ES2819206T3 - Transcriptoma génico de amplio espectro del virus del papiloma y genotipo como biomarcadores de las etapas del cáncer asociadas al virus del papiloma - Google Patents

Transcriptoma génico de amplio espectro del virus del papiloma y genotipo como biomarcadores de las etapas del cáncer asociadas al virus del papiloma Download PDF

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Abstract

Un método para determinar el riesgo de un paciente a desarrollar cáncer inducido por virus oncogénicos, como el VPH del grupo alfa, que comprende: a) enriquecer los ARN virales en una muestra mediante amplificación previa aleatoria o de consenso y / o reacción de transcriptasa inversa específica, preferiblemente amplificación previa de consenso, b) secuenciar el ADNc producido en el paso a) y generar lecturas de dicho ADNc, c) determinar el número de lecturas que coinciden con dichos virus en función de la discriminación de especies y determinar las especies de alto riesgo más prevalentes presentes en la muestra en relación con otras especies, d) determinar dentro de dichas especies de alto riesgo más prevalentes el número relativo de lecturas que coinciden con al menos un gen oncogénico en comparación con al menos un gen no oncogénico, preferiblemente genes oncogénicos en comparación con genes no oncogénicos, e) calcular las proporciones dentro de dicha especie de alto riesgo de lecturas que coinciden con al menos un gen oncogénico frente al correspondiente gen estructural o regulador interespecies, preferiblemente genes oncogénicos frente a los correspondientes genes estructurales o reguladores interespecies, f) determinar el riesgo de desarrollar cáncer inducido por virus oncogénicos en pacientes en los que dicha proporción tiende a infinito, en el que el enriquecimiento de los ARN virales se realiza mediante una transcripción inversa de los ARN virales, y una amplificación del ADNc producido mediante PCR múltiple con una composición de cebadores específica de VPH del grupo alfa que comprende al menos uno de los siguientes grupos de pares de cebadores: - grupo SD1-SA1 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 397-398; 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Description

DESCRIPCIÓN
Transcriptoma génico de amplio espectro del virus del papiloma y genotipo como biomarcadores de las etapas del cáncer asociadas al virus del papiloma
Antecedentes de la invención
Las infecciones por VPH están asociadas con el desarrollo del carcinoma de cuello uterino y, posiblemente, con otros cánceres como los de cabeza y cuello. Por ejemplo, el cáncer de cuello uterino es uno de los cánceres más comunes entre las mujeres en todos los países. Los virus del papiloma humano (VPH) son los agentes etiológicos responsables de más del 99% de todos los cánceres de cuello uterino. Los VPH son virus de ADN que se transmiten comúnmente a través del contacto sexual e incluyen más de 100 genotipos. Los virus del papiloma humano son virus de ADN pequeños, sin envoltura y de aproximadamente 55 nm de diámetro que infectan las células basales y se replican en el núcleo de las células epiteliales escamosas. La organización genómica de cada uno de los virus del papiloma es similar y se puede dividir en tres regiones funcionales. Después de la infección, se expresan los primeros genes del VPH (E6, E7, E1, E2, E4 y E5) y el ADN viral se replica a partir de la forma episómica del virus. En la capa superior del epitelio, el genoma vírico se replica más y se expresan los genes tardíos (L1 y L2) y E4. El virus diseminado puede iniciar entonces nuevas infecciones.
Los virus del papiloma humano (VPH) son virus que presentan una gran diversidad genética. Alrededor de cien tipos de VPH que se clasifican en diferentes géneros, principalmente los géneros alfa, beta y gamma. Dentro de estos géneros se han identificado muchas especies. La clasificación del VPH se basa en la secuencia genómica del gen L1 que codifica la proteína de la cápside principal. Los diferentes tipos de VPH se caracterizan por su tropismo tisular, y se pueden distinguir los tipos de VPH o bien con tropismo cutáneo o bien mucoso. También se caracterizan por su potencial oncogénico y se pueden distinguir entre tipos de VPH altamente oncogénicos (VPH de alto riesgo) y tipos de VPH débilmente oncogénicos (VPH de bajo riesgo). Las infecciones por VPH son muy comunes y, según los tipos de VPH y las defensas inmunitarias del huésped, la infección desaparece en 6-12 meses en el 90% de las mujeres. Según un informe reciente de los CDC, hay 14 millones de nuevas infecciones por VPH cada año solo en los EE. UU., lo que representa el 50% de las infecciones de transmisión sexual (ETS). Esto significa que cada año 1,4 millones de personas corren el riesgo de desarrollar un cáncer inducido por el VPH. Se han aprobado dos vacunas contra el VPH, pero no se utilizan da manera amplia para el total de la población. Además, estas vacunas solo cubren varios tipos como VPH6, 11, 16 y 18 y dejan desprotegida a una parte importante de la población.
Dado que los VPH son virus comunes que generalmente pueden causar verrugas y, debido además que existen más de 100 tipos de VPH, el diagnóstico y el control de la enfermedad son difíciles. Todavía es más complicado aún si se tiene en cuenta que la mayoría de los VPH se consideran inofensivos y, hasta ahora, solo se ha demostrado que aproximadamente 14 tipos estaban asociados a un mayor riesgo de padecer cáncer. Estos tipos de VPH afectan al tracto genital y se transmiten a través del contacto sexual con la pareja infectada. A día de hoy, los tipos de VPH se clasifican como VPH de bajo o alto riesgo, según las observaciones de los grupos clínicos. Los VPH de bajo riesgo se clasifican según su asociación a las verrugas genitales; mientras que los VPH de alto riesgo se identifican como un número limitado de tipos que se han mostrado que inducen cánceres de cuello uterino, vulva, vagina y ano en las mujeres. En los hombres, estos VPH de alto riesgo pueden provocar cánceres de ano y pene.
Los biomarcadores del cáncer en los cánceres relacionados con el VPH son muy necesarios para realizar un mejor diagnóstico, pronóstico y control terapéutico en las etapas precancerosas y cancerosas de la enfermedad.
A pesar de la responsabilidad de los VPH de alto riesgo en la mayoría de los cánceres de cuello uterino, las pruebas de detección del cáncer se basan principalmente en la citología de Papanicolaou y no en las pruebas del VPH. Esto se debe en gran parte a las limitaciones de las pruebas moleculares actuales. La identificación del ADN del VPH de los VPH de alto riesgo no predice por completo el cáncer: solo las altas cargas del VPH16 y la posibilidad de persistencia durante meses del VPH de alto riesgo están asociadas a tener un mayor riesgo de desarrollo del cáncer. Por lo tanto, el uso de pruebas de ADN del VPH, como ensayo de detección, muestra un valor predictivo positivo bajo para las lesiones CIN2 / 3. La expresión de los ARNm de E6 y E7 de los VPH de alto riesgo se ha propuesto como un mejor marcador del desarrollo del cáncer, pero E6 y E7 se expresan durante la infección aguda por VPH, por lo que sigue siendo difícil definir un umbral de expresión asociado a la persistencia y el desarrollo del cáncer.
Las lesiones intraepiteliales de bajo grado son un sitio de replicación vírico productivo. La progresión hacia lesiones intraepiteliales de alto grado y los carcinomas invasivos están asociados con las infecciones persistentes por VPH de alto riesgo y, a menudo, con la integración del genoma del VPH en los cromosomas del hospedador, la pérdida o alteración de E2 y la consiguiente regulación positiva de las expresiones de E6 y E7. E6 y E7 son los oncogenes del virus y la expresión de estos genes es necesaria para la transformación maligna. Entre otros, E6 y E7 median la degradación de los supresores tumorales p53 y RB, respectivamente, e interfieren con la regulación del ciclo celular. Las proteínas E6 y E7 de los tipos de bajo riesgo son menos competentes para interferir con las funciones p53 y pRb que las proteínas E6 / E7 de los tipos de alto riesgo. Por tanto, las infecciones por VPH de bajo riesgo se asocian con proliferaciones benignas, como las verrugas genitales y las lesiones intraepiteliales de bajo grado con tendencia a la regresión.
Hoy en día existen diferentes técnicas para detectar el VPH basadas en la tipificación del ADN. Por ejemplo, los kits COBAS (Roche) y APTIMA (GEN-PROBE) son pruebas PCR de dianas específicas destinadas al análisis cualitativo por medio de la detección in vitro del ARNm del gen L1 de 14 tipos de virus del papiloma humano (VPH) considerados de alto riesgo (VPH 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 y 68). Sin embargo, estos dos ensayos del VPH no distinguen entre las diferencias de los 14 tipos de alto riesgo. De hecho, solo se pueden obtener 6 resultados diferentes: VPH16 positivo o negativo, VPH18 positivo o negativo, otros 12 VPH positivos o negativos. La prueba de genotipado LINEAR ARRAY VPH (Roche) es una prueba cualitativa que detecta 37 genotipos de virus del papiloma humano de alto y bajo riesgo, incluidos los que se consideran factores de riesgo significativo para la progresión de lesiones intraepiteliales escamosas de alto grado (HSIL) al cáncer de cuello uterino. Esta prueba es una prueba cualitativa in vitro para la detección del virus del papiloma humano en muestras clínicas. La prueba utiliza la amplificación del ADN diana mediante PCR del gen tardío L1 de los genotipos de ADN del VPH 6, 11, 16, 18, 26, 31,33, 35, 39, 40, 42, 45, 51,52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 61, 62, 64, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 (MM9) (nuevo tipo relacionado con VPH73), 81, 82 (MM4) (nuevo tipo relacionado con VPH82), 83 (MM7) (nuevo tipo relacionado con VPH83), 84 (MM8) (nuevo tipo relacionado con VPH84), IS39 y CP6108. La prueba de ADN del VPH del digen HC2, desarrollada por Qiagen, se basa en la hibridación de captura de ADN del VPH (gen L1) para la detección cualitativa de 18 tipos (VPH 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68 [68a], 73, 82MM4 [82IS39]) en muestras cervicales.
Más recientemente, se ha puesto a disposición NucliSENS EasyQ VPH para la detección cualitativa de ARNm de los oncogenes E6 / E7 de 5 VPH específicos de alto riesgo 16, 18, 31,33 y 45. Se ha propuesto la detección de VPH E6 y E7 como una mejor correlación del desarrollo del cáncer que el ADN del VPH.
Además, el documento WO2011 / 088573 (Su Majestad la Reina en Derecho de Canadá, representada por el Ministro de Salud), describe un conjunto de sondas para detectar e identificar 46 especies específicamente dirigidas del virus del papiloma humano de las mucosas (VPH). Estas sondas se utilizan como un ensayo múltiple basado en la amplificación por PCR anidada y la tecnología Luminex xMAP para genotipar el ADN de los genes L1 de los tipos de VPH 6, 11, 13, 16, 18, 26, 30, 31,32, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 56, 58, 59, 61, 62, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 81,82 ,83 , 84, 85, 86, 87, 89, 90, 91 y 97.
El documento US2006222656 describe métodos para tratar el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (SCCHN) utilizando antígenos de Trojan y composiciones inmunogénicas que comprenden los antígenos de Trojan. El documento WO2010129941 describe un método para determinar la mayor probabilidad de desarrollar cáncer de cuello uterino mediante el análisis de los niveles de expresión de un ARNm de E6 y / o ARNm de E7 del virus del papiloma humano (VPH).
Todas las pruebas moleculares descritas actualmente para la identificación del VPH utilizan técnicas moleculares basadas en la unión de oligonucleótidos específicos del genotipo de especie / género para amplificar y / o sondar específicamente los ácidos nucleicos del virus del papiloma. Además, todas estas pruebas comparten una detección cualitativa específica restringida a algunos VPH específicos, pero no a un rango general y amplio del VPH. Finalmente, la presencia de los ácidos nucleicos del VPH, especialmente del ADN, no significa la presencia de displasia cervical o cáncer de cuello uterino.
Los presentes inventores analizaron datos clínicos de grupos de individuos infectados por VPH y consideraron que aproximadamente el 15% de los pacientes no daban positivo para alguno de los VPH de alto riesgo clasificados aunque, sin embargo, tenían riesgo de desarrollar cánceres inducidos por VPH. Por lo tanto, existe la necesidad de diseñar un nuevo ensayo del VPH con un enfoque transversal y amplio que no se limite a unos pocos tipos específicos del VPH. Además, debe caracterizarse el perfil de expresión de los genes virales. De hecho, las infecciones por VPH durante el desarrollo del cáncer están asociadas a cambios de infecciones productivas a infecciones no productivas caracterizadas por un alto nivel de E6 y E7 y bajos niveles de expresión de E2 y de genes tardíos, a menudo asociados a una integración del ADN del VPH en los cromosomas del huésped, al menos para VPH16. En relación con la presente invención, los inventores investigaron la homología compartida de secuencias de todos los tipos de VPH y no se encontraron homologías globales claras dentro de las características entre las secuencias de polipéptidos o ácidos nucleicos.
Los inventores diseñaron cebadores de consenso dentro de todos los intra-subgrupos alfa, y la composición de cebadores específica de la especie de VPH que abarca uniones de empalme, regiones genómicas y no empalmadas, y regiones de transcripción de fusión humana de cada transcripción del VPH. Por lo tanto, se proporcionan a continuación varias composiciones de cebadores dependiendo de la especificidad y cobertura deseadas del ensayo. Los inventores proponen en este documento un enfoque para detectar un cáncer o el riesgo de desarrollar un cáncer que no se limite a los VPH específicos que se conocen hoy en día como clasificados como de alto riesgo. Por tanto, para evitar la limitación de las pruebas actuales anterior mencionadas, la presente invención no se basa en la unión de los 14 oligonucleótidos específicos de genotipo / especie de HR anteriores para amplificar específicamente y / o sondear unos cuantos ADN o unas cuantas transcripciones del virus del papiloma. Se basa en un aspecto en la identificación de las diferentes transcripciones de genes basadas en la secuenciación de alto rendimiento, lo que permite otra identificación de transcripciones / especies / genotipos en función de la comparación de las secuencias con las secuencias conocidas del virus del papiloma alfa en base a los datos relevantes. Esto tiene la ventaja de poder ser capaces de probar simultáneamente las diferentes transcripciones de un gran número de genotipos / especies del virus del papiloma y de identificar biomarcadores relevantes en una amplia gama de VPH de alto riesgo y bajo riesgo.
La invención también proporciona cebadores de consenso genéricos que permiten una amplia amplificación o amplificación previa de genes relevantes del VPH alfa no dependientes de las transcripciones específicas de los 14 VPH de alto riesgo, susceptibles de someterse a las pruebas de PCR o que mejoran la relación señal / ruido en relación con la secuenciación de alto rendimiento mencionada anteriormente.
Más particularmente, la invención se refiere a la identificación de todas las transcripciones de E6 / E7 en una muestra dada, y al reconocimiento de a qué especies / genotipos pertenecen, clasificando las lecturas correspondientes a otras transcripciones virales del mismo genotipo / especie para calcular las proporciones que definen la abundancia molecular relativa de las transcripciones dentro de este genotipo o estos genotipos proporcionados como biomarcadores en el desarrollo del cáncer.
Consecuentemente, los inventores diseñaron un kit para el diagnóstico del VPH basado en una selección amplia del nivel de ARNm de E6 y / o E7 dentro del grupo alfa de los VPH. En la prueba descrita con detalle a continuación, los inventores diseñaron cebadores de consenso que permitían la amplificación o amplificación previa de los ARNm de E6 y / o E7 de los genotipos del subgrupo alfa para detectar su nivel de expresión, en el que un nivel de expresión significativo de E6 y / o E7 de los VPH del grupo alfa en un solo punto de tiempo o a través del tiempo era indicativo de tener un cierto riesgo de desarrollar los cánceres inducidos por el VPH. Después de la amplificación de amplio espectro con cebadores de VPH de consenso, o con cebadores de VPH diseñados para realizar un primer paso de la reacción de transcripción inversa específica de VPH, los inventores también han propuesto cuantificar E6 y/o E7 para ser identificadas como las lecturas suministradas por las técnicas de secuenciación de última generación.
La presente invención también proporciona un método para determinar el nivel de expresión de proteínas virales tardías o estructurales tales como L1 o L2. En tal realización, se determina la relación R1 entre E6 y / o E7, y L1 y / o L2, y se compara con la relación R encontrada en infecciones por VPH de bajo riesgo o no persistentes, en donde una relación R1 por debajo de un valor de referencia R es indicativa de padecer infecciones por VPH asociadas con un mayor riesgo de desarrollar neoplasias genitales y cáncer.
Descripción general de la invención
La invención proporciona un método de secuenciación de alto rendimiento que permite una cuantificación relativa de las lecturas a través de los virus oncogénicos, como el virus del polioma o el VPH del grupo alfa, preferiblemente el VPH del grupo alfa, que comprende el enriquecimiento de los ARN virales en una muestra mediante la pre­ amplificación aleatoria o de consenso y / o la reacción de transcriptasa inversa específica, determinando el número de lecturas que coinciden con dichos virus en función de la discriminación de especies, comparando las especies de alto riesgo más prevalentes, determinando además dentro de dicha especie de alto riesgo más prevalente el número relativo de lecturas que coinciden con al menos un gen oncogénico, preferiblemente dos genes oncogénicos, en comparación con al menos un gen no oncogénico, preferiblemente varios genes no oncogénicos. A partir de estos pasos de discriminación de especies y números de lectura entre especies, se calculan las proporciones para detectar el aumento en el nivel relativo de especies de alto riesgo frente a especies de bajo riesgo y las proporciones dentro de dichas especies de alto riesgo de lecturas que coinciden con genes oncogénicos frente a genes estructurales o reguladores. Aplicada al VPH, esta prueba comprende determinar el nivel de lecturas de VPH de alto riesgo frente al de las lecturas de VPH de bajo riesgo a través de VPH del grupo alfa, determinando la proporción de genes tempranos versus tardíos (E6 y / o E7 versus L1 y / o L2) dentro de los VPH de alto riesgo más prevalentes, y evaluar el riesgo de desarrollar cáncer inducido por VPH en aquellos pacientes cuya dicha proporción tiende a infinito. Se pueden obtener relaciones refinadas utilizando un filtro aplicado en las lecturas que mapean específicamente los eventos de empalme del ARN.
El alcance de la invención está definido por los términos de las reivindicaciones adjuntas.
En una realización, el método sirve para evaluar el riesgo de desarrollar un cáncer inducido por VPH en pacientes infectados con al menos dos especies de VPH diferentes del grupo alfa.
En una realización, el método sirve para evaluar el aclaramiento del virus del VPH en pacientes a los que se les administra la vacuna contra el VPH preventiva o curativa del VPH.
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para determinar el riesgo que tiene un paciente de desarrollar un cáncer inducido por virus oncogénicos según las reivindicaciones 1 -6.
En el presente documento se describe un método para determinar el riesgo que tiene un paciente de desarrollar un cáncer inducido por virus oncogénicos, como el virus del polioma o el VPH del grupo alfa que comprende:
a) enriquecer los ARN virales en una muestra usando amplificación previa aleatoria o de consenso y / o la reacción de transcriptasa inversa específica, preferiblemente la amplificación previa de consenso;
b) secuenciar el ADNc producido en el paso a) y generar lecturas de dicho ADNc;
c) determinar el número de lecturas que coinciden con dichos virus basándose en la discriminación de especies y determinar las especies de alto riesgo más prevalentes presentes en la muestra en relación con otras especies;
d) determinar dentro de dicha especie de alto riesgo más prevalente el número relativo de lecturas que coinciden con al menos un gen oncogénico en comparación con al menos un gen no oncogénico, preferiblemente genes oncogénicos en comparación con genes no oncogénicos;
e) calcular las proporciones dentro de dicha especie de alto riesgo de las lecturas que coinciden con al menos un gen oncogénico frente al correspondiente gen estructural o regulador interespecies, preferiblemente genes oncogénicos frente a los correspondientes genes estructurales o reguladores interespecies;
f) determinar el riesgo de desarrollar un cáncer inducido por virus oncogénicos en pacientes en los que dicha relación tiende al infinito, como por ejemplo cuando la relación R está entre 0,25, 0,4, 0,5, 1 hasta infinito.
Este método es adecuado para el diagnóstico o pronóstico del riesgo de desarrollar un cáncer inducido por un virus en un sujeto humano.
Este método es particularmente adecuado para evaluar el riesgo de desarrollar un cáncer inducido por VPH en pacientes infectados con al menos dos especies diferentes de VPH del grupo alfa, por ejemplo, múltiples infectados con VPH16, VPH35 y VPH6.
Este método también es específicamente adecuado para evaluar la eliminación del virus del VPH en pacientes que reciben la vacuna contra el VPH preventiva o curativa contra el VPH. Se puede realizar antes de la vacunación para confirmar el potencial que posee la vacuna para eliminar las infecciones existentes o, después de la vacunación, para su seguimiento.
En una realización preferida de la etapa a), el enriquecimiento de los ARN virales se realiza mediante una transcripción inversa de los ARN virales y una amplificación del ADNc producido mediante PCR múltiple con una composición de cebadores específica del VPH del grupo alfa que abarca uniones de empalme, regiones genómicas y no empalmadas, y regiones de transcripción de fusión humana de cada transcripción del VPH.
En otra realización, la transcripción inversa se realiza con hexámeros aleatorios.
En otra realización, la transcripción inversa se realiza con cebadores específicos del VPH.
En otra realización, la transcripción inversa (RT) y la amplificación múltiple se realizan en el mismo tubo (RT-PCR de un solo paso).
En otra realización preferida de la etapa a) anterior, la amplificación previa de consenso comprende la transcripción inversa aleatoria de los ARN virales seguida de una amplificación múltiple de las transcripciones del VPH.
Por suerte, la transcripción inversa aleatoria se realiza con hexámeros aleatorios.
Por suerte, la amplificación múltiple de las transcripciones de VPH se realiza con cebadores específicos del VPH.
En una realización preferida del paso b) anterior, la secuenciación es un método de secuenciación de alto rendimiento.
La proporción (R) se calcula como el número de lecturas de al menos una transcripción temprana de VPH16 con respecto a la cantidad de lecturas de al menos una transcripción tardía de VPH16, con una proporción (R) más alta que se correlaciona con un mayor riesgo de desarrollar un cáncer inducido por VPH maligno grave. Este método incluye además realizar la correlación de un mayor número de lecturas de transcripciones de VPH16 en relación con las lecturas de transcripciones de otras especies del VPH con un mayor riesgo de desarrollar algún cáncer maligno inducido por VPH grave. Para obtener un número suficiente de lecturas, el ADNc se genera usando cebadores aleatorios o usando cebadores específicos del VPH.
Por ejemplo, la relación se calcula calculando una relación (R1) del número de lecturas de una transcripción de VPH de alto riesgo E6 y / o E7 con respecto al número de lecturas de dicha transcripción de VPH de alto riesgo L1 y / o L2 y se calcula la proporción calculando la proporción (R2) del número de lecturas de una segunda transcripción de VPH de alto riesgo E6 y E7 respecto al número de lecturas de dicha segunda transcripción de VPH de alto riesgo L1 y L2. Este método es aplicable para determinar el número de lecturas de la secuencia de VPH de al menos 2 especies de VPH del grupo Alfa, incluido, por ejemplo, el VPH16.
En una realización específica pero aplicada a virus oncogénicos, en general, como el polioma o el VPH, el método de la invención comprende:
a) opcionalmente, pretratar ácidos nucleicos para eliminar el ADN genómico humano,
b) opcionalmente, preamplificar los ARNm virales, donde dichos ARNm virales comprenden ARNm oncogénicos y al menos otro ARNm,
c) secuenciar el ARNm, o sus ADNc, obtenidos después de los pasos a) y b), en la muestra de un sujeto humano, d) identificar las lecturas correspondientes a dichos ARNm oncogénicos,
e) identificar a qué especies o genotipos pertenecen dichos ARNm oncogénicos del paso d),
f) clasificar las lecturas correspondientes a dicho al menos otro ARNm vírico, o sus ADNc obtenidos después de las etapas a) y b), del mismo genotipo o especie identificada en la etapa e),
g) opcionalmente, identificar las transcripciones de fusión como una firma de eventos de integración de ADN vírico en el cromosoma del huésped y / u otros biomarcadores de células cancerosas humanas,
h) opcionalmente, eliminar todas las demás secuencias, incluidas las secuencias humanas que no son secuencias identificadas y clasificadas siguiendo los pasos d), e), f) y g),
i) calcular las proporciones R que definen la abundancia molecular de dichos ARNm oncogénicos en relación con dicho al menos otro ARNm vírico del mismo genotipo o especie de la etapa f),
en el que un aumento de las proporciones R se correlaciona con un mayor riesgo de desarrollar un cáncer inducido por virus.
Por cáncer inducido por virus, se contempla más particularmente en la presente memoria el cáncer inducido por el virus de Papova, más específicamente el cáncer inducido por el virus del papiloma o polioma, preferiblemente el cáncer inducido por el virus del papiloma.
Por otros ARNm virales en la etapa f) se entienden ARNm de genes virales seleccionados de genes estructurales, por ejemplo genes de la cápside, así como genes reguladores y genes de replicación / transcripción.
La presente invención se refiere a un método para el diagnóstico o pronóstico del riesgo de desarrollar un cáncer inducido por VPH según las reivindicaciones 7-12.
En el presente documento se describe un método para el diagnóstico o pronóstico del riesgo de desarrollar un cáncer inducido por VPH en un sujeto humano que comprende:
a) opcionalmente, pretratar ácidos nucleicos para eliminar el ADN genómico humano,
b) opcionalmente, preamplificar los ARNm de VPH, en donde dichos ARNm comprenden ARN de VPH E6 y / o E7 y al menos otros ARNm de VPH,
c) secuenciar ácidos nucleicos en la muestra de un sujeto humano u obtenerlos después de los pasos a) y b), d) identificar las lecturas correspondientes a los ARN de VPH E6 y / o E7,
e) identificar a qué especies o genotipos pertenecen los ARNm de VPH E6 y / o E7 del paso d),
f) clasificar las lecturas correspondientes a otros ARNm de VPH víricos del mismo genotipo o especie identificados en el paso e),
g) opcionalmente, identificar las transcripciones de fusión como una firma de los eventos de integración del ADN del VPH en el cromosoma del huésped y / u otros biomarcadores de células cancerosas humanas,
h) opcionalmente, eliminar todas las demás secuencias, incluidas las secuencias humanas que no son secuencias identificadas y clasificadas siguiendo los pasos d), e), f) y g),
i) calcular las proporciones que definen la abundancia molecular de los ARNm de VPH E6 y / o E7 en relación con dichas otras transcripciones virales del mismo genotipo o especie del paso f),
en el que un mayor nivel de dichas proporciones se correlaciona con un mayor riesgo de desarrollar un cáncer inducido por virus.
Por otros ARNm virales en el paso f), se hace referencia más particularmente a ARNm seleccionados de genes que codifican proteínas de la cápside (L1 y L2), genes que codifican la proteína de estimulación del crecimiento (E5), genes que codifican proteínas de replicación o transcripción (E4, E2 y E1, E8). En el paso g), pueden seleccionarse otros biomarcadores de células cancerosas humanas, por ejemplo, de PRC1, CCNB2, SYCP2 CDKN3, NUSAP1, CDC20, p16INK4a, Ki-67.
En una realización específica, el paso f) comprende clasificar las lecturas de ARNm de VPH L1 y / o L2 correspondientes a la especie o genotipo de los ARNm de VPH E6 y / o E7 identificados en el paso d). En esta realización, el paso h) comprende calcular las proporciones que definen la abundancia molecular relativa de los ARNm de VPH E6 y / o E7 en relación con las lecturas de L1 y / o al menos otros ARNm víricos correspondientes a la especie o genotipo de los ARNm de VPH E6 y / o E7. En tal realización, la etapa b) comprende opcionalmente preamplificar los ARNm de VPH, en los que dichos ARNm comprenden los ARN de VPH E6 y / o E7 y L1 y / o al menos otro ARNm de VPH viral.
En el presente documento, en un segundo aspecto, se describe un método para diagnosticar el riesgo de desarrollar un cáncer inducido por VPH que comprende:
(a) determinar el nivel de al menos un primer marcador seleccionado entre los ARNm de E6 de los VPH del grupo alfa, los ARNm de E7 de los VPH del grupo alfa, o ambos, en la muestra de un paciente o en la muestra de un individuo sospechoso de estar infectado por el VPH,
(b) comparar los niveles determinados en el paso (a) con un valor de referencia de los ARNm de E6 de los VPH del grupo alfa, los ARNm de E7 de los VPH del grupo alfa, o ambos en individuos de bajo riesgo infectados por los VPH,
(c) en el que un mayor nivel según se determina en el paso a) en comparación con el nivel de referencia en el paso b) es indicativo de un riesgo más alto de desarrollar un cáncer inducido por VPH.
Debe contemplarse que estos biomarcadores no se limitan a los ARNm de E6 o E7 de VPH16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 sino que se extienden a todos los ARNm de VPH de E6 o E7 de varios géneros alfa, que comprenden y cubren los VPH de los grupos a5, 6, 7, 10; extendiéndose opcionalmente a otros VPH del grupo alfa según se desee.
En este segundo aspecto, los niveles de ARNm de E6 de VPH del grupo alfa, ARNm de E7 de VPH del grupo alfa, o ambos, se determinan, entre otras cosas, mediante hibridación con una sonda marcada, amplificación, incluida la PCR, microarrays de ácido nucleico, secuenciación de alto rendimiento con o sin amplificación previa. La medida se puede llevar a cabo directamente en una muestra de ARN mensajero (ARNm) extraída, o en ADN complementario transcrito inverso (ADNc) preparado a partir del ARNm extraído. A partir de la muestra de ARNm o ADNc, la cantidad de transcripciones de ácido nucleico se determina usando microarrays de ácido nucleico, PCR cuantitativa, hibridación con una sonda marcada o directamente contando las lecturas correspondientes después de una secuenciación de alto rendimiento.
Tanto para el primer como para el segundo aspecto, la amplificación o amplificación previa se describe con detalle a continuación con cebadores de consenso específicamente diseñados que permiten la amplificación previa genérica de todos los VPH deseados que pertenecen al grupo alfa, en particular la amplificación previa de los dominios específicos del grupo alfa, preferiblemente del HR-aVPH. De acuerdo con la invención, los cebadores representados a continuación se proporcionan para amplificar y detectar la cantidad de ARNm de E6 y ARNm de E7 de todos o varios VPH del grupo alfa, dependiendo del alcance deseado de la prueba. Por lo tanto, la invención proporciona una prueba mucho más amplia que se extiende más allá de tipos como el VPH 16, 18, 31,33, 35, 39, 45, 51,52, 56, 58, 59, 66, 68 que hoy se clasifican como VPH de alto riesgo; ya que permite la determinación de un alto nivel de expresión de E6 y / E7 de varios subgrupos alfa de VPH e incluso cubre todos los VPH del grupo alfa.
Por ejemplo, en el método anterior, la cuantificación se realiza en ARNm de E6 y / o E7 de virus del papiloma a6 que comprende VPH 30, VPH 53, VPH 56 y VPH 66, virus del papiloma a7 que comprende VPH 68, VPH 39, VPH 70, VPH 85, VPH 59, v Ph 45, v Ph 18, VPH 97, virus del papiloma a10 que comprende VPH 16, VPH 35, VPH 31, VPH 52, VPH 67, VPH 33, VPH 58 y el virus del papiloma a5 que comprende VPH 26, VPH 69, VPH 51, VPH 82. Los cebadores de consenso genéricos combinados para amplificar genéricamente subgrupos alfa se describen a continuación.
En una realización específica, el método de la invención perfecciona aún más el método anterior que tiene como objetivo la determinación cuantitativa de los niveles de expresión de un panel de biomarcadores en muestras biológicas de pacientes o individuos sospechosos de estar infectados con VPH, cuyos biomarcadores combinados son indicativos y / o predictivos, en un solo punto temporal, de pacientes con riesgo de desarrollar cánceres inducidos por VPH.
El panel proporcionado por la invención comprende los siguientes biomarcadores:
- Al menos un primer marcador seleccionado entre los ARNm de E6 de los VPH del grupo alfa, los ARNm de E7 de los VPH del grupo alfa, o ambos,
- Al menos un segundo marcador seleccionado entre los ARNm de L1 de los VPH del grupo alfa, los ARNm de L2 de los VPH del grupo alfa, o ambos,
- donde dichos ARNm de E6, E7, L1 y L2 tienen las secuencias intragenéticas correspondientes,
- opcionalmente, al menos un marcador celular huésped indicativo de neoplasia o cáncer.
Por ejemplo, el panel está compuesto por al menos 5, 10, 20, 30 o 50 ARNm diferentes de dichos ARNm de E6, E7, L1 y L2 de los VPH del grupo alfa. En una realización específica, el panel está compuesto por todos los ARNm de VPH del grupo alfa de E6 y / o E7, y L1 y / o L2. Cebadores de consenso genéricos combinados que amplifican genéricamente los subgrupos alfa dependiendo del alcance deseado de la prueba se proporcionan más adelante en este documento. Alternativamente, la invención se realiza usando una secuenciación HT directa o amplificada independiente de la secuencia para la detección cuantitativa de ARNm individual de secuencias de VPH E6 y / o E7 que pertenecen al grupo VPH alfa.
Tal método de acuerdo con la invención también se proporciona para predecir la progresión de la infección por VPH en un paciente que padece una infección por VPH.
En una realización, la invención abarca un método para evaluar a un paciente infectado con el virus del papiloma humano (VPH) que comprende: generar ADNc a partir de una muestra de paciente que comprende ARN; secuenciar el ADNc; generar lecturas de secuencia del ADNc; discriminar las lecturas de la secuencia de VPH sobre la base de la especie de VPH; discriminar las lecturas de la secuencia de VPH sobre la base de la transcripción del gen de VPH; cuantificar el número de lecturas de la secuencia del VPH según la especie del VPH y la transcripción del gen del VPH, determinar el número de lecturas de la secuencia del VPH de al menos 2 transcripciones del gen del VPH; y determinar el número de lecturas de secuencias de VPH de al menos 2 especies de VPH; en el que la muestra del paciente contiene 2 o más especies de VPH.
En otra realización, el método comprende calcular una relación (R) del número de lecturas de al menos una transcripción temprana de VPH16 con respecto al número de lecturas de al menos una transcripción tardía de VPH16, con una relación más alta (R) correlacionada con una mayor riesgo de desarrollar cáncer maligno inducido por VPH de alto grado.
En otra realización, el método comprende correlacionar un mayor número de lecturas de transcripciones de VPH16 en relación con las lecturas de transcripciones de otra especie de VPH con un mayor riesgo de desarrollar cáncer inducido por VPH maligno de alto grado.
En una realización, el ADNc se genera usando cebadores aleatorios. En una realización, el ADNc se genera usando cebadores específicos de VPH (es decir, cebadores específicos para los dominios de un VPH, como un HR-aVPH, que comprende uniones de corte y empalme, regiones genómicas y no empalmadas y regiones de transcripción de fusión humana de cada transcrito de VPH).
En una realización, la relación se calcula calculando la relación (R) del número de lecturas de transcripciones E6 y / o E7 de VPH16 con respecto al número de lecturas de transcripciones L1 y / o L2 de VPH16. En una realización, la relación se calcula calculando la relación (R) del número de lecturas de transcripciones E6 y E7 de VPH16 con respecto al número de lecturas de las transcripciones L1 y L2.
