ES2823280T3 - Osteomodulina y fragmentos de osteomodulina como biomarcadores para la osteoartritis y uso de los mismos - Google Patents
Osteomodulina y fragmentos de osteomodulina como biomarcadores para la osteoartritis y uso de los mismos Download PDFInfo
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Abstract
Uso de la proteína osteomodulina (OMD) o un fragmento de la proteína osteomodulina (OMD) en el pronóstico y/o diagnóstico in vitro de osteoartritis y/o esclerosis ósea subcondral de mamíferos, preferiblemente individuos humanos en donde la proteína osteomodulina de longitud completa es la que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:1, en donde la proteína osteomodulina (OMD) es una proteína representada por las posiciones de aminoácidos 1- 421 o por las posiciones de aminoácidos 21-421 de SEQ ID NO:1; y en donde dicho fragmento se selecciona del grupo que consiste en a) y b) a) OMD-(131-223), b) OMD-(236-296).
Description
DESCRIPCIÓN
Osteomodulina y fragmentos de osteomodulina como biomarcadores para la osteoartritis y uso de los mismos La presente invención se refiere a un método para diagnosticar o determinar el pronóstico de osteoartritis y/o esclerosis ósea subcondral y osteomodulina y fragmentos de la misma como biomarcadores para osteoartritis y uso de los mismos.
La osteoartritis (OA) es la enfermedad articular más común y es una de las principales causas de dolor y discapacidad articular en la población envejecida. Su etiología es multifactorial (es decir, edad, obesidad, lesión articular, predisposición genética) y el proceso fisiopatológico afecta la totalidad de la articulación. La destrucción del cartílago articular, la esclerosis del hueso subcondral y la formación de osteofitos, la inflamación sinovial y el daño de ligamentos y meniscos constituyen las principales características que caracterizan la OA.
Además de encontrar estrategias de gestión para la OA, el reto es también identificar herramientas que puedan ayudar al pronóstico, el diagnóstico y el seguimiento de la progresión de la enfermedad y evaluar la eficacia de nuevas intervenciones terapéuticas. Estas herramientas deber ser lo suficientemente precisas y sensibles para identificar sucesos tempranos a nivel molecular y evaluar objetivamente la eficacia de modalidades terapéuticas nuevas o preexistentes. Es probable que los biomarcadores solubles se encuentren entre estas herramientas.
Hasta ahora, solo se utilizan en la osteoartritis biomarcadores derivados del cartílago. Se utilizan principalmente fragmentos procedentes de colágeno de Tipo II (Coll2-1. Coll2-1NO2. C2C, PIINP, CTXII), agrecano (neo-epítopos generados por MMPs o ADAMTSs, keratán sulfato o CS846), COMP o fibulina-3.
La osteomodulina se conoce en la técnica, particularmente por NINOMIYA et al., en BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, Academic Press Inc Orlando US 362(2) 2007, pero no se conoce como biomarcador de osteoartritis.
Anticuerpos policlonales de osteomolulina se describen en el documento de Patente WO 2010/046443 publicado el 29 de abril de 2010, pero no su uso en el pronóstico y/o diagnóstico in-vitro de la osteoartritis.
Bay-JENSEN A C et al., en Osteoarthritis and Cartilage 24(1) 2016 p9-20, describen una lista de biomarcadores para osteoartritis, pero la lista no revela la osteomodulina.
SANCHEZ-SABATE E et al., en Osteoarthritis and Cartilage 17(8) 2009 p1106-1114 describen la disminución de la osteomodulina en pacientes del grupo E en comparación con los pacientes del grupo C. Pero los pacientes del grupo E y C no se ven afectados por la osteoartritis.
Además, actualmente ningún marcador específico individual es capaz de pronosticar y/o diagnosticar con precisión la patología. Por lo tanto, en la actualidad se ha utilizado una combinación de diferentes marcadores que reflejan diferentes aspectos de la patología. De hecho, la OA es un síndrome heterogéneo con diferentes fenotipos clínicos definidos por factores de riesgo, perfiles de progresión, comorbilidades, signos y síntomas. En los métodos de diagnóstico actuales para la osteoartritis, solo se utilizan biomarcadores derivados del cartílago.
Por lo tanto, el objetivo técnico de la presente invención era proporcionar un nuevo marcador, un marcador específico individual y un método para pronosticar y diagnosticar con precisión la patología de la osteoartritis.
Compendio de la presente invención
Al continuar con los estudios de la presente invención, los presentes inventores descubrieron que la osteomodulina se expresa menos y se secreta menos por los osteoblastos subcondrales escleróticos durante la osteoartritis (OA). Además, los presentes inventores encontraron fragmentos de osteomodulina en fluidos corporales, en particular en suero, de pacientes con OA, y que las concentraciones séricas de los fragmentos de osteomodulina eran más bajas que en comparación con las de los individuos sanos.
Por lo tanto, la presente invención proporciona los siguientes (1) a (9):
(1) el uso de una proteína osteomodulina (OMD) o un fragmento de una proteína osteomodulina (OMD) en pronósticos in-vitro y/o diagnóstico de osteoartritis y/o esclerosis ósea subcondral de mamíferos, preferiblemente individuos humanos en donde la proteína osteomodulina de longitud completa es la que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1,
en donde la proteína osteomodulina (OMD) es una proteína representada por las posiciones de aminoácidos 1-421 o por las posiciones de aminoácidos 21-421 de SEQ ID NO:1; y
en donde dicho fragmento se selecciona del grupo que consiste en a) y b)
a) OMD-(131 -223),
b) OMD-(236-296).
(2) el uso de una proteína osteomodulina (OMD) o un fragmento de una proteína osteomodulina (OMD) según (1), en donde la expresión disminuida o la concentración disminuida en los fluidos corporales de dicha proteína osteomodulina o sus fragmentos comparado con los individuos sanos indica la aparición de osteoartritis y/o esclerosis ósea subcondral.
(3) el uso de una proteína osteomodulina (OMD) o un fragmento de una proteína osteomodulina (OMD) según (2), en donde dicha expresión disminuida o concentración disminuida se mide en fluidos corporales seleccionados del grupo que consiste en orina, secreciones, líquido intersticial, sangre, líquido sinovial, suero, linfa del líquido cefalorraquídeo, preferiblemente suero. Los niveles de los fluidos corporales disminuidos, en particular los niveles séricos disminuidos, de dicha proteína osteomodulina (OMD) o dichos fragmentos comparados con los individuos sanos, indican la aparición de osteoartritis y/o esclerosis ósea subcondral.
(4) un método para el pronóstico y/o diagnóstico de la osteoartritis y/o esclerosis ósea subcondral, que comprende las siguientes etapas:
i) medir la proteína osteomodulina (OMD) o un fragmento o fragmentos de la proteína osteomodulina (OMD) en muestras de fluidos corporales de individuos mamíferos, preferiblemente muestras de suero humano;
ii) considerar que niveles reducidos de proteína osteomodulina (OMD) o de dichos fragmentos en comparación con niveles de fluidos corporales, preferiblemente suero, de individuos sanos indican la aparición de osteoartritis y/o esclerosis ósea subcondral
en donde la proteína osteomodulina de longitud completa es la que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1,
en donde la proteína osteomodulina (OMD) es una proteína representada por las posiciones de aminoácidos 1-421 o por las posiciones de aminoácidos 21-421 de SEQ ID NO:1; y
en donde dicho fragmento se selecciona del grupo que consiste en a) y b)
a) OMD-(131 -223),
b) OMD-(236-296).
(5) un método para determinar o comprobar o diagnosticar el efecto terapéutico del tratamiento de la osteoartritis y/o la esclerosis ósea subcondral en un individuo mamífero, preferiblemente un individuo humano, que comprende las siguientes etapas:
i) medir la proteína osteomodulina (OMD) o un fragmento o fragmentos de la proteína osteomodulina (OMD) en muestras de fluidos corporales, preferiblemente muestras de suero, de dicho individuo durante o después del tratamiento;
ii) considerar que cualquiera de (1) a (3)
(1) los niveles normales de la proteína osteomodulina (OMD) o de dichos fragmentos en las muestras obtenidas en la etapa i), o
(2) los niveles aumentados de la proteína osteomodulina (OMD) o de dichos fragmentos en las muestras obtenidas en la etapa i) comparados con los niveles en las muestras de fluidos corporales, preferiblemente muestras de suero, de dichos individuos antes de dicho tratamiento, o
(3) los niveles aumentados de la proteína osteomodulina (OMD) o de dichos fragmentos en dichas muestras obtenidas en la etapa i) comparados con los niveles en las muestras de fluidos corporales, preferiblemente muestras de suero, de individuos sanos,
indican un efecto terapéutico del tratamiento de osteoartritis y/o esclerosis ósea subcondral en dichos individuos en donde la proteína osteomodulina de longitud completa es la que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1,
en donde la proteína osteomodulina (OMD) es una proteína representada por las posiciones de aminoácidos 1-421 o por las posiciones de aminoácidos 21-421 de SEQ ID NO:1; y
en donde dicho fragmento se selecciona del grupo que consiste en a) y b)
a) OMD-(131 -223)
b) OMD-(236-296).
