ES2759782T3 - Procedimiento de detección por PCR múltiplex para tipos sanguíneos humanos poco comunes y kit - Google Patents

Procedimiento de detección por PCR múltiplex para tipos sanguíneos humanos poco comunes y kit Download PDF

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Abstract

Un procedimiento de cribado rápido por PCR múltiplex de grupos sanguíneos humanos poco comunes, en el que el procedimiento comprende las siguientes etapas: A. preparar una muestra para analizar: construir un grupo con múltiples muestras de sangre, extrayendo respectivamente plantillas de ADN de las muestras de sangre que forman el grupo y mezclar las plantillas de ADN para obtener una muestra para analizar del grupo; B. cribar un grupo positivo: utilizando las etapas i)-v) para realizar la detección por PCR múltiplex en la muestra a analizar del grupo obtenido en la etapa A, y cribar el grupo cuyo resultado de detección es positivo: i) preparar un sistema de reacción PCR múltiplex: el sistema de reacción PCR múltiplex comprende pares múltiples de cebadores específicos, solución tampón de PCR, dNTP, enzima Taq y ddH2O, y las secuencias de los pares múltiples de cebadores específicos son las SEQ ID NOs: 1-6, SEQ ID NOs: 7-12 o SEQ ID NOs: 13- 16; los cebadores específicos son cebadores específicos para loci de SNP de antígeno de grupos sanguíneos poco comunes en genes que codifican antígeno de superficie de células sanguíneas; ii) agregar la muestra a analizar preparada por el procedimiento de recolección de muestras de sangre y extracción de plantillas de ADN para el sistema de reacción PCR múltiplex preparado en la etapa i), para obtener una solución de reacción PCR; iii) realizar una reacción de amplificación en la solución de reacción PCR en la etapa ii) de acuerdo con un procedimiento de amplificación por PCR múltiplex; iv) realizar electroforesis en productos de amplificación obtenidos de la reacción de amplificación en la etapa iii) en gel de agarosa, y observar los resultados de electroforesis a través de un formador de imágenes en gel; y v) si la electroforesis muestra la aparición de una banda, el resultado de detección de un grupo sanguíneo poco común es positivo; y si la electroforesis no muestra banda, el resultado de detección del grupo sanguíneo poco común es negativo; C. la detección y resolución de grupo positivo se selecciona de cualquiera de los siguientes: a) si el número de muestras de sangre en el grupo cuyo resultado de detección es positivo es menor o igual a 5, se toman las plantillas de ADN de las muestras de sangre en el grupo como una muestra para analizar, respectivamente, utilizando las etapas i)-v) para realizar la detección por PCR múltiplex y cribar las muestras de sangre cuyo resultado de detección es positivo; b) si el número de muestras de sangre en el grupo cuyo resultado de detección es positivo es mayor que 5, se resuelven las muestras de sangre del grupo cribado en la etapa B cuyo resultado de detección es positivo para formar dos nuevos grupos, mezclando respectivamente plantillas de ADN de las muestras de sangre de los dos grupos, para obtener muestras que se analizan de los dos grupos, y utilizando las etapas i)-v) para realizar la detección por PCR múltiplex, para cribar el grupo cuyo resultado de detección es positivo; y D. repetir la etapa C.

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento de detección por PCR múltiplex para tipos sanguíneos humanos poco comunes y kit Antecedentes de la presente invención
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de la biología molecular, específicamente a un procedimiento de detección de grupos sanguíneos humanos poco comunes, kit, procedimiento de cribado rápido y aplicación.
Descripción de la técnica relacionada
El antígeno de grupo sanguíneo poco común es un antígeno de grupo sanguíneo cuya frecuencia en el público es inferior a una milésima, y debido a su escasez, en la transfusión de sangre de pacientes de un grupo sanguíneo poco común, es difícil encontrar la fuente de sangre coincidente, lo que resulta en un retraso del tratamiento. Por lo tanto, la detección de grupos sanguíneos poco comunes, el cribado rápido y el establecimiento de un banco de grupos sanguíneos poco comunes son extremadamente importantes.
El procedimiento de detección de grupos sanguíneos poco comunes existente incluye principalmente:
1. Procedimientos serológicos
(1) El uso de sueros policlonales humanos, el aprovechamiento de la prueba de aglutinación salina o la prueba de antiglobulina indirecta para realizar la detección de grupos sanguíneos poco comunes mediante un procedimiento de tubo, un procedimiento de placa de microtitulación de 96 pocillos en forma de U o un procedimiento en gel.
(2) El uso de reactivos de anticuerpos monoclonales o policlonales de origen animal (principalmente murinos) de tipo IgM o tipo IgG, el aprovechamiento de la prueba de aglutinación salina o la prueba de antiglobulina indirecta para realizar la detección de grupos sanguíneos poco comunes por un procedimiento de tubo, un procedimiento de placa de microtitulación de 96 pocillos en forma de U o un procedimiento en gel.
(3) Para el fenotipo especial Jk(a-b-), se puede utilizar un procedimiento con urea. Los glóbulos rojos (RBC) de fenotipo Jk(a-b-) pueden mantener la integridad de la membrana durante 30 minutos en una solución de urea 2 M, y si el fenotipo Jk(a-b-) se juzga de acuerdo con si un RBC de un sujeto sufre hemólisis en la solución de urea 2 M después de 10 minutos.
2. Procedimientos de biología molecular: diseño con base en los SNP del antígeno de RBC
(1) Genotipado de rendimiento medio y bajo: incluyendo PCR-RFLP, PCR-SSP, PCR cuantitativa en tiempo real y técnicas de pirosecuenciación.
(2) Genotipado de alto rendimiento: incluyendo las técnicas comerciales o no comerciales Beadchip, BloodChip, GenomeLab SNPstream, LuminexxMAP y de hibridación en fase sólida.
3. Revisión: las muestras de grupos sanguíneos poco comunes obtenidos a través del cribado con los dos procedimientos anteriores generalmente deben revisarse a través de procedimientos serológicos tales como la prueba de aglutinación salina o la prueba de antiglobulina indirecta.
El procedimiento de detección de grupos sanguíneos poco comunes existente tiene los siguientes problemas:
1) Procedimientos serológicos: es difícil para la mayoría de los antígenos de los grupos sanguíneos poco comunes de RBC obtener anticuerpos humanos o reactivos de detección comercializados, o dado que el precio del reactivo es demasiado alto y el cribado es costoso, es difícil lograr un cribado de alto rendimiento a gran escala.
2) Procedimientos de biología molecular: los procedimientos de genotipado de medio y bajo rendimiento a menudo requieren mucho tiempo y, por lo tanto, es difícil lograr un cribado de alto rendimiento a gran escala. Los procedimientos de genotipado de alto rendimiento existentes son costosos. Y los procedimientos de genotipado existentes detectan una sola muestra, y los costos de detección indudablemente aumentarán.
Por lo tanto, encontrar un procedimiento de detección y cribado de grupos sanguíneos poco comunes rápido, económico y eficiente es de gran importancia práctica.
Sumario de la presente invención
La presente invención, tal como se define en las reivindicaciones adjuntas, describe un procedimiento y un kit de cribado de detección de grupos sanguíneos humanos poco comunes, que aplica un diseño especial de cebadores con un procedimiento de PCR múltiplex, y logra un cribado eficaz de grupos sanguíneos humanos poco comunes.
Un objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento de detección por PCR múltiplex de grupos sanguíneos humanos poco comunes, tomando una plantilla de ADN extraída de muestras de sangre como muestra para analizar, usando pares múltiples de cebadores específicos para la amplificación de PCR múltiplex, y detectar resultados de amplificación a través de electroforesis; en el que los cebadores específicos son cebadores específicos para loci de SNP de antígeno de grupo sanguíneo poco común en genes que codifican antígeno de superficie de células sanguíneas; y un resultado de electroforesis del procedimiento de detección por PCR múltiplex es que se puede detectar positivo.
El procedimiento de detección por PCR múltiplex de acuerdo con la presente invención tal como se define en las reivindicaciones adjuntas incluye pares múltiples de cebadores específicos, cada par de cebadores específicos se dirigen a un antígeno de superficie de un grupo sanguíneo poco común y fragmentos de genes de antígeno de superficie de células sanguíneas que contienen los loci de SNP de antígeno de grupo sanguíneo poco común se amplifican.
Preferiblemente, una secuencia de los pares múltiples de cebadores específicos es SEQ ID NO: 1-6, SEQ ID NO: 7­ 12 o SEQ ID NO: 13-16.
Ese positivo que es detectable en la presente invención significa: plantillas de ADN de muestras de sangre de grupos sanguíneos poco comunes, o plantillas de ADN de muestras de sangre de grupos sanguíneos heterocigotos no poco comunes que contienen loci de SNP de antígeno de grupos sanguíneos poco comunes podrían identificarse por especificidad de cebadores diseñados por la presente invención, y se amplifican a gran escala a través de un procedimiento de PCR, es positivo si la electroforesis muestra que emerge una banda en una ubicación correspondiente a un grupo sanguíneo poco común; mientras que las plantillas de ADN de las muestras de sangre homocigotas de grupos sanguíneos no comunes no pudieron ser identificadas por cebadores y amplificadas, y la electroforesis muestra que surge una banda de grupo sanguíneo no poco común. Es decir, es positivo en presencia de una banda.
Relativamente, ese negativo que es detectable significa: las plantillas de ADN de muestras de grupos sanguíneos homocigotas o heterocigotas no poco comunes (grupo sanguíneo común) podrían identificarse mediante cebadores específicos diseñados correspondientemente, y se amplifican a gran escala mediante un procedimiento de PCR, es negativo si la electroforesis muestra que una banda emerge en un lugar correspondiente a un grupo sanguíneo no poco común; mientras que las plantillas de ADN de muestras de sangre de grupos sanguíneos poco comunes no pudieron identificarse por cebadores y amplificarse (el genotipo de grupo sanguíneo poco común es homocigoto), y es positivo si la electroforesis muestra que no surge una banda de grupo sanguíneo poco común. Es decir, es negativo en presencia de una banda.
