ES2770616T3

ES2770616T3 - Proceso biológico para la producción de un compuesto fenólico sulfatado

Info

Publication number: ES2770616T3
Application number: ES15754200T
Authority: ES
Inventors: Christian Bille Jendresen; Alex Toftgaard Nielsen
Original assignee: Cysbio Aps
Current assignee: Cysbio Aps
Priority date: 2014-08-22
Filing date: 2015-08-21
Publication date: 2020-07-02
Anticipated expiration: 2035-08-21
Also published as: EP3663406A1; US20200354758A1; EP3183355A1; US11390894B2; PT3183355T; US20220325306A1; US20170226543A1; WO2016026976A1; EP3183355B1; HUE047658T2; PL3183355T3; DK3183355T3

Abstract

Un proceso para la producción de un compuesto fenólico sulfatado, que comprende: (i') poner en contacto un medio que comprende un compuesto fenólico con una primera célula hospedadora recombinante; o (i") poner en contacto un medio que comprende un sustrato de carbono fermentable con una primera célula hospedadora recombinante; o (i''') poner en contacto un medio que comprende un precursor de un compuesto fenólico con una primera célula hospedadora recombinante; en donde la primera célula hospedadora recombinante comprende un polipéptido heterólogo que tiene una actividad aril sulfotransferasa, y en donde la primera célula hospedadora recombinante ha sido modificada adicionalmente para tener una expresión proteica aumentada de (i) una ATP sulfurilasa, (ii) una APS quinasa y/o (iii) una PAP fosfatasa en comparación con una célula hospedadora idéntica que no lleva dicha modificación.

Description

DESCRIPCIÓN

Proceso biológico para la producción de un compuesto fenólico sulfatado

Campo técnico de la invención

La presente invención generalmente se refiere al campo de la biotecnología, ya que se aplica a la producción de un compuesto fenólico sulfatado usando polipéptidos o células recombinantes que comprenden dichos polipéptidos. También, la presente invención se refiere a células hospedadoras recombinantes que expresan dichos polipéptidos y composiciones que comprenden tales células hospedadoras.

Antecedentes de la invención

Una gama de compuestos fenólicos son de gran interés para la industria biotecnológica, ya que son componentes básicos para los compuestos poliméricos. Los ejemplos de tales compuestos fenólicos incluyen ácido p-cumárico (pHCA) u otros ácidos hidroxicinámicos que forman la base de muchos metabolitos secundarios, incluyendo flavonoides y estilbenos. Sin embargo, muchos de estos compuestos fenólicos son tóxicos para los organismos productores y, por tanto, limitan la productividad durante la fermentación. Por tanto, existe la necesidad de procesos de producción a gran escala, y especialmente procesos de producción biológicos a gran escala que permitan una productividad mejorada.

Además, una gama de compuestos fenólicos, y especialmente aquellos utilizados como medicamentos o aditivos alimentarios como resveratrol o vainillina, muestran poca solubilidad en agua, lo que dificulta que el cuerpo absorba estos compuestos. Por tanto, también es necesario proporcionar tales compuestos fenólicos en una forma que mejore la solubilidad y, por tanto, la biodisponibilidad, preferentemente mediante el uso de procesos biológicos de producción a gran escala.

Que las sulfotransferasas están implicadas en la sulfatación de, por ejemplo, ácidos hidroxicinámicos se desvela, por ejemplo, en Biofactors, vol. 39,2013, pp. 644-651 de Wong et al.

Sumario de la invención

El objetivo de la presente invención es proporcionar un método para la producción a gran escala de compuestos fenólicos sulfatados (sulfatos de arilo). Adicionalmente, Un objetivo es proporcionar un proceso biológico para la producción a gran escala de fenoles. Los inventores han desarrollado un proceso biológico con el que se logran ambos objetivos.

La presente invención proporciona así en un primer aspecto un proceso para la producción de un compuesto fenólico sulfatado que comprende:

(i') poner en contacto un medio que comprende un compuesto fenólico con una primera célula hospedadora recombinante; en donde la primera célula hospedadora recombinante comprende un polipéptido heterólogo que tiene una actividad aril sulfotransferasa; o

(i") poner en contacto un medio que comprende un sustrato de carbono fermentable con una primera célula hospedadora recombinante; en donde la primera célula hospedadora recombinante comprende un polipéptido heterólogo que tiene una actividad aril sulfotransferasa; o

(i''') poner en contacto un medio que comprende un precursor de un compuesto fenólico con una primera célula hospedadora recombinante; en donde la primera célula hospedadora recombinante comprende un polipéptido heterólogo que tiene una actividad aril sulfotransferasa, y en donde la primera célula hospedadora recombinante se ha modificado además para tener una expresión proteica aumentada de (i) una ATP sulfurilasa, (ii) una APS quinasa y/o (iii) una PAP fosfatasa en comparación con una célula hospedadora idéntica que no lleva dicha modificación.

En un aspecto adicional la presente invención proporciona un proceso para la producción de un compuesto fenólico sulfatado, como ácido zostérico, el método comprende sulfatar un compuesto fenólico, como ácido p-cumárico, usando un polipéptido como se detalla en este documento. Particularmente, el proceso implica el uso de un polipéptido que tiene una actividad aril sulfotransferasa, tal como un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 (por ejemplo, SEQ ID NO: 1);

b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 70 %, como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 (por ejemplo, SEQ ID NO: 1); o

c) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 (por ejemplo, SEQ ID NO: 1), en donde 1 a 50, como 1 a 40, 1 a 35, 1 a 30, 1 a 25, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 1 a 3, restos de aminoácido están sustituidos, eliminados y/o insertados.

La presente invención proporciona en un aspecto adicional una célula hospedadora recombinante como se detalla en este documento. Particularmente, la presente invención proporciona una célula hospedadora recombinante que comprende (por ejemplo, expresa) un primer polipéptido heterólogo que tiene una actividad aril sulfotransferasa, tal como un polipéptido heterólogo seleccionado del grupo que consiste en:

c) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 (por ejemplo, SEQ ID NO: 1), en donde 1 a 50, como 1 a 40, 1 a 35, 1 a 30, 1 a 25, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 1 a 3, restos de aminoácido están sustituidos, eliminados y/o insertados, en donde la célula hospedadora se ha modificado adicionalmente para tener una expresión proteica aumentada de (i) una ATP sulfurilasa, (ii) una APS quinasa y/o (iii) una PAP fosfatasa en comparación con una célula hospedadora idéntica que no lleva dicha modificación.

La presente divulgación proporciona en un aspecto adicional el uso de un polipéptido como se detalla en este documento en la sulfatación de un compuesto fenólico. Particularmente, la divulgación proporciona el uso de un polipéptido que tiene una actividad aril sulfotransferasa en la sulfatación de un compuesto fenólico, tal como un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

La presente invención proporciona en un aspecto adicional una composición que comprende una primera célula hospedadora recombinante como se detalla en este documento y una segunda célula hospedadora recombinante como se detalla en este documento. Particularmente, la presente invención proporciona una composición que comprende una primera célula hospedadora recombinante que comprende (por ejemplo, que expresa) un polipéptido heterólogo que tiene una actividad aril sulfotransferasa, tal como un polipéptido heterólogo seleccionado del grupo que consiste en:

c) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 (por ejemplo, SEQ ID NO: 1), en donde 1 a 50, como 1 a 40, 1 a 35, 1 a 30, 1 a 25, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 1 a 3, restos de aminoácido están sustituidos, eliminados y/o insertados, en donde la célula hospedadora se ha modificado adicionalmente para tener una expresión proteica aumentada de (i) una ATP sulfurilasa, (ii) una APS quinasa y/o (iii) una PAP fosfatasa; y

una segunda célula hospedadora recombinante que comprende (por ejemplo, que expresa) un polipéptido heterólogo que tiene actividad tirosina amoniaco liasa, tal como un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

d) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 (por ejemplo, SEQ ID NO: 14);

e) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 (por ejemplo, SEQ ID NO: 14); o f) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 (por ejemplo, SEQ ID NO: 14), en donde 1 a 50, como 1 a 40, 1 a 35, 1 a 30, 1 a 25, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 1 a 3, restos de aminoácido están sustituidos, eliminados y/o insertados.

Además se desvela una composición que comprende un primer polipéptido y un segundo polipéptido. Particularmente, la presente invención proporciona una composición que comprende un primer polipéptido que tiene una actividad aril sulfotransferasa, tal como un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

c) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 (por ejemplo, SEQ ID NO: 1), en donde 1 a 50, como 1 a 40, 1 a 35, 1 a 30, 1 a 25, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 1 a 3, restos de aminoácido están sustituidos, eliminados y/o insertados; y

una segunda actividad del polipéptido tirosina amoniaco liasa, tal como un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

e) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 70 %, como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 (por ejemplo, SEQ ID NO: 14); o

f) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 (por ejemplo, SEQ ID NO: 14), en donde 1 a 50, como 1 a 40, 1 a 35, 1 a 30, 1 a 25, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 1 a 3, restos de aminoácido están sustituidos, eliminados y/o insertados.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Mapa del plásmido para la expresión de SULT1A1 de Rattus norvegicus en Escherichia coli

Figura 2: Mapa del plásmido para la sobreexpresión de cysDNC en E. coli.

Figura 3: Mapa del plásmido para la sobreexpresión de cysDNCQ en E. coli.

Figura 4: Mapa del plásmido para la expresión de RmXAL de Rhodotorula mucilaginosa / Rhodotorula rubra en E. coli.

Figura 5: Toxicidad de productos no sulfatados o sulfatados

Figura 6: Mapa del plásmido para la expresión de tirosina amoniaco-liasa RsTAL de Rhodobacter sphaeroides en E. coli.

Figura 7: Mapa del plásmido para la expresión de tirosina amoniaco-liasa FjTAL de Flavobacterium johnsoniae en E. coli.

Figura 8: Mapa del plásmido para la expresión de tirosina amoniaco-liasa RcTAL de Rhodobacter capsulatus en E. coli.

Figura 9: Mapa del plásmido para la expresión de SULT1A1 de Rattus norvegicus en Saccharomyces cerevisiae (gen nativo).

Figura 10: Mapa del plásmido para la expresión de SULT1A1 de Rattus norvegicus en Saccharomyces cerevisiae (gen optimizado con codón).

Descripción detallada de la invención

Salvo que se defina específicamente en este documento, todos los términos técnicos y científicos utilizados tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto en los campos de bioquímica, genética y biología molecular.

Todos los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento se pueden usar en la práctica o el ensayo de la presente invención, con métodos y materiales adecuados que se describen en este documento.

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están dentro de la experiencia en la materia. Tales técnicas se explican por completo en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEl , 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tercera edición, (Sambrook et al, 2001, Cold Spring Harbor, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. Patente de Estados Unidos N.° 4.683.195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries y S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames y S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); la serie, Methods In ENZYMOLOGY (J. Abelson y M. Simon, eds.-in-chief, Academic Press, Inc., Nueva York), específicamente, vol. 154 y 155 (Wu et al. eds.) y vol. 185, "Gene Expression Technology" (D. Goeddel, ed.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller y M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer y Walker, eds., Academic Press, Londres, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volúmenes I-IV (D. M. Weir y C. C. Blackwell, eds., 1986); y Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986).

Polipéptidos y células hospedadoras

Como se ha indicado anteriormente, la presente invención utiliza polipéptidos que tienen actividad aril sulfotransferasa (EC:2.8.2.1). Esto los hace particularmente adecuados para la sulfatación de compuestos fenólicos como ácido pcumárico y sus derivados (por ejemplo, ácido cafeico, ácido ferúlico o ácido sinápico), o resveratrol.

El polipéptido que tiene actividad aril sulfotransferasa puede ser una enzima sulfotransferasa 1A1, una enzima sulfotransferasa 1A2, una enzima sulfotransferasa 1A3, una enzima sulfotransferasa 1B1, una enzima sulfotransferasa 1C1, una enzima sulfotransferasa 1C2, una enzima sulfotransferasa 1C4, o una enzima sulfotransferasa 1E1. Según determinadas realizaciones, el polipéptido que tiene actividad aril sulfotransferasa es una enzima sulfotransferasa 1A1. Según ciertas otras realizaciones, el polipéptido que tiene actividad aril sulfotransferasa es una enzima sulfotransferasa 1A2. Según determinadas realizaciones, el polipéptido que tiene actividad aril sulfotransferasa es una enzima sulfotransferasa 1B1. Según determinadas realizaciones, el polipéptido que tiene actividad aril sulfotransferasa es una enzima sulfotransferasa 1C1. Según determinadas realizaciones, el polipéptido que tiene actividad aril sulfotransferasa es una enzima sulfotransferasa 1C2. Según determinadas realizaciones, el polipéptido que tiene actividad aril sulfotransferasa es una enzima sulfotransferasa 1C4. Según otras ciertas realizaciones, el polipéptido que tiene actividad aril sulfotransferasa es una enzima sulfotransferasa 1E1 (estrógeno sulfotransferasa), como la sulfotransferasa 1E1 de Gallus gallus domesticus.

Según determinadas realizaciones, el polipéptido que tiene actividad aril sulfotransferasa es una aril sulfotransferasa de mamífero, como una enzima sulfotransferasa ¹A ¹de mamífero.

Según determinadas realizaciones, el polipéptido que tiene actividad aril sulfotransferasa es una aril sulfotransferasa de Rattus norvegicus o una variante de la misma. Dicha variante tiene al menos el 70 %, como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la aril sulfotransferasa de Rattus norvegicus. Dicha variante también puede tener una secuencia de aminoácidos de la sulfotransferasa de Rattus norvegicus, en donde 1 a 50, como 1 a 40, 1 a 35, 1 a 30, 1 a 25, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 1 a 3, restos de aminoácido están sustituidos, eliminados y/o insertados.

Se entiende que los valores anteriores definen generalmente el número total de alteraciones a la aril sulfotransferasa de referencia. Las alteraciones pueden ser únicamente sustituciones de aminoácidos, ya sean sustituciones conservadas o no conservadas, o ambas. Pueden ser únicamente deleciones de aminoácidos. Pueden ser únicamente inserciones de aminoácidos. Las alteraciones pueden ser una mezcla de estas alteraciones específicas, como sustituciones de aminoácidos e inserciones de aminoácidos.

Según determinadas realizaciones, el polipéptido que tiene actividad aril sulfotransferasa puede ser un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

Según determinadas realizaciones, un polipéptido para uso en la invención es un polipéptido según a). Por tanto, un polipéptido para uso en la invención puede ser un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 (por ejemplo, SEQ ID NO: 1). Según realizaciones particulares, un polipéptido según a) comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1. Según otras realizaciones particulares, un polipéptido según a) comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2. Según aún otras realizaciones particulares, un polipéptido según a) comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 3. Según aún otras realizaciones particulares, un polipéptido según a) comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 4. Según aún otras realizaciones particulares, un polipéptido según a) comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 5. Según otras realizaciones particulares, un polipéptido según a) comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 6. Según otras realizaciones particulares, un polipéptido según a) comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 7. Según otras realizaciones particulares, un polipéptido según a) comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 8. Según otras realizaciones particulares, un polipéptido según a) comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 9. Según otras realizaciones particulares, un polipéptido según a) comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 10. Según otras realizaciones particulares, un polipéptido según a) comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 11. Según otras realizaciones particulares, un polipéptido según a) comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 12. Según otras realizaciones particulares, un polipéptido según a) comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 13.

Según otras ciertas realizaciones, un polipéptido para uso en la invención es un polipéptido según b). Por tanto, un polipéptido para uso en la invención puede ser un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 70 %, como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 (por ejemplo, SEQ ID NO: 1). Según realizaciones particulares, un polipéptido según b) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 80 %, como al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 (por ejemplo, SEQ ID NO: 1). Según otras realizaciones particulares, un polipéptido según b) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, como al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 (por ejemplo, SEQ ID NO: 1). Según otras realizaciones particulares, un polipéptido según b) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 90 %, como al menos aproximadamente el 93 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 (por ejemplo, SEQ ID NO: 1). Según otras realizaciones particulares, un polipéptido según b) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 95 %, como al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 (por ejemplo, SEQ ID NO: 1).

Según realizaciones particulares, un polipéptido según b) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 70 %, como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1. Según realizaciones más particulares, un polipéptido según b) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 80 %, como al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1. Según otras realizaciones más particulares, un polipéptido según b) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, como al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1. Según otras realizaciones más particulares, un polipéptido según b) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 90 %, como al menos aproximadamente el 93 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1. Según otras realizaciones más particulares, un polipéptido según b) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 95 %, como al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1.

Preferentemente, un polipéptido según b) tiene actividad aril sulfotransferasa. Más preferentemente, un polipéptido según b) tiene una actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 (por ejemplo, SEQ ID NO: 1).