En métodos preferidos según uno cualquiera de (4) a (5), para medir los niveles de fluido corporal, preferiblemente niveles de suero, en la etapa i) se utiliza una pareja de unión inmunológica que se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanizados, fragmentos Fc, fragmentos Fab, anticuerpos monocatenarios (scFv), anticuerpos quiméricos, biobetters y otros fragmentos de anticuerpos específicos de antígenos.
(6) el fragmento de la proteína osteomodulina, en donde la proteína osteomodulina de longitud completa es la que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1, y en donde dicho fragmento se selecciona del grupo que consiste en a) a b):
a) OMD-(131 -223),
b) OMD-(236-296).
(7) el uso de una pareja de unión inmunológica que se une específicamente a la proteína osteomodulina (OMD) o un fragmento de la proteína osteomodulina (OMD) para su uso en el pronóstico y/o diagnóstico de osteoartritis y/o esclerosis ósea subcondral de mamíferos, preferiblemente individuos humanos
en donde la proteína osteomodulina de longitud completa es la que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1, y en donde dicho fragmento se selecciona del grupo que consiste en a) y b):
a) OMD-(131 -223),
b) OMD-(236-296).
(8) la pareja de unión inmunológica que se une específicamente a un fragmento de osteomodulina, en donde la proteína osteomodulina de longitud completa es la que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1, y en donde dicho fragmento se selecciona del grupo que consiste en a) a b):
a) OMD-(131 -223),
b) OMD-(236-296).
En realizaciones preferidas de la pareja de unión inmunológica según (8) la pareja de unión inmunológica se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanizados, fragmentos Fc, fragmentos Fab, anticuerpos monocatenarios (scFv), anticuerpos quiméricos, biobetters y otros fragmentos de anticuerpos específicos de antígenos.
(9) uso de un kit que comprende la pareja de unión inmunológica según 7 u 8 en donde dicha pareja de unión inmunológica se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanizados, fragmentos Fc, fragmentos Fab, anticuerpos monocatenarios (svFv), anticuerpos quiméricos, biobetters y otros fragmentos de anticuerpos específicos de antígenos.
Descripción detallada de la invención
La invención se describe en las reivindicaciones adjuntas.
La presente invención proporciona osteomodulina y fragmentos de la misma como un marcador específico único que es capaz de determinar el pronóstico y/o diagnosticar con precisión la patología de la OA. En particular la presente invención proporciona la proteína osteomodulina (OMD) o un fragmento de la proteína osteomodulina para su uso en el pronóstico y/o diagnóstico de osteoartritis y/o esclerosis ósea subcondral de mamíferos, preferiblemente individuos humanos. En particular, se proporciona un método para el pronóstico y/o diagnóstico de osteoartritis y/o esclerosis ósea subcondral, utilizando proteína osteomodulina (OMD) o fragmento(s) de la proteína osteomodulina como un marcador para el pronóstico y/o diagnóstico e osteoartritis y/o esclerosis ósea subcondral de mamíferos, preferiblemente individuos humanos. En particular, la proteína osteomodulina (OMD) o un fragmento de la proteína osteomodulina (OMD) se utiliza en dicho pronóstico y/o diagnóstico de forma que la expresión disminuida o la concentración disminuida en los fluidos corporales de dicha proteína osteomodulina o sus fragmentos comparados con los individuos sanos indican la aparición de osteoartritis y/o esclerosis ósea subcondral. En realizaciones preferidas adicionales la expresión disminuida o la concentración disminuida se mide en fluidos corporales seleccionados del grupo que consisten en orina, secreciones, líquido intersticial, sangre, líquido sinovial, suero, linfa del líquido cefalorraquídeo, más preferiblemente suero.
El método según la presente invención comprende i) medir la proteína osteomodulina (OMD) o un fragmento o fragmentos de la proteína osteomodulina (OMD) en muestras de fluidos corporales de individuos mamíferos, preferiblemente muestras de suero humano; ii) considerar que los niveles disminuidos de la proteína osteomodulina (OMD) o de dicho(s) fragmento(s) comparados con los niveles de fluidos corporales, preferiblemente niveles de suero, de individuos sanos indican la aparición de osteoartritis y/o esclerosis ósea subcondral.
La osteomodulina es un miembro proteoglicano de keratán sulfato de matriz extracelular de la pequeña familia de proteínas repetidas ricas en leucina. Durante algún tiempo se pensó que la osteomodulina era específica del hueso, pero recientemente también se observó expresión de osteomodulina en otros tejidos articulares como los condrocitos articulares y los fibrocondrocitos derivados del labrum. Se conoce poco sobre la actividad biológica de la osteomodulina. Puede estar implicada en procesos de biomineralización y tiene una función en la unión de osteoblastos mediante la alfa(V)beta(3)-integrina. La osteomodulina es capaz de estimular in vitro la expresión de agrecano por los condrocitos articulares. La forma madura de osteomodulina de Homo sapiens está representada por la secuencia de aminoácidos 21-421 de SEQ ID NO: 1. La secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1 de la lista de secuencias de esta solicitud incluye también las posiciones de aminoácidos 1 a 20. La forma madura de la proteína tiene un peso molecular de 49,5 kDa pero, dependiendo del patrón de glicosilación, se estima alrededor de 60 y 85 kDa. El péptido terminal COOH se une a la hidroxiapatita ósea.
Durante los estudios para la presente invención los presentes inventores identificaron mediante el uso de técnicas proteómicas la osteomodulina y los fragmentos de la misma como nuevos posibles biomarcadores solubles procedentes del secretoma de los osteoblastos subcondrales primarios. Los presentes inventores encontraron que la osteomodulina se expresa menos y se secreta menos por los osteoblastos subcondrales escleróticos durante la OA. Además, se encontraron fragmentos de osteomodulina en suero humano. Se encontró que las concentraciones de suero de los fragmentos de osteomodulina eran significativamente más bajas que las de los individuos sanos.
Los datos y los resultados in vitro obtenidos sugieren que se puede considerar que la osteomodulina representa un biomarcador potencial de la osteoartritis o de un subconjunto de pacientes con osteoartritis con cambios óseos subcondrales. La cuantificación del nivel de osteomodulina o fragmentos de osteomodulina en suero indica un estado particular de la enfermedad y puede utilizarse en el diagnóstico y pronóstico de la osteoartritis y/u otras enfermedades relacionadas con el envejecimiento, y también en el seguimiento de la eficacia del tratamiento de la osteoartritis y/o enfermedades relacionadas con el envejecimiento.
El método de la presente invención para el pronóstico y/o diagnóstico de osteoartritis y/o esclerosis ósea subcondral, así como el método para determinar o comprobar o diagnosticar el efecto terapéutico del tratamiento de osteoartritis y/o esclerosis ósea subcondral en individuos mamíferos, hace uso de la proteína osteomodulina (OMD) o preferiblemente de fragmentos de la proteína osteomodulina como un marcador para el pronóstico y/o diagnóstico de osteoartritis y/o esclerosis ósea subcondral de mamíferos. Estos fragmentos se seleccionan del grupo que consiste en a) a b).
a) OMD-(131-223) (OMD1 131-KIDYGVFAKLPNLLQLHLEHNNLEEFPFPL
PKSLERLLLGYNEISKLQTNAMDGLVNLTMLDLCYNYLHDSLLKDKIFAKMEKLMQL
NLCSNR-223 (SEQ ID NO: 2)),
b) OMD-(236-296) (OMD2 236-MYLSLENNSISSIPEKYFDKLPKLHTLRMSHNK
LQDIPYNIFNLPNIVELSVGHNKLKQAF-296 (SEQ ID NO: 3)).
La cuantificación de OMD1, OMD2 séricos se podía utilizar también para el diagnóstico de OA y el seguimiento de terapias anti-OA. Además, dado que la OA es un síndrome heterogéneo con diferentes fenotipos clínicos, los fragmentos de osteomodulina se podrían utilizar en combinación con otros biomarcadores de OA para mejorar el conocimiento de la enfermedad del paciente y dar información para realizar una medicina personalizada. Además, OMD1, OMD2 se pueden utilizar también como un marcador de pre-osteoblastos y osteoblastos subcondrales escleróticos.
