ES2770603T3

ES2770603T3 - Celobiosa deshidrogenasa mutada con especificidad de sustrato modificada

Info

Publication number: ES2770603T3
Application number: ES17702333T
Authority: ES
Inventors: Christoph Sygmund; Roland Ludwig; Leonard Stoica
Original assignee: DIRECTSENS GmbH
Current assignee: DIRECTSENS GmbH
Priority date: 2016-01-26
Filing date: 2017-01-26
Publication date: 2020-07-02
Anticipated expiration: 2037-01-26
Also published as: EP3408384A1; DK3408384T3; EP3408384B1; WO2017129637A1; EP3199625A1

Abstract

Una celobiosa deshidrogenasa (CDH) modificada o su dominio funcional de flavodehidrogenasa que tiene una sustitución en el aminoácido correspondiente a N721 de la SEQ ID NO: 5 (CDH de M. thermophilum) por glutamina, isoleucina, treonina o leucina o una sustitución de asparagina en el motivo del centro activo que tiene la secuencia de aminoácidos NHW por glutamina, isoleucina, treonina o leucina, que comprende un dominio de flavodehidrogenasa modificada basado en uno de los dominios de flavodehidrogenasa no modificada de acuerdo con los aminoácidos 253-831 de la SEQ ID NO: 1, aminoácidos 269-845 de la SEQ ID NO: 2, aminoácidos 249-787 de la SEQ ID NO: 3, aminoácidos 253-829 de la SEQ ID NO: 4, aminoácidos 251-828 de la SEQ ID NO: 5, aminoácidos 251-829 de la SEQ ID NO: 6, aminoácidos 233-771 de la SEQ ID NO: 7, aminoácidos 236-774 de la SEQ ID NO: 8, aminoácidos 235-773 de la SEQ ID NO: 9, aminoácidos 230-768 de la SEQ ID NO: 10; dicho dominio de flavodehidrogenasa modificada tiene una secuencia con al menos un 50% de identidad de secuencia con uno de dichos dominios de flavodehidrogenasa no modificada y además comprende la mutación de sustitución en el aminoácido correspondiente al N721 de la SEQ ID NO: 5 o en el motivo NHW.

Description

DESCRIPCIÓN

Celobiosa deshidrogenasa mutada con especificidad de sustrato modificada

El campo de la presente invención se refiere a la modificación enzimática recombinante para modificar la especificidad de sustrato.

La celobiosa deshidrogenasa (EC 1.1.99.18, CDH) fue descubierta por primera vez en 1974 en el sistema enzimático extracelular de Phanerochaete chrysosporium y posteriormente en varios otros hongos basidiomicetos. Una característica especial de esta enzima es su composición: la combinación de un dominio de flavodehidrogenasa catalíticamente activo (también llamado “dominio de flavina”), que aloja un FAD unido de forma no covalente, y un dominio de hemo, con un hemo b como cofactor. Ambos dominios están conectados por un enlazador. Por su actividad catalítica, la celobiosa de sustrato natural se oxida en una reacción que reduce el FAD del dominio de flavina.

La CDH o su dominio de flavodehidrogenasa oxida los carbohidratos como sus sustratos naturales, celobiosa y celo-oligosacáridos, y otros como lactosa y maltosa. Se ha descubierto y demostrado previamente que las CDH son capaces de convertir glucosa de manera eficiente (Harreither et al., 2011; WO 2010/097462 A). Existen CDH modificadas que tienen actividad reducida en maltosa (WO2013/131942). Se conocen otras CDHS de Metarhizium anisopliae (Base de datos Uniprot, N.° de Acc. E9DZA5) o Stemphylium lycopersici (Base de datos Uniprot, N.° de Acc. A0A0L1HDV7). Gao et al. (Plos Genetics, 7(1), (2001): e1001264) describe la secuenciación genómica de los hongos Metarhizium anisopliae y M. acridum. El documento de patente EP 2636733 A1 describe CDH mutadas artificialmente para reducir su actividad de oxidación de maltosa.

El problema con las CDH reside en la versatilidad que disminuye su uso en sensores para detectar un solo analito en mezclas de varios sustratos potenciales. La presente invención se refiere a una celobiosa deshidrogenasa (CDH) modificada como se describe en las presentes reivindicaciones.

Un objetivo de la presente divulgación es proporcionar una celobiosa deshidrogenasa o su dominio de flavodehidrogenasa catalíticamente activo, que sea capaz de detectar selectivamente la lactosa en presencia de glucosa y galactosa, especialmente con electrodos basados en transferencia directa de electrones o electrodos basados en transferencia mediada de electrones para proporcionar sensores adecuados analíticamente útiles.

La presente divulgación se refiere a celobiosa deshidrogenasas (CDH) recombinantes modificadas con un recambio reducido de glucosa y galactosa. El objetivo es reducir el efecto de cualquier concentración de glucosa y galactosa presente en una matriz de muestra en la detección de lactosa. En particular, la divulgación proporciona una celobiosa deshidrogenasa (CDH) modificada o su dominio funcional de flavodehidrogenasa que tiene una sustitución en el aminoácido correspondiente a N721 de la SEQ ID NO: 5 (CDH de M. thermophilum) o correspondiente a N722 de la SEQ ID NO: 4 (CDH de N. crassa) por glutamina, isoleucina, treonina o leucina o una sustitución de la asparagina en el motivo del centro activo que tiene la secuencia de aminoácidos NHW por glutamina, isoleucina, treonina o leucina; por lo tanto, este motivo sería QHW, IHW, THW o LHW. Por lo general, el motivo se encuentra cerca del extremo C terminal de una CDH o del dominio de la flavodehidrogenasa, por ejemplo, alrededor de los aminoácidos 660 a 780 de una CDH o los aminoácidos 430 a 550 de un dominio de flavodehidrogenasa. Las enzimas de celobiosa deshidrogenasa modificadas preferidas de la invención están optimizadas para su uso en biosensores basados en transferencia directa de electrones (3a generación) o en transferencia mediada de electrones (2a generación).