Según cierta realización, un polipéptido según b) tiene una actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1. Según ciertas otras realizaciones, un polipéptido según b) tiene una actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2. Según ciertas otras realizaciones, un polipéptido según b) tiene una actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 3. Según ciertas otras realizaciones, un polipéptido según b) tiene una actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 4. Según ciertas otras realizaciones, un polipéptido según b) tiene una actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 5. Según ciertas otras realizaciones, un polipéptido según b) tiene una actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 6. Según ciertas otras realizaciones, un polipéptido según b) tiene una actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 7. Según ciertas otras realizaciones, un polipéptido según b) tiene una actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 8. Según ciertas otras realizaciones, un polipéptido según b) tiene una actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 9. Según ciertas otras realizaciones, un polipéptido según b) tiene una actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 10. Según ciertas otras realizaciones, un polipéptido según b) tiene una actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 11. Según ciertas otras realizaciones, un polipéptido según b) tiene una actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 12. Según ciertas otras realizaciones, un polipéptido según b) tiene una actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 13.

Con actividad aril sulfotransferasa "similar", se entiende que el polipéptido según b) tiene al menos aproximadamente el 10 %, como al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 100 %, al menos aproximadamente el 200 %, al menos aproximadamente el 300 %, al menos aproximadamente el 400 %, al menos aproximadamente el 500 %, al menos aproximadamente el 800 %, al menos aproximadamente el 1000 % o al menos aproximadamente el 2000 %, de la actividad aril sulfotransferasa del polipéptido de referencia (por ejemplo, SEQ ID NO: 1).

La actividad aril sulfotransferasa se puede determinar, por ejemplo, según el siguiente método: La actividad aril sulfotransferasa puede determinarse por la reacción de PAPS marcado radiactivamente con azufre, [35S]PAPS, con el sustrato en presencia del polipéptido de interés. Esto fue descrito anteriormente, por ejemplo por Hattori et al. (Biosci Biotechnol Biochem. 2008; 72(2):540-7). La reacción tiene lugar en un tampón como 250 pl de fosfato sódico 50 mM, pH 6,8 con [35S]PAPS 1 pM (3,7kBq) con compuesto aceptor 100 pM durante un periodo de 30 min a 30 °C. La reacción se detiene mediante la adición de 100 pl de una mezcla 1:1 de acetato de bario 0,1 M e hidróxido de bario. Se añaden 50 pl de sulfato de cinc 0,1 M, seguido de centrifugación a 1.200 x g durante 5 min. Luego se transfieren 300 pl del sobrenadante a un nuevo recipiente y se añaden 50 pl de un volumen igual de hidróxido de bario 0,1 M y sulfato de cinc 0,1 M. La mezcla se centrifuga luego a 13.000 x g durante 5 min, y se mezclan alícuotas de 300 pl del sobrenadante con 2,5 ml de Cleasol I (Nacalai Tesque, Kyoto, Japón). La radiactividad se mide luego por centelleo.

Alternativamente, la actividad de una sulfotransferasa se puede detectar mediante la medición directa del producto mediante métodos analíticos como cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) o cromatografía líquida en combinación con espectrometría de masas (LC-MS).

Según otras ciertas realizaciones, un polipéptido o uso en la invención es un polipéptido según c). Por tanto, un polipéptido para uso en la invención puede ser un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 (por ejemplo, SEQ ID NO: 1), en donde 1 o más, tal como 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, 10 o más, 11 o más, 12 o más, 13 o más, 14 o más, 15 o más, 16 o más, 17 o más, 18 o más, 19 o más, 20 o más, 25 o más, 30 o más, 35 o más, 40 o más, 45 o más, 50 o más, 60 o más, 70 o más, 80 o más, 90 o más, 100 o más, 110 o más, 120 o más, 130 o más, 140 o más, o 150 o más, restos de aminoácido están sustituidos, eliminados y/o insertados. Según realizaciones particulares, un polipéptido según c) comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 (por ejemplo, SEQ ID NO: 1), en donde aproximadamente 1 a aproximadamente 150, como aproximadamente 1 a aproximadamente 140, aproximadamente 1 a aproximadamente 130, aproximadamente 1 a aproximadamente 120, aproximadamente 1 a aproximadamente 110, aproximadamente 1 a aproximadamente 100, aproximadamente 1 a aproximadamente 90, aproximadamente 1 a aproximadamente 80, aproximadamente 1 a aproximadamente 70, aproximadamente 1 a aproximadamente 60, aproximadamente 1 a aproximadamente 50, aproximadamente 1 a aproximadamente 40, aproximadamente 1 a aproximadamente 35, aproximadamente 1 a aproximadamente 30, aproximadamente 1 a aproximadamente 25, aproximadamente 1 a aproximadamente 20, aproximadamente 1 a aproximadamente 15, aproximadamente 1 a aproximadamente 10, aproximadamente 1 a aproximadamente 5, o aproximadamente 1 a aproximadamente 3, restos de aminoácido están sustituidos, eliminados y/o insertados. Según realizaciones más particulares, un polipéptido según c) comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 (por ejemplo, SEQ ID NO: 1), en donde aproximadamente 1 a aproximadamente 50, aproximadamente 1 a aproximadamente 40, aproximadamente 1 a aproximadamente 35, aproximadamente 1 a aproximadamente 30, aproximadamente 1 a aproximadamente 25, aproximadamente 1 a aproximadamente 20, aproximadamente 1 a aproximadamente 15, aproximadamente 1 a aproximadamente 10, aproximadamente 1 a aproximadamente 5, o aproximadamente 1 a aproximadamente 3, restos de aminoácido están sustituidos, eliminados y/o insertados. Según otras realizaciones más particulares, un polipéptido según c) comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 (por ejemplo, SEQ ID NO: 1), en donde aproximadamente 1 a aproximadamente 30, como aproximadamente 1 a aproximadamente 25, aproximadamente 1 a aproximadamente 20, aproximadamente 1 a aproximadamente 15, aproximadamente 1 a aproximadamente 10, aproximadamente 1 a aproximadamente 5, o aproximadamente 1 a aproximadamente 3, restos de aminoácido están sustituidos, eliminados y/o insertados.

Según otras realizaciones más particulares, un polipéptido según c) comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 (por ejemplo, SEQ ID NO: 1), en donde aproximadamente 1 a aproximadamente 25, como aproximadamente 1 a aproximadamente 20, aproximadamente 1 a aproximadamente 15, aproximadamente 1 a aproximadamente 10, aproximadamente 1 a aproximadamente 5, o aproximadamente 1 a aproximadamente 3, restos de aminoácido están sustituidos, eliminados y/o insertados.

Según realizaciones particulares, un polipéptido según c) comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1, en donde aproximadamente 1 a aproximadamente 150, como aproximadamente 1 a aproximadamente 140, aproximadamente 1 a aproximadamente 130, aproximadamente 1 a aproximadamente 120, aproximadamente 1 a aproximadamente 110, aproximadamente 1 a aproximadamente 100, aproximadamente 1 a aproximadamente 90, aproximadamente 1 a aproximadamente 80, aproximadamente 1 a aproximadamente 70, aproximadamente 1 a aproximadamente 60, aproximadamente 1 a aproximadamente 50, aproximadamente 1 a aproximadamente 40, aproximadamente 1 a aproximadamente 35, aproximadamente 1 a aproximadamente 30, aproximadamente 1 a aproximadamente 25, aproximadamente 1 a aproximadamente 20, aproximadamente 1 a aproximadamente 15, aproximadamente 1 a aproximadamente 10, aproximadamente 1 a aproximadamente 5, o aproximadamente 1 a aproximadamente 3, restos de aminoácido están sustituidos, eliminados y/o insertados. Según realizaciones más particulares, un polipéptido según c) comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1, en donde aproximadamente 1 a aproximadamente 50, aproximadamente 1 a aproximadamente 40, aproximadamente 1 a aproximadamente 35, aproximadamente 1 a aproximadamente 30, aproximadamente 1 a aproximadamente 25, aproximadamente 1 a aproximadamente 20, aproximadamente 1 a aproximadamente 15, aproximadamente 1 a aproximadamente 10, aproximadamente 1 a aproximadamente 5, o aproximadamente 1 a aproximadamente 3, restos de aminoácido están sustituidos, eliminados y/o insertados. Según otras realizaciones más particulares, un polipéptido según c) comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1, en donde aproximadamente 1 a aproximadamente 30, como aproximadamente 1 a aproximadamente 25, aproximadamente 1 a aproximadamente 20, aproximadamente 1 a aproximadamente 15, aproximadamente 1 a aproximadamente 10, aproximadamente 1 a aproximadamente 5, o aproximadamente 1 a aproximadamente 3, restos de aminoácido están sustituidos, eliminados y/o insertados. Según otras realizaciones más particulares, un polipéptido según c) comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1, en donde aproximadamente 1 a aproximadamente 25, como aproximadamente 1 a aproximadamente 20, aproximadamente 1 a aproximadamente 15, aproximadamente 1 a aproximadamente 10, aproximadamente 1 a aproximadamente 5, o aproximadamente 1 a aproximadamente 3, restos de aminoácido están sustituidos, eliminados y/o insertados.

Se entiende que los valores anteriores generalmente definen el número total de alteraciones al polipéptido de referencia (por ejemplo, SEQ ID NO: 1). Las alteraciones pueden ser únicamente sustituciones de aminoácidos, ya sean sustituciones conservadas o no conservadas, o ambas. Pueden ser únicamente deleciones de aminoácidos. Pueden ser únicamente inserciones de aminoácidos. Las alteraciones pueden ser una mezcla de estas alteraciones específicas, como sustituciones de aminoácidos e inserciones de aminoácidos.

Preferentemente, un polipéptido según c) tiene actividad aril sulfotransferasa. Más preferentemente, un polipéptido según c) tiene una actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 (por ejemplo, SEQ ID NO: 1).

Según cierta realización, un polipéptido según c) tiene una actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 1. Según ciertas otras realizaciones, un polipéptido según c) tiene una actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 2. Según ciertas otras realizaciones, un polipéptido según c) tiene una actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 3. Según ciertas otras realizaciones, un polipéptido según c) tiene una actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 4. Según ciertas otras realizaciones, un polipéptido según c) tiene una actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 5. Según ciertas otras realizaciones, un polipéptido según c) tiene una actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 6. Según ciertas otras realizaciones, un polipéptido según c) tiene una actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 7. Según ciertas otras realizaciones, un polipéptido según c) tiene una actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 8. Según ciertas otras realizaciones, un polipéptido según c) tiene una actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 9. Según ciertas otras realizaciones, un polipéptido según c) tiene una actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 10. Según ciertas otras realizaciones, un polipéptido según c) tiene una actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 11. Según ciertas otras realizaciones, un polipéptido según c) tiene una actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 12. Según ciertas otras realizaciones, un polipéptido según c) tiene una actividad aril sulfotransferasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 13.

Con actividad aril sulfotransferasa "similar" se entiende que el polipéptido según c) tiene al menos aproximadamente el 10 %, como al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 100 %, al menos aproximadamente el 200 %, al menos aproximadamente el 300 %, al menos aproximadamente el 400 %, al menos aproximadamente el 500 %, al menos aproximadamente el 800 %, al menos aproximadamente el 1000 % o al menos aproximadamente el 2000 %, de la actividad aril sulfotransferasa del polipéptido de referencia (por ejemplo, SEQ ID NO: 1).

La presente invención contempla la producción de un compuesto fenólico sulfatado a partir de un precursor del mismo, y en particular a partir de un precursor de la fórmula general (p-I) como se describe con más detalle a continuación. En este caso, puede ser adecuado emplear un polipéptido adicional (por ejemplo, segundo) que tenga actividad tirosina amoniaco liasa. Tal polipéptido puede ser un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

e) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 70 %, como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 (por ejemplo, SEQ ID NO: 14); o

f) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 (por ejemplo, SEQ ID NO: 14), en donde 1 o más, como aproximadamente 1 a aproximadamente 50, aproximadamente 1 a aproximadamente 40, aproximadamente 1 a aproximadamente 35, aproximadamente 1 a aproximadamente 30, aproximadamente 1 a aproximadamente 25, aproximadamente 1 a aproximadamente 20, aproximadamente 1 a aproximadamente 15, aproximadamente 1 a aproximadamente 10, aproximadamente 1 a aproximadamente 5, o aproximadamente 1 a aproximadamente 3, restos de aminoácido están sustituidos, eliminados y/o insertados.

Según determinadas realizaciones, un polipéptido adicional para uso en la invención es un polipéptido según d). Por tanto, un polipéptido según la invención puede ser un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22 o 23 (por ejemplo, SEQ ID NO: 14). Según realizaciones particulares, un polipéptido según d) comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 14. Según otras realizaciones particulares, un polipéptido según d) comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 15. Según aún otras realizaciones particulares, un polipéptido según d) comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 16. Según otras realizaciones particulares, un polipéptido según d) comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 17. Según otras realizaciones particulares, un polipéptido según d) comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 18. Según otras realizaciones particulares, un polipéptido según d) comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 19. Según otras realizaciones particulares, un polipéptido según d) comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 20. Según otras realizaciones particulares, un polipéptido según d) comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 21. Según otras realizaciones particulares, un polipéptido según d) comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 22. Según otras realizaciones particulares, un polipéptido según d) comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 23.

Según otras ciertas realizaciones, un polipéptido adicional para uso en la invención es un polipéptido según e). Por tanto, un polipéptido para uso en la invención puede ser un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 70 %, como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 (por ejemplo, SEQ ID NO: 14). Según realizaciones particulares, un polipéptido según e) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 80 %, como al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 (por ejemplo, SEQ ID NO: 14). Según otras realizaciones particulares, un polipéptido según e) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, como al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 (por ejemplo, SEQ ID NO: 14). Según otras realizaciones particulares, un polipéptido según e) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 90 %, como al menos aproximadamente el 93 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 (por ejemplo, SEQ ID NO: 14). Según otras realizaciones particulares, un polipéptido según e) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 95 %, como al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 (por ejemplo, SEQ ID NO: 14).

Según realizaciones particulares, un polipéptido según e) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 70 %, como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 14. Según realizaciones más particulares, un polipéptido según e) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 80 %, como al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 14. Según otras realizaciones más particulares, un polipéptido según e) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, como al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 14. Según otras realizaciones más particulares, un polipéptido según e) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 90 %, como al menos aproximadamente el 93 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 14. Según otras realizaciones más particulares, un polipéptido según e) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 95 %, como al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 14.

Preferentemente, un polipéptido según e) tiene actividad tirosina amoniaco liasa. Más preferentemente, un polipéptido según e) tiene una actividad tirosina amoniaco liasa similar a la del polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 (por ejemplo, SEQ ID NO: 14).

Según cierta realización, un polipéptido según e) tiene una actividad tirosina amoniaco liasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 14. Según ciertas otras realizaciones, un polipéptido según e) tiene una actividad tirosina amoniaco liasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 15. Según ciertas otras realizaciones, un polipéptido según e) tiene una actividad tirosina amoniaco liasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 16. Según ciertas otras realizaciones, un polipéptido según e) tiene una actividad tirosina amoniaco liasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 17. Según ciertas otras realizaciones, un polipéptido según e) tiene una actividad tirosina amoniaco liasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 18. Según ciertas otras realizaciones, un polipéptido según e) tiene una actividad tirosina amoniaco liasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 19. Según ciertas otras realizaciones, un polipéptido según e) tiene una actividad tirosina amoniaco liasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 20. Según ciertas otras realizaciones, un polipéptido según e) tiene una actividad tirosina amoniaco liasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 21. Según ciertas otras realizaciones, un polipéptido según e) tiene una actividad tirosina amoniaco liasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 22. Según ciertas otras realizaciones, un polipéptido según e) tiene una actividad tirosina amoniaco liasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 23. Por actividad de tirosina amoniaco liasa "similar" se entiende que el polipéptido según e) tiene al menos aproximadamente el 10 %, como al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 100 %, al menos aproximadamente el 200 %, al menos aproximadamente el 300 %, al menos aproximadamente el 400 %, al menos aproximadamente el 500 %, al

menos aproximadamente el 800 %, al menos aproximadamente el 1000 % o al menos aproximadamente el 2000 %, de la actividad amoniaco liasa del polipéptido de referencia (por ejemplo, SEQ ID NO: 14).

La actividad tirosina amoniaco liasa se puede determinar, por ejemplo, según el siguiente método: Los ensayos enzimáticos se realizan en volúmenes de 200 pl en pocillos en una placa transparente de 96 pocillos UV, siguiendo el aumento de la absorbancia a 315 nm (pHCA) usando espectrofotometría o HPLC con detección UV. Las mezclas de reacción contienen 2 pg de proteína purificada y se inician mediante la adición de tirosina 1 mM o 6 mM después del equilibrio a 30 °C. La actividad enzimática se calcula como U/g, donde U se define como sustrato pmol convertido por minuto. Los controles negativos no contienen proteínas purificadas. Las constantes cinéticas Km y vmáx se determinan a partir de ensayos que contienen tirosina de 1,56 pM a 200 pM.