En una realización, el método comprende determinar el número de lecturas de secuencia de VPH de al menos 2 especies de VPH del grupo alfa. En una realización, el método comprende generar al menos 106 lecturas de la secuencia del ADNc. En una realización, el método comprende generar al menos 107 lecturas de la secuencia del ADNc.
En una realización, la invención abarca un método para evaluar a un paciente infectado con el virus del papiloma humano (VPH) que comprende generar ADNc a partir de una muestra de paciente que comprende ARN; secuenciar el ADNc; generar lecturas de secuencia del ADNc; discriminar las lecturas de la secuencia de VPH sobre la base de la transcripción del gen de VPH; cuantificar el nivel de lecturas de secuencia de VPH de acuerdo con la transcripción del gen de VPH; determinar el número de lecturas de la secuencia de VPH de al menos una transcripción del gen temprano de VPH; determinar el número de lecturas de la secuencia de VPH de al menos una transcripción tardía del gen de VPH; y determinar la relación entre el número de lecturas de la secuencia de VPH de al menos una transcripción del gen temprano de VPH y el número de lecturas de la secuencia de VPH de al menos una transcripción tardía del gen de VPH.
En una realización, el método comprende calcular una relación (R) del número de lecturas de al menos una transcripción temprana de VPH16 con respecto al número de lecturas de al menos una transcripción tardía de VPH16 con una relación (R) más alta que se correlaciona con un mayor riesgo de desarrollar un cáncer maligno inducido por VPH de alto grado.
En una realización, la al menos una transcripción temprana es VPH E6 o E7 y la al menos una transcripción tardía es L1 o L2. En una realización, la al menos una transcripción temprana es VPH E6 y E7 y la al menos una transcripción tardía es L1 y L2.
En una realización, el ADNc se genera usando cebadores aleatorios. En una realización, el ADNc se genera usando cebadores específicos de VPH.
Se definen específicamente a continuación algunos de los términos utilizados en la memoria descriptiva:
Definiciones
Las muestras biológicas, según se hace referencia en este documento, incluyen, sin limitación, fluidos corporales de mamíferos, especialmente fluidos orales o raspados, raspados genitales, en particular raspados del cuello uterino.
Grupo alfa del VPH: los VPH están contenidos en cinco grupos evolutivos. Los tipos de VPH que infectan el cuello uterino provienen del grupo Alfa, que contiene más de 60 miembros. Los tipos de VPH de los grupos o géneros Beta, Gamma, Mu y Nu infectan principalmente los sitios cutáneos. Los virus del papiloma alfa se pueden subdividir en tres categorías (alto riesgo, bajo riesgo y cutáneo), dependiendo de su prevalencia en la población general y de la frecuencia con la que provocan el cáncer de cuello uterino. Los tipos de alto riesgo provienen de los grupos Alfa 5, 6, 7 y 10.
Los cebadores abarcados por la invención no se limitan a las secuencias definidas en los cebadores representados a continuación, pero pueden comprender bases extra en el extremo 5', por ejemplo de 1 a 5 bases extra como extensión correspondientes a las secuencias de los correspondientes VPH E6 o E7. Además, se entenderá que los cebadores abarcan secuencias más cortas de al menos 12, 15, 20 o 25 bases consecutivas de los cebadores que se presentan a continuación. En algunas realizaciones, se entenderá que la invención también contempla sondas genéricas que tienen las secuencias de los cebadores representados en este documento y que están marcados directa o indirectamente. Las sondas y los cebadores pueden ampliar o cambiar desde 1 a 15 bases dependiendo de la especificidad deseada del paso de amplificación por PCR y / o de la especificidad del paso de detección utilizando parámetros estándar como el tamaño del ácido nucleico y el contenido de GC, condiciones de hibridación rigurosas y reacciones de temperatura. Por ejemplo, se utilizan condiciones de rigurosidad baja cuando se desean obtener resultados positivos amplios en una gama de dianas homólogas, mientras que se prefieren condiciones de rigurosidad alta para obtener resultados positivos sólo si el ácido nucleico diana específico está presente en la muestra. Como se usa en el presente documento, la expresión "condiciones de hibridación rigurosas" se refiere a las condiciones en las que el cebador o la sonda se hibridarán solo con esa diana o dianas exactamente complementarias. Las condiciones de hibridación afectan a la estabilidad de los híbridos, por ejemplo, temperatura, concentración de sal, pH, concentración de formamida, etc. Estas condiciones están optimizadas para maximizar la unión específica y minimizar la unión no específica del cebador o sonda a su secuencia de ácido nucleico diana. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Las secuencias más largas se hibridan específicamente a temperaturas más altas. Generalmente, las condiciones rigurosas se seleccionan para que sean aproximadamente 5°C más bajas que el punto de fusión térmico (Tm) para las secuencias específicas a una fuerza iónica y un pH definidos. La Tm es la temperatura (bajo una fuerza iónica y un pH definidos) a la que el 50% de una secuencia diana complementaria se hibrida con una sonda o cebador perfectamente emparejado. Normalmente, las condiciones rigurosas serán aquellas en las que la concentración de sal sea inferior a aproximadamente 1,0 M de Na+, normalmente una concentración de aproximadamente 0,01 a 1,0 M de Na+ (u otras sales) a un pH de 7,0 a 8,3 y la temperatura sea de al menos aproximadamente 30°C para sondas o cebadores cortos (por ejemplo, de 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60°C para sondas o cebadores largos (por ejemplo, más de 50 nucleótidos). También se pueden lograr condiciones rigurosas con la adición de agentes desestabilizadores tales como la formamida. Las condiciones de baja rigurosidad ejemplares incluyen la hibridación con una solución tampón de formamida al 20-30%, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37°C y un lavado en SSC 2x a 40°C. Las condiciones de alta rigurosidad ejemplares incluyen la hibridación en formamida al 40-50%, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37°C y un lavado en 0,1 x SSC a 60°C. La determinación de condiciones de hibridación particulares relacionadas con un ácido nucleico especificado es rutinaria y es habitual en la técnica, por ejemplo, como se describe en J. Sambrook y D.W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3a ed., 2001; and F.M. Ausubel, Ed., Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols; 5a ed., 2002.
Los cebadores de PCR preferidos, que pueden usarse por separado o juntos como un conjunto para amplificar una secuencia de ácido nucleico de VPH, comprenden los cebadores.
a1:
- E6
Directo: 5'- RGTACWTCTGCCTCATCACAGCC -3' (SEQ ID NO. 1)
Inverso: 3'- CTCTGCAMTGSGTACASCGAC -5' (SEQ ID NO. 2)
- E7
Directo: 5'- GGARASRCRCCWACSCTAAAGGA -3' (SEQ ID NO. 3)
Inverso: 3'- CACGCRGGCACACAAWGGACA -5' (5EQ ID NO. 4)
- L1
Directo: 5'- GCGGCCTAGTGACRACAAGG -3' (SEQ ID NO. 5) Inverso: 3'- GCACGYAACCCRGCYTGCAG -5' (5EQ ID NO. 6)
a2:
- E6
Directo: 5'- GHGHGCCMTAYGSTGCCTGTG -3' (SEQ ID NO. 7) Directo: 5'- CKCCSTACGGTGCWTGTGC -3' (SEQ ID NO. 8) Inverso: 3'- GCGGACCGTGCATCKTRWCCA -5' (SEQ ID NO. 9) Inverso: 3'- GGCTTTGGCCCATGCATCGT -5' (SEQ ID NO. 10) Inverso: 3'- GTGCATCGTGACCAGCAGTAC -5' (SEQ ID NO. 11)
- E7
Directo: 5'- TTGRDTCTTGCACCAGAGGMCGT -3' (SEQ ID NO. 12) Directo: 5'- TGCACGGTCCGCATCCCAC -3' (SEQ ID NO. 13) Directo: 5'- TGTCTATGGGTGCACAAGAACCC -3' (SEQ ID NO. 14) Inverso: 3'- CCCTTATATCTGCKTSGCTGCWS -5' (SEQ ID NO. 15) Inverso: 3'- GCAGCGAGGRCACACGASC -5' (SEQ ID NO. 16) Inverso: 3'- GGACCGTGCATCGTGACCA -5' (SEQ ID NO. 17)
- L1
Directo: 5'- ATGGCWYTSTGGCGCYCTAGTG -3' (SEQ ID NO. 18) Inverso: 3'- CCTCCARGCTAGTRGAYGGYGGY -5' (SEQ ID NO. 19) Inverso: 3'- GGGRACYACYGAACGMCGKCGCG -5' (SEQ ID NO. 20) a3:
- E6
Directo: 5'- AGTGGACRGGRAAGTGCWGCAAC -3' (SEQ ID NO. 21) Directo: 5'- YTGTGCAAAGACTGCGASGTGG -3' (SEQ ID NO. 22) Directo: 5'- ACTGGCCATTTGGAGTMTGCGC -3' (SEQ ID NO. 23) Inverso: 3'- GGCCRYGCATGTTRCYCTACAGT -5' (SEQ ID NO. 24) Inverso: 3'- CACYKTCCTGTCCACTBYCCWGC -5' (SEQ ID NO. 25) Inverso: 3'- CCAGTGYCGTAGCTCYCGYRYC -5' (SEQ ID NO. 26) Inverso: 3'- CTGGCCGTGCATRSYCCTCT -5' (SEQ ID NO. 27)
- E7
Directo: 5'- VAGCAMAGCWGGCCYWTAGGGTG -3' (SEQ ID NO. 28) Directo: 5'- KGYWGAACRRGCACAGCAGGCC -3' (SEQ ID NO. 29) Inverso: 3'- GGCCACYRCKTCCACYATAAGCT -5' (SEQ ID NO. 30) Inverso: 3'- CAGCYGGGACACACTATRTCCAC -5' (SEQ ID NO. 31) Inverso: 3'- GCGCAGCSVGGACACACTAT -5' (SEQ ID NO. 32)
- L1
Directo: 5'- CTWTGTGGCGRCMTGGTGAYGGC -3' (SEQ ID NO. 33) Inverso: 3'- GGARGGAGGGGGCAMWACMCC -5' (SEQ ID NO. 34)
Inverso: 3'- CCCTGBGCVCGNTGYAGCCAR -5' (SEQ ID NO. 35)
a4:
- E6
Directo: 5'- SAGTATGGTYTGGAGCTAGAGGA -3' (SEQ ID NO. 36)
Inverso: 3'- GTCCSGTCCACYGGCCKGM -5' (SEQ ID NO. 37)
- E7
Directo: 5'- MCGMCCCAGCCTSRMGGAC -3' (SEQ ID NO. 38)
Inverso: 3'- CCTCCATRACGCTABGCGCAG -5' (5EQ ID NO. 39)
- L1
Directo: 5'- TGGCCTAAACGACGTAAACGTGT -3' (SEQ ID NO. 40)
Directo: 5'- TTCTTTGCAGATGGCTWTGTGGC -3' (5EQ ID NO. 41)
Inverso: 5'- YGTGTCTCGMAARCGCRCCGC -3' :: 3'- GCGGYGCGYTTKCGAGACACR -5' (5EQ ID NO. 42) Inverso: 5'- CGCAAGTTYTTRYTGCAGCGGGG -3' :: 3'- CCCCGCTGCARYAARAACTTGCG -5' (5EQ ID NO. 43) a5:
- E6
Directo: 5'- GRGAAAGACCACGAACGCTGC -3' (SEQ ID NO. 44)
Directo: 5'- AATAGCAGGGYASTGGAAAGGGT -3' (SEQ ID NO. 45)
Inverso: 3'- GCAATTWGCRCAYTGYCCCGTCC -5' (SEQ ID NO. 46)
Inverso: 3'- TTGTGTTTCTGTTTGGCGCCTTG -5' (SEQ ID NO. 47)
Inverso: 3'- GCCTTGGTCTCCAGCAGTTTG -5' (5EQ ID NO. 48)
- E7
Directo: 5'- YTAGATYTGGTGCCGCAACCCG -3' (SEQ ID NO. 49)
Directo: 5'- MGCCATGCGTGGTAATGTACCAC -3' (SEQ ID NO. 50)
Inverso: 3'- CTCCASCRCTCGRACGTTCTGT -5' (SEQ ID NO. 51)
Inverso: 3'- CACGGGCAMACCAGGCTTAGK -5' (SEQ ID NO. 52)
- L1
Directo: 5'- KCAGATGGCYTTGYGGCGTACTA -3' (SEQ ID NO. 53)
Directo: 5'- TGGCYTTGYGGCGTACTAGTGAC -3' (SEQ ID NO. 54)
Directo: 5'- TGTATTTRCCACCTGCACCWGTG -3' (SEQ ID NO. 55)
Inverso: 3'- GGGGCRTYRCGYTGACAKGTAGT -5' (SEQ ID NO. 56)
Inverso: 3'- GGCMGGSCKTTTAAGGCCTGGT -5' (SEQ ID NO. 57)
a6:
- E6
Directo: 5'- GARCGHCCACGWASHBTGCACC -3' (SEQ ID NO. 58)
Directo: 5'- AATACAGRMGAGCGMCCACGTAC -3' (SEQ ID NO. 59)
Directo: 5'- RCAATMCACAGGAACGTCCACGA -3' (SEQ ID NO. 60)
Inverso: 3'- CCTCTGGTGTCAACGGMTGTTGA -5' (SEQ ID NO. 61) Inverso: 3'- TCTCCARCACY5CAAACATGACC -5' (SEQ ID NO. 62) - E7
Directo: 5'- GRACAGCTCAGAGGAWGAGGATG -3' (SEQ ID NO. 63) Directo: 5'- GCTCAGAGGAWGAGGATGAGG -3' (SEQ ID NO. 64) Directo: 5'- YTRCWGRAGCRGCCACAGCAAGC -3' (SEQ ID NO. 65) Directo: 5'- GRAGCRGCCACAGCAAGCTAG -3' (SEQ ID NO. 66) Directo: 5'- GAACAGCTCAGAGGAWGAGGATG -3' (SEQ ID NO. 67) Directo: 5'- ARTAGACCATTTGCWGGAGCGGC -3' (SEQ ID NO. 68) Inverso: 3'- GCCTTGTTGCRCASAGGGG -5' (SEQ ID NO. 69) Inverso: 3'- CGCAGAGTGGGCACGTTACT -5' (SEQ ID NO. 70)
- L1
Directo: 5'- TTGCAGATGGCGRYGTGGCG -3' (SEQ ID NO. 71) Inverso: 3'- CACCTAAAGGYTGDCCDCGGC -5' (5EQ ID NO. 72) a7:
- E6
Directo: 5'- TASAGGACAGTGYCGMCRSTGC -3' (SEQ ID NO. 73) Directo: 5'- TCMCAAYCCTGMRGAACGGCCAT -3' (SEQ ID NO. 74) Directo: 5'- ASAGGACAGTGTCGYSGGTG -3' (SEQ ID NO. 75) Directo: 5'- TGCCAGAAACCRTTGAAYCCAGC -3' (SEQ ID NO. 76) Inverso: 3'- GTCTGCGGTCCTCYCGBTTDST -5' (SEQ ID NO. 77) Inverso: 3'- CTGSCCTCKRTASTGCCCAGCT -5' (SEQ ID NO. 78) Inverso: 3'- CACCAGTGTTTCACTACGCGC -5' (5EQ ID NO. 79) Inverso: 3'- GCCTTGCTGTTCTTGTGCACG -5' (SEQ ID NO. 80) Inverso: 3'- GTCTGGAAAGCCTTTCTTGCCGT -5' (SEQ ID NO. 81) - E7
Directo: 5'- GACGRGMHGAACMACARCGTCAC -3' (SEQ ID NO. 82) Directo: 5'- GACGRGMHGAACMACAGCGTCAC -3' (SEQ ID NO. 83) Directo: 5'- ARCACCYTGTCCTTTGTGTGTCC -3' (SEQ ID NO. 84) Inverso: 3'- GTGWSTCCATAAACAGCWGCWGT -5' (SEQ ID NO. 85) Inverso: 3'- CACACCAMGGACACACAAAGGAC -5' (SEQ ID NO. 86) - L1
Directo: 5'- GCGBTCTAGYGACARCAHGGTGT -3' (SEQ ID NO. 87) Directo: 5'- HCCTGCTATTGGKGARCAYTGGG -3' (SEQ ID NO. 88) Inverso: 3'- CCAGTGYTCYCCMATRGCRGGWA -5' (SEQ ID NO. 89) Inverso: 3'- TAGASCCACTDGGWGANGGRGAA -5' (SEQ ID NO. 90) - E6
Directo: 5'- WATGWCTGCACGKWGCKGCTCC -3' (SEQ ID NO. 91) Inverso: 3'- GTAGGCARTATCCYTTCCACRCG -5' (SEQ ID NO. 92) Inverso: 3'- CTCCGAGCGTTGGCCTTTC -5' (SEQ ID NO. 93)
- E7
Directo: 5'- GCGTGAGCAAYCCACGCAAC -3' (SEQ ID NO. 94) Inverso: 3'- CAGCCATKGYAGTCACACMGCTG -5' (SEQ ID NO. 95) Inverso: 3'- TGCCATTGTTGTCACKCTGTAGC -5' (SEQ ID NO. 96) - L1
Directo: 5'- CCYCCHATKGGNGAATATTGGGG -3' (SEQ ID NO. 97) Inverso: 3'- GGAGGATGGTGCWGMACGC -5' (SEQ ID NO. 98) Inverso: 3'- GGGTGACTGRCYYAGAAGAGGAA -5' (SEQ ID NO. 99) a9:
- E6
Directo: 5'- AGTRMARATGCCTCCACGYCTGC -3' (SEQ ID NO. 100) Directo: 5'- CTGCACAGGACCAGATGGC -3' (SEQ ID NO. 101) Inverso: 3'- TCCATGCATGWTGWCCAGCARTG -5' (SEQ ID NO. 102) Inverso: 3'- GCAGCGMCCYTTCCAGGTRTCK -5' (SEQ ID NO. 103) Inverso: 3'- GGCATTTCGCCCACCATTGTTAT -5' (SEQ ID NO. 104) - E7
Directo: 5'- GCYTACACTGCTGGACAACATGC -3' (SEQ ID NO. 105) Directo: 5'- AGACAGCTCAGAAGABGAGGTGG -3' (SEQ ID NO. 106) Directo: 5'- AACAATGGTGGGCGAAATGCCAG -3' (SEQ ID NO. 107) Inverso: 3'- CGTCCGCCATCSTTGTTATGKYT -5' (SEQ ID NO. 108) Inverso: 3'- CCTGTRCACTSCACMACMAGCC -5' (SEQ ID NO. 109) Inverso: 3'- CTGTCGCTGTAGGGTGCACA -5' (5EQ ID NO. 110)
- L1
Directo: 5'- ATGTGCCTCCTCCYRMCCCWGTA -3' (SEQ ID NO. 111) Directo: 5'- AGATGGCTGTCTGGTTACCAGC -3' (SEQ ID NO. 112) Inverso: 3'- CCATAWGGRTCYGCAGCCATTTG -5' (SEQ ID NO. 113) Inverso: 3'- GCCTTACGCCTGCGCTTGG -5' (SEQ ID NO. 114) a10:
- E6
Directo: 5'- CCSARSTGTAAWCATGCRTGGAG -3' (SEQ ID NO. 115) Directo: 5'- MCGSAMCCTGCACGAATTGTGTG -3' (SEQ ID NO. 116) Directo: 5'- CARGACRCWGAGGARAAACCACG -3' (SEQ ID NO. 117) Inverso: 3'- CCAACACWCTGAACASCGYCC -5' (SEQ ID NO. 118) Inverso: 3'- CCATGCATGATTACASCTSGGTT -5' (SEQ ID NO. 119) Inverso: 3'- GTCGGGRYCTCCAACACRCYG -5' (SEQ ID NO. 120) Inverso: 3'- CTCCACGCATGTTTACACTTGGG -5' (SEQ ID NO. 121) - E7
Directo: 5'- GCWCAYTWGGAATHGTGTGCCCC -3' (SEQ ID NO. 122) Directo: 5'- CSTGTAAMAACGCCATGAGAGGA -3' (SEQ ID NO. 123) Directo: 5'- CGCCATGAGAGGAMACAASCCA -3' (SEQ ID NO. 124) Inverso: 3'- GGCACACDATTCCWARTGWGCCC -5' (SEQ ID NO. 125) Inverso: 3'- GGTTCGTASGTCRSTTGYTGTAC -5' (SEQ ID NO. 126) Inverso: 3'- GTGCACAGSYGGGRCACACWAYT -5' (SEQ ID NO. 127) - L1
Directo: 5'- GARGCCACWGTSTACYTGCCTC -3' (SEQ ID NO. 128) Directo: 5'- ACAGATGTCTCTGTGGCGGC -3' (SEQ ID NO. 129) Inverso: 3'- GGATGNCCACTWAYRCCHACDCC -5' (SEQ ID NO. 130) Inverso: 3'- GAGGWWACCATAGARCCACTRGG -5' (SEQ ID NO. 131) Inverso: 3'- GTGCACGYTGTAGCCAATAWGGC -5' (SEQ ID NO.132) Inverso: 3'- TCCTGTAAACTRGCAGAYGGAGG -5' (5EQ ID NO. 133) Inverso: 3'- GGCCYTGTGCWCGTTGYAACCAA -5' (SEQ ID NO. 134) a11:
- E6
Directo: 5'- GAACGRCCATACAAGCTACMAGC -3' (SEQ ID NO. 135) Inverso: 3'-GCAGATGGTCTCCAGCACYG -5' (SEQ ID NO. 136)
- E7
Directo: 5'- WATTGTGTGCCCCAACTGTTCCA -3' (SEQ ID NO. 137) Inverso: 3'- CTGGAACAGTTGGGGCACACA -5' (SEQ ID NO. 138) - L1
Directo: 5'- AGTTCTATCTTCCTCCCCAGCC -3' (SEQ ID NO. 139) Inverso: 3'- GGACGKGCACGCATACCWAG -5' (SEQ ID NO. 140) a13:
- E6
Directo: 5'- TGTCTGCTACTGAACCCCACAC -3' (SEQ ID NO. 141) Inverso: 3'- GGCTTCCAGCAATGTAGACACC -5' (SEQ ID NO. 142) - E7
Directo: 5'- GTTTGACCTGTACTGCAGGGAG -3' (SEQ ID NO. 143) Inverso: 3'- GTGAAGCACAGGTGGGACACA -5' (SEQ ID NO. 144) - L1
Directo: 5'- AAAGTATACCTGCCTCCTACCCC -3' (SEQ ID NO. 145) Inverso: 3'- GCACGCTTGCGCGCTGTAC -5' (SEQ ID NO. 146)
a14:
- E6
Directo: 5'- TAYSAMSTGGACCTGCAGGACC -3' (SEQ ID NO. 147)
Inverso: 3'- GGCCWYGCATGRTKTCCAACACT -5' (5EQ ID NO.148)
- E7
Directo: 5'- CAATTWGCCAGCTCAGAMGAGGA -3' (SEQ ID NO. 149)
Inverso: 3'- CCACCACMAGCCTWACTGYACRV -5' (SEQ ID NO. 150)
- L1
Directo: 5'- ARGTATACCTGCCTCCYGCCC -3' (SEQ ID NO. 151)
Inverso: 3'- CCTGTGCWCGTTGYAGCCAG -5' (SEQ ID NO. 152)
Como se usa en este documento, G se usa para designar guanina, A se usa para designar adenina, T se usa para designar timina, C se usa para designar citosina. R se usa comúnmente para designar una purina (A o G), Y se usa comúnmente para designar una pirimidina (T o C), W se usa comúnmente para designar A o T, S se usa comúnmente para designar C o G, K es se usa comúnmente para designar G o T, H se usa comúnmente para designar A o T o C, B se usa comúnmente para designar G o C o T, V se usa comúnmente para designar G o A o T, D se usa comúnmente para designar G o A o T, N se usa comúnmente para designar cualquier nucleótido (A o T o C o G).
La adición de índices y adaptadores de secuenciación es necesaria para las tecnologías de secuenciación de modo que se pueden agregar mediante procedimientos estándar. Por ejemplo, dichos cebadores se pueden utilizar en solución o unidos a un soporte sólido. Para permitir su acoplamiento covalente al soporte, el cebador generalmente está funcionalizado. Por tanto, puede ser modificado por un grupo terminal tiol, amina o carboxilo en la posición 5' o 3'. En particular, la adición de un grupo tiol, amina o carboxilo permite, por ejemplo, acoplar el oligonucleótido a un soporte que lleve funciones disulfuro, maleimida, amina, carboxilo, éster, epóxido, bromuro de cianógeno o aldehído. Estos acoplamientos se forman mediante el establecimiento de enlaces disulfuro, tioéter, éster, amida o amina entre el cebador y el soporte. Se pueden utilizar cualesquiera otros métodos conocidos por los expertos en la técnica, tal como reactivos de acoplamiento bifuncionales, por ejemplo.
Además, para mejorar la hibridación con el oligonucleótido acoplado, puede ser ventajoso que el oligonucleótido contenga un "brazo" y una secuencia de bases "espadadora". El uso de un brazo permite, en efecto, unir el cebador a una distancia elegida del soporte, lo que permite mejorar sus condiciones de interacción con el ADN. Ventajosamente, el brazo consta de una cadena carbonada lineal que comprende de 1 a 18 y preferiblemente 6 o 12 grupos (CH2), y una amina que permite la unión a la columna. El brazo está unido a un fosfato del oligonucleótido o de un "espaciador" compuesto de bases que no interfieren con la hibridación. Por tanto, el "espaciador" puede comprender bases de purina. Como ejemplo, el "espaciador" puede comprender la secuencia GAGG. Ventajosamente, el brazo está compuesto por una cadena de carbono lineal que comprende 6 o 12 átomos de carbono.
Para la implementación de la presente invención, se pueden utilizar diferentes tipos de soporte. Estos pueden ser soportes cromatográficos funcionalizados, a granel o preempaquetados en una columna, superficies plásticas funcionalizadas o perlas de látex funcionalizadas, magnéticas o de otro tipo. Preferiblemente se utilizan soportes cromatográficos. A modo de ejemplo, los soportes cromatográficos susceptibles de ser utilizados son agarosa, acrilamida o dextrano así como sus derivados (como Sephadex, Sepharose, Superose, etc.), polímeros como poli(estireno / divinilbenceno), o sílice injertada o no injertada, por ejemplo. Las columnas de cromatografía pueden operar en el modo de difusión o perfusión.
Como se usa en este documento, el término "secuenciación" se usa en un sentido amplio y se refiere a cualquier técnica conocida por los expertos que incluye, entre otras, la secuenciación de terminación didesoxi de Sanger, secuenciación de genoma completo, secuenciación por hibridación, pirosecuenciación, electroforesis capilar, ciclo secuenciación, secuenciación en extensión de base única, secuenciación en fase sólida, secuenciación a alto rendimiento, secuenciación de firmas masivamente paralela (MPSS), secuenciación mediante terminador de colorante reversible, secuenciación de extremos emparejados, secuenciación a corto plazo, secuenciación de exonucleasas, secuenciación por ligación, secuenciación de lectura corta, secuenciación de una sola molécula, secuenciación por síntesis, secuenciación a tiempo real, secuenciación de terminador inverso, secuenciación de nanoporos, secuenciación 454, secuenciación del analizador de genoma Solexa, secuenciación SOLiD (R), secuenciación MS-PET, espectrometría de masas, y una combinación de las mismas. En realizaciones específicas, el método y el kit de la invención están adaptados para aplicarse en un secuenciador de ADN ABI PRISM(R) 377, un Analizador Genético ABI PRISM(R) 310, 3100, 3100-Avant, 3730 o 3730x1, un Analizador de ADN ABI PRISM(R) 3700, o un sistema SOLiD (TM) de Applied Biosystems (todos de Applied Biosystems), un sistema Secuenciador del Genoma 20 (Roche Applied Science).
Para todas las tecnologías descritas en este documento, aunque dichos cebadores puedan usarse en solución, en otra realización dichos cebadores están unidos a un soporte sólido.
Para permitir su acoplamiento covalente al soporte, el cebador generalmente está funcionalizado. Por tanto, puede ser modificado por un grupo terminal tiol, amina o carboxilo en la posición 5' o 3'. En particular, la adición de un grupo tiol, amina o carboxilo permite, por ejemplo, acoplar el oligonucleótido a un soporte que lleve funciones disulfuro, maleimida, amina, carboxilo, éster, epóxido, bromuro de cianógeno o aldehído. Estos acoplamientos se forman mediante el establecimiento de enlaces disulfuro, tioéter, éster, amida o amina entre el cebador y el soporte. Se puede utilizar cualquier otro método conocido por el experto en la técnica, tal como reactivos de acoplamiento bifuncionales, por ejemplo.
Además, para mejorar la hibridación con el oligonucleótido acoplado, puede ser ventajoso que el oligonucleótido contenga un "brazo" y una secuencia de bases "espadadora". El uso de un brazo permite, en efecto, unir el cebador a una distancia elegida del soporte, lo que permite mejorar sus condiciones de interacción con el ADN. Ventajosamente, el brazo consta de una cadena carbonada lineal, que comprende de 1 a 18 y preferiblemente 6 o 12 grupos (CH2), y una amina que permite la unión a la columna. El brazo está unido a un fosfato del oligonucleótido o de un "espaciador" compuesto de bases que no interfieren con la hibridación. Por tanto, el "espaciador" puede comprender bases de purina. Como ejemplo, el "espaciador" puede comprender la secuencia GAGG. Ventajosamente, el brazo está compuesto por una cadena carbonada lineal que comprende 6 o 12 átomos de carbono.
Para la implementación de la presente invención, se pueden utilizar diferentes tipos de soporte. Estos pueden ser soportes cromatográficos funcionalizados, a granel o preempaquetados en una columna, superficies plásticas funcionalizadas o perlas de látex funcionalizadas, magnéticas o de otro tipo. Preferiblemente se utilizan soportes cromatográficos. A modo de ejemplo, los soportes cromatográficos susceptibles de ser utilizados son agarosa, acrilamida o dextrano así como sus derivados (como Sephadex, Sepharose, Superose, etc.), polímeros como poli(estireno / divinilbenceno), o sílice injertada o no injertada, por ejemplo. Las columnas de cromatografía pueden operar en el modo de difusión o perfusión.
Como se usa en el presente documento, "genes oncogénicos o ARNm oncogénicos" se refiere a genes o ARNm que inducen directa o indirectamente la transformación celular en el desarrollo de células cancerosas. Por ejemplo, los genes oncogénicos se utilizan para designar genes E6 y / o genes E7.
Como se usa en el presente documento, "otros ARNm virales" se refiere a ARNm que codifican proteínas de la cápside (L1 y L2), ARNm que codifican la estimulación del crecimiento (E5), ARNm que codifican replicación / transcripción (E4 y E2) y ARNm que codifican replicación (E1 y E8), que no son genes oncogénicos.
Las proporciones R, tal como se utilizan en este documento, se definen como el nivel relativo de un ARNm oncogénico, por ejemplo E6, E7 o ARNm oncogénicos, por ejemplo E6 E7, en comparación con otros ARNm virales del mismo genotipo o especie, más particularmente en comparación con ARNm seleccionados entre genes que codifican proteínas de la cápside (L1 y L2), genes que codifican la proteína de estimulación del crecimiento (E5), genes que codifican proteínas de replicación o transcripción (E4, E2 y E1, E8).
Por ejemplo, una relación de referencia R se puede definir como:
R = I(xE 6 y/o xE7) / I(xL1 y/o xL2 y/o xE 2...)
Donde x es un factor en el intervalo 0-1000000,
Donde xE6 es, por ejemplo, el número de lecturas mapeadas en el gen Ex o el número de veces que se secuencia cada nucleótido del gen Ex,
y donde xL1 es, por ejemplo, el número de lecturas mapeadas en el gen Lx, o el número de veces que se secuencia cada nucleótido del gen Lx.
Dibujos
La Fig. 1 representa el porcentaje de homología entre las proteínas oncogénicas de los VPH E6 HR y LR. El eje x corresponde a HR-VPH y el eje y representa el porcentaje de homología de secuencias de nucleótidos de VPH en comparación con los VPH LR HR.
La Fig. 2 representa el porcentaje de homología entre las proteínas oncogénicas de los VPH E7 HR y LR. El eje x corresponde a HR-VPH y el eje y representa el porcentaje de homología de secuencias de nucleótidos de VPH en comparación con los VPH LR HR.
La Fig. 3 representa el porcentaje de homología entre las proteínas oncogénicas de los VPH E6 HR. El eje x corresponde a HR-VPH y el eje y representa el porcentaje de homología de secuencias de nucleótidos de los VPH HR.
La Fig. 4 representa el porcentaje de homología entre las proteínas oncogénicas de los VPH E7 HR. El eje x corresponde a HR-VPH y el eje y representa el porcentaje de homología de secuencias de nucleótidos de los VPH HR.
La Fig. 5 representa el porcentaje de homología entre las proteínas oncogénicas de los VPH E6 LR. El eje x corresponde a HR-VPH y el eje y representa el porcentaje de homología de secuencias de nucleótidos de los VPH HR.
La Fig. 6 representa el porcentaje de homología entre las proteínas oncogénicas de lo VPH E7 LR. El eje x corresponde a HR-VPH y el eje y representa el porcentaje de homología de secuencias de nucleótidos de los VPH HR.
La Fig. 7 representa el mapa de transcripción de aVPH HR. Parte superior: las coordenadas genómicas de los sitios donante (SD) y aceptor (SA) de empalme se indican para cada aVPH HR (gris claro para sitios documentados previamente, gris oscuro para sitios identificados por analogía). Se agregan poliA (pA) adicionales y sitios putativos de punto de interrupción (put bkpt). Parte inferior: descripción general de los eventos de empalme de aVPH HR (línea negra: secuencias encontradas en el ARNm; línea de puntos: eventos de empalme) delineando las isoformas de empalme que componen la base de datos de transcripciones de aVPH.
Descripción detallada
Con referencia tanto al primer aspecto como al segundo, y en una primera realización específica, el método se pone en práctica para incluir al menos el grupo que consiste en virus del papiloma a6 que comprende VPH 30, VPH 53, VPH 56 y VPH 66, virus del papiloma a7 que comprende VPH 68, v Ph 39, VPH 70, VPH 85, VPH 59, VPH 45, VPH 18, VPH 97, virus del papiloma a 10 que comprende VPH 16, VPH 35, VPH 31, VPH 52, VPH 67, VPH 33, VPH 58 y virus del papiloma a5 que comprende VPH 26, VPH 69, VPH 51, VPH 82.
La invención también se refiere a una composición según la reivindicación 13.
