ES2838804T3 - BAG3 como diana para el tratamiento de la insuficiencia cardíaca - Google Patents

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Abstract

Un vector de expresion que codifica un peptido o polipeptido de atanogen 3 asociado a BCL2 (BAG3) para su uso en el tratamiento de la insuficiencia cardiaca o el riesgo de insuficiencia cardiaca.

Description

DESCRIPCIÓN
BAG3 como diana para el tratamiento de la insuficiencia cardíaca
Campo de la invención
Las realizaciones de la invención se dirigen a un vector de expresión que codifica un péptido o polipéptido de atanogén 3 asociado a BCL-2 (BAG3) para su uso en el tratamiento de la insuficiencia cardíaca o el riesgo de la insuficiencia cardíaca, y a un método de diagnóstico o identificación de un paciente en riesgo de desarrollar cardiomiopatía dilatada idiopática.
Antecedentes
La insuficiencia cardíaca (HF), secundaria a la disfunción sistólica y la dilatación cardíaca, afecta a más de 5 millones de personas en EE. UU. y es una causa importante de morbilidad y mortalidad. Aproximadamente el 30 % de estos pacientes tienen enfermedad no isquémica o cardiomiopatía dilatada idiopática (IDC). Aunque en la mayoría de los pacientes con IDC los factores causales han permanecido indefinidos, la evidencia emergente sugiere que hasta el 35 % de las personas con IDC tienen un familiar de primer grado afectado (Jefferies JL TJ. Lanceta. 2010; 375:752-762) y la iDc puede asociarse con anomalías genéticas en el 20-35 % de las personas, lo que lleva al uso de la nomenclatura cardiomiopatía dilatada familiar (FDC) (Judge DP y otros, Journal of Cardiovascular Translational Research. 2008; 1:144-154; Hershberger RE y otros, Circulation. Genética cardiovascular. 2010; 3:155-161). De hecho, se han identificado mutaciones en más de 30 genes como factores causales (Hershberger RE, y otros, Circulation. Insuficiencia cardiaca. 2009; 2:253-261) y el patrón de herencia más común es el autosómico dominante con penetrancia reducida y expresividad variable (Morales A, Hershberger RE. Informes actuales de cardiología. 2013;15:375).
Las mutaciones que causan FDC se encuentran en genes que codifican un amplio espectro de proteínas 6; sin embargo, una gran cantidad de mutaciones que causan FDC ocurren en genes que codifican proteínas sarcómeras o la compleja red de proteínas en el disco Z (Chang AN, Potter JD. Revisiones de insuficiencia cardíaca.
2005;10:225-235; Selcen D. Miopatías miofibrilares. Trastornos neuromusculares: ENM. 2011; 21:161-171).
Resumen
Las realizaciones de la invención se dirigen a un vector de expresión que codifica un péptido o polipéptido de atanogén 3 (BAG3) asociado a BCL-2 para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 y de acuerdo con las reivindicaciones dependientes 2 a 14, y a un método de diagnóstico o identificación de un paciente en riesgo de desarrollar cardiomiopatía dilatada idiopática de acuerdo con la reivindicación 15.
Brevemente, los resultados obtenidos en el presente documento han identificado una variante nueva y rara en una familia con cardiomiopatía dilatada familiar.
Se encontró que los pacientes con cardiomiopatía dilatada idiopática que no tenían una mutación en el gen BAG3 tenían la mitad del nivel normal de BAG3, la misma disminución que se encontró en el corazón del paciente con la enfermedad familiar y la mutación BAG3.
Los resultados también mostraron que los ratones con insuficiencia cardíaca debido a la banda aórtica (un modelo comúnmente usado para estudios de insuficiencia cardíaca) tenían sustancialmente menos BAG3 que los controles normales, y una reducción en BAG3 que refleja la observada en humanos.
Los resultados también mostraron que cuando se administró un vector AAV (AAV9) in vivo, para sobreexpresar BAG3 en el corazón, se observó una fuerte sobreexpresión. En otras realizaciones generales, un agente comprende un vector cardiotrópico que expresa una molécula bAG3. En algunas realizaciones, el vector es un vector AAV9. También se encontró que cuando la proteína BAG3 se sobreexpresaba en los corazones de ratones con insuficiencia cardíaca secundaria a bandas aórticas (y niveles bajos de BAG3) mediante el uso del vector AAV9, se reconstituía el rendimiento ventricular izquierdo normal. Estos resultados proporcionan evidencia de que los niveles de BAG3 están disminuidos en el corazón que falla en el ratón y el vector AAV9 sobreexpresa BAG3 en la diana deseada en el corazón, lo que resulta en un cambio en la función comparable a una función normal.
Otros aspectos se describen a continuación.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es una representación esquemática que muestra el Pedigrí de la Cardiomiopatía Dilatada Asociada a BAG3. Los varones están representados por cuadrados. Los círculos indican mujeres. Los símbolos abiertos representan a los individuos no afectados y los símbolos negros representan a los individuos afectados. La presencia o ausencia de la deleción de 10 nucleótidos en BAG3 se indica mediante un (+) o un (-), respectivamente. Una flecha denota el probando. Se usó un asterisco para indicar los individuos cuyo ADN se usó para secuenciar el exoma completo. Se usó una línea diagonal para indicar a las personas fallecidas.
La Figura 2A es una representación esquemática que muestra el alineamiento de secuencia para la deleción de 10 nucleótidos en BAG3. La Figura 2B es una representación esquemática que muestra la secuencia representativa de Sanger de la deleción en el gen BAG3 en un individuo afectado.
Las Figuras 3A y 3B muestran el bajo nivel de expresión de BAG3 en pacientes con insuficiencia cardíaca. Se muestra una transferencia Western representativa de los niveles de BAG3 y GAPDH en el corazón humano que no falla (NF) y en el que falla (F). El gráfico muestra la cuantificación de los niveles de proteína BAG3 en el corazón humano que no falla y en el que falla. Los valores se normalizan al nivel de GAPDH para tener en cuenta las variaciones en la carga de proteínas. Las líneas horizontales representan la media y el error estándar de la media. El análisis estadístico se realizó mediante el uso de la prueba t para datos independientes con la corrección de Welch para la varianza desigual.
La Figura 4 muestra la medición de la fracción de eyección en ratones salvajes operados, ratones salvajes que se han inyectado con el constructo AAV9-BAG3, ratones que se han sometido a bandas aórticas (y desarrollaron insuficiencia cardíaca) y ratones que se han anillado y están con insuficiencia cardiaca pero fueron inyectados con AAV9-BAG3. Como puede verse, la inyección de BAG3 normalizó la función del LV temporalmente en relación con la expresión de la proteína BAG3 (aproximadamente de 5 a 6 semanas después de la inyección).
La Figura 5 es una transferencia Western que muestra los niveles de BAG3 en pacientes. Se muestran tres carriles de "control" y tres carriles de "paciente". Este es el paciente IV-1, que está afectado. Los carriles de "control" son de un corazón humano que no falla, es decir, un corazón humano normal, que se obtuvo en el momento de la recolección de tejido, pero que no se pudo usar para trasplantar debido a la incompatibilidad de tamaño o tipo de tejido con los aceptores disponibles. Todos los carriles etiquetados como "paciente" eran del mismo paciente: IV-1. Estos se obtuvieron de pedazos de su corazón que se explantaron en el momento en que se sometió a un trasplante de corazón. Los resultados muestran que la disminución de los niveles de BAG3 es comparable con la disminución que se observó en los pacientes con insuficiencia cardíaca no familiar.
Las Figuras 6A-6D muestran los niveles de BAG3 en corazones murinos que fallan. La Figura 6A es un gráfico que representa las relaciones entre el peso del corazón y el peso corporal; la Figura 6B es un gráfico que representa la contractilidad; la Figura 6C es un gráfico que representa los niveles de la proteína BAG3; la Figura 6D es un análisis de inmunotransferencia de los niveles de la proteína BAG3.
Las Figuras 7A-7F muestran índices hemodinámicos y niveles de BAG3 en corazones porcinos después de la oclusión con balón. La Figura 7A es un gráfico que representa la fracción de eyección; la Figura 7B es un gráfico que representa el acortamiento fraccionado; la Figura 7C es un gráfico que representa el volumen diastólico final; la Figura 7D es un gráfico que representa el volumen sistólico final; la Figura 7E es un gráfico que representa los niveles de la proteína BAG3; la Figura 7F es un análisis de inmunotransferencia de los niveles de la proteína BAG3. La Figura 8 muestra la secuencia de aminoácidos de referencia NCBI para BAG3.
Descripción detallada
La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de los inventores de una nueva mutación de BAG3 en una familia con cardiomiopatía dilatada familiar (FDC) de inicio en la adultez. Más específicamente, los inventores han descubierto que una nueva deleción de 10 nucleótidos segrega en todos los individuos afectados. Además, los inventores también encontraron que los niveles de la proteína BAG3 se redujeron significativamente en corazones de pacientes no emparentados con insuficiencia cardíaca en etapa terminal en comparación con controles que no fallaron. Además, los inventores han demostrado que, en un modelo murino de insuficiencia cardíaca, la administración de un vector AAV que expresa BAG3 restauró la función ventricular normal. Por consiguiente, esta descripción presenta composiciones que aumentan la expresión de BAG3, métodos para preparar tales composiciones y métodos para usar tales composiciones para tratar un sujeto, es decir, un paciente que padece cardiomiopatía dilatada. También se presentan métodos y composiciones para el diagnóstico de la insuficiencia cardíaca, por ejemplo, cardiomiopatía dilatada idiopática (IDC).
Antanogén-3 asociado a Bcl-2 (BAG3), también conocido como atanogén 3 asociado a BCL2; MFM6; Bis de proteína de unión a Bcl-2; CAIR-1; Proteína de acoplamiento CAIR-1; Regulador 3 de la chaperona molecular familia de BAG; BAG-3; Atanogén 3 de unión a BCL2; o BIS, es un polipéptido citoprotector que compite con Hip-1 por unirse a HSP 70. La función de BAG3 se ilustra en la Figura 8 y el mecanismo para la participación de BAG3 en la función de los cardiomiocitos se ilustra en la Figura 9. La secuencia de aminoácidos de referencia de NCBI para BAG3 puede encontrarse en Genbank con el número de acceso NP_004272.2; GI pública:14043024. Nos referimos a la secuencia de aminoácidos del número de acceso de Genbank NP_004272.2; Público GI:14043024 como SEQ ID NO: 1 como se muestra en la Figura 10. La secuencia de ácido nucleico de referencia de NCBI para BAG3 puede encontrarse en Genbank con el número de acceso NM 004281.3 GI: 62530382. Nos referimos a la secuencia de ácido nucleico del número de acceso de Genbank NM_004281.3 GI:62530382 como SEQ ID NO: 2. Otras secuencias de aminoácidos de BAG3 incluyen, por ejemplo, sin limitación, 095817.3 GI: 12643665 (SEQ ID NO: 3); EAW49383.1 GI:119569768 (SEQ ID NO: 4); EAW49382.1 GI:119569767 (SEQ ID NO: 5); y CAE55998.1 GI:38502170 (SEQ ID NO: 6).
En el presente documento se proporcionan vectores que contienen ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de BAG3.
Se identificó una nueva mutación BAG3 en una familia con FDC de inicio en la adultez. Los niveles de la proteína BAG3 disminuyeron significativamente en pacientes no emparentados con IDC no familiar, lo que proporciona evidencia de que los niveles alterados de la proteína BAG3 participan en la progresión de la HF.
Esta descripción da a conocer composiciones que modulan la expresión de anthanogén-3 (BAG3) asociado a Bcl-2 in vivo o in vitro. La modulación de BAG3 en pacientes que necesitan tal terapia, incluye pacientes con enfermedades o trastornos cardíacos, por ejemplo, insuficiencia cardíaca, o enfermedades o trastornos músculoesqueléticos. La descripción también da a conocer la identificación de nuevos compuestos o agentes que modulan la expresión de BAG3 mediante el uso de ensayos que miden la expresión de BAG3.
Varios aspectos de la invención se describen a continuación con referencia a aplicaciones ejemplo para ilustración. Debe entenderse que se establecen numerosos detalles específicos, relaciones y métodos específicos se establecen para proporcionar una comprensión completa de la invención. Sin embargo, alguien con habilidades ordinarias en la técnica relevante reconocerá fácilmente que la invención puede ponerse en práctica sin uno o más de los detalles específicos o con otros métodos. La presente invención no está limitada por el orden en que se ilustran los actos o eventos, ya que algunos actos pueden ocurrir en diferentes órdenes y/o simultáneamente con otros actos o eventos. Además, no todos los actos o eventos ilustrados se requieren para implementar una metodología de acuerdo con la presente invención.
Pueden ponerse en práctica realizaciones de la invención sin los aspectos teóricos presentados. Por otra parte, los aspectos teóricos se presentan en el entendimiento de que los solicitantes no buscan estar sujetos a la teoría presentada.
Todos los genes, nombres de genes y productos génicos descritos en el presente documento están destinados a corresponder a homólogos de cualquier especie para los cuales las composiciones y los métodos descritos en el presente documento sean aplicables. Por lo tanto, los términos incluyen, entre otros, genes y productos génicos de seres humanos y ratones. Se entiende que cuando se divulga un gen o producto génico de una especie particular, esta divulgación pretende ser únicamente ilustrativa, y no debe interpretarse como una limitación a menos que el contexto en el cual aparece lo indique claramente. Por lo tanto, por ejemplo, para los genes descritos en el presente documento, los cuales en algunas realizaciones se refieren a secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos de mamíferos, se pretende que abarquen genes y productos génicos homólogos y/u ortólogos de otros animales, incluidos, pero no limitados a, otros mamíferos, peces, anfibios, reptiles y aves. En realizaciones preferentes, los genes o secuencias de ácidos nucleicos son humanos.
Definiciones
La terminología usada en el presente documento tiene el propósito de describir realizaciones particulares solamente y no pretende ser una limitación de la invención. Como se usa en el presente documento, las formas singulares "un", "una" y "el" pretenden incluir las formas plurales también, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Además, en la medida en que los términos "que incluye", "incluye", "que tiene", "tiene", "con" o variantes de los mismos se usan en la descripción detallada y/o las reivindicaciones, se pretende que tales términos sean inclusivos de una manera similar al término "que comprende".
Como se usa en el presente documento, los términos "que comprende", "comprende" o "comprendido" y variaciones de los mismos, en referencia a elementos definidos o descritos de un artículo, composición, aparato, método, proceso, sistema, etc., deben ser inclusivos o abierto, lo que permite elementos adicionales, lo que indica que el elemento, composición, aparato, método, proceso, sistema, etc. definido o descrito incluye esos elementos especificados o, según corresponda, equivalentes de los mismos y que otros elementos pueden incluirse y aún caen dentro del alcance/definición del elemento definido, composición, aparato, método, proceso, sistema, etc.
El término "alrededor de" o "aproximadamente" significa dentro de un rango de error aceptable para el valor particular determinado por alguien con habilidades ordinarias en la técnica, lo cual dependerá en parte de cómo se mida o determine el valor, es decir, las limitaciones del sistema de medición. Por ejemplo, "alrededor de" puede significar dentro de 1 o más de 1 de desviación estándar, según la práctica en la técnica. Alternativamente, "alrededor de" puede significar un rango de hasta el 20 %, preferentemente hasta el 10 %, con mayor preferencia hasta el 5 % y aún con mayor preferencia hasta el 1 % de un valor dado. Alternativamente, particularmente con respecto a sistemas o procesos biológicos, el término puede significar dentro de un orden de magnitud, preferentemente dentro de 5 veces, y con mayor preferencia dentro de 2 veces, de un valor. Cuando se describen valores particulares en la solicitud y las reivindicaciones, a menos que se indique lo contrario, se debe asumir el término "alrededor de" que significa dentro de un rango de error aceptable para el valor particular.
"Opcional" u "opcionalmente" significa que la circunstancia descrita posteriormente puede ocurrir o no, tal que la descripción incluye casos donde la circunstancia ocurre y casos en donde no.
El término "vector de expresión", como se usa en el presente documento, se refiere a un vector que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos parte de un producto génico que puede transcribirse. En algunos casos, las moléculas de ARN se traducen después en una proteína, polipéptido, o péptido. En otros casos, estas secuencias no se traducen, por ejemplo, en la producción de moléculas antisentido, ARNip, ribozimas y similares. Los vectores de expresión pueden contener una variedad de secuencias de control, que se refieren a secuencias de ácido nucleico necesarias para la transcripción y posiblemente la traducción de una secuencia codificante unida operativamente en un organismo huésped particular. Además de las secuencias de control que gobiernan la transcripción y la traducción, los vectores y los vectores de expresión pueden contener secuencias de ácido nucleico que también cumplen otras funciones.
Un "vector viral recombinante" se refiere a un vector viral que comprende uno o más productos o secuencias de genes heterólogos. Dado que muchos vectores virales exhiben limitaciones de tamaño asociadas con el empaquetamiento, las secuencias o productos génicos heterólogos se introducen típicamente mediante el reemplazo de una o más porciones del genoma viral. Tales virus pueden volverse defectuosos en la replicación, lo que requiere que la función o funciones eliminadas se proporcionen en trans durante la replicación y encapsidación viral (mediante el uso, por ejemplo, de un virus auxiliar o una línea celular de empaquetamiento que lleve los productos génicos necesarios para la replicación y/o encapsidación). También se han descrito vectores virales modificados en los que un polinucleótido a administrar se transporta en el exterior de la partícula viral (véase, por ejemplo, Curiel, DT, y otros, PNAS 88:8850-8854, 1991).
Por "codificar" o "codificado", "codifica", con respecto a un ácido nucleico especificado, significa que comprende la información para la traducción en la proteína especificada. Un ácido nucleico que codifica una proteína puede comprender secuencias no traducidas (por ejemplo, intrones) dentro de las regiones traducidas del ácido nucleico, o puede carecer de tales secuencias no traducidas intermedias (por ejemplo, como en el ADNc). La información mediante la cual se codifica una proteína se especifica mediante el uso de codones. Típicamente, la secuencia de aminoácidos está codificada por el ácido nucleico con el uso del código genético "universal".
Como se usa en el presente documento, el término "secuencia promotora/reguladora" significa una secuencia de ácido nucleico que se requiere para la expresión de un producto génico operativamente unido a la secuencia promotora/reguladora. En algunos casos, esta secuencia puede ser la secuencia promotora central y, en otros casos, esta secuencia también puede incluir una secuencia potenciadora y otros elementos reguladores que se requieren para la expresión del producto génico. La secuencia promotora/reguladora puede ser, por ejemplo, una que exprese el producto génico de una manera específica de tejido.
Un "promotor constitutivo" es un promotor que dirige la expresión de un gen al que está unido operativamente, de manera constante en una célula. A modo de ejemplo, los promotores que dirigen la expresión de genes de mantenimiento celular se consideran promotores constitutivos.
Un promotor "inducible" es una secuencia de nucleótidos la cual, cuando está operativamente enlazada con un polinucleótido que codifica o especifica un producto génico, hace que el producto génico se produzca en una célula viva sustancialmente solo cuando un inductor el cual corresponde al promotor está presente en la célula.
Un promotor "específico de tejido" es una secuencia de nucleótidos que, cuando se enlaza operativamente con un polinucleótido que codifica o especifica un producto génico, hace que el producto génico se produzca en una célula viva sustancialmente solo si la célula es una célula del tipo de tejido. correspondiente al promotor.
Como se usa en el presente documento, "BAG3", "moléculas BAG3", "genes de atanogén 3 asociado a BCL2 (BAG3)", "moléculas de atanogén 3 asociadas a BCL2 (BAG3)" incluyen todos los miembros de la familia, mutantes, secuencias de ADNc, alelos y fragmentos, especies, secuencias codificantes y no codificantes, cadenas de polinucleótidos con sentido y antisentido, etc. De manera similar, "BAG3", "moléculas BAG3", "moléculas de atanogén 3 asociadas a BCL2 (BAG3)" también se refieren a polipéptidos BAG3 o fragmentos de los mismos, proteínas, variantes, derivados, etc. El término "molécula", por lo tanto, abarca tanto las secuencias de ácido nucleico como las secuencias de aminoácidos de BAG3.
Un "ácido nucleico o ADNc aislado" se refiere a un segmento o fragmento de ácido nucleico que se ha separado de las secuencias que lo flanquean en un estado natural, por ejemplo, un fragmento de ADN que se ha eliminado de las secuencias que normalmente son adyacentes al fragmento, por ejemplo, las secuencias adyacentes al fragmento en un genoma en donde se encuentra naturalmente, y se refiere a secuencias de ácido nucleico en las cuales se han eliminado uno o más intrones. El término también aplica a los ácidos nucleicos que se han purificado sustancialmente de otros componentes que acompañan naturalmente al ácido nucleico, por ejemplo, ARN o ADN o proteínas, que lo acompañan naturalmente en la célula. Por tanto, el término incluye, por ejemplo, un ADN recombinante que se incorpora a un vector, a un plásmido o virus de replicación autónoma, o al ADN genómico de un procariota o eucariota, o que existe como una molécula separada (por ejemplo, como un ADNc o un fragmento genómico o de ADNc producido por PCR o por digestión con enzimas de restricción) independientemente de otras secuencias. También incluye un ADN recombinante, por ejemplo, ADN el cual es parte de un gen híbrido que codifica secuencias polipeptídicas adicionales.
Un "polinucleótido" significa una hebra única o hebras paralelas y antiparalelas de un ácido nucleico. Por lo tanto, un polinucleótido puede ser un ácido nucleico monocatenario o bicatenario.
El término "variante", cuando se usa en el contexto de una secuencia de polinucleótidos, puede abarcar una secuencia de polinucleótidos relacionada con un gen salvaje. Esta definición también puede incluir, por ejemplo, variantes "alélicas", "empalme", "especies" o "polimórficas". Una variante de empalme puede tener una identidad significativa con una molécula de referencia, pero generalmente tendrá un número mayor o menor de polinucleótidos debido al empalme alternativo de exones durante el procesamiento del ARNm. El polipéptido correspondiente puede poseer dominios funcionales adicionales o la ausencia de dominios. Las variantes de especies son secuencias de polinucleótidos que varían de una especie a otra. De particular utilidad en la invención son las variantes de productos génicos salvajes. Las variantes pueden resultar de al menos una mutación en la secuencia de ácido nucleico y pueden resultar en ARNm alterados o en polipéptidos cuya estructura o función puede o no estar alterada. Cualquier gen natural o recombinante dado puede tener ninguna, una o muchas formas alélicas. Los cambios mutacionales comunes que dan lugar a variantes se atribuyen generalmente a deleciones, adiciones o sustituciones naturales de nucleótidos. Cada uno de estos tipos de cambios puede ocurrir solo o en combinación con los demás, una o más veces en una secuencia determinada.
