ES2734884T3 - Composición de núcleo aniónico para suministro de agentes terapéuticos y métodos de preparación y uso de la misma - Google Patents

Composición de núcleo aniónico para suministro de agentes terapéuticos y métodos de preparación y uso de la misma Download PDF

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Abstract

Una composición que comprende: una cadena principal polimérica que comprende polilisina, poliornitina, poliarginina, poliglutamato, poliaspartato, policisteína, poliserina, politreonina, politirosina, heparina, sulfato de condroitina, sulfato de dermatano, sulfato de heparano, sulfato de queratano, carragenina, pectina, fucoidano o dextrano; múltiples cadenas protectoras, en donde cada cadena protectora comprende poli(etilenglicol) y está unida covalentemente con la cadena principal polimérica por un enlace simple; un miembro de grupo o grupos aniónicos seleccionado del grupo que consiste en sulfato, sulfonato, fosfato y carboxilo, estando dicho grupo aniónico unido covalentemente mediante un enlace químico simple con una unidad monomérica de la cadena principal polimérica; y una molécula de carga unida directamente mediante interacción iónica con el grupo aniónico sin ion metálico intermediario; en donde la molécula de carga i) comprende un péptido penetrante celular; ii) comprende un dominio de unión aniónico; o iii) tiene un punto isoeléctrico mayor de 7,3.

Description

DESCRIPCIÓN
Composición de núcleo aniónico para suministro de agentes terapéuticos y métodos de preparación y uso de la misma
Referencia cruzada
La presente solicitud reivindica beneficio de prioridad de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos 61/240857 presentada el 9 de septiembre de 2009 y la Solicitud Provisional de los Estados Unidos 61/241004 presentada el 9 de septiembre de 2009.
Declaración con respecto a investigación patrocinada por la Adm inistración federal
La presente invención se realizó con el apoyo del gobierno de los Estados Unidos según el número de contrato 1 R43 AI078539 por el Instituto Nacional de Envejecimiento y Enfermedades Infecciosas (NIAID) y 1R43DK084724 por el Instituto Nacional de la Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales (NIDDK). La Administración de los Estados Unidos puede tener ciertos derechos en la materia objeto proporcionada en el presente documento.
Antecedentes de la invención
El desarrollo de nuevos fármacos, formulaciones y otros sistemas para administración de péptidos y proteínas fisiológicamente activos y proteínas y otros productos terapéuticos y materiales está conducido por la necesidad de proporcionar estos péptidos o proteínas u otros materiales para conseguir los efectos fisiológicos deseables. Con respecto a péptidos y proteínas, se ha observado que muchos de ellos son inestables en el tracto gastrointestinal y por lo tanto pueden necesitar estabilizarse o protegerse o suministrarse mediante circulación sistémica. Además, los péptidos y proteínas que tienen masas moleculares bajas tienden a tener semividas biológicas cortas debido a su retirada eficaz de la circulación sistémica a través de los riñones y el sistema reticuloendotelial. Muchos péptidos y proteínas también pierden su actividad in vivo debido a la proteólisis (escisión de enlaces peptídicos).
En parte para superar estos efectos indeseables, puede usarse un sistema de suministro farmacológico. Se han desarrollado estrategias de suministro farmacológico para el suministro de péptidos y proteínas in vivo, pero la mayoría no son útiles para suministro prolongado. Por ejemplo, el uso de una infusión sistémica continua de fármaco mediante una bomba es poco práctica para pacientes externos que requieran altos niveles de movilidad. La infusión tiene las desventajas asociadas de calidad de vida e infecciones potenciales de la vía intravenosa (i.v.). El uso de una bomba implantable, comprendida por una cápsula con una membrana que permite la difusión de un fármaco, está limitado por el volumen de la cápsula. Se usan con frecuencia péptidos y proteínas en formulaciones concentradas en las cápsulas y se agregan, perdiendo de este modo actividad específica. En muchos casos, el fármaco se libera al espacio extracelular y se distribuye en el sistema linfático. Otros sistemas de suministro biodegradables implantables se implantan o inyectan en la epidermis. Los componentes del sistema se degradan habitualmente de forma lenta como resultado de la actividad biológica de las células circundantes (es decir como resultado de la liberación de enzimas que degradan enlaces químicos que mantienen estos implantes unidos).
Las proteínas que tienen una carga neta positiva en su superficie en condiciones fisiológicas y tienen un punto isoeléctrico (pI) básico (mayor de pH 7,5) se beneficiarán de la composición de la presente invención. El uso de proteínas básicas tiene mucho potencial terapéutico, incluyendo usos en el tratamiento del cáncer y enfermedades neoplásicas relacionadas, infecciones sistémicas, inflamaciones y enfermedades del sistema nervioso tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y enfermedades priónicas. Existe la necesidad de un vehículo de suministro farmacológico biodegradable para el suministro sistémico de proteínas y péptidos básicos (pI mayor de pH 7,5) que proporcionarán circulación más larga en el cuerpo, más estabilidad en la sangre y pueden administrarse más convenientemente. En una realización de la presente invención el agente antiinfeccioso que se beneficia del vehículo de la presente invención es lisostafina con pI de 9,56. La mayoría de péptidos y fármacos que pueden ser potencialmente útiles in vivo en el bloqueo de un mecanismo intracelular específico requieren restos básicos tales como grupos amino que permiten la internalización de membrana. Uniendo restos básicos, estos péptidos y fármacos de acción intracelular pueden penetrar las membranas biológicas. Estos restos básicos se denominan en ocasiones de forma colectiva resto penetrante celular o péptidos penetrantes celulares (Cell-Penetrating Peptides por Ulo Langel, Pharmacology & Toxicology Series, 2002, CRC Press, Nueva York).
Sumario de la invención
La materia objeto de la presente invención se define en las reivindicaciones 1-15 adjuntas. Las realizaciones descritas en el presente documento que no están abarcadas por las reivindicaciones sirven únicamente para ilustrar el contexto técnico de la invención.
En un aspecto de la invención, se proporciona una composición que comprende una cadena principal polimérica que comprende polilisina, poliornitina, poliarginina, poliglutamato, poliaspartato, policisteína, poliserina, politreonina, politirosina, heparina, sulfato de condroitina, sulfato de dermatano, sulfato de heparano, sulfato de queratano, carragenina, pectina, fucoidano o dextrano; múltiples cadenas protectoras, en donde cada cadena protectora comprende poli(etilenglicol) y está unida covalentemente con la cadena principal polimérica por un enlace simple; y grupos aniónicos de carboxilato, sulfato, sulfonato o fosfato unidos covalentemente con una unidad monomérica de la cadena principal polimérica y una molécula de carga unida electrostáticamente con el grupo aniónico directamente sin iones intermediarios (tales como metales), en donde dicha interacción electrostática es una interacción iónica. En un aspecto, los átomos de azufre y/o fósforo de grupos aniónicos están a más de un átomo de distancia entre sí para minimizar la propiedad quelante. La molécula de carga comprende: i) un péptido penetrante celular, ii) un dominio de unión aniónico o iii) un punto isoeléctrico mayor de 7,3. Se entiende que la interacción electrostática de la molécula de carga con la composición de la presente invención es el principal modo de interacción (Kd de 10 j M) y cualquier interacción hidrófoba mínima, cuando esté presente, es débil (Kd > 10 j M) e insignificante. Para el fin de la presente memoria descriptiva la expresión “dominio de unión aniónico” es cualquier parte de una molécula que tenga átomos de nitrógeno con carga positiva de modo que las moléculas puedan unirse con restos de carboxilato, sulfato, sulfonato o fosfato con una constante de disociación menor de 10 j M. En un aspecto relacionado, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una cadena principal polimérica que comprende unidades monoméricas, una cadena protectora unida covalentemente con la cadena principal polimérica y grupos aniónicos de carboxilato, sulfato, sulfonato o fosfato unidos covalentemente con una unidad monomérica de la cadena principal polimérica y una molécula de carga unida electrostáticamente directamente sin iones intermediarios (tales como metales) con el grupo aniónico con un excipiente farmacéuticamente aceptable, en donde los átomos de azufre y/o fósforo de grupos aniónicos cuando están presentes están a más de un átomo de distancia entre sí, y en donde la molécula de carga comprende: i) un péptido penetrante celular, ii) un dominio de unión aniónico o iii) un punto isoeléctrico mayor de 7,3. Se ha descubierto que los polímeros que contienen moléculas quelantes pueden unirse con péptidos/proteínas de unión a metales en ausencia de metales intermediarios. Sin desear quedar ligado a la teoría, la retirada de la capacidad de moléculas quelantes para quelar metales por derivatización de los grupos carboxilo con un resto negativo de forma similar pero no quelante (tal como sulfato, sulfonato y fosfato) indica que la capacidad para unirse con péptidos y proteínas es mediante interacciones iónicas.
Estas realizaciones de la presente invención, otras realizaciones y sus elementos y características, resultarán evidentes a partir de la descripción, los dibujos y las reivindicaciones a continuación.
Breve descripción de los dibujos
Determinados elementos de la invención se exponen de forma particular en las reivindicaciones adjuntas. Se obtendrá un mejor entendimiento de los elementos y ventajas de la presente invención mediante referencia a la siguiente descripción detallada que se expone realizaciones ilustrativas, en las que se utilizan los principios de la invención, y los dibujos adjuntos de los que:
La Figura 1 representa un ejemplo de una de las composiciones de núcleo aniónico de la presente invención. La invención representa una composición con cadena principal polimérica y una molécula de carga catiónica o péptido/proteína básico unido de forma electrostática directamente con el grupo aniónico del vehículo. Este diagrama ilustrativo representa una cadena principal polimérica con: a) cadenas protectoras unidas de forma covalente y colgantes, b) grupos aniónicos unidos covalentemente y colgantes procedentes de grupos carboxilato, sulfato, sulfonato o fosfato, en donde los grupos aniónicos a su vez interaccionan de forma electrostática directamente (sin iones intermediarios) con la molécula de carga catiónica o el péptido/proteína básico (punto isoeléctrico mayor de 7 pero preferentemente mayor de 7,3 y más preferentemente mayor de 7,5). Este diagrama no limita las composiciones contempladas por la presente invención.
Descripción detallada de la invención
Definiciones
Por conveniencia, antes de la descripción adicional de la presente invención, se recogen aquí determinados términos empleados en la memoria descriptiva, ejemplos y reivindicaciones adjuntas que necesitan explicaciones adicionales. Estas definiciones deberían interpretarse a la luz del resto de la divulgación y entenderse como lo haría un experto en la materia. A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende habitualmente un experto habitual en la materia.
Los artículos “un” y “una” se usan para hacer referencia a uno o más de uno (es decir, al menos uno) del objeto gramatical del artículo. Como ejemplo, “un elemento” significa un elemento o más de un elemento.
La expresión “proteína básica” es una proteína cuyo punto isoeléctrico es básico (por encima de 7), que se denomina una “proteína básica” mientras que una proteína cuyo punto isoeléctrico es ácido (por debajo de 7) se denomina una “proteína ácida”. La solubilidad de las proteínas es menor en el punto isoeléctrico. Las proteínas tienen grupos ionizables tales como grupos carboxilo y grupos amino. Ya que la carga de estos grupos depende del pH, una molécula proteica puede tener diferentes cargas según el pH. El número de cargas negativas es el mismo que el número de cargas positivas a un valor de pH específico y este pH es el punto isoeléctrico, por lo tanto, la repulsión electrostática entre proteínas similares es menor en este punto y la solubilidad también es menor. Sin embargo, por ejemplo, a pH por debajo del punto isoeléctrico los grupos amino obtendrán protones extra haciendo que la proteína obtenga cargas positivas extra o los grupos carboxilo se protonarán haciendo que la proteína pierda cargas negativas en comparación con la carga en el punto isoeléctrico. La determinación de si la protonación de los grupos amino o carboxilo es responsable de los cambios en la propiedad de la proteína tras la acidificación depende del pH del punto isoeléctrico de partida. La acidificación de proteína básica, con punto isoeléctrico por encima de 8,0, hacia pH neutro, el grupo principal que cambiará será el grupo amino. La acidificación adicional por debajo de pH 7 dará como resultado protonación del grupo carboxilo haciéndolo neutro y por tanto haciendo la carga neta global de la proteína más positiva. Todas las proteínas básicas tendrán más cargas positivas que cargas negativas a pH neutro haciéndolas capaces de unirse con el vehículo aniónico de la presente invención a pH neutro. Debido a que los grupos carboxilo pueden perder carga negativa a pH entre 5 y 7, el grupo aniónico preferido de vehículo de la presente invención es el grupo sulfato, sulfonato y fosfato que requiere pH entre 2 y 5 antes de perder cargas negativas. Los grupos carboxilo también serán útiles, sin embargo en múltiples ocasiones los grupos carboxilo agrupados entre sí tenderán a captar iones metálicos con carga positiva haciendo la carga neta global en presencia de metal más cercana a neutra o menos aniónica. Cuanto mayor sea el número de sitios aniónicos en el vehículo menos probable es que los metales interfieran con su capacidad para unirse con moléculas de carga con carga positiva.
El término “vehículo” para el fin de la presente invención se refiere a una composición de la presente invención que comprende una cadena principal polimérica con restos aniónicos y una cadena protectora unida covalentemente.
La expresión “cadena principal” para el fin de la presente invención se refiere a la estructura que comprende un polímero (lineal o ramificado).
El término “derivado” o “análogo” como se usa en el presente documento incluye compuestos cuyas estructuras de núcleo son las mismas que, o se asemejan estrechamente a la de, un compuesto parental, pero que tienen una modificación química o física, tal como grupos diferentes o adicionales; el término incluye copolímeros de compuestos parentales que pueden unirse a otros átomos o moléculas. El término también incluye un péptido o proteína con al menos 50 % de identidad de secuencia con el péptido o proteína parental. El término también incluye un péptido con grupos adicionales unidos a él, tales como marcador o etiqueta adicional, en comparación con el péptido parental. El término también incluye un polímero con grupo adicional unido a él, tal como un grupo alcoxi o metoxi, en comparación con el polímero parental.
El “punto isoeléctrico” (pI), en ocasiones abreviado a IEP, es el pH al que una molécula o superficie particular no porta carga eléctrica neta. Moléculas anfotéricas denominadas iones dipolares contienen cargas tanto positivas como negativas dependiendo de los grupos funcionales presentes en la molécula. La carga neta en la molécula está afectada por el pH de su ambiente circundante y puede adquirir más carga positiva o negativa debido a la pérdida o ganancia de protones (H+). El pI es el valor de pH al que la molécula no porta carga eléctrica o las cargas negativas y positivas son iguales. Las superficies adquieren carga de forma natural para formar una doble capa. En el caso habitual cuando los iones determinantes de carga de superficie son H+/OH-, la carga de superficie neta está afectada por el pH del líquido en el que se sumerge el sólido. De nuevo, el pI es el valor de pH de la solución al que la superficie no porta ninguna carga neta. El valor de pI puede afectar a la solubilidad de una molécula a un pH dado. Dichas moléculas tienen solubilidad mínima en soluciones acuosas o salinas al pH que corresponde a su pI y con frecuencia precipitan fuera de la solución. Las moléculas anfotéricas biológicas tales como proteínas contienen grupos funcionales tanto ácidos como básicos. Los aminoácidos que componen proteínas pueden tener naturaleza positiva, negativa, neutra o polar, y juntos proporcionan a una proteína su carga global. A un pH por debajo de su pI, las proteínas portan una carga neta positiva; por encima de su pI portan una carga neta negativa. Las proteínas pueden separarse de este modo según su punto isoeléctrico (carga global) en un gel de poliacrilamida utilizando la técnica denomina isoelectroenfoque, que usa un gradiente de pH para separar proteínas. El isoelectroenfoque también es la primera etapa en una electroforesis en gel de poliacrilamida de gel bidimensional. Para un aminoácido con solamente un grupo amina y uno carboxilo, el pI puede calcularse a partir del pKa de esta molécula usando una fórmula: pI={{pKi pK2}/2}. Para aminoácidos con más de dos grupos ionizables, tales como lisina, se usa la misma fórmula, pero esta vez los dos pKa usados son los de los dos grupos que pierden y ganan una carga desde la forma neutra del aminoácido. La lisina tiene un único pKa carboxílico y dos valores pKa de amina (uno de los cuales está en el grupo R), de modo que la lisina completamente protonada tiene una carga neta 2. Para obtener una carga neutra, se puede desprotonar la lisina dos veces, y por lo tanto usar los valores de pKa del grupo R y amina (hallados en la Lista de aminoácidos convencionales): pI={{9,06 10,54}/2} = 9,80. En un polipéptido, los grupos amino y carboxilo alfa no son ionizables y por tanto no se calculan excepto en el extremo. En este caso solamente los grupos R (principalmente lisina, arginina, aspartato y glutamato) son los más relevantes en el cálculo del pI. El pH de un gel electroforético se determina mediante el tampón usado para ese gel. Si el pH del tampón está por encima del pI de la proteína que se procesa, la proteína migrará al polo positivo (la carga negativa es atraída a un polo positivo). Si el pH del tampón está por debajo del pI de la proteína que se procesa, la proteína migrará al polo negativo. Si la proteína se procesa con un pH de tampón que es igual al pI, esta no migrará en absoluto. Esto también sucede para aminoácidos individuales. Para el fin de la presente invención, el pI por encima de 7 se denomina proteína básica, pero el pI más preferido para la molécula de carga de la presente invención está por encima del pH fisiológico de 7,3 ya que estas moléculas de carga tienen una carga neta positiva a pH fisiológico. Debería enfatizarse que para una molécula de carga grande tal como proteína, el pI básico no es el único requisito para cargar en el vehículo ya que la existencia de parcelas de superficie o carga positiva es suficiente para permitir una interacción electrostática fuerte con el vehículo.
La expresión “molécula de carga” es el agente activo, agente terapéutico o agente de captura de imágenes que se pretende suministrar mediante la composición de núcleo aniónico o el vehículo de la presente invención al sujeto. Se pretende que la molécula de carga esté unida electrostáticamente directamente con los grupos aniónicos del vehículo pero no esté unida covalentemente con el vehículo. La molécula de carga puede ser un péptido o proteína que contiene grupos amino con carga positiva a pH neutro. El agente activo también incluye una molécula orgánica con carga positiva pequeña.
La expresión “de origen natural” o “nativo”, cuando se aplica a un objeto, se refiere al hecho de que un objeto puede hallarse en la naturaleza. Por ejemplo, una cadena principal que puede aislarse de una fuente de la naturaleza y que no se ha modificado de forma intencionada, por ejemplo, en el laboratorio, es de origen natural. La expresión “de origen no natural” o “no nativo” o “sintético” se aplica a un objeto que se ha modificado de forma intencionada, por ejemplo, en el laboratorio, y no hallado normalmente en la naturaleza.
El término “polímero” es una molécula (o macromolécula) compuesta de unidades estructurales repetidas conectadas por enlaces químicos covalentes. Este término incluye poliaminoácidos (con aminoácidos repetidos; obsérvese que para el fin de la presente memoria descriptiva, las proteínas no tienen aminoácidos repetidos ya que sus aminoácidos varían a lo largo de la cadena), polialiamina, ácido poliacrílico, polietilenimina, polisacáridos y otras cadenas principales poliméricas mencionadas en la presente memoria descriptiva. Para mayor claridad de la presente memoria descriptiva, la expresión “cadena principal polimérica” o “polímero de cadena principal” es un polímero no proteico. Proteico significa proteínas de origen natural o sus derivados que no son un homopolímero y tienen actividad enzimática o biológica provocada por su conformación tridimensional. El homopolímero de poliaminoácido tal como polilisina no es proteico.
Un “paciente”, “sujeto” u “hospedador” para tratar con la composición de la presente invención puede significar un ser humano o animal no humano. El término “mamífero” se conoce en la técnica y los mamíferos ejemplares incluyen seres humanos, primates, bovinos, porcinos, caninos, felinos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas).
El término “péptido/proteína” significa péptido o proteína donde el péptido tiene 50 o menos aminoácidos y la proteína tiene más de 50 aminoácidos y puede aislarse de células o prepararse de forma sintética. También pueden aislarse o prepararse de forma sintética derivados y fragmentos. Idealmente, la molécula de carga peptídica/proteica de la presente invención tendrá un punto isoeléctrico por encima de pH 7. Es posible, sin embargo, que determinados derivados de un agente activo peptídico/proteico pueda tener parcelas de grupos con carga positiva a pesar de tener un punto isoeléctrico ácido que permite la interacción de este tipo de péptido/proteína con los grupos aniónicos del vehículo. Se pretende que este tipo de molécula de carga esté abarcada por la presente invención. Un derivado de agente activo puede generarse mediante el truncamiento de la secuencia de aminoácidos o la adición de otros aminoácidos o grupos funcionales.
Introducción general
Las realizaciones de la presente invención están dirigidas a sistemas de suministro de proteínas básicas basados en vehículos que comprenden una cadena principal, un dominio aniónico unido covalentemente a la cadena principal y una proteína básica unida por enlaces iónicos o unida de forma electrostática al dominio aniónico del vehículo. La cadena principal contiene múltiples cadenas de polietilenglicol para cubrir o proteger la proteína básica. Las cadenas de polietilenglicol protectoras pueden aumentar el radio hidrodinámico global del agente macromolecular que puede dar como resultado circulación prolongada en la sangre (no permitiendo la eliminación/filtración a través del riñón) y aumentar la retención/acumulación en sitios de alta permeabilidad vascular.
Los vehículos de la presente invención atraviesan barreras vasculares degradadas o anómalas con permeabilidad aumentada pero debido al tamaño del vehículo y la dirección del flujo/presión, el vehículo no es capaz de fluir en sentido contrario en la circulación. Esto da como resultado acumulación de vehículo en sitios de barreras vasculares anómalas. Esto se demostró en un modelo de inflamación bacteriana del tejido muscular en ratas inducidas con E. coli. Como alternativa, el vehículo podría usarse para la detección temprana de filtración al espacio extravascular y dirección específica a los sitios con permeabilidad vascular aumentada, tal como inflamación. Por tanto, el aumento de la acumulación del vehículo en sitios de inflamación permitirá que la proteína básica asociada a vehículos se acumule en sitios de infección.
La asociación de una proteína básica o un derivado de la misma a la cadena principal se consiguen usando una interacción iónica. El uso de proteína modificada o proteína derivatizada añadiendo restos de aminoácidos básicos puede mantener o potenciar la interacción iónica. Una ventaja de los grupos aniónicos en los vehículos de la presente invención es proporcionar unión reversible de proteínas básicas que son capaces de formar enlaces iónicos con el resto aniónico del vehículo. El enlace iónico permite la disociación reversible de proteínas/péptidos básicos y fármacos de la cadena principal que contienen los grupos funcionales aniónicos.
La formulación de vehículo-resto aniónico-proteína básica puede proporcionar varios beneficios. Por ejemplo, dichas formulaciones proporcionan mejor biocompatibilidad; reducen la toxicidad potencial; reducen la inmunogenicidad; aumentan el tiempo de permanencia en sangre; permiten la acumulación específica de sitio en sitios de inflamación.
Los vehículos de la presente invención también tienen alta capacidad de carga farmacológica, con su unión reversible específica de una proteína básica ejemplar, lisostafina (Ej. 44).
Basándose en los resultados presentados, las proteínas básicas se unen con el resto quelante en ausencia de metal. Las interacciones también pueden facilitarse posiblemente mediante interacciones con cadenas protectoras y/u otros componentes del vehículo. El diseño de los vehículos de la presente invención se realiza de tal modo que la proteína básica asociada de forma iónica esté protegida por las cadenas protectoras (cadenas de polietilenglicol) de, por ejemplo, peptidasas y anticuerpos. Además, la asociación de proteínas básicas (tales como lisostafina) y péptidos (tales como los presentados en la Tabla 1 y sus análogos o derivados) con el vehículo de alto peso molecular pueden prolongar la semivida in vivo evitando la eliminación mediante ultrafiltración renal, la captación mediante células presentadoras de antígenos y captación mediante el sistema reticuloendotelial.
Elementos del vehículo de la invención y proteínas básicas
Los vehículos de la presente invención están comprendidos por: una cadena principal polimérica que comprende polilisina, poliornitina, poliarginina, poliglutamato, poliaspartato, policisteína, poliserina, politreonina, politirosina, heparina, sulfato de condroitina, sulfato de dermatano, sulfato de heparano, sulfato de queratano, carragenina, pectina, fucoidano o dextrano capaz de apoyar múltiples grupos aniónicos derivados de grupos carboxilo, sulfato, sulfonato o fosfato que pueden unirse (mediante interacción iónica) con nitrógeno con carga positiva en un agente activo o molécula terapéutica (o molécula de carga). La cadena principal comprende además múltiples cadenas protectoras unidas covalentemente con la cadena principal polimérica mediante un único enlace. En un aspecto, el vehículo es biocompatible. Los componentes individuales se describen a continuación.
a. Cadenas principales
Las cadenas principales de los vehículos de la presente invención pueden ser polímeros y copolímeros de estructura lineal o ramificada o conjugados de los mismos. El peso molecular de la cadena principal varía de 1.000 Da a 200.000 Da. En algunas realizaciones el peso molecular de la cadena principal puede variar de 1.500 Da a 100.000 Da, o de 2.000 Da-50.000 Da, o de 2.000 Da-30.000 Da, o de 2.000 Da-25.000 Da. Es preferible que la cadena principal polimérica proceda de un polímero de origen natural. También es preferible que la cadena principal polimérica sea hidrosoluble.
1) Cadenas principales poliméricas o copoliméricas:
Los polímeros están compuestos de unidades estructurales repetidas conectadas por enlaces químicos covalentes. Un copolímero es un polímero derivado de dos o más polímeros diferentes unidos entre sí.
En determinadas realizaciones, los polímeros de cadena principal o copolímeros de cadena principal de las composiciones tienen pesos moleculares que varían de aproximadamente 500 a 5.000, 10.000, 15.000, 20.000, 25.000, 30.000, 40.000 o 50.000, 60.000, 70.000, 80.000, 90.000 o 100.000 Daltons e incluso más específicamente entre 2.000 y 50.000 Daltons. Los pesos moleculares en promedio en número (Mn) también pueden variar ampliamente, pero en general quedan en el intervalo de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 120.000 Daltons o incluso de aproximadamente 2.000 a aproximadamente 70.000 o incluso de aproximadamente 3.000 a 50.000 Daltons. En determinadas realizaciones, el Mn varía entre aproximadamente 5.000 y 45.000 Daltons. Dentro de una muestra dada de una cadena principal polimérica objeto, puede estar presente un amplio intervalo de pesos moleculares. Por ejemplo, las moléculas dentro de la muestra pueden tener pesos moleculares que difieren en un factor de 2, 5, 10, 20, 50, 100 o más, o que difieren del peso molecular promedio en un factor de 2, 5, 10, 20, 50, 100 o más. El número de monómeros en el polímero de cadena principal puede variar de 10 (un 10-mero) a 1.000 (un 1.000-mero). El polímero de cadena principal puede ser como alternativa aproximadamente 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 o 450-mero, y aún más específicamente entre un 100-mero a 250-mero. El número de monómeros en la cadena principal polimérica determina en general el número de grupos funcionales que pueden modificarse para aportar restos aniónicos o cadenas protectoras. El tamaño preferido de las cadenas principales poliméricas se selecciona de modo que el diámetro hidrodinámico global de la molécula vehículo (cadena principal, grupos aniónicos y cadenas protectoras) antes de la carga con molécula de carga básica esté por debajo de 100 nm.
En algunas realizaciones, la cadena principal polimérica es un homo o heteropolímero no proteico con grupos monoméricos repetidos que contienen grupos amino, carboxilo, hidroxilo y tiol y pueden ser de origen natural o sintético, en donde los grupos monoméricos repetidos pueden modificarse covalentemente para contener adicionalmente grupos aniónicos o más grupos aniónicos tales como restos carboxilato, sulfato, sulfonato o fosfato y cadenas protectoras hidrófilas. El sulfato, sulfonato o fosfato puede unirse al polímero directamente o usando un espaciador con múltiples grupos carboxilo, tales como ácido dietilentriaminpentaacético (DTPA), ácido etilendiamintetraacético (DTPA), ácido nitrilotriacético (NTA), ácido etilenglicoltetraacético (EGTA) o ácido cítrico por nombrar algunos, que permitirán la unión conveniente y/o el agrupamiento de cargas aniónicas como un único colgante en la cadena principal polimérica (que no es parte de la cadena principal que es importante para la integridad molecular de la cadena principal). La cadena principal puede modificarse para portar uno o más grupos aniónicos colgantes. En otras realizaciones la cadena principal polimérica también puede ser un homo o heteropolímero no proteico con grupos hidrófobos repetidos con grupos amino, carboxilo, hidroxilo y tiol terminales o cualquier grupo funcional modificable que pueda modificarse covalentemente para contener adicionalmente un agolpamiento (dos o más) de grupos aniónicos tales como restos carboxilato, sulfato, sulfonato o fosfato y cadenas protectoras hidrófilas. La expresión “poliaminoácido no proteico” como se usa en el presente documento incluye un poliaminoácido que no es hecho de forma natural por un organismo vivo a menos que se modifique por ingeniería genética de forma recombinante o no tenga actividad enzimática o biológica resultante de su conformación tridimensional. En determinadas realizaciones, la cadena principal polimérica es un poliaminoácido que puede tener quiralidad D o L o ambas y es un homopolímero de cadena sencilla. Los homopolímeros de cadena sencilla incluyen polilisina, poliornitina, poliarginina, poliglutamato, poliaspartato, poliserina, politirosina o cualquier otro homopolímero unido a amida hecho de aminoácidos. Los homopolímeros hidrófobos de cadena sencilla comprenden poliamina, polivalina, polileucina, poliisoleucina, poliglicina o polifenilalanina. Estos poliaminoácidos hidrófobos pueden modificarse en un extremo para contener un agrupamiento (2 o más) de grupos aniónicos tales como carboxilato, sulfato, sulfonato o fosfato, o combinación de los mismos, y en el otro extremo para contener cadenas protectoras hidrófilas. Si la cadena principal es un polímero que comprende poliaminoácidos, este es habitualmente no proteico, lo que significa que no es una proteína de origen natural con actividad asociada con su conformación tridimensional. La cadena principal polimérica puede tener un peso molecular de aproximadamente 600-1.000.000 Daltons, incluyendo el intervalo de aproximadamente 1.000-70.000 Daltons. También pueden usarse otras cadenas principales poliméricas con grupos funcionales modificables repetidos tales como las que tienen grupos sulfhidrilo (tiol), amino, carboxilo e hidroxilo repetidos. También pueden usarse como la cadena principal polimérica polímeros de carbohidratos de fuente biológica y otros polímeros sintéticos donde los monómeros no son biológicos. La cadena principal polimérica proporciona múltiples sitios a partir de los que pueden unirse los grupos aniónicos y cadenas protectoras hidrófilas. La cadena principal incluye las que tienen carboxilato, sulfato, sulfonato o fosfato ya presentes y de modo que después de la unión covalente de cadenas protectoras hidrófilas tales como polietilenglicol o derivados, puede no ser necesaria ninguna modificación adicional. Estos incluyen polisacáridos sulfatados tales como sulfato de condroitina, sulfato de heparano, sulfato de dermatano, sulfato de heparina, sulfato de dextrano, fucoidano y carragenina, por ejemplo. Estas cadenas principales pueden modificarse para contener cadenas protectoras hidrófilas para obtener el componente de vehículo de la presente invención a partir del que puede unirse iónicamente la molécula de carga básica para completar una composición de la presente invención. Como una realización adicional de la composición donde la cadena principal ya contiene grupos sulfato, sulfonato o fosfato, la cadena principal puede modificarse adicionalmente para contener grupos sulfato, sulfonato o fosfato adicionales para aumentar la densidad de carga aniónica de la composición de la presente invención para potenciar adicionalmente su capacidad para unirse con molécula de carga básica (las que tienen el punto isoeléctrico por encima de 7).
Las cadenas principales poliméricas pueden incluir polisacáridos. Los polisacáridos abarcan disacáridos, oligosacáridos y polímeros mayores de hasta millones de Daltons. Las cadenas principales poliméricas incluyen polisacáridos, oligosacáridos y productos derivados químicamente de los mismos, que portan grupos carboxílicos modificables, grupos alcohólicos o grupos amino, que pueden ilustrarse por: polixilotol, ácido galacturónico, ácido glucurónico, ácido manurónico, ácido hialurónico, ácido péctico, ácido neuramínico, ácido algínico, carragenina; dextranos oxidados; dextrano aminado, por ejemplo que contiene grupos amino unidos. Las cadenas principales poliméricas incluyendo polisacáridos pueden ser lineales o ramificadas, pueden estar carboxiladas, carboximetiladas, sulfatadas o fosforiladas. Las cadenas principales poliméricas que incluyen polisacáridos pueden hacerse reaccionar con derivados de ácidos carbónico, dicarbónico, sulfúrico, aminosulfúrico, fosfórico con unión resultante de grupos carboxílico, aminocarboxílico, carboximetilo, sulfúrico, amino o fosfato. Las cadenas principales poliméricas que incluyen polisacáridos pueden obtenerse mediante la alteración química de dextrano, manano, xilano, pululano, celulosa, quitosano, agarosa, fucoidano, galactano, arabinano, fructano, fucano, quitina, pustulano, levano o pectina. Además estos polisacáridos pueden estar representados por heteropolímeros u homopolímeros de monosacáridos tales como, pero sin limitación, glucosa, galactosa, manosa, galactosa, desoxiglucosa, ribosa, desoxirribosa, arabinosa, fucosa, xilosa, xilulosa y ribulosa.
Las cadenas principales poliméricas también incluyen polímeros (lineales o ramificados) tales como polietilenimina, poliamidoamina, polialiamina, ácido poliacrílico; polialcoholes (por ejemplo, alcohol polivinílico) con los que se unen químicamente grupos carboxílico, amino o alcohólico y/o que están disponibles para la unión de más grupos aniónicos. Estas cadenas principales poliméricas pueden ser cadenas no biológicas para las que están disponibles grupos carboxílico, amino o alcohólico para unión de más grupos aniónicos. La cadena principal polimérica puede contener grupos aniónicos y puede realizarse modificación adicional para aumentar el número de grupos aniónicos o para potenciar la calidad de los grupos aniónicos tal como convertir grupos carboxilo en grupos sulfato, sulfonato o fosfato.
El polímero que actúa como la cadena principal polimérica puede ser poli(etilenglicol) (PEG) con grupos funcionales en el extremo terminal o cerca del extremo terminal que compone el agrupamiento (2 o más) de grupos aniónicos con los que puede unirse la proteína básica. Esquemáticamente, esta realización puede estar representada por lo siguiente: PEG-grupos aniónicos*proteína básica, donde el asterisco representa interacción iónica que es una relación muy específica entre elementos de la presente invención. Como alternativa, el PEG puede funcionalizarse a lo largo de su cadena principal permitiendo que el agrupamiento aniónico sea colgante de la cadena principal de la que puede asociarse proteína básica mediante interacción electrostática directa. Esta estructura también puede permitir además cadenas protectoras colgantes.
