JP4075562B2 - メチル基転移酵素、それをコードする遺伝子、その遺伝子を含有する形質転換体、及びその遺伝子を用いる形質転換法 - Google Patents
メチル基転移酵素、それをコードする遺伝子、その遺伝子を含有する形質転換体、及びその遺伝子を用いる形質転換法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、環境ストレスに対する耐性が付与された生物、及びその作出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ベタイン（グリシンベタイン、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシン）は、外的浸透圧変化に応じて細胞内の浸透圧を維持するための適合溶質の１つであり、多くの耐塩性生物において、種々の環境ストレスに反応して生合成される。
【０００３】
最も良く知られているベタインの生合成経路は、コリンの２段階酸化である。多くのバクテリア、植物、動物は、乾燥又は塩ストレスの条件のもとでベタインを蓄積する。これらの生物においては、コリンからベタインアルデヒド、さらにベタインアルデヒドからベタインへの２段階酸化によってベタインが合成されることが分かっている。
【０００４】
このうち、ベタインアルデヒドからベタインを生成する第２段階目に関与する酵素は、植物、動物、バクテリアにおいて同じもの、つまり、ＮＡＤ+依存のベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＢＡＤＨ）である。
反対に、コリンからベタインアルデヒドを生成する第１段階目に関与する酵素は、これら生物の間で異なる。植物では、第１段階目はリスケ（Rieske）型の鉄−硫黄酵素であるコリンモノオキシゲナーゼ（ＣＭＯ）によって触媒される。動物や多くのバクテリアにおいては、第１段階目は膜結合コリンデヒドロゲナーゼ（ＣＤＨ）又は溶解性コリンオキシダーゼ（ＣＯＸ）によって触媒される。また、ある種のバクテリアにおいては、ＣＤＨやＣＯＸが１段階目だけでなく２段階目も触媒する。
【０００５】
しかし、大腸菌のＣＤＨ及びＢＡＤＨ、ホウレンソウのＣＭＯ及びＢＡＤＨ、バクテリアのＣＯＸをそれぞれ植物に導入する試みが行われたが、すべてにおいてベタインはわずかしか蓄積しなかった（例えば、非特許文献１参照）。
【０００６】
古細菌のメタン細菌、好気性従属真正細菌、嫌気性光栄養細菌、シアノバクテリアの中には単純な炭素源からベタインを合成するものがあることは今まで示唆されていたが、これらの生合成経路はほとんど知られていなかった。しかし最近、好気性従属真正細菌であるActinopolyspora halophila（アクチノポリスポラハロフィラ；以下、A. halophilaと記載する。）、嫌気性光栄養細菌であるEctothiorhodopspira halochloris（エクトチオロドスピラ ハロクロリス；以下、E. halochlorisと表記する。）が、グリシンから一連のメチル化反応によってベタインを合成することがわかった。そして２種のメチル基転移酵素遺伝子がE. halochlorisから単離された。
【０００７】
２種の遺伝子のうち、第１の遺伝子によってコード化された酵素、グリシンサルコシンメチル基転移酵素（ＧＳＭＴ）は、グリシンをサルコシンに、サルコシンをジメチルグリシンに変換するメチル化反応を触媒する。第２の遺伝子によってコード化された酵素、サルコシングリシンメチル基転移酵素（ＳＤＭＴ）はサルコシンをジメチルグリシンに、ジメチルグリシンをベタインに変換するそれぞれのメチル化反応を触媒する。これら両方の反応において、Ｓ−アデノシルメチオニン（AdoMet）がメチル基供与体として作用する。一方A. halophilaからは、Ｎ−及びＣ−末端部分が、E. halochlorisから単離されたＧＳＭＴ及びＳＤＭＴの配列とそれぞれ相同の配列を持つ１つのオープンリーディングフレームが発見された。A. halophilaのＧＳＭＴの機能性は得られなかったが、A. halophilaのＳＤＭＴがE. halochlorisのＳＤＭＴと類似した基質特異性を持っていることがわかった。
【０００８】
これらベタイン合成に関する遺伝子をEscherichia coli（エシェリキア コリ；以下、E.coliと表記する。）に導入することによって、導入前のE.coliに比べ耐塩性が増強される事がわかっている。そこで、形質転換後も高レベルに環境ストレス耐性を発現することのできる新規遺伝子、及びそれを用いた、より高いストレス耐性を植物に付与する方法が求められていた。
【０００９】
【非特許文献１】
デニス・ロンテン（Denis Rontein）、ギルス・バセット（Gilles Basset）、アンドリュー・ディー・ハンソン（Andrew D. Hanson）著、植物における耐浸透圧性物質の蓄積の代謝工学（Metabolic Engineering of Osmoprotectant Accumulation in Plants）、「メタボリック エンジニアリング（Metabolic Engineering）」、（米国）、２００２年１月、第４巻、第１号、ｐ.４９−５６
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明の目的は、ベタイン合成に関与するメチル基転移酵素、それをコードする遺伝子、及びそれを用いる形質転換によって高レベルに耐環境性を発現することができる生物と、それを作出するための形質転換方法とを提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、耐塩性ラン藻からベタイン合成に関与する２種のメチル基転移酵素及びそれらをコードする遺伝子を取得し、それらを用いて供発現系を構築し、ラン藻に導入することによって上記目的が達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち本発明は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列で表されるグリシンサルコシンメチル基転移酵素である。
本発明は、前記グリシンサルコシンメチル基転移酵素をコードする遺伝子である。
本発明は、配列表の配列番号２に記載の塩基配列で表される前記の遺伝子である。
本発明は、前記遺伝子を含むベクター及び形質転換体である。
【００１３】
本発明は、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列で表されるジメチルグリシンメチル基転移酵素である。
本発明は、前記ジメチルグリシンメチル基転移酵素をコードする遺伝子である。
本発明は、配列表の配列番号４に記載の前記遺伝子である。
本発明は、前記遺伝子を含むベクター及び形質転換体である。
【００１４】
本発明は、前記グリシンサルコシンメチル基転移酵素をコードする遺伝子又は前記配列表２に記載の遺伝子と、前記ジメチルグリシンメチル基転移酵素をコードする遺伝子又は前記配列表４に記載の遺伝子とを含む供発現ベクター及び形質転換体である。
【００１５】
本発明は、前記供発現ベクターを宿主細胞に導入する形質転換法である。
本発明は、前記配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列で表されるグリシンサルコシンメチル基転移酵素をコードする遺伝子又は前記配列番号２に記載の塩基配列で表される遺伝子を含むベクターと、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列で表されるジメチルグリシンメチル基転移酵素をコードする遺伝子又は前記配列番号４に記載の塩基配列で表される遺伝子を含むベクターとを用いる、前記の形質転換法である。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明において、メチル基転移酵素及びそれをコードする遺伝子の取得には、ラン藻（シアノバクテリア）の１種であるAphanothece halophytica（アファノティーキ ハロフィティカ；以下、A. halophyticaと記載する。）を用いると良い。A. halophyticaは、０．２５Ｍ〜３．０Ｍ ＮａＣｌの広い範囲の塩分濃度条件下で生育することができる耐塩性ラン藻である。A. halophyticaは、高塩濃度下においてベタインを１mol/l以上蓄積する性質がある。