Aunque todavía no está claro si precede u ocurre posteriormente al daño del cartílago, la esclerosis ósea subcondral es una característica importante en la fisiopatología de la OA. La esclerosis ósea subcondral se caracteriza por la resorción ósea local y la acumulación de sustancia osteoide débilmente mineralizada. Se sospecha que la esclerosis ósea subcondral está relacionada con la degradación del cartílago no solo modificando las propiedades mecánicas del hueso subcondral, sino también liberando factores bioquímicos con actividad sobre el metabolismo del cartílago. Los presentes inventores han demostrado previamente que los osteoblastos aislados de hueso subcondral OA expresaban un fenotipo alterado. Más precisamente, se demostró que los osteoblastos provenientes del engrosamiento (llamado esclerótico, SC) del hueso subcondral localizado justo debajo de una lesión de cartílago muestran una actividad de fosfatasa alcalina (AP) elevada y expresan niveles más altos de IL-6, IL-8, PGE2, TGF-p1 y colágeno de tipo I que los osteoblastos provenientes del área vecina no engrosada (denominada área no esclerótica, NSC). Durante los estudios de la presente invención, este modelo in vitro se utilizó para comparar el secretoma de los osteoblastos NSC y SC.
Descripción de las figuras
La Figura 1 muestra la expresión del gen de osteomodulina por los pre-osteoblastos u osteoblastos maduros en células no escleróticas o escleróticas. Los números de copias de mRNA se normalizaron frente al número de copias correspondiente de mRNA de HPRT y los resultados son la media ± SEM de cinco experimentos independientes
llevados a cabo con biopsias óseas procedentes de diferentes donadores. En cada experimento, cada condición experimental se realizó por duplicado. La comparación de los valores medios se realizó mediante una prueba t pareada. Los resultados mostraron que la osteomodulina se expresa menos por los osteoblastos escleróticos que por los osteoblastos no escleróticos.
La Figura 2 muestra una detección por transferencia de Western de osteomodulina utilizando antisueros policlonales de cabra producidos frente a osteomodulina completa. rhOMD: osteomodulina recombinante humana (control positivo), DMEM: concentración de sobrenadante de cultivo no condicionada (control negativo), NSC: sobrenadante de osteoblastos no escleróticos, SC: sobrenadante de osteoblastos escleróticos, s59, s67, s62: suero de tres pacientes sanos.
La Figura 3 muestra los resultados de los ensayos ELISA utilizando anticuerpos frente a fragmentos de los péptidos OMD1 y OMD2. La figura muestra la concentración de OMD1 y OMD2 en sobrenadante de cultivo de preosteoblastos y osteoblastos no escleróticos o escleróticos. Con estos ensayos ELISA se detectaron fragmentos en sobrenadante de cultivo de osteoblastos, y también se confirmó la disminución de OMD1 y OMD2 en secretoma esclerótico en comparación con secretoma no esclerótico.
La Figura 4 muestra los resultados del análisis de los niveles de OMD1 y OMD2 en suero humano. Se cuantificaron 33 pacientes sanos y 24 con OA. En la población sana, 11 tenían entre 20 y 30 años, 12 entre 31 y 45 años y 10 entre 46 y 65 años. El rango de edad en la población con OA fue de 44 a 83 años. OMD1 y OMD2 fueron ambos significativamente más bajos en pacientes con OA en comparación con los pacientes sanos.
La Figura 5 muestra la cuantificación de OMD1 y OMD2 en suero de un modelo espontáneo de OA de cobaya. Definiciones
Como se utiliza en la presente memoria “proteína osteomodulina” o “OMD” se refiere a osteomodulina de Homo sapiens representada por la secuencia de aminoácidos 1-421 de SEQ ID NO:1. En realizaciones preferidas “proteína osteomodulina” o “OMD”, en particular “proteína osteomodulina” o “OMD” para su uso en el pronóstico y/o diagnóstico de osteoartritis y/o esclerosis ósea subcondral, se refiere a la forma madura de osteomodulina de Homo sapiens representada por la secuencia de aminoácidos 21-421 de SEQ ID NO: 1.
Por “muestra” se entiende cualquier muestra biológica obtenida de un organismo, en particular fluidos corporales que contiene, o se sospecha que contiene, un polipéptido o péptido seleccionado de SEQ ID NOs: 1 a 5, preferiblemente SEQ ID NOs: 2 a 5. Como se indica, las muestras biológicas incluyen fluidos corporales que contienen los polipéptidos y/o péptidos, y otras fuentes de tejidos que se encuentra que expresan los polipéptidos y/o péptidos. Los métodos para obtener biopsias de tejidos y fluidos corporales de organismos son bien conocidas en la técnica. Muestras de fluidos corporales como orina, secreciones, líquido intersticial, sangre, líquido sinovial, suero, linfa del líquido cefalorraquídeo, son particularmente preferidas y el suero es el más preferido.
El término “pareja de unión inmunológica” o “anticuerpo” se utiliza de manera sinónima y se utiliza en el sentido más amplio y cubre específicamente, por ejemplo, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanizados, fragmentos Fc, fragmentos Fab, y fragmentos de anticuerpo que muestran la actividad biológica e inmunológica deseada, anticuerpos monocatenarios (scFv), anticuerpos quiméricos, biobetters u otros fragmentos de anticuerpos específicos de antígenos que se unen específicamente a los polipéptidos y péptidos mostrados en SEQ ID NOs: 1 a 5, preferiblemente SEQ ID NOs: 2 a 5. El término “inmunoglobulina” (Ig) se utiliza de manera intercambiable con “anticuerpo” en la presente memoria.
El término “anticuerpo monoclonal” como se utiliza en la presente memoria se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por mutaciones posiblemente naturales que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos siendo dirigidos contra un único sitio antigénico. Además, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales que incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un único determinante de antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos porque pueden sintetizarse sin contaminarse por otros anticuerpos. El modificador “monoclonal” no debe interpretarse como que requiera la producción del anticuerpo por ningún método en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales útiles en la presente invención pueden prepararse mediante la metodología de hibridomas o pueden prepararse utilizando métodos de DNA recombinante en bacterias, animales eucariotas o células vegetales o pueden aislarse de bibliotecas de anticuerpos fagos.
Los anticuerpos monoclonales de la presente memoria incluyen anticuerpos “quiméricos” en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a un clase o subclase de anticuerpos particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como los fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada. Los anticuerpos quiméricos de interés en la presente memoria incluyen anticuerpos “primatizados” que comprenden secuencias de unión a antígeno de dominio variable derivadas
de un primate no humano (por ejemplo, Mono del Viejo Mundo, Simios, etc), y secuencias de región constante humana.
Un anticuerpo “intacto” es uno que comprende un sitio de unión al antígeno, así como un CL y al menos los dominios constantes de cadena pesada CH1, CH2 y CH3.
Los “fragmentos de anticuerpos” comprenden una parte de un anticuerpo intacto, preferiblemente la región de unión al antígeno o la región variable del anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2, y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpos monocatenarios; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
La digestión de anticuerpos con papaína produce dos fragmentos de unión al antígeno idénticos llamados “Fab”, y un fragmento residual “Fc”, una designación que refleja la capacidad de cristalizar fácilmente. El fragmento Fab consiste en una cadena L completa junto con el dominio de la región variable de la cadena H (VH), y el primer dominio constante de una cadena pesada (CH1). Cada fragmento Fab es monovalente con respecto a la unión al antígeno, es decir, tiene un sitio de unión al antígeno único. El tratamiento con pepsina de un anticuerpo produce un único fragmento F(ab’)2 grande que corresponde aproximadamente a dos fragmentos Fab unidos por disulfuro que tienen actividad de unión al antígeno divalente y todavía es capaz de reticular el antígeno. Los fragmentos Fab’ se diferencian de los fragmentos Fab por tener pocos residuos adicionales en el extremo carboxi terminal del dominio CH1 que incluyen una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab’-SH es la designación en la presente memoria para el Fab’ en el que el residuo(s) de cisteína de los dominios constantes llevan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab’)2 se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab’ que tienen cisteínas de bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.
El fragmento Fc comprende las partes carboxi terminales de ambas cadenas H mantenidas juntas por disulfuros. Las funciones efectoras de los anticuerpos están determinadas por las secuencias en la región Fc, región que también es la parte reconocida por los receptores Fc (FcR) que se encuentran en ciertos tipos de células.
