JP5820378B2 - 治療剤の送達のための陰イオンコア組成物およびその製造ならびに使用方法 - Google Patents

治療剤の送達のための陰イオンコア組成物およびその製造ならびに使用方法 Download PDF

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Description

相互参照
本願は、２００９年９月９日に出願された米国仮特許出願６１／２４０，８５７号、および２００９年９月９日に出願された米国仮特許出願６１／２４１，００４号への優先権を主張する。
政府支援の研究に関する陳述
本発明は、国立老化および感染症研究所（ＮＩＡＩＤ；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ）による契約番号１ Ｒ４３ ＡＩ０７８５３９、および国立糖尿病・消化器・腎疾患研究所（ＮＩＤＤＫ）による契約番号１Ｒ４３ＤＫ０８４７２４の下、政府支援により成された。合衆国政府は、本明細書に提供される発明に一定の権利を有する。
発明の背景
新薬、製剤、ならびに生理的に活性なペプチドおよびタンパク質を投与するための他のシステム、ならびに他の治療剤および物質の開発は、望ましい生理的効果を実現するためのこれらのペプチドもしくはタンパク質または他の物質を提供する必要性によって推進されている。ペプチドおよびタンパク質に関して、これらの多くは、胃腸管内で不安定であることが観察されており、したがって、安定化もしくは保護され、または体循環を介して送達される必要がある場合がある。さらに、低分子量を有するペプチドおよびタンパク質は、腎臓および細網内皮系を介した体循環からのその効率的な除去のために短い生物学的半減期を有する傾向がある。多くのペプチドおよびタンパク質はまた、タンパク質分解（ペプチド結合切断）のためにインビボでその活性を失う場合がある。
これらの望ましくない作用をある程度逃れるために、薬物送達システムを使用することができる。インビボでペプチドおよびタンパク質を送達するための薬物送達ストラテジーが開発されているが、ほとんどは持続性の送達に有用でない。例えば、ポンプを介した薬物の連続的全身性注入の使用は、高いレベルの移動性を必要とする外来患者にとって非現実的である。注入は、生活の質および潜在的な静脈（ｉ．ｖ．）ライン感染という関連した不利点を有する。薬物の拡散を可能にする膜を伴ったカプセルから構成される移植可能なポンプの使用は、カプセルの体積によって制限される。ペプチドおよびタンパク質は、カプセル中の濃縮された製剤および凝集物として使用されることが多く、それによって特定の活性を失う。多くの場合では、薬物は、細胞外空間中に放出され、リンパ管内に分布される。他の移植可能な生分解性送達システムは、移植され、または表皮中に注射される。システムの成分は通常、周囲細胞の生物活性の結果として（すなわち、これらのインプラントを一緒に保持する化学結合を分解させる酵素の放出の結果として）、徐々に分解される。
生理的条件下で表面に正味の正電荷を有し、塩基性（ｐＨ７．５超）等電点（ｐＩ）を有するタンパク質は、本発明の組成物の恩恵を受ける。塩基性タンパク質の使用は、癌および関係した腫瘍性疾患、全身性感染症、炎症、ならびに神経系の疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、およびプリオン病などの処置における用途を含めて、多くの治療可能性を有する。体内でより長い循環、血液中でより高い安定性をもたらし、より便利に投与することができる塩基性の（ｐＨ７．５超のｐＩ）タンパク質およびペプチドの全身送達用生分解性薬物送達キャリアの必要性が存在する。本発明の一実施形態では、本発明のキャリアの恩恵を受ける抗感染症薬は、９．５６のｐＩを有するリゾスタフィンである。特定の細胞内機構の遮断においてインビボで潜在的に有用となり得るほとんどのペプチドおよび薬物は、膜内部移行を可能にするアミノ基などの塩基性部分を必要とする。塩基性残基を結合することによって、これらの細胞内で作用するペプチドおよび薬物は、生体膜を貫通することができる。これらの塩基性残基は時折、細胞浸透性部分または細胞浸透性ペプチドと一括して呼ばれる（Ｕｌｏ ＬａｎｇｅｌによるＣｅｌｌ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ＆ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｉｅｓ、２００２年、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
発明の要旨
本発明の一態様では、モノマーユニットを含むポリマー骨格、ポリマー骨格に共有結合的に連結した保護鎖（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｃｈａｉｎ）、ポリマー骨格のモノマーユニットに共有結合的に結合したカルボキシレート、サルフェート、スルホネート、またはホスフェートの陰イオン基、および媒介するイオン（金属など）を伴うことなく直接陰イオン基に静電気的に連結した積荷分子（ｌｏａｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を含む組成物が提供される。一態様では、陰イオン基の硫黄原子および／またはリン原子は、キレート化性を最小限にするために、１個を超える原子で互いに離れている。積荷分子は、ｉ）細胞浸透性ペプチド、ｉｉ）陰イオン結合ドメイン、またはｉｉｉ）７．３超の等電点を含むことができる。積荷分子と本発明の組成物の静電相互作用が相互作用の主要な機序であり（１０μＭのＫｄ）、任意のかすかな疎水性相互作用は、存在する場合、弱く（Ｋｄ＞１０μＭ）、重要でないことが理解される。本明細書の目的に関して、用語「陰イオン結合ドメイン」は、正に帯電した窒素原子を有し、その結果、分子が１０μＭ未満の解離定数でカルボキシレート部分、サルフェート部分、スルホネート部分、またはホスフェート部分に結合することができる、分子の任意の部分である。関係した態様では、モノマーユニットを含むポリマー骨格、ポリマー骨格に共有結合的に連結した保護鎖、ポリマー骨格のモノマーユニットに共有結合的に結合したカルボキシレート、サルフェート、スルホネート、またはホスフェートの陰イオン基、および陰イオン基に媒介するイオン（金属など）を伴うことなく直接静電気的に連結した積荷分子を含む薬学的組成物が、薬学的に許容可能な賦形剤と共に提供され、陰イオン基の硫黄原子および／またはリン原子は、存在する場合、１個を超える原子で互いに離れており、積荷分子は、ｉ）細胞浸透性ペプチド、ｉｉ）陰イオン結合ドメイン、またはｉｉｉ）７．３超の等電点を含む。キレート化分子を含有するポリマーは、媒介する金属の非存在下で金属結合ペプチド／タンパク質に結合することができることが発見された。理論に束縛されることを望むわけではないが、同様に負電荷性であるがキレートしない部分（サルフェート、スルホネート、およびホスフェートなど）を用いてカルボキシル基を誘導体化することによって、キレート化分子の金属をキレートする能力が除去されることは、ペプチドおよびタンパク質に結合する能力がイオン相互作用を通じたものであることを示す。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
モノマーユニットを含むポリマー骨格と、
該ポリマー骨格に共有結合的に連結した保護鎖と、
該ポリマー骨格のモノマーユニットに化学単結合によって共有結合的に結合した、サルフェート、スルホネート、ホスフェート、およびカルボキシルからなる群から選択される陰イオン基（単数または複数）メンバーと、
媒介する金属イオンを伴うことなく該陰イオン基に静電相互作用によって直接連結した積荷分子であって、
ｉ）細胞浸透性ペプチドを含み、
ｉｉ）陰イオン結合ドメインを含み、または
ｉｉｉ）７．３超の等電点を有する
積荷分子と
を含む組成物。
（項目２）
前記積荷分子と前記陰イオン基の前記静電相互作用が、イオン相互作用から本質的になる、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記保護側鎖がポリ（エチレングリコール）を含む、項目１に記載の組成物。
（項目４）
前記ポリ（エチレングリコール）がアルコキシポリ（エチレングリコール）である、項目３に記載の組成物。
（項目５）
前記アルコキシポリ（エチレングリコール）がメトキシポリ（エチレングリコール）である、項目４に記載の組成物。
（項目６）
前記ポリマー骨格が非生体モノマーを含む、項目１から５に記載の組成物。
（項目７）
前記非生体モノマーが、ポリエチレンイミン、ポリメチルアクリル酸、ポリアクリル酸、およびポリアリルアミンから選択される、項目６に記載の組成物。
（項目８）
前記ポリマー骨格がポリアミノ酸を含む、項目１から５に記載の組成物。
（項目９）
前記ポリアミノ酸が、ポリリシン、ポリオルニチン、ポリアルギニン、ポリグルタメート、ポリアスパルテート、ポリシステイン、ポリセリン、ポリトレオニン、およびポリチロシンからなる群から選択される、項目８に記載の組成物。
（項目１０）
前記ポリアミノ酸がポリリシンである、項目８に記載の組成物。
（項目１１）
前記ポリマー骨格が多糖を含む、項目１から５に記載の組成物。
（項目１２）
前記多糖が、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、カラゲナン、ペクチン、ヒアルロナン、フコイダン、およびデキストランからなる群から選択される、項目１１に記載の組成物。
（項目１３）
前記多糖がヘパリンである、項目１１に記載の組成物。
（項目１４）
前記多糖がコンドロイチン（ｃｈｏｎｄｒｉｏｔｉｎ）である、項目１１に記載の組成物。
（項目１５）
前記積荷分子が、（ｉ）ペプチド、（ｉｉ）タンパク質、および（ｉｉｉ）小有機分子からなる群から選択される、項目１から１４に記載の組成物。
（項目１６）
前記積荷分子が、塩基性アミノ酸（リシンおよびアルギニン）の数から酸性アミノ酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸）の数を引いた数が２以上である５〜１０アミノ酸の細胞浸透性の連続した配列を含むペプチドまたはタンパク質である、項目１から１４に記載の組成物。
（項目１７）
前記積荷分子が、塩基性アミノ酸であるリシンおよびアルギニンの全数から酸性アミノ酸であるグルタミン酸およびアスパラギン酸の数を引いた数が２以上である５〜１０アミノ酸の細胞浸透性の連続した配列を含むペプチドまたはタンパク質である、項目１３から１４に記載の組成物。
（項目１８）
前記ペプチド中の前記細胞浸透性の連続した配列が、１）Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、２）Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ、３）Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ、４）Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ、４）Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ、５）Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ、および５）Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇからなる群から選択される配列を含み、任意のアミノ酸は、Ｄ異性体であっても、Ｌ異性体であってもよく、提示された該配列の配向は、アミノからカルボキシであっても、カルボキシルからアミノであってもよい、項目１６または１７に記載の組成物。
（項目１９）
前記積荷分子が抗感染薬である、項目１から１４に記載の組成物。
（項目２０）
前記積荷分子が、リゾスタフィン、インターフェロン、および配列番号１２〜４５からなる群から選択される作用物質のいずれか１つを含む、項目１３から１４に記載の組成物。
（項目２１）
前記積荷分子がリゾスタフィンである、項目１から１４に記載の組成物。
（項目２２）
前記積荷分子がリゾスタフィンである、項目１３に記載の組成物。
（項目２３）
前記積荷分子がリゾスタフィンである、項目１４に記載の組成物。
（項目２４）
アモキシシリン、アンピシリン、アジドシリン、アズロシリン、アズトレオナム、バシタシン、ベンザチンベンジルペニシリン、ベンザチンフェノキシメチルペニシリン、ベンジルペニシリン（Ｇ）、ビアペネム、カルベニシリン、セファセトリル、セファドロキシル、セファレキシン、セファログリシン、セファロニウム、セファロリジン、セファロチン、セファピリン、セファトリジン、セファゼドン、セファザフルール、セファゾリン、セフラジン、セフロキサジン、セフテゾール、セファクロル、セファマンドール、セフミノクス、セフォニシド、セフォラニド、セフォチアム、セフプロジル、セフブペラゾン、セフロキシム、セフゾナム、セファマイシン（セフォキシチン、セフォテタン、セフメタゾールなど）、カルバセフェム（ロラカルベフなど）、セフカペン、セフダロキシム、セフジニル、セフジトレン、セフェタメト、セフィキシム、セフメノキシム、セフォジジム、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフピミゾール、セフピラミド、セフポドキシム、セフスロジン、セフタジジム、セフテラム、セフチブテン、セフチオレン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、オキサセフェム（フロモキセフ、ラタモキセフなど）、セフェピム、セフォゾプラン、セフピロム、セフキノム、セフトビプロール、クロロアムフェニコール、クロロヘキシジン、クリンダマイシン、クロメトシリン、クロキサシリン、コリスチン、シクロセリン、ダプトマイシン、ドリペネム、ドキシサイクリン、エピシリン、エルタペネム、エリスロマイシン、ファロペネム、ホスホマイシン、ゲンタマイシン、イミペネム、リネゾリド、メシリナム、メロペネム、メチシリン（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ）、メチシリン（ｍｅｔｉｃｉｌｌｉｎ）、メズロシリン、ミノサイクリン、ムピロシン、ナフシリン、ネオマイシン、オキサシリン、パニペネム、ペナメシリン、フェネチシリン、フェノキシメチルペニシリン（Ｖ）、ピペラシリン、ポリミキシン、ポリミキシンＢ、プロカインベンジルペニシリン、プロピシリン、キヌプリスチン／ダルホプリスチン、ラモプラニン、リファンピシン、リファンピン、スルベニシリン、テイコプラニン、チゲサイクリン、チゲモナム、トリメトプリム／スルファメトキサゾール、およびバンコマイシンから選択される抗生物質をさらに含む、項目２０から２３に記載の組成物。
（項目２５）
前記積荷分子が、配列番号１〜５９を含む、項目１から１４に記載の組成物。
（項目２６）
前記積荷分子が、配列番号１〜５９を含む、項目１３に記載の組成物。
（項目２７）
前記積荷分子が、配列番号１〜５９を含む、項目１４に記載の組成物。
（項目２８）
前記積荷分子が、配列番号３４を含む、項目１３に記載の組成物。
（項目２９）
前記積荷分子が、配列番号３４を含む、項目１４に記載の組成物。
（項目３０）
前記積荷分子が、配列番号３１を含む、項目１３に記載の組成物。
（項目３１）
前記積荷分子が、配列番号３１を含む、項目１４に記載の組成物。
（項目３２）
前記積荷分子が抗炎症剤である、項目１から１４に記載の組成物。
（項目３３）
前記積荷分子が、（ｉ）配列番号１の最後の１１アミノ酸、（ｉｉ）配列番号５の最後の８アミノ酸、（ｉｉｉ）配列番号７の最後の１２アミノ酸、（ｉｖ）配列番号９の最後の１０アミノ酸、または（ｖ）配列番号１０の最後の１４アミノ酸からなる群から選択される抗炎症性ペプチドを含む、項目１から１４に記載の組成物。
（項目３４）
前記積荷分子が、（ｉ）配列番号１の最後の１１アミノ酸、（ｉｉ）配列番号５の最後の８アミノ酸、（ｉｉｉ）配列番号７の最後の１２アミノ酸、（ｉｖ）配列番号９の最後の１０アミノ酸、または（ｖ）配列番号１０の最後の１４アミノ酸からなる群から選択される抗炎症性ペプチドを含む、項目１３に記載の組成物。
（項目３５）
前記積荷分子が、（ｉ）配列番号１の最後の１１アミノ酸、（ｉｉ）配列番号５の最後の８アミノ酸、（ｉｉｉ）配列番号７の最後の１２アミノ酸、（ｉｖ）配列番号９の最後の１０アミノ酸、または（ｖ）配列番号１０の最後の１４アミノ酸からなる群から選択される抗炎症性ペプチドを含む、項目１４に記載の組成物。
（項目３６）
前記積荷分子が、配列番号１〜１１からなる群から選択される抗炎症性ペプチドを含む、項目１４に記載の組成物。
（項目３７）
前記積荷分子が成長因子または抗アポトーシス剤である、項目１から１４に記載の組成物。
（項目３８）
前記積荷分子が成長因子または抗アポトーシス剤である、項目１３に記載の組成物。
（項目３９）
前記積荷分子が成長因子または抗アポトーシス剤である、項目１４に記載の組成物。
（項目４０）
前記成長因子または抗アポトーシス剤が、配列番号３１〜３４、配列番号４６〜４９、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、および血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）から選択されるペプチド配列を含む、項目３７に記載の組成物。
（項目４１）
前記成長因子がＦＧＦである、項目３８から３９に記載の組成物。
（項目４２）
前記ＦＧＦがｂＦＧＦである、項目４１に記載の組成物。
（項目４３）
前記成長因子がＥＧＦである、項目３８から３９に記載の組成物。
（項目４４）
前記成長因子がヘパリン結合性ＥＧＦである、項目３９に記載の組成物。
（項目４５）
前記成長因子がＨＧＦである、項目３８から３９に記載の組成物。
（項目４６）
前記成長因子がＶＥＧＦである、項目３８から３９に記載の組成物。
（項目４７）
前記成長因子がＴＧＦ−βである、項目３８から３９に記載の組成物。
（項目４８）
前記成長因子がＴＧＦ−αである、項目３８から３９に記載の組成物。
（項目４９）
前記成長因子がＮＧＦである、項目３８から３９に記載の組成物。
（項目５０）
前記成長因子がＰＤＧＦである、項目３８から３９に記載の組成物。
（項目５１）
前記積荷分子が、細胞増殖阻害剤、瘢痕成長阻害剤、またはアポトーシス促進剤である、項目１から１４に記載の組成物。
（項目５２）
前記積荷分子が、細胞増殖阻害剤、瘢痕成長阻害剤、またはアポトーシス促進剤である、項目１３に記載の組成物。
（項目５３）
前記積荷分子が、細胞増殖阻害剤、瘢痕成長阻害剤、またはアポトーシス促進剤である、項目１４に記載の組成物。
（項目５４）
前記細胞増殖阻害剤、瘢痕成長阻害剤、またはアポトーシス促進剤が、配列番号５０〜５９、およびインターフェロンから選択される配列を含む、項目５２から５３に記載の組成物。
（項目５５）
項目１から５４から選択される組成物と、
薬学的に許容可能な賦形剤と
を含む薬学的組成物。
（項目５６）
薬学的組成物を投与する方法であって、項目５５に記載の薬学的組成物を被験体に注射するステップを含む方法。
（項目５７）
感染の処置を必要とする被験体における感染を処置する方法であって、項目１９から３１から選択される有効量の組成物を前記被験体に投与するステップを含む方法。
（項目５８）
炎症の処置を必要とする被験体における炎症を処置する方法であって、項目３２から３７から選択される有効量の組成物を前記被験体に投与するステップを含む方法。
（項目５９）
前記炎症が関節炎に関連する、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
前記炎症がクローン病に関連する、項目５８に記載の方法。
（項目６１）
前記炎症が関節リウマチに関連する、項目５８に記載の方法。
（項目６２）
前記炎症が慢性炎症性腸疾患に関連する、項目５８に記載の方法。
（項目６３）
前記炎症が潰瘍性大腸炎に関連する、項目５８に記載の方法。
（項目６４）
前記炎症が多発性硬化症に関連する、項目５８に記載の方法。
（項目６５）
前記炎症が糖尿病に関連する、項目５８に記載の方法。
（項目６６）
増殖またはアポトーシス予防の必要のある被験体における臓器損傷または細胞損傷を処置する方法であって、項目３８から５１から選択される有効量の組成物を前記被験体に投与するステップを含む方法。
（項目６７）
前記臓器損傷または細胞損傷が放射線傷害によって引き起こされる、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
前記臓器損傷または細胞損傷が腸におけるものである、項目６６に記載の方法。
（項目６９）
前記臓器損傷または細胞損傷が骨髄におけるものである、項目６６に記載の方法。
（項目７０）
前記臓器損傷または細胞損傷が肝臓におけるものである、項目６６に記載の方法。
（項目７１）
前記臓器損傷または細胞損傷が心臓におけるものである、項目６６に記載の方法。
（項目７２）
前記臓器損傷または細胞損傷が心筋梗塞によって引き起こされる、項目６６に記載の方法。
（項目７３）
前記臓器損傷または細胞損傷が自己免疫疾患によって引き起こされる、項目６６に記載の方法。
（項目７４）
前記自己免疫疾患が１型糖尿病に関連する、項目７３に記載の方法。
（項目７５）
増殖阻害剤またはアポトーシス誘導物質を使用して、細胞異常増殖または癌の処置を必要とする被験体における細胞異常増殖または癌を処置する方法であって、項目４５から４７に記載の有効量の組成物を前記被験体に投与するステップを含む方法。
本発明のこれらの実施形態、他の実施形態、ならびにこれらの特徴および特性は、以下に続く説明、図面および特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
参照による援用
本明細書において述べられる全ての刊行物、特許、および特許出願は、それぞれ個々の刊行物、特許、または特許出願が、参照により組み込まれるように具体的かつ個々に示されているのと同じ程度に、参照により本明細書に援用される。
本発明の特定の特徴を、入念に、添付の特許請求の範囲において記載する。本発明の原理を活用する例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明、および付随する図面を参照することにより、本発明の特徴および利点のより良好な理解が得られるであろう。
図１は、本発明の陰イオンコア組成物のうちの１つの例を描写する図である。描写する本発明は、ポリマー骨格と、キャリアの陰イオン基に直接、静電気的に結合している陽イオン性積荷分子または塩基性のペプチド／タンパク質とを有する組成物である。この例示的な略図は、ａ）共有結合的に連結し、ぶら下がった保護鎖、ｂ）カルボキシレート基、サルフェート基、スルホネート基またはホスフェート基に由来する、共有結合的に連結し、ぶら下がった陰イオン基であって、続いて、（等電点が、７超であるが、好ましくは、７．３超、より好ましくは、７．５超である）陽イオン性積荷分子または塩基性のペプチド／タンパク質と、（媒介するイオンなしで）直接、静電気的に相互作用する陰イオン基を有するポリマー骨格を描写する。この略図は、本発明が企図する組成物を制限するものではない。
定義
便宜上、本発明をさらに説明する前に、さらなる説明を必要とする、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で使用されるある特定の用語をここに集める。これらの定義は、本開示の残りを踏まえて読まれるべきであり、当業者によって理解されるように理解されるべきである。別段の定義のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、冠詞の文法的な対象の１つまたは１つ超（すなわち、少なくとも１つ）を指すのに使用される。例として、「ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ」は、１つの要素または１つを超える要素を意味する。
用語「塩基性タンパク質」は、等電点が塩基性（７超）であり、「塩基性タンパク質」と呼ばれるタンパク質であり、一方、等電点が酸性（７未満）であるタンパク質は「酸性タンパク質」と呼ばれる。タンパク質の溶解度は等電点で最低である。タンパク質は、カルボキシル基およびアミノ基などのイオン化基を有する。これらの基の電荷はｐＨに依存するので、タンパク質分子は、ｐＨによって異なる電荷を有し得る。負電荷の数は、特定のｐＨ値で正電荷の数と同じであり、このｐＨは等電点であり、したがって、同様のタンパク質同士間の静電気的反発はこの点で最小であり、溶解度も最低である。しかし、例えば、等電点未満のｐＨで、アミノ基は、追加のプロトンを獲得して、タンパク質に追加の正電荷を獲得させることになるか、またはカルボキシル基は、プロトン化されて、等電点における電荷と比較してタンパク質に負電荷を失わせることになる。アミノ基またはカルボキシル基のプロトン化が、酸性化した際のタンパク質の性質の変化に関与するかどうかを判定することは、開始等電点ｐＨに依存する。８．０超の等電点を有する塩基性タンパク質の中性ｐＨへの酸性化について、変化する主要な基はアミノ基となる。ｐＨ７未満にさらに酸性化すると、カルボキシル基のプロトン化をもたらし、これらを中性にし、したがってタンパク質の全体的な正味の電荷をさらに正にする。全ての塩基性タンパク質は、中性ｐＨにおいて負電荷より多くの正電荷を有することになり、塩基性タンパク質を中性ｐＨで本発明の陰イオン性キャリアに結合することができるようにする。カルボキシル基は、５〜７の間のｐＨで負電荷を失うことができるので、本発明のキャリアの好適な陰イオン基は、サルフェート基、スルホネート基、およびホスフェート基であり、これらは、負電荷を失う前に２〜５の間のｐＨを必要とする。しかしカルボキシル基も、一緒にクラスター化した複数のカルボキシル基が正電荷の金属イオンを受け取る傾向があり、金属の存在下での全体的な正味の電荷を中性に近くし、または陰イオン性をより低くする場合に有用となる。キャリア中の陰イオン部位の数が多いほど、金属が正電荷の積荷分子に結合する陰イオン部位の能力を妨げる可能性が低い。