Preferiblemente, el procedimiento de detección por PCR múltiplex de grupos sanguíneos humanos poco comunes incluye específicamente:
1) preparar una muestra para analizar: recolectar muestras de sangre y extraer plantillas de ADN como muestra para analizar;
2) preparar un sistema de reacción de PCR múltiplex: el sistema de reacción de PCR múltiplex incluye pares múltiples de cebadores específicos, solución tampón de PCR, dNTP, enzima Taq y ddH2O, y las secuencias de los pares múltiples de cebadores específicos son las SEQ ID NOs: 1-6, SEQ ID NOs: 7-12 o SEQ ID NOs: 13-16; 3) agregar la muestra a analizar preparada en la etapa 1) al sistema de reacción de PCR múltiplex preparado en la etapa 2), para obtener una solución de reacción de PCR;
4) realizar la reacción de amplificación en la solución de reacción de PCR en la etapa 3) de acuerdo con un procedimiento de amplificación de PCR múltiplex;
5) realizar electroforesis en productos de amplificación obtenidos a partir de la reacción de amplificación en la etapa 4) en gel de agarosa, y observar los resultados a través de un formador de imágenes en gel; y
6) juzgar un resultado de detección: si la electroforesis muestra la aparición de una banda, el resultado de detección de un grupo sanguíneo poco común es positivo; y si la electroforesis no muestra banda, el resultado de detección del grupo sanguíneo poco común es negativo.
Preferiblemente, en el sistema de reacción de PCR múltiplex en la etapa 2), el sistema de reacción de PCR múltiplex con secuencias de cebador de las SEQ ID NOs: 1-6 es un sistema Yt-K-Kpc que se usa en la detección de tres grupos sanguíneos poco comunes: Yt(b+), K y Kp(c+); el sistema de reacción de PCR múltiplex con secuencias de cebadores de las SEQ ID NOs: 7-12 es un sistema Dia-OK-Cob que se utiliza en la detección de tres grupos sanguíneos poco comunes: Di(a+), OK(a-) y Co(b+); y el sistema de reacción de PCR múltiplex con las secuencias de cebadores de las SEQ ID NOs: 13-16 es un sistema Fyb-S que se usa en la detección de dos grupos sanguíneos poco comunes: Fy(b+) y S.
Preferiblemente, el procedimiento de detección por PCR múltiplex de grupos sanguíneos humanos poco comunes incluye específicamente:
1) preparar una muestra para analizar: recolectar muestras de sangre y extraer plantillas de ADN como muestra para analizar;
2) preparar un sistema de reacción de PCR múltiplex: el sistema de reacción de PCR múltiplex incluye pares múltiples de cebadores específicos, solución tampón de PCR, dNTP, enzima Taq y ddH2 O, y las secuencias de los pares múltiples de cebadores específicos son las SEQ ID NOs: 1-6, SEQ ID NOs: 7-12 o SEQ ID NOs: 13-16;
3) agregar la muestra a analizar preparada en la etapa 1) y un control positivo incorporado al sistema de reacción de PCR múltiplex separado preparado en la etapa 2), para obtener soluciones de reacción de PCR;
4) realizar una reacción de amplificación en las soluciones de reacción de PCR en la etapa 3) de acuerdo con un procedimiento de amplificación de PCR múltiplex;
5) realizar electroforesis en productos de amplificación obtenidos de la reacción de amplificación en la etapa 4) en gel de agarosa, y observar los resultados a través de un formador de imágenes en gel; y
6) juzgar un resultado de detección: si la electroforesis muestra que una banda emerge en una ubicación correspondiente a una banda de amplificación de control positivo, el resultado de detección de un grupo sanguíneo poco común es positivo; y si la electroforesis muestra que no surge una banda en la ubicación correspondiente a la banda de amplificación de control positivo, el resultado de detección del grupo sanguíneo poco común es negativo.
Más preferiblemente, el control positivo es un plásmido que contiene un fragmento de gen de loci de SNP del grupo sanguíneo poco común, y el control positivo puede ser amplificado por un par de cebadores específicos en los pares múltiples de cebadores específicos con una secuencia de las SEQ ID NOs: 1-16.
Preferiblemente, el sistema de reacción de PCR múltiplex en la etapa 2) incluye además cebadores de control interno; y juzgar un resultado de detección en la etapa 6) es: si la electroforesis muestra una banda de grupo sanguíneo poco común y emerge una banda de control interno, el resultado de detección de un grupo sanguíneo poco común es positivo; si la electroforesis muestra que solo emerge una banda de control interno, el resultado de detección del grupo sanguíneo poco común es negativo; y si la electroforesis no muestra banda, la detección falla.
La banda del grupo sanguíneo poco común es: la banda en una ubicación correspondiente al tamaño de la amplificación del grupo sanguíneo poco común produce fragmentos después de que la muestra del grupo sanguíneo poco común se amplifica mediante un cebador específico correspondiente. La banda de control interno es: la banda en una ubicación correspondiente al tamaño de los fragmentos del producto de amplificación de control interno después de que la muestra de sangre a analizar se amplifica mediante un cebador de control interno correspondiente.
Más preferiblemente, para el sistema de reacción de PCR múltiplex con las secuencias de cebador específicas de las SEQ ID NO: 1-6, las secuencias de los cebadores de control interno de las mismas son las SEQ ID NOs: 17-18; para el sistema de reacción de PCR múltiplex con la secuencia del cebador específico de las SEQ ID NOs: 7-12, las secuencias de los cebadores de control interno de los mismos son las SEQ ID NOs: 19-20; y para el sistema de reacción de PCR múltiplex con la secuencia de cebador específica de las SEQ ID NOs: 13-16, las secuencias de los cebadores de control interno de los mismos son las SEQ ID NOs: 21-22.
Más preferiblemente, las secuencias del cebador del sistema Yt-K-Kpc, el sistema Dia-OK-Cob y el sistema Fyb-S son las siguientes:
Sistema del grupo Nombre del Secuencia Producto de Loci de SNP sanguíneo poco cebador amplificación
común (pb)
Yt-sm4 TCATCAACGCGGGAGACTT|A|A ( SEQ ID N O : 1 ) 636 Ytb
Sistema del grupo Yt-as CACGGGGCACACGACATT (SEQ ID NO:2)
Yt-K-Kpc K-sm5
CTTC C TTAAAC TTTAAC C G §AT (S E Q ID N O :3 ) 204 K
K-as CCCAACCTGCAACCTTCCTC (SEQ ID NO:4)
Kpc-sm2 TG TC AATC TC C A TC AC TTC A @ A ( S E Q ID N O : 5 ) 462 Kpc ______________________________________ (continuación)
Sistema del grupo Nombre del Secuencia Producto de Loci de SNP sanguíneo poco cebador amplificación
común (pb)
Kpc-as TCCTCCACCAGTTGTGACAT (SEQ ID NO:6)
Bactina-s TTCCCTCCTCAGATCATTGCT (SEQ ID NO:17) 320 Beta-actina Bactina-as TCACCTTCACCGTTCCAGTTT (SEQ ID NO:18) (Referencia) dia-sm4h G T G G G T G G T G A A G T C C A ^ C T ( S E Q ID N O : 7 ) 645 Di3 Sistema del grupo dia-as AGAGGGTCTGGCTGTCTTGAA (SEQ ID NO:8)
Dia-OK-Cob OK-sm80hu
T A C T C C T G C G T C T T C C T c [a a |c A (S E Q ID 292 OK 274A N O : 9)
OK-as CTCCCCCTCGTTGATGTGTTC (SEQ ID NO:10)
Co-smh
Figure imgf000005_0001
395 Cob
Co-ash CCTCCAGCAACCTCTTGTCCTCTC (SEQ ID
NO:12)
Beta-actina CGGCATCGTCACCAACTG (SEQ ID NO:19) 508 Beta-actina F (Referencia) Beta-actina TGCAAAGAACACGGCTAAG (SEQ ID NO:20)
R
F Y B S C TTC C C A G A TG G A G A C TA T§A (S E Q ID N O : 13 ) 558 F y
Sistema del grupo FYBAS AACAAGACAAAGATGGCAAGA (SEQ ID NO: 14)
Fyb-S S-s TGATAGCCGCATGACCCTTCT (SEQ ID NO:15) 442 S
S-asm AC G A TG GACAAG TTG TCC§A_ (S E Q ID N O : 16 )
Bactina-S2 CTCTGCCTGACATGAGGGTTA (SEQ ID NO:21) 675 Beta-actina Bactina-AS TCACCTTCACCGTTCCAGTTT (SEQ ID NO:22) (Referencia Nota: Las partes subrayadas representan los loci de SNP específicos que se detectarán, y las cajas representan la base de discrepancia introducida en el diseño de los cebadores.
Preferiblemente, la cantidad de componentes del sistema Yt-K-Kpc, el sistema Dia-OK-Cob y el sistema Fyb-S pueden referirse al sistema de PCR múltiplex convencional. Más preferiblemente, se usa la versión TaKaRa TaqMR Hot Start, Cat. # R007A/B (suministrada con el tampón 10* PCR (más Mg2+) y la mezcla de dNTP), que es específicamente como sigue:
(1) sistema Yt-K-Kpc
Nombre Cantidad (^l/25 ^l)
Plantilla de ADN 4
Tampón 2,5
dNTP 2
Yt-sm4 1,75
Yt-as 1,75
K-sm5 1
K-as 1
(continuación)
Nombre Cantidad (jl/25 jl)
Kpc-sm2 1
Kpc-as 1
Bactina-s 0,2
Bactina-as 0,2
Tap-HS 0,125
H2 O 8,475
(2) el sistema Dia-OK-Cob
Nombre Cantidad (jl/25 |jl)
Plantilla de ADN 4
Tampón 2,5
dNTP 2
dia-sm4h 1,75
dia-as 1,75
OK-sm8h 1
OK-as 1
Co-smh 1
Co-ash 1
Beta-actina F 0,2
Beta-actina R 0,2
Tap-HS 0,125
H2O 8,475
(3) el sistema Fyb-S
Nombre Cantidad (jl/25 jl)
Plantilla de ADN 4
Tampón 2,5
dNTP 2
FYB-s 0,75
FYB-as 0,75
S-asm 1
S-s 1
Bactina-S2 0,2
Bactina-as 0,2
Tap-HS 0,125
H2O 12,475
Preferiblemente, el procedimiento de amplificación por PCR múltiplex del sistema Yt-K-Kpc, el sistema Dia-OK-Cob y El sistema Fyb-S es el siguiente:
(1) sistema Yt-K-Kpc
Fase Etapa Temperatura (°C) Tiempo de espera Ciclos
Primera fase 1 94 5 min 1
Segunda fase 1 94 30 s
2 61 30 s 5
3 72 45 s
Tercera fase 1 94 30 s
2 58 30 s 30
3 72 45 s
Cuarta fase 1 72 7 min 1
Cob
Fase Etapa Temperatura (°C) Tiempo de espera Ciclos
Primera fase 1 94 5 min 1
Segunda fase 1 94 30 s
2 60 30 s 35
3 72 45 s
Tercera fase 1 72 7 min 1
(3) Sistema Fyb-S
Fase Etapa Temperatura (°C) Tiempo de espera Ciclos
Primera fase 1 94 5 min 1
Segunda fase 1 94 30 s
2 58 30 s 35
3 72 45 s
Tercera fase 1 72 7 min 1
Preferiblemente, en la etapa 5), el porcentaje en peso de la agarosa utilizada en la electroforesis es un gel de agarosa al 2%.
