ES2788952T3 - Método y kits para identificación de inhibidores CDK9 para el tratamiento de cáncer - Google Patents

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Abstract

Un inhibidor de CDK9, seleccionado del grupo que consiste en PHA-767491, DRB, SNS-032, flavopiridol y ARNph contra CDK9, para usar en el tratamiento del cancer en un sujeto que sobreexpresa MYC en el que el cancer es carcinoma hepatocelular.

Description

DESCRIPCIÓN
Método y kits para identificación de inhibidores CDK9 para el tratamiento de cáncer
Campo técnico
La presente descripción generalmente se refiere a métodos de tratamiento para cáncer usando inhibidores de CDK9 y la detección de biomarcadores relacionados con tumores resistentes a fármacos.
Antecedentes
El carcinoma hepatocelular (HCC) es la tercera causa principal de mortalidad relacionada con el cáncer a nivel mundial. Un factor de riesgo importante para HCC, el tipo más común de cáncer primario de hígado, es la cirrosis, frecuentemente causada por hepatitis viral crónica, abuso de alcohol y enfermedad del hígado graso no alcohólico. Aunque el tratamiento del HCC ha mejorado mucho en las últimas décadas, la mayoría de los pacientes con HCC diagnosticados en etapas avanzadas no son elegibles para terapias curativas ablativas como la resección o el trasplante de hígado. El uso del inhibidor multiquinasa sorafenib en pacientes con HCC avanzado sugiere que las terapias dirigidas podrían ser beneficiosas en este cáncer; sin embargo, este régimen solo extiende la esperanza de vida de 8 a 11 meses, lo que pone de relieve la necesidad urgente de nuevos enfoques terapéuticos.
Los desarrollos recientes en tecnologías de perfiles de expresión génica han permitido la clasificación molecular de HCC en subclases definidas, creando una base sólida sobre la cual construir ensayos clínicos más informativos. Además, exhaustivos estudios genómicos han identificado amplificaciones genómicas de MYC, mutaciones de pcatenina e inactivación del supresor tumoral TP53 como eventos frecuentes en e1HCC. Sin embargo, a diferencia de otros tipos de tumores, que presentan controladores genéticos que pueden ser explotados terapéuticamente, tal como las mutaciones del EGFR en el cáncer de pulmón y las mutaciones de BRAF en el melanoma, e1HCC es genéticamente heterogéneo y carece de controladores genéticos claramente dirigibles. Por lo tanto, parece probable que serán necesarias más ideas sobre la función de las lesiones genéticas actualmente "no tratables con fármacos" para desarrollar terapias racionales para esta enfermedad.
La inhibición de CDK ya se describió en relación con el cáncer de mama triple negativo y los modelos de tumor hematológico (Horiuchi, D et al., Journal of Experimental Medicine 209 (4): 679-696; Yin, T et al., Molecular Cancer Therapeutics 13 (6): 1442-1456), y también se describió el papel de MYC como oncogén (Cowling, VH et al., Molecular and Cellular Biology 27 (6): 2059-2073). Además, se describió el uso de Ibulocidina como profármaco inhibidor de CDK que induce la apoptosis en células de carcinoma hepatocelular (Cho, S-J et al., Journal of Biological Chemistry 286 (22): 19662-19671). Los inhibidores de CDK BA-12 y BP-14 se describieron como represión de la formación de tumores en HCC humano xenoinjertado (Haider, C et al., Molecular Cancer Therapeutics 12 (10): 1947-1957).
Resumen
Un aspecto de la presente invención se refiere a un método para determinar la sensibilidad al tratamiento de cáncer en un paciente que padece cáncer. El método comprende las etapas de: determinar la presencia de sobreexpresión de MYC en una muestra biológica del paciente, en la que la presencia de sobreexpresión de MYC indica una sensibilidad a un tratamiento por un inhibidor de CDK9, en la que el cáncer es carcinoma hepatocelular. El inhibidor de CDK9 se selecciona del grupo que consiste en PHA 767491, DRB, SNS-032, flavopiridol y ARNph contra CDK9.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un inhibidor de CDK9, seleccionado del grupo que consiste en PHA 767491, DRB, SNS-032, flavopiridol y ARNph contra CDK9, para usar en el tratamiento de un paciente que padece cáncer hepatocelular. El paciente es un sujeto que sobreexpresa MYC.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra el cribado de ARNi para los genes que codifican objetivos conocidos para fármacos. (Figura 1A) Características de la biblioteca y esquema del vector TRMPV-neo. TRE, elemento regulado por tetraciclina. (Figura 1B) Categorías de rutas de genes "objetivo para fármaco" incluidas en la biblioteca. Los números indican el número de genes en cada categoría. (Figura 1C) Estrategia de cribado de ARNi. (Figura 1D) Gráficos de dispersión representativos que ilustran la correlación de lecturas normalizadas por ARNph entre réplicas al comienzo del experimento (izquierda) y réplicas en diferentes puntos de tiempo (derecha). (Figura 1E) Resultados del cribado de selección negativa agrupados en células de HCC murinas MP1. Las relaciones de abundancia de ARNph de 2046 ARNph se calcularon como el número de lecturas normalizadas después de 12 días de cultivo en doxiciclina (T12) dividido por el número de lecturas normalizadas antes del tratamiento con doxiciclina (T0), y se representaron como la media de tres réplicas en orden ascendente. MP1, células de HCC murinas Myc; p53 -/- clon 1; T0, población de células al comienzo del experimento; T12, población de células al final del experimento, en el día 12; dox, doxiciclina; r, coeficiente de correlación de Pearson.
La Figura 2 muestra que se requiere CDK9 para la proliferación de algunas líneas celulares de HCC. (Figura 2A) Ensayo de proliferación competitiva. Las células Venus+ seleccionadas por G418 se mezclaron con células no transducidas en una proporción de 1:1, y posteriormente se cultivaron en presencia de doxiciclina. El porcentaje de células Venus+dsRed+ (que expresan ARNph) se determinó en diferentes puntos de tiempo (los resultados en el día 0 y el día 14 se muestran y son relativos al día 0). Los cambios se utilizaron como lectura de los efectos inhibidores del crecimiento. Los valores son la media DE de tres réplicas independientes. Los gráficos muestran la validación de los ARNph candidatos así como los ARNph de control (Ren.713; Myc.1891 y Rpa3.561) en células de HCC murinas MP1. (Figura 2B) Inmunotransferencias que muestran la inactivación inducida por los ARNph expresados a partir de TRMPV-neo en células de HCC murinas MP1. Se usó p-actina como control de carga. (Figura 2C) Ensayo de proliferación competitiva de ARNph de control y candidatos expresados a partir de TRMPV-neo en MEF inmortalizadas (MEFi), como se describe en la Figura 2A. (Figura 2D) Inmunotransferencias que muestran la inactivación inducida por ARNph expresados a partir de TRMPV-neo en MEFi. Se usó p-actina como control de carga. (Figuras 2E y 2F) Ensayo de proliferación competitiva de ARNph de control (Renilla y MYC) y CDK9 expresados a partir de TRMPV-neo-miR-E (Figura 2E) o TRMPV-neo (Figura 2F) en diferentes líneas celulares murinas (Figura 2E) y humanas (Figura 2F), como se describe en la Figura 2A. Se muestra el porcentaje de células que expresan ARNph en el día 14 con respecto al día 0. MP1, células de HCC murinas clon #1, Myc; p53 -/-; la letra "E" después del nombre del ARNph indica que el ARNph se clona en la cadena principal de miR-E en lugar de miR-30.
La Figura 3 muestra la inhibición farmacológica de CDK9 en líneas celulares de HCC. (Figura 3A) Gráfico de dispersión que ilustra la correlación entre los efectos antiproliferativos de los ARNph de CDK9 y la IC50 de PHA-767491 en seis líneas celulares humanas. La correlación y los valores p de tres inhibidores de CDK9 adicionales y un inhibidor de replicación de ADN (afidicolina) también se muestran en el panel derecho. La supervivencia se define como el promedio de la relación de supervivencia de dos ARNph en un ensayo de proliferación competitivo. (Figura 3B) Tasas de proliferación de células humanas tratadas con PHA-767491, calculadas midiendo el cambio en el número de células viables después de 72 h en cultivo y ajustando los datos a una curva de crecimiento exponencial. Los resultados se normalizaron a la tasa de proliferación de las células tratadas con vehículo (H2O), establecida como 1. Los valores son la media /- DE de tres réplicas independientes. (Figura 3C) Resumen de los valores de IC50 de PHA-767491 de líneas celulares humanas en la Figura 3A. (Figura 3D) Diagrama de dispersión que ilustra la correlación entre la supervivencia con ARNph de CCNT1 y la supervivencia con CDK9 (negro), en líneas celulares murinas y humanas. (Figura 3E) Representación gráfica de citometría de flujo que muestra el análisis del ciclo celular (tinción doble con BrdU+7-AAD) de las células después de 48 horas de tratamiento con PHA-767491. El experimento se realizó dos veces y los valores indican la media ± DE. r, coeficiente de correlación de Pearson; FLV, flavopiridol; PHA, PHA-767491; SNS, SNS-032; APHI, afidicolina.
La Figura 4 muestra que la expresión de MYC predice la respuesta a la inhibición de CDK9. (Figura 4A) Gráfico de dispersión que ilustra la correlación entre los valores de IC50 de PHA-767491 y los niveles de expresión de MYC en líneas celulares humanas de HCC (rojo), leucemia, linfoma y cáncer de pulmón (n = 28). (Figura 4B) Diagrama de dispersión que ilustra la correlación entre la supervivencia con los ARNph de CDK9 y los niveles de expresión de MYC en un panel de diferentes líneas celulares de HCC humano. La supervivencia se define como el promedio de la relación de supervivencia de dos ARNph en un ensayo de proliferación competitivo. (Figura 4C) Inmunotransferencias que muestran los niveles de proteína de MYC en 10 líneas celulares de HCC humano. Se usó p-actina como control de carga. (Figuras 4D y 4E) Gráfico de GSEA que evalúa la asociación entre IC50 baja de PHA-767491 y objetivos MYC (Figura 4D) o una subclase de pacientes con HCC que sobreexpresan MYC (Figura 4E). (Figura 4F) Análisis de términos GO de los genes que están significativamente asociados con la sensibilidad a PHA-767491. r, coeficiente de correlación de Pearson; PHA, PHA-767491; NES, puntaje de enriquecimiento normalizado; FDR, tasa de descubrimiento falso.
