ES2839456T3 - Proteína 2 que contiene el dominio del esperma móvil y del cáncer - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo anti-Proteína 2 que contiene el dominio espermático móvil (MOSPD2) o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer, en donde MOSPD2 es expresado por dicho cáncer.

Description

DESCRIPCIÓN
Proteína 2 que contiene el dominio del esperma móvil y del cáncer
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un anticuerpo de Proteína 2 que contiene el dominio del anti-esperma móvil (MOSPD2) o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer, en donde MOSPD2 se expresa por dicho cáncer, o para su uso en el tratamiento, prevención o reducción de la incidencia de metástasis de una célula cancerosa, en donde MOSPD2 se expresa por dicha célula cancerosa. En este contexto, la invención se refiere al tratamiento, prevención, o reducción de la incidencia de cáncer y metástasis. El tratamiento o la prevención del cáncer puede incluir, por ejemplo, el tratamiento, la prevención o la reducción de la incidencia del cáncer mediante la regulación de la migración de macrófagos asociados a tumores (TAMs).
Antecedentes de la invención
La metástasis, la diseminación de las células cancerosas desde su tejido de origen a otros órganos, es el resultado de un proceso de varias etapas que involucra una serie de moléculas. La evidencia sugiere que las quimioquinas y los receptores de quimioquinas juegan un papel importante en la metástasis tumoral. Las quimioquinas son moléculas pequeñas que inducen la migración celular direccional a través de la interacción con sus receptores afines. La unión de las quimioquinas a los receptores de quimioquinas activa las vías de señalización, tales como las vías MAPK/ERK y PI3K/AKT, lo que da como resultado la fosforilación de ERK y AKT, respectivamente.
Los enfoques terapéuticos incluyen el uso de moléculas pequeñas (Khotskaya (2014); Am. J. Transl. Res. 6(4):361-376) o de anticuerpos (Stephenson (2015); Oncotarget 6(10):7554-7569). Sin embargo, la eficacia depende del tipo de cáncer y de la diana de tales terapias. Siempre existe la necesidad de proporcionar más enfoques terapéuticos. La proteína 2 que contiene el dominio de esperma móvil (MOSPD2) es una proteína muy conservada de 518 aminoácidos de longitud con un 90% de homología entre los seres humanos y los ratones. Los análisis bioinformáticos indican que MOSPD2 contiene una región CRAL-TRIO, llamada así por la proteína de unión a retinaldehído celular (CRALBP) y por la proteína TRIO. MOSPD2 también contiene una región relacionada estructuralmente con la principal proteína del esperma del nematodo y una región transmembrana. Aún no se ha descrito una función biológica para MOSPD2. Como se detalla en la presente memoria, los inventores encontraron que MOSPD2 es esencial para la migración de determinadas células (por ejemplo, monocitos y diversas células cancerosas) hacia diferentes quimioquinas (por ejemplo, factor de crecimiento epidérmico (EGF)).
Compendio de la invención
La presente invención se refiere a los siguientes elementos:
1. Un anticuerpo de Proteína 2 que contiene el dominio del anti-esperma móvil (MOSPD2) o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer, en donde MOSPD2 se expresa por dicho cáncer.
2. Un anticuerpo de Proteína 2 que contiene el dominio del anti-esperma móvil (MOSPD2) o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en el tratamiento, prevención o reducción de la incidencia de metástasis de una célula cancerosa, en donde MOSPD2 se expresa por dicha célula cancerosa.
3. El anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según el punto 1 o 2, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
4. El anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según cualquiera de los puntos 1 a 3, en donde el anticuerpo es humano o humanizado.
5. El anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según cualquiera de los puntos 1 a 4, en donde el fragmento de unión a antígeno es un Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, fragmento sdFv, dominio VH, o dominio VL.
6. El anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según cualquiera de los puntos 1 a 5, en donde el anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo se une específicamente a un polipéptido que tiene una secuencia de SEQ ID NO:1.
7. El anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según cualquiera de los puntos 1 a 5, en donde el anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo se une específicamente a un polipéptido que tiene una secuencia de cualquiera de las SEQ ID NOs:2-4.
8. El anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según cualquiera de los puntos 1 a 7, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a MOSPD2 con una afinidad de unión (Kd) de aproximadamente 10-6 M a aproximadamente 10-12 M.
9. El anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según cualquiera de los puntos 1 a 8, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo inhibe la migración de células cancerosas, la migración de monocitos asociada con el crecimiento tumoral, una vía de señalización de quimioquinas, una vía de señalización del factor de crecimiento, fosforilación del receptor EGF, fosforilación de ERK, fosforilación de AKT, fosforilación de FAK, o una combinación de las mismas.
10. El anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según cualquiera de los puntos 1 a 9, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo reduce el número de monocitos circulantes o macrófagos asociados a tumores cerca o dentro de la masa cancerosa, o la migración de macrófagos asociados a tumores.
11. El anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según cualquiera de los puntos 1 a 10, en donde el cáncer es cáncer de vejiga, cáncer de cerebro, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de esófago, cáncer de vesícula biliar, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de estómago, cáncer de cuello uterino, cáncer de tiroides, cáncer de próstata, cáncer de piel, cáncer hematopoyético, cáncer de origen mesenquimal, cáncer del sistema nervioso central o periférico, cáncer de endometrio, cáncer de cabeza y cáncer de cuello, glioblastoma, o ascitis maligna.
12. El anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según el punto 11, en donde el cáncer de pulmón es un cáncer de pulmón de células pequeñas o un cáncer de pulmón de células no pequeñas.
13. El anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según el punto 11, en donde el cáncer de piel es carcinoma de células escamosas, cáncer de células basales, melanoma, dermatofibrosarcoma protuberans, carcinoma de células de Merkel, sarcoma de Kaposi, queratoacantoma, tumores de células fusiformes, carcinomas sebáceos, carcinoma anexial microquístico, enfermedad de Paget de mama, fibroxantoma atípico, leiomiosarcoma, o angiosarcoma.
14. El anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según el punto 11, en donde el cáncer hematopoyético es un cáncer hematopoyético de linaje linfoide.
15. El anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según el punto 14, en donde el cáncer hematopoyético de linaje linfoide es leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de células B, linfoma de células T, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, linfoma de células pilosas, o linfoma de Burkitt.
16. El anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según el punto 11, en donde el cáncer hematopoyético es un cáncer hematopoyético de linaje mieloide.
17. El anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según el punto 16, en donde el cáncer hematopoyético de linaje mieloide es leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, síndrome mielodisplásico, o leucemia promielocítica.
18. El anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según el punto 11, en donde el cáncer de origen mesenquimal es fibrosarcoma, rabdomiosarcoma, sarcoma de tejido blando, o sarcoma óseo.
19. El anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según el punto 11, en donde el cáncer del sistema nervioso central o periférico es astrocitoma, neuroblastoma, glioma, o schwannomas.
20. El anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según cualquiera de los puntos 1-10, en donde el cáncer es cáncer anal, cáncer óseo, cáncer de estoma gastrointestinal, enfermedad trofoblástica gestacional, queratoacantoma, mesotelioma maligno, enfermedad de Castleman multicéntrica, mieloma múltiple y otras neoplasias de células plasmáticas, neoplasias mieloproliferativas, osteosarcoma, cáncer de ovario, de trompas de Falopio, o primario de peritoneo, cáncer de pene, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, seminoma, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de estómago (gástrico), cáncer testicular, teratocarcinoma, cáncer folicular de tiroides, cáncer vaginal, cáncer vulvar, tumor de Wilms y otros cánceres renales infantiles, o xeroderma pigmentoso.
21. El anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según cualquiera de los puntos 1 a 20, en donde dicho uso es en un ser humano.
Como se explica anteriormente, la presente invención se refiere a un anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer, en donde dicho cáncer expresa MOSPD2. En algunas realizaciones, el uso incluye poner en contacto monocitos circulantes o macrófagos asociados a tumores con una cantidad eficaz de dicho anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo para reducir el número de macrófagos asociados a tumores cerca o dentro de la masa cancerosa y/o para regular la migración de macrófagos asociados a tumores. En algunas realizaciones, MOSPD2 se expresa mediante monocitos circulantes o macrófagos asociados a tumores. En algunas realizaciones, la administración del anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo reduce el número de macrófagos asociados a tumores cerca o dentro de una masa cancerosa y/o regula la migración de macrófagos asociados a tumores. En algunas realizaciones, la administración del anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo reduce el número o la migración de macrófagos asociados a tumores en al menos un 10% o más.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo policlonal, monoclonal, murino, humano, humanizado, o quimérico.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a MOSPD2 expresado en una superficie celular (por ejemplo., una superficie de la célula cancerosa).
En particular, la invención se refiere a un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a MOSPD2 para su uso como se define anteriormente en la presente memoria y en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a MOSPD2 con una constante de disociación de equilibrio (Kd) de aproximadamente 10-6 M a aproximadamente 10-12 M. En otras realizaciones, el MOSPD2 es MOSPD2 humano. En otras realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une específicamente a una o más de las siguientes regiones de aminoácidos de MOSPD2 humano, numeradas según SEQ ID NO:1: de aproximadamente 508 a aproximadamente 517, aproximadamente 501 a aproximadamente 514, de aproximadamente 233 a aproximadamente 241, de aproximadamente 509 a aproximadamente 517, de aproximadamente 212 a aproximadamente 221, de aproximadamente 13 a aproximadamente 24, de aproximadamente 505 a aproximadamente 517, de aproximadamente 505 a aproximadamente 514, de aproximadamente 89 a aproximadamente 100, de aproximadamente 506 a aproximadamente 517, de aproximadamente 233 a aproximadamente 245, de aproximadamente 504 a aproximadamente 514, de aproximadamente 128 a aproximadamente 136, de aproximadamente 218 a aproximadamente 226, de aproximadamente 15 a aproximadamente 24, de aproximadamente 83 a aproximadamente 96, de aproximadamente 42 a aproximadamente 50, de aproximadamente 462 a 474, de aproximadamente 340 a aproximadamente 351, de aproximadamente 504 a aproximadamente 517, de aproximadamente 462 a aproximadamente 470, de aproximadamente 327 a aproximadamente 337, de aproximadamente 21 a aproximadamente 32, aproximadamente 217 a aproximadamente 226, aproximadamente 510 a aproximadamente 517, de aproximadamente 178 a aproximadamente 190, de aproximadamente 497 a aproximadamente 509, de aproximadamente 504 a aproximadamente 516, de aproximadamente 64 a aproximadamente 77, de aproximadamente 504 a aproximadamente 515, de aproximadamente 147 a aproximadamente 159, de aproximadamente 503 a aproximadamente 515, de aproximadamente 88 a aproximadamente 97, de aproximadamente 208 a aproximadamente 218, de aproximadamente 178 a aproximadamente 191, de aproximadamente 502 a aproximadamente 515, de aproximadamente 503 a aproximadamente 516, de aproximadamente 497 a aproximadamente 505, de aproximadamente 500 a aproximadamente 509, de aproximadamente 189 a aproximadamente 202, de aproximadamente 189 a aproximadamente 197, de aproximadamente 505 a aproximadamente 516, de aproximadamente 1 a aproximadamente 63, de aproximadamente 82 a aproximadamente 239, de aproximadamente 93 a aproximadamente 234, de aproximadamente 327 a aproximadamente 445, de aproximadamente 327 a aproximadamente 431, y de aproximadamente 497 a aproximadamente 517.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une específicamente a una o más de las siguientes regiones de aminoácidos de MOSPD2 humano, numeradas según SEQ ID NO:1: de aproximadamente 505 a aproximadamente 515, de aproximadamente 500 a aproximadamente 515, de aproximadamente 230 a aproximadamente 240, de aproximadamente 510 a aproximadamente 520, de aproximadamente 210 a aproximadamente 220, de aproximadamente 15 a aproximadamente 25, de aproximadamente 505 a aproximadamente 520, de aproximadamente 505 a aproximadamente 515, de aproximadamente 90 a aproximadamente 100, de aproximadamente 505 a aproximadamente 525, de aproximadamente 230 a aproximadamente 245, de aproximadamente 505 a aproximadamente 510, de aproximadamente 130 a aproximadamente 140, de aproximadamente 220 a aproximadamente 230, de aproximadamente 15 a aproximadamente 30, e aproximadamente 80 a aproximadamente 95, de aproximadamente 40 a aproximadamente 50, de aproximadamente 460 a aproximadamente 475, de aproximadamente 340 a aproximadamente 350, de aproximadamente 500 a aproximadamente 515, de aproximadamente 460 a aproximadamente 470, de aproximadamente 325 a aproximadamente 335, de aproximadamente 20 a aproximadamente 35, de aproximadamente 215 a aproximadamente 225, e aproximadamente 510 a aproximadamente 520, de aproximadamente 175 a aproximadamente 190, de aproximadamente 500 a aproximadamente 510, de aproximadamente 505 a aproximadamente 530, de aproximadamente 60 a aproximadamente 75, de aproximadamente 500 a aproximadamente 520, de aproximadamente 145 a aproximadamente 160, de aproximadamente 502 a aproximadamente 515, de aproximadamente 85 a aproximadamente 100, de aproximadamente 205 a aproximadamente 220, de aproximadamente 175 a aproximadamente 190, de aproximadamente 500 a aproximadamente 505, de aproximadamente 500 a aproximadamente 525, de aproximadamente 495 a aproximadamente 505, de aproximadamente 495 a aproximadamente 510, de aproximadamente 190 a aproximadamente 200, de aproximadamente 190 a aproximadamente 198, de aproximadamente 502 a aproximadamente 515, de aproximadamente 1 a aproximadamente 60, de aproximadamente 80 a aproximadamente 240, de aproximadamente 90 a aproximadamente 235, de aproximadamente 330 a aproximadamente 445, de aproximadamente 330 a aproximadamente 430, y de aproximadamente 495 a aproximadamente 515.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 presenta imágenes que muestran los resultados de ensayos de células cancerosas transducidas con partículas lentivirales sh-control o sh-MOSPD2 en un ensayo de migración de pocillos trans hacia suero bovino fetal (FCS) al 10% y EGF (200 ng/ml). Se silenció la expresión de MOSPD2 por líneas celulares de cáncer de mama humano MDA-231 y melanoma A2058 empleando partículas lentivirales sh-MOSPD2. Las transferencias de Western en la FIG. 1 muestran una disminución de la expresión de la proteína MOSPD2 en líneas de células cancerosas transducidas con sh-MOSPD2. La FIG. 1 muestra que MOSPD2 promueve la migración de líneas celulares metastásicas de cáncer de mama y melanoma.
La FIG. 2 presenta un gráfico que muestra las tasas de proliferación celular para células de cáncer de mama MDA-231 transducidas con partículas lentivirales sh-control o sh-MOSPD2. Las células MDA-231 se sembraron como se describe y se recogieron y contabilizaron cada 24 horas durante tres días consecutivos. Los resultados se expresan como media ± desviación estándar de triplicados. Estos resultados demuestran que el silenciamiento de MOSPD2 no afectó a la viabilidad celular o a la proliferación de las células MDA-231.
Las FIGs. 3A-3C muestran resultados de ensayos in vivo de metástasis de células de cáncer de mama MDA-231 con o sin MOSPD2 silenciado. En la FIG. 3A, se inyectaron (106) células de cáncer de mama MDA-231 transducidas con partículas lentivirales sh-control o sh-MOSPD2 en la vena de la cola de ratones SCID (n=10/grupo). Los ratones se sacrificaron el día 28, se obtuvieron sus pulmones para la tinción con hematoxilina-eosina (tinción H y E), y se determinó el área tumoral. Los resultados mostrados en la FIG. 3A se expresan como media ± error estándar del tamaño de metástasis medido (* p<0,05).
En las FIGs. 3B y 3C, se inyectaron (5x106) células de cáncer de mama, MDA-231 transducidas con partículas lentivirales sh-control o sh-MOSPD2 (n=13 y n=8 respectivamente) en la almohadilla de grasa mamaria de ratones SCID. Los ratones se sacrificaron el día 56. Se extirpó el ganglio linfático inguinal homolateral (FIG. 3B), se obtuvieron los pulmones para la tinción H y E, y se determinó el área tumoral (FIG. 3C). Los resultados mostrados en la FIG. 3C se expresan como media ± error estándar del tamaño de metástasis medido: el área tumoral para las células transducidas con sh-control es 1376,9 ± 752,6 (n=13), en comparación con 550,0 ± 326,2 (n=8) para células transducidas con sh-MOSPD2.
Las FIGs. 3A-3C muestran que MOSPD2 promueve la metástasis de las células de cáncer de mama MDA-231 in vivo.
Las FIGs. 4A-4E muestran imágenes que comparan los niveles de expresión de MOSPD2 de varios tejidos cancerosos humanos con los de sus respectivos homólogos de tejido normal. Los portaobjetos que contenían varios tejidos humanos normales y cancerosos se tiñeron con control o anticuerpo anti-MOSPD2. Se muestran los tejidos cancerosos que se tiñeron positivamente para MOSPD2. Las FIGs. 4A-4E muestran que MOSPD2 se expresa en varios tejidos cancerosos humanos.
Las FIGs. 5A y 5B muestran los resultados de células cancerosas transducidas con control o partículas lentivirales CRISPR-CAS9 para MOSPD2, que se ensayaron en un ensayo de migración de pocillos trans en el que las células se sembraron en el compartimento superior y se atrajeron al compartimento inferior utilizando un medio enriquecido con FCS al 10% y EGF (200 ng/ml). El gráfico que se muestra en la FIG. 5A se determinó mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) con resultados expresados como media ± desviación estándar de triplicados. Las imágenes mostradas en la FIG. 5B son de registro visual. En las FIGs. 5A y 5B, se transdujeron células de cáncer de mama MDA-231 con partículas lentivirales con plásmidos que contenían control o sistema CRISPR-CAS9 para MOSPD2. Las transferencias de Western muestran una expresión disminuida de la proteína MOSPD2 (recuadro). Las FIGs. 5A y 5B muestran que la edición del gen MOSPD2 dirigida por CRISPR-CAS9 inhibe la migración de células de cáncer de mama.
La FIG. 5C presenta transferencias de Western que muestran el efecto del silenciamiento de MOSPD2 mediante la edición genética dirigida por CRISPR-CAS9 sobre los eventos de fosforilación asociados con la migración celular. Se incubaron células de cáncer de mama MDA-231 transducidas con control o partículas lentivirales CRISPR-CAS9 MOSPD2 con FCS al 10% y EGF (400 ng/ml) durante 10 minutos. La fosforilación de ERK, AKT y FAK se determinó mediante transferencia Western. Se empleó HSP90 para el control de carga. La FIG. 5C muestra que el silenciamiento de MOSPD2 mediante la edición de genes dirigida por CRISPR-CAS9 inhibe los eventos de fosforilación asociados con la migración celular.
La FIG. 5D muestra los resultados de los ensayos in vivo de metástasis de células de cáncer de mama MDA-231 transducidas con partículas lentivirales CRISPR-CAS9 MOSPD2 o de control. En la Fig. 5D, se inyectaron 106 células MDA-231 transducidas con lenti-virus CRISPR-control o CRISPR-MOSPD2, en la vena de la cola de ratones SCID hembra de 8 semanas de edad (C.B-17/IcrHsd-Prkdcscid, Harlan Israel).. Los ratones se sacrificaron después de 3 semanas y se extirparon sus pulmones para examen histopatológico. La FIG. 5D muestra que silenciar MOSPD2 por el sistema CRISPR-CAS9 inhibe significativamente la presencia de células de cáncer de mama metastásico en los pulmones en más del 95% (área metastásica), con un valor de p de 0,002.
LA FIG. 6 presenta una imagen de Western Blot que muestra el efecto de VB-201 en la inhibición de la fosforilación de AKT inducida por EGF en células cancerosas MDA-231. Como se muestra en la FIG. 6, VB-201 a 10 |ug/ml inhibe casi completamente la fosforilación de AKT inducida por EGF, con una inhibición significativa observada a 5 |ug/ml. Se empleó HSP90 para el control de carga.
La FIG. 7 enumera 17 clones de anticuerpos monoclonales anti-MOSPD2 F(ab')2 que se identificaron después de un cribado primario para la unión a células que sobre-expresan MOSPD2. El análisis adicional de los clones para la unión de MOSPD2 con el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) identificó 12 clones que tienen valores de densidad óptica (D.O.) superiores a 5 veces sobre el fondo (* en la Figura 7).
Las FIGs. 8A-8B muestran la unión de dos clones de anticuerpos monoclonales (mAb) F(ab')2 anti-MOSPD2 representativos para células que sobre-expresan MOSPD2.
La FIG. 9 muestra la unión de un mAb F(ab')2 anti-MOSPD2 representativo para MOSPD2 expresado por células de cáncer de mama MDA-231.
Las FIGs. 10A-10B muestran que mAb F(ab')2 anti-MOSPD2 se une a las células MDA-231 (FIG. 10A), pero no se une a las células MDA-231 silenciadas con MOSPD2 (FIG. 10B).
Las FIGs. 11A-11B muestran que mAb F(ab')2 anti-MOSPD2 se une a MOSPD2 en líneas celulares de melanoma A2058 y cáncer de hígado HepG2.
La FIG. 12 muestra que la incubación de células MDA-231 con mAb F(ab')2 anti-MOSPD2 inhibe la fosforilación del receptor de EGF (p-EGF-R), AKT (p-AKT) y ERK1/2 (p-ERK 1/2).
La FIG. 13 muestra mAb F(ab')2 anti-MOSPD2 inhibe significativamente la migración de pocillos trans inducida por EGF de las células MDA-231.
Las FIGs. 14A-14D muestran la especificidad de expresión celular y la localización de MOSPD2.
Las FIGs. 15A-15C muestran que MOSPD2 se expresa en monocitos que se han infiltrado en tejidos inflamados.
Las FIGs. 16A-16E muestran que MOSPD2 promueve la migración de monocitos. La FIG. 16A muestra la expresión de ARNm y proteína de MOSPD2 en células U937 transducidas con partículas lentivirales sh-control o sh-MOSPD2. Se muestra uno de al menos tres experimentos. La FIG. 16B muestra una migración de pocillos trans de tres horas de células U937 transducidas con partículas lentivirales sh-control o sh-MOSPD2 hacia RANTES (100 ng/ml). Se presenta el porcentaje de células transducidas con sh-MOSPD2 en relación con las células migratorias transducidas con control sh. Se muestra uno de los tres experimentos. La FIG. 16C muestra células U937 transducidas con partículas lentivirales sh-control o sh-MOSPD2 que se incubaron durante el tiempo indicado (min) con RANTES, y se evaluó la fosforilación de ERK1/2 (p-ERK1/2) y AkT (p-AKT). Se empleó HSP90 como control de carga. La FIG. 16D muestra una migración de pocillos trans de tres horas de células U937 transducidas con partículas lentivirales shcontrol (sh-cont) o sh-MOSPD2 hacia MCP-3 (100 ng/ml), MCP-1 (100 ng/ml), RANTES (100 ng/ml) y SDF-1 (25 ng/ml). Se presenta el porcentaje de sh-MOSPD2 en relación con las células migratorias transducidas de control de sh. Se muestra uno de los tres experimentos. La FIG. 16E muestra que las células U937 transducidas con partículas lentivirales sh-control (sh-cont) o sh-MOSPD2 se incubaron durante 5 minutos con MCP-3 (100 ng/ml), m Cp-1 (100 ng/ml), RANTES (100 ng/ml)/ml) y SDF-1 (25 ng/ml), y se evaluó la fosforilación de ERK1/2 (p-ERK1/2) y AKT (p-AKT). Se empleó tubulina como control de carga.
Las FIGs. 17A-17B muestran que MOSPD2 no afecta a la fosforilación de STAT1 (p-Stat1) inducida por IFN-gamma o la fosforilación de ERK1/2 (pERK1/2) mediada por PMA, respectivamente, respaldando la especificidad de las actividades de MOSPD2 antes mencionadas.
Las FIGs. 18A-18F muestran imágenes histológicas de muestras de cáncer de mama humano de diferentes etapas patológicas o de tejido normal adyacente a un tumor (tejido adyacente normal; NAT). Los portaobjetos se tiñeron con anticuerpo anti-MOSPD2. Las FIGs 18A-18F muestran que la expresión de MOSPD2 se asoció con la transición de las células de cáncer de mama de un tumor restringido localmente a un tumor invasivo y metastásico.
La FIG. 19 muestra la puntuación de la intensidad de expresión de MOSPD2 (en una escala de 0-3, donde 0 es sin expresión y 3 es expresión muy alta) en muestras de diferentes etapas del cáncer de mama o del tejido adyacente normal (NAT) (* p<0,001).
Las FIGs. 20A-20D muestran imágenes que comparan el nivel de expresión de MOSPD2 en varios tejidos humanos normales y cancerosos recogidos del colon (FIGs. 20A-20B) o del hígado (FIGs. 20C-20D). MOSPD2 se expresó en el 67% de los adenocarcinomas de colon y en el 45% de las muestras de carcinoma hepatocelular, mientras que no se detectó expresión en tejidos normales de colon e hígado.
Las FIGs. 21A-21E muestran imágenes que comparan el nivel de expresión de MOSPD2 de tejido normal, NAT y tejido canceroso en diferentes grados recogidos de hígado humano. Las FIGs. 21C-21E muestran que la intensidad de tinción de MOSPD2 aumentó junto con el aumento del grado tumoral del carcinoma hepatocelular.
Las FIGs. 22A-22B muestran la puntuación MOSPD2 de la intensidad de expresión de MOSPD2 en muestras recogidas de carcinoma hepatocelular. La FIG. 22A muestra que la expresión de MOSPD2 se incrementó significativamente (p<0,001) en muestras recogidas de carcinoma hepatocelular maligno, en comparación con muestras normales y NAT. La FIG. 22B muestra que la intensidad de la tinción de MOSPD2 aumentó significativamente en correlación con la progresión del carcinoma hepatocelular.
