ES2807274T3 - Un canal catiónico no selectivo en células neurales y compuestos que bloquean el canal para su uso en el tratamiento de la inflamación del cerebro - Google Patents

Un canal catiónico no selectivo en células neurales y compuestos que bloquean el canal para su uso en el tratamiento de la inflamación del cerebro Download PDF

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Abstract

Un antagonista de SUR1 que bloquea el canal de NCCa-ATP para su uso en (a) la prevención o el tratamiento de la inflamación de las células neurales en el cerebro de un sujeto; (b) el alivio de los efectos negativos de la lesión cerebral traumática o la isquemia cerebral derivadas de la inflamación de las células neurales en un sujeto; (c) tratar la inflamación de las células neurales en el cerebro de un sujeto que tiene daño en el sistema nervioso central o periférico; o (d) tratar la inflamación de las células neurales en el cerebro de un sujeto que tiene sangrado en el cerebro.

Description

DESCRIPCIÓN
Un canal catiónico no selectivo en células neurales y compuestos que bloquean el canal para su uso en el tratamiento de la inflamación del cerebro
Campo de la invención
La presente invención se refiere a usos terapéuticos de un antagonista de SUR1 que bloquea un canal iónico que se encuentra en las células neurales que participa en el flujo de cationes implicado en la inflamación celular. Por lo tanto, la invención proporciona tales antagonistas de SUR1 y composiciones que los contienen para su uso en métodos terapéuticos que inhiben la actividad del canal iónico para inhibir o prevenir la inflamación de las células neurales en el cerebro. Se ha descubierto que la inflamación de las células neurales está mediada por la apertura de un nuevo canal sensible al ATP catiónico monovalente no selectivo (el canal NCCa-ATP) y que este canal está acoplado al receptor de sulfonilurea de tipo 1. Además, se ha descubierto que la inflamación de las células neurales y la muerte celular, particularmente la inflamación de los astrocitos, se puede inhibir bloqueando el canal NCCa-ATP de la presente invención, particularmente antagonizando los receptores acoplados a este canal, como antagonizar el SUR1. La invención también abarca dichos compuestos y composiciones, que modulan la actividad del canal NCCa-ATP, para su uso en el tratamiento de la inflamación cerebral. La presente invención se refiere al tratamiento de la inflamación cerebral que es resultado de un traumatismo cerebral o isquemia cerebral, debido a la inflamación de las células neurales y la muerte celular.
Antecedentes de la invención
Después de lesión cerebral e ictus, la respuesta normal del cerebro circundante consiste en montar una respuesta celular que incluye la formación de astrocitos reactivos que se cree que son importantes para "contener" y "limpiar" el lugar de la lesión. La inflamación de las células neurales es parte de la respuesta citotóxica o de inflamación celular que caracteriza a la lesión del cerebro en la isquemia cerebral y la lesión traumática del cerebro, y es una causa principal de morbidez y mortalidad. Véanse, Staub et al., 1993; Kimelberg et al., 1995. Se han identificado numerosos mediadores que inician la inflamación de las células neurales, incluyendo la elevación de K+ extracelular, acidosis, liberación de neurotransmisores y ácidos grasos libres. Véanse, Kempski et al., 1991; Rutledge y Kimelberg, 1996; Mongin et al., 1999. El edema citotóxico es un fenómeno bien reconocido clínicamente que ocasiona inflamación en el cerebro, que empeora las consecuencias e incrementa la morbidez y la mortalidad en lesiones del cerebro e ictus.
Se han estudiado los mecanismos subyacentes a la muerta apoptótica de los astrocitos reactivos. Véanse, Tanaka et al., 2000; Yu et al., 2001. Los mecanismos responsables de la muerte celular necrótica no han sido caracterizados. La muerte celular apoptótica está precedida de una contracción de la célula y una pérdida neta de K+. Véanse, Yu et al., 1997; Yu et al., 1999. Por el contrario, en la muerte celular necrótica, la membrana plasmática se rompe, ocasionando la liberación del contenido citosólico y desencadenando de ese modo la inflamación del tejido. Véase, Leist y Nicotera, 1997. La muerte celular necrótica puede ser más perjudicial para los tejidos viables próximos, dada la lesión inflamatoria secundaria que se inicia.
La muerte celular necrótica se inicia por medio de la inflamación osmótica que sigue al influjo de Na+, la mayor parte osmolito extracelular. En la mayoría de los tipos de células, se considera la acumulación de Na+ intracelular como un proceso pasivo que no requiere activación de los efectores específicos, sino que se debe, en lugar de eso, a un bombeo defectuoso de Na+ hacia afuera en condiciones de [ATP]i baja. Véanse, Leist y Nicotera, 1997; Trump et al., 1997. El burbujeo celular o la inflamación, una indicación de sobrecarga de Na+ intracelular, se considera generalmente como un signo temprano de muerte celular necrótica. Véanse, Leist y Nicotera, 1997; Majno y Joris, 1995.
La inhibición de la síntesis de ATP o el agotamiento de ATP también ocasionan inflamación de las células neurales, burbujeo y, si es suficientemente grave, desorganización de la membrana plasmática y muerte celular. Véase, Jurkowitz-Alexander et al., 1993. Los mecanismos de la inflamación de las células neurales asociados con el agotamiento del ATP aún no se han caracterizado completamente. Véanse, Lomneth y Gruenstein, 1989; Juurlink et al., 1992; Rose et al., 1998.
Un mecanismo potencial sería cambios en la concentración de Na+ y K+ debidos a la inhibición de la bomba de Na+/K+-ATPasa. No obstante, un grado equivalente de inflamación osmótica inducida por la inhibición mediada por ouabaína de la bomba de Na+/K+-ATPasa en las células neurales no produce una gran despolarización, burbujeo o muerte celular. Véanse, Jurkowitz-Alexander et al., 1992; Brismar y Collins, 1993. Por lo tanto, el fallo de la bomba de Na+/K+-ATPasa, no es el mecanismo crítico para la inflamación de las células neurales. Ninguno de estos estudios ha identificado el mecanismo celular decisivo en la inflamación celular que está asociada con la lesión en el cerebro en la isquemia cerebral y la lesión traumática del cerebro.
Un subtipo de canal catiónico sensible a ATP es el canal catiónico no selectivo, que es un canal que es sensible a Ca2+ y a ATP. Más específicamente, los canales catiónicos no selectivos son activados por el Ca2+ intracelular ([Ca2+]i) e inhibidos por el ATP intracelular ([ATP]i). Aunque los canales catiónicos sensibles a Ca2+ y ATP han sido identificados en numerosos tipos de células no neurales, no han sido identificados en astrocitos ni en cualquier otro tipo de células neurales. Véanse, Sturgess et al., 1987; Gray y Argent, 1990; Rae et al., 1990; Champigny et al., 1991; Popp y Gogelein, 1992; Ono et al., 1994, cada uno de los cuales se incorpora a la presente como referencia en su totalidad. Estos canales que no son de astrocitos comprenden un grupo heterogéneo con características definidas de manera incompleta. Muestran conductancias de un único canal en el intervalo de 25-35 pS, discriminan escasamente entre Na+ y K+, son impermeables a los aniones, la mayor parte impermeables a cationes divalentes, y son bloqueados por concentraciones similares de nucléotidos de adenina ATP, ADP y AMP en el lado citoplásmico. La función de estos canales catiónicos sensibles a ATP no selectivos en estos tipos de células no neurales sigue siendo un enigma, en parte debido a que generalmente se requieren concentraciones de Ca2+ no fisiológicas para la activación del canal.
Otro subtipo de canal catiónico sensible a ATP es el canal de potasio sensible a ATP (canales Katp) de las células p pancreáticas. Una clase de secretagogos de insulina, las sulfonilureas antidiabéticas, se utiliza para inhibir estos canales Katp y estimular la liberación de insulina en la diabetes mellitus. Véase, Lebovitz, 1985. Las sulfonilureas antidiabéticas median su efecto sobre los canales Katp a través de un receptor de sulfonilurea de alta afinidad (SUR). Véanse, Panten et. al., 1989; Aguilar-Bryan et. al., 1995. Se han identificado y clonado varias isoformas de SUR, denominadas SUR1, SUR2A, SUR2B, y SUR2C. Véanse, Aguilar-Bryan et. al., 1995; Inagaki et. al., 1996; Isomoto et. al., 1996; Lawson, 2000. Estos receptores pertenecen a la familia de transportadores con una casete de unión a ATP (ABC), de la cual también es miembro el regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR), otro modulador del canal iónico. Véanse, Higgins, 1992; Aguilar-Bryan et. al., 1995. Notablemente, el CFTR tiene una mayor importancia terapéutica, puesto que su ausencia genética ocasiona fibrosis quística, una enfermedad fatal.
El receptor de sulfonilurea confiere sensibilidad a las sulfonilureas antidiabéticas tales como la glibenclamida y la tolbutamida. Asimismo, SUR es responsable de la activación del canal de potasio por medio de un grupo químicamente diverso de agentes denominados abridores del canal de K+ (activadores SUR), tales como diazóxido, pinacidil, y cromacalina. Véanse, Aguilar-Bryan et. al., 1995; Inagaki et. al., 1996; Isomoto et. al., 1996; Nichols et. al., 1996; Shyng et. al., 1997b. En diversos tejidos, SUR molecularmente distintos se acoplan a radicales de canales distintos para formar diferentes canales Katp con características fisiológicas y farmacológicas distinguibles. El canal Katp en las células pancreáticas 3 está formado por SUR1 conectado con un canal K+, mientras los canales Katp cardíacos y de la musculatura lisa se forman a partir de SUR2A y SUR2B, respectivamente, conectados a canales K+. Véase, Fujita ad Kurachi, 2000.
La Patente de los Estados Unidos N.° 5.215.985 describe un método para el tratamiento de una lesión neuronal, tal como la causada por la falta de oxígeno, mediante la administración de un bloqueador de los canales de potasio sensible al ATP, como una sulfonilurea, por ejemplo tolbutamida.
Chen y Simard, J. Neuroscience 21 (17): 6512-6521, septiembre de 2001 informan de que un canal de catión no selectivo activado por Ca2+ interno y bloqueado por ATP interno se expresa en astrocitos reactivos naturales del cerebro adulto lesionado y que este canal está involucrado en la inflamación celular secundaria al agotamiento de ATP.
Khan et al, Journal of China Pharmaceutical University 2000, 31 (4), 289-293 documentan la comparación de los efectos terapéuticos por el abridor de canales K minoxidil y la gliburida bloqueadora en la isquemia cerebral producida por la oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) y levotiroxina en ratas.
Plangger, Acta Neurochir. (1994) [Supl] 60: 519-520 documenta el efecto de torasemida sobre la presión intracraneal, la presión arterial sistémica media y la presión de perfusión cerebral en el edema cerebral experimental de la rata.
El documento EP 0 210 772 describe una serie de compuestos que poseen efectos inhibidores sobre el edema cerebral.
De este modo, existe la necesidad de una diana fisiológica decisiva en la inflamación celular que está asociada con la lesión en el cerebro en la isquemia cerebral y la lesión traumática en el cerebro y en la consiguiente morbidez y mortalidad. También existe la necesidad de tratamientos específicos para el edema citotóxico que ocasiona la inflamación del cerebro, que empeora las consecuencias e incrementa la morbidez y la mortalidad en la lesión del cerebro y el ictus. Asimismo existe la necesidad de compuestos terapéuticos capaces de modular la actividad de esta diana con el fin de prevenir la lesión en el cerebro. La presente invención se refiere a un canal catiónico monovalente sensible a calcio y ATP no selectivo, denominado canal NCcb-atp, que está presente en células neurales, y ligado a un SUR. La presente invención proporciona antagonistas, tales como sulfonilureas y otros bloqueadores SUR1, para su uso en las terapias para inhibir la actividad de este canal y de ese modo evitar la inflamación de las células neurales y la muerte celular y la lesión del sistema nervioso concomitante que incluye inflamación del cerebro y lesión del cerebro.
La presente invención en particular proporciona un antagonista SURI que bloquea el canal NCCa-ATP para su uso en (a) la prevención o el tratamiento de la inflamación de las células neurales en el cerebro de un sujeto; (b) el alivio de los efectos negativos de la lesión cerebral traumática o la isquemia cerebral derivada de la inflamación de las células neurales en un sujeto; (c) tratar la inflamación de las células neurales en el cerebro de un sujeto que tiene daño en el sistema nervioso central o periférico; o (d) tratar la inflamación de las células neurales en el cerebro de un sujeto que tiene sangrado en el cerebro.
Sumario de la invención
La invención se basa, en parte, en el descubrimiento de un canal específico, el canal NCCa-ATP, que se expresa en células neurales reactivas después de un traumatismo cerebral. La presente invención se refiere a composiciones purificadas que contienen un nuevo canal de catión no específico activado por Ca2+, sensible a [i], en adelante el canal NCcb-atp. Las composiciones comprenden preferiblemente células neurales de mamífero o preparaciones de membrana que expresan el canal NCcb-atp, lo más preferentemente las células neurales de mamífero son astrocitos reactivos recién aislados. Un ejemplo preferido de dicha composición purificada que contiene el canal NCcb-atp es una preparación de membrana derivada de astrocitos reactivos naturales. Como se demuestra en el presente documento, cuando las células neurales que expresan el canal NCcb-atp se agotan de ATP intracelular, el canal NCCa-ATP se abre y las células se hinchan y mueren. Sin embargo, si el canal NCCa-ATP está bloqueado en dichas células, las células no se hinchan ni mueren. La invención también se basa, en parte, en el descubrimiento de que el canal NCCa-ATP está regulado por un receptor de sulfonilurea tipo 1, y que los antagonistas de este receptor son capaces de bloquear el canal NCCa-ATP e inhibir la inflamación de las células neurales.
El canal NCoa-ATP descrito en el presente documento se distingue por ciertas características funcionales, cuya combinación lo distingue de los canales iónicos conocidos. Las características que distinguen el canal NCCa-ATP incluyen, pero no están necesariamente limitadas a, las siguientes: 1) es un canal catiónico no selectivo que permite fácilmente el paso de Na, K y otros cationes monovalentes; 2) es activado por un incremento en el calcio intracelular, y/o por una disminución en el ATP intracelular; 3) está regulado por el receptor de sulfonilurea de tipo 1 (SUR1), que hasta ahora se había considerado que estaba asociado exclusivamente con canales Katp tales como los encontrados en las células pancreáticas 13.
Más específicamente, el canal NCoa-ATP descrito en el presente documento tiene una conductancia del canal individual para el ión potasio (K+) entre 20 y 50 pS. El canal NCCa-ATP también es estimulado por Ca2+ en el lado citoplásmico de la membrana celular en un intervalo de concentración fisiológica, donde dicho intervalo de concentración es de 10-8 a 10-5 M. El canal NCCa-ATP también es inhibido por el ATP citoplásmico en un intervalo de concentración no fisiológico, donde dicho intervalo de concentración es de 10-1 a 10 M. El canal NCCa-ATP también es permeable a los siguientes cationes; K+, Cs+, Li+, Na+; hasta el punto de que la razón de permeabilidad entre dos cualesquiera de dichos cationes es mayor de 0,5 y menor de 2.
La invención también se refiere a ensayos diseñados para seleccionar compuestos o composiciones que modulan el canal NCCa-ATP, en particular, compuestos o composiciones que actúan como antagonistas del canal, y de este modo, modulan la inflamación de las células neurales y la inflamación cerebral concomitante. Para este fin, se pueden usar ensayo basados en células o ensayos no basados en células para detectar compuestos que interaccionan con, por ejemplo, se unen al exterior (es decir, el dominio extracelular) del canal NCCa-ATP y/o su SUR1 asociado. Los ensayos basados en células tienen la ventaja de que pueden usarse para identificar compuestos que afectan a la actividad biológica del canal NCCa-ATP (es decir, la despolarización).
En el presente documento se describe un método para detectar e identificar antagonistas del canal NCCa-ATP, al poner en contacto las células neurales con un compuesto de prueba y determinar si el compuesto de prueba inhibe la actividad del canal NCCa-ATP. Se describen métodos para identificar compuestos que son antagonistas del canal NCCa-ATP. Los compuestos terapéuticos, incluidos los antagonistas de NCCa-ATP, pueden identificarse por la capacidad del compuesto para bloquear el canal abierto o para evitar la apertura del canal, cuantificando la función del canal utilizando técnicas electrofisiológicas para medir la corriente de membrana a través del canal. Los antagonistas de NCCa-ATP incluyen compuestos que son inhibidores de los canales de NCCa-ATP, bloqueadores de canales de NCCa-ATP, antagonistas de SUR1, inhibidores de SUR1 y/o compuestos que reducen la magnitud de la corriente de membrana a través del canal. La función del canal se puede medir en una preparación de células neurales de un humano o animal, y el compuesto de prueba se puede poner en contacto con la preparación celular lavándolo sobre la preparación celular en solución. También se describe en el presente documento un método de detección de compuestos de sulfonilurea que pueden actuar como antagonistas del canal NCCa-ATP.
En el presente documento se describen ensayos de detección de fármacos para identificar compuestos para el tratamiento de la inflamación cerebral, tal como la inflamación que ocurre después de una lesión cerebral o isquemia cerebral mediante el uso del canal NCCa-ATP como diana. También se describen en el presente documento compuestos que modulan la inflamación de las células neurales a través del canal NCCa-ATP. La presente invención proporciona compuestos para su uso en el tratamiento de la inflamación cerebral dirigiéndose al canal NCCa-ATP.
