públicamente tales como el programa “BLAST” proporcionado en la página web del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) usando parámetros por defecto proporcionados en la misma. En la técnica se conocen métodos adicionales de cálculo de porcentajes de identidad de secuencia de conjuntos de secuencias de aminoácidos o secuencias de ácido nucleico. Además, en una realización preferida, el anticuerpo anti-VHS o el fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según la presente invención comprende la Vh de SEQ ID NO:9 y la Vl de SEQ ID NO:10.

La especificidad del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno no solo puede expresarse por la naturaleza de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo o del fragmento de unión a antígeno, tal como se definió anteriormente, sino también por el epítopo al que es capaz de unirse el anticuerpo. Por tanto, también se da a conocer un anticuerpo anti-VHS o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según la presente invención que reconoce el mismo epítopo que el anticuerpo descrito anteriormente, el AcM hu2c preferiblemente. Tal como se muestra en la sección de ejemplos y tal como se ilustra en las figuras 13A y 13B del documento WO2011/038933 A2, este epítopo es un epítopo discontinuo o más bien un epítopo pseudocontinuo parcialmente resistente a la desnaturalización ubicado en los aminoácidos 172-195 y 295-313 de la glicoproteína B de VHS-1 y VHS-2. En este contexto, el epítopo del anticuerpo AcM 2c puede estar ubicado dentro de los primeros 487 residuos amino-terminales de la proteína gB. Preferiblemente, el epítopo puede comprender al menos una secuencia de aminoácidos ubicada dentro de la secuencia de aminoácidos entre la posición 172 y 307 de la proteína gB.

El epítopo puede comprender la secuencia de aminoácidos consecutivos ³⁰¹YGYRE³⁰⁵ de la proteína gB, preferiblemente la secuencia de aminoácidos consecutivos ³⁰¹YGYREG³⁰⁶ o ³⁰⁰FYGYRE³⁰⁵, más preferiblemente la secuencia puede extenderse además en los extremos terminales (es decir, ²⁹⁹PFYGYRE³⁰⁵ o ³⁰⁰FYGYREGS³⁰⁷). El epítopo de los anticuerpos de la presente invención puede comprender la secuencia de aminoácidos consecutivos 298-313 (²⁹⁸SPFYGYREGSHTEHTS³¹³) de gB.

Alternativamente, el epítopo puede estar ubicado en la secuencia de aminoácidos consecutivos ¹⁷²QVWFGHRYSQFMGIFED¹⁸⁸. El epítopo puede comprender la secuencia de aminoácidos consecutivos ¹⁷²QVWFGHRYSQFMG¹⁸⁴.

Preferiblemente, el epítopo puede consistir en más de una secuencia de aminoácidos consecutivos. El epítopo puede ser en parte un epítopo discontinuo. Más preferiblemente, el epítopo puede comprender dos secuencias de aminoácidos consecutivos. Un epítopo de este tipo compuesto por dos secuencias de aminoácidos puede designarse como “duótopo”. El anticuerpo puede unirse a ambas secuencias de aminoácidos.

Más preferiblemente, las secuencias de aminoácidos del duótopo pueden comprender la secuencia de aminoácidos ³⁰⁰FYGYRE³⁰⁵ y una secuencia de aminoácidos ubicada entre la posición de aminoácidos 172 y 188. Incluso más preferiblemente, el epítopo puede comprender la secuencia de aminoácidos ³⁰⁰FYGYRE³⁰⁵ y la secuencia de aminoácidos ¹⁷⁹YSQFMG¹⁸⁴ de la proteína gB. Alternativamente, el epítopo o el duótopo pueden sintetizarse químicamente. El epítopo puede ser un epítopo sintetizado químicamente que tiene la secuencia YSQFMG-pA-FYGYRE. La abreviatura pA tal como se usa en el presente documento se refiere a beta-alanina.

Lo más preferiblemente, el epítopo puede comprender la secuencia de aminoácidos FYGYRE y la secuencia de aminoácidos FED de la proteína gB. El epítopo puede ser un epítopo sintetizado químicamente que tiene la secuencia FED-pA-pA-FYGYRE o PFYGYREGFEDF.

Un experto en la técnica puede entender que los epítopos pueden estar comprendidos en la proteína gB, pero también pueden estar comprendidos en un producto de degradación de la misma o pueden ser un péptido sintetizado químicamente. Las posiciones de aminoácidos solo se indican para demostrar la posición de la secuencia de aminoácidos correspondiente en la secuencia de la proteína gB. Se da a conocer a conocer que todos los péptidos que comprende el epítopo están abarcados. El péptido puede ser parte de un polipéptido de más de 100 aminoácidos de longitud o puede ser un péptido pequeño de menos de 100, preferiblemente menos de 50, más preferiblemente menos de 25 aminoácidos, incluso más preferiblemente menos de 16 aminoácidos. Los aminoácidos de tal péptido pueden ser aminoácidos naturales o aminoácidos no naturales (por ejemplo, beta-aminoácidos, gamma-aminoácidos, D-aminoácidos) o una combinación de los mismos. Además, también se dan a conocer los respectivos péptidos retroinversos de los epítopos. El péptido puede estar no unido o unido. Puede estar unido, por ejemplo, a una molécula pequeña (por ejemplo, un fármaco o un fluoróforo), a un polímero de alto peso molecular (por ejemplo, polietilenglicol (PEG), polietilenimina (PEI), hidroxipropilmetacrilato (HPMa ), etc.) o a una proteína, un ácido graso, un resto de azúcar o puede insertarse en un membrana.

Con el fin de someter a prueba si un anticuerpo en cuestión y el anticuerpo tal como se da a conocer en el presente documento reconocen el mismo epítopo, puede llevarse a cabo el siguiente estudio de competición: se incuban células Vero infectadas con 3 moi (multiplicidad de infección) después de 20 h con concentraciones variables del anticuerpo en cuestión como competidor durante 1 hora. En una segunda etapa de incubación, el anticuerpo se aplica en una concentración constante de 100 nM y su unión se detecta por citometría de flujo usando un anticuerpo marcado con fluorescencia dirigido contra los dominios constantes del anticuerpo de la invención. La unión que se produce de manera antiproporcional a la concentración del anticuerpo en cuestión es indicativa de que ambos anticuerpos reconocen el mismo epítopo. Sin embargo, se conocen en la técnica muchos otros ensayos que pueden usarse.

Por tanto, también se da a conocer que el anticuerpo anti-VHS o el fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según la presente divulgación reconoce el mismo epítopo que AcM 2c, en el que dicho epítopo se ubica en los aminoácidos 172-195 y 295-315 de la glicoproteína B de v HS-1 y VHS-2. Usando péptidos de 15 meros solapantes que abarcan la región de gB desde el aminoácido 31 hasta 505, se ha descrito en Daumer et al., Med Microbiol Immunol 2011 (200):85-97 que el AcM 2c es capaz de reconocer un epítopo que se ubica en los aminoácidos 175­ 195 y 298-315 de la glicoproteína B de VHS-1 y VHS-2. Usando microalineamientos de péptidos de 13 meros de alta resolución, Krawczyk et al., Journal of Virology 2011 (85):1793-1803 mapearon el epítopo reconocido por AcM 2c en los aminoácidos 172-195 y 295-313 de la glicoproteína B de VHS-1 y VHS-2.