Análisis de los resultados de la detección: los resultados se juzgan de acuerdo con la presencia o ausencia y el tamaño del producto de PCR, si el resultado de la imagen en el gel de la muestra, muestra que una banda emerge en una ubicación correspondiente al tamaño de un cierto producto de amplificación de PCR del grupo sanguíneo no común, o una ubicación correspondiente al producto de amplificación del control positivo, el resultado de detección del grupo sanguíneo poco común de la muestra es positivo, e indica que la muestra de sangre puede ser un grupo sanguíneo poco común o heterocigoto que tiene loci de SNP del grupo sanguíneo poco común, que se verifica además mediante procedimientos de biología molecular o procedimientos serológicos; si el resultado de la imagen en gel de la muestra, muestra que no surge una banda en una ubicación correspondiente al tamaño de un determinado producto de amplificación por PCR de un grupo sanguíneo poco común, o en una ubicación correspondiente al producto de amplificación de control positivo, indica que el resultado de detección del grupo sanguíneo poco común de la muestra es negativa, es decir, la muestra de sangre no pertenece a ninguno de los grupos sanguíneos Yt(b+), K, Kp(c+), Di(a+), Ok(a-), Co(b+), Fy(b+) y S.
Un segundo aspecto de la presente invención, tal como se define en las reivindicaciones adjuntas, describe un kit de detección por PCR múltiplex de sangre poco común, para usar en un procedimiento para cribar un grupo sanguíneo humano poco común como se describió anteriormente en el presente documento, en el que el kit incluye pares múltiples de cebadores específicos y las secuencias de los pares múltiples de cebadores específicos son las SEQ ID NOs: 1-6 y/o SEQ ID NOs: 7-12 y/o SEQ ID NOs: 13-16.
El kit de detección por PCR múltiplex de sangre poco común permite la detección de un sistema Yt-K-Kpc y/o un sistema Dia-OK-Cob y/o un sistema Fyb-S.
Preferiblemente, el kit incluye además uno o más de una solución tampón de PCR, dNTP, enzima Taq y ddH2 O.
Preferiblemente, el kit incluye además cebadores de control interno, y si las secuencias de los pares múltiplex de cebadores específicos son las SEQ ID NOs: 1-6, las secuencias de cebadores de control interno correspondientes de los mismos son las SEQ ID NOs: 17-18; si las secuencias de los pares múltiplex de cebadores específicos son las SEQ ID NOs: 7-12, las secuencias de cebadores de control interno correspondientes de los mismos son las SEQ ID NOs: 19-20; y si las secuencias de los pares múltiplex de cebadores específicos son las SEQ ID NOs: 13-16, las secuencias de cebadores de control interno correspondientes de los mismos son las SEQ ID NOs: 21-22.
Preferiblemente, el kit incluye además un control positivo. El control positivo es el plásmido que contiene un fragmento del gen del loci de SNP del grupo sanguíneo poco común, y el control positivo puede ser amplificado por un par de cebadores específicos en los pares múltiples de cebadores específicos con secuencias de las SEQ ID NOs: 1-16.
La presente divulgación proporciona un procedimiento de cribado rápido de grupos sanguíneos poco comunes, que detecta múltiples muestras de sangre en un solo tubo de PCR bajo un procedimiento de PCR sobre la base del procedimiento de detección por PCR múltiplex de la presente divulgación.
El cribado eficaz de grupos sanguíneos poco comunes se logra mediante una combinación de un procedimiento de PCR múltiplex y un esquema de detección por grupos.
El principio de diseño de que el procedimiento de cribado de grupos sanguíneos poco comunes de la presente invención combina el procedimiento de PCR múltiplex con el esquema de detección por grupos es el siguiente: el procedimiento de PCR múltiplex puede amplificar secuencias específicas de antígenos de grupos sanguíneos poco comunes a través de cebadores específicos de los mismos, para juzgar si se incluyen los loci de SNP de cierto grupo sanguíneo poco común observando si emerge una banda en la formación de imágenes en gel; el esquema de detección por grupos puede mezclar un cierto número de muestras de sangre para la detección, si el resultado de la detección por PCR múltiplex de muestras mixtas muestra que la detección del loci de SNP de antígeno de grupo sanguíneo poco común es positiva, resuelva el grupo, para realizar la detección por PCR múltiplex respectivamente, y luego continúa resolviendo el grupo cuyo resultado de detección es positivo, hasta que se haya determinado la muestra positiva original; finalmente, verifica las muestras detectadas que contienen loci de SNP de grupos sanguíneos poco comunes a través de PCR-SSP o procedimientos de secuenciación o serología.
Preferiblemente, el procedimiento de cribado de grupos sanguíneos poco comunes incluye específicamente:
A. preparar una muestra para analizar: construir un grupo con muestras de sangre múltiplex, extraer respectivamente las plantillas de ADN de las muestras de sangre que forman el grupo y mezclar las plantillas de ADN para obtener una muestra para analizar del grupo;
B. cribar el grupo positivo: utilizando las etapas 2) a 6) de dicho procedimiento de detección por PCR múltiplex de acuerdo con la presente invención, para realizar la detección por PCR múltiplex en la muestra a analizar del grupo obtenido en la etapa A, y cribar el grupo cuyo resultado de detección es positivo;
C. la detección y resolución del grupo positivo se selecciona de cualquiera de los siguientes:
a) si el número de muestras de sangre en el grupo cuyo resultado de detección es positivo es menor o igual a 5, tomar las plantillas de ADN de las muestras de sangre en el grupo como una muestra para analizar, respectivamente, utilizando las etapas 2) a 6 ) del procedimiento de detección por PCR múltiplex de acuerdo con la presente invención para realizar la detección por PCR múltiplex y cribar muestras de sangre cuyo resultado de detección es positivo;
b) si el número de muestras de sangre en el grupo cuyo resultado de detección es positivo es mayor que 5, se resuelven las muestras de sangre del grupo cribado en la etapa B cuyo resultado de detección es positivo, para formar dos nuevos grupos, mezclando respectivamente plantillas de ADN de las muestras de sangre de los dos grupos, para obtener muestras para analizar de los dos grupos, y usar la etapa 2) a la etapa 6) del procedimiento de detección por pCr múltiplex de acuerdo con la presente invención para realizar la detección por PCR múltiplex, para cribar el grupo cuyo resultado de detección es positivo; y
D. repetir la etapa C.
Preferiblemente, las muestras de sangre múltiplex de acuerdo con la presente invención significan que el número de muestras de sangre es 2-12. Más preferiblemente, las muestras de sangre múltiplex significan que el número de muestras de sangre es 5-12. Más preferiblemente, las muestras de sangre múltiplex significan que el número de muestras de sangre es 5.
El procedimiento de cribado realiza la detección después de hacer muestras de sangre múltiplex formando un grupo, y si el resultado de PCR múltiplex no es positivo, todas las muestras de sangre que forman el grupo no pertenecen al grupo sanguíneo poco común; si el resultado de la PCR múltiplex es positivo, al menos una muestra de sangre en las muestras que forman el grupo contiene loci de SNP del grupo sanguíneo poco común. Por lo tanto, la detección de grupos sanguíneos poco comunes se realiza continuamente en el grupo cuyo resultado de detección es positivo: cuando el número de muestras de sangre del grupo positivo es mayor (mayor que 5), se resuelve el grupo y se realiza la detección respectivamente, hasta que el número de muestras de sangre del grupo positivo sea menor o igual a 5, se toman plantillas de ADN de las muestras de sangre que forman el grupo como muestras a analizar para realizar una reacción de PCR múltiplex, para cribar muestras de sangre cuya detección de sangre sea positiva; cuando el número de muestras de sangre del grupo positivo es menor (menor o igual a 5), las plantillas de ADN de las muestras de sangre en el grupo se pueden tomar como muestras para analizar, respectivamente, para realizar una reacción de PCR múltiplex, para cribar muestras de sangre cuya detección de sangre es positiva. Finalmente, se confirman las muestras de sangre que son positivas a través de procedimientos biológicos, procedimientos serológicos o secuenciación.
Los efectos beneficiosos de la presente invención tal como se definen en las reivindicaciones adjuntas son los siguientes: el grupo sanguíneo poco común es causado por el polimorfismo de los loci de SNP del antígeno de superficie de las células sanguíneas y, por lo tanto, como los cebadores utilizados en la detección de grupos sanguíneos poco comunes en la técnica anterior están diseñados con respecto a los loci de SNP de antígenos de alta frecuencia (antígenos de grupos sanguíneos comunes), los resultados negativos son detectables en la técnica anterior (las muestras de grupos sanguíneos no poco comunes tienen bandas en una ubicación correspondiente en el gel mediante amplificación por PCR y pruebas de imágenes en gel; mientras que el grupo sanguíneo poco común no tiene bandas); la presente invención aprovecha el diseño especial de cebadores que amplifican alelos que contienen loci de SNP de antígeno de baja frecuencia (antígeno de grupo sanguíneo poco común) o alelos que contienen loci de SNP de fenotipo de supresión de antígeno de alta frecuencia para que la detección del grupo sanguíneo poco común sea positiva y sea detectable, de modo que el procedimiento de PCR múltiplex se puede combinar con el esquema de detección de grupo: por un lado, la PCR múltiplex puede realizar la tipificación en genes de antígenos diana múltiplex en la misma reacción PCR al mismo tiempo a través de pares de cebadores múltiplex con respecto a diferentes loci de SNP de grupos sanguíneos poco comunes, se obtiene más información en una sola reacción, el procedimiento de PCR tiene buena repetición, alta sensibilidad y fuerte especificidad, que puede formar reactivos de detección comerciales, y es más rentable; por otro lado, el defecto de que el procedimiento de detección existente solo detecta una muestra de sangre a la vez, y es ineficiente y consume mucho tiempo se supera mediante el esquema de detección de mezclar múltiples muestras de sangre en un grupo de detección de grupo, que puede detectar múltiples muestras de sangre, y mejora la eficiencia de detección. Además, la presente invención supera el problema de que las muestras de sangre tienen demasiados fragmentos para analizar e interfieren con la PCR múltiplex mediante el diseño de cebadores no coincidentes y la optimización de diferentes cebadores en combinaciones, que pueden realizar un cribado de alta sensibilidad y fuerte especificidad en el grupo sanguíneo poco común. Por lo tanto, el procedimiento de detección de la presente invención combina las ventajas del procedimiento de PCR múltiplex y el esquema de detección de grupo, que tiene un efecto multiplicador, mejora en gran medida la eficiencia de detección del grupo sanguíneo poco común, mejora la sensibilidad y especificidad de detección, acorta el tiempo que se dedicará a la detección, reduce los costos de detección y tiene una gran importancia práctica.