Según otras ciertas realizaciones, un polipéptido adicional para uso en la invención es un polipéptido según f). Por tanto, un polipéptido para uso en la invención puede ser un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 (por ejemplo, SEQ ID NO: 14 ), en donde 1 o más, tal como 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, 10 o más, 11 o más, 12 o más, 13 o más, 14 o más, 15 o más, 16 o más, 17 o más, 18 o más, 19 o más, 20 o más, 25 o más, 30 o más, 35 o más, 40 o más, 45 o más, 50 o más, 60 o más, 70 o más, 80 o más, 90 o más, 100 o más, 110 o más, 120 o más, 130 o más, 140 o más, o 150 o más, restos de aminoácido están sustituidos, eliminados y/o insertados. Según realizaciones particulares, un polipéptido según f) comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 (por ejemplo, SEQ ID NO: 14), en donde aproximadamente 1 a unos 150, como aproximadamente 1 a aproximadamente 140, aproximadamente 1 a aproximadamente 130, aproximadamente 1 a aproximadamente 120, aproximadamente 1 a aproximadamente 110, aproximadamente 1 a aproximadamente 100, aproximadamente 1 a aproximadamente 90, aproximadamente 1 a aproximadamente 80, aproximadamente 1 a aproximadamente 70, aproximadamente 1 a aproximadamente 60, aproximadamente 1 a aproximadamente 50, aproximadamente 1 a aproximadamente 40, aproximadamente 1 a aproximadamente 35, aproximadamente 1 a aproximadamente 30, aproximadamente 1 a aproximadamente 25, aproximadamente 1 a aproximadamente 20, aproximadamente 1 a aproximadamente 15, aproximadamente 1 a aproximadamente 10, aproximadamente 1 a aproximadamente 5, o aproximadamente 1 a aproximadamente 3, restos de aminoácido están sustituidos, eliminados y/o insertados. Según realizaciones más particulares, un polipéptido según f) comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 (por ejemplo, SEQ ID NO: 14), en donde aproximadamente 1 a unos 50, aproximadamente 1 a aproximadamente 40, aproximadamente 1 a aproximadamente 35, aproximadamente 1 a aproximadamente 30, aproximadamente 1 a aproximadamente 25, aproximadamente 1 a aproximadamente 20, aproximadamente 1 a aproximadamente 15, aproximadamente 1 a aproximadamente 10, aproximadamente 1 a aproximadamente 5, o aproximadamente 1 a aproximadamente 3, restos de aminoácido están sustituidos, eliminados y/o insertados. Según otras realizaciones más particulares, un polipéptido según f) comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22 o 23 (por ejemplo, SEQ ID NO: 14), en donde aproximadamente 1 a unos 30, como aproximadamente 1 a aproximadamente

25, aproximadamente 1 a aproximadamente 20, aproximadamente 1 a aproximadamente 15, aproximadamente 1 a aproximadamente 10, aproximadamente 1 a aproximadamente 5, o aproximadamente 1 a aproximadamente 3, restos de aminoácido están sustituidos, eliminados y/o insertados. Según otras realizaciones más particulares, un polipéptido según f) comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22 o 23 (por ejemplo, SEQ ID NO: 14), en donde aproximadamente 1 a unos 25, como aproximadamente 1 a aproximadamente 20, aproximadamente 1 a aproximadamente 15, aproximadamente 1 a aproximadamente 10, aproximadamente 1 a aproximadamente 5, o aproximadamente 1 a aproximadamente 3, restos de aminoácido están sustituidos, eliminados y/o insertados.

Según realizaciones particulares, un polipéptido según f) comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 14, en donde aproximadamente 1 a aproximadamente 150, como aproximadamente 1 a aproximadamente 140, aproximadamente 1 a aproximadamente 130, aproximadamente 1 a aproximadamente 120, aproximadamente 1 a aproximadamente 110, aproximadamente 1 a aproximadamente 100, aproximadamente 1 a aproximadamente 90, aproximadamente 1 a aproximadamente 80, aproximadamente 1 a aproximadamente 70, aproximadamente 1 a aproximadamente 60, aproximadamente 1 a aproximadamente 50, aproximadamente 1 a aproximadamente 40, aproximadamente 1 a aproximadamente 35, aproximadamente 1 a aproximadamente 30, aproximadamente 1 a aproximadamente 25, aproximadamente 1 a aproximadamente 20, aproximadamente 1 a aproximadamente 15, aproximadamente 1 a aproximadamente 10, aproximadamente 1 a aproximadamente 5, o aproximadamente 1 a aproximadamente 3, restos de aminoácido están sustituidos, eliminados y/o insertados. Según realizaciones más particulares, un polipéptido según f) comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 14, en donde aproximadamente 1 a aproximadamente 50, aproximadamente 1 a aproximadamente 40, aproximadamente 1 a aproximadamente 35, aproximadamente 1 a aproximadamente 30, aproximadamente 1 a aproximadamente 25, aproximadamente 1 a aproximadamente 20, aproximadamente 1 a aproximadamente 15, aproximadamente 1 a aproximadamente 10, aproximadamente 1 a aproximadamente 5, o aproximadamente 1 a aproximadamente 3, restos de aminoácido están sustituidos, eliminados y/o insertados. Según otras realizaciones más particulares, un polipéptido según f) comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 14, en donde aproximadamente 1 a aproximadamente 30, como aproximadamente 1 a aproximadamente 25, aproximadamente 1 a aproximadamente 20, aproximadamente 1 a aproximadamente 15, aproximadamente 1 a aproximadamente 10, aproximadamente 1 a aproximadamente 5, o aproximadamente 1 a aproximadamente 3, restos de aminoácido están sustituidos, eliminados y/o insertados. Según otras realizaciones más particulares, un polipéptido según f) comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 14, en donde aproximadamente 1 a aproximadamente 25, como aproximadamente 1 a aproximadamente 20, aproximadamente 1 a aproximadamente 15, aproximadamente 1 a aproximadamente 10, aproximadamente 1 a aproximadamente 5, o aproximadamente 1 a aproximadamente 3, restos de aminoácido están sustituidos, eliminados y/o insertados.

Se entiende que los valores anteriores generalmente definen el número total de alteraciones al polipéptido de referencia (por ejemplo, SEQ ID NO: 14). Las alteraciones pueden ser únicamente sustituciones de aminoácidos, ya sean sustituciones conservadas o no conservadas, o ambas. Pueden ser únicamente deleciones de aminoácidos. Pueden ser únicamente inserciones de aminoácidos. Las alteraciones pueden ser una mezcla de estas alteraciones específicas, como sustituciones de aminoácidos e inserciones de aminoácidos.

Preferentemente, un polipéptido según f) tiene actividad tirosina amoniaco liasa. Más preferentemente, un polipéptido según f) tiene una actividad tirosina amoniaco liasa similar a la del polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22 o 23 ( por ejemplo, SEQ ID NO: 14). Según cierta realización, un polipéptido según f) tiene una actividad tirosina amoniaco liasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 14. Según ciertas otras realizaciones, un polipéptido según f) tiene una actividad tirosina amoniaco liasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 15. Según ciertas otras realizaciones, un polipéptido según f) tiene una actividad tirosina amoniaco liasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 16. Según ciertas otras realizaciones, un polipéptido según f) tiene una actividad tirosina amoniaco liasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 17. Según ciertas otras realizaciones, un polipéptido según f) tiene una actividad tirosina amoniaco liasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 18. Según ciertas otras realizaciones, un polipéptido según f) tiene una actividad tirosina amoniaco liasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 19. Según ciertas otras realizaciones, un polipéptido según f) tiene una actividad tirosina amoniaco liasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 20. Según ciertas otras realizaciones, un polipéptido según f) tiene una actividad tirosina amoniaco liasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 21. Según ciertas otras realizaciones, un polipéptido según f) tiene una actividad tirosina amoniaco liasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 22. Según ciertas otras realizaciones, un polipéptido según f) tiene una actividad tirosina amoniaco liasa similar a la del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 23. Por actividad de tirosina amoniaco liasa "similar" se entiende que el polipéptido según f) tiene al menos aproximadamente el 10 %, como al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 100%, al menos aproximadamente el 200 %, al menos aproximadamente el 300 %, al menos aproximadamente el 400 %, al menos aproximadamente el 500 %, al menos aproximadamente el 800 %, al menos aproximadamente el 1000 % o al menos aproximadamente el 2000 %, de la actividad amoniaco liasa del polipéptido de referencia (por ejemplo, SEQ ID NO: 14).

La actividad tirosina amoniaco liasa se puede determinar, por ejemplo, según el siguiente método: Los ensayos enzimáticos se realizan en volúmenes de 200 |jl en pocilios en una placa transparente de 96 pocilios UV, siguiendo el aumento de la absorbancia a 315 nm (pHCA) usando espectrofotometría o HPLC con detección UV. Las mezclas de reacción contienen 2 jg de proteína purificada y se inician mediante la adición de tirosina 1 mM o 6 mM después del equilibrio a 30 °C. La actividad enzimática se calcula como U/g, donde U se define como sustrato jm ol convertido por minuto. Los controles negativos no contienen proteínas purificadas. Las constantes cinéticas Km y vmáx se determinan a partir de ensayos que contienen tirosina de 1,56 jM a 200 jM .

En la presente invención además se contempla el uso de un polipéptido adicional (por ejemplo, tercero) que tiene actividad de fenilalanina amoniaco liasa, como una fenilalanina amoniaco liasa (EC 4.3.1.24).

Los polipéptidos pueden emplearse según la invención en forma aislada, como en forma purificada. Los polipéptidos pueden, por ejemplo, ser expresados por una célula hospedadora recombinante, y luego purificados. Las técnicas y medios para la purificación de polipéptidos producidos por una célula hospedadora recombinante se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, para facilitar la purificación, un motivo de aminoácido que comprende varios restos de histidina, como al menos 6, puede insertarse en el extremo C- o N-terminal del polipéptido. Un ejemplo no limitante de dicho motivo de aminoácido se proporciona en la SEQ ID NO: 24. Diversos kits de purificación para polipéptidos marcados con histidina están disponibles en fuentes comerciales como Qiagen, Hilden, Alemania; Clontech, Mountain View, CA, USA; Bio-Rad, Hercules, CA, USA y otros. Alternativamente, los polipéptidos pueden sintetizarse químicamente. Las técnicas para la síntesis química de péptidos se conocen bien e incluyen síntesis en fase líquida y síntesis en fase sólida.

Los polipéptidos también pueden emplearse según la invención como parte de una célula hospedadora recombinante. Dichas células hospedadoras recombinantes se describen con más detalles a continuación.

La presente invención también proporciona células hospedadoras recombinantes que comprenden (por ejemplo, que expresan) polipéptidos como se detalla en este documento. Generalmente, los polipéptidos según la invención serán heterólogos para las células hospedadoras, lo que significa que los polipéptidos normalmente no son encontrados ni preparados (es decir, expresados) por las células hospedadoras, pero se derivan de una especie diferente.

Por tanto, la presente invención proporciona una célula hospedadora recombinante que comprende un polipéptido heterólogo que tiene una actividad aril sulfotransferasa, y en donde la célula hospedadora se ha modificado adicionalmente para tener una expresión proteica aumentada de (i) una ATP sulfurilasa, (ii) una APS quinasa y/o (iii) una PAP fosfatasa. Según determinadas realizaciones, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende un polipéptido heterólogo seleccionado del grupo que consiste en:

c) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 (por ejemplo, SEQ ID NO: 1), en donde 1 a 50, como 1 a 40, 1 a 35, 1 a 30, 1 a 25, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 1 a 3, restos de aminoácido están sustituidos, eliminados y/o insertados, y en donde la célula hospedadora se ha modificado adicionalmente para tener una expresión proteica aumentada de (i) una ATP sulfurilasa, (ii) una APS quinasa y/o (iii) una PAP fosfatasa.

Una célula hospedadora recombinante proporcionada y utilizada según la presente invención puede comprender un polipéptido heterólogo que tiene actividad tirosina amoniaco liasa. Según determinadas realizaciones, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende un polipéptido heterólogo seleccionado del grupo que consiste en:

f) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 (por ejemplo, SEQ ID NO: 14), en donde 1 o más, como aproximadamente 1 a aproximadamente 50, aproximadamente 1 a aproximadamente 40, aproximadamente 1 a aproximadamente 35, 1 a 30, 1 a 25, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 1 a 3, restos de aminoácido están sustituidos, eliminados y/o insertados.

Según determinadas realizaciones, una célula hospedadora recombinante según la invención reivindicada comprende un primer polipéptido heterólogo que tiene actividad aril sulfotransferasa y un segundo polipéptido heterólogo que tiene actividad tirosina amoniaco liasa. Según realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante según la invención reivindicada comprende un primer polipéptido heterólogo seleccionado de los polipéptidos según los puntos a) a c) como se detalla en este documento, y un segundo polipéptido heterólogo seleccionado de los polipéptidos según los puntos e) a f) como se detalla en este documento.

Según realizaciones más particulares, una célula hospedadora recombinante según la invención reivindicada comprende un primer polipéptido heterólogo seleccionado del grupo que consiste en:

a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1;

b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 70 %, como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1; o

c) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1, en donde 1 a 50, como 1 a 40, 1 a 35, 1 a 30, 1 a 25, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 1 a 3, restos de aminoácido están sustituidos, eliminados y/o insertados; y

un segundo polipéptido heterólogo seleccionado del grupo que consiste en:

d) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 14;

e) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 70 %, como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 14; o

f) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 14, en donde 1 a 50, como 1 a 40, 1 a 35, 1 a 30, 1 a 25, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5, 1 a 3, restos de aminoácido están sustituidos, eliminados y/o insertados.

Según determinadas realizaciones, una célula hospedadora recombinante según la invención reivindicada comprende un primer polipéptido heterólogo que tiene actividad aril sulfotransferasa y un polipéptido heterólogo adicional (por ejemplo, tercero) que tiene actividad fenilalanina amoniaco liasa.

Las células hospedadoras recombinantes según la invención pueden producirse a partir de cualquier organismo hospedador adecuado, incluyendo microorganismos unicelulares o multicelulares como bacterias, levaduras, hongos, algas y plantas, y organismos eucariotas superiores, incluyendo nemátodos, insectos, reptiles, aves, anfibios y mamíferos.

Según determinadas realizaciones, una célula hospedadora recombinante según la invención se selecciona del grupo que consiste en bacterias, levaduras, hongos, algas y plantas.

Según ciertas otras realizaciones, una célula hospedadora recombinante según la invención se selecciona del grupo que consiste en bacterias, levaduras, hongos y algas.

Según ciertas otras realizaciones, una célula hospedadora recombinante según la invención se selecciona del grupo que consiste en bacterias, levadura y hongos.

Según ciertas otras realizaciones, una célula hospedadora recombinante según la invención se selecciona del grupo que consiste en bacterias y levadura.

Según determinadas realizaciones, una célula hospedadora recombinante según la invención no es una célula vegetal. Las células hospedadoras bacterianas se seleccionan de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. Los ejemplos no limitantes para las células hospedadoras bacterianas Gram negativas incluyen especies del género Escherichia, Erwinia, Klebsiella y Citrobacter. Ejemplos no limitantes de células hospedadoras bacterianas Gram-positivas incluyen especies del género Bacillus, Lactococcus, Lactobacillus, Clostridium, Corynebacterium, Streptomyces, Streptococcus y Cellulomonas.

Según determinadas realizaciones, la célula hospedadora recombinante es una bacteria, que puede ser una bacteria del género Bacillus, Lactococcus, Lactobacillus, Clostridium, Corynebacterium, Geobacillus, Thermoanaerobacterium, Streptococcus, Pseudomonas, Streptomyces, Escherichia, Shigella, Acinetobacter, Citrobacter, Salmonella, Klebsiella, Enterobacter, Erwinia, Kluyvera, Serratia, Cedecea, Morganella, Hafnia, Edwardsiella, Providencia, Proteus o Yersinia.

Según realizaciones particulares, la célula hospedadora recombinante es una bacteria del género Bacillus. Ejemplos no limitantes de una bacteria del género Bacillus son Bacillus subtitlis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis y Bacillus mojavensis. Según realizaciones más particulares, la célula hospedadora recombinante es Bacillus subtitlis. Según otras realizaciones más particulares, la célula hospedadora recombinante es Bacillus licheniformis.

Según otras realizaciones particulares, la célula hospedadora recombinante es una bacteria del género Lactococcus. Un ejemplo no limitante de una bacteria del género Lactococcus es Lactococcus lactis. Según realizaciones más particulares, la célula hospedadora recombinante es Lactococcus lactis.

Según otras realizaciones particulares, La célula hospedadora recombinante es una bacteria del género Corynebacterium. Un ejemplo no limitante de una bacteria del género Corynebacterium es Corynebacterium glutamicum. Según realizaciones más particulares, la célula hospedadora recombinante es Corynebacterium glutamicum.