La Figura 5 muestra que CDK9 media el alargamiento de la transcripción de objetivos MYC en células cancerosas que sobreexpresan MYC. (Figuras 5A y 5B) ChIP-qPCR realizada en células de HCC humano que expresan ARNph de CDK9 y MYC (Figura 5a ) o tratadas con PHA-767491 (6 horas a 4,5 |jM) (Figura 5B) con anticuerpos y cebadores de ARN pol II ubicado en el sitio de inicio de la transcripción (TSS) o en el cuerpo del gen (GB) de NPM1. (Figura 5C) Índice de pausa de NPM1 en líneas celulares de HCC humano. El índice de pausa, también conocido como relación de desplazamiento, se calcula como la relación entre el ARN pol II unido al TSS y el ARN pol II unido al GB. Código de color y estadísticas como en las Figuras 5A y 5B. (Figura 5D) RT-PCR cuantitativa de NPM1 en líneas celulares de HCC humano tratadas con PHA-767491 (16 horas a 4,5 j M) o con ARNph de CDK9. Los datos son relativos a la expresión en las células no tratadas o ARNph de Renilla en células HepG2, normalizados a la expresión promedio del gen de mantenimiento GAPDH. Los valores son la media ± DE de dos experimentos independientes. Código de color y estadísticas como en las Figuras 5A y 5B. PHA, PHA-767491. (Figuras 5E y 5F) Imágenes de PET con 89Zrtransferrina de tumores HepG2 (E) o Alexander (F) con o sin tratamiento tridimensional con PHA-767491. (L) hígado; (T) tumor; (trans) transversal. La escala de marcas de Hash para todos los datos de imágenes de PET muestra la captación de radiotrazadores en unidades de dosis inyectada por gramo (% de la DI/g), con marcas de Hash diagonales inclinadas hacia la izquierda que corresponden a la actividad más alta y marcas de Hash diagonales inclinadas hacia la derecha correspondientes a la actividad más baja.
La Figura 6 muestra que se requiere el alargamiento de la transcripción para mantener la proliferación en HCC que sobreexpresa MYC. (Figuras 6A y 6B) Diagrama de dispersión que ilustra la correlación entre la supervivencia con los ARNph de MYC y con los ARNph de CDK9 en líneas celulares de ratón y humano (Figura 6A) y con los ARNph de CCNT1 (B). La supervivencia se define como la relación de células supervivientes en los ensayos de proliferación competitiva (Figuras 2E y 2F). En el caso de CDK9 y CCNT1, se utiliza el promedio de supervivencia de dos ARNph diferentes. (Figura 6C) Inmunotransferencias que muestran el efecto de sobreexpresión de MYC sobre la fosforilación de Ser2 de ARN Pol II en células SNU475 y Alexander con baja expresión de MYC. Se usó p-actina como control de carga. Los valores indican niveles de proteína normalizados, normalizados con p-actina o ARN Pol II, y relativos a los niveles en las células HepG2. (Figura 6D) Índice de pausa de NPM1 y BRG1 en células Alexander que sobreexpresan MYC. El índice de pausa, también conocido como relación de desplazamiento, se calcula como la relación entre el ARN pol II unido al sitio de inicio de la transcripción y el ARN pol II unido al cuerpo del gen. (Figura 6E) RT-PCR cuantitativa de NPM1 y BRG1 en células Alexander que sobreexpresan MYC. Los datos son relativos a la expresión en las células que expresan un vector vacío, normalizado a la expresión promedio del gen de mantenimiento GAPDH. Los valores son la media ± DE de dos experimentos independientes. (Figura 6F) Tasas de proliferación de células tratadas con PHA-767491 en la Figura 6C, calculadas midiendo el aumento en el número de células viables después de 72 horas en cultivo y ajustando los datos a una curva de crecimiento exponencial. Los resultados se normalizan a la tasa de proliferación de las células tratadas con vehículo (H2O), establecida como 1. Los valores son la media ± DE de dos réplicas independientes. Los valores de IC50 se incluyen en |jM. (Figura 6G) Gráfico de dispersión que ilustra la correlación entre los niveles de proteína de MYC y la IC50 de PHA-767491 en las diferentes líneas celulares en la Figura 6F. La letra "E" después del nombre del ARNph indica que el ARNph está clonado en la cadena principal de miR-E en lugar de miR-30; PHA, PHA-767491; r, coeficiente de correlación de Pearson.
La Figura 7 muestra que se requiere CDK9 para el inicio y mantenimiento de tumores hepáticos que sobreexpresan MYC. Se requiere CDK9 para iniciar y mantener tumores hepáticos que sobreexpresan MYC. (Figura 7A) Representación del gráfico de puntos del número de tumores hepáticos después de la inyección hidrodinámica del oncogén Myc y los ARNph correspondientes. Las barras representan la media ± DE de cinco ratones independientes. (Figura 7B) Imágenes representativas de campo brillante y fluorescente de los hígados en A. Los tumores son positivos para GFP. (Figura 7C) Inmunotransferencias que muestran la inactivación inducida por los ARNph de CDK9 en dos tumores representativos. La inhibición de CDK9 conduce a una disminución en los niveles de fosforilación de Ser2 de ARN pol II (pSer2) y cambios leves en los niveles totales de ARN pol II (Pol II). Se usó p-actina como control de carga. (Figura 7D) Imágenes bioluminiscentes de ratones representativos trasplantados ortotópicamente con células de HCC MP1 que albergan los ARNph indicados de TRMPV-Neo-miR-E. La doxiciclina se administró al inicio de la enfermedad, siete días después del trasplante. (Figura 7E) Cuantificación de respuestas de imágenes bioluminiscentes con o sin tratamiento con doxiciclina. Los valores son la media DE de seis tumores independientes. (Figura 7F) Cuantificación del número de células positivas Ki67 por campo, después de analizar tres campos por animal y tres animales por condición. Los valores son la media ± DE. (Figura 7G) Inmunotransferencia que muestra los efectos causados por PHA-767491 en dos tumores representativos. El tratamiento con PHA-767491 conduce a una disminución en los niveles de fosforilación de Ser2 de ARN pol II (pSer2) y cambios leves en los niveles totales de ARN pol II (Pol II). Se usó p-actina como control de carga. (Figura 7H) Imágenes bioluminiscentes de ratones representativos ortotópicamente trasplantados con células de HCC HepG2 o Alexander. PHA-767491 se administró al inicio de la enfermedad (considerado como día 0), 28 días después del trasplante. Se muestran los días 3 y 24 del tratamiento. (Figura 7I) Cuantificación de respuestas de imágenes bioluminiscentes con o sin tratamiento con PHA-767491. Los valores son la media ± DE de siete u ocho tumores independientes. (Figura 7J) Cuantificación del número de células positivas para Ki67 por campo, después de analizar tres campos por animal y tres animales por condición. Los valores son la media ± DE. MP1, células de HCC murinas clon #1 Myc; p53 -/-; Dox, doxiciclina; La letra "E" después del nombre del ARNph denota que el ARNph se clona en la cadena principal de miR-E en lugar de miR-30; PHA, PHA-767491.
La Figura 8 muestra la regeneración hepática para revelar el índice terapéutico asociado con la inhibición de CDK9 in vivo. (Figura 8A) Representación esquemática de la regeneración hepática. Los vectores del transposón de ARNph miRE se inyectaron junto con la transposasa CMV-SB13 mediante inyección hidrodinámica en la vena de la cola. La hepatectomía parcial se realizó después de una semana. La relación hígado/cuerpo y el porcentaje de GFP se examinaron después de dos semanas. (Figura 8B) La inhibición de CDK9 no muestra un impacto significativo en la relación hígado/cuerpo, en comparación con Ren.713E (control neutral). shRpa3.561E se utiliza como control positivo. (Figura 8C) Análisis histológico representativo del hígado, teñido para GFP. (Figura 8D) La inhibición de CDK9 no muestra un impacto significativo en el porcentaje de células GFP+ antes y después de la hepatectomía parcial.
La Figura 9 muestra ratones ARNi transgénicos inducibles y reversibles para revelar el índice terapéutico asociado con la inhibición de CDK9 in vivo. (Figura 9A) Representación esquemática de la generación y aplicación de ratones transgénicos para ARNph. Los ARNph miRE dirigidos por TRE están dirigidos al locus ColA1 para impulsar la inactivación de genes dependientes de doxiciclina (dox) en células ES, tejidos embrionarios y adultos del ratón. Mediante el uso de una cepa de ratones rtTA sensible y ampliamente expresada, los ARNph de CAGs-rtTA3, GFP-miRE se pueden expresar de manera eficiente en la mayoría de los tejidos para estudiar las toxicidades en el objetivo. (Figura 9B) Análisis de transferencia Western de inhibiciones de pSer2 en CDK9 y RNAPII en clones de células ES tratadas con dox que contienen R26-rtTA y Ren.713E (control neutro) o dos ARNph miRE de CDK9 (CDK9.421E y CDK9.1260E). (Figura 9C) Inactivación sistemática de CDK9 y expresión de GFP en la mayoría de los tejidos de ratones shRen.713E, shCDK9.421E y shCDK9.1260E que expresan CAGs-rtTA3, mantenidos con una dieta de dox durante 2 semanas. (Figura 9D) Se muestran imágenes representativas de ratones shRen.713E, shCDK9.421E y shCDK9.1260E que expresan CAGs-rtTA3 después de una dieta con dox de 2 semanas. No hay diferencia significativa de apariencia entre los ratones. (Figura 9E) Cambios medios de peso (g) de ratones TG-Ren.713E, TG-CDK9.421E y TG-CDK9.1260E machos y hembras (combinados) CAGs-rtTA3/+; en la dieta con dox, con respecto al día 0 del tratamiento con dox. Las barras de error representan EEM (n = 3).