Breve descripción de los dibujos
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Descripción detallada de las realizaciones preferidas
Las siguientes son realizaciones específicas de la presente invención tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.
Realización 1: Construcción del cebador
Principio de diseño del cebador: se diseñan las bases terminales del cebador 3' de PCR-SSP para apuntar a un locus específico de alelo de antígeno de grupo sanguíneo poco común (un locus de amplificación en la literatura es un locus específico de alelo de antígeno normal), e introducir una pequeña cantidad de desajuste en cebadores específicos.
I. Las secuencias a las que se refiere el diseño del cebador son las siguientes:
Sistema Yt-K-Kpc:
acetilcolinesterasa de Homo sapiens (ACHE), RefSeqGene en el cromosoma 7 (Secuencia de referencia del NCBI: NG_007474.1)
Grupo sanguíneo Kell de Homo sapiens, metaloendopeptidasa (KEL), RefSeqGene en el cromosoma 7 (Secuencia de referencia del NCBI: nG_007492.1)
Sistema Dia-OK-Cob:
Familia 4 de portadores de solutos de Homo sapiens, intercambiador de aniones, miembro 1 (banda 3 de proteína de membrana de eritrocitos, grupo sanguíneo Diego) (SLC4A1), RefSeqGene en el cromosoma 17 (Secuencia de referencia del NCBI: NG_007498.1)
Basigin de Homo sapiens (grupo sanguíneo OK) (BSG), RefSeqGene en el cromosoma 19 (Secuencia de referencia del NCBI: NG_007468.1)
Acuaporina 1 de Homo sapiens (grupo sanguíneo Colton) (AQP1), RefSeqGene en el cromosoma 7 (Secuencia de referencia del NCBI: NG_007475.1)
Sistema Fyb-S:
Grupo sanguíneo Duffy de Homo Sapiens, receptor de quimioquina (DARC), RefSeqGene en el cromosoma 1 (Secuencia de referencia del NCBI: NG_011626.1)
Glicoforina B de Homo sapiens (grupo sanguíneo MNS) (GYPB), RefSeqGene en el cromosoma 4 (Secuencia de referencia del NCBI: NG_007483.2)
Los cebadores se sintetizan con un procedimiento convencional.
II. Un sistema de reacción de PCR múltiplex Yt-K-Kpc es específicamente como sigue:
(1) secuencia de cebador de PCR
Nombre del cebador Secuencia Tamaño del producto Loci de SNP de amplificación (pb)
Yt-sm4 TCATCAACGCGGGAGACTT|A|A ( S E Q ID N 0 : 1 ) 636 Ytb
Yt-as CACGGGGCACACGACATT (SEQ ID NO:2)
K-sm5 C T T C C T T A A A C T T T A A C C G § A T ( S E Q ID N O : 3 ) 204 K
K-as CCCAACCTGCAACCTTCCTC (SEQ ID NO:4)
Kpc-sm2 T G T C A A T C T C C A T C A C T T C A ^ A ( S E Q ID N O : 5 ) 462 Kpc
Kpc-as TCCTCCACCAGTTGTGACAT (SEQ ID NO:6)
Bactina-s TTCCCTCCTCAGATCATTGCT (SEQ ID NO:17) 320 Beta-actina Bactina-as TCACCTTCACCGTTCCAGTTT (SEQ ID NO:18) (referencia)
(2) Composición del sistema
El sistema de PCR múltiplex en la presente invención usa la versión TaKaRa TaqMR Hot Start, Cat. # R007A/B (suministrada con tampón de PCR 10X (más Mg2+) y mezcla dNTP), el volumen total del sistema es 25 pl, y la composición del sistema es específicamente como sigue:
Nombre Volumen (pl)
Plantilla de ADN 4
Tampón 2,5
dNTP 2
Yt-sm4 1,75
Yt-as 1,75
K-sm5 1
K-as 1
(continuación)
Nombre Volumen (pl)
Kpc-sm2 1
Kpc-as 1
Bactina-s 0,2
Bactina-as 0,2
Tap-HS 0,125
H2 O 8,475
(3) Procedimiento de amplificación por PCR:
Fase Etapa Temperatura (°C) Tiempo de espera Ciclos
Primera fase 1 94 5 min 1 Segunda fase 1 94 30 s
2 61 30 s 5
3 72 45 s
Tercera fase 1 94 30 s
2 58 30 s 30
3 72 45 s
Cuarta fase 1 72 7 min 1
III. Un sistema de reacción de PCR múltiplex Dia-OK-Cob es específicamente como sigue:
(1) secuencia de cebador de PCR
Nombre del Secuencia Tamaño del producto Loci de SNP cebador de amplificación (pb)
dia-sm4h GT GGGTGGTG A A GTCC A|AT|CT (S E Q TD NO: 7 ) 645 Dr3 dia-as AGAGGGTCTGGCTGTCTTGAA (SEQ ID NO:8)
OK-sm8h T A C T C C T G C G T C T T C C T Q V A jC A (S E Q ID N O :9 ) 292 OK274A OK-as CTCCCCCTCGTTGATGTGTTC (SEQ ID NO:10)
Co-smh GGTGGGGAACAACCAGA@ GT (S E Q ID NO: 11 ) 395 Cob
Co-ash CCTCCAGCAACCTCTTGTCCTCTC (SEQ ID NO:12)
Beta-actinaF CGGCATCGTCACCAACTG (SEQ ID NO:19) 508 Beta-actina Beta-actinaR TGCAAAGAACACGGCTAAG (SEQ ID NO:20) (referencia)
(2) Composición del sistema
El sistema de PCR múltiplex en la presente invención usa la versión TaKaRa TaqMR Hot Strat, Cat. # R007A/B (suministrada con tampón de PCR 10X (más Mg2+) y la mezcla de dNTP), el volumen total del sistema es 25 pl, y la composición del sistema es específicamente como sigue:
Nombre Volumen (pl)
Plantilla de ADN 4
Tampón 2,5
(continuación)
Nombre Volumen (pl)
dNTP 2
dia-sm4h 1,75
dia-as 1,75
OK-sm8h 1
OK-as 1
Co-smh 1
Co-ash 1
Beta-actina F 0,2
Beta-actina R 0,2
Tap-HS 0,125
H2 O 8,475
(3) Procedimiento de amplificación por PCR:
Fase Etapa Temperatura (°C) Tiempo de espera Ciclos
Primera fase 1 94 5 min 1 Segunda fase 1 94 30 s
2 60 30 s 35
3 72 45 s
Tercera fase 1 72 7 min 1
IV. El sistema de reacción PCR múltiplex Fyb-S es específicamente como sigue:
(1) secuencia del cebador de PCR
Nombre del cebador Secuencia Tamaño del producto loci de SNP de amplificación (pb)
N O : 13 ) 558 F y FYBAS AACAAGACAAAGATGGCAAGA (SEQ ID NO:14)
S-s TGATAGCCGCATGACCCTTCT (SEQ ID NO:15) 442 S
S-asm A C G A T G G A C A A G T T G T C C § A ( S E Q ID N O : 16 )
Bactina-S2 CTCTGCCTGACATGAGGGTTA (SEQ ID NO:21) 675 Beta-actina Bactina-AS TCACCTTCACCGTTCCAGTTT (SEQ ID NO:22) (referencia)
(2) Composición del sistema
El sistema de PCR múltiplex divulgado en la presente invención utiliza la versión TaKaRa TaqMR Hot Start, Cat. # R007A/B (suministrado con tampón de PCR 10X (más Mg2+) y mezcla de NTP), el volumen total del sistema es 25 pl, y la composición del sistema es específicamente como sigue:
Nombre Volumen (pl)
Plantilla de ADN 4
Tampón 2,5
dNTP 2
FYB-s 0,75
(continuación)
Nombre Volumen (jl)
FYB-as 0,75
S-asm 1
S-s 1
Bactina-S2 0,2
Bactina-as 0,2
Tap-HS 0,125
H2 O 12,475
(3) Procedimiento de amplificación por PCR:
Fase Etapa Temperatura (°C) Tiempo de espera Ciclos
Primera fase 1 94 5 min 1
Segunda fase 1 94 30 s
2 58 30 s 35
3 72 45 s
Tercera fase 1 72 7 min 1
Realización 2: Construcción del control positivo.
Método I: se obtuvieron muestras de ADN de donantes de grupos sanguíneos poco comunes, luego se amplificaron mediante cebadores diseñados para amplificar los fragmentos que contienen loci de SNP a detectar. Los productos de amplificación se conectaron a un vector pGM-T, posteriormente se transformaron en células competentes DH5a. Las colonias monoclonales positivas fueron recogidas para ser identificadas por secuenciación. Por lo tanto, se construyeron los controles positivos Ytb, K, Dia y Cob.