本発明の目的に関する用語「キャリア」は、陰イオン部分を有するポリマー骨格および共有結合的に連結した保護鎖を含む本発明の組成物を指す。
本発明の目的に関する用語「骨格」は、ポリマー（直鎖状または分岐）を含む構造を指す。
用語「誘導体」または「類似体」は、本明細書で使用する場合、コア構造が、親化合物のコア構造と同じであるか、または密接に類似するが、異なる基または追加の基などの化学的修飾または物理的修飾を有する化合物を含み、この用語は、他の原子または分子に連結され得る親化合物のコポリマーを含む。この用語はまた、親ペプチドまたは親タンパク質と少なくとも５０％の配列同一性を有するペプチドまたはタンパク質を含む。この用語はまた、親ペプチドと比較して、追加の標識またはタグなどの追加の基が結合したペプチドを含む。この用語はまた、親ポリマーと比較して、アルコキシ基またはメトキシ基などの追加の基が結合したポリマーを含む。
「等電点」（ｐＩ）は、ＩＥＰに時折省略され、特定の分子または表面が、正味の電荷をまったく持たないｐＨである。双性イオンと呼ばれる両性分子は、分子中に存在する官能基に応じて、正電荷および負電荷の両方を含有する。分子上の正味の電荷は、分子の周囲環境のｐＨによって影響され、プロトン（Ｈ＋）の喪失または獲得に起因して、より正にまたはより負に帯電した状態になることができる。ｐＩは、分子が電荷をまったく持たないか、負電荷と正電荷が等しいｐＨ値である。表面は自然に帯電して二重層を形成する。表面電荷決定イオンがＨ＋／ＯＨ−である共通の場合では、正味の表面電荷は、固体が浸されている液体のｐＨによって影響される。やはり、ｐＩは、表面が正味の電荷をまったく持たない溶液のｐＨ値である。ｐＩ値は、所与のｐＨにおける分子の溶解度に影響し得る。そのような分子は、そのｐＩに対応するｐＨで、水または塩溶液中で最低の溶解度を有し、溶液から沈殿することが多い。タンパク質などの生物学的両性分子は、酸性官能基および塩基性官能基の両方を含有する。タンパク質を構成するアミノ酸は、本質的に陽電荷性、負電荷性、中性、または極性となり得、合わさってタンパク質にその全体的な電荷を与える。そのｐＩ未満のｐＨで、タンパク質は正味の正電荷を持ち、そのｐＩより上で、これらは正味の負電荷を持つ。したがってタンパク質は、等電点電気泳動法と呼ばれる技法を使用してポリアクリルアミドゲル上でその等電点（全体的な電荷）によって分離することができ、この技法は、タンパク質を分離するのにｐＨ勾配を使用する。等電点電気泳動法は、２Ｄゲルポリアクリルアミドゲル電気泳動における第１のステップでもある。アミンを１つだけ、およびカルボキシル基を１つだけ有するアミノ酸について、ｐＩは、式：ｐＩ＝｛｛ｐＫ１＋ｐＫ２｝／２｝を使用してこの分子のｐＫａから計算することができる。リシンなどの２つを超えるイオン化基を有するアミノ酸について、同じ式が使用されるが、この場合は、使用される２つのｐＫａは、アミノ酸の中性形態から電荷を喪失または獲得する２つの基のｐＫａである。リシンは、１つのカルボキシのｐＫａおよび２つのアミンのｐＫａ値（その１つはＲ基上にある）を有し、したがって完全にプロトン化されたリシンは、＋２の正味の電荷を有する。中性の電荷を得るために、リシンを２回脱プロトン化し、したがって、Ｒ基およびアミンのｐＫａ値（標準的なアミノ酸のリストで見出される）、すなわちｐＩ＝｛｛９．０６＋１０．５４｝／２｝＝９．８０を使用することができる。ポリペプチドでは、αアミノ基およびカルボキシル基はイオン化されず、したがって、末端を除いて計算されない。この場合、Ｒ基のみ（主にリシン、アルギニン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸）が、ｐＩ計算において最も妥当である。電気泳動ゲルのｐＨは、そのゲルに使用される緩衝液によって決定される。緩衝液のｐＨが実行されているタンパク質のｐＩを超えている場合、タンパク質は、陽極へと移動する（負電荷が陽極に引き寄せられる）。緩衝液のｐＨが実行されているタンパク質のｐＩ未満である場合、タンパク質は陰極へと移動する。タンパク質がｐＩと等しい緩衝液のｐＨを用いて実行される場合、タンパク質はまったく移動しない。これは、個々のアミノ酸についても当てはまる。本発明の目的に関して、７超のｐＩは、塩基性タンパク質と呼ばれるが、本発明の積荷分子についての最も好適なｐＩは、これらの積荷分子が生理的なｐＨで正味の正電荷を有するので、７．３の生理的ｐＨを超えるものである。タンパク質などの大きい積荷分子については、塩基性のｐＩは、正に帯電した表面のパッチ（ｐａｔｃｈ）の存在がキャリアとの強い静電相互作用を可能にするのに十分である場合、キャリア中への積荷のための唯一の必要条件でないことが強調されるべきである。
用語「積荷分子」は、本発明の陰イオンコア組成物またはキャリアによって被験体に送達されることが意図された活性剤、治療剤、または造影剤である。積荷分子は、キャリアの陰イオン基に直接静電気的に結合されるが、キャリアに共有結合的に連結されないことが意図されている。積荷分子は、中性ｐＨで正に帯電したアミノ基を含有するペプチドまたはタンパク質とすることができる。活性剤は、正に帯電した小有機分子も含む。
用語「天然に存在する」または「天然の」は、物体に適用する場合、物体を自然において見出すことができる事実を指す。例えば、自然における源から単離することができ、例えば、実験室において意図的に修飾されていない骨格は、天然に存在する。用語「天然に存在しない」または「非天然の」または「合成の」は、例えば、実験室において意図的に修飾されており、自然において通常見出されない物体に適用される場合である。
用語「ポリマー」は、共有結合性化学結合によって接続された繰返しの構造単位から構成される分子（または巨大分子）である。この用語には、ポリアミノ酸（繰返しのアミノ酸を伴う；本明細書の目的に関して、タンパク質は、そのアミノ酸が鎖に沿って変化するので繰返しのアミノ酸を有さないことに留意されたい）、ポリアリルアミン（ｐｏｌｙａｌｌｙａｍｉｎｅ）、ポリアクリル酸、ポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｅｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）、多糖、および本明細書で述べられる他のポリマー骨格が含まれる。本明細書の明確さの目的のために、用語「ポリマー骨格」または「骨格ポリマー」は、非タンパク質性ポリマーである。タンパク質性は、ホモポリマーでなく、その三次元構造によって生じる酵素活性または生物活性を有する、天然に存在するタンパク質またはその誘導体を意味する。ポリリシンなどのポリアミノ酸ホモポリマーは、非タンパク質性である。
本発明の組成物を用いて処置される「患者」、「被験体」、または「宿主」は、ヒトまたは非ヒト動物を意味することができる。用語「哺乳動物」は当技術分野で公知であり、例示的な哺乳動物には、ヒト、霊長類、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）が含まれる。
用語「ペプチド／タンパク質」は、ペプチドが５０以下のアミノ酸を有し、タンパク質が５０超のアミノ酸を有し、細胞から単離することも、合成的に調製することもできるペプチドまたはタンパク質を意味する。誘導体および断片もまた、単離することも、合成的に調製することもできる。理想的には、本発明のペプチド／タンパク質積荷分子は、ｐＨ７を超える等電点を有することになる。しかし、ペプチド／タンパク質活性剤のある特定の誘導体は、酸性の等電点を有するにもかかわらず、正電荷の基のパッチを有することができ、この型のペプチド／タンパク質がキャリアの陰イオン基と相互作用することを可能にする。この型の積荷分子は、本発明によって対象として含まれることが意図されている。活性剤の誘導体は、アミノ酸配列の切断、または他のアミノ酸もしくは官能基の付加によって生成することができる。
一般的な緒言
本発明の実施形態は、骨格、骨格に共有結合的に連結した陰イオンドメイン、およびキャリアの陰イオンドメインにイオン的に結合し、または静電気的に結合した塩基性タンパク質を含む、キャリアに基づく塩基性タンパク質送達システムを対象とする。任意選択により、骨格は、塩基性タンパク質を遮蔽または保護するための複数のポリエチレングリコール鎖を含有することができる。保護的ポリエチレングリコール鎖は、血液中の循環の延長をもたらし得る（腎臓を通じた排除／ろ過をさせないことによって）巨大分子剤の全体的な流体力学半径を増大させ、高い血管透過性の部位での保持／蓄積を増大させることができる。
本発明のキャリアは、壊れた、または異常な血管バリアを、増大した浸透性で透過するが、キャリアのサイズおよび流れ／圧力の方向のために、キャリアは、循環内に戻って流れることができない。これは、異常な血管バリアの部位でキャリアの蓄積をもたらす。これは、Ｅ．ｃｏｌｉで誘導された、ラットの筋組織の細菌性炎症のモデルにおいて実証された。あるいは、キャリアは、血管外空間への漏出の初期検出、および炎症などの血管透過性の増大を伴った部位への特異的な標的化に使用することができる。したがって、炎症部位でのキャリアの蓄積の増大は、キャリアに会合した塩基性タンパク質を感染部位に蓄積させることになる。
塩基性タンパク質またはその誘導体の骨格への会合は、イオン相互作用を用いて達成される。修飾タンパク質または塩基性アミノ酸残基を付加することによって誘導体化されるタンパク質の使用により、イオン相互作用を維持または増強することができる。本発明のキャリア中の陰イオン基の利点は、キャリアの陰イオン部分へのイオン結合を形成することができる塩基性タンパク質の可逆性結合をもたらすことである。イオン結合は、陰イオン性官能基を含有する骨格からの塩基性タンパク質／ペプチドおよび薬物の可逆性解離をもたらす。
キャリア−陰イオン部分−塩基性タンパク質製剤は、いくつかの恩恵を提供することができる。例えば、そのような製剤は、より良好な生体適合性をもたらし、潜在的な毒性を減少させ、免疫原性を減少させ、血液滞留時間を増大させ、炎症部位での部位特異的蓄積を可能にする。本発明のキャリアはその上、例示的な塩基性タンパク質であるリゾスタフィンのその特異的な可逆性結合を伴った、高い薬物積荷能力を有する（実施例４４）。
提示された結果に基づくと、塩基性タンパク質は、金属の非存在下でキレート化部分に結合する。相互作用も、保護鎖および／またはキャリアの他の成分との相互作用によっておそらく促進され得る。本発明のキャリアの設計は、イオン的に会合した塩基性タンパク質が、例えば、ペプチダーゼおよび抗体から保護鎖（例えば、ポリエチレングリコール鎖）によって保護されるように行われる。さらに、塩基性タンパク質（リゾスタフィンなど）ならびにペプチド（表１に提示されたもの、およびこれらの類似体または誘導体など）の高分子量キャリアとの会合は、腎限外ろ過（ｒｅｎａｌ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を介した排泄、抗原提示細胞による取込み、および細網内皮系による取込みを防止することによってインビボ半減期を延長することができる。
本発明のキャリアの成分および塩基性タンパク質
本発明のキャリアは、カルボキシル基、サルフェート基、スルホネート基、またはホスフェート基に由来する複数の陰イオン基を支持することができるポリマー／コポリマーであってもよい骨格から構成され、これらの基は、活性剤または治療剤分子（または積荷分子）中の正に帯電した窒素に結合することができる（イオン相互作用によって）。本発明のさらなる実施形態では、骨格は、この骨格に共有結合的に連結した保護基をさらに含む。一態様では、キャリアは生体適合性である。個々の成分を以下に説明する。
ａ．骨格
本発明のキャリアの骨格は、直鎖構造もしくは分岐構造のポリマーおよびコポリマー、またはこれらのコンジュゲートとすることができる。骨格の分子量は、１，０００Ｄａ〜２００，０００Ｄａの範囲である。いくつかの実施形態では、骨格の分子量は、１，５００Ｄａ〜１００，０００Ｄａ、または２，０００Ｄａ〜５０，０００Ｄａ、または２，０００Ｄａ〜３０，０００Ｄａ、または２，０００Ｄａ〜２５，０００Ｄａの範囲である場合がある。ポリマー骨格は、天然に存在するポリマーに由来することが好ましい。ポリマー骨格は、水溶性であることも好ましい。
１）ポリマーまたはコポリマーの骨格
ポリマーは、共有結合性化学結合によって接続された繰返しの構造単位から構成される。コポリマーは、一緒に連結した２種以上のポリマーに由来するポリマーである。
ある特定の実施形態では、対象組成物の骨格ポリマーまたは骨格コポリマーは、約５００〜５，０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、４０，０００、または５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、または１００，０００ダルトンの範囲、さらにより具体的には２，０００〜５０，０００ダルトンの間の分子量を有する。数平均分子量（Ｍｎ）も広範に変化し得るが、一般に、約１，０００〜約１２０，０００ダルトン、またはさらには約２，０００〜約７０，０００ダルトン、またはさらには約３，０００〜約５０，０００ダルトンの範囲内に入る。ある特定の実施形態では、Ｍｎは、約５，０００〜４５，０００ダルトンの間で変化する。対象ポリマー骨格の所与の試料内で、広範囲の分子量が存在し得る。例えば、試料内の分子は、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、もしくはそれ以上異なり、または２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、もしくはそれ以上平均分子量から異なる分子量を有する場合がある。骨格ポリマー中のモノマーの数は、１０（１０ｍｅｒ）〜１，０００（１，０００ｍｅｒ）まで変化する場合がある。骨格ポリマーは、あるいは、約２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、または４５０ｍｅｒ、さらにより具体的には１００ｍｅｒ〜２５０ｍｅｒであってもよい。ポリマー骨格中のモノマーの数は一般に、陰イオン部分または保護鎖を持つように修飾することができる官能基の数を決定する。ポリマー骨格の好適なサイズは、塩基性積荷分子を積荷する前のキャリア分子（骨格、陰イオン基、および保護鎖）の全体的な流体力学直径が、１００ｎｍ未満であるように選択される。
いくつかの実施形態では、ポリマー骨格は、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、およびチオール基を含有する繰返しのモノマー基を有する非タンパク質性ホモポリマーまたはヘテロポリマーであり、天然起源であっても合成起源であってもよく、繰返しのモノマー基は、陰イオン基またはより多くの陰イオン基、例えば、カルボキシレート部分、サルフェート部分、スルホネート部分、またはホスフェート部分など、および親水性保護鎖をさらに含有するように共有結合的に修飾することができる。サルフェート、スルホネート、またはホスフェートは、直接に、またはポリマー骨格への１つのペンダント（骨格の分子完全性に重要である骨格の一部でない）として陰イオン電荷の好都合な付着および／またはクラスタリングを可能にする、複数のカルボキシル基、例えば、いくつか挙げると、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＤＴＰＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、またはクエン酸などを有するスペーサーを使用してポリマーに連結することができる。骨格は、１つまたは複数のペンダント陰イオン基を持つように修飾することができる。他の実施形態では、ポリマー骨格は、末端アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、およびチオール基、またはクラスター（２つ以上）の陰イオン基、例えば、カルボキシレート部分、サルフェート部分、スルホネート部分、もしくはホスフェート部分など、および親水性保護鎖をさらに含有するように共有結合的に修飾することができる任意の修飾可能な官能基を伴った繰返しの疎水性基を有する非タンパク質性ホモポリマーまたはヘテロポリマーとすることもできる。用語「非タンパク質性ポリアミノ酸」は、本明細書で使用する場合、組換え操作されない限り生体によって自然に作られない、またはその三次元構造から生じる酵素活性もしくは生物活性を有さないポリアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、ポリマー骨格は、Ｄ−対掌性もしくはＬ−対掌性または両方を有することができ、直鎖ホモポリマーであるポリアミノ酸である。特定の一実施形態では、直鎖ホモポリマーには、ポリリシン、ポリオルニチン、ポリアルギニン、ポリグルタメート、ポリアスパルテート、ポリセリン、ポリチロシン、またはアミノ酸から作られる任意の他のアミド連結ホモポリマーが含まれる。別の好適な実施形態では、直鎖疎水性ホモポリマーは、ポリアラニン、ポリバリン、ポリロイシン、ポリイソロイシン、ポリグリシン、またはポリフェニルアラニンを含む。これらの疎水性ポリアミノ酸は、一方の末端でクラスター（２つ以上）の陰イオン基、例えば、カルボキシレート、サルフェート、スルホネート、もしくはホスフェート、またはこれらの組合せなどを含有し、他方の末端で親水性保護鎖を含有するように修飾することができる。骨格が、ポリアミノ酸を含むポリマーである場合、これは通常、非タンパク質性であり、その三次元構造に関連する活性を有する天然に存在するタンパク質でないことを意味する。ポリマー骨格は、約１，０００〜７０，０００ダルトンの範囲を含む、約６００〜１，０００，０００ダルトンの分子量を有することができる。繰返しのスルフヒドリル（チオール）基、アミノ基、カルボキシル基、およびヒドロキシル基を有するものなどの、繰返しの修飾可能な官能基を有する他のポリマー骨格も使用することができる。生物源由来の炭水化物ポリマーおよびモノマーが非生物学的である他の合成ポリマーも、ポリマー骨格として使用することができる。ポリマー骨格は、陰イオン基および親水性保護鎖を結合することができる複数の部位を提供する。骨格には、カルボキシレート、サルフェート、スルホネート、またはホスフェートがすでに存在し、その結果、ポリエチレングリコールまたは誘導体などの親水性保護鎖の共有結合の後に、さらなる修飾をまったく必要とする場合のないものが含まれる。これらには、硫酸化多糖、例えば、例として、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン硫酸、デキストラン硫酸、フコイダン、およびカラギーナンなどが含まれる。これらの骨格は、親水性保護鎖を含有することによって、塩基性積荷分子がイオン的に結合して本発明の組成物を完成することができる、本発明のキャリア成分を得るように修飾することができる。骨格がサルフェート基、スルホネート基、またはホスフェート基をすでに含有する組成物のさらなる実施形態として、骨格は、追加のサルフェート基、スルホネート基、またはホスフェート基を含有することによって、本発明の組成物の陰イオンの電荷密度を増大させて塩基性積荷分子（７超の等電点を有するもの）に結合するその能力をさらに増強するように、さらに修飾することができる。
ポリマー骨格は、多糖を含むことができる。多糖は、二糖（ｄｉｓａｃｃｈｒｉｄｅｓ）、オリゴ糖、および最大数百万ダルトンのより大きいポリマーを包含する。ポリマー骨格は、多糖、オリゴ糖、および修飾可能なカルボン酸基、アルコール基、またはアミノ基を持っている、これらの化学的に由来する生成物を含み、これらは、ポリキシロトール（ｐｏｌｙｘｙｌｏｔｏｌ）、ガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラギーナン；酸化デキストラン；例えば、連結されたアミノ基を含有するアミノ化デキストランによって例示され得る。多糖を含むポリマー骨格は、直鎖状であっても分岐であってもよく、カルボキシル化、カルボキシメチル化、硫酸化、またはリン酸化されていてもよい。多糖を含むポリマー骨格は、炭酸、二炭酸、硫酸、アミノ硫酸、リン酸の誘導体と反応することができ、カルボキシ基、アミノカルボキシル基、カルボキシメチル基、硫酸基、アミノ基、またはホスフェート基の連結が結果として生じる。多糖を含むポリマー骨格は、デキストラン、マンナン、キシラン、プルラン、セルロース、キトサン（ｃｈｙｔｏｓａｎ）、アガロース、フコイダン、ガラクタン、アラビナン、フルクタン、フカン、キチン、プスツラン、レバン、またはペクチンの化学的変質によって得ることができる。さらに、これらの多糖は、単糖、例えば、それだけには限定されないが、グルコース、ガラクトース、マンノース、ガラクトース、デオキシグルコース、リボース、デオキシリボース、アラビノース、フコース、キシロース、キシルロース、およびリブロースなどのヘテロポリマーまたはホモポリマーによって代表され得る。
ポリマー骨格には、ポリマー（直鎖または分岐）、例えば、ポリエチレンイミン、ポリアミドアミン、ポリアリルアミン、ポリアクリル酸など；カルボキシ基、アミノ基、またはアルコール基が化学的に連結され、かつ／またはより多くの陰イオン基の結合に利用可能な多価アルコール（例えば、ポリビニルアルコール）も含まれる。これらのポリマー骨格は、カルボキシ基、アミノ基、またはアルコール基がより多くの陰イオン基の結合に利用可能な、非生物学的とすることができる。ポリマー骨格は、陰イオン基を含有することができ、カルボキシル基をサルフェート基、スルホネート基、またはホスフェート基に変換することなど、陰イオン基の数を増加させ、または陰イオン基の品質を増強するために、さらなる修飾を行うことができる。
別の実施形態では、ポリマー骨格として作用するポリマーは、塩基性タンパク質が結合することができる陰イオン基のクラスター（２つ以上）を構成する、末端または末端付近に官能基を有するポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）とすることができる。概略的に、この実施形態は、以下、すなわちＰＥＧ−陰イオン基＊塩基性タンパク質によって表すことができ、アステリスクは、本発明の成分間の非常に特異的な関係であるイオン相互作用を表す。あるいは、ＰＥＧをその骨格に沿って官能化し、陰イオンクラスターを、塩基性タンパク質が直接の静電相互作用によって会合することができる骨格にぶら下がっているようにすることを可能にすることができる。この構造はまた、ペンダント保護鎖を同様に可能にすることができる。
ｂ）陰イオン部分または陰イオン基
骨格に化学的に連結することができる陰イオン基の例には、−ホスフェート；−サルフェート；−スルホネート（ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）；および−カルボキシルが含まれる。タンパク質中のアミノ基とカルボキシル基との間の結合は、陰イオン基、例えば、ホスフェート、サルフェート、およびスルホネートなどのように強くない。これは、カルボキシル基が約６のｐＫａを有し、一方、サルフェート、スルホネート、ホスフェートが３未満のｐＫａを有するためである。これは、サルフェート、スルホネート、およびホスフェートの集団を、３超のｐＨで主に負に帯電させる。カルボキシル基集団は、ｐＨ６で主に負に帯電し、ｐＨ６を超えると集団に、穏やかに酸性の条件下で陰イオンを形成することからいくらかの制限を与える。さらに、ポリカルボキシル含有部分のほとんどはキレート化することができ、これは、積荷分子または血液タンパク質の金属を必要とする生理機能を乱す場合がある。好適な陰イオン基は、ホスフェート、サルフェート、およびスルホネートである。しかし、このことは、本発明の様々な実施形態からカルボキシル基を除外しない。本組成物中の陰イオン基は、クラスター中に位置し得る。陰イオンクラスターは、共通の共有結合によって骨格に結合した２つ以上の陰イオン基として、かつ各陰イオン電荷は、他の陰イオン電荷から１２を超える原子より遠くないとして本明細書の目的に関して定義される。陰イオン基は、カルボキシレート、サルフェート、スルホネート、および／またはホスフェートに由来する。陰イオン電荷を構成する硫黄原子またはリン原子は、これらが金属の強いキレーターとなることを防止するために、３つを超える原子によって互いに分離されていることが好ましい。金属がキレート化されると、金属は、陰イオン部位またはクラスター中に正電荷を加えることになり、この部位またはクラスターが、７超の等電点を有する陽イオン性の、または正に帯電した積荷分子に結合することをできなくさせる。一実施形態では、金属は、積荷分子の較正された放出を可能にしない強い配位相互作用を潜在的に作り出す場合があるので除外される。陰イオンクラスター中の硫黄原子および／またはリン原子の間のより大きい分離は、キャリアの陰イオンクラスターのキレート化特性を低減し、または弱めることに役立つ場合がある。このようにして、積荷分子の放出は、生理学的塩を用いて促進することができる。さらに、キレート化はまた、キャリアの陰イオン性を中和することに加えて、第ＶＩＩＩ因子などの金属またはカルシウムを含有する積荷分子を不活化する場合がある。これは、リン原子が１つの原子のみによって分離され、または電荷が３つの原子によって分離されているビスホスホネートの形態でのホスフェートに特に当てはまる。このために、ビスホスホネートは、金属の強いキレーターであり、これは、遷移金属またはカルシウムなどのアルカリ土類金属を含有する生体分子を不活化する場合がある。本発明の組成物中の陰イオン基を形成する硫黄原子およびリン原子は、１つを超える原子によって分離されており、これらを弱いキレーターにしている。これは、ポリカルボキシルアミンスペーサーを使用することによって達成され、次いでこれは、硫黄原子および／またはリン原子を含有するいくつかの強い陰イオン基を保持する。本発明の一実施形態では、陽イオン性積荷分子の陰イオン基への組織的な関係は、直接のイオン相互作用によるものであり、任意の他の二価金属イオンによって媒介されていない。そのような組織的な関係は、結合される積荷分子に金属架橋を使用する他のポリマー組成物と本発明を区別する。さらに、本発明は、正に帯電した、または７．３超の等電点を有する積荷分子は水溶性であり、非常に疎水性になる見込みがないので、積荷分子を結合するのに疎水性相互作用を利用しない。本発明のそのような高度に帯電した積荷分子は、当技術分野で公知であるように疎水性基に反発する。本発明の積荷分子は、疎水性基と著しく相互作用しないもの（疎水性基について５０μＭ超のＫｄを有するもの）に限定される。４つ以上の原子によって分離されたカルボキシル基のクラスターも、それほど強いキレーターでなく、または非キレート的でさえあり、本発明の陰イオンクラスターとして使用することができる。本明細書の目的に関して、化学単結合を通じて骨格にぶら下がった陰イオン基または陰イオン基のクラスターは、骨格質量を除いて分子量が１，５００Ｄａ以下である。これは、好適な質量が２，０００Ｄａと２０，０００Ｄａの間である保護鎖によって守ることを促進するためである。