Descripción detallada
La siguiente descripción detallada se presenta para permitir que cualquier persona experta en la técnica use la presente invención. Para fines de explicación, se establece una nomenclatura específica para proporcionar una comprensión exhaustiva de la presente invención.
Como se usa a lo largo de esta descripción, la palabra "puede" se usa en un sentido permisivo (es decir, significa que tiene el potencial para), en lugar del sentido obligatorio (es decir, significa debe). Los términos "un" y "uno, una" en este documento no denotan una limitación de la cantidad, sino que más bien denotan la presencia de al menos uno de los ítems referenciados.
Como se usa en el presente documento, el término "cáncer" se refiere a cualquiera de las diversas neoplasias malignas caracterizadas por la proliferación de células que tienen la capacidad de invadir el tejido circundante y/o hacer metástasis a nuevos sitios de colonización, incluidos los carcinomas.
El término "carcinoma" se refiere a un nuevo crecimiento maligno compuesto por células epiteliales que tienden a infiltrarse en los tejidos circundantes y dar lugar a metástasis. Los ejemplos de carcinomas incluyen, por ejemplo, carcinoma hepatocelular.
El término "cantidad efectiva" como se usa en este documento, se refiere a una cantidad suficiente para lograr un efecto deseado o pretendido.
Método para determinar la sensibilidad al tratamiento
El gen MYC (c-Myc) es un gen regulador que codifica un factor de transcripción. La proteína codificada por este gen es una fosfoproteína nuclear multifuncional que desempeña un papel en la progresión del ciclo celular, la apoptosis y la transformación celular. La sobreexpresión de MYC induce una proliferación aberrante al afectar diferentes procesos biológicos, incluida la transcripción génica, la traducción de proteínas y la replicación de ADN. La activación sostenida de MYC en ratones crea un estado de adicción al oncogén, mientras que el retiro de MYC en tumores establecidos, incluidos los carcinomas de hígado, conduce a la involución del tumor. Además, debido a su papel en la mediación de las señales oncogénicas, MYC es necesario para el mantenimiento de algunos tumores en los que no está amplificado, incluidos los adenomas pulmonares murinos provocados por KRAS y la leucemia provocada por MLL-AF9. A pesar de la extensa validación de MYC como objetivo terapéutico, los antagonistas de MYC de molécula pequeña no están disponibles. En principio, la identificación de las moléculas y los procesos críticos necesarios para la acción de MYC en el cáncer proporciona una estrategia alternativa para atacar los tumores provocados por MYC.
Un aspecto de la presente invención se refiere a un método para determinar la sensibilidad al tratamiento del cáncer en un paciente que padece cáncer, el método comprende las etapas para determinar la presencia en una muestra biológica del paciente de sobreexpresión de MYC en el tejido tumoral, en el que la presencia de sobreexpresión de MYC indica una sensibilidad al tratamiento por un inhibidor de CDK9. El cáncer es carcinoma hepatocelular. El inhibidor de CDK9 se selecciona del grupo que consiste en PHA 767491, DRB, SNS-032, flavopiridol y ARNph contra CDK9.
La muestra biológica puede ser una muestra de tejido, una muestra de biopsia o una muestra de sangre. El término "sobreexpresión de MYC" se refiere a un nivel de expresión de MYC que es significativamente más alto que el nivel de expresión de MYC en una muestra de control o un valor de referencia. En algunas realizaciones, "sobreexpresión" se refiere a un nivel de expresión que es significativamente mayor que (1) el nivel de expresión en una muestra de control o (2) un valor de referencia. En algunas realizaciones, "sobreexpresión" se refiere a un nivel de expresión que es al menos 20%, 50%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% o 500% más alto que el nivel de expresión en una muestra de control o un valor de referencia. El nivel de expresión de MYC puede determinarse a nivel transcripcional (por ejemplo, determinando el nivel de ARN de MYC), a nivel de traducción (por ejemplo, determinando el nivel de proteína de MYC) o a nivel funcional (por ejemplo, determinando el nivel de actividad de MYC).
La sobreexpresión de MYC en muestras de tejido tumoral se puede determinar con métodos bien conocidos en la técnica. Las técnicas para evaluar la presencia de sobreexpresión de MYC en muestras biológicas incluyen análisis de microarreglos, presentación diferencial, PCR, RT-PCR, Q-RT-PCR, transferencias Northern, transferencias Western y transferencias Southern.
La sobreexpresión de MYC puede identificarse mediante técnicas biológicas moleculares estándar utilizadas para detectar la presencia de biomarcadores específicos en una muestra biológica, tal como una muestra de tejido tumoral. Las técnicas incluyen el uso de cebadores, sondas o anticuerpos, que son capaces de interactuar con la secuencia conocida de ARN o proteína de MYC.
En algunas realizaciones, los anticuerpos se generan contra las proteínas expresadas de MYC en tumores y se usan para detectar la presencia de mutaciones en tales tumores mediante técnicas conocidas, tales como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).
En ciertas realizaciones, los cebadores se usan para soportar la secuenciación de nucleótidos extraídos de una muestra de tejido tumoral. Típicamente, los cebadores serán capaces de extenderse de una manera específica de secuencia. La extensión de un cebador de una manera específica de secuencia incluye cualquier método en el que la secuencia y/o composición de la molécula de ácido nucleico con la que se híbrida el cebador o se asocia de otra manera dirige o influye en la composición o secuencia del producto producido por la extensión del cebador. La extensión del cebador de una manera específica de secuencia, por lo tanto, incluye PCR, secuenciación de ADN, extensión de ADN, polimerización de ADN, transcripción de ARN o transcripción inversa.
Se entiende que en ciertas realizaciones los cebadores también pueden extenderse usando técnicas no enzimáticas, en las que, por ejemplo, los nucleótidos u oligonucleótidos usados para extender el cebador se modifican de modo que reaccionarán químicamente para extender el cebador en una secuencia de manera específica. En otras realizaciones, los cebadores se pueden extender usando técnicas isotérmicas. En algunas realizaciones, las técnicas y condiciones están optimizadas para la amplificación del ARN de MYC.
La muestra biológica puede ser una muestra de tejido, tal como una muestra de biopsia, una muestra de fluido corporal, tal como sangre, fluido linfático, líquido cefalorraquídeo y saliva, o una muestra celular del paciente. En algunas realizaciones, la muestra biológica es una muestra de biopsia recogida de un tumor dentro del paciente.
En algunas realizaciones, la sobreexpresión de la determinación de MYC se realiza en biopsias que están incrustadas en cera de parafina. La fijación de formalina y la inclusión de tejidos en cera de parafina es un enfoque universal para el procesamiento de tejidos antes de la evaluación por microscopio óptico. Una ventaja importante que brindan las muestras embebidas en parafina fijadas con formalina (FFPE) es la preservación de los detalles morfológicos celulares y arquitectónicos en las secciones del tejido. El uso de muestras de FFPE proporciona un medio para mejorar los diagnósticos actuales al identificar con precisión los principales tipos histológicos, incluso a partir de biopsias pequeñas. Dado que la recolección y el almacenamiento de muestras de FFPE es una práctica habitual en los laboratorios de patología, este enfoque permite el análisis de la sobreexpresión de genes en tejidos archivados para determinar retrospectivamente la sensibilidad a los inhibidores de CDK9.
Como se usa en el presente documento, el término "inhibidor de CDK9" se refiere a agentes que inhiben la expresión del gen CDK9 o una actividad de la proteína CDK9. En las realizaciones de la presente invención, estos agentes se seleccionan del grupo que consiste en PHA 767491, DRB, SNS-032, flavopiridol y ARNph contra CDK9.
En algunas realizaciones, la muestra biológica del paciente es una muestra de biopsia de carcinoma hepatocelular. En algunas realizaciones, la presencia de la sobreexpresión del gen MYC en la muestra de biopsia indica una sensibilidad al tratamiento por un inhibidor de CDK9, tal como PHA 767491 o un ARNph anti-CDK9.
En algunas realizaciones, el tratamiento comprende además la etapa de administrar al paciente una cantidad eficaz de un inhibidor de CDK9, si se encuentra una sobreexpresión de m Yc en la muestra biológica.
La ausencia de sobreexpresión de MYC indica que el carcinoma hepatocelular probablemente no responda a los inhibidores de CDK9. Se recomienda al paciente someterse a una cirugía para extirpar el carcinoma hepatocelular sin el uso de inhibidores terapéuticos de c DK9. La presencia de sobreexpresión de MYC indica que es probable que el carcinoma hepatocelular responda a los inhibidores de CDK9. Se aconseja al paciente que se someta a una cirugía para extirpar el carcinoma hepatocelular con la administración de inhibidores de CDK9 antes o después, o ambos antes y después de la cirugía.
Un método para evaluar la eficacia de administrar inhibidores de CDK9 en un paciente que padece cáncer comprende las etapas de determinar la presencia en una muestra biológica del paciente de niveles suprimidos de fosforilación de Ser2 en el dominio de repetición del extremo terminal C (CTD) de ARN pol II, en el que la presencia de un nivel suprimido de fosforilación de Ser2 en el CTD de ARN pol II es indicativo de que CDK9 está siendo inhibido en el paciente. Como se usa en el presente documento, un "nivel de fosforilación suprimido" se refiere a un nivel de fosforilación que es significativamente menor que (1) el nivel de fosforilación en una muestra de control o (2) un nivel de referencia. En algunos casos, "un nivel de fosforilación suprimido" se refiere a un nivel de fosforilación que es aproximadamente 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% o inferior al nivel de fosforilación en una muestra de control o un valor de referencia. El nivel de fosforilación de Ser2 en el CTD de ARN pol II puede determinarse usando métodos bien conocidos en la técnica. Las técnicas para determinar el nivel de fosforilación de Ser2 en el CTD de ARN pol II en muestras biológicas incluyen transferencias Western, inmunohistoquímica (IHC), inmunocitoquímica (ICC) y ensayo inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA) y espectrometría de masas (MS).
