ES2768976T3 - Edición de genoma mediada por nucleasa - Google Patents

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Abstract

Un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido Cpf1 que comprende la secuencia de aminoácidos YLFQIYNKDF (residuos de aminoácidos 784-793 de la SEQ ID NO: 1).

Description

DESCRIPCIÓN
Edición de genoma mediada por nucleasa
Campo de la invención
La invención se refiere al campo de herramientas, procedimientos y técnicas de ingeniería genética para la edición de genomas o genes. Dicha edición o manipulación de secuencias de polinucleótidos, incluidas secuencias de genes estructurales o de control, tiene aplicación en muchos campos de la salud y la biotecnología, por ejemplo en tratamientos de terapia génica de seres humanos o animales, el cultivo de plantas y la cría de animales y la mejora de organismos industriales, por ejemplo mediante la alteración de enzimas y rutas metabólicas, particularmente microorganismos; también en los sectores de la biología sintética y la producción de biocombustibles a partir de algas, por ejemplo. Además, la invención se refiere también a herramientas y procedimientos de investigación para su uso en investigación científica básica que implica genética molecular.
Antecedentes de la invención
Las nucleasas específicas del sitio pueden permitir la generación de roturas bicatenarias (DSB) en posiciones seleccionadas a lo largo de una cadena de ADN. En un organismo de interés, esto permite que las DSB se realicen en posiciones predeterminadas en el genoma. La creación de dichas roturas por medio de nucleasas específicas del sitio hace que la maquinaria de reparación celular endógena se readapte para insertar, eliminar o modificar el ADN en posiciones deseadas en el genoma de interés. La escisión dirigida de ADN mediada por nucleasas específicas del sitio es, por lo tanto, una herramienta de investigación básica importante que ha facilitado la determinación funcional y la anotación de genes específicos, pero, entre otras cosas, también ha permitido la mutación, la adición, la sustitución o la modificación dirigida de genes en organismos de importancia agrícola, industrial o comercial. Como la base genética de fenotipos orgánicos tanto deseados como no deseados se revela a través de la secuenciación del ADN, la capacidad para generar alteraciones dirigidas en loci genómicos específicos es fundamental para la ingeniería genética de rasgos útiles y en el desarrollo de tratamientos clínicos para enfermedades con una base genética.
Otros enfoques de nucleasas específicas del sitio implican roturas de ácido nucleico diana monocatenario, ya sea individualmente o en combinación.
Durante el decenio pasado se han desarrollado una serie de herramientas moleculares para permitir la ingeniería genética específica en general, y para la edición especializada de genomas eucariotas en particular. Inicialmente, se desarrollaron nucleasas con dedos de zinc (ZFN), seguidas de nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN). Recientemente, se ha producido una revolución mediante el desarrollo de la nucleasa Cas9 asociada a CRISPR, como una alternativa muy eficaz, genérica y barata para la cirugía genómica especializada en una serie de células eucariotas (desde levaduras y plantas hasta peces cebra y seres humanos) (revisado por Van der Oost 2013, Science 339: 768-770 y Charpentier y Doudna, 2013, Nature 495: 50-51).
Se han descubierto y aislado muchas nucleasas específicas del sitio útiles a partir de procariotas. Al igual que los eucariotas, los organismos procariotas poseen un conjunto variable de sistemas de defensa para protegerse contra los virus. Las estrategias de defensa que protegen a su huésped microbiano contra el ADN invasor se basan principalmente en sistemas de inmunidad generales (innatos), tales como las, bien conocidas, enzimas de restricción.
Un descubrimiento reciente importante en este sector ha sido la demostración de un sistema inmunitario específico (adaptativo) en bacterias y arqueas. Este sistema inmunitario adaptativo consiste en repeticiones palindrómicas interespaciadas regularmente agrupadas (CRISPR) y genes Cas asociados a CRISPR que codifican las proteínas Cas. El sistema CRISPR-Cas utiliza pequeños ARN de CRISPR que guían las proteínas Cas efectoras a los ácidos nucleicos invasores complementarios, eventualmente neutralizando la invasión. Se distinguen dos clases de complejos efectores de Cas: complejos de múltiples subunidades (por ejemplo. Cascade de E. coli) y sistemas de una única proteína (por ejemplo Cas9 de Streptococcus pyogenes) (Van der Oost et al., 2014, Nature Rev. Microbiol.
12: 479-492).
Los análisis moleculares de CRISPR-Cas han proporcionado la base para el desarrollo de herramientas de ingeniería del genoma. Cas9 es un complejo efector CRISPR-Cas relativamente sencillo que puede expresarse funcionalmente en una amplia serie de células procariotas y eucariotas. Es importante indicar que la guía de ARN de Cas9 se puede manipular fácilmente para que se dirija específicamente a cualquier secuencia de interés. Aunque también es posible ajustar la especificidad para un determinado gen diana con el sistema TALEN, un inconveniente de este sistema es que esto requiere una laboriosa ingeniería de proteínas. En el caso de Cas9, solo se debe generar y clonar un oligonucleótido corto, lo que ahorra tiempo y dinero. Las aplicaciones del sistema Cas9 incluyen ingeniería genética general (alteración, reparación e integración de genes), control de la expresión génica (estimulación y silenciamiento) y marcado de genes (toma de imágenes). La coexpresión de Cas9 con diferentes guías permite la multiplexación, por ejemplo, generar múltiples inactivaciones génicas simultáneamente.
El sistema CRISPR-Cas permite la escisión específica de la diana del ADN genómico guiada por la nucleasa Cas9 en complejo con un ARN guía (ARNg) que se une complementariamente a una secuencia objetivo de 20 nucleótidos. Por lo tanto, la alteración de la secuencia del ARNg permite que la endonucleasa Cas9 se programe para cortar ADN bicatenario en sitios complementarios al ARN guía de 20 pares de bases. El sistema Cas9 se ha utilizado para modificar genomas en múltiples células y organismos.
En comparación con sistemas alternativos de edición de genoma (nucleasas de dedo de cinc, TALEN), la ingeniería genética por medio de Cas9 es muy eficaz, barata y rápida.
A pesar de estos desarrollos, el sistema Cas9 todavía tiene algunos inconvenientes prácticos. En primer lugar, basándose en un mecanismo intrínseco de discriminación propia/discriminación no propia, el Cas9 requiere un motivo de secuencia (motivo adyacente protoespaciador, PAM) en la región flanqueante adyacente a la secuencia diana. El requerimiento del PAM impone una limitación de diseño significativa al sistema de endonucleasa, que excluye potenciales sitios diana.
En segundo lugar, aunque las nucleasas guiadas por ARN tales como Cas9 incorporan ARN guía que se dirigen a la escisión de sitios diana específicos y, por lo tanto, muestran una reducción en la actividad significativa fuera de la diana observada en la mayor parte de las otras nucleasas disponibles, se produce aún un determinado nivel de escisión fuera de la diana (Pattanayak et al., 2013, Nat. Biotechnol. 31: 839-843), es decir, la escisión de secuencias genómicas que difieren de la secuencia diana prevista en uno o más nucleótidos. Generalmente, se requieren 15-17 nucleótidos para el emparejamiento de bases con una diana complementaria de 20 nucleótidos; se ha planteado la hipótesis de la tolerancia a los emparejamientos incorrectos para explicar los problemas fuera de la diana de los que se ha informado. La especificidad imperfecta de la unión específica del sitio modificado mediante ingeniería genética puede conducir a la inserción, modificación o eliminación no deseada de loci genómicos durante un evento de direccionamiento génico, que se ha asociado con toxicidad celular. Las consecuencias de dichos eventos de escisión fuera de la diana que dan como resultado alteraciones no deseadas de los loci genómicos distintos de la diana deseada pueden ser extremadamente graves en un contexto clínico.
La escisión específica de secuencia del sitio diana de la nucleasa prevista en ausencia de actividad de escisión fuera de la diana, o con solo una actividad mínima de fondo, es un requisito previo para la manipulación genómica de alta eficacia en aplicaciones de investigación básicas y especialmente para evitar la escisión de genes que no se deseaban escindir durante las modificaciones genómicas dirigidas asociadas con aplicaciones clínicas de las tecnologías de endonucleasas específicas del sitio, en particular debido a que las roturas bicatenarias resultantes dan como resultado modificaciones genómicas estables y heredables.
A pesar de que se prestó mucha atención a abordar estas características no deseadas del sistema Cas9, hasta la fecha siguen ampliamente sin resolverse.
