ES2738512T3

ES2738512T3 - Formulación farmacéutica para tratar cáncer de páncreas

Info

Publication number: ES2738512T3
Application number: ES14196593T
Authority: ES
Inventors: Tzyy-Wen Chiou; Horng-Jyh Harn; Shinn-Zong Lin; Yi-Wen Chou; Mao-Hsuan Huang
Original assignee: China Medical University
Current assignee: China Medical University
Priority date: 2014-06-04
Filing date: 2014-12-05
Publication date: 2020-01-23
Anticipated expiration: 2034-12-05
Also published as: EP2952184A1; JP5952890B2; US9872912B2; US20150352213A1; CN105267205B; CN105267205A; TWI522099B; JP2015229675A; EP2952184B1; TW201545744A

Abstract

Una formulación farmacéutica para su uso en el tratamiento de cáncer de páncreas, que comprende (Z)- butilidenftalida y que está sustancialmente desprovista de (E)-butilidenftalida.

Description

DESCRIPCIÓN

Formulación farmacéutica para tratar cáncer de páncreas

Antecedentes de la invención

Campo de la invención

La presente invención se refiere a los usos de una formulación farmacéutica, que comprende (Z)-butilidenftalida, especialmente a los usos de la formulación farmacéutica en el tratamiento de cáncer de páncreas.

Descripciones de la técnica relacionada

El páncreas es una glándula alargada, blanda situada en la parte posterior de la cavidad abdominal de un organismo vivo. En general, el páncreas de un ser humano tiene una longitud comprendida entre aproximadamente 15 cm y 20 cm, un ancho de aproximadamente 2,5 cm y un peso comprendido entre aproximadamente 75 gramos y 100 gramos. "Cáncer de páncreas" se refiere a un tumor maligno que se genera desde las células pancreáticas. Los adenocarcinomas ductales representan el 90 % de los cánceres de páncreas, en los que aproximadamente un 80 % se produce dentro de la cabeza de la glándula pancreática.

El cáncer de páncreas suele aparecer en las personas mayores y la tasa de incidencia en los hombres es el doble de alta que en las mujeres. El cáncer de páncreas en su inicio no suele presentar síntomas evidentes, pero a medida que crecen los tumores pancreáticos de forma gradual, los pacientes presentan síntomas de dolor abdominal, dolor de espalda, ictericia, pérdida de peso y diarrea. Por otra parte, el cáncer de páncreas típico presenta fibrosis y adhesión al tejido circundante. Dado que las células del cáncer de páncreas penetran frecuentemente en los nervios periféricos y/o invaden los vasos sanguíneos, casi un 90 % de los cánceres de páncreas no se puede tratar por cirugía. El cáncer de páncreas tiene un mal pronóstico y la tasa de supervivencia de cinco años es inferior a 5 %. La terapia clínica actual para el cáncer de páncreas incluye cirugía, quimioterapia y radioterapia, etc., En general, cuando el estado de un paciente de cáncer de páncreas lo permite, la cirugía es el tratamiento de primera línea para aumentar el índice de supervivencia. En cuanto a la quimioterapia, puede seleccionarse un solo medicamento, como los medicamentos anti-metabolitos 5-fluorouracil (5-FU) y gemcitabina, o una combinación de varios medicamentos, sobre la base del estado clínico del cáncer de páncreas. Sin embargo, la eficacia terapéutica de la quimioterapia es baja. La quimioterapia tradicional es prácticamente ineficaz en el caso de recurrencia de cáncer de páncreas. La radioterapia suele utilizarse como terapia adyuvante durante el tratamiento de cáncer de páncreas, ya que esta terapia no puede curar un tumor pancreático no resecable. Por lo tanto, sigue siendo necesario un medicamento para tratar cáncer de páncreas.

Los autores de la presente invención han observado que Z-butilidenftalida (Z-BP) puede inhibir el crecimiento de células de cáncer de páncreas y que, por tanto, puede utilizarse para tratar cáncer de páncreas. En particular, es posible implantar una forma de dosificación de liberación controlada que contiene Z-butilidenftalida en el área invadida por células de cáncer de páncreas tras la cirugía y conseguir una alta dosis localmente estable de Z-butilidenftalida. Como resultado, puede penetrar Z-butilidenftalida en el tejido pancreático circundante para eliminar las “células de cáncer residuales invasivas” y conseguir el efecto terapéutico deseado.

La patente europea EP2343051 desvela formulaciones farmacéuticas que contienen Z-butilidenftalida y un polímero para el tratamiento del cáncer, pero no cáncer de páncreas.

Sumario de la invención

Un objetivo de la presente invención es proporcionar una formulación farmacéutica para tratar cáncer de páncreas, en la que la formulación farmacéutica comprende (Z)-butilidenftalida y está sustancialmente desprovista de (E)-butilidenftalida. Preferentemente, en la formulación farmacéutica, se incluye (Z)-butilidenftalida en una formulación farmacéutica de matriz de polímero biocompatible, en una forma de dosis de liberación controlada.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar el uso de una formulación farmacéutica en la fabricación de un medicamento, en el que el medicamento se utiliza para tratar cáncer de páncreas. La formulación farmacéutica comprende (Z)-butilidenftalida y está sustancialmente desprovista de (E)-butilidenftalida. Preferentemente, en la formulación farmacéutica, se incluye (Z)-butilidenftalida en una matriz de polímero biocompatible para proporcionar un medicamento en una forma de dosis de liberación controlada.