La secuencia de la glicoproteína B de VHS-1 y/o VHS-2 está bien caracterizada y, tal como se definió anteriormente, sin estar unida a secuencias específicas, se muestran ejemplos de secuencias de diversas cepas de VHS-1 y VHS-2, respectivamente, en SEQ ID n O:11 a 16. El epítopo reconocido por el anticuerpo AcM 2c está altamente conservado entre diversas cepas de VHS de VHS-1 y Vh S-2.

Este anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo que puede usarse en el tratamiento tal como se da a conocer en la presente invención no se limita al anticuerpo que detecta el epítopo anterior de la glicoproteína B de VHS-1 y VHS-2. De hecho, también otros anticuerpos que detectan otro epítopo de la glicoproteína B o incluso un epítopo de otra proteína o polipéptido de VHS-1 y VHS-2 pueden usarse en el tratamiento de la presente invención, siempre que tal anticuerpo sea capaz de tener un efecto en el tratamiento de una infección aguda de tejido mucoso o epidérmico en un sujeto provocada por VHS-1 o VHS-2 en cuando a la presente invención o sea capaz de inhibir la propagación de VHS de una célula infectada a una segunda célula no infectada adyacente (propagación célula a célula) o sea capaz de inhibir la propagación célula a célula independientemente de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) tal como se describe en el presente documento anteriormente y a continuación.

Con la capacidad normal del experto en la técnica y por métodos rutinarios, el experto en la técnica puede deducir fácilmente de las secuencias proporcionadas en el presente documento epítopos relevantes (también fragmentos funcionales) de los polipéptidos de VHS que son útiles en la generación de anticuerpos como anticuerpos policlonales y monoclonales. Sin embargo, el experto en la técnica está fácilmente en condiciones de proporcionar también anticuerpos modificados por ingeniería genética como anticuerpos injertados con CDR o también anticuerpos humanizados y totalmente humanos y similares.

Se prefieren particularmente en el contexto de la presente invención anticuerpos monoclonales. Para la preparación de anticuerpos monoclonales, puede usarse cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos por cultivos de líneas celulares continuos. Los ejemplos de tales técnicas incluyen la técnica del hibridoma, la técnica del trioma, la técnica del híbridoma de células B humanas y la técnica del híbridoma de EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Shepherd y Dean (2000), Monoclonal Antibodies: A Practical Approach, Oxford University Press, Goding y Goding (1996), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice - Production and Application of Monoclonal Antibodies in Cell Biology, Biochemistry and Immunology, Academic Pr Inc, USA).

Los derivados de anticuerpos también pueden producirse por peptidomiméticos. Además, pueden adaptarse técnicas descritas para la producción de anticuerpos de una sola cadena (véase, entre otras, la patente estadounidense 4.946.778) para producir anticuerpos de una sola cadena que reconocen específicamente un antígeno de VHS. Además, pueden usarse animales transgénicos para expresar anticuerpos humanizados frente al polipéptido de VHS.

La presente invención también prevé la producción de anticuerpos específicos contra polipéptidos nativos y polipéptidos recombinantes de glicoproteína B o cualquier otra proteína o polipéptido de VHS-1 y VHS-2. Esta producción se basa, por ejemplo, en la inmunización de animales, como ratones. Sin embargo, también se prevén otros animales para la producción de anticuerpo/antisueros dentro de la presente invención. Por ejemplo, pueden producirse anticuerpos monoclonales y policlonales por conejo, ratones, cabras, asnos y similares. El polinucleótido que codifica para un polipéptido elegido correspondientemente de VHS-1 o VHS-2 puede subclonarse en un vector apropiado, en el que el polipéptido recombinante va a expresarse en un organismo capaz de una expresión, por ejemplo en bacterias. Por tanto, la proteína recombinante expresada puede inyectarse intraperitonealmente en un ratón y el anticuerpo específico resultante puede obtenerse, por ejemplo, del suero de los ratones que se proporciona por punción sanguínea intracardiaca. La presente invención también prevé la producción de anticuerpos específicos contra polipéptidos nativos y polipéptidos recombinantes usando una estrategia de vacuna de ADN, tal como se ejemplifica en los ejemplos adjuntos. En la técnica se conocen bien estrategias de vacunas de ADN y abarcan administración mediada por liposomas, mediante pistola génica o inyección por chorro e inyección intramuscular o intradérmica. Por tanto, pueden obtenerse anticuerpos dirigidos contra un polipéptido o una proteína o un epítopo de VHS-1 y VHS-2 inmunizando directamente el animal inyectando directamente por vía intramuscular el vector que expresa el polipéptido deseado o una proteína o un epítopo de VHS-1 y VHS-2, en particular un epítopo de gB. La cantidad de anticuerpo específico obtenido puede cuantificarse usando un ELISA, que también se describe en el presente documento a continuación. En la técnica se conocen bien métodos adicionales para la producción de anticuerpos, véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988. El término “se une específicamente”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una reacción de unión que es determinante de la presencia del polipéptido deseado o una proteína o un epítopo de VHS-1 y VHS-2, en particular un epítopo de gB, y un anticuerpo en presencia de una población heterogénea de proteínas y otros productos biológicos.

Por tanto, en condiciones de ensayo designadas, los anticuerpos especificados y un polipéptido correspondiente o una proteína o un epítopo de VHS-1 y VHS-2, en particular un epítopo de gB, se unen entre sí y no se unen en una cantidad significativa a otros componentes presentes en una muestra. La unión específica a un analito diana en tales condiciones puede requerir un resto de unión que se selecciona por su especificidad por un analito diana particular.

Puede usarse una variedad de formatos de inmunoensayo para seleccionar anticuerpos específicamente reactivos con un antígeno particular. Por ejemplo, se usan inmunoensayos ELISA en fase sólida rutinariamente para seleccionar anticuerpos monoclonales específicamente inmunoreactivos con un analito. Véase Shepherd y Dean (2000), Monoclonal Antibodies: A Practical Approach, Oxford University Press y/o Howard y Bethell (2000) Basic Methods in Antibody Production and Characterization, Crc. Pr. Inc. para una descripción de los formatos y condiciones de inmunoensayo que pueden usarse para determinar la inmunorreactividad específica. Normalmente, una reacción específica o selectiva será al menos dos veces la señal de fondo con respecto a ruido y más normalmente más de 10 a 100 veces mayor que el fondo. El experto en la técnica se encuentra en condiciones de proporcionar y generar moléculas de unión específicas dirigidas contra los polipéptidos novedosos. Para ensayos de unión específicos, puede emplearse fácilmente para evitar la reactividad cruzada no deseada; por ejemplo, los anticuerpos policlonales pueden purificarse y seleccionarse fácilmente por métodos conocidos (véase Shepherd y Dean, loc. cit.).