1. Diseño de cebadores
Grupo sanguíneo Nombre del cebador Secuencia
Ytb Ytb-F TCCTCCTTGGACGTGTACGAT (SEQ ID NO:23)
Ytb-R CTCCTCTGCCGTGTAGTTTCG (SEQ ID NO:24)
K K-F TTATGCCAGAATCAGGTTAGA (SEQ ID NO:25)
K-R GAGAGAAGGAATGTACGGGAG (SEQ ID NO:26)
Dia Dia-F CAAGCCACCCAAGTATCACCC (SEQ ID NO:27)
Dia-R CATCCCGACCTTCCTCCTCAT (SEQ ID NO:28)
Cob Cob-F AAAGCCTATTAGAGCAACGG (SEQ ID NO:29)
Cob-R CCTAGAGGTGGTTTATTTGGA (SEQ ID NO:30)
Fyb Fyb-F AGAGTCCCTTATCCCTATGCC (SEQ ID NO:31)
Fyb-R ACCTCACCAGGAAATCCAGTC (SEQ ID NO:32)
S S-F GCACAGGTGGAACAGTAAGG (SEQ ID NO:33)
S-R GGTTGTCAAGATGGTCCCTAA (SEQ ID NO:34)
2. sistema de amplificación
(1) Ytb, K, Dia, Cob
Nombre Volumen (jl)
Plantilla de ADN 2,5
Tampón 5
(continuación)
Nombre Volumen (jl)
dNTP 4
Cebador secuencia arriba 1,75
Cebador secuencia abajo 1,75
Tap-HS 0,25*
H2 O 34,75
* Versión TaKaRa TaqMR Hot Start, Cat. # R007A/B (suministrada con Tampón de PCR 10X (más Mg2+) y mezcla de dNTP)
(2) Fyb, S
Nombre Volumen (jl) Plantilla de ADN 2,5
Tampón 5
dNTP 4
Cebador secuencia arriba 2
Cebador secuencia abajo 2
Tap-HS 0,25*
H2O 34,75
* Versión TaKaRa TaqMR Hot Start, Cat. # R007A/B (suministrada con Tampón de PCR 10X (más Mg2+) y mezcla de dNTP)
3. Procedimiento de amplificación por PCR
(1) Procedimiento de amplificación Ytb
Fase Etapa Temperatura (°C) Tiempo de espera Ciclos Primera fase 1 94 5 min 1
1 94 1 min
Segunda fase 2 60 1 min 38
3 72 1,5 min
Tercera fase 1 72 7 min 1
(2) Procedimiento de amplificación K
Fase Etapa Temperatura (°C) Tiempo de espera Ciclos Primera fase 1 94 5 min 1
1 94 1 min
Segunda fase 2 55 1 min 38
3 72 1,5 min
Tercera fase 1 72 7 min 1
(3) Procedimiento de amplificación Dia
Fase Etapa Temperatura (°C) Tiempo de espera Ciclos Primera fase 1 94 5 min 1
(continuación)
Fase Etapa Temperatura (°C) Tiempo de espera Ciclos
1 94 40 s
Segunda fase 2 60 40 s 38
3 72 1 min
Tercera fase 1 72 7 min 1
(4) Procedimiento de amplificación Cob
Fase Etapa Temperatura (°C) Tiempo de espera Ciclos Primera fase 1 94 5 min 1
1 94 1 min
Segunda fase 2 57 1 min 38
3 72 1,5 min
Tercera fase 1 72 7 min 1
(5) Procedimiento de amplificación Fyb
Fase Etapa Temperatura (°C) Tiempo de espera Ciclos Primera fase 1 94 5 min 1
1 94 1 min
Segunda fase 2 57 1 min 35
3 72 1 min 30 s
Tercera fase 1 72 7 min 1
(6) Procedimiento de amplificación S
Fase Etapa Temperatura (°C) Tiempo de espera Ciclos Primera fase 1 94 5 min 1
1 94 1 min
Segunda fase 2 58 1 min 35
3 72 1 min 30 s
Tercera fase 1 72 7 min 1
4. Los productos de amplificación se purificaron mediante un kit de extracción en gel y se conectaron a un vector pGM-T (adquirido a través de TIANGEN BIOTECH), se transformaron en células DH5a competentes. Las colonias monoclonales positivas fueron recogidas para ser identificadas por secuenciación.
Método II: Procedimientos de mutagénesis dirigida al sitio para construir plásmidos de control positivo Kpc, Ok.
1. Construcción de plásmidos de control Kpc
1) De acuerdo con las secuencias del gen KEL (antígenos codificados kpc del sistema del grupo sanguíneo Kell, número de secuencia del GenBank NG07492) en la base de datos del GenBank, los cebadores se diseñan para que se amplifiquen con fragmentos de genes que contienen loci de SNP que se van a mutar.
Las secuencias del cebador son las siguientes:
Kpb-F GGTAAGATGGCACATGGACAAAGGC (SEQ ID NO: 35)
Kpb-R CTGCGGCGAACCTCTGCTTTAG (SEQ ID NO: 36)
El sistema de amplificación es el siguiente:
Tampón de PCR 10X (que contiene MgCh) 5,0 pl
dNTP 5 mM 2,0 pl
Kpb-F 10 pM 2,0 pl
Kpb-R 10 pM 2,0 pl
ADN 5,0 pl
Taq 0,25 pl
H2 O 33,75 pl
El procedimiento de amplificación es el siguiente:
Fase Etapa Temperatura (°C) Tiempo de espera Ciclos Primera fase 1 95 2 min 1
1 94 30 s
Segunda fase 2 58 30 s 35
3 72 30 s
Tercera fase 1 72 10 min 1
2) Los productos de amplificación se purificaron mediante un kit de extracción en gel y se conectaron a un vector pGEM-T easy durante la noche a 4 °C.
3) Los productos de ligación se transforman en células competentes DH5a de E. coli, se recubren en placas de LB sólido que contienen ampicilina y se incuban a 37 °C durante la noche. Para seleccionar los clones positivos para incubar en medio de cultivo líquido LB que contiene ampicilina a 250 r/min, 37 °C durante la noche, se extraen los plásmidos y se usan cebadores de secuenciación universal T7 para secuenciar y analizar los fragmentos insertados.
4) Se diseña un cebador mutagénico y otro cebador de flanqueo (los extremos 5' de dos cebadores son adyacentes entre sí), se toman plásmidos recombinantes que contengan secuencias normales de genes para mutar como plantillas para la amplificación de plásmidos de longitud completa y se introducen loci de mutación.
Las secuencias del cebador son las siguientes:
cebador mutagénico KPC MF: TCACAGCTGTTCCAGTTTCT (SEQ ID No: 37)
cebador de flanqueo KPC MR: AGTGATGGAGTTGACAAGG (SEQ ID NO: 38)
El sistema de amplificación es el siguiente:
Tampón de PCR 10X 5,0 pl
MgSO425 mM 2,0 pl
dNTP 2 mM 5,0 pl
OK-Mu 10 pM 2 pl
PGEMT-R 10 pM 2 pl
Plantilla de plásmido recombinante 5,0 pl
ADN polimerasa KOD de fidelidad Plus 1 pl
Agua desionizada hasta 50 pl
El procedimiento de amplificación es el siguiente:
Fase Etapa Temperatura (°C) Tiempo de espera Ciclos Primera fase 1 94 2 min 1
1 94 30 s
Segunda fase 2 60 30 s 35
(continuación)
Fase Etapa Temperatura (°C) Tiempo de espera Ciclos
3 68 4 min
Tercera fase 1 72 8 min 1
5) Obtención de los controles de detección de genes de antígeno del grupo sanguíneo que contengan loci de SNP mutante.
Después de la purificación mediante un kit de extracción en gel, se realiza la fosforilación del extremo 5' en los productos de PCR.
Sistema de fosforilación de 20 pl:
tampón de reacción A 10X 2 pl
ATP 10 mM 2 pl
Polinucleótido quinasa T4 1 pl
Producto recuperado por PCR 2 pl
ddH2O 13 pl
Se realiza la autoligación después de la fosforilación, y el sistema de ligación de 10 pl es el siguiente:
Producto fosforilado 2 pl
tampón de ligación rápida 2X 5 pl
ADN Ligasa T4 1 pl
ddH2O 2 pl
La ligación se realiza a 4 °C durante la noche. Se transforman los productos de ligación en las células competentes DH5a, se incuba a 37 °C durante la noche, y luego se extraen los plásmidos, y se usan los cebadores de secuenciación T7 para secuenciary analizar los resultados de la mutación.
2. Construcción de plásmidos de control Ok
1) De acuerdo con las secuencias génicas BSG (antígenos codificados Oka del sistema del grupo sanguíneo OKa, número de secuencia del GenBank NG07492) en la base de datos del GenBank, los cebadores se diseñan para que se amplifiquen con fragmentos de genes que contienen loci de SNP que se van a mutar.
Las secuencias del cebador son las siguientes:
OKa-F GACTGGGACAGTTTTGCTTTTTCAC (SEQ ID NO: 39)
OKa-R GTCTCCCCCTCGTTGATGTGTTCTG (SEQ ID NO: 40)
El sistema de amplificación es el siguiente:
Tampón de PCR 10X 5,0 pl
MgCl2 2,5 pl
dNTP 5 mM 2,0 pl
OKa-F 10 pM 2,0 pl
OKa-R 10 pM 2,0 pl
ADN 5,0 pl
Taq 0,4 pl
H2O 50 pl
El procedimiento de amplificación es el siguiente:
Fase Etapa Temperatura (°C) Tiempo de espera Ciclos Primera fase 1 95 10 min 1
1 94 40 s
Segunda fase 2 61 40 s 35
3 72 1 min
Tercera fase 1 72 5 min 1
2) Los productos de amplificación se purificaron mediante un kit de extracción en gel y se conectaron a un vector pGEM-T easy durante la noche a 4 °C.
3) Los productos de ligación se transforman en células competentes DH5a de E. coli, se recubren en placas de LB sólido que contienen ampicilina y se incuban a 37 °C durante la noche. Para seleccionar los clones positivos para incubar en medio de cultivo líquido LB que contiene ampicilina a 250 r/min, 37 °C durante la noche, se extraen los plásmidos y se usan cebadores de secuenciación universal T7 para secuenciar y analizar los fragmentos insertados.
4) Se diseña un cebador mutagénico y otro cebador de flanqueo (los extremos 5' de dos cebadores son adyacentes entre sí), se toman plásmidos recombinantes que contengan secuencias normales de genes para mutar como plantillas para la amplificación de plásmidos de longitud completa y se introducen loci de mutación.
Las secuencias del cebador son las siguientes:
Cebador mutagénico OKa-Mu CATGGGCTTGGGGAGGAAGAC (SEQ ID No: 41)
Cebador de flanqueo PGEMT-R GGCACGGCCAACATCCAGCTC (SEQ ID No: 42)
El sistema de amplificación es el siguiente:
Tampón de PCR 10X 5,0 pl
MgSO425 mM 2,0 pl
dNTP 2 mM 5,0 pl
OK-Mu 10 pM 2 pl
PGEMT-R 10 pM 2 pl
Plantilla de plásmido recombinante 5,0 pl
ADN polimerasa KOD de fidelidad Plus 1 pl
Agua desionizada hasta 50 pl
El procedimiento de amplificación es el siguiente:
Fase Etapa Temperatura (°C) Tiempo de espera Ciclos
Primera fase 1 94 10 min 1
1 94 30 s
Segunda fase 2 60 30 s 35
3 68 4 min
Tercera fase 1 72 5 min 1
5) Se obtienen los controles de detección de genes de antígeno del grupo sanguíneo que contienen loci de SNP mutante.