También se describen en el presente documento agonistas y antagonistas del canal NCCa-ATP, que incluyen moléculas pequeñas, moléculas grandes y anticuerpos, así como secuencias de nucleótidos que pueden usarse para inhibir la expresión génica del canal NCcb-atp (por ejemplo, moléculas antisentido y ribozima). Un antagonista del canal NCcb-atp incluye compuestos capaces de (1) bloquear el canal, (2) evitar la apertura del canal y/o (3) reducir la magnitud de la corriente de membrana a través del canal.
La invención abarca el uso de tales compuestos y composiciones, que modulan la actividad del canal NCcb-atp para tratar la inflamación del cerebro. Los antagonistas para el canal de NCcb-atp pueden ser para su uso en un método de prevención de la inflamación del cerebro y la lesión del cerebro resultante. En una realización, el antagonista terapéutico se puede administrar a o dentro del cerebro. Semejante administración al cerebro incluye la inyección directamente al cerebro, concretamente en el caso en el que el cerebro se ha dejado accesible a la inyección debido a un trauma en el cráneo. En una realización el compuesto de sulfonilurea es glibenclamida. En otra realización, el compuesto de sulfonilurea es tolbutamida.
Breve descripción de las figuras
Figura 1 (que comprende las Figuras 1A, 1B, 1C, 1D, 1E y 1F); la Figura 1A muestra el registro de la fijación de corriente de células completas antes y después de la exposición a ouabaína y antes y después de la exposición a NaN3. La Figura 1B muestra los registros de fijación de voltaje de células completas durante los pulsos en rampa (a) antes y (b) después de la exposición a NaN3; (c) es la diferencia de corriente. La Figura 1C muestra los registros de fijación de voltaje de células completas durante los pulsos de la etapa (a) antes y (b) después de la exposición a NaN3; (c) es la diferencia de corriente. La Figura 1D muestra el registro del parche anclado a la célula de aperturas del canal iónico individual inducidas por NaN3 a potenciales de membrana de (3) -80 mV y (4) 80 mV, en comparación con parches de control a potenciales de membrana de (1) 80 mV y (2) -80 mV. La Figura 1E muestra las corrientes del parche anclado a la célula de la Figura 1D, mostradas a una resolución de tiempo mayor. La Figura 1F muestra la relación de corriente-voltaje de un solo canal del parche anclado a la célula. Figura 2 (que comprende las Figuras 2A y 2B): la Figura 2A muestra las corrientes de un solo canal registradas en un parche interior-fuera a diferentes potenciales de membrana; la línea discontinua indica el cierre del canal. La Figura 2B es un gráfico de la amplitud del canal individual en el parche interior-fuera vs. potenciales de membrana.
Figura 3 (que comprende las Figuras 3A, 3B, 3C y 3D); la Figura 3A muestra corrientes de un solo canal registradas en un parche interior-fuera con diferentes iones alcalinos que sustituyen a K+ en la pipeta; la línea discontinua indica el cierre del canal. La Figura 3B es un gráfico de la amplitud del canal vs. el potencial de membrana con diferentes iones alcalinos que sustituyen a K+ en la pipeta. La Figura 3C es un gráfico de la amplitud del canal medida en parches interior-fuera vs. el voltaje con Ca2+ y Mg2+ que sustituyen a K+ en la pipeta. Para estimar el tamaño del poro del canal, la Figura 3D es un gráfico que ilustra la relación entre la permeabilidad (con respecto a Cs+) y el radio molecular de una serie de cationes orgánicos monovalentes, que incluían: (a) metanolamina, (b) guanidio, (c) etanolamina, (d) dietilamina, (e) piperazina, (f) Tris, y (g) N-metilglucamina, datos que indican un tamaño de poro equivalente de 0,67 nm.
Figura 4 (que comprende las Figuras 4A y 4B); la Figura 4A muestra registros de un solo canal en un parche interior-fuera en ausencia de ATP citoplásmico. La Figura 4B es un gráfico de la probabilidad de un canal abierto normalizada (n^Po) vs. la concentración de ATP citoplásmico.
Figura 5 (que comprende las Figuras 5A y 5B); la Figura 5A muestra registros de corriente de un parche interiorfuera expuesto a diferentes concentraciones de [Ca2+]i. Figura 5B valores de n^Po medido a los potenciales de membrana y [Ca2+]i indicados.
La Figura 6 es un gráfico de las amplitudes de los canales individuales medias obtenidas en una configuración de parche interior-fuera a diferentes potenciales y con diferente [Mg2+]i; la línea discontinua indica la conductancia 35 pS.
La Figura 7 (que comprende las Figuras 7A y 7B) muestra la presencia de ARNm de SURI y las ausencias de Kir6.1 y Kir 6.2 en astrocitos reactivos. Las calles 3 y 5 de la Figura 7A muestran la presencia de SURI en células RIN-m5f de insulinoma y NRA, respectivamente. Las calles 4 y 6 de la Figura 7A demuestran que SUR2 está ausente en ambos tipos de células. Las calles 3 y 4 de la Figura 7b demuestran que Kir6.1 está presente en células RIN-m5f de insulinoma y Kir6.2 está ausente de las células de insulinoma, respectivamente. Las calles 5 y 6 de la Figura 7B demuestran que ni Kir6.1 ni Kir6.2 están presentes en NRA, respectivamente.
La Figura 8 muestra registros de corriente en un parche interior-fuera para ilustrar los efectos de la digestión con tripsina sobre la sensibilidad del canal a la glibenclamida y el ATP.
La Figura 9 (que comprende las Figuras 9A y 9B) demuestra que el activador del canal diazóxido puede lograr actividades del canal en una configuración de registro de parche exterior-fuera. La Figura 9A muestra los registros del parche exterior-fuera con azida de Na y diazóxido aplicados al lado extracelular de la membrana. La Figura 9B muestra los registros de corriente obtenidos a partir de los segmentos marcados con los correspondientes números en la Figura 9A, a una resolución temporal mayor.
Figura 10 (que comprende las Figuras 10A, 10B y 10C): la Figura 10A muestra registros en un parche exteriorfuera (a) antes, (b) durante, y (c) después de la aplicación de glibenclamida al lado extracelular de la membrana. La Figura 10B muestra los registros de corriente de la Figura 10A a una resolución temporal mayor. La Figura 10C muestra un gráfico de las amplitudes del canal individual medias a diferentes potenciales estudiados; la pendiente de los datos indica una conductancia de 35 pS del canal sensible a glibenclamida.
La Figura 11 (que comprende las Figuras 11A y 11B) demuestra que los compuestos de sulfonilurea inhiben las actividades del canal. La Figura 11A muestra los registros del parche exterior-fuera con diferentes concentraciones de tolbutamida aplicada al lado extracelular de la membrana. La Figura 11B muestra las curvas dosis-respuesta para la inhibición de la probabilidad de canal abierto por medio de glibenclamida y tolbutamida para proporcionar una probabilidad de canal abierto normalizada (n^Po); los datos se ajustaron a una ecuación logística convencional, con un coeficiente de Hill de 1 y una inhibición semi-máxima de 48 nM y 16,1 pM; los valores trazados son las medias (±ET) de los parches 3 y 5 parches para Glibenclamida y Tolbutamida, respectivamente.
Figura 12 (que comprende las Figuras 12A, 12B, 12C, 12D, 12E, 12F, 12G, 12H y 12I); las Figuras 12A, 12B y 12C muestran la probabilidad de apertura del canal en presencia de tolbutamida 0 pM, 3 pM, y 30 pM, respectivamente.
Las Figuras 12D, 12E y 12F muestran la distribución de los tiempos exposición del canal abierto en presencia de tolbutamida 0 pM, 3 pM, y 30 pM, respectivamente.
Las Figuras 12g , 12H y 12I muestran la distribución de los tiempos de exposición del canal cerrado en presencia de tolbutamida 0 pM, 3 pM, y 30 pM, respectivamente.
Figura 13 (que comprende las Figuras 13A, 13B y 13C): la Figura 13A muestra los registros del parche exteriorfuera con diazóxido aplicado al lado extracelular de la membrana.
La Figura 13B muestra registros de corriente a una resolución temporal mayor después de la aplicación de diazóxido y a diferentes potenciales de membrana.
La Figura 13C muestra un gráfico de las amplitudes del canal individual medias a los diferentes potenciales estudiados; la pendiente indica una conductancia de 35 pS del canal sensible a glibenclamida.
Las Figuras 14a , 14B y 14C son microfotografías electrónicas de barrido de astrocitos reactivos nativos recién aislados. La Figura 14A muestra las células cuando se inició la fijación con formaldehído-glutaraldehído en condiciones de control; la Figura 14B muestra las células fijadas 5 min después de la exposición a NaN3 1 mM. La Figura 14C muestra las células fijadas 25 min después de la exposición a NaN3 1 mM. Bar, 12 pm.
Figura 15 (que comprende las Figuras 15A, 15B y 15C); la Figura 15A tiene fotomicrografías de las imágenes de epifluorescencia de células expuestas a diferentes compuestos y marcadas con yoduro de propidio (panel superior a, b y c) o anexina V (panel inferior d, e y f). Los compuestos fueron: control (a y d), azida de Na 1 mM (b y e), azida de Na 1 mM mas glibenclamida 1 pM (c y f). La Figura 15B tiene gráficos de barras que muestran los recuentos de células para el marcaje con yoduro de propidio; comparaciones múltiples por pares indicadas a una diferencia significativa (p < 0,05) con tratamiento de azida de Na; la Figura 15C tiene gráficos de barras que muestran los recuentos celulares para la tinción con anexina V; las comparaciones múltiples por pares indicaron una diferencia no significativa con cualquier tratamiento.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
Algunas de las realizaciones preferidas de la presente invención se describirán con detalle con referencia a los dibujos adjuntos. Esta invención se puede plasmar de muchas formas diferentes y no se debe considerar que esté limitada a las realizaciones mostradas en la presente memoria.
La presente invención hace referencia a un canal iónico novedoso cuya función subyace a la inflamación de las células neurales de mamífero, por ejemplo en respuesta al agotamiento de ATP; el uso del canal para escrutar inhibidores del canal, y el uso de la función de inhibidores del canal evitando esta respuesta de inflamación celular, que caracteriza al daño del cerebro en la isquemia cerebral y la lesión traumática del cerebro.
La azida de sodio (NaN3) es una toxina metabólica utilizada para inducir "hipoxia química" por medio del agotamiento de ATP intracelular. Véase, Swanson, 1992. Las respuestas morfológicas y electrofisiológicas de las células neurales a NaN3 se examinan en una preparación de células novedosa. Se utilizan astrocitos reactivos nativos recién aislados (NRA) de cerebro de rata adulta y se estudian en un estado nativo inmediatamente después de su aislamiento. Los astrocitos reactivos son astrocitos que han sido activados o estimulados in vivo, tales como aquellos asociados con la lesión del cerebro o neural. En cerebros post-mortem de pacientes con lesión traumática del cerebro (TBI), los astrocitos reactivos se encuentran en las proximidades de la lesión: La mayoría de los astrocitos reactivos que rodean el lugar de una lesión en el cerebro son astrocitos reactivos. Los astrocitos reactivos de tipo 1 comprenden >80% de astrocitos reactivos recuperables, mientras los astrocitos reactivos de tipo 2 comprenden aproximadamente 5%. Los astrocitos reactivos están normalmente polarizados en condiciones quiescentes.
Según se utiliza en la presente memoria, el término "células neurales" incluye astrocitos. El término "astrocitos reactivos" representa los astrocitos encontrados en el cerebro en el lugar de una lesión o isquemia. El término "astrocitos reactivos nativos" o "NRA" representa astrocitos reactivos que están recién aislados del cerebro. El término "recién aislados" según se utiliza en la presente memoria hace referencia a NRA que han sido purificados del cerebro, concretamente NRA que fueron purificados de aproximadamente 0 a aproximadamente 72 horas antes. Cuando se hace referencia a NRA que están "purificados a partir del cerebro" la expresión "purificado" significa que los NRA están aislados de otro tejido del cerebro y/o implantados en gelatina o esponja, y no hace referencia a un proceso que simplemente cosecha una población de células sin aislamiento adicional de las células. Como se describe en la presente memoria, el canal NCca-ATP encontrado en los astrocitos reactivos está presente solamente en células recién aisladas; el canal NCca-ATP se pierde poco después de cultivar las células. Los NRA proporcionan un modelo in vitro que es más similar a los astrocitos reactivos ya que existen in vivo en el cerebro, que los astrocitos desarrollados en cultivo. Los términos "nativo" y "recién aislado" se utilizan como sinónimos. Según se utiliza en la presente memoria, el término "células neurales aisladas" representa células neurales aisladas de cerebro.
Los astrocitos reactivos son producidos in vivo y cosechados del cerebro de acuerdo con un sistema de métodos similar al descrito por Perillan. Véase, Perillan et al., 1999; Perillan et al., 2000. Las células cosechadas se aíslan a continuación y no se cultivan; en vez de eso, los astrocitos reactivos recién aislados se estudian en un estado nativo inmediatamente después de su aislamiento del cerebro.
Los Ejemplos descritos en la presente memoria revelan que los NRA de cerebro de rata adulta expresan un canal catiónico no selectivo que es activado por el agotamiento de [ATP]i a concentraciones fisiológicas de [Ca2+]i. Este canal de NCca-ATP de la presente invención, que está recién identificado en los NRA y está presente en >90% de los parches de membrana de tales células, se distingue de los canales de calcio y ATP no selectivos referidos previamente por mostrar propiedades significativamente diferentes. Estas propiedades distintivas del NCca-ATP de la presente invención incluyen: estar activado por [Ca] submicromolar y mostrar una sensibilidad diferente al bloqueo por diferentes nucleótidos de adenina. La apertura del canal NCca-ATP de la presente invención por el agotamiento de ATP causa una profunda despolarización de la membrana que precede al burbujeo de la membrana celular. Tras el agotamiento del ATP, el canal NCca-ATP se abre para permitir el influjo de Na+ que conduce a la inflamación de la célula. Este canal está regulado por el receptor de sulfonilurea de tipo 1 (SUR1). El canal puede ser bloqueado por sulfonilurea, tal como glibenclamida y tolbutamida; el tratamiento con glibenclamida da como resultado una reducción significativa en la inflamación y el burbujeo inducidos por el agotamiento químico de ATP. Este canal participa en el flujo de cationes implicado en la inflamación celular. Un método descrito en el presente documento incluye el uso de los compuestos de sulfonilurea para inhibir el flujo de corriente a través del canal NCca-ATP e inhibir el burbujeo relacionado con la apertura del canal. Asimismo, el uso de compuestos de sulfonilurea y otros compuestos que inhiben el flujo de corriente a través del canal NCca-ATP, puede de este modo tener un efecto preventivo terapéutico sobre la inflamación celular en el cerebro.
Por lo tanto, en el presente documento se describe una composición que comprende una preparación de membrana que expresa el canal NCca-ATP. Por ejemplo, la preparación de membrana deriva de células neurales, tales como astrocitos reactivos nativos aislados (NRA), preferiblemente astrocitos reactivos nativos recién aislados. El canal NCca-ATP de la composición tiene las siguientes características: (a) es un canal de tipo 35 pS; (b) es estimulado por Ca2+ citoplásmico; (c) se abre cuando el ATP citoplásmico es menor de aproximadamente 0,8 uM; y (d) es permeable a los cationes monovalentes K+, Cs+, Li+ y Na+ y puede ser bloqueado por antagonistas del receptor de sulfonilurea de tipo 1.
Además, en el presente documento se describe un método para seleccionar los antagonistas del canal NCca-ATP, mediante un método que comprende: (a) poner en contacto un compuesto de ensayo con una composición que comprende el canal NCcb-atp; y (b) identificar compuestos de ensayo que inhiben la actividad de dicho canal midiendo dicha actividad en presencia y ausencia de dicho compuesto de ensayo, en donde un compuesto de ensayo que inhibe dicha actividad es identificado como un antagonista del canal NCca-ATP. Por ejemplo, la composición puede contener una preparación de células neurales que expresan el canal NCca-ATP o una preparación de membrana que expresa el canal NCca-ATP, tal como una preparación de membrana derivada de astrocitos reactivos nativos aislados (NRA). El efecto del compuesto sobre este canal puede incluir: (a) el bloqueo del canal NCca-ATP; (b) el cierre del canal NCcb-atp; (c) la prevención de la apertura del canal NCcb-atp; y (d) la reducción de la magnitud de la corriente de membrana a través del canal NCca-ATP. En el presente documento también se describe la identificación de un compuesto que es un antagonista de NCca-ATP, incluyendo un inhibidor del canal NCca-ATP, un bloqueador del canal de NCca-ATP, un antagonista de SUR1, un inhibidor de SUR1 y/o un compuesto capaz de reducir la magnitud de la corriente de membrana a través del canal.
También se describe en el presente documento un método para identificar compuestos que inhiben la inflamación de las células neurales, que comprende: (a) poner en contacto un compuesto de prueba con una composición que comprende el canal NCca-ATP, y (b) determinar si el compuesto de prueba bloquea el canal NCca-ATP, en donde un compuesto de prueba que bloquea el canal NCca-ATP se identifica como un compuesto, para inhibir la inflamación de las células neurales.
También se describe en el presente documento un método para identificar compuestos que inhiben la inflamación cerebral, que comprende: (a) poner en contacto un compuesto de prueba con una composición que comprende el canal NCca-ATP, y (b) determinar si el compuesto de prueba bloquea el canal NCca-ATP, en el que un compuesto de prueba que bloquea el canal NCca-ATP se identifica como un compuesto para inhibir la inflamación cerebral.