El término “anticuerpo anti-VHS o fragmento de unión a antígeno del mismo” significa, según esta invención, que la molécula de anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es capaz de reconocer específicamente o interaccionar específicamente con y/o unirse a al menos dos aminoácidos del polipéptido deseado o una proteína o un epítopo de v HS-1 y VHS-2, en particular un epítopo de gB. Dicho término se refiere a la especificidad de la molécula de anticuerpo, es decir, a su capacidad para discriminar entre las regiones específicas un polipéptido deseado o una proteína o un epítopo de VHS-1 y VHS-2, en particular un epítopo de gB. En consecuencia, la especificidad puede determinarse experimentalmente por métodos conocidos en la técnica y métodos dados a conocer y descritos en el presente documento. Tales métodos comprenden, pero no se limitan a, inmunotransferencias de tipo Western, pruebas de ELISA, RIA, ECL, IRMA y escaneos de péptidos. Tales métodos también comprenden la determinación de los valores de Kd, tal como se ilustra, entre otros, en los ejemplos adjuntos. El escaneo de péptidos (ensayo pepspot) se usa rutinariamente para mapear epítopos lineales en un antígeno polipeptídico. La secuencia primaria del polipéptido se sintetiza de manera sucesiva sobre celulosa activada con péptidos solapantes entre sí. El reconocimiento de ciertos péptidos por el anticuerpo que va a someterse a prueba para determinar su capacidad para detectar o reconocer un antígeno/epítopo específico se puntúa mediante el desarrollo de color rutinario (anticuerpo secundario con peróxido del rábano y 4-cloronaftol y peróxido de hidrógeno), mediante una reacción de quimioluminiscencia o medios similares conocidos en la técnica. En el caso, entre otros, de reacciones de quimioluminiscencia, la reacción puede cuantificarse. Si el anticuerpo reacciona con un cierto conjunto de péptidos solapantes, puede deducirse la secuencia mínima de aminoácidos que son necesarios para la reacción. El mismo ensayo puede revelar dos grupos distantes de péptidos reactivos, que indican el reconocimiento de un epítopo discontinuo, es decir conformacional en el polipéptido antigénico (Geysen (1986), Mol. Immunol. 23, 709-715).

Un epítopo preferido del anticuerpo anti-VHS o fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se da a conocer en el presente documento definido anteriormente y a continuación es el mismo que el reconocido por el AcM 2c.

Tal como se da a conocer en el presente documento, el anticuerpo anti-VHS (o un fragmento de unión a antígeno del mismo) para su uso según la presente divulgación puede ser el anticuerpo AcM 2c (o un fragmento de unión a antígeno del mismo). Este anticuerpo monoclonal AcM 2c se ha descrito en otra parte y se ha demostrado que neutraliza el virus al suprimir la propagación viral célula a célula, un mecanismo clave por el cual el VHS-1/2 escapa a la vigilancia inmunitaria humoral independientemente de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); Eis-Hübinger et al., Intervirology 32:351-360 (1991); Eis-Hübinger et al., Journal of General Virology 74:379-385 (1993); documento WO2011/038933 A2; Krawczyk A, et al., Journal of virology (2011);85(4):1793-1803; Krawczyk A, et al., Proc Natl Acad Sci U S A (2013);110(17):6760-6765.

Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos definidos anteriormente son particularmente útiles en entornos médicos que implican la administración tópica. Por tanto, tal como se mencionó anteriormente, la presente invención se refiere al uso médico de un anticuerpo anti-VHS o fragmento de unión a antígeno del mismo en el que dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se administra por vía tópica. En consecuencia, la presente invención se refiere a un anticuerpo anti-VHS o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en el tratamiento de una infección aguda de tejido mucoso o epidérmico en un sujeto provocada por VHS-1 o VHS-2 seleccionada del grupo que consiste en herpes simple labial, herpes simple genital, infección por herpes simple cutánea crónica o diseminada, herpes gladiatorum y eccema herpético, en el que dicho anticuerpo va a administrarse por vía tópica.

El término “tratamiento” y similares se usan en el presente documento queriendo decir generalmente la obtención de un efecto fisiológico y/o farmacológico deseado. Tal como ya se describió anteriormente, el tratamiento de la presente invención se refiere al tratamiento de infecciones agudas y, en consecuencia, excluye que el efecto pueda ser profiláctico en cuanto a prevención total o parcial de una enfermedad o síntoma de la misma. Más bien, el término “tratamiento” debe entenderse como terapéutico en cuanto a curar parcial o completamente una enfermedad y/o efecto adverso y/o síntomas atribuidos a la enfermedad de una infección aguda por VHS tal como se definió anteriormente. Por tanto, el tratamiento de la presente invención se refiere al tratamiento de infecciones agudas. “Agudo” en este sentido significa que el sujeto muestra síntomas de la enfermedad. En otras palabras, el sujeto que va a tratarse necesita realmente un tratamiento y el término “tratamiento agudo” en el contexto de la presente invención se refiere a las medidas adoptadas para tratar realmente la enfermedad después del inicio de la enfermedad o el brote de la enfermedad. El término “agudo” mencionado en el contexto de la presente invención se opone a un tratamiento profiláctico o preventivo, es decir, medidas adoptadas para prevenir la enfermedad, por ejemplo, con el fin de prevenir la infección y/o el inicio de la enfermedad. Más específicamente, tratamiento profiláctico puede entenderse de un modo que impide la unión de partículas de virus libres (desde fuera del cuerpo) a las células diana y, a su vez, impide la replicación del virus. Por el contrario, en una infección aguda (que podría ser una infección primaria o recurrente), se ha generado virus de progenie tras la replicación de VHS. Por tanto, el “tratamiento agudo” mencionado en la presente invención no se refiere explícitamente al tratamiento profiláctico o preventivo de una infección provocada por VHS-1 o VH-2. Administración tópica según la presente invención se refiere a un medicamento o aplicación o administración que se aplica a las superficies corporales, tales como la piel o las membranas mucosas para tratar la infección mencionada anteriormente a través de una amplia gama de clases de formas de administración, incluyendo pero sin limitarse a cremas, espumas, geles, lociones y pomadas. En una realización preferida, la administración tópica se entiende que es epicutánea, lo que significa que el anticuerpo anti-VHS o un fragmento de unión a antígeno del mismo se aplica directamente a la piel. Sin querer restringirse a la teoría y para proporcionar algunos ejemplos adicionales no limitantes, la aplicación tópica también puede ser inhalatoria, tal como medicamentos para el asma, o aplicarse a la superficie de tejidos distintos de la piel, tales como gotas para los ojos aplicadas a la conjuntiva, o gotas para los oídos colocadas en el oído, o medicamentos aplicados a la superficie de un diente. Como vía de administración, la administración tópica se contrasta con la entérica (en el tracto digestivo) e intravascular/intravenosa (inyectada en el sistema circulatorio). En su sentido más amplio, un efecto tópico puede entenderse de un modo que se refiere a, en el sentido farmacodinámico, una diana local, en vez de sistémica, para un medicamento.

