ES2841298T3

ES2841298T3 - Procedimiento de producción de ácidos grasos

Info

Publication number: ES2841298T3
Application number: ES17709371T
Authority: ES
Inventors: Zhiwei Zhu; Anastasia Krivoruchko; Jens Nielsen
Original assignee: Total Raffinage Chimie SAS
Current assignee: TotalEnergies Raffinage Chimie SAS
Priority date: 2016-03-04
Filing date: 2017-02-20
Publication date: 2021-07-08
Anticipated expiration: 2037-02-20
Also published as: US10648043B2; CN108779444A; AU2017225545A1; EP3423573B1; US20190040477A1; WO2017148727A1; PT3423573T; ZA201806415B; EP3423573A1; BR112018016151A2

Abstract

Una célula procariota o eucariota recombinante que comprende o que expresa una ácido graso sintasa (FAS) fúngica y una tioesterasa (TE), en la que dicha FAS comprende opcionalmente FAS1 y FAS2, en la que dicha TE y dicha FAS, FAS1 o FAS2 están codificadas como un único marco abierto de lectura (ORF).

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento de producción de ácidos grasos

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la producción de ácidos grasos, en particular la producción de ácidos grasos de cadena corta/media (S/MCFA, forma siglada de short/medium chain fatty acids) y productos derivados tales como los hidrocarburos, los aldehídos grasos y los alcoholes grasos. La presente invención proporciona a este fin construcciones genéticas y células hospedadoras, procedimientos para producirlos así como procedimientos para utilizarlos.

Antecedentes de la invención

Ácidos grasos de cadena corta/media (S/MCFA, por ejemplo, C6 - C12) son precursores de muchos productos químicos industriales y de biocombustibles. La principal fuente de S/MCFA proviene del refinado de aceite vegetal y aceite fósil, pero la disponibilidad mundial de estos compuestos es limitada al tiempo que el consumo aumenta. Por lo tanto, es de especial interés encontrar una nueva fuente para estos productos y, al mismo tiempo, producir este tipo de ácidos grasos de forma sostenible mediante la transformación de materiales basados en biomasa mediante microbios.

El proceso natural de síntesis de ácidos grasos microbianos transcurre mediante la adición progresiva de dos unidades de carbono a una cadena de acilo en crecimiento unida a la proteína transportadora de acilos (ACP, forma siglada de acyl carrier protein). El proceso comienza como una condensación de acetil-ACP y malonil-ACP en acetoacetil-ACP que libera CO2, lo que impulsa la reacción. La segunda etapa implica la reducción de acetoacetil-ACP a D-3-hidroxibutiril-ACP utilizando NADPH. Después de una deshidratación a crotonil-ACP y otra reducción utilizando NADPH, se forma butiril-ACP. El alargamiento de la cadena normalmente continúa con la adición adicional de malonil-ACP hasta que se forma una cadena de acilo de determinada longitud, que luego hidroliza una tioesterasa en un ácido graso libre.

Recientemente, la mayoría de los esfuerzos para el control de la longitud de cadenas se centraron en la síntesis de ácidos grasos o la inversión de la p-oxidación, y las dianas para limitar el alargamiento de la cadena de acilo son las enzimas responsables de la condensación (cetoacil-ACP sintasa y tiolasa) o la liberación del producto (acil-ACP/CoA tioesterasa).

La inversión de la p-oxidación se estableció por primera vez en E. coli y se identificaron las partes funcionales individuales de esta ruta. Sin embargo, esta ruta prefiere producir ácido carboxílico de cadena corta (ácido butírico). El diseño técnico adicional implica el uso de otra tiolasa (tal como BktB) capaz de condensar acetil-CoA con intermedios de acil-CoA C4-C8 para producir ácidos grasos de cadena media. Los títulos en E. coli fueron de más de 1 g/l (C6-C10). Recientemente, después de probar más de 40 enzimas, se realizó la p-oxidación inversa en levaduras, aunque la capacidad es mucho menor que la de E. coli.

En procariotas, se utilizan las ácido graso sintasas de tipo II disociadas. El producto final de la síntesis de ácidos grasos es acil-ACP. Una estrategia común para producir S/MCFA es la expresión acil-ACP tioesterasas de cadena corta, que liberan S/MCFA del tioéster de ACP. Las acil-ACP de cadena corta/media, los sustratos de las tioesterasas, también se incorporan en la síntesis de ácidos grasos de cadena larga. Por lo tanto, se utilizó un mutante de p-cetoacil-ACP sintasa resistente a cerulenina (FabF*) con afinidades más bajas por acil-ACP de cadena media/larga (C8-C14) para bloquear la incorporación de las acil-ACP de cadena corta/media. Las estrategias combinadas utilizadas en E. coli dieron como resultado títulos de ácido graso C8 de 118 mg/l.

De lo anterior se desprende claramente que se investigan y emplean diversas estrategias para producir ácidos grasos, tales como S/MCFA, en particular la producción microbiana de ácidos grasos. Sin embargo, sigue existiendo una necesidad en la técnica de procedimientos nuevos y mejorados para la producción de ácidos grasos, tales como S/MCFA. La presente invención proporciona a este fin una solución.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos y medios para la producción o que implican la producción de ácidos grasos. La presente invención se refiere en particular al diseño técnico de un organismo (por ejemplo, levadura, algas...) para la producción de ácidos grasos, tales como ácidos grasos de cadena corta y media. De acuerdo con la invención, se diseña técnicamente una ácido graso sintasa (FAS, forma siglada de Fatty Acid Synthase) fúngica, o una subunidad FAS1 o FAS2 de la misma, mediante la introducción de una tioesterasa (TE), lo que da como resultado la producción de ácidos grasos, en particular ácidos grasos de cadena corta o media (S/MCFA). La presente invención se centra en la combinación específica de una FAS fúngica modificado (o subunidad FAS1 o FAS2) con una TE, en particular una TE heteróloga, para obtener, en particular, ácidos grasos con una longitud de cadena de carbonos hecha a medida (por ejemplo, de C6 a C12). De acuerdo con la invención, se diseña técnicamente una ácido graso sintasa (FAS) fúngica, o una subunidad FAS1 o FAS2 de la misma, mediante la adición de un dominio de Tioesterasa (TE), preferentemente antes o después de un dominio de proteína transportadora de acilos (ACP) (es decir, adyacente a un dominio de ACP), lo que da como resultado la producción de ácidos grasos, en particular ácidos grasos de cadena corta o media (S/MCFA). En la base de la presente invención se encuentra el uso de una ácido graso sintasa fúngico (FAS) modificada, o una subunidad FAS1 o FAS2 de la misma. Las presentes invenciones han descubierto sorprendentemente que la adición de un dominio de TE a una FAS fúngica (o subunidad FAS1 o FAS2) desprovista de tal dominio de TE, tal como antes o después de que un dominio de ACP existente, permite elaborar a medida la longitud de los ácidos grasos, sin afectar o interferir de otra manera con su función de síntesis de ácidos grasos. Este hallazgo es aún más sorprendente para la FAS de tipo I, en que los dominios enzimáticos individuales están codificados como un único (o como dos subunidades) gran polipéptido (o polipéptidos) multifuncional. Los dominios individuales de FAS están unidos covalentemente y, por tanto, están estructuralmente restringidos. Inesperadamente, en esta situación, la introducción de otro dominio (es decir, TE) no solo no perturba la síntesis de ácidos grasos, sino que además permite elaborar a medida la longitud de la cadena de ácidos grasos. Además, se ha descubierto que algunos genes de (subunidad de) FAS fúngica codifican múltiples dominios de ACP. De manera ventajosa, los presentes inventores han descubierto que es posible no solo eliminar o inactivar uno de estos dominios de ACP duplicados sin pérdida de funcionalidad, sino que, adicionalmente, la funcionalidad puede modificarse mediante la sustitución de uno de tales dominios de ACP por un dominio de TE. La funcionalidad mantenida de tal (subunidad de) FAS modificada de acuerdo con la invención es aún más sorprendente dado que, normalmente, la ACP (o las ACP) están situadas internamente en la FAS, de modo que no se podía esperar que proporcionar una TE adicional, por ejemplo, directamente corriente arriba o corriente abajo de una ACP, no modificara o, en particular, deteriorara la estructura y la actividad de la (subunidad de) FAS.

La invención está plasmada particularmente en las reivindicaciones adjuntas.

En un aspecto, la invención se refiere a un ácido polinucleico recombinante que codifica una ácido graso sintasa (FAS) fúngica o una subunidad FAS1 o FAS2 de la misma, y a una tioesterasa (TE), que en determinadas realizaciones preferentes están codificadas como un único ORF (forma siglada de open reading frame, marco abierto de lectura), y/o en la que dicha TE puede proporcionarse directamente 5' o 3' con respecto a una proteína transportadora de acilos (ACP) de dicha (subunidad de) FAS.

En un aspecto, la invención se refiere a una célula procariota o eucariota recombinante que comprende, que expresa o es capaz de expresar, tal como expresar de manera inducible o constitutivamente, una ácido graso sintasa (FAS) fúngica o una subunidad FAS1 o FAS2, y una tioesterasa (TE) (heteróloga), que están codificadas como un único ORF. Dicha TE puede proporcionarse directamente 5' o 3' (o N-terminal o C-terminal) con respecto a una proteína transportadora de acilos (ACP) de dicha (subunidad de) FAS.

Debe entenderse que, de acuerdo con la invención, la (subunidad de) FAS de origen natural carece de TE y, por eso, la (subunidad de) FAS puede diseñarse técnicamente para comprender o contener adicionalmente una TE, de modo que, por ejemplo, una célula recombinante de acuerdo con la invención como se describe en el presente documento comprende, expresa o es capaz de expresar una FAS y una TE.

Por consiguiente, en un aspecto, la invención se refiere a una célula procariota o eucariota recombinante que comprende, que expresa o es capaz de expresar un ácido polinucleico que comprende una secuencia génica de una ácido graso sintasa (FAS) fúngica o de la subunidad FAS1 o FAS2 que se originan a partir de un gen de la (subunidad de) FAS de origen natural desprovisto de secuencias de nucleótidos que codifican el dominio de tioesterasa (TE), en el que se añaden secuencias de nucleótidos que codifican un dominio de tioesterasa (TE) heteróloga a dicha (subunidad de) FAS, preferentemente antes o después (es decir, 5' o 3') de una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio de la proteína transportadora de acilos (ACP), en la que dicha TE y dicha FAS, FAS1 o FAS2 están codificadas como un único marco abierto de lectura.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a una célula procariota o eucariota recombinante que comprende, que expresa o es capaz de expresar un ácido polinucleico que comprende una secuencia génica de una ácido graso sintasa (FAS) fúngica o de la subunidad FAS1 o FAS2 que se originan a partir de un gen de la (subunidad de) FAS, tal como un gen (subunidad de) FAS de origen natural, que tiene al menos dos secuencias de nucleótidos que codifican la proteína transportadora de acilos (ACP), en la que una de dichas secuencias de nucleótidos que codifican la ACP se sustituye por una secuencia de nucleótidos que codifica una tioesterasa (TE).

La invención, en aspectos relacionados, también se refiere a polipéptidos codificados por el ácido polinucleico recombinante como se define en el presente documento, así como a vectores y células hospedadoras, tal como células hospedadoras procariotas o eucariotas, que comprenden el ácido polinucleico como se define en el presente documento.

En un aspecto alternativo, la invención se refiere a una célula hospedadora procariota o eucariota recombinante que comprende una secuencia génica de FAS (o subunidad FAS1 o FAS2) que se origina a partir de un gen de FAS (o subunidad FAS1 o FAS2) fúngico y que adicionalmente comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una TE, en la que dicha TE y dicha FAS, FAS1 o FAS2 están codificadas como un único marco abierto de lectura. Por consiguiente, la invención también se refiere a una célula hospedadora recombinante que comprende una secuencia génica de FAS (o subunidad FAS1 o FAS2) fúngica que se origina a partir de un gen de (subunidad de) FAS de origen natural desprovisto de secuencias de nucleótidos que codifican un dominio de tioesterasa (TE), en el que se añaden secuencias de nucleótidos que codifican un dominio de tioesterasa heteróloga (TE) a dicha (subunidad de) FAS, preferentemente antes o después (es decir, 5' o 3') de la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio de la proteína transportadora de acilos (ACP), en la que dicha TE y dicha FAS, FAS1 o FAS2 están codificadas como un único marco abierto de lectura. En determinadas realizaciones, dicha FAS y/o dicha TE están integradas genómicamente. En determinadas realizaciones, dicha FAS y/o dicha TE son episómicas, tal como proporcionadas en un vector.

En otros aspectos derivados, la invención también se refiere a procedimientos para producir hidrocarburos, tales como alcanos o alquenos, o alcoholes grasos o aldehídos grasos que implican la conversión simultánea o corriente abajo de los ácidos grasos producidos de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento, en particular, que implican la reducción, hidrogenación, descarboxilación o descarbonilación de los ácidos grasos.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1. Arquitectura de dominios de la FAS de tipo I fúngica. En la FAS de tipo I fúngica hay ocho dominios proteicos distintos, es decir, acetiltransferasa (AT), enoil reductasa (ER), deshidratasa (DH), malonil/palmitoil transferasa (MPT), proteína transportadora de acilos (ACP), cetoacil sintasa (KS), cetoacil reductasa (KR), fosfopanteteinil transferasa (PPT). A diferencia de la FAS de Saccharomyces cerevisiae, las FAS de Rhodosporidium toruloides y Aplanochytrium kerguelense contienen dos dominios de ACP en tándem, y el primero o el segundo dominio de ACP se sustituyó por un dominio de tioesterasa (TE). En la FAS de Saccharomyces cerevisiae, tal dominio heterogéneo de acil-ACP tioesterasa (TE) se insertó en regiones corriente arriba o corriente abajo del dominio de ACP. Estos tipos de FAS modificadas que contienen un dominio de TE se utilizaron para producir ácidos grasos de cadena media elaborados a medida.

Fig. 2. Casetes de expresión de la FAS de Rhodosporidium toruloides (A) y Aplanochytrium kerguelense (B) y Saccharomyces cerevisiae (C). En RtFAS2-ACPI2TE, RtFAS2-ACPII2TE AkFAS2-ACPI2TE y AkFAS2-ACPII2TE, cualquiera de los dominios de ACP se sustituyó por una acil-ACP tioesterasa de cadena corta de Acinetobacter baylyi. En ScFAS2-TE-ACP y ScFAS2-ACP-t E, la acil-ACP tioesterasa de cadena corta de A. baylyi se insertó en ScFAS2 corriente arriba o corriente abajo del dominio de ACP.

Fig. 3. Complementación de la RtFAS para la auxotrofia de ácidos grasos de Saccharomyces cerevisiae PWY12 (MATa ura3 leu2 his3 trp l canl Afas1::HIS3 Afas2::LEU2).

Fig. 4. Ácidos grasos de cadena media (ácido hexanoico, C6; ácido octanoico, C8; ácido decanoico, C10; y ácido dodecanoico, C12) producidos por la RtFAS y sus mutantes. Se utilizó ácido heptanoico (C7) como patrón interno. Fig. 5. Títulos de ácidos grasos extracelulares producidos por Saccharomyces cerevisiae PWY12 que expresa las FAS correspondientes, incluida la ScFAS de Saccharomyces cerevisiae y la FAS de Rhodosporidium toruloides (Tipo silvestre, WT; Híbrido de FAS/TE, ACPI2TE y ACPII2TE).

Fig. 6. Composición de ácidos grasos intracelulares de Saccharomyces cerevisiae PWY12 que expresa la FAS correspondiente, incluida la ScFAS de Saccharomyces cerevisiae y la FAS de Rhodosporidium toruloides (tipo silvestre, WT; Híbrido de FAS/TE, ACPI2TE y ACPII2TE).

Fig. 7. Títulos de ácidos grasos extracelulares producidos por Saccharomyces cerevisiae PWY12 que expresa la FAS correspondiente de Aplanochytrium kerguelense (Tipo silvestre, AkFAS-WT; Híbrido de FAS/TE, AkFAS-ACPI2TE y AkFAS-ACPII2TE).

Fig. 8. Títulos de ácidos grasos extracelulares producidos por Saccharomyces cerevisiae PWY12 que expresa la FAS correspondiente de Saccharomyces cerevisiae (Tipo silvestre, ScFAS-WT; Híbrido de FAS/TE, ScFAS-TE-ACP y ScFAS-ACP-TE).

Fig. 9. Títulos de ácidos grasos extracelulares producidos por Saccharomyces cerevisiae YJZ02 que expresa de forma integrativa la FAS correspondiente de Saccharomyces cerevisiae (Tipo silvestre, WT; Híbrido de FAS/TE, ACP-TE).

Fig. 10. Secuencias adecuadas para su uso en realizaciones como se describe en el presente documento.

Fig. 11. Diseño y estrategia para el diseño técnico de las ácido graso sintasas (FAS) fúngicas para sintetizar oleoquímicos elaborados a medida. (a) Composición de dominios de variantes de FAS fúngicas. (b) Presentación en sección transversal de la estructura de la FAS fúngica. La posición de cada dominio solo se muestra para uno de los tres conjuntos de sitios activos en el compartimento superior. Se puede insertar una enzima heteróloga (círculo negro) en la cámara de reacción, como se muestra. (c) Ciclos de reacción catalizados por las FAS fúngicas modificadas. Se integró una tioesterasa heteróloga de cadena corta (sTE) en los ciclos de alargamiento para liberar ácidos grasos de cadena corta/media. AT, acetil transferasa (AT); ER, enoil reductasa; DH, deshidratasa; MPT, malonil-palmitoil transferasa; ACP, proteína transportadora de acilos; KS, cetoacil sintasa; KR, cetoacil reductasa; PPT, fosfopanteteinil transferasa.

Fig. 12. Fosfopanteteinilación in vitro de dominios de ACP de la ácido graso sintasa de R. toroloides mediante la PPT análoga. (a) Reacción de fosfopanteteinilación catalizada por la fosfopanteteinil transferasa (PPT). La fracción de fosfopanteteína de la coenzima A (CoA) se transfiere al grupo hidroxilo del resto serina de la proteína portadora de acilo (ACP). (b) Análisis por SDS-PAGE de los productos de fosfopanteteinilación. Se expresaron y purificaron wACP I (RtFas2, 1022-1184), wACPII (RtFas2, 1213-1375) y PPT (RtFas2, 2809-2928) como proteínas de fusión GST. En mACPI y mACPII, la serina correspondiente se mutó a alanina como se muestra en (b). La mezcla de reacción de fosfopanteteinilación se escindió con enterocinasa y se separó mediante Tricina-SDS-PAGE al 16 %. Las ACP fosfopanteteiniladas con un peso molecular ligeramente mayor que la apo-ACP se indicaron mediante flechas.