Según otras realizaciones particulares, La célula hospedadora recombinante es una bacteria del género Streptomyces. Un ejemplo no limitante de una bacteria del género Streptomyces son Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor o Streptomyces griseus. Según realizaciones más particulares, la célula hospedadora recombinante es Streptomyces lividans.

Según otras realizaciones más particulares, la célula hospedadora recombinante es Streptomyces coelicolor. Según otras realizaciones más particulares, la célula hospedadora recombinante es Streptomyces griseus.

Según otras realizaciones particulares, la célula hospedadora recombinante es una bacteria del género Pseudomonas. Un ejemplo no limitativo de una bacteria del género Pseudomonas es Pseudomonas putida. Según realizaciones más particulares, la célula hospedadora recombinante es Pseudomonas putida.

Según otras realizaciones particulares, la célula hospedadora recombinante es una bacteria del género Geobacillus. Un ejemplo no limitante de una bacteria del género Geobacillus es Geobacillus thermoglucosidasius y Geobacillus stearothermophilus. Según realizaciones más particulares, la célula hospedadora recombinante es Geobacillus thermoglucosidasius. Según otras realizaciones más particulares, la célula hospedadora recombinante es Geobacillus stearothermophilus.

Según otras realizaciones particulares, la célula hospedadora recombinante es una bacteria del género Thermoanaerobacterium. Un ejemplo no limitante de una bacteria del género Pseudomonas es Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum. Según realizaciones más particulares, la célula hospedadora recombinante es Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum.

Según otras realizaciones particulares, la célula hospedadora recombinante es una bacteria del género Escherichia. Un ejemplo no limitante de una bacteria del género Escherichia es Escherichia coli. Según realizaciones más particulares, la célula hospedadora recombinante es Escherichia coli.

Las células hospedadoras de levadura pueden derivarse de, por ejemplo, Saccharomyces, Pichia, Schizosacharomyces, Zygosaccharomyces, Hansenula, Pachyosolen, Kluyveromyces, Debaryomyces, Yarrowia, Candida, Cryptococcus, Komagataella, Lipomyces, Rhodospiridium, Rhodotorula o Trichosporon.

Según determinadas realizaciones, la célula hospedadora recombinante es una levadura, que puede ser una levadura del género Saccharomyces, Pichia, Schizosacharomyces, Zygosaccharomyces, Hansenula, Pachyosolen, Kluyveromyces, Debaryomyces, Yarrowia, Candida, Cryptococcus, Komagataella, Lipomyces, Rhodospiridium, Rhodotorula o Trichosporon.

Según realizaciones particulares, la célula hospedadora recombinante es una levadura del género Saccharomyces. Un ejemplo no limitante de una levadura del género Saccharomyces es Saccharomyces cerevisiae. Según realizaciones más particulares, la célula hospedadora recombinante es Saccharomyces cerevisiae.

Según realizaciones particulares, la célula hospedadora recombinante es una levadura del género Pichia. Ejemplos no limitantes de una levadura del género Pichia son Pichia pastoris y Pichia kudriavzevii. Según realizaciones más particulares, la célula hospedadora recombinante es Pichia pastoris. Según otras realizaciones más particulares, la célula hospedadora recombinante es Pichia kudriavzevii.

Las células hospedadoras de hongos pueden derivarse de, p. ej., Aspergillus.

Según determinadas realizaciones, la célula hospedadora recombinante es un hongo, como un hongo del género Aspergillus. Ejemplos no limitantes de un hongo del género Aspergillus son Aspergillus oryzae, Aspergillus niger o Aspergillus awamsii. Según realizaciones más particulares, la célula hospedadora recombinante es Aspergillus oryzae. Según otras realizaciones más particulares, la célula hospedadora recombinante es Aspergillus niger. Según otras realizaciones más particulares, la célula hospedadora recombinante es Aspergillus awamsii. Las células hospedadoras de algas pueden derivarse de, p. ej., Chlamydomonas, Haematococcus, Phaedactylum, Volvox o Dunaliella.

Según determinadas realizaciones, la célula hospedadora recombinante es un alga, que puede ser un alga del género Chlamydomonas, Haematococcus, Phaedactylum, Volvox o Dunaliella. Según realizaciones particulares, la célula hospedadora recombinante es una célula alga del género Chlamydomonas. Un ejemplo no limitante de una alga del género Chlamydomonas es Chlamydomonas reinhardtii.

Según realizaciones particulares, la célula hospedadora recombinante es una célula alga del género Haematococcus. Un ejemplo no limitante de una alga del género Haematococcus es Haematococcus pluvialis.

Según otras realizaciones particulares, la célula hospedadora recombinante es una célula alga del género Phaedactylum. Un ejemplo no limitante de una alga del género Phaedactylum es Phaedactylum tricornatum.

Una célula hospedadora de planta puede derivarse de, p. ej., soja, colza, girasol, algodón, maíz, tabaco, alfalfa, trigo, cebada, avena, sorgo, lechuga, arroz, brócoli, coliflor, repollo, chirivías, melones, zanahorias, apio, perejil, tomates, patatas, fresas, cacahuetes, uvas, cultivos de semillas de hierba, remolacha azucarera, caña de azúcar, judías, guisantes, centeno, lino, árboles de madera dura, árboles de madera blanda y hierbas forrajeras.

Según determinadas realizaciones, la célula hospedadora recombinante es una célula vegetal, como una célula vegetal seleccionada del grupo que consiste en soja, colza, girasol, algodón, maíz, tabaco, alfalfa, trigo, cebada, avena, sorgo, lechuga, arroz, brócoli, coliflor, repollo, chirivías, melones, zanahorias, apio, perejil, tomates, patatas, fresas, cacahuetes, uvas, cultivos de semillas de hierba, remolacha azucarera, caña de azúcar, judías, guisantes, centeno, lino, árboles de madera dura, árboles de madera blanda y hierbas forrajeras.

Generalmente, una célula hospedadora recombinante según la invención se ha modificado genéticamente para expresar polipéptidos como se detalla en este documento, lo que significa que en la célula hospedadora se ha introducido moléculas de ácido nucleico exógenas, como moléculas de ADN, que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican dichos polipéptidos. Los expertos en la materia conocen técnicas para introducir moléculas de ácido nucleico exógeno, como una molécula de ADN, en las diversas células hospedadoras e incluyen transformación (por ejemplo, choque térmico o transformación natural), transfección, conjugación, electroporación, microinyección y bombardeo de micropartículas.

Por tanto, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos como se detalla en este documento.

Para facilitar la expresión de los polipéptidos en la célula hospedadora, las moléculas de ácido nucleico exógenas pueden comprender elementos reguladores adecuados tales como un promotor que es funcional en la célula hospedadora para causar la producción de una molécula de ARNm y que está operativamente unida a la secuencia/s de nucleótidos que codifica dicho polipéptido/s.

Los promotores útiles según la invención son cualquier promotor conocido que sea funcional en una célula hospedadora dada para provocar la producción de una molécula de ARNm. La persona experta conoce muchos de estos promotores. Dichos promotores incluyen promotores normalmente asociados con otros genes y/o promotores aislados de cualquier bacteria, levaduras, hongos, alga o célula vegetal. Los expertos en la técnica de biología molecular conocen generalmente el uso de promotores para expresión de proteínas, por ejemplo, véanse Sambrook et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989. El promotor empleado puede ser inducible. El término "inducible" usado en el contexto de un promotor significa que el promotor solo dirige la transcripción de una secuencia de nucleótidos unida operativamente si hay un estímulo presente, como un cambio de temperatura o la presencia de una sustancia química ("inductor químico"). Como se usa en este documento, "inducción química" se refiere a la aplicación física de una sustancia exógena o endógena (incluyendo macromoléculas, p. ej., proteínas o ácidos nucleicos) a una célula hospedadora. Esto tiene el efecto de hacer que el promotor diana presente en la célula hospedadora aumente la velocidad de transcripción. Alternativamente, el promotor empleado puede ser constitutivo. El término "constitutivo" utilizado en el contexto de un promotor significa que el promotor es capaz de dirigir la transcripción de una secuencia de nucleótidos unida operativamente en ausencia de estímulo (como choque térmico, productos químicos, etc.).

Los ejemplos no limitantes de promotores funcionales en bacterias, como Bacillus subtilis, Lactococcus lactis o Escherichia coli, incluyen promotores constitutivos e inducibles como el promotor T7, los sistemas promotores de betalactamasa y lactosa; promotor de fosfatasa alcalina (phoA), un sistema de promotor de triptófano (trp), promotor de tetraciclina, promotor del fago lambda, promotores de proteínas ribosómicos; y promotores híbridos como el promotor tac. También son adecuados otros promotores bacterianos y sintéticos.

Los ejemplos no limitantes de promotores funcionales en levadura, como Saccharomyces cerevisiae, incluyen promotor de xilosa, promotores GAL1 y GAL10, promotor TEF1 y promotor pgk1.

Los ejemplos no limitantes de promotores funcionales en hongos, como Aspergillus Oryzae o Aspergillus niger, incluyen promotores derivados del gen que codifica la amilasa TAKA de Aspergillus oryzae, a-amilasa neutra de Aspergillus niger, a-amilasa estable a ácido de Aspergillus niger, glucoamilasa (gluA) de Aspergillus niger o Aspergillus awamsii, acetamidasa de Aspergillus niger, proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, triosa fosfatasa isomerasa de Aspergillus oryzae, proteinasa aspártica de Rhizopus meihei, y lipasa de Rhizopus meihei.

Los ejemplos no limitantes de promotores funcionales en alga, como Haematococcus pluvialis, incluir el promotor CaMV35S, el promotor SV40 y el promotor del gen RBCS2 de Chlamydomonas reinhardtii y el promotor del gen ARS de Volvox carteri. Los ejemplos no limitantes de promotores funcionales en células vegetales incluyen el promotor psbA de Lactuca sative, el promotor psbA del tabaco, el promotor rrn16 PEP+NEP del tabaco, el promotor 35S de CaMV, el promotor 19S, el promotor E8 del tomate, el promotor nos, el promotor Mac y el promotor pet E o el promotor ACT1.

Además de un promotor, la molécula exógena de ácido nucleico puede comprender además al menos un elemento regulador seleccionado de una región no traducida 5' (5'UTR) y una región no traducida 3' (3'UTR). Los expertos conocen bien muchas de estos 5' UTR y 3' UTR derivados de procariotas y eucariotas. Dichos elementos reguladores incluyen 5' UTR y 3' UTR normalmente asociados con otros genes, y/o 5' UTR y 3' UTR aislados de cualquier bacteria, levaduras, hongos, alga o célula vegetal.

Si la célula hospedadora es un organismo procariota, el 5' UTR generalmente contiene un sitio de unión a ribosomas (RBS), también conocido como la secuencia Shine Dalgarno, que generalmente tiene 3-10 pares de bases cadena arriba del codón de inicio. Mientras tanto, si la célula hospedadora es un organismo eucariota, el 5' UTR generalmente contiene la secuencia consenso de Kozak. Un 5' UTR eucariota también puede contener elementos reguladores de acción cis.

La molécula/s de ácido nucleico exógeno puede ser un vector o parte de un vector, como un vector de expresión. Normalmente, dicho vector permanece extracromosómico dentro de la célula hospedadora, lo que significa que se encuentra fuera del núcleo o región nucleoide de la célula hospedadora.

Según determinadas realizaciones, una célula hospedadora recombinante según la invención no expresa una aril sulfotransferasa dependiente de PAPS endógena.

La presente invención también contempla que la molécula de ácido nucleico exógeno esté integrada de manera estable en el genoma de la célula hospedadora. Medios para una integración estable en el genoma de una célula hospedadora, p. ej., por recombinación homóloga, son bien conocidos por la persona experta.

La reacción de sulfatación depende del suministro de sulfato de 5'-fosfosulfato de 3'-fosfoadenosina (PAPS) o transferencia desde otro compuesto sulfatado. Los inventores demostraron que la reacción de sulfatación puede potenciarse mejorando el suministro de PAPS (5'-fosfosulfato de 3'-fosfoadenosina) y, además, mediante la eliminación del producto 5'-fosfato de 3'-fosfoadenosina (PAP). El suministro mejorado se obtiene por desregulación, mutación o sobreexpresión de enzimas que aumentan la concentración de PAPS o también reducen la concentración de PAP. Esto se ejemplifica en el Ejemplo 2, donde una mayor producción de ácido zostérico en Escherichia coli se obtiene aumentando la expresión de los genes cysD, cysN, y cysC que son responsables de la producción de PAPS. Sin quedar unido a una teoría específica, se cree que un resto adenililo (AMP) de ATP se transfiere al sulfato para formar sulfato activado, o APS (5'-fosfosulfato de adenosina). Esta reacción extremadamente desfavorable está relacionada cinéticamente y energéticamente a la hidrólisis de GTP por la enzima ATP sulfurilasa, que se compone de dos tipos de subunidades: una adenilil transferasa (cysD) y una GTPasa (cysN). APS luego se fosforila en el 3'-hidroxilo para formar PAPS (5'-fosfosulfato de 3'-fosfoadenosina) en una reacción catalizada por APS quinasa, que está codificado por cysC. Adicionalmente, los inventores mejoraron aún más la producción de ácido zostérico al aumentar la expresión del gen cysQ que codifica una PAP fosfatasa que es responsable de la eliminación de PAP.

Por tanto, para mejorar aún más la producción de un compuesto fenólico sulfatado, como ácido zostérico, una célula hospedadora recombinante según la presente invención se modifica adicionalmente para tener una expresión proteica aumentada de una ATP sulfurilasa en comparación con una célula hospedadora idéntica que no lleva dicha modificación; o se modifica adicionalmente para tener una expresión proteica aumentada de una APS quinasa en comparación con una célula hospedadora idéntica que no lleva dicha modificación; y/o se modifica adicionalmente para tener una expresión proteica aumentada de una PAP fosfatasa en comparación con una célula hospedadora idéntica que no lleva dicha modificación. Por "expresión proteica aumentada" se entiende que la cantidad de la proteína respectiva producida por la célula hospedadora modificada de este modo aumenta en comparación con una célula hospedadora idéntica que no lleva dicha modificación. Más en particular, por "aumentar la expresión" se entiende que la cantidad de proteína respectiva producida por la célula hospedadora modificada de este modo aumenta al menos el 10 %, como al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 100 %, al menos el 150 %, al menos el 200 %, al menos el 300 %, al menos el 400 %, al menos el 500 %, al menos el 600 %, al menos el 700 %, al menos 800 %, al menos aproximadamente el 900 %, al menos aproximadamente el 1000 %, al menos aproximadamente el 2000 %, al menos aproximadamente el 3000 %, al menos aproximadamente el 4000 %, al menos aproximadamente el 5000 %, al menos aproximadamente el 6000 %, al menos aproximadamente el 7000 %, al menos aproximadamente el 8000 %, al menos aproximadamente el 9000 % o al menos aproximadamente el 10000 %, comparado con una célula hospedadora idéntica que no lleva dicha modificación. La cantidad de proteína en una célula dada puede determinarse mediante cualquier técnica de cuantificación adecuada conocida en la técnica, como ELISA, Inmunohistoquímica o transferencia de Western.

Según determinadas realizaciones, una célula hospedadora recombinante según la invención se modificó adicionalmente para tener una expresión proteica aumentada de una ATP sulfurilasa en comparación con una célula hospedadora idéntica que no lleva dicha modificación.

Según determinadas realizaciones, una célula hospedadora recombinante según la invención se modificó adicionalmente para tener una expresión proteica aumentada de una APS quinasa en comparación con una célula hospedadora idéntica que no lleva dicha modificación.

Según determinadas realizaciones, una célula hospedadora recombinante según la invención se modificó adicionalmente para tener una expresión proteica aumentada de una PAP fosfatasa en comparación con una célula hospedadora idéntica que no lleva dicha modificación.

Mediante cualquier medio adecuado conocido por los expertos en la materia se puede lograr un aumento de la expresión de proteínas. Por ejemplo, se puede lograr un aumento de la expresión de proteínas aumentando el número de copias del gen o genes que codifican la proteína respectiva (por ejemplo, ATP sulfurilasa, APS quinasa y/o PAP fosfatasa) en la célula hospedadora, como mediante el uso (por ejemplo, la introducción en la célula hospedadora) de vectores que comprenden el gen o genes unidos operativamente a un promotor que es funcional en la célula hospedadora para causar la producción de una molécula de ARNm. También se puede lograr un aumento de la expresión de proteínas mediante la integración de al menos una segunda copia del gen o genes que codifican la proteína respectiva en el genoma de la célula hospedadora. También se puede lograr un aumento de la expresión de proteínas aumentando la fuerza del promotor o los promotores unidos operativamente al gen o genes. También se puede lograr un aumento de la expresión de proteínas modificando el sitio de unión al ribosoma en la molécula de ARNm que codifica la proteína respectiva (por ejemplo, ATP sulfurilasa, APS quinasa y/o PAP fosfatasa). Al modificar la secuencia del sitio de unión al ribosoma se puede aumentar la velocidad de inicio de la traducción, aumentando así la eficacia de la traducción.