A. Halophyticaにおいてベタインは、前記E. Halochlorisと同様に、グリシンからサルコシン、サルコシンからジメチルグリシン、ジメチルグリシンからベタインの３段階のメチル化反応によって生合成される。これらの反応をE. Halochlorisとは異なる２種類の酵素が触媒する。
【００１７】
第１の酵素は、グリシンサルコシンメチル基転移酵素（ＧＳＭＴ）である。ＧＳＭＴは、グリシンの窒素にメチル基を転移しサルコシンを生成する、１段階目の反応を触媒する。さらに、サルコシンの窒素にメチル基を転移しジメチルグリシンを生成する、２段階目の反応も触媒する。
第２の酵素は、ジメチルグリシンメチル基転移酵素（ＤＭＴ）である。ＤＭＴは、ジメチルグリシンの窒素にメチル基を転移しベタインを生成する、３段階目の反応を触媒する。
これら３段階のメチル化反応において、Ｓ−アデノシルメチオニンがメチル基供与体として作用する。Ｓ−アデノシルメチオニンはメチル基を転移した後、Ｓ−アデノシルホモシステインになる。
【００１８】
メチル基転移酵素のアミノ酸配列は、例えば、ペプチドシーケンサーにより決定することができる。
【００１９】
これらメチル基転移酵素をコードする遺伝子は、例えば、A. halophyticaのＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ反応によりそれぞれのコード領域を増幅し、得られたＤＮＡ断片をベクターに組み込み、遺伝子解析装置を用いることによってその塩基配列を決定する。
【００２０】
このようにして決定されるＤＮＡ断片の塩基配列及びこれにより推定されるアミノ酸配列は、配列表の配列番号１〜４に示すものが挙げられるが、前記ＤＮＡ断片がコードするポリペプチドがグリシンサルコシンメチル基転移酵素活性又はジメチルグリシンメチル基転移酵素活性を損なわない範囲で、一部のアミノ酸又は核酸を除去、置換又は付加する等の改変を行ったものも本発明に含まれる。
【００２１】
供発現系の構築方法は、例えば、得られた２種のＤＮＡをそれぞれ、宿主細胞内で発現するプロモーター等を含むベクターと連結させ、得られた２種のベクターを互いに連結させることによって行う。このようにして構築した供発現ベクターをE. coli等に組み込み増幅させた後、宿主細胞に導入する。
【００２２】
ベクターを宿主細胞に導入するには、外来遺伝子を導入するための常用方法、例えばアグロバクテリウム法、パーティクルガン法等の方法を用いることができる。また外来遺伝子が導入された細胞を再生するためにも常用の組織培養による方法を用いることができる。
【００２３】
また本発明においては、光合成能を有する下等植物である淡水性ラン藻Synechococcus sp, PCC 7942（シネココッカス エスピー ピーシーシー ７９４２；以下、Synechococcusと表記する。）を宿主の１例として用いるが、ベタインは下等植物であるラン藻類から高等植物にわたってその作用が有効と考えられるため、本発明は全ての光合成植物に適用することが可能である。このような植物としては、例えば、タバコ、トウモロコシ、イネ、小麦、大麦、トマト、ジャガイモ、大豆、ワタ等の草本植物、さらにはユーカリ、アカシアなどの木本植物等に広く適用することができる。
【００２４】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
【００２５】
［培養条件］
E. coil DH5α及びE. coil BL21(DE3)をLuria-Bertani培地（ＬＢ培地）又は０．２％のグルコースを唯一の炭素源として添加した最少培地で、３７℃で増殖させた。最終濃度５０μg/mlでアンピシリンを用いた。A. halophytica細胞も同様に増殖させた。TSK Bio Assist Qカラムは（東ソー（株））のものを用いた。放射能標識したＳ−アデノシル−Ｌ−［メチル−14Ｃ］−メチオニンはアマルシャム バイオサイエンスのものを用いた。
【００２６】
［メチル基転移酵素遺伝子の単離］
メチル基転移酵素遺伝子はA. halophyticaのＤＮＡを鋳型とし、NcoＩ及びBamHＩの制限酵素部位を含む一組のプライマーを用いたＰＣＲ反応によって増幅させた。ＧＳＭＴのコード領域（７９５ｂｐ）の増幅にはフォワードプライマー（５´−ＡＡＣＣＡＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＡＧＡＡＡＡＡＣＡ−３´（配列表の配列番号５））及びリバースプライマー（５´−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＴＣＴＴＴＴＴＴＣＧＣＡＡＣ−３´（配列表の配列番号６））を用いた。ＤＭＴのコード領域（８３４ｂｐ）の増幅にはフォワードプライマー（５´−ＴＴＣＣＡＴＧＧＣＴＡＡＡＧＣＡＧＡＣＧＣＡＧＴＣ−３´（配列表の配列番号７））及びリバースプライマー（５´−ＧＣＧＧＡＴＣＣＣＴＡＧＧＧＴＴＴＧＴＧＧＡＡＣＴＴ−３´（配列表の配列番号８））を用いた。
【００２７】
ＧＳＭＴから増幅されたＤＮＡ断片（ApGSMT）とＤＭＴから増幅されたＤＮＡ断片（ApDMT）は、別々にプラスミドベクターの１種であるpBluescriptSK+（インビトロジェン社）のEcoRＶ制限部位に連結し、ApGSMTからはpApGSMTSK+、ApDMTからはpApDMTSK+を得た。これら２種のプラスミドをE. coliDH5αに導入した。プラスミド中のApGSMTとApDMTのＤＮＡ配列はマルチキャピラリーＤＮＡシーケンサ（（株）島津製作所）によって解析された。
【００２８】
［発現ベクターの構築］
Ｔ７プロモーターを含むプラスミドベクターの一種、pET3d（ノバジェン社）を用い、これをNcoＩとBamHＩによって二重消化した。pApGSMTSK+をNcoＩとBamHＩによって二重消化し、消化されたpET3dに連結し、pApGSMTを得た。一方、pApDMTSK+もNcoＩとBamHＩによって二重消化し、消化されたpET3dに連結し、pApDMTを得た。これら２種のプラスミド、pApGSMTとpApDMTはそれぞれApGSMTとApDMTとを含んでいる。
【００２９】
［供発現ベクターの構築］
プラスミドpApGSMTをBglＩＩとBamHＩとによって二重消化し、Ｔ７プロモーター部位とApGSMTの全塩基配列とを含むＤＮＡ断片を得た。一方、pApDMTをBamHＩで消化した。前記ＤＮＡ断片をpApDMTのBamHＩ制限部位に連結し、ApGSMTとApDMTの両方を含んだ供発現プラスミドpApGSDMTを得た。
【００３０】
［E. coilにおけるメチル基転移酵素遺伝子の発現］
プラスミドpApGSMT、pApDMT及びpApGSDMTを、E. coil BL21（DE3）に導入した。
イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による誘導によってプラスミド上のＴ７プロモーターが働き、E. coliにおいてpApGSMTは酵素ＧＳＭＴを発現し、pApDMTは酵素ＤＭＴを発現した。ＩＰＴＧの濃度が０．１〜１．０ｍＭのとき、E. coliに高レベルに発現され、発現レベルはＩＰＴＧが最終濃度の０．５ｍＭのときにほとんど頭打ちとなった。
また、E. coliにおいてpApGSDMTは酵素ＧＳＭＴと酵素ＤＭＴとを発現した。これら２種の遺伝子の供発現は発現レベルに影響を及ぼさなかった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析の結果、ＧＳＭＴ、ＤＭＴは両方とも、０．５ｍＭのＩＰＴＧを誘導した後に供発現細胞において高レベルに発現された。
【００３１】
［E. coilにおいて発現したメチル基転移酵素の精製］
発現した細胞は、50μg/mlのアンピシリンを含むＬＢ培地の中で６２０nmにおける濁度が０．６〜０．８となる対数増殖中期まで増殖させた。そして、０．５ｍＭのＩＰＴＧを加え、細胞をさらに３時間増殖させた。細胞は５０００×ｇで１０分間遠心し、バッファーＡ（２０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ８．０、２ｍＭの２−メルカプトエタノール含有）で２回洗浄することにより採取した。全細胞抽出物はKubota Insonator201 M（クボタ（株））により１８０Ｗ、１５分の音波処理を行うことによって得られた。未粉砕細胞は１０,０００×ｇ、１０分間の遠心により除去された。
【００３２】
