ES2812244T3 - Derivados de N-piperidinil acetamida como bloqueadores de canales de calcio - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende un compuesto que tiene la estructura: **(Ver fórmula)** o una sal o conjugado farmacéuticamente aceptable del mismo en mezcla con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Description

DESCRIPCIÓN

Derivados de N-piperidinil acetamida como bloqueadores de canales de calcio

Campo técnico

La invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un compuesto útil en el tratamiento de condiciones asociadas con la función del canal de calcio, y en particular de condiciones asociadas con la actividad de los canales de calcio de tipo T. Más específicamente, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un compuesto que contiene un derivado amino N-piperidinil acetamida sustituido que es útil en el tratamiento de afecciones como enfermedad cardiovascular, epilepsia, cáncer, obesidad, insomnio y dolor.

Antecedentes de la técnica

La entrada de calcio en las células a través de los canales de calcio dependientes de voltaje media una amplia variedad de respuestas celulares y fisiológicas, incluyendo el acoplamiento excitación-contracción, la secreción de hormonas y la expresión génica (Miller, RJ, Science (1987) 235: 46-52 ; Augustine, GJ y col., Annu Rev Neurosci (1987) 10: 633-693). En las neuronas, los canales de calcio afectan directamente el potencial de la membrana y contribuyen a las propiedades eléctricas tales como la excitabilidad, los patrones de disparo repetitivo y la actividad del marcapasos. La entrada de calcio afecta aún más a las funciones neuronales al regular directamente los canales iónicos dependientes de calcio y al modular la actividad de las enzimas dependientes de calcio tales como la quinasa de proteína C y la quinasa IL de proteína dependiente de la calmodulina. Un aumento en la concentración de calcio en la terminal nerviosa presináptica desencadena la liberación del neurotransmisor, que también afecta el crecimiento de neuritas y la migración del cono de crecimiento en las neuronas en desarrollo.

Los canales de calcio median en una variedad de funciones fisiológicas normales, y también están implicados en una serie de trastornos humanos. Los ejemplos de trastornos humanos mediados por calcio incluyen, pero sin limitación, migraña congénita, ataxia cerebelosa, angina, epilepsia, hipertensión, isquemia y algunas arritmias. El tratamiento clínico de algunos de estos trastornos se ha visto favorecido por el desarrollo de antagonistas terapéuticos de los canales de calcio (p. e j, dihidropiridinas, fenilalquilaminas y benzotiazapinas se dirigen a los canales de calcio de tipo L) (Janis, RJ & Triggle, DJ, Ion Calcium Channels: Their Properties, Functions, Regulation and Clinical Relevance (1991) CRC Press, Londres).

Los canales de calcio nativos se han clasificado por su electrofisiológico y propiedades farmacológicas en tipos T, L, N, P/Q y R (revisado en Catterall, W., Annu Rev Cell Dev Biol (2000) 16 : 521 - 555; Huguenard, JR, Annu Rev Physiol (1996) 58: 329 - 348). Los canales de tipo T (o de bajo voltaje) describen una amplia clase de moléculas que se activan transitoriamente a potenciales negativos y son altamente sensibles a los cambios en el potencial de reposo.

Los canales de tipo L, N y P/Q se activan a potenciales más positivos (activados de alto voltaje) y muestran diversas cinéticas y propiedades dependientes del voltaje (Catterall (2000); Huguenard (1996)). Los canales de tipo T pueden distinguirse por tener un rango más negativo de activación e inactivación, inactivación rápida, desactivación lenta y conductancias de un solo canal más pequeñas. Hay tres subtipos de canales de calcio de tipo T que se han identificado molecular, farmacológica y electrofisiológicamente: estos subtipos se han denominado a¹G, a¹H y an (alternativamente llamados Cav 3.1, Cav 3.2 y Cav 3.3 respectivamente).

Los canales de calcio de tipo T están implicados en diversas afecciones médicas. En ratones que carecen del gen que expresa la subunidad an, se observaron ataques de resistencia a la ausencia (Kim, C. y col., Mol Cell Neurosci (2001) 18 (2): 235-245). Otros estudios también han implicado a la subunidad am en el desarrollo de la epilepsia (Su, H. et al, J Neurosci (2002) 22: 3645-3655). Existe una fuerte evidencia de que algunos fármacos anticonvulsivos existentes, tales como etosuximida, funcionan a través del bloqueo de los canales de tipo T (Gomora, JC, y col., Mol Pharmacol (2001) 60: 1121-1132).

Los canales de calcio activados por voltaje bajo son altamente expresados en los tejidos del sistema cardiovascular. Mibefradil, un bloqueador de los canales de calcio 10-30 veces selectivo para los canales de tipo T sobre los de tipo L, fue aprobado para uso en hipertensión y angina de pecho. Se retiró del mercado poco después del lanzamiento debido a interacciones con otros fármacos (Heady, TN, y col., Jpn J Pharmacol. (2001) 85: 339­ 350).

También hay un cuerpo creciente de evidencia que sugiere que los canales de calcio de tipo T se expresan anormalmente en las células cancerosas y que el bloqueo de estos canales pueden reducir la proliferación de células además de inducir la apoptosis. Estudios recientes también muestran que la expresión de canales de calcio de tipo T en células de cáncer de mama depende del estado de proliferación, es decir, los canales se expresan en niveles más altos durante el período de replicación rápida y una vez que las células están en un estado de no proliferación de este canal es mínimo. Por lo tanto, el bloqueo selectivo de la entrada del canal de calcio en células cancerosas puede ser un enfoque valioso para prevenir el crecimiento tumoral (Solicitudes de Patente PCT Nos WO 05/086971 y WO 05/77082; Taylor, J.T., y col., World J. Gastroenterol (2008) 14 (32): 4984 - 4991; Heo, J.H., y col., Biorganic & Medicinal Chemistry Letters (2008) 18: 3899 - 3901).

La creciente evidencia sugiere que los canales de calcio de tipo T también están implicados en el dolor (véanse, por ejemplo, la Solicitud de Patente de Estados Unidos N° 2003/086980, las Solicitudes de Patente PCT Nos WO 03/007953 y WO 04/000311). Tanto mibefradilo como etosuximida han mostrado actividad anti-hiperalgésica en el modelo de ligación de nervio espinal del dolor neuropático en ratas (Dogrul, A., y col., Pain (2003) 105: 159­ 168). Además de la enfermedad cardiovascular, epilepsia (véase también la Solicitud de Patente de Estados Unidos N° 2006/025397), cáncer y dolor crónico y agudo, los canales de calcio de tipo T se han implicado en la diabetes (Solicitud de Patente de Estados Unidos N° 2003/125269), trastornos del sueño (Solicitud de Patente de Estados Unidos N° 2006/003985), enfermedad de Parkinson (Solicitud de Patente de EE.UU. N° 2003/087799); psicosis tal como esquizofrenia (Solicitud de Patente de Estados Unidos N° 2003/087799), vejiga hiperactiva (Sui, G.-P., y col., British Journal of Urology International (2007) 99 (2): 436-441; también US 2004/197825), enfermedad renal (Hayashi, K., y col., Journal of Pharmacological Sciences (2005) 99: 221-227), neuroprotección y control de la natalidad masculina.

Uebele, et al, J. Clinical Investigation doi: 10.1172 /. JCI36954 (aceptado para su publicación Abril de 2009, publicado en internet como "Antagonism of T-type calcium channels inhibits high-fat diet-induced weight gain in mice") informa de que los antagonistas selectivos del canal de calcio de tipo T reducen la vigilia en ratones, y también reducen el aumento de peso asociado con la dieta rica en grasas, y la composición corporal mejorada al reducir la acumulación de grasa. Tras haber encontrado que los ratones que carecían de ciertos canales de calcio de tipo T experimentaban ciclos de sueño alterados también eran resistentes al aumento de peso asociado con las dietas ricas en grasas, investigaron el efecto de un inhibidor selectivo de dichos canales de calcio de tipo T. Demostraron que un inhibidor selectivo del canal de calcio de tipo T llamado TTA-A2 causaba los mismos efectos. En particular, los ratones obesos que reciben el inhibidor pierden peso corporal y grasa, y aumentan la masa muscular. El tratamiento de los ratones de peso normal del inhibidor provocó un aumento del sueño y evitó el aumento de peso inducido por una dieta alta en grasas. En consecuencia, se demostró que tales antagonistas de los canales de calcio del tipo T selectivos pueden prevenir o tratar la ganancia de peso inducida por la dieta. El aumento de peso, la obesidad y los trastornos del sueño están, por lo tanto, dentro del alcance de los trastornos del canal de calcio que pueden tratarse con antagonistas del canal de calcio de tipo T. Los compuestos, composiciones y métodos descritos en la presente memoria son por lo tanto útiles para tratar o prevenir el aumento de peso, por ejemplo, para tratar la obesidad o para reducir el aumento de peso debido a la ingesta dietética rica en grasas. También son útiles para aliviar el insomnio o el jet-lag, y para promover o restablecer los ritmos diurnos normales. Divulgación de la invención

La invención se refiere a la composición farmacéutica de la reivindicación 1, que comprende un compuesto útil en el tratamiento de afecciones moduladas por la actividad del canal de calcio y, en particular, afecciones mediadas por la actividad de los canal esde tipo T. El compuesto en la composición farmacéutica de la invención es un derivado de N-piperidinil acetamida con características estructurales que mejoran la actividad de bloqueo de los canales de calcio de los compuestos. Por tanto, en un aspecto, la invención está dirigida a una composición farmacéutica para su uso en un método de tratamiento de afecciones mediadas por la actividad de los canales de calcio, incluyendo la epilepsia y los trastornos del sueño, administrando a pacientes con necesidad de dicho tratamiento el compuesto de la composición farmacéutica de la reivindicación 1.

La WO 2007/002884 se refiere a los antagonistas de los canales de calcio de tipo T de 4-fluoro-piperidina. La WO 2007/002361 se refiere a los antagonistas de los canales de calcio de tipo T de 3-fluoro-piperidina. Synthesis, Calcium-Channel-Blocking Activity, and Antihypertensive Activity of 4-(Diarylmethyl)-1-[3-(aryloxy)propyl] piperidines and structurally related compounds; Shanklin et al; J. Med. Chem. 1991,34, 3011­ 3022 se refiere a los compuestos del título de la misma.

La WO 2004/046110 se refiere a un antagonista del receptor de la hormona concentradora de melanina. La invención está dirigida a una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1 y al uso de esta composición para tratar afecciones que requieren la modulación de la actividad de los canales de calcio, y particularmente la actividad de los canales de calcio de tipo T incluyendo epilepsia y trastornos del sueño.

