ES2814290T3 - Inhibidores de IDH1 mutante - Google Patents

Abstract

Un compuesto de Fórmula I: **(Ver fórmula)** en la que: R1 es hidrógeno, NH2 o flúor; R2 y R3 son metilo o hidrógeno; o R2 es metilo, etilo, 1-hidroxietilo, 1-metoxietilo, fluorometilo, 1-fluoroetilo o 1-metiletilo, y R3 es hidrógeno; R4 es metilo o fluorometilo; R5 es hidrógeno, etilo o -CH2-ciclopropilo, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

DESCRIPCIÓN

Inhibidores de IDH1 muíante

La proteína isocitrato deshidrogenasa (IDH) es una enzima importante en el ciclo del ácido cítrico (ácido tricarboxílico o Krebs). El ciclo del ácido cítrico es centralmente importante para muchas vías bioquímicas y es uno de los primeros componentes establecidos del metabolismo celular.

Las isocitrato deshidrogenasas catalizan la descarboxilación oxidativa de isocitrato a a-cetoglutarato (2-oxoglutarato). Estas enzimas pertenecen a dos subclases distintas, una de las cuales utiliza nicotinamida adenina dinucleótido (NAD(+)) como aceptor de electrones y la otra nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADP(+)). Se han reportado cinco isocitrato deshidrogenasas: tres isocitrato deshidrogenasas dependientes de NAD(+), que se localizan en la matriz mitocondrial, y dos isocitrato deshidrogenasas dependientes de NADP(+), una de las cuales es mitocondrial y la otra predominantemente citosólica. Cada isoenzima dependiente de NADP(+) es un dímero. La proteína codificada por el gen IDH1 es la isocitrato deshidrogenasa dependiente de NADP(+) que se encuentra en el citoplasma y los peroxisomas. La enzima citoplasmática desempeña un papel importante en la producción de NADPh citoplasmático. IDH1 se expresa en una amplia gama de especies y en organismos que carecen de un ciclo completo de ácido cítrico.

Recientemente, se han encontrado mutaciones en IDH1, y la isoforma relacionada IDH2, en varios tipos de cánceres. Se encontró que las mutaciones se producen en aminoácidos específicos a lo largo de la secuencia de la proteína y se expresan de forma heterocigota, de acuerdo con una ganancia de función. Estas mutaciones ocurren en residuos funcionalmente conservados y los estudios bioquímicos de las formas mutantes de IDH1 demostraron una pérdida de la función normal de IDH1, la conversión reversible de isocitrato a a-cetoglutarato. El resultado de estas mutaciones es permitir una conversión nueva (o neomórfica) de a-cetoglutarato (aKG) a 2-hidroxiglutarato (2HG). Como resultado, las células cancerosas que albergan formas mutantes de IDH1 o IDH2 forman concentraciones sustancialmente más altas de 2HG. Los altos niveles de 2HG provocan un bloqueo en la diferenciación celular que puede revertirse mediante la inhibición de IDH1 o IDH2 mutante.

Ciertos inhibidores de IDH mutante se describen en los documentos de patente WO 2013/046136 y WO 2014/141153. La solicitud PCT/US2016/043264 divulga inhibidores covalentes de IDH1 mutante. Existe la necesidad de compuestos que inhiban selectivamente la enzima IDH1 mutante sobre la IDH1 de tipo salvaje para el tratamiento de diversos tipos de cáncer. Existe una necesidad adicional de compuestos que inhiban selectivamente la enzima IDH1 mutante que demuestre actividad neomórfica sobre la IDH1 de tipo salvaje para el tratamiento de diversos tipos de cáncer. La presente invención proporciona compuestos de Fórmula I que son inhibidores de IDH1 mutante. Los compuestos de Fórmula I son inhibidores covalentes que inhiben selectivamente IDH1 mutante sobre IDH1 de tipo salvaje y enzima IDH2 mutante sobre IDH2 de tipo salvaje.

Un aspecto de la invención es proporcionar compuestos inhibidores de la enzima IDH1 mutante de Fórmula I:

en la que:

R1 es hidrógeno, NH² o flúor;

R2 y R3 son metilo o hidrógeno; o R2 es metilo, etilo, 1-hidroxietilo, 1-metoxietilo, fluorometilo, 1 -fluoroetilo o 1-metiletilo, y R3 es hidrógeno;

R4 es metilo o fluorometilo;

R5 es hidrógeno, etilo o -CH²-ciclopropilo; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Un aspecto adicional de la presente invención proporciona un compuesto de Fórmula I, en la que:

R1 es hidrógeno, ⁶ -NH² o 6-fluoro;

R2 y R3 son metilo; o R2 es 1-metoxietilo, o 1-metiletilo, y R3 es hidrógeno;

R4 es metilo;

R5 es hidrógeno, etilo o -CH²-ciclopropilo; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Otro aspecto de la presente invención proporciona un compuesto seleccionado de:

(S)-3-(2-(((S)-1-(4-((4-acriloilpiperazin-1-il)metil)fenil)etil)amino)pirimidin-4-il)-4-isopropiloxazolidin-2-ona; (S)-3-(2-((1-(4-((4-acriloilpiperazin-1-il)metil)fenil)etil)amino)-6-fluoropirimidin-4-il)-4,4-dimetiloxazolidin-2-ona;

(R)-3-(2-(((S)-1-(4-((4-acriloilpiperazin-1-il)metil)fenil)etil)amino)pirimidin-4-il)-4-((R)-1-metoxietil)oxazolidin-2- ona; y

(R) -3-(2-(((S)-1-(4-((4-acriloilpiperazin-1-il)metil)fenil)etil)amino)-6-fluoropirimidin-4-il)-4-((R)-1-metoxi eti l )oxazol idin-2-ona,

o una sal farmacéuticamente aceptable de cada uno de los compuestos antes mencionados.

Un aspecto adicional de la presente invención proporciona un compuesto:

(S) -3-(2-((1-(4-((4-acriloilpiperazin-1-il)metil)fenil)etil)amino)-6-fluoropirimidin-4-il)-4,4-dimetiloxazolidin-2-ona;

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Un aspecto adicional de la presente invención proporciona un compuesto seleccionado de:

(4S)-3-[2-[[(1S)-1-[4-[2-Ciclopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]pirimidin-4-il]-4-isopropiloxazolidin-2-ona, isómero 1;

(4S)-3-[2-[[(1S)-1-[4-[2-Ciclopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]pirimidin-4-il]-4-isopropiloxazolidin-2-ona, isómero 2;

3- [2-[[(1S)-1-[4-[2-Ciclopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-6-fluoro-pirimidina-4-il]-4,4-dimetil-oxazolidin-2-ona, isómero 1;

3-[2-[[(1S)-1-[4-[2-Ciclopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-6-fluoro-pirimidina-4-il]-4,4-dimetil-oxazolidin-2-ona, isómero 2;

3-[6-Amino-2-[[(1S)-1-[4-[1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)propil]fenil]etil]amino]pirimidin-4-il]-4,4-dimetiloxazolidin-2-ona, isómero 1;

3-[6-Amino-2-[[(1S)-1-[4-[1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)propil]fenil]etil]amino]pirimidin-4-il]-4,4-dimetiloxazolidin-2-ona, isómero 2,

o una sal farmacéuticamente aceptable de cualquiera de los compuestos antes mencionados.

Otro aspecto de la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto inhibidor de IDH1 mutante de Fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Un aspecto adicional de la presente divulgación proporciona un procedimiento para tratar un cáncer que expresa IDH1 mutante que es glioma, glioblastoma, glioblastoma multiforme (GBM), astrocitoma, oligodendroglioma, paraganglioma, fibrosarcoma, linfoma angioinmunoblástico de células T (AITL), síndrome mielodisplásico (MDS), leucemia linfoblástica aguda de células B (B-ALL), cáncer de tiroides, cáncer colorrectal, leucemia mieloide aguda (AML), melanoma, cáncer de próstata, condrosarcoma o colangiocarcinoma en un paciente que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de Fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Otro aspecto de la presente divulgación proporciona un procedimiento para tratar un cáncer que expresa IDH1 mutante que es glioma, glioblastoma, glioblastoma multiforme, astrocitoma, oligodendroglioma, paraganglioma, fibrosarcoma o leucemia mieloide aguda, en un paciente que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de Fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Un aspecto adicional de la presente invención proporciona un compuesto de Fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso en terapia.

Otro aspecto de la presente invención proporciona un compuesto de Fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento de un cáncer que expresa IDH1 mutante que es glioma, glioblastoma, glioblastoma multiforme, astrocitoma, oligodendroglioma, paraganglioma, fibrosarcoma, linfoma angioinmunoblástico de células T (AITL), síndrome mielodisplásico (MDS), leucemia linfoblástica aguda de células B (B-ALL), cáncer de tiroides, cáncer colorrectal, leucemia mieloide aguda (AML), melanoma, cáncer de próstata, condrosarcoma o colangiocarcinoma.

Un aspecto adicional de la presente invención proporciona un compuesto de Fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento de un cáncer que expresa IDH1 mutante que es glioma, glioblastoma, glioblastoma multiforme, astrocitoma, oligodendroglioma, paraganglioma, fibrosarcoma o leucemia mieloide aguda

Otro aspecto de la presente invención proporciona el uso de un compuesto de Fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer que expresa IDH1 mutante que es glioma, glioblastoma, glioblastoma multiforme, astrocitoma, oligodendroglioma, paraganglioma, fibrosarcoma, linfoma angioinmunoblástico de células T (AITL), síndrome mielodisplásico (MDS), leucemia linfoblástica aguda de células B (B-ALL), cáncer de tiroides, cáncer colorrectal, leucemia mieloide aguda (AML), melanoma, cáncer de próstata, condrosarcoma o colangiocarcinoma.

Un aspecto adicional de la presente invención proporciona el uso de un compuesto de Fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer que expresa IDH1 mutante que es glioma, glioblastoma, glioblastoma multiforme, astrocitoma, oligodendroglioma, paraganglioma, fibrosarcoma o leucemia mieloide aguda.

El término "paciente" significa mamífero y "mamífero" incluye, pero no se limita a, un ser humano.

La expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" significa la dosificación del compuesto de Fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o una composición farmacéutica que contiene el compuesto, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, necesaria para inhibir la IDH1 mutante en un paciente con cáncer, que conduce a la liberación del bloqueo en diferenciación con la inhibición resultante del crecimiento de células tumorales y eliminar o retrasar o detener la progresión del cáncer en un paciente. Las dosis anticipadas de un compuesto de Fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, están en el intervalo de 20 mg/paciente/día a 2000 mg/paciente/día. Se anticipa que las dosis preferidas estén en el intervalo de 30 mg/paciente/día a 1800 mg/paciente/día. Se anticipa que las dosis más preferidas estén en el intervalo de 40 mg/paciente/día a 1600 mg/paciente/día. La dosis exacta requerida para tratar a un paciente y la duración del tiempo de tratamiento serán determinadas por un médico en vista de la etapa y la gravedad de la enfermedad, así como las necesidades específicas y la respuesta del paciente individual. Aunque se expresa como dosificación por día, la administración de la dosificación puede ajustarse para proporcionar un beneficio terapéutico más óptimo para un paciente y para controlar o mejorar cualquier toxicidad relacionada con el fármaco. Además de la dosificación diaria, puede ser apropiada una dosificación dos veces al día (B.I.D.), tres veces al día (T.I.D.), dosificación cada dos días (Q2D); cada dos días durante un período de cinco días seguido de dos días sin dosificación (T.I.W.); o cada tercer día (Q3D).

Los términos "tratamiento", "tratar" y "en tratamiento" pretenden incluir el espectro completo de intervención para el cáncer que padece el paciente, tal como la administración del compuesto activo para aliviar, retrasar o revertir uno o más de los síntomas y retrasar la progresión del cáncer incluso si el cáncer no se elimina realmente.

Un compuesto de Fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, se formula preferentemente como una composición farmacéutica usando un vehículo farmacéuticamente aceptable y administrado por una variedad de vías. Preferentemente, tales composiciones son para administración oral. Dichas composiciones farmacéuticas y procedimientos para su prepracación son bien conocidos en la técnica. Consulte, por ejemplo, REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY (LA CIENCIA Y LA PRÁCTICA DE LAS CIENCIAS FARMACÉUTICAS), L.V. Allen, Editor, 22a Edición, Pharmaceutical Press, 2012. En una realización particular, la composición farmacéutica comprende (S)-3-(2-((1-(4-((4-acriloilpiperazin-1-il)metil)fenil)etil)amino)-6-fluoropirimidin-4-il)-4,4-dimetiloxazolidin-2-ona o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable y opcionalmente otros ingredientes terapéuticos particularmente para el tratamiento del cáncer en general o un tipo de cáncer específico.

Un compuesto de Fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable, puede administrarse simultáneamente con, o antes, o después, uno o más de otros agentes terapéuticos. El compuesto de fórmula I o una sal farmacéuticamente aceptable, cuando se administra con uno o más agentes terapéuticos diferentes, se puede administrar por separado, por la misma o diferente vía de administración, o juntos en la misma composición farmacéutica que el otro agente o agentes terapéuticos. Cuando se administran uno o más agentes terapéuticos adicionales, la administración de cada agente terapéutico puede ser simultánea, separada o secuencial.

Un compuesto de Fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, se puede preparar mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica, así como los descritos a continuación. Las etapas sintéticas específicas se pueden combinar en un orden diferente para preparar un compuesto de Fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Los compuestos de Fórmula I se denominan de acuerdo con IUPAC, y también se pueden nombrar de acuerdo con CAS, y se pueden usar otras convenciones de denominación para identificar inequívocamente un compuesto de Fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Se entenderá que un compuesto de Fórmula I puede tener hasta cuatro centros quirales, incluyendo los átomos de carbono que llevan los sustituyentes R4, R5 y R2, así como una posibilidad adicional dentro de los grupos R2 definidos dan lugar a múltiples estereoisómeros. Debe entenderse que uno o más de los compuestos pueden tener una, dos, tres o cuatro de las estructuras estereoisómeras y cada isómero confirmado. Un compuesto particular dentro de la Fórmula I puede representarse como un estereoisómero sustancialmente enantioméricamente puro que tiene la configuración mostrada. Para los compuestos de Fórmula I que tienen una configuración con todos los estereocentros mostrados, "sustancialmente enantioméricamente puro" significa que la pureza isomérica es superior al 90% de exceso enantiomérico. En otra realización, un compuesto de pureza isomérica de Fórmula I es superior al 95% de exceso enantiomérico en el átomo de carbono que lleva R4 y/o R5. En otra realización adicional, un compuesto de pureza isomérica de Fórmula I es superior al 98% de exceso enantiomérico en el átomo de carbono que lleva R4 y/o R5. En otra realización adicional, un compuesto de pureza isomérica de Fórmula I es superior al 99% de exceso enantiomérico en el átomo de carbono que lleva R4 y/o R5. Todos los estereoisómeros, individualmente e incluyendo mezclas diastereoméricas de los compuestos de Fórmula I, se contemplan dentro del alcance de la presente invención.

Como se usa en la presente memoria, las referencias a un solo estereoisómero pretenden incluir también mezclas estereoisoméricas que incluyen el compuesto de Fórmula I denominado o representado. En la presente memoria, las designaciones de Cahn-Ingold-Prelog de (R)- y (S)- pueden ser utilizadas para referirse a estereoisómeros específicos. Los estereoisómeros específicos se pueden preparar mediante síntesis estereoespecífica utilizando materiales de partida enantioméricamente puros o enriquecidos. Los estereoisómeros específicos de materiales de partida, intermedios o mezclas racémicas que incluyen compuestos de Fórmula I pueden resolverse mediante técnicas bien conocidas en la técnica, como las que se encuentran en STEREOCHEMISTRY OF ORGANIC COMPOUNDS (ESTEREOQUÍMICA DE COMPUESTOS ORGÁNICOS), E. I. Eliel y S. H. Wilen (Wiley 1994) y ENANTIOMERS, RACEMATES AND RESOLUTIONS (ENANTIÓMEROS, RACEMATOS Y RESOLUCIONES), J., Jacques, A. Collet y S. H. Wilen (Wiley 1991), incluyendo la cromatografía en fases estacionarias quirales, resoluciones enzimáticas o cristalización fraccionada o cromatografía de diastereómeros formados para ese fin, como las sales diastereoméricas. Las designaciones "isómero 1" e "isómero 2" se refieren a los compuestos que se eluyen de la primera y segunda cromatografía quiral, respectivamente, y si la cromatografía quiral se inicia temprano en la síntesis, la misma designación se aplica a intermedios y ejemplos posteriores. El enlace

representado como se refiere a una mezcla isomérica.