発現した酵素ＧＳＭＴは、２５％硫酸アンモニウムを添加して沈殿させた。沈殿分画をバッファーＡに溶解し、バッファーＡを用いて透析を行った。透析された溶液分画は、TSK BioAssist Qカラム（4.6mm×5.0cm）に通した。さらにＧＳＭＴ分画を０〜１０００ｍＭ ＮａＣｌによって勾配溶離させた。２００〜３００ｍＭで溶出した活性分画を集め、再びバッファーＡで透析を行い、ＨＰＬＣカラムに通した。ＨＰＬＣを３回行った後、精製されたＧＳＭＴが得られた。
【００３３】
発現した酵素ＤＭＴは、５０〜７５％硫酸アンモニウムを添加して沈殿させた。沈殿分画をバッファーＡに溶解し、バッファーＡを用いて透析を行った。透析された溶液分画は、TSK BioAssist Qカラム（4.6mm×5.0cm）に通した。さらにＤＭＴ分画を０〜１０００ｍＭ ＮａＣｌによって勾配溶離させた。３５０〜４５０ｍＭで溶出した活性分画を集め、再びバッファーＡで透析を行い、ＨＰＬＣカラムに通した。ＨＰＬＣを３回行った後、精製されたＤＭＴが得られた。
【００３４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥから推定した酵素の分子量はＧＳＭＴが３０ｋＤａ、ＤＭＴが３４ｋＤａであった。Superdex200 column（60×2.6cm）ゲル濾過カラムクロマトグラフィー（アマルシャムファルマシアバイオテク）によって推定された、活性状態の酵素の分子量は、ＧＳＭＴが３２ｋＤａ、ＤＭＴが２８ｋＤａであった。ゲル濾過によるこの結果は、両方の酵素がモノマーであることを示唆している。
【００３５】
［E. coilにおいて発現した酵素の活性］
メチル基転移酵素活性を、Rohaらの方法（Roha A、Wagner C、MacDonald RG、Bresnick E、J. Biol. Chem、1994年、269巻、p. 5750-5756）に準じて計測した。基質としては、メチル基受容体として作用するいくつかの種類の物質を用い、それぞれについて試験を行った。反応は下記の反応混合物に精製した４ｍＭメチル基転移酵素Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（４５ｎＣｉ Ｓ−アデノシル−Ｌ−［メチル−14Ｃ］−メチオニン）２５μｌを添加することによって開始した。
【００３６】
【００３７】
３７℃で３０分間放置した後、残留Ｓ−アデノシル−Ｌ−［メチル−14Ｃ］−メチオニンを吸着する炭素懸濁液（０．１Ｍ酢酸中１３３ｇ／ｌ）７５μｌを加えることによって反応を停止させ、氷中で１０分間放置した。１０分間遠心した後、転移された14Ｃ−メチル基を液体シンチレーションカウンターmodel 3200C（アロカ（株））によってアッセイするために、７５μｌの上澄み液を取り除いた。酵素活性は、１分間あたり転移されたメチル基のナノモル数として計算された。反応混合物のｐＨは下記のバッファーによって調節された。
【００３８】
１２５ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０〜７．０）
１２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．０〜８．０）
１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５〜８．８）
【００３９】
図１（メチル基転移酵素活性；Methyltransferase activity）は、得られたＧＳＭＴ及びＤＭＴの酵素活性の試験結果を示す。すなわち、図１は、メチル基受容体となり得る各基質に対するＤＳＭＴ及びＤＭＴの相対活性を表す。
【００４０】
ＧＳＭＴについては、グリシン（glycine）、サルコシン（sarcosine）、ジメチルグリシン（dimethylglycine）、プロリン（proline）、アラニン（alanine）、イソロイシン（isoleucine）、バリン（valine）、アスパラギン（asparagine）、グルタミン（glutamine）、ロイシン（leucine）、セリン（serine）、スレオニン（threonine）、フェニルアラニン（phenylalanine）、メチオニン（methionine）、システイン（cysteine）、エタノールアミン（ethanolamine;（EA））、モノメチルエタノールアミン（monomethyl-EA）、ホスホリルエタノールアミン（phosphoryl-EA）、ホスファチジルエタノールアミン（phosphatidyl-EA）の１９種を基質に用い、それぞれについて試験を行った。
【００４１】
ＤＭＴについては、上記１９種の基質に加え、イソ吉草酸（isovaleric acid）、酪酸（n-butyric acid）、ｔ−ブチル酢酸（t-butylacetic acid）、プロピオン酸（propionic acid）を基質に用い、それぞれについて試験を行った。
図１が示すように、ＧＳＭＴは、グリシンとサルコシンに対して厳密な特異性を有し、ＤＭＴはジメチルグリシンのみに対して厳密な特異性を有していた。
【００４２】
また、精製されたＧＳＭＴ及びＤＭＴはアルカリｐＨにおいて高い活性を示した。ＧＳＭＴ及びＤＭＴの最適ｐＨは、Ｔｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液、ｐＨ８．８において得られた。
【００４３】
［E. coliにおいて発現した酵素の特性］
メチル基受容体であるグリシン、サルコシン及びジメチルグリシンの濃度をそれぞれ０ｍＭ〜５０ｍＭに変化させ、一方、メチル基供与体であるＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンの濃度は０〜１０ｍＭに変化させ、ＧＳＭＴ及びＤＭＴの動力学的パラメーターであるＫｍを計測した。グリシンとサルコシンに対し特異性を有するＧＳＭＴは、グリシンに対するＫｍ値が１．５ｍＭ、サルコシンに対するＫｍ値が０．８ｍＭ、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニンに対するＫｍ値が０．６５ｍＭであり、これらの基質に対して低い値を示した。
【００４４】
ジメチルグリシンに対し特異性を有するＤＭＴは、ジメチルグリシンに対するＫｍ値が０．１８ｍＭ、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニンに対するＫｍ値が０．５ｍＭであり、両方の基質に対して低い値を示した。
【００４５】
メチル基転移酵素の強力な阻害剤であるＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインは、グリシンがメチル基受容体として使用されたときは０．８ｍＭ、サルコシンがメチル基受容体として使用されたときは１．０ｍＭの濃度で、ＧＳＭＴの活性を完全に阻害した。１．０ｍＭのＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインの存在下で、ＤＭＴ活性も完全に阻害された。
【００４６】
塩化ナトリウムを加えない時の活性を１００％とすると、ＧＳＭＴ、ＤＭＴは両方とも、１Ｍの塩化ナトリウムの存在下で８５％、２Ｍの塩化ナトリウムの存在下で６５〜７０％の活性を保っていることがわかった。このように、２Ｍという高濃度の塩化ナトリウムを含んでいても、塩化ナトリウムがそれぞれの酵素活性に大きく影響することはない。すなわち、ＧＳＭＴ及びＤＭＴは、高濃度の塩に対する耐性を有しており、高い塩濃度の存在下でもベタインを合成することができる。さらにベタインは、塩化ナトリウムの影響による過酷な条件下でＤＭＴ活性を保護する効果がある。例えば０．５Ｍのベタインを反応混合物に加えるとＤＭＴはその活性を１００％まで回復することができた。
【００４７】
［発現したE. coli細胞中の高塩濃度条件下におけるベタインの含量］
発現ベクターを組み込んだE. coliを富栄養培地（過剰の塩として０．３Ｍの塩化ナトリウムが添加されているＬＢ培地）で増殖させたときの発現細胞中のベタイン含量を、質量分析器ＫＯＭＰＡＣＴ ＭＡＬＤＩ ＩＶ ｔＤＥ（島津／クレイトス）を用いて分析した。発現細胞中のベタイン量は０．３Ｍの高塩濃度の条件下ではコントロール細胞より３−フォールドから６−フォールド高かった。
【００４８】
唯一の炭素源として０．２％のグルコースを添加された最少培地では、標準塩濃度及び高塩濃度のどちらの条件においても、発現細胞中のベタイン量はコントロール細胞より約２−フォールド高かった。富栄養培地中の発現細胞の増殖率がコントロール細胞より高いということは、発現細胞がコントロール細胞より高い耐塩性を有していることを示している。
【００４９】
［アップショック及びダウンショックの条件における発現レベル］