También se describe en el presente documento un método para identificar compuestos que inhiben la inflamación cerebral, que comprende: (a) poner en contacto un compuesto de prueba con una composición que comprende el canal NCca-ATP, y (b) determinar si el compuesto de prueba inhibe la inflamación de las células neurales, en donde un compuesto de prueba que inhibe la inflamación de las células neurales se identifica como un compuesto para inhibir la inflamación del cerebro.
También se describe en el presente documento un método para identificar compuestos que inhiben la inflamación de las células neurales en un animal que comprende: (a) poner en contacto un compuesto de prueba con una composición que comprende el canal NCcb-atp y determinar si el compuesto de prueba bloquea el canal, y (b) administrar el compuesto de prueba a un animal que tiene una lesión cerebral o isquemia cerebral, y determinar si la prueba del compuesto inhibe la inflamación del cerebro del animal tratado, en donde los compuestos de prueba que inhiben la inflamación del cerebro se identifican como compuestos que inhiben la inflamación de las células neurales en un animal.
También se describe en el presente documento un método para identificar compuestos que inhiben la inflamación cerebral, que comprende: (a) poner en contacto un compuesto de prueba con una composición que comprende el canal NCcb-atp, y determinar si el compuesto de prueba bloquea el canal, y (b) administrar la prueba compuesto para el animal sujeto que tiene una lesión cerebral o isquemia cerebral, y determinar si el compuesto de prueba inhibe la inflamación del cerebro del animal tratado, en donde los compuestos de prueba que bloquean el canal NCcb-atp se identifican como compuestos que inhiben la inflamación del cerebro.
En cada caso, la composición comprende preferiblemente una preparación de células neurales que expresan el canal NCcb-atp o una preparación de membrana que expresa el canal NCcb-atp, que preferentemente proviene de astrocitos reactivos naturales aislados (NRA). Los métodos anteriores se pueden proporcionar usando un compuesto que es un antagonista de un receptor de sulfonilurea tipo 1, tal como un compuesto de sulfonilurea, un derivado de benzamida o un derivado de imidazolina.
La etapa determinante de estos métodos puede incluir, pero no se limita a, detectar o identificar la hinchazón de los astrocitos reactivos naturales, tal como por observación microscópica de la apariencia celular (normal, ampollas, hinchazón); medición de corrientes de canal; medición del potencial de membrana; detectar la expresión de anexina V; detectar la expresión de yoduro de propidio; ensayos de unión in vitro; y combinaciones de los mismos.
Es un objeto de la presente invención proporcionar una formulación que contenga una cantidad eficaz de un compuesto que bloquee el canal NCcb-atp, y un portador farmacéuticamente aceptable para su uso en un método de prevención de inflamación de células neurales en el cerebro de un sujeto.
Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar una formulación que comprende una cantidad eficaz de un compuesto que bloquea el canal NCcb-atp y un vehículo farmacéuticamente aceptable para su uso en un método de mejora de los efectos negativos de la lesión en el cerebro o la isquemia cerebral que derivan de la inflamación de las células neurales en un sujeto. Semejante administración puede ser mediante liberación directamente en el cerebro, administración intravenosa, subcutánea, intramuscular, intracutánea, intragástrica y oral. Los compuestos para su uso en el presente documento son antagonistas de un receptor de sulfonilurea de tipo 1, tal como las sulfonilureas como glibenclamida y tolbutamida, así como repaglinida, nateglinida, meglitinida, midaglizol, LY397364, LY389382, gliclazida, glimepirida, MgADP, y combinaciones de los mismos. En una realización, el compuesto se selecciona de repaglinida, nateglinida, meglitinida, LY397364, LY389382, gliclazida, glimepirida, MgADP, glibenclamida, tolbutamida y combinaciones de los mismos.
Es otro objeto más de la presente invención proporcionar una formulación para prevenir o inhibir la inflamación celular en el cerebro de un sujeto, utilizando una formulación que incluye semejante compuesto que bloquea el canal NCca-ATP y un portador farmacéuticamente aceptable, en donde la cantidad de dicho compuesto es al menos 10 veces mayor que la cantidad de dicho compuesto en las formulaciones para tratar la diabetes.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar adicionalmente la presente invención, y no para limitar la invención. Los ejemplos proporcionados en la presente memoria tienen fines ilustrativos solamente. A continuación se describen experimentos y procedimientos ilustrativos que proporcionan un soporte de habilitación adicional para la presente invención. En particular, se describen estudios in vitro que utilizan astrocitos reactivos recién aislados y estudios in vivo que utilizan modelos animales apropiados.
Métodos generales
Preparación de células
Los astrocitos reactivos se producen in vivo y se cosechan de cerebro adulto de la siguiente manera: se implantan esponjas de gelatina (Gelfoam®, Upjohn Co., Kalamazoo MI) en una herida de arma blanca en el lóbulo parietal de ratas Wistar de 8 semanas de edad como se describe en la presente memoria. Los trozos de esponja se cosechan a los 8 días y se lavan tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) para eliminar el tejido adherente. Dependiendo del número de NRA requeridos para el estudio concreto, se pueden recoger los trozos de esponja antes o después tras la implantación en una herida de arma blanca, llevándose a cabo la cosecha preferida de aproximadamente 2 días a aproximadamente 30 días después de la implantación, y siendo el intervalo más preferido de aproximadamente 2 días a aproximadamente 3 días después de la implantación.
Los NRA se aíslan inmediatamente de los trozos de esponja de la siguiente manera: los trozos lavados se colocan en un tubo Eppendorf que contiene fluido cerebroespinal artificial (aCSF) compuesto por (mM): NaCl 124 mM, MgCb 5,0 mM, 1,3 mM, CaCb 2,0 mM, NaHCO326 mM, y D-glucosa 10 mM; a pH 7,4, “ 290 mOsm, en donde el aCSF contiene papaína 20 U/ml, inhibidor de tripsina 10 mg/ml y ADNasa al 0,01% (Worthington, Lakewood, NJ), refiriéndose el conjunto como "sistema de digestión". Este sistema de digestión es transferido a una incubadora (humidificada al 90%/aire 10%/CO2, 37°C) durante 20 minutos, y se tritura suavemente cada 5 minutos. La suspensión celular se centrifuga a 3.000 rpm durante 1 minuto. Las células sedimentadas se resuspenden en aCSF y se almacenan a 4° C hasta su estudio.
Para algunos estudios, antes de la resuspensión en aCSF, las células sedimentadas se pueden purificar adicionalmente eliminando los glóbulos rojos de la sangre (RBC) utilizando una centrifugación en gradiente de densidad en Histopaque-1077 (Sigma Diagnostics, St. Louis, MO). Este proceso de purificación adicional puede producir una población de células en las que <<1% son RBC, como se determina mediante microscopía de contraste de fases.
Microscopía electrónica de barrido (SEM)
Para estudiar el burbujeo y la inflamación celular, se exponen las células recién aisladas a la temperatura ambiente a NaN3 a continuación, después de diferentes intervalos de tiempo, las células se fijan utilizando formaldehído al 4% helado glutaraldehído al 1% durante 24 horas, después se deshidratan utilizando concentraciones seriadas (35, 50, 75, 95, 100%) de etanol. Los especímenes se secan en el punto crítico (Tousimis), se recubren de oro (Technics), y se visualizan utilizando un microscopio electrónico de barrido AMR 1000.
Electrofisiología
Los experimentos se llevan a cabo a la temperatura ambiente, 22-25°C, utilizando NRA en el plazo de 24 horas desde el aislamiento celular. Se coloca una alícuota de estos NRA recién aislados en la cámara de registro cargado con solución de baño extracelular que contiene (mM): NaCl 130, KCl 10, CaCl2 1, MgCb 1, HEPES 32,5, glucosa 12,5, pH 7,4. Después de que las células viables se adhieran a la superficie, el enjuagado con solución en exceso lava cualquier desecho celular residual no eliminado previamente mediante centrifugación. Las corrientes de la membrana se amplifican (Axopatch 200A, Axon Instruments, Foster City, CA) y se toman muestras en línea a 5 kHz utilizando un microordenador equipado con un tablero digitalizado (Digidata 1200A, Axon Instruments) y haciendo funcionar el programa Clampex (versión 8.0, Axon Instruments). Las corrientes de membrana se registran en células intactas utilizando las configuraciones de células completas tanto ancladas a membrana como perforadas con nistatina, de acuerdo con los métodos descritos por Horn y Marty, 1988. Las corrientes de membrana se registran en parches de membrana aislados libres de células, utilizando las configuraciones tanto interior-fuera como exteriorfuera, tal como describen Hamill et al., 1981. Las pipetas para el pinzamiento zonal, extraídas de vidrio de borosilicato (Kimax, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), tienen resistencias de 6-8 MO para los registros de un solo canal y de 2-4 MO para experimentos que utilizan la técnica de las células completas perforadas con nistatina. El electrodo del baño es un sedimento de Ag/AgCl (Clark Electromedical, Reading, Inglaterra) que se coloca directamente en el baño excepto cuando [Cl-] del baño es alterada, en cuyo caso se utiliza un puente de agar elaborado con KCl 3 M para conectar con el baño.
Los términos "intracelular" y "citoplásmico" son indistintos, como lo son los términos "extracelular" y "externo". Los términos "voltaje" y "potencial" son indistintos cuando hacen referencia al voltaje de membrana o al potencial de membrana. "Fijar" una membrana celular hace referencia a mantener el voltaje constante a través de la membrana celular y medir los cambios en la corriente de membrana a medida que la resistencia de la membrana cambia debido a la apertura y cierre del canal iónico ("fijación del voltaje") o mantener constante la corriente a través de la membrana celular y medir los cambios en el voltaje de membrana a medida que la resistencia de la membrana cambia debido a la apertura y cierre del canal iónico ("fijación de la corriente"). Cuando se impone un voltaje de membrana sobre la célula con una "rampa" o "pulso", se entiende que la membrana celular ha sido sometida a fijación del voltaje y que se está midiendo la corriente de membrana. Cuando se mide el "potencial en reposo" de la membrana, se entiende que la membrana celular ha sido sometida a fijación de la corriente y se está midiendo el voltaje de membrana.
La configuración experimental de "células completas" hace referencia a una situación en la que una pipeta de registro atraviesa la membrana celular de manera que la solución de la pipeta es continua con el citoplasma o la membrana bajo la pipeta es perforada utilizando nistatina, la solución externa está en contacto con la membrana extracelular, y los registros de corriente o voltaje representan las mediciones de la membrana celular completa. La configuración experimental de "parche anclado a la célula" hace referencia a una situación en la que la pipeta entra en contacto con la célula de manera que el parche todavía forma parte de la membrana celular intacta y se registran los canales del parche. La configuración experimental de "parche exterior-fuera" hace referencia a una situación en la que un parche escindido de la membrana celular es sellado a la punta de la pipeta de registro de manera que la solución de la pipeta está en contacto con el lado extracelular de la membrana, la solución externa está en contacto con el lado citoplásmico de la membrana, y los registros de corriente o voltaje representan mediciones del parche de membrana escindido. La configuración experimental de "parche interior-fuera" hace referencia a una situación en la que un parche escindido de la membrana celular es sellado a la punta de una pipeta de registro de manera que la solución de la pipeta está en contacto con el lado citoplásmico de la membrana, la solución externa está en contacto con el lado extracelular de la membrana, y los registros de corriente o voltaje representan mediciones del parche de membrana escindido.
El término "parches" incluye, pero no está limitado a: parches interior-fuera, parches exterior-fuera, un parche escindido de una membrana celular, o un parche anclado a una célula. El término "preparación de membrana" incluye parches así como membranas celulares aislados de células o tejidos de mamífero. Las membranas celulares de mamífero aisladas se producen mediante métodos bien conocidos en la técnica. Un ejemplo de semejante preparación de membrana es una fracción microsómica purificada a partir de células desorganizadas o una muestra de tejido por medio de centrifugación en gradiente de sacarosa discontinua.
Se descartan los parches con una resistencia de sellado de <3 GQ y una resistencia al acceso de >50 MQ. Las corrientes de membrana macroscópicas se miden durante pulsos por etapas (600 ms) o durante pulsos en rampas (­ 140 a 50 mV a 0,32 mV/ms) desde un potencial mantenido de -67 mV.
Soluciones de registro
Para los registros macroscópicos de células completas, se utiliza una técnica de parche perforado con nistatina, con una solución de baño que contiene (mM): NaCl 130, KCl 10, CaCb 1, MgCb 1, He PES 32,5, glucosa 12,5, pH 7,4. La solución de la pipeta contiene (mM): KCl 55, K2SO4 75, MgCb 8, y HEPES 10, pH 7,2. La nistatina, 50 mg (Calbiochem) se disuelve en dimetilsulfóxido (DMSO), 1 ml. Las soluciones de la formulación se elaboran antes del experimento añadiendo 16,5 pl de solución de partida de nistatina a 5 ml de la solución de la pipeta base para dar una concentración final de nistatina de 165 pg/ml y DMSO 3,3 pl/ml. Esta composición de la solución de la pipeta incluye K2SO4 en lugar de la porción de KCl que incluiría de otro modo. El anión SO42', a diferencia de Cl-, no penetra a través del poro de nistatina. La reducción de la pipeta [Cl-] reduce la fuerza impulsora para Cl- al interior de la célula, minimizando de ese modo la inflamación osmótica de la célula que se podría producir de otro modo durante el registro electrofisiológico (Horn y Marty, 1988).
Para el registro de parches anclados a células, se utiliza una solución de baño que contiene (mM): NaCl 130, KCl 10, CaCb 1, MgCb 1, HEPES 32,5, glucosa 12,5, pH 7,4. La pipeta contiene (mM): KCl 145, MgCb 1, CaCb 0,2, EGTA 5, HEPES 10, pH 7,28. La osmolaridad medida de la solución extracelular es = 300 mOsm (Precision Systems, Natick, MA).
Para la mayor parte de los registros de parche interior-fuera, se utiliza una solución de baño que contiene (mM): CsCl 145, CaCb 4,5, MgCb 1, EGTA 5, HEPES 32,5, glucosa 12,5, pH 7,4. La pipeta contiene (mM): CsCl 145, MgCb 1, CaCb 0,2, EGTA 5, HEPES 10, pH 7,28. Para otros registros de parches interior-fuera, se remplaza el Cs+ de las soluciones anteriores por K+ equimolar. Para los experimentos de sustitución de cationes inorgánicos, el Cs+ de la pipeta se remplaza por concentraciones equimolares de iones de ensayo individuales, excepto cuando se utiliza Ca2+ o Mg2+, en cuyos casos se utiliza una concentración 75 mM para facilitar la formación del sellado (Cook et al., 1990).
Para el registro de parche exterior-fuera, la solución de la pipeta contiene (mM): CsCl 145, MgCb 1, CaCb 0,2, EGTA 5, HEPES 10, pH 7,28. La solución de baño convencional contiene (mM): CsCl 145, CaCb 4,5, MgCb 1, EGTA 5, HEPES 32,5, glucosa 12,5, pH 7,4. Para los experimentos de sustitución de cationes orgánicos, se remplaza el Cs+ del baño por concentraciones equimolares de catión de ensayo.
Para los experimentos que requieren una baja concentración de Ca2+ libre en la solución de baño, se emplea solución tamponada Ca2+-EGTA, y se calcula [Ca2+] libre utilizando el programa WEBMAXC v2.10 (http://www.stanford.edu/~cpatton/maxc.html). Para [Ca2+]=1 pM, se utiliza EGTA 5 mM y sal de Ca2+ 4,5 mM. También se utiliza [Ca2+]=1 pM en soluciones para someter a ensayo las actividades del ATP intracelular y Mg2+.
Las amplitudes de un solo canal utilizadas para calcular la conductancia en pendiente se obtienen ajustando una función Gaussiana a un histograma de todos los datos de amplitud de los registros obtenidos a diferentes potenciales. Para calcular la probabilidad de canal abierto (n^Po) a diversos potenciales y con diferentes agentes de ensayo, se ajusta el histograma de todos los puntos a una función Gaussiana y se divide el área bajo la curva ajustada para el canal abierto por el área bajo la curva ajustada para el canal cerrado más abierto. Los valores de n^Po a diferentes concentraciones de agentes de ensayo se ajustan a una ecuación logística convencional utilizando un método de mínimos cuadrados.
Para estimar las permeabilidades iónicas de los diversos cationes con respecto a la de K+, se obtiene cada permeabilidad (Px/PK) a partir de su potencial de reversión (Erev) ajustando la ecuación de Goldman-Hodgkin-Katz (GHK) bien conocida en la técnica. Véanse Goldman 1943; Hodgkin y Katz, 1949. Los datos de corriente-voltaje se ajustan a la ecuación GHK, suponiendo que tanto K+ como el ión de ensayo son permeantes.
Para estimar el tamaño de poro del canal NCcb-atp de la presente invención, se evalúan las permeabilidades relativas de los cationes orgánicos. Se calcula el radio de Stokes-Einstein (rse) a partir de las conductividades limitantes (•) de los iones con la fórmula: rsE^ A= constante. La constante se determina a partir del comportamiento de TEA a 25° C, para el cual A=44,9 cm2Q-1, rsE=0,204 nm. El radio de Stoke-Einstein se convierte a continuación en el radio molecular utilizando factores de corrección leídos en la Figura 6.1 en Robinson y Stokes, 1970. Se proporciona la conductancia limitante equivalente para la etanolamina (ídem) y las de los otros iones se calculan a partir de su peso molecular por medio de la fórmula, PM 0,5^A=constante. La constante se determina por el valor para la etanolamina a 25°C: PM=62,1 y A=4,42 cm2Q-1 equiv-1. Las permeabilidades relativas (Px/PCs) se trazan a continuación frente a los radios iónicos calculados. El efecto del tamaño del soluto sobre la tasa de penetración (permeabilidad) a través de los poros se expresa por medio de la ecuación de Renkin (Renkin, 1955):
a/ao = [1-(r/R)]2 ■ [1-2,104(r/R) 2,09 (r/R)3 - 0,95 (r/R)5] (1)
en donde a, ao, r, y R son las áreas eficaces del poro, el área transversal total del poro, el radio del soluto, y el radio del poro, respectivamente.