Los genes que codifican ATP sulfurilasa para usar según la invención pueden ser, por ejemplo, los genes cysD y cysN de Escherichia coli (que codifica SEQ ID NO: 25 y 26, respectivamente). Los genes codificantes alternativos de ATP sulfurilasa incluyen el gen ATP sulfurilasa ASAL de Arabidopsis thaliana (N.° U40715 de Registro en GenBank, Logan et al. (1996) J Biol Chem 271: 12227); el gen ATP-sulfurilasa de la cepa Allium (N.° AF21154 de Registro en GenBank); el gen ATP sulfurilasa de Lotus japonicus (N.° AW164083 de Registro en GenBank); el gen met3-1 ATP sulfurilasa de Arabidopsis thaliana (N.° X79210 de Registro en GenBank).

Según determinadas realizaciones, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (como un vector) que comprende una o más secuencias de nucleótidos que codifican una ATP sulfurilasa.

Según realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 25 o ii) un polipéptido que comprende un amino secuencia ácida que tiene al menos aproximadamente el 70 %, como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 25, proporcionar que la identidad de secuencia no sea del 100 %, y una secuencia de nucleótidos que codifica iii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 26 o iv) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 26, siempre que la identidad de secuencia no sea del 100 %. Preferentemente, los polipéptidos se ensamblan para formar una proteína que tiene actividad ATP sulfurilasa.

Según realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 25 y una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende un amino secuencia ácida establecida en SEQ ID NO: 26.

Según realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 25, proporcionar que la identidad de secuencia no sea del 100 %, y una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 26, siempre que la identidad de secuencia no sea del 100%. Preferentemente, los polipéptidos se ensamblan para formar una proteína que tiene actividad ATP sulfurilasa.

Según realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente aproximadamente el 85 %, como al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 25, proporcionar que la identidad de secuencia no sea del 100 %, y una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, como al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 26, siempre que la identidad de secuencia no sea del 100 %. Preferentemente, los polipéptidos se ensamblan para formar una proteína que tiene actividad ATP sulfurilasa.

Un gen codificante alternativo de ATP sulfurilasa para usar según la invención puede ser, por ejemplo, el gen MET3 de Saccharomyces cerevisiae (que codifica SEQ ID NO: 68). Según realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 68 o ii) un polipéptido que comprende un amino secuencia ácida que tiene al menos aproximadamente el 70 %, como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 68. Preferentemente, el polipéptido según ii) tiene actividad ATP sulfurilasa.

Según realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógeno (como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 68.

Según realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 68. Preferentemente, el polipéptido tiene actividad ATP sulfurilasa.

Según realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente aproximadamente el 85 %, como al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 68. Preferentemente, el polipéptido tiene actividad ATP sulfurilasa.

Un gen codificante de ATP sulfurilasa alternativo para uso según la invención puede ser, por ejemplo, el gen que codifica ATP sulfurilasa de Bacillus subtilis (que codifica SEQ ID NO: 73).

Según realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 73 o ii) un polipéptido que comprende un amino secuencia ácida que tiene al menos aproximadamente el 70 %, como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 73. Preferentemente, el polipéptido según ii) tiene actividad ATP sulfurilasa.

Según realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógeno (como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 73.

Según realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 73. Preferentemente, el polipéptido tiene actividad ATP sulfurilasa.

Según realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente aproximadamente el 85 %, como al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 73. Preferentemente, el polipéptido tiene actividad ATP sulfurilasa.

Para facilitar la expresión de los polipéptidos en la célula hospedadora, la molécula de ácido nucleico exógeno puede comprender elementos reguladores adecuados, tales como un promotor que es funcional en la célula hospedadora para causar la producción de una molécula de ARNm y que está unido operativamente a las secuencias de nucleótidos que codifican dichos polipéptidos.

Un gen que codifica APS quinasa para uso según la invención puede ser, por ejemplo, el gen cysC de Escherichia coli (que codifica SEQ ID NO: 27).

En ciertos casos, se ha demostrado que un único polipéptido posee una actividad ATP sulfurilasa y una actividad 5'-adenililsulfato quinasa. Por ejemplo, se ha aislado un gen que codifica ATP sulfurilasa/APS quinasa de fuentes de ratón (N.° U34883 de Registro en GenBank, Li et al. (1995) J Biol Chem) 70: 1945) y humano (N.° AF033026de Registro en GenBank, Yanagisawa (1998) Biosci Biotechnol Biochem 62: 1037). Otros ejemplos de dicha enzima bifuncional incluyen enzimas 3'-fosfoadenosina 5'-fosfosulfato sintasa (PAPSS) de rata (Rattus norvegicus) (SEQ ID NO: 71 o 72).

Según determinadas realizaciones, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una APS quinasa.

Según realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 27 o ii) un polipéptido que comprende un amino secuencia ácida que tiene al menos aproximadamente el 70 %, como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 27, siempre que la identidad de secuencia no sea del 100 %. Preferentemente, dicho polipéptido según ii) tiene actividad APS quinasa.

Según realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógeno (como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 27.

Según realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 27, siempre que la identidad de secuencia no sea del 100 %. Preferentemente, dicho polipéptido tiene actividad de APS quinasa.

Según realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, como al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 27, siempre que la identidad de secuencia no sea del 100 %. Preferentemente, dicho polipéptido tiene actividad de APS quinasa.

Un gen codificante alternativo de APS quinasa para uso según la invención puede ser, por ejemplo, el gen MET14 de Saccharomyces cerevisiae (que codifica SEQ ID NO: 69).

Según realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 69 o ii) un polipéptido que comprende un amino secuencia ácida que tiene al menos aproximadamente el 70 %, como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 69. Preferentemente, dicho polipéptido según ii) tiene actividad APS quinasa.

Según realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógeno (como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 69.

Según realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 69. Preferentemente, dicho polipéptido tiene actividad de APS quinasa.

Según realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, como al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 69. Preferentemente, dicho polipéptido tiene actividad de APS quinasa.

Un gen codificante alternativo de APS quinasa para uso según la invención puede ser, por ejemplo, el gen codificante de APS quinasa de Bacillus subtilis (que codifica SEQ ID NO: 74).

Según realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 74 o ii) un polipéptido que comprende un amino secuencia ácida que tiene al menos aproximadamente el 70 %, como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 74. Preferentemente, dicho polipéptido según ii) tiene actividad APS quinasa.

Según realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógeno (como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 74.

Según realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 74. Preferentemente, dicho polipéptido tiene actividad de APS quinasa.

Según realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, como al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 74. Preferentemente, dicho polipéptido tiene actividad de APS quinasa.

Alternativamente, se puede usar un polipéptido que tiene una actividad de actividad ATP sulfurilasa y APS quinasa, tal como una 3'-fosfoadenosina 5-fosfosulfato sintasa (PAPSS).

Según determinadas realizaciones, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una 3'-fosfoadenosina 5-fosfosulfato sintasa.

Según realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 71 o ii) un polipéptido que comprende un amino secuencia ácida que tiene al menos aproximadamente el 70 %, como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 71. Preferentemente, dicho polipéptido según ii) tiene actividad tanto de ATP sulfurilasa como de APS quinasa.

Según realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógeno (como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 71.

Según realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 71. Preferentemente, dicho polipéptido tiene actividad tanto de ATP sulfurilasa como de APS quinasa.

Según realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, como al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 71. Preferentemente, dicho polipéptido tiene actividad tanto de ATP sulfurilasa como de APS quinasa.

Según realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 72 o ii) un polipéptido que comprende un amino secuencia ácida que tiene al menos aproximadamente el 70 %, como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 72. Preferentemente, dicho polipéptido según ii) tiene actividad tanto de ATP sulfurilasa como de APS quinasa.

Según realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógeno (como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 72.

Según realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 72. Preferentemente, dicho polipéptido tiene tanto actividad de ATP sulfurilasa como de APS quinasa.

Según realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, como al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 72. Preferentemente, dicho polipéptido tiene actividad tanto de ATP sulfurilasa como de APS quinasa.

Para facilitar la expresión del polipéptido en la célula hospedadora, la molécula exógena de ácido nucleico puede comprender elementos reguladores adecuados, como un promotor que es funcional en la célula hospedadora para causar la producción de una molécula de ARNm y que está operativamente unida a la secuencia de nucleótidos que codifica dicho polipéptido.

Un gen que codifica PAP fosfatasa para uso según la invención puede ser, por ejemplo, el gen cysQ de Escherichia coli (que codifica SEQ ID NO: 28).

Según determinadas realizaciones, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una PAP fosfatasa.

Según realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 28 o ii) un polipéptido que comprende un amino secuencia ácida que tiene al menos aproximadamente el 70 %, como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 28, siempre que la identidad de secuencia no sea del 100 %. Preferentemente, dicho polipéptido según ii) tiene actividad de PAP fosfatasa.

Según realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógeno (como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 28.

Según realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 28, siempre que la identidad de secuencia no sea del 100 %. Preferentemente, dicho polipéptido tiene actividad PAP fosfatasa.

Según realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, como al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 28, siempre que la identidad de secuencia no sea del 100 %. Preferentemente, dicho polipéptido tiene actividad PAP fosfatasa.

Un gen que codifica PAP fosfatasa alternativa para uso según la invención puede ser, por ejemplo, el gen MET22 de Saccharomyces cerevisiae (que codifica SEQ ID NO: 70).

Según realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 70 o ii) un polipéptido que comprende un amino secuencia ácida que tiene al menos aproximadamente el 70 %, como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 70. Preferentemente, dicho polipéptido según ii) tiene actividad de PAP fosfatasa.

Según realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógeno (como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 70.

Según realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 70. Preferentemente, dicho polipéptido tiene actividad PAP fosfatasa.

Según realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, como al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 70. Preferentemente, dicho polipéptido tiene actividad PAP fosfatasa.

Un gen codificante de PAP fosfatasa alternativo para uso según la invención puede ser, por ejemplo, el gen codificante de PAP fosfatasa de Bacillus subtilits (que codifica SEQ ID NO: 75).

Según realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica i) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 75 o ii) un polipéptido que comprende un amino secuencia ácida que tiene al menos aproximadamente el 70 %, como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 75. Preferentemente, dicho polipéptido según ii) tiene actividad de PAP fosfatasa.

Según realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógeno (como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 75.

Según realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, como al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 75. Preferentemente, dicho polipéptido tiene actividad PAP fosfatasa.

Según realizaciones particulares, una célula hospedadora recombinante según la invención comprende una molécula de ácido nucleico exógena (como un vector) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 %, como al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 75. Preferentemente, dicho polipéptido tiene actividad PAP fosfatasa.

Métodos y usos

La presente invención proporciona procesos para la producción de compuestos fenólicos sulfatados. Particularmente, se proporciona un proceso para la producción de un compuesto fenólico sulfatado que comprende:

(i''') poner en contacto un medio que comprende un precursor de un compuesto fenólico con una primera célula hospedadora recombinante; en donde la primera célula hospedadora recombinante comprende un polipéptido heterólogo que tiene una actividad aril sulfotransferasa, y en donde la célula hospedadora se ha modificado aún más para tener una expresión proteica aumentada de (i) una ATP sulfurilasa, (ii) una APS quinasa y/o (iii) una PAP fosfatasa.

Según determinadas realizaciones, el proceso para la producción de un compuesto fenólico sulfatado comprende: (i') poner en contacto un medio que comprende un compuesto fenólico con una primera célula hospedadora recombinante; en donde la primera célula hospedadora recombinante comprende un polipéptido heterólogo que tiene actividad aril sulfotransferasa.

Según otras ciertas realizaciones, el proceso para la producción de un compuesto fenólico sulfatado comprende: (i") poner en contacto un medio que comprende un sustrato de carbono fermentable con una primera célula hospedadora recombinante; en donde la primera célula hospedadora recombinante comprende un polipéptido heterólogo que tiene actividad aril sulfotransferasa.

Según otras ciertas realizaciones, el proceso para la producción de un compuesto fenólico sulfatado comprende: (i''') poner en contacto un medio que comprende un precursor de un compuesto fenólico con una primera célula hospedadora recombinante; en donde la primera célula hospedadora recombinante comprende un polipéptido heterólogo que tiene actividad aril sulfotransferasa.

El medio empleado puede ser cualquier medio convencional adecuado para cultivar la célula hospedadora en cuestión, y puede formarse según los principios de la técnica anterior. El medio generalmente contendrá todos los nutrientes necesarios para el crecimiento y la supervivencia de la célula hospedadora respectiva, como fuentes de carbono y nitrógeno y otras sales inorgánicas. Los medios adecuados, por ejemplo, medios mínimos o complejos, están disponibles en proveedores comerciales, o pueden prepararse según las recetas publicadas, por ejemplo, el Catálogo de cepas de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC). El medio convencional no limitante bien conocido por la persona experta incluye el caldo Luria Bertani (LB), Caldo Sabouraud Dextrosa (SD), Caldo MS, Levadura Peptona Dextrosa, BMMY, GMMY, o caldo de extracto de levadura y malta (YM), que están disponibles comercialmente. Un ejemplo no limitante de medios adecuados para cultivo de células bacterianas, como células de B. subtilis, L. lactis o E. coli, incluyendo medios mínimos y medios enriquecidos como caldo Luria (LB), medios M9, medios M17, medios SA, medios MOPS, Caldo Terrific, YT y otros. Los medios adecuados para cultivo de células eucariotas, las células de levadura, son RPMI 1640, MEM, DMEM, los cuales pueden complementarse con suero y/o factores de crecimiento según lo requiera la célula hospedadora particular que se cultiva. El medio para cultivar células eucariotas también puede ser cualquier tipo de medio mínimo, como medio mínimo de levadura.

El sustrato de carbono fermentable puede ser cualquier sustrato de carbono adecuado conocido en la técnica, y en particular cualquier sustrato de carbono usado comúnmente en el cultivo y/o fermentación de microorganismos. Los ejemplos no limitantes de sustratos de carbono fermentables adecuados incluyen carbohidratos (por ejemplo, azúcares C5 como arabinosa o xilosa, o azúcares C6 como glucosa), glicerol, glicerina, acetato, dihidroxiacetona, fuente de un carbono, metanol, metano, aceites, grasas animales, aceites animales, aceites vegetales, ácidos grasos, lípidos, fosfolípidos, glicerolípidos, monoglicéridos, diglicéridos, triglicéridos, fuentes de carbono renovables, polipéptidos (por ejemplo, una proteína o péptido microbiano o vegetal), extracto de levadura, componente de un extracto de levadura, peptona, casaminoácidos o cualquier combinación de dos o más de los anteriores.

Según determinadas realizaciones, el sustrato de carbono se selecciona del grupo que consiste en azúcares C5 (como arabinosa o xilosa), azúcares C6 (como glucosa o fructosa), lactosa, sacarosa, glicerol, glicerina, acetato, licor de maíz fermentado, extracto de levadura, componente de un extracto de levadura, peptona, casaminoácidos o combinaciones de los mismos.

Según determinadas realizaciones, el medio comprende glucosa.

Según ciertas otras realizaciones, el medio comprende glicerol.

Según ciertas otras realizaciones, el medio comprende acetato.

También se contempla usar almidón como sustrato de carbono. Dependiendo del microorganismo utilizado, el metabolismo del almidón puede requerir el suplemento de beta-glucosidasa, como la beta-glucosidasa de Neurospora crassa, al medio. Alternativamente, una célula hospedadora de recombinación según la invención además puede modificarse genéticamente para expresar una beta-glucosidasa, como la beta-glucosidasa de Neurospora crassa.

Cuando se emplea un sustrato de carbono fermentable, es posible que la célula hospedadora recombinante produzca el compuesto fenólico o un precursor del mismo directamente a partir de dicho sustrato de carbono primario.

Según determinadas realizaciones, el proceso comprende además:

(ii) cultivar la primera célula hospedadora recombinante en condiciones adecuadas para la producción del compuesto fenólico sulfatado correspondiente.

El experto en la materia conoce bien las condiciones adecuadas para cultivar la célula hospedadora respectiva. Generalmente, la célula hospedadora recombinante se cultiva a una temperatura que varía de aproximadamente 23 a aproximadamente 60 °C, tal como de aproximadamente 25 a aproximadamente 40 °C, tal como a aproximadamente 37 °C. El pH del medio puede variar de pH 1,0 a pH 14,0, tal como de aproximadamente pH 1 a aproximadamente pH 2, de aproximadamente pH 4 a aproximadamente pH 11, de aproximadamente pH 5 a aproximadamente pH 10, de aproximadamente pH 6 a aproximadamente pH 10, o de aproximadamente pH 7 a aproximadamente pH 9,5, por ejemplo a pH 6,0, pH 7,0, pH. 7,5, pH 8,0, pH 8,5, pH 9,0, pH 9,5, pH 10,0, pH 10,5 o pH 11,0.