Descripción detallada

Tal como se utiliza aquí, el término "alquilo", "alquenilo" y "alquinilo" incluye sustituyentes de cadena lineal, de cadena ramificada y los monovalentes cíclicos, así como combinaciones de estos, que contiene sólo C y H cuando no sustituidos. Los ejemplos incluyen metilo, etilo, isobutilo, ciclohexilo, ciclopentiletilo, 2-propenilo, 3-butinilo y similares. Típicamente, los grupos alquilo, alquenilo y alquinilo contienen 1-10C (alquilo) o 2-10C (alquenilo o alquinilo). En algunas realizaciones, contienen 1-8C, 1-6C, 1-4C, 1-3C o 1-2C (alquilo); o 2-8C, 2-6C, 2-4C o 2-3C (alquenilo o alquinilo). Además, cualquier átomo de hidrógeno en uno de estos grupos se puede reemplazar por un átomo de halógeno, y en particular un flúor o cloro, y aún estar dentro del alcance de la definición de alquilo, alquenilo y alquinilo. Por ejemplo, CF³ es un alquilo 1C. Estos grupos también pueden estar sustituidos por otros sustituyentes.

Heteroalquilo, heteroalquenilo y heteroalquinilo se definen de forma similar y contienen al menos un átomo de carbono, pero también contienen uno o más heteroátomos O, S o N o combinaciones de los mismos dentro del residuo de la columna vertebral por el que cada heteroátomo en el grupo heteroalquilo, heteroalquenilo o heteroalquinilo sustituye a un átomo de carbono del grupo alquilo, alquenilo o alquinilo al que corresponde la heteroforma. En algunas realizaciones, los grupos heteroalquilo, heteroalquenilo y heteroalquinilo tienen C en cada extremo al que el grupo está unido a otros grupos, y los heteroátomos presentes no están situados en una posición terminal. Como se entiende en la técnica, estas heteroformas no contienen más de tres heteroátomos contiguos. En algunas realizaciones, el heteroátomo es O o N.

El número designado de átomos de carbono en heteroformas de alquilo, alquenilo y alquinilo incluye el recuento de heteroátomo. Por ejemplo, si el heteroalquilo se define como 1-6C, contendrá 1-6 átomos C, N, O o S, de modo que el heteroalquilo contiene al menos un átomo de C y al menos un heteroátomo, por ejemplo 1-5C e IN o 1-4C y 2N. De forma similar, cuando el heteroalquilo se define como 1-6C o 1-4C, contendría 1-5C o 1-3C respectivamente, es decir, al menos una C se reemplaza por O, N o S. En consecuencia, cuando se define heteroalquenilo o heteroalquinilo como 2-6C (o 2-4C), contendría 2-6 o 2-4 átomos de C, N, O o S, ya que el heteroalquenilo o heteroalquinilo contiene al menos un átomo de carbono y al menos un heteroátomo, por ejemplo 2-5C e IN o 2-4C y 2O. Además, los sustituyentes heteroalquilo, heteroalquenilo o heteroalquinilo también pueden contener uno o más grupos carbonilo. Los ejemplos de grupos heteroalquilo, heteroalquenilo y heteroalquinilo incluyen CH²OCH³, CH²N (CHah, CH²OH, (CH²VNR², OR, COOR, CONR², (CH²)nOR, (CH²)nCOR, (CH²VCOOR, (CH²)nSR, (CHa)nSOR, (CH²)nSO²R, (CH²)nCONR², NRCOR, NRCOOR, OCONR², OCOR y similares en donde el grupo contiene al menos un C y el tamaño del sustituyente es consistente con la definición de alquilo, alquenilo y alquinilo.

El resto "aromático" o resto "arilo" se refiere a cualquier sistema bicíclico de anillo condensado o monocíclico que tiene las características de aromaticidad en términos de distribución de electrones en todo el sistema de anillo e incluye un resto bicíclico condensado o monocíclico tal como fenilo o naftilo; "heteroaromático" o "heteroarilo" también se refiere a tales sistemas de anillos monocíclicos o bicíclicos condensados que contienen uno o más heteroátomos seleccionados de O, S y N. La inclusión de un heteroátomo permite la inclusión de anillos de 5 miembros para considerarse aromáticos, así como 6 anillos con anillos. Por lo tanto, los sistemas aromáticos/heteroaromáticos típicos incluyen piridilo, pirimidilo, indolilo, bencimidazolilo, benzotriazolilo, isoquinolilo, quinolilo, benzotiazolilo, benzofuranilo, tienilo, furilo, pirrolilo, tiazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, benzoxazolilo, benzoisoxazolilo, imidazolilo y similares. Debido a que los tautómeros son teóricamente posibles, el ftalimido también se considera aromático. Típicamente, los sistemas de anillo contienen 5-12 átomos de miembro de anillo o 6-10 átomos de miembro de anillo. En algunas realizaciones, el resto aromático o heteroaromático es un sistema de anillos aromáticos de 6 miembros que contiene opcionalmente 1 - 2 átomos de nitrógeno. Más particularmente, el resto es un fenilo, piridilo, indolilo, pirimidilo, piridazinilo, benzotiazolilo o bencimidazolilo, pirazolilo, imidazolilo, isoxazolilo, tiazolilo, benzotiazolilo, indolilo opcionalmente sustituidos. Incluso más particularmente, dicho resto es fenilo, piridilo o pirimidilo e incluso más particularmente, es fenilo.

"O-arilo" o "O-heteroarilo" se refiere a sistemas aromáticos o heteroaromáticos que están acoplados a otro residuo a través de un átomo de oxígeno. Un ejemplo típico de un O-arilo es fenoxi. De manera similar, "arilalquilo" se refiere a sistemas aromáticos y heteroaromáticos que están acoplados a otro residuo a través de una cadena carbonada, saturada o insaturada, típicamente de 1-8C, 1-6C o más particularmente 1-4C o 1-3C cuando están saturados o 2-8C, 2-6C, 2-4C o 2-3C cuando están insaturados, incluidas las heteroformas de los mismos. Para mayor certeza, arilalquilo incluye así un grupo arilo o heteroarilo como se definió anteriormente conectado a un resto alquilo, heteroalquilo, alquenilo, heteroalquenilo, alquinilo o heteroalquinilo también como se definió anteriormente. Los arilalquilos típicos serían un arilo (6-12C) alquilo (1-8C), arilo (6-12C) alquenilo (2-8C) o arilo (6-12C) alquinilo (2-8C), más las heteroformas. Un ejemplo típico es fenilmetilo, comúnmente denominado bencilo.

Los sustituyentes opcionales típicos en los grupos aromáticos o heteroaromáticos incluyen independientemente halo, CN, NO², CF³, OCF³, COOR', CONR’², OR’, SR', SOR’, SO²R’, NR’², NR’(CO)R', NR'C(O)OR’, NR'C(O)NR’², n R'SO²Nr ’² , o NRSO²R', en donde cada R' es independientemente H o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado entre alquilo, alquenilo, alquinilo, heteroalquilo, heteroalquenilo, heteroalquinilo, heteroarilo y arilo (todos como se definen anteriormente); o el sustituyente puede ser un grupo opcionalmente sustituido seleccionado entre alquilo, alquenilo, alquinilo, heteroalquilo, heteroalquenilo, heteroalquinilo, arilo, heteroarilo, O-arilo, O-heteroarilo y arilalquilo.

Los sustituyentes opcionales en un grupo no aromático, se seleccionan típicamente de la misma lista de sustituyentes adecuados para los grupos aromáticos o heteroaromáticos y además pueden ser seleccionados de = O y = NOR’ donde R' es H o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado de alquilo, alquenilo, alquinilo, heteroalquilo, heteroalquenilo, heteroalquinilo, heteroarilo y arilo (todos como se definen anteriormente).

Halo puede ser cualquier átomo de halógeno, especialmente F, Cl, Br, o I, y más particularmente es fluoro, cloro o bromo e incluso más particularmente es fluoro o cloro.

En general, cualquier grupo alquilo, alquenilo, alquinilo, o arilo (incluyendo todas las heteroformas definidas anteriormente) contenido en un sustituyente puede opcionalmente estar sustituido por sustituyentes adicionales. La naturaleza de estos sustituyentes es similar a la de los enumerados con respecto a los sustituyentes en las estructuras básicas anteriores. Por lo tanto, cuando una realización de un sustituyente es alquilo, este alquilo puede estar opcionalmente sustituido con los sustituyentes restantes enumerados como sustituyentes cuando esto tiene sentido químico, y cuando esto no socava el límite de tamaño del alquilo per se; por ejemplo, alquilo sustituido con alquilo o con alquenilo simplemente extendería el límite superior de átomos de carbono para estas realizaciones, y no está incluido. Sin embargo, se incluiría alquilo sustituido con arilo, amino, halo y similares.

El compuesto de la invención puede estar en forma de sales farmacéuticamente aceptables. Estas sales pueden ser sales de adición de ácido que implican ácidos inorgánicos u orgánicos o las sales pueden, en el caso de las formas de acidez del compuesto de la invención, prepararse a partir de bases inorgánicas u orgánicas. Con frecuencia, el compuesto se prepara o usa como sales farmacéuticamente aceptables preparadas como productos de adición o ácidos o bases farmacéuticamente aceptables. Los ácidos y bases farmacéuticamente aceptables adecuadas son bien conocidas en la técnica, tales como ácidos clorhídrico, sulfúrico, bromhídrico, acético, láctico, cítrico o tartárico para formar sales de adición de ácido, e hidróxido de potasio, hidróxido de sodio, hidróxido de amonio, cafeína, diversas aminas y similares para formar sales básicas. Los métodos para la preparación de las sales apropiadas están bien establecidas en la técnica.

La invención incluye cada una de las formas estereoisoméricas aisladas del compuesto de la invención, así como mezclas de estereoisómeros en diversos grados de pureza quiral, que incluyen mezclas racémicas. También abarca los diversos diastereómeros y tautómeros que se pueden formar.

El compuesto de fórmula (1) también es útil para la fabricación de un medicamento útil para tratar condiciones caracterizadas por las actividades de los canales de calcio de tipo T no deseadas.

Además, el compuesto de la invención puede estar acoplado a través de la conjugación a sustancias diseñadas para alterar la farmacocinética, para la orientación, o por otras razones. Por lo tanto, la invención incluye adicionalmente conjugados de estos compuestos. Por ejemplo, el polietilenglicol a menudo se acopla a sustancias para mejorar la vida media; los compuestos pueden acoplarse a los liposomas de forma covalente o no covalente o a otros vehículos en partículas. También se puede acoplar a agentes dirigidos tales como anticuerpos o peptidomiméticos, a menudo a través de restos enlazadores. Por lo tanto, la invención también se dirige a composiciones farmacéuticas que comprenden el compuesto especificado en la reivindicación 1 cuando se modifica para que se incluya en un conjugado de este tipo.