Fig. 13. Ensayo de actividad enzimática in vitro del complejo de RtFAS purificado. (a) Análisis por SDS-PAGE del complejo de RtFAS purificado, se separaron dos subunidades como se indica. (b) Ensayo de actividad enzimática de la RtFAS purificada y sus mutantes. La oxidación de NADPH dependiente de malonil-CoA y acetil-CoA se controló mediante la disminución de la absorción a 340 nm.

Fig. 14. La complementación de la deleción de FAS1 y FAS2 en S. cerevisae PWY12 por distintas FAS y sus mutantes. (a) Crecimiento de PWY12 con los plásmidos correspondientes en placas que contienen ácidos grasos (SC-Ura AG) o sin ácidos grasos (SC-Ura). El estriado con el vector blanco (pYX212) solo pudo crecer en placas complementadas con ácidos grasos. (b) Curvas de crecimiento de las cepas PWY12 con plásmidos como se indica en medio Delft con triptófano 100 mg/l. Las células se cultivaron en un volumen de 200 ul (en una placa en panal de abeja) y la densidad óptica se controló mediante un instrumento Bioscreen C MBR. (c)-(f), Crecimiento de PWY12 con plásmidos como se indica en placas sin ácidos grasos (SC-Ura).

Fig. 15. Síntesis de oleoquímicos mediante las FAS fúngicas modificadas. (a) Presentación esquemática de las FAS fúngicas técnicamente diseñadas. Los restos de serina conservados de la ACP se mutaron en restos de alanina para inactivar los dominios de ACP. En ScFAS27 y ScFAS28, se introdujeron las mutaciones G1250S, S1251W en el dominio de cetoacil-ACP sintasa (KS) de la proteína ScFas2. En la ScFAS técnicamente diseñada, el engarce flexible que separa las dos ACP en tándem en RtFAS se utilizó para aislar las proteínas heterólogas y el dominio de ACP. (b-d) Producción de ácidos grasos extracelulares mediante la cepa S. cerevisiae PWY12 que expresa las FAS fúngicas como se indica. Se extrajeron y cuantificaron el ácido hexanoico (C6), el ácido octanoico (C8), el ácido decanoico (C10), el ácido dodecanoico (C12). Para la cuantificación del producto se utilizaron más de 3 cultivos independientes. Se presentó la media ± DT. *, p < 0,01, y **, p < 0,001. Prueba t de Student.

Fig. 16. Presentación esquemática de ScFAS con la sTE integrada (ScFAS14 y ScFAS15), periférica (ScFAS16) o libre (ScFAS17).

Fig. 17. Producción de los S/MCFA en YJZ02 integrada con ScFAS técnicamente diseñada. (a) Producción de S/MCFA en la cepa ZW201 (YJZ02 con una ScFAS01 integrada en cromosomas) con un plásmido que expresa AcTesA y la cepa ZW206 (YJZ02 con una ScFAS15 integrada en cromosomas) con un vector vacío. Las células se cultivaron en medio Delft complementado con histidina 100 mg/l durante 48 horas. (b) producción de S/MCFA y densidad óptica (DO) de las cepas ZW201, ZW206, ZW202 (YJZ02 con una ScFAS27 integrada en cromosomas) y ZW207 (YJZ02 con una ScFAS28 integrada en cromosomas). Las células se cultivaron en medio Delft complementado con histidina 100 mg/l y uracilo 100 mg/l durante 48 horas, 72 y 96 horas. (c) cultivo de pH ajustado de ZW207 en medio de Delft complementado con histidina 100 mg/l y uracilo 100 mg/l. La flecha muestra la adición de solución de KOH estéril (2 M) para cambiar el pH a 6,0. (d) Producción de S/MCFA de ZW207 durante el cultivo con pH sin ajustar y con pH ajustado como se muestra en (c). Se presentaron la media ± DT de 3-4 cultivos independientes.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se describirá con respecto a realizaciones particulares, pero la invención no se limita a las mismas.

Las declaraciones (características) y realizaciones preferidas de las composiciones, procedimientos y usos descritos en el presente documento se establecen a continuación. Cada declaración y realización así definida puede combinarse con cualquier otra declaración y/o realización a menos que se indique claramente otra cosa. En particular, cualquier característica indicada como preferente o ventajosa puede combinarse con cualquier otra característica o características o declaración indicadas como preferentes o ventajosas. A este fin, la solicitud se refiere en particular a una cualquiera o cualquier combinación de uno o más de los aspectos y realizaciones numerados a continuación 1 a 68, con cualquier otra declaración y/o realización.

Las declaraciones numeradas como se desvelan en la presente solicitud son:

1. Un ácido polinucleico recombinante que codifica (i) una ácido graso sintasa (FAS) o una subunidad de FAS; y (ii) una tioesterasa (TE), preferentemente una TE heteróloga, preferentemente un ácido polinucleico recombinante que comprende (i) una secuencia que codifica una ácido graso sintasa (FAS) o una secuencia que codifica una subunidad de FAS, o una secuencia que codifica una ácido graso sintasa (FAS) parcial, que se origina o procede de un gen de (subunidad de) FAS de origen natural desprovisto de secuencias de nucleótidos que codifican una tioesterasa (TE), en el que se añaden secuencias de nucleótidos que codifican un dominio de tioesterasa (TE) heteróloga a dicha (subunidad de) FAS, preferentemente antes o después de una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio de proteína transportadora de acilos (ACP) de dicha (subunidad de) FAS, opcionalmente en la que dicha subunidad de FAS es FAS 1 o FAS2 o 1. Una célula procariota o eucariota recombinante que comprende, que expresa o es capaz de expresar, o un ácido polinucleico recombinante que codifica (i) una ácido graso sintasa (FAS) o una subunidad de FAS; y (ii) una tioesterasa (TE), preferentemente una TE heteróloga, preferentemente una célula procariota o eucariota recombinante que comprende, que expresa o es capaz de expresar, un ácido polinucleico recombinante que comprende (i) una secuencia que codifica una ácido graso sintasa (FAS) o una secuencia que codifica una subunidad de FAS, o una secuencia que codifica una ácido graso sintasa (FAS) parcial, que se origina o procede de un gen de (subunidad de) FAS de origen natural desprovisto de secuencias de nucleótidos que codifican una tioesterasa (TE), en el que se añaden secuencias de nucleótidos que codifican un dominio de tioesterasa (TE) heteróloga a dicha (subunidad de) FAS, preferentemente antes o después de una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio de proteína transportadora de acilos (ACP) de dicha (subunidad de) FAS, opcionalmente en la que dicha subunidad de FAS es FAS 1 o FAS2.

2. La célula o el ácido polinucleico de acuerdo con la declaración 1, en la que dicha (subunidad de) FAS y dicha TE están codificadas como un único marco abierto de lectura (ORF).

3. La célula o el ácido polinucleico de acuerdo con la declaración 1 o 2, en la que la secuencia de ácido polinucleico que codifica dicha TE está adyacente (directamente 5' o 3') con respecto a la secuencia de ácido polinucleico que codifica una proteína transportadora de acilos (ACP) de dicha (subunidad de) FAS.

4. La célula o el ácido polinucleico de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 1 a 3, que comprende una secuencia que codifica una ácido graso sintasa (FAS) o secuencias que codifican una subunidad de FAS, o una secuencia que codifica una ácido graso sintasa (FAS) parcial, que se originan o proceden de un gen de (subunidad de) FAS, tal como un gen (subunidad de) FAS de origen natural, que tiene al menos dos secuencias de nucleótidos que codifican la proteína transportadora de acilos (ACP), en la que una de dichas secuencias de nucleótidos que codifican la ACP se sustituye por una secuencia de nucleótidos que codifica una tioesterasa (TE).

5. La célula o el ácido polinucleico de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 1 a 4, en el que dicho gen de (subunidad de) FAS de origen natural es una (subunidad de) FAS de tipo I.

6. La célula o el ácido polinucleico de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 1 a 5, en la que dicha (subunidad de) FAS es una (subunidad de) FAS fúngica, en particular de levadura, de protista, de mixomiceto o de algas, en particular de microalgas.

7. La célula o el ácido polinucleico de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 1 a 6, en la que dicha (subunidad de) FAS es de Saccharomyces cerevisiae, preferentemente S. cerevisiae, Rhodosporidium spp., preferentemente R. toruloides o Aplanochytrium spp., preferentemente A. kerguelense.

8. La célula o el ácido polinucleico de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 1 a 7, en la que dicha TE es una acil-CoA/ACP TE, preferentemente una acil-CoA/ACP TE de cadena corta o de cadena media.

9. Un polipéptido recombinante codificado por el ácido polinucleico recombinante de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 1 a 8.

10. Un vector recombinante que comprende el ácido polinucleico recombinante de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 1 a 8 o un ácido polinucleico que codifica el polipéptido recombinante de acuerdo con la declaración 9.

11. El vector recombinante de acuerdo con la declaración 10, en el que dicho vector es un vector de expresión o un vector de recombinación.

12. Una célula procariota o eucariota recombinante que comprende el ácido polinucleico recombinante de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 1 a 8, el polipéptido de acuerdo con la declaración 9, un ácido polinucleico que codifica un polipéptido de acuerdo con la declaración 6, o el vector de acuerdo con la declaración 10 u 11.

13. La célula procariota o eucariota recombinante de acuerdo con la declaración 12, en la que dicho ácido polinucleico recombinante está integrado genómicamente.

14. Una célula procariota o eucariota recombinante que comprende una secuencia proteica de (subunidad de) FAS o una secuencia que codifica la proteína (subunidad de) FAS que se origina a partir de un gen de (subunidad de) FAS, tal como un gen de (subunidad de) FAS de origen natural, y una secuencia proteica de TE o una secuencia que codifica la proteína TE, en la que opcionalmente dicha (subunidad de) FAS tiene al menos dos polipéptidos de ACP o secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos de ACP, en el que uno de dichos polipéptidos de ACP o secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos de ACP se sustituye por un polipéptido de TE o secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos de TE.

15. La célula procariota o eucariota recombinante de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 1 a 14, en la que dicha TE o secuencia de nucleótidos que codifica una TE es una secuencia de nucleótidos que codifica una TE heteróloga, en comparación con la (subunidad de) FAS de origen natural.

16. La célula procariota o eucariota recombinante de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 1 a 15, que es una célula bacteriana, una célula fúngica o una célula de alga.

17. La célula procariota o eucariota recombinante de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 1 a 16, que es una célula de Saccharomyces, tal como una célula de Saccharomyces cerevisiae.

18. Procedimiento para la producción de una célula procariota o eucariota recombinante que comprende la etapa de introducir en una célula procariota o eucariota el ácido polinucleico polipéptido o vector recombinante de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 1 a 11 o 27-56, o introducir en una célula procariota o eucariota una FAS, opcionalmente FAS1 y/o FAS2, y una TE o un ácido polinucleico que codifica una FAS, opcionalmente FAS1 y/o FAS2, y una TE.

19. Procedimiento para la producción de una célula procariota o eucariota recombinante, que comprende las etapas de

(i) proporcionar una célula procariota o eucariota que comprende un gen de una ácido graso sintasa (FAS) o un gen de una subunidad FAS, opcionalmente una FAS1 y/o FAS2, teniendo opcionalmente dicha (subunidad de) FAS al menos dos secuencias de nucleótidos que codifican la proteína transportadora de acilos (ACP), tal como comprendiendo dos secuencias de nucleótidos que codifican la ACP adyacentes, estando preferentemente dicha (subunidad de) FAS desprovista de una secuencia de nucleótidos que codifica una TE; y

(ii) introducir una TE o una secuencia que codifica una TE, opcionalmente sustituyendo una de dichas secuencias de nucleótidos que codifican una ACP por una secuencia que codifica una TE, en la que dicha secuencia de nucleótidos que codifica una TE preferentemente se introduce, preferentemente de forma directa, 5' o 3' de una secuencia de nucleótidos que codifica una ACP de dicha (subunidad de) FAS.

20. Uso del ácido polinucleico, polipéptido, vector o célula recombinante de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 1 a 17 o 27-67 en la producción de ácidos grasos, hidrocarburos, aldehídos grasos y alcoholes grasos.

21. Procedimiento para la producción de ácidos grasos, que comprende las etapas de

(i) proporcionar la célula procariota o eucariota recombinante de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 1 a 17 o 60 a 67; y

(ii) cultivar dicha célula procariota o eucariota recombinante en condiciones de cultivo adecuadas.

22. El procedimiento de acuerdo con la declaración 21, que comprende además la etapa de (iii) aislar y/o purificar dichos ácidos grasos.

23. Procedimiento para la producción de hidrocarburos (de cadena media o corta), que comprende realizar el procedimiento para la producción de ácidos grasos de acuerdo con la declaración 21 o 22, que comprende además la reducción, hidrogenación, descarboxilación o descarbonilación de dichos ácidos grasos.

24. Procedimiento para la producción de aldehídos grasos o alcoholes grasos (de cadena media o corta), que comprende realizar el procedimiento para la producción de ácidos grasos de acuerdo con la declaración 21 o 22, que comprende además la hidrogenación de dichos ácidos grasos, opcionalmente después de la esterificación de dichos ácidos grasos; o que comprende además la reducción de dichos ácidos grasos.

25. Uso de acuerdo con la declaración 20 o el procedimiento de acuerdo con la declaración 21 o 23, en las que dichos ácidos grasos son ácidos grasos de cadena corta (SCFA, forma siglada de short chain fatty acids) o ácidos grasos de cadena media (MCFA, forma siglada de médium chain fatty acids).

26. Uso de acuerdo con la declaración 20 o el procedimiento de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 21 o 23, en las que dichos ácidos grasos son ácidos grasos C1-C12, tales como ácidos grasos C6-C12.

27. La célula procariota o eucariota recombinante o el ácido polinucleico recombinante de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 1 a 17 o 49 a 56, en la que dicha FAS está codificado por una o alternativamente dos secuencias génicas discretas y/o separadas.

28. La célula procariota o eucariota recombinante o el ácido polinucleico recombinante de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 1 a 17 o 27 o 49 a 56, en la que dicha FAS es o comprende opcionalmente FAS1 y/o FAS2.

29. La célula procariota o eucariota recombinante o el ácido polinucleico recombinante de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 1 a 8 o 27 a 28 o 49 a 56, en la que dicha FAS es o comprende una subunidad a de FAS y/o una subunidad p de FAS.

30. La célula procariota o eucariota recombinante o el ácido polinucleico recombinante de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 1 a 8 o 27 a 28 o 49 a 56, en la que dicha (subunidad de) FAS se origina en un organismo enumerado en la Tabla 1, preferentemente de Saccharomyces sp. (por ejemplo, S. cerevisiae), Rhodosporidium sp. (por ejemplo, R. toruloides) o Aplanochytrium sp. (por ejemplo, A. kerguelense).

31. La célula procariota o eucariota recombinante o el ácido polinucleico recombinante de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 1 a 8 o 27 a 28 o 49 a 56, en la que dicha (subunidad de) FAS comprende o consiste en una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 1 a 4 o 19, un fragmento de la misma, o una secuencia que tiene al menos el 50 %, preferentemente al menos el 60 %, más preferentemente al menos el 70 %, muy preferentemente al menos el 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 a 4 o 19, o un fragmento de la misma y/o un ortólogo de la misma.

32. La célula procariota o eucariota recombinante o el ácido polinucleico recombinante de acuerdo con la declaración 31, en el que dicho fragmento comprende una secuencia que codifica una ACP.

33. La célula procariota o eucariota recombinante o el ácido polinucleico recombinante de acuerdo con la declaración 31, en la que dicha secuencia que tiene al menos el 50 %, preferentemente al menos el 60 %, más preferentemente al menos el 70 %, muy preferentemente al menos el 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 a 4, o 19 es un ortólogo o una variante funcional de dicha (subunidad de) FAS que comprende o que consiste en una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 1 a 4, o 19.

34. La célula procariota o eucariota recombinante o el ácido polinucleico recombinante de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 1 a 8 o 27 a 30 o 49 a 56, que comprende una secuencia de ácido polinucleico que comprende o consiste en una secuencia como se expone en la s Eq ID NO: 5, 6, 15 o 16, un fragmento de la misma, o una secuencia que tiene al menos el 50 %, preferentemente al menos el 60 %, más preferentemente al menos el 70 %, muy preferentemente al menos el 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 5, 6, 15 o 16, o un fragmento de la misma y/o un ortólogo de la misma.

35. La célula procariota o eucariota recombinante o el ácido polinucleico recombinante de acuerdo con la declaración 34, en el que dicho fragmento comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una ACP y una secuencia de nucleótidos que codifica una TE, preferentemente de 5' a 3' una secuencia de nucleótidos que codifica una ACP y una secuencia de nucleótidos que codifica una TE, o de 5' a 3' una secuencia de nucleótidos que codifica una TE y una secuencia de nucleótidos que codifica una ACP, preferentemente sin secuencias de nucleótidos codificantes (enzima) intercaladas.

36. La célula procariota o eucariota recombinante o el ácido polinucleico recombinante de acuerdo con la declaración 34, en la que dicha secuencia que tiene al menos el 50 %, preferentemente al menos el 60 %, más preferentemente al menos el 70 %, muy preferentemente al menos el 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 5, 6, 15 o 16, o es un ortólogo o una variante funcional de dicha FAS que comprende o que consiste en una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 5, 6, 15 o 16.

37. La célula procariota o eucariota recombinante o el ácido polinucleico recombinante de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 1 a 8 o 27 a 36 o 43 a 56, en la que dicha (subunidad de) FAS comprende o consiste en uno o más, preferentemente todos los siguientes dominios, preferentemente, del extremo N al C: acetiltransferasa (AT), enoil reductasa (ER), deshidratasa (DH), malonil/palmitoil transferasa (MPT), proteína transportadora de acilos (ACP), cetoacil sintasa (KS), cetoacil reductasa (KR), fosfopanteteinil transferasa (PPT).

38. La célula procariota o eucariota recombinante o el ácido polinucleico recombinante de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 1 a 8 o 27 a 37 o 43 a 56, que comprende una secuencia de ácido polinucleico en la que dicho ácido polinucleico comprende o consiste en una secuencia, preferentemente de 5' a 3', que codifica uno o más, preferentemente todos, de los siguientes dominios: acetiltransferasa (AT), enoil reductasa (ER), deshidratasa (DH), malonilpalmitoil transferasa (MPT), proteína transportadora de acilos (ACP), cetoacil sintasa (KS), cetoacil reductasa (KR), fosfopanteteinil transferasa (PPT).

39. La célula procariota o eucariota recombinante o el ácido polinucleico recombinante de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 1 a 8, o 24 a 38 o 43 a 56, en la que dicha TE se origina en un organismo enumerado en la Tabla 2, preferentemente una TE de Acinetobacter sp. (por ejemplo, A. baylyi o A. baumannii).

40. La célula procariota o eucariota recombinante o el ácido polinucleico recombinante de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 1 a 8, o 27 a 39 o 43 a 56, en la que dicha TE comprende o consiste en una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 7 o una secuencia que tiene al menos el 50 %, preferentemente al menos el 60 %, más preferentemente al menos el 70 %, muy preferentemente al menos el 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 7.