El modo de administración tópica según la presente invención, es decir, el medicamento, la composición farmacéutica o la aplicación o administración que se aplica a las superficies corporales, tales como la piel o las membranas mucosas para tratar la infección de infección aguda de tejido mucoso o epidérmico en un sujeto provocada por VHS-1 o VHS-2 seleccionada del grupo que consiste en herpes simple labial, herpes simple genital, infección por herpes simple cutánea crónica o diseminada, herpes gladiatorum y eccema herpético no está particularmente limitado y el experto conoce muchas formas y preparaciones que pueden ser adecuadas para la administración tópica. Sin querer restringirse a la teoría y sin limitación, se proporcionan los siguientes ejemplos. Hay muchas clases generales, sin una línea divisoria clara entre formulaciones similares adecuadas para medicamentos tópicos. Como ejemplo, puede usarse una disolución tópica. Las disoluciones tópicas son generalmente de baja viscosidad y a menudo usan agua o alcohol en la base. Como otro ejemplo, puede usarse una loción para administrar el anticuerpo anti-VHS por vía tópica. Las lociones son similares a las disoluciones, pero son más espesas y tienden a tener una naturaleza más emoliente que la disolución. Son habitualmente un aceite mezclado con agua, y más a menudo tienen menos alcohol que las disoluciones. Como otro ejemplo, puede usarse una crema para administrar el anticuerpo anti-VHS por vía tópica. Una crema es habitualmente una emulsión de aceite y agua en proporciones aproximadamente iguales. Penetra bien la capa externa del estrato córneo de la piel. La crema es más espesa que la loción, y mantiene su forma cuando se retira de su recipiente. Tiende a ser moderada en tendencia hidratante. Como otro ejemplo, puede usarse una pomada para administrar el anticuerpo anti-VHS por vía tópica. Una pomada es comúnmente una preparación homogénea, viscosa, semisólida, lo más comúnmente un aceite graso, espeso (aceite 80 % - agua 20 %) con una alta viscosidad, que está destinada a aplicación externa a la piel o las membranas mucosas. Las pomadas tienen un índice acuoso que define la cantidad máxima de agua que pueden contener. Pueden usarse como emolientes o para la aplicación del anticuerpo anti-VHS según la presente invención a la piel con fines protectores, terapéuticos o profilácticos y donde se desee un grado de oclusión. El vehículo de una pomada se conoce como la base de la pomada. La elección de una base depende de la indicación clínica de la pomada y se elige apropiadamente basándose en el conocimiento del experto en la técnica. Diferentes tipos de bases de pomada pueden ser bases de hidrocarburos, por ejemplo, parafina dura, parafina blanda, cera microcristalina y ceresina; bases de absorción, por ejemplo, grasa de lana, cera de abejas; bases solubles en agua, por ejemplo, macrogoles 200, 300, 400; bases emulsionantes, por ejemplo, cera emulsionante, cetrimida; aceites vegetales, por ejemplo, aceite de oliva, aceite de coco, aceite de sésamo, aceite de almendras y aceite de cacahuete. Comúnmente, el medicamento, es decir, el anticuerpo anti-VHS en la presente invención, se dispersa en la base, y luego se dividen después de la penetración del fármaco en las células vivas de la piel. Las pomadas se formulan comúnmente usando preparaciones hidrófobas, hidrófilas o emulsionantes de agua para proporcionar preparaciones que son inmiscibles, miscibles o emulsionables con secreciones cutáneas. También pueden derivarse de base de hidrocarburos (grasos), absorbentes, removibles con agua o solubles en agua. Como otro ejemplo, puede usarse un gel para administrar el anticuerpo anti-VHS por vía tópica. Los geles suelen ser más espesos que una disolución. Los geles son a menudo una emulsión semisólida en una base de alcohol. Algunos se derretirán a temperatura corporal. El gel tiende a ser celulosa cortada con alcohol o acetona. Como otro ejemplo, puede usarse una espuma para administrar el anticuerpo anti-VHS por vía tópica. Como otro ejemplo, puede usarse un parche transdérmico para administrar el anticuerpo anti-VHS por vía tópica. Los parches transdérmicos pueden ser un método de liberación temporal muy preciso de suministro de un fármaco. La liberación del componente activo de un sistema de suministro transdérmico (parche) puede controlarse mediante la difusión a través del adhesivo que cubre todo el parche, mediante la difusión a través de una membrana que solo puede tener adhesivo en el borde del parche o la liberación del fármaco puede controlarse mediante la liberación de una matriz de polímero. Como otro ejemplo, puede usarse un polvo para administrar el anticuerpo anti-VHS por vía tópica. El polvo es o bien el propio fármaco puro (polvo de talco), o bien está hecho del fármaco mezclado en un portador tal como almidón de maíz o polvo de mazorca de maíz (Zeosorb AF - polvo de miconazol). Como otro ejemplo, puede usarse una forma sólida para administrar el anticuerpo anti-VHS por vía tópica. Por tanto, el anticuerpo anti-VHS puede colocarse en una forma sólida. Ejemplos son desodorantes, antitranspirantes, astringentes y agentes hemostáticos. En una realización preferida, en particular en el contexto de la administración tópica del anticuerpo anti-VHS en el tratamiento de una infección aguda del tejido mucoso o epidérmico provocada por VHS-1 o VHS-2 de herpes simple genital, el anticuerpo anti-VHS puede administrarse en forma de un supositorio. Un supositorio es un sistema de administración de fármacos que, en el contexto del tratamiento del herpes simple genital, comprende el anticuerpo anti-VHS y puede insertarse en la vagina (es decir, en forma de un supositorio vaginal), donde se disuelve o se funde y libera el anticuerpo anti-VHS y, en consecuencia, sirve para administrar localmente el anticuerpo anti-VHS. Como otro ejemplo, puede usarse un dispositivo de vaporización para administrar el anticuerpo anti-VHS por vía tópica. Por tanto, el anticuerpo anti-VHS puede aplicarse como una pomada o gel, y alcanzar la membrana mucosa por medio de vaporización. Como otro ejemplo, puede usarse una pasta para administrar el anticuerpo anti-VHS por vía tópica. La pasta combina tres agentes: aceite, agua y polvo. Es una pomada en la que se suspende un polvo. Como ejemplo final, no limitante, puede usarse una tintura para administrar el anticuerpo anti-VHS por vía tópica. Una tintura es una preparación para la piel que tiene un alto porcentaje de alcohol.

En otra realización, el anticuerpo anti-VHS o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en el tratamiento de una infección aguda de tejido mucoso o epidérmico en un sujeto provocada por VHS-1 o VHS-2 seleccionada del grupo que consiste en herpes simple labial, herpes simple genital, infección por herpes simple cutánea crónica o diseminada, herpes gladiatorum y eccema herpético, va a aplicarse por vía tópica al tejido mucoso o epidérmico infectado. La zona a la que va a aplicarse el anticuerpo anti-VHS o un fragmento de unión a antígeno del mismo no está particularmente limitada. Preferiblemente, se elige una zona del tejido mucoso o epidérmico que presenta síntomas agudos de una infección provocada por VHS-1 o VHS-2. Preferiblemente, estas zonas o partes del cuerpo del sujeto son los labios, los genitales, la nariz, los oídos, los ojos, los dedos de las manos, los dedos de los pies y/o zonas de la piel por todo el cuerpo, preferiblemente en la cabeza, la zona de la mandíbula, el cuello, el pecho, la cara, el estómago y/o las piernas. En particular, en la infección cutánea por herpes simple tal como se describió anteriormente, zonas de la piel (más grandes) por todo el cuerpo pueden verse afectadas comúnmente mientras que en el herpes gladiatorum tal como se describió anteriormente, se produce habitualmente en la cabeza, lo más comúnmente la zona de la mandíbula, el cuello, el pecho, la cara, el estómago y las piernas. En consecuencia, en estas enfermedades, se prefiere que la administración tópica según la invención se realice a estas partes del cuerpo o zonas de tejido mucoso o epidérmico. En una realización preferida adicional, el anticuerpo anti-VHS o el fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según la presente invención va a aplicarse por vía tópica a zonas que rodean el tejido mucoso o epidérmico infectado. Las zonas que rodean el tejido mucoso o epidérmico infectado deben entenderse como la zona alrededor de una ubicación infectada dada del tejido. La extensión de la zona circundante no es particularmente limitante, pero puede cubrir, por ejemplo, una zona adyacente a/circundante del tejido infectado que tiene aproximadamente 0,5 veces el tamaño de la zona infectada, el mismo tamaño de la zona infectada, 1,5 veces, preferiblemente 2 veces o incluso más preferiblemente 3, 4 o 5 veces el tamaño del área infectada.