Para aumentar el rendimiento de CDH como catalizador de electrodo selectivo para lactosa, la modificación genética persiguió la reducción de la actividad de oxidación de glucosa y galactosa sola o en combinación con un aumento de la actividad de oxidación de lactosa. Con la descripción general de la modificación de un dominio de flavodehidrogenasa de CDH, un dominio de alta homología en todas las CDH, es posible modificar cualquier CDH de acuerdo con los principios descritos en la presente memoria para disminuir la sensibilidad a la glucosa y la galactosa. Por lo tanto, la presente invención proporciona en particular una celobiosa deshidrogenasa (CDH) modificada o su dominio funcional de flavodehidrogenasa que tiene una actividad reducida de oxidación de glucosa y galactosa en comparación con la CDH no modificada o su dominio funcional de flavodehidrogenasa mientras que esencialmente mantiene una alta actividad de oxidación de lactosa, por ejemplo, como máximo una reducción del 20% en la actividad de oxidación de lactosa, en condiciones estándar y como se muestra en los ejemplos. La invención proporciona además un procedimiento de oxidación de la lactosa con la CDH de la invención. Tal procedimiento se usa preferentemente en la detección analítica de lactosa en una muestra. También es posible la detección de maltosa.

La mayoría de las CDH son capaces de oxidar la lactosa. La reacción de oxidación se puede detectar, por ejemplo, monitorizando los aceptores de electrones para la reacción redox, tales quinonas, como DClP (2,6-dicloroindofenol) o- o p-benzoquinona o derivados de las mismas, azul de metileno, verde de metileno, azul de Meldola, ferricianuro de potasio, hexafluorofosfato de ferricenio, FeCh o citocromo c (siendo este último un cofactor del dominio hemo) o simplemente determinando la corriente eléctrica o las tensiones en un electrodo, siendo el aceptor de electrones la superficie del electrodo.

No es necesario usar una CDH completa; el dominio de flavina, incluso sin el dominio hemo, es suficiente para la actividad catalítica. Por lo tanto, el dominio se denomina “dominio funcional” ya que tiene la función de oxidar la lactosa con un aceptor de electrones adecuado. La actividad es ejercida por la enzima celobiosa deshidrogenasa completa o por el dominio de la flavodehidrogenasa catalíticamente activa.

Las CDH de tipo salvaje tienen una actividad indeseable para oxidar la glucosa y la galactosa, especialmente en el caso de las CDH de la ascomicota. La modificación de acuerdo con la presente invención debe entenderse ahora en que las CDH de la invención se desvían de las CDH de tipo salvaje por esta actividad de oxidación de glucosa y galactosa sustancialmente disminuida. Esta actividad de oxidación de glucosa y galactosa sustancialmente disminuida puede estar en combinación con una disminución aumentada o solo pequeña en la actividad de oxidación de lactosa. En algunas realizaciones, la invención aumenta la relación de la actividad de oxidación de lactosa a la actividad de oxidación de glucosa y/o galactosa.

Las CDH modificadas preferidas o su dominio funcional de flavodehidrogenasa son de una CDH del subreino dikarya. Preferentemente, la CDH es de Ascomicota o Basidiomicota. Las ascomicotas preferidas se seleccionan de Myriococcum thermophilum, Corynascus thermophilus, Chaetomium atrobrunneum (Myceliophthora fergusii), Hypoxylon haematostroma, Neurospora crassa o Stachybotrys bisby. Las basidiomicotas preferidas son Athelia rolfsii, Gelatoporia subvermispora, Phanerochaete chrysosporium, Trametes versicolor. Tales CDH no modificadas se describen en los documentos de patente WO 2010/097462 A y WO2013/131942, que incluye secuencias de nucleótidos codificantes, y en secuencias de la SEQ ID NO: 1-10 en la presente memoria descriptiva. Las secuencias adecuadas también están disponibles en las bases de datos de secuencias, en particular la base de datos NCBI, por ejemplo, números de acceso ADT70773.1, ADT70775.1, ADT70772.1, XP_956591.1, ABS45567.2, ADT70777.1, AAO64483.1, ACF60617.1, AAB61455.1, XP_008041466.1. “No modificado” como se usa en la presente memoria es una CDH sin la modificación inventiva que disminuye la actividad de oxidación de glucosa y galactosa. Puede haber modificaciones adicionales que aumenten la interacción entre la flavina y el dominio hemo si se usa una CDH completa (tal como se describe en el documento de patente WO 2010/097462).

Preferentemente, la CDH modificada o su dominio funcional de flavodehidrogenasa se basa en un dominio de CDH o flavodehidrogenasa no modificada con un motivo central activo que tiene la secuencia X¹X²NHWX³X⁴X⁵, en la que X¹es cualquier aminoácido, preferentemente seleccionado de N, C y R; X²se selecciona de S y A; X³se selecciona de V, M e I; X⁴es cualquier aminoácido, preferentemente seleccionado de G y S; y X⁵es cualquier aminoácido, preferentemente seleccionado de S, A y T; especialmente preferido X⁴y X⁵no son ambos S. En la enzima o dominio modificado de la invención, el N en este motivo se cambia a Q, I, T o L como se indicó anteriormente. Este cambio facilita el cambio de actividad de la invención reduciendo la actividad en glucosa y/o galactosa. Con la información del motivo, se puede determinar la posición para la sustitución. Preferentemente, también la CDH modificada o el dominio comprende la secuencia X¹X²ZHWX³X⁴X⁵, siendo Z, Q, I, T o L y X¹-X⁵definidos como anteriormente.

La CDH modificada o su dominio funcional de flavodehidrogenasa comprende preferentemente un dominio de flavodehidrogenasa modificada basado en uno de los dominios de flavodehidrogenasa no modificada de acuerdo con los aminoácidos 253-831 de la SEQ ID NO: 1, aminoácidos 269-845 de la SEQ ID NO: 2, aminoácidos 249 787 de la SEQ ID NO: 3, aminoácidos 253-829 de la SEQ ID NO: 4, aminoácidos 251-828 de la SEQ ID NO: 5, aminoácidos 251-829 de la SEQ ID NO: 6, aminoácidos 233-771 de la SEQ ID NO: 7, aminoácidos 236-774 de la SEQ ID NO: 8, aminoácidos 235-773 de la SEQ ID NO: 9, aminoácidos 230-768 de la SEQ ID NO: 10. Preferentemente el dominio inventivo de flavodehidrogenasa modificada tiene una secuencia con al menos 50%, preferentemente al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, en particular se prefiere al menos 99%, de identidad de secuencia con uno de dichos dominios de flavodehidrogenasa no modificada y además comprende al menos una sustitución de aminoácidos en el aminoácido correspondiente a N721 de la SEQ ID NO: 5 o en el motivo NHW, adecuado para reducir la actividad de oxidación de glucosa y galactosa.