La FIG. 23 presenta imágenes de transferencias Western que muestran que VB-201 se une a MOSPD2 a partir del lisado celular de monocitos CD14 humanos. Se añadió VB-201 o VB-221 marcado (OB201 o OB221) al lisado celular y se precipitaron las proteínas. Las muestras se procesaron en un gel y se transfirieron frente a TLR2 y MOSPD2.
La FIG. 24 presenta imágenes de transferencias Western que muestran que MOSPD2 promueve eventos de señalización inducidos por EGF en células de cáncer de mama.
Descripción detallada
La divulgación técnica detallada que se expone a continuación puede, en algunos aspectos, ir más allá de la divulgación de la invención per sé, y también puede proporcionar antecedentes técnicos para desarrollos técnicos relacionados. Se apreciará que esta divulgación técnica no pretende definir la invención como tal (que se define exclusivamente por las reivindicaciones adjuntas), sino más bien ubicarla en un contexto técnico más amplio. Por consiguiente, se apreciará que el término "realizaciones" refleja un detalle específico de la divulgación y no pretende definir como parte de la invención aspectos que no se comprenden dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
Definiciones generales
Los términos "comprende", "que comprende", "incluye", "que incluye", "que tiene", y sus conjugados significan "que incluye, pero no se limita a".
El término "que consiste en" significa "que incluye y se limita a".
El término "que consiste esencialmente en" significa el material especificado de una composición, o las etapas especificadas de un método, y aquellos materiales o etapas adicionales que no afectan sustancialmente a las características básicas del material o método.
La palabra "ejemplar" se emplea en la presente memoria para significar "que sirve como ejemplo, instancia o ilustración". Cualquier realización descrita como "ejemplar" no debe interpretarse necesariamente como preferida o ventajosa sobre otras realizaciones y/o excluir la incorporación de características de otras realizaciones.
La palabra "opcionalmente" se emplea en la presente memoria para significar que "se proporciona en algunas realizaciones y no se proporciona en otras realizaciones". Cualquier realización particular puede incluir una pluralidad de características "opcionales" a menos que tales características entren en conflicto.
Como se emplea en la presente memoria, la forma singular "un", "uno" y "el" incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, el término "un compuesto" o "al menos un compuesto" puede incluir una pluralidad de compuestos, incluidas las mezclas de los mismos.
Como se emplea en la presente memoria, el término "aproximadamente" que modifica una cantidad se refiere a la variación en la cantidad numérica que puede aparecer, por ejemplo, a través de ensayos y manipulaciones rutinarias; a través de error inadvertido en dichos ensayos y manipulaciones; a través de diferencias en la fabricación, fuente, o pureza de ingredientes, y similares.
En una realización, el término "aproximadamente" significa dentro del 10% del valor numérico informado. En otra realización, el término "aproximadamente" significa dentro del 5% del valor numérico informado.
A lo largo de esta solicitud, se pueden presentar varias realizaciones en un formato de intervalo. Debe entenderse que la descripción en formato de intervalo es meramente por conveniencia y brevedad y no debe interpretarse como una limitación inflexible del alcance de la invención. Por consiguiente, se debe considerar que la descripción de un intervalo ha divulgado específicamente todos los subintervalos posibles, así como los valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, la descripción de un intervalo, tal como de 1 a 6, debe considerarse que tiene subintervalos descritos específicamente, tal como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., así como números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, y 6. Esto se aplica independientemente de la amplitud del intervalo.
Como se emplea en la presente memoria, el término "método" se refiere a maneras, medios, técnicas y procedimientos para realizar una tarea determinada que incluye, pero no se limita a, aquellas maneras, medios, técnicas y procedimientos que se conocen, o se desarrollan fácilmente a partir de maneras, medios, técnicas y procedimientos conocidos por los profesionales de las técnicas de la química, farmacología, biología, bioquímica y medicina.
Como se emplea en la presente memoria, el término "tratar" incluye anular, inhibir sustancialmente, ralentizar o revertir la progresión de una afección, mejorar sustancialmente los síntomas clínicos o estéticos de una afección o prevenir sustancialmente la aparición de síntomas clínicos o estéticos de una afección.
Como se emplea en la presente memoria, "MOSPD2" se refiere a cualquier polipéptido clasificado como una proteína 2 que contiene el dominio espermático móvil, específicamente los polipéptidos de SEQ ID NOs:1-4, o cualquier variante de los mismos (por ejemplo, que tiene una secuencia al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO:1-4). Como alternativa, MOSPD2 puede ser un polipéptido codificado por un polinucleótido de cualquiera de las SEQ ID NOs:5-8, o cualquier variante de la misma (por ejemplo, que tiene un polinucleótido al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% idéntico a cualquiera de las SEQ ID NOs:5-8). Las secuencias de polinucleótidos que codifican MOSPD2 pueden optimizarse en codones para la expresión en un organismo particular mediante métodos conocidos en la técnica. Se pueden identificar otros ejemplos de MOSPD2 buscando en bases de datos públicas (por ejemplo., BLAST), como es bien conocido por un experto en la técnica.
En cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, el MOSPD2 puede ser MOSPD2 expresado por una célula cancerosa, por ejemplo., una célula cancerosa humana. Además, en cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, el MOSPD2 puede ser un MOSPD2 de mamífero o un MOSPD2 humano. La lista no exclusiva de tipos de células cancerosas incluye células de cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de esófago, cáncer de vesícula biliar, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de estómago, cáncer de cuello uterino, cáncer de tiroides, cáncer de próstata, cáncer de piel, cáncer hematopoyético, cáncer de origen mesenquimal, cáncer del sistema nervioso central o periférico, cáncer de endometrio, cáncer de cabeza y cuello, glioblastoma, y ascitis maligna. En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer de pulmón de células pequeñas o un cáncer de pulmón de células no pequeñas. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de piel, por ejemplo., carcinoma de células escamosas, cáncer de células basales, melanoma, dermatofibrosarcoma protuberans, carcinoma de células de Merkel, sarcoma de Kaposi, queratoacantoma, tumores de células fusiformes, carcinomas sebáceos, carcinoma anexial microquístico, enfermedad de Paget de mama, fibroxantoma atípico, leiomiosarcoma, o angiosarcoma. En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer hematopoyético de linaje linfoide, por ejemplo, leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de células B, linfoma de células T, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, linfoma de células pilosas o linfoma de Burkitt. En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer hematopoyético de linaje mieloide, por ejemplo, fibrosarcoma, rabdomiosarcoma, sarcoma de tejido blando, o sarcoma óseo. En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer del sistema nervioso central o periférico, por ejemplo, astrocitoma, neuroblastoma, glioma o schwannomas. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer anal, cáncer óseo, cáncer del estroma gastrointestinal, enfermedad trofoblástica gestacional, linfoma de Hodgkin, sarcoma de Kaposi, queratoacantoma, mesotelioma maligno, enfermedad de Castleman multicéntrica, mieloma múltiple y otras neoplasias de células plasmáticas, neoplasias mieloproliferativas, neuroblastoma, linfoma no Hodgkin, osteosarcoma, cáncer de ovario, de trompas de Falopio o primario de peritoneo, cáncer de pene, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, seminoma, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de estómago (gástrico), cáncer testicular, teratocarcinoma, cáncer folicular de tiroides, cáncer vaginal, cáncer vulvar, Tumor de Wilms y otros cánceres renales infantiles, y xeroderma pigmentoso. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de vejiga, cáncer de cerebro (por ejemplo, astrocitoma del cerebro), cáncer de mama, cáncer de colon (por ejemplo, adenocarcinoma de colon), cáncer de esófago (por ejemplo., adenocarcinoma de esófago), cáncer de pulmón, cáncer de piel (por ejemplo, melanoma), cáncer de lengua (por ejemplo, carcinoma de células de la cabeza y cuello (lengua)), cáncer de riñón (por ejemplo, carcinoma de células claras de riñón), o cáncer hepático (por ejemplo, carcinoma hepatocelular).
Como se emplea en la presente memoria, "una actividad de MOSPD2" o “una actividad MOSPD2” incluye cualquier función conocida o descrita en la presente memoria de una proteína 2 que contiene el dominio de esperma móvil.. Tales actividades incluyen, por ejemplo, la regulación de la migración celular (por ejemplo, migración de leucocitos, monocitos o células cancerosas), la presencia de macrófagos asociados a tumores, quimiotaxis, la migración de leucocitos inducida por quimioquinas, las vías de señalización del receptor de quimioquina, las vías de señalización del factor de crecimiento, la fosforilación del receptor EGF, la fosforilación de ERK, la fosforilación de AKT, la fosforilación de FAK, o la inflamación.
Como se emplea en la presente memoria, "quimiotaxis" se refiere al movimiento de una célula en respuesta a un estímulo químico. La quimiotaxis incluye, pero no se limita a, el movimiento de una célula cancerosa a una quimioquina (porejemplo, un EGF).
Como se emplea en la presente memoria, "un inhibidor de MOSPD2" y “un inhibidor MOSPD2” se refiere a cualquier compuesto que regule negativamente una actividad de MOSPD2. El inhibidor puede ser, por ejemplo, un polipéptido, ADN, o ARN. La inhibición de MOSPD2 también puede ocurrir, por ejemplo, por sobreexpresión ectópica de MOSPD2 por infección, y se pretende que un inhibidor de MOSPD2 o un inhibidor MOSPD2 abarque este tipo de inhibición. El inhibidor también puede ser, por ejemplo, una molécula que se une específicamente a un polipéptido MOSPD2, una molécula que se une específicamente a un ligando de un polipéptido MOSPD2, un antisuero producido contra un polipéptido MOSPD2, un polipéptido MOSPD2 soluble, o un polipéptido MOSPD2 soluble que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un dominio extracelular de un polipéptido MOSPD2. El inhibidor también puede ser, por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido MOSPD2 o un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido MOSPD2. El inhibidor también puede ser, por ejemplo, un ARNi, miARN, ARNip, ARNhc, ARN antisentido, ADN antisentido, molécula señuelo, ADN señuelo, ADN bicatenario, ADN monocatenario, ADN complejado, ADN encapsulado, ADN viral, plásmídico, ADN, ARN desnudo, ARN encapsulado, ARN viral, ARN bicatenario, molécula capaz de generar ARN de interferencia, o combinaciones de los mismos, que hibrida con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido MOSPD2. El inhibidor también puede ser, por ejemplo, un sistema CRISPR-CAS9 de repeticiones palindrómicas cortas, agrupadas y regularmente interespaciadas. Los sistemas CRISPR-CAS9 se han descrito en la bibliografía y pueden incluir, por ejemplo, CAS9 y un ARN guía. En la bibliografía se han descrito también otras técnicas de edición de genes y se pueden emplear también. El inhibidor también puede ser un compuesto químico de molécula pequeña que regula negativamente una actividad de MOSPD2.
Un "anticuerpo" o un "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo incluye, pero no se limita a, anticuerpos policlonales, monoclonales, murinos, humanos, humanizados, o quiméricos, anticuerpos de cadena sencilla, fragmentos de unión a epítopo, por ejemplo, Fab, Fab' y F(ab')2, Fd, Fvs, Fvs monocatenarios (scFv), anticuerpos monocatenarios, Fvs unidos por disulfuro (sdFv), un dominio de región variable de cadena ligera (VL) o de región variable de cadena pesada (VH), fragmentos que comprenden bien un dominio VL o bien un dominio VH, y fragmentos producidos por una biblioteca de expresión Fab. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede ser de cualquier tipo (por ejemplo., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, y IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 y IgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina. Los métodos para fabricar un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo son conocidos e incluyen, por ejemplo, digestión química o por proteasa de un anticuerpo.
Una "región constante" de un anticuerpo se refiere a la región constante de la cadena ligera del anticuerpo o la región constante de la cadena pesada del anticuerpo, ya sea sen solitario o en combinación.
El término "región Fc" se emplea para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina. La "región Fc" puede ser una región Fc de secuencia nativa o una región Fc variante. Aunque los límites de la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina pueden variar, la región Fc de la cadena pesada de IgG humana se define normalmente para que se extienda desde un resto de aminoácido en la posición Cys226, o desde Pro230, hasta el extremo carboxilo terminal del mismo. La numeración de los restos en la región Fc es la del índice UE como en Kabat. Kabat et al.., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Servicio de Salud Pública, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Md., 1991. La región Fc de una inmunoglobulina comprende generalmente dos dominios constantes, CH2 y CH3.
Por "se une específicamente", se entiende generalmente que un anticuerpo o fragmento, variante, o derivado del mismo se une a un epítopo por su dominio de unión al antígeno, y que la unión implica cierta complementariedad entre el dominio de unión al antígeno y el epítopo. Según esta definición, se dice que un anticuerpo o fragmento, variante, o derivado del mismo se "une específicamente" a un epítopo cuando se une a ese epítopo a través de su dominio de unión a antígeno más fácilmente de lo que se uniría a un epítopo aleatorio, no relacionado.
Como se emplea en la presente memoria, un "epítopo" se refiere a una región localizada de un antígeno a la que un anticuerpo puede unirse específicamente. Un epítopo puede ser, por ejemplo, aminoácidos contiguos de un polipéptido (epítopo lineal o contiguo) o un epítopo puede, por ejemplo, venir junto a dos o más regiones no contiguas de un polipéptido o polipéptidos (epítopo conformacional, no lineal, epítopo discontinuo, o no contiguo). En determinadas realizaciones, el epítopo al que se une un anticuerpo se puede determinar mediante métodos descritos en la bibliografía y en la presente memoria, por ejemplo, mediante espectroscopia de RMN, estudios de cristalografía de difracción de rayos X, ensayos de ELISA, intercambio de hidrógeno/deuterio junto con espectrometría de masas (por ejemplo, espectrometría de masas MALDI), ensayos de barrido de oligopéptidos basados en matrices, y/o mapeo de mutagénesis (por ejemplo, mapeo de mutagénesis dirigida al sitio).
El término "porcentaje de identidad", como se conoce en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleótidos, según se determina comparando las secuencias. En la técnica, "identidad" e "identidad de secuencia" también significan el grado de relación de secuencia entre secuencias de polipéptidos o polinucleótidos, según sea el caso, como se determina por la coincidencia entre cadenas de tales secuencias. La "identidad" y la "similitud" se pueden calcular fácilmente mediante métodos conocidos y recursos disponibles públicamente, que incluyen pero no se limitan a, los descritos en: (1) Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., Ed.) Universidad de Oxford: NY (1988); (2) Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., Ed.) Academic: NY (1993); (3) Computer Analysis of Sequence Data, Parte I (Griffin, A. M., y Griffin, H. G., Eds.) Humania: NJ (1994); (4) Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., Ed.) Academic (1987); y (5) Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. y Devereux, J., Eds.) Stockton: NY (1991).
Un polinucleótido puede "hibridar" con otro polinucleótido, cuando una forma monocatenaria del fragmento de ácido nucleico puede reasociarse con el otro fragmento de ácido nucleico en las condiciones apropiadas de temperatura y de fuerza iónica de disolución. Las condiciones de hibridación y lavado son bien conocidas y están ejemplificadas, por ejemplo, en Sambrook e ta l., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Laboratorio de Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), particularmente el Capítulo 11 y la Tabla 11.1 del mismo (incorporados en la presente memoria como referencia en su totalidad). Las condiciones de temperatura y fuerza iónica determinan el "rigor" de la hibridación. Las condiciones de rigurosidad se pueden ajustar para seleccionar fragmentos moderadamente similares (tales como secuencias homólogas a partir de organismos relacionados lejanamente), a fragmentos muy similares (tales como genes que duplican enzimas funcionales de organismos estrechamente relacionados). Los lavados posteriores a la hibridación determinan las condiciones de rigurosidad. Un conjunto ejemplar de condiciones rigurosas emplea una serie de lavados que comienzan con 6xSSC, 0,5% SDS a temperatura ambiente durante 15 min, después se repite con 2xSSC, 0,5% SDS a 45°C durante 30 min, y a continuación se repite dos veces con 0,2xSSC, 0,5 % de SDS a 50°C durante 30 min. Otro conjunto de condiciones rigurosas ejemplares emplea temperaturas más altas en las que los lavados son idénticos a los anteriores excepto por la temperatura de los dos lavados finales de 30 minutos en 0,2xSSC, 0,5% de SDS que se aumentó a 60°C. Este conjunto de condiciones rigurosas se puede modificar a una "condición muy rigurosa" añadiendo dos lavados finales en 0,1 x SSC, SDS al 0,1% a 65°C. Un conjunto ejemplar adicional de condiciones rigurosas incluye hibridación a 0,1xSSC, 0,1% SDS, 65°C y lavados con 2xSSC, 0,1% SDS seguido de 0,1xSSC, 0,1% SDS, por ejemplo.
La hibridación requiere que los dos ácidos nucleicos contengan secuencias complementarias, aunque dependiendo de la rigurosidad de la hibridación, son posibles los desajustes entre bases. El rigor apropiado para hibridar ácidos nucleicos depende de la longitud de los ácidos nucleicos y del grado de complementación, variables bien conocidas en la técnica. Cuanto mayor sea el grado de similitud u homología entre dos secuencias de nucleótidos, mayor será el valor de Tm para los híbridos de ácidos nucleicos que tienen esas secuencias. La estabilidad relativa (correspondiente a una Tm más alta) de las hibridaciones de ácidos nucleicos disminuye en el siguiente orden: ARN:ARN, ADN:ARN, ADN:ADN. Para híbridos de más de 100 nucleótidos de longitud, se han derivado ecuaciones para calcular Tm (véase Sambrook et al., 9,50-9,51). Para hibridaciones con ácidos nucleicos más cortos, es decir, oligonucleótidos, la posición de los desajustes se vuelve más importante, y la longitud del oligonucleótido determina su especificidad (véase Sambrook et al., supra, 11.7-11.8). En una realización, la longitud para un ácido nucleico hibridable es de al menos aproximadamente 10 nucleótidos. En otras realizaciones, una longitud mínima para un ácido nucleico hibridable es de al menos aproximadamente 15 nucleótidos, o al menos aproximadamente 20 nucleótidos.
El término "sal" incluye tanto la sal interna como la sal externa. En algunas realizaciones, la sal es una sal interna, es decir, una estructura de iones híbridos. En algunas realizaciones, la sal es una sal externa. En algunas realizaciones, la sal externa es una sal aceptable farmacéuticamente que tiene un contraión adecuado. Los contraiones adecuados para uso farmacéutico se conocen en la técnica.
El término "VB-201" se refiere a 1-hexadecil-2-(4'-carboxi)butil-glicero-3-fosfocolina. Según las realizaciones descritas en la presente memoria, VB-201 puede ser un enantiómero quiral de 1-hexadecil-2-(4'-carboxi)butil-glicero-3-fosfocolina, es decir, ya sea el enantiómero (R) ((R)-1-hexadecil-2-(4'-carboxi)butil-sn-glicero-3-fosfocolina) o el enantiómero (S) ((S)-1-hexadecil-2-(4'-carboxi)butil-sn-glicero-3-fosfocolina), o una mezcla de los mismos (por ejemplo, un racemato). Según realizaciones ejemplares, VB-201 es (R)-1-hexadecil-2-(4’-carboxi)butil-sn-glicero-3-fosfocolina. Como se entiende por los expertos en la técnica, designar VB-201 como el enantiómero (R) o el enantiómero (S) no requiere una pureza enantiomérica del 100%, sino que se refiere a un enantiómero único enriquecido sustancialmente como un isómero R o S (por ejemplo, que tiene un exceso enantiomérico de al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 98%, al menos el 99%, o más). En algunas realizaciones, VB-201 es (R)-1-hexadecil-2-(4'-carboxi)butil-sn-glicero-3-fosfocolina que tiene al menos un 90% de exceso enantiomérico.
El término "VB-221" se refiere a 1-(2'-octil)dodecil-2-(4'-carboxi)butil-glicero-3-fosfocolina. Según las realizaciones descritas en la presente memoria, VB-221 puede ser un enantiómero quiral de (1-(2'-octil)dodecil-2-(4'-carboxi)butilglicero-3-fosfocolina), es decir, bien el enantiómero (R) o el enantiómero (S), o cualquier mezcla de los mismos (por ejemplo, un racemato). Según las realizaciones ejemplares, VB-221 es (R)-1-(2'-octil dodecil-2-(4'-carboxi)butil-snglicero-3-fosfocolina. De manera similar, como se entiende por los expertos en la técnica, designar VB-221 como el enantiómero (R) o el enantiómero (S) no requiere un 100% de pureza enantiomérica, sino que se refiere a un enantiómero único enriquecido sustancialmente como un isómero R o S (por ejemplo, que tiene un exceso enantiomérico de al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, al menos 99%, o más). En algunas realizaciones, VB-221 es (R)-1-(2'-octil)dodecil-2-(4'-carboxi)butil-sn-glicero-3-fosfocolina que tiene al menos un 90% de exceso enantiomérico.
Se aprecia que determinadas características de la invención que, para mayor claridad, se describen en el contexto de realizaciones separadas, también se pueden proporcionar en combinación en una única realización. A la inversa, varias características de la invención, que se describen, por brevedad, en el contexto de una única realización, también se pueden proporcionar por separado o en cualquier subcombinación adecuada o en cualquier otra realización adecuada descrita de la invención. Determinadas características descritas en el contexto de diversas realizaciones no se deben considerar características esenciales de esas realizaciones, a menos que la realización no funcione sin esos elementos.
MOSPD2 e inhibidores de MOSPD2
Se ha encontrado que la inhibición de MOSPD2 inhibe la migración de células cancerosas y monocitos hacia diferentes quimioquinas (por ejemplo, EGF) y bloquea la activación de las vías de señalización del receptor de quimioquinas. Estos resultados indican que MOSPD2 es fundamental para la migración y metástasis de células cancerosas y que el bloqueo de su actividad tiene un beneficio terapéutico, por ejemplo, en el tratamiento, prevención, o reducción de la incidencia de metástasis de células cancerosas.
Las realizaciones de la invención se refieren a un inhibidor de MOSPD2, por ejemplo, MOSPD2 expresado por una célula cancerosa, en donde dicho inhibidor es un anticuerpo anti-MOSPD2 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, para un uso como se define adicionalmente en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el MOSPD2 es un MOSPD2 de mamífero. En otras realizaciones, el MOSPD2 es un MOSPD2 humano. En algunas realizaciones descritas en la presente memoria, el inhibidor es una molécula de unión aislada que inhibe MOSPD2. En otras realizaciones descritas en la presente memoria, el inhibidor es un polipéptido, ADN, o ARN. En otras realizaciones descritas en la presente memoria, el inhibidor es un polipéptido que se une específicamente a MOSPD2. En otras realizaciones según la invención, el inhibidor es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a MOSPD2. En otras realizaciones descritas en la presente memoria, el inhibidor es un agente silenciador de ARN.
En realizaciones adicionales descritas en la presente memoria, la inhibición de MOSPD2 y la regulación a la baja de una actividad de MOSPD2 pueden verse afectadas a nivel genómico y/o de transcripción empleando una variedad de moléculas que interfieren con la transcripción y/o traducción [por ejemplo, agentes silenciadores de ARN (por ejemplo, antisentido, ARNip, ARNhc, micro-ARN), Ribozima y ADNzima], o en el nivel de proteína empleando por ejemplo, antagonistas, enzimas que escinden el polipéptido, moléculas pequeñas que interfieren con la actividad de la proteína (porejemplo, ligandos competitivos) y similares.
A continuación, se muestra una lista ejemplar de agentes capaces de regular a la baja el nivel de expresión y/o la actividad de una diana, tal como MOSPD2.
La inhibición de MOSPD2 puede ocurrir, por ejemplo, por sobreexpresión ectópica de MOSPD2 por infección, y se describe en la presente memoria que un inhibidor de MOSPD2 o un inhibidor MOSPD2 abarca este tipo de inhibición.
La regulación a la baja de MOSPD2 también se puede lograr mediante la edición de genes. La edición de genes se puede realizar, por ejemplo, con un sistema CRISPR-CAS9 de repeticiones palindrómicas cortas, agrupadas y regularmente interespaciadas. Los sistemas CRISPR-CAS9 se han descrito en la bibliografía y pueden incluir, por ejemplo, CAS9 y un ARN guía. También se han descrito en la bibliografía otras técnicas de edición de genes y también se pueden emplear.
La regulación a la baja de MOSPD2 también se puede lograr mediante el silenciamiento de ARN. Como se emplea en la presente memoria, la frase ''silenciamiento de ARN" se refiere a un grupo de mecanismos reguladores [por ejemplo, ARN de interferencia (ARNi), silenciamiento génico transcripcional (TGS), silenciamiento génico post-transcripcional (PTGS), detención, co-supresión, y represión traduccional] mediada por moléculas de ARN que dan como resultado la inhibición o "silenciamiento" de la expresión de un gen codificador de la proteína correspondiente. El silenciamiento de ARN se ha observado en muchos tipos de organismos, que incluyen plantas, animales, y hongos.
Como se emplea en la presente memoria, el término "agente silenciador de ARN" se refiere a un ARN que es capaz de inhibir o "silenciar" específicamente la expresión de un gen diana. En algunas realizaciones, el agente silenciador de ARN es capaz de prevenir el procesamiento completo (por ejemplo, la traducción y/o expresión completa) de una molécula de ARNm a través de un mecanismo de silenciamiento post-transcripcional. Los agentes silenciadores de ARN incluyen moléculas de ARN no de codificacións, por ejemplo, dúplex de ARN que comprenden cadenas apareadas, así como ARNs precursores a partir de los cuales se pueden generar dichos ARNs pequeños no de codificacións. Los agentes silenciadores de ARN ejemplares incluyen dsARN tal como ARNip, miARN y ARNhc. En una realización, el agente silenciador de ARN es capaz de inducir la interferencia de ARN. En otra realización, el agente silenciador de ARN es capaz de mediar la represión traduccional.