De acuerdo con la invención, la cadena principal polimérica comprende polilisina, poliomitina, poliarginina, poliglutamato, poliaspartato, policisteína, poliserina, politreonina, politirosina, heparina, sulfato de condroitina, sulfato de dermatano, sulfato de heparano, sulfato de queratano, carragenina, pectina, fucoidano o dextrano.
b) Restos aniónicos o grupos aniónicos
Los ejemplos de grupos aniónicos que pueden unirse químicamente con la cadena principal incluyen: -fosfato; -sulfato; -sulfonato; y -carboxilo. La unión entre los grupos amino en la proteína y los grupos carboxilo no es tan fuerte como con grupos aniónicos tales como fosfato, sulfato y sulfonato. Esto se debe a que el grupo carboxilo tiene pKa de aproximadamente 6, mientras que el sulfato, sulfonato y fosfato tienen pKa de menos de 3. Esto hace que la población de sulfato, sulfonato y fosfato tenga carga principalmente negativa a pH por encima de 3. La población de grupo carboxilo tendrá principalmente carga negativa a pH 6 y superior lo que le proporciona cierta limitación para formar anión en condiciones levemente ácidas. Además, la mayoría de los restos que contienen policarboxilo tienen capacidad de quelación que puede alterar la función fisiológica que requiere metales de molécula de carga o proteínas sanguíneas. Los grupos aniónicos preferidos son fosfato, sulfato y sulfonato. Sin embargo, esto no excluye grupos carboxilo de diversas realizaciones de la presente invención. Los grupos aniónicos en la presente composición pueden localizarse en un agrupamiento. El agrupamiento aniónico se define para el fin de la presente memoria descriptiva como dos o más grupos aniónicos unidos a la cadena principal por un enlace covalente común y que cada carga aniónica no está a más de 12 átomos de la otra carga aniónica. Se obtienen grupos aniónicos de carboxilato, sulfato, sulfonato y/o fosfato. Es preferible que los átomos de azufre o fósforo que componen las cargas aniónicas estén separados entre sí por más de tres átomos para evitar que sean un fuerte quelante de metales. Una vez que el metal está quelado, el metal añadirá carga positiva al sitio o agrupamiento aniónico haciéndolo menos capaz de unirse con moléculas de carga catiónicas o con carga positiva con punto isoeléctrico mayor de 7. En una realización, se excluye el metal, ya que puede crear potencialmente una fuerte interacción de coordinación que no permitiría la liberación calibrada de la molécula de carga. La mayor separación entre el átomo de azufre y/o fósforo en un grupo aniónico puede ayudar a reducir o debilitar las propiedades quelantes del agrupamiento aniónico del vehículo. De esta manera la liberación de las moléculas de carga puede facilitarse con sal fisiológica. Asimismo, la quelación también puede inactivar moléculas de carga que contienen metales o calcio tales como Factor VIII, además de neutralizar la propiedad aniónica del vehículo. Esto es especialmente cierto con fosfato en forma de bisfosfonato en el que el átomo de fósforo está separado por solamente un átomo o las cargas están separadas por 3 átomos. Debido a esto, el bisfosfonato es un fuerte quelante de metal que puede inactivar moléculas biológicas que contienen metales de transición o metales alcalinotérreos tales como calcio. Los átomos de azufre y fósforo que forman grupos aniónicos en la composición de la presente invención están separados en más de un átomo lo que los hace quelantes débiles. Esto se consigue mediante el uso de espaciador de policarboxilo amina, que después contienen varios grupos aniónicos fuertes que contienen átomos de azufre y/o fósforo. En una realización de la invención, la relación organizativa de la molécula de carga catiónica con el grupo aniónico es mediante interacción iónica directa y no está mediada por ningún otro ion metálico divalente. Dicha relación organizativa distingue la presente invención de otras composiciones poliméricas que usan enlaces metálicos para moléculas de carga unidas. Además, la presente invención no se basa en interacciones hidrófobas para unir moléculas de carga ya que las moléculas de carga que tienen carga positiva o tienen un punto isoeléctrico por encima de 7,3 son hidrosolubles y es poco probable que sean hidrófobas. Dichas moléculas de carga con carga alta de la presente invención repelen grupos hidrófobos como se conoce en la técnica. Las moléculas de carga de la presente invención están limitadas a las moléculas de carga que no interaccionan con grupos hidrófobos de forma significativa (las que tienen Kd para grupos hidrófobos de más de 50 |jM). Un agrupamiento de grupos carboxilo separados por 4 o más átomos también será un quelante menos fuerte o incluso no quelante y puede usarse como el agrupamiento aniónico de la presente invención. Para el fin de la presente memoria descriptiva, el grupo aniónico o un agrupamiento de grupos aniónicos colgantes de la cadena principal mediante un único enlace químico no tiene más de 1.500 Da de masa molecular excluyendo la masa de cadena principal. Esto es para facilitar la protección por cadenas protectoras en las que la masa preferida es entre 2.000 Da y 20.000 Da.
c) Cadenas pro tectoras
Los ejemplos de cadenas protectoras (denominadas indistintamente cadenas laterales protectoras o cadenas protectoras hidrófilas) incluyen poli(etilenglicol), que puede esterificarse mediante ácido dicarboxílico para formar un monoéster de poli(etilenglicol); monoéster de metoxi poli(etilenglicol) (MPEG) o un copolímero de poli(etilenglicol) y monoéster de poli(propilenglicol) en forma de un éster con un ácido dicarboxílico que proporciona el extremo de estos copolímeros un grupo carboxilo que puede usarse para unirlo covalentemente con una cadena principal (véase anteriormente). Otras formas incluyen poli(etilenglicol)-carboxilo; metoxi poli(etilenglicol)-carboxilo; poli(etilenglicol)-carboximetilo; metoxi poli(etilenglicol)-carboximetilo; poli(etilenglicol)-monoamina; metoxi poli(etilenglicol) monoamina; poli(etilenglicol) hidrazida; metoxi poli(etilenglicol) hidrazida; metoxi poli(etilenglicol) imidazolida copolímero en bloque de poli(etilenglicol) y uno o varios polímeros representados por poliaminoácido, polisacárido, poliamidoamina, polietilenimina donde estos bloques se alternan para proporcionar un copolímero en bloque lineal. En una realización, el peso molecular global de una cadena protectora puede ser mayor de 300 Daltons pero que no supera 10.000 Daltons.
De acuerdo con la invención, múltiples cadenas protectoras, en donde cada cadena protectora comprende poli(etilenglicol), están unidas covalentemente con la cadena principal polimérica mediante un único enlace.
En un ejemplo proporcionado en el presente documento, una composición de la presente invención comprende una cadena principal polimérica lineal con un grado de polimerización en el intervalo de 2-10.000 con la que están unidas de forma independiente y covalentemente cadenas protectoras de metoxipolietilenglicol (mPEG) con un masa de 300­ 25.000 Daltons y grupos aniónicos (que pueden ser de sulfato, sulfonato o fosfato pero no excluyen grupos carboxilo como los grupos aniónicos) donde dichas cadenas protectoras y grupos aniónicos están unidos de forma independiente o colgantes de la cadena principal. En otro ejemplo, el grado de polimerización de la cadena principal polimérica está en el intervalo de 25-1.000. En otro ejemplo más, el grado de polimerización de cadena principal polimérica está en el intervalo de 50 a 300.
d) Agentes activos: Proteínas y péptidos básicos
1) Proteínas: Las proteínas y péptidos básicos se reconocen en la técnica como proteínas y péptidos con punto isoeléctrico mayor de 7. Las proteínas básicas incluyen metaloexopeptidasas tales como lisostafina que es un agente antiinfeccioso. Los vehículos de la presente invención pueden unirse esencialmente con la mayoría de proteínas básicas o los agentes activos de proteínas básicas y derivados, fragmentos y análogos de los mismos siempre que permanezcan básicos o su punto isoeléctrico permanezca por encima de 7. Las proteínas básicas y sus derivados, fragmentos y análogos pueden producirse mediante técnicas recombinantes a partir de construcciones de ADN. Las proteínas con punto isoeléctrico por debajo 7 pueden prepararse para tener un punto isoeléctrico mayor de 7, añadiendo aminoácidos básicos en la secuencia mediante el uso de técnicas recombinantes de ADN o durante la síntesis. Los aminoácidos básicos son lisina y arginina. Los péptidos pueden hacerse básicos durante la síntesis añadiendo un aminoácido básico en su extremo manteniendo al mismo tiempo la bioactividad de la secuencia principal. Como alternativa, la secuencia básica puede añadirse de modo que una vez se ha liberado en la sangre o ha entrado en la célula, la secuencia básica puede escindirse mediante una proteasa endógena (presente de forma natural en el cuerpo de un organismo) que libera los péptidos activos. Los agentes activos de proteína básica de la presente invención pueden ser o no productos recombinantes. Los agentes activos de proteína básica de la presente invención pueden ser producto de la producción recombinante en células de mamífero que pueden estar implicados o no en la modificación de secuencia de ADN que evita la glucosilación. Los agentes activos de proteína básica de la presente invención pueden ser de versión nativa purificada del organismo que produce de forma natural la proteína básica. Los agentes activos de proteína básica de la presente invención pueden purificarse de un organismo. Por ejemplo, puede purificarse lisostafina, una proteína básica ilustrativa, del organismo que la produce de forma natural, tal como Staphylococcus simulans o Staphylococcus staphylolyticus. Los vehículos de la presente invención pueden unirse con proteínas básicas así como análogos, derivados y fragmentos de los mismos.
Los vehículos de la presente invención pueden unirse con proteínas básicas y análogos, derivados y fragmentos de los mismos. En realizaciones específicas los vehículos de la presente invención se unen con lisostafina. La lisostafina está reconocida en la técnica y es bacteriolítica para Staphylococcus aureus. Esto incluye derivados y fragmentos de lisostafina que tienen sustancialmente el mismo efecto biológico que la lisostafina de origen natural. La lisostafina puede aislarse o prepararse de forma sintética. También pueden aislarse o prepararse de forma sintética derivados y fragmentos. Es posible que determinados derivados de lisostafina puedan tener un punto isoeléctrico diferente o incluso tener punto isoeléctrico por debajo de 7, pero siempre que haya un agrupamiento de cargas positivas en una proteína lejos de las cargas negativas, la proteína puede unirse potencialmente con el grupo aniónico del vehículo de la presente invención. Para determinar si la interacción de lisostafina con el vehículo es interacción aniónica-catiónica directa y no mediante ion metálico multivalente intermediario se añade NaCl 0,4 M. La interacción aniónica-catiónica puede alterarse mediante NaCl 0,4 M mientras que la interacción mediada por ion metálico multivalente a través de enlace coordinado no puede alterarse mediante NaCl 0,4 M (véase ejemplo posterior). En una realización, puede generarse un derivado de lisostafina mediante truncamiento de la secuencia de aminoácidos o la adición de otros aminoácidos o grupos funcionales tales como grupo amino básicos. En una realización, la lisostafina (incluyendo sus análogos, derivados y fragmentos) comprende un aminoácido básico total (lisina y arginina) mayor que los aminoácidos ácidos totales (glutamato y aspartato), proporcionando de este modo a la proteína una carga neta positiva capaz de unirse con el vehículo de núcleo aniónico de la presente invención. Ocasionalmente, una proteína o un péptido con punto isoeléctrico por debajo de 7 pueden tener todos los aminoácidos básicos en un extremo de la molécula y todos los aminoácidos ácidos en el otro extremo de la molécula o como alternativa la proteína o el péptido puede plegarse de tal manera que el aminoácido ácido esté internado y los aminoácidos básicos estén expuestos. En estas circunstancias aún puede unirse con el vehículo aniónico de la presente invención siempre que los aminoácidos básicos estén en una región espacialmente separada de la molécula. La determinación de si una proteína o un péptido con punto isoeléctrico inferior a 7 interaccionará con el vehículo de la presente composición tendrá que determinarse caso a caso usando el método descrito en el presente documento y que puede ser realizado fácilmente por un experto en la materia sin experimentación indebida. La lisostafina tiene de forma natural un punto isoeléctrico entre pH 9-10, lo que permite unirla estrechamente con el vehículo de la presente invención. La lisostafina, por lo tanto, proporciona grupos amino con carga positiva de modo que no haya necesidad de modificarla sintéticamente para contener aminoácidos básicos. La lisostafina puede cargarse en el vehículo de la presente invención mezclando una solución de vehículo con una solución de lisostafina a temperatura entre 15 a 37 grados Celsius. El vehículo cargado puede liofilizarse y reconstituirse antes de su uso. La lisostafina de la presente invención o proteínas básicas en general pueden modificarse adicionalmente para contener más aminoácidos básicos para potenciar la unión con los vehículos de la presente invención.
La lisostafina, uno de los agentes activos de la presente invención es una enzima peptidasa producida por determinadas cepas de microorganismos Staphylococcus con actividad antibacteriana contra estafilocos. La lisostafina es una peptidasa de 25 kDa producida por Staphylococcus simulans que escinde un enlace glicina-glicina único de un cruce entre péptidos de la pared celular de Staphylococcus aureus con la designación de número de EC de EC 3.4.24.75. La lisostafina es una proteína básica ilustrativa, más específicamente una proteína básica glicilo-glicilo.
2) Péptidos: Entre los péptidos de acción intracelular hay péptidos que pueden modificar las rutas de transducción de señal. Para que los péptidos modifiquen las rutas de transducción de señales, puede ser necesario que penetren en las membranas celulares. La capacidad de los péptidos para penetrar en la membrana celular depende del número de aminoácidos básicos en proximidad estrecha entre sí. Estos aminoácidos básicos en proximidad estrecha entre sí se denominan dominio de transducción de péptidos o péptidos penetrantes celulares (Cell-Penetrating Peptides por Ulo Langel, Pharmacology & Toxicology Series, 2002, CRC Press, Nueva York). Todos estos péptidos y sus derivados son moléculas de carga ideales para el vehículo de núcleo aniónico de la presente invención. En general todos los péptidos (polipéptidos con 50 o menos aminoácidos) que contienen dominio de transducción de péptidos o secuencia penetrante celular pueden suministrarse usando el vehículo de la presente invención. La secuencia de dominio de transducción de péptidos o péptido penetrante celular se caracteriza por la presencia de una secuencia de 5-10 aminoácidos con al menos 2 aminoácidos básicos (lisina y/o arginina) más que el número de aminoácidos ácidos (glutamato y aspartato). Algunos ejemplos de estos se enumeran todos en un libro titulado Cell-Penetrating Peptides por Ulo Langel, Pharmacology & Toxicology Series, 2002, CRC Press, Nueva York, que se incorpora por la presente por referencia. Debería observarse que en todos los casos el péptido penetrante celular sigue la misma normal general de que contiene 5-10 aminoácidos con al menos 2 aminoácidos básicos (lisina y/o arginina) más que el número de aminoácidos ácidos (glutamato y aspartato). Desafortunadamente todos estos péptidos son degradados y eliminados por el riñón muy rápido una vez que están en la circulación, lo que requiere la administración de una gran cantidad de este péptido (10 mg/kg en ratones). Estos péptidos se beneficiarán significativamente del vehículo de la presente invención. Debido a que todos estos péptidos de acción intracelular con secuencia penetrante celular catiónica tendrán secuencias básicas, serán todos moléculas de carga ideales para la composición de núcleo aniónico de la presente invención. El vehículo aumentará la semivida en circulación en sangre de estos péptidos y acumulará o dirigirá el péptido al sitio de inflamación que está presente en enfermedades tales como artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino crónica, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, ateroesclerosis y diabetes entre otras.
a) Péptidos y proteínas antiinflamatorios.
En una realización, los péptidos/proteínas de la presente invención que son útiles en el tratamiento de la inflamación pueden ser un péptido que bloquea la acción de NFkB y contiene una secuencia penetrante celular. Son ejemplos de enfermedades inflamatorias crónicas que pueden beneficiarse de la composición de la presente invención: artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino crónica, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y diabetes. La secuencia de péptido penetrante celular es un péptido que contiene una serie de aminoácidos básicos (tales como lisina o arginina) que permite la penetración en la célula. Esta secuencia puede unirse a una secuencia que puede suprimir la activación de NFkB y por tanto prevenir la inflamación. Ejemplos: (SEQ ID NO: 60) Péptido básico-Thr-Ala-Lue-Asp-Trp-Ser-Trp-Lue-Gln-Thr-Glu-OH o (SEQ ID NO: 61) Péptido básico-Thr-Thr-Lue-Asp-Trp-Ser-Trp-Lue-Gln-Met-Glu-OH. Un ejemplo específico de este tipo de péptido tiene la secuencia de (SEQ ID NO: 1) (Lys)s-Gly-Gly-Thr-Ala-Lue-Asp-Trp-Ser-Trp-Lue-Gln-Thr-Glu (o KKKKKKKK-GG-TALDWSWLQTE: de Dave S., et al., 2007, Journal of Immunology, vol 179, p7852-7859). Una alternativa a esta secuencia es (SEQ ID NO: 2) H-Asp-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-T rp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-T rp-Lys-Lys-Thr-Ala-Leu-Asp-T rp-Ser-T rp-Leu-Gln-Thr-Glu-OH (o DRQIKIWFQNRRMKWKK-TALDWSWLQTE: de Shibata, W., et al. 2007. Journal of Immunology, vol 179, p2681-2685; Jimi, E., et al. 2004. Nat. Med., 10, 617; Siegmund, D., et al. 2001. J. Biol. Chem. 276, 43708. May, M.J., et al. 2000; Science 289, 1550; Li, Q., et al. 1999; y Science 284, 1999). Como alternativa una secuencia (SEQ ID NO: 3) (Arg)s-Gly-Gly-Thr-Ala-Lue-Asp-Trp-Ser-Trp-Lue-Gln-Thr-Glu-OH (o RRRRRRRR-GG-TALDWSWLQTE) también será una molécula de carga ideal de la presente invención. Un análogo de la secuencia inhibidora de la SEQ ID NO: 1 y n.° 2 también es una molécula de carga ideal para la composición de la presente invención. Esta tiene la secuencia de (TAT-NBD; SEQ ID NO: 4) H-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Gly-Thr-Thr-Lue-Asp-Trp-Ser-Trp-Lue-Gln-Met-Glu-OH (o YGRKKRRQRRRG-TTLDWSWLQME: de Dai, S., et al., 2004. J. Biol. Chem. 279(36): 37219). Otro ejemplo es el péptido que puede actuar en el nivel intracelular para detener enfermedades inflamatorias autoinmunitarias uniéndose con la proteína de interacción con JNK que activa JNK. Un ejemplo es el péptido básico unido a (SEQ ID NO: 62) Arg-Pro-Thr-Thr-Lue-Asn-Lue-Phe-OH (Péptido básico-Arg-Pro-Thr-Thr-Lue-Asn-Lue-Phe-OH). Un ejemplo más específico de este tiene la secuencia (SEQ ID NO: 5) Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Arg-Pro-Lys-Arg-Pro-Thr-Thr-Lue-Asn-Lue-Phe (o YGRKKRRQRRRRPKRPTTLNLF de Melino, M., et al., 2008, Journal of Immunology, vol 181, p7300-7306). La parte de la SEQ ID NO: 5 Arg-Pro-Thr-Thr-Lue-Asn-Lue-Phe es de la región de unión a JNK y la secuencia Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Arg-Pro-Lys- es el péptido penetrante celular o el dominio de transducción de péptidos. Otra secuencia que cumplirá el mismo fin que la SEQ ID NO: 4 es SEQ ID NO: 6 (Arg)s-Arg-Pro-Thr-Thr-Lue-Asn-Lue-Phe-OH. Otro péptido que puede suprimir la inflamación cuando se une a un péptido básico es el P65-P1. Este es el péptido básico unido a (SEQ ID NO: 63) Gln-Leu-Arg-Arg-Pro-Ser-Asp-Arg-Glu-Leu-Ser-Glu-OH. Cuando se une a un péptido básico procedente de antennapedia (PTD o dominio de translocación de péptidos), esto puede suprimir la activación de NF-kB inducida por lipopolisacárido, interleucina-1, ácido ocadaico, forbol 12-miristato 13-acetato y H2O2. Este péptido puede desempeñar un papel en la sensibilización de células a la apoptosis inducida por TNF, doxorrubicina y cisplatino. p65-P1 contiene un único sitio de fosforilación y este es necesario para el nivel de actividad de NF-kB. Más específicamente la secuencia es (SEQ ID NO: 7) H-Asp-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-Gln-Leu-Arg-Arg-Pro-Ser-Asp-Arg-Glu-Leu-Ser-Glu-OH (o DRQIKIWFQNRRMKWKK-QLRRPSDRELSE de Takada, Y. et al., 2004, J. Biol. Chem.
279, p15096). Como alternativa la secuencia puede ser (SEQ ID NO: 8) (Arg)s-Gln-Leu-Arg-Arg-Pro-Ser-Asp-Arg-Glu-Leu-Ser-Glu-OH. Otras secuencias que interfieren con la activación de NF-kB incluyen péptidos básicos unidos a secuencias seleccionadas de (SEQ ID NO: 64) -Gln-Arg-Lys-Arg-Gln-Lys-Leu-Met-Pro-OH (o QRKRQKLMP de Lin, Y.-Z., et al. 1995. J. Biol. Chem. 270, 14255) o (SEQ ID NO: 65) -Asp-Asp-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Lue-Asp-Ser-Met-Lys-Asp-Glu-amida (o DDRHDSGLDSMKDE-NH2 de Swaroop, N., et al. 2001, Pharm. Res. 18, 1631; Traenckner, E.B., et al. 1995, Em Bo . J. 14, 2876). Son ejemplos más específicos (SEQ ID NO: 9) (Arg)s-Gln-Arg-Lys-Arg-Gln-Lys-Leu-Met-Pro-OH y (SEQ ID NO: 10) (Arg)s-DDRHDSGLDSMKDE-NH2. Cortistatina-29 (humano): (SEQ ID NO:11) Pyr-Glu-Gly-Ala-Pro-Pro-Gln-Gln-Ser-Ala-Arg-Arg-Asp-Arg-Met-Pro-Cys-Arg-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Ser-Ser-Cys-Lys-OH (Enlace disulfuro). Pyr es ácido piroglutámico. Esto representa un factor antiinflamatorio, inmunomodulador con un uso terapéutico multietapa potencial en el tratamiento del choque séptico y la enfermedad de Crohn. (E. González-Rey et al., J. Exp. Med., 203, 563 (2006); E. González-Rey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, 4228 (2006)). Estos péptidos o sus derivados son ejemplos de moléculas de carga para el vehículo de la presente invención.
Interferones de Tipo I, Tipo II y Tipo III. Los interferones tienen actividad antiinflamatoria, especialmente interferones de tipo I. El interferón beta (pI = 8,9-9,7) por ejemplo es un interferón de tipo I usado para el tratamiento de la esclerosis múltiple y tiene actividad antiinflamatoria. El punto isoeléctrico básico de alguno de estos interferones y/o la presencia de una parcela de carga positiva en su superficie es ideal para el vehículo de la presente invención. Dicha propiedad permite que se unan con los vehículos de la presente invención. Aunque los expertos y conocedores de la materia esperarán que dicha unión ilustrada por HB-EGF se vea superada por componentes sanguíneos, el descubrimiento sorprendente de los inventores es que dicha forma de unión con el vehículo puede soportar la presencia de componentes sanguíneos, un resultado que es inesperado.
b) Péptidos antiinfecciosos (para tratamiento de infecciones)
Las magaininas son antibióticos peptídicos con actividades antibacterianas y antiparasitarias, extraídos originalmente de la piel de Xenopus laevis. Magainina 1 y 2 son péptidos estrechamente relacionados de 23 aminoácidos cada uno y difieren en dos sustituciones. Estos péptidos antimicrobianos tienen actividad de amplio espectro, inespecífica contra una amplia serie de microorganismos, incluyendo virus, bacterias grampositivas y gramnegativas, protozoos, levaduras y hongos, y también pueden ser hemolíticos y citotóxicos para células cancerosas. La magainina 1 es un bactericida. Tanto magainina 1 como 2 muestran acción inhibidora hacia el virus de1Herpes simple de tipo 1 (VHS-1) y VHS-2. (Williams, RW. et al. Biophysical J. 53, 631A (1988); Morvan, A. et al. Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 3, 327 (1994); Matanic, A. et al. Int. J. Antimicrob Agents 23, 382 (2004); Zasloff, M. Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 5449 (1987)) Secuencia de Magainina 1 (SEQ ID NO: 12) H-Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Leu-His-Ser-Ala-Gly-Lys-Phe-Gly-Lys-Ala-Phe-Val-Gly-Glu-Ile-Met-Lys-Ser-OH. Este péptido o su derivado es un ejemplo de una molécula de carga para el vehículo de la presente invención.
La Magainina 2 asume una hélice anfifílica cuando se une con fosfolípidos ácidos, formando un poro compuesto de un complejo supramolecular de péptido-lípido, dinámico. (SEQ ID NO: 13) H-Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Leu-His-Ser-Ala-Lys-Lys-Phe-Gly-Lys-Ala-Phe-Val-Gly-Glu-Ile-Met-Asn-Ser-OH (Zasloff, M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84, 5449 (1987); Cruciani, rA. et al. EJEMPLO 8, 187 (1992); Corzo, G. et al. Biochem. J. 359, 35 (2001); Matsuzaki, K. et al. Biochem.
36, 2104 (1997)). Este péptido o su derivado es un ejemplo de una molécula de carga para el vehículo de la presente invención.
La Cecropina A (SEQ ID NO: 14; H-Lys-Trp-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-Ile-Glu-Lys-Val-Gly-Gln-Asn-Ile-Arg-Asp-Gly-Ile-Ile-Lys-Ala-Gly-Pro-Ala-Val-Ala-Val-Val-Gly-Gln-Ala-Thr-Gln-Ile-Ala-Lys-NH2) es un péptido antimicrobiano de 37 restos lineal, catiónico, de origen natural. La Cecropina A destruye bacterias disipando gradientes iónicos electroquímicos transmembrana (Silvestro, L. et al. Biophysical J. 72, A195 (1997); Andreu, D. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 6475 (1983); Silvestro, L. et al. Biochem. 36, 11452 (1997)). Este péptido o su derivado es un ejemplo de una molécula de carga para el vehículo de la presente invención.
La Cecropina B (SEQ ID NO: 15; Lys-Trp-Lys-Val-Phe-Lys-Lys-Ile-Glu-Lys-Met-Gly-Arg-Asn-Ile-Arg-Asn-Gly-Ile-Val-Lys-Ala-Gly-Pro-Ala-Ile-Ala-Val-Leu-Gly-Glu-Ala-Lys-Ala-Lue-NH2) es un péptido antibacteriano pequeño de la polilla de cecropia, Hyalophora cecropia. Los péptidos antimicrobianos son esenciales para la defensa innata del hospedador como efectores de la eliminación de patógenos y pueden afectar a la célula hospedadora para promover la reparación de heridas. Kulagina, NV. et al. Sens Actuators B Chem. 121, 150 (2007); Vaara, M. et al. Antimicrob. Agents Chemo.
38, 2498 (1994); Florack, D. et al. Transgenic Res. 4, 132 (1995); Lee, P. et al. Wound Repair Regen. 12, 351 (2004)). Este péptido o su derivado es un ejemplo de una molécula de carga para el vehículo de la presente invención.
Péptido derivado del factorplaquetario humano 4 o C18G (SEQ ID NO: 16; H-Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly-OH) del factor plaquetario humano 4 es activo contra Salmonella. C18G es un péptido a-helicoidal sintético procedente del factor plaquetario humano IV. Se descubrió que este péptido es antibacteriano y activo contra Salmonella. (Coconnier-Polter, M-H. et al. Appl. Environ. Microbiol. 71, 6115 (2005); Darveau, R. et al. J. Clin. Invest. 90, 447 (1992)). Este péptido o su derivado es un ejemplo de una molécula de carga para el vehículo de la presente invención.
La Histatina-8 [Péptido Inhibidor de Hemaglutinación (HIP)] (SEQ ID NO: 17; H-Lys-Phe-His-Glu-Lys-His-His-Ser-His-Arg-Gly-Tyr-OH) es una de las histatinas salivares humanas (Hsts), que pertenece a la familia de los polipéptidos salivares, son proteínas pequeñas, catiónicas y ricas en histidina. Tienen actividades bactericidas y antifúngicas potentes contra Candida albicans y Cryptococcus neoformans y son por lo tanto reactivos terapéuticos potenciales contra especies de Candida. Destruyen células fúngicas uniéndose con la membrana celular, internalizando y alterando mecanismos reguladores del volumen y la función mitocondrial, lo que conduce a la producción de especies reactivas de oxígeno y pérdida no lítica. (Yoshida, M. et al. Biol. Pharm. Bull. 24, 1267 (2001); Ahmad, M. et al. J. Histochem. Cytochem. 52, 361 (2004)). Este péptido o su derivado es un ejemplo de una molécula de carga para el vehículo de la presente invención.
La Histatina-5 (SEQ ID NO: 18; H-Asp-Ser-His-Ala-Lys-Arg-His-His-Gly-Tyr-Lys-Arg-Lys-Phe-His-Glu-Lys-His-His-Ser-His-Arg-Gly-Tyr - OH) es un péptido antimicrobiano salivar básico humano con fuertes propiedades fungicidas (Helmerhorst, E. et al. J. Biol. Chem. 274, 7286 (1999)). Este péptido o su derivado es un ejemplo de una molécula de carga para el vehículo de la presente invención.
La Histatina-3 o H3 (SEQ ID NO: 19; H-Asp-Ser-His-Ala-Lys-Arg-His-His-Gly-Tyr-Lys-Arg-Lys-Phe-His-Glu-Lys-His-His-Ser-His-Arg-Gly-Tyr-Arg-Ser-Asn-Tyr-Leu-Tyr-Asp-Asn - OH) se encuentra en la saliva humana y posee propiedades antimicrobianas potentes. Este péptido rico en histidina es un inhibidor de las proproteína convertasas furina y PC7, pero actúa como sustrato para PC1. (Basak, A. J. Pept. Res. 49, 596(1997); Koshlukova, S. et al. Infect Immun. 68, 6848 (2000)). Este péptido o su derivado es un ejemplo de una molécula de carga para el vehículo de la presente invención.
El HNP-1 o Péptido de Neutrófilos Humanos Defensina-1 (SEQ ID NO: 21; H-Ala-Cys-Tyr-Cys-Arg-Ile-Pro-Ala-Cys-Ile-Ala-Gly-Glu-Arg-Arg-Tyr-Gly-Thr-Cys-Ile-Tyr-Gln-Gly-Arg-Leu-Trp-Ala-Phe-Cys-Cys-OH (Enlace disulfuro: 2-30, 4­ 19, 9-29). Las defensinas de mamífero son abundantes en los gránulos azurófilos citoplasmáticos de neutrófilos, células de Paneth del intestino delgado y algunos macrófagos. El HNP-1 es un péptido que posee amplias actividades tanto antimicrobianas (para bacterias tanto Grampositivas como Gramnegativas) como citotóxicas. HNP-1 reduce la infección adenovírica en más del 95 %. (Frick, I. et al. J. Biol. Chem. 278, 16561 (2003); Valore, E. et al. J. Clin. Invest.
97, 1624 (1996); Mizukawa, N. et al. Anticancer Res. 20, 1125 (2000); Bastian, A. y H. Schafer, Regul Pept. 101, 157 (2001)). Este péptido o su derivado es un ejemplo de una molécula de carga para el vehículo de la presente invención.
La Apidaecina IA (SEQ ID NO: 22; H-Gly-Asn-Asn-Arg-Pro-Val-Tyr-Ile-Pro-Gln-Pro-Arg-Pro-Pro-His-Pro-Arg-Ile - OH) es un derivado de péptido antibacteriano particular hallado en la linfa de abejas melíferas inmunes. Las Apidaecinas, los componentes más prominentes de la defensa humoral de la abeja melífera contra la invasión microbiana, son una serie de péptidos de 18 a 20 restos, ricos en prolina, pequeños. Inhiben la viabilidad de bacterias Gramnegativas; con actividad letal casi inmediata, independiente de un mecanismo “lítico” convencional, e implican reconocimiento estereoselectivo de moléculas diana. (Casteels-Josson, K. et al. EMBO J. 12, 1569 (1993); Casteels, P. J. Biol. Chem.
269, 26107 (1994); Li, W. et al. Pept. 27, 2350 (2006)). Este péptido o su derivado es un ejemplo de una molécula de carga para el vehículo de la presente invención.
Pirrocoricina: (SEQ ID NO: 23; H-Val-Asp-Lys-Gly-Ser-Tyr-Leu-Pro-Arg-Pro-Thr-Pro-Pro-Arg-Pro-Ile-Tyr-Asn-Arg-Asn-OH). Este péptido antibacteriano catiónico rico en prolina pirrocoricina destruye bacterias sensibles mediante la unión con la proteína de choque térmico de 70 kDa DnaK e inhibiendo el plegamiento proteico (Cudic, M. et al. Peptides 23, 2071 (2002), Bulet, P. et al. Dev. Comp. Immunol 23, 329 (1999)). Este péptido o su derivado es un ejemplo de una molécula de carga para el vehículo de la presente invención.
Péptido citolítico 1 (KP1): (SEQ ID NO: 24 (KLAKLAK)2-NH2) es un péptido antimicrobiano helicoidal que rompe la membrana celular altamente aniónica (la membrana bacteriana es más aniónica que la membrana celular de mamífero) y destruye células bacterianas preferentemente. Una secuencia más larga (SEQ ID NO: 25 (KLAKLAK)3-NH2) es más selectiva contra células bacterianas (Javadpour, M.M. et al. J. Med. Chem. 1996, 39: 3107-3113). Estos péptidos o sus derivados serán moléculas de carga ideales para el vehículo de la presente invención.