La presencia en una muestra biológica de un paciente de niveles suprimidos de fosforilación de Ser2 en el CTD de ARN pol II, puede detectarse mediante cualquiera de las técnicas estándar de biología molecular utilizadas para detectar la presencia de fosforilación de una posición de aminoácido, incluidos los enumerados en el presente documento.
Si se encuentra la presencia de niveles suprimidos de fosforilación de Ser2 en el CTD de ARN pol II dentro de la muestra de tejido tumoral del paciente, se puede predecir una mayor eficacia si se prescribe un régimen de inhibidores de CDK9 para el paciente.
Inhibidor de CDK9 para usar en el tratamiento del cáncer hepatocelular
Otro aspecto de la descripción se refiere a un método para tratar a un paciente que padece cáncer. El método comprende las etapas para determinar la presencia en una muestra biológica del paciente de sobreexpresión de sensibilidad a la administración asociada a MYC de un inhibidor de CDK9, y administrar una cantidad efectiva de un inhibidor de CDK9 al paciente si se detecta sobreexpresión de MYC en la muestra.
El cáncer es el carcinoma hepatocelular.
Por lo tanto, un aspecto de la presente invención se refiere a un inhibidor de CDK9, seleccionado del grupo que consiste en PHA 767491, DRB, SNS-032, flavopiridol y ARNph contra CDK9, para usar en el tratamiento de un paciente que padece cáncer hepatocelular. El paciente es un sujeto que sobreexpresa MYC.
En algunas realizaciones, se administra una cantidad efectiva de uno o más inhibidores de CDK9. Cada inhibidor de CDK9 se puede administrar a una dosis de 0,05-500 mg/m2 por ciclo, 0,05-0,2 mg/m2 por ciclo, 0,05-0,5 mg/m2 por ciclo, 0,05-2 mg/m2 por ciclo, 0,05-5 mg/m2 por ciclo, 0,05-20 mg/m2 por ciclo, 0,05-50 mg/m2 por ciclo, 0,05-100 mg/m2 por ciclo, 0,05-200 mg/m2 por ciclo, 0,2-0,5 mg/m2 por ciclo, 0,2-2 mg/m2 por ciclo, 0,2-5 mg/m2 por ciclo, 0,2-20 mg/m2 por ciclo, 0,2-50 mg/m2 por ciclo, 0,2-100 mg/m2 por ciclo, 0,2-200 mg/m2 por ciclo, 0,2-500 mg/m2 por ciclo, 0,5-2 mg/m2 por ciclo, 0,5-5 mg/m2 por ciclo, 0,5-20 mg/m2 por ciclo, 0,5-50 mg/m2 por ciclo, 0,5-100 mg/m2 por ciclo, 0,5­ 200 mg/m2 por ciclo, 0,5-500 mg/m2 por ciclo, 2-5 mg/m2 por ciclo, 2-20 mg/m2 por ciclo, 2-50 mg/m2 por ciclo, 2-100 mg/m2 por ciclo, 2-200 mg/m2 por ciclo, 2-500 mg/m2 por ciclo, 5-20 mg/m2 por ciclo, 5-50 mg/m2 por ciclo, 5-100 mg/m2 por ciclo, 5-200 mg/m2 por ciclo, 5-500 mg/m2 por ciclo, 20-50 mg/m2 por ciclo, 20-70 mg/m2 por ciclo, 20-100 mg/m2 por ciclo, 20-200 mg/m2 por ciclo, 20-500 mg/m2 por ciclo, 50-70 mg/m2 por ciclo , 50-100 mg/m2 por ciclo, 50­ 200 mg/m2 por ciclo, 50-500 mg/m2 por ciclo, 70-100 mg/m2 por ciclo, 70-150 mg/m2 por ciclo, 70-200 mg/m2 por ciclo, 70-300 mg/m2 por ciclo, 70-400 mg/m2 por ciclo, 70-500 mg/m2 por ciclo, 100-150 mg/m2 por ciclo, 100-200 mg/m2 por ciclo, 100-300 mg/m2 por ciclo, 100-400 mg/m2 por ciclo, 100-500 mg/m2 por ciclo, 200-300 mg/m2 por ciclo, 200-400 mg/m2 por ciclo, 200-500 mg/m2 por ciclo, 300-400 mg/m2 por ciclo, 300-500 mg/m2 por ciclo y 400-500 mg/m2 por ciclo. En algunas realizaciones, el inhibidor de CDK9 se administra a aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/m2 por ciclo. Cada ciclo puede tener una duración de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 días, o 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 semanas.
El inhibidor de CDK9 puede administrarse por vía parenteral, intravenosa, intramuscular, subcutánea u oral.
En algunas realizaciones, el inhibidor de CDK9 se administra a una dosis de 10-100 mg/m2 por ciclo, 10-20 mg/m2 por ciclo, 20-40 mg/m2 por ciclo, 40-60 mg/m2 por ciclo, 60-80 mg/m2 por ciclo u 80-100 mg/m2 por ciclo. El intervalo de dosis para la administración del inhibidor de CDK9 como parte de los métodos divulgados en le presente documento varía entre 20 mg/m2 a 100 mg/m2 del inhibidor de CDK9. En algunas realizaciones, el inhibidor de CDK9 se administra por vía parenteral. En algunas realizaciones, el inhibidor de CDK9 a la dosis descrita anteriormente se administra por infusión iv durante 3-24 horas. Los inhibidores de CDK9 están disponibles comercialmente a través de muchas fuentes. La dosis que debe administrarse a un sujeto que tiene cáncer puede ser determinada por un médico en función de la edad y el estado físico del sujeto, la sensibilidad del cáncer a un agente antineoplásico, la naturaleza del cáncer y el estadio y la agresividad del cáncer. Los intervalos de dosificación en el presente documento no pretenden limitar el alcance de la invención de ninguna manera. En algunos casos, los niveles de dosificación por debajo del límite inferior del intervalo de dosis antes mencionado pueden ser más que adecuados, mientras que en otros casos se pueden emplear dosis aún mayores sin causar ningún efecto secundario dañino.
En otras realizaciones, se administra un inhibidor de CDK9 junto con cirugía que elimina el tejido canceroso que contiene una sobreexpresión de MYC. En algunas realizaciones, el inhibidor de CDK9 se administra antes de la cirugía y después de la cirugía. En otras realizaciones, el inhibidor de CDK9 se administra después de la cirugía.
En algunas realizaciones, se administra un inhibidor de CDK9 antes, después o junto con radioterapia.
En algunas realizaciones, se administra una combinación de inhibidores de CDK9 y otros agentes quimioterapéuticos, tales como taxanos, tenipósido, gemcitabina, dacarbazina, flumequina y antraciclinas.
En algunas realizaciones, se administra una combinación de inhibidores de CDK9 y otros inhibidores, tales como sorafenib, atorvastatina, tivantinib, sunitinib y crizotinib.
Kits
Los kits pueden proporcionar los medios para detectar la sobreexpresión de MYC en una muestra biológica obtenida de un paciente que es candidato para el tratamiento con un inhibidor de CDK9. En algunos casos, el kit es un paquete o un contenedor que comprende uno o más reactivos para detectar específicamente la sobreexpresión de MYC en una muestra biológica. En algunos casos, uno o más reactivos comprenden dos o más cebadores o sondas de nucleótidos que hibridan específicamente con uno o más transcritos de ARN de MYC, o alternativamente, anticuerpos para la detección de la proteína de MYC.
En algunos casos, el kit comprende uno o más reactivos para determinar el nivel de fosforilación de Ser2 en el CTD de ARN pol II. El nivel de fosforilación de Ser2 en el CTD de ARN pol II puede determinarse usando métodos bien conocidos en la técnica. Las técnicas para determinar el nivel de fosforilación de Ser2 en el CTD de ARN pol II en muestras biológicas incluyen transferencias Western, inmunohistoquímica (IHC), inmunocitoquímica (ICC) y ensayo inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA) y espectrometría de masas (MS).
En otros casos, el kit comprende un prospecto dentro del empaque que describe el kit y los métodos para su uso.
En algunos casos, el kit comprende uno o más de los componentes seleccionados del grupo que consiste en (1) recipientes para procesar muestras biológicas para obtener moléculas de nucleótidos, en particular ARN o proteínas; (2) reactivos para procesar muestras biológicas para obtener moléculas de nucleótidos o proteínas; (3) componentes de purificación y filtración de ARN, tales como microperlas, o componentes de purificación y filtración de proteínas, tales como columnas de intercambio aniónico; (4) reactivos para filtración y purificación de ARN, o filtración y purificación de proteínas; (5) cebadores y/u otros oligonucleótidos sintéticos para ser utilizados en técnicas de biología molecular para el análisis de secuencias de nucleótidos, incluida la secuenciación de ARN; (6) microarreglos diseñados para el análisis de secuencias de nucleótidos o proteínas, incluidos los arreglos de captura de híbridos; (7) reactivos para determinar el nivel de fosforilación de Ser2 en el CTD de ARN pol II, y (8) medios por los cuales se pueden visualizar secuencias de nucleótidos o unión de anticuerpos, incluidos programas de software.
Ejemplos
Ejemplo 1: Material y método
Cribado de ARNi de selección negativa agrupada
Se diseñó una biblioteca de ARNph personalizada enfocada en 442 genes objetivo del fármaco utilizando predicciones BIOPREDsi adaptadas a miR30 (seis ARNph por gen) y se construyó mediante clonación por PCR de un conjunto de oligonucleótidos sintetizados en matrices personalizadas de 55 k (Agilent Technologies) como se describió anteriormente (Zuber J, McJunkin K, Fellmann C, Dow LE, Taylor MJ, Hannon GJ, Lowe SW. 2011. El juego de herramientas para evaluar los genes MYC requeridos depende del alargamiento de la transcripción para la proliferación y supervivencia utilizando ARNi regulado por tetraciclina (Zuber J et al., Nat Biotechnol (2011) 29: 79-83; Zuber J, et al., Nature (2011) 478: 524-528). La lista de genes se obtuvo del DrugBank (versión 2.5; http://www.drugbank.ca) y fue curado manualmente, excluyendo objetivos ambiguos o redundantes. Después de la verificación de secuencia, se combinaron 2245 ARNph (cinco a seis por gen) con varios ARNph de control positivo y neutro (n = 20) a concentraciones iguales en un grupo.