El proceso puede comprender además iii) recuperar el compuesto fenólico sulfatado. El compuesto fenólico sulfatado puede recuperarse mediante un método convencional para aislar y purificar compuestos químicos de un medio. Los procedimientos de purificación bien conocidos incluyen métodos de centrifugación o filtración, precipitación y cromatográficos como, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel, etc.

Además se proporciona un proceso para la producción de un compuesto fenólico sulfatado, como ácido zostérico, el método comprende sulfatar un compuesto fenólico, como ácido p-cumárico, usando un polipéptido que tiene actividad aril sulfotransferasa como se detalla en este documento. Dicho polipéptido puede seleccionarse del grupo que consiste en:

El experto en la materia conoce bien las condiciones adecuadas para la reacción de sulfatación. Generalmente, la reacción de sulfatación tiene lugar a una temperatura que varía de aproximadamente 23 a aproximadamente 60 °C, tal como de aproximadamente 25 a aproximadamente 40 °C, tal como a aproximadamente 37 °C. La reacción de desaminación puede tener lugar a un pH que varía de pH 1,0 a pH 14,0, tal como de aproximadamente pH 2 a aproximadamente pH 11, tal como de aproximadamente pH 5 a aproximadamente pH 10, de aproximadamente pH 6 a aproximadamente pH 10, o de aproximadamente pH 7 a aproximadamente pH 9,5, por ejemplo a pH 6,0, pH 7,0, pH. 7,5, pH 8,0, pH 8,5, pH 9,0, pH 9,5, pH 10,0, pH 10,5 o pH 11,0.

También se desvela el uso de un polipéptido en la sulfatación de un compuesto fenólico, dicho polipéptido teniendo actividad aril sulfotransferasa como se detalla en este documento. Dicho polipéptido puede seleccionarse del grupo que consiste en:

Para la finalidad de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, debe entenderse que los compuestos fenólicos incluyen aquellos compuestos en donde un grupo hidroxilo está directamente unido a un átomo de carbono bencenoide, y qué compuestos pueden contener o no otros grupos sustituyentes.

Según determinadas realizaciones, el compuesto fenólico es un compuesto representado por la fórmula general (I):

en donde al menos uno de R1, R2 , R3, R4, y R5 son un grupo hidroxilo (-OH);

en donde R1, R2 , R3, R4, R5 y R6 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en haluro, hidrógeno, hidroxilo (-OH), -OR⁷, -OCOR⁷, -NR⁷R⁸, -COR⁷, -COOR⁷, -SR⁷, -OSO³R⁷, -OCSR⁷, -POR⁷R⁸, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo y heteroarilo; en donde R⁷, y R8 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo y heteroarilo;

en donde R¹, R², R³, R⁴, R⁵y R6, están unidos opcionalmente con un elemento puente Yn, formando así uno o más anillos, siendo Yn un enlace o un alquilo C^1-12o un arilo, una estructura carbocíclica, heterocíclica o heteroaromática que tiene 1-3 anillos, 3-8 miembros anulares en cada uno y 0 a 4 heteroátomos, o un heteroalquilo que comprende 1 a 12 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en N, O, S, S(O)^1-2y carbonilo, y en donde n es un número entero entre ¹y ¹².

Los ejemplos específicos de compuestos de Fórmula I incluyen, pero no se limitan a, reservatrol, ácido o-, m- y pcumárico, ácido cafeico, ácido ferúlico, ácido sinápico, curcumina, ácido rosmarínico, alcohol sinapílico, alcohol coniferílico y ácido salvianólico.

Un precursor de un compuesto fenólico según la fórmula I puede ser un compuesto representado por la fórmula general (p-I):

en donde al menos uno de R¹, R², R³, R⁴, y R⁵son un grupo hidroxilo (-OH);

en donde R¹, R², R³, R⁴, R⁵y R6 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en haluro, hidrógeno, hidroxilo (-OH), -OR⁷, -OCOR⁷, -NR⁷R⁸, -COR⁷, -COOR⁷, -SR⁷, -OSO³R⁷, -OCSR⁷, -POR⁷R⁸, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo y heteroarilo; en donde R⁷, y R8 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo y heteroarilo;

Tal precursor puede convertirse en el compuesto fenólico por una célula hospedadora recombinante según la invención, que comprende un polipéptido que tiene actividad tirosina amoniaco liasa. Tal polipéptido eliminará el amoniaco del precursor de Fórmula (p-I) bajo la formación de la molécula correspondiente de Fórmula I. Preferentemente, el precursor p-I es el isómero L.

Según ciertas realizaciones, el precursor de un compuesto fenólico como se emplea en la etapa (i''') es un compuesto de la Fórmula general (p-I) como se define en este documento.

Según ciertas otras realizaciones, el compuesto fenólico es un compuesto representado por la fórmula general (II):

en donde al menos uno de Ri, R², R³, R⁴, y R⁵son un grupo hidroxilo (-OH);

Según determinadas realizaciones, R6 es -COOR⁷.

Según determinadas realizaciones, R⁷es hidrógeno.

Según determinadas realizaciones, R²es hidroxilo (-OH).

Según determinadas realizaciones, R³es hidroxilo (-OH).

Según determinadas realizaciones, R⁴es hidroxilo (-OH).

Según determinadas realizaciones, cada uno de R¹, R², R⁴y R⁵es hidrógeno.

Según ciertos modos de realización, cada uno de R¹, R², y R⁵es hidrógeno.

Según realizaciones particulares, el compuesto fenólico es ácido p-cumárico (Fórmula I: R¹= H, R²= H, R³= OH, R⁴= H, R5= H, Ra=COOH).

Según otras realizaciones particulares, el compuesto fenólico es el ácido cafeico (Fórmula I: R¹= H, R²= H, R³= OH, R⁴= OH, R5= H, Ra=COOH).

Según otras realizaciones particulares, el ácido fenólico es ácido ferúlico (Fórmula I: R¹= H, R²=OCH³, R³= OH, R⁴= H, R5= H, Ra=COOH).

Según otras realizaciones particulares, el ácido fenólico es ácido sinápico (Fórmula I: R¹= H, R²=OCH³, R³= OH, R4=OCH3, R5= H, Ra=COOH).

Según otras realizaciones particulares, el compuesto fenólico es resveratrol (Fórmula I: R¹= H, R²= OH, R³= H, R⁴= OH, R⁵= H, R6=p-hidroxifenilo).

Según otras realizaciones particulares, el compuesto fenólico es vainillina (Fórmula II: R¹= H, R²= H, R³= OH, R⁴= OCH³, R⁵= H, Ra = H).

Según determinadas realizaciones, el compuesto fenólico es un ácido hidroxicinámico.

Según determinadas realizaciones, el compuesto fenólico es un compuesto representado por la fórmula general (I), en donde R¹es hidrógeno; R², R³y R⁴se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno (H), hidroxilo (-OH), alquilo C^1-6y alcoxi C¹-⁶, siempre que al menos uno de R², R³y R⁴sea hidroxilo (-OH); R⁵es hidrógeno y R⁶es COOH. Según determinadas realizaciones, el precursor de un compuesto fenólico como se emplea en la etapa (i''') es un compuesto de la fórmula general (p-I), en donde R¹es hidrógeno; R², R³y R⁴se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno (H), hidroxilo (-OH), alquilo C^1-6y alcoxi C¹-⁶, siempre que al menos uno de R², R³y R⁴sea hidroxilo (-OH); R⁵es hidrógeno y R⁶es COOH.

Según cierta realización, el compuesto fenólico sulfatado obtenido según la presente invención es el ácido zostérico.

Un experto en la materia conoce bien las moléculas dadoras de sulfato adecuadas metabolizadas por un polipéptido que tiene actividad aril sulfotransferasa. Los ejemplos no limitantes incluyen 5'-fosfosulfato de 3'-fosfoadenosina (PAPS), sulfato de paranitrofenilo (pNPS) y sulfato de 4-metilumbeliferilo (MUS). Dichas moléculas dadoras de sulfato pueden emplearse para facilitar la sulfatación de compuestos fenólicos según la invención.

El medio empleado para cultivar la célula hospedadora recombinante puede ser cualquier medio convencional adecuado para cultivar la célula hospedadora en cuestión, y puede formarse según los principios de la técnica anterior. El medio generalmente contendrá todos los nutrientes necesarios para el crecimiento y la supervivencia de la célula hospedadora respectiva, como fuentes de carbono y nitrógeno y otras sales inorgánicas, como sales de sulfato. Los medios adecuados, por ejemplo, medios mínimos o complejos, están disponibles en proveedores comerciales, o pueden prepararse según las recetas publicadas, por ejemplo, el Catálogo de cepas de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC). El medio convencional no limitante bien conocido por la persona experta incluye el caldo Luria Bertani (l B), Caldo Sabouraud Dextrosa (SD), Caldo MS, Levadura Peptona Dextrosa, Bm MY, GMMY, o caldo de extracto de levadura y malta (YM), que están disponibles comercialmente. Un ejemplo no limitante de medios adecuados para cultivar células bacterianas, como células de B. subtilis, L. lactis o E. cotí, incluyendo medios mínimos y medios enriquecidos como caldo Luria (LB), medios M9, medios M17, medios SA, medios MOPS, Caldo Terrific, YT y otros. Los medios adecuados para cultivo de células eucariotas, las células de levadura, son RPMI 1640, MEM, DMEM, los cuales pueden complementarse con suero y/o factores de crecimiento según lo requiera la célula hospedadora particular que se cultiva. El medio para cultivar células eucariotas también puede ser cualquier tipo de medio mínimo, como medio mínimo de levadura.

Algunas definiciones

La "actividad aril sulfotransferasa", como se usa en este documento, se refiere a la capacidad de un polipéptido para catalizar el catalizador de la transferencia de un grupo sulfato desde una molécula dadora a una molécula aceptora de arilo.

La "actividad tirosina amoniaco liasa", como se usa en este documento, se refiere a la capacidad de un polipéptido para catalizar la conversión de L-tirosina en ácido p-cumárico.

La "actividad de fenilalanina amoniaco liasa", como se usa en este documento, se refiere a la capacidad de un polipéptido para catalizar la conversión de L-fenilalanina en ácido trans-cinámico.

"ATP sulfurilasa", como se usa en este documento, se refiere a una enzima que cataliza la reacción: ATP sulfato = difosfato 5'-fosfosulfato de adenosina (APS).

"APS quinasa", como se usa en este documento, se refiere a una enzima que cataliza la reacción: ATP 5'-fosfosulfato de adenosina (APS) = ADP 5'-fosfosulfato de 3'-fosfoadenosina (PAPS).

"PAP fosfatasa", como se usa en este documento, se refiere a una enzima que cataliza la reacción: 5'-fosfato de 3'-fosfoadenosina (PAP) H²O = AMP fosfato.

"Polipéptido", o "proteína" se usan indistintamente en este documento para indicar un polímero de al menos dos aminoácidos unidos covalentemente por un enlace amida, independientemente de la longitud o la modificación postraducción (por ejemplo, glucosilación, fosforilación, lipidación, miristilación, ubiquitinación, etc.). Dentro de esta definición se incluyen D- y L-aminoácidos y mezclas de D- y L-aminoácidos.

"Ácido nucleico" o "polinucleótido" se usan indistintamente en este documento para indicar un polímero de al menos dos unidades o bases de monómero de ácido nucleico (por ejemplo, adenina, citosina, guanina, timina) unidos covalentemente por un enlace fosfodiéster, independientemente de la longitud o la modificación de base.

"Recombinante" o "no natural" cuando se usa con referencia a, p. ej., una célula hospedadora, ácido nucleico o polipéptido, se refiere a un material, o un material correspondiente a la forma natural o nativa del material, que ha sido modificado de manera que de otro modo no existiría en la naturaleza, o es idéntico a los mismos pero producido o derivado de materiales sintéticos y/o mediante manipulación usando técnicas recombinantes. Los ejemplos no limitantes incluyen, entre otros, células hospedadoras recombinantes que expresan genes que no se encuentran dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula o que expresan genes nativos que de otro modo se expresan a un nivel diferente.

"Sustitución" o "sustituido" se refiere a la modificación del polipéptido reemplazando un resto de aminoácido con otro, por ejemplo, el reemplazo de un resto de arginina con un resto de glutamina en una secuencia de polipéptidos es una sustitución de aminoácidos.

"Sustitución conservadora" se refiere a una sustitución de un resto de aminoácido con un resto diferente que tiene una cadena lateral similar, y por tanto generalmente implica la sustitución del aminoácido en el polipéptido con aminoácidos dentro de la misma clase de aminoácidos o similar. A modo de ejemplo y no de limitación, un aminoácido con una cadena lateral alifática puede estar sustituido con otro aminoácido alifático, p. ej., alanina, valina, leucina e isoleucina; un aminoácido con cadena lateral hidroxilo está sustituido con otro aminoácido con una cadena lateral hidroxilo, p. ej., serina y treonina; un aminoácido que tiene una cadena lateral aromática se sustituye con otro aminoácido que tiene una cadena lateral aromática, p. ej., fenilalanina, tirosina, triptófano e histidina; un aminoácido con una cadena lateral básica se sustituye con otro aminoácido con una cadena lateral básica, p. ej., lisina y arginina; un aminoácido con una cadena lateral ácida se sustituye con otro aminoácido con una cadena lateral ácida, p. ej., ácido aspártico o ácido glutámico; y un aminoácido hidrófobo o hidrófilo se reemplaza con otro aminoácido hidrófobo o hidrófilo, respectivamente.

"Sustitución no conservativa" se refiere a la sustitución de un aminoácido en un polipéptido con un aminoácido con propiedades de cadena lateral significativamente diferentes. Las sustituciones no conservativas pueden usar aminoácidos entre, en lugar de dentro de, los grupos definidos y afectan (a) la estructura del esqueleto del péptido en el área de la sustitución (por ejemplo, prolina por glicina) (b) la carga o hidrofobia, o (c) la mayor parte de la cadena lateral. A modo de ejemplo y no de limitación, una sustitución no conservativa a modo de ejemplo puede ser un aminoácido ácido sustituido con un aminoácido básico o alifático; un aminoácido aromático sustituido con un aminoácido pequeño; y un aminoácido hidrófilo sustituido con un aminoácido hidrófobo.

"Deleción" o "eliminado" se refiere a la modificación del polipéptido mediante la eliminación de uno o más aminoácidos en el polipéptido de referencia. Las deleciones pueden comprender la eliminación de 1 o más aminoácidos, 2 o más aminoácidos, 5 o más aminoácidos, 10 o más aminoácidos, 15 o más aminoácidos, o 20 o más aminoácidos, hasta el ¹⁰% del número total de aminoácidos, o hasta el ²⁰% del número total de aminoácidos que forman el polipéptido mientras retienen la actividad enzimática y/o retienen las propiedades mejoradas de una enzima modificada por ingeniería genética. Las deleciones pueden dirigirse a las partes internas y/o partes terminales del polipéptido, en diversas realizaciones, la eliminación puede comprender un segmento continuo o puede ser discontinuo.

"Inserción" o "insertado" se refiere a la modificación del polipéptido mediante la adición de uno o más aminoácidos al polipéptido de referencia. Las inserciones pueden comprender la adición de 1 o más aminoácidos, 2 o más aminoácidos, 5 o más aminoácidos, 10 o más aminoácidos, 15 o más aminoácidos, o 20 o más aminoácidos. Las inserciones pueden estar en las partes internas del polipéptido, o en el extremo carboxi o amino. La inserción puede ser un segmento contiguo de aminoácidos o separado por uno o más de los aminoácidos en el polipéptido de referencia.

"Célula hospedadora", como se usa en este documento, se refiere a una célula viva o microorganismo que es capaz de reproducir su material genético y junto con el material genético recombinante que se ha introducido en él, por ejemplo, mediante transformación heteróloga.

"Expresión" incluye cualquier etapa implicada en la producción de un polipéptido (por ejemplo, enzima codificada) que incluye, pero sin limitación, transcripción, modificación postranscripcional, traducción, modificación postraduccional y secreción.

Como se usa en este documento, "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otra molécula de ácido nucleico a la que se ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle circular de ácido nucleico bicatenario en donde se pueden ligar segmentos adicionales de ácido nucleico. Ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están unidos operativamente. En este documento dichos vectores se denominan "vectores de expresión". Ciertos otros vectores son capaces de facilitar la inserción de una molécula de ácido nucleico exógena en el genoma de una célula hospedadora. En este documento dichos vectores se denominan "vectores de transformación". En general, los vectores de utilidad en las técnicas de ácido nucleico recombinante a menudo están en forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" pueden usarse indistintamente ya que el plásmido es la forma más comúnmente utilizada de un vector. Los expertos en la materia conocen un gran número de vectores adecuados y están disponibles comercialmente.