Fragmento de Catelicidina Humana 104-140 (LL-37): (SEQ ID NO: 26: LLGDFFRKSK EKIGKEFKRI VQRIKDFLRNLVPRTES). La proteína antimicrobiana catiónica humana de 18 kDa (hCAP-18) pertenece a la clase de catelicidinas. Se libera de granulocitos de neutrófilos activados. Después de la liberación, el extremo C terminal alfahelicoidal de 37 aminoácidos se escinde, formando el péptido antimicrobiano funcional LL-37. Aparte de ser antimicrobiano, LL-37 también se une con LPS, y se ha mostrado previamente que esta unión reduce la liberación de óxido nítrico inducida por LPS de la aorta de la rata y protege a los ratones de mortalidad por LPS. También se ha descubierto que LL-37 tiene actividades inmunomoduladoras y quimiotácticas mediadas a través del receptor de péptido de formilo FPRL1. Debido a que el péptido derivado de catelicidina humana LL-37 se une con y neutraliza lipopolisacáridos (LPS) bacterianos, esto podría tener por lo tanto efectos beneficiosos en el tratamiento de choque séptico. Otras variantes que incluyen truncamiento N terminal de LL-37, denominado 106 (aa 106 a 140, SEQ ID NO: 27: GDFFRKSKEK-IGKEFKRIVQ-RIKDFLRNLVPRTES), 110 (aa 110 a 140, SEQ ID NO: 28: RKSKEKIGKE FKRIVQRIKD FLRNLVPRTE S), BMAP-27 (SEQ ID NO: 30: GRFKRFRKKFKKLFKKLSPVIPLLHL-am) y una variante más hidrófoba, la LLKKK de 18 unidades (SEQ ID NO: 29: KLFKRIVKRI-LKFLRKLV). LL-37, fragmentos 106 y 110 y el LLKKK de 18 unidades inhibieron el crecimiento de Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, y Candida albicans en un ensayo de difusión radial, inhibieron la producción de óxido nítrico vascular inducida por lipopolisacáridos y atrajeron granulocitos de neutrófilos de forma similar. Aunque los fragmentos 106 y 110 provocaron menos hemólisis y fragmentación de ADN en células cultivadas que LL-37, el LLKK de 18 unidades indujo hemólisis grave. El efecto antibacteriano de los fragmentos 106 y 110 no se vio afectado por el suero, mientras que el efecto de LL-37 se redujo. La retirada de aminoácidos hidrófobos N terminales de LL-37 reduce su citotoxicidad así como su inhibición por suero sin afectar de forma negativa a su acción antimicrobiana o neutralizante de LPS. Dichos péptidos derivados de LL-37 pueden ser por lo tanto beneficiosos para el tratamiento de sujetos con septicemia. (Ciornei et al. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2005, 49(7): 2845-2850; Bals et al., J. Clin. Invest., 1999, 103: 1113-1117; Deslouches et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2005, 49(8)3208-3216). Estos péptidos o sus derivados son ejemplos de moléculas de carga ideales para el vehículo de la presente invención.
Protegrina-1 o PG-1: (SEQ ID NO: 36: RGGRLCYCRRRFCVCVGR) y los derivados IB-367 o Iseganano: SEQ ID NO: 37: RGGLCYCRGRFCVCVGR (Chen et al., Journal of Chromatography A, 853 (1999) 197-206; Jang et al., BMC Structural Biology 2007, 7:21; van Saene et al., van Saene et al., Chest, 2007, 132:1412; Kollef et al., America, Journal of Respiratory and Critical care, 2006, 173; Shi et al., Infection and Immunity, 1998, 66(8): 3611-3617. La familia de protegrina de péptidos antimicrobianos se identificó en leucocitos porcinos. Se han identificado ahora cinco secuencias de protegrina nativas (PG-1 a PG-5). Estas protegrinas nativas contienen de 16 a 18 aminoácidos, son muy homólogas y comparten la característica común de ser láminas beta anfipáticas, catiónicas. Las moléculas tienen enlaces disulfuro entre restos de cisteína en las posiciones 6 y 15 así como las posiciones 8 y 13. Iseganano, un péptido antimicrobiano, es activo contra bacterias grampositivas y gramnegativas aerobias y anaerobias, así como hongos y levaduras. Estos péptidos o sus derivados serán moléculas de carga ideales para el vehículo de la presente invención.
K4: (SEQ ID NO: 38: KKKKPLFGLFFGLF) es un péptido antimicrobiano diseñado usando la Base de Datos de Péptidos Antimicrobianos. Este péptido tiene fuerte actividad (lisa células bacterianas) contra bacterias grampositivas y gramnegativas incluyendo bacterias patógenas humanas tales como Staphylococcus aureus y algunas bacterias marinas del género Vibrio. El péptido no es tóxico para células de mamífero para concentraciones bacteriolíticas. (Duval et al., Peptides, 2009, 30: 1608-1612). Este péptido o su derivado es un ejemplo de una molécula de carga para el vehículo de la presente invención.
Indolicidina: La Indolicidina es un péptido antimicrobiano de 13 aminoácidos presente en los gránulos citoplasmáticos de neutrófilos bovinos. La Indolicidina es un miembro de la familia de catelicidina de péptidos antimicrobianos aislados de células mieloides de mamífero. Como un péptido de origen natural, la indolicidina tiene una composición particular que consiste en 39 % de triptófano y 23 % de prolina (SEQ ID NO: 39: ILPWKWPWWPWRR-am; y variantes, SEQ ID NO: 40: ILPWKWPWWPWRR-met; SEQ ID NO: 41: ILKKWPWWPWRRK; SEQ ID NO: 42: ILKKWPWWPWRRK-met), y en la naturaleza el péptido está amidado en el extremo C. La Indolicidina tiene actividad contra bacterias grampositivas y gramnegativas, hongos y protozoos. Estos péptidos o sus derivados serán moléculas de carga ideales para el vehículo de la presente invención.
Fragmento de Lactoferrina Humana (hLF(1-11): (SEQ ID NO: 43: GRRRRSVQWCA) La lactoferrina humana (hLF) es un componente principal de la defensa inespecífica de superficies de la mucosa y neutrófilos y está activo contra una diversidad de patógenos. Los estudios con péptidos sintéticos correspondientes a los primeros 11 aminoácidos N terminales, designados hLF(1-11), tienen la actividad bactericida. (Nebbering et al. Infection and Immunity, 2001,69(3): 1469-1476). Este péptido o su derivado es un ejemplo de una molécula de carga para el vehículo de la presente invención.
Polifemusina 1 y Taquiplesina I: (SEQ ID NO: 44: RRWCFRVCYRGFCYRKCR-NH2 , SEQ ID NO: 44: KWCFRVCYRGICYRRCR-NH2). Las Taquiplesinas son del cangrejo cacerola japonés Tachypleus tridentatus y las Polifemusinas son del cangrejo cacerola americano Limulus polyphemus. Estos péptidos son de 17-18 restos de aminoácidos de longitud, contienen dos enlaces disulfuro y tienen una arginina C terminal amidada. Ambas familias de péptidos poseen actividad antibacteriana, que inhibe el crecimiento de especies tanto Grampositivas como Gramnegativas, y hongos, además de una capacidad para prevenir la replicación de virus con envoltura tales como gripe A y VIH. Estos péptidos o sus derivados serán moléculas de carga ideales para el vehículo de la presente invención.
El Interferón gamma (pI=8,5-9,5) es un interferón de tipo II que tiene actividad antivírica y puede usarse para el tratamiento de la infección por hepatitis y otras infecciones víricas. Los interferones beta (pI=8,9-9,7) son interferones de tipo I que tienen actividad antivírica y pueden usarse para el tratamiento de infecciones por hepatitis. Estos interferones tienen puntos isoeléctricos básicos y están entre las moléculas de carga ideales para el vehículo de la presente invención.
c) Estimulantes de crecimiento (para el tratamiento de lesiones tisulares)
PR39, Factor Antiapoptótico (SEQ ID NO: 31; H-Arg-Arg-Arg-Pro-Arg-Pro-Pro-Tyr-Leu-Pro-Arg-Pro-Arg-Pro-Pro-Pro-Phe-Phe-Pro-Pro-Arg-Leu-Pro-Pro-Arg-Ile-Pro-Pro-Gly-Phe-Pro-Pro-Arg-Phe-Pro-Pro-Arg-Phe-Pro - OH) se aisló originalmente del intestino de cerdo, este péptido de 39 aminoácidos rico en prolina y arginina también se encuentra en gránulos azurófilos de neutrófilos y macrófagos. Este péptido desempeña un papel en la movilidad celular y el potencial metastásico en la reparación de heridas; se une con la proteína del complejo de NADPH oxidasa p47phox7 y una proteína adaptadora de la señalización p130Cas. Además, recientemente, se ha descubierto que PR39 inhibe la apoptosis inducida por hipoxia y reduce la actividad caspasa-3 en células endoteliales. (Wu, J. et al. Circulation 109, 1660 (2004)). Los derivados de PR39 incluyen SEQ ID NO: 32: RRRPRPPYLPRPRPPPFFPPRLPPRI o PR26; SEQ ID NO: 33: RRRPRPPYLPRPRPPPFFP o PR19; SEQ ID NO: 34: RRRPRPPYLPR o PR11; y péptidos relacionados tales como SEQ ID NO: 35: RLCRIVVIRVCR o Bactenecina. (Agerberth, B. et al., Eur. J. Biochem., 202, 849-854, 1991; Boman, H.G. et al., Infect. Immun., 61,2978-2984, 1993; Agerberth, B. et al., Vet. Immunol. Immunopathol., 54, 127-131, 1996; Gallo, R.L. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 11035-11039, 1994; Li, J. et al., Circ. Res., 81, 785­ 796, 1997; Gudmundsson, G.H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 7085-7089, 1995; Li, J. et al., Nature. Med., 6, 49-55, 2000; Li, J. et al., Nature. Med., 6, 356, 2000; Gao, Y. et al., J. Clin. Invest., 106, 439-448, 2000; Bao, J. et al. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 281,2612-2618, 2001; Madhani et al., Biochimica et Biophysica Acta 1588 (2002) 232-240). Estos péptidos o sus derivados serán moléculas de carga ideales para el vehículo de la presente invención.
Péptido activador de TGF beta. Un péptido activador del Factor de Crecimiento Transformante p (TGF-p) derivado de trombospondina (TSP-1). Este motivo básico (SEQ ID NO: 46) H-Lys-Arg-Phe-Lys-NH2 (KRf K) en combinación con secuencias Trp-Xaa-Xaa-Trp induce fuerte unión a heparina. Esta secuencia Trp-Xaa-Xaa-Trp es los aminoácidos 412-415 de TSP-1 y es suficiente para activar TGF-p latente. (Shultz-Cherry, S. et al. J. Biol. Chem. 270, 7304 (1995); Guo, N. et al. J. Biol. Chem. 267, 19349 (1992)). Son ejemplos de secuencias procedentes del motivo anterior SEQ ID NO: 48 (H-Lys-Arg-Phe-Lys-Gln-Asp-Gly-Gly-Trp-Ser-His-Trp-Ser-Pro-Trp-Ser-Ser-OH; o KRFKQDGGWSHWSPWSS) y SEQ ID NO: 49 (H-Lys-Arg-Phe-Lys-Gln-Asp-Gly-Gly-Trp-Ser-His-Trp-Ser-Pro-OH; o KRFKQDGGWSHWSP). Estos péptidos o sus derivados serán moléculas de carga ideales para el vehículo de la presente invención.
d) Inhibidor del crecimiento (para el tratamiento del cáncer y crecimiento en exceso de células o cicatrices)
Los interferones alfa (pI=8,8-9,1) son interferones de tipo I que pueden ser útiles para el tratamiento de algunos tipos de cáncer. Pueden usarse interferones alfa para tratar el cáncer del riñón, melanoma maligno, melanoma cutáneo, mieloma múltiple y tumores carcinoides. T ambién puede usarse para tratar determinados tipos de linfoma y leucemia. El Interferón gamma (pI=8,5-9,5) es un interferón de tipo II que tiene actividad anti-cicatricial (suprime el exceso de crecimiento/actividad de células formadoras de cicatrices) y puede usarse para el tratamiento de cirrosis hepática, cirrosis pulmonar, enfermedad granulomatosa crónica, osteopetrosis y cicatrización inducida por Mycobacterium. La cicatrización o el exceso de depósitos de tejido conectivo pueden estar provocados por productos químicos o infecciones.
Inhibidores de TGF-beta procedentes de o que comprenden una cualquiera de las SEQ ID NO: 56 (FCLGPCPYIWSLDT o Tb143-56), SEQ ID NO: 57 (TSLDASIWAMMQNA o P144), SEQ ID NO: 58 (KRIWFIPRSSWYERA o P17) y SEQ ID NO: 58 (TSLDATMIWTMM). Estos péptidos pueden modificarse para contener restos básicos para poder unirse con el vehículo de la presente invención, con la composición resultante que será útil para el tratamiento de cirrosis hepática, fibrosis pulmonar, enfermedad granulomatosa crónica, osteopetrosis y cicatrización inducida por Mycobaterium.
Inhibidor de bFGF (SEQ ID NO: 50; H-Lys-Arg-Thr-Gly-Gln-Tyr-Lys-Leu-OH): Este péptido corresponde a restos humanos, bovinos (119-126), de ratón, de rata (118-125) y de Factor de Crecimiento de Unión a Heparina 2 (118-125) de bFGF. Inhibe la dimerización y activación de receptores de bFGF. (Yayon, A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 10643 (1993)). Este péptido o su derivado es un ejemplo de una molécula de carga para el vehículo de la presente invención.
Péptido derivado del factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF-2): FGF-2 es un factor de crecimiento autocrino en la proliferación autónoma de células de glioma. El péptido derivado de FGF-2 (SEQ ID NO: 51; H-Met-Trp-Tyr-Arg-Pro-Asp-Leu-Asp-Glu-Arg-Lys-Gln-Gln-Lys-Arg-Glu-OH) suprime el crecimiento de glioma maligno. Este péptido de 16 restos tiene similitud conformacional con el dominio de unión a receptor potencial de FGF-2. Suprime el crecimiento de células de glioma humano y es un nuevo producto de tratamiento potencial para el glioma maligno (Kono, K. et al. J. Neuro-Oncology 63, 163 (2003)). Este péptido o su derivado es un ejemplo de una molécula de carga para el vehículo de la presente invención.
Caribdotoxina (SEQ ID NO: 52; Pyr-Phe-Thr-Asn-Val-Ser-Cys-Thr-Thr-Ser-Lys-Glu-Cys-Trp-Ser-Val-Cys-Gln-Arg-Leu-His-Asn-Thr-Ser-Arg-Gly-Lys-Cys-Met-Asn-Lys-Lys-Cys-Arg-Cys-Tyr-Ser-OH (Enlace disulfuro: 7-28, 13-33 y 17­ 35)): Caribdotoxina (ChTX) es un bloqueador de canal K+ activado por Ca2+. Despolariza linfocitos T periféricos y bloquea su proliferación inducida por mitógeno. ChTX es un péptido muy básico aislado del veneno del escorpión, Leiurus quinquestriatus hebraeus. (Leonard, R. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10094 (1992); Giménez-Gallego, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 3329 (1988). Sugg, E. et al. J. Biol. Chem. 265, 18745 (1990)). Este péptido o su derivado es un ejemplo de una molécula de carga para el vehículo de la presente invención.
Péptido de Fusión de Antennapedia Bak BH3 (Ant-BH3) (71-89) (SEQ ID NO: 53: H-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-Met-Gly-Gln-Val-Gly-Arg-Gln-Leu-Ala-Ne-Ne-Gly-Asp-Asp-Ne-Asn-Arg-Arg-Tyr-OH). Este es un péptido de fusión que contiene el fragmento de aminoácidos 71 a 89 del dominio de Bak BH3 fusionado con el péptido antennapedia. El dominio de homología 3 de Bcl-2 (BH3) es crucial para las propiedades inductoras de muerte y de dimerización de los miembros proapoptóticos de la familia de proteínas de Bcl-2, incluyendo Bak, Bax y Bad. Los péptidos sintéticos correspondientes al dominio BH3 de Bak se unen con Bcl-xL, antagonizan su función antiapoptótica e inducen rápidamente la apoptosis cuando se suministran a células intactas mediante fusión con el dominio de internalización de homoproteína antennapedia. Holinger, E. et al. J. Biol. Chem. 274, 13298 (1999). Este péptido o su derivado es un ejemplo de una molécula de carga para el vehículo de la presente invención.
Péptido Proapoptótico dirigido a Tumores: (SEQ ID NO: 54: H-Cys-Asn-Gly-Arg-Cys-Gly-Gly-D-Lys-D-Leu-D-Ala-D-Lys-D-Leu-D-Ala-D-Lys-D-Lys-D-Leu-D-Ala-D-Lys-D-Leu-D-Ala-D-Lys-NH2 (con enlace disulfuro intrapeptídico y la D representa isómero D del aminoácido). Este es igual que CNGRCGGklaklakklaklak-NH2 (Enlace disulfuro) o CNGRCGG-(klaklak)2-NH2 (con enlace disulfuro intrapeptídico) donde los códigos de aminoácidos de letras minúsculas representan el isómero D de los aminoácidos correspondientes. Este péptido consiste en dos dominios funcionales, por un lado un dominio “guiado” o de dirección que guía al péptido a células diana y permite su internalización y por otro lado una secuencia inductora de muerte celular programada. El domino de dirección contiene el motivo Asn-Gly-Arg (NGR) que ha demostrado ser útil para suministrar diversos compuestos antitumorales y partículas víricas a vasos tumorales. Como secuencia inductora de muerte celular programada se seleccionó el péptido de 14 aminoácidos sintético klaklakklaklak, también denominado (klaklak)2 , debido a que destruye bacterias a concentraciones 1 % de las requeridas para destruir células eucariotas. Este dominio proapoptótico no es tóxico fuera de las células, pero es tóxico cuando se internaliza en células diana mediante la alteración de membrana mitocondriales. Por lo tanto, los péptidos proapoptóticos dirigidos representan una nueva clase potencial de agentes antineoplásicos. Combinan dos niveles de especificidad: “guiado” a células diana y apoptosis selectiva de dichas células después de la entrada. (H.M. Ellerby et al., Nat. Med., 5, 1032 (1999); G.Colombo et al., J. Biol. Chem., 277, 47891 (2002); L.A. Plesniak et al., Protein Sci., 13, 1988 (2004)). Este péptido o su derivado es un ejemplo de una molécula de carga para el vehículo de la presente invención. Las secuencias presentadas en la Tabla 1 se basan en la abreviatura de una letra para cada aminoácido conocida en la técnica y los aminoácidos representados pueden ser isómeros D o L. “Pyr” indica piroglutamato, “am” indica aminado en el extremo carboxilo y “met” indica metilación.
T l 1 E m l m l l r í i m l m n l r n in n i n
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continuación
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continuación
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La proteína y el péptido unidos de forma electrostática al vehículo según la presente invención pueden dar como resultado circulación más larga en el cuerpo, más estabilidad en la sangre y/o administración más conveniente (por ejemplo, administraciones más rápidas tales como mediante embolada en lugar de infusión y administraciones menos frecuentes, por ejemplo, una vez cada varios días en lugar de infusión o una vez al día). Con frecuencia la administración crónica de un agente activo proteico básico puede ser inmunogénica. Las formulaciones basadas en vehículo dan como resultado en general menos inmunogenicidad que sistemas de suministro basados en PEG de modo que se espera que la proteína o el péptido básicos sean menos inmunogénicos en composiciones de las presentes invenciones. La “PEGilación Directa” del agente activo es la unión directa de la proteína con PEG y puede dar como resultado pérdida de actividad. Una proteína o un péptido catiónico unidos electrostáticamente con grupos aniónicos que están unidos covalentemente a la cadena principal del vehículo con cadenas laterales protectoras, sin embargo, pueden dar como resultado una alternativa estable, de circulación a largo plazo, a la PEGilación. En una realización, la interacción entre la molécula de carga y el grupo aniónico de la composición es más estable en sangre que la interacción entre la molécula de carga y grupos hidrófobos que pueden ser elementos de la composición. Los vehículos de la presente invención pueden actuar como un crioprotector y estabilizador macromolecular que conservan el agente activo proteico o peptídico básico en solución así como durante el proceso de liofilización y reconstitución.
Aunque las combinaciones de proteína o péptido/vehículo unidas de forma electrostática se describen en el presente documento como composiciones, pueden, como alternativa, entenderse como compuestos que incluyen enlaces electrostáticos. En diversas realizaciones de la invención, pueden excluirse componentes no enumerados en el presente documento que pueden alterar el funcionamiento de la invención permitiendo al mismo tiempo la inclusión de componentes que no alteran el funcionamiento de componentes necesarios. Los elementos no enumerados en el presente documento que pueden alterar el funcionamiento de la invención pueden excluirse mediante el uso de la expresión “que consiste esencialmente en” al describir los elementos necesarios de la invención. Sin embargo, el uso de la expresión “que consiste esencialmente en” no excluye elementos que no alteren el funcionamiento de los componentes necesarios. En una realización “que consiste esencialmente en” significa que la Kd para interacciones iónicas es menor de 10 pM y ninguna otra interacción, tal como interacciones hidrófobas, tendrá una Kd menor de 10 pM.
Liberación sostenida:
Cuando el vehículo de la presente invención se usa para formular un agente activo proteico o peptídico, se observará una liberación del agente activo durante un periodo prolongado como evidente a partir de la presencia sostenida del agente activo en la sangre en comparación con la administración del agente activo solo. La asociación del vehículo con el agente activo se define por la constante de disociación específica (Kd) que puede ser determinada fácilmente por los expertos en la materia. La liberación se determinará por la concentración de agente activo libre de modo que cuando la concentración de agente activo libre desciende (debido a la degradación o eliminación por el cuerpo) y ya no se cumple la Kd, se liberará más agente activo para cumplir la Kd. La Kd es el producto de la concentración de agente activo libre y la concentración de agrupamientos aniónicos (no asociados con el agente activo) dividida por la concentración del agente activo asociado con grupos aniónicos. Para las composiciones de la presente invención que forman estructuras supramoleculares tales como micelas, liposomas y otras estructuras, la tasa de liberación aún seguirá la Kd pero debido a la compartimentalización la Kd solamente se cumplirá en cada compartimento específico. Sin embargo, la mezcla a largo plazo de los diversos compartimentos dará como resultado liberación con el tiempo del agente activo al ambiente circundante. En ambos casos tanto si está implicada o no compartimentalización, un perfil de liberación dará como resultado suministro prolongado (durante, por ejemplo de 1 a aproximadamente 4.000 horas, o como alternativa de aproximadamente 4 a aproximadamente 1500 horas) de cantidades eficaces (por ejemplo, de aproximadamente 0,00001 mg/kg/hora a aproximadamente 10 mg/kg/hora) del agente activo. La ventaja de la formulación es administración por embolada menos frecuente de continua a una vez al día o incluso una vez a la semana. Esto proporcionará un nivel más constante de agente activo en la sangre con menos fluctuación en comparación con un agente activo no formulado. La frecuencia de administración de embolada variará según las necesidades del sujeto y puede ser determinada fácilmente por los expertos en la materia. Sin desear quedar ligado a la teoría, en una realización, una ventaja de la invención con respecto a un vehículo que contiene un resto hidrófobo está en el proceso de fabricación de la presente invención, que puede permitir el uso de agua sin la necesidad de disolventes orgánicos. Los sistemas acuosos pueden representar una ventaja de fabricación significativa.
Usos terapéuticos
Un “paciente”, “sujeto” u “hospedador” para tratar con la composición de la presente invención puede significar un ser humano o animal no humano. Las proteínas básicas (proteína catiónica) de la presente invención son útiles en el tratamiento de dichas enfermedades y trastornos tales como, pero sin limitación, infecciones bacterianas, cáncer y enfermedades neoplásicas relacionadas, y enfermedad de Alzheimer. Las composiciones de la presente invención pueden usarse en la fabricación de un medicamento para cualquier variedad de usos, incluyendo por ejemplo, tratar cualquier enfermedad u otra afección tratable de un sujeto.
A) Tratamiento de la inflamación
La composición de la presente invención con molécula de carga que comprende las SEQ ID NO: 1-11 o sus derivados o análogos puede usarse para tratar la inflamación. Son ejemplos de enfermedades inflamatorias crónicas que pueden beneficiarse de la composición de la presente invención: artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino crónica, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y diabetes.
B) Tratamiento de infecciones
La composición de la presente invención con molécula de carga que comprende las SEQ ID NO: 12-45 o sus derivados o análogos puede usarse para tratar infecciones. Las proteínas básicas de la presente invención son útiles en el tratamiento de infecciones bacterianas. Los agentes activos ilustrativos para tratamiento incluyen lisostafina, una proteína básica que tiene carga positiva global a pH fisiológico. La lisostafina escinde cruces de pentaglicina en el peptidoglucano de la pared celular de bacterias grampositivas. S. aureus es particularmente susceptible a los efectos bacteriolíticos de esta enzima ya que su pared celular contiene una alta proporción de cruces de pentaglicina. La lisostafina es una terapia sistémica potencial para tratar infecciones mediadas por S. aureus multirresistentes incluyendo endocarditis, osteomielitis, infecciones relacionadas con el catéter y furunculosis y neumonía adquiridas en la comunidad mediadas por MRSA.
C) Tratamiento de daño tisular o celular
En una realización, las proteínas básicas de la presente invención incluyen Factor de Crecimiento Transformante (TGF-alfa, beta-1, beta-2, beta 3; pl 8-9), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF-A, -B, -C, -D; pI 8,0-9,5), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF, con 22 miembros; pI 8,0-9,0), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF; tiene sitios positivos que se unen con restos de sulfato), factor de crecimiento nervioso (NGF, pI 8,5-9,5) y un factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-AA, - BB, -AB; pI 8,5-10). Estos factores de crecimiento son útiles en la estimulación del crecimiento de órganos lesionados tales como islotes pancreáticos en el caso de diabetes o corazón en el caso de infarto de miocardio. Estos factores de crecimiento pueden formularse o combinarse con el vehículo de la presente invención y usarse para el tratamiento de la diabetes o el infarto de miocardio. Las proteínas anteriores tienen una carga positiva global a pH fisiológico o tienen una parcela de carga positiva y son capaces de unirse con los grupos aniónicos del vehículo de la presente invención. Otros miembros de la familia del factor de crecimiento epidérmico (EGF) incluyendo EGF de unión a heparina (HB-EGF), Betacelulina (BTC), Anfirregulina (AR), Epiregulina (EPR), Epígeno (EPR) y neurorregulina tienen sitios de unión capaces de unirse con restos de sulfato y pueden formularse usando el vehículo de la presente invención. Pueden usarse TGF-alfa, VEGF y HB-EGF para hacer crecer células de islotes en diabetes. La composición de la presente invención con molécula de carga que comprende las SEQ ID NO: 31-34 y 46-49 o sus derivados o análogos pueden usarse para tratar el daño tisular o celular. En otra realización más, la molécula de carga de la presente invención puede ser una cualquier de factor de crecimiento de fibroblastos (FGF; pI 9,6); factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) o eritropoyetina sin ácido siálico (pI 8,5). Todos los miembros de la familia FGF tienen un punto isoeléctrico básico o tienen parcelas de cargas positivas en su superficie que pueden unirse con grupos aniónicos en el vehículo de la presente invención. Estos factores de crecimiento son útiles para el tratamiento de lesiones por radiación o químicas que requiere la regeneración de órganos. Por ejemplo, la exposición accidental a radiación se beneficiará del uso de FGF a largo plazo (una formulación de FGF con vehículo de núcleo aniónico de la presente invención) que mejorará la regeneración de la mucosa intestinal y la médula ósea. La formulación de eritropoyetina en el vehículo de núcleo aniónico de la presente invención será útil para el tratamiento de daño de la médula ósea o colapso por aceleración de la recuperación de la médula ósea, especialmente cuando el nivel de eritropoyetina se mantiene durante un periodo de tiempo prolongado debido al vehículo de la presente invención.
D) Tratamiento de cáncer o exceso de crecimiento
La composición de la presente invención con molécula de carga que comprende las SEQ ID NO: 50-55 o sus derivados o análogos puede usarse para tratar el cáncer o el exceso de crecimiento.
Adm inistración y Dosificaciones
Un “paciente”, “sujeto” u “hospedador” para tratar con la composición de la presente invención puede significar un ser humano o animal no humano.
La expresión “excipiente farmacéuticamente aceptable” está reconocida en la técnica y se refiere a un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como una carga líquida o sólida, diluyente, disolvente o material encapsulante administrado junto con la composición. Cada excipiente es “aceptable” en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes del complemento y no perjudicial para el sujeto. Algunos ejemplos de materiales que pueden actuar como excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; (2) almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; (3) celulosa y sus derivados, tales como carboximetil celulosa sódica, etilcelulosa y acetato de celulosa; (4) goma arábiga en polvo; (5) malta; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes, tales como manteca de cacao y ceras de supositorio; (9) aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; (10) glicoles, tales como propilenglicol; (11) polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; (12) ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; (13) agar; (14) agentes tamponantes, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; (15) ácido algínico; (16) agua apirógena; (17) solución salina isotónica; (18) solución de Ringer; (19) alcohol etílico; (20) soluciones de tampón de fosfato; y (21) otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en formulaciones farmacéuticas.
La dosificación del agente activo o peptídico/proteico de la presente invención variará dependiendo de los síntomas, la edad y el peso corporal del sujeto, la naturaleza y la gravedad de la enfermedad o el trastorno, la vía de administración y otros fármacos/agentes activos que se administran al sujeto en conjunto. La dosificación debería proporcionarse siempre para asegurar que el beneficio del péptido/proteína supera el riesgo para el sujeto con respecto a toxicidad y otros efectos secundarios. En casos en los que el agente activo es lisostafina, la dosificación dependerá de la gravedad de las infecciones, y la forma de otros antibióticos complementarios. En casos en los que el agente activo es agente antiinflamatorio, la dosificación dependerá de la gravedad de la inflamación y la causa de la inflamación, y la forma de otros fármacos antiinflamatorios complementarios. En casos en los que el agente activo es factor de crecimiento, la dosificación dependerá de la seguridad y tolerabilidad del factor de crecimiento y el beneficio supera el riesgo, y si el factor de crecimiento se usa solo o en combinación con otro factor de crecimiento y agente inductor del factor de crecimiento tal como Omeprazol, en el caso de la diabetes. Cualquiera de las formulaciones objeto pueden administrarse en una única dosis o en dosis divididas. Las dosificaciones para la formulación de péptido/proteína de la presente invención pueden determinarse fácilmente mediante técnicas conocidas por los expertos en la materia o como se enseña en el presente documento. Además, la presente invención contempla mezclas de una o más de las formulaciones de la presente invención junto con uno o más antibióticos u otros agentes terapéuticos. En casos particulares el vehículo que contiene lisostafina de la presente invención puede administrarse junto con uno cualquiera o más de otros antibióticos seleccionados de: amoxicilina, ampicilina, azidocilina, azlocilina, aztreonam, bacitacina, benzatina bencilpenicilina, benzatina fenoximetilpenicilina, bencilpenicilina (G), biapenem, carbenicilina, cefacetrilo, cefadroxilo, cefalexina, cefaloglicina, cefalonio, cefaloridina, cefalotina, cefapirina, cefatricina, cefacedona, cefazaflur, cefazolina, cefradina, cefroxadina, ceftezol, cefaclor, cefamandol, cefminox, cefonicida, ceforanida, cefotiam, cefprocilo, cefbuperazona, cefuroxima, cefuzonam, cefamicina (tal como cefoxitina, cefotetano, cefmetazol), carbacefem (tal como loracarbef), cefcapeno, cefdaloxima, cefdinir, cefditoreno, cefetamet, cefixima, cefmenoxima, cefodicima, cefoperazona, cefotaxima, cefpimizol, cefpiramida, cefpodoxima, cefsulodina, ceftacidima, cefteram, ceftibuteno, ceftioleno, ceftizoxima, ceftriaxona, oxacefem (tal como flomoxef, latamoxef), cefepima, cefozoprano, cefpiroma, cefquinoma, ceftobiprol, cloranfenicol, clorohexidina, clindamicina, clometocilina, cloxacilina, colistina, cicloserina, daptomicina, doripenem, doxiciclina, epicilina, ertapenem, eritromicina, faropenem, fostomicina, gentamicina, imipenem, linazolida, mecilinam, meropenem, meticilina, meticilina, mezlocilina, minociclina, mupirocina, nafcilina, neomicina, oxacilina, panipenem, penamecilina, feneticilina, fenoximetilpenicilina (V), piperacilina, polimixina, polimixina B, procaína bencilpenicilina, propicilina, quinupristina/dalfopristina, ramoplanina, rifampicina, rifampina, sulbenicilina, teicoplanina, tigeciclina, tigemonam, trimetoprim/sulfametoxazol y vancomicina. En realizaciones particulares, el vehículo que contiene proteínas básicas de la presente invención puede administrarse junto con uno cualquiera o más de antibióticos adicionales seleccionados de: aztreonam, bacitacina, ceftazidima, cloranfenicol, clorohexidina, clindamicina, daptomicina, doxiciclina, eritromicina, gentamicina, linezolida, meticilina, minociclina, mupirocina, neomicina, oxacilina, polimixina, quinupristina/dalfopristina, rifampicina, rifampina, teicoplanina, temocilina, ticarcilina, tigeciclina, trimetoprim/sulfametoxazol y vancomicina. En realizaciones particulares, el vehículo que contiene proteínas básicas de la presente invención puede administrarse junto con cualquier antibiótico glucopeptídico en relaciones en peso de proteína básica con respecto a antibiótico glucopeptídico que varían de 0,1:1 a 20:1. En realizaciones particulares, el intervalo de relaciones en peso es de 0,5:1 a 7:1. El antibiótico glucopeptídico puede seleccionarse del grupo que consiste en vancomicina, teicoplanina y ramoplanina. La composición de la presente invención puede estar en una forma adecuada para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, intratecal o tópica.
También desvela un método para tratar una infección estafilocócica en un sujeto humano que comprende: administrar la composición de la presente invención que contiene un vehículo con carga aniónica que está unido electrostáticamente con lisostafina; en donde se administra lisostafina en una cantidad de 1 mg a 150 mg/kg de peso corporal/día al sujeto humano; y administrar un antibiótico beta-lactámico en una cantidad de 50 a 250 mg/kg de peso corporal/día al sujeto humano. El antibiótico beta-lactámico puede administrarse junto con el vehículo y lisostafina; de modo que la dosis de beta-lactama en el sujeto humano es antibiótico de 100 a 200 mg/kg de peso corporal/día. El antibiótico beta-lactámico puede ser una penicilina, una cefalosporina, penem, un carbapenem o una monobactama. Los antibióticos beta-lactámicos que pertenecen a penicilinas incluyen: aminopenicilinas (tales como amoxicilina, ampicilina y epicilina); carboxipenicilinas (tales como carbenicilina, ticarcilina, temocilina); ureidopenicilinas (azlocilina, piperacilina, mezlocilina); y otras: (tales como mecilinam, sulbenicilina, bencilpenicilina (G), azidocilina, penamecilina, clometocilina, benzatina bencilpenicilina, procaína bencilpenicilina, fenoximetilpenicilina (V), propicilina, benzatina, fenoximetilpenicilina, feneticilina, oxacilina, cloxacilina, meticilina, nafcilina). Los antibióticos beta-lactámicos que pertenecen a cefalosporinas son: cefacetrilo, cefadroxilo, cefalexina, cefaloglicina, cefalonio, cefaloridina, cefalotina, cefapirina, cefatrizina, cefazedona, cefazaflur, cefazolina, cefradina, cefroxadina, ceftezol, cefaclor, cefamandol, cefminox, cefonicida, ceforanida, cefotiam, cefprozilo, cefbuperazona, cefuroxima, cefuzonam, cefamicina, carbacefem, cefcapeno, cefdaloxima, cefdinir, cefditoreno, cefetamet, cefixima, cefmenoxima, cefodizima, cefoperazona, cefotaxima, cefpimizol, cefpiramida, cefpodoxima, cefsulodina, ceftazidima, cefteram, ceftibuteno, ceftioleno, ceftizoxima, ceftriaxona, oxacefem, cefepima, cefozoprano, cefpiroma, cefquinoma, y ceftobiprol. Los antibióticos beta-lactámicos que pertenecen a carbopenémicos son: biapenem, doripenem, ertapenem, imipenem, meropenem y panipenem. El antibiótico beta-lactámico que es penémico es faropenem.