Después de la purificación mediante un kit de extracción en gel, se realiza una fosforilación del extremo 5' en los productos de PCR.
Sistema de fosforilación de 20 pl:
Tampón de reacción A 10X 2 pl
ATP 10 mM 2 pl
Polinucleótido quinasa T4 1 |jl
Producto recuperado por PCR 2 j l
ddH2O 13 j l
Se realiza la autoligación después de la fosforilación, y el sistema de ligación de 10 j l es el siguiente:
Producto fosforilado 2 j l
Tampón de ligación rápido 2X 5 j l
ADN Ligasa T4 1 j l
ddH2O 2 j l
La ligación se realiza a 4 °C durante la noche. Se transforman los productos de ligadura en células competentes DH5a, se incuban a 37 °C durante la noche, y luego se extraen los plásmidos, y se usan los cebadores de secuenciación T7 para secuenciar y analizar los resultados de la mutación.
Realización 3: Cribado de un grupo sanguíneo poco común
En los siguientes experimentos, las muestras de sangre de grupos sanguíneos no poco comunes, las muestras de sangre de grupos sanguíneos poco comunes y los plásmidos de control se verifican por secuenciación.
I. Detección de un conjunto de muestras de sangre que no contienen loci de SNP específicos de grupos sanguíneos poco comunes
Se recogieron aleatoriamente 12 muestras de sangre, se extrajo respectivamente ADN genómico y se secuenció para verificar que no contenían loci de SNP específicos de grupos sanguíneos poco comunes.
Detección de grupos sanguíneos poco comunes usando el procedimiento de cribado de grupos sanguíneos poco comunes en la presente invención: se mezclan las plantillas de ADN obtenidas, para formar una muestra a analizar que contiene 12 muestras de sangre; se añaden respectivamente las muestras a analizar en el sistema de reacción PCR múltiplex correspondiente en la realización 1, para obtener soluciones de reacción PCR del sistema Yt-K-Kpc, el sistema Dia-OK-Cob y el sistema Fyb-S, y se preparan soluciones de reacción PCR del control positivo al mismo tiempo; se realiza una reacción de amplificación en las soluciones de reacción PCR obtenidas en la etapa anterior de acuerdo con los procedimientos de amplificación de PCR correspondientes; se detectan los productos de amplificación obtenidos en el gel de agarosa por electroforesis y se observan los resultados a través de un formador de imágenes en gel.
El formador de imágenes en gel muestra que emerge una banda de control interno, pero no emerge ninguna banda en una ubicación correspondiente al tamaño del fragmento de amplificación del control positivo, y por lo tanto el resultado de detección del procedimiento de cribado de grupos sanguíneos poco comunes es que las 12 muestras de sangre no tienen muestras de sangre de grupos sanguíneos poco comunes, y el resultado de la detección es consistente con el resultado de secuenciación del ADN.
II Detección de un conjunto de muestras de sangre que contienen loci de SNP específicos de grupos sanguíneos poco comunes
Se seleccionan 4 muestras de sangre que no contienen loci de SNP específicos de grupos sanguíneos poco comunes, se extraen plantillas de ADN respectivamente, y se mezclan las plantillas, después de la mezcla, las plantillas mezcladas forman con el ADN genómico de la muestra de sangre que no contiene loci de SNP específicos de grupos sanguíneos poco comunes, un ADN genómico de muestra de sangre Yt(b+), un ADN genómico de muestra de sangre K y plásmidos de control Kpc respectivamente para obtener cuatro grupos que contienen cada uno 5 muestras de a Dn , se realiza la amplificación de acuerdo con el sistema Yt-K-Kpc en la realización 1 y la condición de reacción correspondiente, y los productos de amplificación se detectan mediante el formador de imágenes en gel después de la electroforesis en gel.
Por favor observar la Figura 1 de la memoria descriptiva para los resultados de la electroforesis. Carril 1: marcador, los fragmentos son de 100, 200, 300, 400, 500, 600 pb; Carril 2, 3, 4: cuatro mezclas de 3,2 j l de ADN genómico de muestras de sangre que no contienen loci de SNP específicos de grupos sanguíneos poco comunes (concentración de 50-100 ng/jl) 0,8 j l de ADN genómico de grupos sanguíneos poco comunes (concentración de 50-100 ng/jl) o plásmidos de control (concentración de 0,01 ng/jl); Carril 5: cinco ADN genómicos de muestras de sangre de 4 j l que no contienen loci de SNP específicos de grupos sanguíneos poco comunes (concentración de 50-100 ng/jl).
El formador de imágenes en gel muestra que, los carriles 2, 3, 4 tienen bandas en las ubicaciones correspondientes a los tamaños de los fragmentos de amplificación de grupos sanguíneos poco comunes correspondientes, y los resultados de detección de los grupos que forman los carriles 2, 3, 4 son positivos; como el número de muestras de ADN de los grupos en los carriles 2, 4, 5 es igual a 5, los ADN de las muestras de sangre en los grupos de los carriles 2, 3, 4 se toman como plantillas para la reacción PCR múltiplex y el resultado de detección de grupos sanguíneos poco comunes obtenido con el procedimiento de PCR múltiplex es consistente con el resultado de secuenciación del ADN.
2. Sistema Dia-OK-Cob
Se seleccionan 4 ADN genómicos de muestras de sangre que no contienen loci de SNP específicos de grupos sanguíneos poco comunes y se mezclan, después de la mezcla, los ADN mezclados forman con dos muestras de ADN genómico de muestras de sangre que no contienen loci de SNP específicos de grupos sanguíneos poco comunes, un ADN genómico Di(a+b+), plásmidos de control OK, un ADN genómico de muestra sanguínea de Co(b+) respectivamente para obtener cinco grupos que contienen cada uno 5 muestras de ADN, realizar la amplificación de acuerdo con el sistema Dia-OK-Cob en la realización 1 y la condición de reacción correspondiente, y los productos de amplificación son detectados por el formador de imágenes en gel después de la electroforesis en gel.
Por favor observar la Figura 2 de la memoria descriptiva para los resultados de la electroforesis. Carriles 1, 5: cinco ADN genómicos de la muestra de sangre de 4 pl no contienen loci de SNP específicos de grupos sanguíneos poco comunes (concentración de 50-100 ng/pl); carriles 2, 3, 4: cuatro mezclas de 3,2 pl de ADN genómico de la muestra de sangre no contienen loci de SNP específicos de grupos sanguíneos poco comunes (concentración de 50-100 ng/pl) 0,8 pl de ADN genómico de grupos sanguíneos poco comunes (concentración de 50-100 ng/pl) o plásmidos de control (concentración de 0,01 ng/pl); carril 6: marcador, los fragmentos son de 100, 200, 300, 400, 500, 600 pb. El formador de imágenes en gel muestra que, los carriles 2, 3, 4 tienen bandas en ubicaciones correspondientes a los tamaños de los fragmentos de amplificación de grupos sanguíneos poco comunes correspondientes, y los resultados de detección de los grupos que forman los carriles 2, 3, 4 son positivos; como el número de muestras de ADN de los grupos en los carriles 2, 3, 4 es igual a 5, los ADN de las muestras de sangre en los grupos de los carriles 2, 3, 4 se toman como plantillas para la reacción PCR múltiplex, y el resultado de detección de grupos sanguíneos poco comunes obtenido con el procedimiento de PCR múltiplex es consistente con el resultado de secuenciación del ADN.
3. Sistema Fyb-S
A. Se seleccionan 4 ADN genómicos de muestras de sangre de loci de SNP específicas que no contienen grupos sanguíneos poco comunes y se mezclan, después de mezclar, los ADN mezclados forman con un ADN genómico de muestras de sangre que no contienen loci de SNP específicos de grupos sanguíneos poco comunes, un ADN genómico de muestra de sangre Fy(a+b+) y un ADN genómico de muestra de sangre S+s- respectivamente, para obtener tres grupos que contiene cada uno 5 muestras de ADN.
B. Se seleccionan 3 ADN genómicos de muestras de sangre que no contienen loci de SNP específicos de grupos sanguíneos poco comunes y se mezclan, y después de mezclar, se agregan los ADN mezclados a un ADN genómico de muestra de sangre Fy(a+b+) y un ADN genómico de muestra de sangre S+s-, para formar un grupo que contiene 5 muestras de ADN.
Se realiza la amplificación de acuerdo con el sistema Fyb-S en la realización 1 y la condición de reacción correspondiente, y los productos de amplificación se detectan mediante el formador de imágenes en gel después de la electroforesis en gel.
Por favor observar la Figura 3 de la memoria descriptiva para los resultados de la electroforesis. El formador de imágenes en gel muestra que, los carriles 2, 3 tienen bandas en ubicaciones correspondientes a los tamaños de los fragmentos de amplificación de grupos sanguíneos poco comunes correspondientes, y los resultados de detección de los grupos que forman los carriles 2, 3 son positivos; el carril 4 tiene bandas en ubicaciones correspondientes a Fyb y S, los resultados de detección del grupo del carril 4 que contiene grupos sanguíneos poco comunes de Fyb y S son positivos; los ADN de las muestras de sangre en los grupos de los carriles 2, 3, 4 se toman como plantillas para la reacción PCR múltiplex, y el resultado de detección de grupos sanguíneos poco comunes obtenido con el procedimiento de PCR múltiplex es consistente con el resultado de secuenciación de ADN.
Realización 4: Cribado del kit del grupo sanguíneo poco común
En los siguientes experimentos, las muestras de sangre de grupos sanguíneos no poco comunes, las muestras de sangre de grupos sanguíneos poco comunes y los plásmidos de control se verifican todos mediante secuenciación.
1. Materiales experimentales
Se toman 11 muestras de sangre que no contienen loci de SNP específicos de grupos sanguíneos poco comunes, respectivamente se extraen plantillas de ADN y se mezclan las plantillas de ADN de las 11 muestras de sangre; se agrega un ADN genómico de muestra de sangre Fy(b+) a la mezcla de la plantilla de ADN, para preparar un grupo que contiene 12 muestras de ADN.