A menos que se indique lo contrario, los términos "péptido", "polipéptido" o "proteína" se usan indistintamente en el presente documento, aunque normalmente se refieren a secuencias de péptidos de tamaños variables.
"Codificación" se refiere a la propiedad inherente de secuencias específicas de nucleótidos en un polinucleótido, tal como un gen, un ADNc o un ARNm, para servir como plantillas para la síntesis de otros polímeros y macromoléculas en procesos biológicos que tienen una secuencia definida de nucleótidos. (es decir, ARNr, ARNt y ARNm) o una secuencia definida de aminoácidos y las propiedades biológicas resultantes de la misma. Por tanto, un gen codifica una proteína si la transcripción y traducción del ARNm correspondiente a ese gen produce la proteína en una célula u otro sistema biológico. Tanto la cadena codificante, cuya secuencia de nucleótidos es idéntica a la secuencia de ARNm y generalmente se proporciona en listados de secuencias, como la cadena no codificante, usada como plantilla para la transcripción de un gen o ADNc, pueden denominarse "codificantes" la proteína u otro producto de ese gen o ADNc.
A menos que se especifique lo contrario, una "secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos" incluye todas las secuencias de nucleótidos que son versiones degeneradas entre sí y que codifican la misma secuencia de aminoácidos. Las secuencias de nucleótidos que codifican proteínas y ARN pueden incluir intrones. Un "aminoácido no natural" se refiere a un aminoácido que no es uno de los 20 aminoácidos comunes o pirolisina o selenocisteína. Otros términos que pueden usarse como sinónimo del término "aminoácido no natural" son "aminoácido no codificado naturalmente", "aminoácido no natural", "aminoácido que no existe naturalmente", y versiones con guiones y sin guiones de los mismos. El término "aminoácido no natural" incluye, pero no se limita a, aminoácidos los cuales existen naturalmente mediante la modificación de un aminoácido codificado naturalmente (incluidos, entre otros, los 20 aminoácidos comunes o pirrolisina y selenocisteína) pero no son ellos mismos incorporados, sin manipulación por parte del usuario, en una cadena polipeptídica en crecimiento por el complejo de traducción. Los ejemplos de aminoácidos de origen natural que no están codificados naturalmente incluyen, pero no se limitan a, N-acetilglucosaminil-L-serina, N-acetilglucosaminil-L-treonina y O-fosfotirosina. Además, el término "aminoácido no natural" incluye, pero no se limita a, aminoácidos que no se encuentran de forma natural y que pueden obtenerse sintéticamente o pueden obtenerse mediante modificación de aminoácidos no naturales.
Como se usa en el presente documento, el término "inadecuada expresión" se refiere a un patrón de expresión génica que no es salvaje. Este incluye: expresión a niveles que no son salvajes, es decir, sobreexpresión o subexpresión; un patrón de expresión que difiere del salvaje en términos del tiempo o etapa en la que se expresa el gen, por ejemplo, expresión aumentada o disminuida (en comparación con el salvaje) en un período o etapa de desarrollo predeterminado; un patrón de expresión que difiere del salvaje en términos de expresión disminuida (en comparación con el salvaje) en un tipo de célula o tipo de tejido predeterminado; un patrón de expresión que difiere del salvaje en términos del tamaño de corte y empalme, secuencia de aminoácidos, modificación post-transicional o actividad biológica del polipéptido expresado; un patrón de expresión que difiere del salvaje en términos del efecto de un estímulo ambiental o estímulo extracelular sobre la expresión del gen, por ejemplo, un patrón de expresión aumentado o disminuido (en comparación con el salvaje) en presencia de un aumento o disminución de la fuerza del estímulo.
Por el término "modular", se entiende que cualquiera de las actividades mencionadas de los compuestos incorporados en el presente documento, por ejemplo, aumenta, mejora, aumenta, agoniza (actúa como un agonista), promueve, disminuye, reduce, suprime, bloquea o antagoniza (actúa como antagonista). La modulación puede aumentar la actividad más de 1, 2, 3, 5, 10, 100, etc., por encima de los valores iniciales. La modulación también puede disminuir su actividad por debajo de los valores de referencia.
Como se usa en el presente documento, el término "agente" pretende abarcar cualquier molécula, entidad química, composición, fármaco, agente terapéutico, agente quimioterapéutico o agente biológico capaz de prevenir, mejorar o tratar una enfermedad u otra afección médica. El término incluye compuestos de moléculas pequeñas, reactivos antisentido, reactivos de ARNip, anticuerpos, enzimas, péptidos, moléculas orgánicas o inorgánicas, compuestos naturales o sintéticos y similares. Un agente puede ensayarse de acuerdo con los métodos de la invención en cualquier etapa durante los ensayos clínicos, durante las pruebas previas al ensayo o después de la aprobación por la FDA.
Como se define en el presente documento, una cantidad "terapéuticamente eficaz" de un compuesto o agente (es decir, una dosis eficaz) significa una cantidad suficiente para producir un resultado terapéuticamente (por ejemplo, clínicamente) deseable. Las composiciones pueden administrarse una o más veces al día a una o más veces a la semana; incluso una vez cada dos días. El experto en la materia apreciará que ciertos factores pueden influir en la dosis y el tiempo necesarios para tratar eficazmente a un sujeto, incluidos, entre otros, la gravedad de la enfermedad o trastorno, tratamientos previos, la salud general y/o la edad del sujeto, y otras enfermedades presentes. Por otra parte, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente eficaz de los compuestos de la invención puede incluir un único tratamiento o una serie de tratamientos.
Los términos "determinar", "medir", "evaluar", "detectar", "valorar" y "ensayar" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a cualquier forma de medición, e incluyen determinar si un elemento está presente o no. Estos términos incluyen determinaciones tanto cuantitativas como cualitativas. La valoración puede ser relativa o absoluta. "Valorar la presencia de" incluye determinar la cantidad de algo presente, así como determinar si está presente o ausente.
El término "ensayo" usado en el presente documento, ya sea en singular o en plural, no debe malinterpretarse o limitarse como dirigido a un solo ensayo con pasos específicos, sino que también incluirá, sin limitación, cualquier paso adicional, materiales, diversas iteraciones, alternativas, etc. que también puede usarse. Por lo tanto, si el término "ensayo" se usa en singular, es meramente con fines ilustrativos.
Un "marcador" o un "marcador detectable" es una composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o químicos. Por ejemplo, los marcadores útiles incluyen moléculas radiomarcadas, fluoróforos, compuestos luminiscentes, reactivos densos en electrones, enzimas (por ejemplo, como se usa comúnmente en un ELISA), biotina, digoxigenina o haptenos y proteínas que pueden hacerse detectables, por ejemplo, mediante la incorporación de una etiqueta en el péptido o usarse para detectar anticuerpos específicamente reactivos con el péptido.
El término "cribado de alto rendimiento" o "HTS" se refiere a un método que se basa en diferentes tecnologías y disciplinas, por ejemplo, óptica, química, biología o análisis de imágenes para permitir una investigación biológica y un descubrimiento de fármacos rápidos y de alto flujo. Los métodos hTs son conocidos en la técnica y generalmente se realizan en placas de pocillos múltiples con equipo automatizado de detección y manipulación de líquidos; sin embargo, se prevé que los métodos de la invención puedan practicarse en una micromatriz o en un sistema de microfluidos.
El término "biblioteca" o "biblioteca de fármacos", como se usa en el presente documento, se refiere a una pluralidad de moléculas químicas (compuesto de prueba), una pluralidad de ácidos nucleicos, una pluralidad de péptidos o una pluralidad de proteínas, compuestos orgánicos o inorgánicos, moléculas sintéticas, moléculas naturales o combinaciones de las mismas.
Como se usa en el presente documento, el término "diana" o "molécula diana" se refiere a cualquier tipo de molécula o estructura a detectar, manipular o caracterizar. La molécula puede ser una molécula intracelular, tal como, por ejemplo, secuencias de ácido nucleico, péptidos, estructuras (por ejemplo, membranas intracelulares, ribosomas, etc.), moléculas de superficie (por ejemplo, receptores), moléculas extracelulares (por ejemplo, citocinas, enzimas, partículas virales, organismos), muestras biológicas y similares.
Como se usa en el presente documento, "muestras biológicas" incluyen muestras de sólidos y fluidos corporales. Las muestras biológicas usadas en la presente invención pueden incluir células, proteínas o extractos de membranas de células, sangre o fluidos biológicos tales como fluido ascítico o fluido cerebral (por ejemplo, fluido cerebroespinal). Ejemplos de muestras biológicas sólidas incluyen, pero no se limitan a, muestras tomadas de tejidos del sistema nervioso central, hueso, mama, riñón, cuello uterino, endometrio, cabeza/cuello, vesícula biliar, glándula parótida, próstata, glándula pituitaria, músculo, esófago, estómago, intestino delgado, colon, hígado, bazo, páncreas, tiroides, corazón, pulmón, vejiga, tejido adiposo, ganglio linfático, útero, ovario, glándula suprarrenal, testículos, amígdalas, timo y piel, o muestras tomadas de tumores. Los ejemplos de "muestras de fluidos corporales" incluyen, pero no se limitan a sangre, suero, semen, fluido prostético, fluido seminal, orina, heces, saliva, esputo, moco, médula ósea, linfa y lágrimas.
Como se usa en el presente documento, "enfermedad cardíaca" se refiere a cualquier tipo de enfermedad cardíaca que incluye insuficiencia cardíaca, enfermedad del músculo cardíaco, cardiomiopatía, cardiomiopatía hipertrófica, cardiomiopatía dilatada, aterosclerosis, enfermedad de las arterias coronarias, enfermedad cardíaca isquémica, miocarditis, infección viral, heridas, enfermedad de corazón hipertensivo, valvulopatía, cardiopatía congénita, infarto de miocardio, insuficiencia cardíaca congestiva, arritmias, enfermedades que provocan remodelación del corazón, etc. Las enfermedades del corazón pueden deberse a cualquier motivo, tal como, por ejemplo, daño al tejido cardíaco tal como una pérdida de contractilidad (por ejemplo, como puede demostrarse por una fracción de eyección disminuida).
El daño o trastorno cardíaco caracterizado por una función cardíaca insuficiente incluye cualquier deterioro o ausencia de una función cardíaca normal o presencia de una función cardíaca anormal. La función cardíaca anormal puede ser el resultado de una enfermedad, lesión y/o envejecimiento. Como se usa en el presente documento, la función cardíaca anormal incluye la anormalidad morfológica y/o funcional de un cardiomiocito, una población de cardiomiocitos o el corazón mismo. Ejemplos no limitativos de anomalías morfológicas y funcionales incluyen deterioro físico y/o muerte de cardiomiocitos, patrones de crecimiento anormales de cardiomiocitos, anomalías en la conexión física entre cardiomiocitos, producción insuficiente o excesiva de una sustancia o sustancias por cardiomiocitos, falla de cardiomiocitos para producir una sustancia o sustancias que producen normalmente, y la transmisión de impulsos eléctricos en patrones anormales o en momentos anormales. Las anomalías a un nivel más macroscópico incluyen disquinesia, fracción de eyección reducida, cambios observados por ecocardiografía (por ejemplo, dilatación), cambios en el electrocardiograma, cambios en la tolerancia al ejercicio, perfusión capilar reducida y cambios observados por angiografía. La función cardíaca anormal se observa con muchos trastornos que incluyen, por ejemplo, cardiopatía isquémica, por ejemplo, angina de pecho, infarto de miocardio, enfermedad cardíaca isquémica crónica, enfermedad cardíaca hipertensiva, enfermedad cardíaca pulmonar (cor pulmonale), enfermedad cardíaca valvular, por ejemplo, fiebre reumática, prolapso de la válvula mitral, calcificación del anillo mitral, cardiopatía carcinoide, endocarditis infecciosa, cardiopatía congénita, enfermedad del miocardio, por ejemplo, miocarditis, cardiomiopatía dilatada, cardiomiopatía hipertensiva, trastornos cardíacos que provocan insuficiencia cardíaca congestiva y tumores del corazón, por ejemplo, sarcomas primarios y tumores secundarios. El daño cardíaco también incluye heridas, tal como, por ejemplo, herida de cuchillo; biológicos (por ejemplo, virales; enfermedades autoinmunes) o químicos (por ejemplo, quimioterapia, fármacos); cirugía; trasplante y similares.
Como se usa en el presente documento, la frase "diagnóstico" significa identificar la presencia o naturaleza de una condición patológica. Los métodos de diagnóstico difieren en su sensibilidad y especificidad. La "sensibilidad" de un ensayo de diagnóstico es el porcentaje de personas enfermas que dan positivo (porcentaje de "verdaderos positivos"). Los individuos enfermos no detectados por el ensayo son "falsos negativos". Los sujetos que no están enfermos y que dan negativo en el ensayo se denominan "verdaderos negativos". La "especificidad" de un ensayo de diagnóstico es 1 menos la tasa de falsos positivos, donde la tasa de "falsos positivos" se define como la proporción de personas sin la enfermedad que dan positivo en la prueba. Si bien un método de diagnóstico en particular puede no proporcionar un diagnóstico definitivo de una condición, es suficiente si el método proporciona una indicación positiva que ayude en el diagnóstico.
Como se usa en el presente documento, la frase "diagnosticar" se refiere a clasificar una enfermedad o síntoma, determinar la gravedad de la enfermedad, controlar la progresión de la enfermedad, pronosticar el resultado de una enfermedad y/o las perspectivas de recuperación. El término "detectar" también puede abarcar opcionalmente cualquiera de los anteriores. El diagnóstico de una enfermedad de acuerdo con la presente invención puede efectuarse mediante la determinación del nivel de un polinucleótido o polipéptido de la presente invención en una muestra biológica obtenida del sujeto, en donde el nivel determinado puede correlacionarse con la predisposición a, o presencia o ausencia de la enfermedad. Cabe señalar que una "muestra biológica obtenida del sujeto" también puede comprender opcionalmente una muestra que no se ha extraído físicamente del sujeto, como se describe con mayor detalle a continuación.
El "tratamiento" es una intervención realizada con la intención de prevenir el desarrollo o alterar la patología o los síntomas de un trastorno. Por consiguiente, "tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas. El "tratamiento" también puede especificarse como cuidados paliativos. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya padecen el trastorno, así como aquellos en los que se debe prevenir el trastorno. En consecuencia, "tratar" o "tratamiento" de un estado, trastorno o afección incluye: (1) prevenir o retrasar la aparición de los síntomas clínicos del estado, trastorno o afección que se desarrolla en un ser humano u otro mamífero que pueda estar afectado o predispuesto al estado, trastorno o afección, pero aún no experimenta ni muestra síntomas clínicos o subclínicos del estado, trastorno o afección; (2) inhibir el estado, trastorno o afección, es decir, detener, reducir o retrasar el desarrollo de la enfermedad o una recaída de la misma (en caso de tratamiento de mantenimiento) o al menos uno de sus síntomas clínicos o subclínicos; o (3) aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresión del estado, trastorno o afección o al menos uno de sus síntomas clínicos o subclínicos. El beneficio para un individuo a tratar es estadísticamente significativo o al menos perceptible para el paciente o el médico.
Los términos "paciente" o "individuo" o "sujeto" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a un sujeto mamífero que se va a tratar, prefiriéndose los pacientes humanos. En algunos casos, los métodos de la invención encuentran uso en animales de experimentación, en aplicaciones veterinarias y en el desarrollo de modelos animales para enfermedades, incluidos, entre otros, roedores, incluidos ratones, ratas y hámsteres; y primates.
Como se usa en el presente documento, el término "kit" se refiere a cualquier sistema de suministro para entregar materiales. En el contexto de los ensayos de reacción, tales sistemas de suministro incluyen sistemas que permiten el almacenamiento, transporte o entrega de reactivos de reacción (por ejemplo, oligonucleótidos, enzimas, etc. en los recipientes apropiados) y/o materiales de soporte (por ejemplo, tampones, escritos instrucciones para realizar el ensayo, etc.) de un lugar a otro. Por ejemplo, los kits incluyen uno o más recintos (por ejemplo, cajas) que contienen los reactivos de reacción relevantes y/o materiales de soporte. Como se usa en el presente documento, el término "kit fragmentado" se refiere a un sistema de suministro que comprende dos o más recipientes separados que contienen cada uno una subporción de los componentes totales del kit. Los contenedores pueden suministrarse al destinatario previsto juntos o por separado. Por ejemplo, un primer recipiente puede contener una enzima para usar en un ensayo, mientras que un segundo recipiente contiene oligonucleótidos. El término "kit fragmentado" pretende abarcar kits que contienen reactivos específicos de analito (ASR) regulados en la sección 520 (e) de la Ley Federal de Alimentos, Medicamentos y Cosméticos, pero no se limitan a ellos. De hecho, cualquier sistema de suministro que comprenda dos o más recipientes separados, cada uno de los cuales contenga una subporción de los componentes totales del kit, se incluye en el término "kit fragmentado". Por el contrario, un "kit combinado" se refiere a un sistema de suministro que contiene todos los componentes de un ensayo de reacción en un único recipiente (por ejemplo, en una única caja que aloja cada uno de los componentes deseados). El término "kit" incluye kits tanto fragmentados como combinados.
Composiciones
La causa más común de cardiomiopatía dilatada e insuficiencia cardíaca (HF) es la cardiopatía isquémica, sin embargo, en un tercio de todos los pacientes la causa permanece indefinida y se diagnostica a los pacientes con cardiomiopatía dilatada idiopática (IDC). Los estudios realizados en el presente documento emplearon la secuenciación del exoma completo para identificar la variante causante en una gran familia con transmisión autosómica dominante de cardiomiopatía dilatada. La secuenciación y la informática posterior revelaron una nueva deleción de 10 nucleótidos en el gen del atanogén 3 (BAG3) asociado a BCL2 ((Ch10: del 121436332_12143641: del. 1266_1275 [NM 004281]) que segregó con todos los individuos afectados. La deleción predijo un cambio en el marco de lectura con la deleción resultante de 135 aminoácidos del extremo C-terminal de la proteína. De acuerdo con las variantes genéticas en genes que codifican otras proteínas sarcoméricas, había una cantidad considerable de heterogeneidad genética en los miembros de la familia afectados. Interesantemente, también se encontró que los niveles de proteína BAG3 se redujeron significativamente en los corazones de pacientes no emparentados con HF en etapa terminal sometidos a trasplante cardíaco en comparación con los controles que no fallaron. Los niveles disminuidos de proteína BAG3 pueden estar asociados con formas familiares y no familiares de cardiomiopatía dilatada. Por consiguiente, la modulación de la expresión de BAG3 o cantidades de BAG3 en un paciente sería de gran beneficio.
Como se describe, un agente terapéutico para el tratamiento de enfermedades asociadas con BAG3 y sus moléculas asociadas y sus rutas, modula la expresión o cantidades de BAG3 en una célula.
Como también se describe, las composiciones comprenden secuencias de ácido nucleico del atanogén 3 asociado a BCL2 (BAG3), que incluyen, sin limitación, ADNc, secuencias sentido y/o antisentido de BAG3.
Como también se describe, una composición comprende un vector de expresión que tiene un ácido nucleico aislado o una secuencia de ADNc o una secuencia de ácido nucleico sintética, que codifica moléculas de atanogén 3 asociadas a BCL2 (BAG3). El término "secuencia de ácido nucleico" se usará en aras de la brevedad e incluirá, sin limitación, secuencias de ácido nucleico o ADNc aisladas, secuencias de ácido nucleico sintetizadas o sintéticas, secuencias de ácido nucleico quiméricas, homólogos, ortólogos, variantes, mutantes o combinaciones del mismo. Una secuencia de ácido nucleico de BAG3 comprende al menos alrededor de un 50 % de identidad de secuencia con BAG3 de salvaje o secuencias de ADNc de la misma. En otras realizaciones, la secuencia de ácido nucleico de BAG3 comprende al menos alrededor de 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con BAG3 salvaje o secuencias de ADNc de la misma.
Una secuencia de ácido nucleico de BAG3 comprende además una o más mutaciones, sustituciones, deleciones, variantes o combinaciones de las mismas.
La homología, identidad de secuencia o complementariedad entre una secuencia de ácido nucleico de BAG3 que comprende una o más mutaciones, sustituciones, deleciones, variantes o combinaciones de las mismas y las secuencias de ADNc o natural o salvaje de BAG3 es de alrededor de 50 % a alrededor de 60 %. En algunas realizaciones, la homología, identidad de secuencia o complementariedad es de alrededor de 60 % a alrededor de 70 %. En algunas realizaciones, la homología, identidad de secuencia o complementariedad es de alrededor de un 70 % a alrededor de 80 %. En algunas realizaciones, la homología, identidad de secuencia o complementariedad es de alrededor de 80 % a alrededor de 90 %. En algunas realizaciones, la homología, identidad de secuencia o complementariedad es alrededor de 90 %, alrededor de 92 %, alrededor de 94 %, alrededor de 95 %, alrededor de 96 %, alrededor de 97 %, alrededor de 98 %, alrededor de 99 % o alrededor de 100 %.
Un vector de expresión codifica un gen de atanogén 3 (BAG3) asociado a BCL2 o secuencias de ADNc del mismo, o secuencias modificadas del mismo. En una realización, el vector de expresión codifica una secuencia de ácido nucleico que comprende al menos alrededor de 50 % de identidad de secuencia con el atanogén 3 asociado a BCL2 salvaje (BAG3) o secuencias de ADNc del mismo. En otras realizaciones, la secuencia de ácido nucleico comprende al menos alrededor de 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con el atanogén 3 asociado a BCL2 de tipo salvaje (BAG3) o secuencias de ADNc del mismo.
Puede emplearse una amplia variedad de combinaciones de huésped/vector de expresión para expresar las secuencias de ADN de bAG3 relacionadas con esta invención. Los vectores de expresión útiles, por ejemplo, pueden consistir en segmentos de secuencias de ADN cromosómicas, no cromosómicas y sintéticas. Los vectores adecuados incluyen derivados de SV40 y plásmidos bacterianos conocidos, por ejemplo, plásmidos de E. coli col E1, pCR1, pBR322, pMal-C2, pET, pGEX (Smith y otros, Gene 67: 31-40, 1988), pMB9 y sus derivados, plásmidos como RP4; ADN de fago, por ejemplo, los numerosos derivados del fago 1, por ejemplo, NM989, y otro ADN de fago, por ejemplo, M13 y ADN de fago monocatenario filamentoso; plásmidos de levadura tales como el plásmido 2|j o derivados del mismo, vectores útiles en células eucariotas, tales como vectores útiles en células de insectos o mamíferos; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fagos, tales como plásmidos que se han modificado para emplear ADN de fagos u otras secuencias de control de la expresión; y similares.