Otro objetivo más de la presente invención es proporcionar un procedimiento para tratar cáncer de páncreas en un paciente que comprende administrar al paciente que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de una formulación farmacéutica, en la que la formulación farmacéutica comprende (Z)-butilidenftalida y está sustancialmente desprovista de (E)-butilidenftalida. Preferentemente, se incluye en la formulación farmacéutica, (Z)-butilidenftalida en una matriz de polímero biocompatible de modo que se utiliza la formulación farmacéutica en una forma de dosificación de liberación controlada.

En los siguientes párrafos se presenta la tecnología detallada y las realizaciones preferentes implementadas para la presente invención a fin de que las personas expertas en la materia puedan apreciar las características de la invención reivindicada.

Breve descripción de los dibujos

Fig. 1A es un diagrama de barras en el que se presenta el efecto de (E)-butilidenftalida en la tasa de supervivencia de una línea de células de cáncer de páncreas;

Fig. 1B es un diagrama de barras en el que se muestra el efecto de (Z)-butilidenftalida en la tasa de supervivencia celular de una línea de células de cáncer páncreas;

Fig. 2 es un diagrama de flujo de la preparación de un copolímero p(CPP-SA);

Fig. 3 muestra imágenes de dos obleas de p(CPP-SA)-Z-BP, en las que la concentración de Z-BP en la de la izquierda es 0 % y la de la derecha es 17,5 %;

Fig. 4 es un diagrama de curvas de la absorbancia que muestra la liberación continua y lenta de obleas de p(CPP-SA)-ZBP desde 0 a 25 días;

Fig. 5A es un diagrama de barras en el que se muestra el efecto de p(CPPSA)-Z-BP en la reducción de la tasa de supervivencia de células PACA-2;

Fig. 5B muestra imágenes en las que se ilustra el efecto de p(CPP-SA)-Z-BP en la inducción de apoptosis de células PACA-2;

Fig. 6A muestra electroforegramas que ilustran el aumento de los niveles de expresión de genes relacionados con apoptosis en líneas celulares de cáncer de páncreas en diferentes momentos después de haber tratado con ZBP líneas celulares de cáncer de páncreas;

Fig. 6B muestra electroforegramas que ilustran el aumento de los niveles de expresión de genes relacionados con apoptosis en líneas celulares de cáncer de páncreas tratadas con Z-BP a diferentes concentraciones;

Fig. 7A muestra electroforegramas que ilustran el tratamiento de PACA-2 con micro ARN Nurr1 para inhibir el nivel de expresión de gen Nurr1 inducido por Z-BP;

Fig. 7B es un diagrama de barras que ilustra el tratamiento de PACA-2 con micro ARN Nurr1 para restaurar la tasa de supervivencia celular muertas mediante Z-BP;

Fig. 8A muestra electroforegramas que ilustran el efecto de Z-BP para aumentar los niveles de expresión de proteínas relacionadas con la ruta del gen Nur77 en células de cáncer de páncreas;

Fig. 8B muestra electroforegramas que ilustran el efecto de Z-BP en el aumento de los niveles de expresión de proteínas relacionadas con la ruta de apoptosis en células de cáncer de páncreas;

Fig. 9 es un diagrama de curvas que muestra el tamaño de un tumor pancreático en los ratones a los que se les implantó subcutáneamente p(CPP-SA)-Z-BP a diferentes concentraciones de Z-BP; y

Fig. 10 es un diagrama de curvas en el que se muestra el peso corporal de los ratones a los que se les implantó subcutáneamente p(CPP-SA)-Z-BP a diferentes concentraciones de Z-BP.

Descripción detallada de la invención

A continuación, se describen algunas realizaciones de la presente invención en detalle. Sin embargo, sin por ello alejarse del espíritu de la presente invención, la presente invención se puede compendiar en varias realizaciones y no deberá limitarse a las realizaciones descritas en la presente memoria descriptiva. Por otra parte, a no ser que se afirme de otro modo en el presente documento, las expresiones “un/a”, “el/la” o similares citadas en la memoria descriptiva de la presente invención (especialmente en las reivindicaciones) deberán incluir tanto la forma singular como la plural. Asimismo, el término “tratar” o “tratamiento” utilizados en la presente memoria descriptiva se refiere a la administración a un paciente que lo necesita de una cantidad terapéuticamente eficaz de una formulación farmacéutica en la que el paciente tiene un tumor o signos de tumor, padece de enfermedades o síntomas derivados del tumor o es susceptible de cáncer, para conseguir efectos de curación, mitigación, alivio, tratamiento o mejora del tumor, los signos de tumor, las enfermedades o síntomas derivados del tumor, o la susceptibilidad de contraer cáncer. La expresión “cantidad eficaz” empleada en la presente memoria descriptiva se refiere a la cantidad del compuesto que puede aliviar al menos parcialmente la afección que se esté tratando en un paciente sospechoso cuando se administra a dicho paciente. El término “paciente” utilizado en la presente memoria descriptiva se refiere a un mamífero, incluyendo animales humanos y no humanos. La expresión “mg/kg-peso corporal” utilizada en la presente memoria descriptiva se refiere a la dosificación (mg) requerida por kg de peso corporal. La expresión “forma de dosificación de liberación controlada” utilizada en la presente memoria descriptiva se refiere a una forma de dosis que puede liberar lentamente y continuamente el componente activo contenido en ella, después de ser administrada a un paciente. Dentro del significado de la presente invención “sustancialmente desprovisto de (E)-butilidenftalida" significa que la formulación farmacéutica comprende menos de 1 % en peso, preferentemente menos de 0,5 % en peso, más preferentemente menos de 0,05 % en peso y además, preferentemente, menos de 0,001 % en peso o menos de 0,0001 % en peso o 0,0 % en peso de (E)-butilidenftalida, en la que los % en peso se basan en el peso total de la formulación farmacéutica.