“Fv” es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de unión y reconocimiento del antígeno completo. Este fragmento consiste en un dímero de un dominio de región variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en estrecha asociación no covalente. Del plegamiento de estos dos dominios emanan seis bucles hipervariables (3 bucles cada uno de la cadena H y L) que contribuyen con los residuos de aminoácidos para la unión del antígeno y confieren especificidad de unión del antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres CDRs específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque con una afinidad menor que el sitio de unión completo.
“Fv monocatenario” también abreviado como “sFv” o “scFv” son fragmentos de anticuerpos que comprenden los dominios de anticuerpos VH y VL conectados en una única cadena polipeptídica. Preferiblemente, el polipéptido sFv comprende además un enlazador polipeptídico entre los dominios VH y VL que permite que el sFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno.
El término “diacuerpos” se refiere a fragmentos de anticuerpos pequeños preparados mediante la construcción de fragmentos sFv con enlazadores cortos (aproximadamente 5-10 residuos) entre los dominios VH y VL, de modo que se logra el emparejamiento inter-cadenas, pero no intra-cadena de los dominios V, lo que resulta en un fragmento bivalente, es decir, un fragmento que tiene dos sitios de unión al antígeno. Los diacuerpos bis-específicos son heterodímeros de dos fragmentos sFv “cruzados” en los que los dominios VH y VL de los dos anticuerpos están presentes en diferentes cadenas polipeptídicas.
Las formas “humanizadas” de anticuerpos no humanos (por ejemplo, roedores) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada del anticuerpo no humano. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los restos de una región hipervariable del receptor se reemplazan por restos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tienen la especificidad, afinidad y capacidad del anticuerpo deseadas. En algunos casos, los restos de la región marco (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los correspondientes restos no humanos. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar aún más el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todos o sustancialmente todos de los FRs son los de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana.
Un anticuerpo u otra molécula orgánica “que se une” a un antígeno de interés, por ejemplo, un polipéptido o un péptido seleccionado del SEQ ID NOs: 1 a 5, preferiblemente SEQ ID NOs: 2 a 5, es uno que se une al antígeno con suficiente afinidad para que el anticuerpo u otra molécula orgánica sea útil como un agente de diagnóstico en una célula, tejido y/o fluido corporal que expresa el antígeno, y no reacciona significativamente de forma cruzada con
otras proteínas. En dichas realizaciones, el grado de unión del anticuerpo u otra molécula orgánica a una proteína “no diana” será menos de aproximadamente el 10% de la unión del anticuerpo u otra molécula orgánica a su proteína diana particular determinada por radioinmunoprecipitación (RIA). Con respecto a la unión de un anticuerpo u otra molécula orgánica a una molécula diana, el término “unión específica” o “se une específicamente a” o es “específico para” un polipéptido particular o un epítopo en un polipéptido diana particular significa la unión que es mediblemente diferente de una interacción no específica. La unión específica se puede medir, por ejemplo, determinando la unión de una molécula en comparación con la unión de una molécula de control, que generalmente es una molécula de estructura similar que no tiene actividad de unión. Por ejemplo, la unión específica se puede determinar por competencia con una molécula de control que es similar a la diana, por ejemplo, un exceso de diana no marcada. En este caso, se indica la unión específica si la unión de la diana marcada a una sonda se inhibe competitivamente por un exceso de la diana no marcada. El término “unión específica” o “se une específicamente a” o es “específico para” un polipéptido particular o un epítopo en una diana polipeptídica particular, como se utiliza en la presente memoria, puede mostrarse, por ejemplo, por una molécula que tiene una Kd para la diana de al menos aproximadamente 10-4 M, preferiblemente al menos aproximadamente 10-5 M, preferiblemente al menos aproximadamente 10-6 M, preferiblemente al menos aproximadamente 10-7 M, preferiblemente al menos aproximadamente 10-8 M, preferiblemente al menos aproximadamente 10-9 M, preferiblemente al menos aproximadamente 10-10 M, preferiblemente al menos aproximadamente 10-11 M, preferiblemente al menos aproximadamente 10-12 M, o más. En una realización, el término “unión específica” se refiere a la unión en la que una molécula se une a un polipéptido o epítopo particular en un polipéptido particular sin unirse sustancialmente a ningún otro polipéptido o epítopo polipeptídico.
La palabra “marcador” cuando se utiliza en la presente memoria se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga directa o indirectamente con el anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica para generar así un anticuerpo, oligopéptido u otra molécula orgánica “marcada”. El marcador puede ser detectable por sí mismo (por ejemplo, marcadores de radioisótopos o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición del sustrato que sea detectable.
Los términos “transferencia de Western”, “inmunotransferencia de Western” “inmunotransferencia” y “Western” se refieren al análisis inmunológico de proteína(s), polipéptidos o péptidos que se han inmovilizado dentro del soporte de membrana. Las proteínas se resuelven primero mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (es decir, SDS-PAGE) para separar las proteínas, seguido de la transferencia de la proteína desde el gel a un soporte sólido, tal como nitrocelulosa o una membrana de nylon. Las proteínas inmovilizadas se exponen después a un anticuerpo que tiene reactividad hacia un antígeno de interés. La unión del anticuerpo (es decir, el anticuerpo primario) se detecta mediante el uso de un anticuerpo secundario que se une específicamente al anticuerpo primario. El anticuerpo secundario se conjuga típicamente con una enzima que permite la visualización del complejo antígeno-anticuerpo mediante la producción de un producto de reacción coloreado o cataliza una reacción enzimática luminiscente (por ejemplo, el reactivo ECL, Amersham).
Como se utiliza en la presente memoria, el término “ELISA” se refiere a un ensayo inmunoabsorbente de unión a la enzima (o EIA). Se conocen en la técnica numerosos métodos y aplicaciones de ELISA, y se describen en muchas referencias (véase, por ejemplo, Crowther, “Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)”, en Molecular Biomethods Handbook, Rapley et al., [eds.], pp. 595-617, Humana Press, Inc., Totowa, N.J. [1998]; Harlow and Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press [1988]; Ausubel et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, Ch. 11, John Wiley & Sons, Inc., New York [1994]. Además, existen numerosos sistemas de ensayos ELISA disponibles comercialmente.
Un método ELISA es un “ELISA directo”, en el que se detecta un antígeno (por ejemplo, un polipéptido o péptido seleccionado de SEQ ID NOs: 1 a 5, preferiblemente SEQ ID NOs: 2 a 5) en una muestra. En una realización del ELISA directo, una muestra que contiene antígeno se expone a un soporte sólido (es decir, estacionario o inmovilizado) (por ejemplo, un pocillo de la placa de microtitulación). El antígeno dentro de la muestra se inmoviliza en la fase estacionaria y se detecta directamente utilizando un anticuerpo conjugado con la enzima específica para el antígeno.
En una realización alternativa, se detecta un anticuerpo específico para un antígeno en una muestra. En esta realización, una muestra que contiene un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo específico para un polipéptido o péptido seleccionado de las SEQ ID NOs: 1 a 5, preferiblemente SEQ ID NOs: 2 a 5, se inmoviliza en un soporte sólido (por ejemplo, un pocillo de la placa de microtitulación). El anticuerpo específico de antígeno se detecta posteriormente utilizando el antígeno purificado y un anticuerpo conjugado con la enzima específica para el antígeno.
En otra realización alternativa, se utiliza un “ELISA indirecto”. En una realización, un antígeno (o anticuerpo) se inmoviliza en un soporte sólido (por ejemplo, un pocillo de la placa de microtitulación) como en el ELISA directo, pero se detecta indirectamente añadiendo primero un anticuerpo (o antígeno) específico de antígeno, seguido después de la adición de un anticuerpo de detección específico para el anticuerpo que se une específicamente al antígeno, también conocidos como anticuerpos “específicos de especie” (por ejemplo, un anticuerpo anti-conejo de cabra), que están disponibles de varios fabricantes conocidos en la técnica.
