ES2832998T3 - Agente bacteriostático y formulaciones biocidas - Google Patents

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Abstract

Agente bacteriostático y formulaciones biocidas. Se describe un agente bacteriostático libre de conservantes que contiene una disolución acuosa de un poliol y un agente dispersante. La proporción poliol/ agente dispersante está comprendida entre 30: (peso/peso) y 110:1 (peso/peso). El agente bacteriostático es utilizando como diluyente formulaciones biocidas respetuosas como el medio ambiente.

Description

DESCRIPCIÓN
Agente bacteriostático y formulaciones biocidas
Campo técnico de la invención
La invención se refiere a formulaciones biocidas con un agente bacteriostático. El agente bacteriostático contiene una solución acuosa de un poliol y un agente dispersante, en donde la proporción de poliol/agente dispersante está comprendida entre 30:1 (peso/peso) y 110:1 (peso/peso).
Antecedentes de la invención
En los últimos años, ha habido un interés por desarrollar productos fitosanitarios respetuosos con el medio ambiente que no contengan componentes tóxicos para el ser humano ni para el ecosistema, desarrollándose biocidas verdes. Diferentes familias, especies y cepas de bacterias con actividad biocida, tales como Bacillus spp., Pseudomonas spp. o levaduras, por ejemplo, destacan entre los biocidas verdes. También se ha descrito la actividad biocida de diferentes proteínas con propiedades insecticidas tales como, por ejemplo, las cistatinas.
Las cepas de bacterias y de levaduras se almacenan en esporas adsorbidas en sustratos inertes, tal como el caolín, sílice, zeolitas, óxidos de zinc, arcillas, tierra de diatomeas, polisacáridos o carbonatos. Las proteínas también se inmovilizan en sustratos inertes.
Para usar los microorganismos en formulaciones líquidas, es necesario formular una suspensión estable, es decir, una suspensión en la que, con el tiempo, no se produzcan separaciones o precipitaciones del material inerte.
Se sabe que las soluciones acuosas deben contener agentes bacteriostáticos o conservantes para evitar la contaminación microbiana. Se conoce el uso de parabenos, azidas o isotiazolinas para este fin. Sin embargo, estos productos son tóxicos y contaminantes medioambientales y, por lo tanto, no son adecuados para su uso en "agentes fitosanitarios/biocidas verdes".
A su vez, se sabe que los agentes fitosanitarios descritos en el estado de la técnica son nocivos para la salud debido a la presencia de agentes conservantes y agentes biocidas tóxicos. La aplicación de agentes fitosanitarios requiere tomar las precauciones necesarias para evitar el envenenamiento del operador: gafas, guantes y la aplicación del producto a favor del viento.
Basándose en lo anterior, las formulaciones líquidas que comprenden material biológico tienen diferentes inconvenientes:
- las soluciones deben ser homogéneas y, con el tiempo, no deben mostrar separación de fases;
- las formulaciones deben mantener su actividad biocida a lo largo del tiempo, es decir, el microorganismo o la proteína debe ser viable durante al menos dos años;
- las formulaciones no deben contaminarse con microorganismos exógenos sin usar agentes bactericidas o conservantes.
El experto en la materia conoce la existencia de agentes dispersantes que garantizan la estabilidad de las suspensiones, pero los agentes dispersantes son incompatibles con la viabilidad posterior de las bacterias. Además, el contenido de agua es un factor fundamental; una baja concentración de agua no garantiza una homogeneización adecuada de las suspensiones, produciéndose la precipitación de los excipientes o vehículos de las bacterias y, además, el contenido excesivo de agua acelerará la contaminación microbiana de las formulaciones por parte de otras especies de bacterias u hongos.
Los documentos WO200624095, CN101048136, CA110384 y US2006270745 desvelan composiciones que comprenden soluciones que comprenden polioles y agentes dispersantes que se usan para formular emulsiones y microemulsiones de aceite/agua (O/W, Oil/Water).