Butilidenftalida (BP) es un compuesto que se puede extraer de Angélica sinensis. Los autores de la presente invención han observado que en comparación con (E)-butilidenftalida, (Z)-butilidenftalida (es decir, el siguiente compuesto (I)) es significativamente eficaz en la inhibición del crecimiento de células de cáncer de páncreas y por lo tanto puede utilizarse para tratar cáncer de páncreas:

Por lo tanto, la presente invención proporciona una formulación farmacéutica que comprende (Z)-butilidenftalida y está sustancialmente desprovista de (E)-butilidenftalida. (Z)-butilidenftalida está disponible en el mercado (por ejemplo, se puede adquirir de ECHO CHEMICAL CO., LTD, TW) y puede extraerse de materiales naturales o separarse de un extracto en cloroformo de Angélica sinensis. (Z)-butilidenftalida derivado de la extracción y separación puede purificarse adicionalmente a través de técnicas como cromatografía de columna ultrarrápida, cromatografía de líquidos de alto rendimiento o un procedimiento de cristalización antes de su utilización.

Opcionalmente, la fórmula farmacéutica de la presente invención puede comprender una matriz de polímero biocompatible, en la que se incluye (Z)-butilidenftalida en la matriz de polímero de manera que se puede utilizar la formulación farmacéutica en una forma de dosificación de liberación controlada para proporcionar un efecto prolongado en el tratamiento de cáncer de páncreas. La matriz de polímero biocompatible adecuada para la presente invención es generalmente hidrófoba y tiene una capacidad de degradación apropiada. Preferentemente, la matriz de polímero biocompatible se selecciona del grupo que consiste en poli(ácido láctico-co-glicólico), quitosano, colágeno, un hidrogel, un polianhídrido y combinaciones de los mismos. Cuando se utiliza en una forma de dosificación de liberación controlada, la formulación farmacéutica de la presente invención puede liberar de forma lenta y continua (Z)-butilidenftalida al (los) tejido(s) adyacente(s) al sitio de administración de un paciente a lo largo de un período de tiempo prolongado (p.ej., en 20, 30, 35, 40, 50, 60 días) para conseguir los efectos de un tratamiento continuo de cáncer de páncreas.

En una realización de la presente invención, se incluyó (Z)-butilidenftalida en un polianhídrido para dar cabida a una forma de dosificación de liberación controlada. Preferentemente, el polianhídrido es un copolímero de los siguientes monómero (A) y monómero (B):

(A)

(B)

en la que m es un número entero que oscila entre 1 a 10 y n es un número entero que oscila entre 0 a 20, Preferentemente, m es un número entero que oscila entre 2 a 8 y n es un número entero que oscila entre 3 a 10, Por otra parte, preferentemente, los dos grupos carboxilo en los anillos de benceno del monómero (A) están simultáneamente en la posición orto, la posición meta o la posición para y, más preferentemente, en la posición para.

El monómero (A) puede ser uno o más de los siguientes, pero no se limita a ellos: bis(p-carboxi-fenoxi) etano, bis(ocarboxi-fenoxi) etano, bis(m-carboxi-fenoxi) etano, bis(p-carboxi-fenoxi) propano, bis(o-carboxi-fenoxi) propano, bis(m-carboxi-fenoxi) propano, bis(p-carboxi-fenoxi) butano, bis(o-carboxi-fenoxi) butano, bis(m-carboxi-fenoxi) butano, bis(p-carboxi-fenoxi) pentano, bis(o-carboxifenoxi) pentano, bis(m-carboxi-fenoxi) pentano, bis(p-carboxifenoxi) hexano, bis(o-carboxi-fenoxi) hexano, bis(m-carboxi-fenoxi) hexano, bis(p-carboxi-fenoxi) heptano, bis(ocarboxi-fenoxi) heptano, bis(m-carboxi-fenoxi) heptano, bis(p-carboxi-fenoxi) octano, bis(o-carboxi-fenoxi) octano y bis(m-carboxi-fenoxi) octano. Preferentemente, el monómero (A) es uno o más de los siguientes: bis(p-carboxifenoxi) etano, bis(p-carboxi-fenoxi) propano, bis(p-carboxi-fenoxi) butano, bis(p-carboxi-fenoxi) pentano, bis(p-carboxifenoxi) hexano, bis(p-carboxi-fenoxi) heptano y bis(p-carboxi-fenoxi) octano.

El monómero (B) adecuado para la presente invención puede ser uno o más de los siguientes, pero no se limita a ellos: ácido malónico, ácido succínico, ácido glutárico, ácido adípico, ácido pimélico, ácido subérico, ácido azelaico y ácido sebácico. En una realización de la presente invención, se utilizó ácido sebácico como monómero (B).

Preferentemente, en el polianhídrido que se utiliza como matriz de polímero biocompatible, la relación molar entre el monómero (A) y el monómero (B) es de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 1:10 y más preferentemente de aproximadamente 1:3 a aproximadamente 1:6. Asimismo, preferentemente, la matriz de polímero biocompatible es un copolímero de bloque del monómero (A) y monómero (B). En una realización de la presente invención, la matriz de polímero biocompatible es un polianhídrido, que es un copolímero de bloque proporcionado por bis(pcarboxifenoxi)propano y ácido sebácico en una relación molar de 1:4.