En casos determinados, la dosificación de una formulación de péptido/proteína estará en general en el intervalo de aproximadamente 0,01 ng a aproximadamente 1000 mg de proteína básica por kg de peso corporal, específicamente en el intervalo de aproximadamente 1 ng a aproximadamente 100 mg de proteína básica por kg, y más especialmente en el intervalo de aproximadamente 100 ng a aproximadamente 20 mg de proteína básica por kg. El intervalo de dosis más preferible será de aproximadamente 100 ng a aproximadamente 20 mg de proteína básica por kg. La cantidad de péptido/proteína en relación con el peso del vehículo en una formulación puede estar en el intervalo de aproximadamente 1 % a 1000 % del peso del vehículo. En un caso la cantidad de proteína básica proteína en relación con el peso del vehículo en una formulación puede estar en el intervalo de aproximadamente 5 % a 500 % del peso del vehículo. En otros casos la cantidad de proteína básica en relación con el peso del vehículo en una formulación puede estar en el intervalo de aproximadamente 10 % a 100 % del peso del vehículo.
Puede ser necesario identificar una dosis o cantidad y cualquier posible efecto en el momento de la administración de la formulación. Esto puede conseguirse mediante experimentación rutinaria como se describe en el presente documento, usando uno o más grupos de animales (preferentemente al menos 5 animales por grupo), o en ensayos animales si es apropiado. La eficacia de la formulación de péptido/proteína puede evaluarse administrando y evaluando el efecto de la administración midiendo uno o más índices asociados con la enfermedad/trastorno/infección de interés y comparando los valores postratamiento de estos índices con los valores de los mismos índices antes del tratamiento.
El momento preciso de la administración y la cantidad de cualquier compuesto particular que producirá el tratamiento más eficaz en un sujeto dado dependerá de la actividad, farmacocinética y biodisponibilidad de la proteína básica, condición fisiológica del sujeto (incluyendo edad, sexo, tipo y estadio de la enfermedad, condición física general, sensibilidad a una dosificación y tipo de medicación dados), vía de administración y similares. Las directrices presentadas en el presente documento pueden usarse para optimizar el tratamiento, por ejemplo, determinar el momento y/o cantidad de administración óptimos, lo que requerirá solamente experimentación rutinaria consistente en supervisar el sujeto y ajustar la dosificación y/o el momento.
El tratamiento puede iniciarse con dosificaciones menores que son menores que la dosis óptima del compuesto. A continuación, la dosificación puede aumentarse en incrementos pequeños hasta que se obtenga el efecto terapéutico óptimo.
El uso combinado de la formulación de lisostafina de la presente invención con otros antibióticos u otros agentes terapéuticos puede reducir la dosificación necesaria para la formulación de lisostafina. Esto se debe a que el efecto de otros antibióticos u otros agentes terapéuticos puede ser complementario del efecto de la formulación de lisostafina. En dicha terapia combinada, los diferentes agentes activos pueden suministrarse juntos o por separado, y simultáneamente o en momentos diferentes en el día.
La toxicidad y eficacia terapéutica de la formación de péptido/proteína antibacteriana de la presente invención pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la DL50, DE50, CIM (Concentración mínima del producto que aún inhibirá el crecimiento de un microorganismo de ensayo) y/o CBM (Concentración mínima del producto que destruirá un organismo de ensayo o será bactericida para un organismo de ensayo). Se prefieren formulaciones que muestren índices terapéuticos grandes. Aunque pueden usarse formulaciones que muestran efectos secundarios tóxicos, debería tenerse cuidado de que el complejo del vehículo-péptido/proteína antibacteriano se acumule en el sitio deseado para reducir los efectos secundarios.
Los datos obtenidos de los ensayos de cultivo celular y estudios animales pueden usarse en la formulación de un intervalo de dosificación para su uso en seres humanos. Es importante que la dosificación de cualquier formulación de complejo de vehículo-péptido/proteína antibacteriano proporcione una serie de concentraciones en circulación en la sangre que estén por encima de la CIM con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. Para agentes de la presente invención, la dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo bacteriano para obtener la CIM y CBM. Una dosis de la formulación puede obtenerse de modelos animales basándose en la dosis que proporciona un intervalo de concentración en plasma en circulación por encima de la CIM y/o CBM como se determina en cultivo celular. Dicha información puede usarse para determinar con más precisión dosis útiles en seres humanos.
El complejo de vehículo-péptido/proteína antibacteriano de la presente invención puede usarse para administración externa en forma de pomada, pasta, crema o geles y puede contener además excipientes, tales como grasas animales y vegetales, aceites, ceras, parafinas, almidón, goma arábiga, derivados de celulosa, polietilenglicoles, siliconas, bentonitas, ácido silícico, talco y óxido de cinc, o mezclas de los mismos.
El vehículo con proteínas básicas de la presente invención puede usarse para administración externa en forma de polvo o pulverización y puede contener además excipientes tales como lactosa, talco, ácido silícico, hidróxido de aluminio, silicatos de calcio y polvo de poliamida, o mezclas de estas sustancias. Las pulverizaciones pueden contener adicionalmente propulsores habituales tales como clorofluorohidrocarburos e hidrocarburos no sustituidos volátiles, tales como butano y propano.
El complejo de vehículo-péptido/proteína de la presente invención puede usarse para administración externa en forma de aerosol. Esto se consigue preparando un aerosol acuoso, preparación liposómica o partículas sólidas que contienen la composición de la presente invención pero no unidos covalentemente al sólido. Podría usarse una suspensión no acuosa (por ejemplo, propulsor de fluorocarburo). Pueden usarse nebulizadores sónicos debido a que minimizan la exposición del agente a corte, lo que puede dar como resultado la degradación del compuesto. Habitualmente, se prepara un aerosol acuoso formulando una solución o suspensión acuosa de la formulación junto con vehículos y estabilizadores farmacéuticamente aceptables convencionales. Los excipientes y estabilizadores varían según las necesidades del compuesto particular, pero normalmente incluyen tensioactivos no iónicos (Tweens, Pluronics o polietilenglicol), proteínas inocuas como albúmina sérica, ésteres de sorbitano, ácido oleico, lecitina, aminoácidos tales como glicina, tampones, sales, azúcares o alcoholes de azúcares. Los aerosoles se preparan en general a partir de soluciones isotónicas.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden complejo de vehículo-péptido/proteína de la presente invención adecuado para administración parenteral comprenden uno o más componentes de un complemento en combinación con una o más soluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas isotónicas estériles farmacéuticamente aceptables o polvos estériles que pueden reconstituirse en soluciones o dispersiones inyectables estériles justo antes de su uso, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos, solutos que hacen la formulación isotónica con la sangre del receptor pretendido o agentes de suspensión o espesantes.
Los ejemplos de excipientes acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares) y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de dispersiones y mediante el uso de tensioactivos.
Kits
También se desvelan kits para implementar de forma conveniente y eficaz los métodos desvelados en el presente documento. Dichos kits comprenden cualquiera de los complejos de vehículo-péptido/proteína de la presente invención o una combinación de los mismos y un medio para facilitar el cumplimiento de métodos desvelados en el presente documento. Dichos kits, en el caso de formulaciones de complejo de vehículo-péptido/proteína proporcionan un medio conveniente y eficaz para asegurar que el sujeto para tratar tome el activo apropiado en la dosificación correcta de la manera correcta. Los medios de cumplimiento de dichos kits incluyen cualquier medio que facilite la administración de los activos según un método desvelado en el presente documento. Dichos medios de cumplimiento incluyen instrucciones, envases y medios de distribución, y combinaciones de los mismos. Los componentes del kit pueden envasarse para práctica manual o parcial o completamente automática de los métodos anteriores. En otros casos que implican kits, la presente divulgación contempla un kit que incluye composiciones de la presente invención y, opcionalmente, instrucciones para su uso. La muestra puede ser líquidos de muchas fuentes incluyendo suero, plasma, sangre completa, orina, extracto tisular, extractos bacterianos, extractos víricos, extractos fúngicos o cualquier muestra en la que se sospeche o sea necesario cuantificar la presencia de proteínas básicas (por ejemplo lisostafina).
También se desvela un kit que comprende una composición que comprende: (i) una cadena principal polimérica, (ii) un grupo aniónico de resto de sulfato, sulfonato o fosfato unido covalentemente o enlazado con la cadena principal; (iii) un agente activo con grupos con carga positiva unidos electrostáticamente con el ion de grupo aniónico; y (iii) una cadena protectora unida covalentemente o enlazada con la cadena principal. Los usos para dichos kits incluyen, por ejemplo, aplicaciones terapéuticas. Dichos kits pueden tener una diversidad de usos adicionales, incluyendo, por ejemplo, captura de imágenes, dirección, diagnóstico, terapia, vacunación y similares.
Ejemplos
La invención se ilustra adicionalmente por los siguientes Ejemplos. Los Ejemplos se proporcionan solamente para fines ilustrativos y no deben interpretarse como limitantes del alcance o contenido de la invención de ninguna manera.
A menos que se indique otra cosa, todos los números que expresen cantidades de ingredientes, condiciones de reacción y así sucesivamente usados en la memoria descriptiva y reivindicaciones deben entenderse como modificados en todos los casos por el término “aproximadamente”. En consecuencia, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos expuestos en la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se busca obtener mediante la presente invención.
Aunque se han mostrado y descrito en el presente documento realizaciones preferidas de la presente invención, resultará evidente para los expertos en la materia que dichas realizaciones se proporcionan solamente como ejemplo. Debería entenderse que pueden emplearse alternativas evidentes a las realizaciones de la invención descritas en el presente documento en la práctica de la invención.
Ejem plos de com posiciones con cadenas p rincipa les polim éricas procedentes de polisacáridos
Ejem plo 1: S íntesis de HPPEG52g: Se disolvieron 2 g de MPEGAM (PM=5 kDa; 0,4 mmol; Lysan; lote N.° 111­ 102; transparente en solución) en 10 ml de agua y 5 ml de HEPES 1 M pH 7,3 y se añadieron 100 pl de NaOH 10 N para llevar el pH hasta 7,8. El grupo amino se midió mediante TNBs y se descubrió que tenía un total de 0,579 mmol de NH2 en 2 g. En un recipiente separado, se disolvió 1 g de sal sódica de heparina (25 kDa mediante cromatografía de exclusión por tamaño usando patrones proteicos globulares, Cat. N.° 41121-1G Acros. Lote N.° B0128763; PM=~593+4sodio-4H=681 Da/disacárido; 1 g de HP tiene 1,47 mmol del grupo carboxilo teórico suponiendo que no hay ninguna sustitución en el carboxilo) en 5 ml de agua (volumen total). El grupo amino se midió mediante TNBS y se descubrió que era un total insignificante de 2,6 pmol por gramo. Esta solución de HP (5 ml) se activó durante 20 minutos añadiendo 80 mg de NHSS (PM=115,14; 0,7 mmol) y 285 mg de EDC (PM=191,71; 1,5 mmol). Este se añadió después a la solución de MPEGAM y se permitió que reaccionara durante 3 horas. Después de 3 horas, el grupo amino se midió y se descubrió que era un total de 192 pmol, lo que indica que se consumió el 67 % de MPEG. El grupo amino se midió de nuevo al día siguiente y se descubrió que era un total de 84 pmol, lo que indica que se consumió el 85 % de PEG. La mezcla de reacción se lavó con 15 cambios de NaCl 1 M y 10 cambios de agua en un cartucho de ultrafiltración de PCPM 50.000 (UFP-50-E-5A). La muestra HPPEG52g se esterilizó por filtrado (filtro de polisulfona de 0,2 pm, Nalgene, Rochester, NY) y se liofilizó produciendo 1,86 gramos. Se analizó un mg/ml y contenía NH2 0 /-5 pM o 0 nmol/mg. Se midieron diez mg/ml para GPC y mostró un tiempo de retención de 14 min (aproximadamente 11,5 nm).
Ejem plo 2: S íntesis de HPPEG104G: Se disolvieron 4 g de MPEGAM (PM=10 kDa; 0,4 mmol; Sunbio; lote N.° C1AM-010-05053) en 10 ml de agua y 5 ml de HEPES 1 M pH 7,3 y se añadieron 100 pl de NaOH 10 N para llevar el pH a 7,8. El grupo amino se midió mediante TNBS y se descubrió que era un total de 0,528 mmol de NH2 en 4 g. Parece haber más grupos amino de lo esperado, quizás MPEGAM tiene menor peso molecular. En un recipiente separado, se disolvió 1 g de sal sódica de Heparina (25 kDa mediante cromatografía de exclusión por tamaño y usando patrones proteicos globulares, Cat. N.° 41121-1G Acros. Lote N.° B0128763; PM=~593+4sodio-4H=681 Da/disacárido; 1 g de HP tiene 1,47 mmol de grupo carboxilo teórico suponiendo que no hay ninguna sustitución en el carboxilo) en 5 ml de agua (volumen total). El grupo amino se midió mediante TNBS y se descubrió que era un total insignificante de 2,2 pmol por gramo. Esta solución de HP (5 ml) se activó durante 20 minutos añadiendo 80 mg de NHSS (PM=115,14; 0,7 mmol) y 285 mg de EDC (PM=191,71; 1,5 mmol). Esto se añadió después a la solución de MPEGAM y se permitió que reaccionara durante 3 horas. Después de 3 horas, el grupo amino se midió y se descubrió que era un total de 152 pmol, lo que indica que se consumió el 71 % de MPEG. El grupo amino se midió de nuevo al día siguiente y se descubrió que era un total de 58 pmol, lo que indica que se consumió el 89 % de PEG. La mezcla de reacción se lavó con 15 cambios de NaCl 1 M y 10 cambios de agua en un cartucho de ultrafiltración de PCPM de 50.000 (UFP-50-E-5A). La muestra HPPEG52g se filtró (usando papel de filtro N.° 5 de Fischer) y se liofilizó produciendo 2,05 gramos. Se analizó un mg/ml y contenía NH20 /-5 pM o 0 nmol/mg. Se midieron diez mg/ml para GPC y mostró un tiempo de retención de 13,2 min (aproximadamente 17 nm).
Ejem plo 2: S íntesis de 50CSPEG106G: Esta composición tiene sulfato de condroitina o CS (originario de tiburón de Fisher Scientific, Pittsburg, PA. Cat N.° 21355, PM=50 kDa) como la cadena principal polimérica con los grupos carboxilo que han reaccionado con 6 gramos de MPEGAM de 10 kDa (PM=10 kDa MPEG con grupo amino en el extremo; Sunbio, Orinda, CA; Cat N.° P1AM-10)/gramo de CS. Esta composición tiene grupos aniónicos capaces de unirse con péptido/proteínas o moléculas pequeñas con pI mayor de 7. Además, los grupos carboxilo restantes pueden modificarse adicionalmente para contener más grupos sulfato, sulfonato o fosfato. Se preparó 50CSPEG106G de la siguiente manera: 6 g de MPEGAM (PM=10 kDa MPEG con grupo amino en el extremo; Sunbio, Orinda, CA; Cat N.° P1AM-10) disuelto en 20 ml de etanol al 80 %, se añadieron 5 ml de HEPES 1 M a la solución y el pH se ajustó a pH 7,8 usando NaOH 10 N. El grupo amino se midió mediante TNBS y se descubrió que era de 0,91 mmol. En un recipiente separado, se disolvió 1 gramo de CS en 8 ml de agua, para obtener una solución de CS y los grupos carboxilo se activaron añadiendo 115 mg de NHS (PM=115,14; 1 mmol), seguido de 575 mg de EDC (PM=191,71; 3 mmol). Después de 20 minutos de activación, este se añadió directamente al MPEGAM. Después de 2 horas, se descubrió que el grupo amino total era de 0,24 mmol lo que indica que se incorporó el 74 % de MPEG. La mezcla de reacción se concentró hasta 100 ml y se lavó con 15 cambios de agua en un cartucho de ultrafiltración de PCPM de 100 kDa (UFP-100-E-5A). La muestra de 50CSPEG106G se esterilizó por filtrado (filtro de polisulfona de 0,2 pm, Nalgene, Rochester, NY) y se liofilizó produciendo 2,4 gramos. Se analizó un mg/ml y contenía NH2 4,8 /-5 pM o 4,8 nmol/mg. Se analizaron diez mg/ml de 50CSPEG106G mediante cromatografía de exclusión por tamaño usando TosohG4000WXL y mostró un tiempo de retención de 10,7 min (aproximadamente 29,8 nm).
Ejem plo 4: S íntesis de 50CSPEG106GNTA: El 50CSPEG106G resultante (véase anteriormente) puede convertirse en 50CSPEG106GNTA y después en 50CSPEG106GNTASO (véase posteriormente). El 50CSPEG106G resultante (véase anteriormente) puede convertirse en 50CSPEG106GNTA de la siguiente manera: Medir los grupos carboxilo restantes de 2,4 gramos de 50CSPEG106G según el protocolo de Kobayashi y Chiba (Analytical biochemistry 1994, vol 219, p189-194). Para sintetizar 50CSPEG106G, tomar 2,4 g de 50CSPEG106G (con 1 equivalente del grupo carboxilo) y disolver en 25 ml de tampón de MES (ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico, Pierce, Rockford, IL) 20 mM a pH 4,7 para obtener solución de 50CSPEG106G. Añadir 1 equivalente de NHS y 2 equivalentes de EDC (PM=191,71) y activar durante 20 minutos. Después de 20 minutos añadir esta solución de 50CSPEG106G activada a 10 equivalentes de Nalfa,Nalfa-biscarboximetil-lisina (PM=262 Da) en 25 ml de tampón de HEPES 1 M a pH 7,4 y permitir que reaccionen durante una noche. Concentrar la mezcla de reacción hasta 100 ml y lavar con 15 cambios de agua en un cartucho de ultrafiltración de PCPM de 100 kDa (UFP-100-E-5A). Esterilizar por filtrado el producto de 50CSPEG106GNTA (usando un filtro de polisulfona 0,2 pm, Nalgene, Rochester, NY) y liofilizar. Preparar una solución de 10 mg/ml de 50CSPEG106GNTA resultante y determinar el diámetro hidrodinámico mediante cromatografía de exclusión por tamaño usando Columna TosohG4000WXL (0,79 x 30 cm) y solución salina tamponada con fosfato como disolvente de elución (PBS; fosfato 11,9 mM, NaCl 137 mM, KPO4 2,7 mM, pH 7,4) que contiene acetonitrilo al 15 % a un caudal de 0,6 ml/min. El tiempo de retención debería ser coherente con el diámetro de aproximadamente 30-40 nm.
Ejem plo 5: S íntesis de 5OCSPEG106GNTASO o 50CSPEG106GNTASF o 50CSPEG106GNTAPO: Esta estructura comprende sulfato de condroitina 50 kDa con los grupos carboxilo que han reaccionado con 6 gramos de MPEG 10 kDa y los grupos carboxilo restantes unidos covalentemente al grupo amino épsilon de biscarboximetillisina que es un derivado de ácido nitrilotriacético (NTA). El NTA se modifica adicionalmente para contener tres grupos sulfato (o sulfonato o fosfato), cada uno unido a los grupos carbonilo de NTA. Esencialmente, cada NTA actúa como un espaciador para permitir que un agrupamiento de tres grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) se una con la cadena principal de sulfato de condroitina. El 50CSPEG106GNTA (véase anteriormente) puede convertirse en vehículo sulfatado (o sulfonatado o fosforilado) que contiene agrupamientos de grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) con hasta tres grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) en cada agrupamiento. Para hacer esto, tomar 2 gramos de 50CSPEG106GNTA y disolverlos en 50 ml de tampón de MES 10 mM (pH 4,7). Activar el vehículo añadiendo 0,28 g de NHSS (PM=217,14; 1,3 mmol), seguido de 0,56 g de EDC (PM=191,71; 2,9 mmol) y permitir que se activen durante 20 minutos. En un recipiente separado disolver 0,37 g de 2-aminoetilhidrogenosulfato (AES; PM=141; 2,6 mmol) o 0,45 g de ácido sulfanílico (SNA; PM=173; 2,6 mmol) o 0,37 g de O-fosforiletanolamina (OPE; PM=141; 2,6 mmol) en 25 ml de tampón de HEPES 1 M (pH 7,3, mantener el pH a 7,3 usando NaOH) y medir los grupos amino de partida mediante TNBS (Spadaro et al., 1979, Anal. Chem., 96, p317-329) que deberían ser aproximadamente 2,6 mmol, dependiendo de la pureza de AES (o SNA u OPE). Añadir el vehículo activado a la solución de AES (o SNA u OPE) y agitar la solución durante una noche. Medir los grupos amino mediante TNBS para determinar la cantidad de reducción de grupos amino que es equivalente a la cantidad de grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) incorporados. Lavar el vehículo sulfatado (o sulfonatado o fosforilado) mediante 20 volúmenes de agua usando un cartucho de ultrafiltración de PCPM de 100 kDa (UFP-100-E-5A; GE-Amersham), esterilizar por filtrado (filtro de polisulfona 0,2 pm, Nalgene, Rochester, NY) y liofilizar (50CSPEG106GNTASO o 50CSPEG106GNTASF o 50CSPEG106GNTAPO). Este producto tendrá agrupamientos de hasta tres grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) por agrupamiento que está colgante de la cadena principal.
Ejem plo 6: S íntesis de 14HPPEG104G: Esta composición tiene Heparina de 14 kDa ((H4784-1G Sigma. Lote N.° 047K1195; PM 14 kDa; 1 g tiene 0,827 mmol de grupos carboxilo) como la cadena principal polimérica con los grupos carboxilo que han reaccionado con 4 gramos de MPEGAM de 10 kDa (PM=10 kDa MPEG con grupo amino en el extremo; Sunbio, Orinda, CA; Cat. N.° P1AM-10). Esta composición contiene grupos aniónicos capaces de unirse con péptidos/proteínas o moléculas pequeñas con pI mayor de 7. Además, los grupos carboxilo restantes pueden modificarse adicionalmente para contener más grupos sulfato, sulfonato o fosfato. El 14HPPEG104G se preparó de la siguiente manera: A) 1 g de sal sódica de Heparina (HP) (H4784-1G Sigma. Lote N.° 047K1 195; 1 g de HP tiene 0,827 mmol de grupo carboxilo) se disolvió en 8 ml de agua (solución de HP). B) En un recipiente separado, se disolvieron 4 g de MPEG-AM (PM=10000; 0,4 mmol; Sunbio; lote N.° C1AM-010-05053; limpio en solución) en 15 ml de etanol al 80 % y la solución de HP se añadió directamente al MPEG-AM. C) La reacción se compuso hasta MES 20 mM pH=4,7 con adición de agua para eliminar el precipitado. La reacción se inició mediante la adición de 80 mg de NHS (PM=115,14; 0,7 mmol) y 380 mg de EDC (PM=191,71; 2 mmol) y se agitó durante 20 minutos. Después de 20 minutos, se añadieron 4 ml de HEPES 1 M a la solución y el pH se ajustó hasta pH 7,8 lentamente con NaOH 10 N gota a gota, y se permitió que reaccionara durante una noche. Se tomaron alícuotas para determinar los grupos amino restantes del MPEG-AM y determinar el MPEG incorporado. El grupo amino se encontró hasta un total de 0,011 mmol lo que indica que se incorporó todo el MPEG (14HPPEG104G). D) La mezcla de reacción se concentró hasta 100 ml y se lavó con 20 cambios de agua en un cartucho de ultrafiltración de PCPM de 100.000 (UFP-100-E-5A), se esterilizó por filtrado (filtro de polisulfona de 0,2 |jm, Nalgene, Rochester, NY) y se liofilizó produciendo 2,4 gramos. Se analizó un mg/ml y contenía NH2 +/-5 jM o 0 nmol/mg. E) La cromatografía de exclusión por tamaño usando columna TosohG4000WXL (0,79 x 30 cm) eluida con solución salina tamponada con fosfato (PBS; fosfato 11,9 mM, NaCl 137 mM, KPO4 2,7 mmol, pH 7,4) que contenía acetonitrilo al 15 % a un caudal de 0,6 ml/min mostró un tiempo de retención de 12,7 min (aproximadamente 13,8 nm).
Ejem plo 7: S íntesis de 14HPPEG104GNTA: El 14HPPEG104G resultante (véase anteriormente) puede convertirse en 14HPPEG104GNTA y después en 14HPPEG104GNTASO, 14HPPEG104GNTASF o 14HPPEG104GNTAPO (véase posteriormente). El 14HPPEG104G resultante (véase anteriormente) puede convertirse en 14HPPEG104GNTA de la siguiente manera: Medir los grupos carboxilo restantes de 2,4 gramos de 14HPPEG104G según el protocolo de Kobayashi y Chiba (Analytical biochemistry 1994, vol 219, p189-194). Para sintetizar 14HPPEG104GNTA, tomar 2,4 g de grupo carboxilo de 14HPPEG104G) y disolver en 25 ml de tampón de MES (ácido 2-(W-morfolino)etanosulfónico, Pierce, Rockford, IL) 20 mM a pH 4,7 para obtener solución de 14HPPEG104G. Añadir 1 equivalente de NHS y 2 equivalentes de e Dc (PM=191,71) y activar durante 20 minutos. Después de 20 minutos añadir esta solución de 14HPPEG104G activada a 10 equivalentes de Nalfa,Nalfabiscarboximetil-lisina (PM=262 Da) en hasta 25 ml de tampón de HEPES 1 M a pH 7,4 y permitir que reaccionen durante una noche. Medir los grupos amino restantes para determinar el grado de incorporación de NTA. Concentrar la mezcla de reacción hasta 100 ml y lavar con 15 cambios de agua en un cartucho de ultrafiltración de PCPM de 100 kDa (UFP-100-E-5A). Esterilizar por filtrado el producto de 14HPPEG104GNTA (usando un filtro de polisulfona de 0,2 jm , Nalgene, Rochester, NY) y liofilizar. Preparar una solución de 10 mg/ml de 14HPPEG104GNTA resultante y determinar el diámetro hidrodinámico mediante cromatografía de exclusión por tamaño usando una columna TosohG4000WXL (0,79 x 30 cm) y solución salina tamponada con fosfato como disolvente de elución (PBS; fosfato 11,9 mM, NaCl 137 mM, KPO4 2,7 mM, pH 7,4) que contiene acetonitrilo al 15 % a un caudal de 0,6 ml/min. El tiempo de retención debería ser coherente con el diámetro de aproximadamente 15-20 nm.
Ejem plo 8: S íntesis de 14HPPEG104GNTASO o 14HPPEG104GNTASF o 14HPPEG104GNTAPO: Esta estructura comprende heparina 14 kDa en la que el 27 % de los grupos carboxilo teóricos están unidos covalentemente con MPEG de 10 kDa y los grupos carboxilo restantes están unidos covalentemente con el grupo amino épsilon de biscarboximetillisina que es un derivado de ácido nitrilotriacético (NTA): El NTA se modifica adicionalmente para contener tres grupos sulfato (o sulfonato o fosfato), cada uno unido a los grupos carbonilo de NTA. Esencialmente, cada NTA actúa como un espaciador para permitir que un agrupamiento de tres grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) se una con la cadena principal de heparina (también pueden usarse otras cadenas principales). Para hacer esto, tomar 2 gramos del 14HPPEG104GNTA y disolverlo en 50 ml de tampón de MES 10 mM (pH 4,7). Activar el vehículo añadiendo 0,28 g de NHSS (PM=217,14; 1,3 mmol), seguido de 0,56 g de EDC (PM=191,71; 2,9 mmol) y permitir que se active durante 20 minutos. En un recipiente separado disolver 0,37 g de 2-aminoetilhidrogenosulfato (AES; PM=141; 2,6 mmol) o 0,45 g de ácido sulfanílico (SNA; PM=173; 2,6 mmol) o 0,37 g de O-fosforiletanolamina (OPE; PM=141; 2,6 mmol) en 25 ml de tampón HEPES 1 M (pH 7,3, mantener el pH a 7,3 usando NaOH) y medir los grupos amino de partida mediante TNBS (Spadaro et al., 1979, Anal. Chem., 96, p317-329) que deberían ser aproximadamente 2,6 mmol, dependiendo de la pureza de AES (o SNA u OPE). Después de 20 minutos, añadir el vehículo activado a la solución de AES (o SNA u OPE). Después de una reacción de una noche medir los grupos amino mediante TNBS para determinar la cantidad de reducción de grupos amino que es equivalente a la cantidad de grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) incorporados. Lavar el vehículo sulfatado (o sulfonatado o fosforilado) mediante 20 volúmenes de agua usando un cartucho de ultrafiltración de PCPM de 100 kDa (UFP-100-E-5A; GE-Amersham), esterilizar por filtrado (filtro de polisulfona de 0,2 jm , Nalgene, Rochester, NY) y liofilizar (14HPPEG104GNTASO o 14HPPEG104GNTASF o 14HPPEG104GNTAPO). Este producto tendrá agrupamientos de hasta tres grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) por agrupamiento colgante de la cadena principal.
Ejem plo 9: S íntesis de 1000HYPEG1035NTA: Este se usará como materiales de partida para la síntesis de algunas de las composiciones de núcleo aniónico de la presente invención. Esta composición tiene ácido hialurónico o HY (Sigma Chem. Co. St Luis Mo. Cat. N.° 53747, PM=1000 kDa) como la cadena principal polimérica con el 35 % de los grupos carboxilo teóricos reemplazados con MPEGAM de 10 kDa (PM=10 kDa MPEG con grupo amino en el extremo: Sunbio, Orinda, CA; Cat. N.° P1AM-10) y los grupos carboxilo restantes ocupados con ácido nitrilotriácetico. Para hacer esto el ácido hialurónico puede usarse sin adición de más grupos carboxilo o pueden añadirse grupos carboxilo adicionales. Para añadir grupos carboxilo adicionales, los grupos hidroxilo en el hiluronano pueden convertirse en grupos carboxi según el protocolo de Tijsen et al. (Carbohydrate Polymers 2001, vol 45; p219-226). Al final del protocolo de Tijsen et al. el hialuronano carboximetilado se lava con 15 cambios de agua en un cartucho de ultrafiltración de PCPM de 3 kDa (UFP-3-E-5A). Esterilizar por filtrado el producto resultante usando (filtro de polisulfona de 0,2 |jm, Nalgene, Rochester, NY) y liofilizar para obtener hiluronano con grupos carboxilo extra. Antes de la síntesis de 1000HYPEG1035NTA, medir el grupo carboxilo de partida (1 equivalente) de 1,0 g de HY (este podría ser HY sin grupos carboxilo adicionales o el modificado para tener grupos carboxilo adicionales) según el protocolo de Kobayashi y Chiba (Analytical biochemistry 1994, vol 219, p189-194). Para sintetizar 1000HYPEG1035NTA, tomar 1,0 g de h Y (con 1 equivalente de grupo carboxilo) y disolver en 25 ml de tampón de MES (ácido 2-(W-morfolino)etanosulfónico, Pierce, Rockford, IL) 20 mM a pH 4,7 para obtener solución de HY. Disolver 0,35 equivalentes de MPEGAM (PM=10 kDa MPEG con grupo amino en el extremo; Sunbio, Orinda, CA; Cat. N.° P1AM-10) en 20 ml de etanol al 80 % y añadir a la solución de HY para preparar la solución HYPEG. A la solución de HYPEG, añadir 1 equivalente de Nh S (PM=115,14) y 1 equivalente de solución de EDC (PM=191,71) con agitación. Mantener el pH a pH 4,7-5,0 con HCl 6 N durante 20 minutos usando HCl. Después de 20 minutos de activación, ajustar el pH a 7,8 añadiendo 10 ml de HEPES 1 M, pH 7,4, y ajustar adicionalmente el pH con NaOH 10 N gota a gota hasta alcanzar 7,8. Permitir que la reacción continúe durante 2 horas y medir el grupo amino restante del MPEGAM mediante TNBS y no debería haber ninguno lo que indica que se han consumido los 0,35 equivalentes del grupo amino y se han conjugado con e1HY. Si hay grupos amino restantes añadir 1 equivalente de EDC (PM=191,71) y permitir que reaccione durante una noche para formar 1000HYPEG1035. Tomar una alícuota de la solución de 1000HYPEG1035 resultante y determinar el diámetro hidrodinámico mediante cromatografía de exclusión por tamaño usando columna TosohG4000WXL (0,79 x 30 cm) y solución salina tamponada con fosfato (PBS; fosfato 11,9 mM, NaCl 137 mM, KPO42,7 mM, pH 7,4) que contiene acetonitrilo al 15 % como disolvente de elución a un caudal de 0,6 ml/min. El tiempo de retención debería ser coherente con un diámetro de aproximadamente 30-50 nm. Ajustar el pH a 5 con HCl 6 N y añadir 1,5 equivalentes de EDC (PM=191,71) y activar durante 20 minutos. Después de 20 minutos añadir esta solución de 1000HYPEG1035 activada a 10 equivalentes de Nalfa,Nalfa-biscarboximetil-lisina (PM=262 Da) en hasta 25 ml de tampón de HEPES 1 M a pH 7,4 y permitir que reaccionen durante una noche. Concentrar la mezcla de reacción hasta 100 ml y lavar con 15 cambios de agua en un cartucho de ultrafiltración de PCPM de 100 kDa (UFP-100-E-5A). Esterilizar por filtrado el producto de 1000HYPEG1035NTA (usando filtro de polisulfona de 0,2 jm , Nalgene, Rochester, NY) y liofilizar. Preparar una solución de 10 mg/ml de 1000HYPEG1035NTA resultante y determinar el diámetro hidrodinámico mediante cromatografía de exclusión por tamaño usando columna TosohG4000WXL (0,79 x 30 cm) y solución salina tamponada con fosfato como disolvente de elución (PBS; fosfato 11,9 mM, NaCl 137 mM, KPO42,7 mM, pH 7,4) que contiene acetonitrilo al 15 % a un caudal de 0,6 ml/min. El tiempo de retención debería ser coherente con un diámetro de aproximadamente 30-70 nm.