ｃ）保護鎖
保護鎖（保護側鎖（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｓｉｄｅ ｃｈａｉｎ）または親水性保護鎖と互換的に呼ばれる）の例には、ジカルボン酸でエステル化してポリ（エチレングリコール）モノエステルを形成することができるポリ（エチレングリコール）；メトキシポリ（エチレングリコール）モノエステル（ＭＰＥＧ）、またはコポリマーであって、ポリ（エチレングリコール）と、骨格に共有結合的に連結するのに使用することができるカルボキシル基をこのコポリマーの末端に与えるジカルボン酸を用いたエステルの形態でのポリ（プロピレングリコール）モノエステルとのコポリマーが含まれる（上記を参照）。他の形態には、ポリ（エチレングリコール）−カルボキシル；メトキシポリ（エチレングリコール）−カルボキシル；ポリ（エチレングリコール）−カルボキシメチル；メトキシポリ（エチレングリコール）−カルボキシメチル；ポリ（エチレングリコール）モノアミン；メトキシポリ（エチレングリコール）モノアミン；ポリ（エチレングリコール）ヒドラジド；メトキシポリ（エチレングリコール）ヒドラジド；ポリ（エチレングリコール）とポリアミノ酸、多糖、ポリアミドアミン、ポリエチレンイミンによって代表される１つまたはいくつかのポリマーとのメトキシポリ（エチレングリコール）イミダゾリドブロックコポリマーであって、これらのブロックが交互に並ぶことによって直鎖状ブロックコポリマーを与えるブロックコポリマーが含まれる。一実施形態では、保護鎖の全分子量は、３００ダルトンより大きい場合があるが、１０，０００ダルトンを超えない。一実施形態では、１つまたは複数の保護鎖は、単一の連結によってポリマー骨格に連結される。
本明細書に提供される一例では、本発明の組成物は、２〜１０，０００の範囲の重合度を有する直鎖状ポリマー骨格を含み、これに、３００〜２５，０００ダルトンの質量を有するメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）保護鎖、および陰イオン基（これは、サルフェート、スルホネート、またはホスフェート由来とすることができるが、陰イオン基としてカルボキシル基を除外しない）が独立して共有結合的に連結され、前記保護鎖および陰イオン基は、骨格に独立して連結され、またはぶら下がっている。別の例では、ポリマー骨格の重合度は、２５〜１，０００の範囲内である。さらに別の例では、ポリマー骨格の重合度（ｄｅｇｒｅｅ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）は、５０〜３００の範囲内である。
ｄ）活性剤：塩基性タンパク質およびペプチド
１）タンパク質：塩基性タンパク質およびペプチドは、７超の等電点を有するタンパク質およびペプチドとして当技術分野で認められている。塩基性タンパク質には、抗感染症薬であるリゾスタフィンなどのメタロエキソペプチダーゼが含まれる。本発明のキャリアは、塩基性タンパク質の本質的な大部分または塩基性タンパク質活性剤、ならびにこれらの誘導体、断片、および類似体に、これらが塩基性のままであり、またはこれらの等電点が７超のままである限り結合することができる。塩基性タンパク質、ならびにこれらの誘導体、断片、および類似体は、ＤＮＡコンストラクトから組換え技法によって生成することができる。７未満の等電点を有するこれらのタンパク質は、ＤＮＡ組換え技法を使用することにより、または合成の間に配列中に塩基性アミノ酸を付加することによって、７超の等電点を有するようにすることができる。塩基性アミノ酸は、リシンおよびアルギニンである。ペプチドは、主配列の生物活性を維持しながら、ペプチドの末端に塩基性アミノ酸を付加することによって、合成の間に塩基性にすることができる。あるいは、血液中に放出し、または細胞に入った後、塩基性配列が、内因性の（生物の体内に天然に存在する）プロテアーゼによって切断され、活性ペプチドを放出することができるように、塩基性配列を付加することができる。本発明の塩基性タンパク質活性剤は、組換え生成物であってもなくてもよい。本発明の塩基性タンパク質活性剤は、哺乳動物細胞における組換え生産の生成物とすることができ、これは、グリコシル化を防止するＤＮＡ配列修飾を伴っていてもいなくてもよい。本発明の塩基性タンパク質活性剤は、塩基性タンパク質を天然に産生する生物から精製された天然バージョンであってもよい。本発明の塩基性タンパク質活性剤は、生物から精製することができる。例えば、リゾスタフィンは、例示的な塩基性タンパク質であり、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｉｍｕｌａｎｓまたはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｔａｐｈｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓなどの、これを天然に産生する生物から精製することができる。本発明のキャリアは、塩基性タンパク質、ならびにこれらの類似体、誘導体、および断片に結合することができる。
本発明のキャリアは、塩基性タンパク質、ならびにこれらの類似体、誘導体、および断片に結合することができる。特定の実施形態では、本発明のキャリアは、リゾスタフィンに結合する。リゾスタフィンは、当技術分野で認められており、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓについて溶菌性である。これには、天然に存在するリゾスタフィンと実質的に同じ生物学的効果を有するリゾスタフィンの誘導体および断片が含まれる。リゾスタフィンは、単離することも、合成的に調製することもできる。誘導体および断片もまた、単離することも、合成的に調製することもできる。リゾスタフィンのある特定の誘導体は、異なる等電点を有し、またはさらには７未満の等電点を有する場合のあることが可能であるが、負電荷から遠く離れてタンパク質中の正電荷のクラスターが存在する限り、タンパク質は、本発明のキャリアの陰イオン基（ａｎｉｏｎｉｃ ｇｒｕｐ）に潜在的に結合することができる。キャリアに対するリゾスタフィンの相互作用が直接の陰イオン−陽イオン相互作用であり、媒介する多価金属イオンを通じてではないかどうかを判定することは、０．４ＭのＮａＣｌを添加することによるものである。陰イオン−陽イオン相互作用は、０．４ＭのＮａＣｌによって妨害され得るが、一方、配位結合を通じて多価金属イオンによって媒介される相互作用は、０．４ＭのＮａＣｌによって妨害され得ない（以下の実施例を参照）。一実施形態では、リゾスタフィンの誘導体は、アミノ酸配列の切断、または他のアミノ酸もしくは塩基性アミノ基などの官能基の付加によって生成することができる。一実施形態では、リゾスタフィン（その類似体、誘導体、および断片を含む）は、合計の酸性アミノ酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸）より多い合計の塩基性アミノ酸（リシンおよびアルギニン）を含み、したがって本発明の陰イオンコアキャリアに結合することができる正味の正電荷をタンパク質に与える。場合によっては、７未満の等電点を有するタンパク質またはペプチドは、分子の一方の末端に全ての塩基性アミノ酸、および分子の他方の末端に全ての酸性アミノ酸を有することができ、あるいはタンパク質またはペプチドは、酸性アミノ酸が埋もれ、塩基性アミノ酸が露出されるように折り畳むことができる。この状況下で、タンパク質またはペプチドは、塩基性アミノ酸が分子の空間的に離れた領域内にある限り、本発明の陰イオンキャリアに依然として結合することができる。７未満の等電点を有するタンパク質またはペプチドが、本組成物のキャリアと相互作用するかどうかの判定は、本明細書に記載され、過度の実験を伴うことなく当業者によって容易に実施することができる方法を使用して、ケースバイケースに基づいて判定される必要がある。リゾスタフィンは、ｐＨ９〜１０の間の等電点を自然に有し、リゾスタフィンが本発明のキャリアにしっかりと結合することを可能にしている。したがってリゾスタフィンは、正に帯電したアミノ基を供給し、その結果、塩基性アミノ酸を含有するようにこれを合成的に修飾する必要がまったくない。リゾスタフィンは、キャリア溶液をリゾスタフィン溶液と、セ氏１５〜３７度の間の温度で混合することによって、本発明のキャリアに積荷することができる。積荷されたキャリアは、凍結乾燥し、使用前に再構成することができる。本発明のリゾスタフィンまたは塩基性タンパク質は一般に、本発明のキャリアへの結合を増強するために、より多くの塩基性アミノ酸を含有するようにさらに修飾することができる。
本発明の活性剤の１つであるリゾスタフィンは、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉに対する抗菌薬活性を有する、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ微生物のある特定の株によって産生されるペプチダーゼ酵素である。リゾスタフィンは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｉｍｕｌａｎｓによって産生される２５ｋＤａのペプチダーゼであり、これは、ＥＣ３．４．２４．７５．のＥＣ番号指定を有するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ細胞壁のペプチド間架橋（ｉｎｔｅｒ−ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｒｏｓｓ−ｂｒｉｄｇｅ）に独特なグリシン−グリシン結合を切断する。リゾスタフィンは、例示的な塩基性タンパク質、より具体的にはグリシル−グリシル塩基性タンパク質である。
２）ペプチド：細胞内で作用するペプチドの中で、シグナル伝達経路を修飾することができるペプチドである。ペプチドがシグナル伝達経路を修飾するために、これらは、細胞膜を貫通することが必要となる場合がある。細胞膜を貫通するペプチドの能力は、互いにごく接近した塩基性アミノ酸の数に依存する。互いにごく接近したこれらの塩基性アミノ酸は、ペプチドトランスダクションドメインまたは細胞浸透性ペプチドと呼ばれる（Ｕｌｏ
ＬａｎｇｅｌによるＣｅｌｌ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ＆ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｉｅｓ、２００２年、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。全てのこれらのペプチドおよびこれらの誘導体は、本発明の陰イオンコアキャリアにとって理想的な積荷分子である。一般に、ペプチドトランスダクションドメインまたは細胞浸透性配列を含有する全てのペプチド（５０以下のアミノ酸を有するポリペプチド）を、本発明のキャリアを使用して送達することができる。ペプチドトランスダクションドメインまたは細胞浸透性ペプチド配列は、酸性アミノ酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸）の数より多い、少なくとも２つの塩基性アミノ酸（リシンおよび／またはアルギニン）を伴った５〜１０アミノ酸の配列の存在を特徴とする。これらのいくつかの例は、Ｕｌｏ ＬａｎｇｅｌによるＣｅｌｌ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ
Ｐｅｐｔｉｄｅｓという表題の書籍、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ＆ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｉｅｓ、２００２年、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに全て列挙されており、この書籍は参照により本明細書に援用される。全ての場合において、細胞浸透性ペプチドは、これが、酸性アミノ酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸）の数より多い、少なくとも２つの塩基性アミノ酸（リシンおよび／またはアルギニン）を伴った５〜１０アミノ酸を含有するという同じ一般的な規則に従うことに留意されるべきである。残念ながら、全てのこれらのペプチドは、循環内に入ると非常に迅速に腎臓によって分解および排除され、大量のこのペプチドの投与を必要とする（マウスにおいて１０ｍｇ／Ｋｇ）。これらのペプチドは、本発明のキャリアの恩恵を大いに受けることになる。陽イオン性細胞浸透性配列を有する全てのこれらの細胞内で作用するペプチドは、塩基性配列を有することになるので、これらは全て、本発明の陰イオンコア組成物にとって理想的な積荷分子となる。このキャリアは、このペプチドの血液循環半減期を増大させ、とりわけ、関節リウマチ、慢性炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、アテローム性動脈硬化症、および糖尿病などの疾患に存在する炎症部位にペプチドを蓄積し、またはこの部位にペプチドを向ける。
ａ）抗炎症性ペプチドおよびタンパク質
一実施形態では、炎症の処置において有用である本発明のペプチド／タンパク質は、ＮＦｋＢ作用を遮断し、細胞浸透性配列を含有するペプチドとすることができる。本発明の組成物の恩恵を受けることができる慢性炎症疾患の例は、関節リウマチ、慢性炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、および糖尿病である。細胞浸透性ペプチド配列は、細胞内への浸透を可能にする、一連の塩基性アミノ酸（リシンまたはアルギニンなど）を含有するペプチドである。この配列は、ＮＦｋＢ活性化を抑制することができ、したがって炎症を防止する配列に結合することができる。例：（配列番号６０）塩基性ペプチド−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｌｕｅ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｌｕｅ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−ＯＨまたは（配列番号６１）塩基性ペプチド−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｕｅ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｌｕｅ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−ＯＨ。この型のペプチドの具体例は、（配列番号１）（Ｌｙｓ）８−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｌｕｅ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｌｕｅ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ（またはＫＫＫＫＫＫＫＫ−ＧＧ−ＴＡＬＤＷＳＷＬＱＴＥ：Ｄａｖｅ Ｓら、２００７年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１７９巻、７８５２〜７８５９頁から）の配列を有する。この配列に代わるものは、（配列番号：２）Ｈ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−ＯＨ（またはＤＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ−ＴＡＬＤＷＳＷＬＱＴＥ：Ｓｈｉｂａｔａ， Ｗ．ら ２００７年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１７９巻、２６８１〜２６８５頁；Ｊｉｍｉ， Ｅ．ら ２００４年、Ｎａｔ． Ｍｅｄ．、１０巻、６１７頁；Ｓｉｅｇｍｕｎｄ， Ｄ．ら ２００１年、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６巻、４３７０８頁。Ｍａｙ， Ｍ．Ｊ．ら ２０００年；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９巻、１５５０頁；Ｌｉ， Ｑ．ら １９９９年；およびＳｃｉｅｎｃｅ ２８４巻、１９９９年から）である。あるいは、配列（配列番号３）（Ａｒｇ）８−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｌｕｅ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｌｕｅ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−ＯＨ（またはＲＲＲＲＲＲＲＲ−ＧＧ−ＴＡＬＤＷＳＷＬＱＴＥ）も、本発明の理想的な積荷分子となる。配列番号１および２の阻害配列の類似体も、本発明の組成物の理想的な積荷分子である。これは、（ＴＡＴ−ＮＢＤ；配列番号４）Ｈ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｕｅ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｌｕｅ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−ＯＨ（またはＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ−ＴＴＬＤＷＳＷＬＱＭＥ：Ｄａｉ， Ｓ．ら、２００４年、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．
２７９巻（３６号）：３７２１９頁から）の配列を有する。別の例は、ＪＮＫを活性化するＪＮＫ相互作用タンパク質に結合することによって、自己免疫性炎症疾患を阻止するために細胞内レベルで作用することができるペプチドである。例は、（配列番号６２）Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｕｅ−Ａｓｎ−Ｌｕｅ−Ｐｈｅ−ＯＨに連結した塩基性ペプチド（塩基性ペプチド−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｕｅ−Ａｓｎ−Ｌｕｅ−Ｐｈｅ−ＯＨ）である。これのより具体的な例は、配列（配列番号５）Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｕｅ−Ａｓｎ−Ｌｕｅ−Ｐｈｅ（またはＭｅｌｉｎｏ， Ｍ．ら、２００８年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１８１巻、７３００〜７３０６頁からのＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＲＰＫ−ＲＰＴＴＬＮＬＦ）を有する。配列番号５の一部であるＡｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｕｅ−Ａｓｎ−Ｌｕｅ−Ｐｈｅは、ＪＮＫ結合領域由来であり、配列Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−は、細胞浸透性ペプチドまたはペプチドトランスダクションドメインである。配列番号４と同じ目的を果たす別の配列は、配列番号６（Ａｒｇ）８−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｕｅ−Ａｓｎ−Ｌｕｅ−Ｐｈｅ−ＯＨである。塩基性ペプチドに連結される場合に炎症を抑制することができる別のペプチドは、Ｐ６５−Ｐ１である。それは、（配列番号６３）Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−ＯＨに連結した塩基性ペプチドである。アンテナペディア（ＰＴＤまたはペプチド転位ドメイン（ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ））に由来する塩基性ペプチドに連結される場合、これは、リポ多糖、インターロイキン−１、オカダ酸、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート、およびＨ２Ｏ２によって誘導されるＮＦ−ｋＢ活性化を抑制することができる。このペプチドは、ＴＮＦ、ドキソルビシン、およびシスプラチンによって誘導されるアポトーシスに対して細胞を感作させることに役割を果たすことができる。ｐ６５−Ｐ１は、１つのリン酸化部位を含有し、これは、ＮＦ−ｋＢ活性を阻害するのに必要とされる。より具体的には、この配列は、（配列番号７）Ｈ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−ＯＨ（またはＴａｋａｄａ， Ｙ．ら、２００４年、Ｊ．
Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７９巻、１５０９６頁からのＤＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ−ＱＬＲＲＰＳＤＲＥＬＳＥ）である。あるいは配列は、（配列番号８）（Ａｒｇ）８−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−ＯＨであってもよい。ＮＦ−ｋＢ活性化を妨げる他の配列には、（配列番号６４）−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−ＯＨ（もしくはＬｉｎ， Ｙ．−Ｚ．ら １９９５年 Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０巻、１４２５５頁からのＱＲＫＲＱＫＬＭＰ）または（配列番号６５）−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｕｅ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−アミド（もしくはＳｗａｒｏｏｐ， Ｎ．ら ２００１年、Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． １８巻、１６３１頁；Ｔｒａｅｎｃｋｎｅｒ， Ｅ．Ｂ．ら １９９５年、ＥＭＢＯ． Ｊ． １４巻、２８７６頁からのＤＤＲＨＤＳＧＬＤＳＭＫＤＥ−ＮＨ２）から選択される配列に連結した塩基性ペプチドが含まれる。より具体的な例は、（配列番号９）（Ａｒｇ）８−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−ＯＨおよび（配列番号１０）（Ａｒｇ）８−ＤＤＲＨＤＳＧＬＤＳＭＫＤＥ−ＮＨ２である。コルチスタチン−２９（ヒト）：（配列番号１１）Ｐｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−ＯＨ（ジスルフィド結合）。Ｐｙｒはピログルタミン酸である。これは、敗血症ショックおよびクローン病の処置における潜在的な多段階式治療用途を有する抗炎症性、免疫調節性因子を代表する。（Ｅ．Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｒｅｙら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．、２０３巻、５６３頁（２００６年）；Ｅ．Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｒｅｙら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、１０３巻、４２２８頁（２００６年））、これらのペプチドまたはこれらの誘導体は、本発明のキャリア用の積荷分子の例である。