A este respecto, la invención también contempla una composición de cebadores que comprende para E6: a5: ambas SEQ ID NO. 44 y SEQ ID NO. 45, y las tres SEQ ID NO. 46, SEQ ID NO. 47 y SEQ ID NO. 48 y; a6: SEQ ID NO. 58 o ambas SEQ ID NO. 59 y SEQ ID NO. 60, y ambas SEQ ID NO. 61 y SEQ ID NO. 62 y; a7: las tres SEQ ID NO. 73, SEQ ID NO. 75 y SEQ ID NO. 76 o las tres SEQ ID NO. 74, SEQ ID NO. 75 y SEQ ID NO. 76, y las cinco SEQ ID NO. 77, SEQ ID NO. 78, SEQ ID NO. 79, SEQ ID NO. 80 y SEQ ID NO. 81 y; a10: las tres SEQ ID NO. 115, SEQ ID NO. 116, SEQ ID NO. 117 y las cuatro SEQ ID NO. 118, SEQ ID NO. 119, SEQ ID NO. 120, SEQ ID NO. 121.
Y comprende para L1 a5: SEQ ID NO. 53 o ambas SEQ ID NO. 54 y SEQ ID NO. 55, y ambas SEQ ID NO. 56 y SEQ ID NO. 57; y a6: SEQ ID NO. 71 y SEQ ID NO. 72; y a7: ambas SEQ ID NO. 87 y SEQ ID NO. 88, y ambas SEQ ID NO. 89 y SEQ ID NO. 90; y a10: ambas SEQ ID NO. 128, SEQ ID NO. 129 y SEQ ID NO. 130 o las cuatro SEQ ID NO. 131, SEQ ID NO. 132, SEQ ID NO. 133, SEQ ID NO. 134.
O, a este respecto, la invención también contempla una composición de cebadores que comprende para E7: a5: ambas SEQ ID NO. 49, SEQ ID NO. 50 y ambas SEQ ID NO. 51, SEQ ID NO. 52; y a6: SEQ ID NO. 63 o SEQ ID NO. 64 o SEQ ID NO. 65, SEQ ID NO. 66 o ambas SEQ ID NO. 67 y SEQ ID NO. 68, y ambas SEQ ID NO. 69 y SEQ ID NO. 70; y a7: SEQ ID NO. 82 o ambas SEQ ID NO. 83, SEQ ID NO. 84, y ambas SEQ ID NO. 85, SEQ ID NO. 86; y a10: las tres SEQ ID NO. 122, SEQ ID NO. 123 y SEQ ID NO. 124, y las tres SEQ ID NO. 125, SEQ ID NO. 126 y SEQ ID NO. 127.
Y comprende para L1 a5: SEQ ID NO. 53 o ambas SEQ ID NO. 54 y SEQ ID NO. 55, y ambas SEQ ID NO. 56 y SEQ ID NO. 57; y a6: SEQ ID NO. 71 y SEQ ID NO. 72; y a7: ambas SEQ ID NO. 87 y SEQ ID NO. 88, y ambas SEQ ID NO. 89 y SEQ ID NO. 90; y a10: ambas SEQ ID NO. 128, SEQ ID NO. 129 y SEQ ID NO. 130 o las cuatro SEQ ID NO. 131, SEQ ID NO. 132, SEQ ID NO. 133, SEQ ID NO. 134.
En una segunda realización específica, el método se pone en práctica para incluir al menos el grupo que consiste en virus del papiloma a6 que comprenden VPH 30, VPH 53, VPH 56 y VPH 66, virus del papiloma a7 que comprende VPH 68, VPH 39, VPH 70, VPH 85, VPH 59, VPH 45, VPH 18, VPH 97, virus del papiloma a10 que comprende VPH 16, VPH 35, VPH 31, V p H 52, VPH 67, VPH 33, VPH 58, virus del papiloma a5 que comprende VPH 26, VPH 69, VPH 51, VPH 82 y virus del papiloma a9 que comprende VPH 6, VPH 11, VPH 13, VPH 1, VPH 74, VPH 44.
A este respecto, la invención también contempla una composición de cebadores que comprende para E6: a5: ambas SEQ ID NO. 44 y SEQ ID NO. 45, y las tres SEQ ID NO. 46, SEQ ID NO. 47 y SEQ ID NO. 48 y; a6: SEQ ID NO. 58 o ambas SEQ ID NO. 59 y SEQ ID NO. 60, y ambas SEQ ID NO. 61 y SEQ ID NO. 62 y; a7: las tres SEQ ID NO. 73, SEQ ID NO. 75 y SEQ ID NO. 76 o las tres SEQ ID NO. 74, SEQ ID NO. 75 y SEQ ID NO. 76, y las cinco SEQ ID NO. 77, SEQ ID NO. 78, SEQ ID NO. 79, SEQ ID NO. 80 y SEQ ID NO. 81 y; a10: las tres SEQ ID NO. 115, SEQ ID NO. 116, SEQ ID NO. 117 y las cuatro SEQ ID NO. 118, SEQ ID NO. 119, SEQ ID NO. 120, SEQ ID NO. 121; y a9: ambas SEQ ID NO. 100 y SEQ ID NO. 101 y las tres SEQ ID NO. 102, SEQ ID NO. 103 y SEQ ID NO. 104.
Y comprende para L1 a5: SEQ ID NO. 53 o ambas SEQ ID NO. 54 y SEQ ID NO. 55, y ambas SEQ ID NO. 56 y SEQ ID NO. 57; y a6: SEQ ID NO. 71 y SEQ ID NO. 72; y a7: ambas SEQ ID NO. 87 y SEQ ID NO. 88, y ambas SEQ ID NO. 89 y SEQ ID NO. 90; y a10: ambas SEQ ID NO. 128, SEQ ID NO. 129 y SEQ ID NO. 130 o las cuatro SEQ ID NO. 131, SEQ ID NO. 132, SEQ ID NO. 133, SEQ ID NO. 134; y a9: ambas SEQ ID NO. 111 y SEQ ID NO.
112, y ambas SEQ ID NO. 113 y SEQ ID NO. 114.
O, a este respecto, la invención también contempla una composición de cebadores que comprende para E7: a5: ambas SEQ ID NO. 49, SEQ ID NO. 50 y ambas SEQ ID NO. 51, SEQ ID NO. 52; y a6: SEQ ID NO. 63 o SEQ ID NO. 64 o SEQ ID NO. 65, SEQ ID NO. 66 o ambas SEQ ID NO. 67 y SEQ ID NO. 68, y ambas SEQ ID NO. 69 y SEQ ID NO. 70; y a7: SEQ ID NO. 82 o ambas SEQ ID NO. 83, SEQ ID NO. 84, y ambas SEQ ID NO. 85, SEQ ID NO. 86; y a10: las tres SEQ ID NO. 122, SEQ ID NO. 123 y SEQ ID NO. 124, y las tres SEQ ID NO. 125, SEQ ID NO. 126 y SEQ ID NO. 127; y a9: las tres SEQ ID NO. 105, SEQ ID NO. 106 y SEQ ID NO. 107, y las tres SEQ ID NO. 108, SEQ ID NO. 109 y 110, y que comprende para L1 a5: SEQ ID NO. 53 o ambas SEQ ID NO. 54 y SEQ ID NO. 55, y ambas SEQ ID NO. 56 y SEQ ID NO. 57; y a6: SEQ ID NO. 71 y SEQ ID NO. 72; y a7: ambas SEQ ID NO. 87 y SEQ ID NO. 88, y ambas SEQ ID NO. 89 y SEQ ID NO. 90; y a10: ambas SEQ ID NO. 128, SEQ ID NO.
129 y SEQ ID NO. 130 o las cuatro SEQ ID NO. 131, SEQ ID NO. 132, SEQ ID NO. 133, SEQ ID NO. 134; y a9: ambas SEQ ID NO. 111 y SEQ ID NO. 112, y ambas SEQ ID NO. 113 y SEQ ID NO. 114.
En una tercera realización específica, la invención definida anteriormente se pone en práctica para incluir al menos el grupo que consiste en el virus del papiloma a6 que comprende VPH 30, VPH 53, VPH 56 y VPH 66, virus del papiloma a7 que comprende VPH 68, VPH 39, VPH 70, VPH 85, VPH 59, VPH 45, VPH 18, VPH 97, virus del papiloma a10 que comprende VPH 16, VPH 35, VPH 31, VPH 52, VPH 67, VPH 33, VPH 58, virus del papiloma a5 que comprende VPH 26, VPH 69, VPH 51, VPH 82, virus del papiloma a9 que comprende VPH 6, VPH 11, VPH 13, VPH 1, VPH 74, VPH 44 y virus del papiloma a8 que comprende VPH 91, VPH 43, VPH 7, VPH 40.
A este respecto, la invención también contempla una composición de cebadores que comprende para E6: a5: ambas SEQ ID NO. 44 y SEQ ID NO. 45, y las tres SEQ ID NO. 46, SEQ ID NO. 47 y SEQ ID NO. 48 y; a6: SEQ ID NO. 58 o ambas SEQ ID NO. 59 y SEQ ID NO. 60, y ambas SEQ ID NO. 61 y SEQ ID NO. 62 y; a7: las tres SEQ ID NO. 73, SEQ ID NO. 75 y SEQ ID NO. 76 o las tres SEQ ID NO. 74, SEQ ID NO. 75 y SEQ ID NO. 76, y las cinco SEQ ID NO. 77, SEQ ID NO. 78, SEQ ID NO. 79, SEQ ID NO. 80 y SEQ ID NO. 81 y; a10: las tres SEQ ID NO. 115, SEQ ID NO. 116, SEQ ID NO. 117 y las cuatro SEQ ID NO. 118, SEQ ID NO. 119, SEQ ID NO. 120, SEQ ID NO. 121; y a9: ambas SEQ ID NO. 100 y SEQ ID NO. 101 y las tres SEQ ID NO. 102, SEQ ID NO. 103 y SEQ ID NO. 104; y a8: SEQ ID NO. 91, y ambas SEQ ID NO. 92 y SEQ ID NO. 93.
Y comprende para L1 a5: SEQ ID NO. 53 o ambas SEQ ID NO. 54 y SEQ ID NO. 55, y ambas SEQ ID NO. 56 y SEQ ID NO. 57; y a6: SEQ ID NO. 71 y SEQ ID NO. 72; y a7: ambas SEQ ID NO. 87 y SEQ ID NO. 88, y ambas SEQ ID NO. 89 y SEQ ID NO. 90; y a10: ambas SEQ ID NO. 128, SEQ ID NO. 129 y SEQ ID NO. 130 o las cuatro SEQ ID NO. 131, SEQ ID NO. 132, SEQ ID NO. 133, SEQ ID NO. 134; y a9: ambas SEQ ID NO. 111 y SEQ ID NO.
112, y ambas SEQ ID NO. 113 y SEQ ID NO. 114; y a8: SEQ ID NO. 97, y ambas SEQ ID NO. 98 y SEQ ID NO. 99.
O, a este respecto, la invención también contempla una composición de cebadores que comprende para E7: a5: ambas SEQ ID NO. 49, SEQ ID NO. 50 y ambas SEQ ID NO. 51, SEQ ID NO. 52; y a6: SEQ ID NO. 63 o SEQ ID NO. 64 o SEQ ID NO. 65, SEQ ID NO. 66 o ambas SEQ ID NO. 67 y SEQ ID NO. 68, y ambas SEQ ID NO. 69 y SEQ ID NO. 70; y a7: SEQ ID NO. 82 o ambas SEQ ID NO. 83, SEQ ID NO. 84, y ambas SEQ ID NO. 85, SEQ ID NO. 86; y a10: las tres SEQ ID NO. 122, SEQ ID NO. 123 y SEQ ID NO. 124, y las tres SEQ ID NO. 125, SEQ ID NO. 126 y SEQ ID NO. 127; y a9: las tres SEQ ID NO. 105, SEQ ID NO. 106 y SEQ ID NO. 107, y las tres SEQ ID NO. 108, SEQ ID NO. 109 y 110; y a8: SEQ ID NO. 94, y ambas SEQ ID NO. 95 y SEQ ID NO. 96
Y comprende para L1 a5: SEQ ID NO. 53 o ambas SEQ ID NO. 54 y SEQ ID NO. 55, y ambas SEQ ID NO. 56 y SEQ ID NO. 57; y a6: SEQ ID NO. 71 y SEQ ID NO. 72; y a7: ambas SEQ ID NO. 87 y SEQ ID NO. 88, y ambas SEQ ID NO. 89 y SEQ ID NO. 90; y a10: ambas SEQ ID NO. 128, SEQ ID NO. 129 y SEQ ID NO. 130 o las cuatro SEQ ID NO. 131, SEQ ID NO. 132, SEQ ID NO. 133, SEQ ID NO. 134; y a9: ambas SEQ ID NO. 111 y SEQ ID NO.
112, y ambas SEQ ID NO. 113 y SEQ ID NO. 114; y a8: SEQ ID NO. 97, y ambas SEQ ID NO. 98 y SEQ ID NO. 99.
En una cuarta realización específica, la invención definida anteriormente se pone en práctica para incluir al menos el grupo que consiste en el virus del papiloma a6 que comprende VPH 30, VPH 53, VPH 56 y VPH 66, virus del papiloma a7 que comprende VPH 68, VPH 39, VPH 70, VPH 85, VPH 59, VPH 45, VPH 18, VPH 97, virus del papiloma a10 que comprende VPH 16, VPH 35, VPH 31, VPH 52, VPH 67, VPH 33, VPH 58, virus del papiloma a5 que comprende VPH 26, VPH, 69, VPH 51, VPH 82, virus del papiloma a9 que comprende VPH 6, VPH 11, VPH 13, VPH 1, VPH 74, VPH 44, virus del papiloma a8 que comprende VPH 91, VPH 43, VPH 7, VPH 40 y virus del papiloma a1 que comprende VPH 42, v Ph 32.
A este respecto, la invención también contempla una composición de cebadores que comprende para E6: a5: ambas SEQ ID NO. 44 y SEQ ID NO. 45, y las tres SEQ ID NO. 46, SEQ ID NO. 47 y SEQ ID NO. 48 y; a6: SEQ ID NO. 58 o ambas SEQ ID NO. 59 y SEQ ID NO. 60, y ambas SEQ ID NO. 61 y SEQ ID NO. 62 y; a7: las tres SEQ ID NO. 73, SEQ ID NO. 75 y SEQ ID NO. 76 o las tres SEQ ID NO. 74, SEQ ID NO. 75 y SEQ ID NO. 76, y las cinco SEQ ID NO. 77, SEQ ID NO. 78, SEQ ID NO. 79, SEQ ID NO. 80 y SEQ ID NO. 81 y; a10: las tres SEQ ID NO. 115, SEQ ID NO. 116, SEQ ID NO. 117 y las cuatro SEQ ID NO. 118, SEQ ID NO. 119, SEQ ID NO. 120, SEQ ID NO. 121; y a9: ambas SEQ ID NO. 100 y SEQ ID NO. 101 y las tres SEQ ID NO. 102, SEQ ID NO. 103 y SEQ ID NO. 104; y a8: SEQ ID NO. 91, y ambas SEQ ID NO. 92 y SEQ ID NO. 93; y a1: SEQ ID NO. 1 y SEQ ID NO. 2.
Y comprende para L1 a5: SEQ ID NO. 53 o ambas SEQ ID NO. 54 y SEQ ID NO. 55, y ambas SEQ ID NO. 56 y SEQ ID NO. 57; y a6: SEQ ID NO. 71 y SEQ ID NO. 72; y a7: ambas SEQ ID NO. 87 y SEQ ID NO. 88, y ambas SEQ ID NO. 89 y SEQ ID NO. 90; y a10: ambas SEQ ID NO. 128, SEQ ID NO. 129 y SEQ ID NO. 130 o las cuatro SEQ ID NO. 131, SEQ ID NO. 132, SEQ ID NO. 133, SEQ ID NO. 134; y a9: ambas SEQ ID NO. 111 y SEQ ID NO.
112, y ambas SEQ ID NO. 113 y SEQ ID NO. 114; y a8: SEQ ID NO. 97, y ambas SEQ ID NO. 98 y SEQ ID NO. 99; y a1: SEQ ID NO. 5 y SEQ ID NO. 6.
O, a este respecto, la invención también contempla una composición de cebadores que comprende para E7: a5: ambas SEQ ID NO. 49, SEQ ID NO. 50 y ambas SEQ ID NO. 51, SEQ ID NO. 52; y a6: SEQ ID NO. 63 o SEQ ID NO. 64 o SEQ ID NO. 65, SEQ ID NO. 66 o ambas SEQ ID NO. 67 y SEQ ID NO. 68, y ambas SEQ ID NO. 69 y SEQ ID NO. 70; y a7: SEQ ID NO. 82 o ambas SEQ ID NO. 83, SEQ ID NO. 84, y ambas SEQ ID NO. 85, SEQ ID NO. 86; y a10: las tres SEQ ID NO. 122, SEQ ID NO. 123 y SEQ ID NO. 124, y las tres SEQ ID NO. 125, SEQ ID NO. 126 y SEQ ID NO. 127; y a9: las tres SEQ ID NO. 105, SEQ ID NO. 106 y SEQ ID NO. 107, y las tres SEQ ID NO. 108, SEQ ID NO. 109 y 110; y a8: SEQ ID NO. 94, y ambas SEQ ID NO. 95 y SEQ ID NO. 96; y a1: SEQ ID NO. 3 y SEQ ID NO. 4
Y comprende para L1 a5: SEQ ID NO. 53 o ambas SEQ ID NO. 54 y SEQ ID NO. 55, y ambas SEQ ID NO. 56 y SEQ ID NO. 57; y a6: SEQ ID NO. 71 y SEQ ID NO. 72; y a7: ambas SEQ ID NO. 87 y SEQ ID NO. 88, y ambas SEQ ID NO. 89 y SEQ ID NO. 90; y a10: ambas SEQ ID NO. 128, SEQ ID NO. 129 y SEQ ID NO. 130 o las cuatro SEQ ID NO. 131, SEQ ID NO. 132, SEQ ID NO. 133, SEQ ID NO. 134; y a9: ambas SEQ ID NO. 111 y SEQ ID NO.
112, y ambas SEQ ID NO. 113 y SEQ ID NO. 114; y a8: SEQ ID NO. 97, y ambas SEQ ID NO. 98 y SEQ ID NO. 99; y a1: SEQ ID NO. 5 y SEQ ID NO. 6.
En una quinta realización específica, la invención definida anteriormente se pone en práctica para incluir al menos el grupo que consiste en el virus del papiloma a6 que comprende VPH 30, VPH 53, VPH 56 y VPH 66, virus del papiloma a7 que comprende VPH 68, VPH 39, VPH 70, VPH 85, VPH 59, VPH 45, VPH 18, VPH 97, virus del papiloma a10 que comprende VPH 16, VPH 35, VPH 31, VPH 52, VPH 67, VPH 33, VPH 58, virus del papiloma a5 que comprende VPH 26, VPH, 69, VPH 51, VPH 82, virus del papiloma a9 que comprende VPH 6, VPH 11, VPH 13, VPH 1, VPH 74, VPH 44, virus del papiloma a8 que comprende VPH 91, VPH 43, v Ph 7, VPH 40, virus del papiloma a1 que comprende VPH 42, VPH 32 y virus del papiloma a3 que comprende VPH 114, VPH 84, VPH 86, VPH87, VPH 102, VPH83, VPH89, VPH 61, VPH 72, VPH 62.
A este respecto, la invención también contempla una composición de cebadores que comprende para E6: a5: ambas SEQ ID NO. 44 y SEQ ID NO. 45, y las tres SEQ ID NO. 46, SEQ ID NO. 47 y SEQ ID NO. 48 y; a6: SEQ ID NO. 58 o ambas SEQ ID NO. 59 y SEQ ID NO. 60, y ambas SEQ ID NO. 61 y SEQ ID NO. 62 y; a7: las tres SEQ ID NO. 73, SEQ ID NO. 75 y SEQ ID NO. 76 o las tres SEQ ID NO. 74, SEQ ID NO. 75 y SEQ ID NO. 76, y las cinco SEQ ID NO. 77, SEQ ID NO. 78, SEQ ID NO. 79, SEQ ID NO. 80 y SEQ ID NO. 81 y; a10: las tres SEQ ID NO. 115, SEQ ID NO. 116, SEQ ID NO. 117 y las cuatro SEQ ID NO. 118, SEQ ID NO. 119, SEQ ID NO. 120, SEQ ID NO. 121; y a9: ambas SEQ ID NO. 100 y SEQ ID NO. 101 y las tres SEQ ID NO. 102, SEQ ID NO. 103 y SEQ ID NO. 104; y a8: SEQ ID NO. 91, y ambas SEQ ID NO. 92 y SEQ ID NO. 93; y a1: SEQ ID NO. 1 y SEQ ID NO. 2; y a3: las tres SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 22 y SEQ ID NO. 23, y las cuatro SEQ ID NO. 24, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 26 y SEQ ID NO. 27.
Y comprende para L1 a5: SEQ ID NO. 53 o ambas SEQ ID NO. 54 y SEQ ID NO. 55, y ambas SEQ ID NO. 56 y SEQ ID NO. 57; y a6: SEQ ID NO. 71 y SEQ ID NO. 72; y a7: ambas SEQ ID NO. 87 y SEQ ID NO. 88, y ambas SEQ ID NO. 89 y SEQ ID NO. 90; y a10: ambas SEQ ID NO. 128, SEQ ID NO. 129 y SEQ ID NO. 130 o las cuatro SEQ ID NO. 131, SEQ ID NO. 132, SEQ ID NO. 133, SEQ ID NO. 134; y a9: ambas SEQ ID NO. 111 y SEQ ID NO.
112, y ambas SEQ ID NO. 113 y SEQ ID NO. 114; y a8: SEQ ID NO. 97, y ambas SEQ ID NO. 98 y SEQ ID NO. 99; y a1: SEQ ID NO. 5 y SEQ ID NO. 6; y a3: SEQ ID NO. 33 y ambas SEQ ID NO. 34 y SEQ ID NO. 35.
O, a este respecto, la invención también contempla una composición de cebadores que comprende para E7: a5: ambas SEQ ID NO. 49, SEQ ID NO. 50 y ambas SEQ ID NO. 51, SEQ ID NO. 52; y a6: SEQ ID NO. 63 o SEQ ID NO. 64 o SEQ ID NO. 65, SEQ ID NO. 66 o ambas SEQ ID NO. 67 y SEQ ID NO. 68, y ambas SEQ ID NO. 69 y SEQ ID NO. 70; y a7: SEQ ID NO. 82 o ambas SEQ ID NO. 83, SEQ ID NO. 84, y ambas SEQ ID NO. 85, SEQ ID NO. 86; y a10: las tres SEQ ID NO. 122, SEQ ID NO. 123 y SEQ ID NO. 124, y las tres SEQ ID NO. 125, SEQ ID NO. 126 y SEQ ID NO. 127; y a9: las tres SEQ ID NO. 105, SEQ ID NO. 106 y SEQ ID NO. 107, y las tres SEQ ID NO. 108, SEQ ID NO. 109 y 110; y a8: SEQ ID NO. 94, y ambas SEQ ID NO. 95 y SEQ ID NO. 96; y a1: SEQ ID NO. 3 y SEQ ID NO. 4 y a3: ambas SEQ ID NO. 28 y SEQ ID NO. 29, y las tres SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 32.
Y comprende para L1 a5: SEQ ID NO. 53 o ambas SEQ ID NO. 54 y SEQ ID NO. 55, y ambas SEQ ID NO. 56 y SEQ ID NO. 57; y a6: SEQ ID NO. 71 y SEQ ID NO. 72; y a7: ambas SEQ ID NO. 87 y SEQ ID NO. 88, y ambas SEQ ID NO. 89 y SEQ ID NO. 90; y a10: ambas SEQ ID NO. 128, SEQ ID NO. 129 y SEQ ID NO. 130 o las cuatro SEQ ID NO. 131, SEQ ID NO. 132, SEQ ID NO. 133, SEQ ID NO. 134; y a9: ambas SEQ ID NO. 111 y SEQ ID NO.
112, y ambas SEQ ID NO. 113 y SEQ ID NO. 114; y a8: SEQ ID NO. 97, y ambas SEQ ID NO. 98 y SEQ ID NO. 99; y a1: SEQ ID NO. 5 y SEQ ID NO. 6; y a3 SEQ ID NO. 33 y ambas SEQ ID NO. 34 y SEQ ID NO. 35.
En una sexta realización específica, la invención definida anteriormente se pone en práctica para incluir al menos el grupo que consiste en el virus del papiloma a6 que comprende VPH 30, VPH 53, VPH 56 y VPH 66, virus del papiloma a7 que comprende VPH 68, VPH 39, VPH 70, VPH 85, VPH 59, VPH 45, VPH 18, VPH 97, virus del papiloma a10 que comprende VPH 16, VPH 35, VPH 31, VPH 52, VPH 67, VPH 33, VPH 58, virus del papiloma a5 que comprende VPH 26, VPH 69, VPH 51, VPH 82, virus del papiloma a9 que comprende VPH 6, VPH 11, VPH 13, VPH 1, VPH 74, VPH 44, virus del papiloma a8 que comprende VPH 91, VPH 43, VPH 7, VPH 40, virus del papiloma a1 que comprende VPH 42, VPH 32, virus del papiloma a3 que comprende VPH 114, VPH 84, VPH 86, VPH87, VPH 102, VPH83, VPH89, VPH 61, VPH 72, VPH 62 y el virus del papiloma a2 que comprende VPH 117, VPH 10, VPH 94, VPH 28, VPH125, VPH 3, VPH 78, VPH 160, VPH 29, VPH 77.
A este respecto, la invención también contempla una composición de cebadores que comprende para E6: a5: ambas SEQ ID NO. 44 y SEQ ID NO. 45, y las tres SEQ ID NO. 46, SEQ ID NO. 47 y SEQ ID NO. 48 y; a6: SEQ ID NO. 58 o ambas SEQ ID NO. 59 y SEQ ID NO. 60, y ambas SEQ ID NO. 61 y SEQ ID NO. 62 y; a7: las tres SEQ ID NO. 73, SEQ ID NO. 75 y SEQ ID NO. 76 o las tres SEQ ID NO. 74, SEQ ID NO. 75 y SEQ ID NO. 76, y las cinco SEQ ID NO. 77, SEQ ID NO. 78, SEQ ID NO. 79, SEQ ID NO. 80 y SEQ ID NO. 81 y; a10: las tres SEQ ID NO. 115, SEQ ID NO. 116, SEQ ID NO. 117 y las cuatro SEQ ID NO. 118, SEQ ID NO. 119, SEQ ID NO. 120, SEQ ID NO. 121; y a9: ambas SEQ ID NO. 100 y SEQ ID NO. 101 y las tres SEQ ID NO. 102, SEQ ID NO. 103 y SEQ ID NO. 104; y a8: SEQ ID NO. 91, y ambas SEQ ID NO. 92 y SEQ ID NO. 93; y a1: SEQ ID NO. 1 y SEQ ID NO. 2; y a3: las tres SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 22 y SEQ ID NO. 23, y las cuatro SEQ ID NO. 24, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 26 y SEQ ID NO. 27; y a2 y ambas SEQ ID NO. 7 y SEQ ID NO. 8, y las tres SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10 y SEQ ID NO. 11.
Y comprende para L1 a5: SEQ ID NO. 53 o ambas SEQ ID NO. 54 y SEQ ID NO. 55, y ambas SEQ ID NO. 56 y SEQ ID NO. 57; y a6: SEQ ID NO. 71 y SEQ ID NO. 72; y a7: ambas SEQ ID NO. 87 y SEQ ID NO. 88, y ambas SEQ ID NO. 89 y SEQ ID NO. 90; y a10: ambas SEQ ID NO. 128, SEQ ID NO. 129 y SEQ ID NO. 130 o las cuatro SEQ ID NO. 131, SEQ ID NO. 132, SEQ ID NO. 133, SEQ ID NO. 134; y a9: ambas SEQ ID NO. 111 y SEQ ID NO.
112, y ambas SEQ ID NO. 113 y SEQ ID NO. 114; y a8: SEQ ID NO. 97, y ambas SEQ ID NO. 98 y SEQ ID NO. 99; y a1: SEQ ID NO. 5 y SEQ ID NO. 6; y a3 SEQ ID NO. 33 y ambas SEQ ID NO. 34 y SEQ ID NO. 35; y a2 SEQ ID NO. 18, y ambas SEQ ID NO. 19 y SEQ ID NO. 20.
O, a este respecto, la invención también contempla una composición de cebadores que comprende para E7: a5: ambas SEQ ID NO. 49, SEQ ID NO. 50 y ambas SEQ ID NO. 51, SEQ ID NO. 52; y a6: SEQ ID NO. 63 o SEQ ID NO. 64 o SEQ ID NO. 65, SEQ ID NO. 66 o ambas SEQ ID NO. 67 y SEQ ID NO. 68, y ambas SEQ ID NO. 69 y SEQ ID NO. 70; y a7: SEQ ID NO. 82 o ambas SEQ ID NO. 83, SEQ ID NO. 84, y ambas SEQ ID NO. 85, SEQ ID NO. 86; y a10: las tres SEQ ID NO. 122, SEQ ID NO. 123 y SEQ ID NO. 124, y las tres SEQ ID NO. 125, SEQ ID NO. 126 y SEQ ID NO. 127; y a9: las tres SEQ ID NO. 105, SEQ ID NO. 106 y SEQ ID NO. 107, y las tres SEQ ID NO. 108, SEQ ID NO. 109 y 110; y a8: SEQ ID NO. 94, y ambas SEQ ID NO. 95 y SEQ ID NO. 96; y a1: SEQ ID NO. 3 y SEQ ID NO. 4 y a3: ambas SEQ ID NO. 28 y SEQ ID NO. 29, y las tres SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 32; y a2: las tres SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 13 y SEQ ID NO. 14, y las tres SEQ ID NO. 15, SEQ ID NO. 16 y SEQ ID NO. 17.
Y comprende para L1 a5: SEQ ID NO. 53 o ambas SEQ ID NO. 54 y SEQ ID NO. 55, y ambas SEQ ID NO. 56 y SEQ ID NO. 57; y a6: SEQ ID NO. 71 y SEQ ID NO. 72; y a7: ambas SEQ ID NO. 87 y SEQ ID NO. 88, y ambas SEQ ID NO. 89 y SEQ ID NO. 90; y a10: ambas SEQ ID NO. 128, SEQ ID NO. 129 y SEQ ID NO. 130 o las cuatro SEQ ID NO. 131, SEQ ID NO. 132, SEQ ID NO. 133, SEQ ID NO. 134; y a9: ambas SEQ ID NO. 111 y SEQ ID NO.
112, y ambas SEQ ID NO. 113 y SEQ ID NO. 114; y a8: SEQ ID NO. 97, y ambas SEQ ID NO. 98 y SEQ ID NO. 99; y a1: SEQ ID NO. 5 y SEQ ID NO. 6; y a3 SEQ ID NO. 33 y ambas SEQ ID NO. 34 y SEQ ID NO. 35; y a2 SEQ ID NO. 18, y ambas SEQ ID NO. 19 y SEQ ID NO. 20.
En una séptima realización específica, la invención definida anteriormente se pone en práctica para incluir al menos el grupo que consiste en el virus del papiloma a6 que comprende VPH 30, VPH 53, VPH 56 y VPH 66, virus del papiloma a7 que comprende VPH 68, VPH 39, VPH 70, VPH 85, VPH 59, VPH 45, VPH 18, VPH 97, virus del papiloma a10 que comprende VPH 16, VPH 35, VPH 31, VPH 52, VPH 67, VPH 33, VPH 58, virus del papiloma a5 que comprende VPH 26, VPH, 69, VPH 51, VPH 82, virus del papiloma a9 que comprende VPH 6, VPH 11, VPH 13, VPH 1, VPH 74, VPH 44, virus del papiloma a8 que comprende VPH 91, VPH 43, v Ph 7, VPH 40, virus del papiloma a1 que comprende VPH 42, VPH 32, virus del papiloma a3 que comprende v Ph 114, VPH 84, VPH 86, v Ph 87, VPH 102, VPH 83, VPH 89, VPH 61, VPH 72, VPH 62, virus del papiloma a2 que comprende VPH 117, VPH 10, VPH 94, VPH 28, VPH125, V p H 3, v Ph 78, VPH 160, v Ph 29, Vp H 77 y virus del papiloma a4 que comprende VPH 2, VPH 27, VPH 57.
A este respecto, la invención también contempla una composición de cebadores que comprende para E6: a5: ambas SEQ ID NO. 44 y SEQ ID NO. 45, y las tres SEQ ID NO. 46, SEQ ID NO. 47 y SEQ ID NO. 48 y; a6: SEQ ID NO. 58 o ambas SEQ ID NO. 59 y SEQ ID NO. 60, y ambas SEQ ID NO. 61 y SEQ ID NO. 62 y; a7: las tres SEQ ID NO. 73, SEQ ID NO. 75 y SEQ ID NO. 76 o las tres SEQ ID NO. 74, SEQ ID NO. 75 y SEQ ID NO. 76, y las cinco SEQ ID NO. 77, SEQ ID NO. 78, SEQ ID NO. 79, SEQ ID NO. 80 y SEQ ID NO. 81 y; a10: las tres SEQ ID NO. 115, SEQ ID NO. 116, SEQ ID NO. 117 y las cuatro SEQ ID NO. 118, SEQ ID NO. 119, SEQ ID NO. 120, SEQ ID NO. 121; y a9: ambas SEQ ID NO. 100 y SEQ ID NO. 101 y las tres SEQ ID NO. 102, SEQ ID NO. 103 y SEQ ID NO. 104; y a8: SEQ ID NO. 91, y ambas SEQ ID NO. 92 y SEQ ID NO. 93; y a1: SEQ ID NO. 1 y SEQ ID NO. 2; y a3: las tres SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 22 y SEQ ID NO. 23, y las cuatro SEQ ID NO. 24, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 26 y SEQ ID NO. 27; y a2 y ambas SEQ ID NO. 7 y SEQ ID NO. 8, y las tres SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10 y SEQ ID NO. 11; y a4: SEQ ID NO. 36 y SEQ ID NO. 37.
Y comprende para L1 a5: SEQ ID NO. 53 o ambas SEQ ID NO. 54 y SEQ ID NO. 55, y ambas SEQ ID NO. 56 y SEQ ID NO. 57; y a6: SEQ ID NO. 71 y SEQ ID NO. 72; y a7: ambas SEQ ID NO. 87 y SEQ ID NO. 88, y ambas SEQ ID NO. 89 y SEQ ID NO. 90; y a10: ambas SEQ ID NO. 128, SEQ ID NO. 129 y SEQ ID NO. 130 o las cuatro SEQ ID NO. 131, SEQ ID NO. 132, SEQ ID NO. 133, SEQ ID NO. 134; y a9: ambas SEQ ID NO. 111 y SEQ ID NO.
112, y ambas SEQ ID NO. 113 y SEQ ID NO. 114; y a8: SEQ ID NO. 97, y ambas SEQ ID NO. 98 y SEQ ID NO. 99; y a1: SEQ ID NO. 5 y SEQ ID NO. 6; y a3: SEQ ID NO. 33 y ambas SEQ ID NO. 34 y SEQ ID NO. 35; y a2: SEQ ID NO. 18, y ambas SEQ ID NO. 19 y SEQ ID NO. 20; y a4: SEQ ID NO. 40 o SEQ ID NO. 41 y SEQ ID NO. 42 o SEQ ID NO. 43.