El anticuerpo anti-VHS o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en el tratamiento de una infección aguda de tejido mucoso o epidérmico en un sujeto provocada por VHS-1 o VHS-2 seleccionada del grupo que consiste en herpes simple labial, herpes simple genital, infección por herpes simple cutánea crónica o diseminada, herpes gladiatorum y eccema herpético, en el que dicho anticuerpo anti-VHS o un fragmento de unión a antígeno del mismo va a aplicarse por vía tópica, puede administrarse en combinación con un agente virostático. Preferiblemente, una terapia de combinación de este tipo ejerce efectos sinérgicos sobre el tratamiento según la presente invención.

El término “combinación”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una combinación de anticuerpo anti-VHS o un fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se explicó de manera resumida anteriormente y un agente virostático descrito en el presente documento a continuación. En una realización preferida, se prevé una aplicación simultánea. Sin embargo, la combinación incluye también una aplicación posterior de los dos componentes, es decir, anticuerpo anti-VHS o un fragmento de unión a antígeno del mismo tal como describió de manera resumida anteriormente, y un agente virostático descrito en el presente documento a continuación. Por tanto, uno de estos componentes puede administrarse antes, simultáneamente con o después del otro de la combinación, o viceversa. En consecuencia, “en combinación” tal como se usa en el presente documento no restringe el tiempo entre la administración del anticuerpo anti-VHS o un fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se describió de manera resumida anteriormente, y un agente virostático descrito en el presente documento a continuación. Por tanto, cuando los dos componentes no se administran simultáneamente con/concurrentemente, las administraciones pueden estar separadas por 1 minuto, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas o 72 horas o por cualquier diferencial de tiempo adecuado fácilmente determinado por un experto en la técnica y/o descrito en el presente documento.

El experto en la técnica conoce bien agentes virostáticos y se denominan comúnmente también fármacos antivirales que son una clase de medicamentos usados específicamente para tratar infecciones virales. Se usan antivirales específicos para virus específicos. A diferencia de la mayoría de los antibióticos, los fármacos antivirales no destruyen su patógeno diana; en su lugar, inhiben su desarrollo.

Con respecto a las infecciones por VHS, el experto en la técnica está en condiciones de seleccionar un agente virostático adecuado que es adecuado para inhibir el desarrollo del virus según la presente invención. Como ejemplos, el agente virostático puede seleccionarse del grupo que consiste en clases de fármacos de análogos de nucleósidos, análogos de pirofosfato, análogos de nucleótidos, derivados de amantadina e inhibidores de helicasa-primasa. Por tanto, la presente invención se refiere a un anticuerpo anti-VHS o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en el tratamiento de una infección aguda de tejido mucoso o epidérmico en un sujeto provocada por VHS-1 o VHS-2 seleccionada del grupo compuesto por herpes simple labial, herpes simple genital, infección por herpes simple cutánea crónica o diseminada, herpes gladiatorum y eccema herpético, en el que dicho anticuerpo anti-VHS o un fragmento de unión a antígeno del mismo va a aplicarse por vía tópica en combinación con un agente virostático seleccionado del grupo que consiste en clases de fármaco de análogos de nucleósidos, análogos de pirofosfato, análogos de nucleótidos e inhibidores de helicasa primasa.

En la técnica se conocen análogos de nucleósidos y se refieren a moléculas que actúan como nucleósidos en la síntesis de ADN. Incluyen una gama de productos antivirales usados para prevenir la replicación viral en células infectadas. Una vez que se fosforilan, funcionan como antimetabolitos al ser lo suficientemente similares a los nucleótidos que van a incorporarse en hebras de ADN en crecimiento, pero actúan como terminadores de cadena y detienen la ADN polimerasa viral. Se sabe que los análogos de nucleósidos, nucleótidos y pirofosfatos en general inhiben la síntesis de ácido nucleico viral bloqueando la replicación viral. Los análogos de nucleósidos, nucleótidos son fármacos antimetabolitos. Los análogos de pirofosfato (por ejemplo, Foscarnet) imitan estructuralmente el anión pirofosfato y ejercen actividad antiviral mediante una inhibición selectiva del sitio de unión a pirofosfato en ADN polimerasas específicas de virus a concentraciones que no afectan a ADN polimerasas celulares. Los análogos de nucleótidos y pirofosfatos no requieren una activación inicial (fosforilación) por timidina cinasas u otras cinasas antes de captarse en las células. Los inhibidores de helicasa-primasa son inhibidores no nucleosídicos que se seleccionan como diana la helicasa-primasa viral.

Preferiblemente, pueden usarse agentes virostáticos comúnmente conocidos y aprobados tal como se resume a continuación. Como análogo de nucleósido, un compuesto seleccionado del grupo compuesto por aciclovir, penciclovir, valaciclovir y famaciclovir puede mencionarse y usarse a modo de ejemplo en la terapia combinada descrita anteriormente. Como análogo de pirofosfato puede usarse foscarnet. Como análogo de nucleótido puede usarse cidofovir. Como inhibidor de helicasa-primasa se menciona pritelivir a modo de ejemplo. Como derivado de amantadina, puede usarse tromantandina.

Aciclovir, también conocido como acicloguanosina (ACV) o 2-amino-9-(2-hidroxietoximetil)-3H-purina-6-ona, es un fármaco antiviral análogo de guanosina, comercializado con nombres comerciales tales como ACERPES®, Acic®, Aciclobeta®, AcicloCT®, Aciclostad®, Aciclovir, Acic®, Ophtal®, Acivir®, AciVision, Acyclovir®, Aviral®, Cyclovir, Helvevir®, Herpex, Supraviran ®, Virucalm®, Virupos® Virzin, Zoliparin®, Zovir y Zovirax®. Penciclovir (2-amino-9-[4-hidroxi-3-(hidroximetil)butil]-6,9-dihidro-3H-purin-6-ona) es un fármaco antiviral análogo de guanina, comercializado con nombres comerciales tales como denavir y fenistil. Famciclovir (acetato de 2-[(acetiloxi)metil]-4-(2-amino-9H-purina-9-il)butilo) es un profármaco de penciclovir con biodisponibilidad oral mejorada. Foscarnet es la base conjugada del compuesto químico con la fórmula HO²CPO³H² y se comercializa con los nombres comerciales Foscavir® y Triapten®. Valaciclovir, también conocido como (S)-2-[(2-amino-6-oxo-6,9-dihidro-3H-purina-9-il)metoxi-2-amino-3-metilbutanoato, es un profármaco del fármaco antiviral análogo de guanosina ACV comercializado con el nombre de, por ejemplo, Valtrex®. Cidovovir (CDV), también conocido como (S)-1-[3-hidroxi-2-(fosfonilmetoxipropil)]citosina, es un fármaco antiviral análogo de nucleótido comercializado con el nombre Visitde®.

Pritelevir es una tiazolilamida, también conocida como AIC-316 o BAY 57-1293, es un inhibidor de helicasa-primasa actualmente en ensayos clínicos de fase II para el tratamiento de infecciones genitales por VHS-2. El fármaco terapéutico local tromantandina (Viru-Merz Serol Gel) se usa explícitamente para el tratamiento local de infecciones de la piel por VHS. Tromantandina es un derivado de amantadina. Griffin, patente estadounidense n.° 4.351.847 da a conocer que un derivado de amantadina es eficaz contra el virus del herpes simple. Además, también se da a conocer una composición farmacéutica, que comprende una cantidad eficaz del anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo según lo anterior y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Un excipiente es una sustancia inactiva formulada junto con el principio activo, es decir, el anticuerpo anti-VHS o el fragmento de unión a antígeno del mismo según lo anterior, para el fin de aumentar el volumen de formulaciones que contienen principios activos potentes. Los excipientes a menudo se denominan “agentes de aumento de volumen”, “cargas” o “diluyentes”. El aumento de volumen permite la dispensación conveniente y precisa de una sustancia farmacológica cuando se produce una forma de dosificación. También pueden servir para diversos fines que mejoran el potencial terapéutico, tales como facilitar la absorción o solubilidad de los fármacos, u otras consideraciones farmacocinéticas. Los excipientes también pueden ser útiles en el proceso de fabricación, para ayudar en la manipulación de la sustancia activa en cuestión, tal como, facilitando la fluidez del polvo o propiedades antiadherentes, además de ayudar a la estabilidad in vitro, tal como la prevención de la desnaturalización durante la vida útil de almacenamiento prevista. La selección de excipientes apropiados también depende de la vía de administración y la forma de dosificación, así como del principio activo y otros factores.