El documento ES 2370561 desvela suspensiones con actividad biocida en glicerina con al menos el 60 % en peso, que se usan en las formulaciones de productos fitosanitarios. Estas suspensiones contienen agentes dispersantes, pero para evitar la contaminación microbiológica exógena, usan diferentes conservantes tales como benzoisotiazolinas. Los ejemplos detallados en el documento ES2370561 usan una proporción de poliol/agente dispersante inferior a 30:1.
El documento WO2009126647 desvela una formulación acuosa que comprende al menos una espora a una concentración de entre el 3-80 % (peso/peso), al menos un disolvente miscible en agua y/o un agente hidrófobo. Este documento de patente no describe ninguna proporción entre los polioles que pueden ser disolventes miscibles en agua y los agentes dispersantes presentes en la invención. Este documento de patente también describe el uso de agentes conservantes para evitar la contaminación microbiológica exógena.
Objeto de la invención
La presente divulgación se dirige a un agente bacteriostático respetuoso con el medio ambiente que evite la contaminación microbiana exógena en soluciones acuosas y garantice la estabilidad de las suspensiones a lo largo del tiempo.
Se desvela una solución que contiene un poliol y un agente dispersante, en donde la proporción de poliol/agente dispersante está comprendida entre 30:1 (peso/peso) y 110:1 (peso/peso).
Otra ventaja es que garantiza la estabilidad física de las suspensiones bacterianas inoculadas en su vehículo inerte. A través de la selección de policarboxilato de sodio o naftalensulfonato condensado como agentes dispersantes, se obtienen suspensiones en las que no se observa la precipitación de los sólidos inertes suspendidos.
Adicionalmente, la alta concentración de poliol proporciona a las suspensiones una alta viscosidad, y se evita el uso de modificadores reológicos, tales como goma de xantano.
Otro problema resuelto es que garantiza la viabilidad de los microorganismos y de las proteínas en las suspensiones, y la actividad biocida de las formulaciones.
Las formulaciones biocidas con Bacillus subtilis mostraron la misma efectividad que las formulaciones sólidas de Bacillus subtilis contra la esclerotinia de la lechuga, la botritis del tomate y la monilia del melocotón. La efectividad fue similar a la de fungicidas químicos tales como el Thianosan.
Las formulaciones biocidas con cistatinas mostraron actividad contra diferentes especies de ácaros, principalmente Tetranychus urticae.
Las formulaciones obtenidas con el agente bacteriostático como diluyente son adecuadas para el tratamiento de leguminosas, olivo, plantas ornamentales, vides, árboles frutales, maíz, algodón, frutas cítricas, verduras, fresas, bulbos, plantas oleaginosas, etc.
Descripción de la invención
En un primer aspecto, se proporciona una solución acuosa de un poliol y un agente dispersante, en donde la proporción de poliol/agente dispersante está comprendida entre 30:1 (peso/peso) y 110:1 (peso/peso).
Los agentes dispersantes comprenden alquil-sulfonatos o sales de ésteres sulfúricos que derivan de monoalcoholes, sulfonatos o sales de ésteres sulfúricos de polialcoholes o de aminoalcoholes, o de sus derivados, ésteres de ácidos grasos superiores con ácidos hidroxialquilsulfónicos o sus sales, productos de la sulfatación o sulfonación de grasas, aceites, ceras o ácidos grasos superiores, o de sus ésteres, con monoalcoholes, derivados de ácidos sulfocarboxílicos o sulfopolicarboxílicos de bajo peso molecular, aril- o alquilaril-sulfonatos, derivados del ácido fosfórico, aminas o poliaminas, compuestos de amonio cuaternario, compuestos de fosfonio y sulfonio, amidas, sulfonamidas, ácidos amino-carboxílicos, hidroxilatos de proteínas, ésteres de ácido carboxílico, derivados de lignina, resinas naturales o sintéticas, o sus sales, glucósidos, mucílagos o saponinas.