Como se usa en este documento, "promotor" se refiere a una secuencia de ADN, generalmente cadena arriba (5') de la región codificante de un gen estructural, que controla la expresión de la región codificante proporcionando sitios de reconocimiento y unión para la ARN polimerasa y otros factores que pueden ser necesarios para el inicio de la transcripción. La selección del promotor dependerá de la secuencia de ácido nucleico de interés. Un "promotor funcional en una célula hospedadora" se refiere a un "promotor" que es capaz de soportar el inicio de la transcripción en dicha célula, causando la producción de una molécula de ARNm.

Como se usa en este documento, "unido operativamente" se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar de la manera prevista. Una secuencia de control "unida operativamente" a una secuencia codificante se liga de tal manera que la expresión de la secuencia codificante se consigue en condiciones compatibles con la secuencia de control. Una secuencia promotora está "unidad operativamente" a un gen cuando está suficientemente cerca del sitio de inicio de la transcripción de un gen para regular la transcripción del gen.

"Porcentaje de identidad de secuencia", "% de identidad de secuencia" y "porcentaje de identidad" se usan en este documento para referirse a comparaciones entre una secuencia de aminoácidos y una secuencia de aminoácidos de referencia. El "% de identificación de secuencia", como se usa en este documento, se calcula a partir de las dos secuencias de aminoácidos de la siguiente manera: Las secuencias se alinean usando la Versión 9 del GAP (programa de alineación global) del Genetic Computing Group, usando la matriz BLOSUM62 predeterminada (véase a continuación) con una penalización de apertura de hueco de ^{- 12}(para el primer nulo de un hueco) y una penalización de extensión de hueco de -4 (por cada nulo adicional en el hueco). Después de la alineación, el porcentaje de identidad se calcula expresando el número de coincidencias como un porcentaje del número de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de referencia.

Se utiliza la siguiente matriz BLOSUM62:

Ala 4

Arg -1 5

Asn -2 0 6

Asp -2 -2 1 6

Cys 0 -3 -3 -3 9

Gln -1 1 0 0 -3 5

Glu -1 0 0 2 -4 2 5

Gly 0 -2 0 -1 -3 -2 -2 6

His -2 0 1 -1 -3 0 0 -2 8

Ile -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 4

Leu -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3 2 4

Lys -1 2 0 -1 -3 1 1 -2 -1 -3 -2 5

Met -1 -1 -2 -3 -1 0 -2 -3 -2 1 2 -1 5

Phe -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1 0 0 -3 0 6

Pro -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 7

Ser 1 -1 1 0 -1 0 0 0 -1 -2 -2 0 -1 -2 -1 4

Thr 0 -1 0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 5

Trp -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 1 -4 -3 -2 11

Tyr -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3 -3 -2 -2 2 7

Val 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3 3 1 -2 1 -1 -2 -2 0 -3 -1 4

Ala Arg Asn Asp Cys Gln Glu Gly His Ile Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Val

"Secuencia de referencia" o "secuencia de aminoácidos de referencia" se refiere a una secuencia definida con la que se compara otra secuencia. La secuencia de aminoácidos de referencia puede ser una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23.

Los radicales /grupos alifáticos, como se menciona en este documento, están opcionalmente mono- o polisustituidos y pueden ser ramificados o no ramificados, saturados o insaturados. Los grupos alifáticos insaturados, como se define en este documento, incluyen radicales alquilo, alquenilo y alquinilo. Los radicales alifáticos preferentes incluyen, pero sin limitación, metilo, etilo, vinilo (etenilo), etinilo, propilo, n-propilo, isopropilo, alilo (2-propenilo), 1 -propinilo, metiletilo, butilo, n-butilo, iso-butilo, sec-butilo, ferc-butil butenilo, butinilo, 1 -metilpropilo, 2-metilpropilo, 1,1 -dimetiletilo, pentilo, n-pentilo, 1,1-dimetilpropilo, 1,2-dimetilpropilo, 2,2-dimetilpropilo, hexilo, 1 -metilpentilo, n-heptilo, n-octilo, n-nonilo y ndecilo. Los sustituyentes preferentes para los radicales alifáticos son un grupo alquilo C^1-4, un grupo alcoxi C^1-6lineal o ramificado, F, Cl, I, Br, CF³, CH²F, CHF², CN, OH, SH, NH², oxo, (C=O)R', SR', SOR', SO²R', NHR', NR'R" por lo cual R' y opcionalmente R" para cada sustituyente representa independientemente un grupo alquilo C^1-6lineal o ramificado.

"Alquilo", "radical alquilo" o grupo como se usa en este documento significa hidrocarburos saturados, lineales o ramificados, que pueden ser no sustituidos o mono- o polisustituidos. Por tanto, se entiende que el alquilo insaturado incluye grupos alquenilo y alquinilo, como por ejemplo -CH=CH-CH³o -CEC-CH³, mientras que el alquilo saturado incluye por ejemplo, -CH³y -CH²-CH³. "alquilo C^1-12" incluye alquilo C^1-2, alquilo C^1-3, alquilo C^1-4y alquilo C^1-5, alquilo

C^1-6, alquilo C^1-7, alquilo C^1-8, alquilo C^1-9, alquilo C^1-10y alquilo C^1.11. En estos radicales, alquilo C^1-2representa alquilo

C¹- o C²-, alquilo C^1-3representa alquilo C¹-, C²- o C³-, alquilo C^1-4representa alquilo C¹-, C²-, C³- o C⁴-, alquilo C^1-5representa alquilo C¹-, C²-, C³-, C⁴-, o C⁵-, alquilo C^1-6representa alquilo C¹-, C²-, C³-, C⁴-, C⁵- o C6-alquilo pueden ser metilo, etilo, vinilo (etenilo), propilo, alilo (2-propenilo), 1 -propinilo, metiletilo, butilo, 1-metil propilo,

2-metilpropilo, 1,1 -dimetiletilo, pentilo, 1,1-dimetilpropilo, 1,2-dimetilpropilo, 2,2-dimetilpropilo, hexilo, 1 -metilpentilo, si se sustituye también CHF², CF³o CH²OH etc. Estos radicales alquilo, alquenilo o alquinilo pueden estar opcionalmente mono- o polisustituidos por sustituyentes seleccionados independientemente de un grupo alquilo C^1-4, un grupo alcoxi

C^1.6lineal o ramificado, F, Cl, I, Br, CF³, CH²F, CHF², CN, OH, SH, NH², (C=O)R', SR', SOR', SO²R', NHR', NR'R" por lo cual R' y opcionalmente R" para cada sustituyente representa independientemente grupo alquilo C^1-6lineal o ramificado.

"Arilo" o "radical arilo" como se entiende en este documento significa sistemas de anillo con al menos un anillo aromático pero sin heteroátomos incluso en solo uno de los anillos. Estos radicales arilo pueden estar opcionalmente mono- o polisustituidos por sustituyentes seleccionados independientemente de un grupo alquilo C^1-4, un grupo alcoxi

C^1-6lineal o ramificado, un grupo fenilo opcionalmente al menos mono-sustituido, F, Cl, I, Br, CF³, CH²F, CHF², CN,

OH, SH, NH², oxo, (C=O)R', s R', SOR', SO²R', N(C=O)-OR', NHR', NR'R" por lo cual R' y opcionalmente R" para cada sustituyente representa independientemente un grupo alquilo C^1-6lineal o ramificado. Los ejemplos preferentes de radicales arilo incluyen, pero sin limitación, radicales fenilo, naftilo, fluorantenilo, fluorenilo, tetralinilo o indanilo o antracenilo, que opcionalmente pueden estar mono- o polisustituidos, si no se define lo contrario.

"Alquil-arilo" o "radical alquil-arilo" como se usa en este documento comprende un grupo lineal o ramificado, opcionalmente al menos una cadena de alquilo mono-sustituida que está unida a un grupo arilo, como se ha definido anteriormente. Un radical alquil-arilo preferente es un grupo bencilo, en donde la cadena de alquilo está opcionalmente ramificada o sustituida. Los sustituyentes preferentes para los radicales alquil-arilo son F, Cl, Br, I, NH², SH, OH, SO², CF³, carboxi, amido, ciano, carbamilo, nitro, fenilo, bencilo, -SO²NH², alquilo C-i_6y/o alcoxi C^1-6.

"Heteroarilo" o "radical heteroarilo", como se usa en este documento, se entiende que significa sistemas de anillo heterocíclico que tienen al menos un anillo aromático y pueden contener opcionalmente uno o más heteroátomos del grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno y/o azufre y opcionalmente pueden estar mono- o polisustituidos por sustituyentes seleccionados independientemente de un grupo alquilo C^1-4, un grupo alcoxi C^1-6lineal o ramificado, F, Cl, I, Br, CF³, CH²F, CHF², CN, OH, SH, NH², oxo, (C=O)R', SR', SOR', SO²R', NHR', NR'R" por lo cual R' y opcionalmente R" para cada sustituyente representa independientemente un grupo alquilo C^1-6lineal o ramificado. Los ejemplos preferentes de heteroarilos incluyen, pero sin limitación, furano, benzofurano, tiofeno, benzotiofeno, pirrol, piridina, pirimidina, piridazina, pirazina, quinolina, isoquinolina, ftalazina, benzo-1,2,5-tiadiazol, benzotiazol, indol, benzotriazol, benzodioxolano, benzodioxano, bencimidazol, carbazol y quinazolina.

"Alcoxi", "radical alcoxi" o grupo como se usa en este documento significa un "alquilo" singular unido al oxígeno. "Alcoxi C^1-6" incluye alcoxi C^1-2, alcoxi C^1-3, alcoxi C^1-4, y alcoxi C^1-5, así como alcoxi C^2-3, alcoxi C^2-4, alcoxi C^2-5, alcoxi C^3-4, alcoxi C^3-5, y alcoxi C^4-5. En estos radicales, alcoxi C^1-2representa alcoxi C1- o C2-, alcoxi C^1.3representa alcoxi C¹-, C²o C³-, alquilo C^1.4representa alcoxi C¹-, C²-, C³- o C⁴-, alcoxi C^1.5representa alcoxi C¹-, C²-, C³-, C⁴- o C⁵-, alcoxi C^1.6representa alcoxi C¹-, C²-, C³-, C⁴-, C⁵- o C6-. Los radicales alcoxi pueden ser metoxi, etoxi, propoxi, butoxi, pentiloxi o hexiloxi.

La expresión "precursor de un compuesto fenólico" se refiere a cualquier compuesto que pueda convertirse en un compuesto fenólico por las células hospedadoras como se describe en este documento.

Cuando se indique un límite numérico o un intervalo en este documento, los puntos extremos se incluyen. Además, todos los valores y sub intervalos dentro de un límite numérico o intervalo se incluyen específicamente como si estuvieran escritos explícitamente.

En los siguientes Ejemplos, los ejemplos 2 y 6 implican realizaciones de la invención:

Ejemplos

Ejemplo 1 - Producción de ácido zostérico en E. coli

Una gama de aril sulfotransferasas que incluye SULT1A1 de Rattus norvegicus (SEQ ID NO: 1), SULT1A1 de Homo sapiens (SEQ ID NO: 2), SULT1A1 de Equus caballus (SEQ ID NO: 3), SULT1A1 de Sus scrofa domesticus (SEQ ID n O: 4), SULT1A1 de Canis lupus familiaris (SEQ ID n O: 5) y SULT1E1 de Gallus gallus domesticus (SEQ iD NO: 6) se expresaron en Escherichia coli. Los genes respectivos que codifican SEQ ID NO: 1, 3, 4, 5 y 6 se clonaron amplificados a partir de ADNc de tejido hepático (Zyagen) mediante PCR usando los cebadores enumerados en la Tabla 1. La secuencia de nucleótidos del gen que codifica SEQ ID NO: 2 fue un codón optimizado para la expresión en Escherichia coli (GeneArt, Life Technologies) y amplificado por PCR utilizando los cebadores de la Tabla 1. El plásmido pETDuet-1 se digirió con endonucleasas de restricción NcoI y SalI. Los productos de PCR se clonaron individualmente en el plásmido pETDuet-1 usando la reacción de Gibson (New England Biolabs). Los plásmidos resultantes se transformaron en BL21 (DE3) pLysS (Life Technologies). La Figura 1 muestra el mapa plasmídico del plásmido que codifica SULT1A1 de Rattus norvegicus (SEQ ID NO: 1).

Tabla 1: D ri i n n r l nzim r ^ r l n i n ril lf r n ferasas

Las cepas se cultivaron en medios mínimos M9 que contenían glucosa como fuente de carbono e IPTG 0,1 mM para la inducción de la expresión génica, así como ácido p-cumárico 0,1 mM (pHCA). Después de cuatro días de crecimiento, las muestras se extrajeron por filtración y se analizaron por HPLC.

La concentración de ácido p-cumárico (pHCA) y ácido zostérico en el sobrenadante se cuantificó mediante alto rendimiento (HPLC) y se comparó con los patrones químicos. La HPLC se realizó en una configuración Thermo utilizando una columna HS-F5 y fases móviles: formiato de amonio 5 mM pH 4,0 (A) y acetonitrilo (B) a 1,5 ml min-1, usando un gradiente de elución que comienza en B al 5 %. 0,5 min después de la inyección a 7 min, la fracción de B aumentó linealmente del 5 % al 60 %, y entre 9,5 min y 9,6 la fracción de B disminuyó nuevamente al 5 % y permaneció allí hasta los 12 min. El pHCA y el ácido zostérico se cuantificaron midiendo la absorbancia a 277 nm.

La Tabla 2 muestra el pHCA restante y el ácido zostérico producido en los medios de cultivo. El ácido zostérico se formó con una aril sulfotransferasa heteróloga expresada en un microorganismo ejemplificado por E. coli suministrado con el sustrato.

Tabla 2: Producción de ácido zostérico en E. co li a partir de pHCA a través de la expresión heteróloga de sulfotransferasas.

Ejemplo 2 - Aumento de la producción de ácido zostérico en E. co li

La adición de grupos sulfatados a las dianas depende del suministro de la molécula dadora 5'-fosfosulfato de 3'-fosfoadenosina (PAPS). Se examinó si podríamos aumentar la producción de ácido zostérico sobreexpresando enzimas que proporcionan PAPS y una enzima que elimina el producto 5'-fosfato de 3'-Fosfoadenosina(PAP).

Tabla 3: l n i n nzim im li n l iv i n lf limin i n r ductos.

En E. coli, los genes cysD y cysN codifican las dos subunidades de ATP sulfurilasa (EC: 2,7.7,4), cysC codifica APS quinasa (EC: 2,7.1,25) y cysQ codifica una PAP fosfatasa.

El grupo cysDNC se amplificó por PCR con ADN cromosómico MG1655 de E. coli utilizando los cebadores que se muestran en la tabla 3. El plásmido pRSFDuet-1 (Life Technologies) fue digerido por las endonucleasas de restricción Ndel y BglII. El grupo génico se insertó en el plásmido digerido usando la reacción de Gibson (New England Biolabs). La figura 2 muestra el plásmido resultante. Para la expresión combinada de cysDNC y cysQ en un operón artificial, cysDNCQ, las dos partes fueron amplificadas por PCR con ADN cromosómico MG¹⁶⁵⁵de E. coli usando los cebadores que se muestran en la Tabla 3. De nuevo, las partes se insertaron en el plásmido digerido. La Figura 3 muestra los plásmidos resultantes. El plásmido que expresa SULT1A1 de Homo sapiens (SEQ ID NO: 2) del ejemplo 1 se co-transformó en células BL21(DE3)pLysS de E. coli (DE3) (Life Technologies) con el plásmido que expresa cysDNC o cysDNCQ.

Las células se cultivaron como en el Ejemplo 1 y los sobrenadantes se analizaron para la formación del producto como en el ejemplo 1. La cepa que expresa SULT1A1 en combinación con cysDNCQ también se cultivó sin adición de IPTIG para inducción. La Tabla 4 muestra las concentraciones de pHCA y ácido zostérico.

Tabla 4: Concentraciones de pHCA y ácido zostérico en medios de cultivo con E. coli que expresa una aril sulfotransferasa en combinación con c sDNC c sQ.

Esto muestra que una mayor cantidad de pHCA se transforma en ácido zostérico cuando aumenta la expresión proteica de cysDNC. Aún se forma más ácido zostérico cuando la expresión de proteína cysQ aumenta adicionalmente.

Ejemplo 3 - Se puede formar un producto sulfatado in vivo por coexpresión de una ruta heteróloga y una aril sulfotransferasa

La producción de un producto sulfatado se puede lograr biológicamente mediante la expresión de aril sulfotransferasa como se muestra en el ejemplo 1. El sustrato para sulfatación también puede estar formado por un organismo biológico, y aquí se mostrará para un organismo que expresa una ruta heteróloga que conduce a un compuesto fenólico y que expresa una sulfotransferasa que actúa sobre el compuesto fenólico.