2. Procedimientos experimentales
Se toman 3 muestras para analizar del grupo, con referencia al sistema Yt-K-Kpc, el sistema Dia-OK-Cob y el sistema Fyb-S en la realización 1, y a través de los cebadores de PCR y otros reactivos en el kit, se preparan respectivamente soluciones de reacción PCR de los tres sistemas, y la solución de reacción PCR del control positivo. Se realiza la reacción de amplificación de acuerdo con los procedimientos de amplificación del sistema Yt-K-Kpc, el sistema Dia-OK-Cob y el sistema Fyb-S en la realización 1 respectivamente, se colocan los productos de amplificación en el gel de agarosa para electroforesis y se observan los resultados a través de un formador de imágenes en gel. La electroforesis muestra: amplificación del sistema Yt-K-Kpc y el sistema Dia-OK-Cob no tiene bandas, lo que indica que las muestras de sangre del grupo para detección no pertenecen a ninguno de Yt(b+), K, Kp(c+), Di(a+), Ok(a-) o Co(b+); la amplificación del sistema Fyb-S tiene una banda, y la banda emerge en una ubicación correspondiente a un grupo sanguíneo Fy(b+), y prueba que el conjunto de las 12 muestras de sangre puede tener un grupo sanguíneo Fy(b+).
Como el número de muestras de sangre en el grupo es de 12 (mayor que 5), el grupo se resuelve en dos nuevos grupos que contiene cada uno 6 muestras de sangre, y la detección por PCR múltiplex se realiza de acuerdo con las condiciones del sistema Fyb-S, para cribar grupos cuyo resultado de detección es positivo. Se continúa resolviendo los grupos cuyo resultado de detección es positivo, hasta que el número de muestras de sangre en los grupos cuyo resultado de detección sea positivo sea 3, y se realiza una detección por PCR múltiplex en 3 muestras de ADN respectivamente, para finalmente detectar las muestras de sangre cuyo resultado de detección sea positivo.
La secuenciación de ADN se realiza en las muestras de sangre cuyo resultado de PCR es positivo, y el resultado muestra que el resultado de secuenciación es consistente con el resultado del procedimiento de cribado por PCR múltiplex de grupos sanguíneos humanos poco comunes.
Realización 5: Experimento de cribado de sensibilidad del grupo sanguíneo poco común
1. Procedimientos experimentales: se extraen plásmidos de control, se realiza la cuantificación con un espectrofotómetro ultravioleta, se realiza una dilución de acuerdo con 1 ng/pl, 0,1 ng/pl, 0,01 ng/pl, 0,001 ng/pl,... se mezclan con ADN genómicos de grupos sanguíneos no poco comunes que tienen el mismo volumen, y luego se usa el procedimiento de cribado rápido de grupos sanguíneos humanos poco comunes de acuerdo con la presente invención para la detección por PCR múltiplex.
2. Etapas experimentales
(1) Se extraen seis plásmidos de control positivo diferentes respectivamente, se realiza la cuantificación con un espectrofotómetro ultravioleta y luego se realiza la dilución de acuerdo con las proporciones, para obtener plásmidos de control positivo que tengan diferentes concentraciones.
(2) Se seleccionan aleatoriamente 4 ADN genómicos de muestras de sangre de grupos sanguíneos no poco comunes (No. 1-4) para mezclarlos con volúmenes iguales para obtener ADN mezclados, y la concentración de los ADN mezclados es de 50-100 ng/pl; se toman seis de los ADN mezclados, el volumen de cada ADN mezclado es de 3,2 pl, y se agregan 0,8 pl de seis plásmidos de control positivo diferentes después de la dilución a los seis ADN mezclados, para formar seis grupos con un volumen total de 4 pl y el número de muestras es 5.
(3) Se amplifican los grupos que contienen los plásmidos de control correspondientes de acuerdo con el sistema Yt-K-Kpc, el sistema Dia-OK-Cob o el sistema Fyb-S y la condición de reacción correspondiente, y los productos de amplificación se detectan por medio del formador de imágenes en gel después de la electroforesis en gel. 3. Resultados experimentales
(1) plásmidos Yt
Como se muestra en la Figura 4, carriles 1-6: se mezclan 3,2 pl de ADN genómico de muestra de sangre de grupo sanguíneo no poco común 0,8 pl de plásmidos Yt, y las concentraciones de los plásmidos son 1 ng/pl, 0,1 ng/pl, 0,01 ng/pl , 0,001 ng/pl, 0,0001 ng/pl, 0,00001 ng/pl respectivamente; carril 7: marcador, los fragmentos son de 100, 200, 300, 400, 500 y 600 pb.
(2) plásmidos K
Como se muestra en la Figura 5, carriles 1-5: se mezclan 3,2 pl de ADN genómico de muestra de sangre de grupo sanguíneo no poco común 0,8 pl de plásmidos K, y las concentraciones de los plásmidos son 1 ng/pl, 0,1 ng/pl, 0,01 ng/pl , 0,001 ng/pl, 0,0001 ng/pl, 0,00001 ng/pl respectivamente; carril 6: marcador, los fragmentos son de 100, 200, 300, 400, 500 y 600 pb.
(3) Plásmidos Kpc
Como se muestra en la Figura 6, carriles 1-7: se mezclan 3,2 pl de ADN genómico de muestra de sangre de grupo sanguíneo no poco común 0,8 pl de plásmidos Kpc, y las concentraciones de los plásmidos son 1 ng/pl, 0,1 ng/pl, 0,01 ng/pl , 0,001 ng/pl, 0,0001 ng/pl, 0,00001 ng/pl, 0,000001 ng/pl respectivamente; carril 8: marcador, los fragmentos son de 100, 200, 300, 400, 500 y 600 pb.
(4) Plásmidos Dia
Como se muestra en la Figura 7, carriles 1-6: se mezclan 3,2 pl de ADN genómico de muestra de sangre de grupo sanguíneo no poco común 0,8 pl de plásmidos Dia, y las concentraciones de los plásmidos son 1 ng/pl, 0,1 ng/pl, 0,01 ng/pl , 0,001 ng/pl, 0,0001 ng/pl, 0,00001 ng/pl respectivamente; carril 7: marcador, los fragmentos son de 100, 200, 300, 400, 500 y 600 pb.
(5) Plásmidos Ok
Como se muestra en la Figura 8, carriles 1-5: se mezclan 3,2 pl de ADN genómico de muestra de sangre de grupo sanguíneo no poco común 0,8 pl de plásmidos Dia, y las concentraciones de los plásmidos son 1 ng/pl, 0,1 ng/pl, 0,01 ng/pl , 0,001 ng/pl, 0,0001 ng/pl respectivamente; carril 6: marcador, los fragmentos son de 100, 200, 300, 400, 500 y 600 pb.
(6) Plásmidos Cob
Como se muestra en la Figura 9, carriles 1-5: se mezclan 3,2 pl de ADN genómico de muestra de sangre de grupo sanguíneo no poco común 0,8 pl de plásmidos Cob, y las concentraciones de los plásmidos son 1 ng/pl, 0,1 ng/pl, 0,01 ng/pl , 0,001 ng/pl, 0,0001 ng/pl respectivamente; carril 6: marcador, los fragmentos son de 100, 200, 300, 400, 500 y 600 pb.
(7) Plásmidos Fyb
Como se muestra en la Figura 10, carriles 1-7: se mezclan 3,2 pl de ADN genómico de muestra de sangre de grupo sanguíneo no poco común 0,8 pl de plásmidos Fyb, y las concentraciones de los plásmidos son 1 ng/pl, 0,1 ng/pl, 0,01 ng/pl , 0,001 ng/pl, 0,0001 ng/pl, 0,00001 ng/pl, 0,000001 ng/pl respectivamente; carril 8: marcador, los fragmentos son de 100, 200, 300, 400, 500 y 600 pb.
(8) Plásmidos S
Como se muestra en la Figura 11, carriles 1-6: se mezclan 3,2 pl de ADN genómico de muestra de sangre de grupo sanguíneo no poco común 0,8 pl de plásmidos S, y las concentraciones de los plásmidos son 1 ng/pl, 0,1 ng/pl, 0,01 ng/pl , 0,001 ng/pl, 0,0001 ng/pl, 0,00001 ng/pl respectivamente; carril 7: marcador, los fragmentos son de 100, 200, 300, 400, 500 y 600 pb.
Se puede observar a partir de los resultados experimentales anteriores, que el procedimiento de detección del conjunto de grupos sanguíneos poco comunes de la presente invención tiene una mayor sensibilidad, que todavía se puede detectar incluso si la concentración de plásmido es inferior a 0,0001 ng/pl incluso 0,00001 ng/pl.