Ejem plo 10: S íntesis de 1000HYPEG1035NTASO o 1000HYPEG1035NTASF o 1000HYPEG1035NTAPO: Esta estructura comprende ácido hiurónico de 100 kDa en el que el 35 % de los grupos carboxilo teóricos están unidos covalentemente con MPED de 10 kDa y los grupos carboxilo restantes están unidos covalentemente al grupo amino épsilon de biscarboximetillisina que es un derivado de ácido nitrilotriácetico (NTA). El NTA se modifica adicionalmente para contener tres grupos sulfato (o sulfonato o fosfato), cada uno unido con los grupos carbonilo de NTA. Esencialmente, cada NTA actúa como un espaciador para permitir que un agrupamiento de tres grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) se una con la cadena principal de ácido hiurónico (también pueden usarse otras cadenas principales). El 1000HYPEG1035NTA (véase anteriormente) puede convertirse para contener sulfato (o sulfonato o fosfato) con hasta tres grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) en cada agrupamiento. Para hacer esto, tomar 2 gramos del 1000HYPEG1035NTA y disolverlos en 50 ml de tampón de MES 10 mM (pH 4,7). Activar el vehículo añadiendo 0,28 g de NHSS (PM=217,14; 1,3 mmol), seguido de 0,56 g de EDC (PM=191,71; 2,9 mmol), y permitir que se active durante 20 minutos. En un recipiente separado disolver 0,37 g de 2-aminoetilhidrogenosulfato (AES; PM=141; 2,6 mmol) o 0,45 g de ácido sulfanílico (SNA; PM=173; 2,6 mmol) o 0,37 g de O-fosforiletanolamina (OPE; PM=141; 2,6 mmol) en 25 ml de tampón de HEPES 1 M (pH 7,3, mantener el pH a 7,3 usando NaOH) y medir los grupos amino de partida mediante TNBS (Spadaro et al., 1979, Anal. Chem., 96, p317-329) que debería ser de aproximadamente 2,6 mmol, dependiendo de la pureza de AES (o SNA u OPE). Después de 20 minutos, añadir el vehículo activado a la solución de AES (o SNA u OPE). Después de una reacción de una noche medir los grupos amino mediante TNBS para determinar la cantidad de reducción de grupos amino que es equivalente a la cantidad de grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) incorporados. Lavar el vehículo sulfatado (o sulfonatado o fosforilado) mediante 20 volúmenes de agua usando un cartucho de ultrafiltración de PCPM de 100 kDa (UFP-100-E-5A; GE-Amersham), esterilizar por filtrado (filtro de polisulfona de 0,2 jm , Nalgene, Rochester, NY) y liofilizar (1000HYPEG1035NTASO o 1000HYPEG1035NTASF o 1000HYPEG1035NTAPO). Este producto tendrá agrupamientos de hasta tres grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) por agrupamiento que está colgante de la cadena principal.
Ejem plo 11: S íntesis de 6OPGAPEG1O35NTA: Este se usará como materiales de partida para la síntesis de algunas de las composiciones de núcleo aniónico de la presente invención. Esta composición tiene pectina o ácido poligalacturónico (polipectato sódico; Sigma Chem. Co. St Luis Mo. Cat. N.° p3889, PM=60 kDa) como la cadena principal polimérica con el 35 % de los grupos carboxilo teóricos reemplazados con MPEGAM de 10 kDa (PM=10 kDa MPEGAM tiene un grupo amino en el extremo; Sunbio, Orinda, CA; Cat. N.° P1AM-10) y los grupos carboxilo restantes ocupados con ácido nitrilotriacético. La modificación de 60PGAPEG1035NTA a 60PGAPEG1035NTASO, 60PGAPEG1035NTASF y 60PGAPEG1035NTAPO; donde SO, SF y PO son sulfato, sulfonato y fosfato unidos covalentemente con los grupos carbonilo de NTA; es como se ha descrito anteriormente para otras composiciones que contienen NTA. Para preparar 60PGAPEG1035NTA, puede usarse la pectina de partida sin adición de más grupos carboxilo o pueden añadirse grupos carboxilo adicionales. Para añadir grupos carboxilo adicionales, los grupos hidroxilo en hiluronano pueden convertirse en grupos carboxilo según el protocolo de Tijsen et al. (Carbohydrate Polymers 2001, vol 45; p219-226). Al final del protocolo de Tijsen et al. la pectina carboximetilada se lava con 15 cambios de agua en un cartucho de ultrafiltración de PCPM de 3 kDa (UFP-3-E-5A). Esterilizar por filtrado el producto resultante (PMA) usando (filtro de polisulfona de 0,2 |jm, Nalgene, Rochester, NY) y liofilizar para obtener pectina con grupos carboxilo extra. Ocasionalmente, la pectina tendrá un porcentaje significativo del grupo carboxilo bloqueado con grupos metilo. Este puede retirarse usando ácido para exponer todos los grupos carboxilo de pectina. En resumen, disolver 2 g de pectina en 100 de agua y ajustar el pH a 0,5 usando HCl concentrado y mantener a 80 °C durante 2 horas según Constenla y Lazano (Latin American Applied Research 2003, vol33, p91-96). Neutralizar con NaOH y lavar con 15 cambios de agua en un cartucho de ultrafiltración de PCPM de 3 kDa (UFP-3-E-5A). Esterilizar por filtrado el producto resultante usando (filtro de polisulfona de 0,2 jm , Nalgene, Rochester, NY) y liofilizar. Esta pectina puede procesarse para aumentar la cantidad de grupos carboxilo como se ha descrito anteriormente. Puede prepararse 60PGAPEG1035NTA usando cualquiera de la pectina (PGA) descrita anteriormente, sin procesar o procesada para aumentar el grupo carboxilo. Antes de la síntesis de 60PGAPEG1035NTA, medir el grupo carboxilo de partida (1 equivalente) de 1,0 g de PGA (este podría ser PGA sin grupos carboxilo adicionales o PGA modificado para tener grupos carboxilo adicionales) según el protocolo de Kobayashi y Chiba (Analytical biochemistry 1994, vol 219, p189-194). Para sintetizar 60PGAPEG1035NTA, tomar 1,0 g de PGA (con 1 equivalente de grupo carboxilo) y disolver en 50 ml de tampón de MES (ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico, Pierce, Rockford, IL) 20 mM a pH 4,7 para obtener solución de PGA. Disolver 0,35 equivalentes de MPEGAM (PM=10 kDa MPEG con grupo amino en el extremo; Sunbio, Orinda, CA; Cat. N.° P1AM-10) en 20 ml de etanol al 80 % y añadir a la solución de PGA para preparar la solución de PGAPEG. A la solución de PGAPEG, añadir 1 equivalente de NHS (PM=115,14) y 1 equivalente de solución de EDC (PM=191,71) con agitación. Mantener el pH a pH 4,7-5,0, con HCl 6 N durante 20 minutos usando HCl. Después de 20 minutos de activación, ajustar el pH a 7,8 añadiendo 10 ml de HEPES 1 M, pH 7,4 y ajustar el pH a 7,8 con NaOH 10 N gota a gota. Permitir que la reacción continúe durante 2 horas y medir el grupo amino restante del MPEGAM mediante TNBS y no debería haber ninguno lo que indica que se han consumido los 0,35 equivalentes del grupo amino y se han conjugado con el PGA. Si hay grupos amino restantes en MPEGAM, ajustar el pH a 5 con HCl 6 N y añadir 1 equivalente de EDC (PM=191,71), después de 20 minutos ajustar de nuevo el pH a 7,8 y permitir que reaccione durante una noche para formar 60PGAPEG1035. Tomar una alícuota de la solución de 60PGAPEG1035 resultante y determinar el diámetro hidrodinámico mediante cromatografía de exclusión por tamaño usando columna TosohG4000WXL (0,79 x 30 cm) y solución salina tamponada con fosfato (PBS; fosfato 11,9 mM, NaCl 137 mM, KPO42,7 mM, pH 7,4) que contiene acetonitrilo al 15 % como disolvente de elución a un caudal de 0,6 ml/min. El tiempo de retención debería ser coherente con un diámetro de aproximadamente 18­ 30 nm. Ajustar el pH a 5 con HCl 6 N y añadir 1,5 equivalentes de EDC (PM=191,71) y activar durante 20 minutos. Después de 20 minutos añadir esta solución de 60PGAPEG1035 activada a 10 equivalentes de Nalfa,Nalfabiscarboximetillisina (PM=262 Da) en hasta 25 ml de tampón de HEPES 1 M a pH 7,4 y permitir que reaccione durante una noche. Concentrar la mezcla de reacción hasta 100 ml y lavar con 15 cambios de agua en un cartucho de ultrafiltración de PCPM de 100 kDa (UFP-100-E-5A). Esterilizar por filtrado el producto de 60PGAPEG1035NTA (usando filtro de polisulfona de 0,2 jm , Nalgene, Rochester, NY) y liofilizar. Preparar una solución de 10 mg/ml de 60PGAPEG1035NTA resultante y determinar el diámetro hidrodinámico mediante cromatografía de exclusión por tamaño usando columna TosohG4000WXL (0,79 x 30 cm) y solución salina tamponada con fosfato como disolvente de elución (PBS; fosfato 11,9 mM, NaCl 137 mM, KPO42,7 mM, pH 7,4) que contiene acetonitrilo al 15 % a un caudal de 0,6 ml/min. El tiempo de retención debería ser coherente con un diámetro de aproximadamente 20-40 nm.
Ejem plo 12: S íntesis de 30CHIPEG1035DTPA: Este se usará como materiales de partida para la síntesis de algunas de las composiciones de núcleo aniónico de la presente invención. La presente composición tiene quitosano (Sigma Chem. Co. St Luis Mo. Cat, N.° 448869, PM=35 kDa) como la cadena principal polimérica con el 35 % de los grupos amino teóricos ocupados con MPEGC de 10 kDa (PM=10 kDa; MetoxiPEG con grupo carboxilo en el extremo, de Lysan bio; Arab, AL) y el grupo amino restante ocupado con ácido dietilendiaminpentaacético (DTPA). La modificación de 30CHIPEG1035DTPA a 30CHIPEG1035DTPASO, 30CHIPEG1035DTPASF y 30CHlPEG1035DTPAPO; donde SO, SF y PO son sulfato, sulfonato y fosfato unidos covalentemente con los grupos carbonilo de DTPA; es como se ha descrito anteriormente para otra composición que contiene carboxilo. Para sintetizar 30CHIPEG1035DTPA, tomar 1,0 g de clorhidrato de quitosano (con 1 equivalente de grupo amino como se mide mediante TNBS) y disolver en 25 ml de tampón de HEPES 1 M a pH 7,4 (Pierce, Rockford, IL) para obtener una solución de 30CHI. En un recipiente separado, disolver 0,35 equivalentes de MPEGC (PM=10 kDa; MetoxiPEG con grupo carboxilo en el extremo, de Lysan bio; Arab, AL) en 60 ml de etanol al 80 % con MES 20 mM pH=4,7 (1200 j l de MES 1 M añadido a 60 ml), añadir 0,5 equivalentes de NHS (PM=115,14), una vez disuelto añadir 1 equivalente de EDC (PM=191,71; 10,43 mmol) agitando al mismo tiempo y permitir que continúe la activación durante 20 minutos. Añadir MPEGC activado directamente a la solución de 30CHI, permitir que la reacción se produzca durante 2 horas y medir los grupos amino mediante TNBS para asegurar si la saturación del 35 % de grupos amino añade más de la cantidad apropiada de MPEGC activado. Esta es la solución de 30CHIPEG1035. Realizar cromatografía de exclusión por tamaño usando columna TosohG4000WXL (0,79 x 30 cm) con solución salina tamponada con fosfato (PBS; fosfato 11,9 mM, NaCl 137 mM, KPO42,7 mM, pH 7,4) que contiene elución de acetonitrilo al 15 % a un caudal de 0,6 ml/min. El tiempo de retención debería ser coherente con aproximadamente 14-17 nm de diámetro molecular. Añadir 5 equivalentes de dianhídrido de DTPA (PM=357; Sigma Chem Co., St Louis, MO. Cat. N.° D6148) seguido de 200 j l de TEA. Valorar la reacción lentamente con NaOH 10 N hasta pH 7,1 y agitar durante 4 horas. Usando reacción de TNBS, confirmar que no permanece ningún grupo amino lo que es indicativo de una reacción completa y que se prepara el producto de 30CHIPEG1035DTPA. Realizar cromatografía de exclusión por tamaño usando columna TosohG4000WXL (0,79 x 30 cm) con solución salina tamponada con fosfato (PBS; fosfato 11,9 mM, NaCI 137 mM, KPO42,7 mM, pH 7,4) que contiene elución de acetonitrilo al 15 % a un caudal de 0,6 ml/min. El tiempo de retención debería ser coherente con un diámetro molecular de 17-21 nm. Lavar el 30CHIPEG1035DTPA resultante con 15 volúmenes de agua usando un cartucho de ultrafiltración de PCPM de 100.000 (UFP-100-E-5A; GE-Amersham) y liofilizar.
Ejem plo 13: S íntesis de 40DXPEG1035NTA: Este se usará como materiales de partida para la síntesis de algunas de las composiciones de núcleo aniónico de la presente invención. Esta composición tiene dextrano o poliglucosa (alfa1-6 con rama alfa1-4; Sigma Chem. Co. St Luis Mo. Cat. N.° 31389, PM=40 kDa) como la cadena principal polimérica con el 35 % de los grupos hidroxilo derivatizados con MPEGAM de 10 kDa (PM=10 kDa MPEGAM tiene un grupo amino en el extremo; Sunbio, Orinda, CA; Cat. N.° P1AM-10) y en los grupos hidroxilo restantes ocupados con ácido nitrilotriacético. La modificación de 40DXPEG1035NTA a 40DXPEG1035NTASO, 40DXPEG1035NTASF y 40DXPEG1035NTAPO; donde SO, SF y PO son sulfato, sulfonato y fosfato unidos covalentemente con los grupos carbonilo de NTA; es como se ha descrito anteriormente para otras composiciones que contienen carboxilo. Para preparar 40DXPEG1035NTA, los grupos hidroxilo de dextrano de partida se convierten en grupos carboxilo. Para añadir grupos carboxilo, los grupos hidroxilo en dextrano pueden convertirse en grupos carboxilo según el protocolo de Tijsen et al. (Carbohydrate Polymers 2001, vol 45; p219-226). En resumen, suspender 10 gramos de dextrano en 100 ml de propanol/agua al 90 % y añadir 4 gramos de sedimento de NaOH y agitar durante una noche a 40 °C. Al día siguiente añadir 10 gramos de monocloroacetato sódico (Sigma Chem Co. St Luis, MO. Cat. N.° 291773) como se perfila en Tijsen et al. (Carbohydrate Polymers 2001, vol 45; p219-226). Al final de la reacción el dextrano carboximetilado se lava con 15 cambios de agua en un cartucho de ultrafiltración de PCPM de 3 kDa (UFP-3-E-5A). Esterilizar por filtrado el producto resultante (DX) usando (filtro de polisulfona de 0,2 |jm, Nalgene, Rochester, NY) y liofilizar para obtener dextrano carboximetilado. Antes de la síntesis de 40DXPEG1035NTA, medir el grupo carboxilo de partida (1 equivalente) de 1,0 g de DX según el protocolo de Kobayashi y Chiba (Analytical biochemistry 1994, vol 219, p189-194). Para sintetizar 40DXPEG1035NTA, tomar 1,0 g de DX (con 1 equivalente de grupos carboxilo) y disolver en 50 ml de tampón de MES (ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico, Pierce, Rockford, IL) 20 mM a pH 4,7 para obtener una solución de DX. Disolver 0,35 equivalentes de MPEGAM (PM=10 kDa MPEG con grupo amino en el extremo; Sunbio, Orinda, CA; Cat. N.° P1AM-10) en 20 ml de etanol al 80 % y añadir a la solución de DX para preparar solución de DXPEG. A la solución de DXPEG, añadir 1 equivalente de Nh S (PM=115,14) y 1 equivalente de solución de EDC (PM=191,71) con agitación. Mantener el pH a pH 4,7-5,0, con HCl 6 N durante 20 minutos usando HCl. Después de 20 minutos de activación, ajustar el pH a 7,1 añadiendo 10 ml de HEPES 1 M, pH 7,4. Si el pH es inferior a 7,1 ajustar el pH con NaOH 10 N gota a gota hasta alcanzar 7,1. Permitir que la reacción continúe durante 2 horas y medir el grupo amino restante del MPEGAM mediante TNBS y no debería ser ninguno lo que indica que se han consumido los 0,35 equivalentes del grupo amino y se han conjugado con el PGA. Si hubiera grupos amino restantes en MPEGAM, ajustar el pH a 5 con HCl 6 N y añadir 1 equivalente de EDC (PM=191,71), después de 20 minutos ajustar de nuevo el pH a 7,1 y permitir que reaccione durante una noche para formar 40DXPEG1035. Tomar una alícuota de la solución de 40DXPEG1035 resultante y determinar el diámetro hidrodinámico mediante cromatografía de exclusión por tamaño usando columna TosohG4000WXL (0,79 x 30 cm) y solución salina tamponada con fosfato (PBS; fosfato 11,9 mM, NaCl 137 mM, KPO42,7 mM, pH 7,4) que contiene acetonitrilo al 15 % como disolvente de elución a un caudal de 0,6 ml/min. El tiempo de retención debería ser coherente con un diámetro de aproximadamente 14-20. Ajustar el pH a 5 con HCl 6 N y añadir 1,5 equivalentes de EDC (PM=191,71) y activar durante 20 minutos. Después de 20 minutos añadir esta solución de 40DXPEG1035 activada a 10 equivalentes de Nalfa,Nalfa-biscarboximetil-lisina (PM=262 Da) en hasta 25 ml de tampón de HEPES 1 M a pH 7,4 y permitir que reaccionen durante una noche. Concentrar la mezcla de reacción que contiene 40DXPEG1035NTA hasta 100 ml y lavar con 15 cambios de agua en un cartucho de ultrafiltración de PCPM de 100 kDa (UFP-100-E-5A). Esterilizar por filtrado el producto de 40DXPEG1035NTA (usando filtro de polisulfona de 0,2 jm , Nalgene, Rochester, NY) y liofilizar. Preparar una solución de 10 mg/ml de 40DXPEG1035NTA resultante y determinar el diámetro hidrodinámico mediante cromatografía de exclusión por tamaño usando columna TosohG4000WXL (0,79 x 30 cm) y elución a un caudal de 0,6 ml/min con solución salina tamponada con fosfato (PBS; fosfato 11,9 mM, NaCl 137 mM, KPO4 2,7 mM, pH 7,4) que contiene acetonitrilo al 15 %. El tiempo de retención debería ser coherente con un diámetro de aproximadamente 17-25 nm.
Ejem plos de com posiciones con cadenas p rincipa les polim éricas procedentes de poliam inoácidos
Ejem plo 14: S íntesis de 20PLPEG1030DTPASO o 20PLPEG1030DTPASF o 20PLPEG1030DTPAPO: Esta estructura comprende polilisina de 20 kDa en la que el 30 % de los grupos amino épsilon están unidos covalentemente con MPEG de 10 kDa y los grupos amino restantes están unidos covalentemente con ácido dietilentriaminpentaacético (DTPA) modificado para contener grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) unidos covalentemente con los grupos carbonilo de DTPa . Esencialmente, cada DTPA actúa como un espaciador para permitir que un agrupamiento de cuatro grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) se unan con la cadena principal de polilisina (también pueden usarse otras cadenas principales). Esta se sintetizó de la siguiente manera: A) se disolvió 1 g de polilisina de 20 kDa (20PL; producto N.° Q4926 de SAFC lote N.° 018K7775; DP=126) en 6,5 ml de HEPES 1 M. El grupo amino se midió mediante TNBS y se descubrió que era 2,4 mmol de NH2/g. Esta es la solución de 20PL. B) En un recipiente separado, se disolvieron 5 g de MPEGC (Metoxipolietilen glicolcarboximetilo; PM=10 kDa; 0,5 mmol; Laysan Bio; lote N.° 108-108) en 12,5 ml de etanol al 80 % con tampón MES de 10 mM, pH=4,7, con 120 mg de n Hs (PM=115,14; 1,0 mmol). Una vez disuelto se añadieron 320 g de EDC (PM=191,71; 1,7 mmol) con agitación. Se permitió que la activación continuara durante 20 minutos. El MPEGC activado se añadió a la solución de 20PL. El pH se ajustó a pH 7,8 lentamente con NaOH 10 N gota a gota y se permitió que reaccionara durante una noche. Se tomaron alícuotas para medición de grupos amino usando Tn Bs y se descubrió que eran 1,60 mmol lo que indica saturación de Pe G del 33,5 %. Esta es la solución de 20PLPEG1030DA. C) Cromatografía de exclusión por tamaño usando columna TosohG4000WXL (0,79 x 30 cm) eluida con solución salina tamponada con fosfato (PBS; fosfato 11,9 mM, NaCl 137 mM, KPO4 2,7 mM, pH 7,4) que contiene acetonitrilo al 15 % a un caudal de 0,6 ml/min mostró un tiempo de retención de 11,3 min (aproximadamente 23,9 nm de diámetro). D) Se añadieron 3,5 g de DTPA (dianhídrido de ácido dietilentriaminpentaacético; PM=257,32; 9,8 mmol; 6 equivalentes molares de grupo amino) a la solución en la etapa B (20PLPEG1030DA; 1.6 mmol de NH2) y seguido de 100 pl de TEA (trietilamina). La mezcla se valoró lentamente hasta pH 7,8 con NaOH 10 N y se permitió que reaccionara durante una noche. Los grupos amino se midieron y se descubrió que eran 0 pM. La mezcla de reacción se diluyó con 50 ml de etanol al 50 % y se lavó con 10 cambios de agua en cartucho de ultrafiltración de PCPM de 100.000 (UFP-100-E-5A). La solución se concentró hasta 100 ml en agua. E) Se disolvieron 12,7 mmol de hidrogenosulfato de 2-aminoetilo (AES; C2H7N-S04; PM=141,14; 12,7 mmol; Acros; Cas N.° 926-39-6; lote N.° A004514401) o ácido sulfanílico (SNA, C6H7N-SO3; PM=173,19; 12,7 mmol; Acros; Cas N.° 121-57-3; lote N.° A018717701) u O-fosforiletanolamina (C2H8N-PO4; PM=141,06; 12,7 mmol; Acros; Cas N.° 1071-23-4; lote N.° 0001437763) en 25 ml de HEPES 1 M. La mezcla se valoró lentamente hasta pH 7,8 con NaOH 10 N. El grupo amino se midió mediante TNBS y se descubrió que era de aproximadamente 16 mmol de NH2. F) Se compuso la solución de la etapa D (20PLPEG1030DTPA; 4 x 1,6 = 6,4 mmol de carboxilo) hasta MES 10 mM pH=4,7 (1100 pl de MES 1 M añadido a 110 ml) y se añadieron 880 mg de NHS (PM=115,14; 7.7 mmol). Una vez disuelto, se inició la activación añadiendo 4 g de EDC (PM=191,71; 21 mmol) y se permitió que continuara durante 20 minutos. El vehículo activado se añadió a la solución E que se permitió que reaccionara durante una noche. Se tomaron alícuotas para análisis de grupos amino mediante TNBS y se descubrió que eran aproximadamente 9 mmol y lo que indica DTPA completamente saturado con sulfato (o sulfonato o fosfato). Esta es la solución de 20PLPEG1030DTPASO o 20PLPEG1030DTPASF o 20PLPEG1030DTPAPO. F) La solución se lavó con 10 cambios de agua usando cartucho de ultrafiltración de PCPM de 100 kDa (UFP-100-E-5A de GE) y se concentró adicionalmente hasta 100 ml. G) La muestra se esterilizó por filtrado (filtro de polisulfona de 0,2 pm, Nalgene, Rochester, NY) y se liofilizó produciendo ~4 gramos.
Ejem plo 15: S íntesis de 40PLPEG535DTPA y 40PLPEG535DTPAIDA: Esta se usará como materiales de partida para la síntesis de algunas de las composiciones de núcleo aniónico de la presente invención. Para preparar esta, se disolvieron 1,0 g de 40PL (P3995 Sigma lote N.° 085K5102) en 50 ml de HEPES 200 mM. Se midieron grupos amino mediante ensayo de TNBS y se descubrió que eran de 2,86 mmol de NH2/g. Se activaron tres gramos de MPEGC (MetoxiPoliEtilenGlicol-CarboxiMetilo; 1 mmol; PM=5 kDa; 9,0 mmol; Laysan Bio; lote N.° 108-41; transparente en solución) en 17,5 ml de MES 10 mM pH=4,7 añadiendo 150 mg de n Hs S (PM=217,14; 0,7 mmol), seguido de 300 mg de EDC (PM=191,71; 1,57 mmol). Se permitió que la activación continuara durante 20 minutos. El volumen total de solución de MPEGC en esta etapa fue de 18 ml. El MPEGC activado se añadió a una solución de 40PL y se permitió que reaccionara. Después de 45 minutos, se activaron 3 g adicionales de MPEGC y se añadieron como anteriormente y se permitió que reaccionaran durante 2 horas. Se midieron grupos amino mediante TNBS y se descubrió que eran 103 pM lo que proporciona una saturación del 28 %. La cromatografía de exclusión por tamaño usando columna TosohG4000WXL (0,79 x 30 cm) eluida con solución salina tamponada con fosfato (p Bs ; fosfato 11,9 mM, NaCl 137 mM, KPO42,7 mM, pH 7,4) que contiene acetonitrilo al 15 % a un caudal de 0,6 ml/min mostró un tiempo de retención de 11,72 min en UV o 12,20 min en RI (18,4 nm). Se activaron otros 1,5 g y se añadieron hasta alcanzar una saturación de grupos amino del 35 % basándose en los grupos amino restantes medidos (91 pM en 94 ml o 1,82 mmol en total) mediante TNBS. Después de la adición de 1,5 g de MPEG el tiempo de retención en UV se convierte en 11,60 min o 12,10 min en RI o 19 nm. Se añadieron cuatro gramos de DTPA-dianhídrido y el pH se ajustó continuamente para mantener el pH entre 7 y 8. Después de 4 horas, el grupo amino total se midió mediante TNBS y se descubrió que era 0,0 pM. La mezcla de reacción que contenía 40PLPEG535DTPA se lavó con 20 volúmenes de agua usando cartucho de ultrafiltración con punto de corte de peso molecular (PCPM) de 100 kDa (UFP-100-E-5A; GE Healthcare) y se liofilizó, proporcionando 4,7 g (40PLPEG535DTPA). La mitad (2,35 g) se saturó con ácido iminodiacético (IDA) de la siguiente manera: se compuso IDA (3 g) hasta 10 ml de HEPES 1 M, el pH se ajustó a 7,5 y se compuso hasta 50 ml en HEPES 1 M. La mitad de 40PLPEG535DTPA se dividió en 3 partes iguales (1,3 mmol de carboxilo cada una basándose en la estequiometria) y cada una (25 ml) llevada hasta pH 4,7 con 200 pl de MES 1 M, pH 4,7, el pH no descendió hasta 4.7 y por lo tanto se añadieron 20 pl de HCl 6 N. Este se activó mediante la adición de 2 mmol de NHSS (434 mg) y 4,5 mmol de EDC (864 mg). Después de 20 minutos, el 40PLPEG535DTPA activado se añadió a IDA anterior y se repitió 2 veces más y se agitó durante 2 horas. El producto (40PLPEG535DTPAIDA) se lavó con 20 volúmenes de agua, se esterilizó por filtrado (filtro de polisulfona de 0,2 pm, Nalgene, Rochester, NY) y se liofilizó proporcionando 2,0 g (40PLPEG535DTPAIDA).
Ejem plo 16. S íntesis de 40PLPEG535DTPASO o 40PLPEG535DTPASF o 40PLPEG535DTPAPO o 40PLPEG535DTPAIDASO o 40PLPE G535D TPAIDA SF o 40PLPEG535DTPAIDAPO: Esta estructura comprende polilisina de 40 kDa en la que el 35 % de los grupos amino épsilon están unidos covalentemente con MPEG de 5 kDa y los grupos amino restantes están unidos covalentemente con ácido dietilentriaminpentaacético (DTPA) modificado para contener grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) unidos covalentemente con los grupos carbonilo de DTPA. Esencialmente, cada DTPA actúa como un espaciador para permitir que un agrupamiento de cuatro grupos sulfato se unan a la cadena principal de polilisina (también pueden usarse otras cadenas principales). El 40PLPEG535DTPA o 40PLPEG535DTPAIDA puede convertirse en vehículo sulfatado (o sulfonatado o fosforilado) que contiene hasta varios grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) en cada agrupamiento. Para hacer esto, tomar 2 gramos de 40PLPEG535DTPA o 1 gramo de 40PLPEG535DTPAIDA y disolverlo en 50 ml de tampón de MES 10 mM (pH 4,7). Activar el vehículo añadiendo 0,37 g de NHSS (PM=217,14; 1,7 mmol), seguido de 0,75 g de EDC (PM=191,71; 3,9 mmol) y permitir que se activen durante 20 minutos. En un recipiente separado disolver 0,5 g de 2-aminoetilhidrogenosulfato (AES; PM=141; 3,5 mmol) o 0,6 g de ácido sulfanílico (SNA; PM=173; 3,5 mmol) o 0,5 g de O-fosforiletanolamina (OPE; PM=141; 3,5 mmol) en 25 ml de tampón de HEPES 1 M (pH 7,3, ajustar el pH a 7,8 usando NaOH) y medir los grupos amino de partida mediante TNBS (Spadaro et al., 1979, Anal. Chem., 96, p317-329) que deberían ser aproximadamente 3,5 mmol. Añadir vehículo activado a solución de AES (o SNA u OPE). Después de 2 horas añadir otros 0,75 g de EDC y agitar la solución durante una noche. Medir los grupos amino mediante TNBS para determinar la cantidad de reducción de grupos amino que es equivalente a la cantidad de grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) incorporados. Lavar el vehículo sulfatado (o sulfonatado o fosforilado) mediante 20 volúmenes de agua usando un cartucho de ultrafiltración de PCPM de 100 kDa (UFP-100-E-5A; GE-Amersham), esterilizar por filtrado (filtro de polisulfona de 0,2 pm, Nalgene, Rochester, NY) y liofilizar. Este producto (40PLPEG535DTPASO o 40PLPEG535DTPASF o 40PLPEG535DTPAPO o 40PLPEG535DTPAIDASO o 40PLPEG535DTPAIDASF o 40PLPEG535DTPAIDAPO) tendrá un agrupamiento de hasta 4-8 grupos sulfato, sulfonato o fosfato colgantes de la cadena principal.
Ejem plo 17: S íntesis de 40PLPEG537NDA de NTA unido a grupo amino de p o lilis in a (lo te N.° 20080124b): El 40PLPEG537NDA se usará como el material de partida para la síntesis de algunas de las composiciones de núcleo aniónico de la presente invención. Esta estructura comprende polilisina de 40 kDa en la que el 37 % de los grupos amino están unidos covalentemente con MPEG de 5 kDa y los grupos amino restantes están unidos covalentemente con uno de los grupos carbonilo de ácido nitrilotriacético (NTA). Para hacer esto, se disolvieron 1,0 gramos de 40PL (Sigma P3995 lote número 127K5101; 1 g contiene 2,62 mmol de NH2) en 50 ml de HEPES 400 mM. Se activaron cinco g de MPEGC (1 mmol; PW=5 kDa; Sigma/Fisher/Fluka; Cat. N.° 70718; lote N.° 64748/1) en 20 ml de MES 10 mM pH=4,7 añadiendo 250 mg de NHS (PM=115,09; 2 mmol), seguido de 500 mg de EDC (PM=191,71; 1,8 mmol). Se permite que la activación continúe durante 20 minutos (el volumen total es de 20 ml). El MPEGC activado se añadió a una solución de 40PL (pH 7,45 antes de la adición). Se permitió que la mezcla reaccionara durante 4 horas. La medición del grupo amino antes (2,62 mmol) y después (1,64 mmol) de la adición de MEPG indicó que la saturación de PEG del grupo amino fue de 37 %. La cromatografía de exclusión por tamaño usando columna TosohG4000WXL (0,79 x 30 cm) eluida con solución salina tamponada con fosfato (PBS; fosfato 11,9 mM, NaCl 137 mM, KPO4 2,7 mM, pH 7,4) que contiene acetonitrilo al 15 % a un caudal de 0,6 ml/min mostró un tiempo de retención de 12,5 min (o aproximadamente 16 nm de diámetro). Esta es la solución de 40PLPEG537DA. En un recipiente separado, se neutralizó NTA (PM=191; 1 g o 5,2 mmol) en agua con 1 ml de NaOH y se tamponó con MES 20 mM a pH 4,7 (el volumen total es de 10 ml). Este se activó con 1 g (5,2 mmol) de EDC en presencia de 345 mg de NHS (PM=115,09; 3 mmol). Después de 20 minutos de activación este se añadió a 40PLPEG537DA y el pH se ajustó a 7,8 usando NaOH 10 N. Después de 2 horas, se añadieron 2 g adicionales de EDC y se permitió que reaccionaran durante una noche. El grupo amino total se midió y se descubrió que era 0,03 mmol lo que se compara con 1,63 mmol de grupos amino originales antes de la reacción. La muestra se lavó con 20 cambios de volumen de agua usando un cartucho de ultrafiltración de PCPM de 100 kDa (UFP-100-E-5A; GE-Amersham), se esterilizó por filtrado (filtro de polisulfona de 0,2 pm, Nalgene, Rochester, NY) y se liofilizó proporcionando 4,1 g de 40PLPEG537DA.