Los potenciales en la intersección se determinan con un electrómetro midiendo el potencial de difusión establecido a través de una membrana de diálisis y se restan cuando es apropiado. Las corrientes de mantenimiento no se restan de ninguno de los registros. Se obtienen corrientes diferencia simplemente restando los registros de corriente antes y después de la perfusión de NaN3, sin emplear ningún otro proceso.
Resultados
Papel del canal NCca-ATP en la inflamación de las células neurales
Caracterización del canal
Ejemplo 1 Cambios morfológicos con agotamiento de ATP utilizando N aN
Se ha demostrado que las células neurales cultivadas se inflaman tras el agotamiento del ATP. Véanse, Jurkowitz-Alexander et al., 1992; Jurkowitz-Alexander et al., 1993. Los NRA recién aislados con el ATP agotado también dan como resultado inflamación celular. La isquemia o la lesión traumática del cerebro también ocasionan agotamiento de ATP en las células neurales del cerebro.
Las superficies de los NRA recién aislados son muy complejas, mostrando pequeñas evaginaciones de membrana y procesos finos que decoran toda la superficie celular, como se muestra en la micrografía electrónica de barrido en la Figura 14A. La exposición de los NRA a NaN3 (1 mM) ocasiona cambios en la apariencia de la superficie, caracterizados temprano por la pérdida de la estructura compleja y el desarrollo de burbujas en la superficie (Figura 14B), seguido más tarde de una apariencia extremadamente inflamada con una pérdida completa de la estructura fina y la formación de múltiples burbujas grandes (Figura 14C). Por lo tanto, los NRA experimentan burbujeo e inflamación después del agotamiento del ATP inducido por NaN3.
La microscopía de contraste de fases también es útil para evaluar este proceso, aunque la estructura fina no se puede resolver. El burbujeo es visiblemente evidente 10-15 minutos después de la exposición a NaN3. Los cambios morfológicos de esta clase son atribuibles a la pérdida de la integridad del citoesqueleto, combinada con la acción de una fuerza osmótica que ocasiona la inflamación de la célula.
Para evaluar la contribución del gradiente osmótico a la inflamación de la célula, se repite el experimento en presencia de manitol, un agente oncótico no permeante. El manitol (50 mM), a una concentración suficiente para incrementar la osmolaridad de la solución extracelular de 300 a 350 mOsm, retrasa la formación de la burbuja >30 minutos después de la exposición a NaN3. El ATP celular también se puede agotar utilizando la exposición a NaCN (2,5 mM) más 2-desoxiglucosa (10 mM). Véase, Johnson et al., 1994. Se obtienen cambios morfológicos similares, incluyendo el burbujeo de la membrana celular y el retraso del burbujeo por manitol después de la exposición a NaCN y 2-desoxiglucosa. Esto demuestra que el efecto de NaN3 se debe de hecho al agotamiento de ATP y no a ningún efecto no específico del NaN3.
Ejemplo 2 Propiedades electrofisiológicas generales de los NRA
Las corrientes macroscópicas de las preparaciones de células completas de NRA se caracterizan por pequeñas corrientes hacia adentro a potenciales negativos, grandes corrientes hacia afuera a potenciales positivos, y una región "meseta" plana a potenciales intermedios. Los NRA muestran corrientes macroscópicas que coherentes con las observaciones en células cultivadas primarias del mismo origen. Véanse, Perillan et al., 1999; Perillan et al., 2000. Las corrientes hacia adentro mostradas por los NRA negativas para el potencial en equilibrio de K+ (Ek) son normalmente <100 pA, mucho más pequeñas que los valores referidos en astrocitos neonatales cultivados (Ransom y Sontheimer, 1995), pero coherentes con los descubrimientos en astrocitos recién aislados de cerebro lesionado (Bordey y Sontheimer, 1998; Schroder et al., 1999). Las grandes corrientes hacia afuera en los NRA son parcialmente bloqueadas por caribdotoxina (100 nM), iberiotoxina (100 nM) y cloruro de tetraetilamonio (5 mM), coherentes con la presencia de un gran canal de K+ activado por conductancia de Ca2+. Véase, Perillán et al., 1999. La corriente hacia afuera que permanece en presencia de caribdotoxina se puede bloquear adicionalmente por medio de 4-aminopiridina (5 mM), y muestra propiedades cinéticas típicas de un canal de K+ rectificador retardado. Coincidiendo con un informe previo (Perillan et al., 1999), se observan corriente dependientes del voltaje hacia adentro atribuibles a canales de Na+ en menos del 1% de los NRA.
NaN3 logra despolarizar la corriente hacia adentro debida al canal 35 pS
Los registros de la fijación de corriente se utilizan para investigar el efecto del agotamiento de ATP por NaN3 en NRA. Para estos experimentos, se utiliza un método de parche perforado con nistatina para garantizar que la desorganización metabólica procede de la aplicación del fármaco y no de la diálisis celular. La aplicación extracelular de NaN3 (1 mM; temperatura ambiente) da como resultado una despolarización grande y rápida de las células (Fig. 1A). NaN3 despolariza rápidamente las células a Em“ 0 mV (-4,3±0,9 mV). La despolarización normalmente comienza ~1 minuto después de la adición de NaN3, se completa en < 3 minutos, y es irreversible tras el lavado del fármaco. La ouababína es un bloqueador de Na+/K+-ATPasa conocido. Véase, Brismar y Collins, 1993. La magnitud de la despolarización observada con NaN3 excede bastante la pequeña despolarización reversible inducida por la ouabaína (1 mM). Esto indica que la gran despolarización observada después de la exposición a NaN3 no está causada por un fallo en la bomba de Na+/K+-ATPasa.
El curso de tiempo para la despolarización con NaN3 es apreciablemente más rápido que el curso de tiempo para el desarrollo del burbujeo de la membrana celular observado con el mismo tratamiento. Asimismo, ni el curso de tiempo ni la magnitud de la despolarización están afectados por la elevación de la osmolaridad extracelular con manitol 50 mM, un tratamiento que retrasa sustancialmente la formación de burbujas. De este modo, la despolarización es un evento primario, no secundario a la inflamación o el alargamiento celular.
Los registros de la fijación del voltaje muestran que la exposición a NaN3 da como resultado un incremento neto de la corriente hacia adentro en los n Ra . Los registros obtenidos utilizando pulsos tanto en rampa (Fig. 1B) como por etapas (Fig. 1C) muestran corrientes significativamente más grandes después del tratamiento con NaN3, como se muestra por medio de la comparación de los registros antes (a) y después (b) del tratamiento con NaN3. Un gráfico de las "corrientes diferencia", obtenido restando la curva de corriente-voltaje antes del fármaco a la de después del fármaco (línea c de la Fig. 1B), indica que la nueva corriente activada por NaN3 revierte cerca de 0 mV. Un potencial de reversión próximo a 0 mV es indicativo de que la corriente inducida por NaN3 es el resultado de una conductancia catiónica no específica.
Para caracterizar adicionalmente la corriente inducida por NaN3, se utilizan registros de parche anclados a células. La exposición a NaN3 provoca corrientes de un solo canal en parches que no muestran corrientes de un solo canal antes de la adición del fármaco (Fig. 1D). Después de la adición de NaN3, los registros a una baja resolución temporal revelan un gran incremento en la varianza de la corriente que, después de incrementar la resolución temporal, se revela que se debe a eventos de un solo canal (Fig. 1E en 3 y 4). Las amplitudes de los eventos de un solo canal registrados a diferentes potenciales de membrana se trazan en la Fig. 1F, que demuestra que NaN3 activa una conductancia de un solo canal de “ 35 pS que muestra una rectificación débil hacia adentro cuando se mide en la configuración anclada a células.
Se llevan a cabo experimentos adicionales en la configuración anclada a células con la solución de la pipeta con un suplemento de diferentes fármacos. Las corrientes de un solo canal inducidas por NaN3 no son bloqueadas por TEA 10 mM, 4-AP 5 mM, iberiotoxina 100 nM, caribdotoxina 100 nM, o tetrodotoxina 1 pM (4-6 parches para cada compuesto). Estos experimentos que indican que no está implicado un canal de K+ o Na+ típico. Asimismo, debido a que se incluye en la solución de la pipeta Ca2+ 0,2 mM, es improbable que estas aperturas de un solo canal se deban al influjo de cationes monovalentes a través de un canal de Ca2+ de tipo L.
Se obtienen una despolarización similar y una activación del canal 35 pS cuando se agota el ATP celular utilizando la exposición a NaCN (2,5 mM) más 2-desoxiglucosa (10 mM). Esto demuestra que el efecto de NaN3 está causado por el agotamiento de ATP y no por cualquier otro efecto no específico de NaN3.
Aparte del agotamiento de ATP, la escisión del parche es también un método altamente fiable para la activación del canal. De las más de 120 células estudiadas en la configuración de anclaje a las células, se detecta actividad espontánea del canal atribuible a una conductancia “ 35 pS solamente en 2 células. De este modo, el canal NCCa-ATP de la presente invención es típicamente silencioso en células metabólicamente sanas. En contraste, una canal “ 35-pS se encuentra presente en >90% de los parches interior-fuera formados a partir de los NRA no expuestos a NaN3 u otras toxinas metabólicas, demostrando de este modo que un elemento intracelular perdido en la escisión del parche normalmente evita la activación del canal.
Otro mecanismo potencial de activación del canal distinto de la escisión del parche es la disminución de volumen regulador (RVD). La inflamación celular es ampliamente reconocida como estímulo que inicia la RVD, un fenómeno acompañado por la activación de diferentes corrientes, incluyendo un canal catiónico no selectivo en algunos sistemas. Véase, Ono et al., 1994. Cuando se estudian parches de membrana en una configuración anclada a la célula, la estimulación hiposmótica (210 mosmoles/kg H2O) activa los eventos de un solo canal, pero ninguno muestra una conductancia “ 35 pS. Este descubrimiento indica que la despolarización y la activación del canal observadas con NaN3 no son parte de una respuesta de RVD secundaria a la inflamación celular inducida por NaN3, y se ajusta a la observación previamente indicada de que la despolarización inducida por NaN3 precedía a la inflamación celular. Este hecho está apoyado por la observación de que el canal de NCcb-atp es raramente observado en parches anclados a células, pero se vuelve evidente en >90% de los parches después de la conversión en una configuración interior-fuera. Asimismo, el canal de NCca-ATP se pierde poco después de cultivar los astrocitos reactivos.
Ejemplo 3 Permeabilidades relativas y tamaño del poro
El canal se caracteriza adicionalmente utilizando parches de membrana en la configuración interior-fuera. Los registros obtenidos durante los pulsos de ensayo a diversos potenciales con igual [K+] a ambos lados de la membrana se muestran en la Fig. 2A. Se construyen histogramas de amplitud de los eventos observados a potenciales de -140 mV a 100 mV, y se trazan los valores (media ± ET) parar 4 parches y se muestran en la Fig. 2B. El ajuste de los datos a una ecuación lineal indica una conductancia en pendiente de 35 pS, con un potencial de reversión extrapolado (Erev) de 0,1 mV, próximo al potencial de reversión de K+ esperado (Ek) de 0 mV.
Además de conducir K+, el canal transporta una variedad de iones alcalinos (Fig. 3A), indicando que es un canal catiónico no selectivo. En los parches interior-fuera, la conductancia del canal se mide con diversos iones alcalinos en la solución de la pipeta, incluyendo Cs+, Na+, Rb+, K+, y Li+, siempre con K+ equimolar en la solución de baño. Los datos de corriente-voltaje se ajustan a la ecuación GHK. Se demuestra que el Na+ tiene una conductancia en pendiente casi igual (32,6 pS) en comparación con K+ (35,2 pS), pero la conductancia en pendiente se reduce con otros cationes (Fig. 3B). Las mediciones de Erev se utilizan para estimar las permeabilidades relativas para la serie de iones alcalinos. Los valores para las permeabilidades relativas derivadas de la ecuación GHK son Pcs+/Pk+ =1,06, PNa+/PK+ =1,04, PRb+/PK+=1,02, y Plí+/Pk+ =0,96, indicando que este canal es casi igual de permeable a todos los cationes monovalentes.
También se evalúa la permeabilidad del canal de NCca-ATP de la presente invención a los aniones, tales como Cl-. Después de medir las amplitudes de corriente de un solo canal a diferentes potenciales con KCl 145 mM, se cambia la solución de baño por gluconato de K+ equimolar. Cuando se utiliza un puente de agar, el cambio de solución da como resultado un cambio en Erev<0,5 mV, indicando que el canal de NCca-ATP de la presente invención es esencialmente impermeable a los aniones.
También se investiga la permeabilidad del presente canal a los cationes divalentes, Ca2+ y Mg2+ (Fig. 3C). Cuando el ión potasio de la solución de la pipeta se remplaza por Ca2+ o Mg2+ 75 mM, no se detectan corriente hacia adentro. El ajuste a la ecuación GHK proporciona mejores valores de ajuste para Erev<<-65 mV para Ca2+ y Mg2+ respectivamente, proporcionando permeabilidades relativas con respecto a K+ de <<0,001, indicando que este canal es esencialmente impermeable a cationes divalentes.
Debido a que el canal de NCca-ATP de la presente invención discrimina muy poco entre los cationes inorgánicos monovalentes (Figs. 3A y B),se llevan a cabo experimentos para determinar el tamaño de poro equivalente del canal midiendo la permeabilidad del canal, con respecto a Cs+, para una amplia gama de cationes orgánicos. Utilizando una configuración de parche exterior-fuera, se trazan las relaciones corriente-voltaje de un solo canal para obtener Erev para numerosos cationes orgánicos. Las razones de permeabilidad se obtienen a continuación a partir de los ajustes a la ecuación GHK. Para cada uno de los cationes orgánicos (a) metanolamina, (b) guanidio, (c) etanolamina, (d) dietilamina, (e) piperazina, (f) Tris, y (g) N-metilglucamina, se traza el valor medio de la permeabilidad relativa medida frente a su radio molecular hidratado (Fig. 3D, círculos vacíos). Las razones de permeabilidad definen una serie de valores que decaen suavemente que están bien ajustados por la ecuación de Renkin. La ecuación de Renkin describe la penetración de una esfera rígida a través de un poro cilíndrico. Renkin, 1955. El ajuste a la ecuación de mínimos cuadrados, indica un radio del poro equivalente de 0,67 nm para el canal de NCca-ATP de la presente invención. Un radio de poro de 0,67 nm es similar a tamaños de poro de 6 A, encontrados para el canal de Ca2+ (McCleskey y Almers, 1985) y 7,4 A, encontrado para el canal de nAChR (Adams et al., 1980). Los potenciales en la intersección determinados de acuerdo con los métodos descritos en la presente memoria generalmente no excedieron de 5 mV.
Ejemplo 4 Inhibición por [ATP1¡
El canal de NCca-ATP es inhibido por ATP intracelular, basándose en el descubrimiento de que este canal se activa después del agotamiento de ATP intracelular por exposición a NaN3 (Véanse las Figs. 1B, 1C, 1D y 1E) o a NaCN más 2-desoxiglucosa. Este hecho está apoyado por la observación de que el canal de NCca-ATP de la presente invención es raramente observado en parches anclados a células procedentes de células sanas, pero se vuelve evidente en >90% de los parches después de la conversión en una configuración interior-fuera.
Los parches interior-fuera se utilizan para demostrar que el canal es sensible al bloqueo por ATP en el lado citoplásmico de la membrana. Los parches se estudian utilizando Cs+ como portador de carga, para asegurarse de que ningún canal de K+, tal como Kir2.3 o Katp, está contribuyendo a la actividad del parche. Sin ATP y con Ca2+ 1 |jM en el baño, el canal de NCca-ATP muestra aperturas vigorosas. El ATP 1 mM causa una disminución profunda en la actividad del canal, un efecto que es fácilmente revertido tras el lavado (Fig. 4A); no obstante, la disponibilidad del canal no resulta afectada por a Mp o ADP 1 mM. La probabilidad de apertura del canal (n^Po) se mide a diferente [ATP]i, y estos valores se normalizan con respecto al obtenido a [ATP]i=0 mM, y se ajustan a una ecuación logística convencional. Como se muestra en la Fig. 4B, el canal de NCcb-atp es bloqueado por [ATP]i de una manera dependiente de la dosis. La inhibición semi-máxima (CI50) se observa a [ATP]i =0,79 jM con un coeficiente de Hill de 1, y la actividad del canal se anula completamente a [ATP]i>30 jM . El ADP y el AMP, no tienen efecto sobre la actividad del canal de NCca-ATP en los parches interior-fuera.
Este análisis in vitro para determinar la concentración del compuesto de ensayo que logra una inhibición semimáxima de la actividad del canal (CI50) se puede utilizar para formular dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración en plasma circulante que incluya la CI50.