Los polioles son compuestos que tienen varios grupos hidroxilo libres o esterificados, por ejemplo, glicerina, sorbitol, monopropilenglicol o manitol.
Las soluciones obtenidas tras la adición de la mezcla de poliol/agente dispersante a diferentes cantidades de agua no mostraron crecimiento bacteriano hasta que la cantidad de agua fue superior al 50 % (peso/peso).
Los dispersantes usados fueron policarboxilato de sodio, naftalensulfonato de sodio condensado, alquilsulfonato de sodio, dispersantes poliméricos anfóteros, polímeros acrílicos de estireno modificado.
En un segundo aspecto, la invención proporciona suspensiones con actividad biocida que comprenden:
- un sólido inerte con un tamaño de partícula inferior a 40 micrómetros,
- medios tampón,
- un agente biocida seleccionado entre una cepa de Bacillus subtilis o una cistatina, y
- un diluyente acuoso que contiene un poliol y un agente dispersante, en donde la proporción de poliol/agente dispersante está comprendida entre 30:1 (peso/peso) y 110:1 (peso/peso); el agente dispersante es naftalensulfonato condensado o policarboxilato de sodio, y el contenido de agua es inferior al 50 % (peso/peso) de la formulación biocida.
Los mejores resultados, sin formación de espuma persistente, se obtuvieron cuando el agente dispersante fue policarboxilato de sodio o naftalensulfonato de sodio, la proporción de poliol/agente dispersante fue de 50:1 (peso/peso), y el contenido de agua fue inferior al 50 % (peso/peso) de la suspensión total.
Los sólidos inertes adecuados son el caolín, zeolitas o silicatos.
Los medios tampón garantizan la estabilidad del agente biocida a un pH dado. Entre los sistemas tampón, cabe citar los citratos o los fosfatos.
Adicionalmente, las suspensiones pueden contener diferentes agentes humectantes tales como ésteres de sorbitán etoxilados, alcoholes etoxilados, alquilpoliglucósidos y sales de los mismos, ésteres de sorbitol, con el fin de garantizar un tamaño de gota adecuado en la aplicación del producto y la adecuada adherencia del mismo sobre la superficie foliar. La concentración de agentes humectantes está comprendida entre el 0-2 % en peso.
La producción de las suspensiones biocidas se realiza de acuerdo con el siguiente método. Se adsorbe el agente bactericida valorado en un vehículo inerte; A continuación, se prepara la solución acuosa junto con los dispersantes y el agente tampón hasta completar la disolución, se añade el agente biocida adsorbido en su vehículo inerte bajo agitación constante entre 1000 y 1500 rpm con un dispersor de tipo Cowles hasta su completa incorporación, y se lleva a volumen con el poliol hasta alcanzar la concentración deseada de agente biocida y de la proporción del poliol/agente dispersante.
El método anterior es adecuado para cualquier agente biocida de origen natural:
- Bacterias: Pseudomonas spp., Bacillus spp. tales como: Bacillus aizawai, Bacillus cereus, Bacillus firmus, Bacillus kurstaki, Bacillus lentimorbus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus popilliae, Bacillus pumilus, Bacillus sphaericus, Bacillus thuringiensis, Bacillus subtilis, Bacillus polymixa, Azotobacter vinelandii, Rhizobium leguminosarum,
- Hongos y levaduras de la clase Basidiomycetes, Chytridiomycetes, Deuteromycetes, Hyphochytridiomycetes, Oomycetes, Plasmodiophoromycetes, Sordariomycetes, Trichomycetes y Zygomycetes, específicamente, las especies Arlhrobolrys superba, Arlhrobolrys irregular, Beauveria bassiana, Fusarium spp., Hirsulella rhossiliensis, Hirsulella Ihompsonii, Lagenidium giganleum, Myrolhecium, Nomuraea rileyi, Paecilomyces lilacinus, Trichoderma spp., Vericillium lecanii y/o Verlicillium lecanii, Beauveria bassiana, Paecilomyces lilacinus y Saccharomyces spp. - Proteínas: cistatinas
Los estudios de estabilidad acelerados a 54 °C no provocaron una reducción en la viabilidad de los microorganismos tras 14 días, y estos resultados garantizan que la suspensión bacteriana a temperatura ambiente (20 °C) será estable durante al menos 2 años.