Ejem plo 18: S íntesis de 40PLPEG537NDASO o 40PLPEG537NDASF o 40PLPEG537NDAPO: Esta estructura comprende polilisina de 40 kDa en la que el 37 % de los grupos amino están unidos covalentemente con MPEG de 5 kDa y los grupos amino restantes están unidos covalentemente con uno de los grupos carbonilo de NTA y los grupos carbonilo restantes de NTA se modifican para contener grupos sulfato (o sulfonato o fosfato). Esencialmente, cada NTA actúa como un espaciador para permitir que un agrupamiento de dos grupos sulfato (sulfonato o fosfato) se unan con la cadena principal de polilisina (también pueden usarse otras cadenas principales). El 40PLPEG537NDA puede convertirse en vehículo sulfatado (sulfonatado o fosforilado) que contiene hasta dos grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) en cada agrupamiento. Para hacer esto, tomar 2 gramos del vehículo (40PLPEG537NDA) y disolverlos en 50 ml de tampón de MES 10 mM (pH 4,7). Activar el vehículo añadiendo 0,19 g de NHSS (PM=217,14; 0,87 mmol), seguido de 0,37 g de EDC (PM=191,71; 1,9 mmol) y permitir que se activen durante 20 minutos. En un recipiente separado disolver 0,25 g de 2-aminoetilhidrogenosulfato (AES; Pm =141; 1,85 mmol) o 0,31 g de ácido sulfanílico (SNA; PM=173; 1,8 mmol) o 0,25 g de O-fosforiletanolamina (OPE; PM=141; 1,8 mmol) en 25 ml de tampón de HEPES 1 M (pH 7,3, ajustar el pH a 7,8 usando NaOH) y medir los grupos amino de partida mediante TNBS (Spadaro et a l, 1979, Anal. Chem., 96, p317-329) que debería ser aproximadamente 1,8 mmol dependiendo de la pureza de AES (o SNA u OPE). Añadir la solución de AES (SNA u OPE) al vehículo después de 20 minutos de activación del vehículo. Después de 2 horas añadir otros 0,37 g de EDC y agitar la solución durante una noche. Medir los grupos amino mediante TNBS para determinar la cantidad de reducción de grupos amino que es equivalente a la cantidad de grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) incorporados. Lavar el vehículo sulfatado (o sulfonatado o fosforilado) mediante 20 volúmenes de agua usando un cartucho de ultrafiltración de PCPM de 100 kDa (UFP-100-E-5A; GE-Amersham), esterilizar por filtrado (filtro de polisulfona de 0,2 pm, Nalgene, Rochester, NY) y liofilizar. Este producto (40PLPEG537NDASO o 40PLPEG537NDASF o 40PLPEG537NDAPO) tendrá un agrupamiento de hasta 2 grupos sulfato (sulfonato o fosfato) colgantes de la cadena principal.
Ejem plo 19: S íntesis de 20PLPEG500DTPANTA: El 20PLPEG550DTPANTA se usará como el material de partida para la síntesis de algunas de las composiciones de núcleo aniónico de la presente invención. Esta estructura comprende polilisina de 20 kDa en la que el 50 % de los grupos amino están unidos covalentemente con MPEG de 5 kDa y los grupos amino restantes están unidos covalentemente con uno de los grupos carbonilo de DTPA. Los grupos carbonilo restantes de DTPA están unidos con el grupo amino épsilon de biscarboximetil lisina. Para hacer esto: a) se disolvieron 1 ml o 0,4 g equivalentes de 20p L (Q4926 SAFC lote N.° 018K7775; DP=126; se descubrió que 0,4 g contenían 0,895 mmol de NH2 mediante TNb S) en 5 ml de HEPES 1 M. Esta es la solución de 20PL. b) En un recipiente separado, se activaron 2,5 g de MPEG en MES 20 mM pH=4,7 (35 ml) añadiendo 125 mg de Nh S (PM=115,14; 1,09 mmol) y 500 mg de EDC (PM=191,71; 2,60 mmol) con agitación. Se permitió que la activación continuara durante 20 minutos y el MPEGC activado se añadió directamente a solución de 20PL en la etapa a. El pH de la mezcla de reacción se ajustó a pH 7,1 lentamente con NaOH 10 N gota a gota, y se permitió que reaccionara durante una noche. El análisis de grupos amino mediante TNBS mostró que permanecen 0,464mmol de grupos amino, lo que indica saturación de PEG del 50 %. Esta es la solución de 20PLPEG550DA. c) Cromatografía de exclusión por tamaño usando columna TosohG4000WXL (0,79 x 30 cm) eluida con solución salina tamponada con fosfato (PBS; fosfato 11,9 mM, NaCl 137 mM, KPO4 2,7 mM, pH 7,4) que contiene acetonitrilo al 15 % a un caudal de 0,6 ml/min mostró un tiempo de retención de 12,8 min en detector de índice refractario o aproximadamente 14,4 nm de diámetro molecular. d) Se añadió dianhídrido de ácido dietilentriaminpentaacético (1 gramo; PM=357,3; 2,80 mmol) y se valoró lentamente con NaOH 10 N hasta pH 7,1 y se agitó durante 2 horas. Después de 2 horas, la medición del grupo amino mediante TNBS indicó que permanece el 0 % de grupos amino. e) El pH de la solución se ajustó a 7,5 usando NaOH 10 N para facilitar el lavado ya que permanecen cristales de DTPA que no han reaccionado. La solución se concentró hasta 100 ml y se lavó con 15 cambios de agua usando un cartucho de ultrafiltración de PCPM de 100.000 (UFP-100-E-5A; GE-Amersham) y se liofilizó. La cromatografía de exclusión por tamaño usando columna TosohG4000WXL (0,79 x 30 cm) eluida con solución salida tamponada con fosfato (PBS; fosfato 11,9 mM, NaCl 137 mM, KPO42,7 mM, pH 7,4) que contienen acetonitrilo al 15 % a un caudal de 0,6 ml/min mostró un tiempo de retención de 12,7 min en un detector de índice refractario o aproximadamente 15,04 nm de diámetro molecular. f) Se disolvieron 2 gramos de NTA-amina (Nalfa,Nalfa, -bis(carboximetil)-L-Lisina; PM = 262,26 50 % de impureza, hasta 2 mol de agua y 10 % inorgánico) o ~4 mmol de grupos amino en 10 ml de HEPES 1 M. El análisis de grupos amino mediante TNBS indicó que la solución de NTA-amina contiene 3,4 mmol de grupos amino. g) Se disolvió 20PLPEG550DTPA (0,70 mmol de carboxilo) en 10 ml de MES 20 mM, se añadieron 140 mg de NHS (PM=115,09; 1,2 mmol), seguido de 560 mg de EDC (PM=191,71; 2,9 mmol). El pH aumentó lentamente pero se mantuvo por debajo de 5,5 mediante HCl. Esta solución se añadió a solución de NTA y el pH se ajustó hasta pH 7,1 con NaOH 10 N. Después de 2 horas, el análisis de grupos amino mostró un total de 3,2 mmol de grupos amino restantes, lo que indica que se incorporaron 0,2 mmol de NTA-amina a 0,8 mg de vehículo. h) La solución se concentró hasta 100 ml y se lavó con 15 cambios de agua usando un cartucho de ultrafiltración de PCPM de 100.000 (UFP-100-E-5A; GE-Amersham), se esterilizó por filtrado (filtro de polisulfona de 0,2 pm, Nalgene, Rochester, NY) y se liofilizó produciendo 0,5 g (20PLPEG550DTPANTA;). El análisis mediante cromatografía de exclusión por tamaño usando columna TosohG4000WXL (0,79 x 30 cm) eluido con solución salina tamponada con fosfato (PBS; fosfato 11,9 mM, NaCl 137 mM, KPO42,7 mM, pH 7,4) que contiene acetonitrilo al 15 % a un caudal de 0,6 ml/min mostró un tiempo de retención de 12,7 min en un detector de índice refractario o aproximadamente 15,04 nm de diámetro molecular. Ejem plo 20: S íntesis de 20PLPEG550DTPANTASO o 20PLPE G550D TPANTA SF o 20PLPEG550DTPANTAPO: Esta estructura comprende polilisina de 20 kDa en la que el 50 % de los grupos amino están unidos covalentemente con MPEG de 5 kDa y los grupos amino restantes están unidos covalentemente con uno de los grupos carbonilo de DTPA y los grupos carbonilo restantes de DTPA están unidos con el grupo amino épsilon de carboximetil lisina. La carboximetil lisina se modifica adicionalmente para contener tres grupos sulfato (o sulfonato o fosfato), cada uno unido con los grupos carboxilo de carboxilmetil lisina. Esencialmente, cada DTPA(NTA)3 actúa como un espaciador para permitir que un agrupamiento de doce grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) se una a la cadena principal de polilisina (también pueden usarse otras cadenas principales). El producto (20PLPEG550DTPANTA) puede convertirse en vehículo sulfatado (o sulfonatado o fosforilado) que contiene hasta doce grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) en cada agrupamiento. Para hacer esto, tomar 2 gramos del vehículo (20PLPEG550DTPANTA) y disolverlos en 50 ml de tampón de MES 10 mM (pH 4,7). Activar el vehículo añadiendo 1.1 g de NHSS (PM=217,14; 5,1 mmol), seguido de 2,2 g de EDC (PM=191,71; 11,5 mmol) y permitir que se activen durante 20 minutos. En un recipiente separado disolver 1,5 g de 2-aminoetilhidrogenosulfato (AES; PM=141; 10,6 mmol) o 1,8 g de ácido sulfanílico (SNA; PM=173; 10,6 mmol) o 1,5 g de O-fosforiletanolamina (OPE; PM=141; 10,6 mmol) en 25 ml de tampón de HEPES 1 M (pH 7,3, ajustar el pH a 7,8 usando NaOH) y medir los grupos amino de partida mediante TNBS (Spadaro et al., 1979, Anal. Chem., 96, p317-329) que debería ser aproximadamente 10,6 mmol, dependiendo de la pureza de AES (SNA u OPE). Después de 20 minutos de activación del vehículo, añadir el vehículo a solución de AES (o SNA u OPE). Después de 2 horas añadir otros 2.2 g de EDC y agitar la solución durante una noche. Medir los grupos amino mediante TNBS para determinar la cantidad de reducción de grupos amino que es equivalente a la cantidad de grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) incorporados. Lavar el vehículo sulfatado (o sulfonatado o fosforilado) mediante 20 volúmenes de agua usando un cartucho de ultrafiltración de PCPM de 100 kDa (UFP-100-E-5A; GE-Amersham), esterilizar por filtrado (filtro de polisulfona de 0,2 pm, Nalgene, Rochester, NY) y liofilizar. Este producto (20PLPEG550DTPANTASO o 20PLPEG550DTPa Nt ASF o 20PLPEG550DTPAn Ta PO) tendrá agrupamientos de hasta doce grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) cada uno colgante de la cadena principal.
Ejem plo 21: S íntesis de 35PEPEG1035NTA: El 35PEPEG1035NTA se usará como el material de partida para la síntesis de algunas de las composiciones de núcleo aniónico de la presente invención. Esta composición tiene ácido poliglutámico (Sigma Chem. Co. St Luis Mo. Cat. N.° P4033, PM=15-50 kDa; o Fisher Chem Co. Pittsburg, PA, Cat. N.° ICN15191891, PM=15-50 kDa) como la cadena principal polimérica con 35 % del grupo carboxilo ocupado con MPEGAM de 10 kDa (PM=10 kDa MPEG con grupo amino en el extremo; Sunbio, Orinda, CA; Cat.
N. ° P1AM-10) y los grupos carboxilo restantes ocupados con ácido nitrilotriacético. Para sintetizar 35PEPEG1035NTA, medir el grupo carboxilo de partida (1 equivalente) de 1,0 g de ácido poliglutámico según el protocolo de Kobayashi y Chiba (Analytical biochemistry 1994, vol 219, p189-194). Tomar 1,0 g de ácido poliglutámico (Sigma Chem. Co. St Luis Mo. Cat. N.° P4033; PM=15-50 kDa, con 1 equivalente de grupo carboxilo/gramo), disolver en 25 ml de tampón de MES (ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico, Pierce, Rockford, IL) 10 mM a pH 4,7, añadir 1 equivalente de NHS (PM=115,14) y 1 equivalente de EDC (PM=191,71) y agitar para activar PE durante 20 minutos. En un recipiente separado, disolver 0,35 equivalentes de MPEGAM (PM=10 kDa MPEG con grupo amino en el extremo; Sunbio, Orinda, CA; Cat. N.° P1AM-10) en 20 ml de HEPES 0,2 M, pH 7,8 para obtener solución de MPEGAM. Después de 20 minutos de activación de PE, añadir PE a la solución de MPEGAM y permitir que la reacción continúe durante 2 horas. Medir los grupos amino restantes del MPEGAM mediante TNBS y no debería haber ninguno lo que indica que se han consumido los 0,35 equivalentes del grupo amino y se han conjugado con el ácido poliglutámico. Si hubiera grupo amino restante, ajustar el pH a 5 con HCl 6 N y añadir 1 equivalente de EDC (PM=191,71), después de 20 minutos ajustar de nuevo el pH a 7,8 y permitir que reaccione durante una noche. Tomar una alícuota de la solución de 35PEPEG1035 resultante y determinar el diámetro hidrodinámico mediante cromatografía de exclusión por tamaño usando columna TosohG4000WXL (0,79 x 30 cm) y solución salina tamponada con fosfato (PBS; fosfato 11,9 mM, NaCl 137 mM, KPO4 2,7 mM, pH 7,4) que contiene acetonitrilo al 15 % como un disolvente de elución a un caudal de 0,6 ml/min. El tiempo de retención debería ser coherente con un diámetro hidrodinámico de aproximadamente 16-24 nm. Ajustar el pH a 5 con HCl 6 N y añadir 1,5 equivalentes de EDC (PM=191,71) y activar durante 20 minutos. Después de 20 minutos añadir esta solución de 40PEPEG1035 activada a 10 equivalentes de Nalfa,Nalfa-biscarboximetil-lisina (PM=262 Da) en 25 ml de tampón de HEPES 0,2 M a pH 7,8 y permitir que reaccione durante una noche. Concentrar la mezcla de reacción a 100 ml y lavar con 15 cambios de agua en un cartucho de ultrafiltración de PCPM de 100 kDa (UFP-100-E-5A). Esterilizar por filtrado la muestra usando (filtro de polisulfona de 0,2 pm, Nalgene, Rochester, NY) y liofilizar. Preparar una solución de 10 mg/ml de 35PEPEG1035NTA resultante y determinar el diámetro hidrodinámico mediante cromatografía de exclusión por tamaño usando columna TosohG4000WXL (0,79 x 30 cm) y solución salina tamponada con fosfato como disolvente de elución (PBS; fosfato 11,9 mM, NaCl 137 mM, KPO4 2,7 mM, pH 7,4) que contiene Acetonitrilo al 15 % a un caudal de 0,6 ml/min. El tiempo de retención debería ser coherente con un diámetro hidrodinámico de aproximadamente 19-28 nm.
Ejem plo 22: S íntesis de 35PGPEG1035NTASO o 35PGPEG1035NTASF o 35PGPEG1035NTAPO: Esta estructura comprende poliglutamato de 35 kDa en el que el 35 % de los grupos carboxilo están unidos covalentemente con MPEG 10 kDa y los grupos carboxilo restantes están unidos covalentemente al grupo amino épsilon de biscarboximetillisina que es un derivado de ácido nitrilotriacético (NTA). El NTA se modifica adicionalmente para contener tres grupos sulfato (o sulfonato o fosfato), cada uno unido con los grupos carbonilo de NTA. Esencialmente, cada NTA actúa como un espaciador para permitir que un agrupamiento de tres grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) se una con la cadena principal de poliglutamato (también pueden usarse otras cadenas principales). El 35PGPEG1035NTA puede convertirse en un vehículo sulfatado (o sulfonatado o fosforilado) que contiene agrupamientos de grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) con hasta tres grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) en cada agrupamiento. Para hacer esto, tomar 2 gramos del vehículo (35PGPEG1035NTA) y disolverlos en 50 ml de tampón de MES 10 mM (pH 4,7). Activar el vehículo añadiendo 0,28 g de NHSS (PM=217,14; 1,3 mmol), seguido de 0,56 g de EDC (PM=191,71; 2,9 mmol) y permitir que se active durante 20 minutos. En un recipiente separado disolver 0,37 g de 2-aminoetilhidrogenosulfato (AES; PM=141; 2,6 mmol) o O, 45 g de ácido sulfanílico (s Na ; PM=173; 2,6 mmol) o 0,37 g de O-fosforiletanolamina (OPE; PM=141; 2,6 mmol) en 25 ml de tampón de HEPES 1 M (pH 7,3, ajustar el pH a 7,8 usando NaOH) y medir los grupos amino de partida mediante TNBS (Spadaro et al., 1979, Anal. Chem., 96, p317-329) que deberían ser de aproximadamente 2,6 mmol, dependiendo de la pureza de AES (o SNA u OPE). Después de 20 minutos de activación de vehículo, añadir el vehículo activado a solución de AES (o SNA u OPE). Después de 2 horas añadir otros 0,56 g de EDC y agitar la solución durante una noche. Medir los grupos amino mediante TNBS para determinar la cantidad de reducción de grupos amino que es equivalente a la cantidad de grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) incorporados. Lavar el vehículo sulfatado (o sulfonatado o fosforilado) mediante 20 volúmenes de agua usando un cartucho de ultrafiltración de PCPM de 100 kDa (UFP-100-E-5A; GE-Amersham), esterilizar por filtrado (filtro de polisulfona de 0,2 pm, Nalgene, Rochester, NY) y liofilizar. Este producto (35PGPEG1035NTASO o 35PGPEG1035NTASF o 35PGPEG1035NTAPO) tendrá agrupamientos de hasta tres grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) cada uno colgante de la cadena principal.
Ejem plo 23: S íntesis de 10PDPEG1035NTA: El 10PDPEG1035NTA se usará como el material de partida para la síntesis de algunas de las composiciones de núcleo aniónico de la presente invención. Esta composición tiene ácido poliaspártico (Sigma Chem. Co. St Luis Mo. Cat. N.° P5378, PM=5-15 kDa) como la cadena principal polimérica con 35 % de los grupos carboxilo ocupados con MPEGAM de 10 kDa (PM=10 kDa MPEG con grupo amino en el extremo; Sunbio, Orinda, CA; Cat. N.° P1AM-10) y el grupo carboxilo restante ocupado con ácido nitrilotriacético. Medir el grupo carboxilo de partida 1 equivalente de 1,0 g de ácido poliglutámico según el protocolo de Kobayashi y Chiba (Analytical biochemistry 1994, vol 219, p189-194). Para sintetizar 10PDPEG1035n Ta , tomar 1,0 g de ácido poliaspártico (Sigma Chem. Co. St Luis Mo. Cat. N.° p4033; PM=15-50 kDa, con 1 equivalente de grupo carboxilo/gramo) y disolver en 25 ml de tampón de MES (ácido 2-(W-morfolino)etanosulfónico, Pierce, Rockford, IL) 20 mM a pH 4,7 para realizar la solución de PD. Disolver 0,25 equivalentes de MPEGAM (PM=10 kDa MPEG con grupo amino en el extremo; Sunbio, Orinda, CA; Cat. N.° P1AM-10) en 20 ml de etanol al 80 % y añadir a la solución de PD para realizar la solución de PDPEG. A la solución de PDPEG, añadir 1 equivalente de NHS (PM=115,14) y 1 equivalente de EDC (PM=191,71) con agitación. Mantener el pH a pH 4,7-5,0 con HCl 6 N durante 20 minutos usando HCl. Después de 20 minutos de activación, ajustar el pH a 7,8 añadiendo 10 ml de HEPES 1 M, pH 7,4. Ajustar el pH a 7,8 con NaOH 10 N gota a gota. Permitir que la reacción continúe durante 2 horas y medir el grupo amino restante del MPEGAM mediante TNBS y no debería haber ninguno lo que indica que se han consumido los 0,35 equivalentes de grupo amino y se han conjugado con el ácido poliaspártico. Si hay grupos amino restantes, añadir 1 equivalente de EDC (PM=191,71) y permitir que reaccione durante una noche. Tomar una alícuota de la solución de 10PDPEG1035 resultante y determinar el diámetro hidrodinámico mediante cromatografía de exclusión por tamaño usando columna TosohG4000WXL (0,79 x 30 cm) y solución salina tamponada con fosfato (PBS; fosfato 11,9 mM, NaCl 137 mM, KPO42,7 mM, pH 7,4) que contiene acetonitrilo al 15 % como disolvente de elución a un caudal de 0,6 ml/min. El tiempo de retención debería ser coherente con un diámetro hidrodinámico de aproximadamente 12-18 nm. Ajustar el pH a 5 con HCl 6 N y añadir 1,5 equivalentes de EDC (PM=191,71) y activar durante 20 minutos. Después de 20 minutos, añadir esta solución de 10PDPEG1035 activada a 10 equivalentes de Nalfa,Nalfa-biscarboximetil-lisina (PM=262 Da) en hasta 25 ml de tampón de HEPES 1 M a pH 7,8 y permitir que reaccione durante una noche. Concentrar la mezcla de reacción hasta 100 ml y lavar con 15 cambios de agua en un cartucho de ultrafiltración de PCPM de 100 kDa (UFP-100-E-5A). Esterilizar por filtrado la muestra usando (filtro de polisulfona de 0,2 pm, Nalgene, Rochester, NY) y liofilizar. Preparar una solución de 10 mg/ml de 10PDPEG1035NTA resultante y determinar el diámetro hidrodinámico mediante cromatografía de exclusión por tamaño usando columna TosohG4000WXL (0,79 x 30 cm) y solución salina tamponada con fosfato como disolvente de elución (PBS; fosfato 11,9 mM, NaCl 137 mM, KPO42,7 mM, pH 7,4) que contiene Acetonitrilo al 15 % a un caudal de 0,6 ml/min. El tiempo de retención debería ser con un diámetro hidrodinámico de aproximadamente 14-20 nm.
Ejem plo 24. S íntesis de 10PDPEG1035NTASO o 10PDPEG1035NTASF o 10PDPEG1035NTAPO: Esta estructura comprende poliaspartato de 10 kDa en el que el 35 % de los grupos carboxilo están unidos covalentemente con MPEG 10 kDa y los grupos carboxilo restantes están unidos covalentemente al grupo amino épsilon de biscarboximetillisina que es un derivado de ácido nitrilotriacético (NTA). El NTA está modificado adicionalmente para contener tres grupos sulfato (o sulfonato o fosfato), cada uno unido con los grupos carbonilo de NTA. Esencialmente, cada NTA actúa como un espaciador para permitir que un agrupamiento de tres grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) se unan con la cadena principal de poliaspartato (también pueden usarse otras cadenas principales). El 10PDPEG1035NTA puede convertirse en vehículo sulfatado (o sulfonatado o fosforilado) que contiene agrupamientos de grupos sulfato con hasta tres grupos sulfato en cada agrupamiento. Para hacer esto, tomar 2 gramos del 10PDPEG1035NTA y disolverlos en 50 ml de tampón de MES 10 mM (pH 4,7). Activar el vehículo añadiendo 0,28 g de NHSS (PM=217,14; 1,3 mmol), seguido de 0,56 g de EDC (PM=191,71; 2,9 mmol) y permitir que se active durante 20 minutos. En un recipiente separado disolver 0,37 g de 2-aminoetilhidrogenosulfato (AES; PM=141; 2,6 mmol) o 0,45 g de ácido sulfanílico (SNA; PM=173; 2,6 mmol) o 0,37 g de O-fosforiletanolamina (OPE; PM=141; 2,6 mmol) en 25 ml de tampón de HEPES 1 M (pH 7,3, ajustar el pH a 7,8 usando NaOH) y medir los grupos amino de partida mediante TNBS (Spadaro et al., 1979, Anal. Chem., 96, p317-329) lo que debería ser aproximadamente 2,6 mmol, dependiendo de la pureza de AES (o SNA u OPE). Añadir vehículo activado durante 20 minutos a la solución de AES (o SNA u OPE). Después de 2 horas añadir otros 0,56 g de EDC y agitar la solución durante una noche. Medir los grupos amino mediante TNBS para determinar la cantidad de reducción de grupos amino que es equivalente a la cantidad de grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) incorporados. Lavar el vehículo sulfatado (o sulfonatado o fosforilado) mediante 20 volúmenes de agua usando un cartucho de ultrafiltración de PCPM de 100 kDa (UFP-100-E-5A; GE-Amersham), esterilizar por filtrado (filtro de polisulfona de 0,2 pm, Nalgene, Rochester, NY) y liofilizar. Este producto (10PDPEG1035NTASO o 10PDPEG1035NTASO o 10PDPEG1035NTASF o 10PDPEG1035NTAPO) tendrá agrupamientos de hasta tres grupos sulfato (sulfonato o fosfato) por agrupamiento que está colgante de la cadena principal.
Ejem plo 25: S íntesis de 10PSPEG1035NTA: El 10PSPEG1035NTA se usará como el material de partida para la síntesis de algunas de las composiciones de núcleo aniónico de la presente invención. Esta composición tiene poliserina (Sigma Chem. Co. St Luis Mo. Cat. N.° P5857, PM=5-15 kDa) como la cadena principal polimérica con 35 % de los grupos hidroxilo ocupados con MPEGAM de 10 kDa (PM=10 kDa MPEG con grupo amino en el extremo; Sunbio, Orinda, CA; Cat. N.° P1AM-10) y el grupo hidroxilo restante ocupado con ácido nitrilotriacético. Para preparar esta composición todos los grupos hidroxilo se convirtieron en grupos carboxilo usando anhídrido succínico. En resumen, disolver 1 g de poliserina en 25 ml de dioxano y añadir 5,2 gramos de anhídrido succínico (exceso molar quíntuple con respecto al grupo hidroxilo teórico) y 900 mg de N,N'-dimetilaminopiridina como catalizador e incubar la mezcla a 60 °C durante 3 horas. Retirar el dioxano mediante evaporación rotatoria a 40 °C, disolver el sólido en agua, neutralizar con NaOH y lavar con 15 cambios de agua en un cartucho de ultrafiltración de PCPM de 3 kDa (UFP-3-E-5A). Esterilizar por filtrado el producto resultante (PS) usando (filtro de polisulfona de 0,2 pm, Nalgene, Rochester, NY) y liofilizar. Medir el grupo carboxilo de partida (1 equivalente) en 1,0 g de PS según el protocolo de Kobayashi y Chiba (Analytical biochemistry 1994, vol 219, p189-194). Para sintetizar 10PSPEG1035NTA, tomar 1,0 g de PS (con 1 equivalente de grupo carboxilo), disolver en 25 ml de tampón de MES (ácido 2-(A/-morfolino)etanosulfónico, Pierce, Rockford, IL) 10 mM a pH 4,7 (solución de PS), añadir 1 equivalente de NHS (PM=115,14) y 1 equivalente de EDC (PM=191,71; 4 mmol) y agitar durante 20 minutos para activar. En un recipiente separado, disolver 0,35 equivalentes de MPEGAM (PM=10 kDa MPEG con grupo amino en el extremo; Sunbio, Orinda, CA; Cat. N.° P1AM-10) en 20 ml de HEPES 0,2 M a pH 7,8 para preparar la solución de MPEGAM. Después de 20 minutos de activación de PS, añadir solución de PS a la solución de MPEGAM y permitir que la reacción continúe durante 2 horas. Medir el grupo amino restante del MPEGAM mediante TNBS y no debería haber ninguno lo que indica que se han consumido los 0,35 equivalentes de grupo amino de MPEGAM y se han conjugado con el PS. Si hay grupos amino restantes, ajustar el pH a 5 con HCl 6 N y añadir 1 equivalente de EDC (PM=191,71), después de 20 minutos ajustar de nuevo el pH a 7,8 y permitir que reaccione durante una noche. Tomar una alícuota de la solución de 10PSPEG1035 resultante y determinar el diámetro hidrodinámico mediante cromatografía de exclusión por tamaño usando columna TosohG4000WXL (0,79 x 30 cm) y solución salina tamponada con fosfato (PBS; fosfato 11,9 mM, NaCl 137 mM, KPO4 2,7 mM, pH 7,4) que contiene Acetonitrilo al 15 % como disolvente de elución a un caudal de 0,6 ml/min. El tiempo de retención debería ser con diámetro hidrodinámico de aproximadamente 13-18 nm. Ajustar el pH a 5 con HCl 6 N y añadir 1,5 equivalentes de EDC (PM=191,71) y activar durante 20 minutos. Después de 20 minutos añadir esta solución de 10PSPEG1035 activada a 10 equivalentes de Nalfa,Nalfa-biscarboximetil-lisina (PM=262 Da) en hasta 25 ml de tampón de HEPES 0,2 M a pH 7,8 y permitir que reaccione durante una noche. Concentrar la mezcla de reacción hasta 100 ml y lavar con 15 cambios de agua en un cartucho de ultrafiltración de PCPM de 100 kDa (UFP-100-E-5A). Esterilizar por filtrado la muestra usando (filtro de polisulfona de 0,2 pm, Nalgene, Rochester, NY) y liofilizar. Preparar una solución de 10 mg/ml de 10PSPEG1035NTA resultante y determinar el diámetro hidrodinámico mediante cromatografía de exclusión por tamaño usando una columna TosohG4000WXL (0,79 x 30 cm) y solución salina tamponada con fosfato como disolvente de elución (PBS; fosfato 11,9 mM, NaCl 137 mM, KPO42,7 mM, pH 7,4) que contiene Acetonitrilo al 15 % a un caudal de 0,6 ml/min. El tiempo de retención debería ser con diámetro hidrodinámico de aproximadamente 14-19 nm.
Ejem plo 26: S íntesis de 10PSPEG1035NTASO o 10PSPEG1035NTASF o 10PSPEG1035NTAPO: Esta estructura comprende poliserina de 10 kDa en la que el 35 % de los grupos hidroxilo están unidos covalentemente con MPEG de 10 kDa y los grupos hidroxilo restantes están unidos covalentemente al grupo amino épsilon de biscarboximetillisina que es un derivado de ácido nitrilotriacético (NTA). El NTA se modifica adicionalmente para contener tres grupos sulfato (o sulfonato o fosfato), cada uno unido con los grupos carbonilo de NTA. Esencialmente, cada NTA actúa como un espaciador para permitir que un agrupamiento de tres grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) se unan con la cadena principal de poliaspartato (también pueden usarse otras cadenas principales). El 10PSPEG1035NTA (véase anteriormente) puede convertirse en vehículo sulfatado (o sulfonatado o fosfatado) que contiene agrupamientos de grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) con hasta tres grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) en cada agrupamiento. Para hacer esto, tomar 2 gramos del 10PSPEG1035NTA (anterior) y disolverlos en 50 ml de tampón de MES 10 mM (pH 4,7). Activar el vehículo mediante la adición de 0,28 g de NHSS (PM=217,14; 1,3 mmol), seguido de 0,56 g de EDC (Pm =191,71; 2,9 mmol) y permitir que se active durante 20 minutos. En un recipiente separado disolver 0,37 g de 2-aminoetilhidrogenosulfato (AES; PM=141; 2,6 mmol) o 0,45 g de ácido sulfanílico (s Na ; PM=173; 2,6 mmol) o 0,37 g de O-fosforiletanolamina (OPE; PM=141; 2,6 mmol) en 25 ml de tampón de HEPES 1 M (pH 7,3, ajustar el pH a 7,8 usando NaOH) y medir los grupos amino de partida mediante TNBS (Spadaro et al., 1979, Anal. Chem., 96, p317-329) que debería ser aproximadamente 2,6 mmol, dependiendo de la pureza de AES (o SNA u OPE). Añadir vehículo activado durante 20 minutos a la solución de AES (o SNA u OPE). Después de 2 horas añadir otros 0,56 g de EDC y agitar la solución durante una noche. Medir los grupos amino mediante TNBS para determinar la cantidad de reducción de grupos amino que es equivalente a la cantidad de grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) incorporados. Lavar el vehículo sulfatado (o sulfonatado o fosforilado) mediante 20 volúmenes de agua usando un cartucho de ultrafiltración de PCPM de 100 kDa (UFP-100-E-5A; GE-Amersham), esterilizar por filtrado (filtro de polisulfona de 0,2 pm, Nalgene, Rochester, NY) y liofilizar. Este producto (10PSPEG1035NTASO o 10PSPEG1035NTASF o 10PSPEG1035NTAPO) tendrá agrupamientos de hasta tres grupos sulfato (sulfonato o fosfato) por agrupamiento colgante de la cadena principal.
Ejem plo 27: S íntesis de 10PTPEG1035NTA: El 10PTPEG1035NTA se usará como el material de partida para la síntesis de algunas de las composiciones de núcleo aniónico de la presente invención. Esta composición tiene politreonina (Sigma Chem. Co. St Luis Mo. Cat. N.° P8077, PM=5-15 kDa) como la cadena principal polimérica con el 35 % de los grupos hidroxilo ocupados con MPEGAM de 10 kDa (PM=10 kDa MPEG con grupo amino en el extremo; Sunbio, Orinda, CA; Cat. N.° P1AM-10) y el grupo hidroxilo restante ocupado con ácido nitrilotriacético. Para preparar esta composición todos los grupos hidroxilo se convertirán en grupo carboxilo usando anhídrido succínico. En resumen, disolver 1 g de politreonina en 25 ml de dioxano y añadir 4,5 gramos de anhídrido succínico (exceso molar quíntuple con respecto al grupo hidroxilo teórico) en 1 gramo de politreonina) y 900 mg de N,N'-dimetilaminopiridina como catalizador e incubar la mezcla a 60 °C durante 3 horas. Retirar dioxano mediante evaporación rotatoria a 40 °C, disolver el sólido en agua, neutralizado con NaOH y lavar con 15 cambios de agua en un cartucho de ultrafiltración de PCPM de 3 kDa (UFP-3-E-5A). Esterilizar por filtrado el producto resultante (PT) usando (filtro de polisulfona de 0,2 pm, Nalgene, Rochester, NY) y liofilizar para obtener PT. Medir el grupo carboxilo de partida (1 equivalente) en 1,0 g de PT según el protocolo de Kobayashi y Chiba (Analytical biochemistry 1994, vol 219, p189-194). Para sintetizar 10PTPEG1035NTA, tomar 1,0 g de PT (con 1 equivalente de grupo carboxilo), disolver en 25 ml de tampón de MES (ácido 2-(W-morfolino)etanosulfónico, Pierce, Rockford, IL) 10 mM a pH 4,7 (solución de PT), añadir 1 equivalente de NHS (PM=115,14), 1 equivalente de EDC (PM=191,71; 4 mmol) y permitir que se active durante 20 minutos. En un recipiente separado, disolver 0,35X mmol de MPEGAM (PM=10 kDa MPEG con grupo amino en el extremo; Sunbio, Orinda, CA; Cat. N.° P1AM-10) en 20 ml de HEPES 0,2 M, pH 7,8 para preparar solución de MPEGAM. Después de 20 minutos de activación de PT, añadir solución de PT a la solución de MPEGAM y permitir que la reacción continúe durante 2 horas. Medir el grupo amino restante del MPEGAM mediante TNBS y debería ser ninguno lo que indica que se han consumido los 0,35 equivalentes del grupo amino y se han conjugado con el PT. Si hay grupos amino restantes, ajustar el pH a 5 con HCl 6 N y añadir 1 equivalente de EDC (PM=191,71), después de 20 minutos ajustar el pH de nuevo hasta 7,8 y permitir que reaccionen durante una noche. Tomar una alícuota de la solución de 10PTPEG1035 resultante y determinar el diámetro hidrodinámico mediante cromatografía de exclusión por tamaño usando columna TosohG4000WXL (0,79 x 30 cm) y solución salina tamponada con fosfato (PBS; fosfato 11,9 mM, NaCI 137 mM, KPO42,7 mM, pH 7,4) que contiene Acetonitrilo al 15 % como disolvente de elución a un caudal de 0,6 ml/min. El tiempo de retención debería ser coherente con un diámetro hidrodinámico de aproximadamente 12-18 nm. Ajustar el pH a 5 con HCl 6 N y añadir 1,5 equivalentes de EDC (PM=191,71) y activar durante 20 minutos. Después de 20 minutos añadir esta solución de 10PTPEG1035 activada a 10 equivalentes de Nalfa,Nalfa-biscarboximetil-lisina (PM=262 Da) en hasta 25 ml de tampón de HEPES 0,2 M a pH 7,8 y permitir que reaccione durante una noche. Concentrar la mezcla de reacción hasta 100 ml y lavar con 15 cambios de agua en un cartucho de ultrafiltración de PCPM de 100 kDa (UFP-100-E-5A). Esterilizar por filtrado el producto de 10PTPEG1035NTA (usando filtro de polisulfona de 0,2 pm, Nalgene, Rochester, Ny ) y liofilizar. Preparar una solución de 10 mg/ml de 10PTPEG1035NTA resultante y determinar el diámetro hidrodinámico mediante cromatografía de exclusión por tamaño usando columna TosohG4000WXL (0,79 x 30 cm) y solución salina tamponada con fosfato como disolvente de elución (PBS; fosfato 11,9 mM, NaCl 137 mM, KPO4 2,7 mM, pH 7,4) que contiene Acetonitrilo al 15 % a un caudal de 0,6 ml/min. El tiempo de retención debería ser coherente con diámetro hidrodinámico de aproximadamente 14-20 nm.