Ejemplo 5 Activación por [Ca2+1¡
También se ha encontrado que la concentración de Ca2+ al lado citoplásmico de la membrana regula la actividad del canal de NCca-ATP de la presente invención. La relación entre la actividad del canal de NCca-ATP y [Ca2+]i se examina utilizando parches interior-fuera estudiados a un potencial de membrana (Em) =-80 mV. El cambio en [Ca2+]i afecta claramente a la actividad del canal de NCca-ATP (Fig. 5A). Cuando [Ca2+]i libre es <30 nM, no hay actividad aparente del canal. Con [Ca2+]i >30 nM, la probabilidad de apertura (n^Po) se incrementa de acuerdo con la [Ca2+]i, hasta “ 1 jM de [Ca2+]i a la cual la actividad es próxima al máximo.
Se ha encontrado que el efecto de Ca2+ sobre la disponibilidad del canal depende del voltaje de la membrana. Los valores de n^Po de 4-9 parches obtenidos a tres potenciales diferentes, Em=-40 mV, -80 mV y -120 mV, se normalizan con respecto a los valores observados con [Ca2+]i 3 jM . Estos datos se ajustan a una ecuación logística convencional utilizando un coeficiente de Hill de 1,5 y valores semi-máximos de 0,12 jM , 0,31 jM y 1,5 jM a -40 mV, -80 mV y -120 mV, respectivamente (Fig. 5B). Estos datos indican que la actividad del canal es fuertemente dependiente de [Ca2+]i a concentraciones fisiológicamente relevantes, y que el efecto de Ca2+ depende del voltaje, coincidiendo con un sitio de unión a Ca2+ en el interior del campo eléctrico de la membrana.
Ejemplo 6 El Mg2+ interno ocasiona una rectificación
Debido a que ciertos canales son sensibles al Mg2+ intracelular (Chuang et al., 1997; Perillan et al., 2000), se llevan a cabo experimentos para determinar si la rectificación del canal observada en los registros de parches anclados a células (véase la Fig. 1F) podría estar debida al Mg2+ intracelular. Utilizando parches interior-fuera estudiados con K+ equimolar a ambos lados de la membrana, se varía [Mg2+] al lado citoplásmico. Se muestran los registros de un solo canal y las amplitudes de canal observadas con [Mg2+]i diferentes (Fig. 6). No hay una rectificación evidente con [Mg2+]i “ 30 jM , pero a [Mg2+]i “ 100 jM , está presente una fuerte rectificación creciente. A 100 jM , el Mg2+ parece producir un bloqueo intermitente.
Ejemplo 7 Identificación de la presencia de SUR en los NRA
Para determinar si los receptores SUR se encuentran presentes en los NRA, se evalúa la unión de la glibenclamida a estas células mediante microscopía de fluorescencia. Se lesionaron ratas Wistar de ocho semanas de edad mediante una herida con arma blanca en la materia blanca subcortical e implantación de una esponja de gelatina como se ha descrito previamente en la presente memoria. Ocho días más tarde, se incuban secciones de tejido de cerebros fijados con formaldehído de los animales lesionados durante 60 minutos a la temperatura ambiente con glibenclamida conjugada con FITC 20 nM. Una imagen de fluorescencia de la esponja de gelatina muestra células marcadas revistiendo las cavidades de la esponja. En cerebro adyacente a la lesión, esencialmente no es evidente la unión a glibenclamida. Estos datos indican que SUR, que normalmente no está presente en la materia blanca subcortical, son expresados en las células neurales después de la lesión traumática.
RT-PCR
El ARN total extraído de las células y utilizado para sintetizar ADNc, que se amplifica a partir de astrocitos reactivos, se analiza mediante RT-PCR sobre un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio. La Fig. 7A es una fotografía del gel que muestra la RT-PCR para SUR1 y SUR2. La Figura 7B es una fotografía de un gel que muestra la RT-PCR para Kir6.1 y Kir6.2. Las calles 3 y 4 de las Figs. 7A y 7B muestran la RT-PCR para células de insulinoma. Las calles 5 y 6 muestran la RT-PCR para astrocitos reactivos. La calle 1 de las Figs. 7A y 7B representa marcadores de tamaño en escala; La calle 2 de las Figs. 7A y 7B es un blanco de control. En la Fig. 7A, las calles 3 y 4 muestran los experimentos con SUR1 y SUR2, respectivamente, en células de insulinoma. Se sabe que las células de insulinoma expresan SUR1, pero no SUR2. Las calles 5 y 6 de la Fig. 7A muestran los experimentos con SUR1 y SUR2 en astrocitos reactivos, respectivamente. La Fig. 7A demuestra que el ARNm de SUR1 está presente en astrocitos reactivos, así como en las células de insulinoma de control. SUR2 está ausente en ambos tipos de células. En la Fig. 7B, las calles 3 y 4 muestran los experimentos con Kir6.1 y Kir6.2 en células de insulinoma, respectivamente. Kir6.1 está presente en células de insulinoma, pero Kir6.2 no. Kir6 es el canal de potasio asociado con SURI en células de insulinoma. Las calles 5 y 6 de la Fig. 7B demuestran que ni Kir6.1 ni Kir6.2 están presentes en astrocitos reactivos. Por lo tanto, los astrocitos reactivos expresan ARNm de SUR1, pero el ARNm de Kir6.1 y Kir6.2 está ausente de las células.
La presencia de SUR1 en astrocitos reactivos combinada con la regulación del canal de NCca-ATP en astrocitos por los antagonistas de SUR indican que SUR regula el canal de NCca-ATP de la presente invención.
Ejemplo 8 Productos digeridos con tripsina
Un rasgo característico de la función de Katp regulada por SUR es que digestión con tripsina de la cara citoplásmica del canal, pero no de su cara extracelular, ocasiona una pérdida de inhibición por sulfonilureas, sin alterar la sensibilidad al ATP y sin cambiar las propiedades biofísicas del canal. El efecto de la tripsina sobre la función del NCca-ATP se muestra en la Fig. 8. En las condiciones de control, la actividad del canal en la configuración de parche interior-fuera es fuertemente inhibida por glibenclamida 1|j M. La exposición a 100 jg/m l de tripsina en el lado citoplásmico de la membrana durante 3 minutos da lugar a un parche que todavía muestra una fuerte actividad del canal, pero la actividad del canal todavía está completamente no afectada por la glibenclamida. Después de semejante tratamiento con tripsina del lado citoplásmico, las propiedades biofísicas del canal, incluyendo la conductancia del canal abierto, los tiempos de canal abierto, la activación mediada por Ca2+ permanecen inalteradas, y el canal todavía mantiene su típica sensibilidad al ATP. En contraste, la exposición del lado extracelular de la membrana no tiene efecto sobre la inhibición por glibenclamida. Estos datos de la digestión con tripsina del canal de NCca-ATP de la presente invención proporcionan una evidencia adicional que apoya que SURI está implicado en la regulación del canal de NCca-ATP, debido a que los resultados se comparan con los descubrimientos anteriores de los canales de Katp regulados por SURI. La conexión de un SUR con un canal catiónico sensible a ATP no selectivo no ha sido demostrada previamente.
Análisis para compuestos o composiciones que bloquean el canal de NCca-ATP e inhiben la inflamación de las células neurales
Ejemplo 9 Efectos de los compuestos de sulfonilurea
Se sabe que los compuestos de sulfonilurea modulan el receptor de sulfonilurea. Un receptor de sulfonilurea está generalmente asociado con canales de Katp como componente regulador, y se encuentra en diversos tejidos, incluyendo NRA de rata. Notablemente, los canales de Katp Kir6.1 y Kir6.2 no están presentes en NRA de rata (Fig. 7B). Es posible activar el canal de NCca-ATP con el ligando de SUR diazóxido en parches exterior-fuera (Figs. 9A y 9B). NaN3 no provoca la actividad del canal en parches de membrana aislados, indicando que funciona a través del agotamiento de ATP en lugar de cualquier efecto directo sobre el canal.
Ejemplo 10 Análisis in vitro para determinar el bloqueo dependiente de la dosis del canal de NCca-ATP
Se sabe que los compuestos que bloquean SURI, tales como la glibenclamida y la tolbutamida, tienen un efecto inhibidor sobre los canales de Katp. En una realización, la presente invención llega a los objetivos de la invención proporcionando un método en el que se determina el efecto inhibidor directo de la glibenclamida y la tolbutamida sobre los canales de NCca-ATP (Figs. 10 y 11). Se utilizan parches interior-fuera para mostrar el efecto inhibidor de las sulfonilureas. Para garantiza que ningún canal de K+, concretamente Katp está contribuyendo a la corriente del parche, se utiliza Cs+ como portador de carga. La actividad del canal es profundamente reducida por la adición de glibenclamida 10 j M (Figs. 10a a b), y se demuestra que la actividad es debida a un canal catiónico 35 pS, lo que es consistente con el canal de NCca-ATP de la presente invención (Fig. 10C). También se ha demostrado que otra sulfonilurea, la tolbutamida, inhibe la actividad del canal de NCca-ATP (Figs. 11A y 11B). Como se muestra en la Fig. 11B, el canal de NCca-ATP es bloqueado por las sulfonilureas de una manera dependiente de la dosis. Con la tolbutamida, la inhibición semi-máxima (CE50) se observa a 16,1 j M con un coeficiente de Hill de 1,3, y la actividad del canal se pierde completamente a concentraciones >300 j M. Con la glibenclamida, la CE50 se observa a 48 nM con un coeficiente de Hill de 1,2. La sensibilidad del canal de NCca-ATP de la presente invención al bloqueo en los NRA con estos dos compuestos de sulfonilurea se corresponde estrechamente con lo referido en las células p pancreáticas y en los sistemas de expresión don SUR1, pero no con SUR2.
Este análisis in vitro para determinar la concentración del compuesto de ensayo que logra la inhibición semi-máxima de la actividad del canal se puede utilizar para formular la dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración en plasma circulante.
Ejemplo 11 Mecanismo de regulación del canal por las sulfonilureas
El canal de NCca-ATP de la presente invención muestra dos estados abiertos, con un tiempo de permanencia más corto y más largo, cada uno de menos de 10 ms. La Figura 12 muestra los datos de un parche que muestra una probabilidad de canal abierto (n^Po) de 0,63, con valores de tiempo de permanencia abierto T0-1 y T0-2 de 1,9 y 8,2 ms. Después de la aplicación sucesiva de tolbutamida 3 j M (Figs. 12B y 12E) y tolbutamida 30 j M (Figs. 12C y 12F), n^Po disminuía a 0,44 y 0,09, respectivamente, pero los valores de tiempo de permanencia abierto no resultan afectados apreciablemente por el fármaco. Los tiempos de permanencia del canal cerrado se incrementan en duración y frecuencia con la tolbutamida (Figs. 12H y 12I). De este modo, el canal de la presente invención muestra una forma de inhibición del canal en la que el compuesto bloqueador no tiene efecto sobre los tiempos de permanencia del canal abierto y un incremento progresivo en los cierres prolongados. Esta forma de inhibición del canal es similar a la producida por sulfonilureas que actúan sobre el canal de Katp en las células p pancreáticas. Véanse, Gillis et. al., 1989; Babeenko et. al., 1999).
Ejemplo 12
La aplicación de 100 pM del activador de SUR diazóxido activa el canal de 35pS de la presente invención, ocasionando una débil rectificación hacia el interior en los parches anclados a células (Figs. 13A, 13B y 13C). Para determinar el tipo de SUR que afecta a la activación del canal de NCcb-atp de la presente invención, se llevan a cabo experimentos utilizando compuestos de sulfonilurea que activan preferentemente SUR 2 sobre SUR1, esto cromakalina, y pinacidil. Tanto la cromakalina como el pinacidil no tuvieron efecto sobre el canal de NCca-ATP de la presente invención, lo que es coherente con otros datos descritos en la presente memoria que indican que SUR1 está asociado con el canal de NCca-ATP de la presente invención, y la activación del canal no está mediada por SUR2.
Ejemplo 13 Inflamación celular mediada por SUR
Después de la adición de NaN3 para agotar el ATP de las células, el burbujeo celular típicamente se vuelve evidente en 7-10 minutos. El diazóxido es un agonista de SUR1 o un activador de SUR1. Cuando se añade diazóxido solo a las células, se produce el burbujeo incluso sin agotamiento del ATP, por lo tanto el Diazóxido, abre el canal directamente sin agotamiento del ATP por medio de la activación con SUR1. Sin embargo, cuando las células se pretratan con glibenclamida, la adición de NaN3 no ocasiona burbujeo, ni siquiera después de 30 minutos. De este modo, la activación del canal de NCca-ATP por agotamiento del a Tp o por el abridor del canal, diazóxido, puede producir burbujeo e inflamación de los NRA, y que la inflamación pueda ser evitada mediante el bloqueo del canal con glibenclamida. El agotamiento del ATP por azida de Na puede dar como resultado la muerte de las células necróticas de los NRA. Este descubrimiento se ajusta a los datos descritos en la presente memoria de que la glibenclamida protege de la apertura del canal de NCca-ATP después del agotamiento del ATP, y de que la apertura de este canal es responsable del burbujeo celular.
El antagonista para su uso en la presente invención es un compuesto que interfiere en la función de NCca-ATP. Típicamente, el efecto de un antagonista se observa en forma de un bloqueo de la corriente en NCca-ATP en condiciones en las que el canal ha sido activado y se puede medir la corriente en ausencia del antagonista.
Además de los compuestos de sulfonilurea específicos de SUR1, los agentes que bloquean SUR1, también incluyen compuestos que no están relacionados estructuralmente con las sulfonilureas. Tales bloqueadores de SUR1 incluyen una clase de compuestos secretagogos de insulina que se unen a SUR, que fueron identificados y desarrollados para el tratamiento de la diabetes de tipo 2. Los derivados de benzamida: repaglinida, nateglinida, y meglitinida representan una de tales clases de secretagogos de insulina, que se unen a SUR. La nateglinida es un derivado de aminoácido. Asimismo, se han identificado derivados de imidazolina que interaccionan con la subunidad 1 del receptor de sulfonilurea (SUR) tal como midaglizol (KAD-1229), LY397364 y LY389382.
En una realización preferida de la presente invención, los compuestos que bloquean preferentemente SUR1, pero no SUR2, se utilizan. Tales compuestos incluyen tolbutamida y gliclazida. Los siguientes compuestos bloquean tanto SUR1 como SUR2: glibenclamida, glimepirida, repaglinida, and meglitinida. En otra realización más de la presente invención, la administración se combina con MgADP, que se ha demostrado que produce un incremento evidente de la eficacia de la sulfonilurea sobre los canales que contienen SUR1, pero no SUR2.
Ejemplo 14
Para determinar si la activación de NCca-ATP por agotamiento del ATP inicia la necrosis de los astrocitos reactivos que expresan este canal, se llevan a cabo estudios para determinar si la glibenclamida es capaz de proteger a los astrocitos reactivos de la muerte celular inhibiendo la actividad del canal de NCca-ATP por medio de su acción sobre SUR1. Se evalúan dos tipos de muerte celular, apoptosis y necrosis, después del agotamiento del ATP.
De este modo, la activación del canal de NCca-ATP es responsable de la muerte necrótica de los NRA después del agotamiento del ATP, y de que la glibenclamida pueda evitar esta forma de muerte celular.
En este ejemplo, la preparación de NRA recién aislados se purificó adicionalmente mediante eliminación de los RBC, como se describe en la presente memoria, para proporcionar una población celular que tenga <1% de RBC. Más del 95% de las células tuvieron potenciales en reposo próximos a Ek, sugiriendo que el método de disociación enzimática no había perjudicado apreciablemente a las células. Más del 95% de las células son positivas para el marcador de astrocitos, la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) como se determinó mediante inmunofluorescencia.
Cuando se examinan mediante microscopía de fases, los NRA tienen diferentes tamaños, que oscilan entre 11 y 45 |jm de diámetro, algunos de los cuales están en fase brillante y otros en fase oscura. Un subgrupo de las células en fase brillante tuvo procesos celulares cortos pero claros que son más cortos que el soma de la célula. En este ejemplo, solamente se estudian las células en fase brillante más grandes (“ 30 jm de diámetro), con procesos cortos (<1 longitud de la célula). Esta población de NRA expresa de forma fiable los canales de NCcb-atp.
Se llevan a cabo experimentos a la temperatura ambiente (22-25°C) en el plazo de 24 hr desde el aislamiento celular. Se coloca una alícuota de células en un portaobjetos para cámara (LAB-TEK, Naperville, IL) cargado con solución de extracelular que contiene (mM): NaCl 130, KCl 10, CaCb 1, MgCb 1, HEPES 32,5, glucosa 12,5, pH 7,4. Después de que las células viables se adhieran a la superficie, se lava cualquier desecho residual que no se haya eliminado previamente mediante centrifugación arrastrando con solución en exceso. Las células se someten a agotamiento de ATP por medio de azida de Na para activar (abrir) los canales de NCca-ATP, y a continuación se incuban con glibenclamida (1 1 jM).