41. La célula procariota o eucariota recombinante o el ácido polinucleico recombinante de acuerdo con la declaración 40, en la que dicha secuencia que tiene al menos el 50 %, preferentemente al menos el 60 %, más preferentemente al menos el 70 %, muy preferentemente al menos el 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 7 es un ortólogo o una variante funcional de dicha TE que comprende o que consiste en una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 7.

42. La célula procariota o eucariota recombinante o el ácido polinucleico recombinante de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 1 a 8, o 27 a 41 o 43 a 56, en la que dicha secuencia de nucleótidos que codifica dicha ACP no es la secuencia de nucleótidos más 3' o 5'.

43. La célula procariota o eucariota recombinante o el ácido polinucleico recombinante de acuerdo con la declaración 42, en la que dicha secuencia que codifica una ACP es la secuencia que codifica una ACP que se sustituye por dicha secuencia que codifica una TE.

44. La célula procariota o eucariota recombinante o el ácido polinucleico recombinante de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 4 a 8 o 27 a 43 o 43 a 56, en los que dichas dos secuencias que codifican una ACP están dispuestas en tándem.

45. La célula procariota o eucariota recombinante o el ácido polinucleico recombinante de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 1 a 8, o 27 a 44 o 43 a 56, en el que dicho gen (o genes) de (subunidad de) FAS codifica (o codifican) uno o más, preferentemente todos, de los siguientes dominios: acetil transferasa (AT), enoil reductasa (ER), deshidratasa (DH), malonilpalmitoil transferasa (MPT), proteína transportadora de acilos (ACP), cetoacil sintasa (KS), cetoacil reductasa (Kr ), fosfopanteteinil transferasa (PPT).

46. La célula procariota o eucariota recombinante o el ácido polinucleico recombinante de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 1 a 8, o 27 a 44 o 43 a 56, en los que dicha (subunidad de) FAS de origen natural se origina a partir de una célula oleaginosa, preferentemente una levadura oleaginosa o microalgas oleaginosas.

47. Una célula procariota o eucariota recombinante o un ácido polinucleico recombinante que codifica, de 5' a 3', respectivamente MPT, ACP, TE y KS, en la que dicho TE es preferentemente heteróloga en comparación con dichas MPT, ACP y/o KS.

48. Una célula procariota o eucariota recombinante o un ácido polinucleico recombinante que codifica, de 5' a 3', respectivamente MPT, TE, ACP y KS, en la que dicho TE es preferentemente heteróloga en comparación con dichas MPT, ACP y/o KS.

49. Una célula procariota o eucariota recombinante o un ácido polinucleico recombinante que comprende o codifica, de 5' a 3', respectivamente:

- AT, ER, DH, MPT, ACP, TE, KS, KR y PPT;

- AT, ER, DH, MPT, TE, ACP, KS, KR y PPT;

- AT, ER, DH, MPT, ACP, TE, KS y KR;

- AT, ER, DH, MPT, TE, ACP, KS y KR;

- AT, ER, DH, MPT, ACP, TE y KS;

- AT, ER, DH, MPT, TE, ACP y KS;

- AT, ER, DH, MPT, ACP y TE;

- AT, ER, DH, MPT, TE y ACP;

- ER, DH, MPT, ACP, TE, KS, KR y PPT;

- ER, DH, MPT, TE, ACP, KS, KR y PPT;

- DH, MPT, ACP, TE, KS, KR y PPT;

- DH, MPT, TE, ACP, KS, KR y PPT;

- MPT, ACP, TE, KS, KR y PPT;

- MPT, TE, ACP, KS, KR y PPT;

- ACP, TE, KS, KR y PPT;

- TE, ACP, KS, KR y PPT;

- TE y ACP;

- ACP y TE;

- MPT, ACP, TE y KS; o

- MPT, TE, ACP y KS,

en la que dicho TE es preferentemente heteróloga en comparación con dichas AT, ER, DH, MPT, ACP, KS, KR y/o PPT.

50. Una célula procariota o eucariota recombinante o un ácido polinucleico recombinante que comprende el ácido polinucleico de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 47 a 49.

51. La célula procariota o eucariota recombinante o el ácido polinucleico de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 47 a 50, que codifica de 5' a 3', respectivamente, AT, ER, DH, MPT, TE, ACP, KS, KR y PPT. 52. La célula procariota o eucariota recombinante o el ácido polinucleico de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 47 a 51, que codifica de 5' a 3', respectivamente, DH, MPT, TE, ACP, KS, KR y PPT.

53. La célula procariota o eucariota recombinante o el ácido polinucleico de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 47 a 52, en los que dichos, respectivamente, AT, ER, DH, MPT, ACP, KS, KR y PPT proceden de un gen de (subunidad de) FAS de origen natural, preferentemente un gen de (subunidad de) FAS de tipo I. 54. La célula procariota o eucariota recombinante o el ácido polinucleico de acuerdo con la declaración 53, en el que dicho gen de (subunidad de) FAS es un gen de (subunidad de) FAS fúngica, en particular de levadura, de protista, de mixomiceto o de algas, en particular de microalgas.

55. La célula procariota o eucariota recombinante o el ácido polinucleico de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 53 a 54, en el que dicho gen de (subunidad de) FAS de origen natural es de Rhodosporidium spp., preferentemente R. toruloides o Aplanochytrium spp., preferentemente A. kerguelense.

56. La célula procariota o eucariota recombinante o el ácido polinucleico de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 47 a 55, en la que dicha TE es una acil-CoA/ACP TE, preferentemente una acil-CoA/ACP TE de cadena corta o de cadena media.

57. Un polipéptido recombinante codificado por el ácido polinucleico recombinante de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 47 a 56.

58. Un vector recombinante que comprende el ácido polinucleico recombinante de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 47 a 56 o un ácido polinucleico que codifica el polipéptido recombinante de acuerdo con la declaración 57.

59. El vector recombinante de acuerdo con la declaración 58, en el que dicho vector es un vector de expresión o un vector de recombinación.

60. Una célula procariota o eucariota recombinante que comprende el ácido polinucleico recombinante de acuerdo con cualquiera de las declaraciones 47 a 56, el polipéptido de acuerdo con la declaración 57, un ácido polinucleico que codifica un polipéptido de acuerdo con la declaración 57, o el vector de acuerdo con la declaración 58 u 59.

61. La célula procariota o eucariota recombinante de acuerdo con cualquiera de las declaraciones anteriores, en la que un ácido polinucleico que codifica dicha FAS, FAS1 o FAS2 y/o dicha TE, está integrado genómicamente.

62. La célula procariota o eucariota recombinante de acuerdo con cualquiera de las declaraciones anteriores, en la que dicha secuencia de nucleótidos que codifica una TE es una secuencia de nucleótidos que codifica una TE heteróloga.

63. La célula procariota o eucariota recombinante de acuerdo con cualquiera de las declaraciones anteriores, que es una célula bacteriana, una célula fúngica o una célula de alga.

64. La célula procariota o eucariota recombinante de acuerdo con cualquiera de las declaraciones anteriores, que es una célula de Rhodosporidium toruloides o Aplanochytrium kerguelense.

65. La célula procariota o eucariota recombinante de acuerdo con cualquiera de las declaraciones anteriores, que comprende uno o más ácidos polinucleicos que codifican AT, ER, DH, MPT, TE, ACP, KS, KR y PPT.

66. La célula procariota o eucariota recombinante de acuerdo con cualquiera de las declaraciones anteriores, que es una célula oleaginosa, preferentemente una célula de levadura oleaginosa o de microalgas oleaginosas. 67. La célula procariota o eucariota recombinante de acuerdo con cualquiera de las declaraciones anteriores, que es un organismo unicelular.

68. El ácido polinucleico recombinante de acuerdo con cualquiera de las declaraciones anteriores, en el que uno o más de AT, ER, DH, MPT, KS, KR y PPT están modificados en dicha (subunidad de) FAS.

Antes de describir los presentes procedimientos de la invención, debe entenderse que la presente invención no se limita a procedimientos, componentes, productos o combinaciones particulares descritos, dado que tales procedimientos, componentes, productos y combinaciones pueden, por supuesto, variar. Además, debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento no pretende ser limitante, dado que el ámbito de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

Cuando en la presente descripción y en las reivindicaciones se usa la expresión "que comprende", no excluye otros elementos o etapas. Las expresiones "que comprende", "comprende" y "compuesto por", como se usan en el presente documento, son sinónimos de "que incluye", "incluye" o "que contiene", "contiene", y son inclusivos o abiertos y no excluyen componentes, elementos o etapas de procedimiento adicionales no enumerados. Se apreciará que las expresiones "que comprende", "comprende" y "compuesto por" como se usan en el presente documento comprende las expresiones "que consiste en", "consiste" y "consiste en", así como las expresiones "que consiste esencialmente en", "consiste esencialmente" y "consiste esencialmente en".

Como se usa en el presente documento, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen tanto referencias en singular como en plural, a menos que el contexto indique claramente otra cosa.

La enumeración de intervalos numéricos por valores extremos incluye todos los números y fracciones incluidos dentro de los intervalos respectivos, así como los valores extremos enumerados.

La expresión "alrededor de" o "aproximadamente", como se usa en el presente documento haciendo referencia a un valor medible tal como un parámetro, una cantidad, una duración temporal, y similares, pretende abarcar variaciones de /- 20 % o menos, preferentemente de /- 10 % o menos, más preferentemente de+/- 5 % o menos, y aún más preferentemente de /- 1 % o menos, de y desde el valor especificado, en la medida en que tales variaciones sean apropiadas para realizar en la invención desvelada. Debe entenderse que el valor al que se refiere el modificador "alrededor de" o "aproximadamente" también se desvela de específica y preferentemente.

Mientras que las expresiones "uno o más" o "al menos uno", tal como uno o más o al menos un miembro (miembros) de un grupo de miembros, son claras de por sí, mediante ejemplificación adicional, la expresión abarca, entre otras cosas, una referencia a uno cualquiera de dichos miembros, o a dos o más de dichos miembros, tal como, por ejemplo, cualquiera de >3, >4, >5, >6 o >7 etc. de dichos miembros, y hasta todos dichos miembros.

A menos que se definan de otro modo, todos los términos utilizados para desvelar la invención, incluyendo los términos técnicos y científicos, tienen el significado que entiende comúnmente un experto en la materia a la que pertenece la presente invención. Mediante orientación adicional, se incluyen definiciones de términos para apreciar mejor las enseñanzas de la presente invención. La referencia a lo largo de la presente memoria descriptiva a "una realización" o "realización" significa que una particularidad, estructura o característica particular descrita en relación con la realización se incluye en al menos una realización de la presente invención. Por tanto, las apariciones de las frases "en una realización" o "una realización" en diversos lugares a lo largo de la presente memoria descriptiva no se refieren todas necesariamente a la misma realización, pero pueden hacerlo. Adicionalmente, las particularidades, estructuras o características particulares pueden combinarse de cualquier manera adecuada, como será obvio para un experto en la materia a partir de la presente divulgación, en una o más realizaciones. Adicionalmente, mientras que algunas realizaciones descritas en el presente documento incluyen algunas pero no otras características incluidas en otras realizaciones, las combinaciones de características de distintas realizaciones se pretende que estén dentro del ámbito de la invención y forman realizaciones distintas, como entenderán los expertos en la técnica. Por ejemplo, en las reivindicaciones adjuntas, cualquiera de las reivindicaciones puede utilizarse en cualquier combinación.

En la siguiente descripción detallada de la invención, se hace referencia a los dibujos adjuntos que forman parte de la misma, y en los que se muestran a modo de ilustración únicamente realizaciones específicas en las que se puede poner en práctica la invención. Debe entenderse que se pueden utilizar otras realizaciones y se pueden realizar cambios estructurales o lógicos sin apartarse del ámbito de la presente invención. La siguiente descripción detallada, por lo tanto, no debe tomarse en un sentido limitante, y el ámbito de la presente invención está definido por las reivindicaciones adjuntas.

Los siguientes términos o definiciones se proporcionan únicamente para ayudar en la comprensión de la invención. A menos que se defina específicamente en el presente documento, todos los términos usados en el presente documento tienen el mismo significado que tendrían para un experto en la materia de la presente invención. En particular, se dirige a los practicantes a Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Press, Plainsview, Nueva York (1989); y Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology (Suplemento 47), John Wiley & Sons, Nueva York (1999), Innis y col., p Cr Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990. Se exponen principios generales de microbiología, por ejemplo, en Davis, B. D. y col., Microbiology, 3a edición, Harper & Row, editores, Filadelfia, Pa. (1980), en cuanto a definiciones y términos de la técnica. Las definiciones proporcionadas en el presente documento no deben interpretarse como que tienen un menor que el comprendido por un experto en la materia.

A menos que se indique lo otra cosa, todos los procedimientos, etapas, técnicas y manipulaciones que no se describen específicamente en detalle se pueden realizar y se han realizado de una manera de por sí conocida, como quedará claro para el experto. Por ejemplo, se vuelve a hacer referencia a los manuales habituales, a la técnica anterior general a la que se ha hecho referencia anteriormente y a las referencias adicionales allí citadas.

Los inventores han descubierto que, sorprendentemente, a pesar de su compleja estructura, los complejos de enzima ácido graso sintasa de hongos pueden modificarse para generar ácidos grasos de cadena pequeña a media.

En un aspecto, la invención se refiere a un ácido polinucleico recombinante que comprende una secuencia que codifica una ácido graso sintasa (FAS) fúngica, o una secuencia que codifica la subunidad FAS1 o FAS2, y una secuencia que codifica una tioesterasa (TE); opcionalmente en la que dicha (subunidad de) FAS se origina o procede de un gen de (subunidad de) FAS de origen natural que tiene al menos dos o exactamente dos secuencias de nucleótidos que codifican una proteína transportadora de acilos (ACP), en la que una de dichas secuencias de nucleótidos que codifican una ACP está inactivada, interrumpida y/o se sustituye por una secuencia de nucleótidos que codifica una tioesterasa (TE). En aspectos relacionados, la invención se refiere a un polipéptido codificado por dicho ácido polinucleico, a un vector que comprende dicho ácido polinucleico, o un vector que comprende un ácido polinucleico que codifica dicho polipéptido, y a una célula procariota o eucariota recombinante que comprende dicho ácido polinucleico, dicho polipéptido o dicho vector.

En un aspecto, la invención se refiere a un ácido polinucleico recombinante que comprende una secuencia que codifica una ácido graso sintasa (FAS) fúngica, o una secuencia que codifica la subunidad FAS1 o FAS2, que se origina o procede de un gen de (subunidad de) FAS de origen natural que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína transportadora de acilos (ACP) y que carece de una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio de tioesterasa (TE), en el que se añaden secuencias de nucleótidos que codifican un dominio de tioesterasa (TE) heteróloga antes o después de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína transportadora de acilos (ACP). En aspectos relacionados, la invención se refiere a un polipéptido codificado por dicho ácido polinucleico, a un vector que comprende dicho ácido polinucleico, o un vector que comprende un ácido polinucleico que codifica dicho polipéptido, y a una célula procariota o eucariota recombinante que comprende dicho ácido polinucleico, dicho polipéptido o dicho vector.

La solicitud proporciona la expresión de dichos ácidos polinucleicos recombinantes en una célula hospedadora. Por consiguiente, la aplicación se refiere a una célula hospedadora recombinante que comprende, que expresar o es capaz de expresar dicho ácido polinucleico que comprende una secuencia que codifica una ácido graso sintasa (FAS), o una secuencia parcial que codifica una ácido graso sintasa (FAS) (es decir, una secuencia que codifica una subunidad de FAS), y una secuencia que codifica una tioesterasa (TE); opcionalmente en la que dicha (subunidad de) FAS se origina o procede de un gen de (subunidad de) FAS de origen natural que tiene al menos dos o exactamente dos secuencias de nucleótidos que codifican una proteína transportadora de acilos (ACP), en la que una de dichas secuencias de nucleótidos que codifican una ACP está inactivada, interrumpida y/o se sustituye por una secuencia de nucleótidos que codifica una tioesterasa (TE). También se desvela en el presente documento un polipéptido codificado por dicho ácido polinucleico, un vector que comprende dicho ácido polinucleico, o un vector que comprende un ácido polinucleico que codifica dicho polipéptido, y una célula hospedadora que comprende dicho ácido polinucleico, dicho polipéptido o dicho vector.

De forma similar, la aplicación se refiere a una célula hospedadora recombinante, que comprende, que expresar o es capaz de expresar dicho ácido polinucleico que comprende una secuencia que codifica una ácido graso sintasa (FAS), o una secuencia parcial que codifica una ácido graso sintasa (FAS) (es decir, una secuencia que codifica una subunidad de FAS), que se origina o procede de un gen de (subunidad de) FAS de origen natural que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína transportadora de acilos (ACP) y que carece de una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio de tioesterasa (TE), en el que se añaden secuencias de nucleótidos que codifican un dominio de tioesterasa (TE) heteróloga antes o después de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína transportadora de acilos (ACP). También se desvela en el presente documento un polipéptido codificado por dicho ácido polinucleico, un vector que comprende dicho ácido polinucleico, o un vector que comprende un ácido polinucleico que codifica dicho polipéptido, y una célula hospedadora que comprende dicho ácido polinucleico, dicho polipéptido o dicho vector.

Se entenderá que, en el ácido polinucleico recombinante y la célula hospedadora recombinante de acuerdo con la invención como se describe en el presente documento cuando se hace referencia a una FAS, se pretende una FAS funcional, que puede comprender FAS1, FAS2 o ambas subunidades FAS1 y FAS2. Por consiguiente, todos los dominios enzimáticos individuales necesarios para reconstituir una FAS funcional están presentes en dicho ácido polinucleico recombinante (y se expresan o son capaces de expresarse en dicha célula). Por ejemplo, el ácido polinucleico recombinante puede comprender y la célula hospedadora puede comprender o expresar una subunidad de FAS técnicamente diseñada que comprende una TE (tal como una FAS1 o FAS2 que comprende adicionalmente una TE) y una subunidad de FAS nativa o de origen natural o no modificada (tal como FAS2 o FAS1) para complementar la subunidad de FAS técnicamente diseñada y para reconstituir una FAS funcional.

En determinadas realizaciones, la célula hospedadora recombinante de acuerdo con la invención comprende, expresa o es capaz de expresar una FAS funcional nativa o de origen natural (opcionalmente, heteróloga), que comprende opcionalmente las subunidades FAS1 y FAS2. En tales realizaciones, la secuencia que codifica la TE (heteróloga) está integrada en la secuencia que codifica la FAS, como se describe en otra parte en el presente documento, o se proporciona por separado. Por consiguiente, la FAS puede ser una FAS nativa o de origen natural (heteróloga) diseñada técnicamente que comprende adicionalmente una TE.