Los compuestos empleados como materiales de partida iniciales en la síntesis de los compuestos de Fórmula I son bien conocidos y, en la medida en que no estén disponibles comercialmente, se pueden sintetizar fácilmente utilizando referencias específicas proporcionadas, mediante procedimientos estándar comúnmente empleados por los expertos en la técnica, o se encuentran en textos de referencia general.

Los ejemplos de procedimientos y métodos conocidos incluyen los descritos en textos de referencia generales tales como COMPREHENSIVE ORGANIC TRANSFORMATIONS (TRANSFORMACIONES ORGÁNICAS INTEGRALES), VCH Publishers Inc, 1989; COMPENDIUM OF ORGANIC SYNTHETIC METHODS (COMPENDIO DE MÉTODOS SINTÉTICOS ORGÁNICOS), Volúmenes 1-10, 1974-2002, Wiley Interscience; MARCH'S ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY: REACTIONS, MECHANISMS, AND STRUCTURE (QUÍMICA ORGÁNICA AVANZADA DE MARCH: REACCIONES, MECANISMOS Y ESTRUCTURA), 5a Edición, Michael B. Smith y Jerry March, Wiley Interscience, 2001; ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY (QUÍMICA ORGÁNICA AVANZADA), 4ta Edición, Parte B, Reacciones y Síntesis, Francis A. Carey y Richard J. Sundberg, Kluwer Academic/Plenum Publishers, 2000, etc., y LAS referencias citadas en los mismos.

Ciertos centros estereoquímicos pueden dejarse sin especificar en los siguientes esquemas en aras de la claridad y no están destinados a limitar la enseñanza de los esquemas de ninguna manera. Los isómeros, enantiómeros y diastereómeros individuales pueden ser separados o resueltos por un experto en la técnica en cualquier punto conveniente en la síntesis de compuestos de la invención, por procedimientos tales como técnicas de cristalización selectiva o cromatografía quiral.

Ciertas abreviaturas se definen de la siguiente manera: "ACN" se refiere a acetonitrilo; "aKG" se refiere a alfacetoglutarato o 2-cetoglutarato; "BCA" se refiere a ácido bicinconínico; "Boc" se refiere a ferc-butoxicarbonilo; "BSA" se refiere a la albúmina de suero bovino; "CBZ" se refiere a carbobenciloxi; "CDI" se refiere a 1,1'-carbonildiimidazol o di(imidazol-1-il)metanona; "DCC" se refiere a 1,3-diciclohexilcarbodiimida; "1,2-DCE" se refiere a 1,2-dicloroetano; "DIC" se refiere a diisopropilcarbodiimida; "DIPEA" se refiere a diisopropiletilamina o N-etil-N-isopropil-propan-2-amina; "DMAP" se refiere a dimetilaminopiridina; "DME" se refiere a dimetoxietano; "DMEA" se refiere a dimetiletilamina; "DMF" se refiere a dimetilformamida; "DMSO" se refiere a dimetilsulfóxido; "DTT" se refiere a ditiotreitol; "DPPF" se refiere a 1,1 '-ferrocenodiil-bis(difenilfosfino); "EDC" se refiere a EDAC, EDCI o clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida; "EDTA" se refiere a ácido etilendiaminotetraacético; "ee" se refiere al exceso enantiomérico; "EGTA" se refiere a ácido etilenglicol tetraacético; "EtOAc" se refiere a acetato de etilo; "EtOH" se refiere a etanol o alcohol etílico; "Et²O" se refiere a éter dietílico; "Ex" se refiere a un ejemplo; "HATU" se refiere a hexafluorofosfato de (dimetilamino)-N,N-dimetil(3H-[1,2,3]triazolo [4,5-ó]piridin-3 iloxi)metaniminio; "HBTU" se refiere a hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio; "2HG" se refiere a 2-hidroxiglutarato; "d5-3HG" se refiere al ácido 3-hidroxi-1,5-pentanodioico-2,2,3,4,4-ds; "HILIC" se refiere a cromatografía líquida de interacción hidrofílica; "HOAt" se refiere a 1-hidroxi-7-azobenzotriazol; "HOBt" se refiere a hidrato de 1-hidroxilbenzotriazol; "HPLC" se refiere a cromatografía líquida de alto rendimiento; "IC⁵⁰" se refiere a la concentración de un agente que produce el 50% de la respuesta inhibitoria máxima posible para ese agente; "IPAm" se refiere a isopropilamina; "mCPBA" se refiere a ácido mefa-cloroperbenzoico; "MeOH" se refiere a metanol o alcohol metílico; "NADP+ y NAHPH" se refieren a las formas oxidadas y reducidas de nicotinamida adenina dinucleótido fosfato respectivamente; "OAc" se refiere a acetato; "PG" se refiere a grupo protector; "Ph" se refiere a fenilo; "Prep" se refiere a preparación; "PyBOP" se refiere a hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxitripirrolidino-fosfonio; "PyBrop" se refiere a fosfato de bromo-tris-pirrolidino-fosfoniohexafluoro; "rpm" se refiere a revoluciones por minuto; "Rf' se refiere al tiempo de retención; "SCX" se refiere al intercambio catiónico fuerte; "SFC" se refiere a la cromatografía de fluidos supercríticos; "SNAr" se refiere a la sustitución aromática nucleofílica; "TEA" se refiere a trietilamina; "TFA" se refiere a ácido trifluoroacético; "THF" se refiere a tetrahidrofurano; y "Tris" se refiere a tris(hidroximetil)aminometano.

Los compuestos de la presente invención, o las sales de los mismos, se pueden preparar mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica, algunos de los cuales se ilustran en los Esquemas, Preparaciones y Ejemplos a continuación. Las etapas sintéticas específicas para cada una de las vías descritas pueden combinarse de diferentes maneras, o junto con etapas de diferentes esquemas, para preparar compuestos de la invención, o sales de los mismos. Los productos de cada etapa en los esquemas a continuación pueden recuperarse mediante procedimientos convencionales bien conocidos en la técnica, que incluyen extracción, evaporación, precipitación, cromatografía, filtración, trituración y cristalización. En los esquemas a continuación, todos los sustituyentes, a menos que se indique lo contrario, son tal como se definieron previamente. Los reactivos y materiales de partida están fácilmente disponibles para un experto en la técnica. A menos que se defina lo contrario, R1, R2, R3, R4 y R5 son tal como se definen para la Fórmula I.

X = halógeno o grupo saliente

En el Esquema 1, Etapa A, una pirimidina-4-aminoetanol 2-sustituida (1) se cicla a una pirimidina sustituida 2-oxazolidin-2-ona (3) usando una base orgánica tal como trietilamina y di(imidazol-1-il)metanona en un solvente tal como THF. X en la pirimidina puede ser un halógeno u otro grupo saliente tal como metil sulfonilo. Alternativamente, para el compuesto (2), el halo se puede desplazar con la amina de una oxazolidin-2-ona sustituida en una reacción SNAr para proporcionar el compuesto (3), el producto de la Etapa B.

Esquema 2

En el Esquema 2, el compuesto (4) se puede preparar mediante una variedad de procedimientos conocidos por un experto en la técnica. Por ejemplo, una aminación reductora de un 4-(1-aminoetil)benzaldehído sustituido y una piperazina puede dar el compuesto (4). Alternativamente, el desplazamiento de un haluro de una 4-[1-(halometil)fenil]etanamina con una piperazina en condiciones de alquilación también puede dar como resultado el compuesto (4). En la subetapa 1, Etapa C, la amina protegida del compuesto (4) puede desprotegerse. Por ejemplo, la 1 -feniletilamina puede desprotegerse en condiciones de desprotección estándar usando condiciones alcalinas tales como exposición a hidróxido de sodio acuoso en un solvente tal como EtOH para dar el producto de amina libre de la subetapa 1, Etapa C. Alternativamente, si el grupo protector es un grupo carboxibencilo, las condiciones de hidrogenolisis tales como el uso de Pd/C al 10% en un solvente tal como EtOH en una atmósfera de hidrógeno pueden proporcionar el producto desprotegido de la Etapa C, subetapa 1. La amina desprotegida del compuesto (4) puede alquilarse en la subetapa 2, Etapa C con una pirimidina sustituida con 2,4,6-trifluoro en una reacción SNAr con un solvente tal como Et²O a una temperatura de aproximadamente -50 a -20 °C para dar el compuesto (5), el producto de la subetapa 2, Etapa C. Se puede completar una segunda arilación de SNAr en el 4-halógeno o pirimidina sustituida con 4, [5 o 6]-dihalógeno para desplazar el 4-halógeno con el nitrógeno de la oxazolidina-2-ona sustituida utilizando una base como hidruro de sodio en un solvente tal como DMF a una temperatura de aproximadamente 0 °C para dar el compuesto (6), el producto de la Etapa D.

En una vía alternativa, en la subetapa 1, Etapa E, el compuesto (4) puede desprotegerse como se describe en la sibetapa 1, Etapa C y luego alquilarse en una reacción SNAr en la subetapa 2, Etapa E. Por ejemplo, después de la desprotección, El producto de la subetapa 1, Etapa E, puede arilarse con una pirimidina-6-ona 2-sustituida donde la posición 2 es un grupo saliente como metilsulfanilo en un solvente como DME a una temperatura de aproximadamente 120 °C en condiciones de microondas. para dar el compuesto (7), el producto de la subetapa 2, Etapa E. La pirimidona (7) se puede halogenar usando una resina de trifenilfosfina en un solvente tal como 1,2-DCE con tetracloruro de carbono y calentando a aproximadamente 70 °C para dar compuesto (5), el producto de la Etapa F. El Compuesto (5) puede entonces continuarse de la misma manera que se describió anteriormente para la Etapa D para dar al compuesto (6).

Esquema 3

Como alternativa, en el Esquema 3, subetapa 1, Etapa G, el compuesto de 1 -feniletilamina (4) puede desprotegerse como se describe en el Esquema 2, subetapa 1, Etapa C para dar el producto desprotegido de la etapa G, subetapa 1. La 1 -feniletilamina se puede hacer reaccionar con el compuesto (3), el producto del Esquema 1, Etapa A o B en una reacción SNAr usando una base orgánica como DIPEA, fluoruro de cesio para acelerar la reacción, en un solvente como DMSO, y a una temperatura de aproximadamente 70-100 °C para dar al compuesto (6) el producto de la subetapa 2, Etapa G, el producto análogo del Esquema 2, Etapa D. Para aquellos compuestos de Fórmula I en la que R1 es un -NH² sustituyente, la piperazina protegida (6) del Esquema 2, Etapa D, o el Esquema 3, Etapa G, se alquila con amina (amino-deshalohalogenación) haciendo reaccionar una 5- o 6-fluorpirimidina con hidróxido de amonio en una solución de DMSO en un recipiente a presión con calentamiento durante la noche. La piperazina protegida (6) se puede desproteger con procedimientos de desprotección ácidos como HCl en dioxano y MeOH o TFA en CH²Cl² para dar la piperazina desprotegida de la subetapa 1, Etapa H. Si el grupo R2 o R3 de la oxazolidinona está protegida con un grupo ácido lábil como el O-f-butilo, la desprotección de este grupo se puede lograr junto con la desprotección de la piperazina en la misma operación. En la subetapa 2, Etapa H, la piperazina amina se puede acilar con cloruro de acriloilo a una temperatura de -78 a 0 °C con o sin una base orgánica como la trietilamina en un solvente como CH²Cl² para dar compuestos de Fórmula I. Los expertos en la técnica sabrían que se puede lograr un acoplamiento de amida con ácido acrílico y la amina apropiada en un solvente tal como DMF con un reactivo de acoplamiento tal como EDC y un aditivo tal como HOBt. Los expertos en la técnica también reconocerán que hay una serie de procedimientos y reactivos para la formación de amidas que resultan de la reacción de ácidos carboxílicos y aminas. Por ejemplo, la reacción de la amina y el ácido acrílico apropiados en presencia de un reactivo de acoplamiento con o sin una base orgánica como DIPEa o TEA puede proporcionar un compuesto de Fórmula I. Otros reactivos de acoplamiento incluyen carbodiimidas, como DCC, DIC, o un carbonildiimidazol como el CDI. Otros aditivos de acoplamiento de amida, como HOAt también se pueden usar para mejorar la reacción. Además, se podrían usar sales de uronio o fosfonio de aniones no nucleófilos, como HBTU, HATU, PyBOP y PyBrOP en lugar de los reactivos de acoplamiento más tradicionales. También se puede usar un aditivo como DMAP para acelerar la reacción de amidación deseada y dar compuestos de Fórmula I.

Un compuesto de Fórmula I es capaz de reaccionar con varios ácidos inorgánicos y orgánicos para formar una sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable. En una etapa opcional, se puede formar una sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto de Fórmula I por reacción de una base libre apropiada de Fórmula I con un ácido farmacéuticamente aceptable apropiado en un solvente adecuado en condiciones estándar. Además, la formación de tales sales puede ocurrir simultáneamente tras la desprotección de un grupo protector de nitrógeno. La formación de tales sales es bien conocida y apreciada en la técnica. Consulte, por ejemplo, P. Stahl, et al., Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use (Manual de Sales Farmacéuticas: Propiedades, Selección y Uso), (VCHA/Wiley-VCH, 2002); P. L. Gould, "Salt selection for basic drugs (Selección de sales para fármacos básicos)", International Journal of Pharmaceutics, 33: 201-217 (1986); R. J. Bastin, et al. "Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities (Procedimientos de selección y optimización de sales para nuevas entidades químicas farmacéuticas)", "Organic Process Research and Development (Investigación y desarrollo de procedimientos orgánicos), 4:427-435 (2000); y S. M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts (Sales farmacéuticas)", Journal of Pharmaceutical Sciences, 66:1-19, (1977). Un experto en la técnica apreciará que un compuesto de Fórmula I se convierte fácilmente y puede aislarse como una sal farmacéuticamente aceptable.

Preparación 1

Clorhidrato de (1S)-1-[4-(clorometil)fenil]etanamina

A una solución de (S)-(4-(1-aminoetil)fenil)metanol (81,8 g, 541 mmol) en CH²Cl² (2,5 l) se agregó SOCl² (80 ml, 1,1 mmol) gota a gota durante 30 minutos mientras se mantenía una temperatura de reacción por debajo de 25 °C. Después de agitar durante 4 horas, la mezcla se concentró para dar un sólido amarillo. Se agregó ACN (1 l), la mezcla se concentró a 500 ml y el sólido resultante se filtró para dar un sólido blanquecino que se secó al vacío para dar un primer lote del compuesto titulado. El licor madre también se pueden concentrar para proporcionar un producto menos puro (~20 g) como un sólido amarillo. Los dos lotes de productos se combinaron para dar el compuesto titulado (111 g, 78%). MS (m/z): 170 (M+H).

Preparación 2

ferc-Butil 4-[[4-[(1S)-1-[(2,2,2-trifluoroacetil)amino]etil]fenil]-metil]-piperazina-1-carboxilato

A una solución de clorhidrato de (1S)-1-[4-(clorometil)fenil]etanamina (10 g, 48,5 mmol) en CH²Cl² (160 ml) se agregó anhídrido trifluoroacético (8,2 ml, 58 mmol) a 0 °C. Se agregó TEA (15 ml, 108 mmol) mientras se mantenía la temperatura de adición por debajo de 5 °C. Después de agitar durante 1 hora a 0 °C, la mezcla de reacción se concentró a sequedad y se agregó ACN (120 ml) seguido de ferc-butil piperazina-1-il carbonato (13,5 g, 72,5 mmol). Se agregó K²CO³ (20 g, 144,7 mmol) y la mezcla se calentó a 60 °C y se agitó durante 17 horas. El solvente se eliminó al vacío y se agregó EtOAc (1 l) para dar un sólido. El sólido se eliminó por filtración y la solución de EtOAc se lavó con agua y salmuera. La fase orgánica se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró a sequedad para dar un residuo que se purificó por cromatografía en gel de sílice (acetona al 10% -50%/CH2Cb) para dar el compuesto titulado como una espuma blanca (15,8 g, 78%). MS (m/z): 416 (M+H).