O, a este respecto, la invención también contempla una composición de cebadores que comprende para E7: a5: ambas SEQ ID NO. 49, SEQ ID NO. 50 y ambas SEQ ID NO. 51, SEQ ID NO. 52; y a6: SEQ ID NO. 63 o SEQ ID NO. 64 o SEQ ID NO. 65, SEQ ID NO. 66 o ambas SEQ ID NO. 67 y SEQ ID NO. 68, y ambas SEQ ID NO. 69 y SEQ ID NO. 70; y a7: SEQ ID NO. 82 o ambas SEQ ID NO. 83, SEQ ID NO. 84, y ambas SEQ ID NO. 85, SEQ ID NO. 86; y a10: las tres SEQ ID NO. 122, SEQ ID NO. 123 y SEQ ID NO. 124, y las tres SEQ ID NO. 125, SEQ ID NO. 126 y SEQ ID NO. 127; y a9: las tres SEQ ID NO. 105, SEQ ID NO. 106 y SEQ ID NO. 107, y las tres SEQ ID NO. 108, SEQ ID NO. 109 y 110; y a8: SEQ ID NO. 94, y ambas SEQ ID NO. 95 y SEQ ID NO. 96; y a1: SEQ ID NO. 3 y SEQ ID NO. 4; y a3: ambas SEQ ID NO. 28 y SEQ ID NO. 29, y las tres SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 32; y a2: las tres SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 13 y SEQ ID NO. 14, y las tres SEQ ID NO. 15, SEQ ID NO. 16 y SEQ ID NO. 17; y a4: SEQ ID NO. 38 y SEQ ID NO. 39.
Y que comprende para L1 a5: SEQ ID NO. 53 o ambas SEQ ID NO. 54 y SEQ ID NO. 55, y ambas SEQ ID NO. 56 y SEQ ID NO. 57; y a6: SEQ ID NO. 71 y SEQ ID NO. 72; y a7: ambas SEQ ID NO. 87 y SEQ ID NO. 88, y ambas SEQ ID NO. 89 y SEQ ID NO. 90; y a10: ambas SEQ ID NO. 128, SEQ ID NO. 129 y SEQ ID NO. 130 o las cuatro SEQ ID NO. 131, SEQ ID NO. 132, SEQ ID NO. 133, SEQ ID NO. 134; y a9: ambas SEQ ID NO. 111 y SEQ ID NO.
112, y ambas SEQ ID NO. 113 y SEQ ID NO. 114; y a8: SEQ ID NO. 97, y ambas SEQ ID NO. 98 y SEQ ID NO. 99; y a1: SEQ ID NO. 5 y SEQ ID NO. 6; y a3 SEQ ID NO. 33 y ambas SEQ ID NO. 34 y SEQ ID NO. 35; y a2 SEQ ID NO. 18, y ambas SEQ ID NO. 19 y SEQ ID NO. 20; y a4: SEQ ID NO. 40 o SEQ ID NO. 41 y SEQ ID NO. 42 o SEQ ID NO. 43.
En una octava realización específica, la invención definida anteriormente se pone en práctica para incluir al menos el grupo que consiste en el virus del papiloma a6 que comprende VPH 30, VPH 53, VPH 56 y VPH 66, virus del papiloma a7 que comprenden VPH 68, VPH 39, VPH 70, VPH 85, VPH 59, VPH 45, VPH 18 , VPH 97, virus del papiloma a10 que comprende VPH 16, VPH 35, VPH 31, VPH 52, VPH 67, VPH 33, VPH 58, virus del papiloma a5 que comprende VPH 26, VPH 69, VPH 51, VPH 82, virus del papiloma a9 que comprende VPH 6, VPH 11, VPH 13, VPH 1, VPH 74, VPH 44, virus del papiloma a8 que comprende VPH 91, VPH 43, VPH 7, VPH 40, virus del papiloma a1 que comprende VPH 42, VPH 32, virus del papiloma a3 que comprende VPH 114, VPH 84, VPH 86, v Ph 87, VPH 102, VPH 83, VPH 89, VPH 61, VPH 72, VPH 62, virus del papiloma a2 que comprende VPH 117, VPH 10, VPH 94, VPH 28, VPH125, V p H 3, v Ph 78, v Ph 160, VPH 29, VPH 77, virus del papiloma a4 que comprende VPH 2, VPH 27, VPH 57 y virus del papiloma a11 que comprende VpH 73, VPH 34.
A este respecto, la invención también contempla una composición de cebadores que comprende para E6: a5: ambas SEQ ID NO. 44 y SEQ ID NO. 45, y las tres SEQ ID NO. 46, SEQ ID NO. 47 y SEQ ID NO. 48 y; a6: SEQ ID NO. 58 o ambas SEQ ID NO. 59 y SEQ ID NO. 60, y ambas SEQ ID NO. 61 y SEQ ID NO. 62 y; a7: las tres SEQ ID NO. 73, SEQ ID NO. 75 y SEQ ID NO. 76 o las tres SEQ ID NO. 74, SEQ ID NO. 75 y SEQ ID NO. 76, y las cinco SEQ ID NO. 77, SEQ ID NO. 78, SEQ ID NO. 79, SEQ ID NO. 80 y SEQ ID NO. 81 y; a10: las tres SEQ ID NO. 115, SEQ ID NO. 116, SEQ ID NO. 117 y las cuatro SEQ ID NO. 118, SEQ ID NO. 119, SEQ ID NO. 120, SEQ ID NO. 121; y a9: ambas SEQ ID NO. 100 y SEQ ID NO. 101 y las tres SEQ ID NO. 102, SEQ ID NO. 103 y SEQ ID NO. 104; y a8: SEQ ID NO. 91, y ambas SEQ ID NO. 92 y SEQ ID NO. 93; y a1: SEQ ID NO. 1 y SEQ ID NO. 2; y a3: las tres SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 22 y SEQ ID NO. 23, y las cuatro SEQ ID NO. 24, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 26 y SEQ ID NO. 27; y a2 y ambas SEQ ID NO. 7 y SEQ ID NO. 8, y las tres SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10 y SEQ ID NO. 11; y a4: SEQ ID NO. 36 y SEQ ID NO. 37; y a11: SEQ ID NO. 135 y SEQ ID NO. 136.
Y que comprende para L1 a5: SEQ ID NO. 53 o ambas SEQ ID NO. 54 y SEQ ID NO. 55, y ambas SEQ ID NO. 56 y SEQ ID NO. 57; y a6: SEQ ID NO. 71 y SEQ ID NO. 72; y a7: ambas SEQ ID NO. 87 y SEQ ID NO. 88, y ambas SEQ ID NO. 89 y SEQ ID NO. 90; y a10: ambas SEQ ID NO. 128, SEQ ID NO. 129 y SEQ ID NO. 130 o las cuatro SEQ ID NO. 131, SEQ ID NO. 132, SEQ ID NO. 133, SEQ ID NO. 134; y a9: ambas SEQ ID NO. 111 y SEQ ID NO.
112, y ambas SEQ ID NO. 113 y SEQ ID NO. 114; y a8: SEQ ID NO. 97, y ambas SEQ ID NO. 98 y SEQ ID NO. 99; y a1: SEQ ID NO. 5 y SEQ ID NO. 6; y a3: SEQ ID NO. 33 y ambas SEQ ID NO. 34 y SEQ ID NO. 35; y a2: SEQ ID NO. 18, y ambas SEQ ID NO. 19 y SEQ ID NO. 20; y a4: SEQ ID NO. 40 o SEQ ID NO. 41 y SEQ ID NO. 42 o SEQ ID NO. 43; y a11: SEQ ID NO. 139 y SEQ ID NO. 140.
O, a este respecto, la invención también contempla una composición de cebadores que comprende para E7: a5: ambas SEQ ID NO. 49, SEQ ID NO. 50 y ambas SEQ ID NO. 51, SEQ ID NO. 52; y a6: SEQ ID NO. 63 o SEQ ID NO. 64 o SEQ ID NO. 65, SEQ ID NO. 66 o ambas SEQ ID NO. 67 y SEQ ID NO. 68, y ambas SEQ ID NO. 69 y SEQ ID NO. 70; y a7: SEQ ID NO. 82 o ambas SEQ ID NO. 83, SEQ ID NO. 84, y ambas SEQ ID NO. 85, SEQ ID NO. 86; y a10: las tres SEQ ID NO. 122, SEQ ID NO. 123 y SEQ ID NO. 124, y las tres SEQ ID NO. 125, SEQ ID NO. 126 y SEQ ID NO. 127; y a9: las tres SEQ ID NO. 105, SEQ ID NO. 106 y SEQ ID NO. 107, y las tres SEQ ID NO. 108, SEQ ID NO. 109 y 110; y a8: SEQ ID NO. 94, y ambas SEQ ID NO. 95 y SEQ ID NO. 96; y a1: SEQ ID NO. 3 y SEQ ID NO. 4 y a3: ambas SEQ ID NO. 28 y SEQ ID NO. 29, y las tres SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 32; y a2: las tres SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 13 y SEQ ID NO. 14, y las tres SEQ ID NO. 15, SEQ ID NO. 16 y SEQ ID NO. 17; y a4: SEQ ID NO. 38 y SEQ ID NO. 39; y a11: SEQ ID NO. 137 y SEQ ID NO. 138.
Y que comprende para L1 a5: SEQ ID NO. 53 o ambas SEQ ID NO. 54 y SEQ ID NO. 55, y ambas SEQ ID NO. 56 y SEQ ID NO. 57; y a6: SEQ ID NO. 71 y SEQ ID NO. 72; y a7: ambas SEQ ID NO. 87 y SEQ ID NO. 88, y ambas SEQ ID NO. 89 y SEQ ID NO. 90; y a10: ambas SEQ ID NO. 128, SEQ ID NO. 129 y SEQ ID NO. 130 o las cuatro SEQ ID NO. 131, SEQ ID NO. 132, SEQ ID NO. 133, SEQ ID NO. 134; y a9: ambas SEQ ID NO. 111 y SEQ ID NO.
112, y ambas SEQ ID NO. 113 y SEQ ID NO. 114; y a8: SEQ ID NO. 97, y ambas SEQ ID NO. 98 y SEQ ID NO. 99; y a1: SEQ ID NO. 5 y SEQ ID NO. 6; y a3 SEQ ID NO. 33 y ambas SEQ ID NO. 34 y SEQ ID NO. 35; y a2 SEQ ID NO. 18, y ambas SEQ ID NO. 19 y SEQ ID NO. 20; y a4: SEQ ID NO. 40 o SEQ ID NO. 41 y SEQ ID NO. 42 o SEQ ID NO. 43; y a11: SEQ ID NO. 139 y SEQ ID NO. 140.
En una novena realización específica, la invención definida anteriormente se pone en práctica para incluir al menos el grupo que consiste en el virus del papiloma a6 que comprende VPH 30, VPH 53, VPH 56 y VPH 66, virus del papiloma a7 que comprende VPH 68, VPH 39, VPH 70, VPH 85, VPH 59, VPH 45, VPH 18, VPH 97, virus del papiloma a10 que comprende VPH 16, VPH 35, VPH 31, VPH 52, VPH 67, VPH 33, VPH 58, virus del papiloma a5 que comprende VPH 26, VPH, 69, VPH 51, VPH 82, virus del papiloma a9 que comprende VPH 6, VPH 11, VPH 13, VPH 1, VPH 74, VPH 44, virus del papiloma a8 que comprende VPH 91, VPH 43, v Ph 7, VPH 40, virus del papiloma a1 que comprende VPH 42, VPH 32, virus del papiloma a3 que comprende VPH 114, VPH 84, VPH 86, VPH87, VPH 102, VPH 83, VPH 89, VPH 61, VPH 72, VPH 62, virus del papiloma a2 que comprende VPH 117, VPH 10, VPH 94, VPH 28, VPH 125, VPH 3, Vp H 78, V p H 160, v Ph 29, VPH 77, virus del papiloma a4 que comprende VPH 2, VPH 27, VPH 57, virus del papiloma a11 que comprende VPH 73, VPH 34 y virus del papiloma a13 que comprende VPH 54.
A este respecto, la invención también contempla una composición de cebadores que comprende para E6: a5: ambas SEQ ID NO. 44 y SEQ ID NO. 45, y las tres SEQ ID NO. 46, SEQ ID NO. 47 y SEQ ID NO. 48 y; a6: SEQ ID NO. 58 o ambas SEQ ID NO. 59 y SEQ ID NO. 60, y ambas SEQ ID NO. 61 y SEQ ID NO. 62 y; a7: las tres SEQ ID NO. 73, SEQ ID NO. 75 y SEQ ID NO. 76 o las tres SEQ ID NO. 74, SEQ ID NO. 75 y SEQ ID NO. 76, y las cinco SEQ ID NO. 77, SEQ ID NO. 78, SEQ ID NO. 79, SEQ ID NO. 80 y SEQ ID NO. 81 y; a10: las tres SEQ ID NO. 115, SEQ ID NO. 116, SEQ ID NO. 117 y las cuatro SEQ ID NO. 118, SEQ ID NO. 119, SEQ ID NO. 120, SEQ ID NO. 121; y a9: ambas SEQ ID NO. 100 y SEQ ID NO. 101 y las tres SEQ ID NO. 102, SEQ ID NO. 103 y SEQ ID NO. 104; y a8: SEQ ID NO. 91, y ambas SEQ ID NO. 92 y SEQ ID NO. 93; y a1: SEQ ID NO. 1 y SEQ ID NO. 2; y a3: las tres SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 22 y SEQ ID NO. 23, y las cuatro SEQ ID NO. 24, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 26 y SEQ ID NO. 27; y a2 y ambas SEQ ID NO. 7 y SEQ ID NO. 8, y las tres SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10 y SEQ ID NO. 11; y a4: SEQ ID NO. 36 y SEQ ID NO. 37; y a11: SEQ ID NO. 135 y SEQ ID NO. 136; y a13 SEQ ID NO. 141 y SEQ ID NO. 142.
Y que comprende para L1 a5: SEQ ID NO. 53 o ambas SEQ ID NO. 54 y SEQ ID NO. 55, y ambas SEQ ID NO. 56 y SEQ ID NO. 57; y a6: SEQ ID NO. 71 y SEQ ID NO. 72; y a7: ambas SEQ ID NO. 87 y SEQ ID NO. 88, y ambas SEQ ID NO. 89 y SEQ ID NO. 90; y a10: ambas SEQ ID NO. 128, SEQ ID NO. 129 y SEQ ID NO. 130 o las cuatro SEQ ID NO. 131, SEQ ID NO. 132, SEQ ID NO. 133, SEQ ID NO. 134; y a9: ambas SEQ ID NO. 111 y SEQ ID NO.
112, y ambas SEQ ID NO. 113 y SEQ ID NO. 114; y a8: SEQ ID NO. 97, y ambas SEQ ID NO. 98 y SEQ ID NO. 99; y a1: SEQ ID NO. 5 y SEQ ID NO. 6; y a3 SEQ ID NO. 33 y ambas SEQ ID NO. 34 y SEQ ID NO. 35; y a2 SEQ ID NO. 18, y ambas SEQ ID NO. 19 y SEQ ID NO. 20; y a4: SEQ ID NO. 40 o SEQ ID NO. 41 y SEQ ID NO. 42 o SEQ ID NO. 43; y a11: SEQ ID NO. 139 y SEQ ID NO. 140; y a13 SEQ ID NO. 145 y SEQ ID NO. 146.
O, a este respecto, la invención también contempla una composición de cebadores que comprende para E7: a5: ambas SEQ ID NO. 49, SEQ ID NO. 50 y ambas SEQ ID NO. 51, SEQ ID NO. 52; y a6: SEQ ID NO. 63 o SEQ ID NO. 64 o SEQ ID NO. 65, SEQ ID NO. 66 o ambas SEQ ID NO. 67 y SEQ ID NO. 68, y ambas SEQ ID NO. 69 y SEQ ID NO. 70; y a7: SEQ ID NO. 82 o ambas SEQ ID NO. 83, SEQ ID NO. 84, y ambas SEQ ID NO. 85, SEQ ID NO. 86; y a10: las tres SEQ ID NO. 122, SEQ ID NO. 123 y SEQ ID NO. 124, y las tres SEQ ID NO. 125, SEQ ID NO. 126 y SEQ ID NO. 127; y a9: las tres SEQ ID NO. 105, SEQ ID NO. 106 y SEQ ID NO. 107, y las tres SEQ ID NO. 108, SEQ ID NO. 109 y 110; y a8: SEQ ID NO. 94, y ambas SEQ ID NO. 95 y SEQ ID NO. 96; y a1: SEQ ID NO. 3 y SEQ ID NO. 4 y a3: ambas SEQ ID NO. 28 y SEQ ID NO. 29, y las tres SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 32; y a2: las tres SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 13 y SEQ ID NO. 14, y las tres SEQ ID NO. 15, SEQ ID NO. 16 y SEQ ID NO. 17; y a4: SEQ ID NO. 38 y SEQ ID NO. 39; y a11 SEQ ID NO. 137 y SEQ ID NO. 138; y a13: SEQ ID NO. 143 y SEQ ID NO. 144.
Y que comprende para L1 a5: SEQ ID NO. 53 o ambas SEQ ID NO. 54 y SEQ ID NO. 55, y ambas SEQ ID NO. 56 y SEQ ID NO. 57; y a6: SEQ ID NO. 71 y SEQ ID NO. 72; y a7: ambas SEQ ID NO. 87 y SEQ ID NO. 88, y ambas SEQ ID NO. 89 y SEQ ID NO. 90; y a10: ambas SEQ ID NO. 128, SEQ ID NO. 129 y SEQ ID NO. 130 o las cuatro SEQ ID NO. 131, SEQ ID NO. 132, SEQ ID NO. 133, SEQ ID NO. 134; y a9: ambas SEQ ID NO. 111 y SEQ ID NO.
112, y ambas SEQ ID NO. 113 y SEQ ID NO. 114; y a8: SEQ ID NO. 97, y ambas SEQ ID NO. 98 y SEQ ID NO. 99; y a1: SEQ ID NO. 5 y SEQ ID NO. 6; y a3: SEQ ID NO. 33 y ambas SEQ ID NO. 34 y SEQ ID NO. 35; y a2: SEQ ID NO. 18, y ambas SEQ ID NO. 19 y SEQ ID NO. 20; y a4: SEQ ID NO. 40 o SEQ ID NO. 41 y SEQ ID NO. 42 o SEQ ID NO. 43; y a11: SEQ ID NO. 139 y SEQ ID NO. 140; y a13: SEQ ID NO. 145 y SEQ ID NO. 146.
En una décima realización específica, la invención definida anteriormente se pone en práctica para incluir al menos el grupo que consiste en el virus del papiloma a6 que comprende VPH 30, VPH 53, VPH 56 y VPH 66, virus del papiloma a7 que comprende VPH 68, VPH 39, VPH 70, VPH 85, VPH 59, VPH 45, VPH 18, VPH 97, virus del papiloma a10 que comprende VPH 16, VPH 35, VPH 31, VPH 52, VPH 67, VPH 33, VPH 58, virus del papiloma a5 que comprende VPH 26, VPH 69, VPH 51, VPH 82, virus del papiloma a9 que comprende VPH 6, VPH 11, VPH 13, VPH 1, VPH 74, VPH 44, virus del papiloma a8 que comprende VPH 91, VPH 43, VPH 7, VPH 40, virus del papiloma a1 que comprende VPH 42, VPH 32, virus del papiloma a3 que comprende v Ph 114, VPH 84, VPH 86, v Ph 87, VPH 102, VPH 83, VPH 89, VPH 61, VPH 72, VPH 62, virus del papiloma a2 que comprende VPH 117, VPH 10, VPH 94, VPH 28, VPH125, V p H 3, v Ph 78, v Ph 160, VPH 29, VPH 77, virus del papiloma a4 que comprende VPH 2, VPH 27, VPH 57, virus del papiloma a11 que comprende VPH 73, VPH 34, virus del papiloma a13 que comprende VPH 54 y virus del papiloma a14 que comprende VPH 106, VPH 90, VPH 71.
A este respecto, la invención también contempla una composición de cebadores que comprende para E6: a5: ambas SEQ ID NO. 44 y SEQ ID NO. 45, y las tres SEQ ID NO. 46, SEQ ID NO. 47 y SEQ ID NO. 48 y; a6: SEQ ID NO. 58 o ambas SEQ ID NO. 59 y SEQ ID NO. 60, y ambas SEQ ID NO. 61 y SEQ ID NO. 62 y; a7: las tres SEQ ID NO. 73, SEQ ID NO. 75 y SEQ ID NO. 76 o las tres SEQ ID NO. 74, SEQ ID NO. 75 y SEQ ID NO. 76, y las cinco SEQ ID NO. 77, SEQ ID NO. 78, SEQ ID NO. 79, SEQ ID NO. 80 y SEQ ID NO. 81 y; a10: las tres SEQ ID NO. 115, SEQ ID NO. 116, SEQ ID NO. 117 y las cuatro SEQ ID NO. 118, SEQ ID NO. 119, SEQ ID NO. 120, SEQ ID NO. 121; y a9: ambas SEQ ID NO. 100 y SEQ ID NO. 101 y las tres SEQ ID NO. 102, SEQ ID NO. 103 y SEQ ID NO. 104; y a8: SEQ ID NO. 91, y ambas SEQ ID NO. 92 y SEQ ID NO. 93; y a1: SEQ ID NO. 1 y SEQ ID NO. 2; y a3: las tres SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 22 y SEQ ID NO. 23, y las cuatro SEQ ID NO. 24, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 26 y SEQ ID NO. 27; y a2 y ambas SEQ ID NO. 7 y SEQ ID NO. 8, y las tres SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10 y SEQ ID NO. 11; y a4: SEQ ID NO. 36 y SEQ ID NO. 37; y a11: SEQ ID NO. 135 y SEQ ID NO. 136; y a13 SEQ ID NO. 141 y SEQ ID NO. 142; y a14: SEQ ID NO. 147 y SEQ ID NO. 148.
Y que comprende para L1, a5: SEQ ID NO. 53 o ambas SEQ ID NO. 54 y SEQ ID NO. 55, y ambas SEQ ID NO. 56 y SEQ ID NO. 57; y a6: SEQ ID NO. 71 y SEQ ID NO. 72; y a7: ambas SEQ ID NO. 87 y SEQ ID NO. 88, y ambas SEQ ID NO. 89 y SEQ ID NO. 90; y a10: ambas SEQ ID NO. 128, SEQ ID NO. 129 y SEQ ID NO. 130 o las cuatro SEQ ID NO. 131, SEQ ID NO. 132, SEQ ID NO. 133, SEQ ID NO. 134; y a9: ambas SEQ ID NO. 111 y SEQ ID NO.
112, y ambas SEQ ID NO. 113 y SEQ ID NO. 114; y a8: SEQ ID NO. 97, y ambas SEQ ID NO. 98 y SEQ ID NO. 99; y a1: SEQ ID NO. 5 y SEQ ID NO. 6; y a3: SEQ ID NO. 33 y ambas SEQ ID NO. 34 y SEQ ID NO. 35; y a2: SEQ ID NO. 18, y ambas SEQ ID NO. 19 y SEQ ID NO. 20; y a4: SEQ ID NO. 40 o SEQ ID NO. 41 y SEQ ID NO. 42 o SEQ ID NO. 43; y a11: SEQ ID NO. 139 y SEQ ID NO. 140; y a13: SEQ ID NO. 145 y SEQ ID NO. 146; y a14: SEQ ID NO. 151 y SEQ ID NO. 152.
O, a este respecto, la invención también contempla una composición de cebadores que comprende para E7: a5: ambas SEQ ID NO. 49, SEQ ID NO. 50 y ambas SEQ ID NO. 51, SEQ ID NO. 52; y a6: SEQ ID NO. 63 o SEQ ID NO. 64 o SEQ ID NO. 65, SEQ ID NO. 66 o ambas SEQ ID NO. 67 y SEQ ID NO. 68, y ambas SEQ ID NO. 69 y SEQ ID NO. 70; y a7: SEQ ID NO. 82 o ambas SEQ ID NO. 83, SEQ ID NO. 84, y ambas SEQ ID NO. 85, SEQ ID NO. 86; y a10: las tres SEQ ID NO. 122, SEQ ID NO. 123 y SEQ ID NO. 124, y las tres SEQ ID NO. 125, SEQ ID NO. 126 y SEQ ID NO. 127; y a9: las tres SEQ ID NO. 105, SEQ ID NO. 106 y SEQ ID NO. 107, y las tres SEQ ID NO. 108, SEQ ID NO. 109 y 110; y a8: SEQ ID NO. 94, y ambas SEQ ID NO. 95 y SEQ ID NO. 96; y a1: SEQ ID NO. 3 y SEQ ID NO. 4 y a3: ambas SEQ ID NO. 28 y SEQ ID NO. 29, y las tres SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 32; y a2: las tres SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 13 y SEQ ID NO. 14, y las tres SEQ ID NO. 15, SEQ ID NO. 16 y SEQ ID NO. 17; y a4: SEQ ID NO. 38 y SEQ ID NO. 39; y a11: SEQ ID NO. 137 y SEQ ID NO. 138; y a13: SEQ ID NO. 143 y SEQ ID NO. 144; y a14: SEQ ID NO. 149 y SEQ ID NO. 150.
Y que comprende para L1 a5: SEQ ID NO. 53 o ambas SEQ ID NO. 54 y SEQ ID NO. 55, y ambas SEQ ID NO. 56 y SEQ ID NO. 57; y a6: SEQ ID NO. 71 y SEQ ID NO. 72; y a7: ambas SEQ ID NO. 87 y SEQ ID NO. 88, y ambas SEQ ID NO. 89 y SEQ ID NO. 90; y a10: ambas SEQ ID NO. 128, SEQ ID NO. 129 y SEQ ID NO. 130 o las cuatro SEQ ID NO. 131, SEQ ID NO. 132, SEQ ID NO. 133, SEQ ID NO. 134; y a9: ambas SEQ ID NO. 111 y SEQ ID NO.
112, y ambas SEQ ID NO. 113 y SEQ ID NO. 114; y a8: SEQ ID NO. 97, y ambas SEQ ID NO. 98 y SEQ ID NO. 99; y a1: SEQ ID NO. 5 y SEQ ID NO. 6; y a3: SEQ ID NO. 33 y ambas SEQ ID NO. 34 y SEQ ID NO. 35; y a2: SEQ ID NO. 18, y ambas SEQ ID NO. 19 y SEQ ID NO. 20; y a4: SEQ ID NO. 40 o SEQ ID NO. 41 y SEQ ID NO. 42 o SEQ ID NO. 43; y a11: SEQ ID NO. 139 y SEQ ID NO. 140; y a13: SEQ ID NO. 145 y SEQ ID NO. 146; y a14: SEQ ID NO. 151 y SEQ ID NO. 152.
En el presente documento se describe el uso de la composición de cebadores descrita anteriormente para el diagnóstico o pronóstico del riesgo de desarrollar cáncer inducido por VPH en un sujeto humano.
Dichos cebadores pueden comprender además al menos uno de:
- un grupo funcional para el acoplamiento covalente en el extremo 5' o 3', como un grupo terminal que comprende un grupo tiol, amina o carboxilo,
- una molécula espaciadora o secuencia en el extremo 5' o 3',
- secuencias adicionales como secuencias de índice o marcadoras para realizar pasos de amplificación general y adicionales previos o posteriores que no dependan de las secuencias diana a cuantificar.
En el presente documento se describe una composición de cebadores que comprende al menos un cebador seleccionado de SEQ ID No 153 a 158. Dicha composición puede comprender 1, 2, 3, 4, 5 o los 6 cebadores seleccionados de SEQ ID No 153 a 158.
En otra realización, la presente invención se refiere a un kit para el diagnóstico o pronóstico del riesgo de desarrollar cáncer inducido por VPH según la reivindicación 14 o 15.
En el presente documento se describe un kit para el diagnóstico o pronóstico del riesgo de desarrollar cáncer inducido por VPH que comprende:
a) una composición de cebadores,
b) reactivos para detectar productos de amplificación.
En una realización específica, la presente invención se refiere a un kit para el diagnóstico o pronóstico del riesgo de desarrollar cáncer inducido por VPH que comprende:
a) cebadores o sondas para detectar al menos un primer marcador seleccionado de ARNm de E6 de los VPH del grupo alfa, ARNm de E7 de los VPH del grupo alfa, o ambos,
b) cebadores o sondas para detectar al menos un segundo marcador seleccionado entre los ARNm de L1 de los VPH del grupo alfa, los ARNm de L2 de los VPH del grupo alfa, o ambos,
donde dichos ARNm de E6, E7, L1 y L2 tienen secuencias intragenéticas correspondientes,
c) y, opcionalmente, cebadores o sondas para detectar al menos un marcador celular del huésped indicativo de neoplasia o cáncer.
En diversas realizaciones, los cebadores pueden seleccionarse de cebadores que comprenden o consisten en la secuencia de ácido nucleico de cualquiera de las SEQ ID NO: 1-152. Preferiblemente, los cebadores comprenden o consisten en al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos consecutivos de cualquiera de las SEQ ID NO: 1-152. El kit puede contener cualquiera de las composiciones de cebadores descritas en este documento.
El kit puede contener además al menos 1, 2, 3, 4 o más controles para la determinación de R. Los controles pueden contener una relación conocida de E6 y / o E7 a L1 y / o L2. Preferiblemente, los controles contienen una relación conocida de E6 y E7 a L1 y L2.
En varias realizaciones, el kit contiene al menos 1 o al menos 2 controles que indican una infección por VPH de bajo riesgo o no persistente. En varias realizaciones, el kit contiene al menos 1 o al menos 2 controles indicativos de una infección de alto riesgo o asociados con un mayor riesgo de desarrollar neoplasia genital y cáncer. En realizaciones preferidas, el kit contiene al menos 1 o al menos 2 controles que indican una infección por VPH de bajo riesgo o no persistente y al menos 1 o al menos 2 controles que indican una infección de alto riesgo o asociados con un mayor riesgo de desarrollar neoplasia genital y cáncer.
En varias realizaciones, la invención abarca un método para evaluar a un paciente infectado con el virus del papiloma humano (VPH). En una realización, el método comprende generar ADNc a partir de una muestra de paciente que comprende ARN y secuenciar el ADNc para generar lecturas de la secuencia del ADNc.
En varias realizaciones, el número de lecturas es de al menos 106, 5x106, 107, 2x107, 5x107 lecturas.
En una realización, el ADNc se genera usando cebadores aleatorios. En una realización, el ADNc se genera utilizando cebadores específicos de VPH. En realizaciones preferidas, al menos uno de los cebadores comprende o consta de las secuencias de ácido nucleico de la Tabla 3.
En varias realizaciones, el método comprende discriminar las lecturas de la secuencia de VPH en base a las especies de VPH que incluyen cualquiera de las especies específicas a las que se hace referencia en este documento. En varias realizaciones, el método comprende discriminar las lecturas de la secuencia de VPH sobre la base de la transcripción del gen de VPH, incluyendo las transcripciones de E1, E2, E4, E5, E6, E7, E8, L1 y L2. Las transcripciones pueden ser transcripciones empalmadas.
En diversas realizaciones, el ADNc o la secuenciación se pueden realizar con cebadores específicos o aleatorios de VPH, preferiblemente cebadores específicos de VPH.
En diversas realizaciones, los cebadores comprenden o consisten en cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de las SEQ ID NO: 1-158. En varias realizaciones, el ADNc se genera con cebadores específicos de VPH y la secuenciación se realiza de forma aleatoria o específica para las secuencias de VPH.
En varias realizaciones, el ADNc se genera con cebadores aleatorios y la secuenciación se realiza de forma aleatoria o específica para las secuencias de VPH.
Según una realización preferida, el método comprende:
a) enriquecer los ARN virales, preferiblemente ARN de VPH16, en una muestra,
b) realizar la reacción de transcripción inversa aleatoria, ventajosamente con hexámeros aleatorios,
c) amplificar el ADNc producido en la etapa a), realizada ventajosamente por PCR múltiple con cebadores específicos de VPH (para generar una biblioteca de secuencias de ADN),
d) secuenciar a alto rendimiento la biblioteca de ADN producida en el paso c) y generar lecturas de dicho ADNc,
e) determinar el número de lecturas que coinciden con dichos virus en función de la discriminación de especies y determinar las especies de alto riesgo más prevalentes presentes en la muestra en relación con otras especies,
f) determinar dentro de dichas especies de alto riesgo más prevalentes el número relativo de lecturas que coinciden con al menos un gen oncogénico en comparación con al menos un gen no oncogénico, preferiblemente genes oncogénicos en comparación con genes no oncogénicos,
g) calcular las proporciones dentro de dicha especie de alto riesgo de lecturas que coinciden con al menos un gen oncogénico frente a al menos uno vs. correspondiente a al menos un gen estructural o regulador interespecie, preferiblemente genes oncogénicos frente a genes reguladores o estructurales interespecies correspondientes
h) determinar el riesgo de desarrollar un cáncer inducido por virus oncogénicos en pacientes en los que dicha proporción tiende al infinito.