Para uso en agricultura, las suspensiones se diluyen en agua antes de la aplicación.
Ejemplo 1. Actividad bacteriostática de las mezclas de poliol/agente dispersante
Se prepararon diferentes muestras cambiando la proporción de poliol/agente dispersante en agua. Las muestras se almacenaron en una botella cerrada a 20 °C durante 6 meses. Las unidades formadoras de colonias se determinaron de acuerdo con el método descrito en la Farmacopea de Estados Unidos. Estos ejemplos son solo para referencia.
Figure imgf000004_0001
Figure imgf000005_0001
donde
Atlox 4915 es un dispersante polimérico anfótero,
Emulson AG PS BV 4 es un policarboxilato de sodio,
Atlox Metarsperse 500 L es un polímero de estireno acrílico modificado,
Emulson AG/TP1 es un derivado acrílico en una dispersión acuosa,
Emulson AG TRST60 es una sal amino de un éster de poliarilfosfato,
Madeol AG/PWA es una sal sódica de un alquilnaftalensulfato,
Madeol AG W 90 es un naftalensulfonato condensado,
Madeol MW es un alquilnaftalensulfonato condensado,
Madeol AG OR 95 es un naftalensulfonato condensado.
Tras la incubación en todas las muestras, la carga microbiana resultó ser inferior a 1000 unidades formadoras de colonias por gramo (<1000 ufc/g).
Ejemplo 2. Estabilidad de las suspensiones
Se prepararon diferentes suspensiones en agua de un material inerte con un tamaño de partícula de 40 micrómetros con diferentes mezclas de poliol/agente dispersante y con diferentes sólidos inertes.
Figure imgf000005_0002
Figure imgf000006_0003
Se centrifugaron las muestras durante 15 minutos a 1735 rpm con un agitador de tipo Cowles.
Los resultados muestran que, cuando se usa naftalensulfonato condensado o policarboxilato de sodio como dispersante, no se observa la precipitación de los sólidos dispersados tras la centrifugación.
Las Muestras 12 y 22, sin agentes dispersantes, mostraron la precipitación del caolín.
En el resto de los casos, se observó la presencia de espuma persistente o la presencia de sólidos precipitados. Ejemplo 3. Estabilidad de las suspensiones en función del contenido de sólidos
Se prepararon diferentes suspensiones usando policarboxilato de sodio
(Emulson AG PS BV 4) como agente dispersante. Se añadieron diferentes cantidades de sólido inerte. La Muestra 6 es solo para referencia.
Figure imgf000006_0002
No se observaron precipitados tras centrifugar durante 15 minutos a 1735 rpm.
Ejemplo 4. Producción de suspensiones bacterianas con actividad biocida
Se disolvieron 0,10 gramos de caolín que contenía 1010ufc/g de la cepa IAB de Bacillus subtilis, obtenida de acuerdo con el documento ES24002726, en agua destilada, se añadieron los agentes dispersantes y se homogenizó la suspensión. A continuación, la suspensión se diluyó a 100 gramos (cps) con polioles. El pH de la suspensión se ajustó a pH 7 con ácido cítrico. La concentración de la suspensión obtenida fue de 107 ufc/g. La Muestra 7 es solo para referencia.
Los agentes dispersantes y los polioles usados fueron:
Figure imgf000006_0001
Las suspensiones bacterianas se prepararon sin la adición de agentes conservantes, tales como azidas, isotiazolinas o parabenos.