Preferentemente, el aminoácido correspondiente a N721 de la SEQ ID NO: 5 o asparagina en el motivo NHW es el aminoácido N723 de la SEQ ID NO: 1, N738 de la SEQ ID NO: 2, N718 de la SEQ ID NO: 3, N722 de la SEQ ID NO: 4, N721 de la SEQ ID NO: 5, N721 de la SEQ ID NO: 6, N704 de la SEQ ID NO: 7, N707 de la SEQ ID NO: 8, N706 de la SEQ ID NO: 9, N701 de la SEQ ID NO: 10.

Las CDH homólogas o los dominios de flavodehidrogenasa dentro de estos requisitos de secuencia se pueden identificar fácilmente mediante comparaciones de secuencia tales como la alineación de secuencia usando herramientas disponibles públicamente, tales como BLASTP, ClustalW o FastDB. Preferentemente, una CDH homóloga o modificada o el dominio de la misma tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, al menos 11, al menos 13, al menos 15, al menos 17, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 80, al menos 100 y/o hasta 100, hasta 80, hasta 60, hasta 50, hasta 40, hasta 30, hasta 30, hasta 20, hasta 15 sustituciones, deleciones, inserciones o modificaciones de aminoácidos adicionales, y cualquier intervalo entre estos valores, en comparación con cualquiera de las CDH de las SEQ ID NO: 1-10 o cualquiera de sus dominios de flavodehidrogenasa. Una base CDH preferida particular es de N. crassa, SEQ ID NO: 4. Otras “sustituciones, deleciones, inserciones de aminoácidos” no incluyen la sustitución en el N de N721 correspondiente a SEQ ID NO: 5 o en el motivo NHW. Se puede hacer una predicción de tales modificaciones mediante procedimientos computacionales que utilizan, por ejemplo, acoplamiento molecular en estructuras cristalinas como la entrada de base de datos PDB “1kdg”.

El efecto de aminoácidos modificados adicionales en el sitio activo y el sitio de unión al sustrato se puede determinar para catálisis homogénea por procedimientos fotométricos y para catálisis heterogénea por mediciones electroquímicas usando electrodos enzimáticos, tal como se describe en la presente memoria.

Los procedimientos para una modificación adicional pueden ser conocidos en la técnica, tales como mutaciones de aminoácidos, que incluyen sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, pero también modificación/derivación química de cadenas laterales de aminoácidos.

La enzima o dominio inventivos generalmente se expresan de forma recombinante. También se proporcionan preparaciones que comprenden la CDH o dominio modificado. El término “enzima” o “preparación enzimática”, como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a una celobiosa deshidrogenasa o su dominio de flavodehidrogenasa de un organismo específico que es al menos aproximadamente 20% puro, preferentemente al menos aproximadamente 40% puro, incluso más preferentemente al menos aproximadamente 60 % puro, incluso más preferentemente al menos 80% puro y lo más preferentemente al menos 90% puro, según se determina por electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE).

La presente divulgación se refiere a celobiosa deshidrogenasas modificadas/diseñadas genéticamente o al dominio de flavodehidrogenasa a partir de estructuras de proteínas existentes, que oxidan la glucosa y/o galactosa de manera menos eficiente con o sin un recambio de lactosa más eficiente que las celobiosa deshidrogenasas conocidas actualmente, especialmente aquellas que son más cercanas a la CDH modificada o al dominio de la flavodehidrogenasa, como un dominio de CDH o de flavodehidrogenasa de las de secuencias SEQ ID NO: 1-10 (las porciones para el dominio de la flavodehidrogenasa se proporcionan a continuación en la descripción de la Figura 1). Las constantes cinéticas de las enzimas responsables de este efecto son preferentemente un valor Km más alto y un valor kcat más bajo para glucosa y/o galactosa sola o en combinación con un valor Km más bajo y un valor kcat más alto para la lactosa que las enzimas actualmente caracterizadas.

Preferentemente, el valor Km de la celobiosa deshidrogenasa o su dominio funcional de flavodehidrogenasa para una reacción de oxidación de lactosa es inferior a 10 mM, preferentemente según se determina con la CDH o dicho dominio está inmovilizado en un electrodo.

Preferentemente, el valor Km de la celobiosa deshidrogenasa o su dominio funcional de flavodehidrogenasa para una reacción de oxidación de glucosa y/o galactosa es superior a 3 M o superior a 5 M, preferentemente según se determina con la CDH o dicho dominio está inmovilizado en un electrodo.

Por supuesto, la CDH modificada o el dominio de flavina todavía pueden tener actividad para una oxidación electrocatalítica de glucosa y/o galactosa. Es suficiente que se reduzca la dependencia de la concentración de la señal de glucosa y/o galactosa. Esencialmente, las señales de fondo constantes que dependen de glucosa y/o galactosa se pueden eliminar de la detección de lactosa por normalización. Con especial preferencia, el dominio de CDH o flavina tiene la propiedad de que una señal de glucosa y/o galactosa durante la detección de lactosa o la determinación de la concentración de lactosa es inferior al 5%; particularmente la señal, por ejemplo, La corriente de electrodo o la reducción electroquímica de un aceptor de electrones, de 20 g/l de glucosa y/o galactosa en una solución en comparación con la señal de una solución de lactosa de 20 g/l es inferior al 5%. En realizaciones preferentes de la invención, la actividad de oxidación de glucosa y/o galactosa de la CDH o del dominio se reduce en relación con la actividad de oxidación de lactosa. Con especial preferencia, la dependencia de la concentración de la oxidación de glucosa y/o galactosa se reduce de modo que, si hay glucosa y/o galactosa presentes, solo se detecta una contribución sustancialmente constante de glucosa y/o galactosa a la señal en relación con una señal de lactosa.

Se entiende que un experto en la técnica puede diseñar la celobiosa deshidrogenasa mencionada u otra para obtener la CDH modificada o el dominio de la flavodehidrogenasa activa utilizando los principios descritos en la presente memoria o en la técnica anterior (WO 2010/097462 A, WO2013/131942) como el diseño racional de enzimas a través de mutagénesis dirigida al sitio o enfoques de evolución dirigida (por ejemplo, transposición genética, PCR propensa a errores, etc.) y el posterior cribado de la diversidad generada. Las técnicas para introducir una mutación adicional en la secuencia de ácido nucleicos para intercambiar un nucleótido por otro nucleótido con el objetivo de intercambiar un aminoácido por otro en la proteína resultante se pueden lograr mediante mutagénesis dirigida al sitio utilizando cualquiera de los procedimientos conocidos en la técnica. Las posiciones de aminoácidos y la modificación para modificar una CDH pueden obtenerse mediante modelos de homología utilizando la estructura cristalina de Phanerochaete chrysosporium CDH (entrada de la base de datos PDB 1kdg) como plantilla y superposición de los modelos obtenidos, así como estudios de acoplamiento. Es posible usar una CDH como plantilla y mediante comparación de secuencia para obtener los aminoácidos correspondientes para modificación para reducir la actividad de oxidación de glucosa y/o galactosa.