La biblioteca se clonó en TRMPV-Neo y se transdujo en células de HCC murinas MP1 Tet-on usando condiciones que conducen predominantemente a una única integración retroviral y representan cada ARNph en un número calculado de al menos 1000 células. Las células transducidas se seleccionaron durante 5 días usando 1 mg/mL de G418 (Invitrogen); en cada pasada, se mantuvieron más de 20 millones de células para preservar la representación de la biblioteca durante todo el experimento. Después de la selección del fármaco, se obtuvieron muestras T0 (20 millones de células por réplica) y se clasificaron para células Venus+. Después de 12 días (seis pasadas, T12), se clasificaron ~20 millones de células que expresan ARNph (dsRed+Venus+) para cada réplica usando un FACSAriaII (BD Biosciences). El ADN genómico de las muestras T0 y T12 se aisló mediante dos rondas de extracción con fenol usando tubos PhaseLock (5 Prime) seguido de precipitación con isopropanol.
La significancia estadística se calculó mediante la prueba t de Student de dos colas. La correlación se calculó mediante la prueba de Pearson. Se utilizó el software Prism 5 para calcular los valores de IC50. Los valores de significancia son P <0,05 (*), P <0,01 (**) y P <0,001 (***).
El ARN total se aisló usando el Mini Kit RNeasy y el conjunto de DNasa sin RNasa (Qiagen). El ARNm total se aisló usando el Mini Kit de ARNm Oligotex (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. La síntesis de ADNc y las qRT-PCR se realizaron como se describió previamente (Xue W et al., Nature (2007) 445: 656-660). El análisis de PCR cuantitativa se realizó en un ViiAMR 7 (Life Technologies). Todas las señales se cuantificaron utilizando el método deltaCt y se normalizaron a los niveles de GAPDH. Cada reacción se realizó por triplicado utilizando cebadores específicos del gen.
Se generaron bibliotecas de plantillas de secuenciación profunda mediante amplificación por PCR de cadenas guía de ARNph como se describió previamente (Zuber et al., Genes Dev (2011) 25: 1628-1640). Las bibliotecas se analizaron en un analizador de genoma Illumina a una concentración final de 8 pM; se secuenciaron 50 nucleótidos de la cadena guía usando un cebador personalizado. Para proporcionar una línea base suficiente para detectar el agotamiento de ARNph en muestras experimentales, el experimento tuvo como objetivo adquirir 500 lecturas por ARNph en la muestra T0, que requirió más de veinte millones de lecturas por muestra para compensar las disparidades en la representación de ARNph inherentes en la preparación de plásmidos agrupados o introducido por sesgos de PCR. Con estas condiciones, el experimento adquirió líneas base T0 de. más de 500 lecturas para 2246 (99,16% del total) ARNph. El procesamiento de la secuencia se realizó usando una plataforma Galaxy personalizada (Taylor J, Schenck I, Blankenberg D, Nekrutenko A. 2007. Using galaxy to perform large-scale interactive data analyses. Curr Protoc Bioinformatics Capítulo 10: Unidad 10 15).
Estudios con animales
Todos los experimentos con ratones fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Centro de Cáncer Memorial Sloan-Kettering (MSKCC) (protocolo no. 11-06-011). Los ratones se mantuvieron en condiciones específicas libres de patógenos, y se proporcionaron alimentos y agua a voluntad. Para los experimentos condicionales de ARNi in vivo, se transdujeron células de HCC murinas MP1 Tet-on con luciferasa-hygro y constructos de ARNph TRMPV-Neo-miR-E. Un millón de células de HCC murinas o humanas se trasplantaron ortotópicamente en ratones receptores desnudos hembra (NCR nu/nu, adquiridos a través de Charles River Laboratories y Harlan Laboratories), como se describió anteriormente (Saborowski et al., 2013 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 26 de noviembre de 2013; 110 (48): 19513-8. Doi: 10.1073/pnas.1311707110). Para la obtención de imágenes bioluminiscentes de todo el cuerpo, se inyectó intraperitonealmente a los ratones con 50 mg/kg de D-Luciferina (Goldbio), y después de 10 minutos, se analizaron utilizando un sistema IVIS Spectrum (Caliper LifeSciences). La cuantificación se realizó utilizando el software Living Image (Caliper LifeSciences) con regiones de interés redondas estandarizadas que cubren el tronco y las extremidades del ratón. Para la inducción del ARNph, los animales fueron tratados con doxiciclina en agua potable (2 mg/mL con sacarosa al 2%; Sigma-Aldrich) y alimentos (625 mg/kg, Harlan Laboratories). Para los ensayos de tratamiento con PHA-767491, el PHA-767491 se disolvió en agua destilada ultrapura, se filtró con filtros de 0,2 |jm y se diluyó a una concentración final de 5 mg/mL. Los ratones recibieron oralmente dos veces al día PHA-767491 (50 mg/kg) o un volumen similar de vehículo (agua). Los animales enfermos fueron sacrificados y se utilizaron los tumores hepáticos para su posterior análisis. Los tumores hepáticos fueron extirpados, fijados con formalina e incluidos en parafina, congelados o incluidos en OCT.
Para producir células de HCC murinas Tet-on, las células progenitoras hepáticas de ratones p53Loxp/Loxp se transdujeron con CreER y Myc-IRES-rtTA3 y luego se trasplantaron a ratones receptores. Después de la formación del tumor, el tumor se estableció como una línea celular y se probaron diferentes clones para determinar su capacidad para inducir ARNph expresados a partir de TRMPV-neo en presencia de doxiciclina, y para la funcionalidad utilizando ARNph de control neutro (Renilla) y letal (Rpa3) en ensayos de proliferación competitiva. En este ensayo, las células que expresan y no expresan ARNph se mezclaron y analizaron para determinar su potencial de proliferación relativa. Teniendo en cuenta el comportamiento similar de los diferentes clones, Myc;p53-/- clon #1 se seleccionó como la línea celular de cribado (en adelante, denominada como MP1).
Las líneas celulares murinas de HCC restantes se derivaron de células progenitoras hepáticas de ratones p53LoxP/LoxP: MP-CH significa Myc;p53-/- (similar a MP1) pero se generó a partir de infecciones independientes; Myc-AL se generó sobreexpresando ADNc de Myc en células progenitoras hepáticas de p53LoxP/LoxP aunque el locus p53 está intacto; las células KrasG12D;p53-/- se originaron sobreexpresando Kras mutante y eliminando p53.
Plásmidos
Para los experimentos condicionales de ARNi, los ARNph se expresaron a partir del vector TRMPV-Neo ya sea de las cadenas principales miR-30 o miR-E, que se han descrito previamente (y están disponibles en Addgene, catálogo no.
27990, o bajo pedido (por ejemplo, Zuber J, et al. Nat Biotechnol (2011) 29: 79-83; Fellmann C, et al., Hoffmann T. et al., Cell Rep (2013) 5: 1704-1713). Para producir células de HCC murinas MP1 Tet-on, las células progenitoras hepáticas de ratones p53Loxp/Loxp se transdujeron con CreER y Myc-IRES-rtTA3.
Para experimentos de rescate de MYC, el ADNc de MYC humano de tipo silvestre se subclonó en MSCV-PGK-Puro-IRES-GFP (MSCV-PIG) (Hemann MT, et al., Nat Genet, (2003) 33: 396- 400).
Para los experimentos in vivo, las células cancerosas se infectaron con Luciferasa-hygro. Las líneas celulares humanas se infectaron con MSCV-RIEP (MSCV-rtTA3-IRES-EcoR-PGK-Puro) (Zuber J, et al., Genes Dev (2011) 25: 1628-1640). La eficiencia de inactivación o sobreexpresión se evaluó mediante inmunotransferencia. Las secuencias de ARNph están disponibles. El transposón pT3 y los vectores pT3-EF1a-Myc fueron un amable regalo del Dr. Xin Chen, de la Universidad de California en San Francisco. Para generar el vector de expresión constitutivo pT3-EF1a (Tschaharganeh DF, et al., Cell (2014). 31 de julio; 158 (3): 579-92. Doi: 10.1016/j.cell.2014.05.051), se insertó el promotor EFla de pCpGfree-vitroBmcs (InvivoGen) en pT3, y un fragmento de GFP-miR-E se clonó después del promotor EFla.
Inmunotransferencia
Los tejidos hepáticos y los sedimentos celulares se lisaron en tampón Laemmli o tampón de lisis de proteínas (NaCl 200 mM, NP40 al 0,2%, Tris 50 mM a pH 7,5, Tween20 al 1%, inhibidores de proteasa y fosfatasas) usando un homogeneizador de tejidos. Se separaron cantidades iguales de proteína en geles de SDS-poliacrilamida al 12% y se transfirieron a membranas de PVDF. La abundancia de p-actina se controló para garantizar una carga igual. Las imágenes se analizaron utilizando el software Alpha View (ProteinSimple). La detección en Inmunotransferencias se realizó utilizando anticuerpos para CDK9 (Santa Cruz Biotechnology), MCM6 (Santa Cruz Biotechnology), PSMB2 (Santa Cruz Biotechnology), p-Actina (AC-15, Sigma), p53 (Leica Biosystems), MYC (Abcam), CCNT1 (Santa Cruz Biotechnology), fosfo-Ser2 a Rn pol II (Cell Signaling) y A r N pol II (Santa Cruz Biotechnology). Para la tinción de Ki67 (VP-K451, Vector Laboratories), las muestras de órganos se fijaron en paraformaldehído fresco al 4% durante la noche a 4 °C y se sometieron a procedimientos histológicos de rutina para su inclusión en parafina. Las imágenes fueron tomadas en un sistema Zeiss Axio Imager Z2.