Ejemplo 5. Efectividad de las suspensiones contra la esclerotinia de la lechuga
Una suspensión bacteriana líquida de la cepa IAB de Bacillus subtilis a una concentración de 107 ufc/g fue tan efectiva contra la esclerotinia de la lechuga como una formulación sólida de la cepa QST 713 de Bacillus subtilis en tierra de diatomeas a una concentración de 5,13 x 1010 ufc/g.
La composición cuantitativa de la suspensión fue:
Emulson AGPSBV 4: 1.2 gramos
Agua: 7,6 gramos
Caolín: 1.2 gramos
Glicerina: 91.2 gramos
pH: 7,1
Proporción de poliol/agente dispersante: 75:1
Se diluyó la suspensión bacteriana con una concentración de 107 ufc/g a diferentes concentraciones en agua: 300 ml/100 l; 600 ml/100 l; 1000 ml/100 l, y estas diluciones se usaron como agente biocida contra la esclerotinia de la lechuga. Se usó Serenade Max® al 15,65 % como agente biocida de control a una dosis de 4 kg/Ha, que equivale aproximadamente a 4 ml/100 l.
Se observó actividad biocida en todas las muestras.
Ejemplo 6. Producción de suspensiones de proteínas con actividad biocida
Se dispersaron 100 mg de una cistatina en 1 gramo de caolín en 7,7 gramos de agua destilada. Se añadieron 1,04 gramos de policarboxilato de sodio (Emulson AG PS BV 4) y 0,03 de naftalensulfonato condensado. Se homogenizó la mezcla y se añadieron 119,34 gramos de sorbitol 70. El pH de la suspensión se ajustó a pH 7 con ácido cítrico. La concentración de la suspensión fue de 107 ufc/g. La suspensión que se produjo inhibió la actividad de las catepsinas, por lo que las suspensiones de proteínas no pierden la actividad biocida de las cistatinas.
Ejemplo 7. Estudio de la estabilidad de las suspensiones bacterianas de Bacillus subtilis
Se realizó un estudio de la estabilidad acelerado de una suspensión bacteriana de cepa 1AB de Bacillus subtilis con una concentración de 1 x 107 ufc/g obtenida de acuerdo con el Ejemplo 4, Muestra 1.
Los parámetros medios fueron el aspecto, el pH, la concentración del principio activo, la estabilidad de la suspensión diluida al 5 %.
Las condiciones de almacenamiento fueron 14 días a 54 °C, siendo las muestras acondicionadas en botellas de plástico cerradas.
Los resultados obtenidos se detallan a continuación:
Figure imgf000007_0001
Los resultados obtenidos garantizan la estabilidad de la suspensión durante 2 años a temperatura ambiente.
Ejemplo 8. Efectividad contra la botritis del tomate (Ejemplo de referencia)
Una formulación biocida líquida de la cepa 1AB de Bacillus subtilis con una concentración de 107 ufc/g resultó ser tan eficaz contra la botritis del tomate como una formulación sólida de la cepa QST 713 de Bacillus subtilis en tierra de diatomeas con una concentración de 5,13 x 1010 ufc/g.
La composición cuantitativa fue:
Madeol AG W 90: 2.1 gramos
Agua: 8,6 gramos
Caolín: 1.1 gramos
Polietilenglicol 200: 83,4 gramos
pH: 7,1
Proporción de poliol/agente dispersante: 39:1
Se diluyó la suspensión bacteriana con una concentración de 107 ufc/g a diferentes concentraciones en agua: 1 l/Ha; 2 l/Ha 1; 3 l/Ha, y estas diluciones se usaron como agente biocida contra la esclerotinia de la lechuga.
Se usó Serenade Max® al 15,65% como agente biocida de control a una dosis de 4 kg/Ha, que equivale aproximadamente a 4 ml/100 l.
Se observó actividad biocida en todas las muestras.