La CDH modificada o su dominio funcional de flavodehidrogenasa se puede aislar por diafiltración, cromatografía de intercambio iónico y preferentemente purificarse adicionalmente por cromatografía de interacción hidrófoba. Preferentemente, la c Dh o el dominio es producido de forma recombinante por Pichia pastoris.

La invención proporciona además una molécula de ácido nucleico que codifica una CDH modificada o su dominio funcional de flavodehidrogenasa como se describió anteriormente. Las secuencias de CDH no modificadas son conocidas en la técnica, por ejemplo, en la base de datos de secuencias NCBI y divulgada en los documentos de patente WO 2010/097462 A y WO2013/131942. El ácido nucleico puede modificarse para codificar el dominio inventivo de CDH o flavina con la sustitución o mutación adicional. Los ácidos nucleicos, CDH o dominios descritos en la presente memoria pueden aislarse y/o purificarse.

Además, se proporciona un procedimiento de producción de una CDH modificada o su dominio funcional de flavodehidrogenasa de la invención, que comprende expresar de forma recombinante una molécula de ácido nucleico que codifica dicha CDH modificada o su dominio funcional de flavodehidrogenasa en una célula huésped.

En otro aspecto, la invención proporciona además un electrodo que comprende una celobiosa deshidrogenasa inmovilizada o su dominio funcional de flavodehidrogenasa de la invención.

Preferentemente, el electrodo comprende una CDH inmovilizada en modo de transferencia de electrones directa o mediada (Tasca et al. 2011a, Tasca et al. 2011b, Ludwig et al. 2010, Safina et al. 2010, Tasca et al 2010a, Tasca et al. al. 2010b) o un dominio de flavodehidrogenasa inmovilizado en modo de transferencia mediada de electrones. Como electrodo, se entiende cualquier superficie adecuada para recoger electrones de CDH. El electrodo puede ser de cualquier material adecuado para inmovilizar la CDH, por ejemplo, carbono como grafito, grafito pirolítico, carbono vítreo, nanotubos de carbono (de pared simple o múltiple), fibras de carbono, diamante dopado con boro, electrodos de oro modificados con promotores, por ejemplo, tioles o electrodos serigrafiados. Esta es una lista no exhaustiva de posibles electrodos, que pueden, por ejemplo, contienen otras nanopartículas (oro, ...) para aumentar el área de superficie específica. Los usos particulares de los electrodos de la invención están en la provisión de biosensores, más específicamente a los biosensores de lactosa que usan las propiedades de transferencia directa de electrones (DET) de la celobiosa deshidrogenasa (CDH) o que usan propiedades de transferencia mediada de electrones (MET) para medir la concentración de lactosa a ácidos, pH neutro, alcalino.

En el electrodo, la CDH o el dominio de la flavodehidrogenasa pueden inmovilizarse por adsorción, preferentemente también atrapamiento físico en un polímero, formación compleja, preferentemente a través de un enlazador complejante adicional, unión covalente, en particular reticulación o unión iónica y/o la celobiosa deshidrogenasa inmovilizada puede ser reticulada, en particular por agentes bifuncionales, para aumentar la estabilidad o la actividad. Se ha demostrado que la reticulación con agentes bifuncionales, tales como agentes con dos grupos reactivos que hacen una conexión con la CDH, puede estabilizar la CDH e incluso aumentar su actividad en electrodos de grafito medibles por los procedimientos amperométricos descritos en la presente memoria. Esta ventaja puede conducir a una mayor sensibilidad y a reducir el límite de detección de lactosa. Tal agente de reticulación es, por ejemplo, glutaraldehído o cualquier otro dialdehído. Otros procedimientos para la inmovilización se describen, por ejemplo, en WO 2010/097462 y WO2013/131942, que se pueden usar de acuerdo con la invención.

Los electrodos se pueden usar en forma de un solo electrodo o pilas de electrodos, por ejemplo, de 2, 3, 4 o más electrodos.

Las configuraciones y usos de los electrodos, incluyendo los parámetros de medición, se describen, por ejemplo, en WO 2010/097462 y WO2013/131942, que se pueden usar de acuerdo con la invención.

La presente divulgación proporciona además un procedimiento de oxidación de la lactosa con el dominio inventivo de CDH o flavina, especialmente en un procedimiento de detección de o cuantificación de la lactosa en una muestra que comprende la etapa de oxidar lactosa en dicha muestra con una CDH modificada o su dominio funcional de flavodehidrogenasa o un electrodo como se describe en la presente memoria y detecta o cuantifica dicha oxidación, preferentemente en el que dicha muestra comprende o se sospecha que comprende glucosa y/o galactosa. La muestra de fluido puede ser cualquier fluido que potencialmente comprenda lactosa, incluyendo leche o productos lácteos, como suero o queso. Si se analizan productos sólidos, como el queso, los carbohidratos, incluyendo la lactosa, pueden extraerse o el producto sólido puede fluidificarse, por ejemplo, mediante disolución.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un kit de ensayo de lactosa que comprende la celobiosa deshidrogenasa modificada o su dominio funcional de flavodehidrogenasa o un electrodo como se describe en la presente memoria. El kit puede, en realizaciones preferentes, también comprender sustancias auxiliares, tales como tampones, y recipientes tales como medios de retención de muestras y/o patrones de lactosa. Se pueden usar patrones de lactosa para calibrar el ensayo. El kit también puede comprender un lector para una señal, especialmente una señal electroquímica tal como un potenciostato, un dispositivo de memoria legible por ordenador con software para calibración y/o cálculos de medición. La invención se puede definir por las siguientes realizaciones:

1. Una celobiosa deshidrogenasa (CDH) modificada o su dominio funcional de flavodehidrogenasa que tiene una sustitución en el aminoácido correspondiente a N721 de la SEQ ID NO: 5 (CDH de M. thermophilum) por glutamina, isoleucina, treonina o leucina o una sustitución de asparagina en el motivo central activo que tiene la secuencia de aminoácidos NHW por glutamina, isoleucina, treonina o leucina.