Después de eso, se examinan las células mediante tinción con yoduro de propidio (PI) para evidenciar la permeabilización de la membrana celular, una indicación de muerte celular oncótica o necrótica temprana. Véase, Barros et al., 2001. Las células también se examinan mediante unión a anexina V etiquetada con fluoresceína para evidenciar la externalización del fosfoaminolípido fosfatidilserina procedente de la cara interna de la membrana plasmática hacia la superficie externa, una indicación temprana de apoptosis. Véanse, Clodi et al., 2000; Rucker-Martin et al., 1999. El procedimiento de tinción se lleva a cabo de acuerdo con las directrices del fabricante (Vybrant Apoptosis Assay Kit 2, Molecular Probes). Los portaobjetos se montan utilizando medio de montaje anti­ apagamiento ProLong (Molecular Probes). Las señales se visualizan utilizando un microscopio epifluorescente Nikon Diaphot (Leitz Wetzlar). Las imágenes se capturan y se almacenan utilizando una cámara digital SenSys (Roper Scientific Inc.) y el programa IPLab (versión 3.0; Scanalytics Inc.). Las células positivas para Anexina V o las células positivas para PI se cuentan en 20 campos individuales utilizando una lente de objetivo 20*. Los valores medios de las células positivas en los 20 campos para diferentes grupos de tratamiento se comparan utilizando comparaciones múltiples ANOVA por pares, considerándose p<0,05 una indicación de diferencia significativa.
Las fotografías de la microscopía de fluorescencia mostradas en la Fig. 15A demuestran que en las condiciones de partida (control), las células tanto positivas para anexina V como positivas para PI (fotos a y d, respectivamente) son raras en los productos aislados celulares. Después de una incubación de 10 min con azida de Na (1 mM), el número de células positivas para PI aumento sustancialmente (p<0,05) (Fig. 15A de la foto b y Fig. 15B). Esto indica que el agotamiento de ATP desencadena la muerte necrótica en estas células. En contraste, el tratamiento con azida de Na hizo que el número de células positivas a anexina V aumentara ligeramente; no siendo estadísticamente significativo el aumento (p>0,05) (Fig. 15A de la foto e y Fig. 15C). Esto indica que la muerte apoptótica no fue un criterio de valoración fundamental del agotamiento de ATP en estas células.
El pretratamiento de las células con glibenclamida (1 jM ) en el momento de la administración de azida de Na aumentó de manera espectacular el número de células positivas para PI (p<0,05; Fig. 15A de la foto c y Fig. 15B), indicando una protección significativa frente a la muerte necrótica después del agotamiento del ATP. El número de NRA que experimentaron muerte apoptótica también disminuyó con la glibenclamida, como se indica mediante el marcaje con anexina V (Fig. 15A de la foto f y Fig. 15C), pero los valores de este grupo no fueron significativamente diferentes.
Estos datos indican que el canal de NCca-ATP está implicado en el mecanismo de muerte celular necrótica de los astrocitos reactivos. Este Ejemplo demuestra que la muerte celular necrótica, en lugar de la apoptótica, es el criterio de valoración principal del agotamiento de ATP en estas células. Por lo tanto, el agotamiento de ATP por azida de Na inicia la muerte celular por eliminación del bloqueo de ATP del canal de NCca-ATP, iniciando de ese modo la inflamación de las células oncóticas. La implicación de este canal en la inflamación de las células oncóticas se confirma demostrando que la muerte necrótica también puede ser inducida por diazóxido, el abridor del canal que activa el canal de NCca-ATP en estas células, y podría ser bloqueada por glibenclamida, que evita la apertura del canal de NCca-ATP. La implicación del canal de NCca-ATP en la muerte celular de los astrocitos reactivos proporciona un mecanismo y una diana de muerte en estas células, así como la importancia de bloquear el canal de NCca-ATP para prevenir la muerte de los astrocitos reactivos, que se produce en la lesión traumática del cerebro.
Ejemplo 15
Análisis in vitro para determinar la capacidad de un compuesto de ensayo para proporcionar el bloqueo dependiente de la dosis del canal de NCca-ATP
Los compuestos que bloquean los canales de NCca-ATP pueden ser identificados por un método en el cual se determina el efecto inhibidor directo del compuesto de ensayo sobre los canales de NCca-ATP. Los parches interiorfuera se utilizan para mostrar el efecto inhibidor del compuesto. Para garantizar que el canal de K+, concretamente Katp contribuye a la corriente del parche, se utiliza Cs+ como portador de carga. Los compuestos que disminuyen profundamente la actividad del canal, y se demuestra que la actividad se debe a un canal catiónico de 35 pS, se identifican como compuestos que bloquean los canales de NCca-ATP y son capaces de inhibir la inflamación de las células neuronales y la inflamación del cerebro. Se utilizan concentraciones variables del compuesto para determinar si el canal de NCca-ATP es bloqueado por el compuesto de una manera dependiente de la dosis. Se determinan la concentración a la cual se observa una inhibición semi-máxima (CE50) y la concentración a la cual la actividad del canal se ha perdido completamente. Se puede comparar la sensibilidad del canal de NCca-ATP de la presente invención para bloquear los NRA con el compuesto de ensayo. Este análisis in vitro para determinar la concentración del compuesto de ensayo que logra una inhibición semi-máxima de la actividad del canal se puede utilizar para formular la dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración en plasma circulante.
Ejemplo 16
Análisis in vivo para determinar el bloqueo dependiente de la dosis del canal de NCCa-ATP
La concentración del compuesto de ensayo que logra una inhibición semi-máxima de la actividad del canal se utiliza para formular la dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración en plasma circulante. La dosis de compuesto de ensayo que logra un intervalo de concentración en plasma circulante calculado mediante los métodos conocidos en la técnica se administra a un animal que tiene una lesión en el cerebro o isquemia cerebral. Para determinar si el compuesto de ensayo evita, inhibe o disminuye la inflamación del cerebro, se mide la presión epidural y/o la presión intracraneal del animal, por ejemplo utilizando un microglobo, para controlar cuantitativamente la inflamación del cerebro. Asimismo, la inflamación se puede controlar mediante formación de imágenes por resonancia magnética (RM). Tres estudios diferentes inician la administración ante, en el momento de, o después de la lesión en el cerebro. Un compuesto que proporciona disminuciones de la inflamación celular, en comparación con los controles, se identifica como un compuesto capaz de inhibir la inflamación de las células neuronales y la inflamación del cerebro. Se utilizan concentraciones variables del compuesto para determinar si el compuesto proporciona eficacia de una manera dependiente de la dosis. Se determinan la dosis a la cual se observa la inhibición semi-máxima y la concentración a la cual la inflamación del cerebro se alivia más rápidamente. Se producen formulaciones que comprenden la dosis eficaz óptima del compuesto de ensayo para prevenir, inhibir, o disminuir la inflamación del cerebro, junto con un portador farmacéuticamente aceptable.
Compendio de las características del canal de NCca-ATP
Las características de las células y las composiciones que contienen el canal de NCca-ATP de la presente invención se resumen en la Tabla 1.
TABLA 1
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Métodos
La presente invención se refiere a un canal iónico previamente desconocido que se encuentra en células neurales de mamíferos que desempeña un papel en la inflamación celular. La presente invención se refiere además a un método de detección de antagonistas del canal y un nuevo uso de antagonistas del canal, que incluye compuestos de sulfonilurea tales como glibenclamida y tolbutamida, como un tratamiento para la inflamación cerebral en mamíferos.
Los métodos para identificar compuestos que interactúan con, (por ejemplo, se unen, abren, bloquean) el canal NCoa-ATP pueden emplear (i) ensayos basados en células y/o (ii) sistemas de ensayo no basados en células. Dichos compuestos pueden actuar como antagonistas o agonistas de la actividad del canal NCcb-atp.
Los ensayos basados en células usan células neurales que expresan el canal NCcb-atp, preferentemente un canal NCca-ATP funcional; Las células preferidas son las ANR. Los sistemas de ensayo no basados en células incluyen preparaciones de membrana que expresan el canal NCca-ATP, preferentemente un canal NCca-ATP funcional. Los ensayos basados en células incluyen, entre otros, ensayos de unión a compuestos, observación microscópica del estado celular (normal, ampollas, hinchazón) y medición de corrientes de canal tanto antes como después de la exposición al compuesto. Las composiciones que comprenden preparaciones de membrana que expresan el canal NCca-ATP pueden usarse para identificar compuestos que interactúan con, se unen, bloquean o abren el canal NCcaatp o SUR1. El término "expresar el canal NCca-ATP" o "expresa el canal NCca-ATP" significa tener un canal NCca-ATP funcional. El término "canal NCca-ATP funcional" como se usa en el presente documento significa un canal NCca-ATP capaz de ser detectado. Un método preferido para detectar el canal NCca-ATP es determinar, in vitro o in vivo, si el canal está abierto, cerrado y/o bloqueado.
Por ejemplo, en un experimento típico que usa una preparación de membrana, las ANR que expresan el canal NCcaatp se usan para producir la preparación de membrana. Los métodos para producir membranas a partir de células y tejidos enteros son bien conocidos en la técnica. Uno de estos métodos produce membranas celulares purificadas en forma de una fracción microsómica purificada aislada de células alteradas o una muestra de tejido mediante centrifugación discontinua en gradiente de sacarosa. También se incluyen membranas compuestas de parches unidos a células, parches de adentro hacia afuera o parches de afuera hacia afuera. Un ejemplo de una muestra de tejido que expresa canales NCca-ATP es el tejido cerebral adyacente a la lesión cerebral.
Las preparaciones de membrana se usan en varios ensayos, que incluyen, pero no se limitan a medir corrientes de canal, tanto antes como después de la exposición al compuesto; y ensayos de unión in vitro. Las condiciones experimentales para tales ensayos para determinar y cuantificar el estado del canal NCca-ATP se describen a lo largo de la presente memoria descriptiva, incluidas las condiciones de ensayo de unión, composiciones de baño, soluciones de pipetas, concentraciones de ATP y Ca2+ requeridas, voltaje de membrana, potenciales de membrana, intervalos de cantidad del compuesto, controles, etc.
Los ensayos de unión y los ensayos de unión competitiva emplean un ligando o antagonista marcado del canal NCca-ATP. En uno de estos experimentos, la glibenclamida marcada, como la glibenclamida conjugada con FITC o la glibenclamida marcada radiactivamente, se une a las membranas y se analiza su actividad específica; la unión específica se determina mediante comparación con ensayos de unión realizados en presencia de un antagonista no marcado en exceso.
En un método para identificar bloqueadores de canales NCca-ATP, las membranas se incuban con un compuesto marcado que se muestra que bloquea este canal, ya sea en presencia o ausencia del compuesto de prueba. Los compuestos que bloquean el canal NCca-ATP y compiten con el compuesto marcado para unirse a las membranas tendrán una señal reducida, en comparación con las muestras de control del vehículo. En otro aspecto, las selecciones pueden diseñarse para identificar compuestos que compiten con la interacción entre el canal NCca-ATP y un antagonista del canal NCca-ATP conocido o antagonista SUR1, como la glibenclamida. En tales selecciones, se marca el antagonista del canal NCca-ATP conocido o el antagonista SUR1 y luego se analiza la capacidad de los compuestos de prueba para competir o antagonizar la unión del antagonista marcado.
Los ensayos descritos en este documento pueden usarse para identificar compuestos que modulan o afectan la actividad del canal NCca-ATP. Por ejemplo, los compuestos que afectan la actividad del canal NCca-ATP incluyen, entre otros, compuestos que se unen al canal NCca-ATP o SUR1, inhiben la unión de bloqueadores o ligandos identificados (como la glibenclamida) y abren/activan el canal (agonistas) o bloquean/inhiben el canal (antagonistas).
Los ensayos descritos también pueden identificar compuestos que modulan la inflamación de las células neurales (por ejemplo, compuestos que afectan otros eventos involucrados en la inflamación de las células neurales que se activan mediante la unión al ligando o el bloqueo del canal NCca-ATP).
Compuestos seleccionados
Los compuestos para la selección incluyen, pero no se limitan a compuestos orgánicos, péptidos, anticuerpos y fragmentos de los mismos, peptidomiméticos, que se unen al canal NCca-ATP y abren el canal (es decir, agonistas) o bloquean el canal (es decir, antagonistas) . Para su uso en el tratamiento de la inflamación de las células neurales o la inflamación del cerebro, se prefieren los compuestos que bloquean el canal. Los agonistas que abren o mantienen el canal en estado abierto incluyen péptidos, anticuerpos o fragmentos de los mismos, y otros compuestos orgánicos que incluyen la subunidad SUR1 del canal NCca-ATP (o una porción del mismo) y se unen y "neutralizan" el ligando circulante para SUR1.
Con referencia a la selección de compuestos que afectan el canal NCca-ATP, se pueden seleccionar bibliotecas de compuestos conocidos, que incluyen productos naturales o productos químicos sintéticos, y materiales biológicamente activos, incluidas proteínas, para compuestos que son inhibidores o activadores. Preferentemente, dicho compuesto es un antagonista de NCca-ATP, que incluye un inhibidor de canal de NCca-ATP, un bloqueador de canal de NCcb-atp, un antagonista de SUR1, un inhibidor de SUR1 y/o un compuesto capaz de reducir la magnitud de la corriente de membrana a través del canal.
Los compuestos pueden incluir, pero no se limitan a, pequeñas moléculas orgánicas o inorgánicas, compuestos disponibles en bibliotecas de compuestos, péptidos tales como, por ejemplo, péptidos solubles, que incluyen pero no se limitan a miembros de bibliotecas aleatorias de péptidos; (véase, por ejemplo, Lam, KS et al., 1991, Nature 354: 82-84; Houghten, R. et al., 1991, Nature 354: 84-86), y una biblioteca molecular derivada de química combinatoria hecha de aminoácidos de configuración D y/o L, fosfopéptidos (incluidos, entre otros, miembros de bibliotecas de fosfopéptidos dirigidos al azar o parcialmente degenerados; véase, por ejemplo, Songyang, Z. et al., 1993, Cell 72: 767-778) , anticuerpos (que incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, antiidiotípicos, quiméricos o de cadena simple, y fragmentos de biblioteca de expresión de FAb, F(ab1)2 y FAb, y fragmentos de unión a epítopos de los mismos).
Otros compuestos que pueden seleccionarse incluyen, pero no se limitan a, pequeñas moléculas orgánicas que pueden atravesar la barrera hematoencefálica, entrar en una célula neural apropiada y afectar la expresión del gen del canal NCca-ATP o algún otro gen involucrado en la actividad del canal NCca-ATP (por ejemplo, interactuando con la región reguladora o factores de transcripción involucrados en la expresión génica); o tales compuestos que afectan la actividad del canal NCca-ATP o la actividad de algún otro factor intracelular involucrado en la actividad del canal NCca-ATP.
Las tecnologías de búsqueda y modelado por ordenador permiten la identificación de compuestos, o la mejora de compuestos ya identificados, que pueden modular la actividad o expresión del canal NCca-ATP. Una vez identificado dicho compuesto o composición, se identifican los sitios o regiones activos. Tales sitios activos pueden ser típicamente sitios de unión a ligandos. El sitio activo se puede identificar usando métodos conocidos en la técnica que incluyen, por ejemplo, el estudio de complejos del compuesto o composición relevante con otros ligandos, de las secuencias de aminoácidos de los péptidos o de las secuencias de nucleótidos de los ácidos nucleicos. Los métodos cristalográficos químicos o de rayos X se pueden usar para estudiar complejos del compuesto relevante para encontrar el sitio activo. Se determina la estructura geométrica tridimensional del sitio activo. Esto puede hacerse mediante métodos conocidos, incluida la cristalografía de rayos X, que puede determinar una estructura molecular completa. Por otro lado, la RMN en fase sólida o líquida puede usarse para determinar ciertas distancias intramoleculares. Se puede usar cualquier otro método experimental de determinación de estructura para obtener estructuras geométricas parciales o completas. Las estructuras geométricas pueden medirse con un ligando complejo, natural o artificial, lo que puede aumentar la precisión de la estructura del sitio activo determinada.
Si se determina una estructura incompleta o insuficientemente precisa, los métodos de modelado numérico basado en ordenador pueden usarse para completar la estructura o mejorar su precisión. Se puede usar cualquier método de modelado reconocido, incluidos modelos parametrizados específicos para biopolímeros particulares, tales como proteínas o ácidos nucleicos, modelos de dinámica molecular basados en cálculos de movimientos moleculares, modelos de mecánica estadística basados en conjuntos térmicos o modelos combinados. Para la mayoría de los tipos de modelos, los campos de fuerza molecular estándar, que representan las fuerzas entre los átomos y grupos constituyentes, son necesarios y pueden seleccionarse de los campos de fuerza conocidos en química física. Las estructuras experimentales incompletas o menos precisas pueden servir como restricciones en las estructuras completas y más precisas calculadas por estos métodos de modelado.
Finalmente, habiendo determinado la estructura del sitio activo, ya sea experimentalmente, mediante modelado o mediante una combinación, los compuestos moduladores candidatos pueden identificarse buscando bases de datos que contengan compuestos junto con información sobre su estructura molecular. Dicha búsqueda busca compuestos que tengan estructuras que coincidan con la estructura del sitio activo determinado y que interactúen con los grupos que definen el sitio activo. Tal búsqueda puede ser manual, pero preferentemente es asistida por ordenador. Estos compuestos encontrados a partir de esta búsqueda son posibles compuestos de modulación del canal NCca-ATP, preferentemente bloqueantes.
Como alternativa, estos métodos pueden usarse para identificar compuestos moduladores mejorados a partir de un compuesto modulador o ligando ya conocido. La composición del compuesto conocido puede modificarse y los efectos estructurales de la modificación pueden determinarse usando los métodos experimentales y de modelado por ordenador descritos anteriormente aplicados a la nueva composición. La estructura alterada se compara luego con la estructura del sitio activo del compuesto para determinar si se produce un ajuste o interacción mejorada. De esta manera, las variaciones sistemáticas en la composición, como por grupos secundarios variables, se pueden evaluar rápidamente para obtener compuestos moduladores modificados o ligandos de especificidad o actividad mejorada.