En otras realizaciones, se utiliza un “ELISA tipo sándwich”, en el que el antígeno (por ejemplo, contenido en la muestra de prueba) se inmoviliza en un soporte sólido (por ejemplo, una placa de microtitulación) mediante un anticuerpo (es decir, un anticuerpo de captura) que se inmoviliza en un soporte sólido y es capaz de unirse al antígeno de interés. Después de la fijación de un anticuerpo de captura adecuado a la fase inmovilizada, se añade una muestra al pocillo de la placa de mircrotitulación, seguido de lavado. Si el antígeno de interés está presente en la muestra, se une al anticuerpo de captura presente en el soporte. En algunas realizaciones, un ELISA tipo sándwich es un ELISA de tipo “sándwich directo”, en el que el antígeno capturado se detecta directamente utilizando un anticuerpo conjugado con la enzima dirigido contra el antígeno. Alternativamente, en otras realizaciones, un ELISA de tipo sándwich es un ELISA de tipo “sándwich indirecto”, en el que el antígeno capturado se detecta indirectamente utilizando un anticuerpo dirigido contra el antígeno, que se detecta después por otro anticuerpo conjugado con la enzima el cual se une al anticuerpo específico del antígeno, formando así un complejo anticuerpoantígeno-anticuerpo-anticuerpo. A continuación, se añaden reactivos indicadores adecuados para detectar el tercer anticuerpo. Alternativamente, en algunas realizaciones, se añade cualquier número de anticuerpos adicionales según sea necesario, con el fin de detectar el complejo antígeno-anticuerpo. En algunas realizaciones preferidas, estos anticuerpos adicionales se marcan o etiquetan, para permitir su visualización y/o cuantificación.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “anticuerpo de captura” se refiere a un anticuerpo que se utiliza en un ELISA de tipo sándwich para unir (es decir, capturar) un antígeno en una muestra antes de la detección del antígeno. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un anticuerpo policlonal contra un polipéptido o péptido seleccionado de SEQ ID NOs: 1 a 5, preferiblemente SEQ ID NOs: 2 a 5, sirve como un anticuerpo de captura cuando se inmoviliza en un pocillo de la placa de microtitulación. Este anticuerpo de captura se une al polipéptido y/o péptido presente en una muestra añadida al pocillo. En una realización de la presente invención, los anticuerpos de captura biotinilados se utilizan en la presente invención junto con un soporte sólido recubierto con avidina. Después se utiliza otro anticuerpo (es decir, el anticuerpo de detección) para unir y detectar el complejo antígeno-anticuerpo, formando de hecho un “sándwich” compuesto de anticuerpo-antígeno-anticuerpo (es decir, un ELISA de tipo sándwich).
Como se utiliza en la presente memoria, un “anticuerpo de detección” es un anticuerpo que lleva un medio de visualización o cuantificación que es típicamente un resto enzimático conjugado que típicamente produce un producto de reacción coloreado o fluorescente después de la adición de un sustrato adecuado. Las enzimas conjugadas comúnmente utilizadas con anticuerpos de detección en el ELISA incluyen peroxidasa de rábano picante, ureasa, fosfatasa alcalina, glucoamilasa y p-galactosidasa. En algunas realizaciones, el anticuerpo de detección está dirigido contra el antígeno de interés, mientras que, en otras realizaciones, el anticuerpo de detección no está dirigido contra el antígeno de interés. En algunas realizaciones, el anticuerpo de detección es un anticuerpo anti-especie. Alternativamente, el anticuerpo de detección se prepara con un marcador tal como biotina, un marcador fluorescente o un radioisótopo, y se detecta y/o cuantifica utilizando este marcador.
Como se utiliza en la presente memoria, los términos “reactivo informador”, “molécula informadora”, “sustrato de detección” y “reactivo de detección” se utilizan en referencia a reactivos que permiten la detección y/o cuantificación de un anticuerpo unido a un antígeno. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el reactivo informador es un sustrato colorimétrico para una enzima que se ha conjugado con un anticuerpo. La adición de un sustrato adecuado al conjugado anticuerpo-enzima da como resultado la producción de una señal colorimétrica o fluorimétrica (por ejemplo, después de la unión del anticuerpo conjugado al antígeno de interés). Otros reactivos de información incluyen, pero no se limitan a, compuestos radiactivos. Esta definición abarca también el uso de biotina y compuestos basados en avidina (por ejemplo, incluyendo pero no limita a neutravidina y estreptavidina) como parte de un sistema de detección.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “señal” se utiliza generalmente en referencia a cualquier proceso detectable que indique que la reacción ha ocurrido, por ejemplo, la unión del anticuerpo al antígeno. Se contempla que todas las señales en forma de radiactividad, productos/reactivos fluorimétricos o colorimétricos encontrarán uso en la presente invención. En varias realizaciones de la presente invención, la señal se evalúa cualitativamente, mientras que, en realizaciones alternativas, la señal se evalúa cuantitativamente.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “amplificador” se utiliza en referencia a un sistema que mejora la señal en un método de detección, tal como un ELISA (por ejemplo, un sistema amplificador de fosfatasa alcalina utilizado en un ELISA).
Métodos de detección de polipéptidos
Los polipéptidos o péptidos de SEQ ID NOs: 1 a 5, preferiblemente SEQ ID NOs: 2 a 5, se pueden detectar, visualizar, determinar, cuantificar, etc. según cualquier método eficaz. Los métodos útiles incluyen, pero no se limitan a, inmunoensayos, radioinmunoensayos (RIA), ELISA, inmunofluorescencia, citometría de flujo, histología, microscopía electrónica, microscopía óptica, ensayos in situ, inmunoprecipitación, transferencia de Western y similares.
Los inmunoensayos se pueden llevar a cabo en líquido o sobre un soporte. Por ejemplo, una muestra (por ejemplo, sangre, orina, tejido, fluidos corporales, preferiblemente suero) se puede poner en contacto e inmovilizar sobre un
soporte o portador de la fase sólida tal como nitrocelulosa u otro soporte sólido capaz de inmovilizar células, partículas celulares o proteínas solubles. El soporte puede después lavarse con tampones adecuados seguido por el tratamiento con un anticuerpo marcado de forma detectable que reconoce específicamente un polipéptido o péptido de SEQ ID NOs: 1 a 5, preferiblemente SEQ ID NOs: 2 a 5. El soporte de la fase sólida se puede lavar después con un tampón una segunda vez para eliminar el anticuerpo no unido. La cantidad de marcador unido sobre el soporte sólido se puede detectar después por medios convencionales.
Diagnóstico de un trastorno óseo y/o cartilaginoso, por ejemplo, osteoartritis
La presente invención proporciona también un método de pronóstico y/o diagnóstico de un trastorno óseo y/o cartilaginoso, tal como osteoartritis y/o esclerosis ósea subcondral, en un mamífero, que se basa en la expresión y/o concentración disminuida de un polipéptido o péptido seleccionado de SEQ ID NOs: 1 a 5, preferiblemente SEQ ID NOs: 2 a 5, preferiblemente para medirse en muestras de suero. La presente invención proporciona un valioso marcador clínico correlacionado con dicho trastorno.
Dichos métodos comprenden determinar si un polipéptido o péptido seleccionado de SEQ ID NOs: 1 a 5, preferiblemente SEQ ID NOs: 2 a 5, está subexpresado en una muestra de prueba en comparación con una muestra normal. Los polipéptidos de SEQ ID NOs: 1 a 5, preferiblemente SEQ ID NOs: 2 a 5, se expresan selectivamente en huesos humanos como se muestra en los ejemplos de esta solicitud. Una presencia disminuida de un polipéptido o péptido seleccionado de SEQ ID NOs: 1 a 5, preferiblemente SEQ ID NOs: 2 a 5, en una muestra derivada de un paciente indica osteoartritis y/o esclerosis ósea subcondral. El ensayo se lleva a cabo utilizando cualquier metodología estándar que mida los niveles (en comparación con controles normales conocidos) de una determinada proteína, por ejemplo, mediante ensayos de transferencia de Western o un ensayo cuantitativo tal como ELISA. Por ejemplo, un formato de ELISA competitivo estándar que utiliza un anticuerpo específico para un polipéptido o péptido seleccionado de SEQ ID NOs: 1 a 5, preferiblemente SEQ ID NOs: 2 a 5, se utiliza para cuantificar los niveles del polipéptido. Alternativamente, se utiliza un ELISA de tipo sándwich que utiliza un primer anticuerpo como el anticuerpo de captura y un segundo anticuerpo específico para un polipéptido o péptido seleccionado de SEQ ID NOs: 1 a 5, preferiblemente SEQ ID NOs: 2 a 5, como un anticuerpo de detección.