インターフェロンＩ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型。インターフェロン、特にＩ型インターフェロンは、抗炎症（ａｎｔｉｉｎｆｌａｍａｔｏｒｙ）活性を有する。例えば、インターフェロンβ（ｐＩ＝８．９〜９．７）は、多発性硬化症の処置に使用されるＩ型インターフェロンであり、抗炎症活性を有する。これらのインターフェロンのいくつかの塩基性等電点および／またはこれらの表面上の正電荷パッチの存在は、本発明のキャリアにとって理想的である。そのような性質は、これらが本発明のキャリアに結合することを可能にする。ＨＢ−ＥＧＦによって例示されるような結合は、血液成分によって壊されることが当業者によって予期されるが、本発明者らの意外な発見は、キャリアへの結合のそのような様式は、血液成分の存在に耐えることができるということであり、予期されない結果である。
ｂ）抗感染症ペプチド（感染症の処置用）
マガイニンは、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓの皮膚から最初に抽出された抗菌活性および駆虫活性を有するペプチド抗生物質である。マガイニン１および２は、それぞれ２３アミノ酸の密接に関係したペプチドであり、２つの置換によって異なる。これらの抗微生物ペプチドは、ウイルス、グラム陽性菌およびグラム陰性菌、原生動物、酵母、ならびに真菌を含めた広範囲の微生物に対して広域スペクトルの非特異的活性を有し、溶血性かつ癌細胞に対して細胞毒性にもなり得る。マガイニン１は殺菌性である。マガイニン１および２は共に、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）およびＨＳＶ−２に対して阻害性作用を示す。（Ｗｉｌｌｉａｍｓ， ＲＷ．ら Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊ． ５３巻、６３１Ａ（１９８８年）；Ｍｏｒｖａｎ， Ａ．ら Ｍｏｌ． Ｍａｒ． Ｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３巻、３２７頁（１９９４年）；Ｍａｔａｎｉｃ， Ａ．ら Ｉｎｔ． Ｊ． Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ ２３巻、３８２頁（２００４年）；Ｚａｓｌｏｆｆ， Ｍ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８４巻、５４４９頁（１９８７年））。マガイニン１の配列（配列番号１２）Ｈ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−ＯＨ。このペプチドまたはその誘導体は、本発明のキャリア用の積荷分子の一例である。
マガイニン２は、酸性のリン脂質に結合される場合、両親媒性へリックスを引き継ぎ、動的な、ペプチド−脂質超分子複合体から構成される孔を形成する。（配列番号１３）Ｈ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−ＯＨ（Ｚａｓｌｏｆｆ， Ｍ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ８４巻、５４４９頁（１９８７年）；Ｃｒｕｃｉａｎｉ， ＲＡ．ら ＥＪＰＭＯＬ ８巻、１８７頁（１９９２年）；Ｃｏｒｚｏ， Ｇ．ら
Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３５９巻、３５頁（２００１年）；Ｍａｔｓｕｚａｋｉ， Ｋ．ら Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３６巻、２１０４頁（１９９７年）。このペプチドまたはその誘導体は、本発明のキャリア用の積荷分子の一例である。
セクロピンＡ（配列番号１４；Ｈ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−ＮＨ２）は、天然に存在する、直鎖状、陽イオン性、３７残基の抗微生物ペプチドである。セクロピンＡは、膜貫通性電気化学的イオン勾配を散逸することによって細菌を死滅させる。（Ｓｉｌｖｅｓｔｒｏ， Ｌ．ら． Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊ． ７２巻、Ａ１９５頁（１９９７年）；Ａｎｄｒｅｕ， Ｄ．ら Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０巻、６４７５頁（１９８３年）；Ｓｉｌｖｅｓｔｒｏ， Ｌ．ら Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３６巻、１１４５２頁（１９９７年））。このペプチドまたはその誘導体は、本発明のキャリア用の積荷分子の一例である。
セクロピンＢ（配列番号１５；Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｕｅ−ＮＨ２）は、オオカイコガのＨｙａｌｏｐｈｏｒａ ｃｅｃｒｏｐｉａ由来の小抗菌性ペプチドである。抗微生物ペプチドは、病原体クリアランスのエフェクターとして先天的宿主防御に必須であり、創傷修復を促進するために宿主細胞に影響することができる。（Ｋｕｌａｇｉｎａ， ＮＶ．ら Ｓｅｎｓ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ Ｂ Ｃｈｅｍ． １２１巻、１５０頁（２００７年）；Ｖａａｒａ， Ｍ．ら Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏ． ３８巻、２４９８頁（１９９４年）；Ｆｌｏｒａｃｋ， Ｄ．ら Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ． ４巻、１３２頁（１９９５年）；Ｌｅｅ， Ｐ．ら Ｗｏｕｎｄ Ｒｅｐａｉｒ Ｒｅｇｅｎ． １２巻、３５１頁（２００４年））。このペプチドまたはその誘導体は、本発明のキャリア用の積荷分子の一例である。
ヒト血小板因子４誘導ペプチドまたはヒト血小板因子４由来のＣ１８Ｇ（配列番号１６；Ｈ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＯＨ）は、サルモネラに対して活性である。Ｃ１８Ｇは、ヒト血小板因子ＩＶに由来する合成α−らせん状ペプチドである。このペプチドは、抗菌性であることが見出されており、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａに対して活性である。（Ｃｏｃｏｎｎｉｅｒ−Ｐｏｌｔｅｒ， Ｍ−Ｈ．ら
Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ７１巻、６１１５頁（２００５年）；Ｄａｒｖｅａｕ， Ｒ．ら Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９０巻、４４７頁（１９９２年））。このペプチドまたはその誘導体は、本発明のキャリア用の積荷分子の一例である。
ヒスタチン−８［赤血球凝集阻害ペプチド（ＨＩＰ）］（配列番号１７；Ｈ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−ＯＨ）は、唾液ポリペプチドファミリーに属し、小さい陽イオン性の、ヒスチジンに富むタンパク質であるヒト唾液ヒスタチン（Ｈｓｔ）の１つである。これは、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓおよびＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓに対して強力な殺菌活性および抗真菌活性を有し、したがってＣａｎｄｉｄａ種に対して潜在的な治療試薬である。これらは、細胞膜に結合し、内部移行し、体積調節機構およびミトコンドリア機構を妨害し、活性酸素種の産生および非溶解性喪失（ｎｏｎ−ｌｙｔｉｃ ｌｏｓｓ）に導くことによって真菌細胞を死滅させる。（Ｙｏｓｈｉｄａ， Ｍ．ら Ｂｉｏｌ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ． ２４巻、１２６７頁（２００１年）；Ａｈｍａｄ， Ｍ．ら Ｊ． Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ． Ｃｙｔｏｃｈｅｍ． ５２巻、３６１頁（２００４年））。このペプチドまたはその誘導体は、本発明のキャリア用の積荷分子の一例である。
ヒスタチン−５（配列番号１８；Ｈ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−ＯＨ）は、強い殺真菌特性を有するヒト塩基性唾液抗微生物ペプチドである（Ｈｅｌｍｅｒｈｏｒｓｔ， Ｅ．ら Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４巻、７２８６頁（１９９９年））。このペプチドまたはその誘導体は、本発明のキャリア用の積荷分子の一例である。
ヒスタチン−３またはＨ３（配列番号１９；Ｈ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−ＯＨ）は、ヒト唾液中に見出され、強力な抗微生物特性を保有する。このヒスチジンに富むペプチドは、プロタンパク質コンバターゼのフューリンおよびＰＣ７の阻害剤であるが、ＰＣ１の基質として作用する（Ｂａｓａｋ， Ａ． Ｊ． Ｐｅｐｔ． Ｒｅｓ． ４９巻、５９６頁（１９９７年）；Ｋｏｓｈｌｕｋｏｖａ， Ｓら． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ． ６８巻、６８４８頁（２０００年）。このペプチドまたはその誘導体は、本発明のキャリア用の積荷分子の一例である。
ＨＮＰ−１またはデフェンシンヒト好中球ペプチド−１（配列番号２１；Ｈ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−ＯＨ（ジスルフィド架橋：２−３０、４−１９、９−２９）。哺乳動物デフェンシンは、好中球の細胞質アズール性顆粒、小腸のパネート細胞、およびいくつかのマクロファージにおいて豊富である。ＨＮＰ−１は、広い抗微生物性（グラム陽性菌およびラム陰性菌の両方）ならびに細胞毒性活性の両方を保有するペプチドである。ＨＮＰ−１は、アデノウイルス感染を９５％超低減する。（Ｆｒｉｃｋ， Ｉ．ら Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７８巻、１６５６１頁（２００３年）；Ｖａｌｏｒｅ， Ｅ．ら（ａｔ ａｌ．）Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９７巻、１６２４頁（１９９６年）；Ｍｉｚｕｋａｗａ， Ｎ．ら Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２０巻、１１２５頁（２０００年）；Ｂａｓｔｉａｎ， Ａ．およびＨ． Ｓｃｈａｆｅｒ、Ｒｅｇｕｌ Ｐｅｐｔ． １０１巻、１５７頁（２００１年））。このペプチドまたはその誘導体は、本発明のキャリア用の積荷分子の一例である。
アピダエシンＩＡ（配列番号２２；Ｈ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−ＯＨ）は、免疫性ミツバチリンパ（ｉｍｍｕｎｅ ｈｏｎｅｙ ｂｅｅ ｌｙｍｐｈ）中に見出される独特の抗菌性ペプチド誘導体である。アピダエシンは、微生物の侵入に対するミツバチの体液性防御の最も顕著な成分であり、一連の小さい、プロリンに富む１８残基〜２０残基のペプチドである。これらは、従来の「溶解性」機構から独立した即時に近い致死性活性でグラム陰性菌の生存能を阻害し、標的分子の立体選択的認識に関与する。（Ｃａｓｔｅｅｌｓ−Ｊｏｓｓｏｎ， Ｋ．ら ＥＭＢＯ Ｊ． １２巻、１５６９頁（１９９３年）；Ｃａｓｔｅｅｌｓ， Ｐ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９巻、２６１０７頁（１９９４年）；Ｌｉ， Ｗ．ら Ｐｅｐｔ． ２７巻、２３５０頁（２００６年））。このペプチドまたはその誘導体は、本発明のキャリア用の積荷分子の一例である。
ピルホコリシン（ｐｙｒｒｈｏｃｏｒｉｃｉｎ）：（配列番号２３；Ｈ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−ＯＨ）。このプロリンに富む陽イオン性抗菌性ペプチドのピルホコリシンは、７０ｋＤａの熱ショックタンパク質ＤｎａＫに結合し、タンパク質の折り畳みを阻害することによって応答性の細菌を死滅させる。（Ｃｕｄｉｃ， Ｍ．ら Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ２３巻、２０７１頁（２００２年）、Ｂｕｌｅｔ， Ｐ．ら Ｄｅｖ． Ｃｏｍｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ ２３巻、３２９頁（１９９９年））。このペプチドまたはその誘導体は、本発明のキャリア用の積荷分子の一例である。
キラーペプチド１（ＫＰ１）：（配列番号２４（ＫＬＡＫＬＡＫ）２−ＮＨ２）は、高度に陰イオン性の細胞膜が妨害される（細菌の膜が哺乳動物細胞膜より高度にイオン性である）らせん状の（ｈｅｌｅｃａｌ）抗微生物ペプチドであり、優先的に細菌性細胞を死滅させる。より長い配列（配列番号２５（ＫＬＡＫＬＡＫ）３−ＮＨ２）は、細菌性細胞に対してより選択的である（Ｊａｖａｄｐｏｕｒ， Ｍ．Ｍ．ら Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １９９６年、３９巻：３１０７〜３１１３頁）。これらのペプチドまたはこれらの誘導体は、本発明のキャリア用の理想的な積荷分子となる。
ヒトカテリシジン（ｃａｔｈｅｌｅｃｉｄｉｎ）断片１０４〜１４０（ＬＬ−３７）：（配列番号２６：ＬＬＧＤＦＦＲＫＳＫ ＥＫＩＧＫＥＦＫＲＩ ＶＱＲＩＫＤＦＬＲＮ
ＬＶＰＲＴＥＳ）。１８ｋＤａのヒト陽イオン性の抗微生物性タンパク質（ｈＣＡＰ−１８）は、カテリシジンのクラスに属する。これは、活性化された好中球顆粒球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ）から放出される。放出後、３７アミノ酸のα−らせん状Ｃ末端が切断され、機能的な抗微生物ペプチドＬＬ−３７を形成する。抗微生物性は別として、ＬＬ−３７はまた、ＬＰＳに結合する。この結合は、ラット大動脈からのＬＰＳ誘導性一酸化窒素放出を低減し、ＬＰＳ致死性からマウスを保護することが以前に示された。ＬＬ−３７は、ホルミルペプチド受容体ＦＰＲＬ１を介して媒介される免疫調節性活性および走化性活性を有することも見出されている。ヒトカテリシジン誘導ペプチドＬＬ−３７は、細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）に結合し、これを中和するので、したがってこれは、敗血症ショックの処置において有益な作用を有する可能性がある。１０６（ａａ １０６〜１４０、配列番号２７：ＧＤＦＦＲＫＳＫＥＫ−ＩＧＫＥＦＫＲＩＶＱ−ＲＩＫＤＦＬＲＮＬＶ−ＰＲＴＥＳ）、１１０（ａａ １１０〜１４０、配列番号２８：ＲＫＳＫＥＫＩＧＫＥ ＦＫＲＩＶＱＲＩＫＤ ＦＬＲＮＬＶＰＲＴＥＳ）、ＢＭＡＰ−２７（配列番号３０：ＧＲＦＫＲＦＲＫＫＦＫＫＬＦＫＫＬＳＰＶＩＰＬＬＨＬ−ａｍ）と命名されたＬＬ−３７のＮ末端切断を含む他の変異体、およびより疎水性の変異体である１８−ｍｅｒのＬＬＫＫＫ（配列番号２９：ＫＬＦＫＲＩＶＫＲＩ−ＬＫＦＬＲＫＬＶ）。ＬＬ−３７、断片１０６および１１０、ならびに１８−ｍｅｒのＬＬＫＫＫは、放射状拡散アッセイにおいて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、およびＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの増殖を阻害し、リポ多糖に誘導される血管の一酸化窒素生成を阻害し、好中球顆粒球を同様に結合させた。断片１０６および１１０は、ＬＬ−３７ほど溶血および培養細胞中のＤＮＡ断片化を引き起こさなかったが、１８−ｍｅｒのＬＬＫＫＫは、重度の溶血を誘導した。断片１０６および１１０の抗菌性作用は、血清によって影響されなかった一方で、ＬＬ−３７の作用は低減された。ＬＬ−３７からＮ末端疎水性アミノ酸を除去すると、その抗微生物性作用またはＬＰＳ中和作用に悪影響することなく、その細胞毒性ならびに血清によるその阻害が減少する。したがって、そのようなＬＬ−３７誘導ペプチドは、敗血症を有する被験体の処置に有益となり得る。（Ｃｉｏｒｎｅｉら Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、２００５年、４９巻（７号）：２８４５〜２８５０頁；Ｂａｌｓら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．、１９９９年、１０３巻：１１１３〜１１１７頁；Ｄｅｓｌｏｕｃｈｅｓら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、２００５年、４９巻（８号）３２０８〜３２１６頁）。これらのペプチドまたはこれらの誘導体は、本発明のキャリア用の理想的な積荷分子の例である。
プロテグリン−１もしくはＰＧ−１：（配列番号３６：ＲＧＧＲＬＣＹＣＲＲＲＦＣＶＣＶＧＲ）および誘導体ＩＢ−３６７、またはイセガナン：配列番号：３７：ＲＧＧＬＣＹＣＲＧＲＦＣＶＣＶＧＲ（Ｃｈｅｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ、８５３巻（１９９９年）１９７〜２０６頁；Ｊａｎｇら、ＢＭＣ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００７年、７巻：２１頁；ｖａｎ Ｓａｅｎｅら、Ｃｈｅｓｔ、２００７年、１３２巻：１４１２頁；Ｋｏｌｌｅｆら、Ａｍｅｒｉｃａ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ａｎｄ Ｃｒｉｔｉｃａｌ ｃａｒｅ、２００６年、１７３巻；Ｓｈｉら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１９９８年、６６巻（８号）：３６１１〜３６１７頁）。抗微生物ペプチドのプロテグリンファミリーは、ブタ白血球中で同定された。５つの天然のプロテグリン配列（ＰＧ−１〜ＰＧ−５）が現在では同定されている。これらの天然のプロテグリンは、１６〜１８アミノ酸を含有し、高度に相同であり、陽イオン性、両親媒性ｂシートであるという共通の特徴を共有する。この分子は、６位と１５位ならびに８位と１３位のシステイン残基の間にジスルフィド架橋を有する。抗微生物ペプチドであるイセガナンは、好気性および嫌気性のグラム陽性菌およびグラム陰性菌ならびに真菌ならびに酵母に対して活性である。これらのペプチドまたはこれらの誘導体は、本発明のキャリア用の理想的な積荷分子となる。
Ｋ４：（配列番号３８：ＫＫＫＫＰＬＦＧＬＦＦＧＬＦ）は、抗微生物ペプチドデータベースを使用して設計された抗微生物ペプチドである。このペプチドは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓなどのヒト病原性細菌、およびＶｉｂｒｉｏ属のいくつかの海洋細菌を含めた、グラム陽性菌およびグラム陰性菌に対して強い活性（細菌性細胞を溶解する）を有する。このペプチドは、溶菌濃度で哺乳動物細胞に対して無毒性である（Ｄｕｖａｌら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、２００９年、３０巻：１６０８〜１６１２頁）。このペプチドまたはその誘導体は、本発明のキャリア用の積荷分子の一例である。
インドリシジン：インドリシジンは、ウシ好中球の細胞質顆粒中に存在する１３アミノ酸の抗微生物ペプチドである。インドリシジンは、哺乳動物骨髄細胞から単離される抗微生物ペプチドのカテリシジンファミリーのメンバーである。天然に存在するペプチドとして、インドリシジンは、３９％のトリプトファンおよび２３％のプロリンからなる独特の組成を有し（配列番号３９：ＩＬＰＷＫＷＰＷＷＰＷＲＲ−ａｍ；および変異体、配列番号：４０：ＩＬＰＷＫＷＰＷＷＰＷＲＲ−ｍｅｔｈ；配列番号４１：ＩＬＫＫＷＰＷＷＰＷＲＲＫ；配列番号４２：ＩＬＫＫＷＰＷＷＰＷＲＲＫ−ｍｅｔｈ）、自然において、このペプチドは、Ｃ末端でアミド化されている。インドリシジンは、グラム陰性菌およびグラム陽性菌、真菌、ならびに原生動物に対して活性を有する。これらのペプチドまたはこれらの誘導体は、本発明のキャリア用の理想的な積荷分子となる。
ヒトラクトフェリン断片（ｈＬＦ（１−１１）：（配列番号４３：ＧＲＲＲＲＳＶＱＷＣＡ）。ヒトラクトフェリン（ｈＬＦ）は、粘膜表面および好中球の非特異的防御の主要な成分であり、様々な病原体に対して活性である。ｈＬＦ（１−１１）と指定された最初の１１のＮ末端アミノ酸に対応する合成ペプチドでの試験は、殺菌活性を有する。（Ｎｅｂｂｅｒｉｎｇら Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２００１年、６９巻（３号）：１４６９〜１４７６頁）。このペプチドまたはその誘導体は、本発明のキャリア用の積荷分子の一例である。
ポリフェムシン１およびタキプレシンＩ：（配列番号４４：ＲＲＷＣＦＲＶＣＹＲＧＦＣＹＲＫＣＲ−ＮＨ２、配列番号４４：ＫＷＣＦＲＶＣＹＲＧＩＣＹＲＲＣＲ−ＮＨ２）。タキプレシンは、日本カブトガニＴａｃｈｙｐｌｅｕｓ ｔｒｉｄｅｎｔａｔｕｓ由来であり、ポリフェムシンは、アメリカカブトガニＬｉｍｕｌｕｓ ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ由来である。これらのペプチドは、長さが１７〜１８アミノ酸残基であり、２つのジスルフィド結合を含有し、アミド化されたＣ末端アルギニンを有する。両ファミリーのペプチドは、抗菌活性を保有し、インフルエンザＡおよびＨＩＶなどのエンベロープウイルスの複製を防止する能力に加えて、グラム陽性種およびグラム陰性種の両方、ならびに真菌の増殖を阻害する。これらのペプチドまたはこれらの誘導体は、本発明のキャリア用の理想的な積荷分子となる。
インターフェロンγ（ｐＩ＝８．５〜９．５）は、抗ウイルス活性を有するＩＩ型インターフェロンであり、肝炎感染症および他のウイルス感染症の処置に使用することができる。インターフェロンβ（ｐＩ＝８．９〜９．７）は、抗ウイルス活性を有するＩ型インターフェロンであり、肝炎感染症の処置に使用することができる。これらのインターフェロンは、塩基性等電点を有し、本発明のキャリア用の理想的な積荷分子の中にある。
ｃ）増殖刺激物質（組織傷害の処置用）
ＰＲ３９、抗アポトーシス因子（配列番号３１；Ｈ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−ＯＨ）は、ブタの腸から最初に単離された。このプロリンおよびアルギニンに富む３９アミノ酸ペプチドはまた、好中球アズール性顆粒およびマクロファージ中に見出される。このペプチドは、創傷修復において細胞運動性および転移能に役割を果たし、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ複合タンパク質ｐ４７ｐｈｏｘ７およびシグナル伝達アダプタータンパク質ｐ１３０Ｃａｓに結合する。最近、ＰＲ３９は、低酸素で誘導されるアポトーシスを阻害し、内皮細胞内のカスパーゼ−３活性を減少させることが見出されている。（Ｗｕ， Ｊ．ら Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０９巻、１６６０頁（２００４年））。ＰＲ３９の誘導体には、配列番号３２：ＲＲＲＰＲＰＰＹＬＰＲＰＲＰＰＰＦＦＰＰＲＬＰＰＲＩまたはＰＲ２６；配列番号３３：ＲＲＲＰＲＰＰＹＬＰＲＰＲＰＰＰＦＦＰまたはＰＲ１９；配列番号３４：ＲＲＲＰＲＰＰＹＬＰＲまたはＰＲ１１；および配列番号３５：ＲＬＣＲＩＶＶＩＲＶＣＲまたはバクテネシンなどの関係したペプチドが含まれる。（Ａｇｅｒｂｅｒｔｈ， Ｂ．ら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２０２巻、８４９〜８５４頁、１９９１年；Ｂｏｍａｎ， Ｈ．Ｇ．ら．、Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ．、６１巻、２９７８〜２９８４頁、１９９３年；Ａｇｅｒｂｅｒｔｈ， Ｂ．ら、Ｖｅｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．、５４巻、１２７〜１３１頁、１９９６年；Ｇａｌｌｏ， Ｒ．Ｌ．ら Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９１巻、１１０３５〜１１０３９頁、１９９４年；Ｌｉ， Ｊ．ら、Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ．、８１巻、７８５〜７９６頁、１９９７年；Ｇｕｄｍｕｎｄｓｓｏｎ， Ｇ．Ｈ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９２巻、７０８５〜７０８９頁、１９９５年；Ｌｉ， Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ． Ｍｅｄ．、６巻、４９〜５５頁、２０００年；Ｌｉ， Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ． Ｍｅｄ．、６巻、３５６頁、２０００年；Ｇａｏ， Ｙ．ら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．、１０６巻、４３９〜４４８頁、２０００年；Ｂａｏ， Ｊ．ら Ａｍ． Ｊ．
Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２８１巻、２６１２〜２６１８頁、２００１年；Ｍａｄｈａｎｉら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １５８８巻（２００２年）２３２〜２４０頁）。これらのペプチドまたはこれらの誘導体は、本発明のキャリア用の理想的な積荷分子となる。