La matriz de polímero biocompatible que es adecuada para la formulación farmacéutica de la presente invención está disponible en el mercado o se puede preparar a través de procedimientos de síntesis conocidos en la técnica. Por ejemplo, para preparar un polianhídrido a partir de bis(p-carboxifenoxi) propan0 y ácido sebácico, se someten a reflujo por separado bis(p-carboxifenoxi)propano y ácido sebácico en anhídrido acético para obtener prepolímero de ácido sebácico y prepolímero de bis(p-carboxifenoxi)propano, respectivamente. A continuación, se copolimerizan los dos prepolímeros a través de un procedimiento de policondensación en fundido para proporcionar un copolímero de bloque (al que se hace referencia como “copolímero p (CPP-SA)"), que es un polianhídrido. Las etapas del procedimiento de policondensación en fundido pueden observarse en Domb y col., Journal of Polimer science, 1987, 25: 3373-3386.

En la formulación farmacéutica de la presente invención, podría ajustarse la relación entre (Z)-butilidenftalida en la formulación dependiendo de las necesidades en la práctica. Por ejemplo, la concentración de (Z)-butilidenftalida en la formulación farmacéutica puede oscilar entre aproximadamente 1 % en peso y aproximadamente 40 % en peso y, preferentemente, entre aproximadamente 2 % en peso y aproximadamente 30 % en peso.

De acuerdo con la presente invención, la formulación farmacéutica puede utilizarse para proporcionar un medicamento en cualquier forma de administración adecuada para su aplicación de cualquier modo adecuado. Por ejemplo, se puede fabricar la formulación farmacéutica en una forma como pueda ser una oblea, un polvo, una membrana, copos, un bastón, una micorpartícula, una nanopartícula, una pasta o un gel, si bien no se limita por ello. Por otra parte, es posible fabricar la formulación farmacéutica en una forma adecuada para su administración oral, implantación subcutánea, implante intersticial, implantación intra-pancreática, administración nasal o inyección intravenosa, etc.

Al utilizar la fabricación de un medicamento en una forma de dosificación adecuada para administración oral, por ejemplo, la formulación farmacéutica puede comprender un vehículo farmacéuticamente aceptable que no tenga ningún efecto adverso sobre la actividad deseada del componente activo, como pueda ser un disolvente, un disolvente oleoso, un diluyente, un estabilizante, un agente de demora de la absorción, un disgregante, un emulsionante, un antioxidante, un aglutinante, lubricantes y un absorbente de la humedad. La formulación farmacéutica puede prepararse como un medicamento en una forma de administración oral a través de cualquier procedimiento adecuado. Por ejemplo, se puede utilizar la formulación farmacéutica para fabricar un medicamento como un comprimido, una cápsula, un granulado, un polvo, un extracto fluido, una solución, un jarabe, una suspensión, una emulsión, una tintura, etc.

En cuanto a la fabricación de un medicamento en una forma de dosis adecuada para inyección subcutánea o inyección intravenosa, la formulación farmacéutica puede comprender uno o más componentes, como una solución isotónica, una solución de tampón salina (p.ej., un tampón de fosfato o un tampón de sal de ácido cítrico), un solubilizante, un emulsionante y otros vehículos para fabricar la formulación como una inyección intravenosa, una inyección intravenosa en emulsión, una inyección en polvo, una inyección en suspensión o una inyección en suspensión en polvo, etc.

Dependiendo de la forma y el fin, la formulación farmacéutica de la presente invención puede comprender uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables. Además de los vehículo(s), la formulación farmacéutica puede comprender adicionalmente otros aditivos, como un agente aromatizante, un revelador, un agente colorante, etc., para mejorar el gusto al paladar y el aspecto de la formulación resultante. Para mejorar la capacidad de almacenamiento del medicamento así proporcionado, la formulación puede comprender también una cantidad adecuada de un conservante, un agente de conservación, un antiséptico, un reactivo anti-fúngico, etc. Opcionalmente, la formulación farmacéutica de la presente invención puede comprender otro u otros componentes activos más, como un antioxidante (p.ej., vitamina E), fármacos quimioterapéuticos, moduladores inmunitarios, etc. para mejorar aún más la eficacia del medicamento proporcionado de este modo o para aumentar la flexibilidad de aplicación y adaptabilidad del medicamento, siempre y cuando los demás componentes activos no tengan un efecto adverso en la (Z)-butilidenftalida.

En el caso de que la formulación farmacéutica de la presente invención comprenda una matriz de polímero biocompatible, preferentemente, se fabrica la formulación farmacéutica como un medicamento en una forma de dosificación adecuada para implantación subcutánea, implante intersticial e implantación intra-pancreática (co0mo una oblea) de manera que la formulación farmacéutica pueda liberar lentamente (Z)-butilidenftalida al tejido adyacente al sitio de administración de un paciente una vez que se administra al paciente para conseguir una eficacia terapéutica a una dosis alta localmente estable. Como resultado, es posible implantar la formulación farmacéutica alrededor del tumor (p.ej., tumor pancreático) y liberar (Z)-butilidenftalida en el tejido adyacente al sitio de administración durante un período de tiempo determinado (p.ej., in 20, 30, 35, 40, 50, 60 días) para liberar de forma lenta y continua (Z)-butilidenftalida y conseguir así los efectos de un tratamiento prolongado de cáncer de páncreas y/o reducir la recurrencia de cáncer de páncreas.