En una realización, el método comprende (a) obtener una muestra de prueba de un paciente que se sospecha que tenga un trastorno óseo y/o cartilaginoso (b) detectar un nivel de expresión de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1 a 5, preferiblemente SEQ ID NOs: 2 a 5, analizando un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1 a 5, preferiblemente SEQ ID NOs: 2 a 5; y (c) comparar dicho nivel con el de un control sano, por lo que una disminución en el nivel de expresión de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1 a 5, preferiblemente SEQ ID NOs: 2 a 5 con respecto al nivel de expresión de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 1 a 5, preferiblemente SEQ ID NOs: 2 a 5, en el control, indica un resultado positivo para un trastorno óseo y/o cartilaginoso tal como osteoartritis y/o esclerosis ósea subcondral.
La presente invención se describirá con más detalle mediante los ejemplos siguientes que no deben entenderse como limitantes de ninguna manera.
Ejemplos
Ejemplo 1: cultivo celular de osteoblastos subcondrales
Se obtuvieron placas de hueso subcondral tibial de 10 hombres con OA sometidos a cirugía de reemplazo de rodilla. La edad de los pacientes osciló entre 42 y 83 años. Después de la eliminación cuidadosa del hueso trabecular y el cartílago articular, se diseco el hueso subcondral OA para separar las zonas no escleróticas (NSC) de las SC. Solo las zonas de hueso subcondral con un grosor superior a 2 mm y despojadas o superpuestas por cartílago fibrilado se consideraron como hueso SC. Además, solo las zonas de hueso subcondral con un grosor máximo de 1 mm se consideraron hueso NSC. Después, se obtuvieron osteoblastos de hueso subcondral SC o NSC por excrecencia de explantes. En la confluencia, las células primarias se recolectaron mediante tripsinización, se sembraron (50000 células/cm2) en placas de 12 pocillos (placas complementarias de 12 pocillos, Falcon, BD Biosciences) y se cultivaron durante 3 días en DMEM que contiene FBS al 10%, 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina, HEPES 10 mM. En esta etapa se consideraron como preosteoblastos (sin actividad de fosfatasa alcalina). Los preosteoblastos se utilizaron directamente o se diferenciaron en osteoblastos maduros, manteniéndolos durante 14 días más en un medio de diferenciación, compuesto de DMEM que contenía 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina, HEPES 10 mM, Ultroser G al 2%, un sustituto del suero, 1,25-(OH)2-vitamina D3 10-8 M (Sigma-Aldrich, Belgium), glutamina 2 mM, 50 pg/ml de ácido ascórbico y 20 pg/ml de prolina. Al final de este periodo de diferenciación, las células expresaron un fenotipo de osteoblastos/osteocitos caracterizado por la producción de osteocalcina y fosfatasa alcalina, y fueron capaces de mineralizar su matriz en presencia de p-glicerofosfato.
Para los experimentos, los prosteoblastos u osteoblastos maduros se aclararon y después se cultivaron en un medio libre de BSA/FBS durante 72 horas. El medio nutritivo utilizado fue DMEM suplementado con ITS al 1% (Lonza, Belgium), HEPES 10 mM, 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina, glutamina 2 mM (Lonza, Belgium), 50 pg/ml de ácido ascórbico (Sigma-Aldrich, Belgium), 20 pg/ml de prolina (Invitrogen, Belgium). ITS es un sistema de
crecimiento celular premezclado que contiene en un ml: 0,625 mg de insulina, 0,625 mg de transferrina, 0,625 gg de ácido selenioso. Estos sobrenadantes acondicionados de 72 h se utilizaron para realizar el análisis del secretoma. Ejemplo 2: análisis proteómico
Se realizó un análisis proteómico del secretoma de osteoblastos osteoartríticos utilizando un análisis sin marcaje diferencial cuantitativo y relativo en el sistema nanoUPLC-Synapt HDMS G2 (Waters). Se utilizó a un paciente para realizar pruebas de validación antes de analizar a otros 5 pacientes con secretomas NSC y SC coincidentes.
Identificación de proteínas por LC-ESI-MS/MS
Las muestras se redujeron, alquilaron y redujeron, se concentraron utilizando Amicon (Millipore) con un corte de membrana de 3kDa. El contenido de proteínas de las muestras se cuantificó después utilizando un kit RCDC (Biorad). Se redujeron alícuotas de 15 gg para cada muestra, se alquilaron y redujeron, se concentraron utilizando Amicon (Millipore) con un corte de membrana de 3 kDa, y después se aplicó el kit 2D-Clean up (GE) según las recomendaciones del fabricante, para eliminar las impurezas no compatibles con el análisis por espectrometría de masas. Los gránulos de proteínas después de las etapas de lavado se resolubilizaron además en bicarbonato de amonio 50 mM. Las muestras se digirieron en disolución con tripsina (16 horas a 37 °C relación tripsina/proteínas totales (peso/peso) (1/50), 3 horas a 37 °C con una relación 1/100 en ACN al 80%). La reacción se paró mediante la adición de ácido fórmico. Las muestras se evaporaron a sequedad en un vacío rápido. Las muestras se redisolvieron en agua con ácido fórmico al 0,1% y después se purificó una alícuota correspondiente a 3,5 gg de digestión de proteína para cada muestra utilizando un Zip-Tip C18 High Capacity según las recomendaciones del fabricante. Las muestras se evaporaron a sequedad en un vacío rápido.
Los péptidos se acondicionaron a 3,0 gg en formiato de amonio 100 mM, con 150 fmoles en ADH por volumen inyectado para el estándar de mezcla MPDS (Waters). Los estándares internos enriquecidos en diferentes proporciones entre las muestras enriquecidas con mezcla MPDS 1 o 2 permiten la verificación técnica de toda la separación 2D-UPLC, la adquisición de datos MS-MSE con separación adicional de movilidad iónica, el proceso de identificación de PLGS y también el análisis cuantitativo relativo. Estando presente ADH en una relación MPDS1/MPDS2 = 1.
Análisis diferencial cuantitativo y relativo sin marcaje en un sistema nanoUPLC-SynaptTM HDMSTM G2 (Waters). El principio de este método es comparar de manera cuantitativa, digeridos de péptidos trípticos de muestras complejas y enriquecidas con diferentes estándares internos comerciales que permitan su cuantificación relativa. La alta sensibilidad, resolución y precisión de masas de este espectrofotómetro de masas que combina la espectrometría de movilidad iónica de alta eficiencia (IMS) y la espectrometría de masas de tiempo de vuelo (TOF-MS), junto con el software estadístico desarrollado por Waters, permite la identificación segura de los péptidos y proteínas presentes en las mezclas de péptidos originales a comparar.
El espectrómetro de masas SynaptTM HDMS TM G2 utiliza una fuente de ionización por electrospray (ESI) y permite una detección sensible (límite inferior alrededor de 0,1 a 1 fmol de proteína) con alta resolución y alta precisión de masa (dentro de 10 ppm) para los péptidos analizados. Todos los péptidos fueron fragmentados (MSE) y su secuencia e identidad se obtuvieron después de búsquedas en base de datos y correlación con la masa precisa medida para cada péptido original fragmentado.
El análisis estadístico con ProteinLynx Global SERVER vs2.5 incluyó la identificación de los péptidos y proteínas y su cuantificación relativa sobre la base del co-análisis de un segundo estándar interno compuesto por varias digestiones de proteínas, presentes en ambas muestras para ser comparadas en diferentes proporciones de abundancia. El rango dinámico lineal de esta técnica cuantitativa sin marcar fue de alrededor de 3 a 4 órdenes de magnitud.
Análisis PLGS
La identificación de proteínas se llevó a cabo utilizando la base de datos extraída de UNIPROT Sus Crofa con la adición del manual de las secuencias de proteínas utilizadas como picos y patrones internos: mezclas MPDS.
La puntuación PLGS es una puntuación probabilística correlacionada con el grado de confianza con respecto a la identificación de una proteína. Por lo tanto, un valor alto de la puntuación PLGS se correlaciona con el hecho de que una alta calidad y cantidad de información se observó mediante MS y MSE. La puntuación se atribuye a la proteína después de la búsqueda en la base de datos. Esta búsqueda en la base de datos implica también la búsqueda en una base de datos aleatoria recalculada a partir de la base de datos original para evaluar el riesgo de identificación de proteínas falsos positivos. Para la identificación, el mínimo a considerar es al menos dos péptidos diferentes por proteína identificada y para verificar la tasa de falsos positivos, esta debe ser lo más baja posible (la tasa de falsos positivos, será de un máximo del 4% debido a la configuración utilizada en la búsqueda en la base de datos).