Preparación 3

2,2,2-Trifluoro-N-[(1S)-1-[4-(hidroximetil)fenil]etil]acetamida

Se agregó anhídrido trifluoroacético (12 ml, 85,4 mmol) a una solución a 0 °C de [4-[(1S)-1-aminoetil]fenil]metanol (10,8 g, 71,4 mmol) en CH²Cl² (150 ml). Después de 10 minutos, se agregó TEA (24 ml, 172 mmol) en CH²Cl² (8 ml) gota a gota durante 30 minutos, el baño de enfriamiento se retiró y la reacción se agitó durante la noche. La mezcla de reacción se concentró al vacío, se diluyó con CH²Cl² adicional y se lavó con HCl acuoso 1 N y agua. La fase orgánica se secó (Na2SO4), se filtró y se concentró. El material bruto se purificó por cromatografía en gel de sílice eluyendo con un gradiente de 0-50% de EtOAc/hexanos para dar el compuesto titulado como un sólido blanco (11,1 g, 44,9 mmol, 63%). ES/MS (m/z): 246 (M-H).

Preparación 4

(S)-2,2,2-Trifluoro-N-(1-(4-formilfenil)etil)acetamida

Se agregó periodinano de Dess-Martin (20,9 g, 49,3 mmol) a una solución a 0 °C de 2,2,2-trifluoro-N-[(1S)-1-[4-(hidroximetil)fenil]etil]acetamida (11,1 g, 44,9 mmol) en CH²Cl² (450 ml). La mezcla de reacción se agitó durante la noche y se dejó calentar a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se diluyó con CH²Cl² adicional y se lavó con NaHCO3 acuoso saturado, Na2S2O3 acuoso saturado y salmuera. Los orgánicos combinados se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron para dar un residuo que se purificó por cromatografía en gel de sílice eluyendo con un gradiente de 0-50% de EtOAc/hexanos para dar el compuesto titulado como un sólido blanco (9,5 g, 39 mmol, 86%). ES/MS (m/z): 244 (M-H).

Preparación 5

2,2,2-Trifluoro-N-((1S)-1-(4-(1-hidroxipropil)fenil)etil)acetamida

Se agregó bromuro de etilmagnesio (12,23 ml, 36,7 mmol, 3 M en Et²O) durante 15 minutos a una solución de(s)-2,2,2-trifluoro-N-(1-(4-formilfenil)etil)acetamida (4,5 g, 18,35 mmol) en THF (100 ml) a 0 °C. Después de 45 minutos, la mezcla de reacción se apagó mediante la adición de NH4Cl acuoso saturado y se repartió entre EtOAc y agua. La capa orgánica se separó y se lavó con salmuera, se secó (Na2SO4), se filtró y se concentró para dar el compuesto titulado como un sólido blanco ceroso (5,74 g, 19 mmol, 91% de pureza) que se usó sin purificación adicional. ES/MS (m/z): 274 (M-H).

Preparación 6

N-((1S)-1-(4-(1-cloropropil)fenil)etil)-2,2,2-trifluoroacetamida

Se añadió cloruro de tionilo (4,63 ml, 63,6 mmol) gota a gota a una solución de 2,2,2-trifluoro-N-((1S)-1-(4-(1-hidroxipropil)fenil)etil)acetamida (5 g, 18,2 mmol) en CH²Cl² (150 ml) a 0 °C. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla se concentró para dar el compuesto titulado como un sólido beige (5,33 g, 18,2 mmol, 100%) que se usa sin purificación adicional. ES/MS (m/z): 292 (M-H).

Preparación 7

W-[(1S)-1-[4-(2-ciclopropilacetil)fenil]etil]-2,2,2-trifluoro-acetamida

Se añadió n-butil litio (2,5 M en hexanos, 53 ml, 130 mmol) gota a gota a una solución de N-[(1S)-1-(4-bromofenil)etil]-2,2,2-trifluoro-acetamida (18,00 g, 60,79 mmol) en THF (600 ml) a -78 °C para mantener una temperatura interna por debajo de -70 °C. Una vez completada la adición, la mezcla se agitó durante 45 minutos a -78 °C y se agregó 2-ciclopropil-W-metoxi-W-metil-acetamida (11,4 g, 79,6 mmol) como una solución en THF (10 ml). La mezcla se agitó a -78 °C durante 45 minutos, se agregó cloruro de amonio acuoso saturado y la mezcla se calentó a temperatura ambiente. Las capas se separaron y la capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró y se concentró a presión reducida. Al sólido se le agregó una pequeña cantidad de CH²Cl² y la mezcla se calentó brevemente para disolver los sólidos. La mezcla se concentró hasta justo antes de la precipitación y luego se añadieron hexanos (150 ml) gota a gota con agitación vigorosa para dar un sólido incoloro. El sólido se recogió por filtración, se lavó con una pequeña cantidad de hexanos y se secó a presión reducida para dar el compuesto titulado (13,82 g, 76%) como un sólido incoloro. MS (m/z): 298,3 (M-H).

Preparación 8

Bencil (1-(4-bromofenil)-2-fluoroetil)carbamato

Se agregó carbonato de sodio (17 g, 160,3 mmol) a una mezcla de solvente bifásico de agua (115 ml) y CH²Cl² (60 ml) que contenía 1-(4-bromofenil)-2-fluoro-etanamina (10 g, 45,9 mmol) a temperatura ambiente. La mezcla se enfrió a 0 °C y se agregó gota a gota cloroformiato de bencilo (8,45 ml, 57,3 mmol). Después de agitar durante 2 horas a 0 °C, la mezcla de reacción se dejó agitar durante la noche a temperatura ambiente y luego se diluyó con CH²Cl² y se lavó con NaHCO3 acuoso saturado, agua y salmuera. La fase orgánica se secó (Na2SO4), se filtró, se concentró y se disolvió en una cantidad mínima de EtOAc. Se añadieron hexanos hasta que se observó un precipitado y los sólidos se filtraron y se lavaron con hexanos adicionales. El compuesto titulado se obtuvo como un sólido beige (12 g, 34,1 mmol, 74%). ES/MS (m/z): 352 (M+H).

Preparación 9

Metil 4-(1-(((benciloxi)carbonil)amino)-2-fluoroetil)benzoato

A un autoclave Parr se agregó Pd(OAc)² (774 mg, 3.28 mmol), DPPF (2,3 g, 4 mmol), bencil (1-(4-bromofenil)-2-fluoroetil)carbamato (12 g, 34,1 mmol), MeOH (120 ml), CH³CN (180 ml) y TEA (12 ml). El recipiente se selló, purgó y presurizó con gas CO (100 psi). La reacción se agitó a 85 °C durante 24 horas y luego se dejó enfriar a temperatura ambiente. El reactor Parr se ventiló y la mezcla de reacción se concentró. El producto deseado se purificó por cromatografía en gel de sílice eluyendo con 50% de EtOAc/hexanos seguido de precipitación a partir de un mínimo de EtOAc y adición lenta de hexanos. El compuesto titulado se obtuvo como un sólido naranja (9,5 g, 29 mmol, 84%). ES/MS (m/z): 332 (M+H).

Preparación 10

Ácido 4-(1-(((benciloxi)carbonil)amino)-2-fluoroetil)benzoico

Se añadió MeOH (80 ml) e hidróxido de sodio acuoso 2 N (80 ml, 160 mmol) a una solución de 4-(1-(((benciloxi)carbonil)amino)-2-fluoroetil)benzoato de metilo (9,5 g, 29 mmol) en THF (160 ml) a temperatura ambiente. Después de agitar durante la noche, la mezcla de reacción se acidificó con HCl acuoso 6 N a un pH de 4. La mezcla se extrajo con CH²Cl² , se secó (Na2SO4), se filtró y se concentró para dar el producto titulado como un sólido beige (9,2 g, 29 mmol, 100%), que se usa sin purificación adicional. ES/MS (m/z): 316 (M-H).

Preparación 11

Bencil (2-fluoro-1-(4-(hidroximetil)fenil)etil)carbamato

Se añadió sulfato de dimetil borano (51 ml, 102 mmol, 2 N en THF) gota a gota a una solución de ácido 4-(1-(((benciloxi)carbonil)amino)-2-fluoroetil)benzoico (9,2 g, 29 mmol) en THF (150 ml) a 0 °C. La reacción se calentó a 70 °C durante 2,5 horas. Después de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se apagó mediante la adición gota a gota de MeOH hasta que no se observó más desprendimiento de gas. La mezcla de reacción se concentró, se redisuelvió en MeOH y se concentró nuevamente. Esta adición/concentración de MeOH se repitió dos veces para dar el compuesto titulado como un aceite amarillo-marrón (6,65 g, 21,9 mmol, 76%) y se usó sin purificación adicional. ES/Ms (m/z): 304 (M+H).

Preparación 12

(4-(1-Amino-2-fluoroetil)fenil)metanol

Una solución de bencil (2-fluoro-1-(4-(hidroximetil)fenil)etil)carbamato (6,65 g, 21,9 mmol) en EtOH (200 ml) se agregó a 10% en peso de paladio sobre carbono (2,33 g, 2,19 mmol) suspendido en EtOH (200 ml). Después de purgar la solución con N² y llenar con H² , se agregó una entrada de H² (globo) y se dejó agitar la reacción durante la noche a temperatura ambiente. La solución se filtró a través de tierra de diatomeas. Se agregó 10% en peso adicional de paladio sobre carbono (2,33 g, 2,19 mmol) al filtrado y la mezcla de reacción se agitó durante 6 horas adicionales bajo un globo de H². La solución se filtró sobre tierra de diatomeas y el filtrado se concentró a sequedad para dar el compuesto titulado como un sólido gris (3,9 g, 16 mmol, 70% de pureza) y se usó sin purificación adicional. ES/MS (m/z): 170 (M+H).

Preparación 13

Clorhidrato de 1-(4-(clorometil)fenil)-2-fluoroetan-1-amina

Se agregó cloruro de tionilo (4,7 ml, 65 mmol) a una solución de (4-(1-amino-2-fluoroetil)fenil)metanol (3,9 g, 16 mmol, 70% de pureza) en CH²Cl² (80 ml) a 0 °C. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. Los sólidos se filtraron y se lavaron con Et²O y luego se recogieron en agua y se extrajeron con CH²Cl² , se diluyeron adicionalmente con MeOH y se concentraron para dar un residuo que se purificó por cromatografía de fase inversa eluyendo con 10-100% de CH³CN/H²O para dar el compuesto titulado como un sólido blanco (2,4 g, 11 mmol, 66%). ES/MS (m/z): 188 (M+H).

Preparación 14

4-(4-(1-amino-2-fluoroetil)bencil)piperazina-1-carboxilato de ferc-butilo

Se agregó carbonato de potasio (5,9 g, 43 mmol) a una solución de clorhidrato de 1-(4-(clorometil)fenil)-2-fluoroetano-1-amina (2,4 g, 11 mmol) y ferc-butil piperazina-1-carboxilato (4 g, 21,5 mmol) en ACN (50 ml) a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó a 60 °C durante 24 horas, se enfrió a temperatura ambiente y se concentró. La reacción cruda se suspendió en CH²Cl² y se lavó con NaHCO³ acuoso saturado y salmuera. La fase orgánica se secó (Na²SO⁴), se filtró y se concentró para dar un residuo que se purificó por cromatografía de fase inversa eluyendo con CH³CN al ¹⁰ - ^{10 0} %/bicarbonato de amonio acuoso para dar el compuesto titulado como un aceite amarillo (2,47 g, 7,32 mmol, ^{6 8} %). ES/MS (m/z): 338 (M+H).

Preparación 15

ferc-Butil 4-[[4-[(1S)-1-aminoetil]fenil]metil]piperazina-1-carboxilato

A una solución de ferc-butil 4-[[4-[(1S)-1-[(2,2,2-trifluoroacetil)amino]etil]fenil]-metil]-piperazina-1-carboxilato (203 g, 0,489 mol) en EtOH (2,4 l) se agregó NaOH acuoso 5 M (480 ml, 2,40 mol) a temperatura ambiente. Después de agitar a temperatura ambiente durante 3,5 horas, la mezcla de reacción se concentró para eliminar la mayor parte del EtOH. Se agregó EtOAc (2 l) para disolver el residuo y la solución orgánica se lavó con agua y salmuera. Las fases acuosas combinadas se extrajeron con EtOAc (2*). Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre Na²SO⁴ , se filtraron y se concentraron a sequedad para dar el compuesto titulado en bruto como un aceite viscoso amarillo (156 g, 93%) que se usó sin purificación adicional. MS (m/z): 320 (M+H).

Preparación 16

ferc-Butil 4-(1-(4-((S)-1-(2,2,2-trifluoroacetamido)etil)fenil)propil)piperazina-1-carboxilato

Se añadió K²CO³ (9,2 g, 67 mmol) y Nal (1,5 g, 10 mmol) a una solución de N-((1S)-1-(4-(1-cloropropil)fenil)etil)-2,2,2-trifluoroacetamida (4,9 g, 17 mmol) y 1-Boc-piperazina (3,7 g, 20 mmol) en CH³CN (90 ml). La mezcla se agitó a 90 °C durante 3 horas y luego se dejó enfriar a temperatura ambiente. Los sólidos se separaron por filtración y el filtrado se concentró y se purificó por cromatografía en gel de sílice eluyendo con 10-40% de EtOAc/hexanos para dar el compuesto titulado como un aceite (5,56 g, 12,5 mmol, 75%). e S/MS (m/z): 444 (M+H).

Preparación 17

ferc-Butil 4-[2-ciclopropil-1-[4-[(1S)-1-[(2,2,2-trifluoroacetil)amino]etil]fenil]etil]piperazina-1-carboxilato

Se agregó isopropóxido de titanio (IV) (60 ml, 200 mmol) a una solución de N-[(1S)-1-[4-(2-ciclopropilacetil)fenil]etil]-² ,² ,² -trifluoro-acetamida (^{12 , 0} g, 40,1 mmol) y ferc-butil piperazina-¹ -carboxilato (17,9 g, 96,1 mmol) en THF (80 ml) y la mezcla se agitó a 60 °C durante la noche. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente y se agregó MeOH (80 ml) seguido de la adición en porciones de cianoborohidruro de sodio (5,3 g, 80 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante ⁸ horas y luego se añadió agua y MeOH y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla se filtró para eliminar los sólidos y los sólidos se enjuagaron con MeOH y agua. El filtrado se concentró parcialmente para eliminar la mayor parte del MeOH y el residuo se extrajp con EtOAc (2*). Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron a presión reducida. El material bruto se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice eluyendo con un gradiente de EtOAc del 0% al 30% en solvente B, donde el solvente B es 1:1 hexanos:CH²Cl² para dar el compuesto titulado (10,5 g, 56%) como un sólido incoloro. MS (m/z): 470,3 (M+H).

Preparación 18

ferc-Butil 4-(1-(4-((S)-1-aminoetil)fenil)propil)piperazina-1-carboxilato

Se añadió KOH (3,52 g, 62,7 mmol) en agua (11 ml) a una solución de ferc-butil 4-(1-(4-((S)-1-(2,2,2-trifluoroacetamido)etil)fenil)propil)piperazina-1-carboxilato (5,56 g, 12,5 mmol) en EtOH (50,1 ml). La mezcla se agitó durante 3 horas a temperatura ambiente, se concentró y se repartió entre CH²Cl² y NaHCO3 acuoso saturado. La fase orgánica se separó y se lavó con salmuera, se secó (Na2CO3), se filtró y se concentró para dar el compuesto titulado como un aceite (4,31 g, 12 mmol, 96%) que se usó sin purificación adicional. ES/MS (m/z): 348 (M+H).

Preparación 19

ferc-Butil 4-[1-[4-[(1S)-1-aminoetil]fenil]-2-ciclopropil-etil]piperazina-1-carboxilato

Se agregó KOH acuoso (5 M, 69 ml, 350 mmol) a una solución de ferc-butil 4-[2-ciclopropil-1-[4-[(1S)-1-[(2,2,2-trifluoroacetil)amino]etil]fenil]etil]piperazina-1-carboxilato (32,24 g, 68,67 mmol) en EtOH (350 ml) y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. El EtOH se eliminó a presión reducida y al residuo se agregó bicarbonato de sodio acuoso saturado y la mezcla se extrajo con CH²Cl². Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron a presión reducida para dar el compuesto titulado (24,33 g, que contiene pureza al 96,5%, CH²Cl² residual al 3,5%, rendimiento del 92%) como un aceite viscoso incoloro. MS (m/z): 374,3 (M+H).