La especificidad imprecisa, en particular, sigue siendo una dificultad y solo se ha abordado parcialmente expandiendo la secuencia diana que se desea reconocer mediante dímeros de Cas9 catalíticamente inactivado fusionado al dominio de nucleasa de Fokl (dCas9-Fokl) (Guilinger et al., 2014, Nat. Biotechnol. 32: 577-582) Además, se ha demostrado que las variantes de nickasa modificadas genéticamente de Cas9 (en las que uno de los dos sitios de nucleasa está alterado) facilitan la reparación dirigida por homología en genomas eucariotas con una especificidad aumentada y una actividad reducida fuera de la diana (Ran et al., 2013, Cell 154: 1380-1389. También, Mali et al., 2013, Nat. Biotechnol. 31: 833-838).
El documento WO 2015/035139 describe composiciones, procedimientos, sistemas y kits para controlar la actividad y/o mejorar la especificidad de las endonucleasas programables por ARN, tales como Cas9. Por ejemplo, los ARN guía (ARNg) están diseñados para que existan en un estado "activado" o "desactivado", lo que controla la actividad de unión y, por lo tanto, de escisión de las endonucleasas programables por ARN. También se describen ARNg de detección de ARNm que modulan la actividad de las endonucleasas programables por ARN, en función de la presencia o ausencia de un ARNm diana. Se describen algunos ARNg que modulan la actividad de una endonucleasa programable por ARN basándose en la presencia o ausencia de un ADN extendido (ADNx).
Otro enfoque para mitigar la actividad fuera de la diana se ha centrado en el desarrollo de paquetes informáticos para asistir al proceso de diseño de ARN guía mediante la realización de búsquedas exhaustivas de secuencias diana frente a secuencias de referencia genómicas, lo que permite la selección de secuencias diana con efectos de escisión mínimos fuera de la diana (Naito et al., 2015, Bioinformatics 31: 1120-1123). Sin embargo, esto simplemente permite una exploración eficaz del espacio de secuencia diana disponible para el diseño de secuencias guía en lugar de abordar directamente las limitaciones inherentes de CRISPR-Cas9 como herramienta de edición de genoma.
Por lo tanto, las nucleasas disponibles actualmente, incluidos los sistemas CRISPR-Cas9, no se encuentran en su estado actual de desarrollo en una forma necesariamente adecuada para la mayor parte de las aplicaciones clínicas o, de hecho, muchas otras aplicaciones de edición de genoma sensibles a la diana. Existe una necesidad continua de herramientas de edición de genoma con mayor especificidad y fiabilidad inherentes de las que están disponibles actualmente en la técnica.
Schunder et al. proporcionaron la primera indicación de un sistema CRISPR/Cas funcional en Francisella tularensis (Schunder et al., 2013, International Journal of Medical Microbiology 303: 51-60). Sin embargo, hasta la fecha la estructura y la funcionalidad del sistema siguen siendo inciertas.
Posteriormente, Vestergaard et al. proporcionaron una clasificación de todos los sistemas inmunitarios adaptativos CRISPR conocidos de Archaea basada principalmente en sus secuencias de proteínas Cas concatenadas, en el que Cas_Cpf1 se identificó como un único sistema de interferencia de proteínas que carece de Cas3, Cas5, Cas7 y Cas8, que recuerda a Cas9 en sistemas bacterianos tipo II a pesar de no parecer compartir ningún dominio estructural (Vestergaard et al., 2014, RNA biology 11.2 (2014): 156-167).
Sumario de la invención
Tratando de superar determinadas desventajas prácticas asociadas con los sistemas Cas9, los inventores proporcionan una nucleasa novedosa (Cpf1) no relacionada con Cas9 para su aplicación como herramienta de edición de genes. Se ha descubierto que Cpf1 tiene características mecanicistas excepcionalmente ventajosas tales como un dominio de nucleasa único y un motivo PAM aguas arriba y se puede aplicar como una herramienta mejorada para la edición especializada del genoma en general, y para reparar trastornos genéticos de células madre humanas. Además, la nucleasa Cpf1 puede funcionar como parte de un sistema de ingeniería multiplex para microorganismos.
En consecuencia, la presente invención proporciona un vector de expresión tal como se establece en las reivindicaciones 1 a 9, 11, 12, 14 o 15; un sistema vector tal como se establece en las reivindicaciones 10 a 12; y una célula huésped tal como se establece en la reivindicación 13.
En el presente documento se describe un polipéptido aislado o un fragmento del mismo, que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 o una secuencia con al menos 60% de identidad con el mismo, y que tiene una actividad de nucleasa.
El polipéptido o el fragmento puede comprender una secuencia de aminoácidos con al menos el 75%; preferentemente al menos el 85%; de forma más preferida al menos el 90%; de forma incluso más preferida al menos el 95% de SEQ ID NO: 1.
Además de la SEQ ID NO: 1 de referencia, también se describe cualquier secuencia variante que tenga el porcentaje de identidad definido con la misma. Dicho porcentaje de identidad incluye cualquiera de los siguientes: se divulga una secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos de referencia y secuencias con al menos un determinado porcentaje de identidad, por ejemplo al menos el 60%, pudiendo ser diferente opcionalmente el porcentaje de identidad. Por ejemplo: un porcentaje de identidad que se selecciona entre uno de los siguientes: al menos el 60%, al menos el 61%, al menos el 62%, al menos el 63%, al menos el 64%, al menos el 65%, al menos el 66%, al menos el 67%, al menos el 68%, al menos el 69%, al menos el 70%, al menos el 71%, al menos el 72%, al menos el 73%, al menos el 74%, al menos el 75%, al menos el 76%, al menos el 77%, al menos el 78%, al menos el 79%, al menos el 80%, al menos el 81%, al menos el 82%, al menos el 83%, al menos el 84%, al menos el 85%, al menos el 86%, al menos el 87%, al menos el 88%, al menos el 89%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99%, al menos el 99,5% o al menos el 99,8%. Dicha identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias en una ventana de comparación seleccionada, teniendo en cuenta el número de espacios que deben introducirse para un alineamiento óptimo de las dos secuencias y la longitud de cada espacio.
En cualquier aspecto de la presente invención, los residuos de aminoácidos pueden sustituirse de forma conservativa o no conservativa. Las sustituciones conservativas de aminoácidos se refieren a aquellas en las que los residuos de aminoácidos se sustituyen por otros residuos de aminoácidos con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) y, por lo tanto, no alteran las propiedades funcionales del polipéptido resultante. De forma similar, el lector experto apreciará que las secuencias de ácido nucleico pueden sustituirse de forma conservativa o no conservativa sin afectar a la función del polipéptido. Los ácidos nucleicos modificados conservativamente son aquellos sustituidos por ácidos nucleicos que codifican variantes idénticas o funcionalmente idénticas de las secuencias de aminoácidos. El lector experto apreciará que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG y UGG; típicamente los únicos codones para metionina o triptófano, respectivamente) pueden modificarse para producir una molécula funcionalmente idéntica. En consecuencia, cada variación silenciosa (es decir, un codón sinónimo) de un polinucleótido o un polipéptido, que codifica un polipéptido de la presente invención, está implícita en cada secuencia de polipéptidos descrita.
Se describe un polipéptido o un fragmento que tiene actividad de nucleasa y que comprende el motivo de secuencia de aminoácidos: FQIYN. Este corresponde a los residuos 786-790 de SEQ ID NO: 1.
También se describe un polipéptido o un fragmento que tiene actividad de nucleasa y que comprende el motivo de secuencia de aminoácidos: FQIYNK. Este corresponde a los residuos 786-791 de SEQ ID NO: 1.
Además se describe un polipéptido o un fragmento que tiene actividad de nucleasa y que comprende el motivo de secuencia de aminoácidos: FQIYNKD. Este corresponde a los residuos 786-792 de la SEQ ID NO: 1.
Además se describe un polipéptido o un fragmento que tiene actividad de nucleasa y que comprende el motivo de secuencia de aminoácidos: X1X2X3 X4X5FQIYNKDX6X7, correspondiente a los residuos 781-794 de SEQ ID NO: 1, en la que X1 es uno de entre G o K, X2 es uno de entre K, S o D, X3 es uno de entre L o I, X4 es uno de entre Y o F, X5 es uno de entre L o M, X6 es uno de entre F o Y y X7 es uno de entre S, A o V.
También se describe un polipéptido o un fragmento que tiene actividad de nucleasa y que comprende el motivo de secuencia de aminoácidos: GKLYLFQIYNKDFS. Este corresponde a los residuos 781 -794 de SEQ ID NO: 1.
El motivo de secuencia de aminoácidos puede comprender en vez de los mismos residuos seleccionados de entre 784-794, 785-794, 786-794, 787-794, 788-794 o 789-794 de SEQ ID NO: 1. El motivo puede seleccionarse de entre los residuos 783-793, 783-792, 783-791, 783-790, 783-789 o 783-788 de SEQ ID NO: 1. Además, el motivo puede seleccionarse de entre los residuos 784-793, 785-792 o 786-790 de SEQ ID NO: 1.