En realizaciones ventajosas, los cebadores específicos de VPH comprenden al menos uno de, preferiblemente todos, los siguientes grupos de pares de cebadores:
- los cebadores específicos de VPH16 que comprenden o consisten en los cebadores de SEQ ID NO: 219-258 para transcripciones genómicas y no empalmadas de VPH16, SEQ ID NO: 259-352 para transcripciones empalmadas de VPH16 y SEQ ID NO: 353-376 para transcripciones de fusión VPH16-humano (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO: 219-220; 221-222; 223-224; 225-226; 227-228; 229-230; 231-232; 233-234; 235-236; 237-238; 239-240 241-242 243-244 245-246 247-248 249-250 251-252 253-254 255-256 257-258 259-260 261-262 263-264 265-266 267-268 269-270 271-272 273-274 275-276 277-278 279-280 281-282 283-284 285-286 287-288 289-290 291-292 293-294 295-296 297-298 299-300 301-302 303-304 305-306 307-308 309-310 311-312 313-314 315-316 317-318 319-320 321-322 323-324 325-326 327-328 329-330 331-332 333-334 335-336 337-338 339-340 341-342 343-344 345-346 347-348 349-350 351-352 353-354 355-356 357-358 359-360 361-362 363-364 ; 365-366 ; 367-368; 369-370; 371-372; 373-374; 375-376) o 377-470 (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO. 377-378; 379-380; 381-382; 383-384; 385-386 387-388 389-390 391-392 393-394 395-396 397-398 399-400 401-402 403-404 405-406 407-408 409-410 411-412 413-414 415-416 417-418 419-420 421-422 423-424 425-426 427-428 429-430 431-432 433-434 435-436 437-438 439-440 441-442 443-444 445-446 447-448 449-450 451-452 453-454 455-456 457-458 459-460 461-462 463-464 465-466 467-468 y; 469-470); y / o
- los cebadores específicos de VPH18 que comprenden o consisten en los cebadores de SEQ ID NO. 471-574 (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO.: 471-472; 473-474; 475-476; 477-478; 479-480; 481-482; 483-484; 485-486; 487-488; 489-490; 491-492; 493-494; 495-496; 497-498; 499-500; 501-502; 503-504; 505-506; 507-508; 509-510; 511-512; 513-514; 515-516; 517-518; 519-520; 521-522; 523-524; 525-526; 527-528; 529-530; 531-532; 533-534; 535-536; 537-538; 539-540; 541-542; 543-544; 545-546; 547-548; 549-550; 551-552; 553-554; 555-556; 557-558; 559-560; 561-562; 563-564; 565-566; 567-568; 569-570; 571-572; 573-574); y / o
- los cebadores específicos de VPH31 que comprenden o consisten en los cebadores de SEQ ID NO. 575-668 (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO.: 575-576; 577-578; 579-580; 581-582; 583-584; 585-586; 587-588; 589-590; 591-592; 593-594; 595-596; 597-598; 599-600; 601-602; 603-604; 605-606; 607-608; 609-610; 611-612; 613-614; 615-616; 617-618; 619-620; 621-622; 623-624; 625-626; 627-628; 629-630; 631-632; 633-634; 635-636; 637-638; 639-640; 641-642; 643-644; 645-646; 647-648; 649-650; 651-652; 653-654; 655-656; 657-658; 659-660; 661 -662; 663-664; 665-666; 667-668); y / o
- los cebadores específicos de VPH33 que comprenden o consisten en SEQ ID NO. 669-756 (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO.: 669-670; 671-672; 673-674; 675-676; 677-678; 679-680; 681-682; 683-684; 685-686; 687-688; 689-690; 691-692; 693-694; 695-696; 697-698; 699-700; 701-702; 703-704; 705-706; 707-708; 709-710; 711-712; 713-714; 715-716; 717-718; 719-720; 721-722; 723-724; 725-726; 727-728; 729-730; 731-732; 733-734; 735-736; 737-738; 739-740; 741-742; 743-744; 745-746; 747-748; 749-750; 751-752; 753-754; 755-756); y / o
- los cebadores específicos de VPH35 que comprenden o consisten en los cebadores de SEQ ID NO. 757-848 (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO.: 757-758; 759-760; 761-762; 763-764; 765-766; 767-768; 769-770; 771-772; 773-774; 775-776; 777-778; 779-780; 781-782; 783-784; 785-786; 787-788; 789-790; 791-792; 793-794; 795-796; 797-798; 799-800; 801-802; 803-804; 805-806; 807-808; 809-810; 811-812; 813-814; 815-816; 817-818; 819-820; 821-822; 823-824; 825-826; 827-828; 829-830; 831-832; 833-834; 835-836; 837-838; 839-840; 841-842; 843-844; 845-846; 847-848); y / o
- los cebadores específicos de VPH39 que comprenden o consisten en los cebadores de SEQ ID NO. 849-928 (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO.: 849-850; 851-852; 853-854; 855-856; 857-858; 859-860; 861-862; 863-864; 865-866; 867-868; 869-870; 871-872; 873-874; 875-876; 877-878; 879-880; 881-882; 883-884; 885-886; 887-888; 889-890; 891-892; 893-894; 895-896; 897-898; 899-900; 901-902; 903-904; 905-906; 907-908; 909-910; 911-912; 913-914; 915-916; 917-918; 919-920; 921-922; 923-924; 925-926; 927-928); y / o
- los cebadores específicos de VPH45 que comprenden o consisten en los cebadores de SEQ ID NO. 929-1020 (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO.: 929-930; 931-932; 933-934; 935-936; 937-938; 939-940; 941-942; 943-944; 945-946; 947-948; 949-950; 951-952; 953-954; 955-956; 957-958; 959-960; 961-962; 963-964; 965-966; 967-968; 969-970; 971-972; 973-974; 975-976; 977-978; 979-980; 981-982; 983-984; 985-986; 987-988; 989-990; 991-992; 993-994; 995-996 ; 997-998; 999-1000; 1001-1002; 1003-1004; 1005-1006; 1007-1008; 1009-1010; 1011­ 1012; 1013-1014; 1015-1016; 1017-1018; 1019-1020); y / o
- los cebadores específicos de VPH51 que comprenden o consisten en los cebadores de SEQ ID NO. 1021-1102 (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO.: 1021-1022; 1023-1024; 1025-1026; 1027-1028; 1029-1030; 1031­ 1032; 1033-1034; 1035-1036; 1037-1038; 1039-1040; 1041-1042; 1043-1044; 1045-1046; 1047-1048; 1049-1050; 1051-1052; 1053-1054; 1055-1056; 1057-1058; 1059-1060; 1061-1062; 1063-1064; 1065-1066; 1067-1068; 1069­ 1070; 1071-1072; 1073-1074; 1075-1076; 1077-1078; 1079-1080; 1081-1082; 1083-1084; 1085-1086; 1087-1088; 1089-1090; 1091-1092; 1093-1094; 1095-1096; 1097-1098; 1099-1100; 1101-1102); y / o
- los cebadores específicos de VPH52 que comprenden o consisten en los cebadores de SEQ ID NO. 1103-1200 (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO.: 1103-1104; 1105-1106; 1107-1108; 1109-1110; 1111-1112; 1113­ 1114; 1115-1116; 1117-1118; 1119-1120; 1121-1122; 1123-1124; 1125-1126; 1127-1128; 1129-1130; 1131-1132; 1133-1134; 1135-1136; 1137-1138; 1139-1140; 1141-1142; 1143-1144; 1145-1146; 1147-1148; 1149-1150; 1151­ 1152; 1153-1154; 1155-1156; 1157-1158; 1159-1160; 1161-1162; 1163-1164; 1165-1166; 1167-1168; 1169-1170; 1171-1172; 1173-1174; 1175-1176; 1177-1178; 1179-1180; 1181-1182; 1183-1184; 1185-1186; 1187-1188; 1189­ 1190; 1191-1192; 1193-1194; 1195-1196; 1197-1198; 1199-1200); y / o
- los cebadores específicos de VPH56 que comprenden o consisten en los cebadores de SEQ ID NO. 1201-1296 (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO.: 1201-1202; 1203-1204; 1205-1206; 1207-1208; 1209-1210; 1211­ 1212; 1213-1214; 1215-1216; 1217-1218; 1219-1220; 1221-1222; 1223-1224; 1225-1226; 1227-1228; 1229-1230; 1231-1232; 1233-1234; 1235-1236; 1237-1238; 1239-1240; 1241-1242; 1243-1244; 1245-1246; 1247-1248; 1249­ 1250; 1251-1252; 1253-1254; 1255-1256; 1257-1258; 1259-1260; 1261-1262; 1263-1264; 1265-1266; 1267-1268; 1269-1270; 1271-1272; 1273-1274; 1275-1276; 1277-1278; 1279-1280; 1281-1282; 1283-1284; 1285-1286; 1287­ 1288; 1289-1290; 1291 -1292; 1293-1294; 1295-1296); y / o
- los cebadores específicos de VPH58 que comprenden o consisten en los cebadores de SEQ ID NO. 1297-1382 (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO.: 1297-1298; 1299-1300; 1301-1302; 1303-1304; 1305-1306; 1307­ 1308; 1309-1310; 1311-1312; 1313-1314; 1315-1316; 1317-1318; 1319-1320; 1321-1322; 1323-1324; 1325-1326; 1327-1328; 1329-1330; 1331-1332; 1333-1334; 1335-1336; 1337-1338; 1339-1340; 1341-1342; 1343-1344; 1345­ 1346; 1347-1348; 1349-1350; 1351-1352; 1353-1354; 1355-1356; 1357-1358; 1359-1360; 1361-1362; 1363-1364; 1365-1366; 1367-1368; 1369-1370; 1371-1372; 1373-1374; 1375-1376; 1377-1378; 1379-1380; 1381-1382); y / o
- los cebadores específicos de VPH59 que comprenden o consisten en los cebadores de SEQ ID NO. 1383-1470 (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO.: 1383-1384; 1385-1386; 1387-1388; 1389-1390; 1391-1392; 13931394; 1395-1396; 1397-1398; 1399-1400; 1401-1402; 1403-1404; 1405-1406; 1407-1408; 1409-1410; 1411-1412; 1413-1414; 1415-1416; 1417-1418; 1419-1420; 1421-1422; 1423-1424; 1425-1426; 1427-1428; 1429-1430; 1431 -1432; 1433-1434; 1435-1436; 1437-1438; 1439-1440; 1441-1442; 1443-1444; 1445-1446; 1447-1448; 1449-1450; 1451-1452; 1453-1454; 1455-1456; 1457-1458; 1459-1460; 1461-1462; 1463-1464; 1465-1466; 1467-1468; 1469­ 1470); y / o
- los cebadores específicos de VPH66 que comprenden o consisten en los cebadores de SEQ ID NO. 1471-1560 (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO.: 1471-1472; 1473-1474; 1475-1476; 1477-1478; 1479-1480; 1481 -1482; 1483-1484; 1485-1486; 1487-1488; 1489-1490; 1491-1492; 1493-1494; 1495-1496; 1497-1498; 1499-1500; 1501-1502; 1503-1504; 1505-1506; 1507-1508; 1509-1510; 1511-1512; 1513-1514; 1515-1516; 1517-1518; 1519­ 1520; 1521-1522; 1523-1524; 1525-1526; 1527-1528; 1529-1530; 1531-1532; 1533-1534; 1535-1536; 1537-1538; 1539-1540; 1541-1542; 1543-1544; 1545-1546; 1547-1548; 1549-1550; 1551-1552; 1553-1554; 1555-1556; 1557­ 1558; 1559-1560; y / o
- los cebadores específicos de VPH68 que comprenden o consisten en los cebadores de SEQ ID NO. 1561-1642 (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO.: 1561-1562; 1563-1564; 1565-1566; 1567-1568; 1569-1570; 1571­ 1572; 1573-1574; 1575-1576; 1577-1578; 1579-1580; 1581-1582; 1583-1584; 1585-1586; 1587-1588; 1589-1590; 1591-1592; 1593-1594; 1595-1596; 1597-1598; 1599-1600; 1601-1602; 1603-1604; 1605-1606; 1607-1608; 1609­ 1610; 1611-1612; 1613-1614; 1615-1616; 1617-1618; 1619-1620; 1621-1622; 1623-1624; 1625-1626; 1627-1628; 1629-1630; 1631-1632; 1633-1634; 1635-1636; 1637-1638; 1639-1640; 1641-1642); y / o
- los cebadores específicos de VPH73 que comprenden o consisten en los cebadores de SEQ ID NO. 1643-1732 (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO.: 1643-1644; 1645-1646; 1647-1648; 1649-1650; 1651-1652; 1653­ 1654; 1655-1656; 1657-1658; 1659-1660; 1661-1662; 1663-1664; 1665-1666; 1667-1668; 1669-1670; 1671-1672; 1673-1674; 1675-1676; 1677-1678; 1679-1680; 1681-1682; 1683-1684; 1685-1686; 1687-1688; 1689-1690; 1691­ 1692; 1693-1694; 1695-1696; 1697-1698; 1699-1700; 1701-1702; 1703-1704; 1705-1706; 1707-1708; 1709-1710; 1711-1712; 1713-1714; 1715-1716; 1717-1718; 1719-1720; 1721-1722; 1723-1724; 1725-1726; 1727-1728; 1729­ 1730; 1731-1732); y / o
- los cebadores específicos de VPH82 que comprenden o consisten en los cebadores de SEQ ID NO. 1733-1816 (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO.: 1733-1734; 1735-1736; 1737-1738; 1739-1740; 1741-1742; 1743­ 1744; 1745-1746; 1747-1748; 1749-1750; 1751-1752; 1753-1754; 1755-1756; 1757-1758; 1759-1760; 1761-1762; 1763-1764; 1765-1766; 1767-1768; 1769-1770; 1771-1772; 1773-1774; 1775-1776; 1777-1778; 1779-1780; 1781­ 1782; 1783-1784; 1785-1786; 1787-1788; 1789-1790; 1791-1792; 1793-1794; 1795-1796; 1797-1798; 1799-1800; 1801-1802; 1803-1804; 1805-1806; 1807-1808; 1809-1810; 1811-1812; 1813-1814; 1815-1816).
En otras realizaciones ventajosas, los cebadores específicos de VPH comprenden al menos uno de, preferiblemente todos, los siguientes grupos de pares de cebadores:
- Grupo SD1-SA1 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 397-398; 521-522; 609-610; 695­ 696; 819-820; 865-866; 947-948; 1067-1068; 1119-1120; 1267-1268; 1325-1326; 1507-1508; 1597-1598; 1655-1656; 1755-1756; y / o
- Grupo SD1-SA2 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 459-460; 633-634; 687-688; 1111­ 1112; 1235-1236; 1341 -1342; 1503-1504; 1657-1658; 1797-1798; y / o
- Grupo SD1-SA3 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 381-382; 541-542; 599-600; 903­ 904; 941-942; 1047-1048; 1135-1136; 1287-1288; 1459-1460; 1473-1474; 1621-1622; 1717-1718; 1745-1746;y / o
- Grupo SD1-SA4 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 413-414; 551-552; 637-638; 713­ 714; 793-794; 857-858; 981-982; 1093-1094; 1179-1180; 1227-1228; 1319-1320; 1413-1414; 1509-1510; 1563-1564; 1709-1710; 1791-1792; y / o
- Grupo SD1-SA5 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 453-454; 549-550; 613-614; 747­ 748; 761-762; 949-950; 1163-1164; 1249-1250; 1329-1330; 1453-1454; 1501-1502; y / o
- Grupo SD1-SA6 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 431-432; 595-596; 719-720; 827­ 828; 1089-1090; 1137-1138; 1285-1286; 1353-1354; 1561-1562; 1719-1720; 1763-1764; y / o
- Grupo SD1-SA7 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 919-920; 1449-1450; y / o
- Grupo SD1-SA8 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 489-490; 963-964; 1519-1520; y / o
- Grupo SD2-SA4 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 387-388; 473-474; 615-616; 745­ 746; 815-816; 849-850; 933-934; 1091-1092; 1177-1178; 1209-1210; 1367-1368; 1437-1438; 1521-1522; 1603-1604; 1651-1652; 1779-1780; y / o
- Grupo SD2-SA5 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 455-456; 529-530; 629-630; 717­ 718; 777-778; 975-976; 1153-1154; 1273-1274; 1347-1348; 1451-1452; 1531-1532; y / o
- Grupo SD2-SA6 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 399-400; 645-646; 727-728; 811­ 812; 1079-1080; 1127-1128; 1253-1254; 1369-1370; 1615-1616; 1659-1660; 1781-1782; y / o
- Grupo SD2-SA7 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 531-532; 899-900; 943-944; 1411­ 1412; 1495-1496; y / o
- Grupo SD2-SA9 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 437-438; 505-506; 607-608; 739­ 740; 785-786; 887-888; 979-980; 1063-1064; 1185-1186; 1233-1234; 1297-1298; 1423-1424; 1491-1492; 1607-1608; 1693-1694; 1775-1776; y / o
- Grupo SD2-SA10 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 545-546; 831-832; 1149-1150;
1269-1270; 1427-1428; 1671-1672; y / o
- Grupo SD3-SA4 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 379-380; 483-484; 611-612; 721 -722; 833-834; 911-912; 937-938; 1053-1054; 1139-1140; 1251-1252; 1335-1336; 1435-1436; 1487-1488; 1591-1592; 1715-1716; 1785-1786; y / o
- Grupo SD3-SA5 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 415-416; 493-494; 593-594; 733­ 734; 817-818; 993-994; 1145-1146; 1243-1244; 1337-1338; 1401-1402; 1483-1484; y / o
- Grupo SD3-SA6 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 435-436; 655-656; 673-674; 813­ 814; 1045-1046; 1173-1174; 1241-1242; 1303-1304; 1557-1558; 1627-1628; 1647-1648; 1773-1774; y / o
- Grupo SD3-SA7 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 855-856; 1387-1388; y / o
- Grupo SD3-SA8 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 511-512; 957-958; 1529-1530; y / o
- Grupo SD5-SA9 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 419-420; 527-528; 567-568; 587­ 588; 683-684; 775-776; 891-892; 999-1000; 1041-1042; 1113-1114; 1247-1248; 1371-1372; 1403-1404; 1511-1512; 1617-1618; 1677-1678; 1733-1734; y / o
- Grupo SD5-SA10 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 495-496; 837-838; 1183-1184;
1279-1280; 1433-1434; 1723-1724.
En otras realizaciones, los cebadores específicos de VPH comprenden uno de los siguientes grupos de pares de cebadores:
- el grupo de pares de cebadores de SEQ ID NO: 397-398; 521-522; 609-610; 695-696; 819-820; 865-866;
947-948; 1067-1068; 1119-1120; 1267-1268; 1325-1326; 1507-1508; 1597-1598; 1655-1656; 1755-1756; 459-460; 633-634; 687-688; 1111-1112; 1235-1236; 1341-1342; 1503-1504; 1657-1658; 1797-1798; 381 -382; 541-542; 599-600; 903-904; 941-942; 1047-1048; 1135-1136; 1287-1288; 1459-1460; 1473-1474; 1621-1622; 1717-1718; 1745-1746; 413-414; 551-552; 637-638; 713-714; 793-794; 857-858; 981-982; 1093-1094; 1179-1180; 1227-1228; 1319-1320; 1413-1414; 1509-1510; 1563-1564; 1709-1710; 1791-1792; 453-454; 549-550; 613-614; 747-748; 761-762; 949-950; 1163-1164; 1249-1250; 1329-1330; 1453-1454; 1501-1502; 431-432; 595-596; 719-720; 827-828; 1089-1090; 1137-1138; 1285-1286; 1353-1354; 1561 -1562; 1719-1720; 1763-1764; 919-920; 1449-1450; 489-490; 963-964; 1519-1520; 387-388; 473-474; 615­ 616; 745-746; 815-816; 849-850; 933-934; 1091-1092; 1177-1178; 1209-1210; 1367-1368; 1437-1438; 1521-1522; 1603-1604; 1651-1652; 1779-1780; 455-456; 529-530; 629-630; 717-718; 777-778; 975-976; 1153-1154; 1273-1274; 1347-1348; 1451-1452; 1531-1532; 399-400; 645-646; 727-728; 811-812; 1079­ 1080; 1127-1128; 1253-1254; 1369-1370; 1615-1616; 1659-1660; 1781-1782; 531-532; 899-900; 943-944; 1411-1412; 1495-1496; 437-438; 505-506; 607-608; 739-740; 785-786; 887-888; 979-980; 1063-1064; 1185-1186; 1233-1234; 1297-1298; 1423-1424; 1491-1492; 1607-1608; 1693-1694; 1775-1776; 545-546; 831-832; 1149-1150; 1269-1270; 1427-1428; 1671-1672; 379-380; 483-484; 611-612; 721-722; 833-834; 911-912; 937-938; 1053-1054; 1139-1140; 1251-1252; 1335-1336; 1435-1436; 1487-1488; 1591-1592; 1715-1716; 1785-1786; 415-416; 493-494; 593-594; 733-734; 817-818; 993-994; 1145-1146; 1243-1244; 1337-1338; 1401-1402; 1483-1484; 435-436; 655-656; 673-674; 813-814; 1045-1046; 1173-1174; 1241 -1242; 1303-1304; 1557-1558; 1627-1628; 1647-1648; 1773-1774; 855-856; 1387-1388; 511-512; 957-958; 1529-1530; 477-478; 419-420; 527-528; 567-568; 587-588; 683-684; 775-776; 891-892; 999-1000; 1041 -1042; 1113-1114; 1247-1248; 1371-1372; 1403-1404; 1511-1512; 1617-1618; 1677-1678; 1733-1734; 495­ 496; 837-838; 1183-1184; 1279-1280; 1433-1434; 1723-1724; 1011-1012; 557-558; o,
- el grupo de pares de cebadores de SEQ ID NO: 229-230; 233-234; 235-236; 245-246; 247-248; 249-250;
251-252; 255-256; 257-258; 265-266; 273-274; 275-276; 277-278; 279-280; 281-282; 289-290; 291-292; 295-296; 297-298; 299-300; 301-302; 303-304; 305-306; 307-308; 309-310; 311-312; 319-320; 321-322; 323-324 325-326 327-328; 329-330 331-332 333-334 335-336 337-338 341-342 343-344 345-346 347-348 349-350 351-352 377-378 379-380 381-382 383-384 385-386 387-388; 389-390 391-392 393-394 395-396 397-398; 399-400 401-402 403-404 405-406 407-408 409-410 411-412 413-414; 415-416 417-418 419-420 421-422 423-424 425-426 427-428 429-430 431-432 433-434 435-436 437-438 439-440 441-442 443-444 445-446 447-448 449-450 451-452 453-454; 455-456 457-458 459-460 461-462 463-464; 465-466 467-468 469-470 471-472 473-474 475-476; 477-478 479-480 481-482 483-484 485-486; 487-488 489-490 491-492 493-494 495-496 497-498; 499-500 501-502 503-504 505-506 507-508; 509-510 511-512 513-514 515-516 517-518 519-520 521-522 523-524 525-526 527-528 529-530; 531-532 533-534 535-536 537-538 539-540 541-542 543-544 545-546 547-548 549-550 551-552 553-554 555-556 557-558 559-560 561-562 563-564; 565-566 567-568 569-570 571-572 573-574; 575-576 577-578 579-580 581-582 583-584 585-586; 587-588 589-590 591-592 593-594 595-596; 597-598 599-600 601-602 603-604 605-606 607-608; 609-610 611-612 613-614 615-616 617-618 619-620 621-622 623-624 625-626 627-628 629-630; 631-632 633-634 635-636 637-638 639-640; 641-642 643-644 645-646 647-648 649-650 651-652 653-654 655-656 657-658 659-660 661-662 663-664 665-666 667-668 669-670 671-672 673-674; 675-676 677-678 679-680 681-682 683-684; 685-686 687-688 689-690 691-692 693-694 695-696; 697-698 699-700 701-702 703-704 705-706; 707-708 709-710 711-712 713-714; 715-716 717-718 719-720 721-722 723-724 725-726 727-728; 729-730 731-732 733-734 735-736 737-738 739-740; 741-742 743-744 745-746 747-748 749-750; 751-752 753-754 755-756 757-758 759-760 761-762 763-764 765-766 767-768 769-770 771-772 773-774 775-776 777-778 779-780 781-782 783-784; 785-786 787-788 789-790 791-792 793-794; 795-796 797-798 799-800 801-802 803-804 805-806; 807-808 809-810 811-812 813-814; 815-816 817-818 819-820 821-822 823-824 825-826 827-828; 829-830 831-832 833-834 835-836 837-838; 839-840 841-842 843-844 845-846 847-848 849-850; 851-852 853-854 855-856 857-858 859-860; 861-862 863-864 865-866 867-868 869-870 871-872 873-874 875-876 877-878 879-880 881-882 883-884 885-886 887-888 889-890 891-892 893-894; 895-896 897-898 899-900 901-902 903-904; 905-906 907-908 909-910 911-912 913-914; 915-916 917-918 919-920 921-922 923-924 925-926; 927-928 929-930 931-932 933-934 935-936 937-938; 939-940 941-942 943-944 945-946 947-948; 949-950 951-952 953-954 955-956 957-958 959-960; 961-962 963-964 965-966 967-968 969-970; 971-972 973-974 975-976 977-978 979-980 981-982 983-984 985-986 987-988 989-990; 991 -992; 993-994; 995-996 997-998; 999-1000; 1001-1002; 1003-1004; 1005-1006 1007-1008 1009-1010 1011­ 1012 1013-1014 1015-1016 1017-1018 1019-1020 1021-1022 1023-1024 1025-1026 1027-1028 1029­ 1030 1031-1032 1033-1034 1035-1036 1037-1038 1039-1040 1041-1042 1043-1044 1045-1046 1047­ 1048 1049-1050 1051-1052 1053-1054 1055-1056 1057-1058 1059-1060 1061-1062 1063-1064 1065­ 1066 1067-1068 1069-1070 1071-1072 1073-1074 1075-1076 1077-1078 1079-1080 1081-1082 1083­ 1084 1085-1086 1087-1088 1089-1090 1091-1092 1093-1094 1095-1096 1097-1098 1099-1100 1101­ 1102 1103-1104 1105-1106 1107-1108 1109-1110 1111-1112 1113-1114 1115-1116 1117-1118 1119­ 1120 1121-1122 1123-1124 1125-1126 1127-1128 1129-1130 1131-1132 1133-1134 1135-1136 1137­ 1138 1139-1140 1141-1142 1143-1144 1145-1146 1147-1148 1149-1150 1151-1152 1153-1154 1155­ 1156 1157-1158 1159-1160 1161-1162 1163-1164 1165-1166 1167-1168 1169-1170 1171-1172 1173­ 1174 1175-1176 1177-1178 1179-1180 1181-1182 1183-1184 1185-1186 1187-1188 1189-1190 1191­ 1192 1193-1194 1195-1196 1197-1198 1199-1200 1201-1202 1203-1204 1205-1206 1207-1208 1209­ 1210 1211-1212 1213-1214 1215-1216 1217-1218 1219-1220 1221-1222 1223-1224 1225-1226 1227­ 1228 1229-1230 1231-1232 1233-1234 1235-1236 1237-1238 1239-1240 1241-1242 1243-1244 1245­ 1246 1247-1248 1249-1250 1251-1252 1253-1254 1255-1256 1257-1258 1259-1260 1261-1262 1263­ 1264 1265-1266 1267-1268 1269-1270 1271-1272 1273-1274 1275-1276 1277-1278 1279-1280 1281­ 1282 1283-1284 1285-1286 1287-1288 1289-1290 1291-1292 1293-1294 1295-1296 1297-1298 1299­ 1300 1301-1302 1303-1304 1305-1306 1307-1308 1309-1310 1311-1312 1313-1314 1315-1316 1317­ 1318 1319-1320 1321-1322 1323-1324 1325-1326 1327-1328 1329-1330 1331-1332 1333-1334 1335­ 1336 1337-1338 1339-1340 1341-1342 1343-1344 1345-1346 1347-1348 1349-1350 1351-1352 1353­ 1354 1355-1356 1357-1358 1359-1360 1361-1362 1363-1364 1365-1366 1367-1368 1369-1370 1371­ 1372 1373-1374 1375-1376 1377-1378 1379-1380 1381-1382 1383-1384 1385-1386 1387-1388 1389­ 1390 1391-1392 1393-1394 1395-1396 1397-1398 1399-1400 1401-1402 1403-1404 1405-1406 1407­ 1408 1409-1410 1411-1412 1413-1414 1415-1416 1417-1418 1419-1420 1421-1422 1423-1424 1425­ 1426 1427-1428 1429-1430 1431-1432 1433-1434 1435-1436 1437-1438 1439-1440 1441-1442 1443­ 1444 1445-1446 1447-1448 1449-1450 1451-1452 1453-1454 1455-1456 1457-1458 1459-1460 1461 - 1462 1463-1464 1465-1466 1467-1468 1469-1470 1471-1472 1473-1474 1475-1476 1477-1478 1479­ 1480 1481-1482 1483-1484 1485-1486 1487-1488 1489-1490 1491-1492 1493-1494 1495-1496 1497­ 1498 1499-1500 1501-1502 1503-1504 1505-1506 1507-1508 1509-1510 1511-1512 1513-1514 1515­ 1516 1517-1518 1519-1520 1521-1522 1523-1524 1525-1526 1527-1528 1529-1530 1531-1532 1533­ 1534 1535-1536 1537-1538 1539-1540 1541-1542 1543-1544 1545-1546 1547-1548 1549-1550 1551­ 1552 1553-1554 1555-1556 1557-1558 1559-1560 1561-1562 1563-1564 1565-1566 1567-1568 1569­ 1570 1571-1572 1573-1574 1575-1576 1577-1578 1579-1580 1581-1582 1583-1584 1585-1586 1587­ 1588 1589-1590 1591-1592 1593-1594 1595-1596 1597-1598 1599-1600 1601-1602 1603-1604 1605­ 1606 1607-1608 1609-1610 1611-1612 1613-1614 1615-1616 1617-1618 1619-1620 1621-1622 1623­ 1624 1625-1626 1627-1628 1629-1630 1631-1632 1633-1634 1635-1636 1637-1638 1639-1640 1641- 1642 1643-1644 1645-1646 1647-1648 1649-1650 1651-1652 1653-1654 1655-1656 1657-1658; 1659­ 1660; 1661 - 1662; 1663 -1664; 1665 1666 1667 ■1668 1669 ■1670 1671 ■1672 1673-1674 1675-1676; 1677­ 1678; 1679­ 1680; 1681 -1682; 1683 1684 1685 ■1686 1687 ■1688 1689 -1690 1691-1692 1693-1694; 1695­ 1696; 1697­ 1698; 1699 -1700; 1701 1702 1703 ■1704 1705­ ■1706 1707 -1708 1709-1710 1711-1712; 1713­ 1714; 1715­ 1716; 1717 -1718; 1719­ 1720 1721 ■1722 1723­ ■1724 1725 ■1726 1727-1728 1729-1730; 1731­ 1732; 1733­ 1734; 1735 -1736; 1737­ 1738 1739 ■1740 1741 ■ 1742 1743 ■1744 1745-1746 1747-1748; 1749­ 1750; 1751 - 1752; 1753 -1754; 1755­ 1756 1757 ■1758 1759­ ■1760 1761 -1762 1763-1764 1765-1766; 1767­ 1768; 1769­ 1770; 1771 -1772; 1773­ 1774 1775 ■1776 1777 ■1778 1779 -1780 1781-1782 1783-1784; 1785­ 1786; 1787­ 1788; 1789 -1790; 1791 1792 1793 ■1794 1795­ ■1796 1797 ■1798 1799-1800 1801-1802; 1803- 1804; 1805- 1806; 1807- 1808; 1809- 1810; 1811- 1812; 1813- 1814; 1815- 1816.
En diversas realizaciones, se puede determinar el número de lecturas de secuencia de VPH según la especie de VPH y / o la transcripción del gen de VPH.
En una realización, el método comprende determinar el número de lecturas de secuencias de VPH de al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 especies de VPH. En una realización, el método comprende determinar el número de lecturas de la secuencia de VPH de al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 especies de VPH del grupo Alfa.
En otra realización, el método comprende calcular una relación (R) del número de lecturas de al menos una transcripción temprana de VPH respecto al número de lecturas de al menos una transcripción tardía de VPH. Preferiblemente, las transcripciones de VPH son transcripciones de VPH de especies de VPH del grupo Alfa, lo más preferiblemente transcripciones de VPH16 o VPH18.
Los valores de R se pueden determinar utilizando cualquiera de las diversas fórmulas presentadas en la Tabla 9. En una realización, la proporción se calcula calculando una relación (R) del número de lecturas de transcripciones de VPH E6 y / o E7 con relación al número de lecturas de transcripciones de VPH L1 y / o L2. En una realización, la proporción se calcula calculando una proporción (R) del número de lecturas de las transcripciones de VPH E6 y E7 con relación al número de lecturas de las transcripciones de VPH L1 y L2.
En algunas realizaciones, una relación (R) más alta se correlaciona con un mayor riesgo de desarrollar cáncer inducido por VPH maligno de alto grado. En varias realizaciones, un valor de R que tiende hacia valores altos por encima de 0,5, 1, 25, 50, 100 y que tiende al infinito, indica que el ciclo vírico está integrado, los virus no replicantes expresan un alto nivel de oncogenes E6 y E7; mientras que un valor de R por debajo de 0,25, 0,2, 0,1, 0,05 y que tiende a 0 indica que el ciclo de vida vírico es replicativo y expresa niveles bajos de E6 y E7.
En algunas realizaciones, un mayor número de lecturas de transcripciones de VPH16, VPH18 u otro VPH de alto riesgo en relación con las lecturas de transcripciones de una especie de VPH de menor riesgo se correlaciona con un mayor riesgo de desarrollar cáncer inducido por VPH maligno de alto grado.
En algunas realizaciones, el método comprende determinar el número de lecturas que coinciden con los virus basándose en la discriminación de especies y determinar las especies de alto riesgo más prevalentes presentes en la muestra en relación con otras especies y / o determinar dentro de dichas especies de alto riesgo más prevalentes el número relativo de lecturas de genes oncogénicos coincidentes en comparación con genes no oncogénicos.
En una realización, la invención abarca métodos para evaluar a un paciente infectado con el virus del papiloma humano (VPH) que comprenden generar ADNc a partir de una muestra de paciente que comprende ARN; secuenciar el ADNc; generar lecturas de secuencia del ADNc; discriminar las lecturas de la secuencia de VPH sobre la base de la transcripción del gen de VPH; cuantificar el nivel de lecturas de secuencia de VPH de acuerdo con la transcripción del gen de VPH; determinar el número de lecturas de la secuencia de VPH de al menos una transcripción del gen temprano de VPH; determinar el número de lecturas de la secuencia de VPH de al menos una transcripción tardía del gen de VPH; y determinar la relación entre el número de lecturas de la secuencia de VPH de al menos una transcripción del gen temprano de VPH y el número de lecturas de la secuencia de VPH de al menos una transcripción tardía del gen de VPH.