Al utilizar la fabricación de un medicamento en una forma de dosificación adecuada para implantación subcutánea, implante intersticial e implantación intra-pancreática, por ejemplo, la formulación farmacéutica puede comprender un vehículo farmacéuticamente aceptable que no presente ninguna influencia adversa sobre la actividad del componente activo comprendido en ella, como pueda ser un excipiente, un estabilizante y un absorbente de la humedad, etc., para preparar un medicamento en una forma para implantación subcutánea, implante intersticial e implantación intra-pancreática, como una oblea, un comprimido, una cápsula, un granulado. En una realización de la presente invención, se mezcló (Z)-butilidenftalida con copolímero p(CPP-SA) para proporcionar una mezcla y, después, se disolvió la mezcla en diclorometano y se secó para formar un polvo. A continuación, se cargó el polvo seco en un molde y se comprimió a una ligera presión para formar un medicamento en forma de oblea para implantación subcutánea, implante intersticial e implantación intra-pancreática. Después de extirpar el tumor pancreático del paciente de cáncer de páncreas, se implantó la oblea (es decir, una formulación farmacéutica que comprende (Z)-butilidenftalida y copolímero p(CPP-SA) copolímero) en la región enferma del paciente, para tratar más a fondo el cáncer de páncreas y/o reducir la recurrencia del cáncer de páncreas. El procedimiento mencionado para preparar la oblea se ilustra con mayor detalle en los Ejemplos adjuntos y en Walter y col., Cancer Res. 1994, 54(8): 2207-12.

Dependiendo de los requisitos del paciente, se puede aplicar la formulación farmacéutica de la presente invención o el medicamento preparado mediante el uso de la formulación farmacéutica con diversas frecuencias de administración, como puedan ser una vez al día, varias veces al día o una vez cada pocos días, etc. Por ejemplo, cuando se administra a un paciente humano para tratar cáncer de páncreas, se administra la formulación farmacéutica en una cantidad comprendida entre aproximadamente 10 mg to aproximadamente 1000 mg as (Z)-butilidenftalida/kg-peso corporal al día y, preferentemente, entre aproximadamente 50 mg y aproximadamente 500 mg como (Z)-butilidenftalida/kg-peso corporal al día. Sin embargo, para pacientes con afecciones agudas, puede aumentarse la dosis de varias veces a varias decenas de veces, dependiendo de las necesidades en la práctica.

La presente invención proporciona asimismo un procedimiento para tratar cáncer de páncreas que comprende la administración al paciente que lo necesita de una cantidad terapéuticamente eficaz de una formulación farmacéutica, en la que la formulación farmacéutica comprende (Z)-butilidenftalida y está sustancialmente desprovista de (E)-butilidenftalida. Preferentemente, la formulación farmacéutica comprende además una matriz de polímero biocompatible y se incluye (Z)-butilidenftalida en la matriz de polímero biocompatible. Los componentes de la formulación farmacéutica y sus propiedades, así como la eficacia y la dosis de (Z)-butilidenftalida son como se ha descrito.

A continuación, se ilustra con más detalle la presente invención con ejemplos específicos. Sin embargo, los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la presente invención únicamente, y el ámbito de la presente invención no queda limitado por ello.

Ejemplo

[Ejemplo 1] Efectos de eliminación de (Z)-butilidenftalida en diferentes líneas celulares de cáncer de páncreas

Se utilizó MTT (bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,4difenil-tetrazolio) para determinar si la tasa de supervivencia de diferentes líneas celulares de cáncer de páncreas se alterarán al ser tratadas con (Z)-butilidenftalida. Se cultivaron líneas celulares de cáncer de páncreas humanas (3 x 10³células/pocillo), PANC-1 y PACA-2, en una placa de microcultivo de 96 pocillos durante toda la noche. Se añadieron diferentes concentraciones de (Z)-butilidenftalida (0 pg/ml, 10 pg/ml, 25 pg/ml, 50 pg/ml, 75 pg/ml o 100 pg/ml) o (E)-butilidenftalida (0 pg/ml, 50 pg/ml, 100 pg/ml, 200 pg/ml, 400 pg/ml o 800 pg/ml) o 50 pM gemcitabina (una medicina tradicional para tratar cáncer de páncreas, como grupo de control) a cada uno de los pocillos de la placa de cultivo de 96 pocillos a lo largo de la pared interior y se cultivaron durante 24 horas. Se extrajo el medio y a continuación, se añadió un medio que contenía 500 pg/ml de MTT (200 pl) y se cultivó durante 4 horas. Se extrajo el medio y a continuación, se añadieron 200 pl de DMSO a la placa. Se midió la absorbancia de la muestra en cada uno de los pocillos con un espectrofotómetro a 570 nm de longitud de onda. Se calcularon los datos para determinar la tasa de supervivencia y la IC⁵⁰(concentración del 50 % de inhibición) de cada línea celular de cáncer de páncreas tratada con (Z)-butilidenftalida y (E)-butilidenftalida. En la Figura 1A se muestran los resultados ((E)-butilidenftalida) y en la Figura 1B ((Z)-butilidenftalida).

Tal como se muestra en las Figuras 1A y 1B, la IC⁵⁰de (E)-butilidenftalida fue aproximadamente 257,1 pg/ml (aproximadamente 1367 pM) para PANC-1 y aproximadamente 162,5 pg/ml (aproximadamente 864,5 pM) para PACA-2. La IC⁵⁰de (Z)-butilidenftalida fue aproximadamente 45 |jg/ml (aproximadamente 234 j M) para PANC-1 y aproximadamente 25 jg/ml (aproximadamente 133 ^jM) para PACA-2. Estos datos experimentales demuestran que la IC⁵⁰de (Z)-butilidenftalida para las líneas celulares de cáncer de páncreas fue bastante menor a la de (E)-butilidenftalida.