Ensayos de proliferación
Los ensayos de proliferación competitiva usando ARNph en el vector TRMPV-Neo (con estructura principal miR-30 o miR-E) se realizaron como se describió previamente (Zuber J, et al., Nature (2011) 478: 524-528). Los ensayos de proliferación para PHA-767491 se realizaron in vitro contando los números de células viables durante 72 horas en presencia de diferentes concentraciones de PHA-767491. Las células muertas se excluyeron usando tinción con yoduro de propidio (PI) para puntuar las células con contenido de ADN sub-2N. Las mediciones de la concentración celular se realizaron en un Guaba Easycyte (Millipore), activando solo células viables (FSC/SSC/PI-). Las tasas de proliferación se calcularon dividiendo la concentración celular a las 72 horas y la concentración celular a las 0 horas, dividido por 72. Las tasas de proliferación relativas se calcularon normalizando a la tasa de células tratadas con vehículo. La duplicación de la población se calculó calculando log2 (células en el punto final/ células en el punto inicial) dividido por el tiempo en días.
Experimentos de ARNph en líneas celulares de HCC humano
Las células HepG2, Hep3B, SKHep1, SNU398, SNU475 y Alexander se modificaron para expresar el receptor ecotrópico y rtTA3 transduciendo MSCV-RIEP (MSCV-rtTA3-IRES-EcoR-PGK-Puro) seguido de selección de fármaco (1 |jg/mL de puromicina durante 1 semana). Las líneas celulares resultantes se transdujeron con retrovirus TRMPV-Neo-ARNph empacados ecotrópicamente con la cadena principal de miR-30 o miR-E, se seleccionaron con 1 mg/mL de G418 durante 1 semana, y se trataron con 1 jg/m L de dox para inducir la expresión de ARNph. El cambio relativo en las células Venus+dsRed+ (ARNph+) se controló en un Guaba Easycyte (Millipore) mediante ensayos competitivos de proliferación.
Se generaron bibliotecas de plantillas de secuenciación profunda mediante amplificación por PCR de cadenas guía de ARNph como se describió previamente (Zuber J, et al., 2011. Genes Dev 25: 1628-1640). Las bibliotecas se analizaron en un analizador de genoma Illumina a una concentración final de 8 pM; se secuenciaron 50 nucleótidos de la cadena guía usando un cebador personalizado. Para proporcionar una línea base suficiente para detectar el agotamiento de ARNph en muestras experimentales, el experimento tuvo como objetivo adquirir 500 lecturas por ARNph en la muestra T0, que requirió más de veinte millones de lecturas por muestra para compensar las disparidades en la representación de ARNph inherente en la preparación de plásmidos agrupados o introducido por sesgos de PCR. Con estas condiciones, el experimento adquirió líneas base T0 de mas de 500 lecturas para 2246 (99,16% del total) ARNph. El procesamiento de la secuencia se realizó utilizando una plataforma Galaxy personalizada (Taylor J, Schenck I, Blankenberg D, Nekrutenko A. 2007. Using galaxy to perform large-scale interactive data analyses. Curr Protoc Bioinformatics Capítulo 10: Unidad 10 15).
Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)
Los ensayos de ChIP se realizaron como se describió previamente (Bracken AP, et al., Genes Dev (2006) 20: 1123­ 1136). En resumen, se realizó el entrecruzamiento con formaldehído al 1%, y las células se lisaron en tampón SDS. El ADN fue fragmentado por sonicación (Bioruptor). Chip para ARN Pol II se realizó usando un anticuerpo específico (N-20, Santa Cruz Biotechnology). El enriquecimiento de ADN se midió por PCR cuantitativa realizada usando SYBR Green (ABI) en un ViiA 7 (Life Technologies). Cada reacción se realizó por triplicado utilizando cebadores específicos de genes. Cada señal de inmunoprecipitado se referenció con respecto a una serie de diluciones de curva estándar de entrada (inmunoprecipitado/entrada) para normalizar las diferencias en el número de células iniciales y la eficiencia de amplificación del cebador. El índice de pausa, también conocido como relación de desplazamiento, se calculó como la relación entre el ARN Pol II unido al sitio de inicio de la trascripción y el ARN Pol II unido al cuerpo del gen.
Imágenes de PET de animales pequeños
Para los ensayos in vivo, la holo-transferrina humana se marcó con 89Zr. El 89Zr se preparó como se describió previamente (Holland JP, Sheh Y, Lewis JS. 2009. Standardized methods for the production of high specific-activity zirconium-89. Nucl Med Biol 36: 729-739). Se inocularon ratones atímicos hembra desnudos con 5 x 106 a 10 x 106 células reconstituidas en una mezcla 1:1 de medio y Matrigel en el hombro. Después de que los tumores alcanzaron ~500 mm3 , los ratones fueron tratados con PHA-767491 durante 3 días y, 2 días después, se les inyectó 275-300 mCi de 89Zr-holo-transferrina a través de la vena de la cola. En varios puntos de tiempo después de la inyección (24-48 h), los ratones se escanearon usando un escáner MicroPET Focus 120 (Concorde Microsystems). Aproximadamente 5 minutos antes de registrar las imágenes de PET, los ratones fueron anestesiados por inhalación de isoflurano al 1% -2% (Baxter Healthcare) en una mezcla de gas oxígeno y se colocaron en la cama del escáner. La reconstrucción de la imagen y los detalles del procesamiento se han informado en otros lugares (Holland JP et al., J Nucl Med (2010) 51: 1293-1300). Para los estudios de biodistribución, los ratones (n = 5; 10 tumores) fueron sacrificados mediante CO2 a las 48 h después de la inyección, y los órganos se extrajeron de inmediato. La radioactividad en cada órgano se contó junto con una cantidad conocida de 89Zr, los recuentos se correlacionaron con la actividad y se corrigió el decaimiento. Luego se pesaron los órganos y se calculó el porcentaje de la dosis inyectada por gramo (% de la DI/g) en cada tejido.
Inyección hidrodinámica en la vena de la cola
Se preparó una mezcla estéril de solución de NaCI al 0,9%/ plásmido que contenía 5 |jg de ADN de pT3-EFla-Myc y 20 jg de ADN del vector de transposón pT3-EF1a-GFP-miRe junto con la transposasa CMV-SB13 (relación 1:5) para cada inyección. Los ratones FVBN de jAx fueron inyectados con la mezcla de solución de NaCl al 0.9%/ plásmido en la vena lateral de la cola con un volumen total correspondiente al 10% del peso corporal en 5-7 segundos.
Ejemplo 2 : Cribado de ARNi para genes que codifican objetivos de fármacos conocidos
Los efectos inhibidores del crecimiento de varios inhibidores de CDK9 disponibles se han comparado con los efectos antiproliferativos de numerosos ARNph de CDK9 y se identificó un compuesto principal (PHA-767491, un inhibidor dual de CDC7/CDK9) que recapituló más estrechamente la inhibición de CDK9 mediada por ARNph en líneas celulares humanas y murinas. Si bien esta molécula muestra eficacia tanto in vitro como in vivo, dada su estructura extremadamente simple, se puede obtener una mayor potencia, selectividad y farmacodinámica modificando su estructura.
Para obtener inhibidores de CDK9 mejorados para el manejo clínico de tumores que sobreexpresan MYC, se acopló PHA-767491 a la estructura cristalina existente de CDK9 y CDC7 y se identificaron regiones potenciales de la molécula que pueden derivatizarse para mejorar la potencia, la selectividad y farmacodinámica. En este proyecto, se sintetizan varias de estas estructuras, utilizando la Instalación Central de Síntesis Orgánica en MSKCc o, potencialmente, Takeda, y se prueba la potencia y selectividad in vitro utilizando ensayos de quinasas bien establecidos. Las mejores moléculas identificadas se mueven a ensayos de validación basados en células, utilizando la fosforilación de Ser2 de ARN pol II como biomarcador. Se puede proporcionar un panel de líneas celulares de cáncer murino y humano, que exhiben sensibilidad diferencial a los ARNph de CDK9, y es posible comparar las IC50 generadas con las moléculas anteriores para confirmar aún más la selectividad del compuesto. Se pueden emplear ensayos de todo el quinoma tales como KiNativ para confirmar aún más la especificidad de los compuestos identificados in situ. Finalmente, los mejores candidatos se prueban en modelos in vivo establecidos, y utilizando el centro de Evaluación Antitumoral en MSKCC, es posible definir los parámetros farmacodinámicos para estos compuestos.
Los ejemplos de enfoques se basan en el hallazgo de que PHA-767491 es más selectivo para CDK9 que otros inhibidores disponibles. También es posible modificar las estructuras de otros inhibidores de CDK9 previamente identificados.
Al definir la inhibición de CDK9 como un enfoque "anti-MYC" en el presente documento, es posible identificar un criterio de selección de pacientes (MYC alto) y un marcador farmacodinámico (fosforilación de Ser2 de ARN pol II), que puede facilitar en gran medida el desarrollo clínico y preclínico de esta estrategia en cánceres hematológicos y sólidos.
Para probar sistemáticamente los objetivos de fármacos candidatos necesarios para el mantenimiento de HCC, se puede proporcionar una plataforma de cribado y una biblioteca de ARNph para facilitar la identificación de las dependencias de cáncer en un contexto genético definido. Para este sistema de cribado, el experimento estableció un modelo de HCC murino provocado por la sobreexpresión de Myc y la pérdida de p53, que imita dos de los impulsores genéticos más comunes en el HCC humano. Estas células también expresaron un transactivador de tetraciclina inverso (rtTA) que permitió la inducción eficiente de transgenes sensibles a tet introducidos por transferencia génica mediada por retrovirus.
Para centrarse en los genes cuyos productos proteicos pueden ser dirigidos por agentes establecidos, el cribado usó una biblioteca de ARNph personalizada contra 442 genes que codifican objetivos de fármacos conocidos (~6 ARNph/gen) (Figura 1A). Esta lista de objetivos constaba de genes involucrados en el metabolismo, modificaciones de proteínas, transducción de señales y transporte macromolecular (Figura 1B), con un sesgo para receptores y quinasas. Los ARNph se clonaron secuencia de un promotor sensible a la tetraciclina en TRMPV-neo (Figura 1A), un vector de expresión inducible que se optimizó previamente para cribados de ARNi de selección negativa.