La invención también contempla una composición de cebadores específicos del VPH del grupo alfa que comprenden al menos uno de, preferiblemente todos, los siguientes grupos de pares de cebadores:
- los cebadores específicos de VPH16 que comprenden o consisten en los cebadores de SEQ ID NO: 219­ 258 para transcripciones genómicas y no empalmadas de VPH16, SEQ ID NO: 259-352 para transcripciones empalmadas de VPH16 y SEQ ID NO: 353-376 para transcripciones de fusión VPH16-humano (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO: 219-220; 221-222; 223-224; 225-226; 227-228; 229-230; 231-232; 233-234; 235-236; 237-238; 239-240; 241-242; 243-244; 245-246; 247-248; 249-250; 251-252; 253-254; 255-256; 257-258; 259-260; 261-262; 263-264; 265-266; 267-268; 269-270; 271-272; 273-274; 275-276; 277-278; 279-280; 281-282; 283-284; 285-286; 287-288; 289-290; 291-292; 293-294; 295-296; 297-298; 299-300; 301-302; 303-304; 305-306; 307-308; 309-310; 311-312; 313-314; 315-316; 317-318; 319-320; 321-322; 323-324; 325-326; 327-328; 329-330; 331-332; 333-334; 335-336; 337-338; 339-340; 341-342; 343-344; 345-346; 347-348; 349-350; 351-352; 353-354; 355-356; 357-358; 359-360; 361-362; 363-364; 365-366; 367-368; 369-370; 371-372; 373-374; 375-376) o 377-470 (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO. 377-378; 379-380; 381-382; 383-384; 385-386; 387-388; 389-390; 391-392; 393-394; 395-396; 397-398; 399-400; 401-402; 403-404; 405-406; 407-408; 409-410; 411-412; 413-414; 415-416; 417-418; 419-420; 421-422; 423-424; 425-426; 427-428; 429-430; 431-432; 433-434; 435-436; 437-438; 439-440; 441-442; 443-444; 445-446; 447-448; 449-450; 451-452; 453-454; 455-456; 457-458; 459-460; 461 -462; 463-464; 465-466; 467-468 y; 469-470); y / o
- los cebadores específicos de VPH18 que comprenden o consisten en los cebadores de SEQ ID NO. 471 -574 (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO.: 471-472; 473-474; 475-476; 477-478; 479-480; 481 -482; 483-484; 485-486; 487-488; 489-490; 491-492; 493-494; 495-496; 497-498; 499-500; 501-502; 503­ 504; 505-506; 507-508; 509-510; 511-512; 513-514; 515-516; 517-518; 519-520; 521-522; 523-524; 525­ 526; 527-528; 529-530; 531-532; 533-534; 535-536; 537-538; 539-540; 541-542; 543-544; 545-546; 547­ 548; 549-550; 551-552; 553-554; 555-556; 557-558; 559-560; 561-562; 563-564; 565-566; 567-568; 569­ 570; 571-572; 573-574); y / o
- los cebadores específicos de VPH31 que comprenden o consisten en los cebadores de SEQ ID NO. 575­ 668 (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO.: 575-576; 577-578; 579-580; 581-582; 583-584; 585-586; 587-588 589-590 591-592 593-594 ; 595-596; 597-598; 599-600; 601-602; 603-604; 605-606; 607-608; 609-610 611-612 613-614 615-616 617-618; 619-620; 621-622; 623-624; 625-626; 627-628; 629-630; 631-632 633-634 635-636 637-638 ; 639-640; 641-642; 643-644; 645-646; 647-648; 649-650; 651-652; 653-654; 655-656; 657-658; 659-660; 661-662; 663-664; 665-666; 667-668); y / o
- los cebadores específicos de VPH33 que comprenden o consisten en SEQ ID NO. 669-756 (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO.: 669-670; 671-672; 673-674; 675-676; 677-678; 679-680; 681-682; 683-684; 685-686; 687-688; 689-690; 691-692; 693-694; 695-696; 697-698; 699-700; 701-702; 703-704; 705-706; 707-708; 709-710; 711-712; 713-714; 715-716; 717-718; 719-720; 721-722; 723-724; 725-726; 727-728; 729-730; 731-732; 733-734; 735-736; 737-738; 739-740; 741-742; 743-744; 745-746; 747-748; 749-750; 751 -752; 753-754; 755-756); y / o
- los cebadores específicos de VPH35 que comprenden o consisten en los cebadores de SEQ ID NO. 757­ 848 (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO.: 757-758; 759-760; 761-762; 763-764; 765-766; 767-768; 769-770 771-772 773-774 775-776 ; 777-778; 779-780; 781-782; 783-784; 785-786; 787-788; 789-790; 791-792 793-794 795-796 797-798 ; 799-800; 801-802; 803-804; 805-806; 807-808; 809-810; 811-812; 813-814; 815-816 817-818 819-820 821-822; 823-824; 825-826; 827-828; 829-830; 831-832; 833-834; 835-836; 837-838; 839-840; 841-842; 843-844; 845-846; 847-848); y / o
- los cebadores específicos de VPH39 que comprenden o consisten en los cebadores de SEQ ID NO. 849­ 928 (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO.: 849-850; 851-852; 853-854; 855-856; 857-858; 859-860; 861-862; 863-864; 865-866; 867-868; 869-870; 871-872; 873-874; 875-876; 877-878; 879-880; 881-882; 883-884; 885-886; 887-888; 889-890; 891-892; 893-894; 895-896; 897-898; 899-900; 901-902; 903-904; 905-906; 907-908; 909-910; 911-912; 913-914; 915-916; 917-918; 919-920; 921-922; 923-924; 925-926; 927-928) y / o
- los cebadores específicos de VPH45 que comprenden o consisten en los cebadores de SEQ ID NO. 929­ 1020 (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO.: 929-930; 931-932; 933-934; 935-936; 937-938; 939-940; 941-942; 943-944; 945-946; 947-948; 949-950; 951-952; 953-954; 955-956; 957-958; 959-960; 961-962; 963-964; 965-966; 967-968; 969-970; 971-972; 973-974; 975-976; 977-978; 979-980; 981-982; 983-984; 985-986; 987-988; 989-990; 991-992; 993-994; 995-996; 997-998; 999-1000; 1001-1002; 1003­ 1004; 1005-1006; 1007-1008; 1009-1010; 1011-1012; 1013-1014; 1015-1016; 1017-1018; 1019-1020); y / o
los cebadores específicos de VPH51 que comprenden o consisten en los cebadores de SEQ ID NO. 1021­ 1102 (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO.: 1021-1022; 1023-1024; 1025-1026; 1027-1028 1029-1030 1031-1032 1033-1034 1035-1036 1037-1038 1039-1040 1041-1042 1043-1044 1045-1046 1047-1048 1049-1050 1051-1052 1053-1054 1055-1056 1057-1058 1059-1060 1061-1062 1063-1064 1065-1066 1067-1068 1069-1070 1071-1072 1073-1074 1075-1076 1077-1078 1079-1080 1081-1082 1083-1084 1085-1086 1087-1088 1089-1090 1091-1092 1093-1094 1095-1096 1097-1098 1099-1100 1101-1102); y / o
los cebadores específicos de VPH52 que comprenden o consisten en los cebadores de SEQ ID NO. 1103­ 1200 (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO.: 1103-1104; 1105-1106; 1107-1108; 1109-1110 1111-1112 1113-1114 1115-1116 1117-1118 1119-1120 1121-1122 1123-1124 1125-1126 1127-1128 1129-1130 1131-1132 1133-1134 1135-1136 1137-1138 1139-1140 1141-1142 1143-1144 1145-1146 1147-1148 1149-1150 1151-1152 1153-1154 1155-1156 1157-1158 1159-1160 1161-1162 1163-1164 1165-1166 1167-1168 1169-1170 1171-1172 1173-1174 1175-1176 1177-1178 1179-1180 1181-1182 1183-1184 1185-1186 1187-1188; 1189-1190; 1191-1192; 1193-1194; 1195-1196; 1197-1198; 1199-1200); y / o
- los cebadores específicos de VPH56 que comprenden o consisten en los cebadores de SEQ ID NO. 1201­ 1296 (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO.: 1201-1202; 1203-1204; 1205-1206; 1207-1208; 1209-1210; 1211-1212; 1213-1214; 1215-1216; 1217-1218; 1219-1220; 1221-1222; 1223-1224; 1225-1226; 1227-1228; 1229-1230; 1231-1232; 1233-1234; 1235-1236; 1237-1238; 1239-1240; 1241-1242; 1243-1244; 1245-1246; 1247-1248; 1249-1250; 1251-1252; 1253-1254; 1255-1256; 1257-1258; 1259-1260; 1261-1262; 1263-1264; 1265-1266; 1267-1268; 1269-1270; 1271-1272; 1273-1274; 1275-1276; 1277-1278; 1279-1280; 1281-1282; 1283-1284; 1285-1286; 1287-1288; 1289-1290; 1291-1292; 1293-1294; 1295-1296); y / o
- los cebadores específicos de VPH58 que comprenden o consisten en los cebadores de SEQ ID NO. 1297­ 1382 (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO.: 1297-1298; 1299-1300; 1301-1302; 1303-1304; 1305-1306; 1307-1308; 1309-1310; 1311-1312; 1313-1314; 1315-1316; 1317-1318; 1319-1320; 1321-1322; 1323-1324; 1325-1326; 1327-1328; 1329-1330; 1331-1332; 1333-1334; 1335-1336; 1337-1338; 1339-1340; 1341-1342; 1343-1344; 1345-1346; 1347-1348; 1349-1350; 1351-1352; 1353-1354; 1355-1356; 1357-1358; 1359-1360; 1361-1362; 1363-1364; 1365-1366; 1367-1368; 1369-1370; 1371-1372; 1373-1374; 1375-1376; 1377-1378; 1379-1380; 1381-1382); y / o
- los cebadores específicos de VPH59 que comprenden o consisten en los cebadores de SEQ ID NO. 1383­ 1470 (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO.: 1383-1384; 1385-1386; 1387-1388; 1389-1390; 1391-1392; 1393-1394; 1395-1396; 1397-1398; 1399-1400; 1401-1402; 1403-1404; 1405-1406; 1407-1408; 1409-1410; 1411-1412; 1413-1414; 1415-1416; 1417-1418; 1419-1420; 1421-1422; 1423-1424; 1425-1426; 1427-1428; 1429-1430; 1431-1432; 1433-1434; 1435-1436; 1437-1438; 1439-1440; 1441-1442; 1443-1444; 1445-1446; 1447-1448; 1449-1450; 1451-1452; 1453-1454; 1455-1456; 1457-1458; 1459-1460; 1461-1462; 1463-1464; 1465-1466; 1467-1468; 1469-1470); y / o
- los cebadores específicos de VPH66 que comprenden o consisten en los cebadores de SEQ ID NO. 1471­ 1560 (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO.: 1471-1472; 1473-1474; 1475-1476; 1477-1478; 1479-1480; 1481-1482; 1483-1484; 1485-1486; 1487-1488; 1489-1490; 1491-1492; 1493-1494; 1495-1496; 1497-1498; 1499-1500; 1501-1502; 1503-1504; 1505-1506; 1507-1508; 1509-1510; 1511-1512; 1513-1514; 1515-1516; 1517-1518; 1519-1520; 1521-1522; 1523-1524; 1525-1526; 1527-1528; 1529-1530; 1531-1532; 1533-1534; 1535-1536; 1537-1538; 1539-1540; 1541-1542; 1543-1544; 1545-1546; 1547-1548; 1549-1550; 1551 -1552; 1553-1554; 1555-1556; 1557-1558; 1559-1560; y / o
los cebadores específicos de VPH68 que comprenden o consisten en los cebadores de SEQ ID NO. 1561­ 1642 (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO.: 1561-1562; 1563-1564; 1565-1566; 1567-1568 1569-1570 1571-1572 1573-1574 1575-1576 1577-1578 1579-1580 1581-1582 1583-1584 1585-1586 1587-1588 1589-1590 1591-1592 1593-1594 1595-1596 1597-1598 1599-1600 1601-1602 1603-1604 1605-1606 1607-1608 1609-1610 1611-1612 1613-1614 1615-1616 1617-1618 1619-1620 1621-1622 1623-1624 1625-1626 1627-1628 1629-1630 1631-1632 1633-1634 1635-1636 1637-1638 1639-1640 1641-1642); y / o
- los cebadores específicos de VPH73 que comprenden o consisten en los cebadores de SEQ ID NO. 1643­ 1732 (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO.: 1643-1644; 1645-1646; 1647-1648; 1649-1650; 1651-1652; 1653-1654; 1655-1656; 1657-1658; 1659-1660; 1661-1662; 1663-1664; 1665-1666; 1667-1668; 1669-1670; 1671-1672; 1673-1674; 1675-1676; 1677-1678; 1679-1680; 1681-1682; 1683-1684; 1685-1686; 1687-1688; 1689-1690; 1691-1692; 1693-1694; 1695-1696; 1697-1698; 1699-1700; 1701-1702; 1703-1704; 1705-1706; 1707-1708; 1709-1710; 1711-1712; 1713-1714; 1715-1716; 1717-1718; 1719-1720; 1721-1722; 1723-1724; 1725-1726; 1727-1728; 1729-1730; 1731 -1732); y / o
los cebadores específicos de VPH82 que comprenden o consisten en los cebadores de SEQ ID NO. 1733­ 1816 (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO.: 1733-1734; 1735-1736; 1737-1738; 1739-1740 1741-1742 1743-1744 1745-1746 1747-1748 1749-1750 1751-1752 1753-1754 1755-1756 1757-1758 1759-1760 1761-1762 1763-1764 1765-1766 1767-1768 1769-1770 1771-1772 1773-1774 1775-1776 1777-1778 1779-1780 1781-1782 1783-1784 1785-1786 1787-1788 1789-1790 1791-1792 1793-1794 1795-1796 1797-1798 1799-1800 1801-1802 1803-1804 1805-1806 1807-1808 1809-1810 1811-1812 1813-1814 1815-1816).
La invención también contempla una composición de pares de cebadores específicos de VPH del grupo alfa que comprenden al menos uno de, preferiblemente todos, los siguientes grupos de pares de cebadores:
- Grupo SD1-SA1 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 397-398; 521-522; 609-610; 695­ 696; 819-820; 865-866; 947-948; 1067-1068; 1119-1120; 1267-1268; 1325-1326; 1507-1508; 1597-1598; 1655-1656; 1755-1756; y / o
- Grupo SD1-SA2 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 459-460; 633-634; 687-688; 1111­ 1112; 1235-1236; 1341-1342; 1503-1504; 1657-1658; 1797-1798; y / o
- Grupo SD1-SA3 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 381-382; 541-542; 599-600; 903­ 904; 941-942; 1047-1048; 1135-1136; 1287-1288; 1459-1460; 1473-1474; 1621-1622; 1717-1718; 1745-1746;y / o
- Grupo SD1-SA4 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 413-414; 551-552; 637-638; 713­ 714; 793-794; 857-858; 981-982; 1093-1094; 1179-1180; 1227-1228; 1319-1320; 1413-1414; 1509-1510; 1563-1564; 1709-1710; 1791-1792; y / o
- Grupo SD1-SA5 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 453-454; 549-550; 613-614; 747­ 748; 761-762; 949-950; 1163-1164; 1249-1250; 1329-1330; 1453-1454; 1501-1502; y / o
- Grupo SD1-SA6 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 431-432; 595-596; 719-720; 827­ 828; 1089-1090; 1137-1138; 1285-1286; 1353-1354; 1561-1562; 1719-1720; 1763-1764; y / o
- Grupo SD1-SA7 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 919-920; 1449-1450; y / o - Grupo SD1-SA8 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 489-490; 963-964; 1519-1520; y / o
- Grupo SD2-SA4 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 387-388; 473-474; 615-616; 745­ 746; 815-816; 849-850; 933-934; 1091-1092; 1177-1178; 1209-1210; 1367-1368; 1437-1438; 1521-1522; 1603-1604; 1651-1652; 1779-1780; y / o
- Grupo SD2-SA5 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 455-456; 529-530; 629-630; 717­ 718; 777-778; 975-976; 1153-1154; 1273-1274; 1347-1348; 1451-1452; 1531-1532; y / o
- Grupo SD2-SA6 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 399-400; 645-646; 727-728; 811­ 812; 1079-1080; 1127-1128; 1253-1254; 1369-1370; 1615-1616; 1659-1660; 1781-1782; y / o
- Grupo SD2-SA7 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 531-532; 899-900; 943-944; 1411­ 1412; 1495-1496; y / o
- Grupo SD2-SA9 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 437-438; 505-506; 607-608; 739­ 740; 785-786; 887-888; 979-980; 1063-1064; 1185-1186; 1233-1234; 1297-1298; 1423-1424; 1491-1492; 1607-1608; 1693-1694; 1775-1776; y / o
- Grupo SD2-SA10 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 545-546; 831-832; 1149-1150;
1269-1270; 1427-1428; 1671-1672; y / o
- Grupo SD3-SA4 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 379-380; 483-484; 611-612; 721 -722; 833-834; 911-912; 937-938; 1053-1054; 1139-1140; 1251-1252; 1335-1336; 1435-1436; 1487-1488; 1591-1592; 1715-1716; 1785-1786; y / o
- Grupo SD3-SA5 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 415-416; 493-494; 593-594; 733­ 734; 817-818; 993-994; 1145-1146; 1243-1244; 1337-1338; 1401-1402; 1483-1484; y / o
- Grupo SD3-SA6 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 435-436; 655-656; 673-674; 813­ 814; 1045-1046; 1173-1174; 1241-1242; 1303-1304; 1557-1558; 1627-1628; 1647-1648; 1773-1774; y / o - Grupo SD3-SA7 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 855-856; 1387-1388; y / o - Grupo SD3-SA8 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 511-512; 957-958; 1529-1530; y / o
- Grupo SD5-SA9 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 419-420; 527-528; 567-568; 587­ 588; 683-684; 775-776; 891-892; 999-1000; 1041-1042; 1113-1114; 1247-1248; 1371-1372; 1403-1404; 1511-1512; 1617-1618; 1677-1678; 1733-1734; y / o
- Grupo SD5-SA10 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 495-496; 837-838; 1183-1184;
1279-1280; 1433-1434; 1723-1724.
La invención también contempla una composición de cebadores específicos del VPH del grupo alfa que comprende uno de los siguientes grupos de pares de cebadores:
- el grupo de pares de cebadores de SEQ ID NO: 397-398; 521-522; 609-610; 695-696; 819-820; 865-866;
947-948; 1067-1068; 1119-1120; 1267-1268; 1325-1326; 1507-1508; 1597-1598; 1655-1656; 1755-1756; 459-460; 633-634; 687-688; 1111-1112; 1235-1236; 1341-1342; 1503-1504; 1657-1658; 1797-1798; 381 -382; 541-542; 599-600; 903-904; 941-942; 1047-1048; 1135-1136; 1287-1288; 1459-1460; 1473-1474; 1621-1622; 1717-1718; 1745-1746; 413-414; 551-552; 637-638; 713-714; 793-794; 857-858; 981-982; 1093-1094; 1179-1180; 1227-1228; 1319-1320; 1413-1414; 1509-1510; 1563-1564; 1709-1710; 1791-1792; 453-454; 549-550; 613-614; 747-748; 761-762; 949-950; 1163-1164; 1249-1250; 1329-1330; 1453-1454; 1501-1502; 431-432; 595-596; 719-720; 827-828; 1089-1090; 1137-1138; 1285-1286; 1353-1354; 1561 -1562; 1719-1720; 1763-1764; 919-920; 1449-1450; 489-490; 963-964; 1519-1520; 387-388; 473-474; 615 616; 745-746; 815-816; 849-850; 933-934; 1091-1092; 1177-1178; 1209-1210; 1367-1368; 1437-1438; 1521-1522; 1603-1604; 1651-1652; 1779-1780; 455-456; 529-530; 629-630; 717-718; 777-778; 975-976; 1153-1154; 1273-1274; 1347-1348; 1451-1452; 1531-1532; 399-400; 645-646; 727-728; 811-812; 1079­ 1080; 1127-1128; 1253-1254; 1369-1370; 1615-1616; 1659-1660; 1781-1782; 531-532; 899-900; 943-944; 1411-1412; 1495-1496; 437-438; 505-506; 607-608; 739-740; 785-786; 887-888; 979-980; 1063-1064; 1185-1186; 1233-1234; 1297-1298; 1423-1424; 1491-1492; 1607-1608; 1693-1694; 1775-1776; 545-546; 831-832; 1149-1150; 1269-1270; 1427-1428; 1671-1672; 379-380; 483-484; 611-612; 721-722; 833-834; 911-912; 937-938; 1053-1054; 1139-1140; 1251-1252; 1335-1336; 1435-1436; 1487-1488; 1591-1592; 1715-1716; 1785-1786; 415-416; 493-494; 593-594; 733-734; 817-818; 993-994; 1145-1146; 1243-1244; 1337-1338; 1401-1402; 1483-1484; 435-436; 655-656; 673-674; 813-814; 1045-1046; 1173-1174; 1241 -1242; 1303-1304; 1557-1558; 1627-1628; 1647-1648; 1773-1774; 855-856; 1387-1388; 511-512; 957-958; 1529-1530; 477-478; 419-420; 527-528; 567-568; 587-588; 683-684; 775-776; 891-892; 999-1000; 1041 -1042; 1113-1114; 1247-1248; 1371-1372; 1403-1404; 1511-1512; 1617-1618; 1677-1678; 1733-1734; 495­ 496; 837-838; 1183-1184; 1279-1280; 1433-1434; 1723-1724; 1011-1012; 557-558; o,
251-252 255-256 257-258; 265-266 273-274 275-276 277-278 279-280 281-282 289-290 291-292 295-296 297-298 299-300; 301-302 303-304 305-306 307-308 309-310 311-312 319-320 321-322 323-324 325-326 327-328; 329-330 331-332 333-334 335-336 337-338 341-342 343-344 345-346 347-348 349-350 351-352 377-378 379-380 381-382 383-384 385-386 387-388; 389-390 391-392 393-394 395-396 397-398; 399-400 401-402 403-404 405-406 407-408 409-410 411-412 413-414; 415-416 417-418 419-420 421-422 423-424 425-426 427-428 429-430 431-432 433-434 435-436 437-438 439-440 441-442 443-444 445-446 447-448 449-450 451-452 453-454; 455-456 457-458 459-460 461-462 463-464; 465-466 467-468 469-470 471-472 473-474 475-476; 477-478 479-480 481-482 483-484 485-486; 487-488 489-490 491-492 493-494 495-496 497-498; 499-500 501-502 503-504 505-506 507-508; 509-510 511-512 513-514 515-516 517-518 519-520 521-522 523-524 525-526 527-528 529-530; 531-532 533-534 535-536 537-538 539-540 541-542 543-544 545-546 547-548 549-550 551-552 553-554 555-556 557-558 559-560 561-562 563-564; 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1537-1538; 1539-1540; 1541-1542 1543-1544 1545-1546 1547-1548 1549-1550 1551-1552 1553-1554; 1555-1556; 1557-1558; 1559-1560 1561-1562 1563-1564 1565-1566 1567-1568 1569-1570 1571-1572; 1573-1574; 1575-1576; 1577-1578 1579-1580 1581-1582 1583-1584 1585-1586 1587-1588 1589-1590; 1591-1592; 1593-1594; 1595-1596 1597-1598 1599-1600 1601-1602 1603-1604 1605-1606 1607-1608; 1609-1610; 1611-1612; 1613-1614 1615-1616 1617-1618 1619-1620 1621-1622 1623-1624 1625-1626; 1627-1628; 1629-1630; 1631-1632 1633-1634 1635-1636 1637-1638 1639-1640 1641-1642 1643-1644; 1645-1646; 1647-1648; 1649-1650 1651-1652 1653-1654 1655-1656 1657-1658 1659-1660 1661-1662; 1663-1664; 1665-1666; 1667-1668 1669-1670 1671-1672 1673-1674 1675-1676 1677-1678 1679-1680; 1681-1682; 1683-1684; 1685-1686 1687-1688 1689-1690 1691-1692 1693-1694 1695-1696 1697-1698; 1699-1700; 1701-1702; 1703-1704 1705-1706 1707-1708 1709-1710 1711-1712 1713-1714 1715-1716; 1717-1718; 1719-1720; 1721-1722 1723-1724 1725-1726 1727-1728 1729-1730 1731-1732 1733-1734; 1735-1736; 1737-1738; 1739-1740 1741-1742 1743-1744 1745-1746 1747-1748 1749-1750 1751-1752; 1753-1754; 1755-1756; 1757-1758 1759-1760 1761-1762 1763-1764 1765-1766 1767-1768 1769-1770; 1771-1772; 1773-1774; 1775-1776 1777-1778 1779-1780 1781-1782 1783-1784 1785-1786 1787-1788; 1789-1790; 1791-1792; 1793-1794 1795-1796 1797-1798 1799-1800 1801-1802 1803-1804 1805-1806; 1807-1808; 1809-1810; 1811-1812 ; 1813-1814 ; 1815-1816.
Los siguientes ejemplos no son limitativos.
Ejemplo 1: Amplificación general de los VPH a5, a6, a7 y a10
Se desarrolló una prueba NGS para cuantificar los ARNm de VPH E7 oncogénicos en relación con sus respectivos ARNm de L1. Se buscaron y diseñaron cebadores de consenso a este respecto para una amplificación previa cuantitativa de los ARNm oncogénicos del VPH E7 de todos los virus del papiloma alfa (alto y bajo riesgo).
Se completó la prueba con la identificación del nivel del ARNm de L1 y se determinó la proporción entre la expresión E7 (gen temprano) y L1 (gen tardío) para determinar el riesgo de que un paciente desarrolle cáncer. Esta nueva prueba permite determinar el riesgo inherente de cualquier tipo de VPH independientemente de la clasificación actual independientemente de si el paciente está infectado con las especies de VPH 16 o 18, etc. (HR) o 30, etc. (BR).
Además, este ensayo permite la identificación de múltiples infecciones por VPH en individuales concretos.
En primer lugar, se analizaron la viabilidad de generar secuencias de consenso para diferentes tipos de VPH (HR y LR).
Se comenzó determinando el porcentaje de homología de proteínas de los diferentes tipos de VPH, utilizando NCBI Blastn. Se observó que existía una alta heterogeneidad entre la secuencia de genes de E7 de un tipo de VPH y otra, incluso entre las especies de HR (FIGURA 1, 2, 3, 4, 5, 6). Esta observación no reveló características obvias en las secuencias de VPH que explican el consenso de las parejas de diseño según la clasificación actual como LR o HR. Esta observación refuerza la hipótesis de una falta de correlación entre la secuencia de un gen E7 completo y la clasificación basada en el riesgo: esto perjudica la posibilidad de derivar pruebas basadas en la secuencia de consenso para diferenciar HT = R y LR.
Luego, se hizo un alineamiento de secuencia basado en los VPH E7 oncogénicos HR y LR.
Se centró en la comparación global de HR y LR, luego solo dentro de HR y, finalmente, solo dentro de LR. Se observó que no surgió ninguna secuencia de consenso específica de la alineación de secuencias de HR, HR y LR / LR en general en las especies de genes E7. Hay muy poca homología de secuencia global, siendo el locus de homología muy puntual.
No obstante, se diseñaron así cebadores de consenso basados en el subgrupo a para E7 utilizando ClustalW para alineaciones. Se encontraron algunas homologías entre las secuencias de tipos de VPH contenidas en un subgrupo. Después de haber generado la alineación de todos los archivos FASTA, se buscó generar secuencias de consenso utilizando el programa GEMI. A veces, no se pudieron encontrar secuencias de consenso en todo el subgrupo de VPH. Se dividió el subgrupo para generar las secuencias de consenso degeneradas. A continuación, se seleccionaron cebadores combinados más particularmente que cubrían todos los parámetros de los subgrupos, como minimizar el número de cebadores necesarios, seleccionar cebadores para obtener los amplicones más grandes posibles, seleccionar otros cebadores para las secuencias 3' conservadas relativas y seleccionar cebadores que no se hibridaban de forma cruzada. Se hicieron estas selecciones para todo el subgrupo de VPH E7 y L1. Después de analizar todas las secuencias, se eligió el mejor conjunto de cebadores para a5, a6, a7 y a10 E7 y a5, a6, a7 y a10 L1 para amplificar todos los genes.
Finalmente, se proporcionó en este caso una nueva prueba de diagnóstico que comprendía un conjunto de sondas para la amplificación previa del nivel de ARNm de VPH E7 a5, a6, a7 y a10 y de ARNm de VPH L1 a5, a6, a7 y a10 lo que permitió evaluar la relación entre la expresión de E7 (gen temprano) y L1 (gen tardío) como marcador del riesgo de que un paciente desarrollara cáncer.
Un conjunto preferido de cebadores para la amplificación previa comprende las siguientes secuencias:
a5:
- E7
Directo: 5'- YTAGATYTGGTGCCGCAACCCG -3' (SEQ ID NO. 49)
Directo: 5'- MGCCATGCGTGGTAATGTACCAC -3' (SEQ ID NO. 50)
Inverso: 3'- CTCCASCRCTCGRACGTTCTGT -5' (SEQ ID NO. 51)
Inverso: 3'- CACGGGCAMACCAGGCTTAGK -5' (SEQ ID NO. 52)
- L1
Directo: 5'- KCAGATGGCYTTGYGGCGTACTA -3' (SEQ ID NO. 53)
Inverso: 3'- GGGGCRTYRCGYTGACAKGTAGT -5' (SEQ ID NO. 56)
Inverso: 3'- GGCMGGSCKTTTAAGGCCTGGT -5' (SEQ ID NO. 57)
a6:
- E7
Directo: 5'- GCTCAGAGGAWGAGGATGAGG -3' (5EQ ID NO. 64)
Inverso: 3'- GCCTTGTTGCRCASAGGGG -5' (SEQ ID NO. 69)
Inverso: 3'- CGCAGAGTGGGCACGTTACT -5' (SEQ ID NO. 70)
- L1
Directo: 5'- TTGCAGATGGCGRYGTGGCG -3' (SEQ ID NO. 71)
Inverso: 3'- CACCTAAAGGYTGDCCDCGGC -5' (SEQ ID NO. 72)
a7:
- E7
Directo: 5'- GACGRGMHGAACMACARCGTCAC -3' (SEQ ID NO. 82)
Inverso: 3'- GTGWSTCCATAAACAGCWGCWGT -5' (SEQ ID NO. 85)
Inverso: 3'- CACACCAMGGACACACAAAGGAC -5' (SEQ ID NO. 86)
- L1
Directo: 5'- GCGBTCTAGYGACARCAHGGTGT -3' (SEQ ID NO. 87)
Directo: 5'- HCCTGCTATTGGKGARCAYTGGG -3' (SEQ ID NO. 88)
Inverso: 3'- CCAGTGYTCYCCMATRGCRGGWA -5' (SEQ ID NO. 89)
Inverso: 3'- TAGASCCACTDGGWGANGGRGAA -5' (SEQ ID NO. 90)
a10:
- E7
Directo: 5'- GCWCAYTWGGAATHGTGTGCCCC -3' (SEQ ID NO. 122)
Directo: 5'- CSTGTAAMAACGCCATGAGAGGA -3' (5EQ ID NO. 123)
Directo: 5'- CGCCATGAGAGGAMACAASCCA -3' (SEQ ID NO. 124)
Inverso: 3'- GGCACACDATTCCWARTGWGCCC -5' (SEQ ID NO. 125)
Inverso: 3'- GGTTCGTASGTCRSTTGYTGTAC -5' (SEQ ID NO. 126)
Inverso: 3'- GTGCACAGSYGGGRCACACWAYT -5' (SEQ ID NO. 127)
- L1
Directo: 5'- GARGCCACWGTSTACYTGCCTC -3' (SEQ ID NO. 128)
Directo: 5'- ACAGATGTCTCTGTGGCGGC -3' (SEQ ID NO. 129)
Inverso: 3'- GGATGNCCACTWAYRCCHACDCC -5' (SEQ ID NO. 130)
Ejemplo 2: Cuantificación de las lecturas E6 y E7 frente a otras lecturas virales
Se toma una muestra de células del cuello uterino con una espátula o un cepillo pequeño y se coloca en una solución conservadora. Los ARN se extraen de las células usando un procedimiento estándar y los ARNm poliA se seleccionan usando procedimientos estándar como el uso de perlas de poli dT. Las bibliotecas se preparan utilizando la preparación de la biblioteca estándar (fragmentación de ARN y transcripción inversa en ADN complementario de doble hebra cebado por hexámero aleatorio seguido de la selección del adaptador, o transcripción inversa a ADNc de cadena sencilla, ligación de ADNc y amplificación aleatoria por polimerasa phi 29 seguida de fragmentación y ligación del adaptador). Alternativamente, la RT-PCR se realiza utilizando un conjunto de cebadores para E6 y e7 y al menos otro gen tardío como se ha descrito. Después de secuenciar usando varios millones de lecturas de al menos 100 nt, las lecturas se mapean en una base de datos de genes E6 y E7: se identifican los genotipos de VPH que expresan E6 / E7. Las otras lecturas se mapean en el subconjunto de genomas correspondientes a los genotipos correspondientes. Dentro de cada genotipo, se calcula la relación entre el número de lecturas E6 / E7 y las lecturas mapeadas en al menos un gen de antera y se compara con los umbrales.
Ejemplo 3: Muestras biológicas
Se recolectaron dos muestras de lesiones de alto grado (HSIL) del cuello uterino de dos mujeres donantes, en lo sucesivo en este documento 117 y 119, en medio PreservCyt (Hologic) y se mantuvieron a temperatura ambiente durante un par de días. Después de la homogeneización, se recogieron alícuotas de 1 ml del medio líquido total de 20 |jl para la genotipificación del VPH (Papillocheck, Greiner Bio-One). Los resultados de la tipificación del VPH se muestran en la tabla 1. Las muestras restantes se centrifugaron a 4.500 xg durante 10 min y los sedimentos se estabilizaron en 1 ml de RNAProtect Cell (Qiagen) para su almacenamiento a -80°C antes de la extracción del ARN.
Ejemplo 4: Base de datos del VPH
Se recuperaron sesenta y cuatro (64) secuencias de referencia que representaban todo el género alfa del VPH del Centro Internacional de Referencia del Virus del Papiloma Humano (actualizado en mayo de 2014). Se agregaron nueve (9) secuencias de sublinaje adicionales correspondientes a VPH16, más nueve (9) secuencias de sublinaje correspondientes a VPH18 (descritas en Burk et al. Virology, 2013). Los ochenta y dos (82) genomas de VPH resultantes (enumerados en la tabla 2) se alinearon usando ClustalW2 (parámetros predeterminados) y el archivo de salida se analizó usando el software Geneious (Geneious 7.1.5, Biomatters Ldt).
Ejemplo 5: Diseño de cebadores de transcripción inversa del VPH
Se estableció una estrategia dedicada para el diseño de cebadores de transcripción inversa (RT) del VPH con el objetivo de llevar a cabo un enriquecimiento específico de las secuencias de HVP durante la etapa de transcripción inversa dentro de un lastre de secuencias de ARN virales y no virales. El enfoque general consiste en reconocer a todas las poblaciones de transcripciones tempranas y tardías de VPH a partir de un número limitado de cebadores de RT específicos. El diseño se logra aprovechando la secuencia compartida por todas las transcripciones tempranas y tardías, ubicadas en la vecindad 5' de las señales poliA tempranas y tardías, respectivamente (figura 1). Con el fin de minimizar el número de cebadores de RT necesarios para cubrir todo tipo de VPH alfa, se tuvo en cuenta el grado de similitud entre los 82 genomas de VPH. Los criterios adicionales para el diseño de cebadores de RT fueron los siguientes: (i) una buena especificidad general del cebador alineado con todas las bases de datos de secuencias existentes (BLAST NCBI) con especial atención al considerar la parte 3' del cebador, (ii) un contenido de GC de alrededor el 50% (+/- 12%), (iii) una temperatura de fusión (Tm) > 50°C (asumiendo cebadores 0,2 |j M y sal 50 mM), (iv) sin tractos de T, (v) nulo o bajo contenido de GC en la parte 3' del cebador y (vi) ninguna o un número limitado de estructuras secundarias putativas. Este enfoque se implementó manualmente como prueba de principio para diseñar un (1) cebador específico de RT dirigido a las transcripciones tempranas de las 9 secuencias de VPH16, un (1) cebador específico de RT dirigido a las transcripciones tardías de las 9 secuencias de VPH16, dos (2) cebadores específicos de RT dirigidos a las transcripciones tempranas de las 9 secuencias de VPH18 y dos (2) cebadores específicos de RT dirigidos a las transcripciones tardías de las 9 secuencias de VPH18. Los seis (6) cebadores específicos de RT resultantes, que se dirigían tanto a las secuencias de VPH16 como a las de VPH18 e incluían los sublinajes, se proporcionan en la tabla 3. Los cebadores purificados con HPSF (0,01 gmol) se pidieron a Eurofins Genomics (http://www.eurofinsgenomics.eu).
Ejemplo 6: Extracción y caracterización de ARN
El ARN total de las muestras 117 y 119 se extrajo usando el kit de aislamiento de ARN PicoPure (Life Technologies), agregando un paso de tratamiento con ADNasa directamente en la columna (conjunto de ADNsa libre de ARNasa, Qiagen) según lo recomendado por el proveedor. La elución se logró en 30 gl de tampón de elución. La evaluación de la cantidad y calidad de ARN se realizó con un Nanodrop 1000 (Thermo Scientist) y un Bioanalyzer 2100 utilizando los Nano chips de ARN (Agilent).