Se sabe que varios vectores son capaces de mediar en la transferencia de productos génicos a células de mamíferos, como se conoce en la técnica y se describe en el presente documento. Un "vector" (a veces denominado "vehículo" de suministro de genes o de transferencia de genes) se refiere a una macromolécula o complejo de moléculas que comprenden un polinucleótido que se administra a una célula huésped, ya sea in vitro o in vivo. El polinucleótido a administrar puede comprender una secuencia codificante de interés en terapia génica. Los vectores incluyen, por ejemplo, vectores virales (tal como adenovirus ("Ad"), virus adenoasociados (AAV) y virus de la estomatitis vesicular (VSV) y retrovirus), liposomas y otros complejos que contienen lípidos, y otros complejos macromoleculares capaces de mediar la entrega de un polinucleótido a una célula huésped. Los vectores también pueden comprender otros componentes o funcionalidades que modulan adicionalmente el suministro de genes y/o la expresión de genes, o que de otro modo proporcionan propiedades beneficiosas a las células diana. Como se describe e ilustra con más detalle a continuación, tales componentes incluyen, por ejemplo, componentes que influyen en la unión o direccionamiento a las células (incluidos componentes que median la unión de tipo celular o específica de tejido); componentes que influyen en la absorción del ácido nucleico del vector por la célula; componentes que influyen en la localización del polinucleótido dentro de la célula después de la captación (tales como agentes que median la localización nuclear); y componentes que influyen en la expresión del polinucleótido. Tales componentes también pueden incluir marcadores, tales como marcadores detectables y/o seleccionables que pueden usarse para detectar o seleccionar células que han captado y expresan el ácido nucleico liberado por el vector. Tales componentes pueden proporcionarse como una característica natural del vector (tal como el uso de ciertos vectores virales que tienen componentes o funcionalidades que median la unión y la absorción), o los vectores pueden modificarse para proporcionar tales funcionalidades. Otros vectores incluyen los descritos por Chen y otros; BioTechniques, 34: 167-171 (2003). Se conoce en la técnica una gran variedad de tales vectores y generalmente están disponibles.
Los sistemas de suministro de ácido nucleico adecuados incluyen un vector viral, típicamente secuencia de al menos uno de un adenovirus, un virus asociado a adenovirus (AAV), un adenovirus dependiente de ayudante, un retrovirus o un virus hemaglutinante del complejo Japón-liposoma (HVJ). Preferentemente, el vector viral comprende un promotor eucariótico fuerte unido operativamente al polinucleótido, por ejemplo, un promotor de citomegalovirus (CMV).
Los vectores adicionalmente preferentes incluyen vectores virales, proteínas de fusión y conjugados químicos. Los vectores retrovirales incluyen virus de leucemia murina de Moloney y virus basados en VIH. Un vector viral basado en VIH comprende al menos dos vectores en donde los genes gag y pol son de un genoma de VIH y el gen env es de otro virus. Se prefieren los vectores virales de ADN. Estos vectores incluyen vectores de la viruela tales como los vectores ortopox o avipox, vectores de herpesvirus tales como un vector del virus herpes simplex I (HSV) [Geller, AI y otros, J. Neurochem, 64:487 (1995); Lim, F., y otros, En DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, Ed. (Universidad de Oxford. Press, Oxford, Inglaterra) (1995); Geller, AI y otros, Proc Natl. Acad. Sci.: USA: 90 7603 (1993); Geller, AI y otros, Proc Natl. Acad. Sci USA: 87:1149 (1990)], Vectores de adenovirus [LeGal LaSalle y otros, Science, 259:988 (1993); Davidson y otros, Nat. Gineta. 3:219 (1993); Yang y otros, J. Virol. 69:2004 (1995)] y vectores de virus adenoasociados [Kaplitt, MG, y otros, Nat. Gineta. 8:148 (1994)].
Los vectores virales de la viruela introducen el gen en el citoplasma de las células. Los vectores del virus avipox resultan sólo en una expresión a corto plazo del ácido nucleico. Los vectores de adenovirus, los vectores de virus adenoasociados y los vectores del virus del herpes simple (HSV) pueden ser una indicación para algunas realizaciones de la invención. El vector de adenovirus da como resultado una expresión a más corto plazo (por ejemplo, menos de alrededor de un mes) que el virus adenoasociado (AAV), en algunas realizaciones, puede exhibir una expresión mucho más prolongada. En algunas realizaciones, el vector de expresión es un vector AAV9. El vector particular elegido dependerá de la célula diana y de la afección que se trata. La selección de los promotores apropiados puede realizarse fácilmente. Preferentemente, se usaría un promotor de alta expresión. Un ejemplo de un promotor adecuado es el promotor de citomegalovirus (CMV) de 763 pares de bases. También pueden usarse el virus del sarcoma de Rous (RSV) (Davis y otros, Hum Gene Ther 4:151 (1993)) y los promotores de MMT. Ciertas proteínas pueden expresarse mediante el uso de su promotor nativo. También pueden incluirse otros elementos que pueden potenciar la expresión, tal como un potenciador o un sistema que da como resultado altos niveles de expresión, tal como un gen tat y un elemento tar. Este casete puede insertarse luego en un vector, por ejemplo, un vector plásmido tal como pUC19, pUC118, pBR322 u otros vectores plásmidos conocidos, que incluye, por ejemplo, un origen de replicación de E. coli. Véase, Sambrook, y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory press, (1989). El vector plasmídico también puede incluir un marcador seleccionable tal como el gen de la p-lactamasa para la resistencia a la ampicilina, siempre que el polipéptido marcador no afecte negativamente al metabolismo del organismo que se está se trata. El casete también puede unirse a un resto de unión de ácido nucleico en un sistema de suministro sintético, tal como el sistema descrito en el documento WO 95/22618.
Si se desea, los polinucleótidos descritos también pueden usarse con un vehículo de microsuministro, tal como liposomas catiónicos y vectores adenovirales. Para una revisión de los procedimientos para la preparación de liposomas, direccionamiento y suministro de contenidos, ver Mannino y Gould-Fogerite, BioTechniques, 6:682 (1988) . Véase también Felgner y Holm, Bethesda Res. Lab. Focus, 11(2):21 (1989) y Maurer, RA, Bethesda Res. Lab. Focus, 11(2):25 (1989).
Los vectores adenovirales recombinantes defectuosos en la replicación pueden producirse de acuerdo con técnicas conocidas. Véase, Quantin, y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:2581-2584 (1992); Stratford-Perricadet y otros, J. Clin. Invest., 90:626-630 (1992); y Rosenfeld y otros, Cell, 68:143-155 (1992).
Otro método de administración consiste en usar vectores productores de ADN monocatenario que pueden producir BAG3 intracelularmente, por ejemplo, tejidos cardíacos. Véase, por ejemplo, Chen y otros, BioTechniques, 34:167-171 (2003).
La expresión de BAG3 puede controlarse mediante cualquier elemento promotor/potenciador conocido en la técnica, pero estos elementos reguladores deben ser funcionales en el hospedador seleccionado para la expresión. En algunas realizaciones, el promotor es un promotor específico de tejido. Son de particular interés los promotores específicos del músculo y, más particularmente, los promotores específicos del corazón. Estos incluyen el promotor de la cadena ligera de miosina-2 (Franz y otros (1994) Cardioscience, Vol. 5 (4):235-43; Kelly y otros (1995) J. Cell Biol., Vol. 129(2):383-396), el promotor de alfa actina (Moss y otros (1996) Biol. Chem., Vol. 271(49):31688-31694), el promotor de troponina 1 (Bhavsar y otros (1996) Genomics, Vol. 35(1):11-23); el promotor del intercambiador de Na+/Ca2+ (Barnes y otros (1997) J. Biol. Chem., Vol. 272(17):11510-11517), el promotor de distrofina (Kimura y otros (1997) Dev. Growth Differ., Vol. 39(3):257-265), el promotor de la integrina alfa7 (Ziober y Kramer (1996) J. Bio. Chem., Vol. 271(37):22915-22), el promotor del péptido natriurético cerebral (LaPointe y otros (1996) Hypertension, Vol. 27(3 Pt 2):715-22) y el promotor alfa B-cristalina/proteína de choque térmico pequeña (Gopal-Srivastava (1995) J. Mol. Cell. Biol., Vol. 15(12):7081-7090), promotor de cadena pesada de alfa miosina (Yamauchi-Takihara y otros (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 86(10):3504-3508) y el promotor ANF (LaPointe y col. (1988) J. Biol. Chem., Vol. 263(19):9075-9078).
Otros promotores que pueden utilizarse para controlar la expresión del gen BAG3 incluyen, pero no se limitan a, el promotor del citomegalovirus (CMV) (Patentes de Estados Unidos Nos. 5,385,839 y 5,168,062), la región promotora temprana de SV40 (Benoist y Chambon, 1981, Nature 290:304-310), el promotor contenido en la repetición terminal larga 3' del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto, y otros, Cell 22:787-797, 1980), el promotor de timidina quinasa de herpes (Wagner y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. uSa 78:1441-1445, 1981), las secuencias reguladoras del gen de la metalotioneína (Brinster y otros, Nature 296:39-42, 1982); vectores de expresión procarióticos tales como el promotor de p-lactamasa (Villa-Kamaroff, y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3727-3731, 1978), o el promotor tac (DeBoer, y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25, 1983); véase también "Proteínas útiles de bacterias recombinantes" en Scientific American, 242:74-94, 1980; elementos promotores de levaduras u otros hongos tales como el promotor de Gal 4, el promotor de ADC (alcohol deshidrogenasa), el promotor de PGK (fosfoglicerol quinasa), el promotor de fosfatasa alcalina; y las regiones de control de la transcripción de los animales, que exhiben especificidad de tejido y se han usado en animales transgénicos: región de control del gen de elastasa I que es activa en las células acinares pancreáticas (Swift y otros, Cell 38:639-646, 1984; Ornitz y otros, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409, 1986; MacDonald, Hepatology 7:425-515, 1987); región de control del gen de la insulina que es activa en las células beta pancreáticas (Hanahan, Nature 315:115-122, 1985), región de control del gen de la inmunoglobulina que es activa en las células linfoides (Grosschedl y otros, Cell 38:647-658, 1984; Adames y otros, Nature 318:533-538, 1985; Alexander y otros, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444, 1987), región de control del virus del tumor mamario de ratón que es activa en células testiculares, de mama, linfoides y mastocitos (Leder y otros, Cell 45:485-495, 1986), región de control del gen de albúmina que es activa en el hígado (Pinkert y otros, Genes and Devel. 1:268-276, 1987), región de control del gen de alfa-fetoproteína que es activa en el hígado (Krumlauf y otros, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648, 1985; Hammer y otros, Science 235:53-58, 1987), región de control del gen de alfa 1-antitripsina que es activa en el hígado (Kelsey y otros, Genes and Devel. 1:161-171, 1987), región de control del gen de la beta-globina que es activa en las células mieloides (Mogram y otros, Nature 315:338-340, 1985; Kollias y otros, Cell 46:89-94, 1986), región de control del gen de la proteína básica de mielina que está activa en las células de oligodendrocitos en el cerebro (Readhead y otros, Cell 48:703-712, 1987), región de control del gen de la cadena ligera-2 de miosina que está activa en el músculo esquelético (Sani, Nature 314:283-286, 1985) y la región de control del gen de la hormona liberadora de gonadotrópicos que es activa en el hipotálamo (Mason y otros, Science 234:1372-1378, 1986).
Los sistemas de expresión de levadura también pueden usarse de acuerdo con la invención para expresar BAG3. Por ejemplo, el vector pYES2 sin fusión (XbaI, SphI, ShoI, NotI, GstXI, EcoRI, BstXI, BamH1, SacI, Kpn1 y sitios de clonación HindIII; Invitrogen) o la fusión pYESHisA, B, C (XbaI, SphI, Los sitios de clonación ShoI, NotI, BstXI, EcoRI, BamH1, SacI, Kpnl y HindIII, péptido N-terminal purificado con resina ProBond y escindido con enteroquinasa; Invitrogen), por mencionar solo dos, pueden emplearse de acuerdo con la invención. Puede prepararse un sistema de expresión de levadura de dos híbridos de acuerdo con la invención.
Un sistema de suministro preferente es un vector viral recombinante que incorpora uno o más de los polinucleótidos en el mismo, preferentemente alrededor de un polinucleótido. Preferentemente, el vector viral usado en los métodos de la invención tiene un pfu (unidades formadoras de placas) de alrededor de 108 a alrededor de 5 x 1010 pfu. En realizaciones en las cuales el polinucleótido se va a administrar con un vector no viral, el uso de entre alrededor de 0,1 nanogramos a alrededor de 4000 microgramos será a menudo útil, por ejemplo, alrededor de 1 nanogramo a alrededor de 100 microgramos.
En algunas realizaciones, el vector es un vector viral asociado a adenovirus (AAV), por ejemplo, AAV9. El término "vector AAV" significa un vector derivado de un serotipo de virus adenoasociado, que incluye, sin limitación, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7 y AAV-8. Los vectores de AAV pueden tener uno o más de los genes de AAV salvajes suprimidos en su totalidad o en parte, preferentemente los genes rep y/o cap, pero retienen secuencias de ITR flanqueantes funcionales. A pesar del alto grado de homología, los diferentes serotipos tienen tropismos para diferentes tejidos. Se desconoce el receptor de AAV1; sin embargo, se sabe que AAV1 transduce el músculo esquelético y cardíaco de forma más eficaz que AAV2. Dado que la mayoría de los estudios se han realizado con vectores pseudotipados en los que el ADN del vector flanqueado por AAV2 ITR se empaqueta en cápsides de serotipos alternativos, está claro que las diferencias biológicas están relacionadas con la cápside más que con los genomas. Evidencia reciente indica que los casetes de expresión de ADN empaquetados en cápsides de AAV 1 son al menos 1 log 10 más eficaces en la transducción de cardiomiocitos que los empaquetados en cápsides de AAV2. En una realización, el sistema de suministro viral es un sistema de suministro viral adenoasociado. El virus adenoasociado puede ser de serotipo I (AAV 1), serotipo 2 (AAV2), serotipo 3 (AAV3), serotipo 4 (AAV4), serotipo 5 (AAV5), serotipo 6 (AAV6), serotipo 7 (AAV7), serotipo 8 (a Av 8) o serotipo 9 (a Av 9).
Algunos expertos en la técnica han eludido algunas de las limitaciones de los vectores basados en adenovirus mediante el uso de virus "híbridos" de adenovirus, que incorporan características deseables de adenovirus, así como de otros tipos de virus como un medio para generar vectores únicos con propiedades altamente especializadas. Por ejemplo, se generaron quimeras de vector viral entre adenovirus y virus adenoasociado (AAV). Estos aspectos de la invención no se desvían del alcance de la invención descrita en el presente documento.
Los ácidos nucleicos que codifican las proteínas BAG3 de la invención pueden suministrarse al músculo cardíaco mediante métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la solicitud de patente de EE. UU. Publicación No. US 2009/0209631). Por ejemplo, las células cardíacas de un mamífero grande pueden transfectarse mediante un método que incluye dilatar un vaso sanguíneo de la circulación coronaria mediante la administración de una sustancia vasodilatadora a dicho mamífero antes y/o simultáneamente con la administración de los ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, el método incluye administrar los ácidos nucleicos en un vaso sanguíneo de la circulación coronaria in vivo, en donde los ácidos nucleicos se infunden en el vaso sanguíneo durante un período de al menos alrededor de tres minutos, en donde la circulación coronaria no está aislada o sustancialmente aislado de la circulación sistémica del mamífero, y en donde los ácidos nucleicos transfectan las células cardíacas del mamífero.
El sujeto puede ser un ser humano, un animal experimental, por ejemplo, una rata o un ratón, un animal doméstico, por ejemplo, un perro, una vaca, una oveja, un cerdo o un caballo, o un primate no humano, por ejemplo, un mono. El sujeto puede padecer un trastorno cardíaco, tal como insuficiencia cardíaca, isquemia, infarto de miocardio, insuficiencia cardíaca congestiva, arritmia, rechazo de trasplante y similares. Preferentemente, el sujeto padece insuficiencia cardíaca. En otro ejemplo particular, el sujeto sufre de arritmia. En un caso, el sujeto es un ser humano. Por ejemplo, el sujeto tiene entre 18 y 65 años. En otro caso, el sujeto es un animal no humano.
En un caso, el sujeto tiene o está en riesgo de insuficiencia cardíaca, por ejemplo, una cardiomiopatía no isquémica, insuficiencia de la válvula mitral, cardiomiopatía isquémica o estenosis o insuficiencia aórtica.
En algunos casos, la transfección de células cardíacas con moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína BAG3 o una proteína BAG3 fusionada a un dominio efector aumenta el acortamiento fraccional del ventrículo lateral. En algunos casos, el mamífero es un ser humano y la enfermedad es insuficiencia cardíaca congestiva. En algunos casos, la transfección de las células cardíacas aumenta el acortamiento fraccional del ventrículo lateral cuando se mide alrededor de 4 meses después de dicha infusión en al menos un 25 % en comparación con el acortamiento fraccional del ventrículo lateral antes de la infusión del polinucleótido. En algunos casos, la transfección de las células cardíacas da como resultado una mejora en una medida de la función cardíaca seleccionada del grupo que consiste en expresión de proteína BAG3, acortamiento fraccional, fracción de eyección, gasto cardíaco, constante de tiempo de relajación ventricular y volumen regurgitante.
Un tratamiento puede evaluarse al valorar el efecto del tratamiento sobre un parámetro relacionado con la contractilidad. Por ejemplo, puede medirse la actividad de SR Ca2+ ATPasa o la concentración de Ca2+ intracelular. Además, la generación de fuerza por el corazón o el tejido cardíaco puede medirse mediante el uso de métodos descritos en Strauss y otros, Am. J. Physiol., 262:1437-45, 1992.
Secuencias de ácidos nucleicos modificados: No se pretende que la presente divulgación esté limitada por la naturaleza del ácido nucleico empleado, siempre que modulan la expresión o cantidades de BAG3 en una célula, o en un paciente para quien, la composición de ácido nucleico debe administrarse como agente terapéutico. El ácido nucleico puede ser a Dn o ARN y puede existir en forma bicatenaria, monocatenaria o parcialmente bicatenaria.
Los ácidos nucleicos útiles en la presente invención incluyen, a modo de ejemplo y no de limitación, oligonucleótidos y polinucleótidos tales como ADN y/o ARN antisentido; ribozimas; ADN para terapia génica; fragmentos virales que incluyen ADN y/o ARN viral; quimeras de ADN y/o ARN; ARNm; plásmidos; cósmidos; ADN genómico; ADNc; fragmentos de genes; varias formas estructurales de ADN que incluyen ADN monocatenario, ADN bicatenario, ADN superenrollado y/o ADN de triple hélice; Z-ADN; y los similares. Los ácidos nucleicos pueden prepararse mediante cualquier medio convencional que se use típicamente para preparar ácidos nucleicos en gran cantidad. Por ejemplo, los ADN y ARN pueden sintetizarse químicamente mediante el uso de reactivos y sintetizadores disponibles comercialmente mediante métodos que son bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Gait, 1985, OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS: A PRACTICAL APPROACH (IRL Press, Oxford, Inglaterra)). Los ARN pueden producirse con alto rendimiento mediante transcripción in vitro mediante el uso de plásmidos tal como el vector pGEM® T o SP65 (Promega Corporation, Madison, WI).
Por consiguiente, ciertas secuencias de ácido nucleico preferentes son secuencias de ácido nucleico quiméricas. Las "secuencias quiméricas de ácido nucleico" o "quimeras", en el contexto de esta invención, contienen dos o más regiones químicamente distintas, cada una de ellas formada por al menos un nucleótido. Estas secuencias contienen típicamente al menos una región de nucleótidos modificados que confiere una o más propiedades beneficiosas (tales como, por ejemplo, el aumento de la resistencia a las nucleasas, el aumento de la captación en las células, el aumento de la afinidad de unión por la diana).
Las secuencias de ácido nucleico quiméricas pueden formarse como estructuras compuestas de dos o más oligonucleótidos, oligonucleótidos modificados, oligonucleósidos y/o miméticos de oligonucleótidos. Tales compuestos también se han denominado en la técnica híbridos o gapmers. Las patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de tales estructuras híbridas comprenden, pero no se limitan a, las patentes de EE. UU. N° 5,013,830; 5,149,797; 5,220,007; 5,256,775; 5,366,878; 5,403,711; 5,491,133; 5,565,350; 5,623,065; 5,652,355; 5,652,356; y 5, 700,922.