Merck & Co., Inc. ha presentado dos solicitudes de patente dirigidas a bloqueadores de los canales de calcio de tipo T con un núcleo de acetamida de piperidinilo similar a la descrita en la presente invención, a saber, las aplicaciones del Tratado de Cooperación de Patentes WO 2007/002361 y WO 2007/002884 (las solicitudes de patente '361 y' 884). Sin embargo, en la patente '361 es esencial que el grupo piperidinilo esté sustituido por un flúor en la posición 3, mientras que en la aplicación' 884, es esencial que el grupo piperidinilo esté sustituido por un flúor en la posición 4. Merck no solo ve la presencia de flúor en el anillo de piperidinilo como se requiere sino también que la posición en el anillo da lugar a dos invenciones separadas. No se proporcionan datos experimentales para ninguno de los compuestos en ninguna de las patentes, no se explica el papel del flúor en ninguna de las solicitudes de patente, ni está claro qué subtipo del canal de calcio de tipo T se ve afectado por sus compuestos. (es decir, a¹G, a¹H o an). Sorprendentemente, hemos encontrado que el núcleo central de piperidinilo no necesita fluorarse para obtener actividad contra el canal de calcio de tipo T. De mayor importancia es la presencia de un nitrógeno o hidroxi en el carbono beta estimulado desde el nitrógeno de piperidinilo que, inesperadamente, también proporciona selectividad contra el canal hERG K+. Actividades contra los subtipos de canales de calcio de tipo T a¹G y am, así como contra el canal hERG K+ se muestran para los compuestos seleccionados a continuación en las tablas 4 y 5. Modos de llevar a cabo la invención

La composición farmacéutica de la reivindicación 1 que es útil en los métodos de la invención y, aunque no limitado por la teoría, se cree que los compuestos activos de la misma ejercen sus efectos deseables a través de su capacidad para modular la actividad de los canales de calcio, particularmente la actividad de canales de calcio de tipo T. Esto lo hace útil para el tratamiento de ciertas afecciones en las que se desea la modulación de los canales de calcio de tipo T, incluyendo: enfermedad cardiovascular; epilepsia; diabetes; cáncer; dolor, incluyendo tanto dolor crónico como agudo; trastornos del sueño; enfermedad de Parkinson; psicosis como esquizofrenia; vejiga hiperactiva; enfermedad renal, neuroprotección, adicción y control de la natalidad masculina; insomnio; y obesidad.

La enfermedad cardiovascular como se usa en la presente incluye, pero no se limita a, hipertensión, hipertensión pulmonar, arritmia (como fibrilación auricular y fibrilación ventricular), insuficiencia cardíaca congestiva, angina de pecho, arteriosclerosis, aterosclerosis y derrame cerebral.

La epilepsia como se usa en la presente incluye, pero no se limita a, convulsiones parciales como epilepsia del lóbulo temporal, convulsiones de ausencia, convulsiones generalizadas y convulsiones tónico/clónicas.

El cáncer, como se usa en la presente, incluye, pero no se limita a, carcinoma de mama, neuroblastoma, retinoblastoma, glioma, carcinoma de próstata, carcinoma de esófago, fibrosarcoma, carcinoma colorrectal, feocromocitoma, adrenocarcinoma, insulinoma, carcinoma de pulmón, melanoma y cáncer de ovario.

El dolor agudo como se usa en el presente documento incluye pero no se limita a dolor nociceptivo y dolor post-operatorio. El dolor crónico incluye, pero no está limitado por: dolor neuropático periférico, como neuralgia posherpética, dolor neuropático diabético, dolor por cáncer neuropático, síndrome de la cirugía de espalda fallida, neuralgia del trigémino y dolor en el miembro fantasma; dolor neuropático central, como dolor relacionado con la esclerosis múltiple, dolor relacionado con la enfermedad de Parkinson, dolor posterior a la apoplejía, dolor por lesión de la médula espinal postraumática y dolor en la demencia; dolor musculoesquelético como el dolor osteoartrítico y el síndrome de fibromialgia; dolor inflamatorio tal como artritis reumatoide y endometriosis; dolor de cabeza como migraña, cefalea en racimo, síndrome de dolor de cabeza por tensión, dolor facial, dolor de cabeza causado por otras enfermedades; dolor visceral tal como cistitis intersticial, síndrome del intestino irritable y síndrome de dolor pélvico crónico; y dolor mixto, como dolor de espalda, dolor de cuello y hombros, síndrome de boca ardiente y síndrome de dolor regional complejo.

Para mayor certeza, en el tratamiento de dolor osteoartrítico, la movilidad de las articulaciones también mejorará a medida que el dolor crónico subyacente se reduce. Por lo tanto, el uso del compuesto de la presente invención para tratar el dolor artrósico incluye inherentemente el uso de tal compuesto para mejorar la movilidad articular en pacientes que sufren de osteoartritis.

La adicción incluye, pero no se limita a, dependencia, abstinencia y/o recaída de cocaína, opioides, alcohol y nicotina.

La obesidad, como se usa en la presente, se refiere a un peso excesivo asociado con una cantidad de grasa corporal no saludable o no deseada. El tratamiento de la obesidad puede incluir la prevención de su desarrollo, la desaceleración de su progresión o la reversión, es decir, la pérdida de peso. Los métodos de tratamiento de la invención pueden incluir la administración diaria de un compuesto divulgado en la presente durante un período de semanas o meses, opcionalmente en combinación con una dieta prescrita o un programa de pérdida de peso similar. Pueden ser especialmente útiles junto con dietas que incluyen una ingesta de grasas relativamente alta, como la dieta Aktins.

Se sabe que la actividad del canal de calcio está involucrada en una multiplicidad de trastornos, y los tipos particulares de canales están asociados con condiciones particulares. La asociación de canales de tipo T en condiciones asociadas con la transmisión neuronal indicaría que los compuestos de la invención que se dirigen a los receptores de tipo T son los más útiles en estas condiciones. Muchos de los miembros del género de compuestos, al que pertenece el compuesto de la reivindicación 1, exhiben una gran afinidad por los canales de tipo T. Por lo tanto, como se describe a continuación, se evalúan para su capacidad de interactuar con los canales de tipo T como una indicación inicial de la función deseable. Es particularmente deseable que los compuestos exhiban valores de CI⁵⁰ de <1 pm. El CI⁵⁰ es la concentración que inhibe el 50% del calcio, de bario o de otro flujo de cationes divalentes permeante a un potencial aplicado particular.

Con el fin de ser máximamente útiles en el tratamiento, también es útil evaluar las reacciones laterales que podrían ocurrir. Por lo tanto, además de poder modular un canal de calcio particular, es deseable que el compuesto tenga una actividad muy baja con respecto al canal de hERG K+ que se expresa en el corazón. Los compuestos que bloquean este canal con alta potencia pueden causar reacciones que son fatales. Por lo tanto, para un compuesto que modula el canal de calcio, se prefiere que no se inhiba el canal hERG K+. Se puede tolerar cierta inhibición del canal hERG K+ en un fármaco, siempre que el compuesto sea suficientemente selectivo para el objetivo de interés sobre el canal hERG K+. Por ejemplo, una selectividad de 10 veces de un canal de calcio de tipo T sobre el canal hERG K+ sería beneficioso y más preferiblemente una selectividad de 30 veces o una selectividad de 100 veces.

Del mismo modo, sería indeseable que el compuesto inhibiera el citocromo P450 ya que se requiere esta enzima para la desintoxicación de drogas. Finalmente, se evaluará el compuesto para especificidad de tipo de canal de iones de calcio comparando su actividad entre los diversos tipos de canales de calcio, y se prefiere la especificidad para un tipo de canal particular. Los compuestos que progresan con éxito a través de estas pruebas se examinan luego en modelos animales como candidatos reales a fármacos.

Los compuestos de la invención modulan la actividad de los canales de calcio; en general, dicha modulación es la inhibición de la capacidad del canal para transportar calcio. Como se describe a continuación, el efecto de un compuesto particular sobre la actividad del canal de calcio puede determinarse fácilmente en un ensayo de rutina en el que las condiciones se organizan de modo que el canal se active y se evalúe el efecto del compuesto sobre esta activación (ya sea positivo o negativo). Además, el compuesto de la invención es selectivo contra el canal hERG K+. Los ensayos típicos se describen a continuación en el Ejemplo 17.

Bibliotecas y proyección

Los compuestos de la invención se pueden sintetizar de forma individual usando métodos conocidos en la técnica per se, o como un miembro de una biblioteca combinatoria.

La síntesis de bibliotecas combinatorias es ahora un lugar común en la técnica. Se encuentran descripciones adecuadas de tales síntesis, por ejemplo, en Wentworth, Jr., P., y col., Current Opinion in Biol. (1993) 9: 109 - 115; Salemme, FR, y col., Structure (1997) 5: 319-324. Las bibliotecas contienen compuestos con varios sustituyentes y diversos grados de insaturación, así como diferentes longitudes de cadena. Las bibliotecas, que contienen, como mínimo 10, pero típicamente varios cientos de miembros a varios miles de miembros, pueden seleccionarse entonces para compuestos que son particularmente eficaces contra un subtipo específico de canal de calcio, por ejemplo, el canal de tipo N. Además, usando protocolos de selección estándar, las bibliotecas pueden cribarse para detectar compuestos que bloquean canales o receptores adicionales tales como canales de sodio, canales de potasio y similares.

Los métodos para realizar estas funciones de selección son bien conocidos en la técnica. Estos métodos también se pueden usar para determinar individualmente la capacidad de un compuesto para agonizar o antagonizar el canal. Típicamente, el canal a ser dirigido se expresa en la superficie de una célula hospedadora recombinante tal como células de riñón embrionario humano. La capacidad de los miembros de la biblioteca para unir el canal que se va a analizar se mide, por ejemplo, por la capacidad del compuesto en la biblioteca para desplazar un ligando de unión marcado tal como el ligando normalmente asociado con el canal o un anticuerpo contra al canal. Más típicamente, la capacidad de antagonizar el canal se mide en presencia de calcio, bario u otro catión divalente permeable y la capacidad del compuesto para interferir con la señal generada se mide usando técnicas estándar. En más detalle, un método implica la unión de agentes radiomarcados que interactúan con el canal de calcio y el análisis posterior de las mediciones de unión en equilibrio que incluyen, pero no se limitan a, tasas, tasas de desviación, valores de Kd y unión competitiva por otras moléculas.