Ejem plo 28: S íntesis de 10PTPEG1035NTASO o 10PTPEG1035NTASF o 10PTPEG1035NTAPO:Esta estructura comprende politreonina de 10 kDa en la que el 35 % de los grupos hidroxilo están unidos covalentemente con MPEG de 10 kDa y los grupos hidroxilo restantes están unidos covalentemente al grupo amino épsilon de biscarboximetillisina que es un derivado de ácido nitrilotriacético (NTA). El NTA está modificado adicionalmente para contener tres grupos sulfato (o sulfonato o fosfato), cada uno unido con los grupos carbonilo de NTA. Esencialmente, cada NTA actúa como un espaciador para permitir que un agrupamiento de tres grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) se unan con la cadena principal de politreonina (también pueden usarse otras cadenas principales). El 10PTPEG1035NTA (véase anteriormente) puede convertirse en vehículo sulfatado (o sulfonatado o fosfatado) que contiene agrupamientos de grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) con hasta tres grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) en cada agrupamiento. Para hacer esto, tomar 2 gramos del 10PTPEG1035NTA y disolverlos en 50 ml de tampón de MES 10 mM (pH 4,7). Activar el vehículo mediante la adición de 0,28 g de NHSS (PM=217,14; 1,3 mmol), seguido de 0,56 g de EDC (Pm =191,71; 2,9 mmol) y permitir que se active durante 20 minutos. En un recipiente separado disolver 0,37 g de 2-aminoetilhidrogenosulfato (AES; PM=141; 2,6 mmol) o 0,45 g de ácido sulfanílico (s Na ; PM=173; 2,6 mmol) o 0,37 g de O-fosforiletanolamina (OPE; PM=141; 2,6 mmol) en 25 ml de tampón de HEPES 1 M (pH 7,3, ajustar el pH a 7,8 usando NaOH) y medir los grupos amino de partida mediante TNBS (Spadaro et al., 1979, Anal. Chem., 96, p317-329) que debería ser aproximadamente 2,6 mmol, dependiendo de la pureza de AES (o SNA u OPE). Añadir vehículo activado durante 20 minutos a la solución de AES (o SNA u OPE). Después de 2 horas añadir otros 0,56 g de EDC y agitar la solución durante una noche. Medir los grupos amino mediante TNBS para determinar la cantidad de reducción de grupos amino que es equivalente a la cantidad de grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) incorporados. Lavar el vehículo sulfatado (o sulfonatado o fosforilado) mediante 20 volúmenes de agua usando un cartucho de ultrafiltración de PCPM de 100 kDa (UFP-100-E-5A; GE-Amersham), esterilizar por filtrado (filtro de polisulfona de 0,2 pm, Nalgene, Rochester, NY) y liofilizar. Este producto (10PTPEG1035NTASO o 10PTPEG1035NTASF o 10PTPEG1035NTAPO) tendrá agrupamientos de hasta tres grupos sulfato (sulfonato o fosfato) por agrupamiento colgante de la cadena principal.
Ejem plo 29: S íntesis de 20PYPEG1035NTA: El 20PYPEG1035NTA se usará como el material de partida para la síntesis de otras composiciones del núcleo aniónico de la presente invención. Esta composición tiene politirosina (Sigma Chem. Co. St Luis Mo. Cat. N.° 1800, PM=10-40 kDa) como la cadena principal polimérica con el 35 % de los grupos hidroxilo ocupados con MPEGAM de 10 kDa (PM=10 kDa MPEG con un grupo amino en el extremo; Sunbio, Orinda, CA; Cat. N.° P1AM-10) y el grupo hidroxilo restante ocupado con ácido nitrilotriacético. Para preparar esta composición todos los grupos hidroxilo se convertirán en grupos carboxilo usando anhídrido succínico. En resumen, disolver 1 g de politirosina en 25 ml de dioxano y añadir 2,9 gramos de anhídrido succínico (exceso molar quíntuple con respecto al grupo hidroxilo teórico en 1 gramo de politirosina) y 900 mg de N,N'-dimetilaminopiridina como catalizador e incubar la mezcla a 60 °C durante 3 horas. Retirar el dioxano mediante evaporación rotatoria a 40 °C, disolver el sólido en agua, neutralizar con NaOH y lavar con 15 cambios de agua en un cartucho de ultrafiltración de PCPM de 3 kDa (UFP-3-E-5A). Esterilizar por filtrado el producto resultante (PY) usando (filtro de polisulfona de 0,2 pm, Nalgene, Rochester, NY) y liofilizar para obtener PY. Medir el grupo carboxilo de partida (1 equivalente) en 1,0 g de PY según el protocolo de Kobayashi y Chiba (Analytical biochemistry 1994, vol 219, p189-194). Para sintetizar 20PYPEG1035NTA, tomar 1,0 g de PY (con 1 equivalente de grupo carboxilo) y disolver en 25 ml de tampón de MES (ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico, Pierce, Rockford, IL) 10 mM a pH 4,7 (solución de PY), añadir 1 equivalente de NHS (PM=115,14) y 1 equivalente de EDC (PM=191,71) y agitar durante 20 minutos para activar. En un recipiente separado, disolver 0,35 equivalentes de MPEGAM (PM=10 kDa MPEG con grupo amino en el extremo; Sunbio, Orinda, CA; Cat. N.° P1AM-10) en 20 ml de tampón de HEPES 0,2 M a pH 7,8 para preparar una solución de MPEGAM. Añadir solución de PY activada a la solución de PY y permitir que la reacción continúe durante 2 horas. Medir el grupo amino restante del MPEGAM mediante TNBS y debería ser ninguno lo que indica que se han consumido los 0,35 equivalentes de grupos amino y se han conjugado con el PY. Si existen grupos amino restantes, ajustar el pH a 5 con HCl 6 N y añadir 1 equivalente de EDC (PM=191,71), después de 20 minutos ajustar de nuevo el pH a 7,8 y permitir que reaccione durante una noche. Tomar una alícuota de la solución de 20PYPYG1035 resultante y determinar el diámetro hidrodinámico mediante cromatografía de exclusión por tamaño usando columna TosohG4000WXL (0,79 x 30 cm) y solución salina tamponada con fosfato (PBS; fosfato 11,9 mM, NaCl 137 mM, KPO42,7 mM, pH 7,4) que contiene Acetonitrilo al 15 % como disolvente de elución a un caudal de 0,6 ml/min. El tiempo de retención debería ser coherente con un diámetro hidrodinámico de aproximadamente 13-18 nm. Ajustar el pH a 5 con HCl 6 N y añadir I , 5 equivalentes de EDC (PM=191,71) y activar durante 20 minutos. Después de 20 minutos añadir este a 10 equivalentes de Nalfa,Nalfa-biscarboximetil-lisina (PM=262 Da) en hasta 25 ml de tampón de HEPES 0,2 M a pH 7,8 y permitir que reaccione durante una noche. Concentrar la mezcla de reacción hasta 100 ml y lavar con 15 cambios de agua en un cartucho de ultrafiltración de PCPM de 100 kDa (UFP-100-E-5A). Esterilizar por filtrado la muestra usando (filtro de polisulfona de 0,2 pm, Nalgene, Rochester, NY) y liofilizar. Preparar una solución de 10 mg/ml de 20PYPEG1035NTA resultante y determinar el diámetro hidrodinámico mediante cromatografía de exclusión por tamaño usando columna TosohG4000WXL (0,79 x 30 cm) y solución salina tamponada con fosfato como disolvente de elución (PBS; fosfato 11,9 mM, NaCl 137 mM, KPO42,7 mM, pH 7,4) que contiene Acetonitrilo al 15 % a un caudal de 0,6 ml/min. El tiempo de retención debería ser coherente con un diámetro hidrodinámico de aproximadamente 14-20 nm.
Ejem plo 30: S íntesis de 20PYPEG1035NTASO o 20PYPEG1035NTASF o 20PYPEG1035NTAPO: Esta estructura comprende politirosina de 20 kDa en la que el 35 % de los grupos hidroxilo están unidos covalentemente con MPEG de 10 kDa y los grupos hidroxilo restantes están unidos covalentemente al grupo amino épsilon de biscarboximetillisina que es un derivado de ácido nitrilotriacético (NTA). El NTA se modifica adicionalmente para contener tres grupos sulfato (o sulfonato o fosfato), cada uno unido con los grupos carbonilo de NTA. Esencialmente, cada NTA actúa como un espaciador para permitir que un agrupamiento de tres grupos sulfato se una con la cadena principal de politirosina (también pueden usarse otras cadenas principales). El 20PYPEG1035NTA (véase anteriormente) puede convertirse en vehículo sulfatado (o sulfonatado o fosforilado) que contiene agrupamientos de grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) con hasta tres grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) en cada agrupamiento. Para hacer esto, tomar 2 gramos del 20PYPEG1035NTA y disolverlos en 50 ml de tampón de MES 10 mM (pH 4,7). Activar el vehículo añadiendo 0,28 g de NHSS (PM=217,14; 1,3 mmol), seguido de 0,56 g de EDC (PM=191,71; 2,9 mmol) y permitir que se active durante 20 minutos. En un recipiente separado disolver 0,37 g de 2-aminoetilhidrogenosulfato (AES; PM=141; 2,6 mmol) o 0,45 g de ácido sulfanílico (SNA; PM=173; 2,6 mmol) o 0,37 g de O-fosforiletanolamina (OPE; PM=141; 2,6 mmol) en 25 ml de tampón de HEPES 1 M (pH 7,3, ajustar el pH a 7,8 usando NaOH) y medir los grupos amino de partida mediante TNBS (Spadaro et al., 1979, Anal. Chem., 96, p317-329) que debería ser aproximadamente 2,6 mmol, dependiendo de la pureza de AES (o SNA u OPE). Añadir vehículo activado durante 20 minutos a la solución de AES (o SNA u OPE). Después de 2 horas añadir otros 0,56 g de EDC y agitar la solución durante una noche. Medir los grupos amino mediante TNBS para determinar la cantidad de reducción de grupos amino que es equivalente a la cantidad de grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) incorporados. Lavar el vehículo sulfatado (o sulfonatado o fosforilado) mediante 20 volúmenes de agua usando un cartucho de ultrafiltración de PCPM de 100 kDa (UFP-100-E-5A; GE-Amersham), esterilizar por filtrado (filtro de polisulfona de 0,2 pm, Nalgene, Rochester, NY) y liofilizar. Este producto (20PYPEG1035NTASO o 20PYPEG1035NTASF o 20PYPEG1035NTAPO) tendrá agrupamientos de hasta tres grupos sulfato (sulfonato o fosfato) por agrupamiento colgante de la cadena principal.
Ejem plo 31: S íntesis de 20PCPEG1035DTPA: El 20PCPEG1035DTPA se usará como el material de partida para la síntesis de otras composiciones de núcleo aniónico de la presente invención. Esta composición tiene policisteína (Sigma Chem. Co. St Luis Mo. Cat. N.° P1800, PM=10-40 kDa) como la cadena principal polimérica con el 35 % de los grupos tiol ocupados con MPEGAM de 10 kDa (PM=10 kDa; SunBright; ME-100HS; lote N.° M62503; limpio en solución) y el grupo tiol restante ocupado con ácido dietilentriaminpentaacético (DTPA). Para preparar esta composición todos los grupos tiol se convertirán en grupo amino usando Aminoetil-8 (N-(yodoetil) trifluoroacetamida (Pierce, Rockford, IL, Cat. N.° 23010). En resumen, disolver 1 g de policisteína en 25 ml de tampón de tricina 20 mM a pH 8,5 y añadir 4,7 gramos de Aminoetil-8 (N-(yodoetil) trifluoroacetamida (exceso molar doble con respecto al grupo tiol teórico en 1 gramo de policisteína) e incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 3 horas. Lavar 15 cambios de agua en un cartucho de ultrafiltración de PCPM de 3 kDa (UFP-3-E-5A). Esterilizar por filtrado el producto resultante (PC) usando (filtro de polisulfona de 0,2 pm, Nalgene, Rochester, NY) y liofilizar para obtener PC. Medir el grupo amino de partida (1 equivalente) en 1,0 g de PC usando TNBS como anteriormente. Para sintetizar 20PCPEG1035DTPA, tomar 1,0 g de PC (con 1 equivalente de grupo amino) y disolver en 25 ml de tampón de HEPES 0,2 M a pH 7,8 (Pierce, Rockford, IL) para obtener una solución de 20 PC. En un recipiente separado, disolver 0,35 equivalentes de MPEGAM (PM=10 kDa; MetoxiPEG con grupo carboxilo en el extremo; de Lysan bio; Arab, AL) en 60 ml de MES 10 mM a pH=4,7, añadir 0,5 equivalentes de NHS (PN=115,14), una vez disuelto añadir 1 equivalente de EDC (PM=191,71; 10,43 mmol) agitando al mismo tiempo y permitir que la activación continúe durante 20 minutos. Añadir MPEGC activado directamente a la solución de 20PC, permitir que la reacción se produzca durante 2 horas y medir los grupos amino mediante TNBS para asegurar el 35 % de saturación de grupos amino, de otro modo añadir más de la cantidad apropiada de MPEGC activado. Esta es la solución de 20PCPEG1035. Realizar cromatografía de exclusión por tamaño usando columna TosohG4000WXL (0,79 x 30 cm) con solución salina tamponada con fosfato (PBS; fosfato 11,9 mM, NaCl 137 mM, KPO4 2,7 mM, pH 7,4) que contiene elución de Acetonitrilo al 15 % a un caudal de 0,6 ml/min. El tiempo de retención debería ser coherente con un diámetro hidrodinámico de aproximadamente 14-17 nm. Añadir 5 equivalentes de dianhídrido de DTPA (PM=357,32; Sigma Chem Co., St Louis, MO. Cat. N.° 284025) seguido de 200 pl de TEA. Valorar la reacción lentamente con NaOH 10 N hasta pH 7,8 y agitar durante 4 horas. Usando reacción de TNBS, confirmar que no permanece ningún grupo amino lo que es indicativo de una reacción completa y que se ha preparado el producto de 20PCPEG1035DTPA. Realizar cromatografía de exclusión por tamaño usando columna TosohG4000WXL (0,79 x 30 cm) con solución salina tamponada con fosfato (PBS; fosfato I I , 9 mM, NaCl 137 mM, KPO4 2,7 mM, pH 7,4) que contiene elución de Acetonitrilo al 15 % a un caudal de 0,6 ml/min. El tiempo de retención debería ser coherente con un diámetro molecular de 17-21 nm. Lavar el 20PCPEG1035DTPA resultante con 15 volúmenes de agua usando un cartucho de ultrafiltración de PCPM de 100.000 (UFP-100-E-5A; GE-Amersham) y liofilizar.
Ejem plo 32: S íntesis de 20PCPEG1035DTPASO o 20PCPEG1035DTPASF o 20PCPEG1035DTPAPO: Esta estructura comprende policisteína de 20 kDa en la que el 35 % de los grupos tiol están unidos covalentemente con MPEG de 10 kDa y los grupos tiol restantes están unidos covalentemente con uno de los grupos carbonilo del ácido etilendiamintetraacético (DTPA). El DTPA se modifica adicionalmente para contener cuatro grupos sulfato (o sulfonato o fosfato), cada uno unido con los grupos carbonilo de DTPA. Esencialmente, cada DTPA actúa como un espaciador para permitir que un agolpamiento de cuatro grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) se una con la cadena principal de policisteína (también pueden usarse otras cadenas principales). El 20PCPEG1035DTPA (véase anteriormente) puede convertirse en vehículo sulfatado (o sulfonatado o fosforilado) que contiene agrupamientos de grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) con hasta cuatro grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) en cada agrupamiento. Para hacer esto, tomar 2 gramos del 20PCPEG1035DTPA y disolverlo en 50 ml de tampón de MES l0 mM (pH 4,7). Activar el vehículo añadiendo 0,28 g de NHSS (PM=217,14; 1,3 mmol), seguido de 0,56 g de EDC (PM=191,71; 2,9 mmol) y permitir que se active durante 20 minutos. En un recipiente separado disolver 0,37 g de 2-aminoetilhidrogenosulfato (AES; PM=141; 2,6 mmol) o 0,45 g de ácido sulfanílico (SNA; PM=173; 2,6 mmol) o 0,37 g de O-fosforiletanolamina (OPE; PM=141; 2,6 mmol) en 25 ml de tampón de He PES 1 M (pH 7,3, ajustar el pH a 7,8 usando NaOH) y medir los grupos amino de partida mediante TNBS (Spadaro et al., 1979, Anal. Chem., 96, p317-329) que deberían ser aproximadamente 2,6 mmol, dependiendo de la pureza de AES (o SNA u OPE). Añadir vehículo activado durante 20 minutos a la solución de AES (o SNA u OPE). Después de 2 horas añadir otros 0,56 g de EDC y agitar la solución durante una noche. Medir los grupos amino mediante TNBS para determinar la cantidad de reducción de grupos amino que es equivalente a la cantidad de grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) incorporados. Lavar el vehículo sulfatado (o sulfonatado o fosforilado) mediante 20 volúmenes de agua usando un cartucho de ultrafiltración de PCPM de 100 kDa (UFP-100-E-5A; GE-Amersham), esterilizar por filtrado (filtro de polisulfona de 0,2 pm, Nalgene, Rochester, NY) y liofilizar. Este producto (20PCPEG1035DTPASO o 20PCPEG1035DTPASF o 20PCPEG1035DTPAPO) tendrá agrupamientos de hasta cuatro grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) por agrupamiento que está colgante de la cadena principal.
Ejem plos de com posiciones con cadenas p rincipa les polim éricas derivadas de m onóm eros no b io lóg icos
Ejem plo 33: S íntesis de 15PALPEG1035DTPA: Se usará 15PALPEG1035DTPA como el material de partida para la síntesis de algunas de las composiciones de núcleo aniónico de la presente invención. Esta composición tiene clorhidrato de polialilamina (Sigma Chem. Co. St Luis Mo. Cat. N.° 283215, PM=15 kDa) como la cadena principal polimérica con 35 % de los grupos amino ocupados con MPEGC de 10 kDa (PM=10 kDa; SunBright; ME-100HS; lote N.° M62503; limpio en solución) y el grupo amino restante ocupado con ácido etilendiamintetraacético (DTPA). Para sintetizar 15PALPEG1035DTPA, tomar 1,0 g de clorhidrato de polialilamina (con 1 equivalente de grupo amino como se mide mediante TNBS) y disolver en 25 ml de tampón de HEPES 0,2 M a pH 7,4 (Pierce, Rockford, IL) para obtener una solución de 15 PAL. En un recipiente separado, disolver 0,35 equivalentes de MPEGAM (PM=10 kDa; MetoxiPEG con grupo carboxilo en el extremo, de Lysan bio; Arab, AL) en 60 ml de MES 20 mM a pH=4,7, añadir 0,5 equivalentes de NHS (PN=115,14), una vez disuelto añadir 1 equivalente de EDC (PM=191,71; 10,43 mmol) y agitar durante 20 minutos. Después de 20 minutos, añadir MPEGC activado directamente a la solución de 15PAL, después de 2 horas y medir los grupos amino mediante TNBS para asegurar si el 35 % de saturación de los grupos amino por otro lado añade más de la cantidad apropiada de MPEGC activado. Esta es la solución 15PALPEG1035. Realizar cromatografía de exclusión por tamaño usando columna TosohG4000WXL (0,79 x 30 cm) con solución salina tamponada con fosfato (PBS; fosfato 11,9 mM, NaCl 137 mM, KPO4 2,7 mM, pH 7,4) que contiene elución de Acetonitrilo al 15 % a un caudal de 0,6 ml/min. El tiempo de retención debería ser coherente con un diámetro molecular de aproximadamente 14-17 nm. Añadir 5 equivalentes de dianhídrido de DTPA (PM=357,32; Sigma Chem Co., St Louis, MO. Cat. N.° 284025) seguido de 200 pl de TEA. Valorar la reacción lentamente con NaOH 10 N hasta pH 7,8 y agitar durante 4 horas. Usando la reacción de TNBS, confirmar que no permanece ningún grupo amino indicativo de una reacción completa y que se ha preparado el producto de 15PALPEG1035DTPA. Realizar cromatografía de exclusión por tamaño usando columna TosohG4000WXL (0,79 x 30 cm) con solución salina tamponada con fosfato (PBS; fosfato 11,9 mM, NaCl 137 mM, KPO42,7 mM, pH 7,4) que contiene elución de Acetonitrilo al 15 % a un caudal de 0,6 ml/min. El tiempo de retención debería ser coherente con un diámetro molecular de 17-21 nm. Lavar el 15PALPEG1035DTPA resultante con 15 volúmenes de agua usando un cartucho de ultrafiltración de PCPM de 100.000 (UFP-100-E-5A; GE-Amersham) y liofilizar. Ejem plo 34: S íntesis de 15PALPEG1035DTPASO o 15PALPEG1035DTPASF o 15PALPEG1035DTPAPO: Esta estructura comprende polialilamina de 15 kDa en la que el 35 % de los grupos amino están unidos covalentemente con MPEG de 10 kDa y los grupos amino restantes están unidos covalentemente con uno de los grupos carboxilo de ácido dietilentriaminpentaacético (DTPA). El DTPA se modifica adicionalmente para contener cuatro grupos sulfato, cada uno unido con los grupos carbonilo de DTPA. Esencialmente, cada DTPA actúa como un espaciador para permitir que un agrupamiento de cuatro grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) se unan con la cadena principal de polialilamina (también pueden usarse otras cadenas principales). El 15PALPEG1035DTPA (véase anteriormente) puede convertirse en vehículo sulfatado (o sulfonatado o fosforilado) que contiene agrupamientos de grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) con hasta cuatro grupos sulfato en cada agrupamiento. Para hacer esto, tomar 2 gramos del 15PALPEG1035DTPA y disolverlo en 50 ml de tampón de MES 10 mM (pH 4,7). Activar el vehículo añadiendo 0,28 g de NHSS (p M=217,14; 1,3 mmol), seguido de 0,56 g de e Dc (PM=191,71; 2,9 mmol) y permitir que se active durante 20 minutos. En un recipiente separado disolver 0,37 g de 2-aminoetilhidrogenosulfato (AES; PM=141; 2,6 mmol) o 0,45 g de ácido sulfanílico (SNA; PM=173; 2,6 mmol) o 0,37 g de O-fosforiletanolamina (OPE; PM=141; 2,6 mmol) en 25 ml de tampón de HEPES 1 M (pH 7,3, ajustar el pH a 7,8 usando NaOH) y medir los grupos amino de partida mediante TNBS (Spadaro et al., 1979, Anal. Chem., 96, p317-329) que deberían ser aproximadamente 2,6 mmol, dependiendo de la pureza de AES (o SNA u OPE). Añadir vehículo activado durante 20 minutos a la solución de AES (o SNA u OPE). Después de 2 horas añadir otros 0,56 g de EDC y agitar la solución durante una noche. Medir los grupos amino mediante TNBS para determinar la cantidad de reducción de grupos amino que es equivalente a la cantidad de grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) incorporados. Lavar el vehículo sulfatado (o sulfonatado o fosforilado) mediante 20 volúmenes de agua usando un cartucho de ultrafiltración de PCPM de 100 kDa (UFP-100-E-5A; GE-Amersham), esterilizar por filtrado (filtro de polisulfona de 0,2 pm, Nalgene, Rochester, NY) y liofilizar. Este producto (15PALPEG1035DTPASO o 15PALPEG1035DTPASF o 15PALPEG1035DTPAPO) tendrá agrupamientos de hasta cuatro grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) por agrupamiento colgante de la cadena principal.
Ejem plo 35: S íntesis de 20PMAPEG1035NTA: El 20PMAPEG1035NTA se usará como el material de partida para la síntesis de algunas de las composiciones de núcleo aniónico de la presente invención. Esta composición tiene polimetilmetacrilato (Sigma Chem. Co. St Luis Mo. Cat. N.° 81498, PM=20 kDa) como la cadena principal polimérica con el 35 % de los grupos metoxi reemplazados con MPEGAM de 10 kDa (PM=10 kDa MPEG con grupo amino en el extremo; Sunbio, Orinda, CA; Cat. N.° P1AM-10) y los grupos metoxi restantes ocupados con ácido nitrilotriacético. Para preparar esta composición todos los grupos metoxi en polimetilmetacrilato (Sigma Chem. Co. St Luis Mo. Cat. N.° 81498, PM=20 kDa) se retirarán usando Metanólico/KOH para obtener ácido polimetilacrílico (PMA). En resumen, disolver 2 g de polimetilmetacrilato en 25 ml de KOH metanólico al 10 % y someter a reflujo durante 96 horas. Neutralizar con HCl y retirar metanol mediante evaporación rotatoria a 40 °C, disolver el sólido en agua y lavar con 15 cambios de agua en un cartucho de ultrafiltración de PCPM de 3 kDa (UFP-3-E-5A). Esterilizar por filtrado el producto resultante (PMA) usando (filtro de polisulfona de 0,2 pm, Nalgene, Rochester, NY) y liofilizar para obtener PMA. Medir el grupo carboxilo de partida (1 equivalente) en 1,0 g de PMA según el protocolo de Kobayashi y Chiba (Analytical biochemistry 1994, vol 219, p189-194). Para sintetizar 20PMAPEG1035NTA, tomar 1,0 g de PMA (con 1 equivalente de grupo carboxilo) y disolver en 25 ml de tampón de MES (ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico, Pierce, Rockford, IL) 10 mM a pH 4,7 (solución de PS) y activar añadiendo 1 equivalente de n Hs (PM=115,14) y 1 equivalente de EDC (PM=191,71). En un recipiente separado, disolver 0,35 equivalentes de MPEGAM (PM=10 kDa MPEG con grupo amino en el extremo; Sunbio, Orinda, CA; Cat. N.° P1AM-10) en 10 ml de HEPES 0,2 M y ajustar el pH a 7,8 con NaOH 10 N. Después de 20 minutos de activación de PMA, añadir PMA a la solución de MPEGAM. Permitir que la reacción continúe durante 2 horas y medir el grupo amino restante del MPEGAM mediante TNBS y no debería haber ninguno lo que indica que se han consumido los 0,35 equivalentes del grupo amino y se han conjugado con el PMA. Si hay grupos amino restantes, ajustar el pH hasta 5 con HCl 6 N y añadir 1 equivalente de e Dc (PM=191,71), después de 20 minutos ajustar de nuevo el pH a 7,8 y permitir que reaccione durante una noche. Tomar una alícuota de la solución de 20PMAPEG1035 resultante y determinar el diámetro hidrodinámico mediante cromatografía de exclusión por tamaño usando columna TosohG4000WXL (0,79 x 30 cm) y solución salina tamponada con fosfato (PBS; fosfato 11,9 mM, NaCl 137 mM, KPO42,7 mM, pH 7,4) que contiene Acetonitrilo al 15 % como disolvente de elución a un caudal de 0,6 ml/min. El tiempo de retención debería ser coherente con un diámetro de aproximadamente 13­ 18 nm. Ajustar el pH a 5 con HCl 6 N y añadir 1,5 equivalentes de EDC (PM=191,71) y activar durante 20 minutos. Después de 20 minutos añadir esta solución de 20PMAPEG1035 activada a 10 equivalentes de Nalfa,Nalfabiscarboximetil-lisina (PM=262 Da) en hasta 25 ml de tampón de HEPES 1 M a pH 7,4 y permitir que reaccione durante una noche. Concentrar la mezcla de reacción hasta 100 ml y lavar con 15 cambios de agua en un cartucho de ultrafiltración de PCPM de 100 kDa (UFP-100-E-5A). Esterilizar por filtrado el producto de 20PMAPEG1035NTA (usando filtro de polisulfona de 0,2 pm, Nalgene, Rochester, NY) y liofilizar. Preparar una solución de 10 mg/ml de 20PMAPEG1035NTA resultante y determinar el diámetro hidrodinámico mediante cromatografía de exclusión por tamaño usando columna TosohG4000WXL (0,79 x 30 cm) y solución salina tamponada con fosfato como disolvente de elución (PBS; fosfato 11,9 mM, NaCl 137 mM, KPO4 2,7 mM, pH 7,4) que contiene Acetonitrilo al 15 % a un caudal de 0,6 ml/min. El tiempo de retención debería ser coherente con un diámetro de aproximadamente 16-20 nm.
Ejem plo 36: S íntesis de 20PMAPEG1035NTASO o 20PMAPEG1035NTASF o 20PMAPEG1035NTAPO: Esta estructura comprende politimetilacrilato de 20 kDa en el que el 35 % de los grupos carboxilo están unidos covalentemente con MPEG de 10 kDa y los grupos carboxilo restantes están unidos covalentemente al grupo amino épsilon de biscarboximetillisina que es un derivado de ácido nitrilotriacético (NTA). El NTA está modificado adicionalmente para contener tres grupos sulfato (o sulfonato o fosfato), cada uno unido con los grupos carbonilo de NTA. Esencialmente, cada NTA actúa como un espaciador para permitir que un agrupamiento de tres grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) se una con la cadena principal de polimetilacrilato (también se pueden usar otras cadenas principales). El 20PMAPEG1035NTA (véase anteriormente) puede convertirse en vehículo sulfatado (o sulfonatado o fosforilado) que contiene agrupamientos de grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) con hasta tres grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) en cada agrupamiento. Para hacer esto, tomar 2 gramos del 20PMAPEG1035NTA y disolverlo en 50 ml de tampón de MES 10 mM (pH 4,7). Activar el vehículo añadiendo 0,28 g de NHSS (PM=217,14; 1,3 mmol), seguido de 0,56 g de EDC (p M=191,71; 2,9 mmol) y permitir que se active durante 20 minutos. En un recipiente separado disolver 0,37 g de 2-aminoetilhidrogenosulfato (AES; PM=141; 2,6 mmol) o 0,45 g de ácido sulfanílico (SNA; PM=173; 2,6 mmol) o 0,37 g de O-fosforiletanolamina (OPE; PM=141; 2,6 mmol) en 25 ml de tampón de HEPES 1 M (pH 7,3, ajustar el pH hasta 7,8 usando NaOH) y medir los grupos amino de partida mediante TNBS (Spadaro et al., 1979, Anal. Chem., 96, p317-329) que debería ser aproximadamente 2,6 mmol, dependiendo de la pureza de AES (o SNA u OPE). Añadir vehículo activado durante 20 minutos a la solución de AES (o SNA u OPE). Después de 2 horas añadir otros 0,56 g de EDC y agitar la solución durante una noche. Medir los grupos amino mediante TNBS para determinar la cantidad de reducción de grupos amino que es equivalente a la cantidad de grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) incorporados. Lavar el vehículo sulfatado (o sulfonatado o fosforilado) mediante 20 volúmenes de agua usando un cartucho de ultrafiltración de Pc Pm de 100 kDa (UFP-100-E-5A; GE-Amersham), esterilizar por filtrado (filtro de polisulfona de 0,2 |jm, Nalgene, Rochester, NY) y liofilizar. Este producto (20PMAPEG1035NTASO o 20PMAPEG1035NTASF o 20PMAPEG1035NTAPO) tendrá agolpamientos de hasta tres grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) por agrupamiento colgante de la cadena principal.
Ejem plo 37: S íntesis de 15PACPEG1035NTA: El 15PACPEG1035NTA se usará como el material de partida para la síntesis de algunas de las composiciones de núcleo aniónico de la presente invención. Esta composición tiene ácido policrílico o PAC (Sigma Chem. Co. St Luis Mo. Cat. N.° 81123, PM=16 kDa) como la cadena principal polimérica con el 35 % de los grupos carboxi unidos a MPEGAM de 10 kDa (PM=10 kDa MPEG con grupo amino en el extremo; Sunbio, Orinda, CA; Cat. N.° P1AM-10) y los grupos carboxilo restantes ocupados con ácido nitrilotriacético. Medir el grupo carboxilo de partida (1 equivalente) en 1,0 g de PAC según el protocolo de Kobayashi y Chiba (Analytical biochemistry 1994, vol 219, p189-194). Para sintetizar 15PACPEG1035NTA, tomar I , 0 g de PAC (con 1 equivalente de grupo carboxilo) y disolver en 25 ml de tampón de MES (ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico, Pierce, Rockford, IL) 10 mM a pH 4,7 (solución de PAC). Añadir 1 equivalente de NHS (PM=115,14) y 1 equivalente de EDC (PM=191,71) a la solución de PAC agitándose al mismo tiempo para activar PAC. En un recipiente separado, disolver 0,35 equivalentes de MPEGAM (PM=10 kDa MPEG con grupo amino en el extremo; Sunbio, Orinda, CA; Cat. N.° P1AM-10) en 20 ml de HEPES 0,2 M y ajustar el pH a 7,8 usando NaOH para obtener MPEGAM. Después de activación durante 20 minutos de PAC, añadir la solución de PAC a la solución de MPEGAM. Permitir que la reacción continúe durante 2 horas y medir el grupo amino restante del MPEGAM mediante TNBS y no debería haber ninguno lo que indica que se han consumido los 0,35 equivalentes de grupo amino y se han conjugado con el PAC. Si hay grupos amino restantes en MPEGAM, ajustar el pH hasta 5 con HCl 6 N y añadir 1 equivalente de EDC (PM=191,71), después de 20 minutos ajustar de nuevo el pH a 7,8 y permitir que reaccione durante una noche para formar 15PACPEG1035. Tomar una alícuota de la solución de 15PACPEG1035 resultante y determinar el diámetro hidrodinámico mediante cromatografía de exclusión por tamaño usando columna TosohG4000WXL (0,79 x 30 cm) y solución salina tamponada con fosfato (PBS; fosfato I I , 9 mM, NaCl 137 mM, KPO42,7 mM, pH 7,4) que contiene Acetonitrilo al 15 % como disolvente de elución a un caudal de 0,6 ml/min. El tiempo de retención debería ser coherente con un diámetro de aproximadamente 12­ 17 nm. Ajustar el pH hasta 5 con HCl 6 N y añadir 1,5 equivalentes de EDC (PM=191,71) y activar durante 20 minutos. Después de 20 minutos añadir esta solución de 15PACPEG1035 activada a 10 equivalentes de Nalfa,Nalfa-biscarboximetil-lisina (PM=262 Da) en hasta 25 ml de tampón de HEPES 1 M a pH 7,4 y permitir que reaccione durante una noche. Concentrar la mezcla de reacción hasta 100 ml y lavar con 15 cambios de agua en un cartucho de ultrafiltración de PCPM de 100 kDa (UFP-100-E-5A). Esterilizar por filtrado el producto de 15PACPEG1035NTA (usando filtro de polisulfona de 0,2 jm , Nalgene, Rochester, NY) y liofilizar. Preparar una solución de 10 mg/ml de 15PACPEG1035NTA resultante y determinar el diámetro hidrodinámico mediante cromatografía de exclusión por tamaño usando columna TosohG4000WXL (0,79 x 30 cm) y solución salina tamponada con fosfato como disolvente de elución (PBS; fosfato 11,9 mM, NaCl 137 mM, KPO42,7 mM, pH 7,4) que contiene Acetonitrilo al 15 % a un caudal de 0,6 ml/min. El tiempo de retención debería ser coherente con un diámetro de aproximadamente 15-20 nm.