Los resultados muestran que la osteomodulina es más abundante en secretomas no escleróticos que en secretomas escleróticos. Como se mencionó anteriormente, el análisis proteómico del secretoma de osteoblastos osteoartríticos
se realizó, utilizando un análisis diferencial cuantitativo y relativo sin mareaje en un sistema nanoUPLC-Synapt HMDS G2 (Waters) para descubrir la producción de proteína diferencial entre osteoblastos escleróticos y no escleróticos. Con este análisis proteómico y utilizando 6 pacientes, se encontró que la producción de proteína osteomodulina era un 60% menor por osteoblastos escleróticos en comparación con los no escleróticos en 4 pacientes (p < 0,001), mientras que era indetectable en los otros 2 pacientes en el secretoma de los osteoblastos escleróticos.
Además, se encontraron diferentes fragmentos peptídicos de osteomodulina en el estudio proteómico (fragmentos A H) y se compararon con datos de fluidos corporales humanos, a saber, líquido sinovial, orina, plasma). Los fragmentos de osteomodulina y en qué muestras de prueba se encontraron se resumen en la siguiente Tabla 1.
Tabla 1: Fragmentos de osteomodulina identificados mediante el análisis proteómico
Ejemplo 3: Expresión de osteomodulina en osteoblastos. Medida por RT-PCR cuantitativa en tiempo real.
Para mostrar la expresión de osteomodulina en osteoblastos se analizaron los niveles de mRNA de osteomodulina en 5 pacientes. Se aisló el RNA de 1.106 células mediante el sistema de aislamiento de RNA total del mini kit RNeasy (Qiagen, Belgium) y se llevó a cabo la reacción en cadena de polimerasa (PCR) utilizando la premezcla Light Cycler-SYBR premix Ex Taq (Takara, Belgium). La fuente de la plantilla de PCR fue o 3 ng de cDNA de la primera cadena o estándar de DNA purificado. Las siguientes secuencias de cebadores se utilizaron para amplificar el cDNA deseado: HPRT directo 5’-TGTAATGACCAGTCAACAGGG-3’ (SEQ ID NO: 6) e inverso 5’-TGCCTGACCAAGGAAAGC-3’ (SEQ ID NO: 7), Osteomodulina (OMD) directo 5’-TCCTGGTTTGCCTTCTTCACTT-3’ (SEQ ID NO: 8) e inverso 5’-GGGTCAATAGAAGGACACATCAC-3’ (SEQ ID NO: 9). Se utilizó hipoxantinaguanina-fosforribosil-transferasa (HPRT) como un estándar interno y se calculó la proporción de OMD a HPRT. Se analizaron cinco pacientes, y cuatro de ellos son distintos a los utilizados en el análisis proteómico.
Los resultados mostraron que la osteomodulina se expresa menos por los osteoblastos escleróticos que por los osteoblastos no escleróticos. Los niveles de mRNA de osteomodulina se analizaron en 5 pacientes. Como resultado, se observó unas 0,57 ± 0,19 veces entre los preosteoblastos no escleróticos y escleróticos (Figura 1, p = 0,0306) y 0,66 ± 0,27 veces entre los osteoblastos maduros no escleróticos y escleróticos (Figura 1, p = 0,0241). En la Figura 1 se muestra la expresión del gen de osteomodulina por preosteoblastos u osteoblastos maduros, en las células no escleróticas o escleróticas. Los números de copias de mRNA se normalizaron frente al número de copias correspondientes al mRNA de HPRT y los resultados son la media ± SEM de cinco experimentos independientes realizados con biopsia ósea procedente de diferentes donantes. En cada experimento, cada condición experimental se realizó por duplicado. La comparación de los valores medios se realizó mediante el ensayo t pareado.
Ejemplo 4: Detección de la presencia de osteomodulina y fragmentos de osteomodulina en suero humano mediante la transferencia de Western.
Con el fin de evaluar esta hipótesis de que la osteomodulina o los fragmentos de osteomodulina están presentes en el suero humano y podrían ser dirigidos como biomarcadores, muestras de suero humano se analizaron mediante la transferencia de Western utilizando un antisuero policlonal de cabra producido frente a la proteína de osteomodulina completa (R&D systems) en 3 pacientes sanos y sobrenadante de cultivo de osteoblastos.
Se utilizó suero de 12 hombres en experimentos de transferencia de Western, 6 sanos y 6 que sufren OA severa. Antes del experimento, el suero se redujo en IgG y albúmina utilizando kits ProteoPrep (Sigma). Durante este proceso, el suero se diluyó aproximadamente 3,3 veces. Los sobrenadantes de osteoblastos subcondrales se concentraron 20 veces utilizando una columna Amicon Ultra 3 kDa de 2 ml (Millipore). El suero empobrecido (15 pl) o el sobrenadante concentrado de osteoblastos (6 pl = 6 pg de proteínas totales) se fraccionaron mediante electroforesis en gel de poliamida (9%) y se transfirieron a una membrana de PVDF. Las membranas se bloquearon durante la noche a 4 °C con reactivo de bloqueo de Roche. Después las membranas se incubaron durante la noche a 4 °C con un antisuero policlonal de cabra biotinilado, purificado por afinidad, producido contra la proteína osteomodulina completa (BAF2884, R&D Systems) dilución 1:200 en reactivo bloqueante de Roche al 0,5%. Se utilizó estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (HRP) (dilución 1:2500) como detección (Roche). La reacción se
reveló con sustrato de transferencia de Western Luminata classico (Millipore) y se capturó con un ImageQuantl_AS4000 (Amersham).
Los resultados de la transferencia de Western para detectar la presencia de osteomodulina y posibles fragmentos de osteomodulina en suero humano se muestran en la Figura 2 (carriles s59, s67, s62). En los sobrenadantes de cultivo de osteoblastos, la osteomodulina secretada apareció en dos bandas principales a aproximadamente 70 y 75 kDa, pero con un patrón variable de 65 a 120 kDa debido probablemente a una variación en la glicosilación. La banda de osteomodulina fue más fuerte en los osteoblastos no escleróticos (NSC) que en los escleróticos (SC) (Figura 2. Carriles NSC y SC). En muestras de suero humano se observó la forma principal de la proteína osteomodulina (detectada aproximadamente a 54 kDa). También se observaron formas menores a aproximadamente 42, 35 y 30 kDa (véase flechas en la Figura 2), lo que indicó que estaban presentes fragmentos de la proteína en el suero circulante (Figura 2. Carriles s59, s67, s62).
En la Figura 2 se muestran los resultados de la detección por transferencia de Western de osteomodulina, en donde los diferentes carriles mostrados son los siguientes: rhOMD: osteomodulina recombinante humana (control positivo), DMEM: concentración de sobrenadante de cultivo no acondicionado (control negativo). NSC: sobrenadante de osteoblastos no escleróticos, SC: sobrenadante de osteoblastos escleróticos. S59, s67, s62: suero de tres pacientes sanos.
Ejemplo 5: Desarrollo de ELISA dirigido a 2 fragmentos de osteomodulina
A partir de los resultados obtenidos en los Ejemplos 2 y 4 y del procesamiento de datos, los inventores supusieron que la osteomodulina se escinde en varios péptidos antes de que estos péptidos lleguen al suero. En vista de los sitios de escisión de predicción de MMPs, los estudios proteómicos en fluidos biológicos, y el hecho de que se considera que 70 residuos C-terminales permanecen en el tejido óseo, ligados a la hidroxiapatita, se crearon y comprobaron dos polipéptidos como posibles biomarcadores de osteoartritis, OMD1 131-KIDYGVFAKLPNLLQLHLEHNNLEEFPFPLPKSLERLLLGYNEISKLQTNAMDGLVNLTMLDLCYNYLHDSLLKDKIFAK MEKLMQLNLCSNR-223 (SEQ ID NO: 2) y OMD2 236-MYLSLENNSISSIPEKYFDKLPKLHTLRMSHNKLQ DIPYNIFNLPNIVELSVGHNKLKQAF-296 (SEQ ID NO: 3).