Otro método implica la detección de los efectos de los compuestos de ensayo electrofisiológico con lo que las células individuales se empalan con un microelectrodo y las corrientes a través del canal de calcio se registran antes y después de la aplicación del compuesto de interés.

Otro método, el ensayo espectrofotométrico de alto rendimiento, utiliza la carga de las líneas celulares con un tinte fluorescente sensible a la concentración de calcio intracelular y el examen subsiguiente de los efectos de los compuestos sobre la capacidad de la despolarización por el cloruro de potasio u otros medios para alterar los niveles de calcio intracelulares.

Como se describió anteriormente, un ensayo más definitivo se puede usar para distinguir los inhibidores del flujo de calcio que operan como bloqueadores de los canales abiertos, en oposición a aquellos que operan al promover la inactivación del canal o como bloqueadores de canales en reposo. Los métodos para distinguir estos tipos de inhibición se describen más particularmente en los ejemplos a continuación. En general, los bloqueadores de canal abierto se evalúan midiendo el nivel de corriente máxima cuando se impone la despolarización en un potencial de reposo de fondo de aproximadamente -100 mV en presencia y en ausencia del compuesto candidato. Los bloqueadores exitosos de canal abierto reducirán la corriente máxima observada y pueden acelerar la disminución de esta corriente. Los compuestos que son bloqueadores de los canales inactivados generalmente están determinados por su capacidad para desplazar la dependencia del voltaje de la inactivación hacia potenciales más negativos. Esto también se refleja en su capacidad para reducir las corrientes máximas a potenciales de retención más despolarizados (por ejemplo, -70 mV) y a frecuencias de estimulación más altas, por ejemplo, 0,2 Hz frente a 0,03 Hz. Finalmente, los bloqueadores de los canales en reposo disminuirían la amplitud máxima de la corriente durante la primera despolarización después de la aplicación del fármaco sin inhibición adicional durante la despolarización.

Utilidad y administración

Para su uso como tratamiento de sujetos humanos y animales, los compuestos de la invención se pueden formular como composiciones farmacéuticas o veterinarias. Dependiendo del tema a tratar, el modo de administración y el tipo de tratamiento deseado, por ejemplo, prevención, profilaxis, terapia; los compuestos se formulan de formas en consonancia con estos parámetros. Un resumen de tales técnicas se encuentra en Remington's Pharmaceutical Sciences, última edición, Mack Publishing Co., Easton, PA, incorporado aquí como referencia.

En general, para uso en el tratamiento, la composición farmacéutica de la reivindicación 1 se puede usar sola, o en combinación con otros productos farmacéuticos. Un ejemplo de otros fármacos potenciales para combinar con el compuesto de la reivindicación 1 incluiría productos farmacéuticos para el tratamiento de la misma indicación pero que tienen un mecanismo de acción diferente del bloqueo del canal de calcio de tipo T. Por ejemplo, en el tratamiento del dolor, un compuesto de la reivindicación 1 se puede combinar con otro tratamiento de alivio del dolor tal como un AINE, o un compuesto que inhibe selectivamente COX-2, o un opioide, o un analgésico adyuvante tal como un antidepresivo. Otro ejemplo de un posible producto farmacéutico para combinar con el compuesto de la reivindicación 1 (1) incluiría productos farmacéuticos para el tratamiento de síntomas o indicaciones diferentes, aunque asociados o relacionados. Dependiendo del modo de administración, los compuestos se formularán en composiciones adecuadas para permitir una administración fácil.

El compuesto especificado en la reivindicación 1 se prepara y usa como composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad eficaz del compuesto de la reivindicación 1 mezclado con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, como es bien conocido en la técnica. Las formulaciones se pueden preparar de una manera adecuada para administración sistémica o administración tópica o local. Las formulaciones sistémicas incluyen aquellas diseñadas para inyección (p. ej., Inyección intramuscular, intravenosa o subcutánea) o pueden prepararse para administración transdérmica, transmucosa u oral. La formulación generalmente incluirá un diluyente así como, en algunos casos, adyuvantes, tampones, conservantes y similares. El compuesto puede administrarse también en composiciones liposómicas o como microemulsiones.

Para la inyección, las formulaciones se pueden preparar en formas convencionales como soluciones líquidas o suspensiones o como formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en líquido antes de la inyección o como emulsiones. Los excipientes adecuados incluyen, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol y similares. Tales composiciones también pueden contener cantidades de sustancias auxiliares no tóxicas tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponantes del pH y similares, tales como, por ejemplo, acetato de sodio, monolaurato de sorbitán, y similares.

También se han ideado varios sistemas de liberación sostenida de los medicamentos. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 5.624.677.

La administración sistémica también puede incluir métodos relativamente no invasivos tales como el uso de supositorios, parches transdérmicos, administración transmucosal y administración intranasal. La administración oral también es adecuada para los compuestos de la invención. Las formas adecuadas incluyen jarabes, cápsulas y tabletas, como se entiende en la técnica.

Para la administración a sujetos animales o humanos, la dosificación del compuesto de la invención es típicamente 0,01-15 mg/kg, preferiblemente 0,1-10 mg/kg. Sin embargo, los niveles de dosificación dependen en gran medida de la naturaleza de la enfermedad, la eficacia del fármaco, el estado del paciente, el juicio del médico y la frecuencia y el modo de administración. La optimización de la dosificación para un sujeto particular está dentro del nivel ordinario de habilidad en la técnica.

Síntesis de los compuestos de la invención

Los siguientes esquemas de reacción y ejemplos están destinados a ilustrar la síntesis de un número representativo de compuestos. Por consiguiente, los siguientes ejemplos están destinados a ilustrar, pero no a limitar, la invención. Los compuestos adicionales no ejemplificados específicamente pueden sintetizarse usando métodos convencionales en combinación con los métodos descritos a continuación. Aquí, el compuesto 367 es el compuesto de la reivindicación 1. Los compuestos restantes se describen, pero no se reivindican.

Ejemplo 1

Síntesis de N-((1-((1-(etilsulfonamido)ciclopentilo)metilo)piperidina-4-ilo)metilo)-3.5-bis(trifluorometilo)benzamida (Compuesto 3)

A. Síntesis de N-(pÍperidina-4-ilmetilo)-3.5-bis(trifluorometilo)benzamida

A una solución de 1-Boc-4-(aminometilo)piperidina (18,0 g, 84,1 mmol) y DIPEA (12,9 g, 100 mmol) en CH²CI² anhidro (200 mL) a 15°C se añadió cloruro de 3,5-bis-(trifluorometilo)benzoílo (23,4 g, 85,0 mmol) lentamente. Después de que la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos, se añadió agua (50 mL) seguido de la adición de HCl acuoso (0,5 N, 100 ml). La fracción orgánica fue recolectada. La fracción acuosa se extrajo con CH²Cl² (100 mL). La solución orgánica combinada se secó sobre Na2SO4 anhidro y se pasó a través de un tapón de gel de sílice. El compuesto deseado se eluyó con EtOAc/éter de petróleo (1:3 en v/v). Los disolventes se eliminaron y el producto se disolvió en EtOAc (200 mL). A la solución HCl (g) se burbujeó durante 5 minutos para formar una suspensión blanca. La suspensión se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos y luego se concentró a aproximadamente 100 mL. Se añadió éter dietílico (150 mL) y la suspensión se enfrió a 7°C durante 1 h. Se recogió una sal de HCl blanco por filtración. La sal se disolvió en una mezcla de metanol/agua (30/300 mL), y se añadió NaOH acuoso (2 N) hasta pH = ~ 11. La mezcla se extrajo con CH²Cl² (5 X 200 mL) y la solución orgánica combinada se secó sobre Na2SO4 anhidro. Después de la filtración, el filtrado se concentró a vacío para dar una espuma pegajosa de color amaril I o pálido (28,8 g, 97%).

B. Síntesis de N-((1-((1-aminociclopentilo)metilo)piperidina-4-ilo)metilo)-3.5-bis(trifluorometilo)benzamida

A una solución de N-(piperidina-4-ilmetilo)-3,5-bis(trifluorometilo)benzamida (546 mg, 1,54 mmol) y N-BOC-cicloleucinal (329 mg, 1,54 mmol) en CH²Cl² (15 mL) se añadió NaBH (OAC)3 (481 mg, 2,16 mmol). La mezcla resultante se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 18 horas y luego se diluyó con acetato de etilo. La fracción orgánica se lavó con sat. NaHCO3 (30 mL), salmuera (30 mL) y se secó sobre Na2SO4. El disolvente se eliminó a vacío para proporcionar carbamato de 1-((4-((3,5-bis(trifluorometilo)benzamido)metilo)piperidina-1-ilo)metilo)ciclopentilo de terc-butilo en bruto como un aceite.

El producto en bruto de terc-butilo por encima de carbamato de 1-((4-((3,5-bis(trifluorometilo)benzamido)metilo)piperidina-1-ilo)metilo)ciclopentilo disuelto en CH²Cl² (3 mL) y TFA (2 mL) se añadió a temperatura ambiente. La reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 2 horas y después se diluyó con CH²Cl² (15 mL). La mezcla orgánica se lavó con la mezcla de NaHCO3 sat. (10 mL) y NaOH²N (5 mL), se secaron sobre Na2SO4. La eliminación del solvente al vacío proporcionó aceite. El aceite bruto se purificó por Biotage (10% de MeOH en CH²Ch) para dar N-((1-((1-aminociclopentilo)metilo)piperidina-4-ilo)metilo)-3,5-bis(trifluorometilo)benzamida (379 mg, 56% en dos etapas).

C. Síntesis de N-((1-((1-(etilsulfonamido)ciclopentilo)metilo)piperidina-4-ilo)metilo)-3,5-bis(trifluorometilo)benzamida (Compuesto 3)

A una solución de N-((1-((1-aminociclopentilo)metilo)piperidina-4-ilo)metilo)-3,5-bis(trifluorometilo)benzamida (100 mg, 0,28 mmol) e i-Pr²NEt (0,2 ml, 1,1 mmol) en CH²Cl² (5 mL) se añadió cloruro de etanosulfonilo (0,05 mL, 0,53 mmol). La mezcla de reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 18 horas y luego se diluyó con acetato de etilo. La fracción orgánica se lavó con NaHCO3 sat., y después con salmuera y se secó sobre Na²SO⁴. El disolvente se eliminó y el producto bruto se purificó mediante un sistema de purificación de alto rendimiento (HiTOP) para proporcionar N-((1-((1-(etilsulfonamido)ciclopentilo)metilo)piperidina-4-ilo)metilo)-3,5-bis(trifluorometilo)benzamida.