ＴＧＦ β活性化ペプチド。トロンボスポンジン（ＴＳＰ−１）に由来するトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）活性化ペプチド。この塩基性モチーフ（配列番号４６）Ｈ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（ＫＲＦＫ）は、Ｔｒｐ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｔｒｐ配列と組み合わせて、強いヘパリン結合を誘導する。この配列Ｔｒｐ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｔｒｐは、ＴＳＰ−１のアミノ酸４１２−４１５であり、潜在性のＴＧＦ−βを活性化するのに十分である。（Ｓｈｕｌｔｚ−Ｃｈｅｒｒｙ， Ｓ．ら Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０巻、７３０４頁（１９９５年）；Ｇｕｏ， Ｎ．ら Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７巻、１９３４９頁（１９９２年））。上記モチーフに由来する配列の例は、配列番号４８（Ｈ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−ＯＨ；またはＫＲＦＫＱＤＧＧＷＳＨＷＳＰＷＳＳ）および配列番号４９（Ｈ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−ＯＨ；またはＫＲＦＫＱＤＧＧＷＳＨＷＳＰ）である。これらのペプチドまたはこれらの誘導体は、本発明のキャリア用の理想的な積荷分子となる。
ｄ）増殖阻害剤（癌および細胞の過剰増殖または瘢痕の処置用）
αインターフェロン（ｐＩ＝８．８〜９．１）は、いくつかの型の癌の処置に有用となり得るＩ型インターフェロンである。αインターフェロンは、腎臓の癌、悪性黒色腫、皮膚黒色腫、多発性骨髄腫、およびカルチノイド腫瘍を処置するのに使用することができる。これは、ある特定の型のリンパ腫および白血病を処置するのにも使用することができる。インターフェロンγ（ｐＩ＝８．５〜９．５）は、抗瘢痕活性を有する（瘢痕形成（ｓｃａｒ ｆｏｍｎｉｎｇ）細胞の過剰増殖／活性を抑制する）ＩＩ型インターフェロンであり、肝硬変、肺線維症、慢性肉芽腫症、大理石骨病、およびマイコバクテリウム（ｍｙｃｏｂａｔｅｒｉｕｍ）で誘導される瘢痕の処置に使用することができる。瘢痕または過剰の結合組織沈着は、化学物質または感染によって引き起こされる場合がある。
配列番号５６（ＦＣＬＧＰＣＰＹＩＷＳＬＤＴまたはＴｂ１４３−５６）、配列番号５７（ＴＳＬＤＡＳＩＷＡＭＭＱＮＡまたはＰ１４４）、配列番号５８（ＫＲＩＷＦＩＰＲＳＳＷＹＥＲＡまたはＰ１７）、および配列番号５８（ＴＳＬＤＡＴＭＩＷＴＭＭ）のいずれか１つに由来し、またはこれを含むＴＧＦ−β阻害剤。これらのペプチドは、本発明のキャリアに結合することができるように、塩基性残基を含有するように修飾することができ、肝硬変、肺線維症、慢性肉芽腫症、大理石骨病、およびマイコバクテリウムで誘導される瘢痕の処置に有用となる組成物が得られる。
ｂＦＧＦ阻害剤（配列番号５０；Ｈ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−ＯＨ）：このペプチドは、ｂＦＧＦのヒト、ウシ（１１９−１２６）、マウス、ラット（１１８−１２５）、およびヘパリン結合成長因子２（１１８−１２５）残基に対応する。これは、ｂＦＧＦ受容体の二量体化および活性化を阻害する。（Ｙａｙｏｎ， Ａ．ら Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９０巻、１０６４３頁（１９９３年））。このペプチドまたはその誘導体は、本発明のキャリア用の積荷分子の一例である。
線維芽細胞成長因子−２（ＦＧＦ−２）誘導ペプチド：ＦＧＦ−２は、神経膠腫細胞の自律性増殖における自己分泌増殖因子である。ＦＧＦ−２誘導ペプチド（配列番号５１；Ｈ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−ＯＨ）は、悪性神経膠腫の増殖を抑制する。この１６残基のペプチドは、ＦＧＦ−２の推定上の受容体結合ドメインに対して立体配置的類似性を有する。これは、ヒト神経膠腫細胞の増殖を抑制し、悪性神経膠腫についての潜在的な新規処置生成物である（Ｋｏｎｏ， Ｋ．ら Ｊ． Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ６３巻、１６３頁（２００３年））。このペプチドまたはその誘導体は、本発明のキャリア用の積荷分子の一例である。
カリブドトキシン（配列番号５２；Ｐｙｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−ＯＨ（ジスルフィド架橋：７−２８、１３−３３および１７−３５））：カリブドトキシン（ＣｈＴＸ）は、Ｃａ２＋で活性化されたＫ＋チャネル遮断薬である。これは、末梢Ｔリンパ球を脱分極させ、そのマイトジェンで誘導される増殖を遮断する。ＣｈＴＸは、サソリ、Ｌｅｉｕｒｕｓ ｑｕｉｎｑｕｅｓｔｒｉａｔｕｓ ｈｅｂｒａｅｕｓの毒液から単離される高度に塩基性のペプチドである。（Ｌｅｏｎａｒｄ， Ｒ．ら Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９巻、１００９４頁（１９９２年）；Ｇｉｍｅｎｅｚ−Ｇａｌｌｅｇｏ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５巻、３３２９頁（１９８８年）。Ｓｕｇｇ， Ｅ．ら Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５巻、１８７４５頁（１９９０）年）。このペプチドまたはその誘導体は、本発明のキャリア用の積荷分子の一例である。
アンテナペディア Ｂａｋ ＢＨ３（Ａｎｔ−ＢＨ３）（７１−８９）融合ペプチド（配列番号５３：Ｈ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＯＨ）。これは、アンテナペディアペプチドに融合したＢａｋ ＢＨ３ドメインのアミノ酸７１〜８９断片を含有する融合ペプチドである。Ｂｃｌ−２相同３（ＢＨ３）ドメインは、Ｂａｋ、Ｂａｘ、およびＢａｄを含めたＢｃｌ−２タンパク質ファミリーのアポトーシス促進性メンバーの死誘導特性および二量体化特性に極めて重要である。ＢａｋのＢＨ３ドメインに対応する合成ペプチドは、Ｂｃｌ−ｘＬに結合し、その抗アポトーシス機能をアンタゴナイズし、アンテナペディアホメオタンパク質内部移行ドメインへの融合を介してインタクトな細胞に送達される場合、アポトーシスを迅速に誘導する。Ｈｏｌｉｎｇｅｒ， Ｅ．ら Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４巻、１３２９８頁（１９９９年）。このペプチドまたはその誘導体は、本発明のキャリア用の積荷分子の一例である。
腫瘍を標的にしたアポトーシス促進性ペプチド：（配列番号５４：Ｈ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（ペプチド内ジスルフィド結合を有し、Ｄは、アミノ酸のＤ異性体を表す）。これは、ＣＮＧＲＣＧＧｋｌａｋｌａｋｋｌａｋｌａｋ−ＮＨ２（ジスルフィド結合）またはＣＮＧＲＣ−ＧＧ−（ｋｌａｋｌａｋ）２−ＮＨ２（ペプチド内ジスルフィド結合を有する）と同じであり、この場合、小文字のアミノ酸コードは、対応するアミノ酸のＤ異性体を表す。このペプチドは、２つの機能ドメイン、すなわち一方では標的細胞にペプチドをガイドし、その内部移行を可能にする「ホーミング」または標的化ドメイン、および他方ではプログラム細胞死誘導配列からなる。標的化ドメインは、様々な抗腫瘍化合物およびウイルス粒子を腫瘍血管に送達するのに有用であることを証明したＡｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＮＧＲ）モチーフを含有する。プログラム細胞死誘導配列として、（ｋｌａｋｌａｋ）２とも呼ばれる合成の１４アミノ酸ペプチドｋｌａｋｌａｋｋｌａｋｌａｋが選択された。その理由は、これが真核細胞を死滅させるのに必要とされる濃度の１％の濃度で細菌を死滅させるためである。このアポトーシス促進性ドメインは、細胞の外側で無毒性であるが、ミトコンドリア膜の破壊によって標的細胞内に内部移行されると毒性である。したがって、標的にされるアポトーシス促進性ペプチドは、潜在的な新しいクラスの抗癌剤を代表する。これらは、２つのレベルの特異性、すなわち、標的細胞への「ホーミング」および流入後のそのような細胞の選択的なアポトーシスを組み合わせる。（Ｈ．Ｍ．Ｅｌｌｅｒｂｙら、Ｎａｔ． Ｍｅｄ．、５巻、１０３２頁（１９９９年）；Ｇ．Ｃｏｌｏｍｂｏら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７７巻、４７８９１頁（２００２年）；Ｌ．Ａ．Ｐｌｅｓｎｉａｋら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．、１３巻、１９８８頁（２００４年）。このペプチドまたはその誘導体は、本発明のキャリア用の積荷分子の一例である。表１に提示された配列は、当技術分野で公知であるような各アミノ酸についての１文字略語に基づき、表されたアミノ酸は、Ｄ異性体であってもＬ異性体であってもよい。「Ｐｙｒ」は、ピログルタミン酸を示し、「ａｍ」は、カルボキシル末端でアミノ化されていることを示し、「ｍｅｔｈ」はメチル化を示す。
表１：本発明の成分としてのペプチド積荷分子の例
本発明によるキャリアに静電気的に結合したタンパク質およびペプチドは、体内でのより長い循環、血液中でのより高い安定性および／またはより好都合な投与（例えば、注入の代わりにボーラスを通じてなどのより迅速な投与、およびより少ない頻度の投与、例えば、注入または１日１回の代わりに数日毎に１回）をもたらすことができる。多くの場合、塩基性タンパク質活性剤の慢性投与は、免疫原性となり得る。キャリアに基づく製剤は一般に、ＰＥＧに基づく送達システムより低い免疫原性をもたらし、したがって塩基性タンパク質またはペプチドは、本発明の組成物中で免疫原性がより低いことが予期される。活性剤の「直接ペグ化」は、ＰＥＧへのタンパク質の直接結合であり、活性の喪失をもたらす場合がある。しかし、保護側鎖を有するキャリアの骨格に共有結合的に連結した陰イオン基に静電気的に結合した陽イオン性タンパク質またはペプチドは、ペグ化に代わって安定な、長い循環をもたらし得る。一実施形態では、積荷分子と組成物の陰イオン基との間の相互作用は、積荷分子と組成物の成分となり得る疎水性基との間の相互作用より、血液中でより安定である。本発明のキャリアは、凍結保護物質および巨大分子安定剤として作用することができ、溶液中、ならびに凍結乾燥および再構成プロセスの間の塩基性タンパク質またはペプチド活性剤を保存する。
静電気的に結合したタンパク質またはペプチド／キャリアの組合せは、組成物として本明細書に記載されているが、これらは代わりに、静電結合を含む化合物として理解され得る。本発明の様々な実施形態では、本発明の効力を変更する場合のある本明細書に列挙されていない成分を除外することができる一方で、必要とされる成分の効力を変更しない成分を含めることを依然として可能にする。本発明の効力を変更する場合のある本明細書に列挙されていない特徴は、本発明の必要とされる特徴の記載において語句「から本質的になる」を使用することによって除外することができる。しかし、語句「から本質的になる」の使用は、必要とされる成分の効力を変更しない特徴を除外しない。一実施形態では、「から本質的になる」は、イオン性相互作用についてのＫｄが１０μＭ未満であり、疎水性相互作用などの他の相互作用は１０μＭ未満のＫｄを有さないことを意味する。
徐放
本発明のキャリアがタンパク質またはペプチド活性剤を製剤化するのに使用される場合、活性剤単独を投与することと比較して、血液中での活性剤の持続した存在から明白なように、長期間の活性剤の放出が観察される。キャリアの活性剤との会合は、当業者によって容易に求めることができる特定の解離定数（Ｋｄ）によって定義される。放出は、遊離活性剤の濃度によって決定され、その結果、遊離活性剤の濃度が下がり（体による分解または排除のために）、Ｋｄがもはや満たされないとき、より多くの活性剤がＫｄを満たすために放出されることになる。Ｋｄは、遊離活性剤の濃度と陰イオンクラスター（活性剤と会合していない）の濃度の積を、陰イオン基と会合した活性剤の濃度によって除したものである。超分子構造、例えば、ミセル、リポソーム、および他の構造などを形成する本発明の組成物に関して、放出速度は依然としてＫｄに従うが、区画化のために、Ｋｄは、各特定の区画においてのみ満たされる。しかし、様々な区画の長期の混合は、活性剤の周囲環境への偶発的な放出をもたらす場合がある。区画化が伴われる場合および伴われない場合の両方において、放出プロファイルは、有効量（例えば、約０．００００１ｍｇ／ｋｇ／時間〜約１０ｍｇ／ｋｇ／時間）の活性剤の送達の延長をもたらす（例えば、１〜約４０００時間、または代わりに約４〜約１５００時間を超えて）。製剤の利点は、連続的から、１日１回またはさらには１週間に１回までの頻度のより少ないボーラス投与である。これは、製剤化されていない活性剤と比較して変動がより少ない、血液中でのより一定のレベルの活性剤をもたらすことになる。ボーラス投与の頻度は、被験体の必要性に応じて変化し、当業者によって容易に求めることができる。理論に束縛されることを望むわけではないが、一実施形態では、疎水性部分を含有するキャリアに対する本発明の利点は、本発明の製造プロセスにあり、これは、有機溶媒を必要とすることなく、水の使用を可能にすることができる。水溶液系は、重要な製造の利点を代表することができる。
治療用途
本発明の組成物を用いて処置される「患者」、「被験体」、または「宿主」は、ヒトまたは非ヒト動物を意味することができる。本発明の塩基性タンパク質（陽イオン性タンパク質）は、それだけには限定されないが、細菌感染症、癌および関係する腫瘍性疾患、およびアルツハイマー病などの疾患および障害の処置において有用である。一実施形態では、本発明の組成物は、例えば、被験体の任意の疾患または他の治療可能な状態を処置することを含めて、任意の数の用途のための薬物の製造において使用することができる。
Ａ）炎症の処置
一実施形態では、配列番号１〜１１またはこれらの誘導体もしくは類似体を含む積荷分子を有する本発明の組成物は、炎症を処置するのに使用することができる。本発明の組成物の恩恵を受けることができる慢性炎症疾患の例は、関節リウマチ、慢性炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、および糖尿病である。
Ｂ）感染症の処置
一実施形態では、配列番号１２〜４５またはこれらの誘導体もしくは類似体を含む積荷分子を有する本発明の組成物は、感染症を処置するのに使用することができる。別の実施形態では、本発明の塩基性タンパク質は、細菌感染症の処置において有用である。処置用の例示的な活性剤には、生理学的なｐＨで全体的な正電荷を有する塩基性タンパク質であるリゾスタフィンが含まれる。リゾスタフィンは、グラム陽性菌の細胞壁ペプチドグリカン中のペンタグリシン架橋を切断する。Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、その細胞壁が高い割合のペンタグリシン架橋を含有するので、この酵素の溶菌作用に特に感受性である。リゾスタフィンは、心内膜炎、骨髄炎、カテーテルに関係する感染症、ＭＲＳＡに媒介される地域感染型のフルンケル症および肺炎を含めた多剤耐性のＳ．ａｕｒｅｕｓに媒介される感染症を処置するための潜在的な全身療法である。
Ｃ）組織または細胞損傷の処置
一実施形態では、本発明の塩基性タンパク質には、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ−α、−β１、−β２、−β３；ｐＩ ８〜９）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ；ｐＩ ８．０〜９．５）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ、２２メンバーを有する；ｐＩ ８．０〜９．０）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ；サルフェート残基に結合する正電荷の部位を有する）、神経成長因子（ＮＧＦ、ｐＩ ８．５〜９．５）、および血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ−ＡＡ、−ＢＢ、−ＡＢ；ｐＩ ８．５〜１０）が含まれる。これらの成長因子は、糖尿病の場合における膵島、または心筋梗塞の場合における心臓など、傷害された臓器の増殖を刺激するのに有用である。これらの成長因子は、本発明のキャリアと製剤化し、または組み合わせ、糖尿病または心筋梗塞の処置に使用することができる。上記タンパク質は、生理学的なｐＨで全体的な正電荷を有し、またはこれは、正電荷のパッチを有し、本発明のキャリアの陰イオン基に結合することができる。ヘパリン結合ＥＧＦ（ＨＢ−ＥＧＦ）、ベータセルリン（ＢＴＣ）、アンフィレグリン（ＡＲ）、エピレグリン（ＥＰＲ）、エピゲン（ＥＰＲ）、およびニューロレグリン（ｎｅｕｒｏｒｅｇｕｌｉｎ）を含めた上皮成長因子（ＥＧＦ）ファミリーの他のメンバーは、サルフェート部分に結合することができる結合部位を有し、本発明のキャリアを使用して製剤化することができる。ＴＧＦ−α、ＶＥＧＦ、およびＨＢ−ＥＧＦは、糖尿病における島細胞を増殖させるのに使用することができる。別の実施形態では、配列番号３１〜３４および４６〜４９またはこれらの誘導体もしくは類似体を含む積荷分子を有する本発明の組成物は、組織損傷または細胞損傷を処置するのに使用することができる。さらに別の実施形態では、本発明の積荷分子は、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ；ｐＩ ９．６）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、またはシアル酸を含まないエリスロポエチン（ｐＩ
８．５）のいずれか１つとすることができる。ＦＧＦファミリーの全てのメンバーは、塩基性の等電点を有し、または本発明のキャリア中の陰イオン基に結合することができるこれらの表面上に正電荷のパッチを有する。これらの成長因子は、臓器再生を必要とする放射線傷害または化学傷害の処置に有用である。例えば、放射線への不慮の曝露は、腸粘膜および骨髄の再生を改善する長時間作用型ＦＧＦ（本発明の陰イオンコアキャリアを有するＦＧＦの製剤）の恩恵を受けることになる。本発明の陰イオンコアキャリア中のエリスロポエチンの製剤は、特にエリスロポエチンのレベルが本発明のキャリアのために持続可能な（ｓｕｓｔａｉｎ）時間維持される場合、骨髄の回復を加速することによって骨髄損傷または崩壊の処置に有用となる。
Ｄ）癌または過剰増殖の処置
別の実施形態では、配列番号５０〜５５またはこれらの誘導体もしくは類似体を含む積荷分子を有する本発明の組成物は、癌または過剰増殖を処置するのに使用することができる。
投与および投与量
本発明の組成物を用いて処置される「患者」、「被験体」、または「宿主」は、ヒトまたは非ヒト動物を意味することができる。
用語「薬学的に許容可能な賦形剤」は当技術分野で認められており、薬学的に許容される物質、組成物、またはビヒクル、例えば、組成物と共に投与される液体または固体の充填剤、希釈剤、溶媒、または封入材料などを指す。各賦形剤は、サプリメントの他の成分と適合性であり、被験体に対して傷害性でないという意味で「許容される」。薬学的に許容可能な賦形剤として機能を果たすことができる物質のいくつかの例として、（１）糖、例えば、ラクトース、グルコース、およびスクロースなど；（２）デンプン、例えば、コーンスターチおよびジャガイモデンプンなど；（３）セルロースおよびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロースなど；（４）粉末トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）賦形剤、例えば、カカオバターおよび坐剤ワックスなど；（９）油、例えば、ラッカセイ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、およびダイズ油など；（１０）プロピレングリコールなどのグリコール；（１１）ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールなど；（１２）エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなど；（１３）寒天；（１４）緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなど；（１５）アルギン酸；（１６）発熱物質なしの水；（１７）等張性食塩水；（１８）リンガー液；（１９）エチルアルコール；（２０）リン酸緩衝液溶液、および（２１）医薬製剤中に使用される他の無毒性の適合性物質が挙げられる。
本発明のペプチド／タンパク質活性剤の投与量は、被験体の症状、年齢、および体重、疾患または障害の性質および重症度、投与経路、ならびに組み合わせて被験体に投与される他の薬物／活性剤に応じて変化することになる。投与量は常に、ペプチド／タンパク質の恩恵が、毒性および他の副作用の観点からの被験体へのリスクより勝ることを保証するように与えられるべきである。活性剤がリゾスタフィンである実施形態では、投与量は、感染症の重症度、および他の追加の抗生物質の形態に依存することになる。活性剤が抗炎症剤である実施形態では、投与量は、炎症の重症度および炎症の原因、ならびに他の追加の抗炎症薬の形態に依存することになる。活性剤が成長因子である実施形態では、投与量は、成長因子の安全性および耐容性、ならびにリスクに勝る恩恵、ならびに成長因子が単独で使用されるか、または他の成長因子および糖尿病の場合、オメプラゾールなどの成長因子誘導剤と組み合わせて使用されるかどうかに依存することになる。対象製剤のいずれも、単一用量または分割量で投与することができる。本発明のペプチド／タンパク質製剤の投与量は、当技術分野で公知であるか、または本明細書に教示される技法によって容易に求めることができる。また、本発明は、１つまたは複数の抗生物質または他の治療剤を伴った本発明の製剤の１つまたは複数の混合物を企図する。特定の実施形態では、本発明のリゾスタフィンを含有するキャリアは、アモキシシリン、アンピシリン、アジドシリン、アズロシリン、アズトレオナム、バシタシン（ｂａｃｉｔａｃｉｎ）、ベンザチンベンジルペニシリン、ベンザチンフェノキシメチルペニシリン、ベンジルペニシリン（Ｇ）、ビアペネム、カルベニシリン、セファセトリル、セファドロキシル、セファレキシン、セファログリシン、セファロニウム、セファロリジン、セファロチン、セファピリン、セファトリジン、セファゼドン、セファザフルール、セファゾリン、セフラジン、セフロキサジン、セフテゾール、セファクロル、セファマンドール、セフミノクス、セフォニシド、セフォラニド、セフォチアム、セフプロジル、セフブペラゾン、セフロキシム、セフゾナム、セファマイシン（セフォキシチン、セフォテタン、セフメタゾールなど）、カルバセフェム（ロラカルベフなど）、セフカペン、セフダロキシム、セフジニル、セフジトレン、セフェタメト、セフィキシム、セフメノキシム、セフォジジム、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフピミゾール、セフピラミド、セフポドキシム、セフスロジン、セフタジジム、セフテラム、セフチブテン、セフチオレン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、オキサセフェム（フロモキセフ、ラタモキセフなど）、セフェピム、セフォゾプラン、セフピロム、セフキノム、セフトビプロール、クロロアムフェニコール（ｃｈｌｏｒｏａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）、クロロヘキシジン、クリンダマイシン、クロメトシリン、クロキサシリン、コリスチン、シクロセリン、ダプトマイシン、ドリペネム、ドキシサイクリン、エピシリン、エルタペネム、エリスロマイシン、ファロペネム、ホスホマイシン（ｆｏｓｔｏｍｙｃｉｎ）、ゲンタマイシン、イミペネム、リネゾリド、メシリナム、メロペネム、メチシリン（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ）、メチシリン（ｍｅｔｉｃｉｌｌｉｎ）、メズロシリン、ミノサイクリン、ムピロシン、ナフシリン、ネオマイシン、オキサシリン、パニペネム、ペナメシリン、フェネチシリン、フェノキシメチルペニシリン（Ｖ）、ピペラシリン、ポリミキシン、ポリミキシンＢ、プロカインベンジルペニシリン、プロピシリン、キヌプリスチン／ダルホプリスチン、ラモプラニン、リファンピシン、リファンピン、スルベニシリン、テイコプラニン、チゲサイクリン、チゲモナム、トリメトプリム／スルファメトキサゾール、およびバンコマイシンから選択される他の抗生物質の任意の１つまたは複数と共に投与することができる。特定の実施形態では、本発明の塩基性タンパク質を含有するキャリアは、アズトレオナム、バシタシン、セフタジジム、クロロアムフェニコール、クロロヘキシジン、クリンダマイシン、ダプトマイシン、ドキシサイクリン、エリスロマイシン、ゲンタマイシン、リネゾリド、メチシリン（ｍｅｔｈｈｉｃｉｌｌｉｎ）、ミノサイクリン、ムピロシン、ネオマイシン、オキサシリン、ポリミキシン、キヌプリスチン／ダルホプリスチン、リファンピシン、リファンピン、テイコプラニン、テモシリン、チカルシリン、チゲサイクリン、トリメトプリム／スルファメトキサゾール、およびバンコマイシンから選択される他の抗生物質の任意の１つまたは複数と共に投与することができる。特定の実施形態では、本発明の塩基性タンパク質を含有するキャリアは、０．１：１〜２０：１の範囲の塩基性タンパク質と糖ペプチド抗生物質の重量比で任意の糖ペプチド抗生物質と共に投与することができる。特定の実施形態では、重量比の範囲は０．５：１〜７：１である。糖ペプチド抗生物質は、バンコマイシン、テイコプラニン、およびラモプラニンからなる群から選択することができる。本発明の組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、クモ膜下、または局所投与に適した形態とすることができる。