Los ejemplos de sistemas de modelado molecular son los programas CHARMm y QUANTA (Polygen Corporation, Waltham, Mass.). CHARMm realiza las funciones de minimización de energía y dinámica molecular. QUANTA realiza la construcción, modelado gráfico y análisis de estructura molecular. QUANTA permite la construcción interactiva, modificación, visualización y análisis del comportamiento de las moléculas entre sí. Varios artículos revisan el modelado informático de medicamentos interactivos con proteínas específicas, como Rotivinen, et al. (1988), Acta Pharmaceutical Fennica 97: 159-166); Ripka (1988 New Scientist 54-57); McKinaly y Rossmann (1989, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 29: 111-122); Perry y Davies, OSAR: Quantitative Structure-Activity Relationships in Drug Design págs. 189-193 Alan R. Liss, Inc. 1989; Lewis y Dean (1989, Proc. R. Soc. Lond. 236: 125-140 y 141­ 162); y, con respecto a un receptor modelo para componentes de ácido nucleico, Askew, et al. (1989, J. Am. Chem. Soc. 111: 1082-1090). Otros programas de ordenador que seleccionan y representan gráficamente productos químicos están disponibles en compañías como BioDesign, Inc. (Pasadena, California), Allelix, Inc. (Mississauga, Ontario, Canadá) e Hypercube, Inc. (Cambridge, Ontario). Aunque estos están diseñados principalmente para su aplicación a medicamentos específicos para proteínas particulares, se pueden adaptar al diseño de medicamentos específicos para regiones de ADN o ARN, una vez que se identifica esa región.
Los compuestos identificados a través de los análisis tales como los descritos en la presente memoria pueden ser útiles, por ejemplo, en la elaboración de la función biológica del canal de NCcb-atp y para aliviar la inflamación del cerebro.
Los análisis para someter a ensayo la eficacia de los compuestos identificados en el barrido celular se pueden someter a ensayo en sistemas de modelos animales para la inflamación del cerebro. Tales modelos animales se pueden utilizar como sustratos de ensayo para la identificación de fármacos, productos farmacéuticos, terapias e intervenciones que pueden ser eficaces en el tratamiento de la inflamación del cerebro. Por ejemplo, los modelos animales de inflamación en el cerebro, tales como la lesión del cerebro, se pueden exponer a un compuesto, que se sospecha que muestra una capacidad para inhibir la inflamación del cerebro, a una concentración suficiente y durante un tiempo suficiente para lograr semejante inhibición de la inflamación del cerebro en los animales expuestos. La respuesta de los animales a la exposición se puede controlar utilizando medios visuales (p. ej., radiológicos, CAT, MRI), medición de la presión intracraneal, y/o la reversión de los síntomas asociados con la inflamación del cerebro. Con respecto a la intervención, cualquier tratamiento que revierta cualquier aspecto de los síntomas asociados con la inflamación del cerebro se debe considerar candidato a la intervención terapéutica de la inflamación. Las dosificaciones de los agentes de ensayo se pueden determinar obteniendo las curvas dosisrespuesta, como se comenta en la presente memoria.
Por consiguiente, la presente invención es útil en el tratamiento o el alivio de la inflamación y muerte de las células neurales y la inflamación del cerebro, especialmente aquellos insultos del cerebro relacionados con la lesión traumática del cerebro, el daño del sistema nervioso central o periférico, la isquemia cerebral, tal como el ictus, o las complicaciones que implican y/o derivan del edema, la lesión, o el trauma. Tales daños o complicaciones se pueden caracterizar por un daño o aberración evidente en el cerebro, cuyos síntomas pueden ser reducidos por la presente invención incluyendo la administración de una cantidad eficaz de los compuestos o sustancias activas descritos en la presente memoria. En un aspecto de la invención, el antagonista de SUR1 que bloquea el canal NCcb-atp se usa en un método para la prevención o el tratamiento de la inflamación de las células neurales en el cerebro de un ser humano como resultado de una lesión cerebral traumática o isquemia cerebral, en cuyo método el antagonista de SUR1 que bloquea el canal NCcb-atp se administra después de la lesión cerebral traumática o la isquemia cerebral. De acuerdo con una realización específica de la presente invención la administración de cantidades eficaces del compuesto activo pueden bloquear el canal, que si permanece abierto conduce a inflamación de las células neurales y muerte celular. Varios antagonistas de SUR1 son adecuados para bloquear el canal. Los ejemplos de los antagonistas de SUR1 adecuados incluyen, pero no están limitados a glibenclamida, tolbutamida, repaglinida, nateglinida, meglitinida, midaglizol, LY397364, LY389382, gliclazida, glimepirida, MgADP y combinaciones de los mismos. En una realización preferida de la invención los antagonistas de SUR1 se seleccionan del grupo que consiste en glibenclamida y tolbutamida. Se pueden adoptar otras "estrategias" terapéuticas más para prevenir la inflamación y la muerte de las células neurales incluyendo, pero no limitadas a los métodos para mantener la célula neural en un estado polarizado y los métodos que evitan la despolarización fuerte.
Ejemplo 17
Mecanismos adicionales para mantener los NRA en un estado polarizado
Cuando los astrocitos reactivos están fuertemente despolarizados debido a la apertura del canal de NCcb-atp, experimentan burbujeo e inflamación y eventualmente sufren muerte celular necrótica. Como se ha establecido anteriormente, cuando los astrocitos reactivos están fuertemente despolarizados debido a la apertura de un canal no selectivo que es sensible a Ca2+ y a ATP (canal de NCcb-atp), experimentan burbujeo e inflamación y eventualmente sufren muerte celular necrótica. La muerte de estos astrocitos Reactivos se puede evitar si se puede evitar la fuerte despolarización, en otras palabras, si las células se pueden mantener en un estado polarizado.
Un modo potencial de mantener los NRA es un estado polarizado consiste en abrir el canal de Kir2.3. Los NRA se exponen al abridor del canal de Kir2.3, Tenidap, para mantener los canales de Kir2.3 abiertos. Los astrocitos reactivos nativos recién cosechados de cerebros de rata adulta después de la lesión se exponen a Tenidap para evaluar la capacidad del fármaco para abrir el canal de Kir2.3 en estas células. Preferiblemente, los astrocitos reactivos de tipo 1 (R1) se cosechan y se utilizan en este análisis. Uno de los subtipos de astrocitos reactivos es el astrocito de tipo R1. Los astrocitos de tipo R1 comprenden la mayor población de astrocitos recuperables en el lugar de la lesión del cerebro. Están localizados de forma característica en la región del tejido que rodea el sitio de la lesión, muchos de los cuales se encuentra que han migrado por sí mismo al sitio de la lesión. Véase, Perillan, et al., 1999.
Los astrocitos reactivos que son parte de la respuesta celular a TBI e ictus comprenden al menos dos subtipos. Uno de los subtipos de astrocitos reactivos es el astrocito de tipo R1. Los astrocitos de tipo R1 comprenden la población más grande de astrocitos recuperables en el lugar de la lesión del cerebro. Están localizados característicamente en la región de tejido que rodea el sitio de la lesión, habiéndose encontrado que muchas de estas células también han migrado al sitio de la lesión por sí mismas. Véase, Perillan, et al. 1999.
Los astrocitos de tipo R1 son el tipo predominante de astrocitos de reactivos en las preparaciones de NRA. Los astrocitos de tipo R1 expresan dos canales iónicos sumamente importantes en su membrana celular: (a) el canal de Kir2.3, que está presente en células cultivadas así como en células recién aisladas; y (b) el canal de NCca-ATP, que está presente solamente en astrocitos reactivos recién aislados y que se pierden poco después del cultivo. El Kir2.3 es un rectificador del canal hacia el interior que es sumamente importante para mantener la célula polarizada a un potencial de reposo normal próximo del potencial de reversión de potasio (“ -75 mV). Cuando este canal es inactivado o inhibido, la célula se despolariza a un potencial próximo al potencial de reversión del cloruro (“ -25 mV). Los rasgos característicos del canal de NCca-ATP son: 1) es un canal catiónico no selectivo que permite el paso de Na, K y otros cationes monovalentes bastante rápidamente; 2) es activado por un incremento en el calcio intracelular, y/o por un descenso en el ATP intracelular; y 3) está regulado por el receptor de sulfonilurea de tipo 1 (SUR1). Se ha considerado que SUR1 está asociado exclusivamente con los canales de Katp, tales como los encontrados en las células p pancreáticas.
La apertura del canal de NCca-ATP después del agotamiento de ATP, como con la isquemia o la hipoxia, ocasiona la despolarización de la célula debida al influjo de Na. Este influjo de Na incrementa la carga osmótica dentro de la célula, y como resultado, entra H2O en la célula para equilibrar la carga osmótica. El resultado es un exceso de Na y H2O intracelularmente, una respuesta patológica que produce el burbujeo celular y la inflamación de la célula y que es conocida como edema citotóxico. Sin control, esta respuesta patológica conduce eventualmente a la muerte celular. Como se describe en la presente memoria, esta muerte celular es en su mayor parte muerte celular necrótica, pero en un grado menor, también muerte celular apoptótica.
Se pueden utilizar numerosos enfoques para aliviar la inflamación del cerebro debida a edema citotóxico. Un tratamiento utilizado actualmente para tratar a los pacientes en situaciones clínicas relevantes se basa en una osmolaridad extracelular creciente para reducir la fuerza impulsora para el influjo de H2O. Esta estrategia también reduce el burbujeo en células aisladas.
Una estrategia más específica para reducir el edema citotóxico es la inactivación o el bloqueo del canal de NCca-ATP que es responsable principalmente del influjo de Na que introduce el H2O en la célula y que realmente causa el edema citotóxico. Un enfoque altamente selectivo para inactivar este canal consiste en explotar la relación única entre el canal y la subunidad reguladora de control, SUR1. Se han desarrollado varios fármacos que interaccionan con SUR1 en las células p pancreáticas para bloquear el canal de Katp en esas células y tratar de ese modo la diabetes. Algunos de estos fármacos pertenecen a la clase de agentes denominados sulfonilureas. Como se describe en la presente memoria, los fármacos que bloquean el canal de Katp, tales como glibenclamida y tolbutamida, son altamente eficaces al bloquear el canal de NCca-ATP en astrocitos de tipo R1. Los fármacos capaces de bloquear el canal de NCca-ATP en los NRA (a) evitan el burbujeo celular en respuesta al agotamiento de ATP, (b) reducen significativamente la muerte celular después del agotamiento de ATP. Asimismo, el uso de glibenclamida para tratar la inflamación del cerebro es un animal que padece un ictus o una lesión del cerebro se describe en la presente memoria.
Otra estrategia más para combatir el efecto del canal de NCca-ATP y reducir el edema citotóxico sería contrarrestar la despolarización de la célula que acompaña a la apertura del canal de NCca-ATP. Un modo de lograr esto consiste en intensificar la apertura de los canales de Kir2.3que también están presentes en estas células. Un compuesto anti­ inflamatorio, Tenidap, es un abridor de canales de Kir2.3. Véanse, Popp et al., 1992; Liu et al., 2002.
El Tenidap se valúa para determinar su capacidad para reducir el burbujeo celular y la inflamación y la muerte celular necrótica en respuesta al agotamiento de ATP en las células aisladas así como in situ en cerebro de rata lesionado. Para evaluar si el Tenidap abre los canales de Kir2.3 en los astrocitos de tipo R1, se utilizan métodos similares a los descritos en la presente memoria para evaluar el estatus del canal de NCca-ATP. Los resultados de tales experimentos que demuestran que el Tenidap abre los canales de Kir2.3 en los astrocitos de tipo R1, y reducen el burbujeo celular y la muerte celular en respuesta al agotamiento de ATP indicarían la utilidad de Tenidap en el tratamiento de la inflamación del cerebro y del edema citotóxico resultante de TBI o de la isquemia cerebral. La cantidad eficaz de Tenidap es aquella cantidad capaz de reducir la inflamación del cerebro o la isquemia cerebral debido a la capacidad del fármaco para inhibir la inflamación de las células neurales y la muerte celular necrótica.
Es probable que los bloqueadores de SUR1 sean los más específicos, proporcionando de manera fiable los menores efectos secundarios no deseados. Adicionalmente, una combinación de tratamientos que incluya el uso de diuréticos osmóticos, bloqueadores del canal de NCCa-ATP tales como glibenclamida y abridores del canal de Kir2. 3 tales como Tenidap, puede proporcionar mejor eficacia en el alivio del edema citótoxico y la reducción de la morbidez y la mortalidad en la lesión del cerebro y el ictus.
En el presente documento se describe un método para identificar compuestos que inhiben la inflamación de las células neurales, que comprende: (a) poner en contacto un compuesto de prueba con una composición que comprende el canal Kir2.3, y (b) determinar si el compuesto de prueba abre el canal Kir2.3, en donde un compuesto de prueba que abre el canal Kir2.3 se identifica como un compuesto para inhibir la inflamación de las células neurales.
[También se describe en el presente documento un método para identificar compuestos que inhiben la inflamación cerebral, que comprende: (a) poner en contacto un compuesto de prueba con una composición que comprende el canal Kir2.3, y (b) determinar si el compuesto de prueba abre el Kir2.3 canal, en el que un compuesto de prueba que abre el canal Kir2.3 se identifica como un compuesto para inhibir la inflamación cerebral,
También se describe en el presente documento un método para identificar compuestos que inhiben la inflamación de las células neurales y/o la inflamación del cerebro en un animal, que comprende: (a) poner en contacto un compuesto de prueba con una composición que comprende el canal Kir2.3, y (b) determinar si el compuesto de prueba abre el canal Kir2.3, en donde un compuesto de prueba que abre el canal Kir2.3 se identifica como un compuesto para inhibir la inflamación de las células neurales y/o la inflamación del cerebro en un animal.
También se describe en el presente documento un método para identificar compuestos que previenen, inhiben y/o alivian la inflamación cerebral en un sujeto, que comprende: (a) poner en contacto un compuesto de prueba con una composición que comprende el canal Kir2.3, y determinar si la prueba el compuesto abre el canal Kir2.3 y (b) administrar el compuesto de prueba a un sujeto que tiene una lesión cerebral o isquemia cerebral, y determinar si el compuesto de prueba previene, inhibe y/o alivia la inflamación cerebral en el sujeto, en donde los compuestos de prueba que abren el canal Kir2.3 se identifican como compuestos que inhiben la inflamación cerebral.
También se describe en el presente documento un método para identificar compuestos que inhiben la inflamación de las células neurales en un animal, que comprende: (a) poner en contacto un compuesto de prueba con una composición que comprende el canal Kir2.3, y determinar si el compuesto de prueba abre el canal Kir2.3, y (b) administrar el compuesto de prueba a un animal que tiene una lesión cerebral o isquemia cerebral, y determinar si el compuesto de prueba inhibe la inflamación cerebral del animal tratado, en donde los compuestos de prueba que inhiben la inflamación cerebral se identifican como compuestos que inhiben la inflamación de las células neurales en un animal.
También se describe en el presente documento un método para prevenir la inflamación de las células neurales en el cerebro de un sujeto, dicho método comprende administrar al sujeto una formulación que contiene una cantidad eficaz de un compuesto que abre el canal Kir2.3 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
También se describe en el presente documento un método para aliviar los efectos negativos de la lesión traumática del cerebro o la isquemia cerebral provenientes de la inflamación de las células neurales en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una formulación que comprende una cantidad eficaz de un compuesto que abre el canal Kir2.3 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un compuesto preferido es Tenidap. Por ejemplo, la formulación puede proporcionar una dosis diaria de Tenidap que es de aproximadamente 10 mg/día a aproximadamente 500 mg/día, o, cuando se administra directamente en el cerebro, la dosis diaria de Tenidap es de aproximadamente 500 mg/día a 1,5 gms/día o mayor.
Formulaciones farmacéuticas y métodos de tratamiento de la inflamación de las células neurales y la inflamación del cerebro
Composiciones
La presente invención también contempla composiciones que comprenden las sustancias activas descritas en la presente memoria para su uso en métodos terapéuticos. Preferiblemente, estas composiciones incluyen composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más de los compuestos o sustancias activos junto con un portador farmacéuticamente aceptable.
Según se utiliza en la presente memoria, el término portador "farmacéuticamente aceptable" representa una carga, diluyente, material encapsulante, formulación coadyuvante de cualquier tipo líquido, semi-sólido, sólido inerte, no tóxico, o simplemente un medio acuoso estéril, tal como solución salina. Algunos ejemplos de los materiales que pueden servir como portadores farmacéuticamente aceptables son azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa, almidones tales como almidón de maíz y almidón de patata, celulosa y sus derivados tales como sal de sodio de carboximetilcelulosa, etilcelulosa y acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta, gelatina, talco; excipientes tales como manteca de cacao y ceras para supositorios; aceites tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; glicoles, tales como propilenglicol, polioles tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; ésteres tales como oleato de etilo y laurato de etilo, agar; agentes tamponadores tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua libre de pirógeno; solución salina isotónica, solución de Ringer; alcohol etílico y soluciones de tampón fosfato, así como otras sustancias compatibles no tóxicas utilizadas en formulaciones farmacéuticas.
También pueden estar presentes agentes humectantes, emulsionantes y lubricantes tales como laurilsulfato de sodio y estearato de magnesio, así como agentes colorantes, agentes de liberación, agentes de recubrimiento, agentes edulcorantes, aromatizantes y perfumantes, conservantes y antioxidantes en la composición, de acuerdo con el criterio del formulador. Los ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no están limitados a, agua, antioxidantes solubles tales como ácido ascórbico, hidrocloruro de cisteína, bisulfito de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio, y similares; antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol y similares; y los agentes quelantes metálicos tales como ácido cítrico, ácido etilenediaminotetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico y similares.