Aquí se describe una versión catalíticamente inactiva de Cpf1 en la que el dominio RuvC puede comprender:
(a) un residuo Glu (E) y un motivo corto Glu-Ile-Asp (GID); o
(b) un residuo Glu (E), y un motivo corto Gly-Ile-Asp (GID); o
(c) un residuo Glu (E) y un motivo corto Glu-Ile-Asp (EID); o
(d) un residuo Glu (E) y un motivo corto Ser-Ile-Asp (SID); o
(e) el motivo de secuencia de aminoácidos: X8IDRGER en la que X8 es uno de entre G o S; o
(f) el motivo de secuencia de aminoácidos: DANGAY; o
(g) el motivo de secuencia de aminoácidos: EX9LN en la que X9 es uno de entre D, N o E; o
(h) el motivo de secuencia de aminoácidos: EDLN.
Un polipéptido o un fragmento descrito en el presente documento puede definirse tanto en términos de la secuencia de referencia SEQ ID NO: 1 como de cualquier porcentaje de variante con respecto a la misma, en combinación con cualquiera de los motivos de aminoácidos mencionados anteriormente como características esenciales.
La proteína o el polipéptido descrito en el presente documento puede tener un dominio RuvC (nucleasa); preferentemente el dominio RuvC puede comprender:
(a) un motivo corto GID; o
(b) un motivo corto SID;
(c) un residuo Glu (E) y un motivo corto GID.
El dominio RuvC puede comprender un residuo Glu (E) y un motivo corto SID.
Cuando el dominio RuvC comprende un residuo Glu (E) y un motivo corto GID o SID, el residuo D (aspartato) del motivo puede ser un residuo catalítico.
El dominio RuvC puede comprender el motivo de secuencia de aminoácidos X8IDRGER en el que X8 es uno de entre G o S. Por ejemplo, la proteína o el polipéptido puede tener un dominio RuvC (nucleasa), en el que el dominio RuvC comprende el motivo de secuencia de aminoácidos SIDRGER.
Cuando el dominio RuvC comprende un motivo de secuencia de aminoácidos GIDRGER o SIDRGER, el residuo D (aspartato) del motivo puede ser un residuo catalítico.
La proteína o el polipéptido puede tener un dominio RuvC (nucleasa), en el que el dominio RuvC puede comprender el motivo de secuencia de aminoácidos DANGAY.
Cuando el dominio RuvC comprende un motivo de secuencia de aminoácidos DANGAY, el residuo D (aspartato) del motivo puede ser un residuo catalítico.
La proteína o el polipéptido puede tener un dominio RuvC (nucleasa), en el que el dominio RuvC puede comprender el motivo de secuencia de aminoácidos: EX9LN en el que X9 es uno de entre D, N o E. Por ejemplo, la proteína o el polipéptido puede tener un dominio RuvC (nucleasa), en el que el dominio RuvC comprende el motivo de secuencia de aminoácidos: EDLN. Cuando el dominio RuvC comprende un motivo de secuencia de aminoácidos EDLN, ENLN o EELN, el residuo E (glutamato) del motivo puede ser un residuo catalítico.
El polipéptido o el fragmento descrito en el presente documento puede tener un dominio RuvC (nucleasa) que comprende un residuo Glu (E) y los motivos de secuencia de aminoácidos SID y DANGAY.
Opcionalmente, el polipéptido o el fragmento puede tener un dominio RuvC (nucleasa) que comprende un residuo Glu (E) y los motivos de secuencia de aminoácidos SID y EDLN.
Opcionalmente, el polipéptido o el fragmento puede tener un dominio RuvC (nucleasa) que comprende un residuo Glu (E), y los motivos de secuencia de aminoácidos SID, DANGAY y EDLN.
Opcionalmente, el dominio RuvC (nucleasa) puede comprender el motivo de secuencia de aminoácidos: X8IDRGER en el que X8 es uno de entre G o S, y el motivo de secuencia de aminoácidos DANGAY.
Opcionalmente, el dominio RuvC (nucleasa) puede comprender el motivo de secuencia de aminoácidos: X8IDRGER en el que X8 es uno de entre G o S, y el motivo de la secuencia de aminoácidos: EX9LN en el que X9 es uno de entre D, N o E.
Opcionalmente, el dominio RuvC (nucleasa) puede comprender el motivo de secuencia de aminoácidos: X8IDRGER en el que X8 es uno de entre G o S, y el motivo de la secuencia de aminoácidos: EDLN.
Opcionalmente, el dominio RuvC (nucleasa) puede comprender el motivo de secuencia de aminoácidos: X8IDRGER en el que X8 es uno de entre G o S, y el motivo de secuencia de aminoácidos: DANGAY y el motivo de secuencia de aminoácidos: EX9LN en el que X9 es uno de entre D, N o E.
Opcionalmente, el dominio RuvC (nucleasa) puede comprender el motivo de secuencia de aminoácidos: X8IDRGER en el que X8 es uno de entre G o S, y los motivos de la secuencia de aminoácidos DANGAY y EDLN.
Preferentemente, el dominio RuvC (nucleasa) comprende los motivos de secuencia de aminoácidos: SIDRGER, DANGAY y EDLN.
En otros aspectos, el polipéptido o el fragmento puede tener un motivo rico en arginina.
El motivo rico en arginina puede comprender el motivo de secuencia de aminoácidos: X10YX11X12X13LX14X15X16EX17X18X19X20X21ARX22X23, en el que X10es uno de entre D o N, X11 es uno de entre R, Q o H, X12 es uno de entre K, E, S o D, X13 es uno de entre A, K o L, X14 es uno de entre D, N o A, X15 es uno de entre V, N, Q, K o A, X16 es uno de entre R, K o I, X17 es uno de entre Y, K o I, X18 es uno de entre D o E, X19 es uno de entre N, R o M, X20 es uno de entre K, V, F o D, X21 es uno de entre E, A, D o S, X22 es uno de entre R, Q o K y X23 es uno de entre N, A, S o D.
El motivo rico en arginina puede comprender el motivo de secuencia de aminoácidos: DYRKALDVREYDNKEARRN, DYQKKLDNREKERVAARQA, DYREKLNQREIEMKDARQS, DYHSLLDKKEKERFEARQN o NYHDKLAAIEKDRDSARKD.
Un polipéptido o un fragmento descrito en el presente documento puede tener un dominio RuvC (nucleasa) que comprende un residuo Glu (E), y los motivos de la secuencia de aminoácidos Ser-Ile-Asp (SID), DANGAY y el motivo de la secuencia de aminoácidos EDLN. Preferentemente, el dominio RuvC (nucleasa) comprenderá el motivo de secuencia de aminoácidos: X8IDRGER en el que X8 es uno de entre G o S, y los motivos de la secuencia de aminoácidos DANGAY y EDLN. Más preferentemente, el dominio RuvC (nucleasa) comprenderá los motivos de secuencia de aminoácidos: SIDRGER, DANGAY y EDLN.
Un polipéptido o un fragmento descrito en el presente documento preferentemente no comprende un dominio HNH (nucleasa). Adicionalmente o alternativamente, un polipéptido o un fragmento tal como se describe en el presente documento no comprende un lóbulo de reconocimiento que está típicamente presente en Cas9.
Determinados polipéptidos o fragmentos descritos en el presente documento pueden tener actividad de nucleasa que viene proporcionada por un único sitio en el polipéptido.
Otros polipéptidos o fragmentos descritos en el presente documento pueden comprender además un dominio de dedo de zinc, aunque el sitio de unión a metal (típicamente 4 aminoácidos, Cys y/o His) no está completo en todas las variantes de Cpf1.
Los polipéptidos o los fragmentos descritos en el presente documento pueden tener una actividad de nucleasa que es una escisión monocatenaria, por ejemplo actividad de nickasa.
Preferentemente, se pueden utilizar dos subunidades de Cpf1 en una disposición dimérica en la que los dominios de nucleasa de cada una de las dos subunidades escinden cadenas de ADN individuales. Preferentemente, dicho dímero puede ser un homodímero en el que los dominios similares a RuvC de cada una de las dos subunidades escinden cadenas de ADN individuales. Alternativamente, los polipéptidos Cpf1 pueden modificarse genéticamente para que contengan más de un dominio de nucleasa, nativo o de otro tipo, que permita la escisión de ambas cadenas de ADN.
El polipéptido o los fragmentos de la invención tienen preferentemente afinidad de unión por una molécula de ARN guía.
En otros aspectos, un polipéptido o un fragmento descrito en el presente documento puede tener un ARN guía que comprende una secuencia sustancialmente complementaria a una secuencia comprendida en una cadena de ácido nucleico diana.