Los ejemplos específicos de algunas secuencias de ácido nucleico modificadas incluyen aquellas que comprenden cadenas principales modificadas, por ejemplo, fosforotioatos, fosfotriésteres, metilfosfonatos, enlaces interazúcares alquilo o cicloalquilo de cadena corta o enlaces interazúcares heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta. Ejemplos de oligonucleótidos con cadenas principales de fosforotioato y aquellos con cadenas principales de heteroátomos, incluyen, sin limitación: cadenas principales CH2-NH--O--CH2 , CH, --N(CH3)-O--CH2 [conocido como metileno (metilimino) o esqueleto MMI], CH2-O-N(CH3)-CH2 , CH2-N(CH3)-N (CH3)-CH 2 y O-- N(CH3)-CH2-CH2 , en donde la cadena principal del fosfodiéster nativo se representa como O--P--O--CH,). Las cadenas principales de amida descritas por De Mesmaeker y otros. (1995) Acc. Chem. Res. 28:366-374 también son un ejemplo. En otros casos, una secuencia de ácido nucleico comprende estructuras de esqueleto de morfolino (Summerton y Weller, Patente de Estados Unidos No 5.034.506). En otros casos, tal como el esqueleto del ácido nucleico peptídico (PNA), el esqueleto del fosfodiéster de la secuencia de ácido nucleico se reemplaza con un esqueleto de poliamida, mientras los nucleótidos están unidos directa o indirectamente a los átomos de nitrógeno aza del esqueleto de poliamida (Nielsen y otros (1991) Science 254, 1497). Las secuencias de ácidos nucleicos también pueden comprender uno o más restos de azúcar sustituidos. Los ejemplos incluyen: OH, SH, SCH3 , F, OCN, OCH3 , OCH3 O(CH2)n CH3 , O(CH2)n NH2 u O(CH2)n CH3 donde n es de 1 a alrededor de 10; Ci a C10 alquilo inferior, alcoxialcoxi, alquilo inferior sustituido, alcarilo o aralquilo; Cl; Br; CN; CF3 ; OCF3 ; O-, S- o N-alquilo; O-, S- o N-alquenilo; SOCH3 ; SO2 CH3 ; ONO2 ; NO2; N3 ; NH2 ; heterocicloalquilo; heterocicloalcarilo; aminoalquilamino; polialquilamino; sililo sustituido; un grupo reportero; un intercalador; un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido; o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un oligonucleótido y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. Otras modificaciones incluyen, por ejemplo: 2'-metoxietoxi [2'-O- CH2 CH2 OCH3 , también conocido como 2'-O-(2-metoxietil)] (Martin y otros, (1995) Hely. Chim. Acta, 78, 486), 2'-metoxi (2'-O--CH3), 2'-propoxi (2 -OCH2 CH2CH3) y 2'-fluoro (2'-F). También pueden realizarse modificaciones similares en cualquier posición del oligonucleótido, la posición 2' o 3' del azúcar en el nucleótido terminal 3' y la posición 5' del nucleótido terminal 5'. Las secuencias de ácido nucleico también pueden tener miméticos de azúcar tales como ciclobutilos en lugar del grupo pentofuranosilo.
Las cadenas principales de oligonucleótidos modificados preferentes comprenden, pero no se limitan a, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, metil y otros alquil fosfonatos que comprenden 3 'alquilen fosfonatos y fosfonatos quirales, fosfinatos, aminoforamidatoramidatos, fosfinatos que comprenden 3' aminoforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres y boranofosfatos que tienen enlaces 3'-5' normales, análogos enlazados 2'-5' de estos y aquellos que tienen polaridad invertida en los que los pares adyacentes de unidades de nucleósidos están enlazados 3'-5' a 5'-3' o 2'-5' a 5'-2'. También se incluyen diversas sales, sales mixtas y formas de ácidos libres.
Las cadenas principales de oligonucleótidos modificados preferentes que no incluyen un átomo de fósforo en las mismas tienen cadenas principales que están formadas por enlaces internucleosídicos de alquilo o cicloalquilo de cadena corta, enlaces internucleosídicos de heteroátomo y alquilo o cicloalquilo mixtos, o uno o más enlaces internucleósidos heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta. Estos comprenden los que tienen enlaces morfolino (formados en parte a partir de la porción de azúcar de un nucleósido); cadenas principales de siloxano; cadenas principales de sulfuro, sulfóxido y sulfona; cadenas principales de formacetilo y tioformacetilo; cadenas principales de metileno formacetilo y tioformacetilo; cadenas principales que contienen alqueno; esqueletos de sulfamato; cadenas principales de metilenimino y metilenhidrazino; cadenas principales de sulfonato y sulfonamida; columna vertebral de amida; y otros que tienen partes componentes mezcladas de N, O, S y CH2.
Las secuencias de ácido nucleico también pueden incluir, adicional o alternativamente, modificaciones o sustituciones de nucleobase (a menudo denominado en la técnica simplemente como "base"). Como se usa en el presente documento, los nucleótidos "no modificados" o "naturales" incluyen adenina (A), guanina (G), timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Los nucleótidos modificados incluyen nucleótidos que se encuentran solo con poca frecuencia o de manera transitoria en ácidos nucleicos naturales, por ejemplo, hipoxantina, 6-metiladenina, pirimidinas 5-Me, particularmente 5-metilcitosina (también conocida como 5-metil-2' desoxicitosina y a menudo referida en la técnica como 5-Me-C), 5-hidroximetilcitosina (HMC), glicosi1HMC y gentobiosi1HMC, así como nucleótidos sintéticos, por ejemplo, 2-aminoadenina, 2-(metilamino) adenina, 2- (imidazolilalquil) adenina, 2-(aminoalquilamino) adenina u otras alquiladeninas heterosustituidas, 2-tiouracilo, 2-tiotimina, 5-bromouracilo, 5-hidroximetiluracilo, 8-azaguanina, 7-deazaguanina, N6 (6-aminohexil)adenina y 2,6-diaminopurina. (Kornberg, A., DNA Replication, WH Freeman & Co., San Francisco, 1980, págs. 75-77; Gebeyehu, G., (1987) y col. Nucl. Acids Res. 15: 4513). Puede incluirse una base "universal" conocida en la técnica, por ejemplo, inosina.
Otra modificación implica unir químicamente al oligonucleótido uno o más restos o conjugados que potencian la actividad o captación celular del oligonucleótido. Tales restos incluyen, pero no se limitan a, restos de lípidos tales como un resto de colesterol, un resto de colesterilo, ácido cólico, un tioéter, por ejemplo, hexil-5-tritiltiol, una cadena alifática, por ejemplo, restos de dodecandiol o undecilo, un fosfolípido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o trietilamonio 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato, una poliamina o una cadena de polietilenglicol, o ácido adamantano acético. Las secuencias de ácido nucleico que comprenden restos lipófilos y los métodos para preparar tales oligonucleótidos son conocidos en la técnica, por ejemplo, las patentes de EE. UU. Nos. 5.138.045, 5.218.105 y 5.459.255.
No es necesario que todas las posiciones en una secuencia de ácido nucleico dada se modifiquen uniformemente y, de hecho, más de una de las modificaciones mencionadas anteriormente pueden incorporarse en una única secuencia de ácido nucleico o incluso dentro de un solo nucleósido dentro de tales secuencias. La presente descripción también incluye oligonucleótidos los cuales son oligonucleótidos quiméricos como se definieron anteriormente en el presente documento.
En otro caso, la molécula de ácido nucleico BAG3 está conjugada con otro resto que incluye, pero no se limita a, nucleótidos básicos, poliéter, poliamina, poliamidas, péptidos, carbohidratos, lípidos o compuestos polihidrocarbonados. Los expertos en la técnica reconocerán que estas moléculas pueden unirse a uno o más de cualquiera de los nucleótidos que comprenden la molécula de ácido nucleico en varias posiciones del azúcar, la base o el grupo fosfato.
En otro caso, las secuencias de ácido nucleico BAG3 comprenden uno o más nucleótidos sustituidos con ácidos nucleicos bloqueados (LNA). Las secuencias de ácido nucleico modificadas con LNA pueden tener un tamaño similar al de la secuencia original o nativa o pueden ser más grandes o preferentemente más pequeñas. Es preferente que tales oligonucleótidos modificados con LNA contengan menos de alrededor de 70 %, con más preferencia menos de alrededor de 60 %, con la mayor preferencia menos de alrededor de 50 % de monómeros de LNA y que sus tamaños estén entre alrededor de 1 y 25 nucleótidos.
Oligonucleótidos BAG3 antisentido: en otro caso preferente, la expresión de BAG3 en una célula o paciente está modulada por una o más secuencias de ácido nucleico diana que modulan la expresión de BAG3, por ejemplo, elementos reguladores de la transcripción.
En un caso preferente, un oligonucleótido comprende al menos cinco bases consecutivas complementarias a una secuencia de ácido nucleico, en donde el oligonucleótido se hibrida específicamente y modula la expresión de BAG3 in vivo o in vitro. En otro caso preferente, los compuestos oligoméricos también incluyen variantes en las cuales está presente una base diferente en una o más de las posiciones de nucleótidos en el compuesto. Por ejemplo, si el primer nucleótido es una adenosina, pueden producirse variantes que contengan timidina, guanosina o citidina en esta posición. Esto puede realizarse en cualquiera de las posiciones del oligonucleótido. A continuación, estos compuestos se prueban mediante el uso de los métodos descritos en el presente documento para determinar su capacidad para inhibir la expresión de un ácido nucleico diana.
En algunos casos, la homología, identidad de secuencia o complementariedad entre el oligonucleótido y la diana es de alrededor de 50 % a alrededor de 60 %. En algunos casos, la homología, identidad de secuencia o complementariedad es de alrededor de 60 % a alrededor de 70 %. En algunos casos, la homología, identidad de secuencia o complementariedad es de alrededor de 70 % a alrededor de 80 %. En algunos casos, la homología, identidad de secuencia o complementariedad es de alrededor de 80 % a alrededor de 90 %. En algunos casos, la homología, identidad de secuencia o complementariedad es alrededor de 90 %, alrededor de 92 %, alrededor de 94 %, alrededor de 95 %, alrededor de 96 %, alrededor de 97 %, alrededor de 98 %, alrededor de 99 % o alrededor de 100 %.
En otro caso preferente, un oligonucleótido comprende combinaciones de enlaces internucleotídicos fosforotioato y al menos un enlace internucleotídico seleccionado del grupo que consiste en: alquilfosfonato, fosforoditioato, alquilfosfonotioato, fosforamidato, carbamato, carbonato, triéster de fosfato, éster de acetametilo, carboxi o combinaciones de los mismos.
En otro caso preferente, un oligonucleótido comprende opcionalmente al menos una nucleobase modificada que comprende ácidos nucleicos peptídicos, moléculas de ácido nucleico bloqueado (LNA), análogos, derivados y/o combinaciones de los mismos.
Un oligonucleótido puede hibridarse específicamente cuando la unión del compuesto al ácido nucleico diana interfiere con la función normal del ácido nucleico diana para causar una pérdida de actividad, y hay un grado suficiente de complementariedad para evitar la unión inespecífica del oligonucleótido a secuencias de ácido nucleico no diana en condiciones en las que se desea una unión específica. Tales condiciones incluyen, es decir, condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapéutico, y condiciones en las que se realizan ensayos en el caso de ensayos in vitro.
Un oligonucleótido, ya sea ADN, ARN, quimérico, sustituido, etc., puede hibridarse específicamente cuando la unión del compuesto a la molécula de ADN o ARN diana interfiere con la función normal del ADN o ARN diana para causar una pérdida de utilidad, y hay una grado suficiente de complementariedad para evitar la unión inespecífica del oligonucleótido a secuencias no diana en condiciones en las que se desea la unión específica, es decir, en condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapéutico, y en el caso de ensayos in vitro ensayos, en las condiciones en las cuales se realizan los ensayos.
Los expertos en la técnica también aprovechan la especificidad y sensibilidad del antisentido para usos terapéuticos. Se han empleado oligonucleótidos antisentido como restos terapéuticos en el tratamiento de estados patológicos en animales y en el hombre. Los oligonucleótidos antisentido se administran de forma segura y eficaz a seres humanos y actualmente se realizan numerosos ensayos clínicos. Por lo tanto, se establece que los oligonucleótidos pueden ser modalidades terapéuticas útiles que pueden configurarse para ser útiles en regímenes de tratamiento para el tratamiento de células, tejidos y animales, especialmente seres humanos.
Por ejemplo, los oligonucleótidos oligoméricos, en particular los oligonucleótidos, se unen a moléculas de ácido nucleico diana y modulan la expresión de moléculas codificadas por un gen diana. Las funciones del ADN a interferir comprenden, por ejemplo, replicación y transcripción. Las funciones del ARN que se va a interferir comprenden todas las funciones vitales tales como, por ejemplo, la translocación del ARN al sitio de traducción de la proteína, la traducción de la proteína del ARN, el corte y empalme del ARN para producir una o más especies de ARNm, y actividad catalítica la cual puede participar en o ser facilitado por el ARN. Las funciones pueden regularse al alza o inhibirse en dependencia de las funciones deseadas.
Los oligonucleótidos incluyen compuestos oligoméricos antisentido, oligonucleótidos antisentido, oligonucleótidos de secuencia guía externa (EGS), empalmadores alternativos, cebadores, sondas y otros compuestos oligoméricos que se hibridan con al menos una porción del ácido nucleico diana. Como tales, estos compuestos pueden introducirse en forma de compuestos oligoméricos circulares, de cadena sencilla, de cadena doble o de cadena sencilla.
Direccionar un oligonucleótido a una molécula de ácido nucleico particular, en el contexto de esta invención, puede ser un proceso de varios pasos. El proceso suele comenzar con la identificación de un ácido nucleico diana cuya función se va a modular. Este ácido nucleico diana puede ser, por ejemplo, un gen celular (o ARNm transcrito del gen) cuya expresión está asociada con un trastorno o enfermedad particular.
El proceso de direccionamiento usualmente también incluye la determinación de al menos una región, segmento o sitio diana dentro del ácido nucleico diana para que se produzca la interacción antisentido de tal manera que resulte el efecto deseado, por ejemplo, la modulación de la expresión. Dentro del contexto de la presente invención, el término "región" se define como una porción del ácido nucleico diana que tiene al menos una estructura, función o característica identificable. Dentro de las regiones de los ácidos nucleicos diana hay segmentos. Los "segmentos" se definen como subporciones más pequeñas de regiones dentro de un ácido nucleico diana. Los "sitios", como se usan en la presente invención, se definen como posiciones dentro de un ácido nucleico diana.
Preferentemente, los oligonucleótidos antisentido se unen a regiones codificantes y/o no codificantes de un polinucleótido diana y modulan la expresión y/o función de la molécula diana.
También es preferente que los oligonucleótidos antisentido se unan a polinucleótidos antisentido naturales y modulen la expresión y/o función de la molécula diana. Un ejemplo de una "función" puede ser una que inhiba un regulador negativo de la transcripción, permitiendo así una expresión aumentada de una molécula deseada, tal como, por ejemplo, BAG3.
También es preferente que los oligonucleótidos antisentido se unan a polinucleótidos sentido y modulen la expresión y/o función de la molécula diana.
Por ejemplo, los oligonucleótidos se unen a una hebra antisentido de una diana en particular. Los oligonucleótidos tienen al menos 5 nucleótidos de longitud y pueden sintetizarse de modo que cada oligonucleótido se dirija a secuencias superpuestas de tal modo que los oligonucleótidos se sinteticen para cubrir toda la longitud del polinucleótido diana. Los diana también incluyen regiones codificantes y no codificantes.
En el contexto de la presente invención, los compuestos antisentido incluyen oligonucleótidos antisentido, ribozimas, oligonucleótidos de secuencia guía externa (eGS), compuestos de ARNip, compuestos de interferencia de ARN monocatenario o bicatenario (ARNi) tales como compuestos de ARNip, y otros compuestos oligoméricos que hibridan a, al menos, una porción del ácido nucleico diana y modulan su función. Como tales, pueden ser a Dn , ARN, similares a ADN, similares a ARN o mezclas de los mismos, o pueden ser miméticos de uno o más de estos. Estos compuestos pueden ser compuestos oligoméricos monocatenarios, bicatenarios, circulares o en horquilla y pueden contener elementos estructurales tales como protuberancias internas o terminales, desajustes o bucles. Los compuestos antisentido se preparan de forma rutinaria de forma lineal, pero pueden unirse o preparar de otro modo para que sean circulares y/o ramificados. Los compuestos antisentido pueden incluir construcciones tales como, por ejemplo, dos cadenas hibridadas para formar un compuesto total o parcialmente bicatenario o una sola cadena con suficiente autocomplementariedad para permitir la hibridación y formación de un compuesto total o parcialmente bicatenario. Las dos hebras pueden unirse internamente de modo que dejen libre los extremos 3' o 5' o pueden unirse para formar una estructura de horquilla o bucle continuo. La estructura de horquilla puede contener un saliente en el extremo 5' o 3' que produce una extensión de carácter monocatenario. Los compuestos bicatenarios opcionalmente pueden incluir extensiones en los extremos. Otras modificaciones pueden incluir grupos conjugados unidos a uno de los extremos, posiciones de nucleobase seleccionadas, posiciones de azúcar o a uno de los enlaces internucleosídicos. Alternativamente, las dos cadenas pueden unirse mediante un resto de ácido no nucleico o un grupo enlazador. Cuando se forma a partir de una sola hebra, el ARNbc puede tomar la forma de una molécula de tipo horquilla autocomplementaria que se duplica sobre sí misma para formar un dúplex. Por lo tanto, los ARNbc pueden ser total o parcialmente bicatenarios. La modulación específica de la expresión génica puede lograrse mediante la expresión estable de horquillas de ARNbc en líneas celulares transgénicas, sin embargo, en realizaciones preferentes, la expresión génica está regulada positivamente. Cuando se forma a partir de dos hebras, o una hebra única que toma la forma de una molécula tipo horquilla autocomplementaria doblada sobre sí misma para formar un dúplex, las dos hebras (o regiones de formación de dúplex de una hebra única) son hebras de ARN complementarias que aparean las bases al estilo Watson-Crick.
En otro caso preferente, los oligonucleótidos deseados o compuestos antisentido comprenden al menos uno de: ARN antisentido, ADN antisentido, oligonucleótidos antisentido quiméricos, oligonucleótidos antisentido que comprenden enlaces modificados, ARN de interferencia (ARNi), ARN interferente corto (ARNic); un micro ARN interferente (miARN); un pequeño ARN temporal (ARNpt); o un ARN en horquilla corto (ARNhc); activación génica inducida por ARN pequeño (ARNa); ARN pequeños activadores (ARNap), o combinaciones de los mismos.
El ARNbc también puede activar la expresión génica, un mecanismo que se ha denominado "activación génica inducida por ARN pequeño" o ARNa. Los ARNbc que se dirigen a los promotores de genes inducen una potente activación transcripcional de genes asociados. Se detectó ARNa en células humanas mediante el uso de ARNbc sintéticos, denominados "ARN activadores pequeños" (ARNa).
El ARN bicatenario pequeño (ARNbc) también puede actuar como ARN activador pequeño (ARNap). Sin desear estar ligado a la teoría, al dirigirse a secuencias en promotores de genes, los ARNa inducirían la expresión del gen diana en un fenómeno denominado activación transcripcional inducida por ARNbc (ARNa).
En algunos casos, la secuencia del ácido ribonucleico es específica para los segmentos reguladores del genoma que controlan la transcripción de BAG3. Por lo tanto, un agente terapéutico candidato puede ser un ARNbc que activa la expresión de BAG3 en una célula y se administra a un paciente que necesita tratamiento.
Péptidos: en otra realización, un péptido de BAG3 está codificado por un ácido nucleico que comprende un atanogén 3 asociado a BCL2 (BAG3) salvaje, quimérico o secuencias de ADNc del mismo. El péptido también puede ser un péptido sintético de atanogén 3 asociado a BCL2 (BAG3).
Debe entenderse que las secuencias de péptidos no se limitan a las secuencias nativas o de ADNc de las mismas, de moléculas de atanogén 3 asociadas a BCL2 (BAG3). El experto en la materia reconocerá que pueden realizarse cambios conservadores de aminoácidos, que, aunque alteran la secuencia primaria de la proteína o péptido, normalmente no alteran su función. Por ejemplo, las sustituciones conservadoras de aminoácidos típicamente incluyen sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico; asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina.
También pueden realizarse sustituciones conservadoras basadas en tipos de aminoácidos: alifáticos (valina, isoleucina, leucina y alanina); cargados (ácido aspártico, ácido glutámico, lisina, arginina e histidina); residuos aromáticos (fenilalanina, tirosina y triptófano); y que contienen azufre (metionina y cisteína). Secuencias de polipéptidos que tienen al menos alrededor de 68 % de identidad, al menos alrededor de 70 % de identidad o al menos alrededor de 71 % de identidad con una secuencia de ácido nucleico del atanogén 3 (BAG3) asociado a BCL2, o secuencias de ADNc de la misma.
La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos puede lograrse mediante el uso de un algoritmo matemático. Por ejemplo, un algoritmo matemático útil para comparar dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268), modificado como en Karlin y Altschul (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873 - 5877). Este algoritmo está incorporado en los programas NBLAST y XBLAST de Altschul, y otros (1990, J. Mol. Biol. 215:403-410), y puede accederse a este, por ejemplo, en el sitio web mundial del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) que tiene el localizador universal de recursos http://blast(punto)ncbi(punto)nlm(punto)nih(punto)gov/blast.cgi/. Las búsquedas de nucleótidos BLAST pueden realizarse con el programa Nb LASt (designado "blastn" en el sitio web del NCBI), mediante el uso de los siguientes parámetros: penalización por brecha=5; penalización por extensión de la brecha=2; penalización por no-complementariedad=3; recompensa por complementariedad=1; valor esperado 10,0; y tamaño de palabra=11 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a un ácido nucleico descrito en el presente documento. Las búsquedas de proteínas BLAST pueden realizarse con el programa XBLAST o el programa "blastp" de NCBI, mediante el uso de los siguientes parámetros: valor esperado 10,0, matriz de puntuación BLOSUM62 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a una molécula de proteína descrita en el presente documento. Para obtener alineaciones de brechas con fines de comparación, puede usarse Gapped BLAST como se describe en Altschul y otros (1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402). Alternativamente, pueden usarse PSI-Blast o PHI-Blast para realizar una búsqueda iterada que detecta relaciones distantes entre moléculas y relaciones entre moléculas que comparten un patrón común. Cuando se usan los programas BLAST, Gapped BLASt , PSI-Blast y PHI-Blast, pueden usarse los parámetros predeterminados de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Al calcular el porcentaje de identidad, normalmente se cuentan las coincidencias exactas.
Las realizaciones de la invención también incluyen polinucleótidos que codifican proteínas híbridas que comprenden polipéptido de atanogén 3 asociado a BCL2 (BAG3) fusionado operativamente directa o indirectamente mediante un enlazador peptídico, a una segunda secuencia polipeptídica. Las secuencias enlazadoras son bien conocidas en la técnica. En una realización, una proteína híbrida comprende un polipéptido de BAG3 o un polipéptido de BAG3 fusionado operativamente a un resto detectable, tal como un polipéptido reportero, en donde el polipéptido reportero está fusionado al N- o C-terminal del polipéptido de BAG3, directamente o indirectamente. Los polipéptidos reporteros ejemplares incluyen luciferasa (LUC), proteína verde fluorescente (GFP) y derivados de GFP.
Las proteínas híbridas que comprenden un polipéptido de BAG3 o un fragmento del mismo pueden unirse a otros tipos de polipéptidos, además de un polipéptido reportero, o en lugar de un polipéptido indicador. Estos polipéptidos adicionales pueden ser cualquier secuencia de aminoácidos útil para la purificación, identificación y/o aplicación terapéutica o profiláctica del péptido. Además, el polipéptido adicional puede ser un péptido señal, un péptido dirigido, etc.