ウェスタンブロット法による分析から、野生型のA. halophlyticaにおいては、ＧＳＭＴ及びＤＭＴは、高塩濃度の条件で培養したとき高レベルで発現した。すなわち、ＧＳＭＴ及びＤＭＴは、０．５Ｍの塩化ナトリウムよりも２．５Ｍの塩化ナトリウムを含む培地の培養細胞の方が強い交差反応バンドを示した。なお、ウェスタンブロット法を行うにあたり、精製したＧＳＭＴとＤＭＴとをそれぞれwhite New Zealand rabbit（ホワイトニュージーランドウサギ）のメスに注射することによって、それぞれの酵素に対する抗体を調製した。
【００５０】
ＮａＣｌを含まない培地では、A. halophlytica細胞は増殖することができない。A. halophlytica細胞が塩濃度の条件を変更（塩化ナトリウムのアップショック及びダウンショック）された場合、ＧＳＭＴ及びＤＭＴは、塩濃度のアップショックを受けた時発現レベルを高め、ＤＭＴのレベルはＧＳＭＴに比べて高強度のバンドを有する事がわかった。反対にダウンショックの条件においては、これら２種の遺伝子の発現度は減少する。塩のアップショック及びダウンショックの条件下におけるウェスタンブロット法の分析結果から、ＧＳＭＴ及びＤＭＴは野生型のA. halophlyticaにおいてベタイン量の調整に関与し、塩のダウンショック条件においてはより重要な役割を果たすことを示している。
【００５１】
［淡水性ラン藻における形質転換］
淡水性ラン藻Synechococcusを宿主として用いた形質転換は、Porter R. D.、「DNA Transformation」、Methods in Enzymology 、167巻、p. 703-712に記載されている方法に従って行った。まず、ＢＧ１１培地（Rippka, R. et al.、J. Gen. Microbiol.、1979年、111巻、 1号）で淡水性ラン藻Synechococcusを生育させ、導入するＤＮＡ体積の１〜９倍のラン藻をセルで混合した。次に１５〜６０分かけてＤＮＡを取り込み、１０μｇ／ｍｌのＤＮＡａｓｅ、１０ｍＭのＭｇ2+を加え、取り込みを停止した。これをアンピシリン培地において光照射のもとで増殖させた。さらにスクリーニングを行い、形質転換ラン藻を得た。
【００５２】
［野生型淡水性ラン藻と形質転換ラン藻との生育速度の比較］
（１）ＮａＣｌを加えない培地（ＢＧ１１）で生育させた場合
野生型淡水性ラン藻Synechococcusと、前述の方法で得られた酵素ＧＳＭＴ及びＤＭＴをコードするそれぞれの遺伝子をSynechococcusに導入した形質転換ラン藻と、同様の方法で得られた、コリンの酸化によってベタインを合成する酵素ＣＤＨ及びＢＡＤＨをコードするそれぞれの遺伝子を導入した形質転換ラン藻とを、ＮａＣｌを加えないＢＧ１１培地で生育させたときの結果を図２に示す。図２及び後述する図３〜５において、縦軸は７３０ｎｍにおける濁度（OD730）を表し、横軸は日数（Day）を表す。また、Controlは野生型淡水性ラン藻コントロール）を表し、ＧＳＭＴ／ＤＭＴは酵素ＧＳＭＴ及びＤＭＴをコードするそれぞれの遺伝子を導入した形質転換ラン藻を表し、ＣＤＨ／ＢＡＤＨは酵素ＣＤＨ及びＢＡＤＨをコードするそれぞれの遺伝子を導入した形質転換ラン藻を表す。図２が示すように、コントロール、ＧＳＭＴ／ＤＭＴ及びＣＤＨ／ＢＡＤＨの生育速度はほぼ同じであった。
【００５３】
（２）０．４Ｍ ＮａＣｌを含む培地（ＢＧ１１＋０．４Ｍ ＮａＣｌ）で生育させた場合
野生型淡水性ラン藻と、酵素ＧＳＭＴ及びＤＭＴをコードするそれぞれの遺伝子を導入した形質転換ラン藻と、酵素ＣＤＨ及びＢＡＤＨをコードするそれぞれの遺伝子を導入した形質転換ラン藻とを、０．４Ｍ ＮａＣｌを含む培地で生育させた時の結果を図３に示す。図３が示すように、コントロール及びＣＤＨ／ＢＡＤＨは生育することができなかったが、ＧＳＭＴ／ＤＭＴは生育した。
【００５４】
（３）０．５Ｍ ＮａＣｌを含む培地（ＢＧ１１＋０．５Ｍ ＮａＣｌ）で生育させた場合
野生型淡水性ラン藻と、酵素ＧＳＭＴ及びＤＭＴをコードするそれぞれの遺伝子を導入した形質転換ラン藻と、酵素ＣＤＨ及びＢＡＤＨをコードするそれぞれの遺伝子を導入した形質転換ラン藻とを、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む培地で生育させた時の結果を図４に示す。図４が示すように、コントロール及びＣＤＨ／ＢＡＤＨは生育することができなかったが、ＧＳＭＴ／ＤＭＴは生育した。
【００５５】
（４）海水（sea water）中で生育させた場合
野生型淡水性ラン藻と、酵素ＧＳＭＴ及びＤＭＴをコードするそれぞれの遺伝子を導入した形質転換ラン藻と、酵素ＣＤＨ及びＢＡＤＨをコードするそれぞれの遺伝子を導入した形質転換ラン藻とを、海水中で生育させた時の結果を図５に示す。図５が示すように、コントロール及びＣＤＨ／ＢＡＤＨは生育することができなかったが、ＧＳＭＴ／ＤＭＴは生育した。
【００５６】
［形質転換ラン藻におけるベタインの蓄積量］
ＢＧ１１培地中のＮａＣｌ濃度を変化させ、野生型の淡水性ラン藻と、前記の方法で得られたＧＳＭＴ及びＤＭＴをコードするそれぞれの遺伝子を導入した形質転換ラン藻とのベタイン蓄積量を、質量分析器ＫＯＭＰＡＣＴ ＭＡＬＤＩ ＩＶ ｔＤＥ（島津／クレイトス）を用いて分析した。培地は、ＮａＣｌ濃度が０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍのものを用いた。その結果を図６（ＧＳＭＴ及びＤＭＴを発現するSynechococcus sp. PCC 7942細胞におけるベタインの蓄積量；Accumulation of betaine in Synechococcus sp. PCC 7942 cells expressing DSMT and DMT）に示す。
【００５７】
図６において、縦軸はベタイン（Betaine）を１ｍｇタンパク質当たりのナノモル数（nmol/mg protein）で表し、横軸は培地のＮａＣｌ濃度を表す。また、controlは野生型淡水性ラン藻（コントロール）を表し、ＧＳＭＴ／ＤＭＴは酵素ＧＳＭＴ及びＤＭＴをコードするそれぞれの遺伝子を導入した形質転換ラン藻を表す。図６が示すように、コントロールはベタインを蓄積しなかったが、ＧＳＭＴ／ＤＭＴはベタインを蓄積し、その量は塩濃度の増加とともに増加した。
【００５８】
【発明の効果】
本発明によると、ベタイン合成に関与するメチル基転移酵素、それをコードする遺伝子、及びそれを用いる形質転換によって高レベルに耐環境性を発現することができる生物と、それを作出するための形質転換方法とを提供することができる。
【配列表】
【００５９】
【配列表フリーテキスト】
配列番号５〜８は合成プライマーである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＧＳＭＴ及びＤＭＴのメチル基転移酵素活性の試験結果である。
【図２】 ＮａＣｌを含まない培地における野生型淡水性ラン藻及び形質転換ラン藻を生育させた場合のそれぞれの生育速度を表わしたグラフである。
【図３】 ０．４Ｍ ＮａＣｌを含む培地で野生型淡水性ラン藻及び形質転換ラン藻を生育させた場合のそれぞれの生育速度を表わしたグラフである。
【図４】 ０．５Ｍ ＮａＣｌを含む培地で野生型淡水性ラン藻及び形質転換ラン藻を生育させた場合のそれぞれの生育速度を表わしたグラフである。
【図５】 海水中で野生型淡水性ラン藻及び形質転換ラン藻を生育させた場合のそれぞれの生育速度を表わしたグラフである。
【図６】 野生型淡水性ラン藻及び形質転換ラン藻におけるベタインの蓄積量を表わしたグラフである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、環境ストレスに対する耐性が付与された生物、及びその作出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ベタイン（グリシンベタイン、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシン）は、外的浸透圧変化に応じて細胞内の浸透圧を維持するための適合溶質の１つであり、多くの耐塩性生物において、種々の環境ストレスに反応して生合成される。
【０００３】
最も良く知られているベタインの生合成経路は、コリンの２段階酸化である。多くのバクテリア、植物、動物は、乾燥又は塩ストレスの条件のもとでベタインを蓄積する。これらの生物においては、コリンからベタインアルデヒド、さらにベタインアルデヒドからベタインへの２段階酸化によってベタインが合成されることが分かっている。