Un polipéptido o fragmento descrito en el presente documento tiene preferentemente afinidad de unión por un motivo de secuencia de polinucleótidos presente en una cadena de ácido nucleico diana. Este motivo de secuencia generalmente se conoce como secuencia de motivo adyacente protoespaciador (PAM). Preferentemente, el motivo de la secuencia de nucleótidos es de al menos 3 residuos contiguos de ácido nucleico.
El PAM está ubicado en la diana (adyacente al protoespaciador). Típicamente, el dominio SEED del ARN guía (la región que es la responsable más probable del emparejamiento de bases inicial de la guía/diana) es complementario a la secuencia de ácido nucleico diana. Preferentemente, la parte SEED de la guía no tolera los emparejamientos incorrectos.
Para mejorar aún más los polipéptidos o los fragmentos descritos en el presente documento, se pueden añadir aminoácidos adicionales, preferentemente por medio de una fusión al extremo N-terminal o C-terminal. La secuencia de aminoácidos adicional puede tener actividad de modificación, visualización, activación de la transcripción o represión de la transcripción de ácidos nucleicos o cromatina y preferentemente se fusiona traduccionalmente a través de la expresión en sistemas de expresión de proteínas naturales o artificiales, o se une covalentemente mediante una etapa de síntesis química a la, al menos una, subunidad; preferentemente el, al menos un, resto funcional está fusionado o unido a al menos la región del extremo N-terminal y/o la región del extremo C-terminal. La secuencia de aminoácidos adicional que tiene actividad de modificación, activación, represión o visualización de ácidos nucleicos o cromatina puede ser una proteína; opcionalmente seleccionada de entre una helicasa, una nucleasa, una nucleasa-helicasa, una ADN metiltransferasa (por ejemplo, Dam) o ADN desmetilasa, una histona metiltransferasa, una histona desmetilasa, una acetilasa, una desacetilasa, una fosfatasa, una quinasa, un (co-)activador de la transcripción, una subunidad de ARN polimerasa, un represor de la transcripción, una proteína de unión al ADN, una proteína de estructuración de ADN, una proteína marcadora, una proteína reportera, una proteína fluorescente, una proteína de unión a ligando (por ejemplo, mCherry o una proteína de unión a metales pesados), un péptido señal (por ejemplo, secuencia de señal TAT), una secuencia de localización subcelular (por ejemplo, secuencia de localización nuclear) o un epítope de anticuerpo.
Cuando la proteína es una nucleasa, puede ser una seleccionada de entre una endonucleasa de restricción de tipo II tal como Fokl, o una porción mutante o activa de la misma. Preferentemente, un complejo de proteínas de la invención puede fusionarse al dominio N-terminal de Fokl y otro complejo de proteínas de la invención puede fusionarse al dominio C-terminal de Fokl. Estos dos complejos de proteínas pueden utilizarse juntos (en una configuración dimérica) para lograr un corte bicatenario específico del locus ventajoso en un ácido nucleico, por lo que la ubicación del corte en el material genético depende del diseño y la elección del usuario, por ejemplo de forma guiada por el componente de ARN (definido y descrito más adelante) y se debe a la presencia de una secuencia denominada "motivo adyacente protoespaciador" (PAM) en la cadena de ácido nucleico diana (también descrita con más detalle más adelante).
Una proteína o un polipéptido descrito en el presente documento puede tener una secuencia de aminoácidos adicional que es una endonucleasa de restricción modificada, por ejemplo Fokl. La modificación se encuentra preferentemente en el dominio catalítico.
El Fokl modificado puede ser KKR Sharkey o ELD Sharkey, que está fusionado con la proteína Cpf1. En una aplicación preferida de estos complejos, dos de estos complejos (KKR Sharkey y ELD Sharkey) pueden estar juntos en combinación. Un par heterodímero de complejos de proteínas que emplean Fokl modificado de forma diferente tiene una ventaja particular en el corte bicatenario dirigido de ácido nucleico. Si se utilizan homodímeros, entonces es posible que se produzcan más escisiones en sitios no diana debido a la actividad no específica. Un enfoque heterodímero aumenta ventajosamente la fidelidad de la escisión en una muestra de material.
Ventajosamente, las modificaciones anteriores pueden permitir a un usuario seleccionar de forma predeterminada un locus genético preciso que se desea escindir, marcar o alterar de otra forma de alguna manera, por ejemplo por metilación, utilizando cualquiera de los ácidos nucleicos o cromatina modificando, visualizando, activando la transcripción o reprimiendo la transcripción de entidades definidas en el presente documento. La otra parte componente del sistema es una molécula de ARN que actúa como guía para dirigir los complejos de la invención al locus correcto en el ADN o ARN que se pretende modificar, cortar o marcar.
Un polipéptido o un fragmento descrito en el presente documento está preferentemente unido a un ARN guía y a un ácido nucleico diana. De esta forma, se forma un complejo que proporciona actividad de nucleasa de cadena de ADN dirigida, en el que se escinde un locus diana deseado.
Se describe un polinucleótido que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido o un fragmento tal como se ha definido en el presente documento anteriormente.
También se describe un vector de expresión que comprende un polinucleótido tal como se ha mencionado anteriormente.
Además se describe un vector de expresión tal como se ha definido anteriormente, que comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN guía que tiene una complementariedad sustancial con una secuencia deseada presente en la cadena de ácido nucleico diana. El ARN guía en el estado nativo es un único ARN que consiste en un ARNcr.
Un vector de expresión tal como se describe es preferentemente un vector vírico, por ejemplo adenovirus o virus adenoasociado (AAV).
También se describe una célula huésped transformada para expresar un polipéptido o un fragmento tal como se ha descrito anteriormente en el presente documento.
Típicamente, el ADN del vector de expresión puede suministrarse a la célula huésped por transformación, electroporación o virus (AAV). Además, el ARN puede suministrarse a una célula huésped mediante inyección o electroporación. Las proteínas pueden suministrarse a las células mediante electroporación, etiquetas de péptidos (VIH). Una célula huésped tal como se ha descrito anteriormente en el presente documento puede transformarse adicionalmente para que contenga un ARN guía que comprende una secuencia sustancialmente complementaria a una secuencia comprendida en una cadena de ácido nucleico diana presente en la célula huésped.
En el presente documento se describe cualquier célula huésped transformada con un vector de expresión tal como se ha descrito anteriormente en el presente documento.
También se describe un procedimiento para escindir una cadena de ácido nucleico diana en un locus específico, que comprende exponer el ácido nucleico diana a un polipéptido o un fragmento tal como se define en el presente documento, y con una molécula de ARN guía que comprende una secuencia sustancialmente complementaria a una secuencia comprendida en la cadena de ácido nucleico diana.
Además se describe un procedimiento para escindir una cadena de ácido nucleico diana en un locus específico en el genoma de una célula de un organismo, que comprende transformar la célula con un vector de expresión tal como se describe en el presente documento, y transformar la célula con un vector que expresa un ARN guía que comprende una secuencia sustancialmente complementaria a una secuencia comprendida en una cadena de ácido nucleico diana.
También se describe un procedimiento para escindir una cadena de ácido nucleico diana en un locus específico en el genoma de una célula de un organismo, que comprende transformar la célula con un vector de expresión tal como se describe en el presente documento.
Además, se describe un procedimiento de edición de genes de unión de extremos no homólogos que comprende (a) transformar la célula con un vector de expresión tal como se describe en el presente documento y transformar la célula con un vector que expresa un ARN guía que comprende una secuencia sustancialmente complementaria a una secuencia comprendida en un cadena de ácido nucleico diana; o (b) transformar la célula con un vector de expresión tal como se describe en el presente documento. Los polipéptidos pueden modificarse o utilizarse para causar roturas bicatenarias.
También se describe un procedimiento de edición de genes de unión a extremos homólogos que comprende (a) transformar la célula con un vector de expresión tal como se describe en el presente documento, y transformar la célula con un vector que expresa un ARN guía que comprende una secuencia sustancialmente complementaria a una secuencia comprendida en una cadena de ácido nucleico diana; o (b) transformar la célula con un vector de expresión tal como se describe en el presente documento; para crear una rotura bicatenaria en un locus deseado en el material genético, y exponer el material genético a una secuencia de polinucleótidos que tiene regiones terminales complementarias a las regiones finales rotas del material genético.
Descripción detallada
La proteína de secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 es una proteína grande (aproximadamente 1300 aminoácidos) que contiene un dominio de nucleasa similar a RuvC homólogo a los respectivos dominios de Cas9 y el elemento transponible ORF-B, junto con una región rica en arginina similar a aquella en Cas9 y dedo de cinc (ausente en Cas9 pero compartido con ORF-B), pero carece del dominio de nucleasa HNH que está presente en todas las proteínas Cas9.