Preparación 19a

ferc-Butil 4-[1-[4-[(1S)-1-aminoetil]fenil]-2-ciclopropil-etil]piperazina-1-carboxilato, isómero 1

Preparación 19b

ferc-Butil 4-[1-[4-[(1S)-1-aminoetil]fenil]-2-ciclopropil-etil]piperazina-1-carboxilato, isómero 2

El ferc-butil 4-[1-[4-[(1S)-1-aminoetil]fenil]-2-ciclopropil-etil]piperazina-1-carboxilato (3,23 g) se disolvió en MeOH (40 ml) y se separó en diastereómeros individuales mediante cromatografía HPLC quiral preparativa usando las siguientes condiciones: columna Chiralpak AD, 20 pm, (8 x 33 cm); volumen de inyección 10 ml; eluyente 100% metanol con DMEA al 0,2%; longitud de onda de detección de 220 nm; caudal de 400 ml/min. Ejemplo 19a, el fercbutil 4-[1-[4-[(1S)-1-aminoetil]fenil]-2-ciclopropiletil]piperazina-1-carboxilato, isómero 1, se obtuvo del primer pico de elución como un aceite viscoso transparente (1,50 g, 46%,> 99% de, Rt = 4,2 minutos). MS (m/z): 374,3 (M+H). Ejemplo 19b, el ferc-butil 4-[1-[4-[(1S)-1-aminoetil]fenil]-2-ciclopropiletil]piperazina-1-carboxilato, isómero 2, se obtuvo del segundo pico de elución como un aceite viscoso transparente (1,46 g, 45%,> 98,2% de, Rt = 5,7 minutos). MS (m/z): 374,3 (M+H).

Preparación 20

2-((2-(Metiltio)pirimidin-4-il)amino)etan-1-ol

Se agregó DIPEA (5 ml, 29 mmol) a una solución de 4-cloro-2-metilsulfanil-pirimidina (4,2 g, 26 mmol) y 2-aminoetanol (3,2 g, 52 mmol) en CH³CN (60 ml). La mezcla se agitó a 80 °C durante 2 horas y luego se concentró a 50 °C. El producto bruto se recogió en EtOAc y se lavó con agua, se secó (Na²CO³), se filtró y se concentró. El material se purificó por cromatografía en gel de sílice eluyendo con un gradiente de 0 a 100% de EtOAc/hexanos para dar el compuesto titulado como un sólido blanco (3,33 g, 18,0 mmol, 69%). ES/MS (m/z): 186 (M+H).

Preparación 21

(S)-3-(2-Cloropirimidin-4-il)-4-etiloxazolidin-2-ona

Se agregó TEA (0,864 ml, 6,2 mmol) a una solución de (2S)-2-[(2-cloropirimidin-4-il)amino]butan-1-ol (1,25 g, 6,2 mmol) [Ger. Offenlegungsschrift, 102009001438, 16 de septiembre de 2010] y di(imidazol-1-il)metanona (1,21 g, 7,44 mmol) en THF (12,4 ml) a temperatura ambiente. Después de agitar durante 5 horas, se agregó di(imidazol-1-il)metanona (1,21 g, 7,44 mmol) y TEA (0,864 ml, 6,2 mmol) adicionales y la mezcla resultante se calentó a 50 °C y se agitó durante 3 horas. El calentamiento se retiró y la mezcla resultante se dejó reposar durante 16 horas antes de diluir con agua y extraer con EtOAc (3*). Los extractos orgánicos combinados se lavaron luego con HCl acuoso 1 M y salmuera, se secaron (MgSO⁴), se filtraron y se concentraron para dar el compuesto titulado como un sólido blanco (1,20 g, 5,27 mmol, 85%). ES/MS (m/z): 228 (M+H).

El siguiente compuesto fue preparado esencialmente de la misma manera que el procedimiento de Preparación ²¹ usando el reactivo adecuado.

Tabla 1

Preparación 23

3-(2-(Metilsulfonil)pirimidin-4-il)oxazolidin-2-ona

Se añadió mCPBA (7,4 g, 30 mmol, 70% en peso) a una solución de 3-(2-metilsulfanilpirimidin-4-il)oxazolidin-2-ona (3,0 g, 14 mmol) en CH²O ² (71 ml) a temperatura ambiente. Después de agitar durante 1 hora, los sólidos se filtraron y el filtrado se concentró para dar un sólido. El sólido se trituró con Et²O y se secó al vacío para dar el compuesto titulado como un sólido blanco (2,63 g, 9,30 mmol, ^{8 6} % de pureza). ES/MS (m/z): 244 (M+H).

Preparación 24

(S)-3-(2-cloropirimidin-4-il)-4-metiloxazolidin-2-ona

Se agregó hidruro de sodio (379 mg, 9,48 mmol, 60% en aceite mineral) como un sólido a una solución de 2,4-dicloropirimidina (1,47 g, 9,89 mmol) y (S)-4-metiloxazolidin-2-ona (877 mg, 8,2 mmol, 95% de pureza) en DMF (16,5 ml) a temperatura ambiente. Después de agitar durante 16 horas a temperatura ambiente, la mezcla se apagó con NhUCl acuoso saturado y se extrajo con EtOAc (3*). Los extractos orgánicos se combinaron, se secaron (MgSÜ4), se filtraron y se concentraron. El material crudo se disolvió en 9:1 de ChhCh/MeOH y los sólidos blancos no deseados se filtraron. El producto bruto obtenido en el filtrado se purificó por cromatografía en gel de sílice eluyendo con un gradiente del 5%-100% de EtOAc/hexanos para dar el compuesto titulado como un sólido blanco (518 mg, 2,42 mmol, 29%). ES/MS (m/z): 214 (M+H).

Preparación 25

Bencil ((2R,3S)-3-(ferc-butoxi)-1-hidroxibutan-2-il)carbamato

Se agregó 4-metilmorfolina (0,540 ml, 4,9 mmol) al cloroformiato de isobutilo (0,640 ml, 4,90 mmol) y N-ciclohexilciclohexanamonio (2S,3S)-2-(benciloxicarbonilamino)-3-ferc-butoxi-butanoato (2.00 g, 4,08 mmol) en THF (30 ml) a -25 °C. Después de 10 minutos, se eliminó un sólido por filtración y se enjuagó con un mínimo de THF anhidro. El filtrado se enfrió a -20 °C y se añadió borohidruro de sodio (231 mg, 6,1 mmol) seguido de agua (4 ml). La mezcla se agitó durante 10 minutos a -20 °C y luego se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. Se agregó agua y la mezcla se extrajo con EtOAc (2*). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera, se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron para dar el compuesto titulado como un aceite amarillo (1,367 g, 3,93 mmol, 85% de pureza). ES/MS (m/z): 240 (M+H-f-butilo).

El siguiente compuesto fue preparado esencialmente de la misma manera que el procedimiento de Preparación 25 usando el reactivo adecuado.

Tabla 2

Preparación 27

(R)-4-((S)-1-(ferc-butoxi)etil)-3-(4-metoxibencil)oxazolidin-2-ona

Se agregó hidruro de sodio (616 mg, 15,4 mmol, 60% en aceite mineral) a 0 °C a una solución de bencilo ((2R, 3S)-3-(ferc-butoxi)-1-hidroxibutan-2-il)carbamato (2,61 g, 7,51 mmol) en DMF (40 ml) y la mezcla se agitó durante 30 minutos. Se añadió cloruro de 4-metoxibencilo (1,49 ml, 11,3 mmol) y yoduro de tetrabutilamonio (277 mg, 0,749 mmol) a la mezcla y la solución se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó durante la noche. La mezcla de reacción se virtió sobre agua con hielo (200 ml) y se agregó EtOAc mientras se agitaba. La capa de EtOAc se separó y la fase acuosa se extrajo con EtOAc adicional (2*). Los extractos de EtOAc combinados se lavaron con LiCl acuoso al 5% (2*), se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron para dar un residuo que se purificó por cromatografía en gel de sílice eluyendo con 0-20% de EtOAc/hexanos para dar el compuesto titulado. (1,91 g, 6,21 mmol, 83%). ES/MS (m/z): 308 (M+H).

El siguiente compuesto fue preparado esencialmente de la misma manera que el procedimiento de Preparación 27 usando el reactivo adecuado.

Tabla 3

Preparación 29

(R)-4-((S)-1-hidroxietil)-3-(4-metoxibencil)oxazolidin-2-ona

Se agregó TFA (15 ml, 198 mmol) a una solución de (R)-4-((S)-1-(ferc-butoxi)etil)-3-(4-metoxibencil)oxazolidin-2-ona (2,31 g, 7,51 mmol) en CH²Cl² (15 ml) a temperatura ambiente y la mezcla se agitó durante 20 minutos y se concentró a sequedad. El producto bruto se redisolvió en CH²Cl² adicional y se concentró. La adición de CH²Cl² y la concentración se repitieron una vez más para dar el compuesto titulado como un aceite amarillo (1,97 g, 7,51 mmol, 100%) que se usó sin purificación adicional. ES/MS (m/z): 252 (M+H).

El siguiente compuesto fue preparado esencialmente de la misma manera que el procedimiento de Preparación 29 usando el reactivo adecuado.

Tabla 4

Preparación 31

(R)-4-((R)-1-fluoroetil)-3-(4-metoxibencil)oxazolidin-2-ona

Una solución de (R)-4-((S)-1-hidroxietil)-3-(4-metoxibencil)oxazolidin-2-ona (985 mg, 3,92 mmol) en CH³CN (13 ml) fue tratada con TEA (5 ml, 35,9 mmol) a 0 °C. Se añadió secuencialmente fluoruro de nonafluorobutano sulfonilo (2,11 ml, 11,7 mmol) y trihidrofluoruro de trietilamina (1,94 ml, 11,7 mmol) y la mezcla se agitó durante 1 hora a 0 °C. Se añadió fluoruro de nonafluorobutano sulfonilo adicional (0,9 ml, 5 mmol), trihidrofluoruro de trietilamina (1 ml, 6 mmol) y TEA (2,5 ml, 17,95 mmol) y la mezcla se agitó durante 45 minutos a 0 °C. Se añadió más fluoruro de nonafluorobutano sulfonilo (1,05 ml, 5,8 mmol), trihidrofluoruro de trietilamina (1 ml, 6 mmol) y TEA (2,5 ml, 17,95 mmol) y la mezcla se agitó durante 30 minutos. La mezcla se enfrió con agua y se extrajo con EtoAc (3*). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera, se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron. La mezcla bruta se recogió en CH²Cl² y los sólidos se eliminaron por filtración. El filtrado resultante se concentró y el residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice eluyendo con un gradiente de 20-60% de EtOAc/hexanos para dar el compuesto titulado como un aceite amarillo (300 mg, 1,18 mmol, 30%). ES/MS (m/z): 254 (M+H). El siguiente compuesto fue preparado esencialmente de la misma manera que el procedimiento de Preparación 31 usando el reactivo adecuado.

Tabla 5

Preparación 33

(R)-4-((R)-1-fluoroetil)oxazolidin-2-ona

Una solución de (R)-4-((R)-1-fluoroetil)-3-(4-metoxibencil)oxazolidin-2-ona (290 mg, 1,15 mmol) en TFA (6 ml) se calentó durante 40 horas a 65 °C. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente y se concentró. El producto bruto se redisolvió en CH²Cl² adicional y se concentró. Esto se repitió una vez más para eliminar el TFA residual. El residuo bruto se purificó por cromatografía en gel de sílice eluyendo con un gradiente de 30-80% de EtOAc/CH²Cl² para dar el compuesto titulado como un aceite ámbar (141 mg, 1,06 mmol, 93%). ES/MS (m/z): 134 (M+H). Los siguientes compuestos fueron preparados esencialmente de la misma manera que el procedimiento de Preparación 33 usando el intermedio adecuado.

Tabla 6

N.° de Prep.

Nombre Químico

Estructura

ES/MS (m/z) (M+H)

Preparación 37

(R)-4-((R)-1-(ferc-butoxi) etil)oxazolidin-2-ona

Se agregó hidruro de sodio (822 mg, 20,6 mmol, 60% en aceite mineral) a 0 °C a una solución de bencilo N-[(1R, 2R)-2-ferc-butoxi-1-(hidroximetil)propil]carbamato (4,35 g, 13,7 mmol) en THF (70 ml). Después de agitar durante 1 hora a 0 °C, la mezcla de reacción se dejó calentar a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla se apagó con NH4Cl acuoso saturado, se extrajo con EtOAc (2*), se secó (Na2SÜ4), se filtró y se concentró. El material se purificó con cromatografía en gel de sílice eluyendo con un gradiente de 30-70% de EtOAc/hexanos para dar el compuesto titulado como un aceite incoloro que solidifica a un sólido blanco en reposo (1,95 g, 9,35 mmol, 90% de pureza). ES/MS (m/z): 188 (M+H).

Preparación 38

(R)-3-(4-metoxibencil)-4-((S)-1-metoxietil)oxazolidin-2-ona

Se agregó hidruro de sodio (300 mg, 7,5 mmol, 60% en aceite mineral) a 0 °C a una solución de (4R)-4-[(1S)-1-hidroxietil]-3-[(4-metoxifenil)metil]oxazolidin-2-ona (985 mg, 3,92 mmol) en DMF (20 ml). Después de 30 minutos, se agregó CH³ I (0,732 ml, 11,75 mmol). Después de 30 minutos adicionales, se agregó hidruro de sodio adicional (100 mg, 2,5 mmol, 60% en aceite mineral) y la reacción se dejó agitar durante 45 minutos, luego se apagó con NH⁴Cl acuoso saturado, se agregó agua y la mezcla de reacción se extrajo con EtOAc (3*). Los extractos orgánicos combinados se secaron (Na²SO⁴), se filtraron y se concentraron para dar un residuo que se purificó con cromatografía en gel de sílice eluyendo con un gradiente de 25-60% de EtOAc/hexano para dar el compuesto titulado como un aceite incoloro (423 mg, 1,59 mmol, 41%). ES/MS (m/z): 266 (M+H).

El siguiente compuesto fue preparado esencialmente de la misma manera que el procedimiento de Preparación 38 usando el intermedio adecuado.

Tabla 7

ferc-Butil 4-(4-((S)-1-((4-((S)-4-isopropil-2-oxooxazolidin-3-il)pirimidin-2-il)amino)etil)bencil)piperazina-1-carboxilato

Se agregó fluoruro de cesio (9,35 g, 61,6 mmol) a una solución de (S)-3-(2-cloropirimidin-4-il)-4-isopropiloxazolidin-2-ona (7,44 g, 30,8 mmol) [Solicitud Int. PCT (2013), WO 2013046136] en DMSO (50 ml) a temperatura ambiente. Luego se agregó DIPEA (8,05 ml, 46,2 mmol). La mezcla resultante se agregó a una solución de ferc-butil 4-[[4-[(1S)-1-aminoetil]fenil]metil]piperazina-1-carboxilato (10,0 g, 31,4 mmol) en DMSO (50 ml). Esta mezcla de reacción se calentó a 60 °C durante 6 horas, a 70 °C durante 17,5 horas y a 90 °C durante 1,5 horas. La mezcla de reacción se enfrió, se diluyó con NaCl acuoso (50% saturado) y se extrajo con EtOAc (3*). Los extractos orgánicos se combinaron, se lavaron con salmuera, se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentraron para dar un residuo que se purificó por cromatografía en gel de sílice (35-95% de EtOAc/hexanos) para dar el compuesto titulado (10,72 g, 20,4 mmol), 66%). ES/MS (m/z): 525 (M+H).

Los siguientes compuestos fueron preparados esencialmente de la misma manera que el procedimiento de Preparación 40 usando los intermedios adecuados.

Tabla 8

Preparación 50

ferc-Butil 4-[1-[4-[(1S)-1-[[4-[(4R)-4-[(1R)-1-ferc-butoxietil]-2-oxo-oxazolidin-3-il]pirimidin-2-il]amino]etil]fenil]-2-ciclopropil-etil]piperazina-1 -carboxilato

Una mezcla de ferc-butil 4-[1-[4-[(1S)-1-aminoetil]fenil]-2-ciclopropiletil]piperazina-1-carboxilato (350 mg, 0,91 mmol), (4R)-4-[(1R)-1-ferc-butoxietil]-3-(2-cloropirimidin-4-il)oxazolidin-2-ona (273 mg, 0,91 mmol), fluoruro de cesio (152 mg, 1,00 mmol) y DiPEA (0,17 ml, 1,00 mmol) en DMSO (3,0 ml) se calentó en un vial sellado a aproximadamente 85 °C. Después de aproximadamente 6 horas, la mezcla se enfrió a temperatura ambiente y se repartió entre Et²O y agua. La capa orgánica se lavó con NaCl de sodio acuoso saturado y se concentró. El material bruto se purificó con cromatografía en gel de sílice eluyendo con un gradiente del 20% al 50% de EtOAc en hexanos para dar el compuesto titulado como un aceite (288 mg, 0,448 mmol, 49%). ES/MS (m/z): 637,4 (M+H).