【０００４】
このうち、ベタインアルデヒドからベタインを生成する第２段階目に関与する酵素は、植物、動物、バクテリアにおいて同じもの、つまり、ＮＡＤ+依存のベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＢＡＤＨ）である。
反対に、コリンからベタインアルデヒドを生成する第１段階目に関与する酵素は、これら生物の間で異なる。植物では、第１段階目はリスケ（Rieske）型の鉄−硫黄酵素であるコリンモノオキシゲナーゼ（ＣＭＯ）によって触媒される。動物や多くのバクテリアにおいては、第１段階目は膜結合コリンデヒドロゲナーゼ（ＣＤＨ）又は溶解性コリンオキシダーゼ（ＣＯＸ）によって触媒される。また、ある種のバクテリアにおいては、ＣＤＨやＣＯＸが１段階目だけでなく２段階目も触媒する。
【０００５】
しかし、大腸菌のＣＤＨ及びＢＡＤＨ、ホウレンソウのＣＭＯ及びＢＡＤＨ、バクテリアのＣＯＸをそれぞれ植物に導入する試みが行われたが、すべてにおいてベタインはわずかしか蓄積しなかった（例えば、非特許文献１参照）。
【０００６】
古細菌のメタン細菌、好気性従属真正細菌、嫌気性光栄養細菌、シアノバクテリアの中には単純な炭素源からベタインを合成するものがあることは今まで示唆されていたが、これらの生合成経路はほとんど知られていなかった。しかし最近、好気性従属真正細菌であるActinopolyspora halophila（アクチノポリスポラハロフィラ；以下、A. halophilaと記載する。）、嫌気性光栄養細菌であるEctothiorhodopspira halochloris（エクトチオロドスピラ ハロクロリス；以下、E. halochlorisと表記する。）が、グリシンから一連のメチル化反応によってベタインを合成することがわかった。そして２種のメチル基転移酵素遺伝子がE. halochlorisから単離された。
【０００７】
２種の遺伝子のうち、第１の遺伝子によってコード化された酵素、グリシンサルコシンメチル基転移酵素（ＧＳＭＴ）は、グリシンをサルコシンに、サルコシンをジメチルグリシンに変換するメチル化反応を触媒する。第２の遺伝子によってコード化された酵素、サルコシングリシンメチル基転移酵素（ＳＤＭＴ）はサルコシンをジメチルグリシンに、ジメチルグリシンをベタインに変換するそれぞれのメチル化反応を触媒する。これら両方の反応において、Ｓ−アデノシルメチオニン（AdoMet）がメチル基供与体として作用する。一方A. halophilaからは、Ｎ−及びＣ−末端部分が、E. halochlorisから単離されたＧＳＭＴ及びＳＤＭＴの配列とそれぞれ相同の配列を持つ１つのオープンリーディングフレームが発見された。A. halophilaのＧＳＭＴの機能性は得られなかったが、A. halophilaのＳＤＭＴがE. halochlorisのＳＤＭＴと類似した基質特異性を持っていることがわかった。
【０００８】
これらベタイン合成に関する遺伝子をEscherichia coli（エシェリキア コリ；以下、E.coliと表記する。）に導入することによって、導入前のE.coliに比べ耐塩性が増強される事がわかっている。そこで、形質転換後も高レベルに環境ストレス耐性を発現することのできる新規遺伝子、及びそれを用いた、より高いストレス耐性を植物に付与する方法が求められていた。
【０００９】
【非特許文献１】
デニス・ロンテン（Denis Rontein）、ギルス・バセット（Gilles Basset）、アンドリュー・ディー・ハンソン（Andrew D. Hanson）著、植物における耐浸透圧性物質の蓄積の代謝工学（Metabolic Engineering of Osmoprotectant Accumulation in Plants）、「メタボリック エンジニアリング（Metabolic Engineering）」、（米国）、２００２年１月、第４巻、第１号、ｐ.４９−５６
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明の目的は、ベタイン合成に関与するメチル基転移酵素、それをコードする遺伝子、及びそれを用いる形質転換によって高レベルに耐環境性を発現することができる生物と、それを作出するための形質転換方法とを提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、耐塩性ラン藻からベタイン合成に関与する２種のメチル基転移酵素及びそれらをコードする遺伝子を取得し、それらを用いて供発現系を構築し、ラン藻に導入することによって上記目的が達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち本発明は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列で表されるグリシンサルコシンメチル基転移酵素である。
本発明は、前記グリシンサルコシンメチル基転移酵素をコードする遺伝子である。
本発明は、配列表の配列番号２に記載の塩基配列で表される前記の遺伝子である。
本発明は、前記遺伝子を含むベクター及び形質転換体である。
【００１３】
本発明は、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列で表されるジメチルグリシンメチル基転移酵素である。
本発明は、前記ジメチルグリシンメチル基転移酵素をコードする遺伝子である。
本発明は、配列表の配列番号４に記載の前記遺伝子である。
本発明は、前記遺伝子を含むベクター及び形質転換体である。
【００１４】
本発明は、前記グリシンサルコシンメチル基転移酵素をコードする遺伝子又は前記配列表２に記載の遺伝子と、前記ジメチルグリシンメチル基転移酵素をコードする遺伝子又は前記配列表４に記載の遺伝子とを含む供発現ベクター及び形質転換体である。
【００１５】
本発明は、前記供発現ベクターを宿主細胞に導入する形質転換法である。
本発明は、前記配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列で表されるグリシンサルコシンメチル基転移酵素をコードする遺伝子又は前記配列番号２に記載の塩基配列で表される遺伝子を含むベクターと、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列で表されるジメチルグリシンメチル基転移酵素をコードする遺伝子又は前記配列番号４に記載の塩基配列で表される遺伝子を含むベクターとを用いる、前記の形質転換法である。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明において、メチル基転移酵素及びそれをコードする遺伝子の取得には、ラン藻（シアノバクテリア）の１種であるAphanothece halophytica（アファノティーキ ハロフィティカ；以下、A. halophyticaと記載する。）を用いると良い。A. halophyticaは、０．２５Ｍ〜３．０Ｍ ＮａＣｌの広い範囲の塩分濃度条件下で生育することができる耐塩性ラン藻である。A. halophyticaは、高塩濃度下においてベタインを１mol/l以上蓄積する性質がある。
A. Halophyticaにおいてベタインは、前記E. Halochlorisと同様に、グリシンからサルコシン、サルコシンからジメチルグリシン、ジメチルグリシンからベタインの３段階のメチル化反応によって生合成される。これらの反応をE. Halochlorisとは異なる２種類の酵素が触媒する。
【００１７】
第１の酵素は、グリシンサルコシンメチル基転移酵素（ＧＳＭＴ）である。ＧＳＭＴは、グリシンの窒素にメチル基を転移しサルコシンを生成する、１段階目の反応を触媒する。さらに、サルコシンの窒素にメチル基を転移しジメチルグリシンを生成する、２段階目の反応も触媒する。
第２の酵素は、ジメチルグリシンメチル基転移酵素（ＤＭＴ）である。ＤＭＴは、ジメチルグリシンの窒素にメチル基を転移しベタインを生成する、３段階目の反応を触媒する。
これら３段階のメチル化反応において、Ｓ−アデノシルメチオニンがメチル基供与体として作用する。Ｓ−アデノシルメチオニンはメチル基を転移した後、Ｓ−アデノシルホモシステインになる。
【００１８】
メチル基転移酵素のアミノ酸配列は、例えば、ペプチドシーケンサーにより決定することができる。
【００１９】
これらメチル基転移酵素をコードする遺伝子は、例えば、A. halophyticaのＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ反応によりそれぞれのコード領域を増幅し、得られたＤＮＡ断片をベクターに組み込み、遺伝子解析装置を用いることによってその塩基配列を決定する。