La interferencia de ARN se refiere al proceso de silenciamiento génico post-transcripcional específico de secuencia en animales mediado por ARNs pequeños de interferencia (ARNip). El proceso correspondiente en plantas se conoce comúnmente como silenciamiento génico post-transcripcional o silenciamiento de ARN y también se conoce como extinción (quelling) en hongos. Se cree que el proceso de silenciamiento génico post-transcripcional es un mecanismo de defensa celular conservado evolutivamente que se emplea para prevenir la expresión de genes extraños y que se comparte normalmente por diversas especies de flora y filos. Esta protección contra la expresión de genes extraños puede haber evolucionado en respuesta a la producción de ARNs bicatenarios (dsARN) derivados de una infección viral o de la integración aleatoria de elementos transposones en el genoma del huésped a través de una respuesta celular que destruye específicamente el ARN monocatenario homólogo o el ARN genómico viral.
Algunas realizaciones descritas en la presente memoria contemplan el empleo de dsARN para regular a la baja la expresión proteica del ARNm.
El término "ARNip" se refiere a pequeños ARN inhibidores bicatenarios (generalmente entre 18-30 pares de bases) que inducen la vía de interferencia de ARN (ARNi). Por lo general, los ARNip se sintetizan químicamente como 21 monómeros con una región doble central de 19 pb y salientes simétricos 3' de 2 bases en los extremos, aunque se ha descrito recientemente que los ARN dobles sintetizados químicamente de 25-30 bases de longitud pueden tener un aumento de la potencia de hasta 100 veces en comparación con 21 monómeros en la misma localización. Se especula que el aumento de la potencia observada obtenida empleando ARN más largos en la activación de ARNi es el resultado de proporcionar un Dicer con un sustrato (27 monómeros) en lugar de un producto (21 monómeros) y que esto mejora la velocidad o eficacia de entrada del ARNip bicatenario en RISC.
Las hebras de un ARN de interferencia bicatenario (por ejemplo, un ARNip) se pueden unir para formar una estructura de horquilla o de bucle (por ejemplo., un ARNhc o hc-ARN). Por tanto, como se mencionó, el agente silenciador de ARN de algunas realizaciones descritas en la presente memoria también puede ser un ARN en horquilla corta (ARNhc).
Los términos "ARNhc" o "hc-ARN", como se emplean en la presente memoria, se refieren a un agente de ARN que tiene una estructura de bucle, que comprende una primera y una segunda región de secuencia complementaria, siendo suficiente el grado de complementariedad y orientación de las regiones, tal que el emparejamiento de bases se produce entre las regiones, estando unidas la primera y la segunda regiones mediante una región de bucle, siendo el bucle el resultado de una falta de emparejamiento de bases entre nucleótidos (o análogos de nucleótidos) dentro de la región del bucle. El número de nucleótidos en el bucle es un número entre 3 y 23 inclusive, o 5 a 15, o 7 a 13, o 4 a 9, o 9 a 11. Algunos de los nucleótidos en el bucle pueden estar involucrados en las interacciones de los pares bases con otros nucleótidos en el bucle.
Se apreciará que el agente silenciador de ARN de algunas realizaciones descritas en la presente memoria no necesita limitarse a aquellas moléculas que contienen sólo ARN, sino que además abarca nucleótidos y no nucleótidos modificados químicamente.
En algunas realizaciones, el agente silenciador de ARN descrito en la presente memoria se puede asociar funcionalmente con un péptido que penetra en las células. Como se emplea en la presente memoria, un "péptido que penetra en las células" es un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos corta (aproximadamente 12-30 restos) o un motivo funcional que confiere propiedades de translocación independiente de energía (es decir, no endocitótica) asociadas con el transporte del complejo permeable a la membrana a través del plasma y/o de las membranas nucleares de una célula.
Según otra realización descrita en la presente memoria, el agente silenciador de ARN puede ser un miARN o una imitación del mismo.
El término "microARN", "miARN" y "miR" son sinónimos y se refieren a una colección de moléculas de ARN monocatenario no de codificacións de aproximadamente 19-28 nucleótidos de longitud, que regulan la expresión génica. Los miARN se encuentran en una amplia gama de organismos y se ha demostrado que desempeñan un papel en el desarrollo, la homeostasis, y la etiología de la enfermedad.
El término "imitador de microARN" se refiere a ARNs sintéticos no de codificacións que son capaces de entrar en la ruta del ARNi y regular la expresión génica. Los imitadores de miARN imitan la función de microARN endógenos (miARN) y pueden diseñarse como moléculas maduras de doble hebra o precursores imitadores (porejemplo, o premiARN). Los imitadores de miARN pueden estar compuestos de ARN, ADN, híbridos de ARN-ADN modificados o no modificados, o químicas alternativas de ácidos nucleicos (por ejemplo., LNA o ácidos nucleicos con puentes de etileno 2'-O, 4'-C (ENA)). Para imitadores de miARN de doble hebra maduros, la longitud de la región doble puede variar entre 13-33, 18-24 o 21-23 nucleótidos. El miARN también puede comprender un total de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 nucleótidos. La secuencia del miARN puede ser los primeros 13-33 nucleótidos del pre-miARN. La secuencia del miARN también puede ser los últimos 13-33 nucleótidos del pre-miARN.
Otro agente capaz de regular a la baja una diana es una molécula de ADNzima capaz de escindir específicamente un transcrito de ARNm o una secuencia de ADN de la diana. Las ADNzimas son polinucleótidos monocatenarios que son capaces de escindir secuencias diana tanto monocatenarias como bicatenarias. (Breaker et al., Chemistry and Biology 1995; 2:655; Santoro et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 1997; 943:4262). Se ha propuesto un modelo general (el modelo "10-23") para la ADNzima. Las ADNzimas "10-23" tienen un dominio catalítico de 15 desoxirribonucleótidos, flanqueado por dos dominios de reconocimiento de sustrato de siete a nueve desoxirribonucleótidos cada uno. Este tipo de ADNzima puede escindir eficazmente su sustrato ARN en las uniones purina: pirimidina. (Santoro et al.,; Khachigian, Curr. Opin. Mol. Ther. 2002; 4:119-121).
La regulación a la baja de una diana también puede verse afectada mediante el empleo de un polinucleótido antisentido capaz de hibridar específicamente con un transcrito de ARNm que codifica la diana.
Otro agente capaz de regular a la baja una diana es una molécula de ribozima capaz de escindir específicamente un transcrito de ARNm que codifica una diana. Las ribozimas se emplean cada vez más para la inhibición específica de la secuencia de la expresión génica mediante la escisión de ARNm que codifican proteínas de interés. (Welch et al., Curr. Opin. Biotechnol. 1998; 9: 486-96).
Otro agente capaz de regular a la baja una diana es cualquier molécula que se una a la diana y/o la escinda. Tales moléculas pueden ser antagonistas de la diana, o péptidos inhibidores de la diana.
Se apreciará que un análogo no funcional de al menos una porción catalítica o de unión de una diana también se puede emplear como un agente que regula a la baja la diana.
Otro agente que se puede emplear junto con algunas realizaciones de la invención para regular a la baja una diana es una molécula que previene la activación de la diana o la unión del sustrato.
En algunas realizaciones, un inhibidor de una proteína diana determinada inhibe la proteína mediante la unión a la proteína, mediante la unión a un compuesto que se une a la proteína (por ejemplo, un sustrato, una proteína reguladora) y/o mediante la unión a un oligonucleótido (por ejemplo, ARNm) que codifica la proteína.
En algunas realizaciones descritas en la presente memoria, el inhibidor de MOSPD2 es una molécula pequeña (por ejemplo, caracterizado por un peso molecular de menos de 800 Da). En algunas realizaciones descritas en la presente memoria, el inhibidor de MOSPD2 de molécula pequeña es un tocoferol o un derivado del mismo (por ejemplo, alfa-tocoferol, beta-tocoferol, gamma-tocoferol, delta-tocoferol), un triterpeno (por ejemplo, escualeno), una vitamina A o un derivado de la misma (por ejemplo, retinaldehído), un fosfatidilglicérido (por ejemplo, fosfatidilinositol), o un fosfolípido (por ejemplo, fosfatidilcolina, un fosfolípido oxidado).
En una realización descrita en la presente memoria, el fosfolípido oxidado. es 1-hexadecil-2-(4'-carboxi) butil-glicero-3-fosfocolina. En otra realización descrita en la presente memoria, el fosfolípido oxidado es (,fl>1-hexadecil-2- (4'-carboxi) butil-sn-glicero-3-fosfocolina.
En una realización descrita en la presente memoria, el fosfolípido oxidado es
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o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo.
En una realización descrita en la presente memoria, el fosfolípido oxidado es
Figure imgf000013_0002
o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo.
El inhibidor de MOSPD2 de molécula pequeña descrito en la presente memoria se puede emplear en solitario, como un agente único, en cualquiera de los usos descritos en la presente memoria o se puede emplear en combinación con otro agente (por ejemplo, otro inhibidor de MOSPD2 o un fármaco anticanceroso).
VB-201 inhibe la quimiotaxis de monocitos humanos in vitro y vías de señalización descendentes activadas de los receptores de quimioquinas. Por el contrario, VB-221, un derivado de VB-201, no inhibe la señalización ni la migración inducidas por quimioquinas en los monocitos humanos. También se encontró que el VB-201 marcado con ovoalbúmina se une y precipita MOSPD2 del lisado celular de monocitos CD14 humanos. Además, las células HEK293 transfectadas con MOSPD2 humana marcada con hemaglutinina (HA) y teñidas positivamente para HA tienen una fuerte unión a VB-201 marcada con ovoalbúmina, pero no para VB-221 marcada con ovoalbúmina. Estos y otros experimentos demuestran que 1) VB-201 se une a MOSPD2; 2) que el VB-201 inhibe la quimiotaxis celular y las vías descendentes mediadas por quimiotaxis; y 3) que la adición de VB-201 produce los mismos efectos de señalización que el silenciamiento de MOSPD2.
Como se describe en la presente memoria, en cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, los inhibidores de MOSPD2 de molécula pequeña útiles incluyen aquellos que son inhibidores más potentes de MOSPD2 (por ejemplo, MOSPD2 humano en la superficie celular de un monocito o célula cancerosa) en comparación con VB-221, por ejemplo, los que tienen un valor CI50 más bajo en comparación con el de VB-221. Más preferiblemente, los inhibidores útiles de MOSPD2 de molécula pequeña incluyen aquellos que son inhibidores iguales o más potentes de MOSPD2 (por ejemplo, MOSPD2 humano en la superficie celular de un monocito o célula cancerosa) cuando se compara con VB-201, por ejemplo, los que tienen un valor CI50 más bajo en comparación con el de VB-201. Como se entiende por los expertos en la técnica, un valor CI50 indica qué cantidad de un fármaco en particular u otra sustancia (inhibidor) se necesita para inhibir a la mitad un proceso biológico determinado (o componente de un proceso, es decir, una enzima, célula, receptor celular o microorganismo). Los métodos para determinar los valores CI50 son conocidos en la técnica.
Como se describe en la presente memoria, cuando un inhibidor de MOSPD2 de molécula pequeña (como se describe en la presente memoria) en una composición farmacéutica se administra en solitario a un sujeto como un agente único o en combinación con otro agente, el inhibidor de MOSPD2 de molécula pequeña (por ejemplo, VB-201) está presente en una cantidad tal que la administración causa al menos un 10% (por ejemplo, al menos el 20%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 99%, o más) de inhibición de una o más actividades de MOSPD2 (por ejemplo, MOSPD2 humano) (por ejemplo, expresión de MOSPD2, migración de células cancerosas, migración de monocitos asociada con el crecimiento tumoral (por ejemplo, presencia de macrófagos asociados a tumores), una vía de señalización de quimioquinas, una vía de señalización del factor de crecimiento, fosforilación del receptor EGF, fosforilación de ERK, fosforilación de AKT, y/o fosforilación de FAK). En algunas realizaciones descritas en la presente memoria, la administración del inhibidor de MOSPD2 de molécula pequeña a un sujeto humano causa al menos el 10% (por ejemplo, al menos el 20%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 99%, o más) de inhibición de una o más actividades de un MOSPD2 humano. En un aspecto, la administración del inhibidor de MOSPD2 de molécula pequeña causa de aproximadamente 10% a 100%, de aproximadamente 10% a aproximadamente 99%, de aproximadamente 10% a aproximadamente 95%, de aproximadamente 10% a aproximadamente 90%, de aproximadamente 10% a aproximadamente 85%, de aproximadamente 10% a aproximadamente 80%, de aproximadamente 10% a aproximadamente 70%, de aproximadamente 20% a aproximadamente 99%, de aproximadamente 20% a aproximadamente 95%, de aproximadamente 20% a aproximadamente 90%, desde aproximadamente 20% a aproximadamente 85%, de aproximadamente 20% a aproximadamente 80%, de aproximadamente 30% a aproximadamente 95%, de aproximadamente 30% a aproximadamente 90%, de aproximadamente 30% a aproximadamente 85%, de aproximadamente 30% a aproximadamente 80%, de aproximadamente 40% a aproximadamente el 95%, de aproximadamente el 40% a aproximadamente 90%, de aproximadamente 40% a aproximadamente el 85%, de aproximadamente el 40% a aproximadamente el 80%, de aproximadamente 50% a aproximadamente el 95%, de aproximadamente 50% a aproximadamente 90%, de aproximadamente 50% a aproximadamente 85%, de aproximadamente 50% a aproximadamente 80%, de aproximadamente 60% a aproximadamente 95%, de aproximadamente 60% a aproximadamente 90%, de aproximadamente 60% a aproximadamente aproximadamente 85%, o aproximadamente 60% a aproximadamente 80% de inhibición de una o más actividades de MOSPD2, por ejemplo, regulación de la migración de células cancerosas, migración de monocitos asociada con crecimiento tumoral, presencia de macrófagos asociados a tumores, vías de señalización de quimioquinas, vías de señalización del factor de crecimiento, fosforilación del receptor EGF, fosforilación de ERK, fosforilación de AKT, y/o fosforilación de FAK. Preferiblemente, el inhibidor de MOSPD2 de molécula pequeña es Vb -201.
En algunas realizaciones, un inhibidor de una proteína dada inhibe la proteína mediante la unión a la proteína y/o a un oligonucleótido (por ejemplo, ARNm) que codifica la proteína.
En otras realizaciones descritas en la presente memoria, el inhibidor de MOSPD2 es (i) una molécula de unión aislada que se une específicamente a un polipéptido de MOSPD2, (ii) una molécula de unión aislada que se une específicamente a un ligando de un polipéptido de MOSPD2, (iii) un antisuero producido contra un polipéptido MOSPD2, (iv) un polipéptido MOSPD2 soluble, o (v) un polipéptido MOSPD2 soluble que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un dominio extracelular de un polipéptido MOSPD2.
En otras realizaciones según la invención, el inhibidor es un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido MOSPD2. En otras realizaciones, el inhibidor es un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido MOSPD2. En otras realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo policlonal, monoclonal, murino, humano, humanizado, quimérico, o monocatenario. En otras realizaciones, el fragmento de unión a antígeno es un Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, fragmento sdFv, dominio VH, o dominio VL.
En algunas realizaciones, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en la presente memoria, que se une específicamente a MOSPD2 (por ejemplo, MOSPD2 humano), comprende un VH, un VL, o un VH y VL. En otras realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región constante.
En algunas realizaciones, el VH, VL, o VH y VL comprenden una o más regiones determinantes de complementariedad (CDRs). En algunas realizaciones, el VH comprende CDR1, CDR2, CDR3, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el VL comprende CDR1, CDR2, CDR3, o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, el VH, VL, o VH y VL comprenden una o más regiones marco (FRs). En algunas realizaciones, el VH comprende FR1, FR2, FR3, FR4, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el VL comprende FR1, FR2, FR3, FR4, o cualquier combinación de los mismos.
En una realización particular, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en la presente memoria, que se une específicamente a MOSPD2 (por ejemplo, MOSPD2 humano), comprende un VH que comprende CDR1, CDR2, y CDR3, y un VL que comprende CDR1, CDR2, y CDR3.
En otras realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden una región constante. En algunas realizaciones, la región constante de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de una región constante de la cadena ligera kappa humana o una región constante de la cadena ligera lambda humana. En algunas realizaciones, la región constante de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de una región constante de la cadena pesada gamma humana. Se han descrito ejemplos no limitantes de secuencias de regiones constantes humanas, por ejemplo, véase la Patente U.S. N° 5.693.780 y Kabat, EA et al., (1991). En algunas realizaciones, se ha modificado la secuencia de aminoácidos de la región constante (por ejemplo, una, dos o más sustituciones de aminoácidos) de manera que tenga al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, o al menos el 99% de identidad de secuencia con un secuencia humana nativa. En otro aspecto, en la presente memoria se proporcionan anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que reconocen o se unen a un epítopo de MOSPD2 (por ejemplo, un epítopo de MOSPD2 humano). En otro aspecto, se proporcionan en la presente memoria anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que reconocen o se unen al mismo epítopo o a un epítopo superpuesto de MOSPD2 (por ejemplo, MOSPD2 humano) como un anticuerpo descrito en la presente memoria (por ejemplo, un anticuerpo descrito en el Ejemplo 1 o 8). En otro aspecto, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos reconocen más de un epítopo de MOSPD2 (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco o seis epítopos).
En determinadas realizaciones, un epítopo de MOSPD2 se puede determinar mediante uno o más métodos descritos en la bibliografía, por ejemplo, espectroscopia de RMN, estudios de cristalografía de difracción de rayos X, ensayos de ELISA, intercambio de hidrógeno/deuterio junto con espectrometría de masas (por ejemplo, espectrometría de masas MALDI), ensayos de barrido de oligopéptidos basados en matrices, y/o mapeo de mutagénesis (por ejemplo, mapeo de mutagénesis dirigida al sitio). Para la cristalografía de rayos X, la cristalización se puede lograr empleando métodos descritos en la bibliografía (por ejemplo, Giegé R et al., (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50 (Parte 4): 339-350; McPherson A (1990) Eur J Biochem 189: 1-23.; Chayen NE (1997) Estructura 5: 1269-1274; McPherson A (1976) J Biol Chem 251: 6300-6303). Los cristales de antígeno:anticuerpo se pueden estudiar empleando técnicas de difracción de rayos X bien conocidas y se pueden perfeccionar empleando un programa informático de ordenador, tal como X-PLOR (Universidad de Yale, 1992, distribuido por Molecular Simulations, Inc .; véase, por ejemplo Meth Enzymol (1985) volúmenes 114 y 115, eds Wyckoff HW et al.,; Solicitud de Patente U.S. N° 2004/0014194), y BUSTER (Bricogne G (1993) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49 (Parte 1): 37-60; Bricogne G (1997) Meth Enzymol 276A: 361-423, ed Carter CW; Roversi P et al., (2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56 (Parte 10): 1316-1323). Los estudios de mapeo de mutagénesis se pueden realizar empleando métodos descritos en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Champe M et al., (1995) supra y Cunningham BC y Wells JA (1989) supra para obtener una descripción de las técnicas de mutagénesis, que incluyen las técnicas de mutagénesis de exploración con alanina. En una realización específica, se determina un epítopo de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo empleando estudios de mutagénesis de exploración de alanina. La caracterización del epítopo de un anticuerpo también se puede determinar mediante los métodos proporcionados en Ravn et al., Journal of Biological Chemistry 288: 19760-19772 (2013).
Además, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que reconocen o se unen a los mismos o a epítopos superpuestos de MOSPD2 (por ejemplo, MOSPD2 humano) se puede identificar empleando técnicas rutinarias, tales como un inmunoensayo, por ejemplo, mostrando la capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno diana, es decir, un ensayo de unión competitiva. La unión competitiva se puede determinar en un ensayo en el que la inmunoglobulina bajo ensayo inhibe la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común, tal como MOSPD2. Se han descrito numerosos tipos de ensayos de unión competitiva, por ejemplo: radioinmunoensayo directo o indirecto (RIA) en fase sólida, inmunoensayo enzimático (EIA) directo o indirecto en fase sólida, ensayo de competición en sándwich (véase Stahli C et al., (1983) Methods Enzymol 9: 242-253); EIA biotina-avidina directa en fase sólida (véase Kirkland TN et al., (1986) J Immunol 137: 3614-9); ensayo de marcaje directo en fase sólida, ensayo sándwich de marcaje directo en fase sólida (véase Harlow E & Lane D, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); RIA marcaje directo de fase sólida empleando marcaje 1-125 (véase Morel g A et al., (1988) Mol Immunol 25 (1): 7-15); EIA biotina-avidina directa en fase sólida (Cheung RC et al., (1990) Virology 176: 546-52); y mareaje directo RIA (Moldenhauer G et al., (1990) Scand J Immunol 32: 77-82). Normalmente, dicho ensayo implica el empleo de antígeno purificado (por ejemplo, MOSPD2, tal como MOSPD2 humano) unido a una superficie sólida o a células que portan cualquiera de estos, una inmunoglobulina de ensayo sin marcar y una inmunoglobulina de referencia marcada. La inhibición competitiva se puede medir determinando la cantidad de marcador unido a la superficie sólida o a las células en presencia de la inmunoglobulina de ensayo. Por lo general, la inmunoglobulina de ensayo está presente en exceso. Por lo general, cuando un anticuerpo competidor está presente en exceso, inhibirá la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común en al menos 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70% 70-75% o más. Un ensayo de unión competitiva se puede configurar en un gran número de formatos diferentes empleando bien el antígeno marcado o bien el anticuerpo marcado. En una versión común de este ensayo, el antígeno se inmoviliza en una placa de 96 pocillos. A continuación, se mide la capacidad de los anticuerpos no marcados para bloquear la unión de los anticuerpos marcados al antígeno empleando marcadores radiactivos o enzimáticos. Para mas detalles véase, por ejemplo, Wagener C et al., (1983) J Immunol 130: 2308-2315; Wagener C et al., (1984) J Immunol Methods 68: 269-274; Kuroki M et al., (1990) Cancer Res 50: 4872-4879; Kuroki M et al., (1992) Immunol Invest 21: 523-538; Kuroki M et al., (1992) Hybridoma 11: 391-407 y Antibodies: A Laboratory Manual, editores de Ed Harlow E y Lane D, supra, págs. 386-389.
En una realización, se realiza un ensayo de competición empleando resonancia de plasmón de superficie (BIAcore®), por ejemplo, mediante un "enfoque en tándem", tal como el descrito por Abdiche YN et al., (2009) Analytical Biochem 386: 172-180, por lo que el antígeno MOSPD2 se inmoviliza en la superficie del chip, por ejemplo, un chip sensor CM5 y los anticuerpos anti-MOSPD2 se pasan luego sobre el chip. Para determinar si un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo compite con un anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en la presente memoria, el anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo se pasa primero sobre la superficie del chip para lograr la saturación y después se añade el potencial anticuerpo competidor. A continuación, se puede determinar y cuantificar la unión del anticuerpo competidor en relación con un control no competitivo.
En determinados aspectos, se pueden emplear ensayos de unión competitiva para determinar si un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo está bloqueado competitivamente, por ejemplo, de una manera dependiente de la dosis, mediante por ejemplo otro anticuerpo, un anticuerpo se une esencialmente al mismo epítopo, o epítopos superpuestos, como anticuerpo de referencia, cuando los dos anticuerpos reconocen epítopos idénticos o que se superponen estéricamente en ensayos de unión competitiva, tal como los ensayos ELISA de competición, que se pueden configurar en todos los formatos diferentes, empleando bien antígeno marcado o bien anticuerpo marcado. En una realización particular, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se puede ensayar en ensayos de unión competitiva con un anticuerpo descrito en la presente memoria (por ejemplo, los del Ejemplo 1 o 8), o un anticuerpo quimérico o Fab del mismo, o un anticuerpo que comprende CDRs VH y CDRs VL de un anticuerpo descrito en la presente memoria (por ejemplo, los del Ejemplo 1 o 8).
Por consiguiente, en un determinado aspecto, en la presente memoria se proporcionan anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que compiten (por ejemplo, de una manera dependiente de la dosis) para unirse a MOSPD2 (por ejemplo, MOSPD2 humano) con un anticuerpo descrito en la presente memoria (por ejemplo, Ejemplo 1 o 8), como se determina empleando ensayos conocidos por un experto en la técnica o descritos en la presente memoria (porejemplo, Ensayos competitivos ELISA, resonancia de plasmón superficial o análisis Scatchard).