Determinaciones de la dosis
Por "cantidad terapéuticamente eficaz" o simplemente "cantidad eficaz" de un compuesto activo, tal como glibenclamida o tolbutamida, se quiere significar una cantidad suficiente del compuesto para tratar o aliviar la inflamación del cerebro con una razón beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento médico. Se entenderá, sin embargo, que el uso diario total de los compuestos activos y las composiciones de la presente invención será decidido por el médico a cargo dentro del criterio lógico del juicio médico. El nivel de dosis terapéuticamente eficaz específico para cualquier paciente dependerá de una variedad de factores incluyendo el trastorno que se esté tratando y la gravedad de la lesión del cerebro o isquemia; la actividad del compuesto específico empleado; la composición específica empleada; la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo y la dieta del paciente; el tiempo de administración, la ruta de administración, y la tasa de excreción del compuesto específico empleado; la duración del tratamiento; los fármacos utilizados de forma combinada o coincidente con el compuesto específico empleado; y factores similares bien conocidos en la técnica médica.
La toxicidad y la eficacia terapéutica de tales compuestos se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en análisis con células o animales experimentales, p. ej., para determinar la DL50 (dosis letal para el 50% de la población) y la DE50 (dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La proporción de la dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y se puede expresar como la razón DL50/DE50. Se prefieren los compuestos que muestran índices terapéuticos grandes. Si bien se pueden utilizar compuestos que muestran efectos secundarios tóxicos, se debe tener cuidado de diseñar un sistema de liberación que dirija tales compuestos al lugar del tejido afectado con el fin de minimizar el daño potencial para las células no infectadas y, de ese modo, reducir los efectos secundarios.
Los datos obtenidos de los análisis de cultivos de células y de estudios en animales se pueden utilizar en la formulación de un intervalo de dosificación para su uso en seres humanos. La dosificación de tales compuestos se encuentra preferiblemente en un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y de la ruta de administración utilizada. Para cualquier compuesto utilizado en el método de la invención, la dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente a partir de análisis basados en células. Se puede formular una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración en plasma circulante que incluya la CI50 (esto es, la concentración del compuesto de ensayo que logra una inhibición semi-máxima de los síntomas) determinada en el cultivo de células. Semejante información se puede utilizar para determinar más exactamente las dosis útiles en seres humanos. Se pueden medir los niveles en plasma, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alta resolución.
La dosis diaria total de los compuestos activos de la presente invención administrados a un sujeto en una sola dosis o en dosis divididas puede estar en cantidades, por ejemplo, de 0,01 a 25 mg/kg de peso corporal o más normalmente de 0,1 a 15 mg/kg de peso corporal. Las composiciones de una sola dosis pueden contener tales cantidades o submúltiplos de las mismas hasta sumar la dosis diaria. En general, los regímenes de tratamiento de acuerdo con la presente invención comprenden la administración a un ser humano u otro mamífero que necesite semejante tratamiento de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 1000 mg de las sustancias activas de esta invención por día en múltiples dosis o en una sola dosis de 1 mg, 5 mg, 10 mg, 100 mg, 500 mg o 1000 mg.
En ciertas situaciones, puede ser importante mantener una dosis razonablemente elevada del agente activo en la corriente sanguínea del paciente, concretamente al principio del tratamiento. Semejante dosis razonablemente elevada puede incluir una dosis que sea varias veces mayor que su uso en otras indicaciones. Por ejemplo, la dosis anti-diabétia típica de la glibenclamida oral o IV es de aproximadamente 2,5 mg/kg a aproximadamente 15 mg/kg por día; la dosis anti-diabética típica de la tolbutamida oral o IV es de aproximadamente 0,5 gm/kg a aproximadamente 2,0 gm/kg por día; la dosis anti-diabética típica para la gliclazida oral es de aproximadamente 30 mg/kg a aproximadamente 120 mg/kg por día; sin embargo, se pueden requerir dosis mucho mayores para bloquear la inflamación de las células neurales y la inflamación del cerebro.
Por ejemplo, en una realización de la presente invención dirigida a una formulación que contiene una cantidad eficaz de un compuesto que bloquea el canal de NCCa-ATP y un portador farmacéuticamente aceptable para su uso en un método de prevención de inflamación de células neurales en el cerebro de un sujeto, tales formulaciones pueden contener de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100 gramos de tolbutamida o de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 150 miligramos de glibenclamida. En otra realización de la presente invención dirigida a una formulación que contiene una cantidad eficaz de un compuesto que bloquea el canal NCCa-ATP y un vehículo farmacéuticamente aceptable para su uso en un método de alivio de los efectos negativos de la lesión traumática del cerebro o isquemia cerebral derivada de una inflamación de las células neurales en un sujeto.
En situaciones de lesión traumática del cerebro o isquemia cerebral (tal como ictus), o hipoxia cerebral, puede ser importante mantener una dosis razonablemente elevada del agente activo para garantizar la liberación en el cerebro del paciente, concretamente al principio del tratamiento. Por consiguiente, al menos inicialmente, puede ser importante mantener la dosis relativamente elevada y/o a un nivel sustancialmente constante durante un período de tiempo dado, preferiblemente, al menos aproximadamente seis o más horas, más preferiblemente, al menos aproximadamente doce o más horas, y muy preferiblemente, al menos aproximadamente veinticuatro o más horas. Cuando el método se emplea para tratar afecciones que implican hemorragia en el cerebro, tal como lesión traumática en el cerebro o isquemia cerebral (tal como ictus), la liberación a través del sistema vascular está disponible y no se requiere necesariamente que el compuesto atraviese rápidamente la barrera hemato-encefálica.
Formulaciones y administración
Los compuestos para su uso en la presente invención se pueden administrar solos o combinados o en una terapia concurrente con otros agentes que afectan al sistema nervioso central o periférico, concretamente áreas seleccionadas del cerebro.
Las formas de dosificación líquida para la administración oral pueden incluir emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables que contienen diluyentes inertes comúnmente utilizados en la técnica, tales como agua, soluciones iónicas, o solución salina. Tales composiciones pueden comprender coadyuvantes, tales como agentes humectantes; agentes emulsionantes y de suspensión; agentes edulcorantes, aromatizantes y perfumantes.
Las preparaciones inyectables, por ejemplo, suspensiones acuosas u oleosas inyectables estériles se pueden formular de acuerdo con la técnica conocida utilizando agentes de dispersión o humectantes y agentes de suspensión adecuados. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución, suspensión o emulsión inyectable estéril en un diluyente o disolvente parenteralmente aceptable no tóxico, por ejemplo, en forma de una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que se pueden emplear están agua, solución de Ringer, U.S.P. y solución de cloruro de sodio isotónica. Además, se emplean convencionalmente aceites fijados estériles como disolvente o medio de suspensión. Para este fin se puede emplear cualquier aceite fijado blando incluyendo mono- o di-glicéridos sintéticos. Además, se utilizan ácidos grasos tales como ácido oleico en la preparación de inyectables.
La formulación inyectable se puede esterilizar, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro de retención de bacterias, o mediante la incorporación de agentes esterilizadores en forma de composiciones sólidas estériles, que se pueden disolver o dispersar en agua estéril u otro medio inyectable estéril inmediatamente antes de su uso.
Con el fin de prolongar el efecto de un fármaco, a menudo es deseable ralentizar la absorción de un fármaco procedente de una inyección subcutánea o intramuscular. El modo más común de lograr esto es inyectar una suspensión de material cristalino o amorfo con una escasa solubilidad en agua. La tasa de absorción del fármaco es dependiente de la tasa de disolución del fármaco, que a su vez, depende del estado físico del fármaco, por ejemplo, el tamaño del cristal y la forma cristalina. Otro enfoque para retrasar la absorción de un fármaco consiste en administrar el fármaco en forma de una solución o suspensión en aceite. Las formas de depósito inyectable también se pueden elaborar formando matrices de microcápsulas de fármacos y polímeros biodegradables, tales como polilactida-poliglicósido. Dependiendo de la proporción de fármaco con respecto a polímero y de la composición del polímero, la tasa de liberación de fármaco puede ser controlada. Los ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poliortoésteres y polianhídridos. Los inyectables de depósito también se pueden elaborar atrapando el fármaco en liposomas o microemulsiones, que son compatibles con los tejidos corporales.
Los supositorios para la administración rectal del fármaco se pueden preparar mezclando el fármaco con un excipiente no irritante adecuado, tal como manteca de cacao y polietilenglicol que son sólidos a la temperatura normal pero líquidos a la temperatura rectal y por lo tanto, se fundirán en el recto y liberarán el fármaco.
Las formas de dosificación sólidas para la administración oral pueden incluir cápsulas, comprimidos, píldoras, polvos, cápsulas de gel y gránulos. En tales formas de dosificación el compuesto activo se puede mezclar con al menos un diluyente inerte tal como sacarosa, lactosa o almidón. Tales formas de dosificación también pueden comprender, como es práctica normal, sustancias adicionales distintas de los diluyentes inertes, p. ej., lubricantes para la formación de comprimidos y otras ayudas para formar comprimidos tales como estearato de magnesio y celulosa microcristalina. En el caso de las cápsulas, comprimidos y píldoras, las formas de dosificación también pueden comprender agentes tamponadores. Los comprimidos y las píldoras se pueden preparar adicionalmente con recubrimientos entéricos y otros recubrimientos de control de la liberación.
Las composiciones sólidas de un tipo similar también se pueden emplear como cargas en cápsulas de gelatina rellenas duras y blandas utilizando excipientes tales como lactosa o galactosa así como polietilenglicoles de elevado peso molecular y similares.
Los compuestos activos también pueden estar en forma microencapsulada con un o más excipientes como se ha observado anteriormente. Las formas de dosificación sólida de los comprimidos, cápsulas, píldoras, y gránulos se pueden preparar con recubrimientos y cubiertas tales como recubrimientos entéricos y otros recubrimientos bien conocidos en la técnica de formulación farmacéutica. Pueden contener opcionalmente agentes para conferir opacidad y también pueden tener una composición de manera que liberen el ingrediente o los ingredientes activos solamente, o preferiblemente, en una cierta parte del tracto intestinal, opcionalmente de una manera retardada. Los ejemplos de las composiciones de imbibición que se pueden utilizar incluyen sustancias poliméricas y ceras.
Las formas de dosificación para la administración tópica o transdérmica de un compuesto de esta invención incluyen adicionalmente pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, polvos, soluciones, pulverizaciones, inhalantes o parches. Los parches transdérmicos tienen la ventaja añadida de proporcionar la liberación controlada del compuesto activo en el organismo. Tales formas de dosificación se pueden elaborar disolviendo o dispersando el compuesto en el medio apropiado. También se pueden utilizar intensificadores de la absorción para incrementar el flujo del compuesto a través de la piel. La tasa se puede controlar o bien proporcionando una membrana que controle la tasa o bien dispersando el compuesto en una matriz polimérica o gel. Las pomadas, pastas, cremas y geles pueden contener, además de un compuesto activo de esta invención, excipientes tales como grasas animales y vegetales, aceites, ceras, parafinas, almidón, tragacanto, derivados de celulosa, polietilenglicoles, siliconas, bentonitas, ácido silícico, talco y óxido de cinc, o mezclas de los mismos.
Los compuestos identificados en la presente memoria se pueden emplear para aplicaciones tanto in vitro como in vivo. Para las aplicaciones in vivo, los compuestos se pueden incorporar a una formulación farmacéuticamente aceptable para su administración. Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente los niveles de dosificación adecuados cuando se utilizan de este modo los compuestos de la invención.
Según se emplea en la presente memoria, la expresión "niveles de dosificación adecuados" hace referencia a niveles de compuesto suficientes para proporcionar concentraciones circulantes suficientemente elevadas para bloquear eficazmente el canal de NCCa-ATP y evitar o reducir la inflamación de las células neurales in vivo.
De acuerdo con una realización concreta de la presente invención, se contemplan composiciones que comprenden al menos un compuesto antagonista de SUR1 (como se ha descrito anteriormente), y un portador farmacéuticamente aceptable.
Los portadores farmacéuticamente aceptables ilustrativos incluyen portadores adecuados para la administración oral, intravenosa, subcutánea, intramuscular, intracutánea, y similares. Se contempla la administración en forma de cremas, lociones, comprimidos polvos dispersables, gránulos, jarabes, soluciones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas estériles, y similares.
Para la preparación de líquidos orales, los portadores adecuados incluyen emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes, y similares, que contienen opcionalmente aditivos tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, agentes edulcorantes, aromatizantes y perfumantes, y similares.
Para la preparación de fluidos para la administración parenteral, los portadores adecuados incluyen soluciones, suspensiones, o emulsiones acuosas o no acuosas estériles. Los ejemplos de los disolventes o vehículos no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales, tales como aceite de oliva y aceite de maíz, gelatina, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Tales formas de dosificación también pueden contener coadyuvantes tales como agentes conservantes, humectantes, emulsionantes, y dispersantes. Estos se pueden esterilizar, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro de retención de bacterias, incorporando agentes esterilizantes a las composiciones, irradiando las composiciones, o calentando las composiciones. También se pueden formular en forma de agua estéril, o algún otro medio inyectable estéril inmediatamente antes de su uso. El compuesto activo se mezcla en condiciones estériles con un portador farmacéuticamente aceptable y cualquier conservante o tampón necesario que se pueda requerir.
La descripción anterior de las realizaciones preferidas de la presente invención se ha presentado con fines ilustrativos y descriptivos. No se pretende ser exhaustivo ni limitar la invención a las formas precisas descritas. Muchas variaciones y modificaciones de las realizaciones descritas en la presente memoria serán evidentes para un experto en la técnica a la luz de la descripción anterior. El alcance de la invención va a ser definido solamente por las reivindicaciones adjuntas, y por sus equivalentes.
Además, al describir realizaciones representativas de la presente invención, la memoria descriptiva puede haber presentado el método y/o proceso de la presente invención como una secuencia particular de etapas. Sin embargo, en la medida en que el método o proceso no se base en el orden particular de etapas establecidas en el presente documento, el método o proceso no debe limitarse a la secuencia particular de etapas descritas. Como apreciaría un experto habitual en la técnica, pueden ser posibles otras secuencias de etapas. Por lo tanto, el orden particular de las etapas establecidas en la memoria descriptiva no debe interpretarse como limitaciones en las reivindicaciones. Además, las reivindicaciones que se refieren a un método y/o proceso no deben limitarse al desempeño de sus etapas en el orden escrito, y un experto en la materia puede apreciar fácilmente que las secuencias pueden variar.
Las citas completas para las referencias citadas en la presente memoria se proporcionan en la siguiente lista.
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Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un antagonista de SURI que bloquea el canal de NCcb-atp para su uso en (a) la prevención o el tratamiento de la inflamación de las células neurales en el cerebro de un sujeto; (b) el alivio de los efectos negativos de la lesión cerebral traumática o la isquemia cerebral derivadas de la inflamación de las células neurales en un sujeto; (c) tratar la inflamación de las células neurales en el cerebro de un sujeto que tiene daño en el sistema nervioso central o periférico; o (d) tratar la inflamación de las células neurales en el cerebro de un sujeto que tiene sangrado en el cerebro.
2. Un antagonista de SUR1 que bloquea el canal de NCcb-atp para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, que es para su uso en un método para la prevención o el tratamiento de la inflamación de las células neurales en el cerebro de un ser humano que da como resultante de una lesión traumática en el cerebro o de isquemia cerebral, en cuyo método el antagonista de SURI que bloquea el canal de NCcb-atp se administra después de la lesión traumática del cerebro o la isquemia cerebral.
3. Un antagonista de SURI que bloquea el canal de NCcb-atp para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es un compuesto de sulfonilurea.
4. Un antagonista de SURI que bloquea el canal de NCc-btp para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, cuyo compuesto se selecciona entre repaglinida, nateglinida, meglitinida, LY397364, LY389382, gliclazida, glimepirida, MgADP, glibenclamida, tolbutamida y combinaciones de los mismos.
5. Un antagonista de SURI que bloquea el canal NCcb-atp para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior en donde el antagonista de SURI que bloquea el canal NCcb-atp se usa en (a) la prevención o el tratamiento de la inflamación de las células neurales en el cerebro de un sujeto; o (b) el alivio de los efectos negativos de la lesión cerebral traumática o la isquemia cerebral derivada de la inflamación de las células neurales en un sujeto; , cuyo compuesto se administra por vía intravenosa, subcutánea, intramuscular, intracutánea, intragástrica, oral o en el cerebro.
6. Un antagonista de SURI que bloquea el canal de NCcb-atp para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la isquemia cerebral es ictus.
7. Un antagonista de SURI que bloquea el canal de NCcb-atp para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el sujeto ha sufrido un ictus.
8. Un antagonista de SURI que bloquea el canal de NCcb-atp para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el sujeto ha sufrido una lesión cerebral traumática.
9. Un antagonista de SURI que bloquea el canal NCCa-ATP para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se administra en forma de una formulación que contiene el compuesto y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
10. Un antagonista de SURI que bloquea el canal de NCc-btp para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, que se administra en forma de una composición farmacéutica que contiene como portador farmacéuticamente aceptable un azúcar seleccionado entre lactosa, glucosa y sacarosa.
11. Un antagonista de SUR1 que bloquea el canal NCcb-atp para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el vehículo farmacéuticamente aceptable es adecuado para la administración oral, intravenosa, subcutánea, intramuscular o intracutánea.
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