【００２０】
このようにして決定されるＤＮＡ断片の塩基配列及びこれにより推定されるアミノ酸配列は、配列表の配列番号１〜４に示すものが挙げられるが、前記ＤＮＡ断片がコードするポリペプチドがグリシンサルコシンメチル基転移酵素活性又はジメチルグリシンメチル基転移酵素活性を損なわない範囲で、一部のアミノ酸又は核酸を除去、置換又は付加する等の改変を行ったものも本発明に含まれる。
【００２１】
供発現系の構築方法は、例えば、得られた２種のＤＮＡをそれぞれ、宿主細胞内で発現するプロモーター等を含むベクターと連結させ、得られた２種のベクターを互いに連結させることによって行う。このようにして構築した供発現ベクターをE. coli等に組み込み増幅させた後、宿主細胞に導入する。
【００２２】
ベクターを宿主細胞に導入するには、外来遺伝子を導入するための常用方法、例えばアグロバクテリウム法、パーティクルガン法等の方法を用いることができる。また外来遺伝子が導入された細胞を再生するためにも常用の組織培養による方法を用いることができる。
【００２３】
また本発明においては、光合成能を有する下等植物である淡水性ラン藻Synechococcus sp, PCC 7942（シネココッカス エスピー ピーシーシー ７９４２；以下、Synechococcusと表記する。）を宿主の１例として用いるが、ベタインは下等植物であるラン藻類から高等植物にわたってその作用が有効と考えられるため、本発明は全ての光合成植物に適用することが可能である。このような植物としては、例えば、タバコ、トウモロコシ、イネ、小麦、大麦、トマト、ジャガイモ、大豆、ワタ等の草本植物、さらにはユーカリ、アカシアなどの木本植物等に広く適用することができる。
【００２４】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
【００２５】
［培養条件］
E. coil DH5α及びE. coil BL21(DE3)をLuria-Bertani培地（ＬＢ培地）又は０．２％のグルコースを唯一の炭素源として添加した最少培地で、３７℃で増殖させた。最終濃度５０μg/mlでアンピシリンを用いた。A. halophytica細胞も同様に増殖させた。TSK Bio Assist Qカラムは（東ソー（株））のものを用いた。放射能標識したＳ−アデノシル−Ｌ−［メチル−14Ｃ］−メチオニンはアマルシャム バイオサイエンスのものを用いた。
【００２６】
［メチル基転移酵素遺伝子の単離］
メチル基転移酵素遺伝子はA. halophyticaのＤＮＡを鋳型とし、NcoＩ及びBamHＩの制限酵素部位を含む一組のプライマーを用いたＰＣＲ反応によって増幅させた。ＧＳＭＴのコード領域（７９５ｂｐ）の増幅にはフォワードプライマー（５´−ＡＡＣＣＡＴＧＧＣＴＡＴＣＡＡＡＧＡＡＡＡＡＣＡ−３´（配列表の配列番号５））及びリバースプライマー（５´−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＴＣＴＴＴＴＴＴＣＧＣＡＡＣ−３´（配列表の配列番号６））を用いた。ＤＭＴのコード領域（８３４ｂｐ）の増幅にはフォワードプライマー（５´−ＴＴＣＣＡＴＧＧＣＴＡＡＡＧＣＡＧＡＣＧＣＡＧＴＣ−３´（配列表の配列番号７））及びリバースプライマー（５´−ＧＣＧＧＡＴＣＣＣＴＡＧＧＧＴＴＴＧＴＧＧＡＡＣＴＴ−３´（配列表の配列番号８））を用いた。
【００２７】
ＧＳＭＴから増幅されたＤＮＡ断片（ApGSMT）とＤＭＴから増幅されたＤＮＡ断片（ApDMT）は、別々にプラスミドベクターの１種であるpBluescriptSK+（インビトロジェン社）のEcoRＶ制限部位に連結し、ApGSMTからはpApGSMTSK+、ApDMTからはpApDMTSK+を得た。これら２種のプラスミドをE. coliDH5αに導入した。プラスミド中のApGSMTとApDMTのＤＮＡ配列はマルチキャピラリーＤＮＡシーケンサ（（株）島津製作所）によって解析された。
【００２８】
［発現ベクターの構築］
Ｔ７プロモーターを含むプラスミドベクターの一種、pET3d（ノバジェン社）を用い、これをNcoＩとBamHＩによって二重消化した。pApGSMTSK+をNcoＩとBamHＩによって二重消化し、消化されたpET3dに連結し、pApGSMTを得た。一方、pApDMTSK+もNcoＩとBamHＩによって二重消化し、消化されたpET3dに連結し、pApDMTを得た。これら２種のプラスミド、pApGSMTとpApDMTはそれぞれApGSMTとApDMTとを含んでいる。
【００２９】
［供発現ベクターの構築］
プラスミドpApGSMTをBglＩＩとBamHＩとによって二重消化し、Ｔ７プロモーター部位とApGSMTの全塩基配列とを含むＤＮＡ断片を得た。一方、pApDMTをBamHＩで消化した。前記ＤＮＡ断片をpApDMTのBamHＩ制限部位に連結し、ApGSMTとApDMTの両方を含んだ供発現プラスミドpApGSDMTを得た。
【００３０】
［E. coilにおけるメチル基転移酵素遺伝子の発現］
プラスミドpApGSMT、pApDMT及びpApGSDMTを、E. coil BL21（DE3）に導入した。
イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による誘導によってプラスミド上のＴ７プロモーターが働き、E. coliにおいてpApGSMTは酵素ＧＳＭＴを発現し、pApDMTは酵素ＤＭＴを発現した。ＩＰＴＧの濃度が０．１〜１．０ｍＭのとき、E. coliに高レベルに発現され、発現レベルはＩＰＴＧが最終濃度の０．５ｍＭのときにほとんど頭打ちとなった。
また、E. coliにおいてpApGSDMTは酵素ＧＳＭＴと酵素ＤＭＴとを発現した。これら２種の遺伝子の供発現は発現レベルに影響を及ぼさなかった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析の結果、ＧＳＭＴ、ＤＭＴは両方とも、０．５ｍＭのＩＰＴＧを誘導した後に供発現細胞において高レベルに発現された。
【００３１】
［E. coilにおいて発現したメチル基転移酵素の精製］
発現した細胞は、50μg/mlのアンピシリンを含むＬＢ培地の中で６２０nmにおける濁度が０．６〜０．８となる対数増殖中期まで増殖させた。そして、０．５ｍＭのＩＰＴＧを加え、細胞をさらに３時間増殖させた。細胞は５０００×ｇで１０分間遠心し、バッファーＡ（２０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ８．０、２ｍＭの２−メルカプトエタノール含有）で２回洗浄することにより採取した。全細胞抽出物はKubota Insonator201 M（クボタ（株））により１８０Ｗ、１５分の音波処理を行うことによって得られた。未粉砕細胞は１０,０００×ｇ、１０分間の遠心により除去された。
【００３２】
発現した酵素ＧＳＭＴは、２５％硫酸アンモニウムを添加して沈殿させた。沈殿分画をバッファーＡに溶解し、バッファーＡを用いて透析を行った。透析された溶液分画は、TSK BioAssist Qカラム（4.6mm×5.0cm）に通した。さらにＧＳＭＴ分画を０〜１０００ｍＭ ＮａＣｌによって勾配溶離させた。２００〜３００ｍＭで溶出した活性分画を集め、再びバッファーＡで透析を行い、ＨＰＬＣカラムに通した。ＨＰＬＣを３回行った後、精製されたＧＳＭＴが得られた。
【００３３】
発現した酵素ＤＭＴは、５０〜７５％硫酸アンモニウムを添加して沈殿させた。沈殿分画をバッファーＡに溶解し、バッファーＡを用いて透析を行った。透析された溶液分画は、TSK BioAssist Qカラム（4.6mm×5.0cm）に通した。さらにＤＭＴ分画を０〜１０００ｍＭ ＮａＣｌによって勾配溶離させた。３５０〜４５０ｍＭで溶出した活性分画を集め、再びバッファーＡで透析を行い、ＨＰＬＣカラムに通した。ＨＰＬＣを３回行った後、精製されたＤＭＴが得られた。
【００３４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥから推定した酵素の分子量はＧＳＭＴが３０ｋＤａ、ＤＭＴが３４ｋＤａであった。Superdex200 column（60×2.6cm）ゲル濾過カラムクロマトグラフィー（アマルシャムファルマシアバイオテク）によって推定された、活性状態の酵素の分子量は、ＧＳＭＴが３２ｋＤａ、ＤＭＴが２８ｋＤａであった。ゲル濾過によるこの結果は、両方の酵素がモノマーであることを示唆している。
【００３５】
［E. coilにおいて発現した酵素の活性］