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-MOSPD2 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la invención se unen específicamente a una o más de las siguientes regiones de aminoácidos (epítopos) de MOSPD2, numeradas según SEQ ID NO: 1 (1-518 restos de aminoácidos ): 508-517, 501-514, 233-241, 509-517, 212-221, 13­ 24, 505-517, 505-514, 89-100, 506-517, 233-245, 504-514, 128-136, 218-226, 15-24, 83-96, 42-50, 462-474, 340­ 351, 504-517, 462-470, 327-337, 21-32, 217-226, 510-517, 178-190, 497-509, 504-516, 64-77, 504-515, 147-159, 503-315, 88-97, 208-218, 178-191, 502-515, 503-516, 497-505, 500-509, 189-202, 189-197, 505-516, 1-63, 82-239, 93-234, 327-445, 327-431, y 497-517.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-MOSPD2 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la invención se unen específicamente a una o más de las siguientes regiones de aminoácidos (epítopos) de MOSPD2, numeradas según SEQ ID NO: 1 (1-518 restos de aminoácidos): de aproximadamente 508 a aproximadamente 517, de aproximadamente 501 a aproximadamente 514, de aproximadamente 233 a aproximadamente 241, de aproximadamente 509 a aproximadamente 517, de aproximadamente 212 a aproximadamente 221, de aproximadamente 13 a aproximadamente 24, de aproximadamente 505 a aproximadamente 517, de aproximadamente 505 a aproximadamente 514, de aproximadamente 89 a aproximadamente 100, de aproximadamente 506 a aproximadamente 517, de aproximadamente 233 a aproximadamente 245, de aproximadamente 504 a aproximadamente 514, de aproximadamente 128 a aproximadamente 136, de aproximadamente 218 a aproximadamente 226, de aproximadamente 15 a aproximadamente 24, de aproximadamente 83 a aproximadamente 96, de aproximadamente 42 a aproximadamente 50, de aproximadamente 462 a aproximadamente 474, de aproximadamente 340 a aproximadamente 351, de aproximadamente 504 a aproximadamente 517, de aproximadamente 462 a aproximadamente 470, de aproximadamente 327 a aproximadamente 337, de aproximadamente 21 a aproximadamente 32, de aproximadamente 217 a aproximadamente 226, de aproximadamente 510 a aproximadamente 517 , de aproximadamente 178 a aproximadamente 190, de aproximadamente 497 a aproximadamente 509, de aproximadamente 504 a aproximadamente 516, de aproximadamente 64 a aproximadamente 77, de aproximadamente 504 a aproximadamente 515, de aproximadamente 147 a aproximadamente 159, de aproximadamente 503 a aproximadamente 515, de aproximadamente 88 a aproximadamente 97, de aproximadamente 208 a aproximadamente 218, de aproximadamente 178 a aproximadamente 191, de aproximadamente 502 a aproximadamente 515, de aproximadamente 503 a aproximadamente 516, de aproximadamente 497 a aproximadamente 505, de aproximadamente 500 a aproximadamente 509, de aproximadamente 189 a aproximadamente 202 , de aproximadamente 189 a aproximadamente 197, de aproximadamente 505 a aproximadamente 516, de aproximadamente 1 a aproximadamente 63, de aproximadamente 82 a aproximadamente 239, de aproximadamente 93 a aproximadamente 234, de aproximadamente 327 a aproximadamente 445, de aproximadamente 327 a aproximadamente 431, y de aproximadamente 497 a aproximadamente 517.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-MOSPD2 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la invención se unen específicamente a una o más de las siguientes regiones de aminoácidos (epítopos) de MOSPD2, numeradas según SEQ ID NO: 1 (1-518 restos de aminoácidos): de aproximadamente 505 a aproximadamente 515, de aproximadamente 500 a aproximadamente 515, de aproximadamente 230 a aproximadamente 240, de aproximadamente 510 a aproximadamente 520, de aproximadamente 210 a aproximadamente 220, de aproximadamente 15 a aproximadamente 25, de aproximadamente 505 a aproximadamente 520, de aproximadamente 505 a aproximadamente 515, de aproximadamente 90 a aproximadamente 100, de aproximadamente 505 a aproximadamente 525, de aproximadamente 230 a aproximadamente 245, de aproximadamente 505 a aproximadamente 510, de aproximadamente 130 a aproximadamente 140, de aproximadamente 220 a aproximadamente 230, de aproximadamente 15 a aproximadamente 30, de aproximadamente 80 a aproximadamente 95, de aproximadamente 40 a aproximadamente 50, de aproximadamente 460 a aproximadamente 475, de aproximadamente 340 a aproximadamente 350, de aproximadamente 500 a aproximadamente 515, de aproximadamente 460 a aproximadamente 470, de aproximadamente 325 a aproximadamente 335, de aproximadamente 20 a aproximadamente 35, de aproximadamente 215 a aproximadamente 225, de aproximadamente 510 a aproximadamente 520, de aproximadamente 175 a aproximadamente 190, de aproximadamente 500 a aproximadamente 510, de aproximadamente 505 a aproximadamente 530, de aproximadamente 60 a aproximadamente 75, de aproximadamente 500 a aproximadamente 520, de aproximadamente 145 a aproximadamente 160, de aproximadamente 502 a aproximadamente t 515, aproximadamente 85 a aproximadamente 100, aproximadamente 205 a aproximadamente 220, de aproximadamente 175 a aproximadamente 190, de aproximadamente 500 a aproximadamente 505, de aproximadamente 500 a aproximadamente 525, de aproximadamente 495 a aproximadamente 505, de aproximadamente 495 a aproximadamente 510, de aproximadamente 190 a aproximadamente 200, de aproximadamente 190 a aproximadamente 198, de aproximadamente 502 a aproximadamente 515, de aproximadamente 1 a aproximadamente 60, de aproximadamente 80 a aproximadamente 240, de aproximadamente 90 a aproximadamente 235, de aproximadamente 330 a aproximadamente 445, de aproximadamente 330 a aproximadamente 430, y de aproximadamente 495 a aproximadamente 515.
En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la invención se unen a MOSPD2 con una constante de disociación de equilibrio anticuerpo-antígeno (Kd) de aproximadamente 10-6 M a aproximadamente 10-12 M, o cualquier intervalo de valores del mismo (por ejemplo, de aproximadamente 10-7 M a aproximadamente 10-12, de 10-8 M a aproximadamente 10-12 M, de aproximadamente 10-9 M a aproximadamente 10-12 M, de aproximadamente 10-10 M a aproximadamente 10-12 M, de aproximadamente 10-11 M a aproximadamente 10-12 M, de aproximadamente 10-6 M a aproximadamente 10-11 M, de aproximadamente 10-7 M a aproximadamente 10-11 M, de aproximadamente 10-8 M a aproximadamente 10-11 M, de aproximadamente 10-9 M a aproximadamente 10-11 M, de aproximadamente 10-10 M a aproximadamente 10-11 M, de aproximadamente 10-6 M a aproximadamente 10-10 M, de aproximadamente 10-7 M a aproximadamente 10-10 M, de aproximadamente 10-8 M a aproximadamente 10-10 M, de aproximadamente 10-9 M a aproximadamente 10-10 M, de aproximadamente 10-6 M a aproximadamente 10-9 M, de aproximadamente 10-7 M a aproximadamente 10-9 M, de aproximadamente 10-8 M a aproximadamente 10-9 M, de aproximadamente 10-6 M a aproximadamente 10-8 M, o de aproximadamente 10-7 M a aproximadamente 10-8). En otras realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo tiene una Kd de aproximadamente 10­ 6 M, aproximadamente 10-7 M, aproximadamente 10-8 M, aproximadamente 10-9 M, aproximadamente 10-10 M, aproximadamente 10-11 M, o aproximadamente 10-12 M. En algunas realizaciones, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno se une a uno o más epítopos en MOSPD2. En algunas realizaciones, la Kd se determina mediante análisis de Scatchard, resonancia de plasmón superficial, u otro método descrito en la presente memoria, en algunas realizaciones, a 37°C.
En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la invención se unen a MOSPD2 con una Kon de aproximadamente 103 l/Ms a aproximadamente 106 l/Ms, o cualquier intervalo de valores del mismo (por ejemplo, de aproximadamente 103 l/Ms a aproximadamente 1051/Ms, de aproximadamente 1041/Ms a aproximadamente 105 l/Ms, de aproximadamente 104 l/Ms a aproximadamente 106 l/Ms, de aproximadamente 1051/Ms a aproximadamente 106 l/Ms, o de aproximadamente 1031/Ms a aproximadamente 104 l/Ms). En otras realizaciones, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno tiene una Kon de aproximadamente 103 l/Ms, aproximadamente 104 l/Ms, aproximadamente 105 l/Ms, o aproximadamente 106 l/Ms.
En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la invención se unen a MOSPD2 con una Koff de aproximadamente 10-3 l/s a aproximadamente 10-6 l/s, o cualquier intervalo de valores del mismo (por ejemplo, de aproximadamente 10-3 l/s a aproximadamente 10-51/s, de aproximadamente 10-41/s a aproximadamente 10-51/s, de aproximadamente 10-4 l/s a aproximadamente 10-61/s, de aproximadamente 10-5 l/s a aproximadamente 10-61/s, o de aproximadamente 10-31/s a aproximadamente 10-4 l/s). En otras realizaciones, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno tiene una Koff de aproximadamente 10-3 l/s, aproximadamente 10-4 l/s, aproximadamente 10-51/s, o aproximadamente 10-6 l/s.
En otras realizaciones descritas en la presente memoria, el inhibidor de MOSPD2 es un ARNi, miARN ARNip, ARNhc, un ARN antisentido, un ADN antisentido, una molécula señuelo, un ADN señuelo, un ADN bicatenario, un ADN monocatenario, un complejo ADN, un ADN encapsulado, un ADN viral, un ADN plasmídico, un ARN desnudo, un ARN encapsulado, un ARN viral, un ARN bicatenario, una molécula capaz de generar ARN de interferencia o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones descritas en la presente memoria, el inhibidor se hibrida con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido MOSPD2. En algunas realizaciones, la hibridación se realiza en condiciones rigurosas o en condiciones muy rigurosas.
En algunas realizaciones descritas en la presente memoria, el inhibidor es un sistema CRISPR-CAS9 de repeticiones palindrómicas cortas, agrupadas y regularmente interespaciadas.
En realizaciones adicionales, un polipéptido MOSPD2 tiene una secuencia de al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o 100% idéntica a cualquiera de las SEQ ID NOs:1-4. En otras realizaciones, el polipéptido MOSPD2 tiene una secuencia de al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos un 99% idéntica a cualquiera de las SEQ ID NOs:1-4. En otras realizaciones, el polipéptido MOSPD2 tiene una secuencia de aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% o aproximadamente 99% idéntica a cualquiera de las SEQ ID NOs:1-4. En otras realizaciones, el polipéptido MOSPD2 tiene una secuencia con 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad con cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-4. En otras realizaciones, el polipéptido MOSPD2 tiene una secuencia con aproximadamente 75% a 100% de identidad con cualquiera de las SEQ ID NOs:1-4, o cualquier intervalo de valores de las mismas, por ejemplo, de aproximadamente 80% a 100% de identidad, de aproximadamente 85% a 100% de identidad, de aproximadamente 90% a 100% de identidad, de aproximadamente 95% a 100% de identidad, de aproximadamente 96% a 100% de identidad, de aproximadamente 97% a 100% de identidad, de aproximadamente 98% a 100% de identidad, de aproximadamente 99% a aproximadamente 100% de identidad, de aproximadamente 75% a aproximadamente 99% de identidad, de aproximadamente 80% a aproximadamente 99% de identidad, de aproximadamente 85% a aproximadamente 99% de identidad, de aproximadamente 90% a aproximadamente 99% de identidad, de aproximadamente 95% a aproximadamente 99% de identidad, de aproximadamente 96% a aproximadamente 99% de identidad, de aproximadamente 97% a aproximadamente 99% de identidad, de aproximadamente 98% a aproximadamente 99% de identidad, de aproximadamente 99% a aproximadamente 100% de identidad, de aproximadamente 75% a aproximadamente 95% de identidad, de aproximadamente 80% a aproximadamente 95% de identidad, de aproximadamente 85% a aproximadamente 95% de identidad, o de aproximadamente 90% a aproximadamente 95% de identidad a cualquiera de las SEQ ID NOs:1-4.
En realizaciones adicionales, el polipéptido MOSPD2 está codificado por una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99%, o 100% de identidad con cualquiera de las SEQ ID NOs:5-8. En otras realizaciones, el polipéptido MOSPD2 está codificado por una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos al menos 98%, o al menos 99% de identidad con cualquiera de las SEQ ID NOs:5-8. En otras realizaciones, el polipéptido MOSPD2 está codificado por una secuencia de polinucleótidos que tiene aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, o aproximadamente 99% de identidad con cualquiera de las SEQ ID NOs:5-8. En otras realizaciones, el polipéptido MOSPD2 está codificado por una secuencia de polinucleótidos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica a cualquiera de las SEQ ID NOs:1-4. En otras realizaciones, el polipéptido MOSPD2 está codificado por una secuencia de polinucleótidos que tiene de aproximadamente 75% a 100% de identidad con cualquiera de las SEQ ID NOs:5-8, o cualquier intervalo de valores de la misma, por ejemplo, de aproximadamente 80% a 100 % de identidad, de aproximadamente 85% a 100% de identidad, de aproximadamente 90% a 100% de identidad, de aproximadamente 95% a 100% de identidad, de aproximadamente 96% a 100% de identidad, de aproximadamente 97% a 100% de identidad, de aproximadamente 98% a 100% de identidad, de aproximadamente 99% a aproximadamente 100% de identidad, de aproximadamente 75% a aproximadamente 99% de identidad, de aproximadamente 80% a aproximadamente 99% de identidad, de aproximadamente 85% a aproximadamente 99% de identidad, de aproximadamente 90 % a aproximadamente 99% de identidad, de aproximadamente 95% a aproximadamente 99% de identidad, de aproximadamente 96% a aproximadamente 99% de identidad, de aproximadamente 97% a aproximadamente 99% de identidad, de aproximadamente 98% a aproximadamente 99% de identidad, de aproximadamente 99% a aproximadamente 100% de identidad, de aproximadamente 75% a aproximadamente 95% de identidad, de aproximadamente 80% a aproximadamente 95% de identidad, de aproximadamente 85% a aproximadamente 95% de identidad, o de aproximadamente 90% a aproximadamente 95% de identidad a cualquiera de las SEQ ID NOs: 5-8.
En cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, un inhibidor de MOSPD2 puede ser un inhibidor de MOSPD2 expresado por una célula cancerosa, por ejemplo, una célula cancerosa humana. La lista no exclusiva de tipos de células cancerosas incluye células de cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de esófago, cáncer de vesícula biliar, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de estómago, cáncer de cuello uterino, cáncer de tiroides, cáncer de próstata, cáncer de piel, cáncer hematopoyético, cáncer de origen mesenquimal, cáncer del sistema nervioso central o periférico, cáncer de endometrio, cáncer de cabeza y cuello, glioblastoma, y ascitis maligna. En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer de pulmón de células pequeñas o un cáncer de pulmón de células no pequeñas. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de piel, por ejemplo, carcinoma de células escamosas, cáncer de células basales, melanoma, dermatofibrosarcoma protuberans, carcinoma de células de Merkel, sarcoma de Kaposi, queratoacantoma, tumores de células fusiformes, carcinomas sebáceos, carcinoma anexial microquístico, enfermedad de Paget de mama, fibroxantoma atípico, leiomiosarcoma, o angioacantoma. En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer hematopoyético de linaje linfoide, por ejemplo, leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de células B, linfoma de células T, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, linfoma de células pilosas o linfoma de Burkitt. En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer hematopoyético de linaje mieloide, por ejemplo, fibrosarcoma, rabdomiosarcoma, sarcoma de tejidos blandos, o sarcoma óseo. En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer del sistema nervioso central o periférico, por ejemplo, astrocitoma, neuroblastoma, glioma, o schwannomas. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer anal, cáncer óseo, cáncer de estoma gastrointestinal, enfermedad trofoblástica gestacional, linfoma de Hodgkin, sarcoma de Kaposi, queratoacantoma, mesotelioma maligno, enfermedad de Castleman multicéntrica, mieloma múltiple y otras neoplasias de células plasmáticas, neoplasias mieloproliferativas, neuroblastoma, linfoma, no Hodgkin, osteosarcoma, cáncer de ovario, de trompas de Falopio, o cáncer primario de peritoneo, cáncer de pene, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, seminoma, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de estómago (gástrico), cáncer testicular, teratocarcinoma, cáncer folicular de tiroides, cáncer vaginal, cáncer vulvar, Tumor de Wilms y otros cánceres renales infantiles, y xeroderma pigmentoso. En algunas realizaciones, el cáncer es cáncer de vejiga, cáncer de cerebro (por ejemplo, astrocitoma del cerebro), cáncer de mama, cáncer de colon (por ejemplo, adenocarcinoma de colon), cáncer de esófago (por ejemplo., adenocarcinoma de esófago), cáncer de pulmón, cáncer de piel (por ejemplo, melanoma), cáncer de lengua (p.ej, carcinoma de células de cabeza y cuello (lengua)), cáncer de riñón (por ejemplo., carcinoma de células claras de riñón) o cáncer hepático (por ejemplo, carcinoma hepatocelular).
Composiciones farmacéuticas
También se describen en la presente memoria terapias contra cánceres que expresan MOSPD2 empleando una composición farmacéutica que comprende cantidades eficaces de un inhibidor de MOSPD2 y un vehículo aceptable farmacéuticamente. Los inhibidores adecuados se describen en la presente memoria como tipos adecuados de cáncer. En particular, el inhibidor puede ser un anticuerpo anti-MOSPD2 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y la cantidad eficaz terapéuticamente es de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 10 pg/ml, o cualquier intervalo de valores del mismo (por ejemplo, de aproximadamente 2 pg/ml a aproximadamente 10 pg/ml, de aproximadamente 3 pg/ml a aproximadamente 10 pg/ml, de aproximadamente 4 pg/ml a aproximadamente 10 pg/ml, de aproximadamente 5 pg/ml a aproximadamente 10 pg/ml, de aproximadamente 6 pg/ml a aproximadamente 10 pg/ml, de aproximadamente 7 pg/ml a aproximadamente 10 pg/ml, de aproximadamente 8 pg/ml a aproximadamente 10 pg/ml, de aproximadamente 9 pg/ml a aproximadamente 10 pg/ml, de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 9 pg/ml, de aproximadamente 2 pg/ml a aproximadamente 9 pg/ml, de aproximadamente 3 pg/ml a aproximadamente 9 pg/ml, de aproximadamente 4 pg/ml a aproximadamente 9 pg/ml, de aproximadamente 5 pg/ml a aproximadamente 9 pg/ml, de aproximadamente 6 pg/ml a aproximadamente 9 pg/ml, de aproximadamente 7 pg/ml a aproximadamente 9 pg/ml, de aproximadamente 8 pg/ml a aproximadamente 9 pg/ml, de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 8 pg/ml, de aproximadamente 2 pg/ml a aproximadamente 8 pg/ml, de aproximadamente 3 pg/ml a aproximadamente 8 pg/ml, de aproximadamente 4 pg/ml a aproximadamente 8 pg/ml, de aproximadamente 5 pg/ml a aproximadamente 8 pg/ml, de aproximadamente 6 pg/ml a aproximadamente 8 pg/ml, de aproximadamente 7 pg/ml a aproximadamente 8 pg/ml , de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 7 pg/ml, de aproximadamente 2 pg/ml a aproximadamente 7 pg/ml, de aproximadamente 3 pg/ml a aproximadamente 7 pg/ml, de aproximadamente 4 pg/ml a aproximadamente 7 pg/ml, de aproximadamente 5 pg/ml a aproximadamente 7 pg/ml, de aproximadamente 6 pg/ml a aproximadamente 7 pg/ml, de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 6 pg/ml, de aproximadamente 2 pg/ml a aproximadamente 6 pg/ml, de aproximadamente 3 pg/ml a aproximadamente 6 pg/ml, de aproximadamente 4 pg/ml a aproximadamente 6 pg/ml, de aproximadamente 5 pg/ml a aproximadamente 6 pg/ml, de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 5 pg/ml, de aproximadamente 2 pg/ml a aproximadamente 5 pg/ml, de aproximadamente 3 pg/ml a aproximadamente 5 pg/ml, de aproximadamente 4 pg/ml a aproximadamente 5 pg/ml, de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 4 pg/ml, de aproximadamente 2 pg/ml a aproximadamente 4 pg/ml, de aproximadamente 3 pg/ml a aproximadamente 4 pg/ml, de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 3 pg/ml, de aproximadamente 2 pg/ml a aproximadamente 3 pg/ml, o de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 2 pg/ml). En otras realizaciones, el inhibidor de MOSPD2 es un anticuerpo anti-MOSPD2 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y la cantidad eficaz terapéuticamente es aproximadamente 1 pg/ml, aproximadamente 2 pg/ml, aproximadamente 3 pg/ml, aproximadamente 4 pg/ml, aproximadamente 5 pg/ml, aproximadamente 6 pg/ml, aproximadamente 7 pg/ml, aproximadamente 8 pg/ml, aproximadamente 9 pg/ml, o aproximadamente 10 pg/ml.
En algunas realizaciones, el inhibidor de MOSPD2 es un anticuerpo anti-MOSPD2 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y la cantidad eficaz terapéuticamente es de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, o cualquier intervalo de valores del mismo (por ejemplo de aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 25 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 30 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 35 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 35 mg/kg, de aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 35 mg/kg, de aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 35 mg/kg, de aproximadamente 25 mg/kg a aproximadamente 35 mg/kg, de aproximadamente 30 mg/kg a aproximadamente 35 mg/kg, de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 25 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 25 mg/kg, de aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 25 mg/kg, de aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 25 mg/kg, de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, o de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 15 mg/kg). En otras realizaciones, el inhibidor de MOSPD2 es un anticuerpo anti-MOSPD2 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y la cantidad eficaz terapéuticamente es aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 15 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 25 mg/kg, aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 35 mg/kg, o aproximadamente 40 mg/kg.
En algunas realizaciones, el inhibidor de MOSPD2 (es decir, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo) está presente en una cantidad tal que la administración del inhibidor de MOSPD2 causa al menos un 10% (por ejemplo, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 99%, o más) de inhibición de una o más actividades de MOSPD2 (por ejemplo, MOSPD2 humano, por ejemplo, MOSPD2 expresado por una célula cancerosa humana) (por ejemplo, expresión de MOSPD2, migración de células cancerosas, migración de monocitos asociada con el crecimiento tumoral (por ejemplo, presencia de macrófagos asociados a tumores), una vía de señalización de quimioquinas, una vía de señalización del factor de crecimiento, fosforilación del receptor EGF, fosforilación de ERK, fosforilación de AKT, y/o fosforilación de FAK). En algunas realizaciones, la administración del inhibidor de MOSPD2 a un sujeto humano causa al menos un 10% (por ejemplo, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 99%, o más) de inhibición de una o más actividades de un MOSPD2 humano, por ejemplo, MOSPD2 expresado por una célula cancerosa humana.
En otro aspecto, la administración del inhibidor de MOSPD2 (es decir, el anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo) causa de aproximadamente 10% a 100%, de aproximadamente 10% a aproximadamente 99%, de aproximadamente 10% a aproximadamente 95%, de aproximadamente 10% a aproximadamente 90%, de aproximadamente 10% a aproximadamente 85%, de aproximadamente 10% a aproximadamente 80%, de aproximadamente 10% a aproximadamente 70%, de aproximadamente 20% a aproximadamente 99%, de aproximadamente 20% a aproximadamente 95%, de aproximadamente 20% a aproximadamente 90%, de aproximadamente 20% a aproximadamente 85%, de aproximadamente 20% a aproximadamente 80%, de aproximadamente 30% a aproximadamente 95%, de aproximadamente 30% a aproximadamente 90%, de aproximadamente 30% a aproximadamente 85%, de aproximadamente 30% a aproximadamente 80%, de aproximadamente 40% a aproximadamente 95%, de aproximadamente 40% a aproximadamente 90%, de aproximadamente 40% a aproximadamente 85%, de aproximadamente 40% a aproximadamente 80%, de aproximadamente 50% a aproximadamente 95%, de aproximadamente 50% a aproximadamente 90%, de aproximadamente 50% a aproximadamente 85%, de aproximadamente 50% a aproximadamente 80%, de aproximadamente 60% a aproximadamente 95%, de aproximadamente 60% a aproximadamente 90%, de aproximadamente 60% a aproximadamente 85%, o de aproximadamente 60% a aproximadamente 80% de inhibición de una o más actividades de MOSPD2, por ejemplo, regulación de la migración de células cancerosas, migración de monocitos asociada con el crecimiento tumoral, presencia de macrófagos asociados a tumores, vías de señalización de quimioquinas, vías de señalización del factor de crecimiento, fosforilación del receptor EGF, fosforilación de ERK, fosforilación de AKT, y/o fosforilación de FAK.
Como se emplea en la presente memoria, una "composición farmacéutica" se refiere a una preparación de uno o más agentes como se describe en la presente memoria (por ejemplo, un inhibidor de MOSPD2, o un inhibidor de MOSPD2 con uno o más de los demás agentes descritos en la presente memoria), o sales o profármacos de los mismos aceptables fisiológicamente, con otros componentes químicos, que incluyen, pero no se limitan a, vehículos, excipientes, lubricantes, agentes reguladores agentes antibacterianos, agentes de carga (por ejemplo, manitol), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico o bisulfito de sodio) aceptables farmacéuticamente, y similares. El propósito de la composición farmacéutica es facilitar la administración del agente de los agentes a un sujeto.
Como se emplea en la presente memoria, "administración" o "administrar" a un sujeto incluye, pero no se limita a, el acto de un médico u otro profesional médico de prescribir una composición farmacéutica de la invención para un sujeto. La administración puede ser una administración local, por ejemplo, una administración intra-tumoral.
En la presente memoria, la frase "vehículo aceptable farmacéuticamente" se refiere a un vehículo o diluyente que no causa una irritación significativa al sujeto y no anula la actividad biológica y las propiedades del agente o agentes descritos en la presente memoria.
Como se emplea en la presente memoria, el término "vehículo" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente, o vehículo con el que se administra el agente terapéutico.
En la presente memoria, el término "excipiente" se refiere a una sustancia inerte añadida a una composición farmacéutica para facilitar aún más la administración de un ingrediente activo.
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de MOSPD2 comprende además uno o más agentes activos adicionales. En algunas realizaciones, el único o más agentes activos adicionales es un fármaco anticanceroso. En algunas realizaciones, el único o más agentes activos adicionales es un agente anti-proliferativo.
En cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, los fármacos anticancerosos útiles incluyen los conocidos en la técnica, por ejemplo, los fármacos anticancerosos aprobados para su uso por una agencia reguladora, tal como la Administración de Drogas y Alimentos de EE.UU. (FDA de EE.UU.), o similares. El Instituto Nacional del Cáncer de EE.UU. enumera algunos de los fármacos anticancerosos útiles en http://www.cancer.gov/about-cancer/treatment/drugs. Ejemplos de fármacos anticancerosos útiles incluyen los aprobados (por ejemplo, por la FDA de los EE. UU.) para cáncer anal, cáncer de vejiga, cáncer óseo, cáncer de cerebro, cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, cáncer de colon y recto, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, cáncer de estoma gastrointestinal, enfermedad trofoblástica gestacional, cáncer de cabeza y cuello, linfoma de Hodgkin, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón (células renales), leucemia, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, mesotelioma maligno, melanoma, enfermedad de Castleman multicéntrica, mieloma múltiple y otras neoplasias de células plasmáticas, neoplasias mieloproliferativas, neuroblastoma, linfoma no Hodgkin, cáncer de ovario, cáncer de trompas de Falopio o peritoneal primario, cáncer pancreático, cáncer de pene, cáncer de próstata, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de piel, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de estómago (gástrico), cáncer testicular, cáncer de tiroides, cáncer vaginal, cáncer vulvar, y tumor de Wilms y otros cánceres de riñón infantiles.