En algunos casos, las otras adiciones, sustituciones o deleciones pueden aumentar la estabilidad (incluyendo, pero sin limitarse a, la resistencia a la degradación proteolítica) del polipéptido o aumentar la afinidad del polipéptido por su receptor, ligando y/o proteínas de unión apropiados. En algunos casos, las otras adiciones, sustituciones o deleciones pueden aumentar la solubilidad del polipéptido. En algunas realizaciones, los sitios se seleccionan para la sustitución con un aminoácido codificado naturalmente o no natural además de otro sitio para la incorporación de un aminoácido no natural con el fin de aumentar la solubilidad del polipéptido después de la expresión en células huésped recombinantes. En algunas realizaciones, los polipéptidos comprenden otra adición, sustitución o deleción que modula la afinidad por el ligando asociado, las proteínas de unión y/o el receptor, modula (incluyendo, pero sin limitarse a, aumenta o disminuye) la dimerización del receptor, estabiliza los dímeros del receptor, modula el tiempo de vida media en circulación, modula la liberación o biodisponibilidad, facilita la purificación o mejora o altera una vía de administración particular. De manera similar, el polipéptido de aminoácidos no natural puede comprender secuencias de escisión química o enzimática, secuencias de escisión de proteasa, grupos reactivos, dominios de unión a anticuerpos (que incluyen, entre otros, FLAG o poli-His) u otras secuencias basadas en afinidad (que incluyen pero no limitado a, FLAg , poli-His, GST, etc.) o moléculas unidas (que incluyen, entre otras, biotina) que mejoran la detección (que incluyen, entre otros, GFP), purificación, transporte a través de tejidos o membranas celulares, liberación de profármacos o activación, reducción de tamaño u otros rasgos del polipéptido.
Los métodos y composiciones descritos en el presente documento incluyen la incorporación de uno o más aminoácidos no naturales en un polipéptido. Pueden incorporarse uno o más aminoácidos no naturales en una o más posiciones particulares que no interrumpen la actividad del polipéptido. Esto puede lograrse mediante sustituciones "conservadoras", que incluyen, entre otras, la sustitución de aminoácidos hidrófobos con aminoácidos hidrófobos naturales o no naturales, aminoácidos voluminosos con aminoácidos voluminosos naturales o no naturales, aminoácidos hidrófilos con aminoácidos no naturales o aminoácidos hidrófilos naturales o no naturales) y/o mediante la inserción del aminoácido no natural en un lugar que no es necesario para la actividad.
Puede emplearse una variedad de enfoques bioquímicos y estructurales para seleccionar los sitios deseados para la sustitución con un aminoácido no natural dentro del polipéptido. Cualquier posición de la cadena polipeptídica es adecuada para la selección para incorporar un aminoácido no natural, y la selección puede basarse en un diseño racional o mediante selección aleatoria para cualquier propósito particular deseado o no. La selección de los sitios deseados puede basarse en la producción de un polipéptido de aminoácido no natural (que puede modificarse más o permanecer sin modificar) que tenga cualquier propiedad o actividad deseada, incluidos, entre otros, agonistas, superagonistas, agonistas parciales, agonistas inversos, antagonistas, moduladores de unión al receptor, moduladores de la actividad del receptor, moduladores de la unión a los socios del aglutinante, moduladores de la actividad del socio de unión, moduladores de la conformación del socio de unión, formación de dímeros o multímeros, sin cambios en la actividad o propiedad en comparación con la molécula nativa, o manipulación de cualquier sustancia física o química propiedad del polipéptido tal como solubilidad, agregación o estabilidad. Por ejemplo, las ubicaciones en el polipéptido necesarias para la actividad biológica de un polipéptido pueden identificarse mediante el uso de métodos que incluyen, pero no se limitan a, análisis de mutación puntual, escaneo de alanina o métodos de escaneo de homólogos. Los residuos distintos de los identificados como críticos para la actividad biológica por métodos que incluyen, pero no se limitan a, alanina u mutagénesis de exploración de homólogos pueden ser buenos candidatos para la sustitución con un aminoácido no natural dependiendo de la actividad deseada buscada para el polipéptido. Alternativamente, los sitios identificados como críticos para la actividad biológica también pueden ser buenos candidatos para la sustitución con un aminoácido no natural, de nuevo dependiendo de la actividad deseada buscada para el polipéptido. Otra alternativa sería realizar sustituciones en serie en cada posición de la cadena polipeptídica con un aminoácido no natural y observar el efecto sobre las actividades del polipéptido. Cualquier medio, técnica o método para seleccionar una posición para la sustitución con un aminoácido no natural en cualquier polipéptido es adecuado para su uso en los métodos, técnicas y composiciones descritos en el presente documento.
Agentes candidatos y ensayos de cribado
Las composiciones incorporadas en el presente documento también pueden aplicarse en las áreas de descubrimiento de fármacos y validación de objetivos. La presente descripción comprende el uso de las secuencias de ácido nucleico y péptidos incorporados en el presente documento, en los esfuerzos por descubrir de fármacos para dilucidar las relaciones que existen entre los polinucleótidos del anthanógeno-3 (BAG3) asociados a Bcl-2 y un estado de enfermedad, fenotipo o afección. Estos métodos incluyen la detección o modulación de polinucleótidos del anthanogén-3 (BAG3) asociados con Bcl-2 que comprenden poner en contacto una muestra, tejido, célula u organismo con un compuesto, medir el nivel de ácido nucleico o proteína del antanogén-3 asociado con Bcl-2 (BAG3). polinucleótidos y/o un punto final fenotípico o químico relacionado en algún momento después del tratamiento, y opcionalmente mediante la comparación del valor medido con una muestra no tratada o una muestra tratada con un compuesto adicional de la invención.
Los ensayos de cribado incluyen e incorporan adecuadamente modelos animales, sistemas basados en células y sistemas no basados en células. Las secuencias de ácido nucleico y los péptidos incorporados en el presente documento se usan para identificar agentes de interés terapéutico, por ejemplo, mediante el cribado de bibliotecas de compuestos o mediante la identificación compuestos de interés mediante cualquiera de una variedad de técnicas de análisis o cribado de fármacos, o síntesis de nuevos compuestos. El gen, alelo, fragmento u oligopéptido del mismo empleado en tal cribado puede estar libre en solución, fijado a un soporte sólido, soportado sobre una superficie celular o localizado intracelularmente. Las mediciones se realizan como se describe en detalle en la sección de ejemplos que sigue. En casos, se realiza el cribado de agentes candidatos para identificar aquellos que modulan la traducción de BAG3.
Los ensayos pueden ser de formato in vitro o in vivo. Los formatos in vitro de interés incluyen formatos basados en células, en los que se produce el contacto, por ejemplo, mediante la introducción del sustrato en un medio, tal como un medio acuoso, en donde está presente la célula. En otros casos, el ensayo puede ser in vivo, en el cual se emplea un organismo multicelular que incluye la célula. El contacto de un vector de direccionamiento que codifica las secuencias de ácido nucleico incorporadas en el presente documento, con la(s) célula(s) diana puede lograrse mediante el uso de cualquier protocolo conveniente. En aquellos casos en donde las células diana están presentes como parte de un organismo multicelular, por ejemplo, un animal, el vector se administra convenientemente (por ejemplo, se inyecta, se alimenta, etc.) al organismo multicelular, por ejemplo, un animal completo, donde la administración puede ser sistémica o localizada, por ejemplo, directamente a tejido(s) específico(s) y/u órgano(s) del organismo multicelular.
Los organismos multicelulares de interés incluyen, pero no se limitan a: insectos, vertebrados, tales como especies de aves, por ejemplo, pollos; mamíferos, incluidos roedores, por ejemplo, ratones, tasas; ungulados, por ejemplo, cerdos, vacas, caballos; perros, gatos, primates, por ejemplo, monos, simios, humanos; y similares. Como tales, las células diana de interés incluyen, pero no se limitan a: células de insectos, células de vertebrados, particularmente células de aves, por ejemplo, células de pollo; células de mamífero, incluidas células murinas, porcinas, unguladas, ovinos, equinos, de rata, de perro, de gato, de mono y humanas; y similares.
La célula diana que comprende los polinucleótidos BAG3 o polipéptidos BAG3 contacta con un compuesto de prueba y la traducción de BAG3 se evalúa o valora mediante la detección de la presencia o ausencia de señal de un resto detectable, por ejemplo, sustrato de luciferasa, es decir, mediante el cribado de la célula (ya sea in vitro o in vivo) para detectar la presencia de una señal luminiscente mediada por luciferasa. Luego, la señal detectada se emplea para evaluar la actividad de traducción y/o transcripción de BAG3 en presencia de un agente de prueba. La señal luminiscente puede detectarse mediante el uso de cualquier dispositivo de detección luminiscente conveniente. En determinadas realizaciones, los detectores de interés incluyen, pero no se limitan a: tubos fotomultiplicadores (PMT), fotodiodos de avalancha (APD), dispositivos de carga acoplada (CCD); semiconductores de óxido de metal complementario (detectores CMOS) y similares. El detector puede estar presente en un dispositivo de detección de señales, por ejemplo, un luminómetro, que es capaz de detectar la señal una o varias veces durante un período predeterminado, según se desee. Los datos pueden recopilarse de esta manera a intervalos frecuentes, por ejemplo, una vez cada 10 ms, durante el transcurso de un período de tiempo de ensayo dado.
En ciertos casos, los métodos en cuestión se realizan en un formato de alto rendimiento (HT). En las realizaciones de HT en cuestión, se analizan o prueban simultáneamente una pluralidad de células diferentes. Por probadas simultáneamente se quiere decir que cada una de las células de la pluralidad se prueban sustancialmente al mismo tiempo. En general, el número de células que se prueban simultáneamente en los métodos de HT en cuestión varía de alrededor de 10 a 10 000, normalmente de alrededor de 100 a 10 000 y en determinadas realizaciones de alrededor de 1000 a 5000. Se conocen en la técnica una variedad de ensayos de cribado de alto rendimiento para determinar la actividad del agente candidato y se adaptan fácilmente, incluidos los descritos en, por ejemplo, Schultz (1998) Bioorg Med Chem Lett 8:2409-2414; Fernandes (1998) Curr Opin Chem Biol 2:597-603; así como los descritos en la patente de EE. UU. No. 6.127,13, 3.
Un método de cribado de agentes que modulan la traducción y/o la transcripción del anthanoggén-3 asociado a Bcl-2 (BAG3) comprende poner en contacto una molécula de BAG3 con un agente en donde la molécula de BAG3 comprende un ácido nucleico aislado o una secuencia de ADNc del antanogén-3 asociado a Bcl-2 (BAG3) operativamente unido a un resto detectable, y al menos un codón de parada entre BAG3 y el resto detectable; valorar el nivel de traducción de BAG3 en ausencia de un agente candidato para obtener un nivel de referencia de traducción y/o transcripción, valorar el nivel de traducción y/o transcripción de BAG3 en presencia del agente candidato para obtener un nivel de prueba de traducción y/o transcripción, donde el agente candidato se identifica como un agente que aumenta la traducción y/o transcripción si el nivel de prueba de traducción y/o transcripción es mayor que el nivel de referencia de traducción y/o transcripción.
Por ejemplo, el resto detectable comprende: un resto luminiscente, un resto quimioluminiscente, un resto fluorescente, un resto bioluminiscente, una enzima, un resto natural o sintético.
Puede usarse cualquier método conocido en la técnica para valorar la traducción. En un caso preferente, la traducción se valora mediante el uso de células de mamífero transfectadas con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico como se describe. La transfección puede ser transitoria o las células pueden transformarse de manera estable con el vector de expresión. Un ensayo basado en células tal como se describe en Butcher y otros, 2007, J Biol Chem. 282:2853-28539. Alternativamente, puede usarse un ensayo de traducción in vitro.
En el contexto de un vector de expresión, el vector puede introducirse fácilmente en una célula huésped, por ejemplo, célula de mamífero, bacteriana, de levadura o de insecto, mediante cualquier método en la técnica. Por ejemplo, el vector de expresión puede transferirse a una célula huésped por medios físicos, químicos o biológicos. Los métodos físicos para introducir un polinucleótido en una célula huésped incluyen precipitación con fosfato calcico, lipofección, bombardeo de partículas, microinyección, electroporación, fotoporación y similares. Los métodos para producir células que comprenden vectores y/o ácidos nucleicos exógenos son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook y otros (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York) y en Ausubel y otros (1997, Protocolos actuales en biología molecular, John Wiley & Sons, Nueva York).
Los métodos biológicos para introducir un polinucleótido de interés en una célula huésped incluyen el uso de vectores de ADN y ARN. Los vectores virales, y especialmente los vectores retrovirales, se han convertido en el método más ampliamente usado para insertar genes en células de mamíferos, por ejemplo, humanas. Otros vectores virales pueden derivarse de lentivirus, poxvirus, virus del herpes simple I, adenovirus y virus adenoasociados y similares. Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. 5.350.674 y 5.585.362.
Los medios químicos para introducir un polinucleótido en una célula huésped incluyen sistemas de dispersión coloidal, tales como complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, perlas y sistemas basados en lípidos que incluyen emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. Un sistema coloidal preferente para usar como vehículo de suministro in vitro e in vivo es un liposoma (es decir, una vesícula de membrana artificial). La preparación y uso de tales sistemas es bien conocido en la técnica.
En el caso de que se use un sistema de suministro no viral, un vehículo de suministro preferente es un liposoma. Por lo tanto, los sistemas y protocolos de administración mencionados anteriormente pueden encontrarse en "Gene Targeting Protocols, 2ed.", Kmiec ed., Humana Press, Totowa, NJ, págs. 1-35 (2002) y "Gene Transfer and Expression Protocols, Vol. 7, (Methods in Molecular Biology), "Murray ed., Humana Press, Totowa, NJ, págs. 81 - 89 (1991).
Agentes candidatos: Los métodos pueden practicarse con cualquier compuesto de prueba como agentes candidatos. Los compuestos de prueba útiles pueden obtenerse mediante el uso de cualquiera de los numerosos enfoques en métodos de biblioteca combinatoria conocidos en la técnica, incluidas bibliotecas biológicas, bibliotecas de fase sólida paralela o de fase de solución direccionables espacialmente, métodos de biblioteca sintética que requieren deconvolución, el método de biblioteca "una perla un compuesto", y métodos de biblioteca sintética que usan la selección por cromatografía de afinidad. El enfoque de bibliotecas biológicas se limita a bibliotecas de péptidos, mientras que los otros cuatro enfoques son aplicables a bibliotecas de compuestos de péptidos, oligómeros no peptídicos o moléculas pequeñas (Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12:145).
Pueden encontrarse en la técnica ejemplos de métodos para la síntesis de bibliotecas moleculares, por ejemplo, en: DeWitt y otros, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909-6913; Erb y col., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422-11426; Zuckermann y otros, 1994, J. Med. Chem. 37:2678-2685; Cho y otros, 1992, Science 261:1303-1305; Carell y otros, 1994, Angew. Chem. En t. Ed. Engl. 33:2059-2061; Carell y otros, 1994, Angew. Chem. En t. Ed. Engl. 33:2061-2064; y Gallop y otros, 1994, J. Med. Chem. 37:1233-1251.
Las bibliotecas de compuestos pueden presentarse en solución (p. Ej., Houghten, 1992, Bio/Techniques 13:412-421), o en perlas (Lam, 1991, Nature 354:82-84), chips (Fodor, 1993, Nature 364:555-556), bacterias (Patente de Estados Unidos No 5.223.409), esporas (Patentes de Estados Unidos No 5.571.698; 5.403.484 y 5.223.409), plásmidos (Cull y otros, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869), o fagos (Scott y Smith, 1990, Science 249:386-390; Devlin, 1990, Science 249:404-406; Cwirla y otros, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382; y Felici, 1991, J Mol. Biol. 222:301-310).
Las bibliotecas disponibles comercialmente que pueden cribarse incluyen, entre otras, la biblioteca de productos naturales de TimTec (NPL), la biblioteca n Pl-640 y la biblioteca TimTec NDL-3000. También pueden cribarse bibliotecas que comprenden compuestos modelados en poliaminas (es decir, análogos de poliaminas).
En ciertos casos, el agente candidato es una molécula pequeña o un ligando de molécula grande. Por ligando de molécula pequeña se entiende un ligando que varía en tamaño de alrededor de 50 a alrededor de 10000 daltons, usualmente de alrededor de 50 a alrededor de 5000 daltons y más usualmente de alrededor de 100 a alrededor de 1000 daltons. Por molécula grande se entiende un ligando que varía en tamaño desde alrededor de 10000 daltons o más en peso molecular.
El método puede practicarse de forma iterativa mediante el uso de diferentes concentraciones de un candidato de prueba y/o diferentes condiciones de prueba, tal como la duración del tiempo de reacción. Los candidatos de prueba que se identifican mediante el método pueden probarse adicionalmente mediante métodos convencionales en la técnica para verificar la especificidad, dependencia de la dosis, eficacia in vivo y similares. Los candidatos de prueba pueden servir como compuestos principales para desarrollar candidatos de prueba adicionales.
Como se indicó anteriormente, la presente divulgación encuentra uso para controlar la actividad de traducción y/o transcripción de BAG3 en un ensayo en donde la prueba se realiza mediante el uso de células. En estas realizaciones, las células se cultivan en condiciones específicas definidas por el usuario (por ejemplo, en presencia o ausencia de una citocina, un nutriente y/o un agente terapéutico candidato) y se controlan para detectar la luz emitida.
Puede creerse que un compuesto o agente prototipo tiene actividad terapéutica sobre la base de cualquier información disponible para el experto. Por ejemplo, puede creerse que un agente prototipo tiene actividad terapéutica basándose en la información contenida en el Physician's Desk Reference. Adicionalmente, a modo de ejemplo no limitativo, puede creerse que un compuesto tiene actividad terapéutica sobre la base de la experiencia de un médico clínico, la estructura del compuesto, los datos de relaciones de actividad estructural, CE 50, los datos de ensayo, datos IC 50 de ensayo, estudios clínicos o en animales, o cualquier otra base, o combinación de tales bases. Un compuesto o agente terapéuticamente activo es un agente que tiene actividad terapéutica, que incluye, por ejemplo, la capacidad del agente para inducir una respuesta específica cuando se administra a un sujeto o se prueba in vitro. La actividad terapéutica incluye el tratamiento de una enfermedad o afección, que incluye tanto el tratamiento profiláctico como el de mejora. El tratamiento de una enfermedad o afección puede incluir la mejora de una enfermedad o afección en cualquier cantidad, incluida la prevención, la mejora y la eliminación de la enfermedad o afección. La actividad terapéutica puede llevarse a cabo contra cualquier enfermedad o afección, incluso en una realización preferente contra cualquier enfermedad o trastorno asociado con el daño por intermediarios reactivos de oxígeno. Para determinar la actividad terapéutica puede usarse cualquier método mediante el cual pueda evaluarse la actividad terapéutica de un compuesto. Por ejemplo, pueden usarse métodos tanto in vivo como in vitro, que incluyen, por ejemplo, la evaluación clínica, los ensayos de CE 50 e IC 50 y las curvas de respuesta a la dosis.
Los compuestos candidatos para su uso con un ensayo o identificados mediante ensayos como agentes farmacológicos útiles pueden ser agentes farmacológicos ya conocidos en la técnica o variaciones de los mismos o pueden ser compuestos previamente desconocidos que tengan alguna actividad farmacológica. Los compuestos candidatos pueden producirse naturalmente o diseñarse en el laboratorio. Los compuestos candidatos pueden comprender un solo diastereoisómero, más de un diastereoisómero o un solo enantiómero o más de un enantiómero.
Los compuestos candidatos pueden aislarse de microorganismos, animales o plantas, por ejemplo, y pueden producirse de forma recombinante o sintetizarse mediante métodos químicos conocidos en la técnica. Si se desea, los compuestos candidatos pueden obtenerse mediante el uso de cualquiera de los numerosos métodos de biblioteca combinatoria conocidos en la técnica, que incluyen, entre otros, bibliotecas biológicas, bibliotecas de fase sólida paralela o de fase de solución espacialmente direccionables, métodos de biblioteca sintética que requieren deconvolución, el método de biblioteca "una perla un compuesto" y métodos de biblioteca sintética que usan la selección por cromatografía de afinidad. El enfoque de la biblioteca biológica se limita a las bibliotecas de polipéptidos. Los otros cuatro enfoques son aplicables a polipéptidos, oligómeros no peptídicos o bibliotecas de compuestos de moléculas pequeñas y son enfoques preferentes en la presente invención. Véase Lam, Anticancer Drug Des. 12:145-167 (1997).
En un caso, la presente divulgación proporciona un método para identificar un compuesto candidato como profármaco adecuado. Un profármaco adecuado incluye cualquier profármaco que pueda identificarse mediante los métodos de la presente descripción. Puede usarse cualquier método evidente para el experto para identificar un compuesto candidato como profármaco adecuado.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona métodos para seleccionar compuestos candidatos para determinar su idoneidad como agentes terapéuticos. El cribado de la idoneidad de los agentes terapéuticos puede incluir la valoración de uno, algunos o muchos criterios relacionados con el compuesto que pueden afectar la capacidad del compuesto como agente terapéutico. Pueden considerarse factores tales como, por ejemplo, eficacia, seguridad, eficiencia, retención, localización, selectividad tisular, degradación o persistencia intracelular. En un caso, se proporciona un método de cribado de compuestos candidatos para determinar su idoneidad como agentes terapéuticos, donde el método comprende proporcionar un compuesto candidato identificado como un profármaco adecuado, determinar la actividad terapéutica del compuesto candidato y determinar la persistencia intracelular del compuesto candidato. La persistencia intracelular puede medirse mediante cualquier técnica evidente para el experto en la materia, tal como, por ejemplo, mediante trazador radiactivo, marcaje de isótopos pesados o LCMS. Al seleccionar compuestos para determinar su idoneidad como agentes terapéuticos, se evalúa la persistencia intracelular del compuesto candidato. En un caso preferente, los agentes se evalúan por su capacidad para modular la traducción de las composiciones incorporadas en el presente documento, durante un período de tiempo en respuesta a un agente terapéutico candidato.