Ejemplo 2

Síntesis de N-((1-((1-(3-etilureido)ciclopentilo)metilo)piperidina-4-ilo)metilo)-3.5-bis(trifluorometilo)benzamida (compuesto 11)

A una solución de N-((1-((1-aminociclopentilo)metilo)piperidina-4-ilo)metilo)-3.5-bis(trifluorometilo)benzamida (100 mg. 0.28 mmol) en ChbCh (5 mL) se añadió isocianato de etilo (0.05 mL, 0.63 mmol). La mezcla de reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 18 horas y luego se diluyó con acetato de etilo. La fracción orgánica se lavó con NaHCÜ3 sat.. y después con salmuera y se secó sobre Na2Sü4. El disolvente se eliminó y el producto en bruto se purificó mediante HiTOP para proporcionar N-((1-((1-(3-etilureido)ciclopentilo)metilo)piperidina-4-ilo)metilo)-3.5-bis(trifluorometilo)benzamida.

Eiemplo 3

Síntesis de 1-((4-((3.5-bis(trifluorometilo)benzamido)metilo)piperidina-1-ilo)metilo)ciclopentilcarbamato de etilo (compuesto 17)

A una solución de N-((1-((1-aminociclopentilo)metilo)piperidina-4-ilo)metilo)-3.5-bis(trifluorometilo)benzamida (100 mg. 0.28 mmol) y i-PR² neto (0.2 mL. 1.1 mmol) en CH²Cl² (5 mL) se añadió cloroformiato de etilo (0.05 mL. 0.53 mmol). La mezcla de reacción se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 18 horas y luego se diluyó con acetato de etilo. La fracción orgánica se lavó con NaHCO3 sat.. y después con salmuera y se secó sobre Na2SO4. El disolvente se eliminó y el producto bruto se purificó mediante HiTOP para proporcionar 1 -((4-((3.5-bis(trifluorometilo)benzamido)metilo)piperidina-1 -ilo)metilo)ciclopentilcarbamato de etilo. Ejemplo 4

Síntesis_____de_____la_____síntesis_____de_____N-((1-(2-(1-metiletilsulfonamido)etilo)piperidina-4-ilo)metilo)-3.5-bis(trifluorometilo)benzamina (Compuesto 20)

Síntesis de N-((1-(cianometilo)piperidina-4-ilo)metilo)-3.5-bis(trifluorometilo)benzamida

N-(piperidina-4-ilmetilo)-3,5-bis(trifluorometilo)benzamida (3.54 g. 10.0 mmol) se disolvió en CH³CN (100 mL). Se añadieron DIPEA (1.94 g. 15.0 mmol) y bromoacetonitrilo (1.32 g. 11.0 mmol). La mezcla de reacción se calentó a 50°C durante la noche. El disolvente se eliminó a vacío. NaHCÜ3 saturado se añadió (40 mL) y la mezcla se extrajo con CH²CL (4 X 30 mL). La solución orgánica combinada se secó sobre Na2SÜ4 anhidro y se pasó a través de un tapón de gel de sílice. El compuesto deseado se eluyó con EtOAc. El producto se purificó adicionalmente por cristalización en EtOAc/éter de petróleo como un sólido blanco (3.62 g. 92%).

B. Síntesis de N-((1-(2-aminoetilo)piperidina-4-ilo)metilo)-3.5-bis(trifluorometilo)benzamida

Se colocó un matraz de hidrogenación con una solución de N-((1-(cianometilo)piperidina-4-ilo)metilo)-3,5-bis(tr¡fluoromet¡lo)benzam¡da (2,80 g, 7,13 mmol) en metanol (20 mL) y níquel Raney (~1 g, enjuagado con metanol). El matraz se agitó a temperatura ambiente bajo hidrógeno (40 psi) durante la noche. La mezcla de reacción se filtró a continuación a través de una torta de celita, y el filtrado se concentró para dar una solución pegajosa que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional.

C. Síntesis de N-((1-(2-(1-metiletilsulfonamido)etilo)piperidina-4-ilo)metilo)-3.5-bis(trifluorometilo)benzamida (Compuesto 20)

Una solución de N-((1-(2-aminoetilo)piperidina-4-ilo)metilo)-3,5-bis(trifluorometilo)benzamida (70 mg, 0,18 mmol) y 2,6-lutidina (123 pL, 0,882 mmol) en ChbCb (2 mL) se trató con cloruro de isopropilsulfonilo (49,9 mg, 0,35 mmol). La reacción se agitó durante una noche y después se transfirió a un tubo de ensayo que contiene solución acuosa saturada de NaHCÜ3 (4 mL) y EtOAc (4 mL). La mezcla bifásica se mezcló vigorosamente y se dejó separar durante 15 minutos. Después de la separación, la mezcla se enfrió a -20°C hasta que la capa acuosa se congeló. La capa orgánica se vertió luego y el disolvente se eliminó a presión reducida a 50°C. El residuo resultante fue purificado por HiTOPs

Ejemplo 5

Síntesis de 2-(4-((3.5-bis(triflorometilo)benzamido)metilo)piperidina-1-ilo)etilcarbamato de etilo (Compuesto 36)

Una solución de N-((1-(2-aminoetilo)piperidina-4-ilo)metilo)-3,5-bis(trifluorometilo)benzamida (66 mg, 0,17 mmol) en una mezcla 2:1 de CH²Cl² :DMF (3 mL) y TEA (69 pL, 0,50 mmol) se trató con cloroformiato de etilo (27 mg, 0,25 mmol). La mezcla de reacción se dejó en agitación durante la noche, luego el disolvente se eliminó a vacío y el residuo se purificó mediante HiTOP.

Ejemplo 6

Síntesis de 2-(4-((3-fluoro-5-(trifluorometilo)benzamido)metilo)piperidina-1-ilo)etilcarbamato de terc-butilo (Compuesto 38)

Síntesis de 2-(4-cianopiperidina-1-ilo)etilcarbamato de terc-butilo

Una mezcla de piperidina-4-carbonitrilo (1,10 g, 10 mmol), terc-butilo 2-oxoetilcarbamato (1,59 g, 10 mmol) y triacetoxiborohidruro de sodio (2,5 g, 12 mmol) en 25 ml de CH²Cl² se agitó a temperatura ambiente durante la noche. El disolvente se evaporó y se añadió acetato de etilo y se lavó con agua. El disolvente se eliminó a vacío para proporcionar aceite. El aceite bruto se purificó por cromatografía en columna (acetato de etilo al 100%) para producir aceite incoloro (2,3 g, 91%).

B. Síntesis de 2-(4-aminometilo)piperidina-1 -ilo)etilcarbamato de terc-butilo

A una mezcla de terc-butilo 2-(-1-il 4-cianopiperidin)etilcarbamato (2,3 g, 9,05 mmol) y níquel Raney (1,1 g) en CH³OH (50 mL) se hizo burbujear gas amoniaco durante 5 min. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente bajo hidrógeno (40 psi) durante la noche. El catalizador se filtró a través de Celite. El disolvente se eliminó a vacío para proporcionar aceite (2,3 g, 98,5%).

C. Síntesis de 2-(4-((3-fluoro-5-(trifluorometilo)benzamido)metilo)piperidina-1-ilo)etilcarbamato de terc-butilo (Compuesto 38)

Una solución de tero-butilo 2-(4-(aminometilo)piperidina-1-ilo)etilcarbamato (50 mg, 0,19 mmol), TEA (135 pL, 0,972 mmol), y 3-fluoro-5-(ácido trifluorometilo)benzoico (48 mg, 0,23 mmol) en una mezcla de CH²Cl²:THF 1:1 (2 mL) con una solución de HATU (111 mg, 0,292 mmol) en DMF (1 mL). La solución resultante se agitó durante la noche, luego se transfirió a un tubo de ensayo que contiene solución acuosa saturada de NaHCܳ (4 mL) y EtOAc (4 mL). La mezcla bifásica se mezcló vigorosamente y se dejó separar durante 15 minutos. Después de la separación, la mezcla se enfrió a -20°C hasta que la capa acuosa se congeló. La capa orgánica se vertió luego y el disolvente se eliminó a presión reducida a 50°C. El residuo resultante se purificó mediante HiTOP.

Ejemplo 7

Síntesis de 2-(4-((2,2-d¡fluorobenzo[d1[1,31d¡oxol-5-carboxam¡do)metilo)p¡per¡d¡na-1-¡lo)et¡lcarbamato de terc-butilo (Compuesto 54)

Una solución de terc-butilo 2-(4-(aminometilo)piperidina-1-ilo)etilcarbamato (50 mg, 0,19 mmol) y TEA (135 pL, 0,972 mmol) en una mezcla de 1:1 CH²Cl²:THF (2,5 mL) se trató con 2,2-difluorobenzo[d]cloruro de [1,3]dioxol-5-carbonilo (51 mg, 0,23 mmol). La solución resultante se agitó durante la noche, luego se transfirió a un tubo de ensayo que contiene solución acuosa saturada de NaHCO³ (4 mL) y EtOAc (4 mL). La mezcla bifásica se mezcló vigorosamente y se dejó separar durante 15 minutos. Después de la separación, la mezcla se enfrió a -20°C hasta que la capa acuosa se congeló. La capa orgánica se vertió luego y el disolvente se eliminó a presión reducida a 50°C. El residuo resultante se purificó mediante HiTOP.

Ejemplo 8

Síntesis de N-((1-(2-p¡valam¡doet¡lo)p¡per¡d¡na-4-¡lo)metilo)-3,5-b¡s(tr¡fluoromet¡lo)benzam¡da (Compuesto 60)

Una solución de N-((1-(2-aminoetilo)piperidina-4-ilo)metilo)-3,5-bis(trifluorometilo)benzamida (70 mg, 0,18 mmol) y TEA (123 pL, 0,881 mmol) en una mezcla 1:1 de CH²Cl²:DMF (2 mL) se trató con cloruro de pivaloílo (42 mg, 0,35 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante la noche luego se transfiere a un tubo de ensayo que contiene solución acuosa saturada de NaHCܳ (4 mL) y EtOAc (4 mL). La mezcla bifásica se mezcló vigorosamente y se dejó separar durante 15 minutos. Después de la separación, la mezcla se enfrió a -20°C hasta que la capa acuosa se congeló. La capa orgánica se vertió luego y el disolvente se eliminó a presión reducida a 50°C. El residuo resultante se purificó mediante HiTOP.