Por tanto, en consonancia con lo anterior, la composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz del anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo puede estar en forma sólida, líquida o gaseosa y puede estar, entre otros, en forma de polvo(s), comprimido(s), disolución/disoluciones o aerosol(es). Es preferible que dicha composición farmacéutica comprenda opcionalmente un diluyente y/o portador farmacéuticamente aceptable.

Ejemplos de portadores, excipientes y/o diluyentes farmacéuticos adecuados se conocen bien en la técnica e incluyen soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua, diversos tipos de agentes humectantes, disoluciones estériles, etc. Pueden formularse composiciones que comprenden tales portadores mediante métodos convencionales bien conocidos. Estas composiciones farmacéuticas pueden administrarse al sujeto a una dosis adecuada, es decir, en una “cantidad eficaz” que puede determinarla fácilmente el experto mediante métodos conocidos en la técnica. La administración de la composición farmacéutica adecuada se efectúa según la presente invención por administración tópica. El régimen de dosificación lo determinará el médico encargado y los factores clínicos. Tal como se sabe bien en las técnicas médicas, las dosificaciones de cada paciente dependen de muchos factores, incluyendo el tamaño del paciente o sujeto, el área de superficie corporal, la edad, el compuesto particular que va a administrarse, el sexo, el momento y la vía de administración, la salud general y otros medicamentos que estén administrándose simultáneamente. Puede estar presente materia proteínica farmacéuticamente activa en cantidades entre 0,1 -10 |ig/kg de peso corporal por dosis; sin embargo, se prevén dosis por encima o por debajo de este intervalo a modo de ejemplo, especialmente teniendo en cuenta los factores anteriormente mencionados. Para la administración tópica, tal como se prefiere particularmente en el contexto de la presente invención, se prevé particularmente una materia farmacéuticamente activa adecuada para la administración tópica tal como se definió en el presente documento además anteriormente y a continuación, que contiene concentraciones de anticuerpos de 0,1 a 10 mg/ml, preferiblemente de 0,5 a 5 mg/ml. Esto corresponde a los intervalos usados en los ejemplos tal como se ejemplifica adicionalmente a continuación donde se ha usado el anticuerpo en disolución líquida (PBS) o mezclado 1:2 con crema a concentraciones entre 0,5 y 5 mg/ml, lo que corresponde a de 0,5 a 5 mg/g en PBS o una crema con la misma densidad del PBS.

Por tanto, preferiblemente, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo y/o el agente virostático se incluyen en una cantidad eficaz. El término “cantidad eficaz” se refiere a una cantidad suficiente para inducir una respuesta terapéutica detectable en el sujeto al que va a administrarse la composición farmacéutica. Según lo anterior, el contenido del anticuerpo en la composición farmacéutica no se limita en la medida en que sea útil para el tratamiento descrito anteriormente, pero preferiblemente contiene el 0,0000001 -10 % en peso por composición total. Además, el anticuerpo descrito en el presente documento se emplea preferiblemente en un portador. Generalmente, en el portador se usa una cantidad apropiada de sal farmacéuticamente aceptable para hacer que la composición sea isotónica. Los ejemplos del portador incluyen, pero no se limitan a, solución salina, disolución de Ringer y disolución de dextrosa. Preferiblemente, excipientes, portadores o estabilizadores aceptables no son tóxicos en las dosificaciones y concentraciones empleadas, incluyendo tampones tales como citrato, fosfato y otros ácidos orgánicos; contraiones formadores de sal, por ejemplo, sodio y potasio; polipéptidos de bajo peso molecular (> 10 residuos de aminoácidos); proteínas, por ejemplo, albúmina sérica o gelatina; polímeros hidrófilos, por ejemplo, polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como histidina, glutamina, lisina, asparagina, arginina o glicina; hidratos de carbono incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; monosacáridos; disacáridos; otros azúcares, por ejemplo, sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; agentes quelantes, por ejemplo, EDTA; tensioactivos no iónicos, por ejemplo, Tween, Pluronics o polietilenglicol; antioxidantes incluyendo metionina, ácido ascórbico y tocoferol; conservantes y/o, por ejemplo, cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio; fenol, alcohol bencílico o butílico; alquilparabenos, por ejemplo, metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol). Se describen portadores adecuados y sus formulaciones con mayor detalle en las Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a ed., 1985, Mack Publishing Co.

El progreso puede monitorizarse mediante una evaluación periódica. El anticuerpo, fragmento de unión a antígeno del mismo o la composición farmacéutica de la invención se administran localmente tal como se definió anteriormente, en contraste con una administración sistémica. Ya se han descrito preparaciones para administración tópica anteriormente e incluyen, entre otras, disoluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas estériles, así como cremas y supositorios. Ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos tales como oleato de etilo. Los portadores acuosos incluyen agua, disoluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, incluyendo solución salina y medios tamponados. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes y similares. Además, la composición farmacéutica de la invención puede comprender agentes adicionales dependiendo del uso previsto de la composición farmacéutica. Dichos agentes pueden ser, por ejemplo, Tween, EDTA, citrato, sacarosa, así como otros agentes adecuados para el uso previsto de la composición farmacéutica que son conocidos por el experto en la técnica.

Según esta invención, el término “composición farmacéutica” se refiere a una composición para su administración a un paciente, preferiblemente un paciente humano. En el contexto de la presente invención, se medicamento/composición farmacéutica va a administrarse por vía tópica a un paciente que padece una infección aguda de tejido mucoso o epidérmico provocada por VHS-1 o VHS-2 según la presente invención. En el contexto de la presente invención, el sujeto, es decir, el paciente, se refiere a un paciente humano. Por tanto, la presente invención también se refiere a una composición farmacéutica, que comprende una cantidad eficaz del anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en el tratamiento de una infección aguda de tejido mucoso o epidérmico en un sujeto provocada por VHS-1 o VHS-2 seleccionada del grupo consistente en herpes simple labial, herpes simple genital, infección por herpes simple cutánea crónica o diseminada, herpes gladiatorum y eccema herpético y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. En cuanto a las realizaciones preferidas de la composición farmacéutica se aplica lo mismo, cambiando lo que se tenga que cambiar, tal como se ha expuesto anteriormente en el contexto del anticuerpo anti-VHS o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en el tratamiento de una infección aguda de tejido mucoso o epidérmico en un sujeto provocada por VHS-1 o VHS-2 seleccionada del grupo que consiste en herpes simple labial, herpes simple genital, infección por herpes simple cutánea crónica o diseminada, herpes gladiatorum y eccema herpético en el que dicho anticuerpo va a administrarse por vía tópica, así como la composición farmacológica tal como se definió anteriormente.