En cualquiera de las realizaciones descritas en la presente memoria, el fármaco anticanceroso se puede seleccionar del grupo que consiste en Acetato de Abiraterona, Abitrexato (Metotrexato), Abraxane (formulación de nanopartículas de paclitaxel estabilizadas con albúmina), ABVD, ABVE, ABVE-PC, AC, AC-T, Adcetris (Brentuximab Vedotin), ADE, Ado-Trastuzumab Emtansine, Adriamicina (Clorhidrato de Doxorrubicina), Adrucil (Fluorouracilo), Dimaleato de Afatinib, Afinitor (Everolimus), Akynzeo (Netupitant y Clorhidrato de Palonosetrón), Aldara (Imiquimod), Aldesleuquina, Alemtuzumab, Alimta (Pemetrexed Disódico), Aloxi (Clorhidrato de Palonosetrón), Amboclorina (Clorambucilo), Amboclorina (Clorambucilo), Ácido Aminolevulínico, Anastrozol, Aprepitant, Aredia (Pamidronato Disódico), Arimidex (Anastrozol), Aromasin (Exemestano), Arranon (Nelarabina), Trióxido de Arsénico, Arzerra (Ofatumumab), Asparaginasa Erwinia chrysanthemi, Avastin (Bevacizumab), Axitinib, Azacitidina, BEACOPP, Becenum (Carmustina), Beleodaq (Belinostat), Belinostat, Clorhidrato de Bendamustina, BEP, Bevacizumab, Bexaroteno, Bexxar (Tositumomab y yodo I 131 Tositumomab), Bicalutamida, BiCNU (Carmustina), Bleomicina, Blinatumomab, Blincyto (Blinatumomab), Bortezomib, Bosulif (Bosutinib), Bosutinib, Brentuximab Vedotin, Busulfán, Busulfex (Busulfán), Cabazitaxel, Cabozantinib-S-Malato, CAF, Campath (Alemtuzumab), Camptosar (Clorhidrato de Irinotecán), Capecitabina, CAPOX, Carboplatino, Carboplatino-Taxol, Carfilzomib, Carmubris (Carmustina), Carmustina, implante de Carmustina, Casodex (Bicatulamida), ,CeeNU (Lomustina), Ceritinib, Cerubidina (Clorhidrato de Daunorrubicina), Cervarix (vacuna bivalente contra el VPH recombinante), Cetuximab, Clorambucilo, Clorambucil-Prednisona, CHOP, Cisplatino, Clafen (Ciclofosfamida), Clofarabina, CMF, Cometriq (S-Malato de Cabozantinib), COPP, COPP-ABV, Cosmegen (Dactinomicina), Crizotinib, CVP, Ciclofosfamida, Cyfos (Ifosfamida), Cyramza (Ramucirumab), Citarabina, Citarabina Liposomal, Cytosar-U (Citarabina), Cytosan (Ciclofosfamida), Dabrafenib, Dacarbazina, Dacogen (Decitabina), Dactinomicina, Dasatinib, Clorhidrato de Daunorrubicina,, Decitabina, Degarelix, Denileukin Diftitox, Denosumab, DepoCyt (Cytarabina Liposomal), DepoFoam (Citarabina Liposomal), Clorhidrato de Dexrazoxano, Dinutuximab, Docetaxel, Doxil (Liposoma de Clorhidrato de Doxorrubicina), Clorhidrato de Doxorrubicina, Liposoma de Clorhidrato de Doxorrubicina, Dox-SL (Liposoma de Clorhidrato de Doxorrubicina), DTIC-Dome (Dacarbazina), Efudex (Fluorouracilo), Elitek (Rasburicase), Ellence (Clorhidrato de Epirubicina), Eloxatina (Oxaliplatina),Eltrombopag Olamina, Emend (Aprepitant), Enzalutamida, Clorhidrato de Epirubicina, EPOCH, Erbitux (Cetuximab), Mesilato de Eribulina, Erivedge (Vismodegib), Clorhidrato de Erlotinib, Erwinaze (Asparaginasa Erwinia chrysanthemi), Etopofos (Fosfato de Etopósido), Etopósido, Fosfato de Etopósido, Evacet (Liposoma de Clorhidrato de Doxorrubicina), Everolimus, Evista (Clorhidrato de Raloxifeno), Exemestano, Fareston (Toremifeno), Farydak (Panobinostat), Faslodex (Fulvestrant), FEC, Femara (Letrozol), Filgrastim, Fludara (Fosfato de Fludarabina), Fosfato de Fludarabina, Fluoroplex (Fluorouracilo), Fluorouracilo, Folex (Metotrexato), Folex PFS (Metotrexato), Folfiri, Folfiri-Bevacizumab, Folfiri-Cetuximab, Folfirinox, Folfox, Folotyn (Pralatrexato), FU-LV, Fulvestrant, Gardasil (vacuna cuadrivalente contra el VPH recombinante), Gardasil 9 (vacuna novalente contra el VPH recombinante), Gazyva (Obinutuzumab), Gefitinib, Clorhidrato de Gemcitabina, Gemcitabina-Cisplatino, Gemcitatinina-Oxaliplatino, Gentuzumab Ozogamicina, Gemzar (Clorhidrato de Gemcitabina), Gilotrif (Dimaleato de Afatinib), Gleevec (Mesilato de Imatinib), Gliadel (Implante de Carmustina), oblea de Gliadel (Implante de Carmustina), Glucarpidasa, Acetato de Goserelina, Halaven (Mesilato de Eribulina), Herceptin (Trastuzumab), vacuna bivalente recombinante del VPH, vacuna novalente contra el VPH, recombinante, vacuna cuadrivalente contra el VPH, recombinante, Hycamtin (Clorhidrato de Topotecán), Hyper-CVAD, Ibrance (Palbociclib), Ibritumomab Tiuxetán, Ibrutinib, ICE, Iclusig (Clorhidrato de Ponatinib), Idamicina (Clorhidrato de Idarubicina), Clorhidrato de Idarubicina, Idelalisib, Ifex (Ifosfamida), Ifosfamida, Ifosfamidum (Ifosfamida), Mesilato de Imatinib, Imbruvica (Ibrutinib), Imiquimod, Inlyta (Axitinib), Intron A (Interferón Alfa-2b recombinante), yodo 131 Tositumomab y Tositumomab, Ipilimumab, Iressa (Gefitinib), Clorhidrato de Irinotecán, Istodax (Romidepsina), Ixabepilona, Ixempra (Ixabepilona), Jakafi (Fosfato de Ruxolitinib), Jevtana (Cabazitaxel), Kadcyla (Ado-Trastuzumab Emtansina), Keoxifeno (Clorhidrato de Raloxifeno), Kepivance (Palifermin), Keytruda (Pembrolizumab), Kyprolis (Carfilzomib), Acetato de Lanreotida, Ditosilato de Lapatinib, Lenalidomida, Mesilato de Lenvatinib, Lenvima (Mesilato de Lenvatinib), Letrozol, Leucovorin Cálcico, Leukeran (Clorambucilo), Acetato de Leuprolida, Levulan (Ácido Aminolevulínico), Linfolizin (Clorambucilo), LipoDox (Liposoma de Clorhidrato de Doxorrubicina), Citarabina Liposomal, Lomustina, Lupron (Acetato de Leuprolida), Lupron Depot (Acetato de Leuprolida), Lupron Depot-Ped (Acetato de Leuprolida), Lupron Depot-3 meses (Acetato de Leuprolida), Lupron Depot-4 meses (Acetato de Leuprolida), Lynparza (Olaparib), Marqibo (Liposoma de Sulfato de Vincristina), Matulane (Clorhidrato de Procarbazina), Clorhidrato de Mecloretamina, Megace (Acetato de Megestrol), Acetato de Megestrol, Mekinist (Trametinib), Mercaptopurina, Mesna, Mesnex (Mesna), Metazolastona (Temozolomida), Metotrexato, Metotrexato LPF (Metotrexato), Mexato (Metotrexato), Mexato-AQ (Metotrexato), Mitomicina C, Clorhidrato de Mitoxantrona, Mitozytrex (Mitomicina C), MOPP, Mozobil (Plerixafor), Mustargen (Clorhidrato de Mecloretamina), Mutamicina (Mitomicina C), Myleran (Busulfán), Mylosar (Azacitidina), Mylotarg (Gemtuzumab Ozogamicina), nanopartículas de Paclitaxel (formulación de nanopartículas estabilizadas con albúmina de paclitaxel), Navelbina (Tartrato de Vinorelbina), Nelarabina, Neosar (Ciclofosfamida), Netupitant y Clorhidrato de Palonosetrón, Neupogen (Filgrastim), Nexavar (Sorafenib Tosilato), Nilotinib, Nivolumab, Nolvadex (Citrato de Tamoxifeno), Nplate (Romiplostim), Obinutuzumab, OEPA, Ofatumumab, OFF, Olaparib, Mepesuccinato de Omacetaxina, Oncaspar (Pegaspargasa), Ontak (Denileukin Diftitox), Opdivo (Nivolumab), OPPA, Oxaliplatino, Paclitaxel, Formulación de nanopartículas de Paclitaxel estabilizadas con albúmina, PAD, Palbociclib, Palifermina, Clorhidrato de Palonosetrón, Pamidronato Disódico, Panitumumab, Panobinostat, Paraplat (Carboplatino), Paraplatino (Carboplatino), Clorhidrato de Pazopanib, Pegaspargasa, Peginterferón Alfa-2b, PEG-Intron (Peginterferón Alfa-2b),, ,Pembrolizumab, Pemetrexed Disódico, Perjeta (Pertuzumab), Pertuzumab, Platinol (Cisplatin), Platinol-AQ (Cisplatino), Plerixafor, Pomalidomida, Pomalyst (Pomalidomida), Clorhidrato de Ponatinib, Pralatrexato, Prednisona, Clorhidrato de Procarbazina, Proleukin (Aldesleuquina), Prolia (Denosumab), Promacta (Eltrombopag Olamina), Provenge (Sipuleucel-T), Purinethol (Mercaptopurina), Purixan (Mercaptopurina), Dicloruro de Radio 223, Clorhidrato de Raloxifeno, Ramucirumab, Rasburicasa, R-CHOP, R-CVP, vacuna bivalente del virus del papiloma humano recombinante (VPH), vacuna novalente del virus del papiloma humano recombinante (VPH), vacuna tetravalente del virus del papiloma humano recombinante (VPH), interferón Alfa-2b recombinante, Regorafenib, R-EPOCH, Revlimid (Lenalidomida), Rheumatrex (Metotrexato), Rituxan (Rituximab), Rituximab, Romidepsina, Romiplostim, Rubidomicina (Clorhidrato de Daunorrubicina), Ruxolitinib Fosfato, Aerosol Intrapleural de Sclerosol (Talco), Siltuximab, Sipuleucel-T, Somatulina Depot (Acetato de Lanreotida), Tosilato de Sorafenib, Sprycel (Dasatinib), STANFORD V, polvo de talco estéril (Talco), Steritalc (Talco), Stivarga (Regorafenib), Malato de Sunitinib, Sutent (Malato de Sunitinib), Sylatron (Peginterferón Alfa-2b), Sylvant (Siltuximab), Sinovir (Talidomida), Sinribo (Mepesuccinato de Omacetaxina), TAC, Tafinlar (Dabrafenib), Talco, Citrato de Tamoxifeno, Tarabina PFS (Citarabina), Tarceva (Clorhidrato de Erlotinib), Targretin (Bexaroteno), Tasigna (Nilotinib), Taxol (Paclitaxel), Taxotere (Docetaxel), Temodar (Temozolomida), Temozolomida, Temsirolimus, Talidomida, Talomida (Talidomida), Tiotepa, Toposar (Etopósido), Clorhidrato de Topotecán, Toremifeno, Torisel (Temsirolimus), Tositumomab y yodo I 131 Tositumomab, Totect (Clorhidrato de Dexrazoxano), TPF, Trametinib, Trastuzumab, Treanda (Clorhidrato de Bendamustina), Trisenox (Trióxido de Arsénico), Tykerb (Ditosilato de Lapatinib), Unituxin (Dinutuximab), Vandetanib, VAMP, Vectibix (Panitumumab), VeIP, Velban (Sulfato de Vinblastina), Velcade (Bortezomib), Velsar (Sulfato de Vinblastina), Vemurafenib, VePesid (Etopósido), Viadur (Acetato de Leuprolida), Vidaza (Azacitidina), Sulfato de Vinblastina, Vincasar PFS (Sulfato de Vincristina), Sulfato de Vincristina, Liposoma de Sulfato de Vincristina, Tartrato de Vinorelbina, VIP, Vismodegib, Voraxaze (Glucarpidasa), Vorinostat, Votrient (Clorhidrato de Pazopanib), Wellcovorin (Leucovorina Cálcica), Xalkori (Crizotinib), Xeloda (Capecitabina), XELIRI, XELOX, Xgeva (Denosumab), Xofigo (Dicloruro de Radio 223), Xtandi (Enzalutamida), Yervoy (Ipilimumab), Zaltrap (Ziv-Aflibercept), Zelboraf (Vemurafenib), Zevalin (Ibntumomab Tiuxetan), Zinecard (Clorhidrato de Dexrazoxano), Ziv-Aflibercept, Zoladex (Acetato de Goserelina), Ácido Zoledrónico, Zolinza (Vorinostat), Zometa (Ácido Zoledrónico), Zydelig (Idelalisib), Zykadia (Ceritinib), y Zytiga (Acetato de Abiraterona).
Cuando se administran dos o más agentes como una composición farmacéutica, cada agente se puede administrar opcionalmente en una composición separada y/o mediante una vía de administración diferente. Las posibles vías de administración para cada agente incluyen independientemente, pero no se limitan a, administración parenteral, administración transmucosa, administración rectal, administración bucal y/o inhalación (por ejemplo, como se describe en la presente memoria).
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica es adecuada para administración sistémica o local. En otras realizaciones, la composición farmacéutica es adecuada para administración nasal, oral, o intraperitoneal. En otras realizaciones, la composición farmacéutica es adecuada para administración intravenosa, administración intramuscular o administración subcutánea. En otras realizaciones, la composición farmacéutica es adecuada para la administración intratumoral.
Uso en cáncer y metástasis
La presente invención se basa en el descubrimiento de que la expresión de MOSPD2 en células cancerosas está regulada al alza en comparación con su equivalente no cancerosa. Como se muestra en la sección de Ejemplos, la expresión de MOSPD2 se identificó positivamente en varios tipos de células cancerosas, por ejemplo, cáncer de vejiga, cáncer de cerebro (por ejemplo, astrocitoma cerebral), cáncer de mama, cáncer de colon (por ejemplo, adenocarcinoma de colon), cáncer de esófago (por ejemplo, adenocarcinoma de esófago), cáncer de pulmón, cáncer de piel (por ejemplo., melanoma), cáncer de lengua (por ejemplo, carcinoma de células de cabeza y cuello (lengua)), cáncer de riñón (por ejemplo., carcinoma de células claras de riñón), y cáncer hepático (por ejemplo, carcinoma hepatocelular), pero no en las células normales equivalentes, no cancerosas. Además, la inhibición de MOSPD2 mediante el silenciamiento de la expresión de MOSPD2 o la administración de anti-MOSPD2 mAb F(ab’)2 en varios tipos de células cancerosas inhibe la migración y la metástasis de las células cancerosas tanto in vitro como in vivo.
La divulgación proporciona métodos para tratar, prevenir o reducir la incidencia de un cáncer, o de una metástasis de una célula cancerosa, o de un cáncer metastásico mediante la administración de un inhibidor de MOSPD2, en donde el inhibidor se administra al sujeto que necesita del mismo en un cantidad eficaz. Se puede emplear cualquier inhibidor descrito en la presente memoria, pero para los propósitos de la invención, el inhibidor es un anticuerpo anti-MOSPD2 o un fragmento de unión a antígeno del mismo. MOSPD2 se expresa por dicho cáncer o en dicha célula cancerosa. En algunos casos, el cáncer es cáncer de vejiga, cáncer cerebral (por ejemplo, astrocitoma cerebral), cáncer de mama, cáncer de colon (por ejemplo, adenocarcinoma de colon), cáncer de esófago (por ejemplo, adenocarcinoma de esófago), cáncer de pulmón, cáncer de piel (porejemplo, melanoma), cáncer de lengua (por ejemplo, carcinoma de células de la cabeza y el cuello (lengua)), cáncer de riñón (por ejemplo, carcinoma de células claras de riñón), o cáncer hepático (por ejemplo, carcinoma hepatocelular).
En algunos casos, la terapia comprende además administrar otro fármaco anticanceroso.
En un aspecto, el anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en la presente memoria, y utilizable para los propósitos de la invención, tiene una constante de disociación de equilibrio anticuerpoantígeno (Kd) de aproximadamente 10-6 M a aproximadamente 10-12 M, o cualquier intervalo de valores del mismo (por ejemplo, de aproximadamente 10-7 M a aproximadamente 10-12, de 10-8 M a aproximadamente 10-12 M, de aproximadamente 10-9 M a aproximadamente 10-12 M, de aproximadamente 10-10 M a aproximadamente 10-12 M, de aproximadamente 10-11 M a aproximadamente 10-12 M, de aproximadamente 10-6 M a aproximadamente 10-11 M, de aproximadamente 10-7 M a aproximadamente 10-11 M, de aproximadamente 10-8 M a aproximadamente 10-11 M, de aproximadamente 10-9 M a aproximadamente 10-11 M, de aproximadamente 10-10 M a aproximadamente 10-11 M, de aproximadamente 10-6 M o de aproximadamente 10-10 M, de aproximadamente 10-7 M a aproximadamente 10-10 M, de aproximadamente 10-8 M a aproximadamente 10-10 M, de aproximadamente 10-9 M a aproximadamente 10-10 M, de aproximadamente 10-6 M a aproximadamente 10-9 M, de aproximadamente 10-7 M a aproximadamente 10-9 M, de aproximadamente 10-8 M a aproximadamente 10-9 M, de aproximadamente 10-6 M a aproximadamente 10-8 M, o de aproximadamente 10-7 M a aproximadamente 10-8). En otras realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo tiene una Kd de aproximadamente 10-6 M, aproximadamente 10-7 M, aproximadamente 10-8 M, aproximadamente 10-9 M, aproximadamente 10-10 M, aproximadamente 10-11 M, o aproximadamente 10-12 M. En algunas realizaciones, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno se une a uno o más epítopos en MOSPD2. En algunas realizaciones, la Kd se determina mediante análisis de Scatchard, resonancia de plasmón superficial, u otro método descrito en la presente memoria, en algunas realizaciones, a 37°C.
En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno se unen a MOSPD2 con una Kon de aproximadamente 103 l/Ms a aproximadamente 106 l/Ms, o cualquier intervalo de valores del mismo (por ejemplo, de aproximadamente 103 l/Ms a aproximadamente 105 l/Ms, de aproximadamente 104 l/Ms a aproximadamente 105 l/Ms, de aproximadamente 104 l/Ms a aproximadamente 106 l/Ms, de aproximadamente 105 l/Ms a aproximadamente 106 l/Ms, o de aproximadamente 103 l/Ms a aproximadamente 104 l/Ms). En otras realizaciones, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno tiene una Kon de aproximadamente 103 l/Ms, aproximadamente 104 l/Ms, aproximadamente 105 l/Ms, o aproximadamente 106 l/Ms.
En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno se unen a MOSPD2 con una Koff de aproximadamente 10-3 l/s a aproximadamente 10-6 l/s, o cualquier intervalo de valores de los mismos (por ejemplo, de aproximadamente 10-3 l/s a aproximadamente 10-51/s, de aproximadamente 10-4 l/s a aproximadamente 10-5 l/s, de aproximadamente 10-4 l/s a aproximadamente 10-6 l/s, de aproximadamente 10-5 l/s a aproximadamente 10-6 l/s, o de aproximadamente 10-3 l/s a aproximadamente 10-4 l/s). En otras realizaciones, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno tiene una Koff de aproximadamente 10-3 l/s, aproximadamente 10-4 l/s, aproximadamente 10-5 l/s, o aproximadamente 10-6 l/s.
En algunas realizaciones, el inhibidor de MOSPD2 es un anticuerpo anti-MOSPD2 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y la cantidad eficaz terapéuticamente es de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 10 pg/ml, o cualquier intervalo de valores del mismo (por ejemplo, de aproximadamente 2 pg/ml a aproximadamente 10 pg/ml, de aproximadamente 3 pg/ml a aproximadamente 10 pg/ml, de aproximadamente 4 pg/ml a aproximadamente 10 pg/ml, de aproximadamente 5 pg/ml a aproximadamente 10 pg/ml, de aproximadamente 6 pg/ml a aproximadamente 10 pg/ml, de aproximadamente 7 pg/ml a aproximadamente 10 pg/ml, de aproximadamente 8 pg/ml a aproximadamente 10 pg/ml, de aproximadamente 9 pg/ml a aproximadamente 10 pg/ml, de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 9 pg/ml, de aproximadamente 2 pg/ml a aproximadamente 9 pg/ml, de aproximadamente 3 pg/ml a aproximadamente 9 pg/ml, de aproximadamente 4 pg/ml a aproximadamente 9 pg/ml, de aproximadamente 5 pg/ml a aproximadamente 9 pg/ml, de aproximadamente 6 pg/ml a aproximadamente 9 pg/ml, de aproximadamente 7 pg/ml a aproximadamente 9 pg/ml, de aproximadamente 8 pg/ml a aproximadamente 9 pg/ml, de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 8 pg/ml, de aproximadamente 2 pg/ml a aproximadamente 8 pg/ml, de aproximadamente 3 pg/ml a aproximadamente 8 pg/ml, de aproximadamente 4 pg/ml a aproximadamente 8 pg/ml, de aproximadamente 5 pg/ml a aproximadamente 8 pg/ml, de aproximadamente 6 pg/ml a aproximadamente 8 pg/ml, de aproximadamente 7 pg/ml a aproximadamente 8 pg/ml, de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 7 pg/ml, de aproximadamente 2 pg/ml a aproximadamente 7 pg/ml, de aproximadamente 3 pg/ml a aproximadamente 7 pg/ml, de aproximadamente 4 pg/ml a aproximadamente 7 pg/ml, de aproximadamente 5 pg/ml a aproximadamente 7 pg/ml, de aproximadamente 6 pg/ml a aproximadamente 7 pg/ml, de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 6 pg/ml, de aproximadamente 2 pg/ml a aproximadamente 6 pg/ml, de aproximadamente 3 pg/ml a aproximadamente 6 pg/ml, de aproximadamente 4 pg/ml a aproximadamente 6 pg/ml, de aproximadamente 5 pg/ml a aproximadamente 6 pg/ml, de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 5 pg/ml, de aproximadamente 2 pg/ml a aproximadamente 5 pg/ml, de aproximadamente 3 pg/ml a aproximadamente 5 pg/ml, de aproximadamente 4 pg/ml a aproximadamente 5 pg/ml, de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 4 pg/ml, de aproximadamente 2 pg/ml a aproximadamente 4 pg/ml, de aproximadamente 3 pg/ml a aproximadamente 4 pg/ml, de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 3 pg/ml, de aproximadamente 2 pg/ml a aproximadamente 3 pg/ml, o de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 2 pg/ml). En otras realizaciones, el inhibidor de MOSPD2 es un anticuerpo anti-MOSPD2 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y la cantidad eficaz terapéuticamente es aproximadamente 1 pg/ml, aproximadamente 2 pg/ml, aproximadamente 3 pg/ml, aproximadamente 4 pg/ml, aproximadamente 5 pg/ml, aproximadamente 6 pg/ml, aproximadamente 7 pg/ml, aproximadamente 8 pg/ml, aproximadamente 9 pg/ml, o aproximadamente 10 pg/ml.
En algunas realizaciones, el inhibidor de MOSPD2 es un anticuerpo anti-MOSPD2 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y la cantidad eficaz terapéuticamente es de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, o cualquier intervalo de valores del mismo (por ejemplo, de aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 25 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 30 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 35 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 35 mg/kg, de aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 35 mg/kg, de aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 35 mg/kg, de aproximadamente 25 mg/kg a aproximadamente 35 mg/kg, de aproximadamente 30 mg/kg a aproximadamente 35 mg/kg, de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 25 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 25 mg/kg, de aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 25 mg/kg, de aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 25 mg/kg, de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, o de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 15 mg/kg). En otras realizaciones, el inhibidor de MOSPD2 es un anticuerpo anti-MOSPD2 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y la cantidad eficaz terapéuticamente es aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 15 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 25 mg/kg, aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 35 mg/kg, o aproximadamente 40 mg/kg.
En algunas realizaciones, el sujeto es un mamífero o un ser humano. En otras realizaciones, el MOSPD2 es un MOSPD2 de mamífero o un MOSPD2 humano.
Inhibición o prevención de una o más actividades de una célula cancerosa
En la presente memoria se describen métodos para inhibir o prevenir una o más actividades de una célula cancerosa que comprenden administrar un inhibidor de MOSPD2, como se define adicionalmente en las reivindicaciones, en donde dicho inhibidor de MOSPD2 es un anticuerpo anti-MOSPD2 o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, este uso comprende administrar una cantidad eficaz terapéuticamente de dicho inhibidor de MOSPD2 a un sujeto que necesite del mismo. En algunas realizaciones, la administración es la administración local, por ejemplo., administración intratumoral.