2. La CDH modificada o su dominio funcional de flavodehidrogenasa de acuerdo con 1, en la que el motivo del centro activo tiene la secuencia X¹X²NHWX³X⁴X⁵, en la que X¹es cualquier aminoácido, preferentemente seleccionado de N, C y R; X²se selecciona de S y A; X³se selecciona de V, M e I; X⁴es cualquier aminoácido, preferentemente seleccionado de G y S; y X⁵es cualquier aminoácido, preferentemente seleccionado de S, A y T; especialmente preferido X⁴y X⁵no son ambos S.

3. La CDH modificada o su dominio funcional de flavodehidrogenasa de acuerdo con 1 o 2, caracterizada porque la CDH es de dikaryota, preferentemente seleccionada de ascomycota o basidiomycota.

4. La CDH modificada o su dominio funcional de flavodehidrogenasa de acuerdo con 3, caracterizada porque la CDH es una CDH modificada de una CDH de Myriococcum thermophilum, Corynascus thermophilus, Chaetomium atrobrunneum (Myceliophthora fergusii), Hypoxylon haematostroma, Neurospora crassa o Stachybotrys bisby, Athelia rolfsii, Gelatoporia subvermispora, Phanerochaete chrysosporium, Trametes versicolor.

5. La CDH modificada o su dominio funcional de flavodehidrogenasa de acuerdo con uno cualquiera de 1 a 4, que comprende un dominio de flavodehidrogenasa modificada basado en uno de los dominios de flavodehidrogenasa no modificada de acuerdo con los aminoácidos 253-831 de la SEQ ID NO: 1, aminoácidos 269- 845 de la SEQ ID NO: 2, aminoácidos 249-787 de la SEQ ID NO: 3, aminoácidos 253-829 de la SEQ ID NO: 4, aminoácidos 251-828 de la SEQ ID NO: 5, aminoácidos 251-829 de la SEQ ID NO: 6, aminoácidos 233-771 de la SEQ ID NO: 7, aminoácidos 236-774 de la SEQ ID NO: 8, aminoácidos 235-773 de la SEQ ID NO: 9, aminoácidos 230-768 de la SEQ ID NO: 10;

dicho dominio de flavodehidrogenasa modificada tiene una secuencia con al menos 50%, preferentemente al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, a al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, en particular se prefiere al menos 99%, de identidad de secuencia con uno de dichos dominios de flavodehidrogenasa no modificada y además comprende la mutación de sustitución en el aminoácido correspondiente a N721 de la SEQ ID NO: 5 o en el motivo NHW.

6. La CDH modificada o su dominio funcional de flavodehidrogenasa de acuerdo con uno cualquiera de 1 a 5, en la que el aminoácido correspondiente a N721 de la SEQ ID NO: 5 o asparagina en el motivo NHW es el aminoácido N723 de la SEQ ID NO: 1, N738 de la SEQ ID NO: 2, N718 de la SEQ ID NO: 3, N722 de la SEQ ID NO: 4, N721 de la SEQ ID NO: 5, N721 de la SEQ ID NO: 6, N704 de la SEQ ID NO: 7, N707 de la SEQ ID NO: 8, N706 de la SEQ ID NO: 9, N701 de la SEQ ID NO: 10.

7. La CDH modificada o su dominio funcional de flavodehidrogenasa de acuerdo con uno cualquiera de 1 a 6, que se produce de forma recombinante por Pichia pastoris, se aísla por diafiltración, cromatografía de intercambio iónico y preferentemente se purifica adicionalmente por cromatografía de interacción hidrófoba.

8. La CDH modificada o su dominio funcional de flavodehidrogenasa de acuerdo con uno cualquiera de 1 a 7, caracterizada porque el valor Km de la celobiosa deshidrogenasa o su dominio funcional de flavodehidrogenasa para una reacción de oxidación de lactosa es inferior a 10 mM, preferentemente según se determina con la CDH, o estando dicho dominio inmovilizado en un electrodo.

9. La CDH modificada o su dominio funcional de flavodehidrogenasa de acuerdo con uno cualquiera de 1 a 8, caracterizada porque el valor Km de la celobiosa deshidrogenasa o su dominio funcional de flavodehidrogenasa para una reacción de oxidación de glucosa es superior a 3 M, preferentemente como se determina con la CDH, o estando dicho dominio inmovilizado en un electrodo.

10. La CDH modificada o su dominio funcional de flavodehidrogenasa de acuerdo con uno cualquiera de 1 a 9, caracterizada porque el valor Km de la celobiosa deshidrogenasa o su dominio funcional de flavodehidrogenasa para una reacción de oxidación de galactosa es superior a 3 M, preferentemente como se determina con la CDH, o estando dicho dominio inmovilizado en un electrodo.

11. Una molécula de ácido nucleico que codifica una CDH modificada o su dominio funcional de flavodehidrogenasa de acuerdo con uno cualquiera de 1 a 10.

12. Un procedimiento de producción de una CDH modificada o su dominio funcional de flavodehidrogenasa de acuerdo con uno cualquiera de 1 a 10, que comprende expresar de forma recombinante una molécula de ácido nucleico de acuerdo con 11 en una célula huésped.

13. Un electrodo que comprende una celobiosa deshidrogenasa inmovilizada o su dominio funcional de flavodehidrogenasa de acuerdo con uno cualquiera de 1 a 10;

preferentemente en el que la celobiosa deshidrogenasa se inmoviliza por adsorción, formación de complejo, con especial preferencia a través de un enlazador complejante adicional, enlace covalente o iónico, y/o en el que preferentemente la celobiosa deshidrogenasa inmovilizada se retícula, en particular por agentes bifuncionales, para aumentar la estabilidad o actividad.

14. Un procedimiento de detección o cuantificación de lactosa en una muestra que comprende la etapa de oxidar lactosa en dicha muestra con una CDH modificada o su dominio funcional de flavodehidrogenasa de acuerdo con uno cualquiera de 1 a 10, o un electrodo de acuerdo con 13 y detectar o cuantificar dicha oxidación, preferentemente en el que dicha muestra comprende o se sospecha que comprende glucosa y/o galactosa, con especial preferencia una muestra que contiene leche o productos lácteos.

15. Un kit de ensayo de lactosa que comprende la celobiosa deshidrogenasa modificada o su dominio funcional de flavodehidrogenasa de acuerdo con cualquiera de los 1 a 10 o un electrodo de acuerdo con 13 y un medio de retención de muestras y/o estándares de lactosa.

La presente invención se ilustra adicionalmente mediante las siguientes Figuras y ejemplos sin limitarse a los mismos.