Ejemplo 9

Síntesis_____ de_____ N-((1-(2-(2-c¡cloprop¡lacetam¡do)et¡lo)p¡per¡d¡na-4-¡lo)metilo)-3.5-b¡s(tr¡fluoromet¡lo)benzam¡da (compuesto 63)

Una solución de N-((1-(2-aminoetilo)piperidina-4-ilo)metilo)-3,5-bis(trifluorometilo)benzamida (70 mg, 0,18 mmol), TEA (123 0,881 mmol), y ácido 2-ciclopropilacético (35 mg, 0,35 mmol) en una mezcla 1:1 de CH²Cl² :DMF (2 mL) se trató con una solución de HATU (100 mg, 0,264 mmol) en DMF (1 mL). La reacción se agitó durante la noche luego se transfirió a un tubo de ensayo que contiene saturado acuoso NaHCO³ (4 mL) y EtOAc (4 mL). La mezcla bifásica se mezcló vigorosamente y se dejó separar durante 15 minutos. Después de la separación, la mezcla se enfrió a -20°C hasta que la capa acuosa se congeló. La capa orgánica se vertió luego y el disolvente se eliminó a presión reducida a 50°C. El residuo resultante se purificó mediante HiTOP.

Ejemplo 10

Síntesis de N-((1-(2-(3-terc-but¡lure¡do)et¡lo)p¡per¡d¡na-4-¡lo)metilo)-3,5-b¡s(tr¡fluoromet¡lo)benzam¡da (Compuesto 72)

Una solución de N-((1-(2-aminoetilo)piperidina-4-ilo)metilo)-3,5-bis(trifluorometilo)benzamida (25 mg, 0,063 mmol) en CH²CL (1,5 mL) se trató con isocianato de t-butilo (30 mg, 0,13 mmol). La mezcla se agitó durante la noche, se trató con MeOH (1 mL). El disolvente se eliminó a vacío. El residuo se purificó mediante HiTOPs.

Ejemplo 11

Síntesis de_____(R)-N-((1-(5-oxop¡rrol¡d¡na-2-carbon¡lo)p¡per¡d¡na-4-¡lo)metilo)-3,5-b¡s(tr¡fluoromet¡lo)benzam¡da (compuesto 83)

Una solución de N-(piperidina-4-ilmetilo)-3,5-bis(trifluorometilo)benzamida (48 mg, 0,14 mmol), TEA (95 pL, 0,68 mmol), y ácido (R)-5-oxopirrolidina-2-carboxílico (20,66 mg, 0,16 mmol) en DMF (1,5 mL) se trató con una solución de HATU (77 mg, 0,20 mmol) en DMF (1 mL). La mezcla de reacción se agitó durante la noche luego se transfiere a un tubo de ensayo que contiene solución acuosa saturada de NaHCÜ3 (4 mL) y EtOAc (4 mL). La mezcla bifásica se mezcló vigorosamente y se dejó separar durante 15 minutos. Después de la separación, la mezcla se enfrió a -20°C hasta que la capa acuosa se congeló. La capa orgánica se vertió luego y el disolvente se eliminó a vacío a 50°C. El residuo resultante se disolvió en CH²Cl² (1 mL) y se trató con 2M HCl en Et²O (3 mL) y se dejó agitar durante la noche a temperatura ambiente. El disolvente se eliminó a presión reducida y el sólido bruto se purificó mediante HiTOP.

Ejemplo 12

Síntesis_____ de_____ N-((1-(2-(ciclopentilamino)-2-oxoetilo)piperidina-4-ilo)metilo)-3.5-bis(trifluorometilo)benzamida (compuesto 93)

Una solución de ácido 2-(4-((3,5-bis(trifluorometilo)benzamido)metilo)piperidina-1-ilo)acético (73 mg, 0,18 mmol), TEA (123 pL, 0,88 mmol), y la ciclopentilamina (30 mg, 0,35 mmol) en DMF (1 mL) se trató con una solución de HATU (100 mg, 0,26 mmol) en DMF (1 mL). La mezcla de reacción se agitó durante la noche luego se transfiere a un tubo de ensayo que contiene solución acuosa saturada de NaHCO³ (4 mL) y EtOAc (4 mL). La mezcla bifásica se mezcló vigorosamente y se dejó separar durante 15 minutos. Después de la separación, la mezcla se enfrió a -20°C hasta que la capa acuosa se congeló. La capa orgánica se vertió luego y el disolvente se eliminó a presión reducida a 50°C. El residuo resultante se purificó mediante HiTOP.

Ejemplo 13

Síntesis de 3-bromo-5-(trifluorometilo)-N-(1-(2-(trifluorometilsulfonamido)etilo)piperidina-4-ilo)metilo)benzamida (Compuesto 116)

Síntesis de terc-butilo (1-(2-(trifluorometilsulfonamido)etilo)piperidina-4-ilo)metilcarbamato

A una solución de 2-aminoetanol (0,84 g, 13,8 mmol) y trietilamina (3,85 mL, 27,7 mmol) en CH²CI² (100 mL) a -78°C se añadió lentamente anhídrido trifluorometanosulfónico (8,4 g, 29,8 mmol). La mezcla de reacción se agitó a -78°C durante 2 horas, se calentó a -40°C y se agitó a -40°C durante la noche. La mezcla de reacción se diluyó con CH²Cl² (50 mL), se lavó con 0,1 N HCl acuoso frío (2 X 150 mL) y solución acuosa saturada fría de NaHCÜ3 (150 mL), y se secó sobre Na2SÜ4 anhidro. Después de filtrar al filtrado, se añadió piperidina-4-ilmetilcarbamato de terc-butilo (3,00 g, 14,0 mmol). La mezcla de reacción se concentró a 0°C a 50 mL y se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. El disolvente se eliminó luego, y el residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida (MeOH al 3-8% en CH²Ch) para proporcionar (1-(2-(trifluorometilsulfonamido)etilo)piperidina-4-ilo)metilcarbamato de terc-butilo (1,40 g, 26%).

B. Síntesis de sal de di-HCl de N-(2-(4-(aminometilo)piperidina-1-ilo)etilo)-1.1.1-trifluorometanosulfonamida

(1-(2-(trifluorometilsulfonamido)etilo)piperidina-4-ilo)metilcarbamato de terc-butilo (1,25 g, 3,21 mmol) se disolvió en CH³OH (15 mL) y se burbujeó con HCl (g) por 30 seg. Después de que la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos, el disolvente se eliminó a vacío para proporcionar sal de di-HCl de N-(2-(4-(aminometilo)piperidina-1 -ilo)etilo)-1,1,1-trifluorometanosulfonamida en forma de un sólido blanco (1,01 g, 87%). C. Síntesis de 3-bromo-5-(trifluorometilo)-N-((1-(2-(trifluorometilsulfonamido)etilo)piperidina-4-ilo)metilo)benzamida (Compuesto 116)

A una solución de 3-bromo-5-(trifluorometilo)benzoico (0,1 g, 0,37 mmol) en CH²Cl² (4 mL) se añadió DIPEA (0,3 mL, 1,8 mmol), sal de dihidrocloruro de N-(2-(4-(aminometilo)piperidina-1-ilo)etilo)-1,1,1-trifluorometanosulfonamida (0,1 g, 0,3 mmol) y HATU (0,17 g, 0,4 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. La capa orgánica se lavó con NaHCO3 ac. sat. (8 mL), se secó sobre Na2SO4, y se concentró para dar el producto bruto en forma de sólido gomoso. La purificación del material en bruto se realizó usando un sistema de purificación de alto rendimiento (HiTOP).

Ejemplo 14

Síntesis de 3.5-dicIoro-N-((1-(2-(cicIopropanosuIfonamido)etiIo)piperidina-4-iIo)metiIo)benzamida (Compuesto 131)

Síntesis de (1-(cianometilo)piperidina-4-ilo)metilcarbamato de tero-butilo

Piperidina-4-ilmetilcarbamato de tero-butilo (5 g, 23,2 mmol) se disolvió en CH³CN (40 mL). Se añadieron carbonato de potasio (3,5 g, 25 mmol), DIPEA (4,4 mL, 25 mmol) y bromoacetonitrilo (2,77 g, 23,2 mmol), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Después, la solución se concentró y se añadió NaHCü³ saturada (40 mL). La mezcla se extrajo con CH²Cl² (4 X 30 mL). El extracto se secó sobre Na²SÜ⁴ anhidro. El extracto seco se pasó a través de un tapón de gel de sílice, y el compuesto deseado se eluyó con EtOAc. El producto se purificó adicionalmente por cristalización en EtOAc/éter de petróleo como un sólido blanco (5,4 g, 92%).

B. Síntesis de (1-(2-am¡noetilo)p¡per¡d¡na-4-¡lo)met¡lcarbamato de terc-butilo

A un matraz de hidrogenación cargado con una solución de terc-butilo (1-(cianometilo)piperidina-4-ilo)metilcarbamato (5,4 g, 21,3 mmol) en CH³OH (20 mL) se añadió níquel Raney (~1 g, se aclaró con CH³OH). El matraz se agitó a temperatura ambiente bajo hidrógeno (40 psi) durante la noche. La mezcla de reacción se filtró entonces a través de una torta de celite, y el filtrado se concentró para dar una espuma adhesiva que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional.

C. Síntesis de (1-(2-(c¡clopropanosulfonam¡do)etilo)p¡per¡d¡na-4-¡lo)met¡lcarbamato de terc-butilo

A 15°C, a una solución de (1-(2-aminoetilo)piperidina-4-ilo)metilcarbamato de terc-butilo (2,00 g, 7,78 mmol) y DIPEA (3,00 g, 23,3 mmol) en CH²Cl² (40 mL) se añadió lentamente, cloruro de ciclopropilsulfonilo (3,40 g, 25,0 mmol) en Ar. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. Se añadió agua (30 mL), y la mezcla se extrajo con CH²Cl² (3 X 30 mL). El extracto combinado se lavó con solución saturada de NaHCO³ (40 mL) y se secó sobre Na2SÜ4 anhidro. Después de la filtración, el disolvente se eliminó a vacío y el residuo se aplicó a cromatografía en columna ultrarrápida (3 - 7% de CH³OH en CH²Cl²) para proporcionar (1-(2-(ciclopropanosulfonamido)etilo)piperidina- 4-ilo)metilcarbamato de terc-butilo como un aceite amarillo pálido (2,2 g, 78%).