La invención se describirá ahora en detalle con referencia a los ejemplos y a los dibujos en los que:
La figura 1 muestra la estructura del dominio de la nucleasa novedosa CRISPR-Cas, Cpf1. Se muestran tres dominios de nucleasa RuvC, un dedo de cinc y un dominio rico en arginina que permite la interacción con guía de ARN y diana de ADN.
La figura 2 muestra los resultados de un análisis in silico del motivo adyacente protoespaciador conservado (PAM). El panel A muestra un Weblogo basado en flancos de 5' de protoespaciadores representados en la tabla 1. El panel B muestra un Weblogo basado en flancos de 3' de protoespaciadores representados en la tabla 1.
La figura 3 muestra los resultados de un alineamiento múltiple de la familia de proteínas Cpf1. Cada secuencia está marcada con el número identificador de GenBank (GI) y el nombre sistemático de un organismo. La estructura secundaria pronosticada (SS) se muestra sombreada. Los residuos del sitio activo de los dominios similares a RuvC se muestran en negrita y con doble subrayado. La hélice de puente potencial se muestra sombreada y con un subrayado simple. La secuencia de aminoácidos FQIYN también se indica en negrita, con sombreado y subrayado discontinuo.
Ejemplo 1 - Nucleasas novedosas para la edición de genes
Ejemplos específicos son (1) Cpf1 asociado a CRISPR de la bacteria marina Francisella novicida (Fn-Cpf1), y (2) Cpf1 asociado a CRISPR del arqueón Methanomethylophylus alvus cepa Mx1201 (Mal-Cpf1) que reside en el intestino humano.
Sin que los inventores deseen vincularse a ninguna teoría particular, Cpf1 reconoce el ARNcr en una forma específica de secuencia, después de lo cual se produce la escisión del segmento de ARN bicatenario y, finalmente, la formación de un complejo efector que consiste en Cpf1 y una única guía de ARNcr. Cpf1 puede funcionar como un dímero, escindiendo los dominios similares a RuvC de cada una de las dos subunidades cadenas de ADN individuales. Alternativamente, Cpf1 puede contener más de un dominio de nucleasa que permite la escisión de ambas cadenas de ADN. Alternativamente, uno o más dominios RuvC de Cpf1 pueden mostrar una flexibilidad inusual que permite la escisión de ambas cadenas.
Los ejemplos siguientes se realizaron en paralelo para las variantes de proteínas bacterianas Fno-Cpf1 y de arqueas Mal-Cpf1:
La clonación se lleva a cabo en la totalidad del locus CRISPR, incluido el operón cas (cpf1-cas4-cas1-cas2), la región líder, la matriz CRISPR y las regiones flanqueantes (aproximadamente 10 kb) en un vector de copia baja (por ejemplo, pACYC184) en una cepa de E. coli K12; no se conocen detalles sobre la maduración de la guía, que puede ser similar a la de Cas9 (traARNcr/RNasaIII), o puede ser similar a la de Cascade (ribonucleasa similar a Cas6, aunque esa no es parte de los operones cpf1), o puede ser única. Otros materiales y procedimientos detallados se proporcionan en Sapranauskas et al., 2011, Nucleic Acids Res. 39: 9275-9282.
Se utilizaron procedimientos estándar para optimizar posibilidades de producción funcional de proteínas de las proteínas Cpf1 seleccionadas en E. coli: (i) realizando un diseño de armonización de codones para ajustar secuencias de nucleótidos cpft (véase Angov et al., 2008, PLoS One 3, e2189); (ii) incluyendo la etiqueta strepll N-terminal o C-terminal, que permitirá una purificación por afinidad; (iii) clonando un gen sintético en el vector de expresión T7 (por ejemplo pET24d) y transformando el plásmido en cepa de no producción de E. coli (por ejemplo JM109, que carece del gen de la ARN polimerasa T7), (iv) transfiriendo el plásmido por medio de la segunda transformación a la cepa de producción de E. coli (por ejemplo, BL21 (DE3), que contiene el gen de la ARN polimerasa T7 bajo el control del promotor ramnosa, que permite un ajuste preciso de la expresión, (v) variando condiciones de expresión (medio, concentración de inductor, tiempo de inducción), (vi) utilizando condiciones óptimas para el cultivo a escala de litro, después de lo cual las células se recolectan y se alteran mecánicamente para obtener extracto desprovisto de células (pequeños volúmenes por sonicación; grandes volúmenes por French Press), (vii) separando membranas y fracciones solubles, y realizando una purificación por afinidad utilizando resina de estreptactina, (viii) analizando fracciones relevantes por SDS-PAGE, y almacenando la proteína pura para análisis posteriores.
Además de lo anterior, adicionalmente, el gen de ARNcr predicho se secuencia, o se crea un gen de ARN de guía única (ARNsg), por ejemplo mediante la adición de 4 bucles sintéticos de nucleótidos (Jinek et al., 2012, Science 337: 816-821); genes de ARN que residen en el mismo plásmido que el gen cpfl, o en un plásmido separado.
Adicionalmente, se produce un mutante Cpf1 catalíticamente inactivo (el sitio activo RuvC contiene glutamato conservado (E), así como un motivo GID).
Adicionalmente, se produce un mutante Cpf1 catalíticamente inactivo (el sitio activo RuvC contiene glutamato conservado (E), así como motivo SID).
Además, las fusiones N-terminales o C-terminales están hechas del mutante Cpf1 con el dominio nucleasa Fokl con enlazadores de conexión diferentes (tal como se describe para Cas9; véase Guilinger et al., 2014, Nat. Biotecnología 32: 577-82).
Ejemplo 2 - Caracterización bioquímica de nucleasas Cpfl
Estos experimentos caracterizan la vigilancia de la guía y la escisión de la diana. El sistema CRISPR es un sistema inmunitario adaptativo en bacterias y arqueas. Las matrices CRISPR consisten en repeticiones idénticas (por ejemplo 30 pb) y espaciadores variables (por ejemplo 35 pb). La naturaleza adaptativa del sistema CRISPR se basa en la adquisición regular de nuevos separadores, a menudo correspondientes a fragmentos (protoespaciadores) derivados de virus. La adquisición generalmente depende de la selección de un protoespaciador sobre la base de la presencia de un motivo adyacente de protoespaciador (PAM). La presencia de este motivo es crucial para la eventual interferencia del complejo efector asociado a CRISPR (por ejemplo Cas9) con su guía de ARNcr. El motivo PAM permite la discriminación propia frente a la discriminación no propia: las secuencias diana potenciales (es decir, complementarias a la secuencia guía de ARNcr) residen tanto en el genoma del huésped (la matriz CRISPR propia) como en el genoma del invasor (el protoespaciador no propio); la presencia del protoespaciador en el ADN invasor activa el complejo efector para unirlo de forma escalonada; cuando se produce un emparejamiento perfecto de bases entre la secuencia del protoespaciador inmediatamente adyacente al PAM (la denominada secuencia semilla), las bases se emparejan como una cremallera, que eventualmente conduce a un estado de Cas9 para catalizar la escisión de las cadenas de ADN diana (véase Jinek et al., 2012, Science 337: 816-821; también Gasiunas et al., 2012, PNAS 109: E2579-E2586).
Análisis in silico del PAM asociado a Cpf1 por análisis BLAST de los espaciadores CRISPR de los loci de cpfl. El análisis BLAST de algunos espaciadores muestra varias secuencias homólogas (90-100% de identidad), (tabla 1). Los éxitos más prometedores se refieren a secuencias idénticas de genes víricos en general, y genes de profagos en particular. Los profagos se derivan a partir de virus lisogénicos, cuyos genomas se han integrado en el genoma de las bacterias. Como es el caso con los virus eucariotas, la gama de huéspedes de los virus procariotas es a menudo bastante limitada; por lo tanto, cuando se encuentra el profago coincidente en una bacteria que está estrechamente relacionada con la bacteria que tiene la secuencia espaciadora correspondiente en su matriz CRISPR, esto proporciona cierta confianza de que es un verdadero éxito. En otras palabras, puede ser que el profago se asemeje a un virus que ha intentado infectar la bacteria que contiene CRISPR, pero la invasión ha dado como resultado la adquisición de espaciadores y la inmunidad vírica de esta última bacteria.