La biblioteca se transdujo como un grupo por triplicado en células de HCC murinas; Myc;p53-/- (en adelante, células MP1) con baja multiplicidad de infección (MOI <1). Las células transducidas se cultivaron de tal manera que, en teoría, cada ARNph estaba representado en al menos 1000 células durante todo el experimento (Figura 1C). Después de la selección de G418, se indujeron ARNph mediante la adición de doxiciclina (dox), y los cambios en la representación de ARNph después de 12 días de cultivo se cuantificaron usando secuenciación profunda de cadenas guía de ARNph amplificadas a partir de ADN genómico de células que expresan ARNph clasificadas (Figura 1C). La correlación de las lecturas de ARNph normalizadas presentes en las réplicas a T0 fue cercana a 1 pero disminuyó sustancialmente al comparar T0 y T12 dentro de la misma réplica, lo que sugiere cambios en la representación de la biblioteca asociada con el agotamiento de ARNph (Figura 1D).
Utilizando el criterio de puntuación de un agotamiento promedio de más de 5 veces en tres réplicas independientes, 43 ARNph se agotaron fuertemente (Figura 1E): estas incluyeron todos los ARNph de control positivo dirigidos a genes esenciales (Rpa1, n = 1; Rpa3, n = 5; Pcna, n = 1), así como tres ARNph dirigidos a Myc, el oncogén impulsor en este modelo. Para que un acierto se sometiera a un análisis adicional, se requería que al menos dos ARNph independientes que se dirigían a un gen en particular se identificaran en el cribado primario. Los genes que cumplían estos criterios incluían el componente de proteasoma Psmb2 (subunidad de proteasoma beta tipo 2), el factor de replicación Mcm6 (componente 6 del complejo de mantenimiento de minicromosomas) y el factor de alargamiento de la transcripción CDK9 (quinasa 9 dependiente de ciclina).
Ejemplo 3: Ensayo de inhibición competitiva
Para identificar objetivos cuya inhibición mostró efectos antiproliferativos selectivos en células cancerosas, se validaron los aciertos positivos anteriores en las células MP1 utilizadas en el cribado, y luego aquellos que mostraron un efecto similar sobre fibroblastos de embriones de ratón inmortalizados no transformados (iMEF) fueron filtrados. Los ARNph dirigidos a Rpa3, un gen esencial, y Myc, el conductor oncogénico en la línea celular MP1cribada, se usaron como controles positivos; se usó ARNph de luciferasa de Renilla como control negativo. Todos los ARNph seleccionados produjeron una desventaja competitiva en las células MP1 (Figura 2A), lo que confirma que el rendimiento del cribado y los criterios de selección fueron suficientes para eliminar los eventos falsos positivos. Además, cada ARNph validado mostró una inactivación sustancial de la proteína deseada, lo que indica que los fenotipos observados se debieron a efectos sobre el objetivo (Figura 2B).
Los ARNph dirigidos a Mcm6 y Psmb2 inhibieron los iMEF y las células MP1 en un grado similar, lo que sugiere que la inhibición de sus proteínas objetivo fue generalmente letal, muy similar al ARNph de control de Rpa3 (Figuras 2C y 2D). Por el contrario, los ARNph de CDK9 mostraron una capacidad reducida para inhibir la proliferación en iMEF en comparación con las células MP1 (Figuras 2C y 2D), un efecto que fue similar al ARNph de Myc y no pudo explicarse por las diferencias en las tasas de proliferación de los iMEF y las células MP1 o en la inactivación del ARNph (Figuras 2B y 2D). Debido a esta especificidad evidente, CDK9 se convirtió en candidato para un análisis más detallado.
Para confirmar que el impacto de la inhibición de CDK9 sobre la proliferación de células cancerosas no se limitó a una línea experimental de h Cc , se estudiaron líneas celulares murinas y humanas adicionales modificadas para expresar rtTA3 para permitir la inducción de ARNph dependiente de dox. Los ARNph de control (Renilla y Myc) y CDK9 se subclonaron en miR-E, una cadena principal optimizada basada en miR-30 que aumenta la eficiencia de inactivación, particularmente para aquellos ARNph con potencia intermedia. Las tres líneas celulares de HCC murinas experimentales que sobreexpresaron Myc fueron sensibles a la inhibición de CDK9, mientras que las células de HCC murinas que expresan células mutantes de hepatoma KrasG12D, Hepa1-6, fibroblastos NIH-3T3 e iMEF mostraron sensibilidad moderada o nula (Figura 2E). De manera similar, las líneas celulares de HCC humanas mostraron un intervalo de respuestas a los ARNph de CDK9 humanos, siendo algunas altamente sensibles y otras más resistentes (Figura 2F). Nuevamente, estas respuestas diferenciales fueron independientes de las tasas de proliferación de varias líneas celulares y del alcance de la inactivación de CDK9. Juntos, estos resultados indican que la inhibición farmacológica de CDK9 puede tener un efecto terapéutico contra ciertos tipos de cáncer, tal como HCC, leucemia, linfoma y NSCLC.
Los inhibidores de CDK9 disponibles cuya biología está más estrechamente relacionada con la inhibición de CDK9 pueden mostrar un espectro de actividad similar a los ARNph de CDK9. La IC50 de varios inhibidores de CDK9 se comparó con los efectos antiproliferativos de los ARNph de CDK9 en ensayos de proliferación competitivos (Figuras 2E y 2F). Después de probar cuatro inhibidores de CDK9 diferentes, los resultados identificaron PHA-767491, un inhibidor dual de quinasa de CDK9 y CDC7 (ciclo de división celular 7), la inhibición de CDK9 mediada por ARNph más recapitulada en líneas celulares humanas y murinas (Figuras 3A-3C). En particular, se requiere CDC7 en complejos con su regulador alostérico, DBF4, para iniciar la replicación del ADN. Sin embargo, la exposición de las células a la afidicolina, un inhibidor de la ADN polimerasa, no imitaba los efectos de los ARNph de CDK9 (Figura 3A). Por el contrario, los ARNph dirigidos a Ciclina T1 (CCNT1), un regulador alostérico obligado de la quinasa CDK9, recapitularon los resultados obtenidos con los ARNph de CDK9 (Figura 3D), destacando así la especificidad de estos resultados.
Se evaluó el efecto de PHA-767491 en líneas celulares de HCC humanas adicionales (Figuras 3B y 3C), y se observó una amplia actividad antiproliferativa en las líneas celulares más sensibles (IC50 < 2 |jM) (Figura 3E). El tratamiento con PHA-767491 desencadenó la detención del ciclo celular, similar a los efectos de los ARNph de CDK9 (Figura 3E); sin embargo, los efectos antiproliferativos mediados por PHA-767491 fueron más pronunciados. Es de destacar que dos líneas celulares no transformadas fueron consistentemente menos sensibles al tratamiento con PHA-767491 (Figuras 3B y 3C), lo que respalda aún más la mayor sensibilidad de ciertas células cancerosas a la inhibición de CDK9. Si bien algunos de estos fenotipos pueden deberse a la inhibición de CDC7, la correlación significativa entre la IC50 de PHA-767491 y los efectos antiproliferativos de los ARNph de CDK9 implica que un componente principal de la actividad de PHA-767491 es a través de la inhibición de CDK9. Estos datos ilustran cómo el uso de ARNi e inhibidores de moléculas pequeñas como enfoques ortogonales puede ayudar a la validación del objetivo e indica que se puede requerir CDK9 para la proliferación de HCC.
Ejemplo 4: Predicción de la respuesta a la inhibición de CDK9
Como el sistema de cribado fue provocado por la pérdida de p53 y la sobreexpresión de Myc, las alteraciones en cualquiera de los genes podrían determinar la sensibilidad a la inhibición de c DK9. Los datos sobre la sensibilidad relativa de las líneas celulares de HCC con respecto a la inhibición de CDK9 (medida como los efectos inhibidores del crecimiento de los ARNph de CDK9 en ensayos de proliferación competitivos o la IC50 de PHA-767491) se referenciaron de forma cruzada con respecto a los perfiles mutacionales y de expresión génica de las mismas líneas celulares disponibles en la Cáncer Cell Line Encyclopedia (CCLE). La referencia cruzada no encontró correlación entre la respuesta antiproliferativa a la inhibición de CDK9 y la expresión o estado mutacional de p53, de acuerdo con los hallazgos previos que indican que PHA-767491 inhibe la proliferación de células cancerosas a través de mecanismos independientes de p53. Sin embargo, hubo una correlación altamente significativa entre la respuesta a la inhibición de CDK9 y la expresión de ARNm de MYC (Figuras 4A y 4B), un efecto que se confirmó por inmunotransferencia para la proteína de MYC (Figura 4C). Esta correlación significativa no se limitó a las líneas celulares de HCC sino que también se observó en un panel de líneas celulares de cáncer de pulmón y hematopoyético (Figura 4A). En todos los casos, no se observó correlación entre la sensibilidad a la inhibición de CDK9 y las tasas de proliferación relativas de líneas celulares individuales, ni la sensibilidad se relacionó con la amplificación de MYC, lo que indica que la expresión de MYC, en lugar del estado de amplificación de MYC, está asociada con la respuesta a los inhibidores de c DK9.
Los perfiles transcripcionales de las 10 líneas celulares de HCC humanas con sensibilidades definidas a PHA-767491 también se sometieron a análisis de enriquecimiento de grupos de genes (GSEA) y análisis de ontología génica (GO) para señalar genes y procesos que podrían subyacer a su sensibilidad diferencial. Este análisis reveló una correlación significativa entre la baja IC50 (sensibilidad a la inhibición de CDK9) y cuatro firmas transcripcionales canónicas de genes dependientes de MYC (Figura 4D), y una firma génica que define una subclase de pacientes con HCC caracterizada por la activación de MYC y AKT (Figura 4E). Por el contrario, hubo una correlación inversa entre una firma de expresión génica relacionada con una subclase diferente de pacientes con HCC con activación de la vía WNT y sensibilidad al fármaco. MYC es un regulador global de la expresión génica que afecta la transcripción general, la biogénesis ribosómica, la traducción de proteínas y el metabolismo celular, y curiosamente los transcritos sobrerrepresentados en células sensibles en comparación con las resistentes se vincularon con la "expresión génica", el "proceso metabólico del ARN" y el "procesamiento del ARN" (Figura 4F). Tomados en conjunto, estos resultados indican que CDK9 podría ser crucial para el mantenimiento de tumores que sobreexpresan MYC e identifican una población potencial de pacientes que podría ser sensible a la inhibición de CDK9.