Ejemplos de inhibidores de MOSPD2 incluyen los descritos en la presente memoria, en particular el anticuerpo anti-MOSPD2 o el fragmento de unión a antígeno del mismo con las propiedades descritas anteriormente y que se administran en las cantidades descritas anteriormente. En la presente memoria se describen también tipos adecuados de cáncer.
El anticuerpo anti-MOSPD2 o el fragmento de unión a antígeno del mismo puede, por ejemplo, tener una constante de disociación de equilibrio anticuerpo-antígeno (Kd) de aproximadamente 10-6 M a aproximadamente 10-12 M, o cualquier intervalo de valores del mismo (por ejemplo, de aproximadamente 10-7 M a aproximadamente 10-12, de aproximadamente 10-8 M a aproximadamente 10-12 M, de aproximadamente 10-9 M a aproximadamente 10-12 M, de aproximadamente 10-10 M a aproximadamente 10-12 M, de aproximadamente 10-11 M a aproximadamente 10-12 M, de aproximadamente 10-6 M a aproximadamente 10-11 M, de aproximadamente 10-7 M a aproximadamente 10-11 M, de aproximadamente 10-8 M a aproximadamente 10-11 M, de aproximadamente 10-9 M a aproximadamente 10-11 M, de aproximadamente 10-10 M a aproximadamente 10-11 M, de aproximadamente 10-6 M a aproximadamente 10-10 M, de aproximadamente 10-7 M a aproximadamente 10-10 M, de aproximadamente 10-8 M a aproximadamente 10-10 M, de aproximadamente 10-9 M a aproximadamente 10-10 M, de aproximadamente 10-6 M a aproximadamente 10-9 M, de aproximadamente 10-7 M a aproximadamente 10-9 M, de aproximadamente 10-8 M a aproximadamente 10-9 M, de aproximadamente 10-6 M a aproximadamente 10-8 M, o de aproximadamente 10-7 M a aproximadamente 10-8). En otras realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo tiene una Kd de aproximadamente 10­ 6 M, aproximadamente 10-7 M, aproximadamente 10-8 M, aproximadamente 10-9 M, aproximadamente 10-10 M, aproximadamente 10-11 M, o aproximadamente 10-12 M. En algunas realizaciones, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno se une a uno o más epítopos en MOSPD2. En algunas realizaciones, la Kd se determina mediante análisis de Scatchard, resonancia de plasmón superficial, u otro método descrito en la presente memoria, en algunas realizaciones, a 37°C.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-MOSPD2 o el fragmento de unión a antígeno del mismo se une a MOSPD2 con una Kon de aproximadamente 103 l/Ms a aproximadamente 106 l/Ms, o cualquier intervalo de valores del mismo (porejemplo, de aproximadamente 103 l/Ms a aproximadamente 105 l/Ms, de aproximadamente 104 l/Ms a aproximadamente 105 l/Ms, de aproximadamente 104 l/Ms a aproximadamente 106 l/Ms, de aproximadamente 1051/Ms a aproximadamente 106 l/Ms, o de aproximadamente 1031/Ms a aproximadamente 104 l/Ms). En otras realizaciones, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno tiene una Kon de aproximadamente 103 l/Ms, aproximadamente 104 l/Ms, aproximadamente 105 l/Ms, o aproximadamente106 l/Ms.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-MOSPD2 o el fragmento de unión a antígeno del mismo se une a MOSPD2 con una Koff de aproximadamente 10-3 l/s a aproximadamente 10-6 l/s, o cualquier intervalo de valores del mismo (por ejemplo, de aproximadamente 10-3 l/s a aproximadamente 10-5 l/s, de aproximadamente 10-4 l/s a aproximadamente 10-5 l/s, de aproximadamente 10-4 l/s a aproximadamente 10-6 l/s, de aproximadamente 10-5 l/s a aproximadamente 10-6 l/s, o de aproximadamente 10-3 l/s a aproximadamente 10-4 l/s). En otras realizaciones, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno tiene una Koff de aproximadamente 10-31/s, de aproximadamente 10­ 4 l/s, aproximadamente 10-5 l/s, o aproximadamente 10-6 l/s.
En algunas realizaciones, la cantidad eficaz terapéuticamente del anticuerpo anti-MOSPD2 o el fragmento de unión a antígeno del mismo es de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 10 pg/ml, o cualquier intervalo de valores del mismo (por ejemplo, de aproximadamente 2 pg/ml a aproximadamente 10 pg/ml, de aproximadamente 3 pg/ml ta aproximadamente 10 pg/ml, de aproximadamente 4 pg/ml a aproximadamente 10 pg/ml, de aproximadamente 5 pg/ml a aproximadamente 10 pg/ml, de aproximadamente 6 pg/ml a aproximadamente 10 pg/ml, de aproximadamente 7 pg/ml a aproximadamente 10 pg/ml, de aproximadamente 8 pg/ml a aproximadamente 10 pg/ml, desde aproximadamente 9 pg/ml a aproximadamente 10 pg/ml, de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 9 pg/ml, de aproximadamente 2 pg/ml a aproximadamente 9 pg/ml, de aproximadamente 3 pg/ml a aproximadamente 9 pg/ml, de aproximadamente 4 pg/ml a aproximadamente 9 pg/ml, de aproximadamente 5 pg/ml a aproximadamente 9 pg/ml, de aproximadamente 6 pg/ml a aproximadamente 9 pg/ml, de aproximadamente 7 pg/ml a aproximadamente 9 pg/ml, de aproximadamente 8 pg/ml a aproximadamente 9 pg/ml, de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 8 pg/ml, de aproximadamente 2 pg/ml a aproximadamente 8 pg/ml, de aproximadamente 3 pg/ml a aproximadamente 8 pg/ml, de aproximadamente 4 pg/ml a aproximadamente 8 pg/ml, de aproximadamente 5 pg/ml a aproximadamente 8 pg/ml, de aproximadamente 6 p g/ml a aproximadamente 8 pg/ml, desde aproximadamente 7 pg/ml a aproximadamente 8 pg/ml, de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 7 pg/ml, de aproximadamente 2 pg/ml a aproximadamente 7 pg/ml, de aproximadamente 3 pg/ml a aproximadamente 7 pg/ml, de aproximadamente 4 pg/ml a aproximadamente 7 pg/ml, de aproximadamente 5 pg/ml a aproximadamente 7 pg/ml, de aproximadamente 6 pg/ml a aproximadamente 7 pg/ml , de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 6 pg/ml, de aproximadamente 2 pg/ml a aproximadamente 6 pg/ml, de aproximadamente 3 pg/ml a aproximadamente 6 pg/ml, de aproximadamente 4 pg/ml a aproximadamente 6 pg/ml, de aproximadamente 5 pg/ml a aproximadamente 6 pg/ml, de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 5 pg/ml, de aproximadamente 2 pg/ml a aproximadamente 5 pg/ml, de aproximadamente 3 pg/ml a aproximadamente 5 pg/ml, desde aproximadamente 4 pg/ml a aproximadamente 5 pg/ml, de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 4 pg/ml, de aproximadamente 2 pg/ml a aproximadamente 4 pg/ml, de aproximadamente 3 pg/ml a aproximadamente 4 pg/ml, de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 3 pg/ml, de aproximadamente 2 pg/ml a aproximadamente 3 pg/ml, o de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 2 pg/ml). En otras realizaciones, la cantidad eficaz terapéuticamente es aproximadamente 1 pg/ml, aproximadamente 2 pg/ml, aproximadamente 3 pg/ml, aproximadamente 4 pg/ml, aproximadamente 5 pg/ml, aproximadamente 6 pg/ml, aproximadamente 7 pg/ml , aproximadamente 8 pg/ml, aproximadamente 9 pg/ml, o aproximadamente 10 pg/ml.
En algunas realizaciones, la cantidad eficaz terapéuticamente del anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo es de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, o cualquier intervalo de valores del mismo (por ejemplo, de aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 25 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 30 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 35 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 35 mg/kg, de aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 35 mg/kg, de aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 35 mg/kg, de aproximadamente 25 mg/kg a aproximadamente 35 mg/kg, de aproximadamente 30 mg/kg a aproximadamente 35 mg/kg, de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 25 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 25 mg/kg, de aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 25 mg/kg, de aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 25 mg/kg, de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, o de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 15 mg/kg). En otras realizaciones, la cantidad eficaz terapéuticamente es aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 15 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 25 mg/kg, aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 35 mg/kg, o aproximadamente 40 mg/kg.
En algunas realizaciones, el inhibidor de MOSPD2 (es decir, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo) causa al menos aproximadamente un 10% (por ejemplo, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente el 99%, o más) de inhibición de una o más actividades de MOSPD2 (por ejemplo, MOSPD2 humano) (por ejemplo., expresión de MOSPD2, migración de células cancerosas, migración de monocitos asociada con el crecimiento tumoral (por ejemplo, presencia de macrófagos asociados a tumores), una vía de señalización de quimioquinas, una vía de señalización del factor de crecimiento, fosforilación del receptor EGF, fosforilación de ERK, fosforilación de AKT, y/o fosforilación de FAK). En otras realizaciones, la administración del inhibidor de MOSPD2 (es decir, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo) causa de aproximadamente 10% a 100%, de aproximadamente 10% a aproximadamente 99%, de aproximadamente 10% a aproximadamente 95%, de aproximadamente 10% a aproximadamente 90%, de aproximadamente 10% a aproximadamente 85%, de aproximadamente 10% a aproximadamente 80%, de aproximadamente 10% a aproximadamente 70%, de aproximadamente 20% a aproximadamente 99%, de aproximadamente 20% a aproximadamente 95%, de aproximadamente 20% a aproximadamente el 90%, de aproximadamente 20% a aproximadamente el 85%, de aproximadamente 20% a aproximadamente el 80%, de aproximadamente 30% a aproximadamente 95%, de aproximadamente 30% a aproximadamente 90%, de aproximadamente 30% a aproximadamente 85%, de aproximadamente 30% a aproximadamente 80%, de aproximadamente 40% a aproximadamente 95%, de aproximadamente 40% a aproximadamente 90%, de aproximadamente 40% a aproximadamente 85%, de aproximadamente 40% a aproximadamente 80%, de aproximadamente 50% a aproximadamente 95%, de aproximadamente 50% a aproximadamente 90%, de aproximadamente 50% a aproximadamente 85%, de aproximadamente 50% a aproximadamente 80%, de aproximadamente 60% a aproximadamente 95%, de aproximadamente 60% a aproximadamente 90%, de aproximadamente 60% a aproximadamente el 85%, o de aproximadamente 60% a aproximadamente 80% de inhibición de una o más actividades de MOSPD2 (por ejemplo, MOSPD2 humano) (por ejemplo, expresión de MOSPD2, migración de células cancerosas, migración de monocitos asociada con el crecimiento tumoral (por ejemplo, presencia de macrófagos asociados a tumores), una vía de señalización de quimioquinas, una vía de señalización del factor de crecimiento, fosforilación del receptor EGF, fosforilación de ERK, fosforilación de AKT, y/o fosforilación de FAK). En un aspecto, la administración de un anticuerpo anti-MOSPD2 o de un fragmento de unión a antígeno del mismo causa de aproximadamente 10% a 100%, de aproximadamente 10% a aproximadamente 99%, de aproximadamente 10% a aproximadamente 95%, de aproximadamente 10% a aproximadamente 90%, de aproximadamente 10% a aproximadamente 85%, de aproximadamente 10% a aproximadamente 80%, de aproximadamente 10% a aproximadamente 70%, de aproximadamente 20% a aproximadamente 99%, de aproximadamente 20% a aproximadamente 95%, de aproximadamente 20% a aproximadamente 90%, de aproximadamente 20% a aproximadamente 85%, de aproximadamente 20% a aproximadamente 80%, de aproximadamente 30% a aproximadamente 95%, de aproximadamente 30% a aproximadamente 90%, de aproximadamente 30% a aproximadamente 85%, de aproximadamente 30% a aproximadamente 80%, de aproximadamente 40% a aproximadamente 95%, de aproximadamente 40% a aproximadamente 90%, de aproximadamente 40% a aproximadamente 85%, de aproximadamente 40% a aproximadamente 80%, de aproximadamente 50% a aproximadamente 95%, de aproximadamente 50% a aproximadamente 90%, de aproximadamente 50% a aproximadamente 85%, de aproximadamente 50% a aproximadamente 80%, de aproximadamente 60% a aproximadamente 95%, de aproximadamente 60% a aproximadamente 90%, de aproximadamente 60% a aproximadamente 85%, o de aproximadamente 60% a aproximadamente 80% de inhibición de la migración de células cancerosas (por ejemplo, migración inducida por EGF).
En algunas realizaciones, una o más actividades es una o más de: expresión de MOSPD2, migración de células cancerosas, migración de monocitos asociada con el crecimiento tumoral (por ejemplo, presencia de macrófagos asociados a tumores), una vía de señalización de quimioquinas, una vía de señalización del factor de crecimiento, fosforilación del receptor EGF, fosforilación de ERK, fosforilación de AKT, y/o fosforilación de FAK. En algunas realizaciones, se inhiben al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez, o todas estas actividades.
En algunas realizaciones, se inhibe al menos la migración de células cancerosas y una ruta de señalización de quimioquinas. En otras realizaciones, la inhibición de una vía de señalización de quimioquinas o una vía de señalización de factor de crecimiento es la inhibición de la fosforilación del receptor de EGF, fosforilación de ERK, fosforilación de AKT, y/o fosforilación de FAK. En otras realizaciones, la migración de células cancerosas o la migración de monocitos asociada con el crecimiento tumoral (por ejemplo, la presencia de macrófagos asociados al tumor) es inducida por más de una quimioquina o factor de crecimiento (por ejemplo, EGF) o receptor de quimioquinas o receptor del factor de crecimiento (porejemplo, EGFR).
En algunas realizaciones, el sujeto es un mamífero o un ser humano. En otras realizaciones, el MOSPD2 es un MOSPD2 de mamífero o un MOSPD2 humano.
Reducción de macrófagos asociados a tumores o de la migración de macrófagos asociados a tumores
Los macrófagos asociados a tumores (TAMs, de sus siglas en inglés) a menudo se encuentran muy cerca o dentro de las masas tumorales. Se sabe que los TAMs son importantes para el crecimiento tumoral. Los TAMs se originan principalmente a partir de monocitos circulantes y su reclutamiento en los tumores se dirige por factores quimiotácticos derivados de los tumores. Los TAMs promueven la proliferación de células tumorales y la metástasis mediante la secreción de una amplia gama de factores de crecimiento y proangiogénicos. En consecuencia, muchos tumores con un número elevado de TAMs tienen una mayor tasa de crecimiento tumoral, de proliferación local y de metástasis a distancia. De hecho, el grado de infiltración de TAM se ha empleado como indicador de pronóstico inverso en cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de próstata y de útero (R. D. Leek, R. Landers, S. B. Fox, F. Ng, A. L. Harris, C. E. Lewis, British journal of cancer 1998, 77, 2246; M. R. Young, M. A. Wright, Y. Lozano, M. M. Prechel, J. Benefield, J. P. Leonetti, S. L. Collins, G. J. Petruzzelli, International Journal of Cancer 1997, 74, 69; I. F. Lissbrant, P. Stattin, P. Wikstrom, J. E. Damber, L. Egevad, A. Bergh, International Journal of oncology 2000, 17, 445; H. B. Salvesen, L. A. Akslen, International Journal of Cancer 1999, 84, 538). Los TAMs también son prominentes en los tejidos tumorales y comprenden hasta el 80% de la masa celular en el carcinoma de mama.
La divulgación proporciona métodos para tratar, prevenir o reducir la incidencia de un cáncer, o de metástasis del cáncer, mediante la administración de un inhibidor de MOSPD2, en donde el inhibidor se administra al sujeto que necesita del mismo en una cantidad eficaz para reducir el número de monocitos circulantes o de macrófagos asociados a tumores cerca o dentro de la masa cancerosa, o para reducir su migración. Se puede emplear cualquier inhibidor descrito en la presente memoria, pero para los propósitos de la invención, el inhibidor es un anticuerpo anti-MOSPD2 o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En todos estos escenarios, MOSPD2 se expresa en los monocitos circulantes o en los macrófagos asociados a tumores. En algunos casos, la administración es la administración local, por ejemplo, administración intratumoral. En algunas realizaciones, la administración es eficaz para reducir el número o la migración de macrófagos asociados a tumores en al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, o 100%, o cualquier número entre los porcentajes mencionados anteriormente, en comparación con la referencia.
En algunas realizaciones, la administración es eficaz para reducir el número o la migración de macrófagos asociados a tumores en aproximadamente 5%, aproximadamente 10%, aproximadamente 20%, aproximadamente 25%, aproximadamente 30%, aproximadamente 35%, aproximadamente 40%, aproximadamente 45% , aproximadamente 50%, aproximadamente 55%, aproximadamente 60%, aproximadamente 65%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, o 100%, o cualquier número entre los porcentajes mencionados anteriormente, en comparación con la referencia.
En otras realizaciones, la administración es eficaz para reducir el número o la migración de macrófagos asociados a tumores, en comparación con la referencia, de aproximadamente 5% a 100%, o de aproximadamente 5% a aproximadamente 95%, de aproximadamente 5% a aproximadamente 90%, de aproximadamente 5% a aproximadamente 80%, de aproximadamente 5% a aproximadamente 70%, de aproximadamente 5% a aproximadamente 60%, de aproximadamente 5% a aproximadamente 50%, de aproximadamente 5% a aproximadamente 40%, de aproximadamente 5% a aproximadamente 30%, de aproximadamente 10% a 100%, de aproximadamente 10% a aproximadamente 95%, de aproximadamente 10% a aproximadamente 90%, de aproximadamente 10% a aproximadamente 80%, de aproximadamente 10% a aproximadamente 70%, de aproximadamente 10% a aproximadamente 60%, de aproximadamente 10% a aproximadamente 50%, de aproximadamente 10% a aproximadamente 40%, de aproximadamente 20% a 100%, de aproximadamente 20% a aproximadamente 95%, de aproximadamente 20% a aproximadamente 90%, de aproximadamente 20% a aproximadamente 80%, de aproximadamente 20% a aproximadamente 70%, de aproximadamente 20% a aproximadamente 60%, de aproximadamente 20% a aproximadamente 50%, de aproximadamente 20% a aproximadamente 40%, o cualquier otro intervalo de valores descritos en la presente memoria.
Para medir la densidad o el número de macrófagos asociados al tumor, se puede emplear cualquier ensayo conocido en la técnica, tal como la tinción inmunohistoquímica de secciones tumorales usando anticuerpos que detectan específicamente a los macrófagos. Véase, por ejemplo, las Publicaciones de Patente U.S. Nos 2007/0218116 y 2011/0311616. Ejemplos de inhibidores de MOSPD2 incluyen los descritos en la presente memoria. En la presente memoria se describen también tipos adecuados de cáncer. En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer de mama, un cáncer de cabeza y cuello, un cáncer de próstata o un cáncer de útero.
El anticuerpo anti-MOSPD2 o el fragmento de unión a antígeno del mismo puede, por ejemplo, tener una constante de disociación de equilibrio anticuerpo-antígeno (Kd) de aproximadamente 10-6 M a aproximadamente 10-12 M, o cualquier intervalo de valores del mismo (por ejemplo, de aproximadamente 10-7 M a aproximadamente 10-12 M, de 10-8 M a aproximadamente 10-12 M, de aproximadamente 10-9 M a aproximadamente 10-12 M, de aproximadamente 10-10 M a aproximadamente 10-12 M, de aproximadamente 10-11 M a aproximadamente 10-12 M, de aproximadamente 10-6 M a aproximadamente 10-11 M, de aproximadamente 10-7 M a aproximadamente 10-11 M, de aproximadamente 10-8 M a aproximadamente 10-11 M, de aproximadamente 10-9 M a aproximadamente 10-11 M, de aproximadamente 10-10 M a aproximadamente 10-11 M, de aproximadamente 10-6 M a aproximadamente 10-10 M, de aproximadamente 10-7 M a aproximadamente 10-10 M, de aproximadamente 10-8 M a aproximadamente 10-10 M, de aproximadamente 10-9 M a aproximadamente 10-10 M, de aproximadamente 10-6 M a aproximadamente 10-9 M, de aproximadamente 10-7 M a aproximadamente 10-9 M, de aproximadamente 10-8 M a aproximadamente 10-9 M, de aproximadamente 10­ 6 M a aproximadamente 10-8 M, o de aproximadamente 10-7 M a aproximadamente 10-8). En otras realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo tiene una Kd de aproximadamente 10-6 M, aproximadamente 10-7 M, aproximadamente 10-8 M, aproximadamente 10-9 M, aproximadamente 10-10 M, aproximadamente 10-11 M, o aproximadamente 10-12 M. En algunas realizaciones, el anticuerpo o el fragmento de unión alantígeno se une a uno o más epítopos en MOSPD2. En algunas realizaciones, la Kd se determina mediante análisis de Scatchard, resonancia de plasmón superficial, u otro método descrito en la presente memoria, en algunas realizaciones, a 37°C.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-MOSPD2 o el fragmento de unión a antígeno del mismo se une a MOSPD2 con una Kon de aproximadamente 103 l/Ms a aproximadamente 106 l/Ms, o cualquier intervalo de valores del mismo (por ejemplo, de aproximadamente 103 l/Ms a aproximadamente 105 l/Ms, de aproximadamente 104 l/Ms a aproximadamente 105 l/Ms, de aproximadamente 104 l/Ms a aproximadamente 106 l/Ms, de aproximadamente 105 l/Ms a aproximadamente 106 l/Ms, o de aproximadamente 103 l/Ms a aproximadamente 104 l/Ms). En otras realizaciones, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno tiene una Kon de aproximadamente 103 l/Ms, aproximadamente 104 l/Ms, aproximadamente 105 l/Ms, o aproximadamente 106 l/Ms.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-MOSPD2 o el fragmento de unión a antígeno del mismo se une a MOSPD2 con una Koff de aproximadamente 10-3 l/s a aproximadamente 10-6 l/s, o cualquier intervalo de valores del mismo (por ejemplo, de aproximadamente 10-3 l/s a aproximadamente 10-5 l/s, de aproximadamente 10-4 l/s a aproximadamente 10-5 l/s, de aproximadamente 10-4 l/s a aproximadamente 10-6 l/s, de aproximadamente 10-5 l/s a aproximadamente 10-6 l/s, o de aproximadamente 10-3 l/s a aproximadamente 10-4 l/s). En otras realizaciones, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno tiene una Koff de aproximadamente 10-3 l/s, aproximadamente 10-4 l/s, aproximadamente 10-5 l/s, o aproximadamente 10-6 l/s.
En algunas realizaciones, la cantidad eficaz terapéuticamente del anticuerpo anti-MOSPD2 o el fragmento de unión a antígeno es de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 10 pg/ml, o cualquier intervalo de valores del mismo (por ejemplo, de aproximadamente 2 pg/ml a aproximadamente 10 pg/ml, de aproximadamente 3 pg/ml a aproximadamente 10 pg/ml, de aproximadamente 4 pg/ml a aproximadamente 10 pg/ml, de aproximadamente 5 pg/ml a aproximadamente 10 pg/ml, de aproximadamente 6 pg/ml a aproximadamente 10 pg/ml, de aproximadamente 7 pg/ml a aproximadamente 10 pg/ml, de aproximadamente 8 pg/ml a aproximadamente 10 pg/ml, de aproximadamente 9 pg/ml a aproximadamente 10 pg/ml, de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 9 pg/ml, de aproximadamente 2 pg/ml a aproximadamente 9 pg/ml, de aproximadamente 3 pg/ml a aproximadamente 9 pg/ml, de aproximadamente 4 pg/ml a aproximadamente 9 pg/ml, de aproximadamente 5 pg/ml a aproximadamente 9 pg/ml, de aproximadamente 6 pg/ml a aproximadamente 9 pg/ml, de aproximadamente 7 pg/ml a aproximadamente 9 pg/ml, de aproximadamente 8 pg/ml a aproximadamente 9 pg/ml, de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 8 pg/ml, de aproximadamente 2 pg/ml a aproximadamente 8 pg/ml, de aproximadamente 3 pg/ml a aproximadamente 8 pg/ml, de aproximadamente 4 pg/ml a aproximadamente 8 pg/ml, de aproximadamente 5 pg/ml a aproximadamente 8 pg/ml, de aproximadamente 6 pg/ml a aproximadamente 8 pg/ml, desde aproximadamente 7 pg/ml a aproximadamente 8 pg/ml, de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 7 pg/ml, de aproximadamente 2 pg/ml a aproximadamente 7 pg/ml, de aproximadamente 3 pg/ml a aproximadamente 7 pg/ml, de aproximadamente 4 pg/ml a aproximadamente 7 pg/ml, de aproximadamente 5 pg/ml a aproximadamente 7 pg/ml, de aproximadamente 6 pg/ml a aproximadamente 7 pg/ml, de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 6 pg/ml, de aproximadamente 2 pg/ml a aproximadamente 6 pg/ml, de aproximadamente 3 pg/ml a aproximadamente 6 pg/ml, de aproximadamente 4 pg/ml a aproximadamente 6 pg/ml, de aproximadamente 5 pg/ml a aproximadamente 6 pg/ml, de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 5 pg/ml, de aproximadamente 2 pg/ml a aproximadamente 5 pg/ml, de aproximadamente 3 pg/ml a aproximadamente 5 pg/ml, de aproximadamente 4 pg/ml a aproximadamente 5 pg/ml, de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 4 pg/ml, de aproximadamente 2 pg/ml a aproximadamente 4 pg/ml, de aproximadamente 3 pg/ml a aproximadamente 4 pg/ml, de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 3 pg/ml, de aproximadamente 2 pg/ml a aproximadamente 3 pg/ml, o de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 2 pg/ml). En otras realizaciones, la cantidad eficaz terapéuticamente es aproximadamente 1 pg/ml, aproximadamente 2 pg/ml, aproximadamente 3 pg/ml, aproximadamente 4 pg/ml, aproximadamente 5 pg/ml, aproximadamente 6 pg/ml, aproximadamente 7 pg/ml , aproximadamente 8 pg/ml, aproximadamente 9 pg/ml, o aproximadamente 10 pg/ml.