D. Síntesis de sal de di-HCl de N-(2-(4-(aminometilo)piperidina-1-ilo)etilo)ciclopropanosulfonamida

(1-(2-(ciclopropanesulfonamido)etilo)piperidina-4-ilo)metilcarbamato de terc-butilo (2,20 g, 6,09 mmol) se disolvió en CH³OH (15 mL) y se burbujeó con HCl (g) por 30 seg. Después de que la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos, el disolvente se eliminó a vacío para proporcionar sal de di-HCl de N-(2-(4-(aminometilo)piperidina-1 -ilo)etilo)ciclopropanosulfonamida como un sólido blanco (1.8 g, 89%).

E. Síntesis de 3.5-dicloro-N-((1-(2-(ciclopropanosulfonamido)etilo)piperidina-4-ilo)metilo)benzamida (Compuesto 131)

A una solución de ácido 3,5-diclorobenzoico (23 mg, 0,12 mmol) en DMF (2 mL) se añadió DIPEA (0,1 mL, 0,6 mmol), sal de dihidrocloruro de N-(2-(4-(aminometilo)piperidina-1-ilo)etilo)-1,1,1-trifluorometanosulfonamida (40 mg, 0,12 mmol) y HATU (60 mg, 0,15 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La capa orgánica se lavó con NaHCOa ac. sat. (8 mL), se secó sobre Na2SO4 y se concentró para dar un producto bruto que posteriormente se purificó mediante un sistema de purificación de alto rendimiento (HiTOPs). Ejemplo 15

Síntesis de N-((1-(2-(terc-butilamino)acetilo)piperidina-4-ilo)metilo)-3,5-bis(trifluorometilo)benzamida (Compuesto 242)

A. Síntesis de N-((1-(2-cloroacetilo)piperidina-4-ilo)metilo)-3.5-bis(trifluorometilo)benzamida

Una solución de N-(piperidina-4-ilmetilo)-3,5-bis(trifluorometilo)benzamida (2.0 g. 5.66 mmol) y DIPEA (1.2 mL) en ChbCb (10 ml) se añadió cloruro de 2-cloroacetilo (0.64. 5.66 mmol) gota a gota. la mezcla se agitó durante la noche. La mezcla se lavó con agua. se secó con Na2SÜ4. se filtró y el disolvente se eliminó a vacío. El residuo se purificó por cromatografía flash automática para producir el producto (2.0 g. 82%).

B. Síntesis de N-((1-(2-(terc-butilamino)acetilo)piperidina-4-ilo)metilo)-3.5-bis(trifluorometilo)benzamida (Compuesto 242)

Una solución de N-((1-(2-cloroacetilo)piperidina-4-ilo)metilo)-3.5-bis(trifluorometilo)benzamida (50 mg. 0.12 mmol) y TEA (65 pL. 0.46 mmol) en CH³CN (1 mL) se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (4 mL) y se lavó con solución saturada de NaHCÜ3 acuosa (4 mL). Las capas se dejaron separar y la mezcla se enfrió a -20°C en el congelador. Después de que la capa acuosa se había congelado. la capa orgánica se vertió. y el disolvente se eliminó a vacío. El residuo bruto se purificó por HPLC de fase inversa. Ejemplo 16

Siguiendo los procedimientos generales expuestos en los Ejemplos 1-15. se prepararon los siguientes compuestos enumerados en la Tabla 1 a continuación. La espectrometría de masas se empleó con el compuesto final y en diversas etapas a lo largo de la síntesis como una confirmación de la identidad del producto obtenido (M 1). Para el análisis espectrométrico de masas. se prepararon muestras a una concentración aproximada de 1 pg/ml en acetonitrilo con ácido fórmico al 0.1%. Las muestras se infundieron manualmente en un espectrómetro de masas cuadrupolo triplicado API3000 Applied Biosystems y se escanearon en Q1 en el intervalo de 50 a 700 m/z. El compuesto 367 representa el compuesto de la reivindicación 1 de la invención. Los compuestos restantes se describen pero no se reivindican.

Tabla 1

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Ejemplo 17

Actividades de bloqueo de canal de tipo T de diversos compuestos

A. Transformación de células HEK:

La actividad de bloqueo de canal de calcio de tipo T se ensayó en células de riñón de embrión humano, HEK 293, transfeccionado de forma estable con las subunidades de canal de calcio de tipo T. Brevemente, las células se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal al 10%, 200 U/ml de penicilina y 0,2 mg/ml de estreptomicina a 37°C con 5% de CO². A 85% de confluencia, las células se dividieron con 0,25% de tripsina/1 mM EDTA y se plaquearon al 10% de confluencia sobre cubreobjetos de vidrio. A las 12 horas, el medio se reemplazó y las células se transfectaron de forma estable usando un protocolo estándar de fosfato de calcio y los ADNc de los canales de calcio apropiados. DMEM fresco fue suministrado y las células se transfirieron a 28°C/5% de CO². Las células se incubaron durante 1 a 2 días antes del registro de células completas.

Se emplearon técnicas de pinzamiento de parche estándar para identificar bloqueadores de corrientes de tipo T. Brevemente, las líneas celulares HEK previamente descritas que expresan establemente canales de tipo T humanos a¹G, am y au se utilizaron para todas las grabaciones (pasaje n°: 4-20, 37°C, 5% de CO²). Se llevaron a cabo experimentos de pinzamiento de parche de células enteras usando un amplificador Axopatch 200B (Axon Instruments, Burlingame, CA) conectado a una computadora personal equipada con el software pCLAMP. Los datos se analizaron usando Clampfit (Axon Instruments) y SigmaPlot 4.0 (Jandel Scientific). Para obtener corrientes de tipo T, se colocaron platos de plástico que contenían células semiconfluentes en el escenario de un microscopio ZEISS AXIOVERT S100 después de reemplazar el medio de cultivo con solución externa (véase a continuación). Los parches de células completas se obtuvieron usando pipetas (vidrio de boro-silicato con filamento, O.D.: 1,5 mm, I.D.: 0,86 mm, 10 cm de longitud), fabricadas en un extractor SUTTER P-97 con valores de resistencia de ~5 MQ (véase a continuación para la solución interna).

Tabla 2

Tabla 3

Corrientes de tipo T se obtuvieron de forma fiable mediante el uso de dos protocolos de voltaje:

(1) "no inactivante", y

(2) "inactivación"

En el protocolo sin inactivación, el potencial de retención se establece en -110 mV y con un pulso previo a -100 mV durante 1 segundo antes del pulso de prueba a -40 mV durante 50 ms. En el protocolo de inactivación, el prepulso es aproximadamente de -85 mV durante 1 segundo, lo que inactiva aproximadamente el 15% de los canales de tipo T.

Los compuestos de prueba se disolvieron en solución externa, 0,1-0,01% de DMSO. Después de aproximadamente 10 minutos de descanso, se aplicaron por gravedad cerca de la célula utilizando un tubo microfiltro WPI. El pre-impulso "no inactivado" se usó para examinar el bloque de reposo de un compuesto. El protocolo "inactivado" se empleó para estudiar el bloqueo dependiente de voltaje. Sin embargo, los datos iniciales que se muestran a continuación se obtuvieron principalmente utilizando únicamente el protocolo no inactivado. Valores CI⁵⁰ se muestran para diversos compuestos en la Tabla 4 para el fármaco de interés, donde el compuesto 367 es el compuesto de la reivindicación 1 y se describen los compuestos restantes, pero no se reivindican. Los valores se muestran en pm y valores por encima de 10 pm son simplemente representados como 10 pm. Del mismo modo, los valores CI⁵⁰ para a¹G debajo de 0,30 pm son simplemente representados como 0,30 pm.

Ejemplo 18

Ligación del nervio espinal L5/L6 (SNL) - Modelo de dolor Chuna

La ligadura del nervio espinal es un modelo animal que representa una lesión del nervio periférico que genera un síndrome de dolor neuropático. En este modelo, los animales experimentales desarrollan los síntomas clínicos de alodinia táctil e hiperalgesia. La lesión por ligadura del nervio espinal L5/L6 (SNL) se puede inducir usando el procedimiento de Kim y Chung (Kim, SH, y col., Pain (1992) 50: 355-363) en ratas macho Sprague-Dawley (Harlan; Indianapolis, IN) con un peso de 200 a 250 gramos.

La anestesia se puede inducir con 2% de isofluorano en O² a 2 L/min y se mantiene con 0,5% de isofluorano en O². Las ratas se pueden afeitar y preparar de forma aséptica para las cirugías. Se puede hacer una incisión paraespinal de 2 cm a nivel de L4-S2. L4/L5 puede exponerse al eliminar el proceso transversal por encima de los nervios con una pequeña gubia. El nervio espinal L5 es el más grande de los dos nervios visibles debajo del proceso transversal y se encuentra más cerca de la columna vertebral. El nervio espinal L6 se encuentra debajo de la esquina del hueso de la pendiente. Se puede usar una varilla Chung de vidrio hecha en casa para enganchar L5 o L6 y un nudo corredizo prefabricado de sutura de seda 4.0 se puede colocar en la punta de la varilla justo arriba del nervio y tirar por debajo para permitir la ligadura apretada. Los nervios espinales L5 y L6 pueden estar estrechamente ligados distalmente al ganglio de la raíz dorsal. La incisión puede cerrarse y los animales pueden recuperarse durante 5 días. Las ratas que exhibieron deficiencia motora (como el arrastre de las patas) o que no exhiban alodinia táctil posterior deben ser excluidas de las pruebas adicionales.

Las ratas de control de simulacro pueden experimentar la misma operación y manejo que los animales experimentales, pero sin SNL.

Antes de iniciar la administración del fármaco, deben obtenerse los datos de la prueba conductual inicial. En momentos seleccionados después la infusión del artículo de prueba o de control los datos de comportamiento se pueden recopilar de nuevo.

Evaluación de la alodinia táctil - Von Frey

La evaluación de la alodinia táctil consiste en medir el umbral de retirada de la pata ipsilateral al sitio de lesión del nervio en respuesta a sondeo con una serie de filamentos de von Frey calibrados (estímulos inocuos). Los animales deben aclimatarse a las jaulas de malla de alambre suspendidas durante 30 minutos antes de la prueba. Cada filamento de von Frey se puede aplicar perpendicularmente a la superficie plantar de la pata ligada de las ratas durante 5 segundos. Una respuesta positiva se indica mediante una fuerte extracción de la pata. Para las ratas, el primer filamento de prueba es 4,31. Se pueden tomar medidas antes y después de la administración de los artículos de prueba. El umbral de extracción de la pata se determina mediante el método no paramétrico de Dixon (Dixon, W., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. (1980) 20: 441-462), en donde el estímulo se incrementa incrementalmente hasta obtenerse una respuesta positiva, y luego disminuirse hasta observarse un resultado negativo. El protocolo puede repetirse hasta que se determinen tres cambios en el comportamiento (método "arriba y abajo") (Chaplan, SR, y col., J. Neuroscience Methods (1994) 53: 55-63). El 50% del umbral de extracción de la pata se puede determinar como (¹⁰ [Xf k s ])/¹0,000, donde Xf = el valor del último filamento de von Frey empleado, k = valor de Dixon para el patrón positivo/negativo, y 5 = la diferencia logarítmica entre estímulos. Los valores de corte para las ratas pueden ser no menos de 0,2 g y no más de 15 g (5,18 filamento); para ratones no menos de 0,03 g y no más de 2,34 g (4,56 filamento). Una disminución significativa del umbral de extracción de la pata en comparación con la línea base de pretratamiento se considera alodinia táctil.