Preparación 51

ferc-Butil 4-[2-ciclopropil-1-[4-[(1S)-1-[[4-[(4S)-4-isopropil-2-oxo-oxazolidin-3-il]pirimidin-2-il]amino]etil]fenil]etil]piperazina-1-carboxilato, isómero 1

Una mezcla de ferc-butil 4-[1-[4-[(1S)-1-aminoetil]fenil]-2-ciclopropiletil]piperazina-1-carboxilato, isómero 1 (1,3 g, 3,48 mmol), (4S)-3-(2-cloropirimidin-4-il)-4-isopropil-oxazolidin-2-ona (1,09 g, 4,51 mmol), fluoruro de cesio (1,59 g, 10,5 mmol) y DiPEA (0,911 ml, 5,22 mmol) en DMSO (17 ml) se colocó en un bloque precalentado a 70 °C y se agitó durante 2 horas. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente, se diluyó con EtOAc y se lavó con 3 veces con agua. Las capas acuosas combinadas se volvieron a extraer con 2* EtOAc. Los extractos orgánicos se combinaron, se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y el solvente se eliminó al vacío para dar el producto bruto. El producto se purificó por cromatografía ultrarrápida en gel de sílice usando un gradiente del 30 al 60% de EtOAc en hexanos para dar el compuesto titulado (1,97 g, 93%) como un sólido amorfo blanco. ES/MS m/z 579 (M+H).

El siguiente compuesto fue preparado esencialmente de la misma manera que el procedimiento de Preparación 51.

Tabla 9

Preparación 53

ferc-Butil 4-(4-1-((4-((S)-4-etil-2-oxooxazolidin-3-il)pirimidin-2-il)amino)-2-fluoroetil)bencil)piperazina-1-carboxilato, isómero 2

Se disolvió ferc-Butil 4-(4-(1-((4-((S)-4-etil-2-oxooxazolidin-3-il)pirimidin-2-il)amino)-2-fluoroetil)bencil)piperazina-1-carboxilato (540 mg, 1,0 mmol) en MeOH (4 ml) y se resolvió por cromatografía quiral SFC usando las siguientes condiciones: columna: Chiralpak AS-H, 21,2 x 150 mm); volumen de inyección: 0,9 ml * 5, eluyente: 15% IPA (0,2% IPAm)/CO² , longitud de onda de detección: 225 nm; tiempo de elución: 10 min; caudal: 70 g/min; temperatura de la columna: 40 °C; Punto de ajuste BPR: 100 bar (10 Mpa); Temperatura BPR: 35 °C. El compuesto titulado se aisó como el segundo pico de elución (isómero 2) como un sólido blanco (260 mg, 0,48 mmol, 48%, Rt = 3,04,> 99% ee). ES/MS (m/z): 529 (M+H).

Los siguientes compuestos fueron preparados esencialmente de la misma manera que el procedimiento de Preparación 53.

Tabla 10

Preparación 57

ferc-Butil (S)-4-(4-(1-((4,6-difluoropirimidin-2-il)amino)etil)bencil)piperazina-1-carboxilato

Una solución de 2,4,6-trifluoropirimidina (278 mg, 2,07 mmol) en Et²O (10 ml) se enfrió a -20 °C y se trató, gota a gota, con una solución de ferc-butil 4-[[4-[(1S)-1-aminoetil]fenil]metil]piperazina-1-carboxilato (600 mg, 1,88 mmol) en Et²O (10 ml). La mezcla resultante se agitó a -20 °C durante 1 hora y luego se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó durante la noche. Los sólidos se eliminaron por filtración y se lavaron con Et²O adicional. El filtrado se lavó con agua, usando una pequeña porción de aditivo de NaCl para reducir la emulsión, y la capa acuosa se extrajo de nuevo con Et²O ( i* ) y ChhCb (1x). Los extractos orgánicos combinados luego se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron para dar un producto bruto que se purificó por cromatografía en gel de sílice eluyendo con 20-60% de EtOAc/hexanos para dar el compuesto titulado como un aceite amarillo pálido (606 mg, 1,40 mmol, 74%). ES/MS (m/z): 434 (M+H).

Preparación 58

ferc-Butil 4-(2-ciclopropil-1-(4-((S)-1-((4,6-difluoropirimidin-2-il)amino)etil)fenil)etil)piperazina-1 -carboxilato, isómero 1

Una solución de 2,4,6-trifluoropirimidina (1,7 g, 13 mmol) en Et²O (56 ml) se enfrió a -30 a -40 °C y se trató gota a gota con una solución de ferc-butil 4-[1-[4-[(1S)-1-aminoetil]fenil]-2-ciclopropil-etil]piperazina-1-carboxilato, isómero 1 (5,5 g, 15 mmol) en Et²O (56 ml). La mezcla se agitó y la temperatura se mantuvo de -30 a -40 °C durante 45 minutos. Después de 45 minutos, se retiró el baño de enfriamiento y la reacción se dejó agitar a temperatura ambiente durante la noche. La reacción se diluyó con bicarbonato de sodio acuoso saturado y se extrajo con 3* CH²Cl². Las capas orgánicas se combinaron, se secaron sobre Na2SO4, se filtraron, se concentraron a presión reducida y se purificaron mediante cromatografía ultrarrápida en gel de sílice usando un gradiente del 20% al 50% de EtOAc/hexanos para dar el compuesto titulado (5,318 g, 74%) como sólido amorfo blanco. ES/MS m/z 488 (M+H).

El siguiente compuesto fue preparado esencialmente de la misma manera que el procedimiento de Preparación 58 usando el intermedio adecuado.

Tabla 11

Preparación 60

ferc-Butil 4-(4-((S)-1-((4-fluoro-6-((S)-4-isopropil-2-oxooxazolidin-3-il)pirimidin-2-il)amino)etil)bencil)piperazina-1-carboxilato

Se agregó hidruro de sodio (61 mg, 1,53 mmol, 60% en aceite mineral) a una solución de ferc-butil (S)-4-(4-(1-((4,6-difluoropirimidin-2-il)amino)etil)bencil)piperazina-1-carboxilato (550 mg, 1,27 mmol) en DMF a (6 ml) 0 °C. Después de 1 minuto, se agregó(s)-4-isopropiloxazolidin-2-ona (180 mg, 1,39 mmol) y la mezcla se agitó durante 1 hora a 0 °C seguido de calentamiento a temperatura ambiente y agitación durante la noche. La mezcla de reacción luego se apagó con agua y se extrajo con EtOAc. El extracto de EtOAc se lavó con LiCl acuoso al 5% (2*), se secó (Na2SÜ4), se filtró y se concentró para dar un residuo que se purificó por cromatografía en gel de sílice eluyendo con un gradiente del 30-50% de EtOAc/hexanos para dar compuesto titulado un sólido (500 mg, 0,92 mmol, 73%). ES/MS (m/z): 543 (M+H).

Los siguientes compuestos fueron preparados esencialmente de la misma manera que el procedimiento de Preparación 60 usando los intermedios adecuados.

Tabla 12

Preparación 64

ferc-Butil 4-[2-ciclopropil-1-[4-[(1S)-1-[[4-(4,4-dimetil-2-oxo-oxazolidin-3-il)-6-fluoro-pirimidin-2-il]amino]etil]fenil]etil]piperazina-1-carboxilato, isómero 1

Una solución de 4,4-dimetiloxazolidin-2-ona (493 mg, 4,282 mmol) en DMF (20 ml) se enfrió a 0 °C, se trató con hidruro de sodio (187 mg, 4,67541 mmol) y se agitó durante aproximadamente 40 minutos. Una solución de ferc-butil 4-[2-ciclopropil-1-[4-[(1S)-1-[(4,6-difluoropirimidin-2-il)amino]etil]fenil]etil]piperazina-1-carboxilato, se agregó el isómero 1 (1,90 g, 3,90 mmol) en DMF (10 ml) y la mezcla se dejó calentar a temperatura ambiente a medida que el baño de enfriamiento expiraba durante la noche. Cuando la reacción está completa, la reacción se apagó con cloruro de amonio acuoso saturado y se extrajo con EtOAc. El extracto orgánico se lavó con LiCl acuoso al 5%, se recogió, se secó sobre Na²SO⁴ , se filtró, se concentró a presión reducida y se purificó por cromatografía ultrarrápida en gel de sílice usando un gradiente del 20% al 40% de EtOAc/hexanos para dar el producto titulado (1,12 g, 48%) como un sólido amorfo blanco. ES/MS m/z 583 (M+H).

El siguiente compuesto fue preparado esencialmente de la misma manera que el procedimiento de Preparación 64 usando el intermedio adecuado.

Tabla 13

Preparación 66

ferc-Butil (S)-4-(4-(1-((6-oxo-1,6-dihidropirimidin-2-il)amino)etil)bencil)piperazina-1-carboxilato

2-Metilsulfanil-1H-pirimidin-6-ona (4,81 g, 33,8 mmol), ferc-butil 4-[[4-[(1S)-1-aminoetil]fenil]metil]piperazina-1-carboxilato ( 9,00 g, 28,2 mmol) y DME (56 ml) se dividieron por igual en tres recipientes de microondas que se sellaron y se calentaron a 120 °C durante 4 días. Las mezclas de reacción se dejaron enfriar a temperatura ambiente, se combinaron, se concentraron y se resuspendieron en CH²Cl². Los sólidos se filtraron y el filtrado se adsorbió en gel de sílice y se sometieron a cromatografía en gel de sílice eluyendo con un gradiente de 1-7% de MeOH/CH²Cl² para dar el compuesto titulado como un sólido blanquecino (10,55 g, 22,45 mmol, 88% pureza).

ES/MS (m/z): 414 (M+H).

Preparación 67

ferc-Butil (S)-4-(4-(1-((4-cloropirimidin-2-il)amino)etil)bencil)piperazina-1-carboxilato

Una mezcla de ferc-butil (S)-4-(4-(1-((6-oxo-1,6-dihidropirimidin-2-il)amino)etil)bencil)piperazina-1-carboxilato (10,55 g, 22,45 mmol, 88% de pureza), tetracloruro de carbono (6,5 ml), resina de trifenilfosfina (22,5 g, 67 mmol, 3 mmol de fosfina/g) y 1,2-DCE (300 ml) se agitó a 70 °C durante 6 horas y luego se enfrió a temperatura ambiente. Se agregó MeOH (300 ml) y la mezcla resultante se agitó vigorosamente durante 30 minutos. La resina se eliminó de la mezcla por filtración y se enjuagó con MeOH adicional que se agregó al filtrado. Los filtrados combinados se concentraron y el residuo se disolvió en CH²Cl² y se lavó con NaHCO3 acuoso saturado. La fase acuosa se volvió a extraer con CH²Cl² (2*). Los extractos orgánicos combinados se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron para dar un residuo que se purificó por cromatografía en gel de sílice eluyendo con un gradiente de 35-60% de EtOAc/hexanos para dar el compuesto titulado como un sólido amorfo blanco (6,85 g, 15,9 mmol, 71%). ES/MS (m/z): 432 (M+H).

Preparación 68

ferc-Butil 4-(4-((S)-1-((4-((R)-4-((R)-1-fluoroetil)-2-oxooxazolidin-3-il)pirimidin-2-il)amino)etil)bencil)piperazina-1-carboxilato

Una solución de ferc-butil (S)-4-(4-(1-((4-cloropirimidin-2-il)amino)etil)bencil)piperazina-1-carboxilato (400 mg, 0,925 mmol), (R)-4-((R)-1-fluoroetil)oxazolidin-2-ona (136 mg, 1,02 mmol) y Cs2Co3 (513 mg, 1,57 mmol) en 1,4-dioxano (4,5 ml) se desgasificó burbujeando gas N² a través del mismo durante 5-10 minutos. Luego se agregó tris(dibencilideneacetona)dipaladio (51 mg, 0,056 mmol) y 4,5-bis(difenilfosfino)-9,9-dimetilxanteno (113 mg, 0,195 mmol) y se repitió la desgasificación. El recipiente se selló y se calentó a 100 °C durante 4,5 horas. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente, se diluyó con EtOAc y se filtró sobre tierra de diatomeas. El filtrado se lavó con agua y el agua se extrajo con EtOAc adicional. Los extractos orgánicos combinados se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron. El residuo se purificó con cromatografía en gel de sílice eluyendo con un gradiente de 70-100% de EtOAc/hexanos para dar el compuesto titulado como un sólido amorfo amarillo pálido (421 mg, 0,796 mmol, 86%). ES/MS (m/z): 529 (M+H).

Los siguientes compuestos fueron preparados esencialmente de la misma manera que el procedimiento de Preparación 68 usando los intermedios adecuados.

Tabla 14

Preparación 72

ferc-Butil 4-[1-[4-[(lS)-1-[[4-amino-6-(4,4-dimetil-2-oxo-oxazolidin-3-il)pirimidin-2-il]amino]etil]fenil]propil]piperazina-1-carboxilato, isómero 1

Una solución de DMSO (14 ml) de ferc-butil 4-[1-[4-[(1S)-1-[[4-(4,4-dimetil-2-oxo-oxazolidin-3-il)-6-fluoro-pirimidin-2-il]amino]etil]fenil]propil]piperazina-1-carboxilato, el isómero 1 (1,62 g, 2,74 mmol) se trató con hidróxido de amonio (72%, 1 ml, 10 eq.) en un recipiente a presión y calentado a 110 °C durante la noche. La reacción se dejó enfriar a temperatura ambiente, se diluyó con EtOAc y se lavó con agua (3 veces). La capa orgánica se recogió, se secó sobre MgSO⁴ , se filtró y el solvente se eliminó a presión reducida, dando el compuesto titulado como un sólido amorfo blanco (1,51 g, 93%). ES/MS m/z 554 (M+H).

El siguiente compuesto fue preparado esencialmente de la misma manera que el procedimiento de Preparación 72 usando el intermedio adecuado.

Tabla 15

Preparación 74

(S)-4-isopropil-3-(2-(((S)-1-(4-(piperazin-1-ilmetil)fenil)etil)amino)pirimidin-4-il)oxazolidin-2-ona

Se añadió TFA (69 ml, 912,6 mmol) a una solución de ferc-butil 4-(4-((S)-1-((4-((S)-4-isopropil-2-oxooxazolidin-3-il)pirimidin-2-il)amino)etil)bencil)piperazina-1 -carboxilato (10,7 g, 20,4 mmol) en CH²Cl² (204 ml) a temperatura ambiente. Después de agitar durante 4 horas, el pH de la reacción se ajustó a 9 usando Na²CO³ acuoso saturado y la mezcla resultante se extrajo con CH²Cl² (3*). Los extractos orgánicos se combinaron, se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentraron para dar un residuo que se purificó por cromatografía en gel de sílice eluyendo con un gradiente de 0-15% de 7 N-NH³ en MeOH/EtOAc para dar el compuesto titulado (7,76 g, 18,3 mmol, 90%). ES/MS (m/z): 425 (M+H).

Los siguientes compuestos fueron preparados esencialmente de la misma manera que el procedimiento de Preparación 74 usando el intermedio adecuado.

Tabla 16

Preparación 91

(4S)-3-[2-[[(1S)-1-[4-[2-Ciclopropil-1-piperazin-1-il-etil]fenil]etil]amino]pirimidin-4-il]-4-isopropil-oxazolidin-2-ona, isómero 1

Una solución de ferc-butil 4-[2-ciclopropil-1-[4-[(1S)-1-[[4-[(4S)-4-isopropil-2-oxo-oxazolidin-3-il]pirimidin-2-il]amino]etil]fenil]etil]piperazina-1-carboxilato, el isómero 1 (1,97 g, 3,40 mmol) en CH²Cl² (15 ml) se trató con TFA (5 ml, 66,13 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante la noche. El solvente se eliminó y el residuo se disolvió en CH²Cl². El pH de la solución se hizo básico con carbonato de sodio acuoso al 10%. Las capas se separaron y la capa acuosa se volvió a extraer con 2x CH²Cl². Los extractos orgánicos se combinaron, se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron a presión reducida para dar el compuesto titulado (1,691 g, 97%). ES/MS m/z 479 (M+H).