Como se usa en el presente documento, las expresiones "molécula de ácido nucleico", "polinucleótido", "ácido polinucleico", "ácido nucleico", se utilizan indistintamente y se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, o análogos de los mismos. Los polinucleótidos pueden tener cualquier estructura tridimensional y pueden realizar cualquier función, conocida o desconocida. Los ejemplos no limitantes de polinucleótidos incluyen un gen, un fragmento de gen, exones, intrones, ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia, ARN ribosómico, ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, regiones de control, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico y cebadores. La molécula de ácido nucleico puede ser lineal o circular.

El término "recombinante" como se usa en el presente documento se refiere esencialmente a un ácido (poli)nucleico, un (poli)péptido, una célula u organismo que no es de origen natural o artificial, es decir, hecho por el hombre. Este término se refiere a un ácido (poli)nucleico, (poli)péptido, célula u organismo diseñado técnicamente o manipulado genéticamente. Por el contrario, la expresión "de origen natural" como se usa en el presente documento se refiere esencialmente a un ácido (poli)nucleico, un (poli)péptido, célula u organismo que no está manipulado y que puede encontrarse en la naturaleza. Como se usa en el presente documento, la expresión "que se origina a partir de una (subunidad de) FAS de origen natural" se refiere a un ácido polinucleico o polipéptido obtenido de un polipéptido o ácido polinucleico (subunidad de) FAS de origen natural, que se ha modificado artificialmente (es decir, polipéptido o ácido polinucleico recombinante). Se entenderá que el gen, el ácido polinucleico o la proteína (subunidad de) FAS a los que se hace referencia en el presente documento se modifica al menos mediante la introducción de una TE, ya sea sustituyendo o no un ACP en los casos en los que originalmente están presentes múltiples ACP en dicha (subunidad de) FAS. Sin embargo, también son posibles modificaciones adicionales de dicha (subunidad de) FAS. A modo de ejemplo, pueden modificarse uno o más de los dominios funcionales (por ejemplo, AT, ER, DH, MPT, KS, KR, y/o PPT) de dicha (subunidad de) FAS, incluyendo la sustitución de tal dominio funcional por, por ejemplo y sin limitación, un dominio funcional correspondiente de una (subunidad de) FAS ortóloga.

Como se usa en el presente documento, las expresiones "polipéptido", "proteína", "péptido" y "secuencia de aminoácidos" se utilizan indistintamente, y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que puede incluir aminoácidos codificados y no codificados, aminoácidos modificados o derivatizados química o bioquímicamente, y polipéptidos que tienen estructuras principales peptídicas modificadas. Como se usa en el presente documento, los restos de aminoácido se indicarán por su nombre completo o de acuerdo con el código convencional de aminoácidos de tres o una letra. El término "gen", como se usa generalmente en el presente documento, se refiere a una secuencia de ácido nucleico que contiene una secuencia codificante, un promotor y cualquier otra región reguladora necesaria para la expresión en una célula hospedadora.

Como se usa en el presente documento, el término "promotor" se refiere a una secuencia no traducida ubicada dentro de las 50 pb corriente arriba del sitio de inicio de la transcripción y que controla el inicio de la transcripción del gen estructural. Generalmente se ubica dentro de aproximadamente 1 a 1000 pb, preferentemente 1-500 pb, especialmente 1-100 pb corriente arriba (es decir, 5') del codón de iniciación de la traducción de un gen estructural. De forma similar, el término "terminador" se refiere a una secuencia no traducida ubicada corriente abajo (es decir, 3') del codón de terminación de la traducción de un gen estructural (generalmente dentro de aproximadamente 1 a 1000 pb, más normalmente 1-500 pares de bases y especialmente 1-100 pares de bases) y que controla el final de la transcripción del gen estructural. Un promotor o terminador está "unido o conectado operativamente" o "unido o conectado de forma operativa" a una secuencia codificante si su posición relativa a la de la secuencia codificante es tal que el promotor o el terminador, según sea el caso, realiza su función de control transcripcional.

Como se usa en el presente documento, el término "heterólogo" o "exógeno" se refiere al hecho de que el gen, secuencia de ácido nucleico o proteína, dominio, o secuencia codificante en consideración se origina fuera del organismo hospedador de interés o estudio, o se refiere al hecho de que el gen o secuencia codificante en consideración no es nativa o endógena del hospedador sino que se origina o se ha clonado a partir de un tipo celular distinto o de un organismo de una especie distinta a la del hospedador receptor.

El término "nativo" o "endógeno" se usa en el presente documento con respecto a materiales genéticos (por ejemplo, un gen, promotor o terminador, etc.) que se encuentran (aparte de mutaciones de individuo a individuo que no afectan a la función) dentro del genoma de las células de tipo silvestre de la cepa hospedadora.

El término "sobreexpresión" como se usa en el presente documento cuando se hace referencia a la expresión de un gen en una célula hospedadora, se refiere al hecho de que se expresa a un nivel más alto que el natural en dicha célula hospedadora. Esto puede implicar que es un gen extraño, no expresado de forma natural en la célula hospedadora o que el gen endógeno se haya modificado para aumentar la expresión en dicha célula hospedadora.

El término "inactivación" como se usa en el presente documento cuando se hace referencia a un gen, secuencia de gen o secuencia que codifica un dominio presente en una célula hospedadora, se refiere al hecho de que el producto génico no se expresa o no es activo en dicha célula hospedadora. Esto normalmente implica que el gen, la secuencia génica o secuencia endógena que codifica un dominio, se ha modificado para que ya no permita la expresión en dicha célula hospedadora, pero también puede implicar que el gen se ha modificado para garantizar que el producto génico ya no está activo, e incluye la deleción parcial o completa, preferentemente completa, del gen, secuencia génica, o secuencia que codifica un dominio.

Por "que codifica" se entiende que una secuencia de ácido nucleico o parte (o partes) de la misma corresponde, en virtud del código genético de un organismo en cuestión, a una secuencia de aminoácidos particular, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de un polipéptido o proteína deseada. A modo de ejemplo, los ácidos nucleicos que "codifican" un polipéptido o proteína particular pueden abarcar ácidos nucleicos genómicos, ARNhn, pre-ARNm, ARNm, ADNc, recombinantes o sintéticos.

Preferentemente, un ácido nucleico que codifica un polipéptido o proteína particular puede comprender un marco abierto de lectura (ORF) que codifica dicho polipéptido o proteína. Un "marco abierto de lectura" u "ORF" se refiere a una sucesión de tripletes de nucleótidos codificantes (codones) que comienza con un codón de iniciación de la traducción y cierra con un codón de terminación de la traducción conocido de por sí, y que no contiene ningún codón de terminación de la traducción en fase y potencialmente capaz de codificar un polipéptido. Por tanto, la expresión puede ser sinónimo de "secuencia codificante" como se usa en la técnica. Las secuencias de ácido polinucleico comprenden un marco abierto de lectura que comprende una secuencia que codifica una ACP y una secuencia que codifica una TE, preferentemente adyacentes entre sí.

La expresión "ácido graso" como se usa en el presente documento se refiere a cualquiera de un gran grupo de ácidos orgánicos, especialmente los que se encuentran en grasas y aceites animales y vegetales. Compuestos de manera característica por compuestos alifáticos saturados o insaturados con un número par de átomos de carbono, este grupo de ácidos incluye los ácidos palmítico, esteárico y oleico, pero también incluye ácidos grasos de cadena corta (SCFA) y ácidos grasos de cadena media (MCFA). Los ácidos grasos de cadena corta (SCFA) son ácidos grasos con colas alifáticas de menos de seis carbonos (por ejemplo, ácido butírico), mientras que los ácidos grasos de cadena media (MCFA) son ácidos grasos con colas alifáticas de, normalmente, 6-12 carbonos.

La expresión "ácido graso saturado" como se usa en el presente documento se refiere a cualquier ácido graso en que todos los enlaces entre átomos de carbono son enlaces sencillos.

La expresión "ácido graso insaturado" como se usa en el presente documento se refiere a cualquier ácido graso en que al menos uno de los enlaces entre átomos de carbono es un doble enlace.

La expresión "ácido graso sintasa", "ácido graso sintetasa" o "FAS" se refiere al complejo enzimático o proteína multienzimática que cataliza la síntesis de ácidos grasos. La FAS no es una sola enzima sino un sistema enzimático multimodular compuesto por distintas unidades o dominios enzimáticos o estructurales. Existen dos clases principales de FAS. La FAS de tipo I utiliza un único o alternativamente dos grandes, polipéptidos multifuncionales y son comunes a mamíferos y hongos (aunque la disposición estructural de las sintasas fúngicas y de mamíferos difiere). También se encuentra un sistema de ácido graso sintasa de tipo I en el grupo de bacterias CMN (corinebacterias, micobacterias y nocardia). La FAS de tipo II se encuentra en arqueas y bacterias, y se caracteriza por el uso de enzimas monofuncionales discretas para la síntesis de ácidos grasos. El mecanismo de alargamiento y reducción de las FAS de tipo I y las FAS de tipo II FAS es el mismo, ya que los dominios de las enzimas FAS de tipo II son en gran medida homólogos a sus dominios contraparte en los polipéptidos multienzimáticos de FAS de tipo I. Normalmente, los genes de FAS codifican múltiples unidades enzimáticas o dominios, tal como acetil transferasa (AT), enoil reductasa (ER), deshidratasa (DH), malonilpalmitoil transferasa (MPT), proteína transportadora de acilos (ACP), cetoacil sintasa (KS), cetoacil reductasa (KR), fosfopanteteinil transferasa (PPT), tioesterasa (TE), malonilacetil transferasa (MAT), algunos, o todos ellos, constituyen normalmente el complejo funcional de FAS. A modo de ejemplo y sin limitación, la FAS fúngica normalmente comprende los siguientes dominios enzimáticos: acetil transferasa (AT), enoil reductasa (ER), deshidratasa (DH), malonilpalmitoil transferasa (MPT), proteína transportadora de acilos (ACP), cetoacil sintasa (KS), cetoacil reductasa (KR), fosfopanteteinil transferasa (PPT). La FAS animal, en particular de mamífero, normalmente comprende los siguientes dominios enzimáticos: cetoacil sintasa (KS), malonilacetil transferasa (MAT), deshidratasa (DH), enoil reductasa (ER), cetoacil reductasa (KR), proteína transportadora de acilos (ACP), tioesterasa (TE). La FAS de tipo I está codificada por uno o alternativamente dos genes o secuencias génicas discretas. En caso de que FAS esté codificada por dos genes o secuencias génicas, el gen (secuencias) individual codifica FAS1 (también llamada subunidad p de FAS o cadena p de FAS) y FAS2 (también llamada subunidad a de FAS, cadena a de FAS). Qué dominio enzimático está comprendido en qué subunidad o cadena es variable. A modo de ejemplo y sin limitación, la FAS de Saccharomyces cerevisiae comprende (dispuestos del extremo N al C), ACP, KS, KR y PPT en FAS2 (cadena a) y comprende (dispuestos desde el extremo N al extremo C) AT, ER, DH y MPT en FAS 1 (cadena p). La FAS de Cryptococcus neoformans comprende (dispuestos del extremo N al C), KS, KR y PPT en FAS2 (cadena a) y comprende (dispuestos desde el extremo N al extremo C) AT, ER, DH, MPT y ACP en FAS 1 (cadena p). La FAS de Rhodosporidium toruloides comprende (dispuestos del extremo N al C), d H, MPT, ACP, KS, KR y PpT en FAS2 (cadena a) y comprende (dispuestos desde el extremo N al extremo C) AT y ER en FAS 1 (cadena p). Cabe señalar que Rhodosporidium toruloides comprende dos dominios de ACP dispuestos en tándem. En contraste con lo anterior, otros organismos codifican FAS como un único gen y, por tanto, FAS es un único polipéptido. A modo de ejemplo y sin limitación, la FAS de Ustilago maydis y Aplanochytrium kerguelense comprenden en un único polipéptido (dispuestos del extremo N al C), acetil transferasa (AT), enoil reductasa (ER), deshidratasa (DH), malonilpalmitoil transferasa (MPT), proteína transportadora de acilos (ACP), cetoacil sintasa (KS), cetoacil reductasa (KR), fosfopanteteinil transferasa (PPT). Cabe señalar que Aplanochytrium kerguelense comprende dos dominios de ACP dispuestos en tándem. Como apreciará el experto en la materia, la disposición de ACP "en tándem" se refiere a dos (o más) dominios de ACP que están ubicados uno al lado del otro (es decir, adyacentes, como se define en otra parte en el presente documento, conectados opcionalmente a través de un engarce) en la proteína, sin interponer otros dominios de FAS, es decir, sin interponer AT, ER, DH, MPT, KS, KR, MAT, TE o PPT. Como se usa en el presente documento, la expresión "subunidad de ácido graso sintasa", "subunidad de ácido graso sintetasa" o "subunidad de FAS" se refiere a una FAS parcial en la que no están presentes todos los dominios de una FAS completamente funcional. A modo de ejemplo, una subunidad de FAS puede carecer de una o más de acetil transferasa (AT), enoil reductasa (ER), deshidratasa (DH), malonilpalmitoil transferasa (MPT), proteína transportadora de acilos (ACP), cetoacil sintasa (KS), cetoacil reductasa (KR), fosfopanteteinil transferasa (PPT), malonilacetil transferasa (MAT). Mediante un ejemplo adicional, se entenderá que subunidad de FAS, si bien uno o más de los dominios enzimáticos faltan, los dominios que están presentes están preferentemente completos y son funcionales, es decir, estos dominios preferentemente no están truncados. Mediante un ejemplo adicional, una subunidad de FAS como se hace referencia en el presente documento puede ser FAS1 o FAS2, como se describe en el presente documento. Preferentemente, la subunidad de FAS a la que se hace referencia en el presente documento comprende al menos un dominio de ACP, tal como, por ejemplo, un dominio de ACP o dos dominios de ACP, opcionalmente, dos dominios de ACP en tándem. Las subunidades de FAS ilustrativas se pueden obtener, por ejemplo, de la Figura 1. Se entenderá que una subunidad de FAS como se hace referencia en el presente documento no contiene todos los dominios enzimáticos necesarios para la funcionalidad completa. Para lograr una funcionalidad completa, el subdominio de FAS como se hace referencia en el presente documento puede necesitar complementarse con los dominios enzimáticos que faltan en la subunidad de FAS. Estos dominios faltantes pueden proporcionarse ventajosamente como un único polipéptido o como un único ORF que codifique un único polipéptido.

Para la organización del dominio de FAS de tipo I representativo de origen animal y fúngico, se hace referencia a Maier y col. (2008) "The crystal structure of a mammalian fatty acid synthase"; Science; 321(5894):1315-22 (doi: 10.1126/science.1161269); y Lomakin y col. (2007) "The crystal structure of yeast fatty acid synthase, a cellular machine with eight active sites working together"; Cell; 129(2):319-32.

En una realización preferente, FAS, como se describe en el presente documento, es FAS de tipo I, incluyendo FAS1 y/o FAS2. Por consiguiente, en determinadas realizaciones, FAS, como se describe en el presente documento, es o comprende FAS1 o FAS2. Preferentemente, FAS, como se describe en el presente documento, es o comprende FAS1 o fAS2, en el que dicho FAS1 o FAS2 comprende un dominio de ACP. En determinadas realizaciones, cuando se hace referencia a un dominio de TE insertado en FAS corriente arriba o corriente abajo de una ACP, en el caso de que FAS se componga de dos subunidades discretas FAS1 y FAS2, el dominio de TE se inserta en la subunidad de FAS que contiene el ACP. Por consiguiente, en determinadas realizaciones, FAS como se hace referencia en el presente documento puede estar relacionada a FAS1 o FAS2, cualquiera que comprenda la ACP.

La TE a la que se hace referencia en el presente documento, tal como preferentemente la TE heteróloga, se proporciona o inserta en la (subunidad de) FAS, preferentemente la subunidad de FAS que contiene la ACP. En determinadas realizaciones, la TE a la que se hace referencia en el presente documento, tal como preferentemente la TE heteróloga, se proporciona o inserta en la (subunidad de) FAS corriente arriba o corriente abajo de una ACP de dicha (subunidad de) FAS, es decir, adyacente o directamente adyacente a una ACP de dicha (subunidad de) FAS, preferentemente directamente corriente arriba o corriente abajo de una ACP de dicha (subunidad de) FAS, es decir, una secuencia de ácido nucleico de TE directamente en 5' o 3' de una secuencia de ácido nucleico de la ACP, o una secuencia polipeptídica de TE directamente N-terminal o C-terminal de una secuencia polipeptídica de la ACP. Como se usa en este contexto, el término "directamente" indica que entre las secuencias de la ACP y la TE no están presentes dominios adicionales, en particular, no están presentes dominios enzimáticos adicionales (tales como AT, ER, DH, MPT, KS, KR o PPT), en particular, no están presentes dominios enzimáticos adicionales funcionales. El experto comprenderá que posiblemente pueden estar presentes secuencias de engarce entre las secuencias de la ACP y de la Te , como se sabe en la técnica. Sin embargo, las secuencias de engarce también pueden estar ausentes. Se entenderá que las secuencias de engarce no son ni comprenden dominios enzimáticos (funcionales). En determinadas realizaciones, está presente una secuencia de engarce de como máximo 200 nucleótidos, tal como, por ejemplo, como máximo 100 nucleótidos. En determinadas realizaciones, está presente una secuencia de engarce de como máximo 70 aminoácidos, tal como, como máximo, 35 aminoácidos. En determinadas realizaciones, una secuencia de engarce está codificada por una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 110, o un fragmento funcional o variante de la misma. En determinadas realizaciones, un engarce tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 111, o un fragmento funcional o variante de la misma, o una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 111.

La (subunidad de) FAS como se describe en el presente documento puede ser una (subunidad de) FAS que se origina a partir de un organismo unicelular, preferentemente seleccionado del grupo que comprende o consiste en una levadura, protista, mixomiceto y microalgas, preferentemente una levadura o microalgas.

Preferentemente, la (subunidad de) FAS como se describe en el presente documento es una (subunidad de) FAS que se origina en un organismo oleaginoso, preferentemente un organismo oleaginoso unicelular.

Preferentemente, la FAS como se describe en el presente documento es una FAS de tipo I que se origina a partir de un organismo oleaginoso unicelular, preferentemente seleccionado del grupo que comprende o consiste en una levadura, protista, mixomiceto y microalgas, preferentemente una levadura o microalgas.

La (subunidad de) FAS también puede ser artificial, en el sentido que distintos dominios enzimáticos pueden originarse en distintos organismos. Distintos dominios enzimáticos pueden originarse en el mismo organismo. Distintas subunidades de FAS pueden originarse en distintos organismos. Distintas subunidades de FAS pueden originarse en el mismo organismo.