En algunas realizaciones, la cantidad eficaz terapéuticamente del anticuerpo anti-MOSPD2 o el fragmento de unión a antígeno del mismo es de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, o cualquier intervalo de valores del mismo (por ejemplo, de aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 25 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 30 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 35 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 35 mg/kg, de aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 35 mg/kg, de aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 35 mg/kg, de aproximadamente 25 mg/kg a aproximadamente 35 mg/kg, de aproximadamente 30 mg/kg a aproximadamente 35 mg/kg, de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 25 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 25 mg/kg, de aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 25 mg/kg, de aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 25 mg/kg, de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 15 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, o de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 15 mg/kg). En otras realizaciones, la cantidad eficaz terapéuticamente es aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 15 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 25 mg/kg, aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 35 mg/kg, o aproximadamente 40 mg/kg.
En algunas realizaciones, el sujeto es un mamífero o un ser humano. En otras realizaciones, el MOSPD2 es un MOSPD2 de mamífero o un MOSPD2 humano.
Métodos de diagnóstico
Se ha descubierto que MOSPD2 se expresa en la superficie de diferentes tipos de células cancerosas y tumores, y en células inflamatorias que se han infiltrado en tejidos inflamados o que están asociadas con tumores. Los inventores también han descubierto que la expresión de MOSPD2 se aumenta en correlación con el grado del tumor en varios tipos de tumores. Por lo tanto, en un aspecto, se describe en la presente memoria un método para la predicción, diagnóstico, o pronóstico del cáncer o metástasis del cáncer en un sujeto (por ejemplo., cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de hígado, melanoma, u otro tipo de cáncer descrito en la presente memoria), que comprende determinar el nivel de expresión de MOSPD2 en una muestra del sujeto. En otro aspecto, en la presente memoria se describe un método para la predicción, el diagnóstico, o el pronóstico de la progresión o invasividad del tumor en un sujeto, que comprende determinar el nivel de expresión de MOSPD2 en una muestra del sujeto. En una realización de estos métodos, el nivel de expresión de MOSPD2 es el nivel de expresión del gen MOSPD2. En otra realización, el nivel de expresión de MOSPD2 es el nivel de expresión de la proteína MOSPD2.
En un aspecto, en la presente memoria se describe un método in vitro para la predicción, el diagnóstico o el pronóstico de cáncer en un sujeto (por ejemplo, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de hígado, melanoma, u otro tipo de cáncer descrito en la presente memoria), que comprende determinar o cuantificar el nivel de expresión de MOSPD2 en una muestra del sujeto. En otro aspecto, en la presente memoria se describe un método in vitro para la predicción, el diagnóstico o el pronóstico de cáncer en un sujeto (por ejemplo, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de hígado, melanoma, u otro tipo de cáncer descrito en la presente memoria), que comprende (i) determinar o cuantificar el nivel de expresión de MOSPD2 en una muestra del sujeto, y (ii) comparar el nivel de expresión obtenido en la etapa (i) con un valor de control o de referencia, en donde un nivel de expresión aumentado de MOSPD2 con respecto al valor de control o de referencia es indicativo de cáncer o un riesgo mayor de desarrollar cáncer. En algunas realizaciones, si la expresión de MOSPD2 está presente en la muestra del sujeto, entonces el sujeto tiene cáncer o un mayor riesgo de cáncer. En otras realizaciones, si la expresión de MOSPD2 está presente en la muestra del sujeto en una cantidad mayor que la expresión del valor de control o de referencia de MOSPD2,, entonces el sujeto tiene cáncer o un mayor riesgo de cáncer.
En un aspecto, en la presente memoria se describe un método in vitro para la predicción, el diagnóstico o el pronóstico de metástasis de cáncer en un sujeto (por ejemplo., cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de hígado, melanoma, u otro tipo de cáncer descrito en la presente memoria), que comprende determinar o cuantificar el nivel de expresión de MOSPD2 en una muestra del sujeto. En otro aspecto, en la presente memoria se describe un método in vitro para la predicción, el diagnóstico o el pronóstico de metástasis de cáncer en un sujeto (por ejemplo, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de hígado, melanoma, u otro tipo de cáncer descrito en la presente memoria), que comprende (i) determinar o cuantificar el nivel de expresión de MOSPD2 en una muestra del sujeto, y (ii) comparar el nivel de expresión obtenido en la etapa (i) con un valor de control o de referencia, en donde un nivel de expresión aumentado de MOSPD2 con respecto al valor de control o de referencia es indicativo de metástasis de cáncer o un mayor riesgo de metástasis de cáncer. En algunas realizaciones, si la expresión de MOSPD2 está presente en la muestra del sujeto, entonces el sujeto tiene metástasis del cáncer o un mayor riesgo de metástasis del cáncer. En otras realizaciones, si la expresión de MOSPD2 está presente en la muestra del sujeto en una cantidad mayor que la expresión de MOSPD2 del valor de control o de referencia, entonces el sujeto tiene metástasis del cáncer o un mayor riesgo de metástasis del cáncer.
En un aspecto, en la presente memoria se describe un método in vitro para la predicción, el diagnóstico o el pronóstico de la progresión tumoral (por ejemplo, grado tumoral aumentado) o la invasividad en un sujeto, que comprende determinar o cuantificar el nivel de expresión de MOSPD2 en una muestra del sujeto. En otro aspecto, en la presente memoria se describe un método in vitro para la predicción, el diagnóstico o el pronóstico de la progresión del tumor (por ejemplo, aumento del grado del tumor) o la invasividad en un sujeto, que comprende (i) determinar o cuantificar el nivel de expresión de MOSPD2 en una muestra del sujeto, y (ii) comparar el nivel de expresión obtenido en la etapa (i) con un valor control o de referencia, en donde el aumento del nivel de expresión de MOSPD2 con respecto al valor control o de referencia es indicativo de progresión del tumor (por ejemplo, aumento del grado del tumor) o invasividad o un mayor riesgo de progresión del tumor o invasividad. En algunas realizaciones, si la expresión de MOSPD2 está presente en la muestra del sujeto, entonces el sujeto tiene progresión o invasividad tumoral o un mayor riesgo de progresión o invasividad tumoral. En otras realizaciones, si la expresión de MOSPD2 está presente en la muestra del sujeto en una cantidad mayor que la expresión de MOSPD2 del valor de control o de referencia, entonces el sujeto tiene progresión tumoral o invasividad tumoral o un mayor riesgo de progresión o invasividad tumoral.
En algunas realizaciones, los métodos descritos anteriormente comprenden uno o más de las siguientes etapas adicionales: instruir a un laboratorio para que cuantifique el nivel de expresión de MOSPD2 en la muestra; obtener un informe del nivel de expresión de MOSPD2 en la muestra del laboratorio; y/o administrar al sujeto una cantidad eficaz terapéuticamente de un inhibidor de MOSPD2 (por ejemplo, un anticuerpo anti-MOSPD2 o un fragmento de unión a antígeno del mismo).
En algunas realizaciones, la muestra es una biopsia de tejido, una biopsia de tumor, o una muestra de sangre de un sujeto.
En algunas realizaciones, el valor de control o referencia es el nivel de expresión de MOSPD2 en tejido normal (por ejemplo, tejido adyacente normal (NAT, de sus siglas en inglés)). En otras realizaciones, el valor de control o de referencia no es una expresión de MOSDP2 detectable o ninguna expresión de MOSPD2 significativa.
Los métodos para determinar el nivel de expresión de MOSPD2 se conocen en la bibliografía y se describen en la presente memoria.
En algunos aspectos, los métodos de tratamiento descritos en este documento se aplican si, después de determinar el nivel de expresión de MOSPD2 en el sujeto, se encuentra que es mayor que el de un valor de referencia o control.
Ejemplos
Materiales y métodos
Silenciamiento de MOSPD2
La línea celular de cáncer de mama humano MDA-MB-231 (aquí en lo sucesivo MDA-231) (HTB-26) y la línea celular de melanoma maligno humano A2058 (CRL-11147) se adquirieron de la colección de cultivos tipo de EE.UU. (ATCC). Las células (2x106 en 2 ml) se colocaron en un tubo de 15 ml. Se aplicaron a las células partículas de lentivirales que expresan ARN de horquilla corta de control (ARNhc) (2x105 partículas virales) o ARNhc de MOSPD2 humano (2x106 partículas virales), que se centrifugaron después durante 60 minutos, a 2000 rpm a temperatura ambiente en presencia de polibreno 8 pg/ml (Sigma, Israel). A continuación, las células se sembraron en una placa de 6 pocillos. Después de 72 horas, se añadió medio fresco que contenía puromicina (4 pg/ml de Sigma, Israel) para la selección de células transducidas. Para el silenciamiento mediado por CRISPR-CAS9, las células MDA-231 se transdujeron con el control no diana CRISPR-CAS9 o con partículas lentivirales MOSPD2 humanas CRISPR-CAS9 como se describe anteriormente. La clonación de células individuales se realizó en células transducidas para aislar células con la expresión de la proteína MOSPD2 silenciada y la migración alterada.
Western Blot
Se lavaron y resuspendieron células A2058 o MDA-231 transducidas por lentivirus sh-control o sh-MOSPD2, o células MDA-231 (106), transducidas por partículas lentivirales control o MOSPD2 CRISPR-CAS9, en tampón de lisis que contenía ditiotreitol 1:100 (DTT), inhibidores de fosfatasa y proteasa (Thermo Scientific). Las muestras se cargaron en un gel Criterion TGX prefabricado (Bio-Rad, Hemel Hempstead, Reino Unido) y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Las transferencias se bloquearon con leche al 5% o albúmina de suero bovino (BSA) en solución salina tamponada con Tris y Tween 20 (TBST) durante 1 hora, seguido de incubación con anticuerpos primarios y secundarios. Las membranas se desarrollaron utilizando un kit ECL (Thermo Scientific). Se utilizaron los siguientes anticuerpos para la inmunotransferencia:
Anticuerpos primarios: anti-MOSPD2 de conejo (1:5000) generado por Vascular Biogenics Ltd. Se adquirió quinasa regulada por fósforo extracelular (p-ERK1/2) (Thr 183 y Tyr 185, 1:4000) de Sigma (Israel). Se adquirió fosfo-AKT (Ser 473, 1:1000) de Cell Signaling. Se adquirió Fosfo-FAK (1:2000) de Abcam (Cambridge, Reino Unido). La proteína de choque térmico (HSP) 90 (1:1000) se adquirió de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX).
Anticuerpos secundarios: Se adquirieron anticuerpos anti-conejo de peroxidasa de rábano picante (HRP) de burro (1:5000) y HRP anti-ratón de cabra (1:5000) de Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA).
Q-PCR
Para determinar la eficacia del silenciamiento, se extrajo ARN de células MDA-231 transducidas por Lenti-virus shcontrol y sh-MOSPD2 utilizando el mini kit RNeasy (Qiagen, ValenVBa, CA). Para la preparación de ADNc, se combinaron 2 pg de ARN con mezcla de reacción qScript y transcriptasa inversa qScript (Quanta Bioscience, Gaithersburg, MD). La reacción se colocó en un termociclador (BioRad, Hercules, CA) y se estableció un programa de ejecución según las instrucciones del fabricante. Las reacciones de PCR en tiempo real se realizaron en un sistema de PCR en tiempo real Applied Biosystems 7300 (Grand Island, NY) utilizando conjuntos de cebadores para MOSPD2 humano, 28S para normalizar los niveles de A r N (BIOSEARCH TECHNOLOGIES, Petaluma, CA) y SYBR Green PCR Master Mix ( Applied Biosystems, Warrington, Reino Unido).
Tinción inmunohistoquímica
Para evaluar el nivel de expresión de MOSPD2 en tejidos cancerosos, se tiñeron matrices Biomax (US Biomax Rockville, MD) para cáncer de mama (T088B y BR2028a), para cáncer de hígado (BC03116a), y para tumores de órganos múltiples (MC6163) con el anticuerpo anti-MOSPD2 de conejo o IgG de conejo de control (R&D Systems Cat N° AB-105-C) seguido de incubación con HRP anti-conejo (Cat N° 0399 DAKO, Dinamarca).
Ejemplo 1
Anticuerpos anti-MOSPD2
Se generaron anticuerpos policlonales anti-MOSPD2 según los siguientes métodos.
Materiales y métodos
Producción y purificación de MOSPD2 humano recombinante marcado con hemaglutinina (HA) (HA-rhMOSPD2)
Se insertó ADNc de MOSPD2 humano de longitud completa, empleando sitios de restricción EcoRI y Xbal, en el vector plasmídico lentiviral pLVX-EF1a-IRES-Puro (Clonetech, CA). El oligonucleótido que codifica la HA marcada (YPYDVPDYA; SEQ ID NO:15) se insertó en la región N-terminal de MOSPD2 con sitios de restricción EcoRI. Para la transducción, se centrifugaron células de melanoma A2058 (ATCC CRL-11147, VA) durante 60 minutos a 2000 rpm a temperatura ambiente en presencia de polibreno 8 pg/ml (Sigma, Israel) y partículas lentivirales que contenían el vector que expresa HA-rhMOSPD2. A continuación, las células se sembraron en una placa de 6 pocillos. Después de 72 horas, se añadió medio fresco que contenía puromicina (4 pg/ml de Sigma, Israel) para la selección de células transducidas. Para purificar HA-rhMOSPD2, se lisaron células transducidas con A2058 con reactivo de extracción de proteína de mamífero M-PER (Thermo Scientific) y se pasaron a través de perlas de agarosa anti-HA (Thermo Scientific). Se empleó glicina o tiocianato de sodio para la elución de HA-rhMOSPD2 de las perlas, seguido de una diálisis minuciosa frente a PBS.
Generación y aislamiento de anticuerpos policlonales a-MOSPD2
Se inmunizaron conejos con aproximadamente 0,5 mg de HA-rhMOSPD2 emulsionado en adyuvante completo de Freund seguido de tres refuerzos cada tres semanas con aproximadamente 0,25 mg de HA-rhMOSPD2 emulsionado en adyuvante incompleto de Freund. Se recogió suero una semana después de cada refuerzo para evaluar la inmunogenicidad y los títulos de los anticuerpos. Los anticuerpos a-MOSPD2 se aislaron del suero empleando perlas de proteína A/G (SantaCruz, CA).
Resultados
Los anticuerpos a-MOSPD2 policlonales de conejo detectan y precipitan MOSPD2 humana endógena
Se evaluó la capacidad de los anticuerpos policlonales a-MOSPD2 aislados para detectar y precipitar MOSPD2 endógeno. El lisado celular se preparó a partir de células U937 transducidas con partículas lentivirales control o sh-MOSPD2. Las muestras se analizaron mediante Western blot empleando los anticuerpos a-MOSPD2 aislados (diluidos 1:5000). La expresión de HSP90 también se determinó como control de carga. La inmunoprecipitación del lisado de células U397 también se realizó empleando los anticuerpos a-MOSPD2 o IgG de conejo (10 pg) como control. Los precipitados resultantes se analizaron mediante inmunotransferencia con los anticuerpos a-MOSPD2 aislados, seguido de incubación con anticuerpo HRP de cabra anti-conejo (1:5000). Los resultados muestran que los anticuerpos a-MOSPD2 aislados detectan e inmunoprecipitan fácilmente MOSPD2 expresado de forma endógena en células U937.
Ejemplo 2
MOSPD2 y migración de líneas celulares metastásicas
Para evaluar el papel de MOSPD2 en la migración de células cancerosas, se silenció la expresión de MOSPD2 en dos líneas celulares metastásicas, melanoma A2058 y cáncer de mama MDA-231, empleando partículas lentivirales sh-control o sh-MOSPD2.
En particular, las células A2058 o MDA-231 (3x105) transducidas con sh-control o sh-MOSPD2 privadas previamente de alimento durante 3 horas en FBS/RPMI-1640 al 0,5% se sembraron en la cámara superior de una placa de ensayo de migración QCM de 24 pocillos, 5 gm de poro (Coming-Costar, Corning, NY), seguido de incubación durante 24 horas en presencia de FBS/RPMl-1640 al 10% y EGF (200 ng/ml, Peprotech Israel) en la cámara inferior. Posteriormente, las células que migraron al compartimento inferior se tiñeron con violeta cristal antes de tomar las imágenes.
La FIG. 1 demuestra que las partículas lentivirales sh-MOSPD2 tienen una expresión de proteínas significativamente disminuida e inhiben la migración de células cancerosas in vitro.
Ejemplo 3
MOSPD2 y proliferación celular
Para determinar si el efecto inhibidor sobre la migración celular posterior al silenciamiento de MOSPD2 es secundario a la función celular fundamental, tal como la proliferación, células de cáncer de mama MDA-231 transducidas con partículas lentivirales sh-control o sh-MOSPD2 se ensayaron para la proliferación durante un período de 3 días.
Específicamente, se sembraron células MDA-231 transducidas con lenti-virus sh-control o sh-MOSPD2 en placas de 6 pocillos (104 por pozo). Las células se contaron mediante FACS cada 24 horas por triplicado durante 3 días consecutivos.
Los datos mostrados en la FIG. 2 indican que MOSPD2 no es esencial para la proliferación de estas células, lo que sugiere un papel regulador de MOSPD2 de manera específica en la migración.
Ejemplo 4
MOSPD2 y metástasis celular
Para evaluar el papel de MOSPD2 en la diseminación de células cancerosas a órganos más allá del sitio original del cáncer, la extensión de la metástasis pulmonar en células de cáncer de mama MDA-231 transducidas con partículas lentivirales sh-control o sh-MOSPD2 se transfirieron de forma adoptiva a ratones inmunosuprimidos. En otro modelo en el que el sitio de inicio ocurre en la mama, en la almohadilla de grasa mamaria se inocularon ratones inmunosuprimidos con células de cáncer de mama MDA-231 transducidas con partículas lentivirales sh-control o sh-MOSPD2.
Examen patológico: Los portaobjetos para histología se tiñeron con hematoxilina/eosina (H y E). El tejido fijado con formalina se deshidrató, se embebió en parafina, y se seccionó a 4 gm de espesor. La tinción H y E se calibró en un módulo de tinción Leica. Los portaobjetos se calentaron a 90°C durante 7 minutos y después se procesaron según un protocolo completamente automatizado. Después de desparafinar y rehidratar las secciones, los portaobjetos se tiñeron durante 7 minutos con Hematoxilina de Gill N°3 (Surgipath), se lavaron, se sumergieron en alcohol ácido, y se lavaron. Después de una inmersión breve en etanol al 70% y etanol al 96%, los portaobjetos se tiñeron durante 4 minutos en eosina (Sigma), y se deshidrataron en etanol al 96% y a continuación dos veces en etanol al 100% durante 1 minuto cada vez. Después de que se completó una ejecución en un teñidor automático, las secciones se aclararon en xileno durante 10 segundos y se montaron con Entellan. El área tumoral media comprende el área tumoral pulmonar máxima medida para cada ratón.
Sistémico: 106 células MDA-231 transducidas con lentivirus sh-control o sh-MOSPD2 se inyectaron en la vena de la cola de ratones SCID hembra de 8 semanas de edad (C.B-17/IcrHsd-Prkdcscid, Harlan Israel). Los ratones se sacrificaron después de 4 semanas. Los pulmones se extrajeron para el examen histopatológico. Los resultados de la FIG. 3A muestran que silenciar la expresión de MOSPD2 de forma significativa (p=0,023) inhibe la presencia de células de cáncer de mama metastásico en los pulmones en más del 50% (área de metástasis).
Ortotópico: 5x106 células MDA-231 transducidas con lentivirus sh-control o sh-MOSPD2 se inyectaron en la almohadilla de grasa mamaria de ratones SCID hembra de 8 semanas de edad (C.B-17/IcrHsd-Prkdcscid, Harlan Israel). Los ratones se sacrificaron después de 10 semanas. Se extirparon los ganglios linfáticos inguinales ipsilaterales y los pulmones para su examen. El examen macroscópico mostró que la gran mayoría de los ganglios linfáticos extirpados de ratones transferidos con células sh-control eran abrumadoramente más grandes que los de ratones transferidos con células tratadas con sh-MOSPD2 (FIG. 3B). Por otra parte, el área de metástasis media medida en los pulmones de ratones transferidos con células tratadas con sh-MOSPD2 se redujo en más del 50% en comparación con el grupo de control (FIG. 3C).
La proporción de silenciamiento de ARNm de MOSPD2 en células inyectadas con sh-MOSPD2 fue ~80%, como se determinó mediante Q-PCR como se describe en los Materiales y Métodos.
Estos resultados demuestran que MOSPD2 juega un papel importante en la metástasis del cáncer de mama.
Ejemplo 5
Expresión de MOSPD2 en varios tipos de cáncer
Para determinar si la expresión de MOSPD2 está asociada con la transformación de células normales a cancerosas, se seleccionaron portaobjetos que portaban tejidos normales y cancerosos empleando el anticuerpo anti-MOSPD2 como se describe en la sección de Materiales y Métodos.
La FIG. 4A muestra una tinción representativa de tejido mamario normal y canceroso. Aunque los tejidos de mama normales y cancerosos se tiñeron negativamente con el anticuerpo IgG de control, el anticuerpo anti-MOSPD2 sólo tiñó de manera distintiva los tejidos cancerosos. De forma similar, MOSPD2 no se expresa en tejidos normales de vejiga, cerebro, colon, esófago, lengua, riñón e hígado, pero se regula al alza cuando estos tejidos se vuelven cancerosos (FIGs. 4B-4E). Estos resultados sugieren que en varios tejidos, la expresión de MOSPD2 está asociada con la transformación de tejido normal en tejido canceroso.
Ejemplo 6
Genosupresión de MOSPD2 y migración de células cancerosas
In vitro: Para lograr la genosupresión sostenible de MOSPD2, las células de cáncer de mama MDA-231 se transdujeron con partículas lentivirales que contienen el sistema de edición de genes CRISPR-CAS9 como se describe en la sección Materiales y Métodos. Las células MDA-231 transducidas con partículas lentivirales MOSPD2 CRISPR-CAS9 o control se ensayaron para la migración de manera similar al método descrito en el Ejemplo 2. Las células MDA-231 (3x105) transducidas con partículas lentivirales control o MOSPD2 CRISPR-CAS9 se sembraron en la cámara superior, seguido de incubación durante 2-4 horas. Posteriormente, se determinó mediante FACS el número de células que migraron al compartimento inferior.
Las FIGs. 5A y 5B muestran que la introducción del sistema CRISPR-CAS9 para MOSPD2 en células cancerosas MDA-231 abolió la expresión de proteínas y, en consecuencia, inhibió significativamente la migración de las células en un ensayo de pocillos trans.
Para ensayar los efectos del silenciamiento de MOSPD2 por CRISPR-CAS9 en eventos de señalización impulsados por receptores de quimioquinas, se estudiaron los niveles de fosforilación de ERK, AKT y FAK como se describe en Materiales y Métodos. De acuerdo con los resultados del ensayo de migración, el silenciamiento de MOSPD2 por el sistema CRISPR-CAS9 en comparación con el control evitó por completo la fosforilación de AKT e inhibió claramente la fosforilación de ERK y FAK (véase Western Blots en la FIG. 5C) en células expuestas a EGF.
In vivo: 106 células MDA-231 transducidas con lenti-virus CRISPR-control o CRISPR-MOSPD2 se inyectaron en la vena de la cola de ratones SCID hembra de 8 semanas de edad (C.B-17/IcrHsd-Prkdcscid, Harlan Israel). A continuación, se sacrificaron los ratones después de 3 semanas. Se extirparon los pulmones para un examen histopatológico similar al método descrito en el Ejemplo 4. La FIG. 5D muestra que silenciar MOSPD2 por el sistema CRISPR-CAS9 inhibe significativamente la presencia de células de cáncer de mama metastásico en los pulmones en más del 95% (área de metástasis).
Ejemplo 7
Vía de señalización VB-201 y EGF
In vitro: Para ensayar el efecto de VB-201 sobre la fosforilación inducida por el factor de crecimiento epidérmico (EGF), células de cáncer de mama MDA-231 (106) se privaron de alimento durante 3 horas en medio FCS al 0,5%, seguido de incubación con varias concentraciones de VB-201 (1 pg/ml, 5 pg/ml, y 10 pg/ml) o un control de disolvente durante 20 minutos. A continuación, las células MDA-231 se activaron con EGF (200 ng/ml) durante 10 minutos. A continuación, se analizó la fosforilación de AKT mediante Western Blot. Se empleó HSP90 para un control de carga.
Como se muestra en la FIG. 6, VB-201 a 10 pg/ml inhibe casi completamente la fosforilación de AKT inducida por EGF, con una inhibición significativa observada a 5 pg/ml.
Ejemplo 8
Generación de anticuerpos monoclonales anti-MOSPD2 (Fab ’)2
Los anticuerpos monoclonales (mAb) anti-MOSPD2 (Fab')2 se obtuvieron empleando la plataforma HuCAL PLATINUM® (Bio-Rad AbD Serotec, GmnH) que contiene una selección de Fab humanos que presentan fagos.
Para resumir, la proteína recombinante de la región extracelular de MOSPD2 fusionada a Fc humana se inmovilizó sobre un soporte sólido. La biblioteca de HuCAL® presentada en partículas de fagos se incubó con el antígeno inmovilizado. Los anticuerpos inespecíficos se eliminaron mediante un lavado extenso y los fagos de anticuerpos específicos se eluyeron añadiendo un agente reductor. El ADN del anticuerpo se aisló como una combinación y se subclonó en un vector de expresión E. coli para generar mAb F(ab')2 bivalente Las colonias se recogieron y se cultivaron en una placa de microvaloración. Los cultivos se lisaron para liberar las moléculas de anticuerpo y se seleccionaron para la unión de antígenos específicos mediante ELISA y FACS. Los anticuerpos únicos se expresaron y purificaron empleando cromatografía de afinidad de una etapa, y después se volvieron a analizar mediante ELISA y FACS para determinar su especificidad.