本発明はまた、ヒト被験体におけるブドウ球菌感染症を処置する方法であって、リゾスタフィンに静電気的に結合した陰イオン性電荷を有するキャリアを含む本発明の組成物を投与するステップであって、リゾスタフィンは、ヒト被験体に体重１ｋｇ当たり、１日当たり１ｍｇ〜１５０ｍｇの量で投与されるステップと、ヒト被験体に体重１ｋｇ当たり、１日当たり５０〜２５０ｍｇの量でβ−ラクタム抗生物質を投与するステップとを含む方法に関する。β−ラクタム抗生物質は、ヒト被験体におけるβ−ラクタムの用量が体重１ｋｇ当たり、１日当たり１００〜２００ｍｇであるように、キャリアおよびリゾスタフィンと共に投与することができる。β−ラクタム抗生物質は、ペニシリン、セファロスポリン、ペネム、カルバペネム、またはモノバクタムとすることができる。ペニシリンに属するβ−ラクタム抗生物質として、アミノペニシリン（アモキシシリン、アンピシリン、およびエピシリンなど）；カルボキシペニシリン（カルベニシリン、チカルシリン、テモシリンなど）；ウレイドペニシリン（アズロシリン、ピペラシリン、メズロシリンなど）；および他のもの（例えば、メシリナム、スルベニシリン、ベンジルペニシリン（Ｇ）、アジドシリン、ペナメシリン、クロメトシリン、ベンザチンベンジルペニシリン、プロカインベンジルペニシリン、フェノキシメチルペニシリン（Ｖ）、プロピシリン、ベンザチン、フェノキシメチルペニシリン、フェネチシリン、オキサシリン、クロキサシリン、メチシリン、ナフシリンなど）が挙げられる。セファロスポリンに属するβ−ラクタム抗生物質は、セファセトリル、セファドロキシル、セファレキシン、セファログリシン、セファロニウム、セファロリジン、セファロチン、セファピリン、セファトリジン、セファゼドン、セファザフルール、セファゾリン、セフラジン、セフロキサジン、セフテゾール、セファクロル、セファマンドール、セフミノクス、セフォニシド、セフォラニド、セフォチアム、セフプロジル、セフブペラゾン、セフロキシム、セフゾナム、セファマイシン、カルバセフェム、セフカペン、セフダロキシム、セフジニル、セフジトレン、セフェタメト、セフィキシム、セフメノキシム、セフォジジム、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフピミゾール、セフピラミド、セフポドキシム、セフスロジン、セフタジジム、セフテラム、セフチブテン、セフチオレン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、オキサセフェム、セフェピム、セフォゾプラン、セフピロム、セフキノム、およびセフトビプロールである。カルバペネム（ｃａｒｂｏｐｅｎｅｍ）に属するβ−ラクタム抗生物質は、ビアペネム、ドリペネム、エルタペネム、イミペネム、メロペネム、およびパニペネムである。ペネムであるβ−ラクタム抗生物質は、ファロペネムである。
ある特定の実施形態では、ペプチド／タンパク質製剤の投与量は、一般に、体重１ｋｇ当たり約０．０１ｎｇ〜約１０００ｍｇの塩基性タンパク質の範囲内、具体的には、１ｋｇ当たり約１ｎｇ〜約１００ｍｇの塩基性タンパク質の範囲内、より具体的には１ｋｇ当たり塩基性タンパク質の約１００ｎｇ〜約２０ｍｇの範囲内となる。より好ましい用量範囲は、１ｋｇ当たり約１００ｎｇ〜約２０ｍｇの塩基性タンパク質となる。製剤中のキャリアの重量と比べたペプチド／タンパク質の量は、キャリアの重量の約１％〜１０００％の範囲内とすることができる。一実施形態では、製剤中のキャリアの重量と比べた塩基性タンパク質の量は、キャリアの重量の約５％〜５００％の範囲内とすることができる。他の実施形態では、製剤中のキャリアの重量と比べた塩基性タンパク質の量は、キャリアの重量の約１０％〜１００％の範囲内とすることができる。
製剤の投与のタイミングに対する有効な用量または量、および任意の可能な影響は、本発明において特定される必要がある場合がある。これは、１つまたは複数の群の動物（好ましくは１群当たり少なくとも５匹の動物）、または適切な場合ヒトの治験において、本明細書に記載されるような日常の実験によって達成することができる。ペプチド／タンパク質製剤の有効性は、投与し、対象とする疾患／障害／感染症と関連した１つまたは複数の指標を測定することにより投与の作用を評価し、これら指標の処置後の値を処置前の同じ指標の値と比較することによって評価することができる。
所与の被験体において最も有効な処置を生じる、任意の特定の化合物の投与の正確な時間および量は、塩基性タンパク質の活性、薬物動態、およびバイオアベイラビリティー、被験体の生理的条件（年齢、性別、疾患の型およびステージ、一般的な身体状態、投与量に対する応答性、ならびに薬剤の型を含む）、投与経路などに依存することになる。本明細書に提示される指針を、処置を最適化する、例えば、投与の最適の時間および／または量を求めるのに使用することができ、これは、被験体を監視すること、ならびに投与量および／またはタイミングを調整することからなる、せいぜい日常の実験を必要とするだけとなる。
処置は、化合物の最適用量未満であるより少ない投与量から開始することができる。その後、投与量を、最適の治療効果に達するまで少しの増加によって増加させることができる。
本発明のリゾスタフィン製剤の、他の抗生物質または他の治療剤との併用は、リゾスタフィン製剤の必要とされる投与量を低減する場合がある。これは、他の抗生物質または他の治療剤の作用が、リゾスタフィン製剤の作用と相補的（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）である場合があるためである。そのような組み合わせた療法において、異なる活性剤は、一緒にまたは別個に、かつ同時に、または１日の中で異なる時間に送達することができる。
本発明の抗菌性ペプチド／タンパク質製剤の毒性および治療的有効性は、例えば、ＬＤ５０、ＥＤ５０、ＭＩＣ（試験微生物の増殖を依然として阻害することになる生成物の最低濃度）、および／またはＭＢＣ（試験生物を死滅させる、または試験生物に対して殺菌性となる生成物の最低濃度）を求めるための、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順（ｐｒｏｃｅｅｄｕｒｅｓ）によって求めることができる。大きい治療指数を示す製剤が好適である。毒性副作用を示す製剤を使用することができるが、副作用を低減するために、所望の部位でキャリア−抗菌性ペプチド／タンパク質複合体が蓄積することに注意が払われるべきである。
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られるデータを、ヒトに使用するための様々な投与量を処方するのに使用することができる。任意のキャリア−抗菌性ペプチド／タンパク質複合体製剤の投与量は、毒性をほとんど含まないか、またはまったく含まずに、ＭＩＣを超える血液中の様々な循環濃度をもたらすことが重要である。投与量は、使用される剤形および利用される投与経路に応じてこの範囲内で変更することができる。本発明の作用物質に関して、治療有効用量は、ＭＩＣおよびＭＢＣを得るための細菌培養アッセイから最初に見積もることができる。製剤の用量は、細胞培養で求めた場合のＭＩＣおよび／またはＭＢＣを超える循環血漿濃度範囲を与える用量に基づいて、動物モデルから導出することができる。そのような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に求めるために使用することができる。
本発明のキャリア−抗菌性ペプチド／タンパク質複合体は、軟膏、ペースト、クリーム、またはゲルの形態で外部投与用に使用することができ、賦形剤、例えば、動物および植物性脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク、ならびに酸化亜鉛、またはこれらの混合物などをさらに含有することができる。
本発明の塩基性タンパク質を有するキャリアは、粉末またはスプレーの形態で外部投与用に使用することができ、賦形剤、例えば、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、およびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物などをさらに含有することができる。スプレーは、慣例的な噴霧剤、例えば、クロロフルオロ炭化水素、およびブタンおよびプロパンなどの揮発性未置換炭化水素などを追加として含有することができる。
本発明のキャリア−ペプチド／タンパク質複合体は、エアロゾルの形態で外部投与用に使用することができる。これは、本発明の組成物を含有するが、固体に共有結合的に結合していない水性エアロゾル、リポソーム調製物、または固体粒子を調製することによって達成される。非水性の（例えば、フルオロカーボン噴霧剤）懸濁液を使用することができる。音波噴霧器は、化合物の分解をもたらし得るせん断に作用物質を曝すことを最小にするので、これらを使用することができる。通常、水性のエアロゾルは、従来の薬学的に許容可能なキャリアおよび安定剤と一緒に製剤の水溶液または懸濁液を製剤化することによって作られる。賦形剤および安定剤は、特定の化合物の要求によって異なるが、一般的に非イオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ、プルロニック、またはポリエチレングリコール）、血清アルブミンのような無害なタンパク質、ソルビタンエステル、オレイン酸、レシチン、グリシンなどのアミノ酸、緩衝剤、塩、糖、または糖アルコールを含む。エアロゾルは一般に、等張性の溶液から調製される。
非経口投与に適した本発明のキャリア−ペプチド／タンパク質複合体を含む薬学的組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容される滅菌した等張性の水溶液もしくは非水性溶液、分散物、懸濁液もしくはエマルジョン、または使用直前に滅菌注射用溶液または分散物に再構成することができる滅菌粉末と組み合わせて、サプリメントの１つまたは複数の成分を含み、これは、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬、製剤を意図されるレシピエントの血液と等張性にする溶質、または懸濁化剤もしくは増粘剤を含有することができる。
本発明の薬学的組成物中に使用することができる適当な水性および非水性賦形剤の例は、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの適当な混合物、オリーブ油などの植物油、オレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが含まれる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材を使用することによって、分散物の場合では要求される粒径を維持することによって、界面活性剤を使用することによって維持することができる。
キット
本発明は、本発明の方法を好都合かつ有効に実施するためのキットも提供する。そのようなキットは、任意の本発明のキャリア−ペプチド／タンパク質複合体またはこれらの組合せ、および本発明の方法とのコンプライアンスを促進するための手段を含む。キャリア−ペプチド／タンパク質複合体製剤の場合におけるそのようなキットは、処置される被験体が、正しい様式で正しい投与量で適切な活性物（ａｃｔｉｖｅ）を摂取することを保証するための好都合で有効な手段を提供する。そのようなキットのコンプライアンス手段には、本発明の方法による活性物を投与することを促進する任意の手段が含まれる。そのようなコンプライアンス手段は、使用説明書、包装、および調剤手段、ならびにこれらの組合せを含む。キットの構成要素は、前述の方法の手動の、または部分的もしくは全面的に自動化されたやり方でパッケージすることができる。キットを伴う他の実施形態では、本発明は、本発明の組成物、および任意選択によりこれらの使用のための使用説明書を含むキットを企図する。試料は、血清、血漿、全血、尿、組織抽出物、細菌抽出物、ウイルス抽出物、真菌抽出物、または塩基性タンパク質（例えば、リゾスタフィン）の存在が、推測され、または定量化される必要のある任意の試料を含めた多くの源由来の液体とすることができる。
一態様では、本発明は、（ｉ）ポリマー骨格（ｉｉ）骨格に共有結合的に連結または結合したサルフェート、スルホネート、またはホスフェート部分の陰イオン基、（ｉｉｉ）陰イオン基イオンに静電気的に結合した正電荷の基を有する活性剤、および（ｉｉｉ）骨格に共有結合的に連結または結合した保護鎖を含む組成物を含むキットに関する。そのようなキットの用途には、例えば、治療用途が含まれる。そのようなキットは、例えば、画像法、標的化、診断、療法、ワクチン接種などを含めた様々な他の用途を有することができる。
本発明を、以下の実施例によりさらに例証する。実施例は、例証のためのみに提供し、いかなる場合であっても、本発明の範囲および内容を制限すると解釈してはならない。
別段の記載がない限り、本明細書および特許請求の範囲において使用する成分、反応条件等の分量を表現する全ての数は、全ての場合において、用語「約」により修飾されていると理解されたい。したがって、そうでないことの記載がない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲に記載する数値パラメータは、本発明が得ようとする所望の特性に応じて変化し得る近似値である。
本発明の好ましい実施形態を、本明細書に示し、記載してきたが、そのような実施形態は、例示のためのみに提供されていることが、当業者には明らかであろう。本明細書に記載する本発明の実施形態に対する明らかな代替物を、本発明を実行する際に利用することができることを理解すべきである。
多糖に由来するポリマー骨格を有する組成物の実施例
（実施例１）
ＨＰＰＥＧ５２ｇの合成
２ｇのＭＰＥＧＡＭ（ＭＷ＝５ｋＤａ；０．４ミリモル；Ｌｙｓａｎ；ロット番号１１１−１０２；透明溶液）を、１０ｍｌの水に溶解させ、５ｍｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３および１００μｌの１０Ｎ ＮａＯＨを添加して、ｐＨを７．８とした。アミノ基をＴＮＢＳにより測定し、２ｇ中、全部で０．５７９ミリモルのＮＨ２が存在することが見出された。別個の容器中で、１ｇのヘパリンのナトリウム塩（球状タンパク質標準物質、カタログ番号４１１２１−１Ｇ Ａｃｒｏｓを使用する分子ふるいクロマトグラフィーによれば、２５ｋＤａ。ロット番号Ｂ０１２８７６３；ＭＷ＝約５９３＋４ナトリウム−４Ｈ＝６８１Ｄａ／二糖；１ｇのＨＰが、カルボキシルにおける置換がないと仮定すれば、１．４７ミリモルの理論上のカルボキシル基を有する）を、５ｍｌの水（総体積）に溶解させた。アミノ基をＴＮＢＳにより測定し、アミノ基は、全部でわずか２．６マイクロモル／グラムしか存在しないことが見出された。このＨＰ溶液（５ｍｌ）を、８０ｍｇのＮＨＳＳ（ＭＷ＝１１５．１４；０．７ミリモル）および２８５ｍｇのＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１；１．５ミリモル）を添加することによって２０分間活性化させた。次いで、これを、ＭＰＥＧＡＭ溶液に添加し、３時間反応させた。３時間後に、アミノ基を測定し、アミノ基は、全部で１９２マイクロモル存在することが見出された。このことは、６７％のＭＰＥＧを使い切ったことを示している。翌日、アミノ基を再び測定し、アミノ基は、全部で８４マイクロモル存在することが見出された。このことは、８５％のＰＥＧを使い切ったことを示している。反応混合物を、５０，０００ＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−５０−Ｅ−５Ａ）中で、１Ｍ ＮａＣｌを１５回変え、水を１０回変えて洗浄した。試料ＨＰＰＥＧ５２ｇを、ろ過滅菌（０．２μｍのポリスルホン製フィルター、Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）し、凍結乾燥して、１．８６グラムを得た。１ｍｇ／ｍｌを分析し、これは、０±５μＭまたは０ナノモル／ｍｇのＮＨ２を含有する。１０ｍｇ／ｍｌを、ＧＰＣについて測定し、これは、１４分（およそ１１．５ｎｍ）の保持時間を示した。
（実施例２）
ＨＰＰＥＧ１０４Ｇの合成
４ｇのＭＰＥＧＡＭ（ＭＷ＝１０ｋＤａ；０．４ミリモル；Ｓｕｎｂｉｏ；ロット番号Ｃ１ＡＭ−０１０−０５０５３）を、１０ｍｌの水に溶解させ、５ｍｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３および１００μｌの１０Ｎ ＮａＯＨを添加して、ｐＨを７．８とした。アミノ基をＴＮＢＳにより測定し、４ｇ中、全部で０．５２８ミリモルのＮＨ２が存在することが見出された。予想したよりも多くのアミノ基が存在するようである。おそらく、ＭＰＥＧＡＭが、より低い分子量を有する。別個の容器中で、１ｇのヘパリンのナトリウム塩（球状タンパク質標準物質、カタログ番号４１１２１−１Ｇ Ａｃｒｏｓを使用する分子ふるいクロマトグラフィーによれば、２５ｋＤａ。ロット番号Ｂ０１２８７６３；ＭＷ＝約５９３＋４ナトリウム−４Ｈ＝６８１Ｄａ／二糖；１ｇのＨＰが、カルボキシルにおける置換がないと仮定すれば、１．４７ミリモルの理論上のカルボキシル基を有する）を、５ｍｌの水（総体積）に溶解させた。アミノ基をＴＮＢＳにより測定し、アミノ基は、全部でわずか２．２マイクロモル／グラムしか存在しないことが見出された。このＨＰ溶液（５ｍｌ）を、８０ｍｇのＮＨＳＳ（ＭＷ＝１１５．１４；０．７ミリモル）および２８５ｍｇのＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１；１．５ミリモル）を添加することによって２０分間活性化させた。次いで、これを、ＭＰＥＧＡＭ溶液に添加し、３時間反応させた。３時間後に、アミノ基を測定し、アミノ基は、全部で１５２マイクロモル存在することが見出された。このことは、７１％のＭＰＥＧを使い切ったことを示している。翌日、アミノ基を再び測定し、アミノ基は、全部で５８マイクロモル存在することが見出された。このことは、８９％のＰＥＧを使い切ったことを示している。反応混合物を、５０，０００ＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−５０−Ｅ−５Ａ）中で、１Ｍ ＮａＣｌを１５回変え、水を１０回変えて洗浄した。試料ＨＰＰＥＧ５２ｇを、（Ｆｉｓｈｅｒ製の５番ろ紙を使用して）ろ過し、凍結乾燥して、２．０５グラムを得た。１ｍｇ／ｍｌを分析し、これは、０±５μＭまたは０ナノモル／ｍｇのＮＨ２を含有する。１０ｍｇ／ｍｌを、ＧＰＣについて測定し、これは、１３．２分（およそ１７ｎｍ）の保持時間を示した。
（実施例３）
５０ＣＳＰＥＧ１０６Ｇの合成
この組成物は、コンドロイチン硫酸またはＣＳ（サメ起源、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ、ＰＡ製、カタログ番号２１３５５、ＭＷ＝５０ｋＤａ）を、ポリマー骨格として有し、カルボキシル基を、１グラムのＣＳ当たり、６グラムの１０ｋＤａのＭＰＥＧＡＭ（ＭＷ＝１０ｋＤａ、アミノ基を末端に有するＭＰＥＧ；Ｓｕｎｂｉｏ、Ｏｒｉｎｄａ、ＣＡ；カタログ番号Ｐ１ＡＭ−１０）と反応させてある。この組成物は、７超のｐＩを有するペプチド／タンパク質または小分子に結合することが可能である陰イオン基を含有する。さらに、残存するカルボキシル基をさらに修飾して、より多くのサルフェート基、スルホネート基またはホスフェート基を含有させることもできる。５０ＣＳＰＥＧ１０６Ｇを、以下に従って作製した；６ｇのＭＰＥＧＡＭ（ＭＷ＝１０ｋＤａ、アミノ基を末端に有するＭＰＥＧ；Ｓｕｎｂｉｏ、Ｏｒｉｎｄａ、ＣＡ；カタログ番号Ｐ１ＡＭ−１０）を、２０ｍｌの８０％エタノール中に溶解させ、５ｍｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳを、溶液に添加し、ｐＨを、１０Ｎ ＮａＯＨを使用してｐＨ７．８に調節した。アミノ基をＴＮＢＳにより測定し、アミノ基は、０．９１ミリモル存在することが見出された。別個の容器中で、１グラムのＣＳを、８ｍｌの水中に溶解させて、ＣＳ溶液を得、カルボキシル基を、１１５ｍｇのＮＨＳ（ＭＷ＝１１５．１４；１ミリモル）、続いて、５７５ｍｇのＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１；３ミリモル）を添加することによって活性化させた。２０分間の活性化の後に、これを、ＭＰＥＧＡＭに直接添加した。２時間後に、アミノ基が全部で０．２４ミリモル存在することが見出された。このことは、７４％のＭＰＥＧが組み込まれたことを示している。反応混合物を、１００ｍｌに濃縮し、１００ｋＤａのＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−１００−Ｅ−５Ａ）中で、水を１５回変えて洗浄した。５０ＣＳＰＥＧ１０６Ｇ試料を、ろ過滅菌し（０．２μｍのポリスルホン製フィルター、Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）、凍結乾燥して、２．４グラムを得た。１ｍｇ／ｍｌを分析し、これは、４．８±５μＭまたは４．８ナノモル／ｍｇのＮＨ２を含有する。１０ｍｇ／ｍｌの５０ＣＳＰＥＧ１０６Ｇを、分子ふるいクロマトグラフィーにより、ＴｏｓｏｈＧ４０００ＷＸＬを使用して分析し、これは、１０．７分（およそ２９．８ｎｍ）の保持時間を示した。
（実施例４）
５０ＣＳＰＥＧ１０６ＧＮＴＡの合成
得られた５０ＣＳＰＥＧ１０６Ｇ（上記を参照されたい）を、５０ＣＳＰＥＧ１０６ＧＮＴＡに、次いで、５０ＣＳＰＥＧ１０６ＧＮＴＡＳＯ（下記を参照されたい）に変換することができる。得られた５０ＣＳＰＥＧ１０６Ｇ（上記を参照されたい）を、以下に従って、５０ＣＳＰＥＧ１０６ＧＮＴＡに変換することができる：２．４グラムの５０ＣＳＰＥＧ１０６Ｇの残存するカルボキシル基を、ＫｏｂａｙａｈｉおよびＣｈｉｂａによるプロトコール（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９４年、２１９巻、１８９〜１９４頁）に従って測定する。５０ＣＳＰＥＧ１０６Ｇを合成するために、２．４ｇの５０ＣＳＰＥＧ１０６Ｇ（１当量のカルボキシル基を有する）を取り、２５ｍｌの２０ｍＭ ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）緩衝液、ｐＨ４．７中に溶解させ、５０ＣＳＰＥＧ１０６Ｇ溶液を得る。１当量のＮＨＳおよび２当量のＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１）を添加し、２０分間活性化させる。２０分後に、この活性化させた５０ＣＳＰＥＧ１０６Ｇ溶液を、２５ｍｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．４中の、１０当量のＮα，Ｎα−ビスカルボキシメチル−リシン（ＭＷ＝２６２Ｄａ）に添加し、一晩反応させる。反応混合物を、１００ｍｌに濃縮し、１００ｋＤａ−ＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−１００−Ｅ−５Ａ）中で、水を１５回変えて洗浄する。５０ＣＳＰＥＧ１０６ＧＮＴＡ生成物を、（０．２μｍのポリスルホン製フィルター、Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹを使用して）ろ過滅菌し、凍結乾燥する。得られた５０ＣＳＰＥＧ１０６ＧＮＴＡの１０ｍｇ／ｍｌ溶液を作製し、流体力学直径を、分子ふるいクロマトグラフィーにより、ＴｏｓｏｈＧ４０００ＷＸＬカラム（０．７９×３０ｃｍ）、および溶出溶媒としての、１５％アセトニトリルを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１１．９ｍＭホスフェート、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＰＯ４、ｐＨ７．４）を使用して、０．６ｍｌ／分の流速で決定する。保持時間は、およそ３０〜４０ｎｍの直径と一致するはずである。
（実施例５）
５０ＣＳＰＥＧ１０６ＧＮＴＡＳＯ、または５０ＣＳＰＥＧ１０６ＧＮＴＡＳＦ、または５０ＣＳＰＥＧ１０６ＧＮＴＡＰＯの合成