También se da a conocer un método para el tratamiento de una infección aguda de tejido mucoso o epidérmico en un sujeto provocada por VHS-1 o VHS-2 seleccionada del grupo que consiste en herpes simple labial, herpes simple genital, infección por herpes simple cutánea crónica o diseminada, herpes gladiatorum y eccema herpético que comprende la etapa de administrar por vía tópica el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno tal como se definió anteriormente. Por tanto, se da a conocer un método de tratamiento de infecciones agudas de tejido mucoso o epidérmico en un sujeto provocadas por VHS-1 o VHS-2 seleccionadas del grupo que consiste en herpes simple labial, herpes simple genital, infección por herpes simple cutánea crónica o diseminada, herpes gladiatorum y eccema herpético en un sujeto en el que el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo se administra por vía tópica al sujeto en una cantidad terapéuticamente eficaz. En cuanto a las realizaciones preferidas del método de tratamiento se aplica lo mismo, cambiando lo que se tenga que cambiar, tal como se ha expuesto anteriormente en el contexto del anticuerpo anti-VHS o un fragmento de unión a antígeno del mismo o la composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una infección aguda de tejido mucoso o epidérmico en un sujeto provocada por VHS-1 o VHS-2 seleccionada del grupo que consiste en herpes simple labial, herpes simple genital, infección por herpes simple cutánea crónica o diseminada, herpes gladiatorum y eccema herpético en el que dicho anticuerpo va a administrarse por vía tópica, así como la composición farmacológica tal como se definió anteriormente.

En la presente invención, el sujeto es en una realización preferida un mamífero tal como un perro, gato, cerdo, vaca, oveja, caballo, roedor, por ejemplo, rata, ratón y conejillo de indias, o un primate, por ejemplo, gorila, chimpancé y humano. En la realización más preferible, el sujeto es un humano.

Otros aspectos y ventajas de la invención se describirán en los siguientes ejemplos, que se facilitan a efectos de ilustración y en ningún modo de limitación. Cada publicación, patente, solicitud de patente u otro documento citado en esta solicitud se incorpora por referencia en su totalidad.

Figura 1: compara la supervivencia de ratones inmunodeficientes con infección genital aguda por VHS-2 después del tratamiento tópico, o bien con el anticuerpo monoclonal humanizado hu2c o bien aciclovir. Se trataron ratones hembras (NOD.CB17-Prkdcscid/NCrHsd) con progestina de acción prolongada (Depo-Clinovir, Pharmacia) 7 días antes de la exposición viral para aumentar la susceptibilidad a la infección por VHS-2 y eliminar las diferencias causadas por el ciclo estral. Los ratones anestesiados se expusieron vaginalmente a una dosis letal de 5x105 UFP de VHS-2 G (20 |il). Los ratones que presentan infección visible (pérdida de cabello perineal, enrojecimiento, hinchazón) se trataron un día después de la exposición viral (A) una vez con 40 |il de hu2c (5 mg/ml) (•) o 40 |il de IgG de control (5 mg/ml) (□) o (B) dos veces al día durante 4 días con 40 |il de ACV (25 mg/ml) (A) o 40 |il de PBS (x). Se aplicaron por vía tópica disoluciones de fármaco o PBS al epitelio genital externo. Los ratones se monitorizaron durante 36 días después de la inoculación viral. Los ratones que presentaban signos sistémicos más graves y/o lesiones graves/zóster se sacrificaron. Los ratones supervivientes se sacrificaron el día 36. Los grupos de prueba contenían ocho animales cada uno, los grupos de control contenían cinco animales cada uno. Se analizaron curvas de supervivencia de Kaplan-Meier mediante la prueba de rangos logarítmicos (Mantel-Cox). Se usaron pruebas de significación bilaterales para comparar el nivel de significación entre dos grupos. Todos los protocolos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales.

Figura 2: muestra la puntuación clínica de la infección genital aguda por VHS-2 después del tratamiento tópico con el anticuerpo monoclonal humanizado hu2c o aciclovir. Ratones que presentaban infección visible (pérdida del cabello perineal, enrojecimiento, hinchazón) un día después de la exposición intravaginal a una dosis letal de 5x105 UFP de VHS-2 G (20 |il) se trataron (A y C) dos veces al día durante 4 días con (A) 40 |il de PBS o (C) 40 |il de ACV (25 mg/ml), o se trataron (B y D) una vez a las 24 h después de la infección con (B) 40 |il de hu2c (5 mg/ml) o (D) 40 |il de IgG de control (5 mg/ml). Se aplicaron por vía tópica disoluciones de fármaco o PBS al epitelio genital externo. Se observaron diariamente los animales infectados y su estado clínico se puntuó de la siguiente manera: 0, ausencia de síntomas, sin lesiones; 1-2, enrojecimiento y/o hinchazón (erosión); 3, lesión localizada < 1 mm; 4-5, lesión localizada 2-3 mm; 6-7 lesión localizada 4-5 mm; 8-9, hiperemia grave, destrucción del epitelio y el estroma con necrosis; 10, signos sistémicos, muerte. Los animales con clasificación >8 se sacrificaron para evitar sufrimientos indebidos. Los grupos de prueba contenían ocho animales cada uno, los grupos de control contenían cinco animales cada uno. Las flechas indican los puntos de tiempo de tratamiento.

Ejemplos

Ejemplo 1: Aplicación tópica de un anticuerpo humanizado anti-VHS

1. Sujeto, materiales, métodos

1.1 Generación y producción de un anticuerpo monoclonal humanizado neutralizante de VHS.

Recientemente, se ha demostrado que la reticulación de un epítopo de glicoproteína B altamente conservado de VHS-1/2 a través del anticuerpo monoclonal murino AcM 2c no solo da como resultado una neutralización altamente eficaz de los viriones libres sino también la inhibición de la propagación directa del virus de células infectadas a no infectadas (Krawczyk A, et al., Journal of virology 2011; 85 (4):1793-1803). Para aprovechar estas propiedades únicas para uso terapéutico en humanos, se generó un derivado humanizado del AcM 2c.

Para la gran mayoría de los anticuerpos humanizados, se requiere habitualmente la retención de un conjunto de residuos murinos potencialmente inmunogénicos dentro de los entramados humanos para mantener la integridad estructural de los bucles de unión a antígeno injertados. Con el fin de generar un anticuerpo humanizado con el menor potencial inmunogénico posible, se había evitado cualquier manipulación del entramado mediante una cuidadosa selección de secuencias de línea germinal humana apropiadas y el empleo simultáneo del enfoque de alineamientos múltiples de secuencias descrito anteriormente (Krauss J, et al., Protein Eng 2003;16(10):753-759).

Para identificar armazones aceptores de línea germinal humana apropiados para injertar las regiones determinantes de complementariedad (CDR) del AcM 2c, se alinearon secuencias de entramado de dominio variable de AcM 2c con secuencias humanas correspondientes de la base de datos V Base (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/). Las identidades de secuencia de entramado más altas para la secuencia de cadena variable ligera (Vl) y variable pesada (Vh) del AcM 2c murino mostraron las secuencias de línea germinal humana DP28 (88,5 %) y DPK13 (88,9 %), respectivamente. Por tanto, se injertaron segmentos génicos codificantes de CDR del anticuerpo donador murino 2c (es decir, 2c Vl-CDR1/2/3 y 2c Vh-CDR1/2/3) en entramados aceptores que codifican para DP28 y DPK13, respectivamente. Se clonaron posteriormente genes que codifican para dominios variables de la cadena Vl y cadena Vh quimérica y humanizada en vectores de expresión de inmunoglobulina que contenían una cadena pesada constante humana y1 y una cadena k constante humana, respectivamente. El anticuerpo humanizado se produjo o bien a partir de líneas celulares de mieloma de ratón Sp2/0 transfectadas de manera estable o bien células HEK293 transfectadas de manera transitoria en condiciones libres de suero y se purificaron de los sobrenadantes de cultivo hasta homogeneidad mediante cromatografía de proteína A. La pureza se evaluó mediante cromatografía de filtración en gel (Superdex 200GL, GE Healthcare) como > 95 % (Krawczyk A, et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2013;110(17):6760-6765).