Ejemplo 7: Transcripción inversa aleatoria
La transcripción inversa aleatoria del ARN total se llevó a cabo utilizando el kit de síntesis de ADNc First-Strand SuperScript III (Invitrogen). Brevemente, se utilizaron 8 gl de ARN total para la plantilla y la reacción se realizó en presencia de hexámeros aleatorios 50 nM (proporcionados por Invitrogen), se incubaron 10 minutos a 25°C, 50 minutos a 50°C y 5 minutos a 85°C antes de un tratamiento final de ARNasa H 20 min a 37°C. El ADNc resultante se almacenó a -20°C.
Ejemplo 8: Transcripción inversa específica del VPH
La transcripción inversa específica de VPH se llevó a cabo usando el kit de síntesis de ADNc First-Strand SuperScript III (Invitrogen) y se cebó con los cebadores RT específicos de VPH descritos anteriormente. Brevemente, se usaron 8 gL de ARN total para la plantilla y la reacción se realizó con una mezcla 0,2 gM de los 6 cebadores de RT específicos del VPH, se incubaron 50 minutos a 50°C y 5 minutos a 85°C antes de un tratamiento final con ARNasa H 20 minutos a 37°C. El ADNc resultante se almacenó a -20°C.
Ejemplo 9: PCR de control
Se utilizaron los genes E7 de VPH16 y la beta-actina celular humana (ACTB) como controles de los pasos de transcripción inversa aleatorios y específicos de VPH, respectivamente. Se utilizó 1 gl de ADNc transcrito de forma inversa como plantillas de PCR en un volumen final de 20 gl, trabajando con los reactivos LightCycler DNA Master SybrGreen I (Roche Diagnostics). Se lograron 45 ciclos de amplificación en un Light Cycler 480 (Roche) como sigue: 95°C 10 segundos, 56°C 10 segundos, 72°C 30 segundos. Las curvas de fusión y los geles de electroforesis sirvieron para la validación. En la tabla 4 se ofrece una comparación de los valores de Ct obtenidos siguiendo el protocolo RT aleatorio o RT del VPH.
Ejemplo 10: Amplificación aleatoria del transcriptoma completo
El ADNc se amplificó aleatoriamente utilizando el protocolo de amplificación por desplazamiento múltiple (MDA) con polimerasa phi29 y hexámeros aleatorios (Amplificación del transcriptoma completo, Qiagen). Phi 29 se trató con UV durante una hora antes de su uso, con el fin de evitar cualquier contaminante de ADN residual.
Ejemplo 11: Secuenciación de alto rendimiento
Las muestras 117 (RT aleatoria y RT específica del VPH) y 119 (RT aleatoria y RT específica del VPH) se analizaron de forma independiente en dos ciclos de secuenciación (secuenciación de extremos emparejados de 300 pb, preparación de biblioteca sin PCR TruSeq, kit de 600 ciclos) en un aparato MiSeq (Illumina). Se generaron datos fastQ y se realizaron pruebas de QC siguiendo procedimientos estándar. El número total de lecturas de secuenciación por muestra se resume en la tabla 5.
Ejemplo 12: Análisis de datos
Las lecturas filtradas por calidad se mapearon en secuencias de referencia utilizando los siguientes criterios: (i) identidad de alineación de al menos el 90% y (ii) puntuación de Smith y Waterman por encima de 100. Una selección de 10 genes humanos sirvió como controles celulares (tabla 6). El análisis de las lecturas que mapeaban las secuencias de VPH se basó en dos estrategias: primero, a nivel genómico, se contaron las lecturas de secuenciación que mapearon VPH16 (NC_001526.2), VPH6 (HG793939.1) y VPH35 (JX129488.1) para cada secuencia codificante (CDS), sin añadir ningún filtro en particular (tabla 7). En un segundo enfoque y más específico de la transcripción, se identificaron las lecturas que mapeaban las uniones de empalme de VPH16 (tabla 8). Este último análisis se realizó para VPH16 sólo como prueba de principio, y se basó en sitios de empalme de donantes y aceptores bien documentados, como se describe, por ejemplo, en Zheng et al. FrontBiosci 2006.
Ejemplo 13: Resultados de la secuencia
Siguiendo el protocolo de transcripción inversa aleatoria, la secuenciación del paciente 117 resultó en un total de 1.455 y 126 lecturas (más de 34.977.682) que se asignaron con éxito a los genomas VPH16 (NC_001526.2) y VPH35 (JX129488.1), respectivamente. Se mapearon 15 lecturas (más de 39675490) en el genoma de VPH16 para el paciente monoinfectado 119. Siguiendo el procedimiento alternativo con cebadores de RT específicos de VPH, la secuenciación del paciente 117 resultó en un total de 2033, 69 y 14 lecturas (más de 28598603) para los genomas de VPH16, VPH35 y VPH6, respectivamente. Se asignaron 6 lecturas (más de 19383833) con respecto al genoma de VPH16 para el paciente 119.
Se realizaron dos líneas de análisis para caracterizar poblaciones finamente diferentes de lecturas de VPH. En primer lugar, a nivel genómico, se contaron las lecturas que mapean las regiones de CDS, lo que brinda una visión amplia de fenómenos como el equilibrio de genes temprano vs tardío (tabla 7). Además de eso, se buscaron caracterizar transcripciones de VPH16 profundamente específicas aprovechando los sitios de empalme de donantes y aceptores bien documentados descritos para VPH16. Esto lleva a definir 11 transcripciones empalmadas que pueden asociarse de manera inequívoca a un evento de ARN específico (tabla 8). Juntos, estos dos análisis mostraron que (i) las secuencias de VPH son accesibles usando HTS, (ii) es posible realizar un recuento de lecturas gen por gen a nivel genómico, (iii) existen lecturas asociadas a uniones de empalme específicas y pueden ser caracterizados y contados también, confirmando esencialmente la detección de transcripciones sobre posibles artefactos introducidos por el ADN residual del VPH, (iv) existen discrepancias entre las muestras, entre el género del VPH y entre los genes del VPH y los patrones de transcripciones, que probablemente reflejan la diversidad de infecciones por VPH.
Ejemplo 14: Ejemplos de puntuaciones R
Estas observaciones abrieron la posibilidad de definir una puntuación, denominada puntuación R, basada en los recuentos de CDS de VPH y / o transcripciones específicas dentro de cada genotipo presente en una muestra determinada, para obtener una caracterización molecular fina de cualquier muestra positiva de VPH individual. Desde esta perspectiva, podría considerarse un valor o una combinación de más de una razón. En la tabla 9 se proporciona una lista no restrictiva de puntuaciones R para ilustrar varias combinaciones posibles basadas en CDS o en transcripciones específicas. A modo de ejemplo, las puntuaciones R basadas en una relación E6 y / o E7 y / o E2 y / o L1 y / o L2 lograron generar valores de puntuación altos (resaltados) que deberían estar asociados a ciclos típicos de VPH no productivos o poco productivos de células transformadas. Es de destacar que los coeficientes de ponderación como aE6 y / o pE7 y / o yE2 y / o 5L1 y / o sL2 pueden agregarse como parámetros, de forma independiente, para discriminar mejor, por ejemplo, lesiones de bajo riesgo y de alto riesgo.
Ejemplo 15: RT aleatoria frente a RT específica del VPH
Como alternativa a la RT aleatoria convencional cadena arriba de la amplificación aleatoria, se intentó definir y utilizar cebadores de RT específicos de VPH con el objetivo final de lograr un enriquecimiento específico de VPH sobre secuencias distintas de VPH. Este enfoque dirigido (semi-aleatorio) puede resultar extremadamente importante en la perspectiva de reducir la secuenciación en profundidad (que depende de la proporción de secuencias de VPH y no de VPH), aumentar la capacidad de multiplicación y reducir los costes requeridos antes de poder usar HTS como una prueba de selección. Aunque el número de lecturas de VPH sigue siendo aproximadamente comparable entre los enfoques de RT aleatoria y RT específica de VPH, se observó una marcada diferencia con respecto a los genes celulares, como se ejemplifica en ambas PCR (tabla 4, promedio ACTB ACt -3,01 para RT de VPH comparado con E7 ACt -0,56) y resultados de HTS (tabla 6, reducción media de 3,3 veces para VPH RT, después de la corrección del número total de lecturas). Además de eso, las lecturas de VPH6 eran detectables en la muestra 117 poliinfectada solo cuando se aplicaba el enfoque de VPH RT, recuperando así los resultados de la prueba de genotipado del estándar de oro Papillocheck. Estos resultados, aunque basados en un número limitado de evidencias experimentales, sugieren un mínimo que el innovador enfoque de los inventores de transcripción inversa específico del VPH junto con la amplificación aleatoria es capaz de reducir los balastos celulares y otros balastos distintos del VPH, sin deteriorar la detección de objetivos específicos del VPH. En la actualidad se requieren optimizaciones de la técnica para lograr un fuerte enriquecimiento de VPH y permitir una cuantificación lineal.
Tabla 1: Muestras biológicas y genotipado asociado del VPH
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Tabla 2:
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Tabla 3: cebadores utilizados para la transcripción inversa específica del VPH
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Tabla 4: Valores comparativos de Ct obtenidos por PCR después de una transcripción inversa aleatoria o específica del VPH
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Tabla 5: Número total de lecturas de secuenciación
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Tabla 6: Número de lecturas de secuenciación que mapean genes celulares humanos (GRCh37) después de la transcripción inversa aleatoria o específica del VPH
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Tabla 7: Número de lecturas de secuenciación mapeando CDS VPH
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Tabla 8: Número de lecturas de secuenciación del mapa de transcripciones de VPH16 empalmadas
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Ejemplo 16: Resumen de los ejemplos 1-15
El método según la presente invención descrito en los Ejemplos anteriores comprende:
1. Extracción de ARN virales (Ejemplo 6) a partir de una muestra biológica (Ejemplo 3),
2. Transcripción inversa de los ARN en ADNc con hexámeros aleatorios (Ejemplo 7) o cebadores específicos para VPH (Ejemplo 8); el diseño de los cebadores se ilustra mediante el Ejemplo 1 (cebador consenso) y el Ejemplo 5 (cebadores específicos de VPH16 y VPH18). Se lleva a cabo un control de calidad del ADNc mediante PCR cuantitativa (Ejemplo 9).
3. Amplificación del ADNc mediante tecnología MDA con hexámeros aleatorios (Ejemplo 10) para generar un banco de secuencias de ADN (Ejemplo 2),
4. Secuenciación de alto rendimiento del banco de ADN y generación de "lecturas de secuenciación'' (Ejemplo 11), 5. Alineación de lecturas (Ejemplo 12) con las secuencias de los genomas de VPH presentes en la base de datos (Ejemplo 5). Son posibles dos estrategias analíticas (ejemplo 12, resultados en el ejemplo 13):
a. contar lecturas alineadas con cada CDS de interés, o
b. enumeración de lecturas que alinean solo las uniones de empalme conocidas de cada CDS de interés;
6. Calcular la puntuación R (Ejemplo 14) cuyos diferentes cálculos posibles son las proporciones descritas en la Tabla 9. La relación se define como la relación entre el número de lecturas generadas para al menos 2 genes descritos en la presente solicitud de patente.
Ejemplo 17: Detección y cuantificación de VPH16 y transcripciones humanas
17.1 Base de datos del VPH
Se recuperaron sesenta y cuatro (64) secuencias genómicas que representan el género alfa del VPH del Centro Internacional de Referencia del Virus del Papiloma Humano (http://www.hpvcenter.se/index.html; actualizado en mayo de 2014). Se agregaron nueve (9) secuencias de sublinaje adicionales correspondientes a VPH16, más nueve (9) secuencias de sublinaje correspondientes a VPH18 (descritas en Burk, et al. Virology 2013). Los ochenta y dos (82) genomas de VPH resultantes se denominan la base de datos de aVPH (Tabla 2 anterior). Un subgrupo de la base de datos de aVPH compuesto por dieciséis (16) secuencias (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68, 73 y 82), correspondientes al virus del papiloma de alto riesgo o supuesto alto riesgo, se conoce como el grupo aVPH HR.
17.2 Delineación de mapas de transcripción para aVPH HR
Para cada secuencia del grupo aVPH HR, se anotaron los sitios de donantes de empalme (SD) y aceptores de empalme (SA) conocidos y supuestos / previstos. En primer lugar, se recuperaron los sitios SD y Sa previamente documentados para VPH16 y VPH18 de Zheng et al. Front Biosci. 2006, Wang et al. Journal of Virology 2011 y Toots et al. PLoS ONE 2014 (Figura 7, gris claro). Basado en la idea de que prácticamente todos los sitios empalmados son análogos a los descritos previamente para otros virus del papiloma (Wang et al. Journal of Virology 2011), la anotación de SA y SD se expandió luego a todo el grupo aVPH por analogía directa (Figura 7, números negros). Además, las predicciones SA / SD fueron compatibles con el software de predicción del sitio de empalme en línea.
17.3 Diseño de bases de datos de transcripciones y cebadores
Se generó una base de datos de secuencias cortas (de 150 a 500 pb) reconstruidas en 5' del sitio donante de empalme y 3' del sitio aceptor de empalme, reuniendo cada transcripción, parte de la transcripción o la transcripción putativa para cada aVPH HR, y se identifica con la base de datos de transcripciones de aVPH. Esta base de datos sirvió como base para el diseño de cebadores de la PCR. Más precisamente, se definió un par de cebadores para cada transcripción, parte de la transcripción o transcripción putativa cuando fue posible, con el objetivo de abarcar la unión de empalme, como se define en la Figura 7 (las transcripciones correspondientes aparecen con el sufijo 'sp_' en la Tabla 10).
Tabla 10: Pares de cebadores para VPH16 y transcripciones humanas
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En particular, los sitios de empalme vecinos más cercanos se han tenido en cuenta para minimizar los riesgos de amplificar conjuntamente varias isoformas empalmadas con un par de cebadores determinados. Se definieron otros pares de cebadores, cuando fue posible, para amplificar los límites en las posiciones 5'-SD-genómica y genómica-SA-3’ (sufijo 'unsp_') para permitir una mejor monitorización cuantitativa de empalmes concomitantes y / o genómicos / eventos de transcripción sin empalmar y, si es necesario, refinar la descripción del equilibrio de las transcripciones en el curso de la infección por VPH. Para completar esta vista y proporcionar controles adicionales, también se diseñaron cebadores dentro de algunas regiones genómicas del VPH que carecían de sitios SD / SA conocidos (sufijo 'gen_'), lo que significa que la detección de tales secuencias solo podría resultar de la transcripción local no empalmada o la contaminación del ADN. También se ha incluido una selección de transcripciones humanas en el diseño con fines de normalización y / o para apoyar o mejorar una combinación de transcripciones humanas y / o de VPH que pueden discriminar lesiones de bajo grado frente a lesiones de alto grado del cuello uterino. Es de destacar que se investigaron las transcripciones de fusión adicionales ('fus_') y se concibieron los cebadores siguiendo la hipótesis del punto de corte del VPH en el contexto de la integración del VPH dentro de los dos locus humanos MYC y PTV1, como se discute, por ejemplo, en Lu et al. PLoS ONE 2014, Tang et al. Nature Communication 2013, Wentzensen et al. Oncogene 2002 o Peter et al. Oncogene 2006. En este caso, los cebadores directos se ubicaron en 5' de los puntos de corte del VPH (ver Figura 7) y los cebadores inversos se diseñaron dentro de los exones humanos objetivo, lo que permitió la detección y caracterización fina de las transcripciones híbridas del VPH-humano.
17.4 Muestras biológicas y línea celular
Se recogieron dos muestras de lesiones de alto grado (HSIL) del cuello uterino de dos mujeres donantes, en lo sucesivo denominadas 610 y 729, en medio PreservCyt (Hologic) y se mantuvieron a temperatura ambiente durante un par de días. Después de la homogeneización, se recogieron alícuotas de 1 ml del medio líquido total de 20 gl para la genotipificación del VPH (Papillocheck, Greiner Bio-One). Los resultados de la tipificación del VPH se muestran en la Tabla 11.
Tabla 11: Muestras monoinfectadas por VPH16 de pacientes
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Las muestras restantes se centrifugaron a 4.500 xg durante 10 min y los sedimentos se almacenaron a -80°C antes de la extracción del ARN. Además, las células SiHa (integración genómica de VPH16) se cultivaron y recolectaron, proporcionando otra fuente de ARN.
17.5 Extracción y caracterización del ARN
El ARN total de las muestras 610 y 729 se extrajo utilizando el kit de aislamiento de ARN PicoPure (Life Technologies), agregando un paso de tratamiento con ADNasa directamente en la columna (conjunto de ADNsa libre de ARNasa, Qiagen) según lo recomendado por el proveedor. La elución se logró en 30 gl de tampón de elución. La evaluación de la cantidad y calidad de ARN se realizó con un Nanodrop 1000 (Thermo Scientist) y un Bioanalyzer 2100 utilizando los Nano chips de ARN (Agilent).
17.6 Transcripción inversa aleatoria
La transcripción inversa aleatoria del ARN total se llevó a cabo utilizando el kit de síntesis de ADNc First-Strand SuperScript III (Invitrogen). Brevemente, se utilizaron 2 pl de ARN total para la plantilla y la reacción se realizó en presencia de hexámeros aleatorios 50 nM (proporcionados por Invitrogen), se incubaron 10 minutos a 25°C, 60 minutos a 50°C y 5 minutos a 85°C antes de un tratamiento de ARNasa H final a 20min y 37°C. El ADNc resultante se amplificó inmediatamente utilizando el método múltiple descrito a continuación.
17.7 Amplificación múltiple de transcripciones específicas
La amplificación del VPH junto con las transcripciones humanas se realizó a partir del ADNc de las muestras 610, 729 y SiHa utilizando una mezcla de cebadores (apropiados para la tecnología AmpliSeq™; Life technologies) de manera múltiple, mediante una reacción de amplificación de 20 ciclos. Después de la amplificación, se construyeron bibliotecas de secuenciación (Life technologies) y se validaron en un Bioanalyzer 2100 antes de la secuenciación. 17.8 Secuenciación de alto rendimiento y análisis de datos
Las muestras 610, 729 y SiHa se secuenciaron en un aparato Ion PGM usando un chip Ion 118 (Life Technologies). Se generaron datos FastQ y se realizaron pruebas de QC siguiendo procedimientos estándar. Para cada muestra, las lecturas de secuenciación se recortaron de acuerdo con su puntuación de calidad Phred y luego se asignaron a la base de datos de transcripciones del VPH utilizando Bowtie 2 (Langmead et al. Nature Methods 2012). Para las transcripciones empalmadas, se eliminaron del análisis las alineaciones que no abarcaban la unión de empalme. El número de lecturas para cada muestra se detalla en la Tabla 12.
Tabla 12: Número de lecturas para VPH16 y transcripciones humanas
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17.9 Amplificación múltiple y cuantificación de transcripciones de VPH16
Como prueba de principio, se buscó discriminar 47 transcripciones empalmadas ('sp_'), 16 transcripciones sin empalmar ('unsp_'), 3 transcripciones genómicas ('gen_'), 12 supuestas transcripciones de fusión VPH-humano ('fus_') , más 30 transcripciones humanas adicionales, de muestras de VPH16 monoinfectadas (muestras 610 y 729) y células SiHa. Para garantizar la especificidad de la amplificación, se ha comprobado que el diseño no tiene compatibilidad cruzada con la base de datos del VPH, además de las bases de datos del genoma humano y las transcripciones. Los cebadores se detallan en la Tabla 10. El número de lecturas después del control de calidad, el mapeo y la validación de la unión de empalme se detallan en la Tabla 12.
17.10 Resultados: detección y cuantificación de VPH16 y transcripciones humanas
El experimento mostró que (i) se detectaron transcripciones humanas específicas, como controles internos y / o de normalización, en las muestras 610, 729 y SiHa con niveles de expresión que variaban entre las transcripciones y de una muestra a otra, validando así la integridad del material de ARN inicial y la eficacia de los pasos de amplificación múltiplex subsiguientes (ii) las transcripciones de VPH16 empalmadas ('sp_') y no empalmadas específicas ('unsp_') se detectaron y caracterizaron con éxito en las muestras 610, 729 y SiHa, aunque en una proporción variable entre las muestras, lo que respalda la variaciones de transcripciones específicas de VPH16 o eventos de transcripción entre muestras biológicas, (iii) en particular, la muestra de SiHa no mostró o mostró pocas transcripciones genómicas ('gen_'), sin empalmar ('unsp_') y empalmadas ('sp_') o sin empalmar ('sp_') más allá de la posición genómica 3356, que parecía coherente con la pérdida de genes tardíos virales después de la integración de VPH16 en el genoma de las células SiHa, y (iv) así demostró la capacidad del método para diferenciar con precisión entre las etapas de infección integrativa y no replicativa de VPH16 a menudo asociadas con niveles más altos de transcripciones E6 / E7 (en este caso particular sp_226_409, sp_226_526 y sp_226_742, ver Tabla 12), de otras transformaciones anteriores inducidas por VPH16 y / o etapas de proliferación que normalmente implican la transcripción de los genes E2 y / o L1 y / o L2 (véase como ejemplo sp_880_3357 en la Tabla 12). En consecuencia, las transcripciones empalmadas de VPH16 específicas y / o las transcripciones no empalmadas de VPH16 y / o las transcripciones genómicas de VPH16 y / o las transcripciones de fusión de VPH16-humano se pueden ponderar para calcular una puntuación, o proporción de puntuaciones, discriminando diferentes etapas de interacción de VPH16 con las células infectadas, en particular, las etapas temprana frente a las tardías del ciclo de VPH16, y / o las formas integradoras frente a no integradoras del genoma de VPH16 en las células infectadas, que son eventos asociados a la transformación celular. De manera más general, estos resultados sugieren que el método puede extenderse y aplicarse a todos los aVPH HR.
17.11 Ejemplos de puntuaciones R
Estas observaciones refuerzan la posibilidad de definir una puntuación, denominada puntuación R, basada en los recuentos de transcripciones específicas del VPH como marcador molecular de cualquier muestra individual positiva para el VPH. Desde esta perspectiva, se podría utilizar un valor o una combinación de más de una o más proporciones como marcadores de las interacciones entre células virales que dan forma al proceso de transformación. En la Tabla 13 se proporciona una lista no restrictiva de puntuaciones R para ilustrar varias combinaciones posibles basadas en transcripciones específicas de VPH16.
Tabla 13: Ejemplos de puntuaciones R
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Por ejemplo, las puntuaciones R se basan en una relación sp_226_409 / sp_880_2708 y / o sp_880_2581 / sp_3631_5637 y / o sp_880_2708 / sp_3631_5637 y / o sp_880_3357 / sp_3631_5637 y / o unsp_741_p_742/unsp_p5009_5010 acontecidas cuando se generaban valores de puntuaciones altas (p. ej. M) que estaban asociadas con ciclos de VPH poco productivos o no productivos típicos de las células transformadas. Es de destacar que los coeficientes de ponderación como a (sp_226_409 / sp_880_2708) y / o p (sp_880_2581 / sp_3631_5637) y / o Y(sp_880_2708 / sp_3631_5637) y / o 5(sp_880_3357 / sp_3631_5637) y / o unsp_741_742/unsp_p5009_5010 pueden añadirse como parámetros, de forma independiente, para discriminar mejor, por ejemplo, lesiones de bajo riesgo y de alto riesgo.
17.12 Extensión del método al grupo aVPH HR
El método se extendió a todo el grupo aVPH HR (es decir: VPH16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68, 73 y 82) según el mapa de transcripción descrito en la Figura 7. Los cebadores resultantes de este diseño mejorado se enumeran en la Tabla 14.
Tabla 14: Pares de cebadores para el grupo aVPH HR y transcripciones humanas
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17.13. Sumario del Ejemplo 17
El método según la presente invención descrito en el Ejemplo 17 comprende:
1. Extraer el ARN vírico (Ejemplo 17.5) de una muestra biológica (Ejemplo 17.4),
2. Realizar la transcripción inversa de los ARN en ADNc con hexámeros aleatorios (Ejemplo 17.6),
3. Amplificar del ADNc por PCR múltiple (Ejemplo 7) para generar una base de datos de secuencias de ADN.
La amplificación múltiple se realiza con pares de cebadores específicos del VPH (Ejemplo 17.3)
Los cebadores están diseñados específicamente para cada uno de los genomas de VPH presentes en la base de datos (Ejemplo 17.2).
Los cebadores se modifican para hacerlos compatibles con la técnica de secuenciación de alto rendimiento que se utiliza.
4. Secuenciar con alto rendimiento la biblioteca de ADN y generación de "lecturas de secuenciación" (Ejemplo 17.8), 5. Alinear las lecturas (Ejemplo 8) con las secuencias de los genomas de VPH presentes en la base de datos (Ejemplos 17.3 y 17.8).
6. Calcular una puntuación R (Ejemplo 17.11) cuyos diferentes cálculos posibles son las proporciones descritas en la Tabla 13. En este caso, la proporción se define como la proporción entre el número de lecturas generadas por al menos 2 de los pares de cebadores descritos en este documento.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un método para determinar el riesgo de un paciente a desarrollar cáncer inducido por virus oncogénicos, como el VPH del grupo alfa, que comprende:
a) enriquecer los ARN virales en una muestra mediante amplificación previa aleatoria o de consenso y / o reacción de transcriptasa inversa específica, preferiblemente amplificación previa de consenso,
b) secuenciar el ADNc producido en el paso a) y generar lecturas de dicho ADNc,
c) determinar el número de lecturas que coinciden con dichos virus en función de la discriminación de especies y determinar las especies de alto riesgo más prevalentes presentes en la muestra en relación con otras especies, d) determinar dentro de dichas especies de alto riesgo más prevalentes el número relativo de lecturas que coinciden con al menos un gen oncogénico en comparación con al menos un gen no oncogénico, preferiblemente genes oncogénicos en comparación con genes no oncogénicos,
e) calcular las proporciones dentro de dicha especie de alto riesgo de lecturas que coinciden con al menos un gen oncogénico frente al correspondiente gen estructural o regulador interespecies, preferiblemente genes oncogénicos frente a los correspondientes genes estructurales o reguladores interespecies,
f) determinar el riesgo de desarrollar cáncer inducido por virus oncogénicos en pacientes en los que dicha proporción tiende a infinito,
en el que el enriquecimiento de los ARN virales se realiza mediante una transcripción inversa de los ARN virales, y una amplificación del ADNc producido mediante PCR múltiple con una composición de cebadores específica de VPH del grupo alfa que comprende al menos uno de los siguientes grupos de pares de cebadores:
- grupo SD1-SA1 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 397-398; 521-522; 609-610; 695-696; 819­ 820; 865-866; 947-948; 1067-1068; 1119-1120; 1267-1268; 1325-1326; 1507-1508; 1597-1598; 1655-1656; 1755-1756;y / o
- grupo SD1-SA2 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 459-460; 633-634; 687-688; 1111-1112; 1235-1236; 1341-1342; 1503-1504; 1657-1658; 1797-1798; y / o
- grupo SD1-SA3 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 381-382; 541-542; 599-600; 903-904; 941 -942; 1047-1048; 1135-1136; 1287-1288; 1459-1460; 1473-1474; 1621-1622; 1717-1718; 1745-1746; y / o
- grupo SD1-SA4 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 413-414; 551-552; 637-638; 713-714; 793­ 794; 857-858; 981-982; 1093-1094; 1179-1180; 1227-1228; 1319-1320; 1413-1414; 1509-1510; 1563-1564; 1709­ 1710; 1791-1792; y / o
- grupo SD1-SA5 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 453-454; 549-550; 613-614; 747-748; 761 -762; 949-950; 1163-1164; 1249-1250; 1329-1330; 1453-1454; 1501-1502; y / o
- grupo SD1-SA6 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 431-432; 595-596; 719-720; 827-828; 1089-1090; 1137-1138; 1285-1286; 1353-1354; 1561-1562; 1719-1720; 1763-1764; y / o
- grupo SD1-SA7 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 919-920; 1449-1450; y / o
- grupo SD1-SA8 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 489-490; 963-964; 1519-1520; y / o - grupo SD2-SA4 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 387-388; 473-474; 615-616; 745-746; 815­ 816; 849-850; 933-934; 1091-1092; 1177-1178; 1209-1210; 1367-1368; 1437-1438; 1521-1522; 1603-1604; 1651­ 1652; 1779-1780; y / o
- grupo SD2-SA5 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 455-456; 529-530; 629-630; 717-718; 777­ 778; 975-976; 1153-1154; 1273-1274; 1347-1348; 1451-1452; 1531-1532; y / o
- grupo SD2-SA6 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 399-400; 645-646; 727-728; 811-812; 1079-1080; 1127-1128; 1253-1254; 1369-1370; 1615-1616; 1659-1660; 1781-1782; y / o
- grupo SD2-SA7 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 531-532; 899-900; 943-944; 1411-1412; 1495-1496; y / o
- grupo SD2-SA9 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 437-438; 505-506; 607-608; 739-740; 785­ 786; 887-888; 979-980; 1063-1064; 1185-1186; 1233-1234; 1297-1298; 1423-1424; 1491-1492; 1607-1608; 1693­ 1694; 1775-1776; y / o
- grupo SD2-SA10 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 545-546; 831-832; 1149-1150; 1269­ 1270; 1427-1428; 1671-1672; y / o
- grupo SD3-SA4 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 379-380; 483-484; 611-612; 721 -722; 833­ 834; 911-912; 937-938; 1053-1054; 1139-1140; 1251-1252; 1335-1336; 1435-1436; 1487-1488; 1591-1592; 1715­ 1716; 1785-1786; y / o
- grupo SD3-SA5 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 415-416; 493-494; 593-594; 733-734; 817­ 818; 993-994; 1145-1146; 1243-1244; 1337-1338; 1401-1402; 1483-1484; y / o
- grupo SD3-SA6 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 435-436; 655-656; 673-674; 813-814; 1045-1046; 1173-1174; 1241-1242; 1303-1304; 1557-1558; 1627-1628; 1647-1648; 1773-1774; y / o
- grupo SD3-SA7 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 855-856; 1387-1388; y / o
- grupo SD3-SA8 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 511-512; 957-958; 1529-1530; y / o
- grupo SD5-SA9 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 419-420; 527-528; 567-568; 587-588; 683­ 684; 775-776; 891-892; 999-1000; 1041-1042; 1113-1114; 1247-1248; 1371-1372; 1403-1404; 1511-1512; 1617­ 1618; 1677-1678; 1733-1734; y / o
- grupo SD5-SA10 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 495-496; 837-838; 1183-1184; 1279­ 1280; 1433-1434; 1723-1724.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la composición de cebadores específica del VPH del grupo alfa comprende los siguientes grupos de pares de cebadores:
- Grupo SD1-SA1 que consiste en los pares de cebadores de SEQ ID NO: 397-398; 521-522; 609-610; 695-696; 819-820; 865-866; 947-948; 1067-1068; 1119-1120; 1267-1268; 1325-1326; 1507-1508; 1597-1598; 1655-1656; 1755-1756.
3. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que la composición de cebadores específica de VPH del grupo alfa abarca uniones de empalme, regiones genómicas y no empalmadas, y regiones de transcripción de fusión humana de cada transcrito de VPH.