Preparación 92

(4R)-3-[2-[[(1S)-1-[4-(2-Ciclopropil-1-piperazin-1-il-etil)fenil]etil]amino]pirimidin-4-il]-4-[(1R)-1-hidroxietil]oxazolidin-2-ona

Se agregó TFA (2 ml) a una solución de ferc-butil 4-[1-[4-[(1S)-1-[[4-[(4R)-4-[(1R)-1-ferc-butoxietil]-2-oxooxazolidin-3-il]pirimidin-2-il]amino]etil]fenil]-2-ciclopropil-etil]piperazina-1-carboxilato (288 mg, 0,448 mmol) en (2 ml) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente. Después de aproximadamente 2 horas, la mezcla se concentró y se disolvió en MeOH. La solución se purificó con una columna SCX. La columna se lavó con MeOH y el compuesto titulado se eluyó con amoniaco 1 N en MeOH. La solución de amoniaco/MeOH se concentró para dar el compuesto titulado como un aceite (176 mg, 0,359 mmol, 80%) que se usó sin purificación adicional. ES/MS (m/z): 481,2 (M+H).

Preparación 93

3-[6-Amino-2-[[(1S)-1-[4-[1-piperazin-1-ilpropil]fenil]etil]amino]pirimidin-4-il]-4,4-dimetil-oxazolidin-2-ona, isómero 1

Una solución de CH²Cl² (13 ml) de ferc-butil 4-[1-[4-[(1S)-1-[[4-amino-6-(4,4-dimetil-2-oxo-oxazolidin-3-il)-pinmidin-2-il]amino]etil]fenil]propil]piperazina-1-carboxilato (1,50 g, 2,55 mmol) se trató con TFA (4 ml) y se dejó agitar a temperatura ambiente durante la noche. La reacción se diluyó con carbonato de potasio acuoso al 10% y se extrajo con 3* CH²Cl². Los extractos orgánicos se combinaron, se secaron sobre Na2SO4 sólido, se filtraron y el solvente se eliminó a presión reducida para dar el compuesto titulado como un sólido amorfo amarillo pálido (1,285 g, 100%). ES/MS m/z 454 (M+H).

El siguiente compuesto fue preparado esencialmente de la misma manera que el procedimiento de Preparación 93 usando el intermedio adecuado.

Tabla 16a

Preparación 94

(S)-4-Etil-3-(2-(((S)-1-(4-(piperazin-1-ilmetil)fenil)etil)amino)pirimidin-4-il)oxazolidin-2-ona

Se disolvió ferc-butil 4-(4-((S)-1-((4-((S)-4-etil-2-oxooxazolidin-3-il)pirimidin-2-il)amino)etil)bencil)piperazina-1-carboxilato (749 mg, 1,47 mmol) en una mezcla de HCl (4 M en dioxano, 1,8 ml, 7,3 mmol) y CH²Cl² (2,9 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas y luego se concentró para dar la sal de HCl del compuesto titulado que se desaló usando una columna SCX de intercambio catiónico de 25 g que se lavó previamente con MeOH y se enjuagó con NH³2 N en MeOH para dar el compuesto titulado como un aceite incoloro (491 mg, 1,20 mmol, 82%). ES/MS (m/z): 411 (M+H).

El siguiente compuesto fue preparado esencialmente de la misma manera que el procedimiento de Preparación 94 usando el intermedio adecuado.

Tabla 17

Preparación 96

Diclorhidrato de 3-[2-[[(1S)-1-[4-[(2-Ciclopropil-1-piperazin-1-il-etil]fenil]etil]amino]-6-fluoro-pirimidin-4-il]-4,4-dimetil-oxazolidin-2-ona, isómero 1

Una solución de ferc-butil 4-[2-ciclopropil-1-[4-[(1S)-1-[[4-(4,4-dimetil-2-oxo-oxazolidin-3-il)-6-fluoro-pirimidin-2-il]amino]etil]fenil]etil]piperazina-1-carboxilato (1,11 g, 1,85 mmol) en CH²Cl² (9 ml) se trató con HCl (4,0 mol/l en 1,4-dioxano (9,5 ml, 38 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. La reacción se concentró a presión reducida para dar el compuesto titulado (1,142 g, 90% en masa, 100%) como un sólido blanco. ES/MS m/z 483 (M+H de base libre).

El siguiente compuesto fue preparado esencialmente de la misma manera que el procedimiento de Preparación 96 usando el intermedio adecuado.

Tabla 17a

Ejemplo 1

(S)-3-(2-(((S)-1-(4-((4-Acriloilpiperazin-1-il)metil)fenil)etil)amino)pirimidin-4-il)-4-isopropiloxazolidin-2-ona

A una solución de (S)-4-isopropil-3-(2-(((S)-1-(4-(piperazin-1-ilmetil)fenil)etil)amino)pirimidin-4-il)oxazolidin-2-ona (4,6 g, 11 mmol) en CH²Cl² (100 ml) se le agregó cloruro de acriloilo (0,97 ml, 12 mmol) a 0 °C. Después de 15 minutos, se agregó NaHCO3 acuoso saturado y se retiró el baño de enfriamiento. La mezcla resultante se diluyó adicionalmente con salmuera y se extrajo con CH²Cl² (3*), se secó (MgSO4), se filtró y se concentró para dar un sólido blanco que se purificó por cromatografía en gel de sílice eluyendo con 50-100% de hexanos/[10% de MeOH en acetona] para dar el compuesto titulado como un sólido blanco (4,35 g, 9,1 mmol, 84%). ES/MS (m/z): 479 (M+H).

Los siguientes compuestos fueron preparados esencialmente de la misma manera que el procedimiento del Ejemplo 1 usando el intermedio adecuado.

Tabla 18

Ejemplo 20

(4S)-3-[2-[[(1S)-1-[4-[2-Ciclopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]pirimidin-4-il]-4-isopropiloxazolidin-2-ona, isómero 1

Una solución de (4S)-3-[2-[[(1S)-1-[4-[2-ciclopropil-1-piperazin-1-il-etil]fenil]etil]amino]pirimidin-4-il]-4-isopropiloxazolidin-2-ona, isómero 1 (1,665 g, 3,270 mmol) en CH²Cl² (30 ml) se enfrió a 0 °C, se trató gota a gota con una solución de cloruro de acriloilo (306 pl, 3,760 mmol) en CH²Cl² (3 ml) y se agitó a temperatura ambiente. La mezcla se apagó con MeOH (aproximadamente 3 ml), luego con bicarbonato de sodio acuoso y se dejó calentar a temperatura ambiente. Las capas se separaron y la capa acuosa se volvió a extraer con 3* CH²Cl². Los extractos orgánicos se combinaron, se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y el solvente se eliminó a presión reducida para dar el producto bruto. El material bruto se purificó con cromatografía ultrarrápida en gel de sílice eluyendo con un gradiente de 20 a 40% (10% de MeOH en acetona) en hexanos para dar el compuesto titulado como un sólido amorfo (1,304 g, 74%). ES/MS m/z 533 (M+H).

El siguiente compuesto fue preparado esencialmente de la misma manera que el procedimiento del Ejemplo 20 usando el intermedio adecuado.

Tabla 19

Ejemplo 22

3-[2-[[(1S)-1-[4-[2-Ciclopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-6-fluoro-pirimidina-4-il]-4,4-dimetiloxazolidin-2-ona, isómero 1

Una solución de 3-[2-[[(1S)-1-[4-[2-ciclopropil-1-piperazin-1-il-etil]fenil]etil]amino]-6-fluoro-pirimidin-4-il]-4,4-dimetiloxazolidin-2-ona, diclorhidrato del isómero 1 (1,118 g, 1,811 mmol, 90% en masa) en cH ²Cl² (aproximadamente 50 ml) se trató con NaHCO3 saturado y las capas se separaron. La capa acuosa se extrajo con 2* CH²Cl² adicional y los orgánicos combinados se secaron sobre Na2SO4. La solución de CH²Cl² (aproximadamente 100 ml) se enfrió a 0 °C, se trató gota a gota con una solución de cloruro de acriloilo (170 pl, 2,089 mmol) en CH²Cl² (1 ml) y se agitó a 0 °C durante 2 minutos. La mezcla se apagó con MeOH (aproximadamente 1 ml), se diluyó con NaHCO3 saturado y se dejó calentar a temperatura ambiente. La reacción se extrajo con 2* CH²Cl². Los extractos orgánicos se combinaron, se secaron sobre Na2SO4, se concentraron a presión reducida y se purificaron por cromatografía ultrarrápida en gel de sílice con 10% a 30% (10% de MeOH en acetona) en hexanos para dar el compuesto titulado (870 mg, 89%) como un sólido blanco amorfo ES/MS m/z 537 (M+H).

El siguiente compuesto fue preparado esencialmente de la misma manera que el procedimiento del Ejemplo 22 usando el intermedio adecuado.

Tabla 20

Ejemplo 24

3-[6-Amino-2-[[(1S)-1-[4-[1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)propil]fenil]etil]amino]pirimidin-4-il]-4,4-dimetil-oxazolidin-2-ona, isómero 1

Una solución de CH²Cl² (24 ml) de 3-[6-amino-2-[[(1S)-1-[4-[1-piperazin-1-ilpropil]fenil]etil]amino]pirimidin-4-il]-4,4-dimetil-oxazolidin-2-ona, isómero 1 (1,26 g, 2,78 mmol) se enfrió en un baño de hielo. Cuando se enfrió, la solución se trató con una solución de CH²Cl² (1 ml) de cloruro de acriloilo (224 pl, 2,75 mmol) gota a gota a través de una jeringa dando un precipitado de aceite viscoso. La suspensión se enfrió a -78 °C, se trató con TEA (387 pl, 2,78 mmol) y se dejó agitar a -78 °C durante 15 minutos. La reacción se apagó con MeOH (1 ml), se diluyó con bicarbonato de sodio acuoso saturado y se dejó calentar a temperatura ambiente. Las capas se separaron y la capa acuosa se extrajo con 2* CH²Cl². Los extractos orgánicos se combinaron, se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y el solvente se eliminó a presión reducida. El material bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida en gel de sílice eluyendo con un gradiente del 2% al 5% de MeOH en CH²Cl² para dar el compuesto titulado (855 mg, 59%) como un sólido amorfo blanco. ES/MS m/z 508 (M+H).

El siguiente compuesto fue preparado esencialmente de la misma manera que el procedimiento del Ejemplo 24 usando el intermedio adecuado.

Tabla 21

Ejemplo 26

(4R)-3-[2-[[(1S)-1-[4-[2-Ciclopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]pirimidin-4-il]-4-[(1R)-1-hidroxietil]oxazolidin-2-ona

Se agregó cloruro de acriloilo (1,23 M en CH²Cl² , 0,292 ml, 0,3589 mmol) a una solución de (4R)-3-[2-[[(1S)-1-[4-(2-ciclopropil-1-piperazin-1-il-etil)fenil]etil]amino]pirimidin-4-il]-4-[(1R)-1-hidroxietil]oxazolidin-2-ona (176 mg, 0,3589 mmol) en CH²Cl² (5 ml) y se enfrió en un baño de acetona con hielo seco. Después de -20 minutos, la mezcla se repartió entre CH²O ² y solución saturada de bicarbonato de sodio. La capa orgánica se lavó con NaCl acuoso saturado, se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró. El residuo bruto se purificó con cromatografía en gel de sílice eluyendo con 10% a 70% [10% de MeOH en EtOAc] en CH²Cl² para dar el compuesto titulado como un sólido blanco (199 mg, 100%). ES/MS (m/z): 535,4 (M+H).

El cáncer es reconocido con mayor frecuencia como una colección heterogénea de enfermedades cuyo inicio y progresión son inducidos por la función aberrante de uno o más genes que regulan la reparación del ADN, la estabilidad del genoma, la proliferación celular, la muerte celular, la adhesión, la angiogénesis, la invasión y la metástasis en microambientes celulares y tisulares. La función variante o aberrante de los genes "cancerosos" puede ser el resultado de un polimorfismo de ADN natural, cambios en el número de copias del genoma (mediante amplificación, deleción, pérdida o duplicación de cromosomas), cambios en la estructura de genes y cromosomas (mediante translocación, inversión o cromosoma). otro reordenamiento que conduce a la expresión de genes desregulados) y mutaciones puntuales. Las neoplasias cancerosas pueden ser inducidas por una función genética aberrante y mantenidas por la misma función genética aberrante, o el mantenimiento y la progresión exacerbados por funciones genéticas aberrantes adicionales.

Más allá de las aberraciones cromosómicas genéticas mencionadas anteriormente, cada uno de los cánceres también puede incluir modificaciones epigenéticas del genoma que incluyen metilación de ADN, impresión genómica y modificación de histonas por acetilación, metilación o fosforilación. Una modificación epigenética puede desempeñar un papel en la inducción y/o mantenimiento de la neoplasia maligna.

Se han compilado extensos catálogos de las aberraciones citogenéticas en cáncer humano y se mantienen y actualizan regularmente en línea (consulte La Base de Datos Mitelman sobre Aberraciones Cromosómicas en Cáncer en el sitio web del Proyecto de Anatomía del Genoma del Cáncer (CGAP) del Instituto Nacional del Cáncer de EE. UU. (NCI)). El Proyecto del Genoma del Cáncer del Wellcome Trust Sanger Institute mantiene un "Censo Génico del Cáncer" detallado en línea de todos los genes humanos que se han relacionado causalmente con la tumorigénesis, así como la base de datos COSMIC (Catálogo de Mutaciones Somáticas en el Cáncer) sobre mutaciones somáticas en el cáncer humano. Una fuente adicional que contiene abundante información sobre los cambios citogenéticos causalmente relacionados con varios tipos de cáncer es el Atlas de Genética y Citogenética en Oncología y Hematología.

El diagnóstico de neoplasias malignas cancerosas por medio de biopsia, inmunofenotipaje y otro tipo de pruebas son bien conocidos y se usan de manera rutinaria. Además de las tecnologías formación de bandas cromosómicas de alta resolución y las tecnologías avanzadas de formación de imágenes cromosómicas, las aberraciones cromosómicas en casos sospechosos de cáncer se pueden determinar mediante análisis citogenéticos como la hibridación fluorescente in situ (FISH), cariotipado, cariotipado espectral (SKY), FISH multiplex (M-FISH), hibridación genómica comparativa (CGH), matrices de polimorfismo de un solo nucleótido (chips SNP) y otras pruebas de diagnóstico y análisis conocidas y utilizadas por los expertos en la técnica.

Se han identificado mutaciones en IDH1 en múltiples tipos de tumores cancerosos que incluyen, pero no se limitan a, glioma, glioblastoma multiforme (GBM), astrocitoma, oligodendroglioma, paraganglioma, síndrome mielodisplásico (MDS), leucemia linfoblástica aguda de células B (B-ALL), de tiroides, colorrectal, leucemia mieloide aguda (AML), Dang et al., Trends Mol. Med., 2010, 16: 387-397; Ward et al., Oncogene, 2012, 31(19): 2491-2498; melanoma, Shibata et al., Am. J. Pathol., 2010, 178(3): 1395-1402; de próstata, Flaherty et al., J. Clin. Oncol., 2014, 32 (supl. 4; Resumen 213); Cairns et al., Cancer Discovery, 2013, 3: 730-741; condrosarcoma y colangiocarcinoma, Balss et al., Acta Neuropathol., 2012, 124: 883-891; Cairns et al., Cancer Discovery, 2013, 3: 730-741, linfoma angioinmunoblástico de células T (AITL), Cairns et al. Blood, 2012. 119 (8): 1901-1903. Se han encontrado mutaciones en o cerca de residuos particulares en el sitio activo: G97D, R100, R132H, R132C, R132S, R132V, R132G, V71I, R132L y G123R para IDH1, Dang et al., Trends Mol. Med., 2010, 16: 387-397; Ward et al., 2012 y Tabla Sumplementaria 2.

Se ha demostrado que las formas mutantes de IDH1 tienen una actividad neomórfica (ganancia de función) que reduce el a-cetoglutarato a 2-hidroxiglutarato. La producción endógena de 2-hidroxiglutarato es enantioespecífica, lo que da como resultado la generación del enantiómero D (también denominado enantiómero (R)). Normalmente, las células tienen niveles bajos de 2-hidroxiglutarato mientras que las células que albergan mutaciones IDH1 evidencian niveles significativamente elevados de 2-hidroxiglutarato. Se detectan niveles significativamente elevados de 2-hidroxiglutarato en tumores que albergan las mutaciones y en plasma de pacientes con IDH1 mutante. Los altos niveles de 2-hidroxiglutarato están asociados con un fenotipo de hipermetilación que resulta en un bloqueo en la diferenciación que conduce a una mayor tumorigénesis.