Después del inicio de la transcripción, el ARN pol II queda atrapado cerca del promotor de muchos genes, un proceso conocido como pausa del promotor proximal. Para una transcripción productiva, se recluta P-TEFb y CDK9 fosforila Ser2 en el dominio del extremo terminal C (CTD) de ARN pol II, induciendo la liberación de pausa y el alargamiento de la transcripción posterior. MYC ha demostrado previamente que participa en el alargamiento de la transcripción al regular este mecanismo de liberación de pausa. Por lo tanto, en las células tumorales que sobreexpresan MYC, MYC se acumula en la región promotora de muchos genes transcripcionalmente activos, reclutando el complejo P-TEFb y amplificando la transcripción de genes objetivo MYC.
Para explorar el papel de CDK9 en la amplificación transcripcional mediada por MYC, se investigaron los efectos de la inhibición de CDK9 en dos líneas celulares de HCC humanas, HepG2 y Alexander, que expresan diferentes niveles de MYC (Figura 4C). Como se esperaba, la supresión farmacológica o mediada por ARNi de CDK9 condujo a una disminución de la fosforilación de Ser2 en ambas líneas celulares. Con el fin de investigar si estos cambios se correlacionan con los cambios en el alargamiento de la transcripción, la investigación calculó el índice de pausa o la relación de desplazamiento en la que la relación de la densidad de unión de ARN Pol II en la región del promotor proximal se compara con la del cuerpo del gen. En las células HepG2 que expresan altos niveles de MYC, la inhibición de CDK9 (utilizando moléculas pequeñas o ARNph) o MYC causó una represión significativa del alargamiento de la transcripción de NPM1 y MCM4, dos objetivos de MYC seleccionados y un aumento en su índice de pausa (Figuras 5A-5C). Sin embargo, no se observaron cambios para BRG1, cuya transcripción no se ve afectada por MYC. Por el contrario, en las células Alexander que expresan niveles de MYC mucho más bajos, el índice de pausa en los genes NPM1 y MCM4 ya era alto en las células no tratadas y no cambió sustancialmente después de la inhibición de CDK9 o MYC (Figura 5C). En consecuencia, la inhibición de CDK9 o MYC redujo los niveles de ARNm de genes objetivo MYC en células HepG2 pero no en células Alexander (Figura 5D). Juntos, estos resultados indican que CDK9 regula el alargamiento de la transcripción de los objetivos de MYC, NPM1 y MCM4 en el contexto de alta expresión de MYC, y que los inhibidores de CDK9 pueden revertir estos efectos.
Ejemplo 5: Ensayos de proliferación competitiva
MYC se ha implicado en la replicación del ADN, la activación transcripcional, el alargamiento de la transcripción y otros procesos, aunque la contribución relativa de cada proceso al inicio y mantenimiento del tumor no se conoce bien. A pesar de la diversidad de factores involucrados en estos procesos, los ARNph de CDK9 y MYC mostraron patrones de agotamiento similares en múltiples líneas (Figuras 2E y 2F) y, de hecho, hubo una correlación significativa entre los efectos antiproliferativos de los ARNph de CDK9 y MYC en ensayos de proliferación competitiva (Figura 6A). Una correlación similar existió entre los efectos antiproliferativos de los ciclos de ciclina T1 y los ARNph de Myc (Figura 6B).
Para determinar directamente si la modulación de la actividad de MYC podría influir en la dependencia celular de la actividad de CDK9, el experimento probó la capacidad de la expresión forzada de MYC para influir en la sensibilidad a la inhibición de CDK9. La expresión ectópica de MYC en las células Alexander con MYC bajo produjo niveles de MYC ~ 50% de los medidos en células HepG2 sensibles y un aumento en el alargamiento de la transcripción dependiente de MYC medido por un índice de pausa reducido en los genes NPM1 y MCM4 pero no BRG1 (Figuras 6C y 6D). Este efecto sobre el alargamiento de la transcripción estuvo acompañado por aumentos significativos en los ARNm de NPM1 y MCM4 (Figura 6E), mientras que los niveles de ARNm de BRG1 no cambiaron (Figura 6E).
Concordantemente, las células Alexander que sobreexpresan MYC se volvieron más sensibles a la inhibición de CDK9 por los ARNph de PHA-767491 o CDK9 (Figura 6F). Si bien la expresión forzada de MYC en estas células no produjo la misma sensibilidad que las células HepG2 con alta expresión de MYC, la expresión forzada de MYC en las células SNU-475 logró niveles de MYC equivalentes a los observados en las células HepG2 (Figura 6C) y produjo una sensibilidad similar a PHA-767491 (Figuras 6F y 6G). Las similitudes fenotípicas entre la inhibición de MYC y la inhibición de CDK9/CCNT indican un papel clave para el alargamiento de la transcripción en la mediación de la acción de MYC en el mantenimiento del tumor.
Ejemplo 6 : La supresión mediada por ARNi de CDK9 se aproxima al efecto de la inhibición de Myc en la obtención de efectos antitumorales en HCC in vivo
Para suprimir CDK9 en tumores establecidos en ratones, se transdujeron células de HCC murinas MP1 con Luciferasa y constructos TRMPV-Neo-miR-E inducibles por dox que contenían ARNph de CDK9 o ARNph de control (Renilla y Myc), y se trasplantaron a los hígados de ratones receptores por inyección subcapsular. Tras la detección de una señal luminiscente, los animales fueron aleatorizados y tratados con dox para inducir la expresión de ARNph. Los tumores con ARNph de CDK9 exhibieron una disminución prominente en los niveles de fosforilación de Ser2 del ARN pol II, lo que implica que el alargamiento de la transcripción fue reprimido de manera eficiente (Figura 7A). Para el día 8, las imágenes bioluminiscentes revelaron que los ratones del grupo no tratado (sin dox) mostraron tumores hepáticos grandes; sin embargo, la inactivación de CDK9 o Myc condujo a un retraso comparable y significativo en el crecimiento tumoral (Figuras 7B y 7C). La tinción con Ki67 de secciones histológicas reveló que los tumores que expresan ARNph para CDK9 o Myc mostraron menos proliferación en comparación con los tumores que expresan ARNph de Renilla de control (Figura 7D). Por lo tanto, la supresión mediada por ARNi de CDK9 se aproxima al efecto de la inhibición de Myc en la obtención de efectos antitumorales en HCC in vivo.
También se investigaron los efectos inhibidores del crecimiento de la inhibición farmacológica de CDK9 en una serie de xenoinjertos de HCC humanos que expresan luciferasa. El tratamiento con PHA-767491 (50 mg/kg; dos veces al día; 5 días por semana) o vehículo se inició al detectar la bioluminiscencia. De acuerdo con hallazgos anteriores, el tratamiento con PHA-767491 fue bien tolerado en ratones y provocó una disminución en la fosforilación de Pol2 Ser2 en los tumores emergentes (Figura 7E). En las células HepG2 con alta expresión de MYC, PHA-767491 también disminuyó la proliferación de células tumorales, lo que se asoció con una inhibición sustancial del crecimiento tumoral y algunas regresiones tumorales (Figuras 7F-7H). Por marcado contraste, el mismo tratamiento en células Alexander con baja expresión de MYC produjo poco o ningún efecto, a pesar de la disminución detectable en la fosforilación de Pol2 Ser2 (Figuras 7E-7H). Por lo tanto, se requiere CDK9 para el mantenimiento de HCC que sobreexpresa MYC, lo que implica que el alargamiento transcripcional es importante para la dependencia de MYC in vivo.
Ejemplo 7 : Regeneración hepática para revelar el índice terapéutico asociado con la inhibición de CDK9 in vivo
Se inyectaron vectores de transposón de ARNph miRE en ratones junto con transposasa CMV-SB13 mediante inyección hidrodinámica en la vena de la cola y se realizó una hepatectomía parcial después de una semana (Figura 8). La relación hígado/cuerpo y el porcentaje de GFP de los ratones se examinaron después de dos semanas. La inhibición de CDK9 no muestra un impacto significativo en la relación hígado/cuerpo, en comparación con Ren.713E (control neutral). La inhibición de CDK9 no muestra un impacto significativo en el porcentaje de células GFP+ antes y después de la hepatectomía parcial.
Ejemplo 8: Modelos de ratones con ARNi transgénicos inducibles y reversibles
Los ARNph miRE provocados por TRE se dirigen al locus ColA1 para provocar la inactivación de genes dependientes de doxiciclina (dox) en células ES, tejidos embrionarios y adultos del ratón (Figura 9). No hay diferencia significativa de la apariencia entre los ratones.

Claims (4)

REIVINDICACIONES
1. Un inhibidor de CDK9, seleccionado del grupo que consiste en PHA-767491, DRB, SNS-032, flavopiridol y ARNph contra CDK9, para usar en el tratamiento del cáncer en un sujeto que sobreexpresa MYC en el que el cáncer es carcinoma hepatocelular.
2. El inhibidor de CDK9 para uso de acuerdo con la reivindicación 1, comprendiendo el uso además administrar una cantidad efectiva de un segundo agente quimioterapéutico al paciente.
3. El inhibidor de CDK9 para uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el segundo agente quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste en un taxano, tenipósido, gemcitabina, dacarbazina, flumequina, sorafenib, atorvastatina, tivantinib, sunitinib, crizotinib y una antraciclina.
4. Un método para determinar la sensibilidad al tratamiento del cáncer en un paciente que padece cáncer, comprendiendo el método:
determinar la presencia de sobreexpresión de MYC en una muestra biológica del paciente, en la que la presencia de sobreexpresión de MYC indica una sensibilidad a un tratamiento por un inhibidor de CDK9 seleccionado del grupo que consiste en PHA-767491, DRB, SNS-032, flavopiridol y ARNph contra CDK9, en el que el cáncer es carcinoma hepatocelular.
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