Tabla 1. Resultados de BLAST con espaciadores CRISPR asociados a cpf1 FnU112 como secuencias de consulta. Las secuencias de nucleótidos de ambos espaciadores (arriba) y protoespaciadores están sombreadas; los flancos 5' y 3' de los protoespaciadores no están sombreados; Herramienta: Diana CRISPR (bioanalysis.otago.ac.nz/CRISPRTarget/). Consulta: toda la matriz CRISPR de subespecies de Francisella novicida. Base de datos diana: Genbank-NT. Apertura de hueco -10, Extensión -2; Emparejamiento correcto de nucleótidos 1, Emparejamiento incorrecto de nucleótidos -1; Valor de E 1; Tamaño de palabra 7; Puntuación de corte 20; Protoespaciador flanqueante del extremo 3' 8 pb; Protoespaciador flanqueante del extremo 5' 8 pb.
Figure imgf000011_0001
El análisis de las secuencias que flanquean los protoespaciadores en los genes de profago dio como resultado un motivo conservado rico en T; curiosamente, este motivo no reside aguas abajo del protoespaciador (como en el sistema Cas9), sino aguas arriba. Aunque no desean vincularse a ninguna teoría particular, los inventores encuentran que Cpf1 de la invención requiere un motivo similar a PAM (3-4 nucleótidos) para unirse a una molécula de ADN diana que es complementaria a la guía, tiene una secuencia semilla (8-10 nucleótidos) en la que no se permiten emparejamientos incorrectos, y tiene un único sitio de nucleasa que permite mellar la cadena de ADN diana emparejada con la base.
Los motivos PAM de Cpf1 y las variantes de la invención también se caracterizaron utilizando el enfoque de Jiang et al., 2013, Nat. Biotecnología 31: 233-239). Se utilizaron dos derivados de E. coli BL21 (DE3), inicialmente transformados con un plásmido diana o con un plásmido no diana; dos plásmidos diana variantes utilizados tienen una parte similar (marcador GFP, marcador KmR, origen de replicación) y una parte variable con secuencia diana (protoespaciador) con un PAM degenerado asociado (5-8 nucleótidos variables) aguas arriba o aguas abajo del protoespaciador); a continuación, esta cepa se transformó con un plásmido de expresión Cpf1 (incluye diseño CRISPR con ARN de guía única (ARNsg, marcador CmR); el cribado de transformantes se realizó en placas con cloranfenicol (Cm) (no kanamicina (Km)), y cribado de colonias no fluorescentes, que indica la pérdida de plásmido diana. A medida que se pierdan los plásmidos con los PAM correctos, se realizó DNA Deep Seq de productos de PCR apropiados de la totalidad del conjunto de plásmido diana, antes y después de la transformación. Las diferencias revelan el PAM (Bikard et al., 2013, Nucleic Acids Res. 41: 7429-7437).
Las firmas PAM se confirmaron mediante caracterización in vitro de la actividad de escisión de BsCas9/ARNsg; Los ensayos revelan condiciones óptimas (temperatura, tampón/pH, sal, metales).
La presencia de una secuencia semilla en el PAM se estableció según procedimientos descritos por Jinek et al., 2012, Science 337: 816-821.
Ejemplo 3 - Ingeniería genética bacteriana
Realización de ingeniería genética de alto rendimiento del genoma bacteriano con variantes de nucleasa. Sin desear vincularse a ninguna teoría particular, los inventores esperan que los complejos Cpf1/guía de la invención permitan un direccionamiento específico del ADN genómico. El direccionamiento multiplex se puede establecer mediante el uso de un diseño CRISPR junto con un ARNcr coincidente.
Los experimentos proporcionan la aplicación de Cpf1 y variantes de la invención. Cas9 se analiza en paralelo como referencia.
Se realiza la activación/desactivación génica (inserción/alteración de cualquier secuencia). La cepa huésped E. coli K12 (LacZ , GFP-) se modificó genéticamente de la forma siguiente: el gen que codifica una variante de la proteína verde fluorescente (GFPuv) se inserta en el gen lacZ, dando como resultado un fenotipo claro (LacZ-, GFP+). El gen cpfl se introdujo en un plásmido (o derivados de esos plásmidos), junto con un fragmento que permite la recombinación homóloga de la secuencia diana. Se seleccionó una secuencia diana (protoespaciadora), con una secuencia PAM apropiada ubicada de forma adyacente; una guía correspondiente diseñada, que consiste en el ARNcr (con espaciador complementario al protoespaciador diana) y el gen ARNcr (adaptado del procedimiento descrito para Cas9 por Jiang et al. (2013a) RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nat. Biotechnol. 31: 233-239).
El silenciamiento de la expresión génica (utilizando Cas9 inactivado catalíticamente, fue tal como se describe: dCas9 derivado de Spy-Cas9; (Bikard et al., 2013, Nucleic Acids Res. 41: 7429-7437; Qi et al., 2013, Cell 152: 1173-1183); mediante la unión al promotor (sitio de unión a ARN polimerasa) del gen diana, o de genes diana utilizando un enfoque multiplex (utilizando un diseño CRISPR).
Activación de expresión génica; como anteriormente (silenciamiento); sitio de unión aguas arriba de la unión de ARN polimerasa, con Cas9 fusionado al dominio de activación (tal como se ha descrito para Spy-Cas9) (Bikard et al., 2013, Nucleic Acids Res. 41: 7429-7437).
La fusión de Cpf1 inactivado y el dominio de nucleasa Fokl (descrito en el ejemplo 1) se compararon con un Cpf1 activo en diferentes configuraciones experimentales. Esto requirió dos interacciones simultáneas de guías y dianas, lo que da como resultado una mejora importante de la escisión en el sitio deseado.
Ejemplo 4 - Ingeniería genética de células madre humanas
La edición dirigida de mutaciones genéticas que causan enfermedades sería un tratamiento elegante y eficaz para enfermedades genéticas. Los sistemas de edición de genes recientemente descubiertos, tales como Cas9, permiten el direccionamiento específico de mutaciones que causan enfermedades en el genoma, y pueden utilizarse para reparar funcionalmente o deshabilitar permanentemente genes mutados. La eficacia de los sistemas de edición de genes se ha demostrado en un entorno de laboratorio, y ahora se utilizan de forma rutinaria en la edición del genoma de una amplia diversidad de tipos de células de muchas especies diferentes, incluidos los seres humanos. Sin embargo, a pesar del éxito de estos sistemas en el entorno de investigación, la aplicación clínica de los sistemas de edición de genes se ve obstaculizada por la falta de un sistema de suministro adecuado para introducir tecnologías de edición de genes en las células de los pacientes de una forma segura, transitoria y eficaz. Varios laboratorios están trabajando en el desarrollo de vectores víricos recombinantes que se puedan utilizar para suministrar sistemas de edición de genes a las células del paciente, pero la expresión prolongada de CRISPR/Cas9, por ejemplo, a partir de dichos vectores aumentará la probabilidad de efectos fuera de la diana y, por lo tanto, no es ideal. El suministro intracelular de proteínas de edición de genes recombinantes y ARN de CRISPR sintético sería un procedimiento eficaz, no integrador y transitorio para la aplicación de la tecnología de edición de genes en células de pacientes.
Recientemente se ha desarrollado un procedimiento novedoso que permite la transducción de proteínas nativas en prácticamente cualquier tipo de célula (D'Astolfo et al., 2015, Cell, 161: 674-690). Esta tecnología, denominada iTOP, por Transducción por Osmocitosis y Propanobetaína inducida (induced Transduction by Osmocytosis and Propanebetaine), se basa en una combinación de compuestos de molécula pequeña, que desencadenan la absorción y la liberación intracelular de proteínas nativas. iTOP es altamente eficaz, logra de forma rutinaria eficacias de transducción > 90% de las células y funciona en una amplia diversidad de tipos de células primarias. Se ha demostrado que la transducción mediada por iTOP de la proteína Cas9 recombinante y ARNsg transcrito in vitro permite una edición de genes altamente eficaz en tipos de células difíciles de transfectar, incluidas las células madre humanas. Tras la transducción iTOP-CRISPR/Cas9, se ha informado de > 70% de direccionamiento de genes bialélicos en células ES humanas sin la necesidad de selección con fármacos de células transducidas.
Las ventajas clave de iTOP sobre las tecnologías existentes son: (i) la capacidad de transducir células primarias (madre) con proteína nativa con una eficacia muy alta, (ii) la naturaleza transitoria no integradora de la edición de genes mediada por proteínas, que asegura la seguridad y minimiza efectos fuera de la diana, y (iii) el control estricto de la dosis y el momento de la proteína suministrada. Hemos demostrado que iTOP-CRISPR/Cas9 es una herramienta eficaz para modificar una gran diversidad de tipos de células (del paciente) primarias. Sin embargo, debido a problemas de solubilidad de proteínas y de tamaño, la producción de Cas9 recombinante está obstaculizando la adopción (clínica) a gran escala de este sistema. Cpf1 podría resolver estos problemas y allanar el camino para el desarrollo de nuevos tratamientos para tratar enfermedades genéticas.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido Cpf1 que comprende la secuencia de aminoácidos YLFQIYNKDF (residuos de aminoácidos 784-793 de la SEQ ID NO: 1).