この構造は、５０ｋＤａのコンドロイチン硫酸を含み、カルボキシル基を、６グラムの１０ｋＤａのＭＰＥＧと反応させてあり、残存するカルボキシル基は、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）の誘導体であるビスカルボキシメチルリシンのイプシロンアミノ基に共有結合的に連結している。ＮＴＡを、さらに修飾して、それぞれがＮＴＡのカルボニル基につながった３つのサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基を含有させる。本質的に、それぞれのＮＴＡが、スペーサーとして作用して、３つのサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基のクラスターが、コンドロイチン硫酸骨格につながるのを可能にする。５０ＣＳＰＥＧ１０６ＧＮＴＡ（上記を参照されたい）を、硫酸化した（またはスルホン化したまたはリン酸化した）キャリアに変換することができ、このキャリアは、サルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基のクラスターを含有し、各クラスター中に、最高３つのサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基がある。こうするためには、２グラムの５０ＣＳＰＥＧ１０６ＧＮＴＡを取り、それを、５０ｍｌの１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ４．７）中に溶解させる。キャリアを、０．２８ｇのＮＨＳＳ（ＭＷ＝２１７．１４；１．３ミリモル）、続いて、０．５６ｇのＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１；２．９ミリモル）を添加することによって活性化させ、２０分間活性化させる。別個の容器中で、０．３７ｇの２−アミノエチルハイドロゲンサルフェート（ＡＥＳ；ＭＷ＝１４１；２．６ミリモル）または０．４５ｇのスルファニル酸（ＳＮＡ；ＭＷ＝１７３；２．６ミリモル）または０．３７ｇのＯ−ホスホリルエタノールアミン（ＯＰＥ；ＭＷ＝１４１；２．６ミリモル）を、２５ｍｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３、ｐＨを、ＮａＯＨを使用して７．３に保つ）中に溶解させ、開始アミノ基をＴＮＢＳにより測定する（Ｓｐａｄａｒｏら、１９７９年、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、９６巻、３１７〜３２９頁）。開始アミノ基は、ＡＥＳ（またはＳＮＡまたはＯＰＥ）の純度に応じて、およそ２．６ミリモルであるはずである。活性化させたキャリアを、ＡＥＳ（またはＳＮＡまたはＯＰＥ）溶液に添加し、溶液を一晩撹拌する。アミノ基を、ＴＮＢＳにより測定して、アミノ基の減少量を決定する。アミノ基の減少量は、組み込まれたサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基の量と同等である。硫酸化した（またはスルホン化したまたはリン酸化した）キャリアを、１００ｋＤａのＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−１００−Ｅ−５Ａ；ＧＥ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して、２０倍の体積の水により洗浄し、ろ過滅菌し（０．２μｍのポリスルホン製フィルター、Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）、凍結乾燥する（５０ＣＳＰＥＧ１０６ＧＮＴＡＳＯ、または５０ＣＳＰＥＧ１０６ＧＮＴＡＳＦ、または５０ＣＳＰＥＧ１０６ＧＮＴＡＰＯ）。この生成物は、骨格にぶら下がった１つのクラスター当たり最高３つのサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基のクラスターを有するであろう。
（実施例６）
１４ＨＰＰＥＧ１０４Ｇの合成
この組成物は、１４ｋＤａのヘパリン（（Ｈ４７８４−１Ｇ Ｓｉｇｍａ。ロット番号０４７Ｋ１１９５；ＭＷ １４ｋＤａ；１ｇが、０．８２７ミリモルのカルボキシル基を有する）を、ポリマー骨格として有し、カルボキシル基を、４グラムの１０ｋＤａのＭＰＥＧＡＭ（ＭＷ＝１０ｋＤａ、アミノ基を末端に有するＭＰＥＧ；Ｓｕｎｂｉｏ、Ｏｒｉｎｄａ、ＣＡ；カタログ番号Ｐ１ＡＭ−１０）と反応させてある。この組成物は、７超のｐＩを有するペプチド／タンパク質または小分子に結合することが可能である陰イオン基を含有する。さらに、残存するカルボキシル基をさらに修飾して、より多くのサルフェート基、スルホネート基またはホスフェート基を含有させることもできる。１４ＨＰＰＥＧ１０４Ｇを、以下に従って調製した：Ａ）１ｇのヘパリン（ＨＰ）のナトリウム塩（Ｈ４７８４−１Ｇ Ｓｉｇｍａ。ロット番号０４７Ｋ１１９５；１ｇのＨＰが、０．８２７ミリモルのカルボキシル基を有する）を、８ｍｌの水中に溶解させた（ＨＰ溶液）。Ｂ）別個の容器中で、４ｇのＭＰＥＧ−ＡＭ（ＭＷ＝１００００；０．４ミリモル；Ｓｕｎｂｉｏ；ロット番号Ｃ１ＡＭ−０１０−０５０５３；透明溶液）を、１５ｍｌの８０％エタノール中に溶解させ、ＨＰ溶液を、ＭＰＥＧ−ＡＭに直接添加した。Ｃ）反応物を、２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ＝４．７に加え、水を添加して、沈殿物を解消した。反応を、８０ｍｇのＮＨＳ（ＭＷ＝１１５．１４；０．７ミリモル）および３８０ｍｇのＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１；２ミリモル）を添加することによって開始し、２０分間撹拌した。２０分後に、４ｍｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳを溶液に添加し、ｐＨを、１０Ｎ ＮａＯＨを１滴ずつ用いてｐＨ７．８にゆっくり調節し、一晩反応させた。一定分量を取って、ＭＰＥＧ−ＡＭに由来する残存するアミノ基を決定し、組み込まれたＭＰＥＧを決定する。アミノ基は全部で０．０１１ミリモル存在することが見出された。このことは、全てのＭＰＥＧが組み込まれたことを示している（１４ＨＰＰＥＧ１０４Ｇ）。Ｄ）反応混合物を、１００ｍｌに濃縮し、１００，０００のＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−１００−Ｅ−５Ａ）中で、水を２０回変えて洗浄し、ろ過滅菌し（０．２μｍのポリスルホン製フィルター、Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）、凍結乾燥して、２．４グラムを得た。１ｍｇ／ｍｌを分析し、これは、０±５μＭまたは０ナノモル／ｍｇのＮＨ２を含有する。Ｅ）ＴｏｓｏｈＧ４０００ＷＸＬカラム（０．７９×３０ｃｍ）を使用して、１５％アセトニトリルを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１１．９ｍＭホスフェート、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＰＯ４、ｐＨ７．４）を用いて、０．６ｍｌ／分の流速で溶出する分子ふるいクロマトグラフィーは、１２．７分（およそ１３．８ｎｍ）の保持時間を示した。
（実施例７）
１４ＨＰＰＥＧ１０４ＧＮＴＡの合成
得られた１４ＨＰＰＥＧ１０４Ｇ（上記を参照されたい）を、１４ＨＰＰＥＧ１０４ＧＮＴＡ、次いで、１４ＨＰＰＥＧ１０４ＧＮＴＡＳＯ、１４ＨＰＰＥＧ１０４ＧＮＴＡＳＦ、または１４ＨＰＰＥＧ１０４ＧＮＴＡＰＯに変換することができる（下記を参照されたい）。得られた１４ＨＰＰＥＧ１０４Ｇ（上記を参照されたい）を、以下に従って、１４ＨＰＰＥＧ１０４ＧＮＴＡに変換することができる：２．４グラムの１４ＨＰＰＥＧ１０４Ｇの残存するカルボキシル基を、ＫｏｂａｙａｈｉおよびＣｈｉｂａによるプロトコール（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９４年、２１９巻、１８９〜１９４頁）に従って測定する。１４ＨＰＰＥＧ１０４ＧＮＴＡを合成するために、２．４ｇの１４ＨＰＰＥＧ１０４Ｇカルボキシル基を取り、２５ｍｌの２０ｍＭ ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）緩衝液、ｐＨ４．７中に溶解させ、１４ＨＰＰＥＧ１０４Ｇ溶液を得る。１当量のＮＨＳおよび２当量のＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１）を添加し、２０分間活性化させる。２０分後に、この活性化させた１４ＨＰＰＥＧ１０４Ｇ溶液を、２５ｍｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．４中の、１０当量のＮα，Ｎα−ビスカルボキシメチル−リシン（ＭＷ＝２６２Ｄａ）に添加し、一晩反応させる。残存するアミノ基を測定して、ＮＴＡの組込みの程度を決定する。反応混合物を、１００ｍｌに濃縮し、１００ｋＤａ−ＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−１００−Ｅ−５Ａ）中で、水を１５回変えて洗浄する。１４ＨＰＰＥＧ１０４ＧＮＴＡ生成物を、（０．２μｍのポリスルホン製フィルター、Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹを使用して）ろ過滅菌し、凍結乾燥する。得られた１４ＨＰＰＥＧ１０４ＧＮＴＡの１０ｍｇ／ｍｌ溶液を作製し、流体力学直径を、分子ふるいクロマトグラフィーにより、ＴｏｓｏｈＧ４０００ＷＸＬカラム（０．７９×３０ｃｍ）、および溶出溶媒としての、１５％アセトニトリルを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１１．９ｍＭホスフェート、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＰＯ４、ｐＨ７．４）を使用して、０．６ｍｌ／分の流速で決定する。保持時間は、およそ１５〜２０ｎｍの直径と一致するはずである。
（実施例８）
１４ＨＰＰＥＧ１０４ＧＮＴＡＳＯ、または１４ＨＰＰＥＧ１０４ＧＮＴＡＳＦ、または１４ＨＰＰＥＧ１０４ＧＮＴＡＰＯの合成
この構造は、１４ｋＤａのヘパリンを含み、この場合、２７％の理論上のカルボキシル基が、１０ｋＤａのＭＰＥＧに共有結合的に連結しており、残存するカルボキシル基は、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）の誘導体であるビスカルボキシメチルリシンのイプシロンアミノ基に共有結合的に連結している。ＮＴＡをさらに修飾して、それぞれがＮＴＡのカルボニル基につながった３つのサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基を含有させる。本質的に、それぞれのＮＴＡが、スペーサーとして作用して、３つのサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基のクラスターが、ヘパリン骨格につながるのを可能にする（また、その他の骨格も使用することができる）。こうするためには、２グラムの１４ＨＰＰＥＧ１０４ＧＮＴＡを取り、それを、５０ｍｌの１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ４．７）中に溶解させる。キャリアを、０．２８ｇのＮＨＳＳ（ＭＷ＝２１７．１４；１．３ミリモル）、続いて、０．５６ｇのＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１；２．９ミリモル）を添加することによって活性化させ、２０分間活性化させる。別個の容器中で、０．３７ｇの２−アミノエチルハイドロゲンサルフェート（ＡＥＳ；ＭＷ＝１４１；２．６ミリモル）または０．４５ｇのスルファニル酸（ＳＮＡ；ＭＷ＝１７３；２．６ミリモル）または０．３７ｇのＯ−ホスホリルエタノールアミン（ＯＰＥ；ＭＷ＝１４１；２．６ミリモル）を、２５ｍｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３、ｐＨを、ＮａＯＨを使用して７．３に保つ）中に溶解させ、開始アミノ基をＴＮＢＳにより測定する（Ｓｐａｄａｒｏら、１９７９年、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、９６巻、３１７〜３２９頁）。開始アミノ基は、ＡＥＳ（またはＳＮＡまたはＯＰＥ）の純度に応じて、およそ２．６ミリモルであるはずである。２０分後、活性化させたキャリアを、ＡＥＳ（またはＳＮＡまたはＯＰＥ）溶液に添加する。一晩後、反応物は、ＴＮＢＳによりアミノ基を測定して、アミノ基の減少量を決定する。アミノ基の減少量は、組み込まれたサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基の量と同等である。硫酸化した（またはスルホン化したまたはリン酸化した）キャリアを、１００ｋＤａのＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−１００−Ｅ−５Ａ；ＧＥ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して、２０倍の体積の水により洗浄し、ろ過滅菌し（０．２μｍのポリスルホン製フィルター、Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）、凍結乾燥する（１４ＨＰＰＥＧ１０４ＧＮＴＡＳＯ、または１４ＨＰＰＥＧ１０４ＧＮＴＡＳＦ、または１４ＨＰＰＥＧ１０４ＧＮＴＡＰＯ）。この生成物は、骨格にぶら下がった１つのクラスター当たり最高３つのサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基のクラスターを有するであろう。
（実施例９）
１０００ＨＹＰＥＧ１０３５ＮＴＡの合成
これを、本発明の陰イオンコア組成物のうちのいくつかの合成のための開始材料として使用する。この組成物は、ヒアルロン酸またはＨＹ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、Ｓｔ Ｌｕｉｓ、Ｍｏ．、カタログ番号５３７４７、ＭＷ＝１０００ｋＤａ）を、ポリマー骨格として有し、３５％の理論上のカルボキシル基が、１０ｋＤａのＭＰＥＧＡＭ（ＭＷ＝１０ｋＤａ、アミノ基を末端に有するＭＰＥＧ；Ｓｕｎｂｉｏ、Ｏｒｉｎｄａ、ＣＡ；カタログ番号Ｐ１ＡＭ−１０）で置き換わっており、残存するカルボキシル基は、ニトリロ三酢酸で塞がれている。こうするためには、ヒアルロン酸（ｈｙｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）を、より多くのカルボキシル基を付加することなく使用してもよく、または追加のカルボキシル基を付加してもよい。追加のカルボキシル基を付加するためには、ヒアルロナン（ｈｙｌｕｒｏｎａｎ）中のヒドロキシル基を、Ｔｉｊｓｅｎらによるプロトコール（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、２００１年、４５巻；２１９〜２２６頁）に従ってカルボキシ基に変換することができる。Ｔｉｊｓｅｎらのプロトコールの終わりには、カルボキシメチル化したヒアルロナン（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｅｌａｔｅｄ
ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ）を、３ｋＤａ−ＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−３−Ｅ−５Ａ）中で、水を１５回変えて洗浄する。得られた生成物を、（０．２μｍのポリスルホン製フィルター、Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を使用してろ過滅菌し、凍結乾燥して、余分なカルボキシル基を有するヒアルロナンを得る。１０００ＨＹＰＥＧ１０３５ＮＴＡの合成の前に、１．０ｇのＨＹ（これは、追加のカルボキシル基を有さないＨＹ、または追加のカルボキシル基を有するように修飾したＨＹであり得るであろう）の開始カルボキシル基（１当量）を、ＫｏｂａｙａｈｉおよびＣｈｉｂａによるプロトコール（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９４年、２１９巻、１８９〜１９４頁）に従って測定する。１０００ＨＹＰＥＧ１０３５ＮＴＡを合成するためには、１．０ｇのＨＹ（１当量のカルボキシル基を有する）を取り、２５ｍｌの２０ｍＭ ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）緩衝液、ｐＨ４．７中に溶解させて、ＨＹ溶液を得る。０．３５当量のＭＰＥＧＡＭ（ＭＷ＝１０ｋＤａ、アミノ基を末端に有するＭＰＥＧ；Ｓｕｎｂｉｏ、Ｏｒｉｎｄａ、ＣＡ；カタログ番号Ｐ１ＡＭ−１０）を、２０ｍｌの８０％エタノール中に溶解させ、ＨＹ溶液に添加して、ＨＹＰＥＧ溶液を作製する。ＨＹＰＥＧ溶液に、１当量のＮＨＳ（ＭＷ＝１１５．１４）および１当量のＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１）溶液を、撹拌しながら添加する。ｐＨを、６Ｎ ＨＣｌを用いてｐＨ４．７〜５．０に２０分間維持する。２０分間の活性化の後に、ｐＨを、１０ｍｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４を添加することによって７．８に調節し、さらに、ｐＨを、１０Ｎ ＮａＯＨを１滴ずつ用いて、７．８に達するように調節する。反応を２時間進行させ、ＭＰＥＧＡＭの残存するアミノ基を、ＴＮＢＳにより測定すると、残存するアミノ基は存在しないはずであり、このことは、０．３５当量のアミノ基全てを、使い切り、ＨＹにコンジュゲートさせたことを示している。中に残存するアミノ基が存在する場合には、１当量のＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１）を添加し、一晩反応させて、１０００ＨＹＰＥＧ１０３５を形成する。得られた１０００ＨＹＰＥＧ１０３５溶液の一定分量を取り、流体力学直径を、分子ふるいクロマトグラフィーにより、ＴｏｓｏｈＧ４０００ＷＸＬカラム（０．７９×３０ｃｍ）および溶出溶媒としての、１５％アセトニトリルを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１１．９ｍＭホスフェート、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＰＯ４、ｐＨ７．４）を使用して、０．６ｍｌ／分の流速で決定する。保持時間は、およそ３０〜５０ｎｍの直径と一致するはずである。ｐＨを、６Ｎ ＨＣｌを用いて下げて５に調節し、１．５当量のＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１）を添加し、２０分間活性化させる。２０分後に、この活性化させた１０００ＨＹＰＥＧ１０３５溶液を、２５ｍｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．４中の、１０当量のＮα，Ｎα−ビスカルボキシメチル−リシン（ＭＷ＝２６２Ｄａ）に添加し、一晩反応させる。反応混合物を、１００ｍｌに濃縮し、１００ｋＤａ−ＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−１００−Ｅ−５Ａ）中で、水を１５回変えて洗浄する。１０００ＨＹＰＥＧ１０３５ＮＴＡ生成物を、（０．２μｍのポリスルホン製フィルター、Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹを使用して）ろ過滅菌し、凍結乾燥する。得られた１０００ＨＹＰＥＧ１０３５ＮＴＡの１０ｍｇ／ｍｌ溶液を作製し、流体力学直径を、分子ふるいクロマトグラフィーにより、ＴｏｓｏｈＧ４０００ＷＸＬカラム（０．７９×３０ｃｍ）、および溶出溶媒としての、１５％アセトニトリルを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１１．９ｍＭ ホスフェート、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＰＯ４、ｐＨ７．４）を使用して、０．６ｍｌ／分の流速で決定する。保持時間は、およそ３０〜７０ｎｍの直径と一致するはずである。
（実施例１０）
１０００ＨＹＰＥＧ１０３５ＮＴＡＳＯ、または１０００ＨＹＰＥＧ１０３５ＮＴＡＳＦ、または１０００ＨＹＰＥＧ１０３５ＮＴＡＰＯの合成
この構造は、１０００ｋＤａのヒアルロン酸（ｈｙｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）を含み、この場合、３５％の理論上のカルボキシル基が、１０ｋＤａのＭＰＥＧに共有結合的に連結しており、残存するカルボキシル基は、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）の誘導体であるビスカルボキシメチルリシンのイプシロンアミノ基に共有結合的に連結している。ＮＴＡをさらに修飾して、それぞれがＮＴＡのカルボニル基につながった３つのサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基を含有させる。本質的に、それぞれのＮＴＡが、スペーサーとして作用して、３つのサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基のクラスターが、ヒアルロン酸骨格につながるのを可能にする（また、その他の骨格も使用することができる）。１０００ＨＹＰＥＧ１０３５ＮＴＡ（上記を参照されたい）を、各クラスター中に最高３つのサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基を有するサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）を含有するように変換することができる。こうするためには、２グラムの１０００ＨＹＰＥＧ１０３５ＮＴＡを取り、それを、５０ｍｌの１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ４．７）中に溶解させる。キャリアを、０．２８ｇのＮＨＳＳ（ＭＷ＝２１７．１４；１．３ミリモル）、続いて、０．５６ｇのＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１；２．９ミリモル）を添加することによって活性化させ、２０分間活性化させる。別個の容器中で、０．３７ｇの２−アミノエチルハイドロゲンサルフェート（ＡＥＳ；ＭＷ＝１４１；２．６ミリモル）または０．４５ｇのスルファニル酸（ＳＮＡ；ＭＷ＝１７３；２．６ミリモル）または０．３７ｇのＯ−ホスホリルエタノールアミン（ＯＰＥ；ＭＷ＝１４１；２．６ミリモル）を、２５ｍｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３、ｐＨを、ＮａＯＨを使用して７．３に保つ）中に溶解させ、開始アミノ基をＴＮＢＳにより測定する（Ｓｐａｄａｒｏら、１９７９年、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、９６巻、３１７〜３２９頁）。開始アミノ基は、ＡＥＳ（またはＳＮＡまたはＯＰＥ）の純度に応じて、およそ２．６ミリモルであるはずである。２０分後、活性化させたキャリアを、ＡＥＳ（またはＳＮＡまたはＯＰＥ）溶液に添加する。一晩後、反応物は、ＴＮＢＳによりアミノ基を測定して、アミノ基の減少量を決定する。アミノ基の減少量は、組み込まれたサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基の量と同等である。硫酸化した（またはスルホン化したまたはリン酸化した）キャリアを、１００ｋＤａのＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−１００−Ｅ−５Ａ；ＧＥ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して、２０倍の体積の水により洗浄し、ろ過滅菌し（０．２μｍのポリスルホン製フィルター、Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）、凍結乾燥する（１０００ＨＹＰＥＧ１０３５ＮＴＡＳＯ、または１０００ＨＹＰＥＧ１０３５ＮＴＡＳＦ、または１０００ＨＹＰＥＧ１０３５ＮＴＡＰＯ）。この生成物は、骨格にぶら下がった１つのクラスター当たり最高３つのサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基のクラスターを有するであろう。
（実施例１１）
６０ＰＧＡＰＥＧ１０３５ＮＴＡの合成