[Ejemplo 2] Preparación de forma de dosificación de liberación controlada que contiene Z-butilidenftalida (1) Preparación de prepolímero SA

Se recristalizó ácido sebácico (SA) dos veces en etanol. Se añadieron 2,7 g de monómero de ácido sebácico en 60 ml de anhídrido acético y se sometió a reflujo al vacío (10-4 torr) a entre 135 °C y 140 °C durante 30 minutos. A continuación, se eliminó el anhídrido acético sin reaccionar para obtener un prepolímero SA. Se secó el prepolímero SA al vacío a 60 °C y después se disolvió en tolueno seco. Se mezcló la solución obtenida en una mezcla de éter absoluto y éter de petróleo (1:1 vol/vol) en una relación de 1:10 en volumen y se dejó en reposo durante toda la noche para hacer precipitar el prepolímero SA (10:1 vol/vol). A continuación, se eliminaron el éter absoluto y el éter de petróleo y se secó el prepolímero SA al vacío.

(2) Preparación de prepolímero CPP

Se mezclaron 3 g bis(p-carboxifenoxi)propano (CPP) y 50 ml de anhídrido acético y se sometieron a reflujo al vacío (10-4 torr) a 150 °C durante 30 minutos y se enfrió. A continuación, se filtró la mezcla. Se concentró el filtrado eliminado el anhídrido acético sin reaccionar. A continuación, se llevó a cabo la cristalización a 0 °C para obtener el prepolímero CPP. Se eliminó el anhídrido acético sin reaccionar para obtener prepolímero CPP. Se lavó el prepolímero CPP con éter y se secó al vacío. A continuación, se añadieron sucesivamente dimetilformamida y éter absoluto (la relación de volumen entre dimetilformamida y éter absoluto es 1:9) al prepolímero CPP. Al cabo de 12 horas, se eliminaron dimetilformamida y éter. Se secó el prepolímero cristalino de CPP obtenido al vacío.

(3) Preparación de copolímero p(CPP-SA)

Se cargó prepolímero CPP y prepolímero SA (con una relación molar de 20:80) en un tubo de vidrio (2 x 20 cm), se calentó a 180 °C en un baño de aceite durante 1 minuto y a continuación, se redujo la presión a 10-4 mm Hg. En el proceso de polimerización, se eliminó el vacío cada 15 minutos. Se limpió el tubo con diclorometano y a continuación, se añadió éter de petróleo para hacer precipitar prepolímero CPP y copolímero de prepolímero SA (al que se hace referencia como “copolímero p(CPP-SA) copolímero"). A continuación, se lavó el copolímero p(CPP-SA) con éter anhidro. El proceso de preparación mencionado fue tal como se muestra en la Figura 2.

Se analizaron las características del copolímero p(CPP-SA) obtenido por espectroscopia de infrarrojo (IR) y espectroscopia de resonancia magnética nuclear (1H NMR) (no se muestran los datos). Los resultados experimentales demuestran que hay una señal de un enlace anhídrido que se puede observar a 1812,76 cm^{' 1}. En el espectro de 1H RMN del copolímero p(CPP-SA), se puede observar la señal característica de la porción aromática de CPP a entre 6,9 ppm y 8,2 ppm y se puede observar la señal característica de la porción metileno de SA a 1,3 ppm. Por otra parte, de acuerdo con la intensidad del pico de CPP y SA en el espectro ¹H RMN, la relación molar entre CPP y SA en el copolímero p(CPP-SA) se determinó como de aproximadamente 1:4 a aproximadamente 1:5. (4) Preparación de formulación farmacéutica de p(CPP-SA)-Z-BP

Se mezcló (Z)-butilidenftalida (ECHO CHEMICAL CO., LTD, TW) con el copolímero p(CPP-SA) en una relación en peso de aproximadamente 0 % en peso, 17,5 % en peso, 25 % en peso. Se disolvió la mezcla en cloruro de metileno a una concentración de 10 % (peso/volumen). Se secó la solución al vacío durante 72 horas para obtener un polvo seco. Se comprimió el polvo seco a una presión ligera (Carver Press) de 13,78 bar (200 psi) utilizando un molde de acero inoxidable (con un diámetro interno de 13 mm) para formar una oblea (100 mg/oblea). La oblea comprende la formulación farmacéutica que comprende (Z)-butilidenftalida y copolímero p(CPP-SA), al que se hace referencia a continuación en el siguiente documento como "p(CPP-SA)-Z-BP. En la Figura 3 se muestra el aspecto de la oblea.

[Ejemplo 3] Prueba de cinética de liberación de fármaco de formulación farmacéutica p(CPPSA)-Z-BP Se añadió la oblea p(CPP-SA)-Z-BP (que comprende 17,5 % Z-BP o 25 % Z-BP) preparada en el Ejemplo 2 a un vial de centelleo que contenía 1,0 ml de solución salina tamponada con fosfato (0,1 mM, pH 7,4) y 1,0 ml de n-octanol y se incubó a 37 °C. Se reemplazó la solución por una solución de tampón nueva en diferentes puntos temporales y se midió la absorbancia de la solución a 310 nm utilizando un espectrofotómetro para medir la concentración de (Z)-butilidenftalida en el tampón. El procedimiento mencionado está descrito por Weingart y col., Int. J. Cancer. 1995, 62(5): 605-9.

Tal como se muestra en la Figura 4, la oblea p(CPP-SA)-Z-BP puede liberar de forma lenta y continua el componente activo contenido en ella durante 0 a 144 horas. Estos datos demuestran que se puede utilizar p(CPP-SA)-Z-BP como forma de dosificación de liberación controlada que contiene (Z)-butilidenftalida. Por lo tanto, cuando se implanta p(CPP-SA)-Z-BP en un paciente, se puede liberar Z-butilidenftalida de forma lenta y continua al tejido pancreático circundante y por tanto se puede conseguir un efecto terapéutico continuo.