La FIG. 7 enumera 17 clones de anticuerpos monoclonales anti-MOSPD2 F(ab')2 que se identificaron después de un cribado primario para la unión a células que sobre-expresan MOSPD2. Un análisis adicional de los clones para la unión de MOSPD2 con ELISA identificó 12 clones que tenían valores D.O. 5 veces superiores sobre el de origen (*en la FIG. 7).
Ejemplo 9
El mAb anti-MOSPD2 F (ab ')2 se une al MOSPD2 humano sobre-expresado en las células
Se transfectaron células de melanoma A2058 con MOSPD2 humano marcado con HA para generar células que sobre-expresan MOSPD2.
La unión a MOSPD2 de los 12 clones de anticuerpos identificados en el Ejemplo 8 se ensayó a continuación empleando citometría de flujo con estas células. Específicamente, 105 células se incubaron con 2,5 gg de mAb F(ab')2 a 4°C durante 1 hora en 100 gl de tampón FACS (PBS fCs al 2% azida sódica al 0,02%). Después las células se lavaron, se resuspendieron en tampón FACS y se tiñeron durante 30 minutos a 4°C con Alexa-Fluor 647-conjugado con (Fab')2 anti-IgG humana de cabra, F(ab')2 1:200 (Cat N° 109-606-097, Jackson Immunoresearch, PA). Las células se lavaron, se resuspendieron en tampón FACS y se analizaron en un dispositivo FACS-Calibur.
Todos los clones tiñeron positivamente las células. La tinción representativa para 2 clones se muestra en las FIGs. 8A-8B. Se empleó como control negativo un clon que no se identificó como un clon positivo en el Ejemplo 8 con ELISA.
Ejemplo 10
El mAb anti-MOSPD2 F(ab) 2 se une específicamente a MOSPD2 endógeno en células de cáncer de mama humano
Se ensayó mAb anti-MOSPD2 F(ab')2 por su unión a MOSPD2 endógeno expresado en la superficie en células de cáncer de mama MDA-231. Las células se tiñeron con mAb anti-MOSPD2 F(ab')2 como se describe en el Ejemplo 9. La tinción con 2 clones diferentes se muestra en la FIG. 9. El clon negativo para ELISA descrito en el Ejemplo 9 se utilizó como control negativo. La FIG. 9 muestra que el mAb anti-MOSPD2 F (ab')2 se une específicamente a MOSPD2 endógeno en células de cáncer de mama humano.
Para demostrar aún más la especificidad de unión al antígeno, la expresión del gen MOSPD2 se silenció en células MDA-231 empleando partículas lentivirales CRISP-CAS9. Las células silenciadas con MOSPD2 y las células no silenciadas se combinaron con mAb anti-MOSPD2 (Fab')2 o un control negativo y se analizaron con FACS. Las FIGs 10A-10B muestran que el mAb anti-MOSPD2 F(ab')2 se une a las células MDA-231 (FIG. 10A), pero no se une a las células MDA-231 silenciadas con MOSPD2 (FIG 10B).
Ejemplo 11
El mAb anti-MOSPD2 F(ab ’)2 se une a MOSPD2 endógeno en células de melanoma y cáncer de hígado
Se ensayó la unión de mAb anti-MOSPD2 F(ab')2 a MOSPD2 endógeno expresado en la superficie de líneas celulares de melanoma A2058 y cáncer de hígado HepG2. Las células se tiñeron con mAb anti-MOSPD2 F(ab')2 y se ensayó la unión a MOSPD2 como se describe en los Ejemplos 9 y 10. Las FIGs. 11A-11B muestran que el mAb anti-MOSPD2 F (ab')2 se une específicamente al MOSPD2 endógeno en células de melanoma y cáncer de hígado.
Ejemplo 12
El mAb anti-MOSPD2 F(ab ’)2 inhibe la señalización inducida por EGF en células cancerosas MDA-231
Se analizó con Western blot el efecto del mAb anti-MOSPD2 F(ab')2 sobre la señalización inducida por EGF en células cancerosas MDA-231. Específicamente, las células MDA-231 se privaron de alimento durante la noche con un medio que contenía FCS al 0,5% y después se incubaron durante 1 hora con mAb anti-MOSPD2 F(ab’)2 antes de agregar eGf (100 ng/ml) durante 5 minutos. Las células se lavaron y se resuspendieron en tampón de lisis, se cargaron en un gel Criterion TGX prefabricado (Bio-Rad, Hemel Hempstead, Reino Unido) y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon con leche al 5% o BSA en disolución salina tamponada con Tris y Tween 20 (TBST) durante 1 hora, y después se incubaron con anticuerpos primarios y secundarios. Las membranas se desarrollaron utilizando un kit ECL (Thermo Scientific). Las células que no se trataron con mAb (unt) anti-MOSPD2 F(ab')2 se analizaron como un control negativo. Los niveles de proteína de choque térmico (HSP-90) también se analizaron como un control de carga de proteínas.
Se utilizaron los siguientes anticuerpos:
Anticuerpos primarios: p-ERK1/2 (n° de cat. M8159; 1:10.000) de Sigma (Israel); fosfo-AKT (n° cat. 9271; Ser 473, 1: 1000) y receptor de fosfo-EGF (n° cat. 2236 1:1000) de Cell Signalling; y HSP-90 (cat. no. 13119; 1:500) de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA).
Anticuerpos secundarios: HRP de burro anti-conejo (1:5000) y HRP de cabra anti-ratón (1:3000) de Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, EE.UU.).
Como se muestra en la FIG. 12, la incubación de células MDA-231 con el mAb anti-MOSPD2 F(ab')2 inhibe la fosforilación del receptor EGF (pEGF-R), así como la fosforilación de AKT y ERK, que son mediadores de las vías de señalización descendentes asociadas con la migración celular (p-AKT y p-ERK1/2, respectivamente).
Ejemplo 13
mAb anti-MOSPD2 F (ab ')2 inhibe la migración inducida por EGF de células cancerosas MDA-231
Se analizó el efecto del mAb anti-MOSPD2 F(ab')2 sobre la migración inducida por EGF de células cancerosas MDA-231 con migración de pocillos trans como se explica en el Ejemplo 2. Las células de cáncer de mama MDA-231 (3x105) se privaron de alimento durante 4-5 horas en medio RPMI que contenía FCS al 0,5% y después se incubaron durante 1 hora con mAb anti-MOSPD2 F(ab')2. Se disolvió EGF y se colocó en la cámara inferior (400 ng/ml) de una placa de ensayo de migración de 24 pocillos QCM (poros de 8 gm) (Corning-Costar, Corning, NY) que contenía medio RPMI con FCS al 10%. Las células se sembraron en la cámara superior, seguido de incubación durante la noche, después de lo cual se determinó mediante FACS el número de células que migraron al compartimento inferior.
Como se muestra en la FIG. 13, el mAb F(ab')2 inhibe significativamente la migración de pocillos trans inducida por EGF de las células de cáncer de mama MDA-231.
Ejemplo 14
Definición de la especificidad de la expresión celular y la localización de MOSPD2
El análisis de diferentes subpoblaciones de células inmunitarias indica que MOSPD2 se expresa de manera predominante en monocitos CD14+ sobre los linfocitos T y B (FIG. 14A). Para determinar el nivel de expresión de ARNm de MOSPD2, se extrajo ARN de las células empleando el mini kit RNeasy (Qiagen, ValenVBa, c A). Para la preparación de ADNc, se combinaron 2 gg de ARN con una mezcla de reacción qScript y transcriptasa inversa qScript (Quanta Bioscience, Gaithersburg, MD). La reacción se colocó en un termociclador (BioRad, Hercules, CA) y se programó un ciclo según las instrucciones del fabricante. Las reacciones de PCR en tiempo real se realizaron en un sistema de PCR en tiempo real Applied Biosystems 7300 (Grand Island, NY) empleando conjuntos de cebadores para MOSPD2 humano, 28S para normalizar los niveles de ARN (BIOSEARCH TECHNOLOGIES, Petaluma, CA) y SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Warrington, Reino Unido).
Se predice que MOSPD2 es una proteína de la membrana plasmática con una región transmembrana y una cola intracelular de resto largo. El fraccionamiento de los compartimentos celulares, y la tinción por inmunofluorescencia de monocitos humanos, y la citometría de flujo en células HEK 293 transfectadas para sobre-expresar MOSPD2 marcado con HA (realizado según los métodos descritos anteriormente) revelan que MOSPD2 es una proteína de la superficie celular que se expresa en la membrana plasmática de monocitos humanos (FIGs. 14B-14D, respectivamente).
Ejemplo 15
MOSPD2 se expresa en monocitos infiltrados en tejidos inflamados
Los tejidos fijados con formalina se deshidrataron, se embebieron en parafina, y se seccionaron a 4 gm. La inmunotinción se calibró completamente en un módulo de tinción Benchmark XT (Ventana Medical Systems). Después de desparafinar y rehidratar las secciones, se añadió anti-CD163 (Cell Marque, Rocklin, EE.UU., MRQ-26) o anti-MOSPD2 diluido a 1:80 y 1:100, respectivamente, y se dejó reposar durante 40 minutos. La tinción anti-CD163 se detectó empleando el kit de detección de rojo de fosfatasa alcalina universal UltraView (Ventana Medical Systems, 760-501) y la tinción anti-MOSPD2 se detectó empleando el kit de detección DAB UltraView Universal (Ventana Medical Systems, 760-500). Cuando se aplicó la tinción doble, primero se realizó la tinción con MOSPD2 seguida de la tinción con CD163. Los portaobjetos se tiñeron por contraste con hematoxilina (Ventana Medical Systems). Después de que se completó la ejecución en el teñidor automático, los portaobjetos se deshidrataron consecutivamente en etanol al 70%, etanol al 95% y etanol al 100% durante 10 segundos cada uno. Antes de poner la cubierta, las secciones se aclararon en xileno durante 10 segundos y se fijaron con Entellan. Los portaobjetos teñidos con MOSPD2 y CD163 se visualizaron empleando un microscopio Olympus BX51. Las imágenes se tomaron empleando una cámara de visión digital Nikon y el programa informático NIS Elements Imaging.
Como se muestra en las FIGs. 15A-15C, MOSPD2 se expresa en monocitos infiltrados en una variedad de tejidos inflamados. La FIG. 15A muestra la tinción de la membrana sinovial de un paciente con artritis reumatoide para CD163, MOSPD2, o tanto para CD163 como para MOSPD2. La FIG. 15B muestra la tinción del tejido carotídeo aterosclerótico para CD163, MOSPD2, o tanto para CD163 como para MOSPD2. La FIG. 15C muestra la tinción del tejido mamario infiltrante de carcinoma ductal para MOSPD2. Las flechas oscuras indican tinción positiva para células tumorales. Las flechas claras indican la tinción de los monocitos infiltrados.
Ejemplo 16
MOSPD2 promueve la migración de monocitos
Se transdujeron células de la línea monocítica U937 con partículas lentivirales sh-control o sh-MOSPD2 como se describe anteriormente. La FIG. 16A muestra la eficacia del silenciamiento de MOSPD2 como se evaluó mediante Q-PCR y western blot. Cuando se ensayó la migración, las células silenciadas con MOSPD2 se vieron gravemente afectadas en su capacidad para migrar in vitro hacia RANTES (CCL5) (FIG. 16B). Dos vías de señalización importantes reconocidas como cruciales para la migración de monocitos son las vías MEK-ERK y PI3K-AKT (Di Lorenzo et al., 2009; Wain et al., 2002). La FIG. 16C muestra que la fosforilación de ERK y AKT en presencia de RANTES está completamente suprimida en células silenciadas con MOSPD2.
Para determinar si el efecto observado está restringido a una sola quimioquina, se activaron células U937 silenciadas con sh-control y sh-MOSPD2 con ligandos que inducen la migración y la fosforilación a través de diferentes receptores de quimioquinas. El silenciamiento de MOSPD2 altera la migración de monocitos y la fosforilación de ERK y AKT independientemente de la quimioquina empleada (FIGs. 16D y 16E, respectivamente).
Ejemplo 17
MOSPD2 no afecta la activación inducida por IFN-gamma o la activación mediada por PKC
La selección de MOSPD2 no comprometió las funciones biológicas de los monocitos además de la migración. Se transdujeron células de la línea monocítica U937 con partículas lentivirales sh-control o sh-MOSPD2 como se describe anteriormente y se trataron con IFN-gamma o con PMA. El análisis de transferencia Western de las células tratadas mostró que el silenciamiento de MOSPD2 no alteró la fosforilación de los marcadores de señalización descendente por IFN-gamma o PMA (FIGs. 17A y 17B, respectivamente). Estos resultados sugieren que MOSPD2 promueve específicamente la migración de monocitos.
Ejemplo 18
Mapeo de epítopos de anticuerpos anti-MOSPD2
Para determinar el epítopo o los epítopos a los que se pueden unir los anticuerpos anti-MOSPD2 específicamente a MOSPD2 humano, se miden las afinidades de unión a varios fragmentos de MOSPD2 humano, como se describe en la presente memoria, mediante la captura de fragmentos de MOSPD2 biotinilados en el extremo N mediante una estreptavidina (SA) pre-inmovilizada en un chip SA y midiendo la cinética de unión de los anticuerpos anti-MOSPD2 titulados a través de la superficie de MOSPD2 (el sistema de resonancia de plasmón de superficie (SPR) BIAcore®3000™, Biacore, Inc., Piscataway NJ). Los ensayos BIAcore se realizan en tampón de ejecución HBS-EP (HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, polisorbato P20 al 0,005% v/v). Las superficies de MOSPD2 se preparan diluyendo el MOSPD2 N-biotinilado a una concentración inferior a 0,001 mg/mL en tampón HBS-EP e inyectándolo a través del chip sensor SA empleando tiempos de contacto variables. Las superficies de baja capacidad, correspondientes a niveles de captura <50 unidades de respuesta (RU) se utilizan para estudios cinéticos de alta resolución, mientras que las superficies de alta capacidad (aproximadamente 800 RU de MOSPD2 capturado) se emplean para estudios de concentración, cribado y determinaciones de afinidad de disolución.
Los datos cinéticos se obtienen diluyendo el anticuerpo G1 Fab en serie en incrementos de dos o tres veces hasta concentraciones que abarcan 1 pM-0,1 nM (con el objetivo de 0,1-10 veces el valor estimado de Kd). Las muestras se inyectan normalmente durante 1 minuto a 100 pL/min y se permiten tiempos de disociación de al menos 10 minutos. Después de cada ciclo de unión, las superficies se regeneran con NaOH 25 mM en etanol al 25% v/v, que se tolera durante cientos de ciclos. Una serie de valoración completa (normalmente generada por duplicado) se ajusta globalmente a un modelo de unión de Langmuir 1:1 empleando el programa BIAevaluation. Esto corresponde a un par único de constantes de velocidad cinética de asociación y disociación (respectivamente, Kon y Koff) para cada interacción de unión, cuya relación proporciona la constante de disociación de equilibrio (Kd= Koff/ Kon).
Los anticuerpos anti-MOSPD2 pueden unirse a una o más de las siguientes regiones de aminoácidos de MOSPD2 humano, numeradas según SeQ ID NO:1 (restos de aminoácidos 1-518): 508-517, 501-514, 233-241,509-517, 212­ 221, 13-24, 505-517, 505-514, 89-100, 506-517, 233-245, 504-514, 128-136, 218-226, 15-24, 83-96, 42-50, 462-474, 340-351, 504-517, 462-470, 327-337, 21-32, 217-226, 510-517, 178-190, 497-509, 504-516, 64-77, 504-515, 147­ 159, 503-315, 88-97, 208-218, 178-191, 502-515, 503-516, 497-505, 500-509, 189-202, 189-197, 505-516, 1-63, 82­ 239, 93-234, 327-445, 327-431, y 497-517.
Ejemplo 19
Anticuerpos anti-MOSPD2 adicionales
Se generan anticuerpos anti-MOSPD2 adicionales que reconocen uno o más epítopos de MOSPD2, siguiendo la metodología descrita en el Ejemplo 1 (anticuerpos policlonales) o el Ejemplo 8 (anticuerpos monoclonales).
En resumen, porciones de MOSPD2 identificadas en el Ejemplo 18 como epítopos de MOSPD2 se fusionan con Fc humano y se inmovilizan sobre un soporte sólido. Una biblioteca HuCAL® (Plataforma HuCAL PLATINUM®; Bio-Rad AbD Serotec, GmnH) presentada en partículas de fagos se incuba con el antígeno inmovilizado. Los anticuerpos inespecíficos se eliminan mediante un lavado extenso y los fagos de anticuerpos específicos se eluyen mediante la adición de un agente reductor. El ADN del anticuerpo se aísla como una combinación y se subclona en un vector de expresión E. coli para generar mAb F(ab')2 bivalente Las colonias se recogen y se cultivan en una placa de microvaloración. Los cultivos se lisan para liberar las moléculas de anticuerpo y se seleccionan para la unión de antígenos específicos mediante ELISA y FACS. Los anticuerpos únicos se expresan y purifican empleando cromatografía de afinidad de una etapa, y después se vuelven a analizar mediante ELISA y FACS para determinar su especificidad.
Ejemplo 20
La expresión de MOSPD2 aumenta en correlación con el grado del tumor en varios tipos de cáncer
Para determinar si la expresión de MOSPD2 se asociaba con la progresión del tumor, se seleccionaron portaobjetos que portaban tejidos normales y cancerosos en diferentes grados de tumor empleando el anticuerpo anti-MOSPD2 como se describe en la sección Materiales y Métodos. La abundancia de MOSPD2 se puntuó según la intensidad de la tinción en una escala de 0 a 3. En los casos en que se observó tinción con intraheterogeneidad dentro de un solo núcleo, se asignó la puntuación del área con la cobertura más alta.
Las FIGs. 18A-18F muestran tinción representativa de MOSPD2 en cáncer de mama y tejido de control. El tejido adyacente normal (NAT) sirvió como control negativo, y las etapas tumorales en escalada incluyeron carcinoma lobulillar in situ (LCIS), carcinoma intraductal in situ (IDIS), carcinoma ductal invasivo (IDC), carcinoma lobulillar invasivo (ILC) y carcinoma ductal invasivo metastásico (MIDC). Mientras que las tinciones representativas de NAT, LCIS e IDIS se tiñeron negativamente para MOSPD2, IDC, ILC y MIDC, las tinciones representativas demostraron una intensa tinción positiva de MOSPD2.
La FIG. 19 demuestra una mayor intensidad de tinción de MOSPD2 en el cáncer de mama invasivo y metastásico. Dentro de NAT, sólo el 18% (2/11) de las muestras mostraron una intensidad de tinción de 1, mientras que el 21% (4/19) de las muestras de carcinoma in situ (IDIS+LCIS) se puntuaron con 1 o 2. Sin embargo, el análisis de los tejidos metastásicos demostró una frecuencia más alta en una puntuación de 2 y una mayor intensidad de tinción hasta una puntuación de 3, en comparación con NAT y carcinoma in situ (IDIS+LCIS). Por lo tanto, el porcentaje de puntuaciones combinadas 2 y 3 para ILC, IDC y MIDC fue del 63% (12/19), 77% (50/65) y 81% (25/31), respectivamente.
La expresión de MOSPD2 se correlacionó con la transformación de células normales a cancerosas en el colon así como en los tejidos hepáticos. Las FIGs 20A-20D demuestran que en el 67% de las muestras de cáncer de colon y en el 45% de las muestras de carcinoma hepatocelular analizadas, hubo una tinción MOSPD2 positiva. No se detectó tinción de MOSPD2 (0%) en el colon normal o en los tejidos hepáticos analizados.
La expresión de MOSPD2 también se correlacionó con la malignidad. Las FIGs 21A-21E muestran una intensa tinción de MOSPD2 en el carcinoma hepatocelular que aumenta con el grado del tumor, mientras que las muestras normales y NAT eran negativas para la tinción de MOSPD2.
Las FIGs. 22A-22B resumen la intensidad de la tinción de MOSPD2 en tejidos de hígado cancerosos o controles de las FIGs. 21A-21E. La intensidad de la tinción de MOSPD2 se incrementó significativamente en 3,2 o 4 veces en las muestras malignas en comparación con la muestra normal y NAT, respectivamente (p<0,001). La FIG. 22B muestra el aumento en la intensidad de la tinción de MOSPD2 en diferentes etapas del carcinoma hepatocelular.
Ejemplo 21
VB-201 inhibe MOSPD2
Marcaje de VB-201 y VB-221
VB-201 y VB-221 se marcaron con biotina como sigue. VB-201, VB-221 y ovoalbúmina (OVA, Sigma, Israel) se disolvieron en tampón MES 0,1 M (Thermo Scientific, Rockford, IL) y se conjugaron empleando EDC [1 -etil-3-(dimetilaminopropil) carbodiimida HCL] (Thermo Scientific) en una relación molar de 100 (VB-201/VB-221): 1 (OVA):240 (EDC) durante 2-3 horas a temperatura ambiente. Después de lo cual, las muestras se transfirieron a casetes de diálisis de 10 kDa (Thermo Scientific) y se dializaron durante la noche frente a PBS. La ovoalbúmina unida a VB-201 (OB201) y VB-221 (OB221) se conjugaron después con amina-PEG2-biotina (en tampón MES 0,1 M) empleando EDC en una relación molar de 1 (OB201/OB221):100 (amina-PEG2-biotina):700 (EDC). Se dejó que

Claims (21)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo anti-Proteína 2 que contiene el dominio espermático móvil (MOSPD2) o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer, en donde MOSPD2 es expresado por dicho cáncer.
2. Un anticuerpo anti-Proteína 2 que contiene el dominio espermático móvil (MOSPD2) o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en el tratamiento, prevención o reducción de la incidencia de metástasis de una célula cancerosa, en donde MOSPD2 es expresado por dicha célula cancerosa.
3. El anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según la reivindicación 1 o 2, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
4. El anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el anticuerpo es humano o humanizado.
5. El anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el fragmento de unión a antígeno es un Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, fragmento sdFv, dominio VH, o dominio VL.
6. El anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo se une específicamente a un polipéptido que tiene una secuencia de SEQ ID NO:1.
7. El anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el anticuerpo anti-MOSPD2 o su fragmento de unión a antígeno se une específicamente a un polipéptido que tiene una secuencia de cualquiera de las SEQ ID NOs:2-4.
8. El anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno el mismo para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a MOSPD2 con una afinidad de unión (Kd) de aproximadamente 10-6 M a aproximadamente 10-12 M.
9. El anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo inhibe la migración de células cancerosas, la migración de monocitos asociada con el crecimiento tumoral, una vía de señalización de quimioquinas, una vía de señalización del factor de crecimiento, la fosforilación del receptor EGF, la fosforilación de ERK, la fosforilación de AKT, la fosforilación de FAK, o una combinación de las mismas.
10. El anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo reduce el número de monocitos circulantes o de macrófagos asociados a tumores cerca o dentro de la masa cancerosa, o la migración de macrófagos asociados a tumores.
11. El anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el cáncer es cáncer de vejiga, cáncer de cerebro, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de esófago, cáncer de vesícula biliar, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de estómago, cáncer de cuello uterino, cáncer de tiroides, cáncer de próstata, cáncer de piel, cáncer hematopoyético, cáncer de origen mesenquimal, cáncer del sistema nervioso central o periférico, cáncer de endometrio, cáncer de cabeza y cáncer de cuello, glioblastoma, o ascitis maligna.
12. El anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según la reivindicación 11, en donde el cáncer de pulmón es un cáncer de pulmón de células pequeñas o un cáncer de pulmón de células no pequeñas.
13. El anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según la reivindicación 11, en donde el cáncer de piel es carcinoma de células escamosas, cáncer de células basales, melanoma, dermatofibrosarcoma protuberans, carcinoma de células de Merkel, sarcoma de Kaposi, queratoacantoma, tumores de células fusiformes, carcinomas sebáceos, carcinoma microquístico anexial, enfermedad de Paget de mama, fibroxantoma atípico, leiomiosarcoma, o angiosarcoma.
14. El anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según la reivindicación 11, en donde el cáncer hematopoyético es un cáncer hematopoyético de linaje linfoide.
15. El anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según la reivindicación 14, en donde el cáncer hematopoyético de linaje linfoide es leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de células B, linfoma de células T, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, linfoma de células pilosas, o linfoma de Burkitt.
16. El anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según la reivindicación 11, en el que el cáncer hematopoyético es un cáncer hematopoyético de linaje mieloide.
17. El anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según la reivindicación 16, en donde el cáncer hematopoyético de linaje mieloide es leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, síndrome mielodisplásico, o leucemia promielocítica.
18. El anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según la reivindicación 11, en donde el cáncer de origen mesenquimal es fibrosarcoma, rabdomiosarcoma, sarcoma de tejido blando, o sarcoma óseo.
19. El anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según la reivindicación 11, en donde el cáncer del sistema nervioso central o periférico es astrocitoma, neuroblastoma, glioma, o schwannomas.
20. El. anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el cáncer es cáncer anal, cáncer óseo, cáncer de estoma gastrointestinal, enfermedad trofoblástica gestacional, queratoacantoma, mesotelioma maligno, enfermedad de Castleman multicéntrica, mieloma múltiple y otras neoplasias de células plasmáticas, neoplasias mieloproliferativas, osteosarcoma, cáncer de ovario, de trompas de Falopio o primario de peritoneo, cáncer de pene, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, seminoma, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de estómago (gástrico), cáncer testicular, teratocarcinoma, cáncer folicular de tiroides, cáncer vaginal, cáncer vulvar, tumor de Wilms y otros cánceres de riñón infantiles, o xeroderma pigmentoso.
21. El anticuerpo anti-MOSPD2 o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en donde dicho uso es en un ser humano.
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