En determinadas realizaciones, FAS, preferentemente la FAS de tipo I, como se usa en el presente documento, se refiere a un solo polipéptido que comprende una ACP y uno o más, preferentemente todos, los dominios de enzima FAS (o un ácido polinucleico que codifica los dominios respectivos). En otras realizaciones determinadas, FAS, como se usa en el presente documento, se refiere a FAS1 y/o FAS2 que comprende una ACP y uno o más, preferentemente todos, los otros dominios FAS1 y/o FAS2 (o un ácido polinucleico que codifica los dominios respectivos). La TE y la ACP (que pueden residir en una FAS compuesta como una única proteína o una FAS compuesta por subproteínas FAS1 y FAS2), como se hace referencia en el presente documento, están codificadas por un único marco abierto de lectura. Por consiguiente, en un aspecto, la invención se refiere a un ácido polinucleico recombinante que codifica una subunidad (es decir FAS1 o FAS2) de la ácido graso sintasa (FAS) fúngica, comprendiendo dicha subunidad FAS1 o FAS2 una ACP y una tioesterasa (TE), preferentemente una TE heteróloga.

El experto comprenderá que si FAS está compuesta por FAS1 y FAS2, la TE puede insertarse en uno de estas, preferentemente adyacente a una ACP contenido en la misma. En los procedimientos de producción de ácidos grasos (o derivados de los mismos), como se hace referencia en otro lugar en el presente documento, en determinadas realizaciones, solo la FAS1 (o FAS2) así diseñada técnicamente puede introducirse en un organismo hospedador, si dicho organismo hospedador contiene naturalmente FAS (que puede ser o no el mismo organismo del que se obtiene el FAS modificado). De esta manera, el organismo hospedador puede complementar la otra subunidad de FAS (por ejemplo, se introduce una FAS1 que contiene una TE en un organismo hospedador que expresa FAS2 de forma endógena).

Como se hace referencia en el presente documento, la (subunidad de) FAS (de origen natural) a la que se hace referencia en el presente documento puede, en determinadas realizaciones, comprender al menos dos dominios de ACP, es decir, el gen (o genes) de (subunidad de) FAS codifica al menos dos dominios de ACP. En el ácido polinucleico o secuencias de polipéptidos, vectores, células recombinantes, o procedimientos descritos en el presente documento, uno de los dos dominios de ACP o secuencias que codifican ACP puede sustituirse por un dominio de TE o una secuencia codificante de TE. El experto comprenderá que si están presentes más de dos dominios de ACP en la (subunidad de) FAS de origen natural, puede sustituirse más de un dominio de ACP por un dominio de TE, siempre que quede al menos un dominio de ACP. En determinadas realizaciones, en que la FAS se compone de distintas subunidades de FAS, preferentemente, solo una de las subunidades (o secuencia de nucleótidos que codifica la subunidad) comprende una ACP (o múltiples ACP), mientras que la otra subunidad (o secuencia de nucleótidos que codifica la subunidad) no comprende una ACP.

Como se hace referencia en el presente documento, la (subunidad de) FAS (de origen natural) a la que se hace referencia en el presente documento comprende preferentemente al menos un dominio de ACP, es decir, el gen (o genes) de (subunidad de) FAS codifica al menos un dominio de ACP y está desprovisto de dominio de TE, es decir, el gen (o genes) de (subunidad de) FAS no codifica un dominio de TE. En el ácido polinucleico o secuencias de polipéptidos, vectores, células recombinantes, o procedimientos descritos en el presente documento, se añade preferentemente un dominio de TE antes o después del dominio de ACP o la secuencia que codifica la TE se ha añadido antes o después de la secuencia que codifica la ACP.

Ejemplos no limitantes de una FAS adecuada (de origen natural) para su uso en el presente documento, que tienen al menos dos dominios de ACP, se enumeran en la Tabla 1. Por consiguiente, en determinadas realizaciones, la FAS (de origen natural) es como se especifica en la Tabla 1 o procede de un organismo enumerado en la Tabla 1. Por extensión, los dominios de FAS individuales (o combinaciones de los mismos), tal como acetil transferasa (AT), enoil reductasa (ER), deshidratasa (DH), malonilpalmitoil transferasa (MPT), proteína transportadora de acilos (ACP), cetoacil sintasa (KS), cetoacil reductasa (Kr ), fosfopanteteinil transferasa (PPT), tioesterasa (TE), malonilacetil transferasa (MAT), pueden obtenerse de la FAS (de origen natural) como se enumera en la Tabla 1.

Tabla 1: FAS de organismos adecuados para su uso de acuerdo con las realizaciones de la invención

continuación

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El experto comprenderá que, además de las/los FAS/organismos enumerados en la Tabla 1, se pueden identificar FAS y organismos adicionales que sean adecuados, tal como, pero sin limitación, una (subunidad de) FAS que también comprenda al menos dos dominios de ACP. Esto se puede hacer, por ejemplo, mediante alineamientos de secuencias. Los procedimientos para comparar secuencias y determinar la identidad de secuencia son bien conocidos en la técnica. A modo de ejemplo, porcentaje de identidad de secuencia se refiere a un porcentaje de ácidos nucleicos o aminoácidos idénticos entre dos secuencias después del alineamiento de estas secuencias. Los alineamientos y los porcentajes de identidad se pueden realizar y calcular con diversos programas y algoritmos distintos conocidos en la técnica. Los algoritmos de alineamiento preferidos incluyen BLAST (Altschul, 1990; disponible, por ejemplo, en el sitio de internet del NCBI) y Clustal (revisado en Chenna, 2003; disponible, por ejemplo, en el sitio de internet del IEB). Preferentemente, BLASt se utiliza para calcular el porcentaje de identidad entre dos secuencias, tal como el algoritmo de "Blast 2 sequences" descrito por Tatusova y Madden 1999 (FEMS Microbiol Lett 174: 247-250), por ejemplo, utilizando las configuraciones predeterminadas publicadas u otra configuración adecuada (tal como, por ejemplo, para el algoritmo BLASTN: costo para abrir un hueco = 5, costo para ampliar un hueco = 2, penalización por una falta de coincidencia = -2, recompensa por una coincidencia = 1, disminución por hueco = 50, valor esperado = 10,0, tamaño de palabra = 28; o para el algoritmo BLASTP: matriz = Blosum62, costo para abrir un hueco = 11, costo para ampliar un hueco = 1, valor esperado = 10,0, tamaño de palabra = 3).

A modo de ejemplo, las secuencias de ACP (así como secuencias de (subunidad de) FAS en general, o secuencias de dominios seleccionados de (subunidad de) FAS, tal como acetil transferasa (AT), enoil reductasa (ER), deshidratasa (DH), malonilpalmitoil transferasa (MPT), proteína transportadora de acilos (ACP), cetoacil sintasa (KS), cetoacil reductasa (KR), fosfopanteteinil transferasa (PPT), tioesterasa (TE), malonilacetil transferasa (MAT)) pueden, por ejemplo, alinearse con secuencias como se describe en Zhu y col. (2012) "A multi-omic map of the lipid-producing yeast Rhodosporidium toruloides"; Nat Commun;3:1112 (doi: 10.1038/ncomms21 12).

En determinadas realizaciones, la (subunidad de) FAS (de origen natural) tiene una secuencia proteica como se expone en la SEQ ID NO: 8, 9, 10, 14, o 20, o un fragmento funcional, variante u ortólogo de la misma, o tiene una secuencia codificante que codifica la secuencia proteica como se expone en la SEQ ID NO: 8, 9, 10, 14 o 20, o un fragmento funcional, variante u ortólogo de la misma.

En determinadas realizaciones, la (subunidad de) FAS modificada al sustituir un dominio de ACP con un dominio de TE tiene una secuencia proteica como se expone en la SEQ ID NO: 11 o 12, o un fragmento funcional, variante u ortólogo de la misma, o tiene una secuencia codificante que codifica la secuencia proteica como se expone en la SEQ ID NO: 11 o 12, o un fragmento funcional, variante u ortólogo de la misma.

En determinadas realizaciones, la (subunidad de) FAS se modifica mediante la adición de un dominio de TE antes o después de un dominio de ACP y tiene una secuencia proteica como se expone en la SEQ ID NO: 17 o 18, o un fragmento funcional, variante u ortólogo de la misma, o tiene una secuencia codificante que codifica la secuencia proteica como se expone en la SEQ ID NO: 17 o 18, o un fragmento funcional, variante u ortólogo de la misma.

En determinadas realizaciones, la (subunidad de) FAS o la secuencia polinucleotídica que codifica la (subunidad de) FAS, modificada mediante la introducción de un dominio de TE (o la sustitución de un dominio de ACP por un dominio de TE), comprende o consiste en (una secuencia polinucleotídica que codifica, preferentemente de 5' a 3)':

- AT, ER, DH, MPT, ACP, TE, KS, KR y PPT;

- AT, ER, DH, MPT, TE, ACP, KS, KR y PPT;

- AT, ER, DH, MPT, ACP, TE, KS y KR;

- AT, ER, DH, MPT, TE, ACP, KS y KR;

- AT, ER, DH, MPT, ACP, TE y KS;

- AT, ER, DH, MPT, TE, ACP y KS;

- AT, ER, DH, MPT, ACP y TE;

- AT, ER, DH, MPT, TE y ACP;

- ER, DH, MPT, ACP, TE, KS, KR y PPT;

- ER, DH, MPT, TE, ACP, KS, KR y PPT;

- DH, MPT, ACP, TE, KS, KR y PPT;

- DH, MPT, TE, ACP, KS, KR y PPT;

- MPT, ACP, TE, KS, KR y PPT;

- MPT, TE, ACP, KS, KR y PPT;

- ACP, TE, KS, KR y PPT;

- TE, ACP, KS, KR y PPT;

- TE y ACP;

- ACP y TE;

- MPT, ACP, TE y KS; o

- MPT, TE, ACP y KS;

en la que dicho TE es preferentemente heteróloga en comparación con dichas AT, ER, DH, MPT, ACP, KS, KR y/o PPT, y en los que dichos AT, ER, DH, MPT, ACP, KS, KR y/o PPT preferentemente no son heterólogos comparados entre sí.

Como se describe en el presente documento, en determinadas realizaciones (al menos) uno de los dominios de ACP en la (subunidad de) fAs de origen natural que comprende (al menos) dos dominios de ACP se sustituye por un dominio de TE. En otras realizaciones determinadas, se introduce (directamente) una TE corriente arriba o corriente abajo de la ACP de la (subunidad de) FAS.

Como se usa en el presente documento, el término "sustituido" se refiere a la deleción del dominio de ACP o la secuencia de nucleótidos que codifica la ACP y la inserción del dominio de TE o la secuencia de nucleótidos que codifica la TE en la ubicación del dominio de ACP delecionado o la secuencia de nucleótidos que codifica la ACP. La sustitución del dominio de ACP o de secuencias de nucleótidos que codifican la ACP por un dominio de TE o una secuencia que codifican la TE puede realizarse mediante técnicas conocidas en la técnica, incluidas las técnicas de clonación convencionales. A modo de ejemplo y sin limitación, se puede clonar in vitro la secuencia del gen de FAS, o parte de la secuencia del gen de FAS (es decir, una subunidad de FAS, tal como, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos de FAS parcial, secuencia que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio de ACP; o, por ejemplo, (parte de) una secuencia de FAS1 o FAS2 que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio de ACP). A través de técnicas de clonación convencionales, incluyendo, por ejemplo, el uso de PCR, enzimas de restricción o recombinación homóloga in vitro, la secuencia de nucleótidos que codifica la ACP puede eliminarse y sustituirse por una secuencia de nucleótidos que codifica la TE. En determinadas realizaciones, el ácido polinucleico recombinante resultante puede introducirse en una célula procariota o eucariota como se define en el presente documento en otro lugar, mediante técnicas conocidas en la técnica. El experto en la materia entenderá que sustituir la secuencia que codifica la ACP por una secuencia que codifica la TE preferentemente, pero no necesariamente, implica la deleción de toda la secuencia codificante de la ACP. Puede ser que quede parte o toda la secuencia de ACP original. Por ejemplo, la secuencia que codifica la TE puede insertarse en la secuencia que codifica la ACP, tal como para interrumpir la secuencia que codifica la ACP, en la medida en que no dé como resultado ninguna ACP funcional. Preferentemente, sin embargo, se deleciona la secuencia codificante completa de la ACP, o la mayor parte de la secuencia codificante de la ACP, tal como al menos el 80 %, preferentemente al menos el 90 %, más preferentemente, se deleciona al menos el 95 % de la secuencia codificante de la ACP.

Como se usa en el presente documento, el término "tioesterasa" se refiere a una enzima que cataliza la hidrólisis de un éster en un ácido y un alcohol, específicamente en el grupo tiol. Los ejemplos no limitantes de tioesterasas incluyen, pero sin limitación, acetil-coA hidrolasa, palmitoil-coA hidrolasa, succinil-coA hidrolasa, formil-coA hidrolasa, acil-coA hidrolasa, etc. Las tioesterasas preferentes a las que se hace referencia en el presente documento son las acil-ACP/CoA tioesterasas, preferentemente acil-ACP/CoA tioesterasas que tienen especificidad por y producen o dan como resultado la liberación de SCFA y/o MCFA. En la Tabla 2 se enumeran ejemplos no limitantes de tioesterasas adecuadas para su uso en los aspectos de acuerdo con la invención, como se describe en el presente documento. Por consiguiente, en determinadas realizaciones, la tioesterasa es como se especifica en la Tabla 2 o procede de un organismo enumerado en la Tabla 2.

Tabla 2: TE de organismos adecuados de acuerdo con las realizaciones de la invención

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El experto comprenderá que, además de las/los TE/organismos enumerados en la Tabla 2, pueden identificarse TE y organismos adicionales que también comprenden una TE adecuada para su uso de acuerdo con la invención. Esto se puede hacer, por ejemplo, mediante alineamientos de secuencias, como se detalla en otra parte en el presente documento.

En determinadas realizaciones, la TE se selecciona de AcTesA (obtenido de Acinetobacter baylyi; representado por el número de referencia de genbank WP_004921669.1), TEII (procedente de Mus musculus; representado por el número de referencia de genbank NP_666033.1), TEII (procedente de Rattus norvegicus; representado por el número de referencia de genbank NM_022705.1), YpTesB (procedente de Yersinia pestis; representado por el número de referencia de genbank CAL21736.1), fatB1 (procedente de Cocos nucifera; representado por el número de referencia de genbank AEM72519.1).

En determinadas realizaciones, la TE tiene una secuencia proteica como se expone en la SEQ ID NO: 13, o un fragmento funcional, variante u ortólogo de la misma, o tiene una secuencia codificante que codifica la secuencia proteica como se expone en la SEQ ID NO: 13, o un fragmento funcional, variante u ortólogo de la misma.

En un aspecto, la invención se refiere a una proteína o polipéptido codificado por el ácido polinucleico de acuerdo con la invención.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a un vector que comprende el ácido polinucleico de acuerdo con la invención, o un vector que comprende un ácido polinucleico que codifica el polipéptido de acuerdo con la invención.

Por "vector" se entiende una molécula de polinucleótido, preferentemente una molécula de ADN obtenida, por ejemplo, de un plásmido, bacteriófago o virus vegetal/animal, en que se puede insertar o clonar un polinucleótido. Un vector contiene preferentemente uno o más sitios de restricción únicos y puede tener la capacidad de replicarse de forma autónoma en una célula hospedadora definida, o de ser integrable en el genoma del hospedador definido, de manera que la secuencia clonada sea reproducible. La elección del vector dependerá normalmente de la compatibilidad del vector con la célula hospedadora en la que se introducirá el vector. De acuerdo con una realización de la presente invención, la construcción de expresión es un vector de expresión, adecuado para la transformación en organismos hospedadores, preferentemente bacterias, y adecuado para el mantenimiento y/o la expresión del ácido polinucleico de acuerdo con la presente invención, como se describe en el presente documento, en una célula hospedadora transformada.

Los vectores de la presente invención pueden funcionar como vectores de clonación o vectores de expresión en la cepa hospedadora seleccionada. Los expertos en la materia conocen numerosos vectores, y la selección de un vector apropiado es cuestión de elección. Los vectores pueden, por ejemplo, ser el vector de expresión pASK-IBA3C (IBA-life sciences), el vector de transformación pUR5750 (de Groot y col. 1998 Nature Biotechnology 16, 839 - 842), el vector de transformación pCGHT3 (Chambers y col. 1988 Gene, Volumen 68, Número 1: 15; Scholtmeyer y col. 2001 Appl. Environ. Microbiol. 67(1): 481).

Un "vector de expresión" es una construcción que puede utilizarse para transformar una célula hospedadora seleccionada y proporciona la expresión de una secuencia codificante en el hospedador seleccionado. Los vectores de expresión pueden ser, por ejemplo, vectores de clonación, vectores binarios o de integración (por ejemplo, vectores de recombinación, incluyendo recombinación homóloga o de integración aleatoria). Por tanto, la invención también se refiere a un vector que comprende los ácidos polinucleicos de la invención. Dicho vector puede comprender además secuencias reguladoras para controlar la expresión del ácido polinucleico en dicha célula hospedadora. En general, la expresión implica el uso de un vector de expresión que puede replicarse de manera eficaz en una célula hospedadora, de forma que la célula hospedadora acumule muchas copias del vector de expresión y, a su vez, sintetice altos niveles de un producto deseado codificado por el vector de expresión.

Las expresiones "secuencias reguladoras" y "secuencia de control" utilizadas en el presente documento deben tomarse en un contexto amplio y se refieren a secuencias reguladoras de ácido nucleico capaces de dirigir y/o regular la expresión de las secuencias a las que están ligadas (unidas covalentemente) y/u operativamente unidas. Las secuencias de control difieren dependiendo del organismo hospedador pretendido y de la naturaleza de la secuencia a expresar. Para la expresión de una proteína en procariotas, las secuencias de control generalmente incluyen un promotor, un sitio de unión a ribosomas y un terminador. En eucariotas, las secuencias de control generalmente incluyen promotores, terminadores y, en algunos casos, potenciadores y/o secuencias no traducidas 5' y 3'. La expresión 'secuencia de control' pretende incluir, como mínimo, todos los componentes necesarios para la expresión, y también pueden incluir componentes ventajosos adicionales. De acuerdo con una realización preferente de la presente invención, la secuencia de control es operativa en una célula hospedadora como se define en el presente documento en otra parte. La expresión "secuencia de control" abarca un promotor o una secuencia capaz de activar o potenciar la expresión de una molécula de ácido nucleico en una célula hospedadora.