Figuras

La Figura 1 es una alineación de secuencias de secuencias de aminoácidos de los dominios de flavodehidrogenasa (“dominios de flavina”) de las CDH de tipo salvaje de Chaetomium atrobrunneum (aa 253 831 de la SEQ ID NO: 1), Hypoxylon haematostroma (aa 269-845 de la SEQ ID NO: 2), Corynascus thermophilus (aa 249-787 de la s Eq ID NO: 3), Neurospora crassa (aa 253-829 de la SEQ ID NO: 4), Myriococcum thermophilum (aa 251-828 de la SEQ ID NO: 5), Stachybotrys bisby (aa 251-829 de la SEQ iD n O: 6), Athelia rolfsii (aa 233-771 de la SEQ ID NO: 7), Gelatoporia subvermispora (aa 236-774 de la SEQ ID NO: 8), Phanerochaete chrysosporium (aa 235-773 de la Se Q ID NO: 9), Trametes versicolor (aa 230-768 de la SEQ ID NO: 10). El sitio de mutación correspondiente a N721 de la SEQ ID NO: 5 está resaltado y marcado con “+” (posición 483 de la numeración consensuada mostrada de los dominios de flavina mostrados).

La Figura 2 proporciona curvas de calibración de lactosa de electrodos de detección que presentan CDH de N. crassa de tipo salvaje no modificada y CDH de N. crassa N722Q.

La Figura 3 muestra el efecto de la adición de una solución de lactosa de 0,1 g con diferentes concentraciones de glucosa y galactosa cuando se usa CDH de N. crassa de tipo salvaje no modificada y CDH de N. crassa N722Q. La señal para la CDH de N. crassa de tipo salvaje no modificada es dependiente de glucosa y galactosa. La señal para la CDH de N. crassa N722Q no depende de la glucosa y la galactosa.

La Figura 4 proporciona curvas de calibración de glucosa de electrodos de detección que presentan CDH de N. crassa de tipo salvaje no modificada y variante de CDH de N. crassa, CDH N722Q.

La Figura 5 proporciona curvas de calibración de galactosa de electrodos de detección que presentan CDH de N. crassa de tipo salvaje no modificada y variante de CDH de N. crassa, CDH N722Q.

Ejemplos

Ejemplo 1: Materiales

Los productos químicos utilizados en tampones y medios de fermentación eran productos comerciales y al menos de grado analítico, si no se indica lo contrario. Los sustratos para estudios cinéticos fueron lactosa, galactosa, glucosa y 2,6-dicloroindofenol (DCIP) de Sigma-Aldrich en el grado más alto de pureza disponible. Los tampones se prepararon usando agua purificada y desionizada (18 MQ) con un sistema Milli-Q (Millipore, Bedford, m A, EE. UU.).

Ejemplo 2: Ensayos de actividad enzimática y cinética en estado estable

La actividad enzimática se ensayó a 30 °C usando el DCIP (Karapetyan et al., 2005 Journal of Biotechnology 121:34-48) como aceptor de electrones. Las soluciones madre de carbohidratos usadas para mediciones cinéticas se prepararon en el tampón respectivo y se dejaron reposar durante la noche para la mutarotación, mientras que las soluciones madre de aceptores de electrones se prepararon en agua y se usaron inmediatamente. La estequiometría de reacción es de 1 para el receptor DClP de dos electrones (1 mol de DCIP reducido por mol de carbohidrato oxidado). Las constantes cinéticas se calcularon ajustando los datos observados a la ecuación de Henri-Michaelis-Menten o al modelo adaptado para la inhibición del sustrato usando regresión no lineal por mínimos cuadrados y el programa SigmaPlot (Systat Software, San José, California, E.E. U.U.). La concentración de proteína se determinó con el ensayo de Bradford.

Ejemplo 3: Caracterización de proteínas

La concentración de proteína se determinó mediante el procedimiento de tinción con colorante de Bradford usando un ensayo prefabricado de Bio-Rad Laboratories Hercules, California, EE. UU.) y albúmina de suero bovino como estándar de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

Para la caracterización electroforética, SDS-PAGE se realizó en una unidad de electroforesis vertical Hoefer SE 260 Mighty Small II. Los geles (10,5*10 cm; 10% T, 2,7% C) se moldearon y ejecutaron de acuerdo con las modificaciones del sistema Laemmli por parte de los fabricantes. Las bandas de proteínas en la SDS-PAGE se tiñeron con plata, las bandas en el gel IEF con azul de Coomassie R-250, de acuerdo con las instrucciones.

Ejemplo 4: Actividad de lactosa a glucosa/galactosa

El aminoácido N721 de la CDH de M. therm., que forma parte del subsitio catalítico, cerca del anillo de isoaloxazina y completamente conservada entre las CDH, se seleccionó para la mutagénesis de saturación. Se utilizaron codones degenerados del tipo NNS. La biblioteca mutante correspondiente se transformó en S. cerevisiae y se expresó bajo el control del promotor GAL 1 en cuatro placas de 96 pocillos. Cada placa contenía 88 variantes y se inocularon 8 pocillos con el tipo salvaje como control. Las bibliotecas se seleccionaron dos veces para determinar la actividad de CDH con el ensayo basado en DCIP usando lactosa o glucosa como sustrato. Los 11 transformantes que mostraron una relación aumentada de actividad de lactosa a glucosa se enviaron para secuenciar para identificar la mutación beneficiosa. La Tabla 1 muestra los resultados de la detección y los intercambios de aminoácidos identificados. Las variantes seleccionadas mostraron un aumento en la actividad de lactosa mientras que la actividad de glucosa se redujo drásticamente en comparación con el tipo salvaje.

Tabla 1. Actividad de lactosa a glucosa/galactosa

Relación de act. DCIP (AAbs. h-1)

30 mM Lactosa 50 mM Glucosa Lactosa/Glucosa ^{Intercambio de} _aminoácidos Peso (prom.) 1,7 0,27 6,3 ninguno

Placa 1 D05 4,7 0,03 156 Q

Placa 1 G11 4,6 0,02 230 Q

Placa 2 B05 3,8 0,02 190 I

Placa 2 E05 5,9 0,01 590 I

Placa 2 G05 3,8 0,01 380 T

Placa 2 F07 3,8 0,04 95 T

Placa 3 A11 5,0 0,11 45 Q

Placa 3 C10 4,8 0,02 240 L

Placa 3 H11 5,6 0,02 280 Q

Placa 4 G08 4,7 0,02 235 Q

Placa 4 G10 4,7 0,01 470 Q

La actividad en galactosa se parecía a los resultados en glucosa.