La actividad de un inhibidor covalente irreversible específico se define por su unión al objetivo (IDH1), definida por Ki, y la tasa potencial máxima de formación de enlace covalente, definida por kinact. Estos dos factores no son entidades separadas, sino que trabajan conjuntamente para producir el efecto deseado de la formación de enlaces covalentes. Esto se ilustra en los siguientes 3 puntos.

En primer lugar, el hecho de que un electrófilo, por ejemplo, la acrilamida, debe colocarse adecuadamente en relación con un nucleófilo, por ejemplo, la cisteína, es un componente fundamental de la formación de enlaces covalentes en la química orgánica. Hay un ángulo y una distancia precisos a los que el nucleófilo debe acercarse al electrófilo para formar el enlace covalente. La simple colocación de un electrófilo cerca de un nucleófilo no es suficiente para la formación de enlaces covalentes.

En segundo lugar, cuando se incorpora un grupo reactivo en un núcleo que contiene restos de enlace de hidrógeno para estabilizar la unión del inhibidor a la enzima, por ejemplo, un núcleo de orientación, un experto en la técnica debe considerar cómo el núcleo de orientación se une a la diana y coloca el electrófilo en relación con el nucleófilo a la luz del ángulo y la distancia óptimos mencionados anteriormente. Nuevamente, la simple colocación de un electrófilo cerca de un nucleófilo no es suficiente para la formación de enlaces covalentes. Los cambios en el núcleo de orientación pueden afectar la capacidad de un compuesto inhibidor para formar un enlace covalente.

En tercer lugar, cuando los dos puntos anteriores se consideran en conjunto, la mera presencia de un resto electrófilo en un núcleo de orientación no es suficiente para sugerir que se formará un enlace covalente.

Los siguientes estudios in vitro e in vivo demuestran la actividad inhibidora de la proteína IDH1 mutante y la eficacia de los compuestos probados de Fórmula I contra diversas líneas celulares de cáncer específicas. En general, los expertos en la técnica reconocen que estos ensayos predicen la actividad terapéutica clínica humana contra las neoplasias proliferativas que contienen células cancerosas con estas enzimas de IDH1 mutante. Los ensayos que demuestran la actividad inhibidora de IDH1 mutante y la eficacia pueden llevarse a cabo sustancialmente de la siguiente manera o mediante ensayos similares que proporcionan datos similares.

Los resultados de los siguientes ensayos demuestran que los compuestos ejemplificados y probados son útiles como inhibidores de IDH1 mutante, son inhibidores covalentes y pueden ser útiles en el tratamiento de cánceres que expresan IDH1 mutante. En cada uno de los ensayos a continuación, en los que se somete a prueba el compuesto de la Técnica especificada, compuestos de la técnica adicionales se preparan, prueban y proporcionan datos similares.

Ensayos Bioquímicos para las Enzimas Mutantes IDH1 e IDH2

Las enzimas mutantes IDH1-R132H, IDH1-R132C, IDH2-R172K e IDH2-R140Q catalizan la conversión de aKG a 2HG. Se analiza 2HG utilizando extracción en fase sólida en línea y espectrometría de masas. Este análisis se lleva a cabo en un instrumento RapidFire® acoplado a un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo 6460 (Agilent G6460A).

Las proteínas mutantes IDH1 (R132H y R132C) y mutantes IDH2 (R140Q y R172K) que contienen la etiqueta His N-terminal se expresan en E. coli y se purifican usando cromatografía de afinidad de níquel mediante procedimientos comúnmente utilizados y conocidos por los expertos en la técnica. Los ensayos enzimáticos se llevan a cabo en placas de polipropileno de 96 pocillos con fondo en V que contienen tampón Tris-HCl 100 mM, DTT 1 mM, TRITON™ X-100 al 0,005%, NaCI 120 mM. Para IDH1 R132H, se incluyen a-cetoglutarato, NADPH y MnCl² en concentraciones finales de 300 pM, 2,5 pM y 300 pM, respectivamente. Para IDH1 R132C, se incluyen a-cetoglutarato, NADPH y MnCb a concentraciones finales de 100 pM, 10 pM y 100 pM, respectivamente. Para IDH2 R172K, se incluyen a-cetoglutarato, NADPH y MnCb en concentraciones finales de 150 pM, 10 pM y 150 pM, respectivamente. Para IDH2 R140Q, se incluyen a-cetoglutarato, NADPH y MnCb en concentraciones finales de 300 pM, 10 pM y 100 pM, respectivamente. Ph final = 7,0. El compuesto de prueba, disuelto en reserva de DMSO, se diluyó en la mezcla de reacción a una concentración final de DMSO del 4%. Los compuestos se prueban en formato dosis-respuesta. El ensayo se inicia mediante la adición de enzima. Las enzimas se usan en las siguientes concentraciones finales: IDH1 R132H, 2 nM; IDH1 R132C, 0,5 nM; IDH2 R172K, 1,2 nM; IDH2 R140Q, 1,2 nM y se permite que el ensayo continúe durante los siguientes tiempos: 40 minutos para IDH-1R132C, 60 minutos para IDH-1HR132H y 50 minutos para las enzimas IDH-2172K e IDH-2R140Q. La reacción se apagó agregando ACN (50:50) que contenía ds-3HG como un estándar interno para el análisis de espectrometría de masas y la cuantificación del producto de reacción. Se separó 2HG en muestras inactivadas usando cromatografía en columna de intercambio aniónico fuerte (Phenomenex Strata-X-A SecurityGuard, 4*3 mm) y se analiza por espectrometría de masas en un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo 6460 (Agilent G6460A). La señal de 2HG detectada se transforma en una concentración de analito usando una curva de calibración generada usando concentraciones conocidas de 2HG. Para cada compuesto probado, el % de inhibición se calcula usando una muestra de control DMSO como 0% de inhibición y un control sin enzimas como 100% de inhibición. Los valores de IC⁵⁰ se obtienen a partir de los valores de % de inhibición individual a diferentes concentraciones de compuestos usando una ecuación de 4 parámetros. Estos cálculos se llevaron a cabo utilizando los programas de análisis de datos Activity Base (IDBS) o Screener (Genedata).

Los resultados de este ensayo demuestran que los compuestos ejemplificados y probados inhiben la actividad mutante IDH1 contra IHD1/R132H e IDH1/R132C.

Los siguientes ejemplos fueron sometidos a prueba esencialmente como se describió anteriormente y exhiben actividad para IDH1 mutante como se muestra en la Tabla 22 a continuación y son selectivos para IDH1 mutante sobre IDH2 mutante (datos no mostrados para IDH2 mutante).

Tabla 22

Los resultados de este ensayo demuestran que los compuestos de Ejemplo enumerados en la Tabla 22 son menos activos en la inhibición de la enzima IDH1 de tipo salvaje en comparación con las enzimas mutantes IDH1 R132H o R132C.

Ensayo de Dilución de Salto Bioquímico de IDH1 (R132H)

Los compuestos de Ejemplo liofilizados se reconstituyen a 10 mM o 100 mM con DMSO al 100% y se mantienen a temperatura ambiente hasta que se prueban. La proteína IDH1(R132H)-His se expresa y purifica por procedimientos bien conocidos y comúnmente utilizados por los expertos en la técnica. Los reactivos del ensayo incluyeron lo siguiente: ácido a-cetoglutarico (Sigma N.° de Cat. K1875), MnCh - Fisher Scientific N.° de Cat. M87-100, NADPH - Sigma-Aldrich N.° de Cat. N7505, Tris-HCl (Invitrogen, N.° de Cat. 15567-027), NaCl (Sigma, S3014), ditiotreitol (Sigma, D5545) y TritonX100 (Peirce, 28314). El kit NAD(P) H-Glo™ de Promega (G9061).

El tampón de ensayo utilizado en su totalidad contiene Tris-HCl 100 mM, pH 7,0, NaCl 120 mM, DTT 1 mM, Triton X-100 al 0,005% y DMSO al 2% (a partir de la adición del compuesto de prueba). La IC⁵⁰ de cada compuesto se determinó incubando una respuesta a la dosis del compuesto, preparada en un Echo555, con IDH1 1,5 nM (R132H), a-cetoglutarato 1 mM, MnCh 1 mM y NADPH 15 pM en tampón de ensayo. La reacción se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente, luego se detuvo usando 6-ciclopropil-5-(isoquinolin-5-il)-2-[(3R)-4-(3-metoxipropanoil)-3-metilpiperazin-1-il]piridina-3-carbonitrilo (10 pM). Las concentraciones de NADPH se midieron con el kit NAD(P)H-Glo™, según lo especificado por el proveedor. La señal luminiscente se leyó en el Envision (Perkin Elmer; 0,1 seg/Espejo de Luminiscencia/filtro Lum700 WL400-700). En el siguiente experimento de dilución de salto, una concentración de compuesto equivalente a 10* la IC⁵⁰ se incubó previamente con IDH1 100 nM (R132H). La concentración del compuesto siempre es mayor o igual que la concentración de la enzima. Después de 2 horas a temperatura ambiente, esta mezcla se diluyó 1:100 en una solución que contenía a-cetoglutarato (10 mM), MnCl² (10 mM) y NADPH (15 pM). Esta reacción enzimática final contenía 1 nM IDH1 (R132H) y 0,1 * [IC⁵⁰]. Después de una incubación de 2 horas a temperatura ambiente, la concentración de NADPH se midió como se especificó anteriormente usando 6-ciclopropil-5-(isoquinolin-5-il)-2-[(3R)-4-(3-metoxipropanoil)-3-metilpiperazina-1-il]piridina-3-carbonitrilo y el kit NAD(P)H-Glo™. Se incluyeron tres controles: 1) "Control 10*" que contenía compuesto 10*IC50 en la preincubación y el ensayo enzimático, excepto el a-cetoglutarato 1 mM, MnCh 1 mM y NADPH 15 pM se utilizó en el ensayo final que mide la actividad enzimática, 2) "Control de Actividad Máxima" que contenía DMSO en lugar del compuesto tanto para la preincubación como para el ensayo enzimático, y 3) "Control 0,1*" que contenía DMSO en lugar del compuesto en la preincubación y compuesto 0.1*IC50 en el ensayo enzimático. Se incluyó un "Control de Actividad Mínima" que carecía de enzima, pero por lo demás era equivalente al "Control de Actividad Máxima". Se realizó un segundo conjunto de Controles de Actividad Máxima y Mínima utilizando a-cetoglutarato 1 mM, MnCb 1 mM y NADPH 15 pM. Cada condición de ensayo se probó por triplicado y se realizaron 32 réplicas para el Control de Actividad Máxima (10 mM) y el Control de Actividad Mínima (10 mM), mientras se realizaban 16 réplicas para el Control de Actividad Máxima (1 mM) y el Control de Actividad Mínima (1 mM).

La concentración de NADP (producto) producida en cada experimento/control se determinó usando la disminución porcentual de la señal observada en relación con el Control de Actividad Mínima, que contenía NADPH 15 pM. El Control de Actividad Mínima (1 mM y 10 mM) y el Control de Actividad Máxima (1 mM y 10 mM) se promediaron y se calculó la desviación estándar para cada uno. La señal para cada dilución de salto y para los Controles 0,1* se multiplicó por 15 y luego se dividió por los recuentos promedio para los pocillos de Control de Actividad Mínima (10 mM). Este número se restó de 15 para calcular el NADP (pM de producto). Se usaron los mismos cálculos para los Controles 10* pero se usaron los Controles de Actividad Mínima (1 mM). Los pmoles del producto para los Controles de Actividad Máxima (1 mM y 10 mM) se calcularon multiplicando los recuentos promedio por 15 y luego se dividieron por los Controles de Actividad Mínima respectivos (1 mM y 10 mM). Los pM de NADP para cada pocillo se dividieron por el Control de Actividad Máxima promedio (1 mM o 10 mM) y luego se multiplicó por 100 para determinar el % de actividad IDH para la dilución de salto del compuesto, Control 10* y Control 0,1*. Un compuesto que aprueba debe mostrar <30% de actividad para el Control 10*, lo que demuestra que la concentración de preincubación es suficiente para saturar la enzima con el compuesto. Además, el compuesto debe mostrar> 70-80% de actividad para el Control 0,1*, lo que confirma que no hay inhibición a la concentración 0,1*/compuesto diluido.

Los siguientes ejemplos fueron sometidos a prueba esencialmente como se describió anteriormente y exhiben el % de datos de recuperación para IDH1/R132H en este ensayo como se muestra en la Tabla 23 a continuación.

Los ejemplos que se muestran a continuación inhiben la enzima 2 horas después de la dilución, a diferencia del compuesto de la técnica que no inhibió la enzima 2 horas después de la dilución con el % de recuperación que se muestra a continuación.

Tabla 23

Estos datos demuestran que los compuestos actúan de manera consistente con la inhibición covalente de IDH1 mutante ya que la dilución del inhibidor no da como resultado la recuperación de la actividad enzimática.

Ensayos Bioquímicos para las Enzimas IDH1 e IDH2 de Tipo Salvaje

Las enzimas IDH1 e IDH2 catalizan la conversión de isocitrato a aKG. Las proteínas IDH1 de Tipo Salvaje (Centro Nacional de Información Biotecnológica, Acceso: NP_001269316.1) e IDH2 (Centro Nacional de Información Biotecnológica, Acceso: EAX02082.1) que contienen la etiqueta His N-terminal se expresan en E. coli y se purifican con cromatografía de afinidad con níquel mediante procedimientos comúnmente utilizados y bien conocidos por los expertos en la técnica. Los ensayos enzimáticos se llevan a cabo en placas de polipropileno de 96 pocillos con fondo en V que contienen tampón Tris-HCl 100 mM a pH 7,5, DTT mM, 0,005% TRITON™ X-100, NaCl 120 mM. Para el isocitrato de ensayo de tipo salvaje IDH1, NADp y MnCb se incluyen en las concentraciones de 85 pM, 50 pM y 20 pM, respectivamente. Para el isocitrato de ensayo de tipo salvaje IDH2, NADP+ y MnCb se incluyen a las concentraciones de 30 pM, 50 pM y 10 pM, respectivamente. Los inhibidores disueltos en una solución madre de DMSO se diluyen en la mezcla de reacción a una concentración final de DMSO del 4%. El ensayo enzimático se termina (apaga) mediante la adición de ACN (50:50) que contiene d (d6-aKG) como un estándar interno para el análisis de espectrometría de masas. Se combinaron 10 pl de mezcla de reacción con 100 pl de agua, 50 pl de O-bencilhidroxilamina 1 M en tampón de piridina (⁸ ,⁶ % de piridina, pH 5) y 50 pl de EDC 1 M en tampón de piridina. Después de la derivatización a temperatura ambiente durante una hora, las muestras se extrajeron con EtOAc (600 pl). Se eliminaron 400 pl de la capa superior, se secaron bajo nitrógeno calentado y se reconstituyeron con MeOH/agua (1:1) (100 pl). Se inyectaron 10 pl de muestra derivatizada en un sistema LC-MS que consistía en un sistema HPLC Shimadzu Prominence 20A y un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo Thermo Quantum Ultra™. Los analitos se separaron en una columna Waters XBridge™ C18 (2,1 x 50 mm, 3,5 pm) con un caudal de 0,6 ml/minuto. La fase móvil A es ácido fórmico al 0,1% en agua y la fase móvil B es MeOH. La señal de aKG detectada se transforma en concentración de analito utilizando una curva de calibración generada utilizando concentraciones conocidas de aKG. Para cada compuesto probado, el % de inhibición se calculó usando una muestra de control DMSO como 0% de inhibición y un control sin enzimas como 100% de inhibición. Los valores de IC⁵⁰ se obtienen a partir de los valores de % de inhibición individual a diferentes concentraciones de compuestos usando una ecuación de 4 parámetros. Estos cálculos se llevaron a cabo utilizando los programas de análisis de datos Activity Base (IDBS) o Screener (Genedata).

Los siguientes Ejemplos en la Tabla 24 se prueban esencialmente como se describió anteriormente para los Ensayos Bioquímicos para las Enzimas Mutantes IDH1 e IDH2 y son menos activos en la inhibición de la enzima de tipo salvaje IDH1 en comparación con las enzimas mutantes IDH1 R132H o R132C.