Los vectores de expresión y clonación contienen habitualmente un promotor que es reconocido por el organismo hospedador y está (covalente y) operativamente unido al ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés. Los promotores son secuencias no traducidas ubicadas cadena arriba (5') del codón de iniciación de un gen estructural (generalmente dentro de aproximadamente 100 a 1000 pb) que controlan la transcripción y traducción de una secuencia de ácido nucleico particular, tal como la que codifica una proteína de fusión como se define en el presente documento, a la que están unidos operativamente. Dichos promotores normalmente se dividen en dos clases, inducibles y constitutivos. Los promotores inducibles son promotores que inician niveles elevados de transcripción del ácido nucleico bajo su control en respuesta a algún cambio en las condiciones de cultivo, por ejemplo, la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio de temperatura. En este momento, se conocen bien un gran número de promotores reconocidos por una diversidad de posibles células hospedadoras. Estos promotores están operativamente unidos al ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés mediante la eliminación del promotor del ácido nucleico fuente mediante digestión con enzimas de restricción y la inserción de la secuencia del promotor aislada en el vector. Pueden utilizarse para dirigir la amplificación y/o la expresión del polipéptido de interés tanto la secuencia del promotor de origen natural como muchos promotores heterólogos. En general, con estos hospedadores se utilizan vectores plásmidos que contienen promotores y secuencias de control que se obtienen de especies compatibles con la célula hospedadora. El vector normalmente porta uno o más sitios de replicación, así como secuencias marcadoras, que son capaces de proporcionar una selección fenotípica en células transformadas.

De acuerdo con una realización de la invención, los vectores comprenden un promotor constitutivo. Los ejemplos de promotores constitutivos adecuados para las construcciones y procedimientos de acuerdo con la presente invención incluyen, pero sin limitación, el promotor CaMV35S, GOS2, el promotor de actina, el promotor de ubiquitina, el promotor de tiolasa.

De acuerdo con otra realización de la invención, los vectores comprenden un promotor inducible. Los ejemplos de promotores inducibles adecuados para las construcciones y procedimientos de acuerdo con la presente invención incluyen, pero sin limitación, el promotor lac o el promotor de xilosa

Opcionalmente, los presentes vectores de expresión también contendrán secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm y, así, pueden contener una o más secuencias de terminación de la transcripción. La expresión "secuencia de terminación de la transcripción" abarca una secuencia de control al final de una unidad transcripcional, que actúa de señal para el procesamiento 3' y la terminación de la transcripción. Se pueden incorporar en la construcción de expresión elementos reguladores adicionales, tales como potenciadores transcripcionales o traduccionales.

Las construcciones de expresión de la invención pueden incluir además un origen de replicación que es necesario para el mantenimiento y/o la replicación en un tipo de célula específico. Un ejemplo es cuando es necesario que una construcción de expresión se mantenga en una célula como un elemento genético episómico (por ejemplo, plásmido o molécula de cósmido). Los orígenes preferentes de replicación incluyen, pero sin limitación, el ori de f1, el ori de colE1 y los orígenes de replicación de bacterias gram+.

La construcción de expresión puede comprender opcionalmente un gen marcador de selección. Como se usa en el presente documento, la expresión "gen marcador de selección" incluye cualquier gen, que confiere un fenotipo a una célula en la que se expresa para facilitar la identificación y/o la selección de células que se transfectan o transforman con una construcción de expresión de la invención. Los genes marcadores de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, tales como el cloranfenicol, la zeocina (gen sh ble de Streptoalloteichus hindustanus), genetecina, melibiasa (MEL5), higromicina (gen de resistencia a antibióticos aminoglucósidos de E. coli), ampicilina, tetraciclina o kanamicina (gen de resistencia a kanamicina de Tn903), (b) complementan las deficiencias auxotróficas de la célula. Dos ejemplos destacados de deficiencias auxotróficas son la deficiencia del aminoácido leucina (por ejemplo, el gen LEU2) o la deficiencia de uracilo (por ejemplo, el gen URA3). Las células que son negativas para orotidina-5'-fosfato descarboxilasa (ura3-) no pueden crecer en medios que carecen de uracilo. Por tanto, se puede usar un gen URA3 funcional como marcador en una célula que tenga una deficiencia de uracilo, y se pueden seleccionar transformantes satisfactorios en un medio que carece de uracilo. Solo las células transformadas con el gen funcional URA3 son capaces de sintetizar uracilo y de crecer en tal medio. Si la cepa de tipo silvestre no tiene una deficiencia de uracilo (como es el caso de I. orientalis, por ejemplo), debe prepararse un mutante auxotrófico que tenga la deficiencia para utilizar URA3 como marcador de selección para la cepa. Los procedimientos para lograr esto son bien conocidos en la técnica. Los marcadores de selección preferentes incluyen el gen de resistencia a la zeocina, el gen de resistencia a G418, el gen de resistencia a higromicina. El casete de marcador de selección normalmente incluye además una secuencia promotora y terminadora, unidas operativamente al gen marcador de selección, y que son operativas en la cepa hospedadora. También se pueden utilizar genes marcadores visuales, e incluyen, por ejemplo, la beta-glucuronidasa (GUS), la luciferasa y la proteína verde fluorescente (GFP). La construcción de vectores adecuados que contengan uno o más de los componentes enumerados anteriormente y que incluyan las secuencias de control y codificantes deseadas emplea técnicas de ligamiento convencionales. Para generar los plásmidos necesarios se escinden, se elaboran a medida y religan en la forma deseada plásmidos aislados o fragmentos de ácido nucleico.

Como alternativa a los vectores de expresión descritos anteriormente, que son vectores de expresión inducibles o constitutivos, en determinadas realizaciones, el vector como se describe en el presente documento no comprende secuencias reguladoras responsables de la expresión de la proteína codificada por el ácido polinucleico como se describe en el presente documento. Este puede ser, por ejemplo, el caso de los vectores de integración o recombinación, como se sabe en la técnica. A modo de ejemplo y sin limitación, a través de recombinación, un gen de FAS endógeno, o parte del mismo, puede sustituirse por el ácido polinucleico de acuerdo con la invención como se describe en el presente documento. De esta manera, la célula hospedadora que originalmente comprendía un gen de FAS de origen natural (tal como, pero sin limitación, un gen de fAs que codifica (al menos) dos dominios de ACP), ahora comprende un gen de FAS recombinante que comprende un dominio de TE, bajo el control del promotor endógeno. De manera alternativa, se puede realizar una integración aleatoria, en ese caso, el ácido polinucleico de acuerdo con la invención como se describe en el presente documento preferentemente está unido operativamente a una o más secuencias reguladoras, como se describe en otra parte en el presente documento, tal como por ejemplo un promotor constitutivo o inducible.

La modificación genética de las cepas hospedadoras se logra en una o más etapas mediante el diseño y construcción de vectores apropiados y la transformación de la cepa hospedadora con esos vectores. Pueden utilizarse procedimientos de transformación por electroporación y/o químicos (tales como basados en cloruro de calcio o acetato de litio) o procedimientos de transformación mediados por Agrobacterium tumefaciens, como se conocen en la técnica. Los vectores pueden cortarse con enzimas de restricción particulares o utilizarse como ADN circular. El vector utilizado para la modificación genética de las cepas hospedadoras puede ser cualquier vector siempre que pueda integrarse en el genoma de la cepa hospedadora.

Los transformantes satisfactorios (que comprenden el ácido polinucleico o el vector como se describe en el presente documento integrado episómica o genómicamente) pueden seleccionarse de manera conocida, aprovechando los atributos aportados por el gen marcador, o por otras características (tales como la capacidad para producir ácidos grasos, la incapacidad para producir ácido láctico o lactato, la incapacidad para producir ácido acético o acetato, o la capacidad para crecer en sustratos específicos) aportadas por los genes insertados. El cribado se puede realizar mediante PCR o análisis de Southern, para confirmar que se han tenido lugar las inserciones y deleciones deseadas, para confirmar el número de copias e identificar el punto de integración de los genes en el genoma de la cepa hospedadora. La actividad de la enzima codificada por el gen insertado y/o la falta de actividad de la enzima codificada por el gen delecionado pueden confirmarse utilizando procedimientos de ensayo conocidos.

En un aspecto, la invención se refiere a una célula hospedadora procariota o eucariota recombinante, que expresa o es capaz de expresar la FAS y la TE de acuerdo con la invención, o que comprende el ácido polinucleico, el polipéptido, o el vector de acuerdo con la invención. Preferentemente, la célula hospedadora expresa o es capaz de expresar, tal como expresar de manera inducible o condicionada, el polipéptido codificado por el ácido polinucleico de acuerdo con la invención. Como se detalla anteriormente, la referencia a una célula hospedadora recombinante implica que la célula hospedadora comprende al menos un elemento genético extraño o heterólogo (es decir, no nativo), más particularmente una secuencia polinucleotídica que codifica una (subunidad de) FAS y una TE.

En un aspecto relacionado, la invención se refiere a una célula hospedadora procariota o eucariota recombinante, que expresa o es capaz de expresar, tal como expresar de manera inducible o condicionada, una secuencia del gen FAS (o subunidad FAS1 o FAS2) que se origina a partir de un gen de (subunidad de) FAS de origen natural (preferentemente desprovisto de TE) y que además expresa o es capaz de expresar una TE (heteróloga), tal como, por ejemplo, que tiene una secuencia de nucleótidos de TE (heteróloga) insertada (preferentemente (directamente) corriente arriba o corriente abajo de la ACP de dicha (subunidad de) FAS), en la que opcionalmente dicha (subunidad de) FAS tiene al menos dos secuencias de nucleótidos que codifican la ACP (preferentemente en tándem), en las que una de dichas secuencias de nucleótidos que codifican la ACT se sustituye por una secuencia de nucleótidos que codifica una TE, en la que dichas (subunidad de) FAS, ACP y TE se detallan en otra parte en el presente documento. El experto comprenderá que cuando se hace referencia a una subunidad de FAS, tal como una subunidad de FAS que comprende una o más ACP y una TE técnicamente diseñada, preferentemente directamente corriente arriba o corriente abajo de una ACP, para reconstituir una FAS funcional, capaz de producir S/MCFA, puede ser necesario proporcionar una subunidad separada, subunidad separada que comprende los dominios enzimáticos que faltan de la subunidad de FAS que comprende una o más ACP y una TE técnicamente diseñada. Por consiguiente, en determinadas realizaciones, la invención se refiere a una célula procariota o eucariota recombinante como se hace referencia en el presente documento, que expresa o es capaz de expresar, tal como expresar de manera inducible o condicionada, múltiples secuencias génicas de una subunidad de FAS, tal como dos secuencias génicas de una subunidad de FAS, que se originan en un gen de FAS de origen natural (preferentemente desprovisto de TE) y que tengan una secuencia de nucleótidos de TE (heteróloga) insertada (preferentemente (directamente) corriente arriba o corriente abajo de la ACP de la subunidad de la FAS que contiene la ACP, en la que opcionalmente una de dichas subunidades de FAS tiene al menos dos secuencias de nucleótidos que codifican la ACP (preferentemente en tándem), en las que una de dichas secuencias de nucleótidos que codifican la ACT se sustituye por una secuencia de nucleótidos que codifica una TE, en la que dichas (subunidad de) FAS, ACP y TE se detallan en otra parte en el presente documento. La célula hospedadora puede comprender múltiples subunidades de FAS, de forma que se produzcan S/MCFA, es decir, se proporcionan todos los dominios enzimáticos necesarios en las múltiples subunidades de FAS combinadas.

La célula hospedadora puede ser una célula de bacteriana, una célula fúngica (preferentemente una célula de levadura) o una célula de algas (preferentemente una célula de microalgas).

Preferentemente, la célula hospedadora es un organismo oleaginoso o un organismo unicelular, preferentemente un organismo oleaginoso unicelular. En realizaciones particulares, la célula hospedadora es una célula de levaduras, tal como una célula de levadura oleaginosa. En realizaciones particulares adicionales, el hospedador se selecciona de Saccharomycetes sp (por ejemplo, S. cerevisiae, por ejemplo, S. cerevisiae PWY12), Yarrowia sp. (por ejemplo, Y. lipolytica), Lipomyces sp. (por ejemplo, L. starkeyi), Synechococcus sp, Chlamydomonas sp. (por ejemplo, C. reinhardtii), Yarrowia sp. (por ejemplo, Y. lipolytica).

En determinadas realizaciones, la célula hospedadora es de la misma especie que la célula de la que se obtiene la (subunidad de) FAS de origen natural como se describe en el presente documento. En determinadas realizaciones, la célula hospedadora es de una especie distinta de la célula de la que se obtiene la (subunidad de) FAS de origen natural como se describe en el presente documento.

En el presente documento se desvela un procedimiento para la producción de una célula recombinante como se describe en el presente documento, que comprende la etapa de introducir el ácido polinucleico, el vector, o un ácido polinucleico que codifica el polipéptido de acuerdo con la invención como se describe en el presente documento, en una célula procariota o eucariota, preferentemente una célula procariota o eucariota como se describe en otra parte en el presente documento. Los procedimientos para introducir ácidos nucleicos o proteínas son conocidos en la técnica e incluyen, pero sin limitación, transformación, transfección, lipofección, electroporación, uso de cañón de genes, etc. Como se indica en otra parte en el presente documento, el ácido polinucleico o vector que se introduce en la célula hospedadora puede permanecer episómico (es decir, extracromosómico) o puede integrarse parcial o completamente en el genoma de la célula hospedadora (ya sea por integración dirigida al sitio o por integración aleatoria), y el polipéptido codificado puede expresarse de forma constitutiva, condicionada o inducible.

En el presente documento se desvela un procedimiento para la producción de una célula recombinante como se describe en el presente documento, que comprende las etapas de:

(i) proporcionar una célula procariota o eucariota como se define en el presente documento y que comprende un gen de una sintasa de ácidos grasos (FAS) o múltiples genes de una subunidad de FAS, preferentemente una (subunidad de) FAS como se define en otra parte en el presente documento, que tiene opcionalmente secuencias de nucleótidos que codifican al menos dos proteínas portadoras de acilo (a Cp , preferentemente ACP como se define en otra parte en el presente documento); y

(ii) introducir o insertar una secuencia de TE, o sustituir una de dichas secuencias de nucleótidos que codifican una ACP por una secuencia que codifica una TE, preferentemente una TE como se define en otra parte en el presente documento.

Este procedimiento puede implicar convenientemente el uso de tecnologías de inserción génica (knock-in), como se conoce en la técnica.

La invención en un aspecto adicional se refiere al uso de una célula procariota o eucariota recombinante de acuerdo con la invención, en la producción de ácidos grasos, tales como, en particular, ácidos grasos de cadena corta y/o cadena media.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a un procedimiento para la producción de ácidos grasos, tales como, en particular, ácidos grasos de cadena corta y/o cadena media, que comprende las etapas de:

(i) proporcionar una célula procariota o eucariota recombinante de acuerdo con la invención como se describe en el presente documento; y

Los procedimientos para el cultivo de la célula hospedadora como se describe en el presente documento son bien conocidos en la técnica. El experto en la materia comprenderá que los procedimientos de cultivo adecuados incluyen mantener la célula hospedadora viable y metabólicamente activa, y preferentemente permitir el crecimiento y/o la propagación de la célula hospedadora. Las condiciones de cultivo adecuadas incluyen condiciones que permiten la expresión del polipéptido (es decir, la FAS o el fragmento de FAS modificada, tal como la subunidad de FAS (por ejemplo, FAS1 y/o FAS2), o fragmentos de la misma) que está codificada por el ácido polinucleico de acuerdo con la invención como se describe en el presente documento. Las condiciones de cultivo adecuadas incluyen además la provisión de los ingredientes necesarios que permiten la producción de ácidos grasos, en particular, ácidos grasos de cadena corta y/o cadena media.

En determinadas realizaciones, el procedimiento para la producción de ácidos grasos como se describe en el presente documento, comprende además aislar y/o purificar los ácidos grasos. Como se usa en el presente documento, aislar y/o purificar incluye separar los ácidos grasos de las células hospedadoras, lo que puede realizarse mediante cualquier medio conocido en la técnica, tal como, por ejemplo, centrifugación, filtración, etc. Las etapas de purificación adicionales pueden incluir concentrar los ácidos grasos y/o eliminar las impurezas, así como el fraccionamiento de ácidos grasos. Los procedimientos de purificación adecuados incluyen, por ejemplo, CCF.

La invención, en un aspecto adicional, también proporciona un procedimiento para la producción de hidrocarburos (por ejemplo, hidrocarburos de cadena media o corta) que comprende realizar el procedimiento para la producción de ácidos grasos de acuerdo con la invención como se describe en el presente documento, que comprende además ya sea la reducción, hidrogenación, descarboxilación o descarbonilación de dicho ácido graso para producir alquenos o alcanos. Opcionalmente, dichos ácidos grasos pueden esterificarse antes de la hidrogenación para producir hidrocarburos, como se sabe en la técnica.

La invención, en un aspecto adicional, también proporciona un procedimiento para la producción de aldehídos grasos (por ejemplo, aldehídos grasos de cadena media o corta) que comprende realizar el procedimiento para la producción de ácidos grasos de acuerdo con la invención como se describe en el presente documento, que comprende además la reducción de dichos ácidos grasos a aldehídos grasos, como se sabe en la técnica.

La invención, en un aspecto adicional, también proporciona un procedimiento para la producción de alcoholes grasos (por ejemplo, alcoholes grasos de cadena media o corta) que comprende realizar el procedimiento para la producción de ácidos grasos de acuerdo con la invención como se describe en el presente documento, que comprende además reducir dichos ácidos grasos a aldehídos grasos, seguido por una etapa de alcohol deshidrogenasa para convertir dichos aldehídos grasos en alcoholes grasos, como se sabe en la técnica.

Las etapas de descarboxilación, hidrogenación, esterificación, reducción, se pueden realizar después de la producción de ácidos grasos, tal como, por ejemplo, después de la purificación de dichos ácidos grasos, pero alternativamente puede realizarse simultáneamente con la producción de dichos ácidos grasos, tal como, por ejemplo, mediante la introducción de una descarboxilasa, una reductasa de ácido carboxílico, una aldehído reductasa o una alcohol deshidrogenasa, descarbonilasa u otra enzima de interés adecuada en la célula hospedadora, o un ácido polinucleico que codifique una descarboxilasa, aldehído reductasa o alcohol deshidrogenasa, descarbonilasa u otra enzima de interés adecuada, mediante los medios descritos en otra parte en el presente documento. El experto comprenderá que puede utilizarse para obtener el producto final deseado otros medios y procedimientos conocidos en la técnica, tales como la inclusión de procedimientos no enzimáticos.

La divulgación anterior se describirá ahora con más detalle mediante los siguientes Ejemplos y Figuras no limitantes, en que las figuras muestran:

Ejemplo 1: A islam iento de los genes o ADNc que codifican la FAS.

Los sedimentos celulares recogidos de 1 ml de un caldo de cultivo de Rhodosporidium toruloides en medio YPD (extracto de levadura 10 g/l, peptona 20 g/l y glucosa 20 g/l) se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se reservaron a -70 °C. Se aisló el ARN total de aproximadamente 30-50 mg de muestras de células utilizando el kit FastRNA Pro Red Kit y el FastPrep Instrument (Qbiogen, Inc., Irvine, EE. UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante, y el ajuste del instrumento FastPrep fue de 6,0 m/s durante 60 s. La concentración y la calidad del ARN se determinaron mediante el espectrofotómetro Nanodrop ND1000 (ThermoFisher Scientific), mientras que la integridad del ARN se evaluó mediante electroforesis en gel de agarosa. El ADNc se sintetizó mediante el kit PrimeScript™ High Fidelity RT-PCR (Takara Bio Inc.). El ADN genómico de Saccharomyces cerevisiae y Aplanochytrium kerguelense se extrajo como se describe anteriormente (Burke, D., Dawson, D. y Stearns, T. (2000) Methods in yeast genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory course manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York). Se utilizaron cebadores específicos de genes (Tabla 3) para amplificar el marco abierto de lectura (ORF) de los genes de FAS.