メチル基転移酵素活性を、Rohaらの方法（Roha A、Wagner C、MacDonald RG、Bresnick E、J. Biol. Chem、1994年、269巻、p. 5750-5756）に準じて計測した。基質としては、メチル基受容体として作用するいくつかの種類の物質を用い、それぞれについて試験を行った。反応は下記の反応混合物に精製した４ｍＭメチル基転移酵素Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（４５ｎＣｉ Ｓ−アデノシル−Ｌ−［メチル−14Ｃ］−メチオニン）２５μｌを添加することによって開始した。
【００３６】
３７℃で３０分間放置した後、残留Ｓ−アデノシル−Ｌ−［メチル−14Ｃ］−メチオニンを吸着する炭素懸濁液（０．１Ｍ酢酸中１３３ｇ／ｌ）７５μｌを加えることによって反応を停止させ、氷中で１０分間放置した。１０分間遠心した後、転移された14Ｃ−メチル基を液体シンチレーションカウンターmodel 3200C（アロカ（株））によってアッセイするために、７５μｌの上澄み液を取り除いた。酵素活性は、１分間あたり転移されたメチル基のナノモル数として計算された。反応混合物のｐＨは下記のバッファーによって調節された。
【００３８】
１２５ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０〜７．０）
１２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．０〜８．０）
１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５〜８．８）
【００３９】
図１（メチル基転移酵素活性；Methyltransferase activity）は、得られたＧＳＭＴ及びＤＭＴの酵素活性の試験結果を示す。すなわち、図１は、メチル基受容体となり得る各基質に対するＤＳＭＴ及びＤＭＴの相対活性を表す。
【００４０】
ＧＳＭＴについては、グリシン（glycine）、サルコシン（sarcosine）、ジメチルグリシン（dimethylglycine）、プロリン（proline）、アラニン（alanine）、イソロイシン（isoleucine）、バリン（valine）、アスパラギン（asparagine）、グルタミン（glutamine）、ロイシン（leucine）、セリン（serine）、スレオニン（threonine）、フェニルアラニン（phenylalanine）、メチオニン（methionine）、システイン（cysteine）、エタノールアミン（ethanolamine;（EA））、モノメチルエタノールアミン（monomethyl-EA）、ホスホリルエタノールアミン（phosphoryl-EA）、ホスファチジルエタノールアミン（phosphatidyl-EA）の１９種を基質に用い、それぞれについて試験を行った。
【００４１】
ＤＭＴについては、上記１９種の基質に加え、イソ吉草酸（isovaleric acid）、酪酸（n-butyric acid）、ｔ−ブチル酢酸（t-butylacetic acid）、プロピオン酸（propionic acid）を基質に用い、それぞれについて試験を行った。
図１が示すように、ＧＳＭＴは、グリシンとサルコシンに対して厳密な特異性を有し、ＤＭＴはジメチルグリシンのみに対して厳密な特異性を有していた。
【００４２】
また、精製されたＧＳＭＴ及びＤＭＴはアルカリｐＨにおいて高い活性を示した。ＧＳＭＴ及びＤＭＴの最適ｐＨは、Ｔｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液、ｐＨ８．８において得られた。
【００４３】
［E. coliにおいて発現した酵素の特性］
メチル基受容体であるグリシン、サルコシン及びジメチルグリシンの濃度をそれぞれ０ｍＭ〜５０ｍＭに変化させ、一方、メチル基供与体であるＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンの濃度は０〜１０ｍＭに変化させ、ＧＳＭＴ及びＤＭＴの動力学的パラメーターであるＫｍを計測した。グリシンとサルコシンに対し特異性を有するＧＳＭＴは、グリシンに対するＫｍ値が１．５ｍＭ、サルコシンに対するＫｍ値が０．８ｍＭ、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニンに対するＫｍ値が０．６５ｍＭであり、これらの基質に対して低い値を示した。
【００４４】
ジメチルグリシンに対し特異性を有するＤＭＴは、ジメチルグリシンに対するＫｍ値が０．１８ｍＭ、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニンに対するＫｍ値が０．５ｍＭであり、両方の基質に対して低い値を示した。
【００４５】
メチル基転移酵素の強力な阻害剤であるＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインは、グリシンがメチル基受容体として使用されたときは０．８ｍＭ、サルコシンがメチル基受容体として使用されたときは１．０ｍＭの濃度で、ＧＳＭＴの活性を完全に阻害した。１．０ｍＭのＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインの存在下で、ＤＭＴ活性も完全に阻害された。
【００４６】
塩化ナトリウムを加えない時の活性を１００％とすると、ＧＳＭＴ、ＤＭＴは両方とも、１Ｍの塩化ナトリウムの存在下で８５％、２Ｍの塩化ナトリウムの存在下で６５〜７０％の活性を保っていることがわかった。このように、２Ｍという高濃度の塩化ナトリウムを含んでいても、塩化ナトリウムがそれぞれの酵素活性に大きく影響することはない。すなわち、ＧＳＭＴ及びＤＭＴは、高濃度の塩に対する耐性を有しており、高い塩濃度の存在下でもベタインを合成することができる。さらにベタインは、塩化ナトリウムの影響による過酷な条件下でＤＭＴ活性を保護する効果がある。例えば０．５Ｍのベタインを反応混合物に加えるとＤＭＴはその活性を１００％まで回復することができた。
【００４７】
［発現したE. coli細胞中の高塩濃度条件下におけるベタインの含量］
発現ベクターを組み込んだE. coliを富栄養培地（過剰の塩として０．３Ｍの塩化ナトリウムが添加されているＬＢ培地）で増殖させたときの発現細胞中のベタイン含量を、質量分析器ＫＯＭＰＡＣＴ ＭＡＬＤＩ ＩＶ ｔＤＥ（島津／クレイトス）を用いて分析した。発現細胞中のベタイン量は０．３Ｍの高塩濃度の条件下ではコントロール細胞より３−フォールドから６−フォールド高かった。
【００４８】
唯一の炭素源として０．２％のグルコースを添加された最少培地では、標準塩濃度及び高塩濃度のどちらの条件においても、発現細胞中のベタイン量はコントロール細胞より約２−フォールド高かった。富栄養培地中の発現細胞の増殖率がコントロール細胞より高いということは、発現細胞がコントロール細胞より高い耐塩性を有していることを示している。
【００４９】
［アップショック及びダウンショックの条件における発現レベル］
ウェスタンブロット法による分析から、野生型のA. halophlyticaにおいては、ＧＳＭＴ及びＤＭＴは、高塩濃度の条件で培養したとき高レベルで発現した。すなわち、ＧＳＭＴ及びＤＭＴは、０．５Ｍの塩化ナトリウムよりも２．５Ｍの塩化ナトリウムを含む培地の培養細胞の方が強い交差反応バンドを示した。なお、ウェスタンブロット法を行うにあたり、精製したＧＳＭＴとＤＭＴとをそれぞれwhite New Zealand rabbit（ホワイトニュージーランドウサギ）のメスに注射することによって、それぞれの酵素に対する抗体を調製した。
【００５０】
ＮａＣｌを含まない培地では、A. halophlytica細胞は増殖することができない。A. halophlytica細胞が塩濃度の条件を変更（塩化ナトリウムのアップショック及びダウンショック）された場合、ＧＳＭＴ及びＤＭＴは、塩濃度のアップショックを受けた時発現レベルを高め、ＤＭＴのレベルはＧＳＭＴに比べて高強度のバンドを有する事がわかった。反対にダウンショックの条件においては、これら２種の遺伝子の発現度は減少する。塩のアップショック及びダウンショックの条件下におけるウェスタンブロット法の分析結果から、ＧＳＭＴ及びＤＭＴは野生型のA. halophlyticaにおいてベタイン量の調整に関与し、塩のダウンショック条件においてはより重要な役割を果たすことを示している。
【００５１】
［淡水性ラン藻における形質転換］