En otro caso preferente, las formas solubles y/o unidas a la membrana de las composiciones incorporadas en el presente documento, por ejemplo, proteínas, mutantes o porciones biológicamente activas de los mismos, pueden usarse en los ensayos para seleccionar agentes candidatos. Cuando se usan formas unidas a la membrana de la proteína, puede ser deseable usar un agente solubilizante. Ejemplos de tales agentes solubilizantes incluyen detergentes no iónicos tales como n-octilglucósido, n-dodecilglucósido, n-dodecilmaltósido, octanoil-N-metilglucamida, decanoil-N-metilglucamida, TRITON™ X-100, TRITON™ X-114, THESIT™, Isotridecypoli (etilenglicol éter)n, 3-[(3-colamidopropil)dimetilaminio]-1-propano sulfonato (CHAPS), 3-[(3-colamidopropil) dimetilaminio]-2-hidroxi-1-propano sulfonato (CHAPSO), o N-dodecil=N,N-dimetil-3-amonio-1-propano sulfonato. También pueden usarse ensayos sin células e implican la preparación de una mezcla de reacción que incluye moléculas BAG3 (ácidos nucleicos o péptidos) que comprenden un resto bioluminiscente y el compuesto de prueba en condiciones y períodos de tiempo para permitir la medición de la actividad de traducción y/o transcripción durante tiempo y concentraciones de los agentes de prueba.
En otros casos, un agente candidato es un oligonucleótido antisentido. En casos, la expresión de BAG3 (por ejemplo, proteína) en una muestra (por ejemplo, células o tejidos in vivo o in vitro) tratada mediante el uso de un oligonucleótido antisentido de la invención se evalúa por comparación con la expresión de BAG3 en una muestra control. Por ejemplo, la traducción de BAG3 se controla mediante la señal emitida por el resto detectable y se compara con la de una muestra tratada de forma simulada o sin tratar. Alternativamente, puede hacerse una comparación con una muestra tratada con un oligonucleótido antisentido control (por ejemplo, uno que tiene una secuencia alterada o diferente) en dependencia de la información deseada. En otro caso, una diferencia en la actividad de traducción y/o transcripción en una muestra tratada frente a una no tratada puede compararse con la diferencia en la expresión de un ácido nucleico diferente (incluido cualquier estándar que el investigador considere apropiado, por ejemplo, un gen de mantenimiento) en una muestra tratada frente a una muestra sin tratar.
Las diferencias observadas pueden expresarse como se desee, por ejemplo, en forma de una proporción o fracción, para usar en una comparación con el control. En algunos casos, el nivel de proteína BAG3, en una muestra tratada con un oligonucleótido antisentido, aumenta o disminuye en alrededor de 1,25 veces hasta alrededor de 10 veces o más en relación con una muestra no tratada o una muestra tratada con un ácido nucleico de control. Preferentemente, se aumenta el nivel o la cantidad de BAG3. Por ejemplo, el nivel de proteína BAG3 aumenta o disminuye al menos alrededor de 1,25 veces, al menos alrededor de 1,3 veces, al menos alrededor de 1,4 veces, al menos alrededor de 1,5 veces, al menos alrededor de 1,6 veces, al menos alrededor de 1,7 veces, al menos alrededor de 1,8 veces, al menos alrededor de 2 veces, al menos alrededor de 2,5 veces, al menos alrededor de 3 veces, al menos alrededor de 3,5 veces, al menos alrededor de 4 veces, al menos alrededor de 4,5 veces, al menos alrededor de 5 veces, al menos alrededor de 5,5 veces, al menos alrededor de 6 veces, al menos alrededor de 6,5 veces, al menos alrededor de 7 veces, al menos alrededor de 7,5 veces, al menos alrededor de 8 veces, al menos alrededor de 8,5 veces, al menos alrededor de 9 veces, al menos alrededor de 9,5 veces, o al menos alrededor de 10 veces o más. Es preferente que se aumente el nivel o la cantidad de BAG3.
Micromatrices: la identificación de una secuencia de ácido nucleico capaz de unirse a una molécula diana puede lograrse mediante la inmovilización de una biblioteca de ácidos nucleicos en la superficie del sustrato de modo que cada ácido nucleico único se ubique en una posición definida para formar un arreglo. En general, la biblioteca inmovilizada de ácidos nucleicos se expone a una biomolécula o agente candidato en condiciones que favorecen la unión de la biomolécula a los ácidos nucleicos. Luego, la matriz de ácidos nucleicos se analizaría mediante los métodos incorporados en el presente documento para determinar qué secuencias de ácidos nucleicos se unen a la biomolécula. Preferentemente, las biomoléculas llevarían un marcador predeterminado para su uso en la detección de la ubicación de los ácidos nucleicos unidos.
Puede usarse un ensayo que usa una matriz inmovilizada de secuencias de ácido nucleico BAG3 para determinar la secuencia de un ácido nucleico desconocido; análisis de polimorfismo de nucleótido único (SNP); análisis de patrones de expresión del gen BAG3 de una especie, tejido, tipo celular, etc.; identificación de genes; etc.
En otros casos, pueden usarse oligonucleótidos o fragmentos más largos derivados de cualquiera de las secuencias de polinucleótidos de BAG3 como dianas en un micromatriz. El micromatriz puede usarse para monitorear la identidad y/o el nivel de expresión de un gran número de genes y transcripciones de genes simultáneamente, para identificar genes con los que los genes diana o su producto interactúan y/o para valorar la eficacia de agentes terapéuticos candidatos en la regulación de productos de expresión de genes que median, por ejemplo, trastornos neurológicos. Esta información puede usarse para determinar la función de los genes, y para desarrollar y controlar las actividades de los agentes terapéuticos.
Pueden prepararse, usarse y analizarse micromatrices mediante el uso de métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Brennan y otros, 1995, Patente de Estados Unidos No 5.474.796; Schena y otros, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619; Baldeschweiler y otros, 1995, solicitud PCT WO95/251116; Shalon, y otros, 1995, solicitud PCT WO95/35505; Heller y otros, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150-2155; y Heller y otros, 1997, Patente de Estados Unidos No 5.605.662). En otros casos, una micromatriz comprende péptidos BAG3 u otras moléculas deseadas que pueden ensayarse para identificar un agente candidato.
Un método para seleccionar agentes candidatos para el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno cardíaco comprende poner en contacto una muestra con un agente terapéutico candidato y medir los efectos que el agente tiene sobre un objetivo. Por ejemplo, el agente puede regular la expresión de BAG3 y luego el agente puede estudiarse adicionalmente para detectar cualquier posible efecto terapéutico (parámetro de aumento o disminución que se monitoriza, por ejemplo, expresión). Un estado de expresión anormal puede ser causado por una patología tal como insuficiencia cardíaca, enfermedad, cáncer, defectos genéticos y/o una toxina.
Anticuerpos. Los ensayos de diagnóstico útiles pueden incluir uno o más anticuerpos que se unen específicamente a BAG3. En algunos casos, el anticuerpo se une específicamente a un BAG3 mutante, por ejemplo, el polipéptido de BAG3 descrito en el presente documento tiene la deleción de 10 aminoácidos como se muestra en la Figura 2. Usamos el término anticuerpo para referirnos ampliamente a moléculas de unión basadas en inmunoglobulinas, y el término abarca anticuerpos convencionales (por ejemplo, los anticuerpos tetraméricos de la clase G (por ejemplo, una IgG1)), fragmentos de los mismos que conservan la capacidad de unirse a su objetivo deseado (por ejemplo, un fragmento Fab') y anticuerpos monocatenarios (scFv). El anticuerpo puede ser policlonal o monoclonal y puede ser producido por células humanas, de ratón, conejo, oveja o cabra, o por hibridomas derivados de estas células. El anticuerpo puede ser humanizado, quimérico o biespecífico.
Los anticuerpos pueden asumir varias configuraciones y abarcar proteínas que consisten en uno o más polipéptidos codificados sustancialmente por genes de inmunoglobulina. Puede usarse cualquiera de una variedad de estructuras de anticuerpos, tanto el anticuerpo intacto, los multímeros de anticuerpo o fragmentos de anticuerpo u otras variantes de los mismos que incluyen regiones funcionales de unión a antígeno del anticuerpo. Podemos usar el término "inmunoglobulina" como sinónimo de "anticuerpo". Los anticuerpos pueden ser de origen monoclonal o policlonal. Independientemente de la fuente del anticuerpo, los anticuerpos adecuados incluyen anticuerpos intactos, por ejemplo, tetrámeros de IgG que tienen dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L), anticuerpos monocatenarios, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, región determinante de la complementariedad (CDR)-anticuerpos injertados, así como fragmentos de anticuerpos, por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')2, scFv, Fv y anticuerpos recombinantes derivados de tales fragmentos, por ejemplo, anticuerpos de camello, microanticuerpos, anticuerpos diméricos y anticuerpos biespecíficos.
Un anticuerpo intacto es uno que comprende una región variable de unión a antígeno (Vh y Vl), así como un dominio constante de cadena ligera (Cl) y dominios constantes de cadena pesada, Ch i, Ch2 y Ch3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia nativa (por ejemplo, dominios constantes de secuencia nativa humana) o variantes de secuencia de aminoácidos de los mismos. Como es bien conocido en la técnica, las regiones Vh y Vl se subdividen además en regiones de hipervariabilidad, denominadas "regiones determinantes de la complementariedad" (CDR), intercaladas con las regiones marco más conservadas (FR).
Un anticuerpo anti-BAG3 puede ser de cualquier clase de inmunoglobulina, por ejemplo, IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (así como sus subtipos (por ejemplo, IgGi, IgG2 , IgG3 e IgG4)), y las cadenas ligeras de la inmunoglobulina pueden ser de tipo kappa o lambda. Los genes de inmunoglobulina humana reconocidos incluyen los genes de la región constante kappa, lambda, alfa (IgAi e IgA2), gamma (IgGi, IgG2 , IgG3, IgG4), delta, épsilon y mu, así como muchos genes de región variable de inmunoglobulina.
El término "porción de unión al antígeno" de una inmunoglobulina o anticuerpo se refiere generalmente a una porción de una inmunoglobulina que se une específicamente a una diana, en este caso, un epítopo que comprende residuos de aminoácidos en un polipéptido de BAG3. Por tanto, una porción de unión a antígeno de una inmunoglobulina es una molécula en la que una o más cadenas de inmunoglobulina no son de longitud completa, pero que se une específicamente a una diana celular. Ejemplos de porciones o fragmentos de unión a antígeno incluyen: (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VLC, VHC, CL y CH1; (ii) un fragmento F (ab')2 , un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fv que consiste en los dominios VLC y VHC de un solo brazo de un anticuerpo, y (v) una CDR aislada que tiene suficiente marco para unirse específicamente, por ejemplo, una porción de unión a antígeno de una región variable. Una parte de unión al antígeno de una región variable de cadena ligera y una parte de unión al antígeno de una región variable de cadena pesada, por ejemplo, los dos dominios del fragmento Fv, VLC y VHC, pueden unirse, mediante el uso de métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que les permite fabricarse como una única cadena de proteína en la que las regiones VLC y VHC se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena única (scFv). Tales scFv pueden ser un agente diana de la presente invención y están englobados por el término "porción de unión al antígeno" de un anticuerpo.
Un fragmento "Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de unión y reconocimiento del antígeno completo. Esta región consta de un dímero de una cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera en estrecha asociación concovalente. Es en esta configuración que interactúan tres regiones hipervariables de cada dominio variable para definir un sitio de unión al antígeno en la superficie del dímero Vh-Vl. Mientras que seis regiones hipervariables confieren especificidad de unión al antígeno, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres regiones hipervariables específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque con una afinidad menor que el sitio de unión completo. Para mejorar la estabilidad, los dominios VH-VL pueden conectarse mediante un enlazador de péptido flexible tal como (Gly4Ser)3 para formar un fragmento de anticuerpo Fv o scFV de cadena sencilla o pueden diseñarse para formar un enlace disulfuro mediante la introducción de dos residuos de cisteína en las regiones marco para producir un Fv estabilizado con disulfuro (dsFv). Los fragmentos de anticuerpos son adecuados para su uso en los métodos proporcionados siempre que retengan la especificidad deseada del anticuerpo de longitud completa y/o la especificidad suficiente para unirse específicamente a un polipéptido de BAG3.
Las composiciones descritas incluyen anticuerpos que (1) exhiben un nivel umbral de actividad de unión; y/o (2) no reaccionan de forma cruzada de manera significativa con moléculas polipeptídicas relacionadas conocidas. La afinidad de unión de un anticuerpo puede determinarse fácilmente por un experto en la técnica, por ejemplo, mediante análisis de Scatchard (Scatchard, Ann. NY Acad, Sci. 51:660-672 (1949)).
En algunos casos, los anticuerpos anti-BAG3 pueden unirse a sus epítopos diana o señuelos miméticos al menos 1,5 veces, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 100 veces, 103 veces, 104 veces, 105 veces, 106 veces o más para el anti-BAG3 diana que para otras proteínas que se predice que tienen alguna homología con BAG3.
En algunos casos, los anticuerpos anti-BAG3 se unen con alta afinidad de 10-4 M o menos, 10-7 M o menos, 10-9 M o menos o con afinidad subnanomolar (0,9; 0,8; 0,7; 0,6; 0,5; 0,4; 0,3; 0,2; 0,1 nM o incluso menos). En algunos casos, la afinidad de unión de los anticuerpos anti-BAG3 por sus objetivos respectivos es de al menos 1 x 106 Ka. En algunos casos, la afinidad de unión de los anticuerpos anti-BAG3 por BAG3 es al menos 5x106 Ka, al menos 1x107 Ka, al menos 2x107 Ka, al menos 1x108 Ka o mayor. Los anticuerpos también pueden describirse o especificarse en términos de su afinidad de unión a BAG3. En algunos casos las afinidades de unión incluyen aquellos con una Kd de menos de 5x10-2 M, 10-2 M, 5x10-3 M, 10-3 M, 5x10-3 M, 10-4 M, 5x10-5 M, 10-5 M, 5 x 10-6 M, 10-6 M, 5x10-7 M, 10-7 M, 5x10-8 M, 10-8 M, 5x10-9 M, 5x10-10 M, 10-10 M, 5x10-11 M, 10-11 M, 5x10-12 M, 10-12 M, 5x10-13 M, 10-13 M, 5x10-14 M, 10-14 M, 5x10-15 M, o 10-15 M, o menos.
En algunos casos, los anticuerpos no se unen a moléculas polipeptídicas relacionadas conocidas; por ejemplo, se unen a BAG3, pero no a polipéptidos relacionados conocidos. En algunos casos, los anticuerpos se unen específicamente a un polipéptido de BAG3 mutante, por ejemplo, un polipéptido de BAG3 que tiene la deleción de diez pares de bases como se muestra en la Figura 2, pero no a un polipéptido de BAG3 salvaje. Los anticuerpos pueden cribarse frente a polipéptidos relacionados conocidos para aislar una población de anticuerpos que se une específicamente a BAG3.
Los ensayos de diagnóstico pueden incluir inmunoelectroforesis concurrente, radioinmunoensayo (RIA), radioinmunoprecipitación, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), ensayo de transferencia puntual o de transferencia Western, ensayo de inhibición o competencia y ensayo de sándwich. Los anticuerpos anti-BAG3 pueden incluir una etiqueta, que también puede denominarse reportero o marcador (por ejemplo, un marcador detectable). Un marcador detectable puede ser cualquier molécula que esté unida covalentemente al anticuerpo anti-BAG3 o un fragmento biológicamente activo del mismo que permita la valoración cualitativa y/o cuantitativa de la expresión o actividad del péptido marcado. La actividad puede incluir una actividad biológica, una actividad físicoquímica o una combinación de las mismas. Tanto la forma como la posición del marcador detectable pueden variar, siempre que el anticuerpo marcado conserve la actividad biológica. Pueden usarse muchos marcadores diferentes, y la elección de un marcador particular dependerá de la aplicación deseada. Los anticuerpos anti-BAG3 marcados pueden usarse, por ejemplo, para valorar los niveles de BAG3 o un BAG3 mutante en una muestra biológica, por ejemplo, orina, saliva, líquido cefalorraquídeo, sangre o una muestra de biopsia o para evaluar la respuesta clínica a una enfermedad cardiovascular. terapéutico, por ejemplo, las construcciones BAG3 descritas anteriormente.
Ejemplos de marcadores detectables incluyen agentes radiopacos o de contraste tales como bario, diatrizoato, aceite etiodizado, citrato de galio, ácido iocármico, ácido iocetémico, yodamida, yodipamida, ácido iodoxámico, iogulamida, iohexol, iopamidol, ácido iopanoico, ácido ioprocemiante, ioprocemia. ácido, iosulamida meglumina, ácido iosemético, iotasul, ácido iotétrico, ácido iotalámico, ácido iotróxico, ácido ioxáglico, ácido ioxotrizoico, ipodato, meglumina, metrizamida, metrizoato, propiliodona y cloruro de tallo. Alternativamente o, además, el marcador detectable puede ser un marcador fluorescente, por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído y fluorescamina; un compuesto quimioluminiscente seleccionado del grupo que consiste en luminol, isoluminol, un éster de acridinio aromático, un imidazol, una sal de acridinio y un éster de oxalato; un liposoma o dextrano; o un compuesto bioluminiscente tal como luciferina, luciferasa y aequorina.
Los marcadores adecuados incluyen, por ejemplo, enzimas, ligandos de fotoafinidad, radioisótopos y compuestos fluorescentes o quimioluminiscentes. Los métodos para introducir marcadores detectables en péptidos son bien conocidos en la técnica. Los marcadores pueden agregarse durante la síntesis o post-sintéticamente. Los anticuerpos anti-BAG3 recombinantes o variantes biológicamente activas de los mismos también pueden marcarse mediante la adición de precursores marcados (por ejemplo, aminoácidos radiomarcados) al medio de cultivo en el cual se cultivan las células transformadas. En algunos casos, pueden usarse análogos o variantes de péptidos para facilitar la incorporación de marcadores detectables. Por ejemplo, cualquier residuo de fenilalanina N-terminal puede reemplazarse con un aminoácido aromático estrechamente relacionado, tal como la tirosina, que puede marcarse fácilmente con 1251. En algunas realizaciones, pueden añadirse grupos funcionales adicionales que apoyan el marcaje eficaz a los fragmentos de un anticuerpo anti-BAG3 o una variante biológicamente activa del mismo. Por ejemplo, puede añadirse un grupo 3-tributilestañobenzoílo al extremo N-terminal de la estructura nativa; el desplazamiento posterior del grupo tributiltin con 1251 generará un grupo yodobenzoílo radiomarcado.
Puede usarse cualquier método conocido en la técnica para detectar tales marcadores, por ejemplo, tomografía por emisión de positrones (PET), formación de imágenes SPECT, formación de imágenes por resonancia magnética, rayos X; o es detectable por ultrasonido.
Un método para tratar a un paciente que tiene una enfermedad o trastorno cardíaco, en donde el paciente tiene niveles reducidos de BAG3 en comparación con un nivel inicial, comprende administrar una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente inductor de BAG3 en donde el agente aumenta la expresión de la molécula BAG3.
En otros casos, un método para prevenir o tratar a un sujeto en riesgo o que padece una enfermedad o trastorno cardíaco comprende: administrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente que modula la expresión de BAG3, o un polinucleótido o polipéptido de BAG3. En casos preferentes, la enfermedad y/o trastorno cardíaco es insuficiencia cardíaca.
En otros casos, un método para tratar la insuficiencia cardíaca en un paciente comprende administrar una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente el cual modula la expresión de BAG3 o un polinucleótido o polipéptido de BAG3.
En otros casos, un método para prevenir o tratar una enfermedad o trastorno cardíaco en un sujeto comprende administrar una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente el cual modula la expresión de BAG3 o un polinucleótido o polipéptido de BAG3.
En otros casos más, un método para prevenir o tratar una enfermedad o trastorno cardíaco en un sujeto, comprende administrar una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente el cual modula la expresión de BAG3, o un polinucleótido o polipéptido de BAG3 y uno o más agentes terapéuticos recetados por el cuidador médico. En casos, al menos un agente el cual modula la expresión de BAG3 o un polinucleótido o polipéptido de BAG3 y uno o más agentes terapéuticos prescritos por el cuidador médico se administran consecutivamente o al mismo tiempo.
Diagnóstico, terapéutica, kits
Las composiciones del presente documento y los compuestos descritos pueden usarse para diagnóstico, terapéutica y profilaxis, y como reactivos de investigación y componentes de kits.
Las composiciones descritas en el presente documento son de utilidad general y diversa para el tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno cardíaco, por ejemplo, insuficiencia cardíaca o cardiomiopatía dilatada. Podemos referirnos a un sujeto, paciente o individuo indistintamente. Un sujeto se trata de forma eficaz siempre que se produzca un resultado clínicamente beneficioso. Esto puede significar, por ejemplo, una resolución completa de los síntomas de una enfermedad, una disminución de la gravedad de los síntomas de la enfermedad o una desaceleración de la progresión de la enfermedad. Estos métodos pueden incluir además los pasos de a) identificar un sujeto (por ejemplo, un paciente y, más específicamente, un paciente humano) que tiene una enfermedad o trastorno cardíaco; y b) proporcionar al sujeto una composición que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido de BAG3. El ácido nucleico que codifica el polipéptido de BAG3 puede insertarse en un vector, por ejemplo, un vector AAV, el cual se administra al sujeto. Un sujeto puede identificarse mediante el uso de pruebas clínicas estándar relacionadas con la función cardíaca, por ejemplo. Una cantidad de tal composición proporcionada al sujeto que resulte en una resolución completa de los síntomas de la infección, una disminución de la gravedad de los síntomas de la infección o una ralentización de la progresión de la infección se considera una cantidad terapéuticamente eficaz. Los presentes métodos también pueden incluir un paso de control para ayudar a optimizar la dosificación y la programación, así como para predecir el resultado. En algunos métodos de la presente invención, primero puede determinarse si un paciente tiene niveles reducidos de BAG3 y luego hacer una determinación sobre si tratar o no al paciente con una o más de las composiciones descritas en el presente documento. Los niveles de BAG3 pueden analizarse mediante el uso, por ejemplo, un anticuerpo anti-BAG3 y luego compararse con un nivel de referencia para determinar si el paciente tiene niveles elevados de BAG3. La monitorización también puede usarse para distinguir rápidamente a los pacientes que responden de los que no responden.
Los trastornos cardiovasculares susceptibles de los métodos terapéuticos y/o de pronóstico de la invención pueden ser trastornos que responden a la modulación de BAG3. Si bien creemos comprender ciertos eventos que ocurren en el curso del tratamiento, las composiciones descritas no se limitan a aquellas que funcionan al afectar cualquier mecanismo celular en particular. Cualquier forma de trastorno cardiovascular que esté asociado con una mala regulación de BAG3 está dentro del alcance de la invención.