Ejemplo 9. Efectividad contra la monilia del melocotón (Ejemplo de referencia)
Una formulación biocida líquida de la cepa 1AB de Bacillus subtilis a una concentración de 107 ufc/g resultó ser tan eficaz contra la monilia del melocotón como una formulación sólida de la cepa QST 713 de Bacillus subtilis en tierra de diatomeas a una concentración de 5,13 x 1010 ufc/g.
MadeolAG W90: 2,0 gramos
Agua: 8,6 gramos
Caolín: 1.5 gramos
Polietilenglicol 400: 83,8 gramos
pH: 7.5
Proporción de poliol/agente dispersante 42:1
No se observó separación de fases en la suspensión.
Se diluyó la suspensión bacteriana con una concentración de 107 ufc/g a diferentes concentraciones en agua: 1 l/Ha; 2 l/Ha 1; 3 l/Ha, y estas diluciones se usaron como agente biocida contra la esclerotinia de la lechuga.
Se usó Serenade Max® al 15,65% como agente biocida de control a una dosis de 4 kg/Ha, que equivale aproximadamente a 4 ml/100 l.
Se observó actividad biocida en todas las muestras.
Ejemplo 10. Efectividad de las formulaciones de cistatina (Ejemplo de referencia)
Una formulación biocida líquida de cistatina a una concentración del 1 % p/p fue tan eficaz contra Tetranychus urticae como una formulación de Abamectina a una concentración del 1,8 % p/p.
La suspensión biocida a base de cistatina, a una concentración del 1 % p/p y con los siguientes excipientes:
MadeolAG W 90: 2.1 gramos
Agua: 8,6 gramos
Caolín: 1.2 gramos
Polietilenglicol 200: 83,4 gramos
pH: 7,1
Proporción de poliol/agente dispersante: 39:1,
se diluyó en agua a una concentración de 20 ml/l, y esta dilución se usó como agente biocida contra Tetranychus urticae en cultivo de fresas.
Como agente biocida de control, se usó LAOTTA® al 1,8 % a una dosis de 100 ml/100 l.
Se observó actividad biocida en todas las muestras.

Claims (5)

REIVINDICACIONES
1. Una formulación biocida que comprende:
- un sólido inerte con un tamaño de partícula inferior a 40 micrómetros,
- una cepa de Bacillus subtilis o una cistatina como agente biocida,
- medios tampón,
- un diluyente formado por una solución acuosa que contiene un poliol y un agente dispersante, caracterizado por que la proporción de poliol/agente dispersante está comprendida entre 30:1 (peso/peso) y 110:1 (peso/peso); el agente dispersante es naftalensulfonato condensado o policarboxilato de sodio y su contenido de agua es inferior al 50 % (peso/peso) de la formulación biocida.
2. La formulación de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada por que el poliol es monopropilenglicol, glicerina, manitol o sorbitol.
3. La formulación de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada por que comprende además un agente humectante.
4. Uso de las formulaciones biocidas de acuerdo con cualquier reivindicación anterior para la producción de un biocida contra la esclerotinia de la lechuga, la monilia del melocotón y la botritis del tomate cuando el agente biocida es Bacillus subtilis, o contra Tetranychus urticae en la fresa cuando el agente biocida es cistatina.
5. Un método para obtener una formulación biocida que comprende:
- adsorber una cepa de Bacillus subtilis o una cistatina en un sólido inerte,
- dispersar en una solución acuosa que contenga un poliol y agentes dispersantes mediante agitación,
- añadir agua hasta alcanzar la concentración deseada de agente biocida,
- ajustar el pH,
caracterizado por que la proporción de poliol/agente dispersante está comprendida entre 30:1 y 110:1 (peso/peso); el agente dispersante es naftalensulfonato condensado o policarboxilato de sodio, y el contenido de agua es inferior al 50 % (peso/peso) de la formulación biocida exenta de conservante.
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