淡水性ラン藻Synechococcusを宿主として用いた形質転換は、Porter R. D.、「DNA Transformation」、Methods in Enzymology 、167巻、p. 703-712に記載されている方法に従って行った。まず、ＢＧ１１培地（Rippka, R. et al.、J. Gen. Microbiol.、1979年、111巻、 1号）で淡水性ラン藻Synechococcusを生育させ、導入するＤＮＡ体積の１〜９倍のラン藻をセルで混合した。次に１５〜６０分かけてＤＮＡを取り込み、１０μｇ／ｍｌのＤＮＡａｓｅ、１０ｍＭのＭｇ2+を加え、取り込みを停止した。これをアンピシリン培地において光照射のもとで増殖させた。さらにスクリーニングを行い、形質転換ラン藻を得た。
【００５２】
［野生型淡水性ラン藻と形質転換ラン藻との生育速度の比較］
（１）ＮａＣｌを加えない培地（ＢＧ１１）で生育させた場合
野生型淡水性ラン藻Synechococcusと、前述の方法で得られた酵素ＧＳＭＴ及びＤＭＴをコードするそれぞれの遺伝子をSynechococcusに導入した形質転換ラン藻と、同様の方法で得られた、コリンの酸化によってベタインを合成する酵素ＣＤＨ及びＢＡＤＨをコードするそれぞれの遺伝子を導入した形質転換ラン藻とを、ＮａＣｌを加えないＢＧ１１培地で生育させたときの結果を図２に示す。図２及び後述する図３〜５において、縦軸は７３０ｎｍにおける濁度（OD730）を表し、横軸は日数（Day）を表す。また、Controlは野生型淡水性ラン藻コントロール）を表し、ＧＳＭＴ／ＤＭＴは酵素ＧＳＭＴ及びＤＭＴをコードするそれぞれの遺伝子を導入した形質転換ラン藻を表し、ＣＤＨ／ＢＡＤＨは酵素ＣＤＨ及びＢＡＤＨをコードするそれぞれの遺伝子を導入した形質転換ラン藻を表す。図２が示すように、コントロール、ＧＳＭＴ／ＤＭＴ及びＣＤＨ／ＢＡＤＨの生育速度はほぼ同じであった。
【００５３】
（２）０．４Ｍ ＮａＣｌを含む培地（ＢＧ１１＋０．４Ｍ ＮａＣｌ）で生育させた場合
野生型淡水性ラン藻と、酵素ＧＳＭＴ及びＤＭＴをコードするそれぞれの遺伝子を導入した形質転換ラン藻と、酵素ＣＤＨ及びＢＡＤＨをコードするそれぞれの遺伝子を導入した形質転換ラン藻とを、０．４Ｍ ＮａＣｌを含む培地で生育させた時の結果を図３に示す。図３が示すように、コントロール及びＣＤＨ／ＢＡＤＨは生育することができなかったが、ＧＳＭＴ／ＤＭＴは生育した。
【００５４】
（３）０．５Ｍ ＮａＣｌを含む培地（ＢＧ１１＋０．５Ｍ ＮａＣｌ）で生育させた場合
野生型淡水性ラン藻と、酵素ＧＳＭＴ及びＤＭＴをコードするそれぞれの遺伝子を導入した形質転換ラン藻と、酵素ＣＤＨ及びＢＡＤＨをコードするそれぞれの遺伝子を導入した形質転換ラン藻とを、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む培地で生育させた時の結果を図４に示す。図４が示すように、コントロール及びＣＤＨ／ＢＡＤＨは生育することができなかったが、ＧＳＭＴ／ＤＭＴは生育した。
【００５５】
（４）海水（sea water）中で生育させた場合
野生型淡水性ラン藻と、酵素ＧＳＭＴ及びＤＭＴをコードするそれぞれの遺伝子を導入した形質転換ラン藻と、酵素ＣＤＨ及びＢＡＤＨをコードするそれぞれの遺伝子を導入した形質転換ラン藻とを、海水中で生育させた時の結果を図５に示す。図５が示すように、コントロール及びＣＤＨ／ＢＡＤＨは生育することができなかったが、ＧＳＭＴ／ＤＭＴは生育した。
【００５６】
［形質転換ラン藻におけるベタインの蓄積量］
ＢＧ１１培地中のＮａＣｌ濃度を変化させ、野生型の淡水性ラン藻と、前記の方法で得られたＧＳＭＴ及びＤＭＴをコードするそれぞれの遺伝子を導入した形質転換ラン藻とのベタイン蓄積量を、質量分析器ＫＯＭＰＡＣＴ ＭＡＬＤＩ ＩＶ ｔＤＥ（島津／クレイトス）を用いて分析した。培地は、ＮａＣｌ濃度が０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍのものを用いた。その結果を図６（ＧＳＭＴ及びＤＭＴを発現するSynechococcus sp. PCC 7942細胞におけるベタインの蓄積量；Accumulation of betaine in Synechococcus sp. PCC 7942 cells expressing DSMT and DMT）に示す。
【００５７】
図６において、縦軸はベタイン（Betaine）を１ｍｇタンパク質当たりのナノモル数（nmol/mg protein）で表し、横軸は培地のＮａＣｌ濃度を表す。また、controlは野生型淡水性ラン藻（コントロール）を表し、ＧＳＭＴ／ＤＭＴは酵素ＧＳＭＴ及びＤＭＴをコードするそれぞれの遺伝子を導入した形質転換ラン藻を表す。図６が示すように、コントロールはベタインを蓄積しなかったが、ＧＳＭＴ／ＤＭＴはベタインを蓄積し、その量は塩濃度の増加とともに増加した。
【００５８】
【発明の効果】
本発明によると、ベタイン合成に関与するメチル基転移酵素、それをコードする遺伝子、及びそれを用いる形質転換によって高レベルに耐環境性を発現することができる生物と、それを作出するための形質転換方法とを提供することができる。
【配列表】
【配列表フリーテキスト】
配列番号５〜８は合成プライマーである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＧＳＭＴ及びＤＭＴのメチル基転移酵素活性の試験結果である。
【図２】 ＮａＣｌを含まない培地における野生型淡水性ラン藻及び形質転換ラン藻を生育させた場合のそれぞれの生育速度を表わしたグラフである。
【図３】 ０．４Ｍ ＮａＣｌを含む培地で野生型淡水性ラン藻及び形質転換ラン藻を生育させた場合のそれぞれの生育速度を表わしたグラフである。
【図４】 ０．５Ｍ ＮａＣｌを含む培地で野生型淡水性ラン藻及び形質転換ラン藻を生育させた場合のそれぞれの生育速度を表わしたグラフである。
【図５】 海水中で野生型淡水性ラン藻及び形質転換ラン藻を生育させた場合のそれぞれの生育速度を表わしたグラフである。
【図６】 野生型淡水性ラン藻及び形質転換ラン藻におけるベタインの蓄積量を表わしたグラフである。
Claims (14)
- 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列で表されるグリシンサルコシンメチル基転移酵素。
- 請求項１に記載のグリシンサルコシンメチル基転移酵素をコードする遺伝子。
- 配列表の配列番号２に記載の塩基配列で表される請求項２に記載の遺伝子。
- 請求項２又は３に記載の遺伝子を含むベクター。
- 請求項２又は３に記載の遺伝子を含む形質転換体。
- 配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列で表されるジメチルグリシンメチル基転移酵素。
- 請求項６に記載のジメチルグリシンメチル基転移酵素をコードする遺伝子。
- 配列表の配列番号４に記載の塩基配列で表される請求項７に記載の遺伝子。
- 請求項７又は８に記載の遺伝子を含むベクター。
- 配列表７又は８に記載の遺伝子を含む形質転換体。
- 請求項２又は３に記載の遺伝子、及び請求項７又は８に記載の遺伝子を含む供発現ベクター。
- 請求項２又は３に記載の遺伝子、及び請求項７又は８に記載の遺伝子を含む形質転換体。
- 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列で表されるグリシンサルコシンメチル基転移酵素をコードする遺伝子又は前記配列番号２に記載の塩基配列で表される遺伝子、及び配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列で表されるジメチルグリシンメチル基転移酵素をコードする遺伝子又は前記配列番号４に記載の塩基配列で表される遺伝子を含む供発現ベクターを宿主細胞に導入する形質転換法。
- 前記配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列で表されるグリシンサルコシンメチル基転移酵素をコードする遺伝子又は前記配列番号２に記載の塩基配列で表される遺伝子を含むベクターと、配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列で表されるジメチルグリシンメチル基転移酵素をコードする遺伝子又は前記配列番号４に記載の塩基配列で表される遺伝子を含むベクターとを用いる、請求項１３に記載の形質転換法。
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