Ejem plo 38: S íntesis de 15PACPEG1035NTASO o 15PACPEG1035NTASF o 15PACPEG1035NTAPO: Esta estructura comprende ácido poliacrílico de 15 kDa en el que el 35 % de los grupos carboxilo están unidos covalentemente con MPEG de 10 kDa y los grupos carboxilo restantes están unidos covalentemente al grupo amino épsilon de biscarboximetillisina que es un derivado de ácido nitrilotriacético (NTA). El NTA se modifica adicionalmente para contener tres grupos sulfato (o sulfonato o fosfato), cada uno unido con los grupos carbonilo de NTA. Esencialmente, cada NTA actúa como un espaciador para permitir que un agrupamiento de tres grupos sulfato (o sulfonato o fosfato), se una con la cadena principal de ácido poliacrílico (también pueden usarse otras cadenas principales). El 15PACPEG1035NTA (véase anteriormente) puede convertirse en vehículo sulfatado (o sulfonatado o fosforilado) que contiene agrupamientos de grupos sulfato con hasta tres grupos sulfato en cada agrupamiento. Para hacer esto, tomar 2 gramos del 15PACPEG1035NTA y disolverlo en 50 ml de tampón de MES 10 mM (pH 4,7). Activar el vehículo añadiendo 0,28 g de NHSS (PM=217,14; 1,3 mmol), seguido de 0,56 g de EDC (PM=191,71; 2,9 mmol) y permitir que se active durante 20 minutos. En un recipiente separado disolver 0,37 g de 2-aminoetilhidrogenosulfato (AES; PM=141; 2,6 mmol) o 0,45 g de ácido sulfanílico (SNA; PM=173; 2,6 mmol) o 0,37 g de O-fosforiletanolamina (OPE; PM=141; 2,6 mmol) en 25 ml de tampón de h Ep ES 1 M (pH 7,3, ajustar el pH a 7,8 usando NaOH) y medir los grupos amino de partida mediante TNBS (Spadaro et al., 1979, Anal. Chem., 96, p317-329) lo que debería ser aproximadamente 2,6 mmol, dependiendo de la pureza de AES (o SNA u OPE). Añadir vehículo activado durante 20 minutos a la solución de a Es (o SNA u OPE). Después de 2 horas añadir otros 0,56 g de EDC y agitar la solución durante una noche. Medir los grupos amino mediante TNBS para determinar la cantidad de reducción de grupos amino que es equivalente a la cantidad de grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) incorporados. Lavar el vehículo sulfatado (o sulfonatado o fosforilado) mediante 20 volúmenes de agua usando un cartucho de ultrafiltración de PCPM de 100 kDa (UFP-100-E-5A; GE-Amersham), esterilizar por filtrado (filtro de polisulfona de 0,2 jm , Nalgene, Rochester, NY) y liofilizar. Este producto (15PACPEG1035NTASO o 15PACPEG1035NTASF o 15PACPEG1035NTAPO) tendrá agrupamientos de hasta tres grupos sulfato (o sulfonato o fosfato) por agrupamiento colgante de la cadena principal.
Uso de cadenas p rincipa les polim éricas s in grupos funcionales m odificables específicos.
Ejem plo 39: Uso de po lig lic ina , polialanina, po liva lina , fenilalanina, po liox ie tile ng lico l, p o liox ip ro p ilen g lico l y sim ilares (designados en este ejem plo INRT como grupo) com o una cadena p rin c ip a l polim érica es posib le m ediante el uso de reticu lantes heterobifuncionales fo to rreactivos inespecíficos que pueden in tro d u c ir grupos funcionales carboxilo en todos estos polím eros. Los ejemplos de reticuladores heterobifuncionales fotorreactivos incluyen NHS-diazirina (succinimidil 4,4'-azipentanoato), NHS-LC-diazirina (succinimidil 6-(4,4'-azipentanamido)hexanoato), NHS-SS-diazirina (succinimidil 2-([4,4'-azipentanamido]etil)-1,3'-ditioproprionato, Sulfo-NHS-diazirina (sulfosuccinimidil 4,4'-azipentanoato), Sulfo-NHS-LC-diazirina (sulfosuccinimidil 6-(4,4'-azipentanamido)hexanoato), Sulfo-NHS-SS-diazirina (sulfosuccinimidil 2-([4,4'-azipentanamido]etil-1,3'-ditioproprionato), ANB-NOS (N-5-Azido-2-nitrobenzoiloxisuccinimida), NHS-ASA (ácido N-Hidroxisuccinimidil-4-azidosalicílico), SADP (N-Succinimidil(4-azidofenil)-1,3'-ditioproprionato), Sulfo-SAND (Sulfosuccinimidil-2-(m-azidoo-nitrobenzamido)-etil-1,3'-propionato), SANPAH (N-Succinimidil-6-(4'-azido-2'-nitrofenilamino) hexanoato), Sulfo-HSAB (N-Hidroxisulfosuccinimidil-4-azidobenzoato), Sulfo-NHS-LC-ASA (Sulfosuccinimidil[4-azidosalicilamido]-hexanoato), Sulfo-SADP (N-Sulfosuccinimidil(4-azidofenil)-1,3'-ditioproprionato), Sulfo-SAED (Sulfosuccinimidil 2-[7-amino-4-metilcoumarin-3-acetamido]etil-1,3'ditiopropionato), Sulfo-SANPAH (N-Sulfosuccinimidil-6-(4'-azido-2'-nitrofenilamino) hexanoato), Sulfo-SBED (Sulfo-N-hidroxisuccinimidil-2-(6-[biotinamido]-2-(p-azidobenzamido)-hexanoamido)etil-1,3'-ditioproprionato) y Sulfo-SFAD (Sulfosuccinimidil-(perfluoroazidobenzamido)-etil-1,3'-ditiopropionato). Todos estos reactivos están disponibles en el mercado de Pierce, Rockford, IL. Son reactivos fotorreactivos los reactivos químicamente inertes que se hacen reactivos cuando se exponen a luz ultravioleta o visible. Los grupos fotorreactivos tradicionales en estos reactivos son aril azidas. Cuando una aril azida se expone a luz UV, forma un grupo nitreno que puede iniciar reacciones de adición con dobles enlaces, inserción en C-H en ausencia de sitios N-H (por ejemplo, aminas primarias), lo que sucede para polímeros de INRT. La reacción con la ruta de NH domina cuando están presentes aminas primarias en la muestra y deben evitarse. Deben evitarse agentes reductores que contienen tiol (por ejemplo, DTT o 2-mercaptoetanol) en la solución de muestra durante todas las etapas antes y durante la fotoactivación. Estos reactivos reducirán la azida. Los reactivos de succinimidil-éster diazirina (SDA) son una nueva clase de reticuladores que combinan química sensible a amina demostrada con una fotoquímica basada en diazirina eficaz para fotorreticulación con casi cualquier otro grupo funcional. Los fotorreticuladores basados en diazirina tienen mejor fotoestabilidad que fotorreticulares basados en fenil azida y se activan fácilmente con luz UV de onda larga (330-370 nm). En el ejemplo de síntesis a continuación, INRT designará un polímero que no tiene grupos modificables fácilmente.
Ejem plo 40: S íntesis de 20INRTPEGG1035NTA: Esta composición tiene INRT como la cadena principal polimérica con 35 % de los grupos carboxilo fotoinducidos unidos a MPEGAM de 10 kDa (PM=10 kDa MPEGAM tiene grupo amino en el extremo, Sunbio, Orinda, CA; Cat. N.° P1AM-10) y los grupos carboxilo restantes ocupados con ácido nitrilotriacético. Como se ha descrito anteriormente, una vez que se ha introducido NTA en el polímero, la adición de sulfato, sulfonato y fosfato es sencilla (véase anteriormente). Una vez que se han introducido sulfato, sulfonato y fosfato, la función quelante de NTA se reduce significativamente o se elimina. Para introducir grupos carboxilo en el polímero de INRT, disolver 2 g de INRT (20 kDa) en 50-100 ml de disolvente apropiado, añadir 20-40 mmol de Sulfo-NHS-diazirina y exponer la solución a luz UV (330-370 nm) durante 2-10 minutos. Ajustar el pH hasta 9 y dejar a temperatura ambiente durante 2 horas para escindir el NHS y exponer los grupos carboxilo para su análisis y ensayo de control de calidad. Lavar el producto modificado con 15 cambios de agua en un cartucho de ultrafiltración de PCPM de 3 kDa (UFP-3-E-5A). Esterilizar por filtrado el producto carboxilado resultante (20INRT) usando (filtro de polisulfona de 0,2 |jm, Nalgene, Rochester, NY) y liofilizar para obtener 20INRT. Antes de usar 20INRT para la síntesis de 20INRTPEGG1035NTA, medir el grupo carboxilo de partida (1 equivalente) en 1,0 g de 20INRT según el protocolo de Kobayashi y Chiba (Analytical biochemistry 1994, vol 219, p189-194). Si hay menos de 1 mmol de carboxilo en 1 gramo de 20INRT, introducir más carboxilo repitiendo el proceso anterior. Para sintetizar 20INRTPEGG1035NTA, tomar 1,0 g de INRT (con 1 equivalente de grupo carboxilo) y disolver en 50 ml de tampón de MES (ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico, Pierce, Rockford, IL) 10 mM a pH 4,7 para obtener solución de INRT. A la solución de INRTPEG, añadir 1 equivalente de NHS (PM=115,14) y 1 equivalente de solución de EDC (PM=191,71) agitando al mismo tiempo para permitir que se active durante 20 minutos. En un recipiente separado disolver 0,35 equivalentes de MPEGAM (PM=10 kDa MPEG con grupo amino en el extremo; Sunbio, Orinda, CA; Cat. N.° P1AM-10) en 20 ml de HEPES 0,2 M y ajustar el pH a 7,8 usando NaOH. Después de activación de 20 minutos de INRT, añadir a la solución de INRT para preparar la solución de INRTPEG. Permitir que la reacción continúe durante 2 horas y medir los grupos amino restante del MPEGAM mediante TNBS y no debería haber ninguno lo que indica que se han consumido los 0,35 equivalentes de grupos aminos y se han conjugado con el INRT. Si hay grupos amino restantes en MPEGAM, ajustar el pH a 5 con HCl 6 N y añadir 1 equivalente de EDC (PM=191,71), después de 20 minutos ajustar de nuevo el pH a 7,8 y permitir que reaccione durante una noche para formar 20INRTPEGG1035. Tomar una alícuota de la solución de 20INRTPEGG1035 resultante y determinar el diámetro hidrodinámico mediante cromatografía de exclusión por tamaño usando columna TosohG4000WXL (0,79 x 30 cm) y solución salina tamponada con fosfato (PBS; fosfato 11,9 mM, NaCl 137 mM, KPO4 2,7 mM, pH 7,4) que contiene Acetonitrilo al 15 % como disolvente de elución a un caudal de 0,6 ml/min. El tiempo de retención debería ser coherente con un diámetro de aproximadamente 12-17 nm. Ajustar el pH hasta 5 con HCl 6 N y añadir 1,5 equivalentes de EDC (PM=191,71) y activar durante 20 minutos. Después de 20 minutos añadir esta solución de 20INRTPEGG1035 activada a 10 equivalentes de Nalfa,Nalfa-biscarboximetil-lisina (PM=262 Da) en hasta 25 ml de tampón de HEPES 1 M a pH 7,4 y permitir que reaccione durante una noche. Concentrar la mezcla de reacción hasta 100 ml y lavar con 15 cambios de agua en un cartucho de ultrafiltración de PCPM de 100 kDa (UFP-100-E-5A). Esterilizar por filtrado el producto de 20INRTPEGG1035NTA (usando filtro de polisulfona de 0,2 |jm, Nalgene, Rochester, NI) y liofilizar. Preparar una solución de 10 mg/ml de 20INRTPEGG1035NTA resultante y determinar el diámetro hidrodinámico mediante cromatografía de exclusión por tamaño usando columna TosohG4000WXL (0,79 x 30 cm) y solución salina tamponada con fosfato como disolvente de elución (PBS; fosfato 11,9 mM, NaCl 137 mM, KPO4 2,7 mM, pH 7,4) que contiene Acetonitrilo al 15 % a un caudal de 0,6 ml/min. El tiempo de retención debería ser coherente con un diámetro de aproximadamente 16-22 nm.
Ejem plo 41: D istinción entre interacción aniónica e interacción de enlace m etá lico: Se realizaron estudios de unión con 50 % de carga (donde la cantidad de molécula en peso es del 50 % del peso del vehículo usado) en siete vehículos diferentes en presencia y ausencia de concentración salina alta. La interacción aniónica puede desplazarse mediante concentración alta de NaCl (0,4 M) mientras que la interacción de enlace metálico no puede desplazarse fácilmente con alta concentración de NaCl. Los siguientes vehículos se ensayaron en este estudio: CSPEG104G, HPPEG105G, 20PLPEG1030DTPA, 20PLPEG1030DTPASO, 20PLPEG1030DTPASF y 20PLPEG1030DTPAPO. El 20PLPEG570DANTA-Zn es un vehículo que tiene cadena principal de polilisina de 20 kDa en la que el 70 % de los grupos amino se derivatizaron con MPEG de 5 kDa y los grupos amino restantes se derivatizaron con ácido nitrilotriacético usando bicarboximetil lisina. En este caso se usó ácido succínico como un espaciador entre un grupo amino épsilon de lisina y bicarboximetil lisina. El producto resultante (20PLPEG570DANTA-Zn) se saturó después con ion de cinc y se usó para la demostración de interacción por enlace metálico. En el estudio de unión posterior, no se usó ningún metal en este experimento excepto el control con Lisostafina 6xHis como un control positivo de enlace metálico. Para este estudio se cargaron 0,25 mg de vehículo en 250 j l de solución (HEPES 10 mM/NaCl 400 mM o HEPES 10 mM solamente) con Lisostafina (50 % del peso del vehículo (0,125 mg)) y se incubó durante dos horas a TA. Se realizó análisis por triplicado. Todas las soluciones se centrifugaron a 13000 rpm durante 12 minutos (microcentrífuga Eppendorf) para descartar la posibilidad de que el sedimento de precipitación pueda interferir con el análisis. Los sobrenadante se filtraron usando una membrana de PCPM de 100 kDa (celulosa) a 13000 rpm durante 12 minutos para eliminar el complejo de vehículo-péptido (unido). El filtrado (que contiene Lisostafina libre) se analizó (resultados mostrados en la Tabla 2 posterior) mediante ensayo de TNBS. [Ensayo de TNBS: Se preparó una solución de TNBS añadiendo 30 j l de solución de ácido Picrilsulfónico 1 M (Fluka Cat. N.° 92823) en 12 ml de tetraborato de sodio 0,1 M a pH 9,2. En la placa de 96 pocillos transparente, se añadieron 150 j l de filtrados y patrones para asignar el pocillo. Se añadieron 100 j l de solución de TNBS a los pocillos (volumen final de 250 jl). La placa se incubó durante 30 minutos y la absorbancia a 420 nm se midió mediante BioScan]. La Tabla 2 a continuación muestra que la interacción de lisostafina con la composición de la presente invención es mediante interacción aniónica y no mediante interacción de enlaces metálicos. Para control positivo, se muestra (última columna) que la lisostafina 6-his interacciona con vehículo de control que contiene cinc (un ion metálico multivalente necesario para formar el enlace metálico) mediante interacción de iones metálicos como se demuestra a partir de la incapacidad de NaCl 0,4 M para desplazar lisostafina 6-his del vehículo. La segunda fila en la tabla 2 es el tipo de lisostafina cargada en el vehículo aniónico. La tercera fila en la tabla 2 es el porcentaje de lisostafina total que no se unió con el vehículo cuando hay NaCl 0,4 M en la mezcla de incubación (obsérvese que los iones sodio y potasio no son multivalentes y no forman complejo de multi-coordinación). La cuarta fila en la tabla 2 es el porcentaje de lisostafina total que no se unió con el vehículo cuando no hubo ningún NaCl en la mezcla de incubación. Obsérvese que la unión de liso 6-His es resistente a NaCl 0,4 M (un control positivo de enlace metálico). En presencia de iones metálicos multivalentes (no mostrados en el presente documento), es muy sorprendente que la unión de lisostafina nativa con la composición de núcleo aniónico de la presente invención sigue siendo sensible a NaCl 0,4 M lo que indica que no se produce ningún enlace metálico.
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Ejem plo 42: D eterm inación de kD de la interacción entre L isostafina y com posición de vehículo de núcleo aniónico de la presente invención: Se determinaron las constantes de disociación (Kd) entre Lisostafina y diversos vehículos. Las Kd de lisostafina se midieron con los siguientes vehículos en ausencia de iones metálicos multivalentes: CSPEG104G, HPPEG104G, 20PLPEG1030DTPA, 20PLPEG1030DTPASO, 20PLPEG1030DTPASF y 20PLPEG1030DTPAPO. El lote N.° 20090508 se cargó con 25 %-150 % de Lisostafina (en comparación con el peso de vehículo) para medir la Kd. CSPEG104G se cargó con 150 %-500 % de Lisostafina. Las muestras de los vehículos enumerados anteriormente se cargaron con 50 %-250 % de Lisostafina para medir la Kd. La lisostafina unida y libre se separaron como en el Ejemplo 44 anterior. Todas las muestras se midieron mediante ensayo de TNBS para determinar libre y unida como se ha descrito anteriormente. Con información de libre y unida, se construyeron diagramas de Scatchard (el eje y es unida/libre y el eje x es unida). A partir de los diagramas de Scatchard, se calcularon la Kd y la capacidad del vehículo (la pendiente es -1/Kd y la abscisa en el origen es la capacidad) y se resumen en la Tabla 3. Esto muestra que hay interacción directa entre la lisostafina (proteína con punto isoeléctrico básico de 9,56) y la composición de núcleo aniónico de la presente invención. No estuvieron presentes iones metálicos multivalentes intermediarios en la mezcla y aun así se observó una Kd en el intervalo nanomolar. Además, la interacción fue sensible a alta concentración de NaCl lo que indica interacción iónica y no enlace de coordinación.
Ejem plo 43: E studio de PK de lisosta fina : Se seleccionaron cuatro vehículos para estudio de PK. CSPEG106G, HPp Eg 105G, 20PLPEG1030-DTPA y 20PLPEG1030-DTPA-SO se cargaron con Lisostafina equivalente a 50 % del peso del vehículo. Estas formulaciones se obtuvieron disolviendo juntas una cantidad apropiada de vehículo y Lisostafina en agua e incubando durante dos horas seguido de liofilización. Cada formulación liofilizada (incluyendo lisostafina no formulada sola) se disolvió en solución salina y se administró a ratas Sprague Dawley (n=4) mediante embolada i.v. lenta (al menos 1 min) (12 mg de lisostafina/kg) a través de la vena de la cola lateral. Se tomaron muestras de sangre del seno orbital a 5 m, 15 m, 30 m, 60 m, 120 m, 4 h, 6 h, 24 h, 32 h (30 h) y 48 h y se colocaron en tubos que contenían Inhibidores de proteasa (AEBSF, Aprotinina, E-64, EDTA y Leupeptina). Se obtuvieron sueros por centrifugación a 13.000 rpm. Todos los sueros se almacenaron a -80 °C hasta que se usaron en el ensayo. Se usaron 10 |jl de suero en este ensayo para cada punto temporal. La actividad de lisostafina se midió mediante ensayo de actividad de la siguiente manera: Se preparó tampón de reserva (10X) para que contuviera MOPS 1 M/Tween 10 % (en peso)/EDTA 5 mM/pH 7,3. Las mezclas de reacción finales (200 j l) en placa de 96 pocillos negra se prepararon para contener 5 jg de sustrato, MOPS 100 mM, Tween20 1 %, EDt A 0,5 mM, pH 7,3 y 10 j l de muestras de suero. Las muestras se añadieron al final y después de la adición los pocillos se mezclaron y se retiraron las burbujas en la solución usando una punta de pipeta húmeda con etanol. El aumento de fluorescencia (Ex 485 nm/Em 535 nm) se supervisó durante dos horas usando fluorímetro de microplacas de 96 pocillos Chameleon (Bioscan) cada 7,5 minutos durante 2 horas. El sustrato proporcionó un producto fluorescente cuando fue escindido de forma proteolítica por lisostafina.
Tabla 4: M uestra e l p e rfil de PK de lisosta fina form ulada con diversas com posiciones de núcleo aniónico de
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Ejem plo 44: Unión de diversos péptidos terapéuticos con com posición de núcleo aniónico de la presente invención: Péptidos antiinflamatorios (SEQ ID n O: 2; SEQ ID NO: 7; Se Q ID NO: 31) que actúan de forma intracelular y contienen restos de aminoácidos básicos que les permiten penetrar en la membrana. La misma propiedad que les permite penetrar en la membrana les permite unirse al vehículo de la presente invención. Se realizaron estudios de unión con estos péptidos para cinco vehículos de núcleo aniónico diferentes de la presente invención. Se ensayaron los siguientes vehículos sin metales en este estudio: CSPEG104G, HPpEG105G, 20PLPEG1030DTPA, 20PLPEG1030DTPASO, 20PLPEG1030DTPASF y 20PLPEG1030DTPAPO. Para este estudio se cargaron con péptidos (0,02 mg) 0,1 mg (para 20 % de carga) o 1 mg (para 2 % de carga) de cada vehículo en 250 j l de solución (HEPES 100 mM/NaCl 100 mM) y se incubaron durante dos horas en TA. Se realizó análisis por duplicado. Todas las soluciones se centrifugaron a 13000 rpm durante 12 minutos para descartar la posibilidad de sedimento de precipitación que puede interferir con el análisis. El sobrenadante se filtró usando una membrana de PCPM de 100 kDa (celulosa) a 13000 rpm durante 12 minutos para eliminar el complejo de vehículo-péptido (unido). El filtrado (péptidos libres) se analizó mediante ensayo de HPLC. La tabla 5 a continuación muestra que la heparina con PEG fue el mejor vehículo para la mayoría de los péptidos pero puede usarse cualquier vehículo aniónico para el péptido de SEQ ID NO: 2.
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Ejem plo 45: D eterm inación de K d de la interacción entre SEQ ID NO: 2 y com posición de vehículo de núcleo aniónico de la presente invención: SEQ ID NO: 2 es el Péptido Inhibidor del Dominio de Unión a NEMO (NBD) IKKy que es útil en diversas enfermedades inflamatorias ya que inhibe la activación de NFkB. Se determinaron las constantes de disociación (Kd) entre NBD y diversos vehículos. Se midieron las Kd de NBD con los siguientes vehículos, en ausencia de iones metálicos multivalentes: HPPEG105G, 20PLPEG1030-DTPASO y 20PLPEG1030DTPAPO. HPPEG105G y 20PLPEG1030DTPAPO se cargaron con 100 %-300 % de NBD para medir Kd. 20PLPEG1030-DTPASO se cargó con 50 %-150 % de NBD. Todos los NBD sin unir se midieron mediante HPLC como anteriormente. Con información de libre y unido, se construyeron diagramas de Scatchard (el eje y es unido/libre y el eje x es unido). A partir de los diagramas de Scatchard, se calcularon la Kd y la capacidad del vehículo (la pendiente es -1/Kd y la abscisa en el origen es la capacidad) y los resultados se resumen en la Tabla 6.
T l M r l K i i r hí l r BD
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Ejem plo 46: Unión de fa cto r de crecim iento epidérm ico (EGF) de unión a heparina (HB) con e l vehículo de la presente invención. El HB-EGF es un factor de crecimiento relacionado con el factor de crecimiento epidérmico EGF que señaliza a través del receptor de EGF y estimula la proliferación de células de músculo liso (SMC), fibroblastos, células epiteliales y queratinocitos. El HB-EGF se expresa en numerosos tipos celulares y tejidos, incluyendo células endoteliales vasculares y SMC, macrófagos, músculo esquelético, queratinocitos y determinadas células tumorales. La capacidad del HB-EGf para unirse específicamente con heparina y proteoglucanos de sulfato de heparina es distinta de otras moléculas de tipo EGF y puede estar relacionada con la actividad mitógena potenciada, en relación con EGF, que HB-EGF ejerce sobre células de músculo liso. El gen de HB-EGF humano codifica una proteína transmembrana de 208 aminoácidos, que puede escindirse proteolíticamente para producir HB-EGF soluble. El factor de crecimiento transformante alfa (TGF-a) es un factor de crecimiento polipeptídico relacionado con EGF que señaliza a través del receptor de EGF y estimula la proliferación de una amplia variedad de células epidérmicas y epiteliales. Es producido por monocitos, queratinocitos y diversas células tumorales. TGF-a induce independencia de anclaje de transformación de células cultivadas. TGF-a humano, murino y de rata son reactivos entre especies. El TGF-a humano recombinante es un polipéptido de 50 aminoácidos (5,5 kDa) que comparte aproximadamente 40 % de homología de secuencia con EGF, incluyendo 6 restos de cisteína conservados, que forman 3 enlaces disulfuro intramoleculares. La betacelulina y la anfirregulina son ambos miembros de la familia de EGF. Otra familia de factor de crecimiento cuyos miembros serán moléculas de carga ideales para las composiciones de vehículo de la presente invención es la familia del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) que se sabe en la técnica que tiene más de una docena de miembros. Se pretende que estos factores de crecimiento se carguen en la composición de la presente invención no debido a que tengan un punto isoeléctrico por encima de 7 sino más bien a que tienen sitios de unión aniónicos en su estructura capaces de unirse con carboxilato, sulfato, sulfonato o fosfato. La Tabla 5 a continuación muestra la unión de EGF con los vehículos de la presente invención. Para este estudio se cargaron 2 mg de cada vehículo en 250 pl de solución (HEPES 100 mM/NaCl 100 mM) con EGF (0,01 mg) y se incubaron durante dos horas en TA. Se realizaron análisis por duplicado. Todas las soluciones se centrifugaron a 13000 rpm durante 12 minutos para descartar la posibilidad de que el sedimento de precipitación pueda interferir con el análisis. No se observó precipitación. El sobrenadante se filtró usando membrana de PCPM de 100 kDa (celulosa) a 13000 rpm durante 12 minutos para eliminar el complejo de vehículo-péptido (unido). El filtrado (EGF libre) se analizó mediante ensayo de Elisa (R&D systems; Minneapolis, MN). La tabla 5 a continuación muestra la unión de EGF con los vehículos de la presente invención.
Tabla 5: M uestra e l porcentaje de EGF to ta l que no se unió con e l vehículo (libre) con e l EGF restante unido a l vehículo.
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Ejem plo 47: La m olécula de carga (proteína o péptido) con punto isoe léctrico (p I) p o r encima de 7,3 se beneficia de la p ro tección del vehículo en la sangre. Cuando la molécula de carga se mezcla con el vehículo de la presente invención y se inyecta en animales, el tiempo de circulación en sangre de la molécula de carga con punto isoeléctrico por debajo de 7,3 no está extendido en comparación con el control sin formular (Tabla 7). Sin embargo, cuando una molécula de carga se mezcla con el vehículo de la presente invención y se inyecta en animales el tiempo de circulación en sangre para una molécula de carga con punto isoeléctrico por encima de 7,3 está extendido en comparación con el control sin formular (Tabla 7). En una realización, la molécula de carga debe tener un pI por encima de 7,3 para beneficiarse del vehículo de la presente invención.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende:
una cadena principal polimérica que comprende polilisina, poliomitina, poliarginina, poliglutamato, poliaspartato, policisteína, poliserina, politreonina, politirosina, heparina, sulfato de condroitina, sulfato de dermatano, sulfato de heparano, sulfato de queratano, carragenina, pectina, fucoidano o dextrano;
múltiples cadenas protectoras, en donde cada cadena protectora comprende poli(etilenglicol) y está unida covalentemente con la cadena principal polimérica por un enlace simple;
un miembro de grupo o grupos aniónicos seleccionado del grupo que consiste en sulfato, sulfonato, fosfato y carboxilo, estando dicho grupo aniónico unido covalentemente mediante un enlace químico simple con una unidad monomérica de la cadena principal polimérica; y
una molécula de carga unida directamente mediante interacción iónica con el grupo aniónico sin ion metálico intermediario;
en donde la molécula de carga
i) comprende un péptido penetrante celular;
ii) comprende un dominio de unión aniónico; o
iii) tiene un punto isoeléctrico mayor de 7,3.
2. La composición de la reivindicación 1, en donde el poli(etilenglicol) es alcoxi poli(etilenglicol).
3. La composición de la reivindicación 2, en donde el alcoxi poli(etilenglicol) es metoxi poli(etilenglicol).
4. La composición de la reivindicación 1, en donde la molécula de carga se selecciona de un grupo que consiste en: (i) un péptido; (ii) una proteína; y (iii) una molécula orgánica pequeña.
5. La composición de la reivindicación 1 o 4, en donde la molécula de carga es un péptido o una proteína que comprende una secuencia contigua penetrante celular de 5-10 aminoácidos y en donde el número de aminoácidos básicos (lisina y arginina) menos el número de aminoácidos ácidos (glutamato y aspartato) es 2 o más.
6. La composición de la reivindicación 5, en donde la secuencia contigua penetrante celular en el péptido comprende una secuencia seleccionada de un grupo que consiste en: 1) Lys-Lys-Lys-Lys, 2) Lys-Lys-Lys-Arg, 3) Lys-Lys-Arg-Lys, 4) Lys-Lys-Arg-Arg, 4) Lys-Arg-Arg-Lys, 5) Lys-Arg-Arg-Arg y 6) Arg-Arg-Arg-Arg, en donde cualquier aminoácido puede ser isómero D o L y la orientación de la secuencia presentada puede ser de amino a carboxilo o de carboxilo a amino.
7. La composición de la reivindicación 1, en donde
a) la molécula de carga es un agente antiinfeccioso seleccionado del grupo que consiste en lisostafina, interferón y las SEQ ID NO: 12-45, en donde cuando la molécula de carga es interferón, la cadena principal polimérica comprende heparina o condroitina; o
b) la molécula de carga comprende una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 1-59; o
c) la molécula de carga comprende un péptido antiinflamatorio seleccionado de un grupo que consiste en: (i) los últimos 11 aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, (ii) los últimos 8 aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, (iii) los últimos 12 aminoácidos de la SEQ ID NO: 7, (iv) los últimos 10 aminoácidos de la SEQ ID NO: 9, y (v) los últimos 14 aminoácidos de la SEQ ID NO: 10; o
(d) la molécula de carga que comprende un péptido antiinflamatorio seleccionado de un grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1-11; o
(e) la molécula de carga es un factor de crecimiento o un agente antiapoptótico que comprende una secuencia peptídica seleccionada de las SEQ ID NO: 31-34, 46-49 inclusive, un factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), un factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), un factor de crecimiento transformante (TGF), factor de crecimiento nervioso (NGF) y un factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); o
(f) la molécula de carga es un inhibidor del crecimiento celular, inhibidor del crecimiento de cicatrices o agente proapoptótico que comprende una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 50-59, o la molécula de carga es un interferón, en donde cuando la molécula de carga comprende interferón, la cadena principal polimérica comprende heparina o condroitina.
8. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 4 a 7, en donde la cadena principal polimérica comprende polilisina.
9. La composición de la reivindicación 8, en donde la molécula de carga se selecciona del grupo que consiste en FGF, HGF y las SEQ ID NO: 26-29 y 32-34.
10. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 4 a 7, en donde la cadena principal polimérica comprende condroitina.
11. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 7 y 8, en donde la molécula de carga es EGF de unión a heparina, lisostafina o comprende la SEQ ID NO: 31.
12. Una composición farmacéutica que comprende:
la composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11; y
un excipiente farmacéuticamente aceptable.
13. La composición según la reivindicación 7, parte a) o b) para su uso en un método para tratar la infección en un sujeto; o
la composición según la reivindicación 7, parte c) o d) para su uso en un método para tratar la inflamación en un sujeto; o
la composición según la reivindicación 7, parte e) para su uso en un método para tratar el daño orgánico o celular en un sujeto que necesite crecimiento o prevención de la apoptosis;
en donde dichos métodos comprenden administrar al sujeto una cantidad eficaz de la composición.
14. La composición para su uso según la reivindicación 13 en donde:
(a) la inflamación está asociada con artritis, enfermedad inflamatoria del intestino crónica, esclerosis múltiple, diabetes, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa o artritis reumatoide; o
(b) el daño orgánico o celular está:
(i) provocado por lesión por radiación;
(ii) en el intestino;
(iii) en la médula ósea;
(iv) en el hígado;
(v) en el corazón;
(vi) provocado por infarto de miocardio;
(vii) provocado por enfermedad autoinmunitaria; o
(viii) provocado por diabetes de tipo 1.
15. La composición según la reivindicación 7, parte f) para su uso en el tratamiento del cáncer o exceso de crecimiento de células o cicatrices, en donde la molécula de carga comprende una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 50­ 59, o comprende un interferón alfa o interferón gamma.
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