2. El vector de expresión de la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido Cpf1 tiene al menos el 60% de identidad con la SEQ ID NO: 1 y tiene actividad de nucleasa.
3. El vector de expresión de la reivindicación 1, en el que el polipéptido Cpf1 comprende la secuencia de aminoácidos GKLYLFQIYNKDFS (residuos de aminoácidos 781-794 de la SEQ ID NO: 1).
4. El vector de expresión de la reivindicación 1, en el que el polipéptido Cpf1 es una nickasa.
5. El vector de expresión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el polipéptido Cpf1 está fusionado en su extremo N-terminal o C-terminal a una secuencia de aminoácidos adicional.
6. El vector de expresión de la reivindicación 5, en el que la secuencia de aminoácidos adicional es una proteína seleccionada de entre una helicasa, una nucleasa, una nucleasa-helicasa, una ADN metiltransferasa, una ADN desmetilasa, una histona metiltransferasa, una histona desmetilasa, una acetilasa, una desacetilasa, una fosfatasa, una quinasa, un (co)activador de la transcripción, una subunidad de ARN polimerasa, un represor de la transcripción, una proteína de unión a ADN, una proteína de estructuración de ADN, una proteína marcadora, una proteína reportera, una proteína fluorescente, una proteína de unión a ligando, un péptido señal, una secuencia de localización subcelular o un epítopo de anticuerpo.
7. El vector de expresión de la reivindicación 6, en el que la secuencia de aminoácidos adicional es una secuencia de localización nuclear.
8. El vector de expresión de la reivindicación 6, en el que la secuencia de aminoácidos adicional es un dominio Fokl.
9. El vector de expresión de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que además comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN guía que tiene una complementariedad sustancial con una secuencia deseada presente en una cadena de ácido nucleico diana.
10. Un sistema vector que comprende (a) un vector de expresión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y (b) un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN guía que tiene una complementariedad sustancial con una secuencia deseada presente en una cadena de ácido nucleico diana.
11. El vector o el sistema de expresión de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dichos vectores son vectores víricos.
12. El vector o el sistema de expresión de la reivindicación 11, en el que dichos vectores víricos son vectores víricos adenoasociados.
13. Una célula huésped que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido Cpf1 que comprende la secuencia de aminoácidos YLFQIYNKDF (residuos de aminoácidos 784-793 de la SEQ ID NO: 1), no siendo la célula huésped parte de un cuerpo humano en ninguna etapa de formación o de desarrollo.
14. El vector de expresión de la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido Cpf1 tiene al menos el 85% de identidad con la SEQ ID NO: 1.
15. El vector de expresión de la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido Cpf1 tiene al menos el 95% de identidad con la SEQ ID NO: 1.
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AU2012333134B2 (en) 2011-07-22 2017-05-25 John Paul Guilinger Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US20150044192A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9322037B2 (en) 2013-09-06 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US9340800B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College Extended DNA-sensing GRNAS
US9834791B2 (en) 2013-11-07 2017-12-05 Editas Medicine, Inc. CRISPR-related methods and compositions with governing gRNAS
US20150166984A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting alpha-antitrypsin point mutations
KR20220142547A (ko) 2014-02-11 2022-10-21 더 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 콜로라도, 어 바디 코퍼레이트 Crispr 이용의 다중화된 게놈 조작
AU2015298571B2 (en) 2014-07-30 2020-09-03 President And Fellows Of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
WO2016073990A2 (en) 2014-11-07 2016-05-12 Editas Medicine, Inc. Methods for improving crispr/cas-mediated genome-editing
GB201506509D0 (en) 2015-04-16 2015-06-03 Univ Wageningen Nuclease-mediated genome editing
WO2016182959A1 (en) 2015-05-11 2016-11-17 Editas Medicine, Inc. Optimized crispr/cas9 systems and methods for gene editing in stem cells
WO2016201047A1 (en) 2015-06-09 2016-12-15 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for improving transplantation
US9790490B2 (en) 2015-06-18 2017-10-17 The Broad Institute Inc. CRISPR enzymes and systems
US10648020B2 (en) 2015-06-18 2020-05-12 The Broad Institute, Inc. CRISPR enzymes and systems
WO2017004261A1 (en) 2015-06-29 2017-01-05 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modified crispr rna and modified single crispr rna and uses thereof
WO2017053879A1 (en) 2015-09-24 2017-03-30 Editas Medicine, Inc. Use of exonucleases to improve crispr/cas-mediated genome editing
SG10202104041PA (en) 2015-10-23 2021-06-29 Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
EP3433363A1 (en) 2016-03-25 2019-01-30 Editas Medicine, Inc. Genome editing systems comprising repair-modulating enzyme molecules and methods of their use
WO2017180694A1 (en) 2016-04-13 2017-10-19 Editas Medicine, Inc. Cas9 fusion molecules gene editing systems, and methods of use thereof
US11286478B2 (en) 2016-04-19 2022-03-29 The Broad Institute, Inc. Cpf1 complexes with reduced indel activity
AU2017253089B2 (en) * 2016-04-19 2023-07-20 Massachusetts Institute Of Technology Novel CRISPR enzymes and systems
IL295358B2 (en) * 2016-06-02 2023-09-01 Sigma Aldrich Co Llc Use of programmable DNA-binding proteins to enhance targeted genome modification
AU2017280353B2 (en) 2016-06-24 2021-11-11 Inscripta, Inc. Methods for generating barcoded combinatorial libraries
WO2017037304A2 (en) * 2016-07-28 2017-03-09 Dsm Ip Assets B.V. An assembly system for a eukaryotic cell
SG11201900907YA (en) 2016-08-03 2019-02-27 Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
WO2018031683A1 (en) 2016-08-09 2018-02-15 President And Fellows Of Harvard College Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
US20190225974A1 (en) 2016-09-23 2019-07-25 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Targeted genome optimization in plants
EP3526320A1 (en) 2016-10-14 2019-08-21 President and Fellows of Harvard College Aav delivery of nucleobase editors
CN106591335A (zh) * 2016-11-08 2017-04-26 安徽省农业科学院水稻研究所 一种密码子植物化改造的LbCpf1基因及其应用
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
WO2018165629A1 (en) 2017-03-10 2018-09-13 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
KR20190130613A (ko) 2017-03-23 2019-11-22 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 핵산 프로그램가능한 dna 결합 단백질을 포함하는 핵염기 편집제
EP3615672A1 (en) 2017-04-28 2020-03-04 Editas Medicine, Inc. Methods and systems for analyzing guide rna molecules
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
CN110997908A (zh) 2017-06-09 2020-04-10 爱迪塔斯医药公司 工程化的cas9核酸酶
US9982279B1 (en) 2017-06-23 2018-05-29 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
US10011849B1 (en) 2017-06-23 2018-07-03 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
WO2019014564A1 (en) 2017-07-14 2019-01-17 Editas Medicine, Inc. SYSTEMS AND METHODS OF TARGETED INTEGRATION AND GENOME EDITING AND DETECTION THEREOF WITH INTEGRATED PRIMING SITES
JP2020534795A (ja) 2017-07-28 2020-12-03 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ ファージによって支援される連続的進化（ｐａｃｅ）を用いて塩基編集因子を進化させるための方法および組成物
WO2019139645A2 (en) 2017-08-30 2019-07-18 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising gam
EP3697906A1 (en) 2017-10-16 2020-08-26 The Broad Institute, Inc. Uses of adenosine base editors
AU2018358051A1 (en) 2017-11-01 2020-05-14 The Regents Of The University Of California CasZ compositions and methods of use
EP3830301B1 (en) 2018-08-01 2024-05-22 Mammoth Biosciences, Inc. Programmable nuclease compositions and methods of use thereof
US11479762B1 (en) 2018-08-31 2022-10-25 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
US11407995B1 (en) 2018-10-26 2022-08-09 Inari Agriculture Technology, Inc. RNA-guided nucleases and DNA binding proteins
US11434477B1 (en) 2018-11-02 2022-09-06 Inari Agriculture Technology, Inc. RNA-guided nucleases and DNA binding proteins
EP3931313A2 (en) 2019-01-04 2022-01-05 Mammoth Biosciences, Inc. Programmable nuclease improvements and compositions and methods for nucleic acid amplification and detection
EP3942042A1 (en) 2019-03-19 2022-01-26 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for editing nucleotide sequences
US11692197B2 (en) 2019-05-06 2023-07-04 Inari Agriculture Technology, Inc. Delivery of biological molecules to plant cells
KR20230019843A (ko) 2020-05-08 2023-02-09 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 표적 이중 가닥 뉴클레오티드 서열의 두 가닥의 동시 편집을 위한 방법 및 조성물
AU2021287968A1 (en) 2020-06-12 2023-02-09 Sherlock Biosciences, Inc. CRISPR-based SARS-CoV-2 detection
CN112430622A (zh) * 2020-10-26 2021-03-02 扬州大学 一种FokI和dCpf1融合蛋白表达载体及其介导的定点基因编辑方法
EP4291678A1 (en) 2021-02-09 2023-12-20 Sherlock Biosciences, Inc. Nucleic acid amplification using promoter primers
WO2022217086A1 (en) 2021-04-09 2022-10-13 Vor Biopharma Inc. Photocleavable guide rnas and methods of use thereof
WO2023283585A2 (en) 2021-07-06 2023-01-12 Vor Biopharma Inc. Inhibitor oligonucleotides and methods of use thereof
AU2022324093A1 (en) 2021-08-02 2024-02-08 Vor Biopharma Inc. Compositions and methods for gene modification
WO2023049926A2 (en) 2021-09-27 2023-03-30 Vor Biopharma Inc. Fusion polypeptides for genetic editing and methods of use thereof
EP4299739A1 (en) 2022-06-30 2024-01-03 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
WO2024005863A1 (en) 2022-06-30 2024-01-04 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
EP4299733A1 (en) 2022-06-30 2024-01-03 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
WO2024005864A1 (en) 2022-06-30 2024-01-04 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
WO2024047563A1 (en) 2022-09-02 2024-03-07 Janssen Biotech, Inc. Materials and processes for engineering hypoimmunogenicity
WO2024073751A1 (en) 2022-09-29 2024-04-04 Vor Biopharma Inc. Methods and compositions for gene modification and enrichment

Family Cites Families (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0219746D0 (en) 2002-08-23 2002-10-02 Inst Of Ex Botany Ascr Azapurine derivatives
US7919277B2 (en) 2004-04-28 2011-04-05 Danisco A/S Detection and typing of bacterial strains
EP2238251B1 (en) 2007-12-27 2015-02-11 Protiva Biotherapeutics Inc. Silencing of polo-like kinase expression using interfering rna
FR2930264B1 (fr) 2008-04-18 2013-02-22 Gervais Danone Sa Nouvelle souche de lactobacillus paracasei subsp. paracasei dotee de proprietes antimicrobiennes et immunomodulatrices.