[Ejemplo 4] Experimento celular: Efecto citotóxico de formulación farmacéutica de p(CPP-SA)-Z-BP

Se cultivaron líneas celulares de cáncer de páncreas, PACA-2, con p(CPP-SA)-Z-BP que comprendía 0 % en peso (como grupo de control), 17,5 % en peso o 25 % en peso (Z)-butilidenftalida, respectivamente durante 24 horas y, a continuación, se observaron la morfología de célula de tumor y la tasa de supervivencia celular.

Tal como se muestra en la Figura 5A, en comparación con el grupo de control (es decir., p(CPP-SA) sin (Z)-butilidenftalida), p(CPP-SA)-Z-BP que comprendía 17,5% en peso o 25% en peso de (Z)-butilidenftalida puede reducir eficazmente la tasa de supervivencia de la línea celular de PACA-2. Tal como se muestra en la Figura 5B, el tratamiento con p(CPP-SA)-Z-BP que comprendía 17,5% en peso o 25% en peso de (Z)-butilidenftalida causó la apoptosis de la línea celular PACA-2. Los datos experimentales mencionados demuestran que la formulación farmacéutica de p(CPP-SA)-Z-BP de la presente invención puede inhibir eficazmente el crecimiento de células de cáncer de páncreas.

[Ejemplo 5] Experimento celular: apoptosis inducida porZ-BP

(1) Análisis del nivel de expresión de ARNm

Se sabe que la expresión regulada al alza del receptor orfano-1 (NOR-1), Nurr1, Nur77 está relacionada con apoptosis. En este experimento, se trataron líneas celulares de cáncer de páncreas, PANC-1 y PACA-2, con 100 |jg/ml de Z-BP durante 0, 1, 3, 6 o 24 horas y después se analizaron por reacción en cadena de la transcriptasapolimerasa inversa (RTPCR) (Figura 6A) para analizar los efectos de Z-BP sobre lo niveles de expresión de gen de NOR-1, Nurr1 y Nur77 en la línea celular de cáncer de páncreas. Por otra parte, se trataron líneas celulares de cáncer de páncreas, PANC-1 y PACA-2, con diferentes concentraciones de Z-BP durante 3 horas y después, se analizaron por RT-PCR (Figura 6B). Se utilizó gliceraldehído 3-fosfato dehidrogenasa (GAPDH) como grupo de control.

Tal como se muestra en la Figura 6A, tras el tratamiento de líneas celulares de cáncer de páncreas PANC-1 y PACA-2 con ZBP durante 1 a 3 horas, aumentaron los niveles de expresión de ARNm de NOR1 y Nurr1 en la línea celular de cáncer de páncreas. Tal como se muestra en la Figura 6B, después del tratamiento de las líneas celulares de cáncer de páncreas, PANC-1 y PACA-2 con diferentes concentraciones de Z-BP durante 3 horas, aumentaron los niveles de expresión de ARNm de Nurr1 en la línea celular de cáncer de páncreas. Estos resultados demuestran que la expresión regulada al alza de Nurr1 puede estar causada por la apoptosis inducida por Z-BP.

(2) Prueba de interferencia de micro ARN

Se inhibió la expresión de ARN de Nurr1 en la línea celular de cáncer de páncreas humano, PACA-2, a través de tecnología de interferencia de micro ARN. Se trataron las células con 133 jM Z-BP. A continuación, se analizaron las células por RT-PCR para detectar los cambios en la expresión de ARN Nurr1 en las células. Tal como muestran los resultados en la Figura 7A, cuando se trataron las células PACA-2 con 50 nM de micro ARN Nurr1, se inhibió aproximadamente 50 % de Nurr1 inducido por Z-BP. Estos resultados demuestran que el tratamiento con Z-BP puede aumentar de hecho la expresión de Nurr1.

Por otra parte, se trató una línea celular de cáncer de páncreas, PACA-2, con 10 nM o 50 nM de micro ARN Nurr1 y después se trató con 133 jM de Z-BP. A continuación, se observó la tasa de supervivencia celular utilizando el mismo procedimiento que el descrito en el Ejemplo 4. Tal como se muestra en la Figura 7B, después de tratar células PACA-2 con 50 nM de micro ARN Nurr1, se puede restaurar la tasa de supervivencia celular inhibida por Z-BP. Estos resultados demostraron que el tratamiento con Z-BP reduce la tasa de supervivencia celular de células PACA-2.

(3) Prueba de transferencia Western

Se trató una línea celular de cáncer de páncreas humano, PACA-2, con Z-BP durante 0, 30, 60, 120 o 180 minutos y a continuación, se analizaron los niveles de expresión de proteínas relacionadas con la ruta del gen Nur77 por transferencia de Western, incluyendo Pan-PKC, AKT, ERK y JNK (Figura 8A). Por otra parte, se analizaron también los niveles de expresión de proteínas relacionadas con apoptosis, incluyendo poli(ADP-ribosa) polimerasa (PARP), poli(ADPribosa) polimerasa (cPARP) escindida, caspasa-3 (Figura 8B). Se utilizó p-actina como grupo de control. Tal como se muestra en la Figura 8A, después de tratar las células PACA-2 con Z-BP durante 180 minutos, aumentaron los niveles de expresión de fosfo-JNK (Pi-SAPK/JNK) y fosfoAKT (Pi-AKT) en las células PACA-2 lo cual demuestra que el tratamiento con Z-BP puede aumentar los niveles de expresión de las proteínas relacionadas con la ruta del gen Nur77. Tal como se muestra en la Figura 8B, después de que las células PACA-2 fueran tratadas con Z-BP durante 24 horas o 48 horas, aumentaron los niveles de expresión de caspasa-3, PARP y cPARP en las células PACA-2, lo cual demuestra que el tratamiento con Z-BP puede aumentar los niveles de expresión de las proteínas relacionadas con apoptosis.