Listado de secuencias
<110> Centro de sangre de Shanghai
<120> Procedimiento de detección por PCR múltiplex para tipos sanguíneos humanos poco comunes y kit <130> SHAB001PEP
<140> EP 12865995.0
<141> 2012-01-18
<150> PCT/CN2012/070522
<151> 2012-01-18
<160> 42
<170> PatentIn versión 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<223> Cebador
<400> 1
tcatcaacgc gggagactta a 21 <210>2
<211> 18
<212>ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 2
cacggggcac acgacatt 18 <210>3
<211> 22
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 3
cttccttaaa ctttaaccgc at 22 <210> 4
<211> 20
<212>ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 4
cccaacctgc aaccttcctc 20 <210> 5
<211> 22
<212>ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 5
tgtcaatctc catcacttca aa 22 <210> 6
<211> 20
<212>ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 6
tcctccacca gttgtgacat 20 <210>7
<211> 21
<212>ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador
<400>7
gtgggtggtg aagtccaatc t 21 <210>8
<211> 21
<212>ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 8
agagggtctg gctgtcttga a 21 <210>9
<211> 22
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 9
tactcctgcg tcttcctcaa ca 22 <210> 10
<211> 21
<212>ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 10
ctccccctcg ttgatgtgtt c 21 <210> 11
<211> 21
<212>ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 11
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<211> 24
<212>ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 12
cctccagcaa cctcttgtcc tctc 24 <210> 13
<211> 21
<212>ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 13
cttcccagat ggagactatc a 21 <210> 14
<211> 21
<212>ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 14
aacaagacaa agatggcaag a 21 <210> 15
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 15
tgatagccgc atgacccttc t 21 <210> 16
<211> 20
<212>ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 16
acgatggaca agttgtccga 20 <210> 17
<211> 21
<212>ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 17
ttccctcctc agatcattgc t 21 <210> 18
<211> 21
<212>ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 18
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<211> 18
<212>ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 19
cggcatcgtc accaactg 18 <210> 20
<211> 19
<212>ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 20
tgcaaagaac acggctaag 19 <210> 21
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 21
ctctgcctga catgagggtt a 21 <210> 22
<211> 21
<212>ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 22
tcaccttcac cgttccagtt t 21 <210> 23
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<212>ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 23
tcctccttgg acgtgtacga t 21 <210> 24
<211> 21
<212>ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 24
ctcctctgcc gtgtagtttc g 21 <210> 25
<211> 21
<212>ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 25
ttatgccaga atcaggttag a 21 <210> 26
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<212>ADN
<213> Artificial
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<223> Cebador
<400> 26
gagagaagga atgtacggga g 21 <210> 27
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 27
caagccaccc aagtatcacc c 21 <210> 28
<211> 21
<212>ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 28
catcccgacc ttcctcctca t 21 <210> 29
<211> 20
<212>ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 29
aaagcctatt agagcaacgg 20 <210> 30
<211> 21
<212>ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador
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<211> 21
<212>ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 31
agagtccctt atccctatgc c 21 <210> 32
<211> 21
<212>ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 32
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<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 33
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<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 34
ggttgtcaag atggtcccta a 21 <210> 35
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<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador
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ggtaagatgg cacatggaca aaggc 25 <210> 36
<211> 22
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 36
ctgcggcgaa cctctgcttt ag 22 <210> 37
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<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 37
tcacagctgt tccagtttct 20 <210> 38
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<212>ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador
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agtgatggag attgacaagg 20 <210> 39
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<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador
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gactgggaca gttttgcttt ttcac 25 <210> 40
<211> 25
<212>ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 40
gtctccccct cgttgatgtg ttctg 25 <210> 41
<211> 21
<212>ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 41
catgggcttg gggaggaaga c 21 <210> 42
<211> 21
<212>ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 42
ggcacggcca acatccagct c 21

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento de cribado rápido por PCR múltiplex de grupos sanguíneos humanos poco comunes, en el que el procedimiento comprende las siguientes etapas:
A. preparar una muestra para analizar: construir un grupo con múltiples muestras de sangre, extrayendo respectivamente plantillas de ADN de las muestras de sangre que forman el grupo y mezclar las plantillas de ADN para obtener una muestra para analizar del grupo;
B. cribar un grupo positivo: utilizando las etapas i)-v) para realizar la detección por PCR múltiplex en la muestra a analizar del grupo obtenido en la etapa A, y cribar el grupo cuyo resultado de detección es positivo:
i) preparar un sistema de reacción PCR múltiplex: el sistema de reacción PCR múltiplex comprende pares múltiples de cebadores específicos, solución tampón de PCR, dNTP, enzima Taq y ddH2 O, y las secuencias de los pares múltiples de cebadores específicos son las SEQ ID NOs: 1-6, SEQ ID NOs: 7-12 o SEQ ID NOs: 13­ 16; los cebadores específicos son cebadores específicos para loci de SNP de antígeno de grupos sanguíneos poco comunes en genes que codifican antígeno de superficie de células sanguíneas;
ii) agregar la muestra a analizar preparada por el procedimiento de recolección de muestras de sangre y extracción de plantillas de ADN para el sistema de reacción PCR múltiplex preparado en la etapa i), para obtener una solución de reacción PCR;
iii) realizar una reacción de amplificación en la solución de reacción PCR en la etapa ii) de acuerdo con un procedimiento de amplificación por PCR múltiplex;
iv) realizar electroforesis en productos de amplificación obtenidos de la reacción de amplificación en la etapa iii) en gel de agarosa, y observar los resultados de electroforesis a través de un formador de imágenes en gel; y v) si la electroforesis muestra la aparición de una banda, el resultado de detección de un grupo sanguíneo poco común es positivo; y si la electroforesis no muestra banda, el resultado de detección del grupo sanguíneo poco común es negativo;
C. la detección y resolución de grupo positivo se selecciona de cualquiera de los siguientes:
a) si el número de muestras de sangre en el grupo cuyo resultado de detección es positivo es menor o igual a 5, se toman las plantillas de ADN de las muestras de sangre en el grupo como una muestra para analizar, respectivamente, utilizando las etapas i)-v) para realizar la detección por PCR múltiplex y cribar las muestras de sangre cuyo resultado de detección es positivo;
b) si el número de muestras de sangre en el grupo cuyo resultado de detección es positivo es mayor que 5, se resuelven las muestras de sangre del grupo cribado en la etapa B cuyo resultado de detección es positivo para formar dos nuevos grupos, mezclando respectivamente plantillas de ADN de las muestras de sangre de los dos grupos, para obtener muestras que se analizan de los dos grupos, y utilizando las etapas i)-v) para realizar la detección por PCR múltiplex, para cribar el grupo cuyo resultado de detección es positivo; y
D. repetir la etapa C.
2. El procedimiento de detección por PCR múltiplex como en la reivindicación 1, en el que en el sistema de reacción de PCR múltiplex en la etapa i), el sistema de reacción PCR múltiplex con una secuencia de cebador de las SEQ ID NOs: 1-6 es un sistema Yt-K-Kpc, que se utiliza en la detección de tres grupos sanguíneos poco comunes: Yt(b+), K y Kp(c+); el sistema de reacción PCR múltiplex con una secuencia de cebador de las SEQ ID NOs: 7-12 es un sistema Dia-OK-Cob, que se utiliza en la detección de tres grupos sanguíneos poco comunes: Di(a+), OK(a-) y Co(b+); y el sistema de reacción PCR múltiplex con una secuencia de cebador de las SEQ ID NOs: 13-16 es un sistema Fyb-S, que se utiliza en la detección de dos grupos sanguíneos poco comunes: Fy(b+) y S.
3. El procedimiento de detección por PCR múltiplex como en la reivindicación 1, en el que la etapa ii) es: agregar la muestra a analizar preparada mediante el procedimiento de recolectar muestras de sangre y extraer plantillas de ADN y un control positivo incorporado al sistema de reacción PCR múltiplex preparado en la etapa i) respectivamente, para obtener una solución de reacción PCR; la forma de juzgar un resultado de detección en la etapa v) es: si la electroforesis muestra que una banda emerge en una ubicación correspondiente a una banda de amplificación de control positivo, un resultado de detección de un grupo sanguíneo poco común es positivo; y si la electroforesis muestra que no emerge una banda en la ubicación correspondiente a la banda de amplificación de control positivo, el resultado de detección del grupo sanguíneo poco común es negativo.
4. El procedimiento de detección por PCR múltiplex como en la reivindicación 3, en el que el control positivo es un plásmido que contiene un fragmento de gen que incluye loci de SNP de grupos sanguíneos poco comunes, y el control positivo puede ser amplificado por un par de cebadores específicos en los pares múltiples de cebadores específicos con una secuencia de las s Eq ID NOs: 1-16.
5. El procedimiento de detección por PCR múltiplex como en la reivindicación 1, en el que el sistema de reacción PCR múltiplex en la etapa i) adicionalmente comprende cebadores de control interno; y la forma de juzgar un resultado de detección en la etapa v) es: si la electroforesis muestra que emerge una banda de un grupo sanguíneo poco común y una banda de control interno, el resultado de detección de un grupo sanguíneo poco común es positivo; si la electroforesis muestra que solo emerge una banda de control interno, el resultado de detección del grupo sanguíneo poco común es negativo; y si la electroforesis no muestra banda, la detección falla.
6. El procedimiento de detección por PCR múltiplex como en la reivindicación 5, en el que, para el sistema de reacción PCR múltiplex con las secuencias de cebadores el específicos de las SEQ ID NOs: 1-6, las secuencias de los cebadores de control interno de los mismos son las SEQ ID NOs: 17-18; para el sistema de reacción PCR múltiplex con las secuencias de cebadores específicos de las SEQ ID NOs: 7-12, las secuencias de los cebadores de control interno de los mismos son las SEQ ID NOs: 19-20; y para el sistema de reacción PCR múltiplex con las secuencias de cebadores específicos de las SEQ ID NOs: 13-16, las secuencias de los cebadores de control interno de las mismas son las SEQ ID NOs: 21-22.
7. El procedimiento de detección por PCR múltiplex como en la reivindicación 1, en el que el procedimiento de amplificación por PCR múltiplex del sistema de reacción PCR múltiplex con las secuencias de cebadores específicos de las SEQ iD NOs: 1-6 es: desnaturalización a 94 °C, 5min, 94 °C 30s, 61 °C 30s, 72 °C 45s, un total de 5 ciclos, y 94 °C 30s, 58 °C 30s, 72 °C 45s, un total de 30 ciclos; extensión a 72 °C 7min; el procedimiento de amplificación por PCR múltiplex del sistema de reacción PCR múltiplex con las secuencias de cebadores específicos de las SEQ ID NOs: 7-12 es: desnaturalización a 94 °C 5 min, 94 °C 30 s, 60 °C 30 s, 72 °C 45 s, un total de 35 ciclos; extensión a 72 °C 7 min; y el procedimiento de amplificación por PCR múltiplex del sistema de reacción PCR múltiplex con las secuencias de cebadores específicos de las SEQ ID NOs: 13-16 es: desnaturalización a 94 °C 5 min, 94 °C 30 s, 58 °C 30 s, 72 °C 45 s, un total de 35 ciclos; extensión a 72 °C 7min.
8. El cribado de detección rápida por PCR múltiplex de grupos sanguíneos humanos poco comunes como en la reivindicación 1, en el que múltiples muestras de sangre significa que el número de las muestras de sangre es 5-12.
9. Uso de un kit de detección por PCR múltiplex de grupos sanguíneos humanos poco comunes en un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el kit comprende pares múltiples de cebadores específicos, en el que los cebadores específicos son cebadores específicos para loci de SNP de antígeno de grupo sanguíneo poco común en genes de antígeno de superficie de células sanguíneas, y en el que las secuencias de los pares múltiples de cebadores específicos son las SEQ ID NOs: 1-6 y/o las SEQ ID NOs: 7-12 y/o las SEQ ID NOs: 13-16.
10. El uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el kit comprende además uno o más de una solución tampón de PCR, dNTP, enzima Taq y ddH2O.
11. El uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el kit comprende además cebadores de control interno, y si las secuencias de los pares múltiples de cebadores específicos son las SEQ ID NOs: 1-6, las secuencias de los cebadores de control interno correspondientes a los mismos son las SEQ ID NOs: 17-18; si las secuencias de los pares múltiples de cebadores específicos son las SEQ ID NOs: 7-12, las secuencias de los cebadores de control interno correspondientes a los mismos son las SEQ ID NOs: 19-20; y si las secuencias de los pares múltiples de cebadores específicos son las SEQ ID NOs: 13-16, las secuencias de los cebadores de control interno correspondientes a los mismos son las SEQ ID NOs: 21-22.
12. El uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el kit comprende además un control positivo.
13. El uso de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el control positivo es un plásmido que contiene un fragmento de gen que incluye loci de SNP de grupos sanguíneos poco comunes, y el control positivo puede ser amplificado por un par de cebadores específicos en los pares múltiples de cebadores específicos con secuencias de las SEQ ID NO: 1-16.
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