B. Evaluación de la hipersensibilidad térmica - Hargreaves

El método de Hargreaves y colegas (Hargreaves, K., et al, Pain (1988) 32:77-8) se puede emplear para evaluar la latencia de retirada de la pata a un estímulo térmico nocivo.

Las ratas se pueden dejar aclimatar dentro de un recinto de Plexiglas en una placa de vidrio transparente durante 30 minutos. Una fuente de calor radiante (es decir, una bombilla de halógeno acoplada a un filtro de infrarrojos) puede activarse con un temporizador y enfocarse en la superficie plantar de la pata afectada de las ratas tratadas. La latencia de extracción de la pata se puede determinar mediante una fotocélula que detiene tanto la lámpara como el temporizador cuando se retira la pata. La latencia de la retirada de la pata de la fuente de calor radiante puede determinarse antes de L5/L6 SNL, 7-14 días después de L5/L6 SNL pero antes del fármaco, así como también después de la administración del fármaco. Se emplea un límite máximo de 33 segundos para evitar el daño tisular. La latencia de extracción de la pata se puede determinar al 0,1 segundo más cercano. Una caída significativa de la latencia de retirada de la pata desde la línea base indica el estado de la hiperalgesia térmica. La antinocicepción está indicada por una reversión de la hiperalgesia térmica a la línea base previa al tratamiento o un aumento significativo (p <0,05) en la latencia de retirada de la pata por encima de esta línea base. Los datos se convierten a % anti hiperalgesia o % anti nocicepción mediante la fórmula: (100 x (latencia de prueba - latencia de referencia)/(corte - latencia de línea de base) donde el corte es de 21 segundos para determinar la antihiperalgesia y 40 segundos para determinar anti nocicepción.

Ejemplo 19

Modelo de Epilepsia de Prueba de Choque Electroconvulsivo (ECS)

La actividad proconvulsiva o anticonvulsiva de los compuestos pueden se evaluada usando la prueba de umbral de choque electroconvulsivo siguiendo el método descrito por Swinyard et al., (J. Pharmacol. Exp. Ther., 106, 319-330, 1952).

Para provocar convulsiones tónicas, un choque electroconvulsivo rectangular se administra a ratones OF1 durante 0,4 s a 50 Hz, a través de electrodos corneales conectados a un generador de corriente constante de choque (Ugo Basile: Tipo 7801). El umbral para las convulsiones tónicas se determina de la siguiente manera: El primer animal está expuesto a 30 mA. Si el primer animal no muestra convulsiones tónicas en 5 segundos, el segundo animal se expone a 40 mA, y así sucesivamente (incrementos de 10 mA) hasta que se observe la primera convulsión tónica. Una vez que se observa la primera convulsión tónica, la intensidad de ECS disminuye en 5 mA para el próximo animal y luego la intensidad disminuye o aumenta en 5 mA de animal a animal, dependiendo de si el animal anterior se convulsionó o no. La intensidad mínima dada es de 5 mA y la intensidad máxima dada es de 95 mA.

Cada grupo de tratamiento consiste en un número de ratones que están todos expuestos a ECS, pero solo los primeros 3 animales se usan para estimar el umbral de corriente y no se incluyen en el análisis.

Para obtener resultados óptimos, cada sustancia de prueba se evalúa a dosis múltiples, administradas i.p. o p.o., antes de que ECS coincida con tiempos de máximo efecto óptimo (Tmax), y se compara con un grupo de control de vehículo. El diazepam administrado bajo las mismas condiciones experimentales se puede usar como sustancia de referencia y el vehículo solo se puede administrar como un control de vehículo.

Los resultados se presentan como la media de intensidad administrada, el número de muertes y el porcentaje de cambio de control para cada grupo de tratamiento durante aproximadamente 30 minutos después de que el animal recibe ECS. Un cambio porcentual positivo indica un efecto anticonvulsivo, mientras que un cambio porcentual negativo indica un efecto proconvulsivo. Para las sustancias de prueba, los datos (intensidad) se pueden analizar utilizando un ANOVA de una vía seguido de la prueba t de Dunnett en caso de un efecto de grupo significativo. Los efectos de la sustancia de referencia (diazepam) se pueden analizar utilizando una prueba t de Student.

Ejemplo 20

Modelo de Epilepsia GAERS (Rata de Epilepsia por Ausencia Genética de Estrasburgo)

El GAERS (Ratas de Epilepsia por Ausencia Genética de Estrasburgo) se destaca por sus episodios de crisis de ausencia prolongada y con frecuencia recurrente. Los investigadores han determinado, usando registros electrofisiológicos de neuronas dentro del tálamo, que la actividad y expresión de los canales de calcio de bajo voltaje se incrementa significativamente en GAERS. Ocho ratas hembra GAERS, criadas en el Instituto Ludwig para la Investigación del Cáncer, se utilizaron para este estudio. Las ratas pesaban entre 180 y 250 g y tenían entre 18 y 26 semanas al inicio del experimento.

Los electrodos se fabricaron en nuestro laboratorio soldando conectores hembra chapados en oro (220-S02 Ginder Scientific, VA, Canadá), alambre revestido de teflón de acero inoxidable (tecnología clínica SDR, NSW, Australia) y un tornillo pequeño de acero inoxidable (1,4 x 3 mm, Mr. Specks, Australia). Los animales se anestesiaron con inhalación de isoflurano en partes iguales de aire y oxígeno médicos (5% de inducción, 2,5 - 1,5% de mantenimiento) o alternativamente mediante inyección intraperitoneal con xilazina (10 mg/kg) y ketamina (75 mg/kg). Los animales se fijaron en un marco estereotáxico mediante barras para oídos. Se realizó una incisión en la línea media en el cuero cabelludo, se raspó la piel y el tejido conectivo y se empujó lateralmente para exponer el cráneo subyacente. Se perforaron 6 agujeros bilateralmente, 2 en el hueso frontal y 4 en el hueso parietal, aproximadamente 2 mm anterior a bregma, y 4 y 10 mm posterior a bregma. Se implantaron 6 electrodos en los orificios, y los enchufes dorados se fijaron en un enchufe de 9 pasadores ABS (GS09PLG-220, Ginder Scientific, Canadá). 2 tornillos de anclaje lateral se colocaron lateralmente en el cráneo para mejorar la fuerza de fijación de la tapa, luego se mantuvieron las tapas en su lugar con cemento dental.

Después de la operación, se administró a los animales el analgésico Rimadilo (4 mg/kg), se colocaron en sus jaulas sobre una estera de calor y se observaron hasta la recuperación. Las ratas se enjaularon por separado durante todo el estudio, se pesaron y se comprobaron a diario, y se les permitió recuperarse durante 7 días antes del comienzo de los procedimientos experimentales. A las ratas se les permitió el acceso libre a los roedores chinos (marca, alimentadores de reserva WA) y al agua en condiciones de luz oscura 12:12 en la instalación de investigación biológica del Departamento de Medicina (RMH).

Antes del primer tratamiento de drogas, las ratas fueron ensayadas para convulsiones de tipo ausencia, que van acompañadas por Spike generalizada y las descargas de onda (SWD) en una grabación de EEG. Las pruebas y todos los experimentos posteriores se realizaron en una habitación silenciosa y bien iluminada con ratas en sus jaulas. Las ratas se conectaron a través de cables de 6 canales, que se cortaron y soldaron a 6 pasadores chapados en oro insertados en un zócalo de 9 patillas. Los cables se conectaron a una computadora con el software de adquisición CompumedicsTM EEG (Melbourne, Australia). 3 ratas que no tenían convulsiones iniciales adecuadas al inicio del estudio se iniciaron en la semana 2 y sus tratamientos se recuperaron al final de acuerdo con el cronograma (véase tabla 2). En la semana 1, día 1 después del período de aclimatación posterior a la implantación quirúrgica de electrodos subdurales, se habituaron 4 animales (n° 1 a 4) con el cable conectado durante 15 minutos, y luego se registraron sus SWD durante 60 minutos como valor inicial. Inmediatamente después de la línea base, a las ratas se les proporcionó uno de los artículos de prueba, referencia o control de acuerdo con el programa de tratamiento, y el período objetivo se registró a partir de 15 después de la inyección durante 120 minutos. Los animales fueron monitoreados durante todo el experimento, y se mantuvieron silenciosamente despiertos durante los períodos de referencia y objetivo

La expresión de convulsión por 60 minutos antes de la inyección y 120 minutos después de la inyección de grabación EEG (comenzando 15 minutos después de la administración de drogas) se cuantificó al marcar el inicio y el final de la ráfaga de SWDs. Esto se hizo con la ayuda del software SWCFinder®, diseñado a medida para cuantificar las convulsiones de GAERS, y los investigadores estaban cegados a la naturaleza del fármaco administrado, por lo que el análisis se cegó. El criterio estándar para las convulsiones GAERS es una ráfaga de amplitud SWD de más de tres veces la línea base, una frecuencia de 7 a 12 Hz y una duración superior a 0,5 s. A partir de esto, se determinó el porcentaje total de tiempo transcurrido en el ataque durante los 120 minutos posteriores al registro de EEG (porcentaje de tiempo en el ataque) como la variable principal de resultado.

La Tabla 6 muestra el porcentaje de tiempo promedio en la incautación de vehículo, los compuestos 365 y 368 administrados IP con una dosis de 30 mg/kg en comparación con la línea de base. Ambos compuestos 365 y 368 demostraron una disminución significativa en el porcentaje de tiempo en la actividad convulsiva en comparación con la línea de base y el vehículo.

Claims (3)

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto que tiene la estructura:

o una sal o conjugado farmacéuticamente aceptable del mismo en mezcla con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

2. La composición farmacéutica de la reivindicación 1 para su uso en un método de tratamiento de la epilepsia.

3. La composición farmacéutica de la reivindicación 1 para su uso en un método de tratamiento de un trastorno del sueño.