Ejemplo 2: Construcción de plásmidos recombinantes que expresan FAS y sus mutantes.

Los fragmentos conteniendo los promotores y terminadores de genes de Saccharomyces cerevisiae se amplificaron a partir de ADN genómico de Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-11C (MATa Su C2 MAL2-8 ura3-52 his3-A1, amablemente proporcionado por P. Kotter, Universidad de Frankfurt, Alemania) o de plásmidos construidos anteriormente (Buijs, N. A., Zhou, Y. J., Siewers, V. y Nielsen, J. (2015) Long-chain alkane production by the yeast Saccharomyces cerevisiae, Biotechnol Bioeng. 112, 1275-1279). Y los plásmidos para la expresión del complejo de FAS en levadura se construyeron mediante el ensamblador de ADN (Shao, Z., Zhao, H. y Zhao, H. (2009) DNA assembler, an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways, Nucleic Acids Research. 37, e16. y Zhou, Y. J., Gao, W., Rong, Q., Jin, G., Chu, H., Liu, W., Yang, W., Zhu, Z., Li, G., Zhu, G., Huang, L. y Zhao, Z. K. (2012) Modular Pathway Engineering of Diterpenoid Synthases and the Mevalonic Acid Pathway for Miltiradiene Production, J Am Chem Soc. 134, 3234-3241.). Se utilizó un protocolo de PCR de extensión superpuesta que se describió anteriormente (Heckman KL, Pease LR. 2007. Gene splicing and mutagenesis by PCR-driven overlap extension. Nat. Protoc. 2: 924-932.) para fusionar múltiples fragmentos de ADN. Los cebadores y los moldes de cada una de las reacciones de PCR se enumeran en la Tabla 4. Se utilizó un vector pYX212 de 2 p de levadura que contenía un marcador de selección URA3 y se linealizó mediante digestión con las enzimas de restricción Sphl y EcoRI. Estos fragmentos (enumerados en la Tabla 4) acompañados del vector linealizado se transformaron en Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-11C y seleccionaron en placas de SC-URA (base nitrogenada de levadura 6,7 g/l sin aminoácidos (ForMedium, Norfolk, RU), mezcla de complemento completo 0,77 g/l sin uracilo (ForMedium, Norfolk, RU), glucosa 20 g/l). Los plásmidos se extrajeron de los transformantes utilizando el kit yeast plasmid miniprep II kit de Zymoprep (Zymo Research, Orange, CA), y después se transformaron en células competentes E. coliDH5a. Las colonias de E. coli cultivadas en placas de agar Luria-Bertani (LB) con ampicilina se tomaron y cultivaron para el aislamiento del plásmido. Los plásmidos extraídos de E. coli se digirieron con enzimas de restricción para calcular la fidelidad del ensamblaje. Los casetes de expresión de FAS se ilustraron en la Fig. 2

Tabla 3. Cebadores utilizados para la construcción de plásmidos que expresan FAS

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Tabla 4. Fragmentos de PCR utilizados para el ensamblaje de plásmidos que expresan los genes o los ORF de FAS

(continuación)

(continuación)

Ejemplo 3: Verificación de la función de los genes de FAS.

Los plásmidos recombinantes que expresan genes o las ORF que codifican FAS se transformaron en la cepa deficiente en FAS PWY12 (MATaura3 leu2his3 trp l canl Afas1::HIS3 AAas2::LEU2, Wenz, P., Schwank, S., Hoja, U. ySchuller, H.-J. (2001) A downstream regulatory element located within the coding sequence mediates autoregulated expression of the yeast fatty acid synthase gene FAS2 by the FAS1 gene product, Nucleic Acids Research. 29, 4625-4632.) mediante un procedimiento de acetato de litio/ADN portador monocatenario/polietilenglicol (Daniel Gietz, R. y Woods, R. A. (2002) Transformaron of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method, Methods Enzymol. 350, 87-96.). Se complementaron en el medio si era necesario ácido palmítico 0,5 mM y ácido esteárico 0,5 mM (solución madre 5 mM en TWEEN 80/etanol = 1:1). El medio YPD con ácidos grasos se utilizó para cultivar PWY12 para la transformación, los transformantes se seleccionaron en placas de medio SC-URA+AG (base nitrogenada de levadura 6,7 g/l sin aminoácidos, mezcla de complemento completo 0,77 g/l sin uracilo, glucosa 20 g/l, conteniendo ácidos grasos). Se inocularon colonias individuales en medio "SC-URA+AG" para amplificar las células durante 24 a 36 horas, a continuación, las células se centrifugaron y lavaron dos veces con agua esterilizada y se cultivaron en medio "SC-URA" durante 24 horas para eliminar los residuos de ácidos grasos. Después de esto, las células se sembraron en estrías sobre placas de "SC-URA" o "SC-URA+AG" para probar la recuperación del autótrofo de ácido graso. El resultado de la prueba de complemento se muestra en la Fig. 3.

Ejemplo 4: Producción de ácidos grasos de cadena corta/media de FAS recombinante

Se precultivaron transformantes recombinantes de Saccharomyces cerevisiae PWY12 que expresan genes u ORF de FAS en 2 ml de medio Delft (Jensen, N. B., Strucko, T., Kildegaard, K. R., David, F., Maury, J., Mortensen, U. H., Forster, J., Nielsen, J. y Borodina, I. (2014) EasyClone: method for iterative chromosomal integration of multiple genes Saccharomyces cerevisiae, FEMS Yeast Res. 14, 238-248.) con triptófano 100 mg/l durante una noche. Las células se inocularon en 20 ml de medio "Delft+Trp" en un matraz Erlenmeyer de 100 ml para lograr una densidad óptica inicial (DO a 600 nm) de 0,1. Después del cultivo durante 48 horas, se tomaron 4 ml de caldo de cultivo para el análisis de los ácidos grasos extracelulares, los sedimentos de las células restantes se recogieron por centrifugación, se lavaron una vez con agua Millipore-Q y se liofilizaron para medir los ácidos grasos totales intracelulares. Se desarrolló un procedimiento modificado para la extracción y esterificación de S/MCFA extracelulares. En resumen, se añadieron 0,5 ml de NaCl al 10 % (p/v), 0,5 ml de acetato glacial (que contenía 10 ug de ácido Heptanoico y 10 ug de ácido Pentadecanoico como patrones internos) y 2 ml de cloroformo/metanol 1:1 (v/v) a 4 ml de caldo de cultivo en tubos de extracción (tubos de cultivo PYREX® de 16x100 mm) y tapón roscado GPI 15-415, Corning Inc., EE.UU). Después de agitar vorticialmente a 1800 rpm durante 30 min, las mezclas se centrifugaron a 3000 rpm durante al menos 10 min y la fase inferior de cloroformo se transfirió a un tubo de extracción limpio mediante una jeringuilla de vidrio. Los ésteres metílicos de ácidos grasos (los FAME, forma siglada de fatty acid methyl esters) se generaron mezclando 1 ml de trifluoruro de boro/metanol (14%, p/p, Sigma-Aldrich) con 200 ul de extracto de cloroformo y esterificación a temperatura ambiente durante una noche. Esto se basa en la esterificación efectiva y rápida de ácidos grasos libres mediante trifluoruro de boro/metanol (Mitchell, J., Smith, D. M. y Bryant, W. M. D. (1940) Analytical Procedures Employing Karl Fischer Reagent. 1 III. The Determination of Organic Acids, J Am Chem Soc. 62, 4-6.). Los FAME se extrajeron añadiendo 1 ml de H2O y 600 ul de hexano, agitando vorticialmente a 1500 rpm durante 10 min y centrifugación a 1000 g durante 10 min. Se analizaron 200 ul extraídos de la fase de hexano mediante GC/MS. Los ácidos grasos totales intracelulares se extrajeron y esterificaron mediante un procedimiento descrito anteriormente con modificaciones menores (Khoomrung, S., Chumnanpuen, P., Jansa-ard, S., Nookaew, I. & Nielsen, J. (2012) Fast and accurate preparation fatty acid methyl esters by microwave-assisted derivatization in the yeast Saccharomyces cerevisiae, Appl Microbiol Biotechnol. 94, 1637-1646.). El ácido heptanoico y el ácido pentadecanoico se utilizaron como patrones internos y se utilizó 1 ml de hexano para la extracción.

Los FAME extraídos se analizaron mediante un sistema de GC-MS de cuadrupolo individual Thermo Scientific ISQ (Thermo Fisher Scientific Inc., EE. UU.) utilizando una columna ZB-WAX (30 m * 0,25 mm * 0,15 um, Phenomenex Inc., RU) y helio como gas vehículo (3 ml/min). Se inyectaron muestras de 1 ul (sin división, 240 °C) y la temperatura del horno se fijó a 30 °C durante 2 min; se aumentó a 150 °C a una velocidad de aumento de 40 °C/min, se mantiene durante 2 minutos; se aumentó a 250 °C a una velocidad de aumento de 10 °C/min, se mantiene durante 3 min. Las identidades de los compuestos se asignaron por comparación con patrones comerciales y la base de datos de espectros de masas del NIST. La cuantificación de los FAME se basó en las curvas de calibración de cada patrón individual, y se utilizó para la cuantificación el área de iones específicos (m/z de 87 para los FAME saturados y m/z de 74 para los FAME monoenoicos). La concentración de a G se normalizó con la de los patrones internos. El cromatograma semicuantitativo se muestra en la Fig. 4. Los títulos de los S/MCFA extracelulares se muestran en las Fig. 5, 7 y 8, y la composición de AG intracelulares se enumera en la Fig. 6.

Ejemplo 5: Expresión integrativa de la FAS con contenido de TE

Las regiones corriente arriba y abajo (aproximadamente 500 pb) que flanquean el gen URA3 se amplificaron a partir del genoma de S. cerevisae y se utilizaron para la integración de los genes de FAS en el locus URA3. El casete del gen de resistencia a G418 KanMX se amplificó a partir de pUG6 (Gueldener, U., Heinisch, J., Koehler, G. J., Voss, D. y Hegemann, J. H. (2002) A second set of loxP marker cassettes for Cre-mediated multiple gene knockouts in budding yeast, Nucleic Acids Res. 30, e23.). Se amplificaron los casetes de expresión para los genes de FAS de S. cerevisiae de tipo silvestre e híbridos a partir de los plásmidos pScFAS-WT y pScFAS-ACP-TE, respectivamente, como se describe en el Ejemplo 2. Los fragmentos de PCR enumerados en la Tabla 5 se utilizaron para transformar YJZ02 (MATa SUC2 MAL2-8c ura3-52 his3-A1 pox1A), la cepa isogénica procedente de S. cerevisiae CEN.PK113-11C mediante la deleción del gen POX1 que codifica el gen de la acil-CoA oxidasa peroxisómica, la enzima responsable de la p-oxidación de ácidos grasos. Los transformantes se seleccionaron en placas de "YPD+G418" (medio YPD que contenía G418 200 mg/l) y se verificaron mediante PCR de colonias utilizando las parejas de cebadores ID-dURA3-UP/ScFAS2-R1, ScFAS2-F1/ ScFAS1-F1, y ScFAS1-R1/ ID-dURA3-DOWN (Looke M, Kristjuhan K, Kristjuhan A: Extraction of genomic DNA from yeasts for PCR-based applications. BioTechniques 2011, 50(5):325-328.). Los transformantes correctos con la FAS integrada se precultivaron en 2 ml de medio "Delft+His+Ura" (medio Delft con histidina 100 mg/l y Uracilo 100 mg/l) durante una noche y después, las células se inocularon en 20 ml de medio "Delft+His+Ura" en un matraz Erlenmeyer de 100 ml, para lograr una densidad óptica inicial (DO a 600 nm) de 0,1. Después del cultivo durante 48 horas, se tomaron 4 ml de caldo de cultivo para el análisis de los ácidos grasos extracelulares como se describe anteriormente. Los títulos de S. cerevisiae que expresaba FAS de forma integrativa se muestran en la Fig. 9.

Tabla 5. Fragmentos de PCR utilizados para la expresión integrativa de plásmidos que expresan los genes o los ORF de FAS

Ejemplo 6: Reescritura de las ácido graso sintasas fúngicas para la producción química elaborada medida

Materiales y procedimientos

Plásmidos, cepas y condiciones de cultivo

Todos los plásmidos se construyeron mediante kits de clonación TA (Takara Bio, Dalian, China), procedimiento 25 de ligamiento/digestión con enzimas restricción, procedimiento 26 sin restricción, kits de clonación de Gibson assembly (New England Biolabs, MA, EE. UU.) o ensamblador de ADN. Para la amplificación de plásmidos se utilizó E. coli DH5a y para la expresión de proteínas recombinantes se utilizó E. coli BL21 (DE3). Si no se especifica, la E. coli se cultivó en medio Luria-Bertani (LB) complementado con cantidades apropiadas de antibióticos si fuera necesario (ampicilina 100 mg/l y/o kanamicina 50 mg/l), a 37 °C y 200 rpm. Las cepas de S. cerevisiae BY4741 (MATa his3A1 leu2A0 met15A0 ura3A0) o YJZ029 (MATa SUC2 MAL2-8c his3A1 ura3-52 Apox1) procedentes de CEN PK113-11C (MATa SUC2 MAL2-8c his3A1 ura3-52) se utilizaron para el ensamblaje de plásmidos in vivo. Para la prueba de complementación se utilizó S. cerevisiae PWY1229 (MATa ura3 leu2 his3 trp1 can1 Afas1::HIS3 Afas2::LEU2). Las cepas PWY12 y YJZ02 se utilizaron como hospedadoras para la producción de S/CMFA. Para el cultivo regular de cepas de levadura se utilizó medio "YPD" (extracto de levadura 10 g/l, peptona 20 g/l y glucosa 20 g/l). Para la selección de transformantes con casetes de kanMX se utilizó "YPD+G418" que contenía 200 mg/l de G418 (Formedium). Para la selección de transformantes prototróficos para uracilo se utilizó medio "SC-URA" que contenía glucosa 20 g/l, base nitrogenada de levadura 6,7 g/l sin aminoácidos (YNB, Formedium) y mezcla de suplemento completo 0,77 g/l sin uracilo (CSM-URA, Formedium). Para el cultivo de la cepa PWY12, se añadieron al medio ácidos grasos (solución madre 100X que contenía ácido esteárico 50 mM y ácido palmítico 50 mM disueltos en Tween 80/etanol (1:1, v/v)). Se añadió agar 20 g/l en medio sólido. Las células de levadura se cultivaron a 30 °C y 200 rpm en medio líquido. La densidad celular (DO600) se midió con un espectrofotómetro GENESYS 20 (Thermo Scientific).

Clonación del ADNc de RtFAS

El ARN total de R. toruloides se extrajo como se describió anteriormente. El ADNc se sintetizó mediante el kit PrimeScript High Fidelity RT-PCR (Takara Bio, Dalian, China). El RtFAS1 se amplificó a partir del ADNc utilizando los cebadores FAS1-L1/FAS1-R1, y se amplificaron tres fragmentos de RtFAS2 utilizando los cebadores FAS2-69F/FAS2-3021R, FAS2-2660F/FAS2-4529R y fAs 2-4304F/FAS2-8881R, respectivamente. Todos estos fragmentos de ADNc se insertaron en el vector pMD19-T (Takara Bio, Dalian, China) mediante clonación de TA y se verificaron mediante secuenciación de ADN.

Expresión y purificación de los dominios discretos de ACP y PPT de RtFAS

El mutante S1062A de RtACPI (mRtACPI) y el mutante S1253A de RtACPIl (mRtACPIl) se generaron mediante el procedimiento 30 basado en PCR. Se utilizó pMD19T-RtFAS2 (2660-4529) como molde y se utilizaron los cebadores S1062A-F/S1062A-R y S1253A-F/S1253A-R para la mutación dirigida de RtACPI y RtACPIl, respectivamente. Las parejas de cebadores 41-GST-ACPI-F/41-GST-ACPI-R, 41-GST-ACPII-F/41-GST-ACPN-R y 41-GST-PPT-F/41-GSTPPT-R se utilizaron para amplificar los fragmentos de RtACPI, RtACPIl y RtPPT, que se insertaron en el vector pET-41(a) (Novagen) mediante la clonación sin restricción como se describe anteriormente.

4 ml de cultivos de una noche de E. coli BL21 (DE3) con plásmidos (que expresaban GST-wRtACPI, GST-wRtACPII, GST-mRtACPI, GST-mRtACPII o GST-RtPPT) se inocularon en 400 ml de medio Terrific Broth (TB) (12 g de triptona, 24 g de extracto de levadura, 4 ml de glicerol, 2,31 g de KH2PO4 y 12,54 g de K2HPO4 por litro), complementado con kanamicina 50 pg/ml y cultivado a 37 °C. Se añadió IPTG 1 mM a los cultivos cuando la DO600 fue de aproximadamente 0,8 y a continuación se cultivaron las células a 20 °C durante 24 horas. Las células se recogieron mediante centrifugación y se suspendieron 4 g de masa húmeda en 24 ml de tampón NBP (Na2HPO4/NaH2PO4 50 mM, pH 8,0, NaCl 0,5 M, 2-mercaptoetanol 1 mM, PMSF 1 mM) complementado con imidazol 20 mM y lisozima 1 mg/ml. La suspensión se mantuvo en hielo durante 30 min y a continuación se rompió mediante tratamiento con ultrasonidos. Se utilizó centrifugación (12000 rpm a 4°C durante 20 min) para eliminar los restos celulares. El sobrenadante se mezcló con agarosa Ni-NTA (Life Techologies) y se equilibró durante 15 min en hielo. A continuación, la resina se lavó de forma secuencial con tampón NBP con imidazol 20, 40, 60 y 80 mM y se eluyó con tampón NBP que contenía imidazol 250 mM. Las proteínas eluidas se concentraron con Ultra-15 Centrifugal Filter Units (MWCO 10 kDa, Millipore) y el tampón se cambió a tampón de reacción de fosfopanteteinilación (Tri-Cl 20 mM, pH 7,5, NaCl 10 mM, KCI 100 mM, MgCl2 5 mM, CaCl2 10 mM, 2-mercaptoetanol 1 mM, DTT 0,5 mM, glicerol al 15%), a continuación, las proteínas se almacenaron a -20 °C.

Fosfopanteteinilación in vitro de ACP.