Los métodos descritos pueden expresarse en términos de la preparación de un medicamento. Por consiguiente, la descripción abarca el uso de los agentes y composiciones descritos en el presente documento en la preparación de un medicamento. Los compuestos descritos en el presente documento son útiles en composiciones y regímenes terapéuticos o para la fabricación de un medicamento para uso en el tratamiento de enfermedades o afecciones como se describe en el presente documento (por ejemplo, un trastorno cardiovascular descrito en el presente documento).
Cualquier composición descrita en el presente documento puede administrarse a cualquier parte del cuerpo del huésped para su posterior suministro a una célula diana. Una composición puede administrarse, sin limitación, al cerebro, el líquido cefalorraquídeo, las articulaciones, la mucosa nasal, la sangre, los pulmones, los intestinos, los tejidos musculares, la piel o la cavidad peritoneal de un mamífero. En términos de vías de administración, una composición puede administrarse por inyección intravenosa, intracraneal, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intramuscular, intrarrectal, intravaginal, intratecal, intratraqueal, intradérmica o transdérmica, por administración oral o nasal, o por perfusión gradual sobre hora. En otro ejemplo, puede administrarse una preparación en aerosol de una composición a un huésped por inhalación.
La dosis requerida dependerá de la vía de administración, la naturaleza de la formulación, la naturaleza de la enfermedad del paciente, el tamaño, peso, área de superficie, edad y sexo del paciente, otros medicamentos que se administran y el criterio de los médicos que atienden. Las dosis adecuadas están en el intervalo de 0,01 a 1000 mg/kg. Se esperan grandes variaciones en la dosis necesaria en vista de la variedad de dianas celulares y las diferentes eficacias de las diversas vías de administración. Las variaciones en estos niveles de dosificación pueden ajustarse mediante el uso de rutinas empíricas estándar para la optimización, como se comprende bien en la técnica. Las administraciones pueden ser únicas o múltiples (por ejemplo, 2 o 3, 4, 6, 8, 10, 20, 50, 100, 150 o más veces). La encapsulación de los compuestos en un vehículo de administración adecuado (por ejemplo, micropartículas poliméricas o dispositivos implantables) puede aumentar la eficacia de la administración.
La duración del tratamiento con cualquier composición proporcionada en el presente documento puede ser cualquier período de tiempo desde tan corto como un día hasta tan largo como la vida útil del huésped (por ejemplo, muchos años). Por ejemplo, un compuesto puede administrarse una vez a la semana (por ejemplo, de 4 semanas a muchos meses o años); una vez al mes (por ejemplo, de tres a doce meses o durante muchos años); o una vez al año por un período de 5 años, diez años o más. También se observa que la frecuencia del tratamiento puede ser variable. Por ejemplo, los presentes compuestos pueden administrarse una vez (o dos, tres veces, etc.) al día, semanalmente, mensualmente o anualmente.
Puede administrarse una cantidad eficaz de cualquier composición proporcionada en el presente documento a un individuo que necesite tratamiento. El término "eficaz" como se usa en el presente documento se refiere a cualquier cantidad que induzca una respuesta deseada sin inducir una toxicidad significativa en el paciente. Tal cantidad puede determinarse mediante la valoración de la respuesta de un paciente después de la administración de una cantidad conocida de una composición particular. Además, el nivel de toxicidad, si lo hay, puede determinarse mediante la valoración de los síntomas clínicos de un paciente antes y después de administrar una cantidad conocida de una composición particular. Se observa que la cantidad eficaz de una composición particular administrada a un paciente puede ajustarse de acuerdo con un resultado deseado, así como la respuesta del paciente y el nivel de toxicidad. La toxicidad significativa puede variar para cada paciente en particular y depende de múltiples factores que incluyen, sin limitación, el estado de enfermedad del paciente, la edad y la tolerancia a los efectos secundarios.
Puede usarse cualquier método conocido por los expertos en la técnica para determinar si se induce una respuesta particular. Pueden usarse métodos clínicos para valorar el grado de una enfermedad en particular para determinar si se induce una respuesta. Los métodos particulares usados para evaluar una respuesta dependerán de la naturaleza del trastorno del paciente, la edad y el sexo del paciente, otros fármacos que se administran y el criterio del médico que lo atiende.
La administración concurrente de dos o más agentes terapéuticos no requiere que los agentes se administren al mismo tiempo o por la misma vía, siempre que haya una superposición en el período de tiempo durante el cual los agentes están ejerciendo su efecto terapéutico. Se contempla la administración simultánea o secuencial, al igual que la administración en diferentes días o semanas. Las composiciones también pueden administrarse con otro agente terapéutico estándar para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares.
En otro caso preferente, los agentes modulan la expresión del anthanogén-3 (BAG3) asociado a Bcl-2 en pacientes que padecen o están en riesgo de desarrollar enfermedades o trastornos asociados con moléculas o vías asociadas con BAG3. Ejemplos de tales enfermedades o trastornos asociados comprenden: enfermedades o trastornos cardíacos, enfermedades o trastornos del músculo esquelético, esclerosis múltiple, placas seniles, angiopatía amiloide cerebral, aterosclerosis, glioblastoma, depósito de amiloide, enfermedades neurodegenerativas, ovillos neurofibrilares, demencia, coriocarcinoma, astrocitoma, amiloidosis, hiperlipidemia, neurodegeneración, transformación neoplásica, cáncer de próstata, placa aterosclerótica, obstrucción, SIDA, metástasis, infarto de miocardio, fibrosis pulmonar, necrosis, shock, melanoma, carcinoma colorrectal, susceptibilidad genética, psoriasis, cáncer, inflamación, glioma, carcinoma, cáncer de mama, neuropatología, tumores, carcinoma de próstata, enfermedades vasculares, daño celular, tumores cerebrales, carcinomas de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), hipercolesterolemia. Ejemplos de enfermedades del músculo esquelético incluyen, enfermedades primarias (genéticas) de los músculos (por ejemplo, distrofias musculares y miopatías congénitas, miopatías metabólicas); enfermedades adquiridas (por ejemplo, miositis, miopatía tóxica); enfermedades secundarias del músculo (por ejemplo, atrofia neurogénica, atrofia por enfermedad crónica pulmonar, cardíaca, renal, VIH/SIDA, cáncer, sarcopenia y similares.
Kits: La presente divulgación proporciona además sistemas y kits (por ejemplo, productos comerciales terapéuticos, de diagnóstico o de investigación, mezclas de reacción, etc.) que contienen uno o más o todos los componentes suficientes, necesarios o útiles para practicar cualquiera de los métodos descritos en el presente documento. Estos sistemas y kits pueden incluir tampones, componentes de detección/formación de imágenes, reactivos de control positivo/negativo, instrucciones, software, hardware, empaque u otros componentes deseados.
Los kits proporcionan herramientas útiles para seleccionar compuestos de prueba capaces de modular los efectos de un compuesto en una molécula diana. Los kits pueden empaquetarse de cualquier manera adecuada para ayudar a los laboratorios de investigación, clínicos y de pruebas, típicamente con las diversas partes, en un recipiente adecuado junto con las instrucciones de uso.
En ciertos casos, los kits pueden comprender además lípidos y/o disolventes. En ciertos casos, los kits pueden comprender además tampones y reactivos necesarios para el procedimiento e instrucciones para llevar a cabo el ensayo. En ciertos casos, los kits pueden comprender, además, cuando sea necesario, agentes para reducir la interferencia de fondo en una prueba, reactivos de control positivo y negativo, aparatos para realizar una prueba y similares.
También se proporcionan kits para determinar si un sujeto tiene una mutación en un polipéptido de BAG3, por ejemplo, la deleción de 10 pares de bases descrita en el presente documento, para diagnosticar pacientes que tienen una enfermedad cardiovascular o una predisposición a desarrollar una enfermedad cardiovascular. Los kits también pueden usarse para controlar la eficacia de los agentes usados para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares.
Administración de composiciones
Los agentes identificados por los métodos incluidos en la presente pueden formularse y las composiciones de la invención descrita pueden administrarse junto con uno o más ingredientes activos, composiciones farmacéuticas u otros compuestos adicionales. Los agentes terapéuticos de la presente invención pueden administrarse a un animal, preferentemente a un mamífero, con la mayor preferencia a un ser humano.
En algunos casos, una composición farmacéutica comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente el cual modula la expresión de BAG3, o se administra un polinucleótido o polipéptido de BAG3 como parte del tratamiento.
En algunos casos, una composición farmacéutica comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente el cual modula la expresión de BAG3 o un polinucleótido o polipéptido de BAG3 y uno o más agentes terapéuticos prescritos por el cuidador médico.
En otros casos, una composición farmacéutica comprende al menos uno o más agentes terapéuticos candidatos incorporados en el presente documento.
Las formulaciones farmacéuticas pueden ser para administración por vía oral (sólida o líquida), parenteral (inyección intramuscular, intraperitoneal, intravenosa (IV) o subcutánea), intracardial, transdérmica (ya sea de forma pasiva o mediante ionoforesis o electroporación), transmucosa y sistémica (nasal, vaginal, rectal o sublingual) o vías de administración por inhalación, o mediante el uso de insertos bioerosionables y pueden formularse en formas de dosificación apropiadas para cada vía de administración.
Los agentes pueden formularse en portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables tales como solución salina fisiológica o una solución salina tamponada. Los portadores y diluyentes adecuados pueden seleccionarse en base al modo y la vía de administración y la práctica farmacéutica estándar. Puede encontrarse una descripción de portadores y diluyentes farmacéuticamente aceptables ilustrativos, así como formulaciones farmacéuticas, en Remington's Pharmaceutical Sciences, un texto estándar en este campo, y en USP/NF. Pueden añadirse otras sustancias a las composiciones para estabilizar y/o conservar las composiciones.
Las composiciones pueden administrarse a animales mediante cualquier técnica convencional. Las composiciones pueden administrarse directamente a un sitio objetivo mediante, por ejemplo, administración quirúrgica a un sitio objetivo interno o externo, o mediante catéter a un sitio accesible por un vaso sanguíneo. En la técnica se conocen otros métodos de administración, por ejemplo, administración o difusión de liposomas desde un dispositivo impregnado con la composición. Las composiciones pueden administrarse en un solo bolo, múltiples inyecciones o mediante infusión continúa (por ejemplo, por vía intravenosa). Para la administración parenteral, las composiciones se formulan preferentemente en forma esterilizada libre de pirógenos.
Los compuestos identificados también pueden administrarse por vía oral al paciente, de tal manera que la concentración de fármaco sea suficiente para inhibir la resorción ósea o para lograr cualquier otra indicación terapéutica, como se describe en el presente documento. Normalmente, una composición farmacéutica que contiene el compuesto se administra a una dosis oral de entre alrededor de 0,1 y alrededor de 50 mg/kg de una manera compatible con el estado del paciente. Preferentemente, la dosis oral sería de alrededor de 0,5 a alrededor de 20 mg/kg.
Una infusión intravenosa del compuesto en dextrosa al 5 % en agua o solución salina normal, o una formulación similar con excipientes adecuados, es más eficaz, aunque también es útil una inyección en bolo intramuscular. Normalmente, la dosis parenteral será de alrededor de 0,01 a alrededor de 100 mg/kg; preferentemente entre 0,1 y 20 mg/kg, de manera que se mantenga la concentración de fármaco en el plasma a una concentración eficaz para aumentar la expresión de BAG3. Los compuestos pueden administrarse de una a cuatro veces al día a un nivel para lograr una dosis diaria total de alrededor de 0,4 a alrededor de 400 mg/kg/día. La cantidad precisa de un compuesto que es terapéuticamente eficaz, y la ruta por la cual tal compuesto se administra mejor, la determina fácilmente un experto en la técnica mediante la comparación del nivel en sangre del agente con la concentración requerida para tener un efecto terapéutico. Los profármacos de compuestos pueden prepararse mediante cualquier método adecuado.
No se esperan efectos toxicológicos inaceptables cuando se administran compuestos, derivados, sales, composiciones, etc., de acuerdo con la presente divulgación. Los compuestos, los cuales pueden tener una buena biodisponibilidad, pueden probarse en uno de varios ensayos biológicos para determinar la concentración de un compuesto que se requiere para tener un efecto farmacológico dado.
En otro caso preferente, se proporciona una composición farmacéutica o veterinaria que comprende uno o más compuestos identificados y un vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable. También pueden estar presentes otros materiales activos, según se considere apropiado o aconsejable para la enfermedad o afección que se está trata o se previene.
El portador, o, si está presente más de uno, cada uno de los portadores, debe ser aceptable en el sentido de ser compatible con los demás ingredientes de la formulación y no perjudicial para el receptor.
Los compuestos identificados por los métodos en el presente documento serían adecuados para su uso en una variedad de sistemas de administración de fármacos descritos anteriormente. Además, para mejorar el tiempo de vida media en suero in vivo del compuesto administrado, los compuestos pueden encapsularse, introducirse en el lumen de los liposomas, prepararse como coloide, o pueden emplearse otras técnicas convencionales que proporcionen a los compuestos un tiempo de vida media extendido en suero. Están disponibles una variedad de métodos para preparar liposomas, como se describe en, por ejemplo, Szoka, y otros, Patente de EE. UU. Nos.
4.235.871,4.501.728 y 4.837028. Además, puede administrarse el fármaco en un sistema de suministro de fármaco dirigido, por ejemplo, en un liposoma recubierto con un anticuerpo específico de tejido. Los liposomas se direccionarán al órgano y serán absorbidos selectivamente.
Las formulaciones incluyen aquellas adecuadas para administración rectal, nasal, tópica (incluyendo bucal y sublingual), vaginal o parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa e intradérmica), pero preferentemente la formulación es una formulación administrada por vía oral. Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, comprimidos y cápsulas de liberación sostenida, y pueden prepararse mediante cualquier método bien conocido en la técnica de la farmacia.
Tales métodos incluyen la etapa de asociar el agente activo definido anteriormente con el vehículo. En general, las formulaciones se preparan mediante la asociación uniforme e íntima del agente activo con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos o ambos, y luego, si es necesario, darle forma al producto.
El compuesto identificado mediante el uso de estos métodos puede formularse de acuerdo con métodos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, por lo que el compuesto se combina en una mezcla con un vehículo portador farmacéuticamente aceptable. Las formulaciones terapéuticas se preparan para el almacenamiento al mezclar el ingrediente activo que tiene el grado de pureza deseado con portadores, excipientes o estabilizadores fisiológicamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de alrededor de 10 residuos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tal como polivinilpirrolidona, aminoácidos como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes como EDTA; alcoholes de azúcar como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sal como el sodio; y/o surfactantes no iónicos tales como TWEEN™ (ICI Americas Inc., Bridgewater, NJ), PLURONICS™ (BASF Corporation, Mount Olive, NJ) o PEG.
Las formulaciones que se usarán para la administración in vivo deben ser estériles y libres de pirógenos. Esto se logra fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles, antes o después de la liofilización y reconstitución.
Las dosis y concentraciones de fármaco deseadas de las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variar dependiendo del uso particular previsto. La determinación de la dosis o la vía de administración apropiada está dentro de la habilidad de un médico ordinario. Los experimentos con animales proporcionan una guía confiable para la determinación de las dosis eficaces para la terapia humana. La escala entre especies de las dosis efectivas puede realizarse al seguir los principios establecidos por Mordenti, J. y Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" en Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi y otros, Eds., Pergamon Press, Nueva York 1989, págs.42-96.
Las formulaciones para administración oral pueden presentarse como: unidades discretas tales como cápsulas, sellos o comprimidos que contienen cada uno una cantidad predeterminada del agente activo; como polvo o gránulos; como una solución o suspensión del agente activo en un líquido acuoso o un líquido no acuoso; o como una emulsión líquida de aceite en agua o una emulsión líquida de agua en aceite; o como un bolo, etc.
Para composiciones para administración oral (por ejemplo, comprimidos y cápsulas), el término "portador aceptable" incluye portadores tales como excipientes comunes, por ejemplo, agentes aglutinantes, por ejemplo, jarabe, goma arábiga, gelatina, sorbitol, tragacanto, polivinilpirrolidona (povidona), metilcelulosa, etilcelulosa, sodio. carboximetilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, sacarosa y almidón; cargas y vehículos, por ejemplo, almidón de maíz, gelatina, lactosa, sacarosa, celulosa microcristalina, caolín, manitol, fosfato dicálcico, cloruro de sodio y ácido algínico; y lubricantes tales como estearato de magnesio, estearato de sodio y otros estearatos metálicos, estearato de glicerol, ácido esteárico, fluido de silicona, ceras de talco, aceites y sílice coloidal. También pueden usarse agentes aromatizantes tales como menta, aceite de gaulteria, aroma de cereza y similares. Puede ser deseable añadir un agente colorante para que la forma de dosificación sea fácilmente identificable. Los comprimidos también pueden recubrirse mediante métodos bien conocidos en la técnica.
Una tableta puede prepararse por compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Las tabletas comprimidas pueden prepararse al comprimir en una máquina adecuada el agente activo en una forma fluida tal como un polvo o gránulos, opcionalmente mezclado con un aglutinante, lubricante, diluyente inerte, conservante, agente surfactante o dispersante. Los comprimidos moldeados pueden prepararse al moldear en una máquina adecuada una mezcla del compuesto en polvo humedecido con un diluyente líquido inerte. Los comprimidos pueden recubrirse o ranurarse opcionalmente y pueden formularse para proporcionar una liberación lenta o controlada del agente activo.
Otras formulaciones adecuadas para la administración oral incluyen pastillas que comprenden el agente activo en una base aromatizada, normalmente sacarosa y goma arábiga o tragacanto; pastillas que comprenden el agente activo en una base inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y goma arábiga; y enjuagues bucales que comprenden el agente activo en un vehículo líquido adecuado.
Las formulaciones parenterales generalmente serán estériles.
Dosis: Se administra una dosis eficaz de una composición de la materia objeto actualmente descrita a un sujeto que la necesita. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" o una "cantidad terapéutica" es una cantidad de una composición terapéutica suficiente para producir una respuesta medible (por ejemplo, una respuesta biológica o clínicamente relevante en un sujeto que está siendo tratado). La respuesta puede medirse de muchas formas, como se discutió anteriormente, por ejemplo, perfiles de citocinas, tipos de células, moléculas de superficie celular, etc. Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos en las composiciones de la materia descrita actualmente pueden variarse para administrar una cantidad de (los) compuesto(s) activo(s) eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un sujeto particular. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de la actividad de la composición terapéutica, la vía de administración, la combinación con otros fármacos o tratamientos, la gravedad de la afección que se trata y la afección y el historial médico previo del sujeto que se trata. Sin embargo, está dentro del conocimiento de la técnica comenzar con las dosis del compuesto a niveles más bajos que los requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosis hasta lograr el efecto deseado. La potencia de una composición puede variar y, por lo tanto, una "cantidad eficaz para el tratamiento" puede variar. Sin embargo, al usar los métodos de ensayo descritos en el presente documento, un experto en la técnica puede valorar fácilmente la potencia y eficacia de un compuesto candidato de la materia objeto actualmente descrita y ajustar el régimen terapéutico en consecuencia.
La invención se ha descrito en detalle con referencia a realizaciones preferentes de la misma. Sin embargo, se apreciará que los expertos en la técnica, al considerar esta descripción, pueden realizar modificaciones y mejoras dentro del espíritu y alcance de la invención.
Al citar varias referencias en el presente documento, los solicitantes no admiten ninguna referencia particular como "técnica anterior" a su invención.
Ejemplos
Si bien se han descrito anteriormente varias realizaciones de la presente invención, debe entenderse que se han presentado solo a modo de ejemplo, y no de limitación. Los siguientes ejemplos no limitantes son ilustrativos de la invención.
Ejemplo 1: Los cambios en los niveles de proteína BAG3 están asociados con la cardiomiopatía dilatada familiar y no familiar
Las mutaciones en el anthanogén-3 asociado a Bcl-2 (BAG3), una proteína antiapoptótica de 575 aminoácidos que sirve como cochaperona de las proteínas de choque térmico (HSP), se han asociado con FDC (Selcen D, y otros, Annals of Neurology. 2009;65:83-89; Odgerel Z, y otros, Trastornos neuromusculares: NMD. 2010; 20: 438-442; Lee HC y otros, Clinical Genetics. 2012;81:394-398). Por ejemplo, Norton y otros recientemente identificó una deleción del exón 4 de BAG3 como una variante rara causante de FDC en una familia sin neuropatía o debilidad muscular periférica (Norton N, y otros, American Journal of Human Genetics. 2011;88:273-282). La secuenciación posterior de BAG3 en sujetos diagnosticados con IDC identificó cuatro mutaciones adicionales que se segregaron con todos los familiares afectados por la enfermedad. Un estudio de asociación de todo el genoma realizado en pacientes con HF secundaria a IDC implicó un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) no sinónimo (c.757T> C, [p. Cysl51Arg]) ubicado dentro del gen BAG3 como contribuyente a la cardiomiopatía dilatada esporádica (Villard E, y otros, European Heart Journal. 2011;32:1065-1076).
En el presente estudio, se identificó una nueva mutación de BAG3 en una familia con FDC de inicio en la adultez. Además, se informa en el presente documento, por primera vez, que los niveles de proteína BAG3 disminuyen significativamente en pacientes no emparentados con IDC no familiar, lo que demuestra que los niveles alterados de proteína BAG3 pueden participar en la progresión de la IC.
Materiales y métodos
Materiales: Se identificó una familia con cardiomiopatía dilatada familiar de inicio en la adultez. Después de obtener el consentimiento informado, los familiares participantes se sometieron a un examen físico por parte de un cardiólogo de insuficiencia cardíaca y se extrajo sangre para un posterior análisis de ADN. El ADN se extrajo mediante el uso de un kit de extracción de ADN (Qiagen, Valencia CA) y se almacenó a -70 °C. Siempre que fue posible, se obtuvieron electrocardiogramas de los familiares afectados que no se habían sometido a un trasplante de corazón. Los familiares que no se habían sometido a un ecocardiograma reciente se sometieron a un ecocardiograma transtorácico mediante el uso de un sistema ecocardiográfico portátil SonoHeart Elite (SonoSite Inc, Bothell, Washington, EE. UU.). Se obtuvieron registros médicos de una persona que había fallecido. El estado de afecto se determinó sobre la base de las pautas de consenso (Mestroni L, y otros, European Heart Journal. 1999; 20: 93-102). Los familiares participantes proporcionaron su consentimiento informado por escrito antes de la evaluación y los protocolos se aprobaron por las Juntas de Revisión Interna de la Universidad Thomas Jefferson y la Universidad de Colorado.