Ejemplo 5: Generación de variantes de CDH de Neurospora crassa por mutagénesis dirigida al sitio

El plásmido pNCIIA previamente reportado, que codifica el gen CDH de N. crassa (XM_951498, SEQ ID NO: 12 del documento de patente WO 2010/097462, incorporado por referencia en la presente) se usó como plantillas para la amplificación del gen diana con los cebadores 5NCa-BstBI (5'-TATTTCGAAACGATGAGGACCACCTCGGCC-3', SEQ ID NO: 11) y 3NCa-XbaI (5'-TATCACGTGCTACACACACTGCCAATACC-3', SEQ ID NO: 12). La PCR se realizó con el ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion de New England BioLabs, una mezcla de desoxinucleósido trifosfato (dNTP) de Fermentas, cebadores oligonucleotídicos de VBC Biotech (Viena, Austria) y un termociclador C-1000 de Bio-Rad Laboratories. El fragmento de PCR resultante se digirió con BstBI y XbaI y se clonó en el vector igualmente tratado pPICZa A. El procedimiento dio como resultado un gen que codifica una proteína con sus secuencias de señal nativas clonadas bajo el control del promotor AOX1 inducible por metanol. Se omitieron las etiquetas C-terminales para la purificación o detección de anticuerpos. La correcta inserción de los genes y la ausencia de mutaciones se confirmaron mediante secuenciación de ADN. Los plásmidos lineales verificados se usaron para la transformación en células electrocompetentes de P. pastoris y los transformantes se seleccionaron en placas YPD Zeocin (1 mg l-1).

Ejemplo 6: Producción de CDH recombinante

La CDH recombinante de tipo salvaje, así como la variante, se produjeron en matraces con deflector de 1 l. Los precultivos se cultivaron durante la noche en 30 ml de medio YPD a 30 °C y 120 rpm. Después de aproximadamente 18 horas, los precultivos se transfirieron a matraces con deflectores de 1 litro que contenían 200 ml de medio BMGY sin metanol. La inducción con metanol se inició inmediatamente usando una bomba peristáltica multicanal (Minipuls Evolution, Gilson, Middleton, WI, EE. UU.). Cada matraz se suministró metanol ocho veces al día produciendo una concentración total de metanol al 2% (v/v) por día. El aumento de la actividad se controló usando el DCIP y los ensayos de enzimas citocromo c. El cultivo se detuvo en el quinto día de inducción de metanol, las células se eliminaron por centrifugación (4000 rpm, 20 min) y el sobrenadante se ajustó a una concentración final de sulfato de amonio del 20%.

Ejemplo 7: Purificación de CDH recombinante

Las enzimas se purificaron hasta homogeneidad en una purificación de dos etapas. La muestra se cargó en una columna de 20 ml de PHE Sepharose FF (HR26/20) equilibrada con tampón de acetato de Na 50 mM pH 5,5 que contenía sulfato de amonio al 20%. Las proteínas se eluyeron aumentando la concentración del tampón de elución (tampón de acetato de Na 50 mM, pH 5,5) de 0 a 100% en 5 volúmenes de columna y se agruparon las fracciones que contenían actividad de CDH. Después de la diafiltración con un módulo de flujo cruzado de pila plana de polietersulfona con un límite de 10 kDa (Viva Flow 50, Sartorius, Gottingen, Alemania) hasta una conductividad de 5 mS cm-1 en acetato de Na 20 mM pH 5,5 las muestras se cargaron en una columna Q-Source de 20 ml (HR26/20) equilibrada con un tampón de acetato de Na 20 mM, pH 5,5. La CDH se eluyó aumentando la concentración del tampón de elución (tampón de acetato de Na 50 mM, pH 5,5 que contenía 0,5 M de NaCl) del 0 al 100% en 50 volúmenes de columna. Las fracciones se probaron para determinar la actividad de CDH y se agruparon de acuerdo con el Reinheitszahl más alto (RZ, calculado a partir de la relación de absorbancia 420 nm/280 nm). Las enzimas purificadas se concentraron y se diafiltraron en 50 mM de tampón citrato, pH 5,5, se dividieron en alícuotas y se mantuvieron a 4 °C para su uso posterior.

Ejemplo 8: Mediciones electroquímicas

Se conectó un electrodo serigrafiado con una configuración de tres electrodos (Dropsens, Oviedo, España) a un potenciostato Autolab (PGSTAT204, Metrohm Autolab B. V., Utrecht, Países Bajos) y se usó para mediciones electroquímicas. Los electrodos serigrafiados modificados con enzimas (DropSens, Oviedo, España) se montaron usando un portaelectrodos (DropSens, Oviedo, España) en un vaso de precipitados lleno de 50 ml de tampón de medición y, opcionalmente, concentraciones variables de glucosa. El sistema fue controlado por el software NOVA versión 1.11.0 (Metrohm Autolab B. V., Utrecht, Países Bajos).

Ejemplo 9: CDH mutada de N. crassa - glucosa reducida, actividad de galactosa

La CDH de N. crassa oxida la glucosa y la galactosa (Harreither et al., 2007), lo que tiene efectos secundarios negativos en la precisión de la detección de lactosa si hay glucosa y galactosa. Para reducir la actividad con glucosa y galactosa, se usó CDH de N. crassa como un andamiaje de proteínas para el cual las actividades de glucosa y galactosa se redujeron considerablemente. La variante enzimática N722Q se produjo de forma heteróloga en P. pastoris de acuerdo con las rutinas explicadas y se comparó con la CDH recombinante de tipo salvaje de N. crassa. Los pesos moleculares no diferían significativamente de la enzima nativa producida por el hongo. Para investigar el efecto de la mutación en la variante de N. crassa, se realizó una caracterización completa de las constantes en estado estable (Tablas 2 y 3).