Preparación de antisueros dirigidos a OMD1 y OMD 2
Para verificar la hipótesis de que los fragmentos de osteomodulina podrían encontrarse en el suero y puedan servir como biomarcadores se inmunizaron ratones BalbC frente a 2 péptidos de osteomodulina, OMD1a (148-LEHNNLEEFPFPLK-162; SEQ ID NO: 4) y OMD2a (261-LRMSHNKLQDIPYNI-276; SEQ ID NO:5) péptidos acoplados a KLH, respectivamente. Los dos diferentes antisueros obtenidos fueron específicos de estas secuencias y no mostraron reacción cruzada con los péptidos homólogos al 60% contenidos en la proteína Lumican. Además, el antisuero dirigido a OMD2 no reaccionó de forma cruzada con la secuencia 268-290 de osteomodulina. El cribado se realizó utilizando péptidos biotinilados, sin la cisteína añadida para el acoplamiento de KLH, fijados en una placa de 96 pocillos revestida con estreptavidina. El ELISA competitivo se llevó a cabo utilizando un péptido no biotinilado y desacoplado como competidor, con una curva estándar de concentraciones comprendidas entre 520 nM y 8 nM. Se utilizó IgG anti-ratón de cabra AffiniPure conjugada con peroxidasa, específico de fragmentos Fcy (Jackson ImmunoResearch) como anticuerpo secundario (dilución 1:10000). Se demostró que la dilución de sueros humanos era paralela a la curva estándar de dilución 1:2 a 1:8 en tampón de reactivo diluyente (D-Tek, Belgium). Los ensayos se realizaron a una dilución 1:3 de los sueros para humanos y 1:5 para cobayas. Los sobrenadantes del cultivo se analizaron sin diluir.
Ejemplo 6: ELISA utilizando suero humano para la detección de los fragmentos de osteomodulina
Los anticuerpos monoclonales dirigidos a OMD1 y OMD2 preparados en el Ejemplo 5 se utilizaron para detectar posibles fragmentos de osteomodulina en suero humano mediante ELISA. En suero humano, se cuantificó OMD1 y OMD2 en 33 pacientes sanos y 24 pacientes con OA. En la población sana, 11 tenían entre 20 y 30 años, 12 entre 31 y 45 años y 10 entre 46 y 65 años. Los resultados se resumen en la Figura 4. El rango de edad en la población con OA fue 44-83 años. OMD1 y OMD2 fueron significativamente menores en pacientes con OA en comparación con pacientes sanos (p = 0,0137 y 0,0013, respectivamente, Figura 4). Los niveles no fueron significativamente diferentes entre hombres y mujeres. El nivel de OMD1 no fue significativamente diferente con respecto a la edad en pacientes sanos, pero el nivel de OMD2 fue menor en pacientes jóvenes de 20 a 30 años en comparación con los grupos de 31 a 45 y 46 a 65 años.
Ejemplo 7: ELISA utilizando sobrenadante de cultivo de osteoblastos para la detección de fragmentos de osteomodulina
Además, se llevó a cabo un ELISA utilizando los anticuerpos policlonales dirigidos a OMD1 y OMD2, preparados en el Ejemplo 5 para detectar posibles fragmentos de osteomodulina en el sobrenadante del cultivo de osteoblastos. En estas pruebas de ELISA se detectaron fragmentos en el sobrenadante de cultivo de osteoblastos y también se confirmó la disminución de OMD1 y OMD2 en secretoma esclerótico en comparación con el secretoma no esclerótico. Los resultados se resumen en la Figura 3. La Figura muestra la concentración de OMD1 y OMD2 en el sobrenadante de cultivo de osteoblastos y preosteoblastos no escleróticos o escleróticos. Las medias ± SD de 2
Claims (9)
1. Uso de la proteína osteomodulina (OMD) o un fragmento de la proteína osteomodulina (OMD) en el pronóstico y/o diagnóstico in vitro de osteoartritis y/o esclerosis ósea subcondral de mamíferos, preferiblemente individuos humanos en donde la proteína osteomodulina de longitud completa es la que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:1,
en donde la proteína osteomodulina (OMD) es una proteína representada por las posiciones de aminoácidos 1 421 o por las posiciones de aminoácidos 21-421 de SEQ ID NO:1; y
en donde dicho fragmento se selecciona del grupo que consiste en a) y b)
a) OMD-(131 -223),
b) OMD-(236-296)
2. Uso de la proteína osteomodulina (OMD) o un fragmento de la proteína osteomodulina (OMD) según la reivindicación 1, en donde la expresión disminuida o la concentración disminuida en fluidos corporales de dicha proteína osteomodulina o su(s) fragmento(s) en comparación con los individuos sanos indican la aparición de osteoartritis y/o esclerosis ósea subcondral.
3. Uso de la proteína osteomodulina (OMD) o un fragmento de la proteína osteomodulina (OMD) según la reivindicación 2, en donde dicha expresión disminuida o concentración disminuida se mide en un fluido corporal seleccionado del grupo que consiste en orina, secreciones, líquido intersticial, sangre, líquido sinovial, suero, linfa del líquido cefalorraquídeo, preferiblemente suero.
4. Método para pronóstico y/o diagnóstico in-vitro de osteoartritis y/o esclerosis ósea subcondral, que comprende las siguientes etapas:
i) medir la proteína osteomodulina (OMD) o un fragmento o fragmentos de la proteína osteomodulina (OMD) en muestras de fluidos corporales de individuos mamíferos, preferiblemente muestras de suero humano; ii) decidir que niveles disminuidos de proteína osteomodulina (OMD) o de dicho(s) fragmento(s) en comparación con los niveles en los fluidos corporales, preferiblemente suero, de los individuos sanos indican la aparición de osteoartritis y/o esclerosis ósea subcondral
en donde la proteína osteomodulina de longitud completa es la que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1,
en donde la proteína osteomodulina (OMD) es una proteína representada por las posiciones de aminoácidos 1 421 o por las posiciones de aminoácidos 21-421 de SEQ ID NO:1; y
en donde dicho fragmento se selecciona del grupo que consiste en a) y b)
a) OMD-(131 -223),
b) OMD-(236-296).
5. Método para determinar o comprobar o diagnosticar el efecto terapéutico del tratamiento de osteoartritis y/o esclerosis ósea subcondral en un individuo mamífero, preferiblemente un individuo humano, que comprende las siguientes etapas:
i) medir la proteína osteomodulina (OMD) o un fragmento o fragmentos de la proteína osteomodulina (OMD) en muestras de fluidos corporales, preferiblemente muestras de suero, de dichos individuos durante o después del tratamiento;
ii) decidir que cualquiera de (1) a (3)
(1) los niveles normales de la proteína osteomodulina (OMD) o de dichos fragmentos en las muestras obtenidas en la etapa i), o
(2) los niveles aumentados de la proteína osteomodulina (OMD) o de dichos fragmentos en las muestras obtenidas en la etapa i) en comparación con los niveles en las muestras de fluidos corporales, preferiblemente muestras de suero, de dichos individuos antes de dicho tratamiento, o
(3) los niveles aumentados de la proteína osteomodulina (OMD) o de dichos fragmentos en dichas muestras obtenidas en la etapa i) en comparación con los niveles en las muestras de fluidos corporales, preferiblemente muestras de suero, de individuos sanos,
indican un efecto terapéutico del tratamiento de osteoartritis y/o esclerosis ósea subcondral en dichos individuos
en donde la proteína osteomodulina de longitud completa es la que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1,
en donde la proteína osteomodulina (OMD) es una proteína representada por las posiciones de aminoácidos 1 421 o por las posiciones de aminoácidos 21-421 de SEQ ID NO:1; y
en donde dicho fragmento se selecciona del grupo que consiste en a) y b)
a) OMD-(131 -223)
b) OMD-(236-296).
6. Fragmento de la proteína osteomodulina, en donde la proteína osteomodulina de longitud completa es la que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1, y en donde dicho fragmento se selecciona del grupo que consiste en a) a b):
a) OMD-(131 -223),
b) OMD-(236-296).
7. Uso de una pareja de unión inmunológica que se une específicamente a la proteína osteomodulina (OMD) o un fragmento de la proteína osteomodulina (OMD) para su uso en el pronóstico y/o diagnóstico in vitro de osteoartritis y/o esclerosis ósea subcondral de mamíferos, preferiblemente individuos humanos
en donde la proteína osteomodulina de longitud completa es la que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1, y en donde dicho fragmento se selecciona del grupo que consiste en a) a b): a) OMD-(131 -223),
b) OMD-(236-296).
8. La pareja de unión inmunológica que se une específicamente a un fragmento de osteomodulina, en donde la proteína osteomodulina de longitud completa es la que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 1, y en donde dicho fragmento se selecciona del grupo que consiste en a) a b):
a) OMD-(131 -223),
b) OMD-(236-296).
9. Uso de un kit que comprende la pareja de unión inmunológica según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 8, en el pronóstico y diagnóstico in vitro de osteoartritis y/o esclerosis ósea subcondral de mamíferos;
en donde dicha pareja de unión inmunológica se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanizados, fragmentos Fc, fragmentos Fab, anticuerpos monocatenarios (scFv), anticuerpos quiméricos, biobetters y otros fragmentos de anticuerpo específicos de antígenos.
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