[Ejemplo 6] Experimentos con animales: p(CPP-SA)-Z-BP reduce el tamaño de tumores pancreáticos en ratones

Se trataron ratones desnudos (6 ratones/grupo) con implantes subcutáneos en la espalda que incluían células PACA-2 (1 x 106 células). A continuación, se implantaron p(CPP-SA)-Z-BP que comprendía 0 % (grupo de control), 17,5% o 25% Z-BP en los ratones a través de la región en la que se había implantado células PACA-2. A continuación, se midió el tamaño del tumor en cada ratón mediante un calibrador y se midió el peso corporal de cada ratón. Se calculó el volumen de tumor a través de la fórmula de longitud x altura x ancho x 0,5236 (L x H x W x 0,5236) (milímetros cúbicos). En las Figuras 9 y 10, se muestran los resultados.

Tal como se muestra en la Figura 9, el tamaño relativo de los tumores pancreáticos en los ratones en el grupo de control (los ratones tratados con p(CPP-SA)-Z-BP sin Z-BP) se extendió rápidamente a más de 1000 al cabo de 30 días desde el comienzo del experimento; en cambio, el tamaño relativo de los tumores pancreáticos en los ratones en el grupo del experimento (ratones tratados con p(CPP-SA)-Z-BP que comprendía 17,5% o 25% de Z-BP) fue aproximadamente 200. Tal como se muestra en la Figura 10, no hubo ningún cambio significativo en el peso corporal de los ratones en cada grupo. Estos resultados experimentales demuestran que el tratamiento con p(CPP-SA)-Z-BP puede inhibir eficazmente el crecimiento de tumores pancreáticos en ratones.

Los resultados experimentales anteriores demuestran que la formulación farmacéutica que comprende (Z)-butilidenftalida de la presente invención pueden inhibir eficazmente el crecimiento de células de cáncer de páncreas y, por tanto, pueden utilizarse para tratar cáncer de páncreas. Por otra parte, la formulación farmacéutica de la presente invención puede comprender además un polímero biocompatible hidrófobo para formar una forma de dosificación de liberación controlada y proporcionar así un efecto de tratamiento lento y continuo sobre el cáncer de páncreas.

Los ejemplos expuestos sirven para ilustrar el principio y la eficacia de la presente invención, pero no se utilizan para limitar la presente invención. Las personas expertas en la materia pueden introducir diversas modificaciones y sustituciones sobre la base de las divulgaciones e indicaciones de la invención, tal como se describen, sin por ello alejarse del principio técnico ni el espíritu de la misma. Por lo tanto, el ámbito de protección de la presente invención es el que se define en las reivindicaciones adjuntas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una formulación farmacéutica para su uso en el tratamiento de cáncer de páncreas, que comprende (Z)-butilidenftalida y que está sustancialmente desprovista de (E)-butilidenftalida.

2. La formulación farmacéutica para el uso de la reivindicación 1, que comprende además una matriz de polímero biocompatible, en la que se incluye (Z)-butilidenftalida en la matriz.

3. La formulación farmacéutica para el uso de la reivindicación 2, en la que la matriz de polímero biocompatible se selecciona del grupo que consiste en poli(ácido láctico-co-glicólico), quitosano, colágeno, un hidrogel, un polianhídrido y combinaciones de los mismos.

4. La formulación farmacéutica para el uso de la reivindicación 2, en la que la matriz de polímero biocompatible es un polianhídrido.

5. La formulación farmacéutica para el uso de la reivindicación 4, en la que el polianhídrido es un copolímero de monómero (A) y monómero (B):

en los que,

m es un número entero que oscila entre 1 y 10, y

n es un número entero que oscila entre 0 y 20.

6. La formulación farmacéutica para el uso de la reivindicación 5, en la que m es un número entero que oscila entre 2 y 8, y n es un número entero que oscila entre 3 y 10.

7. La formulación farmacéutica para el uso de la reivindicación 5, en la que el polianhídrido es un copolímero de bloque de monómero (A) y monómero (B).

8. La formulación farmacéutica para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en la que el monómero (A) es bis(p-carboxi-fenoxi)propano y el monómero (B) es ácido sebácico.

9. La formulación farmacéutica para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en la que la relación molar entre el monómero (A) y el monómero (B) oscila entre aproximadamente 1:2 y aproximadamente 1:10.

10. La formulación farmacéutica para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en la que la relación molar entre el monómero (A) y monómero (B) oscila entre aproximadamente 1:3 y aproximadamente 1:6.

11. La formulación farmacéutica para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que la concentración de (Z)-butilidenftalida en la formulación farmacéutica es de aproximadamente 1 % en peso a aproximadamente 40 % en peso.

12. La formulación farmacéutica para el uso de la reivindicación 11, en la que la concentración de (Z)-butilidenftalida es de aproximadamente 2 % en peso a aproximadamente 30 % en peso.

13. La formulación farmacéutica para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que la formulación farmacéutica está en forma de una oblea.

14. La formulación farmacéutica para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en la que la formulación farmacéutica se administra a través de al menos uno entre implantación subcutánea, implante intersticial e implantación intrapancreática.

15. La formulación farmacéutica para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la que se administra la formulación farmacéutica en una cantidad que oscila entre aproximadamente 50 mg (como (Z)-butilidenftalida)/kg-peso corporal y aproximadamente 500 mg (como (Z)-butilidenftalida)/kg-peso corporal al día.