DK2630156T3 (en) 2010-10-20 2018-12-17 Dupont Nutrition Biosci Aps CRISPR-CAS SEQUENCES OF LACTOCOCCUS
UA119135C2 (uk) 2012-09-07 2019-05-10 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб отримання трансгенної рослини
EP2840140B2 (en) 2012-12-12 2023-02-22 The Broad Institute, Inc. Crispr-Cas based method for mutation of prokaryotic cells
WO2014093694A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation in eukaryotes
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
PL2771468T3 (pl) 2012-12-12 2015-07-31 Broad Inst Inc Inżynieria systemów, metod i zoptymalizowanych kompozycji kierujących dla manipulacji sekwencjami
IL293526A (en) 2012-12-12 2022-08-01 Harvard College Providing, engineering and optimizing systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
WO2014118272A1 (en) 2013-01-30 2014-08-07 Santaris Pharma A/S Antimir-122 oligonucleotide carbohydrate conjugates
CA2913869C (en) 2013-05-29 2023-01-24 Cellectis New compact scaffold of cas9 in the type ii crispr system
KR102282990B1 (ko) 2013-06-04 2021-07-28 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 Rna-가이드된 전사 조절
US9267135B2 (en) 2013-06-04 2016-02-23 President And Fellows Of Harvard College RNA-guided transcriptional regulation
KR102551324B1 (ko) 2013-06-05 2023-07-05 듀크 유니버시티 Rna-가이드 유전자 편집 및 유전자 조절
EP3011035B1 (en) 2013-06-17 2020-05-13 The Broad Institute, Inc. Assay for quantitative evaluation of target site cleavage by one or more crispr-cas guide sequences
EP3011029B1 (en) 2013-06-17 2019-12-11 The Broad Institute, Inc. Delivery, engineering and optimization of tandem guide systems, methods and compositions for sequence manipulation
US9340800B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College Extended DNA-sensing GRNAS
WO2015089419A2 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for targeting disorders and diseases using particle delivery components
WO2015089364A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Crystal structure of a crispr-cas system, and uses thereof
EP4219699A1 (en) 2013-12-12 2023-08-02 The Broad Institute, Inc. Engineering of systems, methods and optimized guide compositions with new architectures for sequence manipulation
EP3080271B1 (en) 2013-12-12 2020-02-12 The Broad Institute, Inc. Systems, methods and compositions for sequence manipulation with optimized functional crispr-cas systems
CN104017821B (zh) 2014-05-16 2016-07-06 安徽省农业科学院水稻研究所 定向编辑颖壳颜色决定基因OsCHI创制褐壳水稻材料的方法
WO2016049258A2 (en) 2014-09-25 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Functional screening with optimized functional crispr-cas systems
WO2016094872A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Dead guides for crispr transcription factors
GB201506509D0 (en) 2015-04-16 2015-06-03 Univ Wageningen Nuclease-mediated genome editing
US20160362667A1 (en) 2015-06-10 2016-12-15 Caribou Biosciences, Inc. CRISPR-Cas Compositions and Methods
CA3012607A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Crispr enzymes and systems
US10648020B2 (en) 2015-06-18 2020-05-12 The Broad Institute, Inc. CRISPR enzymes and systems
US9790490B2 (en) 2015-06-18 2017-10-17 The Broad Institute Inc. CRISPR enzymes and systems
FI3430134T3 (fi) 2015-06-18 2023-01-13 Uusia CRISPR-entsyymejä ja järjestelmiä
AU2016339053A1 (en) 2015-09-24 2018-04-12 Crispr Therapeutics Ag Novel family of RNA-programmable endonucleases and their uses in genome editing and other applications
CA3001130A1 (en) 2015-10-16 2017-04-20 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education Methods and compositions utilizing cpf1 for rna-guided gene editing
WO2017106657A1 (en) 2015-12-18 2017-06-22 The Broad Institute Inc. Novel crispr enzymes and systems
CN105602993A (zh) 2016-01-19 2016-05-25 上海赛墨生物技术有限公司 线粒体靶向的基因编辑系统及方法
EP3405570A1 (en) 2016-01-22 2018-11-28 The Broad Institute, Inc. Crystal structure of crispr cpf1
US9896696B2 (en) 2016-02-15 2018-02-20 Benson Hill Biosystems, Inc. Compositions and methods for modifying genomes
AU2017253089B2 (en) 2016-04-19 2023-07-20 Massachusetts Institute Of Technology Novel CRISPR enzymes and systems
US11286478B2 (en) 2016-04-19 2022-03-29 The Broad Institute, Inc. Cpf1 complexes with reduced indel activity
AU2017257274B2 (en) 2016-04-19 2023-07-13 Massachusetts Institute Of Technology Novel CRISPR enzymes and systems
US11352647B2 (en) 2016-08-17 2022-06-07 The Broad Institute, Inc. Crispr enzymes and systems
KR20180050015A (ko) 2016-11-04 2018-05-14 삼성전자주식회사 무선통신시스템에서 고신뢰 저지연 통신을 위한 데이터 송수신 방법 및 장치
WO2018213726A1 (en) 2017-05-18 2018-11-22 The Broad Institute, Inc. Systems, methods, and compositions for targeted nucleic acid editing
KR20200026804A (ko) 2017-05-18 2020-03-11 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 표적화된 핵산 편집을 위한 시스템, 방법 및 조성물
US10253365B1 (en) 2017-11-22 2019-04-09 The Regents Of The University Of California Type V CRISPR/Cas effector proteins for cleaving ssDNAs and detecting target DNAs

Also Published As

Publication number Publication date
DK3283625T3 (da) 2020-03-02
US11053482B2 (en) 2021-07-06
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CA2983567A1 (en) 2016-10-20
WO2016166340A1 (en) 2016-10-20
EP3283625B1 (en) 2019-12-11
AU2022246453A1 (en) 2022-11-03
AU2019283764A1 (en) 2020-01-23

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US11788088B2 (en) CRISPR/Cas system and method for genome editing and modulating transcription
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Ribeiro et al. Protein engineering strategies to expand CRISPR-Cas9 applications
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Yoon et al. PCR-based cloning of the complete mouse mitochondrial genome and stable engineering in Escherichia coli
US20240076718A1 (en) Crispna for genome editing
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Singh et al. Genetic Engineering: Altering the Threads of Life
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