Tabla 24

Ensayos Basados en Células para Inhibidores Mutantes IDH1

Para probar la inhibición celular del mutante IDH1 R132C, se usó la línea celular de fibrosarcoma HT1080 (ATCC). Para las pruebas de inhibición basada en células de la mutación R132H, la línea celular de glioma U87MG (ATCC) se transfectó de manera estable con un constructo de ADN que expresaba la enzima mutante R132H preparada por procedimientos bien conocidos y utilizados habitualmente por los expertos en la técnica.

Ensayo Celular HT1080

Se colocaron en placa 15.000 células en placas de 96 pocillos recubiertas con poli-D-lys (15.000 células/pocillo) 18-24 horas antes del tratamiento con compuestos. Cuatro horas antes del tratamiento compuesto, las células fueron privadas de glutamina eliminando los medios normales y reemplazándolos con medios libres de glutamina. Después de la privación, las células se trataron con diferentes concentraciones de compuestos de prueba (20 pM a 1 nM) disueltos en medios libres de glutamina que contenían DMSO a una concentración final de 0,2%. La incubación inicial del compuesto es de 1 hora a 37 °C/5% de CO². Después de 1 hora, se agregó glutamina a una concentración final de 2 mM y las células tratadas se incubaron durante 18 horas adicionales a 37 °C/5% de CO². Después de la incubación de 18 horas, se analizaron 2HG y aKG intracelulares en lisados celulares. Los lisados se prepararon después de la eliminación de los medios y la adición de tampón que contenía Tris-HCl 25 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM/Triton-X 100 al 1% a las células. Se agregó una alícuota de lisado a una mezcla de d6-aKG y ds-3HG como patrones internos y la mezcla se trató con O-bencilhidroxilamina en presencia de EDC y piridina. Los derivados del analito se extrajeron con EtOAc, se secaron y luego se reconstituyeron con MeOH al 50% en H²O. Las muestras preparadas como se ha descrito se inyectaron en la HPLC para separar los derivados 2HG y aKG (y los patrones internos correspondientes) usando una cromatografía de fase inversa en una columna C18. El análisis de las muestras se llevó a cabo utilizando un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo 6460 (G6460A Agilent). Las señales de 2HG y aKG detectadas se transformaron en concentración de analitos utilizando la relación de aKG/d6-aKG y la relación de 2HG/ds-3HG que se extrapoló dentro de una curva de calibración. El porcentaje de inhibición para cada muestra individual se obtuvo después de normalizar la concentración calculada de 2HG o aKG a las referencias máximas y mínimas obtenidas en presencia y en ausencia de glutamina durante el tratamiento celular con compuestos. Los valores de IC⁵⁰ se obtuvieron a partir del % de inhibición individual usando una ecuación sigmoidea de respuesta a la dosis de 4 parámetros. Estos cálculos se llevaron a cabo automáticamente utilizando los programas de análisis de datos Activity Base (IDBS) o Screener (Genedata).

Los resultados de este ensayo demuestran que los Ejemplos probados en la Tabla 25 inhiben la producción de 2-hidroxiglutarato, lo que indica la inhibición de IDH1 R132C mutante en células en este ensayo. aKG, un metabolito generado por IDH1 de tipo salvaje no se vio afectado por los inhibidores, lo que indica que los compuestos son selectivos para IDH1 mutante sobre IDH1 de tipo salvaje en las células en este ensayo. Los valores IC⁵⁰ resultantes para los siguientes ejemplos se muestran en la Tabla 25.

Tabla 25

Ensayo Celular U87MG/IDH1R132H

Las células se colocaron en placas en placas de 96 pocillos recubiertas con poli-D-lys (12.000 células/pocillo) 18­ 24 horas antes del tratamiento con compuestos. Cuatro horas antes del tratamiento compuesto, las células fueron privadas de glutamina eliminando los medios normales y reemplazándolos con medios libres de glutamina. Después de la privación, las células se trataron con diferentes concentraciones de compuestos de prueba (20 pM a 1 nM) disueltos en medios libres de glutamina que contenían DMSO a una concentración final de 0,2%. La incubación inicial del compuesto es de 1 hora a 37 °C/5% de CO². Después de 1 hora, se agregó glutamina a una concentración final de 2 mM y las células tratadas se incubaron durante 18 horas adicionales a 37 °C/5% de CO². El 2HG intracelular se analizó en lisados celulares obtenidos después de la eliminación del medio y el tratamiento con tampón de lisis (Tris-HCl 25 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM/Triton-X 100 al 1%). Los lisados celulares se conservaron a -80 °C hasta el procesamiento. Para la extracción de analitos, se transfierió una alícuota de lisado descongelado a una placa profunda de 96 pocillos y se trató con MeOH frío que contenía ds-3HG como patrón interno seguido de cloroformo y H²O (1:4:3:2). La fase superior se recogió después de la separación y se inyectó en HPLC para separar 2HG (y patrón interno) usando cromatografía de interacción hidrófila (HILIC) acoplada a la detección MS/MS en un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo 6460. El porcentaje de inhibición para cada muestra individual se obtuvo después de normalizar la concentración calculada de 2HG a las referencias máximas y mínimas obtenidas en presencia y en ausencia de glutamina durante el tratamiento celular con compuestos. Los valores de IC⁵⁰ se obtienen a partir del % de inhibición individual usando una ecuación sigmoidea de respuesta a la dosis de 4 parámetros. Estos cálculos se llevaron a cabo automáticamente utilizando los programas de análisis de datos Activity Base (IDBS) o Screener (Genedata).

Los siguientes ejemplos fueron sometidos a prueba esencialmente como se describió anteriormente y exhiben actividad de inhibición contra IDH1/R132H mutante en células U87MG en este ensayo, tal como se muestra en la Tabla 26 a continuación.

Tabla 26

Ensayo in vivo de 2-Hidroxiglutarato

Para las pruebas in vivo de inhibidores de IDH1, se cultivaron tumores de xenoinjerto subcutáneo en ratones desnudos atímicos (20-22 g, Harlan Laboratories) después de la implantación de células TB08-0537 (TB08) (glioblastoma secundario que porta IDH1 mutante R132H; humano heterocigoto; WO 2013/086506). A los ratones se les dio de beber y se alimentaron ad libitum y se aclimataron durante ¹ semana antes de la implantación de las células. Las TB08 se implantaron como fragmentos tumorales directamente en el flanco trasero derecho. Los volúmenes tumorales se miden con un calibrador dos veces por semana y el volumen tumoral se calcula usando 0,536 x L x W2, donde L = longitud y W = anchura. Cuando los volúmenes tumorales alcanzan 150-400 mm3, los animales son aleatorizados, colocados en grupos (n = 3-6 por grupo) y dosificados con inhibidores de IDH1 o control de vehículo. Para los inhibidores de IDH1, los compuestos se formularon en un vehículo que contenía 20% de Captisol® en tampón fosfato 25 mM, pH 2 con 1 mol eq IN HCl. Los compuestos se bañaron por ultrasonido para obtener la suspensión. Los compuestos se dosificaron en una base de miligramo por kilogramo (mpk) mediante sonda oral en un volumen final de 0,2 ml. Para determinar la inhibición de 2HG, los compuestos se dosificaron una vez al día (QD) durante ⁶ días (número total de dosis = ⁶ ). Doce horas después de la última dosis, los ratones se sacrificaron con anestesia con isofluorano y luxación cervical. Los ratones de control de vehículo recibieron el mismo esquema de dosificación, pero sin la adición del compuesto inhibidor IDH1. Los tumores se extirparon, se colocaron en tubos etiquetados y se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido. Los tumores se almacenaron a -80 °C para su procesamiento.

Preparación de lisados tumorales

El tampón XY Lite se preparó en agua de grado molecular y contiene los siguientes componentes: T ris 25 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, Triton X-100 al 1%, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM. A XY Lite (40 ml), se agregaron 800 pl de cóctel de inhibidores de la proteasa y de la fosfatasa Halt (cóctel de inhibidores de la proteasa y de la fosfatasa Halt™, Thermo Scientific libre de EDTa , N.° de Cat. 78441). Las muestras se agitaron en vórtice y luego se enfriaron en hielo. Los tubos de lisis de tapa naranja-A se etiquetaron y se colocaron en una rejilla sobre hielo. Se colocó un mortero y una maja de cerámica en hielo seco para refrigeración. Se colocó un cuadrado de papel de aluminio de 2 x 2 pulgadas (5 x ⁵ cm) en el fondo del mortero. Una muestra tumoral se transfirió al mortero prerefrigerado en el cuadrado de aluminio. Se agregó nitrógeno líquido (aproximadamente 5 ml) y se dejó evaporar, sobrecongelando el tumor. Se colocó otro trozo de papel de aluminio sobre el tumor y el tumor se rompió en pedazos pequeños con el mortero de cerámica. El tumor aplastado se transfirió rápidamente al tubo de lisis. Se agregó XY Lite helado (500 pl) a cada tubo y se tapó. Luego, los tumores se procesaron en FastPrep-24 MP Biomedicals girando dos veces durante 35 segundos cada uno a la configuración de velocidad 5. Las muestras se centrifugaron en Beckman Microfuge R a 4 °C a 14.000 rpm durante 30 minutos. El sobrenadante se transfirió a una placa de 96 pocillos profundos previamente refrigerada. El gránulo es desechado.

Ensayo de Proteínas

Primero se generó una placa de dilución de ensayo de proteínas mediante la adición de tampón XY (145 pl) a una placa Corning de fondo redondo no estéril de 96 pocillos. Para esto, se agregó lisado tumoral (5 pl) y se mezcló suavemente. El plato se mantuvo en hielo. Las diluciones en serie del estándar BSA (Cat. Thermo Scientific 23209 2 mg/ml) se configuraron de la siguiente manera: se colocaron cinco tubos de 0,5 ml en un estante y se agregó tampón XY (60 pl) a cada uno. La reserva de BSA (60 pl) se agregó al primer tubo y se agitó en vórtice. Se transfirieron 60 pl del primer tubo al siguiente tubo, se agitaron en vórtice, y así sucesivamente, hasta que la serie de dilución se completó de la siguiente manera: Tubo ¹ = reserva de BSA, los tubos 2-5 son diluciones en serie 1:2, tubo ⁶ = tampón XY solo. Los reactivos de ensayo de proteínas Thermo BCA se mezclaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se agregó reactivo BCA mixto (200 pl) a cada muestra y se incubó durante 15 minutos. Los resultados del ensayo de proteínas se leyeron en SOFTmax Pro Plate Reader. En función de los resultados del análisis de proteínas, se agregó la cantidad apropiada de tampón XY a cada lisado tumoral para generar una concentración final de proteína de 5 mg/ml. Todas las muestras fueron etiquetadas y almacenadas a -80 °C.

Análisis de Metabolitos en Lisados Tumorales

Los efectos in vivo de la inhibición de IDH1 sobre las concentraciones totales de 2HG y aKG se determinaron mediante análisis de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) de xenoinjertos tumorales. El procedimiento utilizó derivatización con O-bencilhidroxilamina antes del análisis por LC-MS. Se colocaron 10 pl de cada lisado tumoral en una placa de 96 pocilios de pocilios profundos y se combinaron con 100 pl de solución estándar interna que contenía d5-3HG 10 pM y d6-aKG l0 pM. Se añadieron a cada muestra 50 pl de O-bencilhidroxilamina 1 M en tampón de piridina (8,6% de piridina, pH 5) y 50 pl de EDC 1 M en tampón de piridina. La reacción de derivación procedió a temperatura ambiente durante una hora. Usando un manipulador de líquidos Beckman Biomek FX, se agregó EtOAc (600 pl) a cada muestra. Las placas se sellaron y se agitaron en vórtice durante 5 minutos, luego se centrifugaron durante 5 minutos a 4000 rpm en una centrífuga Eppendorf 5810R. Se transfirieron 400 pl de la capa superior a una nueva placa de 96 pocillos. Las muestras se secaron bajo nitrógeno calentado a 50 °C y se reconstituyeron con 100 pl de MeOH/agua (1:1). Se inyectó 1 pl de muestra derivatizada en un sistema LCMs que consistía en un sistema de HPLC Shimadzu Prominence 20A y un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo Thermo Quantum Ultra™. Los analitos se separaron en una columna Water XBridge™ C18 (2,1 x ⁵⁰ mm, 3,5 pm) con un caudal de 0,6 ml/minuto. La fase móvil A era ácido fórmico al 0,1% en agua y la fase móvil B era MeOH. El perfil del gradiente era: 0 minutos, 5% de B; 3 minutos, 100% de B; 4,00 minutos, 100% de B; 4,1 minutos, 5% de B; 5,50 minutos, detención. El espectrómetro de masas utiliza una sonda HESI-II operada en modo de monitorización de reacción seleccionada con iones positivos. Las curvas de calibración se construyeron graficando las concentraciones de analito versus las relaciones de área de pico estándar analito/interno y realizando un ajuste cuadrático de los datos usando una ponderación de 1/concentración con el software Xcalibur™. Las concentraciones de analitos para las incógnitas se volvieron a calcular a partir de las curvas de calibración. Los datos de metabolitos del ensayo LCMS se expresaron en nmol/mg de proteína. El nivel promedio de 2HG en el grupo tratado con vehículo se usó para determinar el control de inhibición del 0%. El % de inhibición en cada animal tratado con inhibidor se determinó posteriormente en relación con el control del vehículo. Los datos se analizaron en el software JMP para determinar el % de inhibición promedio en cada grupo de dosis, la desviación estándar y el error estándar.

Los datos se muestran demostrando la inhibición in vivo de 2HG en ratones con xenoinjerto mutante IDH1 por los compuestos de los Ejemplos identificados en la Tabla 27. La Tabla 27 muestra la inhibición de 2HG evaluada a diferentes dosis de inhibidor en xenoinjertos mutantes IDH1R132H.

Tabla 27

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto de Fórmula I:

en la que:

R1 es hidrógeno, NH² o flúor;

R2 y R3 son metilo o hidrógeno; o R2 es metilo, etilo, 1-hidroxietilo, 1-metoxietilo, fluorometilo, 1-fluoroetilo o 1-metiletilo, y R3 es hidrógeno;

R4 es metilo o fluorometilo;

R5 es hidrógeno, etilo o -CH²-ciclopropilo, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

2. Un compuesto según la reivindicación 1, en el que:

R1 hidrógeno, ⁶ -NH² o 6-fluoro;

R2 y R3 son metilo; o R2 es 1-metoxietilo, o 1-metiletilo, y R3 es hidrógeno;

R4 es metilo;

R5 es hidrógeno, etilo o -CH²-ciclopropilo, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

3. Un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, seleccionado de:

(S)-3-(2-(((S)-1-(4-((4-acriloilpiperazin-1-il)metil)fenil)etil)amino)pirimidin-4-il)-4-isopropiloxazolidin-2-ona;

(S)-3-(2-((1 -(4-((4-acriloilpiperazin-1-il)metil)fenil)etil)amino)-6-fluoropirimidin-4-il)-4,4-dimetiloxazolidin-2-ona;

(R)-3-(2-(((S)-1-(4-((4-acriloilpiperazin-1-il)metil)fenil)etil)amino)pirimidin-4-il)-4-((R)-1-metoxietil)oxazolidin-2-ona; y

(R) -3-(2-(((S)-1-(4-((4-acriloilpiperazin-1-il)metil)fenil)etil)amino)-6-fluoropirimidin-4-il)-4-((R)-1-metoxietil)oxazolidin-2-ona, o una sal farmacéuticamente aceptable de cada uno de los compuestos antes mencionados.

4. Un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 3, que es:

(S) -3-(2-((1-(4-((4-acriloilpiperazin-1-il)metil)fenil)etil)amino)-6-fluoropirimidin-4-il)-4,4-dimetiloxazolidin-2-ona;

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

5. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

6. Un compuesto según la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en terapia.

7. Un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento de un cáncer que expresa IDH1 mutante que es glioma, glioblastoma, glioblastoma multiforme, astrocitoma, oligodendroglioma, paraganglioma, fibrosarcoma, linfoma angioinmunoblástico de células T, síndrome mielodisplásico, leucemia linfoblástica aguda de células B, cáncer de tiroides, cáncer colorrectal, leucemia mieloide aguda, melanoma, cáncer de próstata, condrosarcoma o colangiocarcinoma.

8. Un compuesto, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el IDH1 muíante que expresa cáncer es glioma, glioblastoma, glioblastoma multiforme, astrocitoma, oligodendroglioma, paraganglioma, fibrosarcoma o leucemia mieloide aguda.