4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la composición de cebadores específicos de VPH del grupo alfa comprende al menos uno de, preferiblemente todos, los siguientes grupos de pares de cebadores:
- los cebadores específicos de VPH16 que comprenden o consisten en los cebadores de SEQ ID NO: 219-258 para transcripciones genómicas y no empalmadas de VPH16, SEQ ID NO: 259-352 para transcripciones empalmadas de VPH16 y SEQ ID NO: 353-376 para transcripciones de fusión de VPH16-humano (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO: 219-220; 221-222; 223-224; 225-226; 227-228; 229-230; 231-232; 233-234; 235-236; 237-238; 239­ 240; 241-242; 243-244; 245-246; 247-248; 249-250; 251-252; 253-254; 255-256; 257-258; 259-260; 261-262; 263­ 264; 265-266; 267-268; 269-270; 271-272; 273-274; 275-276; 277-278; 279-280; 281-282; 283-284; 285-286; 287­ 288; 289-290; 291-292; 293-294; 295-296; 297-298; 299-300; 301-302; 303-304; 305-306; 307-308; 309-310; 311 -312; 313-314; 315-316; 317-318; 319-320; 321-322; 323-324; 325-326; 327-328; 329-330; 331-332; 333-334; 335­ 336; 337-338; 339-340; 341-342; 343-344; 345-346; 347-348; 349-350; 351-352; 353-354; 355-356; 357-358; 359­ 360; 361-362; 363-364; 365-366; 367-368; 369-370; 371-372; 373-374; 375-376) o 377-470 (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO. 377-378; 379-380; 381-382; 383-384; 385-386; 387-388; 389-390; 391-392; 393-394; 395-396; 397-398; 399-400; 401-402; 403-404; 405-406; 407-408; 409-410; 411-412; 413-414; 415-416; 417-418; 419-420; 421-422; 423-424; 425-426; 427-428; 429-430; 431-432; 433-434; 435-436; 437-438; 439-440; 441-442; 443-444; 445-446; 447-448; 449-450; 451-452; 453-454; 455-456; 457-458; 459-460; 461-462; 463-464; 465-466; 467-468 y; 469-470); y / o
- los cebadores específicos de VPH18 que comprenden o consisten en los cebadores de SEQ ID NO. 471-574 (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO.: 471-472; 473-474; 475-476; 477-478; 479-480; 481-482; 483-484; 485-486; 487-488; 489-490; 491-492; 493-494; 495-496; 497-498; 499-500; 501-502; 503-504; 505-506; 507-508; 509-510; 511-512; 513-514; 515-516; 517-518; 519-520; 521-522; 523-524; 525-526; 527-528; 529-530; 531-532; 533-534; 535-536; 537-538; 539-540; 541-542; 543-544; 545-546; 547-548; 549-550; 551-552; 553-554; 555-556; 557-558; 559-560; 561-562; 563 -564; 565-566; 567-568; 569-570; 571-572; 573-574); y / o
- los cebadores específicos de VPH31 que comprenden o consisten en los cebadores de SEQ ID NO. 575-668 (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO.: 575-576; 577-578; 579-580; 581-582; 583-584; 585-586; 587-588; 589-590; 591-592; 593-594; 595-596; 597-598; 599-600; 601-602; 603-604; 605-606; 607-608; 609-610; 611-612; 613-614; 615-616; 617 -618; 619-620; 621-622; 623-624; 625-626; 627-628; 629-630; 631-632; 633-634; 635-636; 637-638; 639-640; 641-642; 643-644; 645-646; 647-648; 649-650; 651-652; 653-654; 655-656; 657-658; 659-660; 661 -662; 663-664; 665-666; 667-668); y / o
- los cebadores específicos de VPH33 que comprenden o consisten en SEQ ID NO. 669-756 (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO.: 669-670; 671-672; 673-674; 675-676; 677-678; 679-680; 681-682; 683-684; 685-686; 687-688; 689-690; 691-692; 693-694; 695-696; 697-698; 699-700; 701-702; 703-704; 705-706; 707-708; 709-710; 711-712; 713-714; 715-716; 717-718; 719-720; 721-722; 723-724; 725-726; 727-728; 729-730; 731-732; 733-734; 735-736; 737-738; 739-740; 741-742; 743-744; 745-746; 747-748; 749-750; 751-752; 753-754; 755-756); y / o
- los cebadores específicos de VPH35 que comprenden o consisten en los cebadores de SEQ ID NO. 757-848 (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO.: 757-758; 759-760; 761-762; 763-764; 765-766; 767-768; 769-770; 771-772; 773-774; 775-776; 777-778; 779-780; 781-782; 783-784; 785-786; 787-788; 789-790; 791-792; 793-794; 795-796; 797-798; 799-800; 801-802; 803-804; 805-806; 807-808; 809-810; 811-812; 813-814; 815-816; 817-818; 819-820; 821-822; 823-824; 825-826; 827-828; 829-830; 831-832; 833-834; 835-836; 837-838; 839-840; 841-842; 843-844; 845-846; 847-848); y / o
- los cebadores específicos de VPH39 que comprenden o consisten en los cebadores de SEQ ID NO. 849-928 (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO.: 849-850; 851-852; 853-854; 855-856; 857-858; 859-860; 861-862; 863-864; 865-866; 867-868; 869-870; 871-872; 873-874; 875-876; 877-878; 879-880; 881-882; 883-884; 885-886; 887-888; 889-890; 891-892; 893-894; 895-896; 897-898; 899-900; 901-902; 903-904; 905-906; 907-908; 909-910; 911-912; 913-914; 915-916; 917-918; 919-920; 921-922; 923-924; 925-926; 927-928); y / o
- los cebadores específicos de VPH45 que comprenden o consisten en los cebadores de SEQ ID NO. 929-1020 (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO.: 929-930; 931-932; 933-934; 935-936; 937-938; 939-940; 941-942; 943-944; 945-946; 947-948; 949-950; 951-952; 953-954; 955-956; 957-958; 959-960; 961-962; 963-964; 965-966; 967-968; 969-970; 971-972; 973-974; 975-976; 977-978; 979-980; 981-982; 983-984; 985-986; 987-988; 989-990; 991-992; 993-994; 995-996; 997-998; 999-1000; 1001-1002; 1003-1004; 1005-1006; 1007-1008; 1009-1010; 1011­ 1012; 1013-1014; 1015-1016; 1017-1018; 1019-1020); y / o
- los cebadores específicos de VPH51 que comprenden o consisten en los cebadores de SEQ ID NO. 1021-1102 (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO.: 1021-1022; 1023-1024; 1025-1026; 1027-1028; 1029-1030; 1031­ 1032; 1033-1034; 1035-1036; 1037-1038; 1039-1040; 1041-1042; 1043-1044; 1045-1046; 1047-1048; 1049-1050; 1051-1052; 1053-1054; 1055-1056; 1057-1058; 1059-1060; 1061-1062; 1063-1064; 1065-1066; 1067-1068; 1069­ 1070; 1071-1072; 1073-1074; 1075-1076; 1077-1078; 1079-1080; 1081-1082; 1083-1084; 1085-1086; 1087-1088; 1089-1090; 1091-1092; 1093-1094; 1095-1096; 1097-1098; 1099-1100; 1101-1102); y / o
- los cebadores específicos de VPH52 que comprenden o consisten en los cebadores de SEQ ID NO. 1103-1200 (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO.: 1103-1104; 1105-1106; 1107-1108; 1109-1110; 1111-1112; 1113­ 1114; 1115-1116; 1117-1118; 1119-1120; 1121-1122; 1123-1124; 1125-1126; 1127-1128; 1129-1130; 1131-1132; 1133-1134; 1135-1136; 1137-1138; 1139-1140; 1141-1142; 1143-1144; 1145-1146; 1147-1148; 1149-1150; 1151­ 1152; 1153-1154; 1155-1156; 1157-1158; 1159-1160; 1161-1162; 1163-1164; 1165-1166; 1167-1168; 1169-1170; 1171-1172; 1173-1174; 1175-1176; 1177-1178; 1179-1180; 1181-1182; 1183-1184; 1185-1186; 1187-1188; 1189­ 1190; 1191-1192; 1193-1194; 1195-1196; 1197-1198; 1199-1200); y / o
- los cebadores específicos de VPH56 que comprenden o consisten en los cebadores de SEQ ID NO. 1201-1296 (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO.: 1201-1202; 1203-1204; 1205-1206; 1207-1208; 1209-1210; 1211­ 1212; 1213-1214; 1215-1216; 1217-1218; 1219-1220; 1221-1222; 1223-1224; 1225-1226; 1227-1228; 1229-1230; 1231-1232; 1233-1234; 1235-1236; 1237-1238; 1239-1240; 1241-1242; 1243-1244; 1245-1246; 1247-1248; 1249­ 1250; 1251-1252; 1253-1254; 1255-1256; 1257-1258; 1259-1260; 1261-1262; 1263-1264; 1265-1266; 1267-1268; 1269-1270; 1271-1272; 1273-1274; 1275-1276; 1277-1278; 1279-1280; 1281-1282; 1283-1284; 1285-1286; 1287­ 1288; 1289-1290; 1291 -1292; 1293-1294; 1295-1296); y / o
- los cebadores específicos de VPH58 que comprenden o consisten en los cebadores de SEQ ID NO. 1297-1382 (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO.: 1297-1298; 1299-1300; 1301-1302; 1303-1304; 1305-1306; 1307­ 1308; 1309-1310; 1311-1312; 1313-1314; 1315-1316; 1317-1318; 1319-1320; 1321-1322; 1323-1324; 1325-1326; 1327-1328; 1329-1330; 1331-1332; 1333-1334; 1335-1336; 1337-1338; 1339-1340; 1341-1342; 1343-1344; 1345­ 1346; 1347-1348; 1349-1350; 1351-1352; 1353-1354; 1355-1356; 1357-1358; 1359-1360; 1361-1362; 1363-1364; 1365-1366; 1367-1368; 1369-1370; 1371-1372; 1373-1374; 1375-1376; 1377-1378; 1379-1380; 1381-1382); y / o
- los cebadores específicos de VPH59 que comprenden o consisten en los cebadores de SEQ ID NO. 1383-1470 (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO.: 1383-1384; 1385-1386; 1387-1388; 1389-1390; 1391-1392; 1393­ 1394; 1395-1396; 1397-1398; 1399-1400; 1401-1402; 1403-1404; 1405-1406; 1407-1408; 1409-1410; 1411-1412; 1413-1414; 1415-1416; 1417-1418; 1419-1420; 1421-1422; 1423-1424; 1425-1426; 1427-1428; 1429-1430; 1431 -1432; 1433-1434; 1435-1436; 1437-1438; 1439-1440; 1441-1442; 1443-1444; 1445-1446; 1447-1448; 1449-1450; 1451-1452; 1453-1454; 1455-1456; 1457-1458; 1459-1460; 1461-1462; 1463-1464; 1465-1466; 1467-1468; 1469­ 1470); y / o
- los cebadores específicos de VPH66 que comprenden o consisten en los cebadores de SEQ ID NO. 1471-1560 (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO.: 1471-1472; 1473-1474; 1475-1476; 1477-1478; 1479-1480; 1481 -1482; 1483-1484; 1485-1486; 1487-1488; 1489-1490; 1491-1492; 1493-1494; 1495-1496; 1497-1498; 1499-1500; 1501-1502; 1503-1504; 1505-1506; 1507-1508; 1509-1510; 1511-1512; 1513-1514; 1515-1516; 1517-1518; 1519­ 1520; 1521-1522; 1523-1524; 1525-1526; 1527-1528; 1529-1530; 1531-1532; 1533-1534; 1535-1536; 1537-1538; 1539-1540; 1541-1542; 1543-1544; 1545-1546; 1547-1548; 1549-1550; 1551-1552; 1553-1554; 1555-1556; 1557­ 1558; 1559-1560; y / o
- los cebadores específicos de VPH68 que comprenden o consisten en los cebadores de SEQ ID NO. 1561-1642 (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO.: 1561-1562; 1563-1564; 1565-1566; 1567-1568; 1569-1570; 1571­ 1572; 1573-1574; 1575-1576; 1577-1578; 1579-1580; 1581-1582; 1583-1584; 1585-1586; 1587-1588; 1589-1590; 1591-1592; 1593-1594; 1595-1596; 1597-1598; 1599-1600; 1601-1602; 1603-1604; 1605-1606; 1607-1608; 1609­ 1610; 1611-1612; 1613-1614; 1615-1616; 1617-1618; 1619-1620; 1621-1622; 1623-1624; 1625-1626; 1627-1628; 1629-1630; 1631-1632; 1633-1634; 1635-1636; 1637-1638; 1639-1640; 1641-1642); y / o
- los cebadores específicos de VPH73 que comprenden o consisten en los cebadores de SEQ ID NO. 1643-1732 (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO.: 1643-1644; 1645-1646; 1647-1648; 1649-1650; 1651-1652; 1653­ 1654; 1655-1656; 1657-1658; 1659-1660; 1661-1662; 1663-1664; 1665-1666; 1667-1668; 1669-1670; 1671-1672; 1673-1674; 1675-1676; 1677-1678; 1679-1680; 1681-1682; 1683-1684; 1685-1686; 1687-1688; 1689-1690; 1691­ 1692; 1693-1694; 1695-1696; 1697-1698; 1699-1700; 1701-1702; 1703-1704; 1705-1706; 1707-1708; 1709-1710; 1711-1712; 1713-1714; 1715-1716; 1717-1718; 1719-1720; 1721-1722; 1723-1724; 1725-1726; 1727-1728; 1729­ 1730; 1731-1732); y / o
- los cebadores específicos de VPH82 que comprenden o consisten en los cebadores de SEQ ID NO. 1733-1816 (incluidos los pares de cebadores de SEQ ID NO.: 1733-1734; 1735-1736; 1737-1738; 1739-1740; 1741-1742; 1743­ 1744; 1745-1746; 1747-1748; 1749-1750; 1751-1752; 1753-1754; 1755-1756; 1757-1758; 1759-1760; 1761-1762; 1763-1764; 1765-1766; 1767-1768; 1769-1770; 1771-1772; 1773-1774; 1775-1776; 1777-1778; 1779-1780; 1781­ 1782; 1783-1784; 1785-1786; 1787-1788; 1789-1790; 1791-1792; 1793-1794; 1795-1796; 1797-1798; 1799-1800; 1801-1802; 1803-1804; 1805-1806; 1807-1808; 1809-1810; 1811-1812; 1813-1814; 1815-1816).
5. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que la composición de cebadores específicos de VPH del grupo alfa comprende uno de los siguientes grupos de pares de cebadores:
- el grupo de pares de cebadores de SEQ ID NO: 397-398; 521-522; 609-610; 695-696; 819-820; 865-866; 947-948; 1067-1068; 1119-1120; 1267-1268; 1325-1326; 1507-1508; 1597-1598; 1655-1656; 1755-1756; 459-460; 633-634; 687-688; 1111-1112; 1235-1236; 1341-1342; 1503-1504; 1657-1658; 1797-1798; 381-382; 541-542; 599-600; 903­ 904; 941-942; 1047-1048; 1135-1136; 1287-1288; 1459-1460; 1473-1474; 1621-1622; 1717-1718; 1745-1746; 413­ 414; 551-552; 637-638; 713-714; 793-794; 857-858; 981-982; 1093-1094; 1179-1180; 1227-1228; 1319-1320; 1413­ 1414; 1509-1510; 1563-1564; 1709-1710; 1791-1792; 453-454; 549-550; 613-614; 747-748; 761-762; 949-950; 1163-1164; 1249-1250; 1329-1330; 1453-1454; 1501-1502; 431-432; 595-596; 719-720; 827-828; 1089-1090; 1137­ 1138; 1285-1286; 1353-1354; 1561-1562; 1719-1720; 1763-1764; 919-920; 1449-1450; 489-490; 963-964; 1519­ 1520; 387-388; 473-474; 615-616; 745-746; 815-816; 849-850; 933-934; 1091-1092; 1177-1178; 1209-1210; 1367­ 1368; 1437-1438; 1521-1522; 1603-1604; 1651-1652; 1779-1780; 455-456; 529-530; 629-630; 717-718; 777-778; 975-976; 1153-1154; 1273-1274; 1347-1348; 1451-1452; 1531-1532; 399-400; 645-646; 727-728; 811-812; 1079­ 1080; 1127-1128; 1253-1254; 1369-1370; 1615-1616; 1659-1660; 1781-1782; 531-532; 899-900; 943-944; 1411­ 1412; 1495-1496; 437-438; 505-506; 607-608; 739-740; 785-786; 887-888; 979-980; 1063-1064; 1185-1186; 1233­ 1234; 1297-1298; 1423-1424; 1491-1492; 1607-1608; 1693-1694; 1775-1776; 545-546; 831-832; 1149-1150; 1269­ 1270; 1427-1428; 1671-1672; 379-380; 483-484; 611-612; 721-722; 833-834; 911-912; 937-938; 1053-1054; 1139­ 1140; 1251-1252; 1335-1336; 1435-1436; 1487-1488; 1591-1592; 1715-1716; 1785-1786; 415-416; 493-494; 593­ 594; 733-734; 817-818; 993-994; 1145-1146; 1243-1244; 1337-1338; 1401-1402; 1483-1484; 435-436; 655-656; 673-674; 813-814; 1045-1046; 1173-1174; 1241-1242; 1303-1304; 1557-1558; 1627-1628; 1647-1648; 1773-1774; 855-856; 1387-1388; 511-512; 957-958; 1529-1530; 477-478; 419-420; 527-528; 567-568; 587-588; 683-684; 775­ 776; 891-892; 999-1000; 1041-1042; 1113-1114; 1247-1248; 1371-1372; 1403-1404; 1511-1512; 1617-1618; 1677­ 1678; 1733-1734; 495-496; 837-838; 1183-1184; 1279-1280; 1433-1434; 1723-1724; 1011-1012; 557-558; o,
- el grupo de pares de cebadores de SEQ ID NO: 229-230; 233-234; 235-236; 245-246; 247-248; 249-250; 251-252 255-256 257-258 265-266 273-274 275-276 277-278 279-280 281-282 289-290 291-292 295-296 297-298 299-300 301-302 303-304 305-306 307-308 309-310 311-312 319-320 321-322 323-324 325-326 327-328 329-330 331-332 333-334 335-336 337-338 341-342 343-344 345-346 347-348 349-350 351-352 377-378 379-380 381-382 383-384 385-386 387-388 389-390 391-392 393-394 395-396 397-398 399-400 401-402 403-404 405-406 407-408 409-410 411-412 413-414 415-416 417-418 419-420 421-422 423-424 425-426 427-428 429-430 431-432 433-434 435-436 437-438 439-440 441-442 443-444 445-446 447-448 449-450 451-452 453-454 455-456 457-458 459-460 461-462 463-464 465-466 467-468 469-470 471-472 473-474 475-476 477-478 479-480 481-482 483-484 485-486 487-488 489-490 491-492 493-494 495-496 497-498 499-500 501-502 503-504 505-506 507-508 509-510 511-512 513-514 515-516 517-518 519-520 521-522 523-524 525-526 527-528 529-530 531-532 533-534 535-536 537-538 539-540 541-542 543-544 545-546 547-548 549-550 551-552 553-554 555-556 557-558 559-560 561-562 563-564 565-566 567-568 569-570 571-572 573-574 575-576 577-578 579-580 581-582 583-584 585-586 587-588 589-590 591-592 593-594 595-596 597-598 599-600 601-602 603-604 605-606 607-608 609-610 611-612 613-614; 615-616 617-618 619-620 621-622 623-624 625-626 627-628 629-630 631-632 633-634 635-636 637-638 639-640 641-642 643-644 645-646; 647-648 649-650 651-652 653-654 655-656 657-658 659-660 661-662 663-664 665-666 667-668 669-670; 671-672 673-674 675-676 677-678 679-680 681-682 683-684 685-686 687-688 689-690 691-692 693-694; 695-696 697-698 699-700 701-702 703-704 705-706 707-708 709-710 711-712 713-714 715-716 717-718; 719-720 721-722 723-724 725-726 727-728 729-730 731-732 733-734 735-736 737-738 739-740 741-742; 743-744 745-746 747-748 749-750 751-752 753-754 755-756 757-758 759-760 761-762 763-764 765-766; 767-768 769-770 771-772 773-774 775-776 777-778 779-780 781-782 783-784 785-786 787-788 789-790; 791-792 793-794 795-796 797-798 799-800 801-802 803-804 805-806 807-808 809-810 811-812 813-814; 815-816 817-818 819-820 821-822 823-824 825-826 827-828 829-830 831-832 833-834 835-836 837-838; 839-840 841-842 843-844 845-846 847-848 849-850 851-852 853-854 855-856 857-858 859-860 861-862; 863-864 865-866 867-868 869-870 871-872 873-874 875-876 877-878 879-880 881-882 883-884 885-886; 887-888 889-890 891-892 893-894 895-896 897-898 899-900 901-902 903-904 905-906 907-908 909-910; 911-912 913-914 915-916 917-918 919-920 921-922 923-924 925-926 927-928 929-930 931-932 933-934; 935-936 937-938 939-940 941-942 943-944 945-946 947-948 949-950 951-952 953-954 955-956 957-958; 959-960 961-962 963-964 965-966 967-968 969-970 971-972 973-974 975-976 977-978 979-980 981-982; 983-984 ; 985-986 ; 987-988; 989-990; 991-992; 993-994; 995-996; 997-998; 999-1000; 1001-1002; 1003-1004; 1005-1006; 1007-1008; 1009-1010; 1011-1012; 1013-1014; 1015-1016; 1017-1018; 1019-1020; 1021-1022; 1023-1024; 1025-1026; 1027-1028; 1029-1030; 1031-1032; 1033-1034; 1035-1036; 1037-1038; 1039­ 1040; 1041-1042; 1043-1044; 1045-1046; 1047-1048; 1049-1050; 1051-1052; 1053-1054; 1055-1056; 1057-1058; 1059-1060; 1061-1062; 1063-1064; 1065-1066; 1067-1068; 1069-1070; 1071-1072; 1073-1074; 1075-1076; 1077­ 1078; 1079-1080; 1081-1082; 1083-1084; 1085-1086; 1087-1088; 1089-1090; 1091-1092; 1093-1094; 1095-1096; 1097-1098; 1099-1100; 1101-1102; 1103-1104; 1105-1106; 1107-1108; 1109-1110; 1111-1112; 1113-1114; 1115­ 1116; 1117-1118; 1119-1120; 1121-1122; 1123-1124; 1125-1126; 1127-1128; 1129-1130; 1131-1132; 1133-1134; 1135-1136; 1137-1138; 1139-1140; 1141-1142; 1143-1144; 1145-1146; 1147-1148; 1149-1150; 1151-1152; 1153­ 1154; 1155-1156; 1157-1158; 1159-1160; 1161-1162; 1163-1164; 1165-1166; 1167-1168; 1169-1170; 1171-1172; 1173-1174; 1175-1176; 1177-1178; 1179-1180; 1181-1182; 1183-1184; 1185-1186; 1187-1188; 1189-1190; 1191­ 1192; 1193-1194; 1195-1196; 1197-1198; 1199-1200; 1201-1202; 1203-1204; 1205-1206; 1207-1208; 1209-1210; 1211-1212; 1213-1214; 1215-1216; 1217-1218; 1219-1220; 1221-1222; 1223-1224; 1225-1226; 1227-1228; 1229­ 1230; 1231-1232; 1233-1234; 1235-1236; 1237-1238; 1239-1240; 1241-1242; 1243-1244; 1245-1246; 1247-1248; 1249-1250; 1251-1252; 1253-1254; 1255-1256; 1257-1258; 1259-1260; 1261-1262; 1263-1264; 1265-1266; 1267­ 1268; 1269-1270; 1271-1272; 1273-1274; 1275-1276; 1277-1278; 1279-1280; 1281-1282; 1283-1284; 1285-1286; 1287-1288; 1289-1290; 1291-1292; 1293-1294; 1295-1296; 1297-1298; 1299-1300; 1301-1302; 1303-1304; 1305­ 1306; 1307-1308; 1309-1310; 1311-1312; 1313-1314; 1315-1316; 1317-1318; 1319-1320; 1321-1322; 1323-1324; 1325-1326; 1327-1328; 1329-1330; 1331-1332; 1333-1334; 1335-1336; 1337-1338; 1339-1340; 1341-1342; 1343­ 1344; 1345-1346; 1347-1348; 1349-1350; 1351-1352; 1353-1354; 1355-1356; 1357-1358; 1359-1360; 1361-1362; 1363-1364; 1365-1366; 1367-1368; 1369-1370; 1371-1372; 1373-1374; 1375-1376; 1377-1378; 1379-1380; 1381­ 1382; 1383-1384; 1385-1386; 1387-1388; 1389-1390; 1391-1392; 1393-1394; 1395-1396; 1397-1398; 1399-1400; 1401-1402; 1403-1404; 1405-1406; 1407-1408; 1409-1410; 1411-1412; 1413-1414; 1415-1416; 1417-1418; 1419­ 1420; 1421-1422; 1423-1424; 1425-1426; 1427-1428; 1429-1430; 1431-1432; 1433-1434; 1435-1436; 1437-1438; 1439-1440; 1441-1442; 1443-1444; 1445-1446; 1447-1448; 1449-1450; 1451-1452; 1453-1454; 1455-1456; 1457­ 1458; 1459-1460; 1461-1462; 1463-1464; 1465-1466; 1467-1468; 1469-1470; 1471-1472; 1473-1474; 1475-1476; 1477-1478; 1479-1480; 1481-1482; 1483-1484; 1485-1486; 1487-1488; 1489-1490; 1491-1492; 1493-1494; 1495­ 1496; 1497-1498; 1499-1500; 1501-1502; 1503-1504; 1505-1506; 1507-1508; 1509-1510; 1511-1512; 1513-1514; 1515-1516; 1517-1518; 1519-1520; 1521-1522; 1523-1524; 1525-1526; 1527-1528; 1529-1530; 1531-1532; 1533­ 1534; 1535-1536; 1537-1538; 1539-1540; 1541-1542; 1543-1544; 1545-1546; 1547-1548; 1549-1550; 1551-1552; 1553-1554; 1555-1556; 1557-1558; 1559-1560; 1561-1562; 1563-1564; 1565-1566; 1567-1568; 1569-1570; 1571­ 1572; 1573-1574; 1575-1576; 1577-1578; 1579-1580; 1581-1582; 1583-1584; 1585-1586; 1587-1588; 1589-1590; 1591-1592; 1593-1594; 1595-1596; 1597-1598; 1599-1600; 1601-1602; 1603-1604; 1605-1606; 1607-1608; 1609­ 1610; 1611-1612; 1613-1614; 1615-1616; 1617-1618; 1619-1620; 1621-1622; 1623-1624; 1625-1626; 1627-1628; 1629-1630; 1631-1632; 1633-1634; 1635-1636; 1637-1638; 1639-1640; 1641-1642; 1643-1644; 1645-1646; 1647­ 1648; 1649-1650; 1651-1652; 1653-1654; 1655-1656; 1657-1658; 1659-1660; 1661-1662; 1663-1664; 1665-1666; 1667-1668; 1669-1670; 1671-1672; 1673-1674; 1675-1676; 1677-1678; 1679-1680; 1681-1682; 1683-1684; 1685­ 1686; 1687-1688; 1689-1690; 1691-1692; 1693-1694; 1695-1696; 1697-1698; 1699-1700; 1701-1702; 1703-1704; 1705-1706; 1707-1708; 1709-1710; 1711-1712; 1713-1714; 1715-1716; 1717-1718; 1719-1720; 1721-1722; 1723­ 1724; 1725-1726; 1727-1728; 1729-1730; 1731-1732; 1733-1734; 1735-1736; 1737-1738; 1739-1740; 1741-1742; 1743-1744; 1745-1746; 1747-1748; 1749-1750; 1751-1752; 1753-1754; 1755-1756; 1757-1758; 1759-1760; 1761­ 1762; 1763-1764; 1765-1766; 1767-1768; 1769-1770; 1771-1772; 1773-1774; 1775-1776; 1777-1778; 1779-1780; 1781-1782; 1783-1784; 1785-1786; 1787-1788; 1789-1790; 1791-1792; 1793-1794; 1795-1796; 1797-1798; 1799­ 1800; 1801-1802; 1803-1804; 1805-1806; 1807-1808; 1809-1810; 1811-1812; 1813-1814; 1815-1816.
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende:
a) opcionalmente, pretratar ácidos nucleicos para eliminar el ADN genómico humano,
b) opcionalmente, preamplificar los ARNm virales, donde dichos ARNm virales comprenden ARNm oncogénicos y al menos otro ARNm,
c) secuenciar ARNm, o ADNc de los mismos, obtenidos después de los pasos a) y b), en la muestra de un sujeto humano,
d) identificar las lecturas correspondientes a dichos ARNm oncogénicos,
e) identificar a qué especies o genotipos pertenecen dichos ARNm oncogénicos del paso d),
f) clasificar las lecturas correspondientes a dicho al menos otro ARNm vírico, o ADNc de los mismos obtenidos después de las etapas a) y b), del mismo genotipo o especie identificada en la etapa e),
g) opcionalmente, identificar las transcripciones de fusión como una firma de eventos de integración de ADN vírico en el cromosoma del huésped y / u otros biomarcadores de células cancerosas humanas,
h) opcionalmente, eliminar todas las demás secuencias, incluidas las secuencias humanas que no sean secuencias identificadas y clasificadas siguiendo los pasos d), e), f) y g),
i) calcular las proporciones R que definen la abundancia molecular de dichos ARNm oncogénicos en relación con dicho al menos otro ARNm vírico del mismo genotipo o especie de la etapa f).
7. Un método para el diagnóstico o pronóstico del riesgo de desarrollar un cáncer inducido por VPH que comprende:
(a) determinar el nivel de al menos un primer marcador seleccionado entre los ARNm de E6 de los VPH del grupo alfa, los ARNm de E7 de los VPH del grupo alfa, o ambos, en la muestra de un paciente o en la muestra de un individuo sospechoso de estar infectado por el VPH, en el que dicho nivel en especies de VPH es selectivo,
(b) comparar los niveles determinados en el paso (a) con un valor de referencia de los ARNm de E6 de los VPH del grupo alfa, los ARNm de E7 de los VPH del grupo alfa, o ambos en individuos de bajo riesgo infectados por los VPH,
en el que un mayor nivel según se determina en el paso a) en comparación con el nivel de referencia en el paso b) es indicativo de un mayor riesgo de desarrollar cáncer inducido por VPH,
en el que el método comprende una etapa de amplificación con una composición de cebadores específica de VPH del grupo alfa como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-2.
8. El método según una de las reivindicaciones 6 y 7, en el que los ARNm de E6 o E7 de los VPH pertenecen a los VPH del género alfa, y en el que ello comprende la amplificación y / o secuenciación que cubre los VPH de al menos los grupos a5, 6, 7 y 10.
9. El método de la reivindicación 8, en el que la amplificación o determinación de los niveles de biomarcadores E6 y L1 comprende usar una composición de cebadores que comprende para E6: a5: SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45, y las tres SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 y SEQ ID NO: 48 y; a6: SEQ ID NO: 58 o ambas SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 60, y ambas SEQ ID NO: 61 y SEQ ID NO: 62 y; a7: las tres SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75 y SEQ ID NO: 76 o las tres SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75 y SEQ ID NO: 76, y las cinco SEQ ID NO: 77 , SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80 y SEQ ID NO: 81 y; a10: las tres SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117 y las cuatro SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121;
y que comprende para L1 a5: SEQ ID NO: 53 o ambas SEQ ID NO: 54 y SEQ ID NO: 55, y ambas SEQ ID NO: 56 y SEQ ID NO: 57; y a6: SEQ ID NO: 71 y SEQ ID NO: 72; y a7: SEQ ID NO: 87 y SEQ ID NO: 88, y SEQ ID NO: 89 y SEQ ID NO: 90; y a10: SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129 y SEQ ID NO: 130 o las cuatro SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134.
10. El método de la reivindicación 8, en el que la amplificación o determinación de los niveles de los biomarcadores E7 y L1 comprende usar una composición de cebadores que comprende para E7: a5: ambos SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 y ambos SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52; y a6: SEQ ID NO: 63 o SEQ ID NO: 64 o SEQ ID NO: 65 SEQ ID NO: 66 o ambas SEQ ID NO: 67 y SEQ ID NO: 68, y ambas SEQ ID NO: 69 y SEQ ID NO : 70; y a7: SEQ ID NO: 82 o ambas SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, y ambas SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86; y a10: las tres SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123 y SEQ ID NO: 124, y las tres SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126 y SEQ ID NO: 127; y a9: las tres SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106 y SEQ ID NO: 107, y las tres SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109 y 110; y a8: SEQ ID NO: 94, y SEQ ID NO: 95 y SEQ ID NO: 96; y a1: SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4; y a3: ambas SEQ ID NO: 28 y SEQ ID NO: 29, y las tres SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32; y a2: las tres SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14, y las tres SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 17; y a4: SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 39; y a11 SEQ ID NO: 137 y SEQ ID NO: 138; y a13: SEQ ID NO: 143 y SEQ ID NO: 144; y a14: SEQ ID NO: 149 y SEQ ID NO: 150;
y que comprende para L1 a5: SEQ ID NO: 53 o ambas SEQ ID NO: 54 y SEQ ID NO: 55, y ambas SEQ ID NO: 56 y SEQ ID NO: 57; y a6: SEQ ID NO: 71 y SEQ ID NO: 72; y a7: SEQ ID NO: 87 y SEQ ID NO: 88, y SEQ ID NO: 89 y SEQ ID NO: 90; y a10: SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129 y SEQ ID NO: 130 o las cuatro SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134; y a9: SEQ ID NO: 111 y SEQ ID NO: 112, y SEQ ID NO: 113 y SEQ ID NO: 114; y a8: SEQ ID NO: 97, y SEQ ID NO: 98 y SEQ ID NO: 99; y a1: SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6; y a3 SEQ ID NO: 33 y ambas SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 35; y a2 SEQ ID NO: 18, y SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20; y a4:
SEQ ID NO: 40 o SEQ ID NO: 41, y SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 43; y a11: SEQ ID NO: 139 y SEQ ID NO: 140; y a13 SEQ ID NO: 145 y SEQ ID NO: 146; y a14: SEQ ID NO: 151 y SEQ ID NO: 152.
11. El método de la reivindicación 8, en el que la amplificación o determinación de los niveles de biomarcadores E6 y L1 comprende usar una composición de cebadores que comprende para E6: a5: SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 45, y las tres SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 y SEQ ID NO: 48 y; a6: SEQ ID NO: 58 o ambas SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 60, y ambas SEQ ID NO: 61 y SEQ ID NO: 62 y; a7: las tres SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75 y SEQ ID NO: 76 o las tres SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75 y SEQ ID NO: 76, y las cinco SEQ ID NO: 77 , SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80 y SEQ ID NO: 81 y; a10: las tres SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117 y las cuatro SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121,
y que comprende para L1 a5: SEQ ID NO: 53 o ambas SEQ ID NO: 54 y SEQ ID NO: 55, y ambas SEQ ID NO: 56 y SEQ ID NO: 57; y a6: SEQ ID NO: 71 y SEQ ID NO: 72; y a7: SEQ ID NO: 87 y SEQ ID NO: 88, y SEQ ID NO: 89 y SEQ ID NO: 90; y a10: SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129 y SEQ ID NO: 130 o las cuatro SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134.
12. El método de una de las reivindicaciones 8 a 11, en el que la amplificación o determinación de los niveles de biomarcadores E6 y L1 comprende usar una composición de cebadores que comprende para E6: a5: SEQ ID NO:
44 y SEQ ID NO: 45, y los tres SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 y SEQ ID NO: 48 y; a6: SEQ ID NO: 58 o ambas SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 60, y ambas SEQ ID NO: 61 y SEQ ID NO: 62 y; a7: las tres SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75 y SEQ ID NO: 76 o las tres SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75 y SEQ ID NO: 76, y las cinco SEQ ID NO: 77 , SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80 y SEQ ID NO: 81 y; a10: las tres SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO:
116, SEQ ID NO: 117 y las cuatro SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121; y a9: SEQ ID NO: 100 y SEQ ID NO: 101 y las tres SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103 y SEQ ID NO: 104; y a8: SEQ ID NO: 91, y SEQ ID NO: 92 y SEQ ID NO: 93; y a1: SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2; y a3: las tres SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO:
22 y SEQ ID NO: 23, y las cuatro SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 27; y a2 y SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, y las tres SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11; y a4: SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 37; y a11: SEQ ID NO: 135 y SEQ ID NO: 136; y a13 SEQ ID NO: 141 y SEQ ID NO: 142; y a14: SEQ ID NO:
147 y SEQ ID NO: 148,
y que comprende para L1, a5: SEQ ID NO: 53 o ambas SEQ ID NO: 54 y SEQ ID NO: 55, y ambas SEQ ID NO: 56 y SEQ ID NO: 57; y a6: SEQ ID NO: 71 y SEQ ID NO: 72; y a7: SEQ ID NO: 87 y SEQ ID NO: 88, y SEQ ID NO: 89 y SEQ ID NO: 90; y a10: SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129 y SEQ ID NO: 130 o las cuatro SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134; y a9: SEQ ID NO: 111 y SEQ ID NO: 112, y SEQ ID NO: 113 y SEQ ID NO: 114; y a8: SEQ ID NO: 97, y SEQ ID NO: 98 y SEQ ID NO: 99; y a1: SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6; y a3 SEQ ID NO: 33 y ambas SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 35 y a2 SEQ ID NO: 18, y ambas SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO:
20; y a4: SEQ ID NO: 40 o SEQ ID NO: 41, y SEQ ID NO: 42 o SEQ ID NO: 43; y a11: SEQ ID NO: 139 y SEQ ID NO: 140; y a13 SEQ ID NO: 145 y SEQ ID NO: 146; y a14: SEQ ID NO: 151 y SEQ ID NO: 152.
13. Una composición de cebadores como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1,2, 4, 5 y 9 a 12.
14. Un kit para el diagnóstico o pronóstico del riesgo de desarrollar cáncer inducido por VPH que comprende:
a) una composición de cebadores según la reivindicación 13,
b) reactivos para detectar o secuenciar productos de amplificación.
15. Un kit para el diagnóstico o pronóstico del riesgo de desarrollar cáncer inducido por VPH que comprende:
a) una composición de cebadores para detectar al menos un primer marcador seleccionado de ARNm de E6 de VPH del grupo alfa, ARNm de E7 de VPH del grupo alfa, o ambos,
b) una composición de cebadores para detectar al menos un segundo marcador seleccionado entre los ARNm de L1 de los VPH del grupo alfa, los ARNm de L2 de los VPH del grupo alfa, o ambos,
donde dichos ARNm de E6, E7, L1 y L2 tienen secuencias intragenéticas correspondientes,
c) y, opcionalmente, cebadores o sondas para detectar al menos un marcador celular del huésped indicativo de neoplasia o cáncer,
en el que la composición de los cebadores es como se define en la reivindicación 1 o 2.
ES15753461T 2014-07-07 2015-07-07 Transcriptoma génico de amplio espectro del virus del papiloma y genotipo como biomarcadores de las etapas del cáncer asociadas al virus del papiloma Active ES2819206T3 (es)

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