La enzima RmXAL de Rhodotorula mucilaginosa/Rhodotorula rubra (SEQ ID NO: 20) tiene actividad tirosina amoniaco liasa, catalizando así la desaminación no oxidativa del aminoácido tirosina, liberando ácido p-cumárico (pHCA) y amoniaco. El gen que codifica RmXAL fue optimizado por codón usando algoritmos estándar para la expresión en E. coli disponible en GeneArt (Life Technologies) y amplificado por PCR utilizando los cebadores que se muestran en la tabla 5 e insertados en el vector pCDFDuet-1 (Novagen/Life Technologies), que había sido digerido por las enzimas de restricción NdeI y BglII, utilizando la reacción de Gibson (New England Biolabs). La Figura 4 proporciona una imagen del plásmido que expresa RmXAL.

Tabla 5: Ceba r iliz r l l n i n ir in amoniacoliasa

El plásmido resultante se co-transformó en células BL21(DE3)pLysS de E. coli (Life Technologies) solas o junto con el plásmido que expresa SULT1A1 de Homo sapiens (ejemplo 1). Las cepas resultantes se cultivaron en medios M9 con glucosa como fuente de carbono, con IPTG 0,1 mM para inducción de la expresión génica. Para análisis de formación del producto se tomaron muestras como se describió anteriormente (ejemplo 1). La Tabla 6 muestra las concentraciones resultantes de pHCA y ácido zostérico. RmXAL permitió la producción de pHCA sin adición de ningún sustrato, proporcionando así una vía heteróloga desde el metabolismo normal de las células a un producto heterólogo. La expresión adicional de una aril sulfotransferasa, ejemplificada por SULT1A1 de Homo sapiens, permitió la conversión in vivo de pHCA a ácido zostérico. Por tanto, una aril sulfotransferasa puede actuar sobre un compuesto producido in vivo y las células pueden liberar el producto sulfatado resultante al medio.

Tabla 6: Concentraciones de pHCA y ácido zostérico en medios de cultivo con E. coli que expresa una aril sulfotransferasa en combinación con una tirosina amoniaco liasa.

Ejemplo 4 - Disminución de la toxicidad del producto sulfatado

MG1655 de E. coli se cultivó en medios mínimos M9 definidos químicamente con glucosa al 0,2 % como fuente de carbono sin adición adicional o con adiciones de 10 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, ácido p-cumárico 35 mM o 40 mM (pHCA), o con 20 mM o 40 mM del éster sulfato de pHCA (ácido zostérico). Todas las preparaciones de medios se habían ajustado a pH 7. Las células se cultivaron a 37 °C con agitación a 250 rpm en un agitador orbital. Las tasas de crecimiento se examinaron siguiendo la densidad óptica a 600 nm. Las tasas de crecimiento resultantes en la fase de crecimiento exponencial se muestran en la Figura 5. Los cuadrados rellenos representan tasas de crecimiento en medios con pHCA. Los cuadrados abiertos representan tasas de crecimiento en medios con ácido zostérico. Y el círculo representa la tasa de crecimiento en los medios sin ninguna de estas adiciones. Es evidente que la presencia de pHCA es tóxica para las células, mientras que el éster sulfato, ácido zostérico es mucho menor.

Ejemplo 5 - Suministro in vivo de precursor de producto sulfatado

El sustrato que es sujeto de sulfatación puede suministrarse al medio vacío de dichos precursores o puede ser proporcionado por microorganismos en el medio. Aquí se muestra que el ácido p-cumárico que se sulfata para generar ácido zostérico, puede ser producido in vivo por la expresión de una tirosina amoniaco-liasa.

Los genes que codifican las tirosina amoniaco-liasas RcTAL (de Rhodobacter capsulatus; SEQ ID NO: 48), RsTAL (de Rhodobacter sphaeroides; SEQ ID NO: 17) y FjTAL (de Flavobacterium johnsoniae; SEQ ID NO: 14) se clonaron en vectores de expresión como sigue. Los genes (SEQ ID NO: 49, 50 y 51, respectivamente) fueron optimizados para E. coli y sintetizados por GeneArt, se amplificaron por PCR usando los oligonucleótidos que se muestran en la tabla a continuación, y se clonaron en pCDFDuet-1 (Novagen): El plásmido se digirió con NdeI y BglII y se purificó en gel. Los genes se insertaron mediante ensamblaje isotérmico utilizando Gibson Assembly Master Mix (New England Biolabs) y se transformaron en DH5a químicamente competente (cepa de laboratorio) o NEB5a (New England Biolabs), seleccionando resistencia a 50 |jg ml-1 de espectinomicina en medio LB. Los plásmidos resultantes pCBJ215 (RsTAL), pCBJ228 (FjTAL) y pCBJ297 (RcTAL) (Figuras 6 a 8, respectivamente) se co-transformaron por electroporación en la cepa de expresión BL21 de E. coli (DE3) (Invitrogen/life Technologies) junto con un plásmido basado en pETDuet-1 que expresa SULT1A1 de rata (Ejemplo 1). Los cultivos de transformación se sembraron en placas sobre LB que contenían 50 jg ml-1 de espectinomicina y 100 jg ml-1 de ampicilina. También se hizo una cepa de control que portaba pCDFDuet-1.

Cebadores:

Las cepas que albergan plásmidos recombinantes se cultivaron previamente en medio líquido 2xYT con 100 |jg ml-1 de ampicilina y 50 jg ml-1 de espectinomicina y se incubaron a 37 °C y 250 rpm durante la noche. Al día siguiente, cada cultivo previo se transfirió a 5 ml de medio mínimo M9 con glucosa al 0,2 %, tirosina 2 mM e IPTG 1 mM para inducción de expresión. Los cultivos se colocaron en una incubadora a 37 °C con agitación a 250 rpm durante la noche. Los sobrenadantes se recogieron luego por centrifugación dos veces y se aplicaron al análisis de HPLC como se describe en el ejemplo 1, y los títulos de ácido p-cumárico (pHCA) y ácido zostérico (ZA) se cuantificaron utilizando patrones químicos y se presentan en la tabla a continuación.

Aquí, es evidente que el ácido zostérico se forma cuando hay un suministro de ácido p-cumárico exógeno o si las células son capaces de producir ácido p-cumárico. En conclusión, se puede formar un producto sulfatado a partir de una molécula precursora no sulfatada, cuando este se produce in vivo.

Adicionalmente, los datos muestran sorprendentemente que el empleo de la tirosina amoniaco-liasa de Flavobacterium johnsoniae (FjTAL; SEQ ID NO: 14) da como resultado un mayor suministro de molécula precursora no sulfatada (aquí: ácido p-cumárico), que a su vez conduce a un mayor rendimiento de producto sulfatado (aquí: ácido zostérico) en comparación con otras tirosina amoniaco-liasas.

Ejemplo 6 - Producción de productos sulfatados en otros hospedadores

Se demostró que se puede producir ácido zostérico in vivo en Escherichia coli por expresión de una aril sulfotransferasa. Para demostrar que la reacción es posible en otros microorganismos, aquí se muestra que la levadura Saccharomyces cerevisiae también se puede utilizar como hospedador para la producción.

El gen que codifica la aril sulfotransferasa SULT1A (Ejemplo 1) se clonó después de un promotor TEF1 en un plásmido episómico con un origen de replicación de 2 micrómetros como sigue. El gen se amplificó por PCR usando los cebadores CBJP633 y CBJP634. Alternativamente, el gen fue optimizado por codón para E. coli y sintetizado por GeneArt y amplificado por los cebadores CBJP635 y CBJP636. El promotor TEF1 (Jensen et al., 2014, FEMS Yeast Res 14: 238-248) se amplificó por PCR utilizando los cebadores PTEF1_fw y PTEF1_rv. El plásmido pCfB132 (Jensen et al., mencionado anteriormente) se digirió mediante las enzimas de restricción AsiSI y Nt.BsmI. Los tres fragmentos - plásmido, promotor TEF1 y gen que codifica SULT1A1 - se ensamblaron usando un procedimiento de clonación por escisión de uracilo, dando como resultado los plásmidos pCBJ283 y pCBJ284 (Figuras 9 y 10, respectivamente, que posteriormente se transformó en la cepa CEN.PK102-5B de Saccharomyces cerevisiae seleccionando para crecimiento en placas de medios sintéticos que carecen de uracilo. También se realizó una cepa de control por transformación de pCfB132 en CEN.PK102-5B.

Cebadores:

Las cepas se cultivaron en medio Delft modificado (Jensen etal., mencionado anteriormente) con 20 mg/ml de histidina y 60 mg/ml de leucina y ácido p-cumárico 10 mM durante la noche a 30 °C con aireación. El sobrenadante se aisló y examinó por HPLC como se describe en el Ejemplo 1. La siguiente tabla muestra que el ácido zostérico (ZA) fue producido por la cepa que expresa SULT1A1 y no por la cepa de control que carece de una sulfotransferasa.

Es evidente que el ácido zostérico se forma solo cuando se expresa una sulfotransferasa en la levadura, y que el gen que lo codifica puede ser natural o codificado por un gen sintético con un codón específico de optimización. En conclusión, las reacciones de sulfatación se muestran catalizadas por sulfotransferasas en E. colitambién se catalizan cuando las sulfotransferasas se expresan en otros organismos, como se demuestra aquí para la levadura S. cerevisiae. La eficacia de la producción puede verse afectada por medios tales como el uso de codón de los genes que codifican la sulfotransferasa. Por tanto las levaduras que expresan sulfotransferasas pueden ser capaces de desintoxicar compuestos aromáticos como ácido p-cumárico y formar productos sulfatados como ácido zostérico.

Ejemplo 7 - Una gama de compuestos son sustratos para sulfatación in vivo

Aquí se muestra que la expresión de una aril sulfotransferasa puede ser capaz de convertir varios sustratos. Algunos de estos son inhibidores que se pueden encontrar en el hidrolizado de biomasa utilizado como sustrato para crecimiento celular y producción en biotecnología. Los compuestos también incluyen algunos que son de interés biotecnológico como productos de un cultivo celular o son algunos cuyo éster sulfato es de interés económico.

Se examinaron diferentes sulfotransferasas para determinar sus especificidades de sustrato contra tres sustratos. Se probaron las sulfotransferasas mencionadas en el ejemplo 1, así como otras adicionales. Los genes que las codifican se clonaron como se describe en el ejemplo 1 usando los cebadores que se muestran en la tabla a continuación de las bibliotecas de ADNc de los organismos respectivos, excepto para SULT1A1 de rata (Rattus norvegicus) optimizado por codón para E. coli (descrito anteriormente). Los vectores resultantes se transformaron en BL21(DE3)pLysS.

Cebadores:

Las cepas resultantes se cultivaron en medio M9 que contenía pHCA 100 j M, resveratrol 95 j M o kaempferol 87 j M. Los cultivos se cultivaron durante la noche a 37 °C, 300 rpm. Al día siguiente, los sobrenadantes se aislaron y se examinaron por HPLC como se describe en el ejemplo 1. BL21(DE3)pLysS se usaron como cepa de control y no convirtieron los sustratos.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un proceso para la producción de un compuesto fenólico sulfatado, que comprende:

(i') poner en contacto un medio que comprende un compuesto fenólico con una primera célula hospedadora recombinante; o

(i") poner en contacto un medio que comprende un sustrato de carbono fermentable con una primera célula hospedadora recombinante; o

(i''') poner en contacto un medio que comprende un precursor de un compuesto fenólico con una primera célula hospedadora recombinante;

en donde la primera célula hospedadora recombinante comprende un polipéptido heterólogo que tiene una actividad aril sulfotransferasa, y

en donde la primera célula hospedadora recombinante ha sido modificada adicionalmente para tener una expresión proteica aumentada de (i) una ATP sulfurilasa, (ii) una APS quinasa y/o (iii) una PAP fosfatasa en comparación con una célula hospedadora idéntica que no lleva dicha modificación.

2. El proceso según la reivindicación 1, que comprende adicionalmente:

3. El proceso según las reivindicaciones 1 o 2, en donde el polipéptido heterólogo que tiene una actividad aril sulfotransferasa es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13, y tiene actividad aril sulfotransferasa.

4. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicha primera célula hospedadora recombinante comprende además un polipéptido heterólogo que tiene una actividad tirosina amoniaco liasa o un polipéptido heterólogo que tiene actividad fenilalanina amoniaco liasa.

5. El proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde en la etapa (i'), (i'') o (i''') el medio se pone en contacto adicionalmente con una segunda célula hospedadora recombinante que comprende un polipéptido heterólogo que tiene una actividad tirosina amoniaco liasa o una tercera célula hospedadora recombinante que comprende un polipéptido heterólogo que tiene actividad fenilalanina amoniaco liasa.

6. El proceso según las reivindicaciones 4 o 5, en donde el polipéptido heterólogo que tiene una actividad tirosina amoniaco liasa es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23, y tiene actividad tirosina amoniaco liasa.

7. El proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el compuesto fenólico está representado por la fórmula general (I):

en donde al menos uno de R¹, R², R³, R⁴y R⁵es un grupo hidroxilo (-OH);

en donde R¹, R², R³, R⁴, R⁵y R6 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en haluro, hidrógeno, hidroxilo (-OH), -OR⁷, -OCOR⁷, -NR⁷R⁸, -COR⁷, -CO⁰R⁷, -SR⁷, -OSO³R⁷, -OCSR⁷, -POR⁷R⁸, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo y heteroarilo; en donde R⁷, y R8 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo y heteroarilo;

en donde R¹, R², R³, R⁴, R⁵y R6, están unidos opcionalmente a un elemento puente Yn, form anillos, siendo Yn un enlace o un alquilo C^1-12o un arilo, una estructura carbocíclica, heterocíclica o heteroaromática que tiene 1-3 anillos, 3-8 miembros anulares en cada uno y 0 a 4 heteroátomos, o un heteroalquilo que comprende 1 a 12 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en N, O, S, S(O)-i^_2y carbonilo, y en donde n es un número entero entre 1 y 12; o en donde el compuesto fenólico está representado por la fórmula general (II):

en donde al menos uno de Ri, R², R³, R⁴y R⁵es un grupo hidroxilo (-OH);

en donde R¹, R², R³, R⁴, R⁵y R6, están unidos opcionalmente a un elemento puente Yn, formando así uno o más anillos, siendo Yn un enlace o un alquilo C^1-12o un arilo, una estructura carbocíclica, heterocíclica o heteroaromática que tiene 1-3 anillos, 3-8 miembros anulares en cada uno y 0 a 4 heteroátomos, o un heteroalquilo que comprende 1 a 12 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en N, O, S, S(O)^1-2y carbonilo, y en donde n es un número entero entre 1 y 12.

8. El proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el precursor de un compuesto fenólico en la etapa (i''') es un compuesto de la fórmula general (p-I):

en donde al menos uno de R¹, R², R³, R⁴y R⁵es un grupo hidroxilo (-OH);

9. El proceso según las reivindicaciones 7 u 8, en donde cada uno de R¹, R², R⁴y R⁵es hidrógeno, R³es hidroxilo ( OH) y R6 es -COOH.

10. Una célula hospedadora recombinante que comprende un primer polipéptido heterólogo que tiene actividad aril sulfotransferasa y ha sido modificado adicionalmente para tener una expresión proteica aumentada de (i) una ATP sulfurilasa, (ii) una APS quinasa y/o (iii) una PAP fosfatasa en comparación con una célula hospedadora idéntica que no lleva dicha modificación.

11. La célula hospedadora recombinante según la reivindicación 10, en donde el polipéptido heterólogo que tiene actividad aril sulfotransferasa es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13, y tiene actividad aril sulfotransferasa.

12. La célula hospedadora recombinante según las reivindicaciones 10 u 11, que comprende además un segundo polipéptido heterólogo que tiene actividad tirosina amoniaco liasa y/o un tercer polipéptido heterólogo que tiene actividad fenilalanina amoniaco liasa.

13. La célula hospedadora recombinante según la reivindicación 12, en donde el heterólogo que tiene actividad tirosina amoniaco liasa es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23, y tiene actividad tirosina amoniaco liasa.

14. Una composición que comprende una primera célula hospedadora recombinante que comprende un polipéptido heterólogo que tiene actividad aril sulfotransferasa y ha sido modificado adicionalmente para tener una expresión proteica aumentada de (i) una ATP sulfurilasa, (ii) una APS quinasa y/o (iii) una PAP fosfatasa en comparación con una célula hospedadora idéntica que no lleva dicha modificación; y una segunda célula hospedadora recombinante que comprende un polipéptido heterólogo que tiene actividad tirosina amoniaco liasa o una tercera célula hospedadora recombinante que comprende un polipéptido heterólogo que tiene actividad fenilalanina amoniaco liasa.

15. La composición según la reivindicación 14, en donde el polipéptido heterólogo que tiene una actividad aril sulfotransferasa es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13, y tiene actividad aril sulfotransferasa; y/o en donde el polipéptido heterólogo que tiene actividad tirosina amoniaco liasa es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23, y tiene actividad tirosina amoniaco liasa.