Tabla 2. Constantes cinéticas aparentes de wtCDH para donantes de electrones indicados en 100 mM de tampón Mcllvaine a pH 5,5 utilizando DCIP como aceptor de electrones artificial

Enzima ^{Sustrato (Donantes}Km Medio (mM) Vmax Medio (U/mg) kcat Medio kcat/Km Medio _{de electrones)}± SD ± SD (s-1) (mM-1 s-1) Lactosa 0,154 ± 0,01 18,2 ± 0,56 25,78 167,4 wtCDH Glucosa3 2039 ± 0,41 20,3 ± 2,34 28,76 12,03

Galactosa3 26,5 ± 6,85 6,33 ± 1,57 8,97 3,75

a Valores Km y kcat extrapolados.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una celobiosa deshidrogenasa (CDH) modificada o su dominio funcional de flavodehidrogenasa que tiene una sustitución en el aminoácido correspondiente a N721 de la SEQ ID NO: 5 (CDH de M. thermophilum) por glutamina, isoleucina, treonina o leucina o una sustitución de asparagina en el motivo del centro activo que tiene la secuencia de aminoácidos NHW por glutamina, isoleucina, treonina o leucina,

que comprende un dominio de flavodehidrogenasa modificada basado en uno de los dominios de flavodehidrogenasa no modificada de acuerdo con los aminoácidos 253-831 de la SEQ ID NO: 1, aminoácidos 269-845 de la SEQ ID NO: 2, aminoácidos 249-787 de la SEQ ID NO: 3, aminoácidos 253-829 de la SEQ ID NO: 4, aminoácidos 251-828 de la SEQ ID NO: 5, aminoácidos 251-829 de la SEQ ID NO: 6, aminoácidos 233-771 de la SEQ ID NO: 7, aminoácidos 236-774 de la SEQ ID NO: 8, aminoácidos 235-773 de la SEQ ID NO: 9, aminoácidos 230-768 de la SEQ ID NO: 10; dicho dominio de flavodehidrogenasa modificada tiene una secuencia con al menos un 50% de identidad de secuencia con uno de dichos dominios de flavodehidrogenasa no modificada y además comprende la mutación de sustitución en el aminoácido correspondiente al N721 de la SEQ ID NO: 5 o en el motivo NHW.

2. La CDH modificada o su dominio funcional de flavodehidrogenasa de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el motivo del centro activo tiene la secuencia X¹X²NHWX³X⁴X⁵, en la que X¹es cualquier aminoácido, preferentemente seleccionado de N, C y R; X²se selecciona de S y A; X³se selecciona de V, M e I; X⁴es cualquier aminoácido, preferentemente seleccionado de G y S; y X⁵es cualquier aminoácido, preferentemente seleccionado de S, A y T; especialmente preferido X⁴y X⁵no son ambos S.

3. La CDH modificada o su dominio funcional de flavodehidrogenasa de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque la CDH es de dikaryota, preferentemente seleccionada de ascomycota o basidiomycota.

4. La CDH modificada o su dominio funcional de flavodehidrogenasa de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizada porque la CDH es una CDH modificada de una CDH de Myriococcum thermophilum, Corynascus thermophilus, Chaetomium atrobrunneum (Myceliophthora fergusii), Hypoxylon haematostroma, Neurospora crassa o Stachybotrys bisby, Athelia rolfsii, Gelatoporia subvermispora, Phanerochaete chrysosporium, Trametes versicolor.

5. La CDH modificada o su dominio funcional de flavodehidrogenasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho dominio de flavodehidrogenasa modificada tiene una secuencia con al menos 70%, preferentemente al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, en particular se prefiere al menos 99%, de identidad de secuencia con uno de dichos dominios de flavodehidrogenasa no modificada, y además comprende la mutación de sustitución en el aminoácido correspondiente a N721 de la SEQ ID NO: 5 o en el motivo NHW.

6. La CDH modificada o su dominio funcional de flavodehidrogenasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el aminoácido correspondiente a N721 de la SEQ ID NO: 5 o asparagina en el motivo NHW es el aminoácido N723 de la SEQ ID NO: 1, N738 de la SEQ ID NO: 2, N718 de la SEQ ID NO: 3, N722 de la SEQ ID NO: 4, N721 de la SEQ ID NO: 5, N721 de la SEQ ID NO: 6, N704 de la SEQ ID NO: 7, N707 de la SEQ ID NO: 8, N706 de la SEQ ID NO: 9, N701 de la SEQ ID NO: 10.

7. La CDH modificada o su dominio funcional de flavodehidrogenasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que se produce de forma recombinante por Pichia pastoris, se aísla por diafiltración, cromatografía de intercambio iónico y preferentemente se purifica adicionalmente por cromatografía de interacción hidrófoba.

8. La CDH modificada o su dominio funcional de flavodehidrogenasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque el valor Km de la celobiosa deshidrogenasa o su dominio funcional de flavodehidrogenasa para una reacción de oxidación de lactosa es inferior a 10 mM, preferentemente según se determina con la CDH, o estando dicho dominio inmovilizado en un electrodo.

9. La CDH modificada o su dominio funcional de flavodehidrogenasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque el valor Km de la celobiosa deshidrogenasa o su dominio funcional de flavodehidrogenasa para una reacción de oxidación de glucosa es superior a 3 M, preferentemente como se determina con la CDH, o estando dicho dominio inmovilizado en un electrodo.

10. La CDH modificada o su dominio funcional de flavodehidrogenasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque el valor Km de la celobiosa deshidrogenasa o su dominio funcional de flavodehidrogenasa para una reacción de oxidación de galactosa es superior a 3 M, preferentemente como se determina con la CDH, o estando dicho dominio inmovilizado en un electrodo.

11. Una molécula de ácido nucleico que codifica una CDH modificada o su dominio funcional de flavodehidrogenasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

12. Un procedimiento de producción de una CDH modificada o su dominio funcional de flavodehidrogenasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende expresar de forma recombinante una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 11 en una célula huésped.

13. Un electrodo que comprende una celobiosa deshidrogenasa inmovilizada o su dominio funcional de flavodehidrogenasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10;

preferentemente en el que la celobiosa deshidrogenasa se inmoviliza por adsorción, formación de complejo, con especial preferencia a través de un enlazador complejante adicional, enlace covalente o iónico, y/o en el que preferentemente la celobiosa deshidrogenasa inmovilizada se reticula, en particular por agentes bifuncionales, para aumentar la estabilidad o actividad.

14. Un procedimiento de detección de o cuantificación de lactosa en una muestra que comprende la etapa de oxidar la lactosa en dicha muestra con una CDH modificada o su dominio funcional de flavodehidrogenasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, o un electrodo de acuerdo con la reivindicación 13 y detectar o cuantificar dicha oxidación, preferentemente en el que dicha muestra comprende o se sospecha que comprende glucosa y/o galactosa, con especial preferencia una muestra que contiene leche o productos lácteos.

15. Un kit de ensayo de lactosa que comprende la celobiosa deshidrogenasa modificada o su dominio funcional de flavodehidrogenasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o un electrodo de acuerdo con la reivindicación 13 y un medio de retención de muestras y/o estándares de lactosa.