1.2 Descripción del ensayo

Entre 2010-2013, se trató a doce voluntarios sanos de 30 a 59 años (7 mujeres, 5 hombres) con recurrencia aguda de infección por herpes oral (herpes labial). Los voluntarios se presentaron por sí mismos cuando se produjo el inicio de los síntomas de VHS (picazón en los labios, ardor u hormigueo cerca de los labios o la zona de la boca) o habían progresado a trastornos visibles de la piel en los labios externos. Los trastornos cutáneos observados incluyeron ampollas pequeñas a grandes llenas de líquido amarillento claro o lesiones herpéticas externas, incluyendo ampollas rojas con fugas. La infección por herpes oral de la zona bucal está provocada principalmente por el virus del herpes simple tipo 1 (VHS-1). Sin embargo, a veces el VHS-2 se extiende a la boca durante el sexo oral, provocando herpes oral. No se analizó el tipo de infección por VHS (VHS-1 o VHS-2).

El anticuerpo se envasó como disoluciones estériles en PBS o PBS/crema de ceniza (1:1) a concentraciones de 0,7­ 1 mg/ml. Los participantes aplicaron aprox. 10 |il del anticuerpo por vía tópica una vez, una vez al día durante dos días o por un total de tres veces máximo.

2. Resultados

ZOVIRAX Cream se había evaluado en 2 ensayos de doble ciego, aleatorizados, controlados por placebo (vehículo) (véase Zovirax N-. Información sobre prescripción de Zovirax. http://wwwaccessdatafdagov/drugsatfda docs/label/2002/21478 zovirax Iblpd f #page =1&zoom=auto,0,792).

En los estudios de Zovirax, se instruyó a los sujetos que iniciaran el tratamiento en el plazo de una hora después de notar signos o síntomas y que continuaran el tratamiento durante 4 días, con aplicación del medicamento de estudio 5 veces al día. En ambos estudios, la duración media del episodio recurrente de herpes labial fue aproximadamente medio día más corta en los sujetos tratados con ZOVIRAX Cream (n = 682) en comparación con los sujetos tratados con placebo (n = 703) (aproximadamente 4,5 días frente a 5 días, respectivamente). No se observó diferencia significativa entre los sujetos que recibieron ZOVIRAX Cream o vehículo en la prevención de la progresión de lesiones de calenturas.

En comparación con brotes previos de VHS que se han tratado con aciclovir (Zovirax créme), todos los participantes que usaron la disolución de anticuerpos notificaron un alivio rápido del dolor y los síntomas en el plazo de 24 h después de la aplicación del anticuerpo. A diferencia de las experiencias con la terapia con aciclovir, las ampollas activas retrocedieron y no se convirtieron en ampollas supurantes cuando se trataron por vía tópica con el anticuerpo. Cuando se inició el tratamiento con anticuerpos en la fase de lesiones herpéticas externas visibles, los participantes notificaron una rápida cicatrización y desaparición de zonas con costras. Todos los participantes notificaron, en contraste con su experiencia con Zovirax, que la zona infectada no se propagó tras el tratamiento con anticuerpos.

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   i. Anticuerpo anti-VHS o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en el tratamiento de una infección aguda de tejido mucoso o epidérmico en un sujeto provocada por VHS-1 o VHS-2 seleccionada del grupo que consiste en herpes simple labial, herpes simple genital, infección por herpes simple cutánea crónica o diseminada, herpes gladiatorum y eccema herpético, en el que dicho anticuerpo va a administrarse por vía tópica, en el que el anticuerpo anti-VHS o el fragmento de unión a antígeno del mismo es capaz de inhibir la propagación de VHS de una célula infectada a una segunda célula no infectada adyacente (propagación célula a célula).
2. 2. Anticuerpo anti-VHS o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo anti-VHS es un anticuerpo monoclonal o policlonal.
3. 3. Anticuerpo anti-VHS o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según la reivindicación 1 o 2, en el que dicho anticuerpo anti-VHS es un anticuerpo humanizado o totalmente humano.
4. 4. Anticuerpo anti-VHS o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho anticuerpo anti-VHS reconoce la glicoproteína B (gB) del VHS-1 y/o VHS-2.
5. 5. Anticuerpo anti-VHS o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según la reivindicación 4, en el que el anticuerpo es capaz de inhibir la propagación célula a célula independientemente de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).
6. 6. Anticuerpo anti-VHS o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 4 o 5, que comprende las regiones determinantes de complementariedad VhCDR1 que comprende SEQ ID NO: 1, VhCd R2 que comprende SEQ ID NO: 2, VhCDR3 que comprende SEQ ID NO: 3, VlCDr 1 que comprende SEQ ID NO: 4, VlCDR2 que comprende SEQ ID NO: 5 y VlCDR3 que comprende SEQ ID NO:6.
7. 7. Anticuerpo anti-VHS o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según la reivindicación 6, en el que el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos el 70 % con los residuos de aminoácidos mostrados en las posiciones 1 a 30, 38 a 51,68 a 99 y 112 a 122 de SEQ ID NO: 7 y en las posiciones 1 a 23, 41 a 55, 63 a 94 y 104 a 114 de SEQ ID NO: 8.
8. 8. Anticuerpo anti-VHS o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7, en el que dicho anticuerpo comprende la Vh de SEQ ID NO:9 y la Vl de SEQ ID NO:10.
9. 9. Anticuerpo anti-VHS o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho anticuerpo va a aplicarse por vía tópica al tejido mucoso o epidérmico infectado de los labios, los genitales, la nariz, los oídos, los ojos, los dedos de las manos, los dedos de los pies y/o zonas cutáneas de todo el cuerpo, preferiblemente en la cabeza, la zona de la mandíbula, el cuello, el pecho, la cara, el estómago y/o las piernas.
10. 10. Anticuerpo anti-VHS o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho anticuerpo va a aplicarse por vía tópica a zonas que rodean el tejido mucoso o epidérmico infectado.
11. 11. Anticuerpo anti-VHS o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho anticuerpo va a administrarse en combinación con un agente virostático.
12. 12. Anticuerpo anti-VHS o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según la reivindicación 11, en el que dicho agente virostático se selecciona del grupo que consiste en clases de fármacos de análogos de nucleósidos, análogos de pirofosfato, análogos de nucleótidos, derivado de amantadina e inhibidores de helicasa-primasa.
13. 13. Anticuerpo anti-VHS o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según la reivindicación 12,

    en el que dicho análogo de nucleósido se selecciona del grupo que consiste en aciclovir, penciclovir, valaciclovir y famaciclovir;

    en el que dicho análogo de pirofosfato es foscarnet;

    en el que dicho análogo de nucleótido es cidofovir;

    en el que dicho derivado de amantadina es tromantandina; y

    en el que dicho inhibidor de helicasa-primasa es pritelevir.
14. 14. Anticuerpo anti-VHS para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el anticuerpo anti-VHS es un anticuerpo de longitud completa/anticuerpo completo.
15. 15. Composición farmacéutica, que comprende una cantidad eficaz del anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.