Métodos: Se obtuvo tejido cardíaco humano de 9 sujetos no relacionados con la familia de estudio con insuficiencia cardíaca en etapa terminal sometidos a trasplante cardíaco en el Hospital de la Universidad de Temple (6 hombres, 3 mujeres, edad media 47,6 5,7 años), de un miembro de la familia afectado en el momento del trasplante de corazón en la Universidad de Colorado y de 7 donantes de órganos (1 hombre, 6 mujeres, edad media 59,3 ± 3,7 años) cuyos corazones no eran aptos para la donación debido a incompatibilidad de tipo sanguíneo, edad o tamaño. Todos los pacientes sometidos a trasplante presentaban disfunción ventricular izquierda grave y dilatación cardíaca con una fracción de eyección ventricular izquierda (FEVI) media del 12,8 1,4 %. Dos de los trasplantados tenían HF secundaria a cardiomiopatía isquémica y el resto tenía CDI no isquémica. Cuatro de los receptores de trasplantes recibían dobutamina sola, 5 recibían milrinona sola y uno recibía tanto milrinona como dobutamina en el momento del trasplante. Se realizó ecocardiografía a todos los donantes de órganos antes de la donación de órganos y todos tenían función ventricular izquierda normal por ecocardiografía con una FEVI media de 57,5 1,6 %. Se extrajeron alícuotas de tejido de la pared libre del ventrículo izquierdo, se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -70 °C, como se describió anteriormente (Bristow MR, y otros, The Journal of Clinical Investigation. 1993; 92:2737-2745). Las Juntas de Revisión Institucional de la Universidad de Colorado y la Universidad de Temple aprobaron el estudio de tejidos y se obtuvo el consentimiento de todos los sujetos.
Secuenciación del exoma y bioinformática: se seleccionó el ADN de 5 miembros de la familia afectados y 1 miembro de la familia no afectado para la secuenciación del exoma con una profundidad objetivo de > 100X. El enriquecimiento del exoma se realizó mediante el uso del kit Agilent SureSelect Human Exon 51Mb (Agilent, Santa Clara, CA). La secuenciación del exoma de 100 nucleótidos de extremos emparejados se realizó mediante el uso de una plataforma Illumina HiSeq 2000 (San Diego, CA). Las lecturas de secuencia que pasaron el Illumina chastity filter se sometieron a un paso de filtrado de calidad, se recortaron y se conservaron si las lecturas recortadas de cada par superaban los 50 nucleótidos. A continuación, se asignaron lecturas emparejadas a la secuencia del genoma humano de referencia (hg19) con gSNAP (Wu TD, y otros, Bioinformatics. 2010; 26:873-881). Se realizaron llamadas de secuencia para variantes (polimorfismos de un solo nucleótido[SNP)], inserciones y deleciones[indels]) mediante el uso del Broad's Genome Analysis Tool kit (McKenna A, y otros, Genome Research. 2010;20:1297-1303).
Después de la detección de variantes, se usó el programa Annotate Variation (ANNOVAR) para clasificar variantes (por ejemplo, exónica, intrónica, sinónima, no sinónima, variante de empalme, parada de ganancia, parada de pérdida, inserción o supresión) y para hacer referencias cruzadas de todas las variantes a través de varias bases de datos de variación genética (por ejemplo, dbSNP, base de datos de 1000 genomas, AVSIFT) para aislar variantes raras (variantes con frecuencias de alelos medias de < 1 % no encontradas en dbSNP, base de datos de 1000 genomas, aVSIFT) (Wang K, y otros, Nucleic Investigación de ácidos. 2010;38:e164). Solo los cambios no sinónimos (SNP e in-dels), aquellos que causan un sitio de empalme alternativo y/o un codón de terminación aberrante, se consideraron para un análisis adicional. Para los cambios no sinónimos, todas las variantes de inserción y deleción se consideraron dañinas, mientras que las variantes de SNP se hicieron referencias cruzadas a la base de datos dbNSFP para determinar si los cambios en la estructura de la proteína se considerarían tolerables o dañinos mediante el uso de cuatro algoritmos (Separación de intolerantes de los tolerantes (SIFT), PolyPhen2, likelihood ratio test [LRT] o MutationTaster) (Liu X, y otros, Human Mutation. 2011;32:894-899). Las supuestas mutaciones identificadas se confirmaron con la secuenciación tradicional de Sanger en miembros de la familia afectados y no afectados (cebadores y condiciones disponibles a pedido).
Análisis por transferencia Western del tejido cardíaco humano: Se homogeneizó tejido congelado en tampón Tris 40 mM, pH 7,5 que contenía NaCl 150 mM, NP40 al 1 %, DTT 1 mM y EDTA 1 mM. Luego, la muestra se centrifugó a 10000 x g a 4 °C durante 30 min y el sobrenadante se recogió y se resuspendió en tampón Tris 350 pM, pH 6,8 que contenía 25 % de betamercaptoetanol, 30 % de glicerol, 10 % de SDS y 2 % de azul de bromofenol. La concentración de proteína se midió mediante el uso del método de Bradford y las muestras se almacenaron a -80 °C. Se fraccionaron cantidades iguales de proteína (10 pg) mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon en leche en polvo descremada al 10 %/solución salina tamponada con tris (pH 7,6) más Tween-20 al 0,1 % (TBS-T) durante 1 h y luego se incubaron con anticuerpo policlonal BAG3 (Proteintech, Chicago, IL) en solución descremada al 5 % en leche en polvo con PBST durante 2 horas. A continuación, las membranas se incubaron con anticuerpo secundario de cabra-anti-conejo 800 y de cabra-anti-ratón durante 1 hora y se escanearon en un sistema de formación de imágenes LI-COR Odyssey (Lincoln NE). Todos los procedimientos de transferencia Western se llevaron a cabo a temperatura ambiente. La intensidad de la señal de BAG3 se normalizó a GAPDH.
Resultados
Antecedentes familiares: el probando (Figura 1, III-5) era una mujer de 65 años de ascendencia de Europa del Este que fue remitida en junio de 2003 a la clínica de insuficiencia cardíaca de la Universidad Thomas Jefferson debido a antecedentes familiares de IC. Se notó por primera vez que tenía una cardiomiopatía dilatada a los 45 años de edad. Estuvo mayormente asintomática mientras recibía un diurético, un antagonista del receptor p-adrenérgico (P-bloqueante) y un inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina (ACE). Sus signos vitales estaban dentro de los límites normales y su examen físico fue notable solo por un suave sonido cardíaco S3. No tenía debilidad de los músculos periféricos y su examen neurológico no presentaba complicaciones. Su electrocardiograma reveló ritmo sinusal normal con leve hipertrofia del VI y cambios inespecíficos de la onda ST-T. Su fracción de eyección del ventrículo izquierdo fue del 20 % por ecocardiografía. Como se observa en la Figura 1 y la Tabla 1, el probando tenía dos hermanas, una de las cuales (III-7) estaba asintomática con un examen físico normal; sin embargo, su fracción de eyección por ecocardiografía fue del 44 %. Una segunda hermana (III-9) era fenotípicamente normal y tenía un ecocardiograma normal.
El probando tuvo tres hijos. Un hijo fue sometido a un trasplante cardíaco a la edad de 20 años secundario a CID (IV-5), un segundo hijo fue diagnosticado con cardiomiopatía dilatada idiopática a la edad de 20 años, pero permaneció asintomático a los 32 años a pesar de una fracción de eyección del 33 % (IV-4). Una hija no tenía síntomas cardíacos; sin embargo, su fracción de eyección del ventrículo izquierdo por ecocardiografía era del 48 % y tenía una dilatación leve del ventrículo izquierdo y la raíz aórtica sin una valvulopatía aórtica evidente. (IV-6) Su ecocardiograma cumplió los criterios para el diagnóstico de una cardiomiopatía dilatada. Su electrocardiograma fue normal. La función neurológica fue normal en los tres niños. La hermana afectada del probando (III-7) tuvo una hija que murió de insuficiencia cardíaca progresiva secundaria a CDI a la edad de 22 años. (IV-7): otros dos niños tenían ecocardiogramas normales. Un primo se sometió a un trasplante cardíaco por IDC a los 42 años de edad después del diagnóstico a la edad de 40 (III-1) y uno de sus hijos también se sometió a un trasplante cardíaco por IDC en la Universidad de Colorado a la edad de 30 (IV-1). Los sujetos sanos se definieron como "no afectados" si habían alcanzado la edad de 40 años sin síntomas y tenían un ecocardiograma normal que no cumplía los criterios para el diagnóstico de una cardiomiopatía. El seguimiento de diez años de todos los participantes demostró que la capacidad funcional se había mantenido estable en todos los miembros de la familia.
Análisis genético: como se ve en la Figura 1, el pedigrí y los datos clínicos fueron compatibles con la IDC familiar autosómica dominante de inicio en la adultez. La secuenciación del exoma del ADN de 5 miembros de la familia afectados (III-5, 7: IV-1,4,5) y 1 no afectado (III-9) tuvo un promedio de 11,8 ± 0,96 Gb de lecturas de secuencia de filtro anterior por muestra. Después del filtrado bioinformático, se observó una deleción de 10 nucleótidos en la porción codificante del exón 4 de BAG3 (Ch10: del 121436332_12143641: del. 1266_1275[NM 004281]) que estaba presente en todos los sujetos afectados probados y ausente en la única hermana sana del probando (III-9) (Figura 2). Se analizaron miembros adicionales de la familia para determinar la deleción de BAG3 mediante secuenciación de Sanger, lo que confirmó la cosegregación apropiada de la deleción con el fenotipo entre los afectados (111-1,5,7 y IV-1,4,5,6) y los individuos no afectados (III-9 y IV-8,9,10,11,12). Esta deleción no se encontró en las bases de datos existentes e introduce un cambio de marco y un codón de parada prematuro después de 13 aminoácidos que predice el truncamiento de BAG3 en el extremo carboxi terminal en 140 aminoácidos. Por tanto, se predice que la proteína BAG3 anormal tiene 435 aminoácidos en lugar de 575 aminoácidos. Además, se predice que la secuencia de aminoácidos distal a la deleción (KPSWRRYRGWSRL) es diferente de la que se encuentra en la proteína normal. Solo se encontró una variante adicional mediante la secuenciación del exoma y después del filtrado bioinformático. La variante (rs8192669), que se encuentra en el gen IKZF5, no se segrega de acuerdo con el fenotipo IDC en otros miembros de la familia. Un análisis de 52 genes previamente asociados con IDC monogénico para variantes raras (< 1 %) identificó solo mutaciones no sinónimas en TTN, GATADI, MYPN, ANKRD1 y RBM20: ninguna de estas variantes segregó con el fenotipo de la enfermedad.
Expresión de BAG3 en el corazón humano defectuoso: para determinar si la deleción de BAG3 (BAG3 del. n M_004281) encontrada en esta cohorte de pacientes resultó en una disminución en los niveles de proteína BAG3, se realizó un análisis de transferencia Western en el músculo cardíaco obtenido de una familia afectada miembro (IV-1) que se sometió a un trasplante cardíaco. El nivel de proteína BAG3 en el sujeto IV-1 fue menos de la mitad del observado en el tejido cardíaco obtenido de donantes de órganos cuyo corazón no se pudo usar para trasplante. Como se ve en las Figuras 3A y 3B, los niveles de BAG3 en el corazón humano con insuficiencia de pacientes con insuficiencia cardíaca en etapa terminal sin mutaciones BAG3 conocidas fueron significativamente (p = 0,0002) menores que los encontrados en corazones de control que no fallaban. Por tanto, parece que pueden encontrarse niveles reducidos de proteína BAG3 tanto en individuos con una mutación BAG3 como en el corazón humano con insuficiencia en etapa terminal.
Discusión
Cada vez se reconoce más que las mutaciones genéticas pueden representar hasta un tercio de los casos de IDC. De hecho, los investigadores han comenzado a referirse a estos casos como cardiomiopatía dilatada familiar (FDC). La herencia puede ocurrir de diversas formas, siendo el patrón de herencia más común el autosómico dominante. Las mutaciones se encuentran con mayor frecuencia en genes que codifican el sarcómero y provocan disfunción cardíaca, desintegración de la estructura de miofibras y acumulación de material degradado en gránulos autofágicos. Aquí, se informa que una deleción de 10 pb en el gen que codifica la proteína sarcomérica BAG3 se segrega completamente con los individuos afectados en una familia con un patrón autosómico dominante de FDC. También se informa por primera vez que la proteína BAG3 se reduce sustancialmente en los corazones de pacientes no relacionados que se someten a un trasplante de corazón en comparación con los corazones normales de los receptores de trasplantes.
BAG3 es una proteína antiapoptótica de 575 aminoácidos que se expresa constitutivamente en el corazón y sirve como cochaperona de las proteínas de choque térmico (HSP). BAG3 se une a las HSP y regula su capacidad para acompañar a las proteínas del citoesqueleto, incluida la desmina, y también participar en la degradación de las proteínas celulares a través de las vías del proteasoma o de la autofagia. BAG3 también protege a las células de la muerte apoptótica e inhibe la degeneración miofibrilar en respuesta al estrés mecánico. La modulación negativa de BAG3 en el pez cebra o en cardiomiocitos neonatales, o la interrupción homocigótica de BAG3 en ratones, conduce a disfunción cardíaca y los niveles de BAG3 disminuyen en el músculo esquelético de ratas espontáneamente hipertensas.
Los resultados del presente estudio en una gran familia con FDC son consistentes con informes anteriores que demostraron una asociación entre mutaciones en BAG3 y el desarrollo de patología muscular. Se demostró por primera vez que las mutaciones en BAG3 causaban una función muscular anormal en dos familias con distrofia muscular de inicio en la infancia (Selcen D, y otros., Annals of Neurology. 2009;65:83-89; Odgerel Z, y otros, Trastornos neuromusculares: NMD. 2010;20:438-442) y el fenotipo de IDC, fibrosis miocárdica difusa y muerte súbita se relacionó con marcadores en la región del cromosoma 10q25-26 que incluye el locus BAG3. Estudios más recientes han demostrado una relación causal entre las mutaciones de BAG3 y el desarrollo de FDC sin debilidad muscular periférica o hallazgos neurológicos (Norton N, y otros, American Journal of Human Genetics. 2011;88:273-282; Villard E, y otros, European Heart Journal. 2011;32:1065-1076; Arimura T, y otros, Human Mutation. 2011; 32:1481-1491).
Como se vio con las variantes genéticas en otros genes sarcoméricos, hubo una heterogeneidad genética sustancial dentro de esta gran familia. Por ejemplo, uno de los hijos del probando tuvo un inicio temprano de enfermedad grave que requirió trasplante, mientras que un hermano con enfermedad moderada y una hija de mediana edad con enfermedad muy leve permanecen asintomáticos durante más de una década. De hecho, la disfunción cardíaca en la hija del probando no habría sido reconocida si no hubiera sido por un fenotipado cuidadoso como parte de este estudio. La identificación de la mutación causal en esta familia brinda la oportunidad de realizar pruebas genéticas basadas en guías y asesorar a los miembros de la familia y la identificación temprana de las personas afectadas. El hallazgo de que el uso de un inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina mejoró la supervivencia en un pequeño grupo de pacientes con distrofia muscular de Duchenne sugiere que la terapia temprana en familias con mutaciones en los genes del sarcómero podría ser beneficiosa; sin embargo, se requerirán estudios adicionales para definir las mejores estrategias de tratamiento.
Se informa en el presente documento, por primera vez, que el nivel de proteína BAG3 se reduce significativamente en los corazones de pacientes no emparentados con HF en etapa terminal que se someten a un trasplante de corazón y que no tienen antecedentes familiares de enfermedad del músculo cardíaco. Este hallazgo es interesante ya que evidencia que, si bien las mutaciones en BAG3 pueden ser causantes de enfermedad en FDC, los cambios en los niveles de proteína BAG3 pueden participar en la progresión de la enfermedad en pacientes con formas no familiares de IDC. No obstante, estos resultados evidencian que la proteína BAG3 podría ser un nuevo objetivo para la intervención terapéutica en la HF.
Ejemplo 2: Cambios en los niveles de la proteína BAG3 en corazones murinos defectuosos
Los ratones c57BL/6 salvajes se sometieron a bandas transaórticas (TAC) como se describe en Tilley y otros (Circulation 2014, 11 de noviembre; 130(20): 1800-11). Dieciocho semanas después del TAC, se midió la contractilidad del ventrículo izquierdo mediante el uso de un catéter de conductancia insertado en el ventrículo izquierdo a través de un abordaje carotídeo, como se describió anteriormente. La contractilidad se midió durante la infusión intravenosa de dosis crecientes de catecolamina. (Figura 6B) Se calcularon las relaciones entre el peso del corazón y el peso corporal después del sacrificio. (Figura 6A). Luego, los corazones se congelaron para la medición posterior de los niveles de BAG3. Las proteínas del miocardio se extrajeron como se describe en el Ejemplo 1, se separaron mediante electroforesis en gel y se sondaron con un anticuerpo BAG3 murino. Como se muestra en la Figura 6C, hubo una disminución significativa en los niveles de BAG3 por transferencia Western en ratones TAC en comparación con controles operados de forma simulada. En la Figura 6D se muestra una transferencia Western representativa.
Ejemplo 3: Cambios en los niveles de proteína BAG3 en corazones porcinos luego de la oclusión con balón
Se midieron los índices hemodinámicos y los niveles de BAG3 en el miocardio del ventrículo izquierdo no infartado de un cerdo 4 semanas después de la oclusión con balón de la arteria coronaria descendente anterior izquierda. Como se muestra en 7A, 7B, 7C y 7D, la fracción de eyección, el acortamiento fraccional, el volumen telediastólico y el volumen telediastólico, respectivamente, se alteraron significativamente después de la oclusión con balón. Como se muestra gráficamente en la Figura 7E, y en la transferencia Western en la Figura 7F, los niveles de BAG3 se redujeron en corazones porcinos después de la oclusión con balón.
Tabla 1: Fenotipo de los sujetos de estudio con y sin deleción de 10 nucleótidos en el gen BAG3.
Sujeto Age Ge; Género EF (%) ECG Mutación Comentario Evaluación/Inicio/Muerte o
Trasplante
II-1 na/na/70+ M Murió a finales de los 70, diagnóstico de HF II-3 na/na/80 F Diagnóstico de HBP y CVA II-4 na/na/29 M accidente de vehículo motorizado
III-1 62/40/42 M Si trasplante a los 42 III-5 65/45/na F 20 Cambios Si
NS-ST-T
III-7 67/47/na F 44 nl Si asintomático
III-9 68/na/na F 58 nl No
IV-1 30/30/30 M Si trasplante a los 30 IV-4 39/20/na M 33 seno Si asintomático bradicardia,
IVCD
IV-5 35/20/20 M Si trasplante a los 20 IV-6 34/34/na F 48 nl Si dilatación leve de la raíz aórtica, LVDD 5,8 IV-7 na/18/22 F murió -empeoramiento de la insuficiencia cardíaca IV-8 38 F nl No
IV-9 42 M nl No
IV-10 41 F nl No
IV-11 44 M nl No
IV-12 45 M nl No

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un vector de expresión que codifica un péptido o polipéptido de atanogén 3 asociado a BCL2 (BAG3) para su uso en el tratamiento de la insuficiencia cardíaca o el riesgo de insuficiencia cardíaca.
2. El vector de expresión para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el vector de expresión comprende un vector viral, un plásmido o un vector de levadura, en donde el vector viral comprende un vector de adenovirus, un vector de virus adenoasociado (AAV), un vector de virus coxsackie, un vector de citomegalovirus, un vector de virus de Epstein-Barr, un vector de parvovirus o un vector de virus de hepatitis.
3. El vector de expresión de AAV para su uso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el serotipo de la cápside de Aa V se selecciona del grupo que consiste de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 y AAV9.
4. El vector de expresión para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el vector expresa el péptido o polipéptido de BAG3 en tejidos cardíacos.
5. El vector de expresión para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el vector de expresión aumenta la expresión del péptido o polipéptido de BAG3 en una célula o tejido en comparación con un control de línea base.
6. El vector de expresión para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la insuficiencia cardíaca es el resultado de una enfermedad cardíaca, una infección viral, una herida o un tumor.
7. El vector de expresión para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la enfermedad cardíaca es cardiomiopatía dilatada idiopática, cardiomiopatía dilatada idiopática causada por una mutación en un gen del atanogén 3 (BAG3) asociado a BCL2, cardiomiopatía hipertrófica, cardiomiopatía dilatada, aterosclerosis, enfermedad de las arterias coronarias, cardiopatía isquémica, cardiopatía no isquémica, miocarditis, cardiopatía hipertensiva, enfermedad valvular, cardiopatía congénita, infarto de miocardio o insuficiencia cardíaca congestiva.
8. El vector de expresión para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la mutación en un gen del atanogén 3 asociado a BCL2 (BAG3) reduce el nivel de proteína del atanogén 3 asociado a BCL2 (BAG3).
9. El vector de expresión para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la enfermedad cardíaca es una cardiomiopatía dilatada familiar.
10. El vector de expresión para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la enfermedad cardíaca es una cardiomiopatía dilatada no familiar.
11. El vector de expresión para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la insuficiencia cardíaca es insuficiencia cardíaca con fracción de eyección reducida.
12. El vector de expresión para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el riesgo de insuficiencia cardíaca resulta de cardiomiopatía no isquémica, cardiomiopatía isquémica, regurgitación de la válvula mitral, o estenosis o regurgitación aórtica.
13. El vector de expresión para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el vector de expresión está comprendido en una composición farmacéutica.
14. El vector de expresión para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el vector de expresión comprende además un promotor específico cardíaco flanqueado por una o más secuencias de repetición terminal invertida (ITR).
15. Un método para diagnosticar o identificar a un paciente en riesgo de desarrollar cardiomiopatía dilatada idiopática que comprende:
medir el nivel de polipéptidos o polinucleótidos de atanogén 3 (BAG3) asociado a BCL2 en una muestra biológica obtenida de un paciente, en donde la detección de niveles disminuidos de BAG3 en la muestra biológica, en comparación con controles sanos normales, es el diagnóstico de una enfermedad o trastorno cardíaco.
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