Se incubaron tubos de 200 pl conteniendo 20 pl de mezcla de reacción (20 pg de GST-RtACP, 2 pg de GST-RtPPT y CoA 0,3 mM en el tampón de reacción de fosfopanteteinilación) a 30 °C durante 3 horas en un termociclador (Eppendorf, Alemania). Los productos de reacción se almacenaron a -20 °C antes de analizarlos con un espectrómetro de masas MALDI-TOF/TOF 5800 (Applied Biosystems, Framingham, MA, EE. UU.) en un modo lineal positivo. El instrumento estaba equipado con un láser Nd:YAG a 355 nm con una frecuencia de repetición de 400 Hz. El intervalo de energía láser se optimizó para obtener una buena relación señal-ruido (S/R). La calibración de masa externa se realizó utilizando proteínas patrón. Para el análisis de proteínas, la muestra se depositó sobre la diana MALDI y a continuación se añadió 1 pl de solución de matriz (ácido sinapínico a 20 mg/ml en ACN al 50 % que contenía TFA al 0,1 %) para el análisis de MS. De manera alternativa, se añadieron 2,5 pl de enterocinasa (1 U, Sangon Biotech, Shanghai, China) a 10 pl de la mezcla de reacción y se incubó a 25 °C durante 16 horas. Las proteínas escindidas se analizaron mediante Tricina-SDS-PAGE al 16 % (acrilamida: bisacriamida = 29:1)31.

Expresión y purificación del complejo de RtFAS y sus mutantes

Los genes de RtFAS se ensamblaron en S. cerevisiae BY4741 mediante el procedimiento descrito, y se utilizó como estructura principal el vector episómico pYX212 de 2 p. Se amplificó el ORF completo de RtFAS1 mediante la pareja de cebadores FAS1-5-NdeI/FAS1-3-EcoRI. El fragmento se digirió con Ndel/EcoRI y se insertó en pET22b(+) (Novagen) para generar pET22b-RtFAS1. Los ORF completos de RtFAS2 y sus dos mutantes (S1062A o S1253A) se amplificaron mediante la pareja de cebadores FAS2-5-Hindlll/FAS2-3-Notl, se digirió con Hindlll/Notl y se insertó en pET24b(+) (Novagen) para generar pET24b-RtFAS2, respectivamente, pET24b-RtFAS2 (S1062A) y pET24b-RtFAS2 (S1253A). Los plásmidos para la expresión de RtFAS1 y RtFAS2 se transformaron simultáneamente en E. coli BL21(DE3) y se seleccionaron en placas de LB con ampicilina 100 mg/l y kanamicina 50 mg/l. La purificación de los complejos de RtFAS se describió anteriormente 17, 22, y se pudo obtener un complejo proteico considerablemente homogéneo mediante una purificación en tres etapas (precipitación con sulfato de amonio, centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa y cromatografía de intercambio aniónico). La actividad de la ácido graso sintasa se sometió a ensayo controlando la oxidación de NADPH dependiente de malonil-CoA y acetil-CoA. El ensayo se realizó a temperatura ambiente (aproximadamente a 25 °C) y en una cubeta de cuarzo de 200 pl que contenía fosfato de potasio 0,1 M (pH 7,0), 5 mM de DTT, acetil-CoA 12,5 pM, malonil-CoA 50 pM, NADPH 75 pM y aproximadamente 10 pg de enzimas purificadas. No hubo una disminución visible en la absorción a 340 nm cuando se controló la reacción del blanco sin malonil-CoA. Y la actividad (1 U) se definió como el recambio de 1 pmol de NADPH por minuto.

Construcción de plásmidos y manipulación genética.

La RtFAS1 y RtFAS2 se amplificaron respectivamente a partir de pET22b-RtFAS1 y pET24b-RtFAS2. Mientras que AkFAS se amplificó a partir del ADN genómico de A. kerguelense. Los genes de ScFAS1 y ScFAS2, los fragmentos del promotor y del terminador, se amplificaron del ADN genómico de S. cerevisiae. Se utilizó el origen de 2 p de pYX212 como elemento de replicación, y se utilizó ScURA3 de pYX212 o KIURA3 de pWJ104232 como marcadores de selección. Los genes con codones optimizados (AcTesA, ShMKS1 y ShMKS2, tabla complementaria S7) los sintetizó Genscript. Y todos estos plásmidos se transformaron en la cepa PWY12 deficiente en FAS y se analizó su complementación con el auxótrofo de ácidos grasos de PWY12. Tras la transformación, se utilizaron placas de "SC-URA+AG" para la selección de transformantes. Se inocularon colonias individuales en medio líquido "SC-URA+AG" para amplificar las células durante 24 a 36 horas, a continuación, las células se centrifugaron y lavaron, y se cultivaron en medio líquido "SC-URA" durante 24 horas para eliminar los residuos de ácidos grasos. Después de esto, las células se sembraron en estrías sobre placas de "SC-URA" y "SC-URA+AG", o se inocularon en medio líquido "SC-URA" para probar la recuperación del autótrofo de ácido graso. El vector vacío (pYX212) portando PWY12 no creció en medio "SC-URA". La integración de los casetes de expresión de FAS también se hizo de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente. Se utilizaron brazos de homología de aproximadamente 500 pb corriente arriba y corriente abajo del locus ura3-52, y el marcador de selección KanMX de pUG633. Las ScFAS01, ScFAS27, ScFAS15 y ScFAS28 se integraron en el locus ura3-52 de YJZ02 para generar la cepa ZW201, ZW202, ZW206 y ZW207, respectivamente. El plásmido pZWM1-AcTesA se construyó mediante Gibson assembly para la expresión episómica de 'AcTesA.

Extracción y cuantificación de metabolitos

Antes de la extracción de metabolitos, las células se cultivaron en matraces de agitación de 100 ml con 20 ml de medio Delft complementado con los componentes necesarios (uracilo 100 mg/l, histidina 100 mg/l y/o triptófano 100 mg/l) durante 48 horas, si no se especifica. La densidad óptica inicial (DO a 600 nm) fue de 0,1. Los S/MCFA extracelulares se extrajeron y esterificaron mediante el procedimiento 10 descrito anteriormente, con modificaciones. En resumen, se añadieron 0,5 ml de NaCl al 10 % (p/v), 0,5 ml de acetato glacial (que contenía 10 pg de ácido heptanoico y 10 pg de ácido pentadecanoico como patrones internos) y 2 ml de cloroformo/metanol 1:1 (v/v) a 4 ml de caldo de cultivo en tubos de extracción (tubos de cultivo PYREX® de 16x100 mm) y tapón roscado GPI 15-415, Corning Inc., EE.UU). Después de agitar vorticialmente a 1800 rpm durante 30 min, las mezclas se centrifugaron a 3000 rpm durante 10 min y la fase inferior de cloroformo se transfirió a un tubo de extracción limpio mediante una jeringuilla de vidrio. Se generaron ésteres metílicos de ácidos grasos (los FAME) mezclando 1 ml de trifluoruro de boro/metanol (14 %, Sigma-Aldrich) con 200 pl de extracto de cloroformo y esterificación a temperatura ambiente durante una noche. Esto se basó en la esterificación efectiva y rápida de ácidos grasos libres mediante trifluoruro de boro/metanol35. A continuación se extrajeron los FAME añadiendo 1 ml de H2O y 600 pl de hexano, agitando vorticialmente a 1500 rpm durante 10 min y centrifugación a 1000 g durante 10 min. Se analizaron 200 pl extraídos de la fase de hexano mediante GC/MS. Para las cepas de alta producción de S/MCFA (ZW201, ZW202, zW206 y ZW207), se utilizó 1 ml de caldo de cultivo diluido en 3 ml de H2O Milli-Q.

Los ácidos grasos totales intracelulares (en forma de los FAME) se extrajeron después de esterificación ayudada con microondas de la biomasa de levaduras de acuerdo con un procedimiento descrito anteriormente, con modificaciones menores. Se añadieron 1 ml de hexano, 2 ml de trifluoruro de boro/metanol (14 %, Sigma-Aldrich), 10 pg de ácido heptanoico y 10 pg de ácido pentadecanoico a 10 mg de biomasa liofilizada para la derivatización los ácidos grasos totales, después de la esterificación ayudada con microondas, se tomaron para el análisis por GC/MS los FAME de la fase superior de hexano. Los FAME de cadena corta/media extraídos se analizaron mediante un sistema de espectrómetro de masas de cuadrupolo individual GC/ISQ FOCUS (Thermo Fisher Scientific Inc., EE. UU.) utilizando una columna ZB-50 (30 m * 0,25 mm * 0,25 um, Phenomenex Inc., RU). Se utilizó helio como gas vehículo (3 ml/min). Se inyectaron muestras de 1 pl (sin división, 240 °C) y la temperatura del horno se fijó a 30 °C durante 2 min; se aumentó a 150 °C con una velocidad de aumento de 40 °C/min, se mantuvo durante 2 min; se aumentó a 250 °C con una velocidad de aumento de 10 °C/min, se mantuvo durante 3 min. Para FAME de cadena larga, sin embargo, se utilizó una columna ZB-WAX (30 m x 0,25 mm x 0,25 um, Phenomenex Inc., RU), y la temperatura inicial del horno fue de 50 °C. La temperatura de la línea de transferencia de MS y la fuente de iones se ajustó a 250 °C y 200 °C, respectivamente. Los iones de fragmentos procedentes de la ionización de electrones (70 eV) se detectaron en un modo de exploración completa (50-450 m/z) y en un modo de control de iones seleccionado (74 m/z). Para la cuantificación de los FAME se utilizó el área del ion específico (m/z de 74).

Resultados

El complejo de FAS tipo I fúngica es una partícula hueca en forma de barril separada por una rueda central en el ecuador para formar dos cámaras de reacción (Fig. 11b). Los FAS fúngicos están codificados por uno o dos polipéptidos y normalmente contienen siete dominios enzimáticos catalíticos y un dominio de ACP que actúa como cofactor proteico (Fig. 11b y 11c). La ACP se activa por la unión catalizada por la fosfopanteteinil transferasa (PPT) de un grupo prostético de fosfopanteteína, que proporciona un grupo tiol para unir la cadena de acilo graso en crecimiento. Los dominios de ACP están ubicados dentro de las cámaras compartimentadas y están conectados por dos engarces flexibles que están anclados a la pared de la cámara y la rueda central (Fig 11b). La ACP que lleva carga de acilo interactúa dinámicamente con otros dominios catalíticos para completar el ciclo de reacción completo. Como la ACP y sus engarces adyacentes son móviles en las cámaras de reacción huecas, los inventores especulan que estas regiones flexibles podrían modificarse fácilmente y, por lo tanto, podría integrarse en la FAS una enzima heteróloga que utiliza acil-ACP como sustrato para crear una nueva maquinaria de FAS sintética que pueda producir diversos ácidos grasos y productos químicos derivados de ácidos grasos (Fig. 11b y 11c). La anotación genómica previa de levadura oleaginosa Rhodosporidium toruloides reveló una FAS especial que es distinta de las FAS de otras especies fúngicas de acuerdo con su arquitectura de dominios proteicos (Fig. 11a). Sin embargo, la FAS de R. toruloides (RtFAS) se ensambla en la estructura típica de FAS fúngica revelada por análisis de crio-ME. De forma más interesante, la RtFAS contiene dos supuestos dominios de ACP muy similares entre sí (el alineamiento de secuencias se realizó de dominios de ACP de FAS fúngicas. Las secuencias incluyen ScACP de Fas2 de S. cerevisiae (número de referencia de Genbank, P19097.2), CnACP de Fas1 de C. neoformans (número de referencia de Genbank, XP_571100.1), UmACP de Fas de U. maydis (número de referencia de Genbank, XP_759118.1), AkACPI y AkACPII de Fas de A. kerguelense (ID de proteína de JGI, 103951), PgACP de Fas2 de P. graminis (número de referencia de Genbank, XP_003889657.1), RtACPI y RtACPII de Fas2 de R. toruloides (número de referencia de Genbank, EMS21268.1), CrACP de Fas de C. reversa (ID de proteína de JGI, 10860); datos no mostrados).

Los inventores descubrieron que ambas ACP podían fosfopanteteinilarse in vitro mediante la PPT análoga de RtFAS, cuando se utilizaron dominios discretos de ACP y PPT (como proteínas de fusión con GST purificadas). Además, se demostró que la fosfopanteteinilación de las ACP era dependiente de la coenzima A, la enzima PPT y el resto de serina conservado en el sitio de unión de la fosfopanteteína (Fig. 12 y Tabla 6).

Tabla 6. Determinación del peso molecular de las ACP mediante espectrometría de masas MOLDI-TOF. El peso molecular de las ACP aumenta en 340 Da durante la fosfopanteteinilación.

PM medido (Da)

Proteína PM teórico (Da) AM (Da) No tratado mediante PPT Tratado mediante PPT

GST-mACPI 49515 49508 49510 2

GST-wACPI 49531 49519 49851 332 GST-mACPII 49417 49465 49419 46 GST-wACPII 49433 49476 49798 322

Los inventores han establecido los protocolos de purificación del complejo de RtFAS recombinante en E. coli, a partir del cual se pudo obtener un complejo de FAS estable y activo mediante precipitación en serie con (NH4)2SO4, ultracentrifugación en gradiente de densidad de sacarosa y cromatografía de intercambio aniónico de DEAE-sefarosa. Para investigar los papeles de los ACP duplicados en la síntesis de ácidos grasos, se mutaron a restos de alanina los restos de serina conservados en los sitios de unión de fosfopanteteína de cualquiera de las ACP. Los ensayos enzimáticos de los complejos de FAS purificados mediante el control de la oxidación de NADPH mostraron que ambos mutantes (S1062A y S1253A) tenían una actividad de síntesis de ácidos grasos comparable a la del tipo silvestre (Fig. 13). Sistemáticamente, la complementación de Saccharomyces cerevisiae PWY12 conteniendo la deleción de ScFASI y ScFAS2 con la RtFAS de tipo silvestre (RtFAS01) y las versiones mutadas de RtFAS (S1062A, RtFAS02 y S1253A, RtFAS03, Fig 14a y 14b), y casi la misma cantidad de ácidos grasos producidos por los mutantes (RtFAS02 y RtFAS03) en comparación con el RtFAS01 de tipo silvestre (Fig 14b y Tabla 7), indicó que ambas ACP desempeñaron papeles similares en la síntesis de ácidos grasos y que una única ACP era suficiente para la actividad de la RtFAS.

Tabla 7. Ácidos grasos totales intracelulares producidos por PWY12 que expresa RtFAS y sus mutantes.

Además, los inventores descubrieron algunas FAS fúngicas de diversos clados filogenéticos que contienen ACP duplicadas. De forma similar, la FAS de Aplanochytrium kerguelense (AkFAS01) codificada por un único polipéptido y sus dos mutantes AkFAS02 (S2150A) y AkFAS03 (S2340A) que albergan una ACP activa se expresaron respectivamente en S. cerevisiae PWY12 (Fig. 14a). Además, se demostró que una única ACP en AkFAS era suficiente para la síntesis de ácidos grasos (Fig. 14c).

Después de demostrar los papeles redundantes de las ACP duplicados en las FAS de tipo I fúngicas, los inventores sopesaron reemplazar las ACP en RtFAS y AkFAS por una acil-ACP tioesterasa de cadena corta (sTE) para hidrolizar intermedios de acil-ACP y producir S/m CfA, que son precursores de muchos productos químicos industriales y también están asociados con la propiedad mejorada de los biocombustibles. Se insertó en las FAS una tioesterasa independiente ('AcTesA) de Acinetobacter baylyi que prefiere producir S/MCFA23 (Fig. 15a). De acuerdo con las estructuras de las FAS fúngicas, la sTE integrada se localizaría en las cámaras de reacción y accedería fácilmente a los sustratos de acil-ACP. A partir de la prueba de complementación, los inventores descubrieron que la FAS con contenido de sTE (RtFAS04, RtFAS05, AkFAS04 y AkFAS05) podían sintetizar ácidos grasos esenciales para

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una célula procariota o eucariota recombinante que comprende o que expresa una ácido graso sintasa (FAS) fúngica y una tioesterasa (TE), en la que dicha FAS comprende opcionalmente FAS1 y FAS2, en la que dicha TE y dicha fAs , FAS1 o FAS2 están codificadas como un único marco abierto de lectura (o Rf ).

2. La célula procariota o eucariota recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, en la que una secuencia de ácido polinucleico que codifica dicha TE está adyacente a una secuencia de ácido polinucleico que codifica una proteína transportadora de acilos (ACP).

3. La célula procariota o eucariota recombinante de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que comprende una secuencia que codifica la FAS o que comprende una secuencia que codifica FAS1 y FAS2 que se origina a partir de un gen de FAS que tiene al menos dos secuencias de nucleótidos que codifican la ACP, en la que una de dichas secuencias de nucleótidos que codifican la ACP se sustituye por una secuencia de nucleótidos que codifica una TE.

4. La célula procariota o eucariota recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha FAS es de Saccharomyces cerevisiae, Rhodosporidium toruloides o Aplanochytrium kerguelense.

5. La célula procariota o eucariota recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicha TE es una acil-CoA/ACP TE, preferentemente una acil-CoA/ACP TE de cadena corta o media.

6. La célula procariota o eucariota recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que es una célula bacteriana, una célula fúngica o una célula de alga.

7. Un ácido polinucleico recombinante que codifica una ácido graso sintasa (FAS) fúngica o una subunidad FAS1 o FAS2 de la misma, y a una tioesterasa (TE).

8. Un polipéptido recombinante codificado por el ácido polinucleico recombinante de acuerdo con la reivindicación 7.

9. Un vector recombinante que comprende el ácido polinucleico recombinante de acuerdo con la reivindicación 7 o un ácido polinucleico que codifica el polipéptido recombinante de acuerdo con la reivindicación 8.

10. Uso de la célula recombinante procariota o eucariota de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la producción de ácidos grasos, hidrocarburos, aldehídos grasos o alcoholes grasos.

11. Un procedimiento para la producción de ácidos grasos, que comprende las etapas de

(i) proporcionar la célula procariota o eucariota recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6; y

12. Procedimiento para la producción de hidrocarburos, tales como hidrocarburos de cadena media o hidrocarburos de cadena corta, que comprende realizar el procedimiento para la producción de ácidos grasos de acuerdo con la reivindicación 11, que comprende además la reducción, hidrogenación, descarboxilación o descarbonilación de dichos ácidos grasos.

13. Procedimiento para la producción de alcoholes grasos o aldehídos grasos, tales como alcoholes o aldehídos grasos de cadena media o alcoholes o aldehídos grasos de cadena corta, que comprende realizar el procedimiento para la producción de ácidos grasos de acuerdo con la reivindicación 11, que comprende además la reducción de dichos ácidos grasos.

14. Uso de acuerdo con la reivindicación 10 o procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12 o 13, en el que dichos ácidos grasos son ácidos grasos de cadena corta (SCFA) o ácidos grasos de cadena media (MCFA), preferentemente ácidos grasos C6-C12.