これを、本発明の陰イオンコア組成物のうちのいくつかの合成のための開始材料として使用する。この組成物は、ペクチンまたはポリガラクツロン酸（ポリペクチン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍｐｏｌｙｐｅｃｔａｔｅ）；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、Ｓｔ Ｌｕｉｓ、Ｍｏ．、カタログ番号ｐ３８８９、ＭＷ＝６０ｋＤａ）を、ポリマー骨格として有し、３５％の理論上のカルボキシル基が、１０ｋＤａのＭＰＥＧＡＭ（ＭＷ＝１０ｋＤａ、ＭＰＥＧＡＭは、アミノ基を末端に有する；Ｓｕｎｂｉｏ、Ｏｒｉｎｄａ、ＣＡ；カタログ番号Ｐ１ＡＭ−１０）で置き換わっており、残存するカルボキシル基は、ニトリロ三酢酸で塞がれている。６０ＰＧＡＰＥＧ１０３５ＮＴＡの、６０ＰＧＡＰＥＧ１０３５ＮＴＡＳＯ、６０ＰＧＡＰＥＧ１０３５ＮＴＡＳＦ、および６０ＰＧＡＰＥＧ１０３５ＮＴＡＰＯへの修飾は、その他のＮＴＡを含有する組成物についての上記の記載に従い、ＳＯ、ＳＦおよびＰＯは、ＮＴＡのカルボニル基に共有結合的に連結しているサルフェート、スルホネートおよびホスフェートである。６０ＰＧＡＰＥＧ１０３５ＮＴＡを作製するためには、開始ペクチンを、より多くのカルボキシル基を付加することなく使用してもよく、または追加のカルボキシル基を付加してもよい。追加のカルボキシル基を付加するためには、ヒアルロナン中のヒドロキシル基を、Ｔｉｊｓｅｎらによるプロトコール（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、２００１年、４５巻；２１９〜２２６頁）に従ってカルボキシ基に変換することができる。Ｔｉｊｓｅｎらのプロトコールの終わりには、カルボキシメチル化したペクチンを、３ｋＤａ−ＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−３−Ｅ−５Ａ）中で、水を１５回変えて洗浄する。得られた生成物（ＰＭＡ）を、（０．２μｍのポリスルホン製フィルター、Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を使用してろ過滅菌し、凍結乾燥して、余分なカルボキシル基を有するペクチンを得る。時には、ペクチンは、顕著なパーセントの、メチル基でブロックされているカルボキシル基を有するであろう。これを、酸を使用して除去して、ペクチンのカルボキシル基の全てを露出させることができる。手短に述べると、ＣｏｎｓｔｅｎｌａおよびＬａｚａｎｏ（Ｌａｔｉｎ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００３年、３３巻、９１〜９６頁）に従って、２ｇのペクチンを、１００の水中に溶解させ、ｐＨを、濃ＨＣｌを使用して０．５に調節し、８０℃に２時間保つ。ＮａＯＨを用いて中和し、３ｋＤａ−ＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−３−Ｅ−５Ａ）中で、水を１５回変えて洗浄する。得られた生成物を、（０．２μｍのポリスルホン製フィルター、Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を使用してろ過滅菌し、凍結乾燥する。このペクチンは、上記の記載に従って処理して、カルボキシル基の量を増加させることができる。６０ＰＧＡＰＥＧ１０３５ＮＴＡを、上記のペクチン（ＰＧＡ）、すなわち、未処理のペクチン、またはカルボキシル基を増加させるために処理したペクチンのうちのいずれかを使用して作製することができる。６０ＰＧＡＰＥＧ１０３５ＮＴＡの合成の前に、１．０ｇのＰＧＡ（これは、追加のカルボキシル基を有さないＰＧＡ、または追加のカルボキシル基を有するように修飾したＰＧＡであり得るであろう）の開始カルボキシル基（１当量）を、ＫｏｂａｙａｈｉおよびＣｈｉｂａによるプロトコール（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９４年、２１９巻、１８９〜１９４頁）に従って測定する。６０ＰＧＡＰＥＧ１０３５ＮＴＡを合成するためには、１．０ｇのＰＧＡ（１当量のカルボキシル基を有する）を取り、５０ｍｌの２０ｍＭ ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）緩衝液、ｐＨ４．７中に溶解させて、ＰＧＡ溶液を得る。０．３５当量のＭＰＥＧＡＭ（ＭＷ＝１０ｋＤａ、アミノ基を末端に有するＭＰＥＧ；Ｓｕｎｂｉｏ、Ｏｒｉｎｄａ、ＣＡ；カタログ番号Ｐ１ＡＭ−１０）を、２０ｍｌの８０％エタノール中に溶解させ、ＰＧＡ溶液に添加して、ＰＧＡＰＥＧ溶液を作製する。ＰＧＡＰＥＧ溶液に、１当量のＮＨＳ（ＭＷ＝１１５．１４）および１当量のＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１）溶液を、撹拌しながら添加する。ｐＨを、６Ｎ ＨＣｌを用いてｐＨ４．７〜５．０に２０分間維持する。２０分間の活性化の後に、ｐＨを、１０ｍｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４を添加することによって７．８に調節し、さらに、ｐＨを、１０Ｎ ＮａＯＨを１滴ずつ用いて、７．８に調節する。反応を２時間進行させ、ＭＰＥＧＡＭの残存するアミノ基を、ＴＮＢＳにより測定すると、残存するアミノ基は存在しないはずであり、このことは、０．３５当量のアミノ基全てを、使い切り、ＰＧＡにコンジュゲートさせたことを示している。ＭＰＥＧＡＭ中に残存するアミノ基が存在する場合には、ｐＨを、６Ｎ ＨＣｌを用いて５に調節し、１当量のＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１）を添加し、２０分後に、ｐＨを調節して７．８に戻し、一晩反応させて、６０ＰＧＡＰＥＧ１０３５を形成させる。得られた６０ＰＧＡＰＥＧ１０３５溶液の一定分量を取り、流体力学直径を、分子ふるいクロマトグラフィーにより、ＴｏｓｏｈＧ４０００ＷＸＬカラム（０．７９×３０ｃｍ）および溶出溶媒としての、１５％アセトニトリルを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１１．９ｍＭホスフェート、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＰＯ４、ｐＨ７．４）を使用して、０．６ｍｌ／分の流速で決定する。保持時間は、およそ１８〜３０ｎｍの直径と一致するはずである。ｐＨを、６Ｎ ＨＣｌを用いて下げて５に調節し、１．５当量のＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１）を添加し、２０分間活性化させる。２０分後に、この活性化させた６０ＰＧＡＰＥＧ１０３５溶液を、２５ｍｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．４中の、１０当量のＮα，Ｎα−ビスカルボキシメチル−リシン（ＭＷ＝２６２Ｄａ）に添加し、一晩反応させる。反応混合物を、１００ｍｌに濃縮し、１００ｋＤａ−ＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−１００−Ｅ−５Ａ）中で、水を１５回変えて洗浄する。６０ＰＧＡＰＥＧ１０３５ＮＴＡ生成物を、（０．２μｍのポリスルホン製フィルター、Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹを使用して）ろ過滅菌し、凍結乾燥する。得られた６０ＰＧＡＰＥＧ１０３５ＮＴＡの１０ｍｇ／ｍｌ溶液を作製し、流体力学直径を、分子ふるいクロマトグラフィーにより、ＴｏｓｏｈＧ４０００ＷＸＬカラム（０．７９×３０ｃｍ）、および溶出溶媒としての、１５％アセトニトリルを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１１．９ｍＭ ホスフェート、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＰＯ４、ｐＨ７．４）を使用して、０．６ｍｌ／分の流速で決定する。保持時間は、およそ２０〜４０ｎｍの直径と一致するはずである。
（実施例１２）
３０ＣＨＩＰＥＧ１０３５ＤＴＰＡの合成
これを、本発明の陰イオンコア組成物のうちのいくつかの合成のための開始材料として使用する。この組成物は、キトサン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、Ｓｔ Ｌｕｉｓ、Ｍｏ．、カタログ番号４４８８６９、ＭＷ＝３５ｋＤａ）を、ポリマー骨格として有し、３５％の理論上のアミノ基が、１０ｋＤａのＭＰＥＧＣ（ＭＷ＝１０ｋＤａ；カルボキシル基を末端に有するメトキシＰＥＧ、Ｌｙｓａｎ ｂｉｏ；Ａｒａｂ、ＡＬ製）で塞がれており、残存するアミノ基は、ジエチレンジアミン五酢酸（ｄｉｅｔｈｙｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）（ＤＴＰＡ）で塞がれている。３０ＣＨＩＰＥＧ１０３５ＤＴＰＡの、３０ＣＨＩＰＥＧ１０３５ＤＴＰＡＳＯ、３０ＣＨＩＰＥＧ１０３５ＤＴＰＡＳＦ、および３０ＣＨＩＰＥＧ１０３５ＤＴＰＡＰＯへの修飾は、その他のカルボキシルを含有する組成物についての上記の記載に従い、ＳＯ、ＳＦおよびＰＯは、ＤＴＰＡのカルボニル基に共有結合的に連結しているサルフェート、スルホネートおよびホスフェートである。３０ＣＨＩＰＥＧ１０３５ＤＴＰＡを合成するためには、１．０ｇのキトサンの塩酸塩（ＴＮＢＳにより測定すると、１当量のアミノ基を有する）を取り、２５ｍｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．４（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）中に溶解させて、３０ＣＨＩ溶液を得る。別個の容器中で、０．３５当量のＭＰＥＧＣ（ＭＷ＝１０ｋＤａ；カルボキシル基を末端に有するメトキシＰＥＧ、Ｌｙｓａｎ ｂｉｏ；Ａｒａｂ、ＡＬ製）を、２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ＝４．７（６０ｍｌに添加した１２００μｌの１Ｍ ＭＥＳ）を有する６０ｍｌの８０％エタノール中に溶解させ、０．５当量のＮＨＳ（ＭＷ＝１１５．１４）を添加し、溶解したら、１当量のＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１；１０．４３ミリモル）を撹拌しながら添加し、活性化を２０分間進行させる。活性化させたＭＰＥＧＣを、３０ＣＨＩ溶液に直接添加し、反応を２時間発生させ、アミノ基を、ＴＮＢＳにより測定して、アミノ基の３５％の飽和を保証し、そうでなければ、活性化させたＭＰＥＧＣのさらなる適切な量を添加する。これが、３０ＣＨＩＰＥＧ１０３５溶液である。分子ふるいクロマトグラフィーを、ＴｏｓｏｈＧ４０００ＷＸＬカラム（０．７９×３０ｃｍ）を使用して実施し、１５％アセトニトリルを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１１．９ｍＭホスフェート、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＰＯ４、ｐＨ７．４）を用いて、０．６ｍｌ／分の流速で溶出する。保持時間は、およそ１４〜１７ｎｍの分子直径と一致するはずである。５当量のＤＴＰＡ二無水物（ＭＷ＝３５７；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ Ｃｏ．，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ。カタログ番号Ｄ６１４８）、続いて、２００μＬのＴＥＡを添加する。反応物を、１０Ｎ ＮａＯＨを用いてゆっくり滴定してｐＨ７．１とし、４時間撹拌する。ＴＮＢＳ反応を使用して、アミノ基が残存しないことから反応が完全であること、および３０ＣＨＩＰＥＧ１０３５ＤＴＰＡ生成物が作製されたことを確認する。分子ふるいクロマトグラフィーを、ＴｏｓｏｈＧ４０００ＷＸＬカラム（０．７９×３０ｃｍ）を使用して実施し、１５％アセトニトリルを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１１．９ｍＭホスフェート、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＰＯ４、ｐＨ７．４）を用いて、０．６ｍｌ／分の流速で溶出する。保持時間は、１７〜２１ｎｍの分子直径と一致するはずである。得られた３０ＣＨＩＰＥＧ１０３５ＤＴＰＡを、１００，０００のＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−１００−Ｅ−５Ａ；ＧＥ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して、１５倍の体積の水を用いて洗浄し、凍結乾燥する。
（実施例１３）
４０ＤＸＰＥＧ１０３５ＮＴＡの合成
これを、本発明の陰イオンコア組成物のうちのいくつかの合成のための開始材料として使用する。この組成物は、デキストランまたはポリグルコース（アルファ１−４の分枝を有するアルファ１−６；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、Ｓｔ Ｌｕｉｓ、Ｍｏ．、カタログ番号３１３８９、ＭＷ＝４０ｋＤａ）を、ポリマー骨格として有し、３５％のヒドロキシル基が、１０ｋＤａのＭＰＥＧＡＭ（ＭＷ＝１０ｋＤａ、ＭＰＥＧＡＭは、アミノ基を末端に有する；Ｓｕｎｂｉｏ、Ｏｒｉｎｄａ、ＣＡ；カタログ番号Ｐ１ＡＭ−１０）で誘導体化されており、残存するヒドロキシル基は、ニトリロ三酢酸で塞がれている。４０ＤＸＰＥＧ１０３５ＮＴＡの、４０ＤＸＰＥＧ１０３５ＮＴＡＳＯ、４０ＤＸＰＥＧ１０３５ＮＴＡＳＦ、および４０ＤＸＰＥＧ１０３５ＮＴＡＰＯへの修飾は、その他のカルボキシルを含有する組成物についての上記の記載に従い、ＳＯ、ＳＦおよびＰＯは、ＮＴＡのカルボニル基に共有結合的に連結しているサルフェート、スルホネートおよびホスフェートである。４０ＤＸＰＥＧ１０３５ＮＴＡを作製するためには、開始デキストランのヒドロキシル基を、カルボキシル基に変換する。カルボキシル基を付加するためには、デキストラン中のヒドロキシル基を、Ｔｉｊｓｅｎらによるプロトコール（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、２００１年、４５巻；２１９〜２２６頁）に従って、カルボキシ基に変換することができる。手短に述べると、１０グラムのデキストランを、１００ｍｌの９０％プロパノール／水中に懸濁させ、４グラムのＮａＯＨペレットを添加し、４０℃で一晩撹拌する。翌日、Ｔｉｊｓｅｎらの概要（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、２００１年、４５巻；２１９〜２２６頁）に従って、１０グラムのモノクロロ酢酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍｍｏｎｏｃｈｌｏｒｏａｃｅｔａｔｅ）（Ｓｉｇｍａ
Ｃｈｅｍ Ｃｏ．、Ｓｔ Ｌｕｉｓ、ＭＯ。カタログ番号２９１７７３）を添加する。反応の終わりには、カルボキシメチル化したデキストランを、３ｋＤａ−ＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−３−Ｅ−５Ａ）中で、水を１５回変えて洗浄する。得られた生成物（ＤＸ）を、（０．２μｍのポリスルホン製フィルター、Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を使用してろ過滅菌し、凍結乾燥して、カルボキシメチル化したデキストランを得る。４０ＤＸＰＥＧ１０３５ＮＴＡの合成の前に、１．０ｇのＤＸの開始カルボキシル基（１当量）を、ＫｏｂａｙａｈｉおよびＣｈｉｂａによるプロトコール（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９４年、２１９巻、１８９〜１９４頁）に従って測定する。４０ＤＸＰＥＧ１０３５ＮＴＡを合成するためには、１．０ｇのＤＸ（１当量のカルボキシル基を有する）を取り、５０ｍｌの２０ｍＭ ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）緩衝液、ｐＨ４．７中に溶解させて、ＤＸ溶液を得る。０．３５当量のＭＰＥＧＡＭ（ＭＷ＝１０ｋＤａ、アミノ基を末端に有するＭＰＥＧ；Ｓｕｎｂｉｏ、Ｏｒｉｎｄａ、ＣＡ；カタログ番号Ｐ１ＡＭ−１０）を、２０ｍｌの８０％エタノール中に溶解させ、ＤＸ溶液に添加して、ＤＸＰＥＧ溶液を作製する。ＤＸＰＥＧ溶液に、１当量のＮＨＳ（ＭＷ＝１１５．１４）および１当量のＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１）溶液を、撹拌しながら添加する。ｐＨを、６Ｎ ＨＣｌを用いて、ｐＨ４．７〜５．０に２０分間維持する。２０分間の活性化の後に、ｐＨを、１０ｍｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４を添加することによって７．１に調節する。ｐＨが７．１を下回る場合には、ｐＨを、１０Ｎ ＮａＯＨを１滴ずつ用いて７．１に達するように調節する。反応を２時間進行させ、ＭＰＥＧＡＭの残存するアミノ基を、ＴＮＢＳにより測定すると、残存するアミノ基は存在しないはずであり、このことは、０．３５当量のアミノ基全てを、使い切り、ＰＧＡにコンジュゲートさせたことを示している。ＭＰＥＧＡＭ中に残存するアミノ基が存在する場合には、ｐＨを、６Ｎ ＨＣｌを用いて５に調節し、１当量のＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１）を添加し、２０分後に、ｐＨを調節して７．１に戻し、一晩反応させて、４０ＤＸＰＥＧ１０３５を形成する。得られた４０ＤＸＰＥＧ１０３５溶液の一定分量を取り、流体力学直径を、分子ふるいクロマトグラフィーにより、ＴｏｓｏｈＧ４０００ＷＸＬカラム（０．７９×３０ｃｍ）および溶出溶媒としての、１５％アセトニトリルを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１１．９ｍＭホスフェート、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＰＯ４、ｐＨ７．４）を使用して、０．６ｍｌ／分の流速で決定する。保持時間は、およそ１４〜２０ｎｍの直径と一致するはずである。ｐＨを、６Ｎ ＨＣｌを用いて下げて５に調節し、１．５当量のＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１）を添加し、２０分間活性化させる。２０分後に、この活性化させた４０ＤＸＰＥＧ１０３５溶液を、２５ｍｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．４中の、１０当量のＮα，Ｎα−ビスカルボキシメチル−リシン（ＭＷ＝２６２Ｄａ）に添加し、一晩反応させる。４０ＤＸＰＥＧ１０３５ＮＴＡを含有する反応混合物を、１００ｍｌに濃縮し、１００ｋＤａ−ＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−１００−Ｅ−５Ａ）中で、水を１５回変えて洗浄する。４０ＤＸＰＥＧ１０３５ＮＴＡ生成物を、（０．２μｍのポリスルホン製フィルター、Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹを使用して）ろ過滅菌し、凍結乾燥する。得られた４０ＤＸＰＥＧ１０３５ＮＴＡの１０ｍｇ／ｍｌ溶液を作製し、流体力学直径を、分子ふるいクロマトグラフィーにより、ＴｏｓｏｈＧ４０００ＷＸＬカラム（０．７９×３０ｃｍ）を使用して、１５％アセトニトリルを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１１．９ｍＭホスフェート、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＰＯ４、ｐＨ７．４）を用いて、０．６ｍｌ／分の流速で溶出して決定する。保持時間は、およそ１７〜２５ｎｍの直径と一致するはずである。
ポリアミノ酸（ｐｏｌｙａｍｉｎｏａｃｉｄ）に由来するポリマー骨格を有する組成物の実施例
（実施例１４）
２０ＰＬＰＥＧ１０３０ＤＴＰＡＳＯ、または２０ＰＬＰＥＧ１０３０ＤＴＰＡＳＦ、または２０ＰＬＰＥＧ１０３０ＤＴＰＡＰＯの合成
この構造は、２０ｋＤａのポリリシンを含み、この場合、３０％のイプシロンアミノ基が、１０ｋＤａのＭＰＥＧに共有結合的に連結しており、残存するアミノ基は、修飾してジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）のカルボニル基に共有結合的に連結するサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基を含有させたＤＴＰＡに共有結合的に連結している。本質的に、それぞれのＤＴＰＡが、スペーサーとして作用して、４つのサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基のクラスターが、ポリリシン骨格につながるのを可能にする（また、その他の骨格も使用することができる）。これを、以下に従って合成した：Ａ）１ｇｍの、２０ｋＤａのポリリシン（２０ＰＬ；製品番号Ｑ４９２６、ＳＡＦＣ製、ロット番号０１８Ｋ７７７５；ＤＰ＝１２６）を、６．５ｍｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ中に溶解させた。アミノ基をＴＮＢＳにより測定し、アミノ基は、２．４ミリモルＮＨ２／ｇ存在することが見出された。これが、２０ＰＬ溶液である。Ｂ）別個の容器中で、５ｇのＭＰＥＧＣ（メトキシポリエチレングリコールカルボキシメチル；ＭＷ＝１０ｋＤａ；０．５ミリモル；Ｌａｙｓａｎ Ｂｉｏ；ロット番号１０８−１０８）を、１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ＝４．７を有する１２．５ｍｌの８０％エタノール中に、１２０ｍｇのＮＨＳ（ＭＷ＝１１５．１４；１．０ミリモル）と共に溶解させた。溶解したら、３２０ｇのＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１；１．７ミリモル）を、撹拌しながら添加した。活性化を、２０分間進行させた。活性化させたＭＰＥＧＣを、２０ＰＬ溶液に添加した。ｐＨを、１０Ｎ ＮａＯＨを１滴ずつ用いてｐＨ７．８にゆっくり調節し、一晩反応させた。一定分量を、ＴＮＢＳを使用するアミノ基の測定のために取り、アミノ基は１．６０ミリモル存在することが見出された。このことは、３３．５％のＰＥＧの飽和を示している。これが、２０ＰＬＰＥＧ１０３０ＤＡ溶液である。Ｃ）ＴｏｓｏｈＧ４０００ＷＸＬカラム（０．７９×３０ｃｍ）を使用して、１５％アセトニトリルを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１１．９ｍＭホスフェート、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＰＯ４、ｐＨ７．４）を用いて、０．６ｍｌ／分の流速で溶出する分子ふるいクロマトグラフィーは、１１．３分（およそ２３．９ｎｍの直径）の保持時間を示した。Ｄ）３．５ｇのＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸二無水物；ＭＷ＝３５７．３２；９．８ミリモル；６モル当量のアミノ基）を、ステップＢの溶液（２０ＰＬＰＥＧ１０３０ＤＡ；１．６ミリモルＮＨ２）に添加し、続いて、１００μｌのＴＥＡ（トリエチルアミン）を添加した。混合物を、１０Ｎ ＮａＯＨを用いてゆっくり滴定してｐＨ７．８とし、一晩反応させた。アミノ基を測定し、アミノ基は、０μＭ存在することが見出された。反応混合物を、５０ｍｌの５０％エタノールを用いて希釈し、１００，０００のＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−１００−Ｅ−５Ａ）中で、水を１０回変えて洗浄した。溶液を、水中で、１００ｍｌに濃縮した。Ｅ）１２．７ミリモルの２−アミノエチルハイドロゲンサルフェート（ＡＥＳ；Ｃ２Ｈ７Ｎ−ＳＯ４；ＭＷ＝１４１．１４；１２．７ミリモル；Ａｃｒｏｓ；Ｃａｓ番号９２６−３９−６；ロット番号Ａ００４５１４４０１）またはスルファニル酸（ＳＮＡ、Ｃ６Ｈ７Ｎ−ＳＯ３；ＭＷ＝１７３．１９；１２．７ミリモル；Ａｃｒｏｓ；Ｃａｓ番号１２１−５７−３；ロット番号Ａ０１８７１７７０１）またはＯ−ホスホリルエタノールアミン（Ｃ２Ｈ８Ｎ−ＰＯ４；ＭＷ＝１４１．０６；１２．７ミリモル；Ａｃｒｏｓ；Ｃａｓ番号１０７１−２３−４；ロット番号０００１４３７７６３）を、２５ｍｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ中に溶解させた。混合物を、１０Ｎ ＮａＯＨを用いてゆっくり滴定してｐＨ７．８とした。アミノ基をＴＮＢＳにより測定し、約１６ミリモルのＮＨ２が存在することが見出された。Ｆ）ステップＤ（２０ＰＬＰＥＧ１０３０ＤＴＰＡ；４×１．６＝６．４ミリモルのカルボキシル）の溶液を、１０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ＝４．７（１１０ｍｌに添加した１１００μＬの１Ｍ ＭＥＳ）に加え、８８０ｍｇのＮＨＳ（ＭＷ＝１１５．１４；７．７ミリモル）を添加した。溶解したら、活性化を、４ｇのＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１；２１ミリモル）を添加することによって開始し、２０分間進行させた。活性化させたキャリアを、溶液Ｅに添加し、一晩反応させた。一定分量を取って、アミノ基のＴＮＢＳによる分析を行い、アミノ基は、約９ミリモル存在することが見出された。このことは、ＤＴＰＡのサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）による完全な飽和を示している。これが、２０ＰＬＰＥＧ１０３０ＤＴＰＡＳＯ溶液、または２０ＰＬＰＥＧ１０３０ＤＴＰＡＳＦ溶液、または２０ＰＬＰＥＧ１０３０ＤＴＰＡＰＯ溶液である。Ｆ）溶液を、１００ｋＤａのＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−１００−Ｅ−５Ａ、ＧＥ製）を使用して、水を１０回変えて洗浄し、１００ｍｌにさらに濃縮した。Ｇ）試料を、ろ過滅菌し（０．２μｍのポリスルホン製フィルター、Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）、凍結乾燥して、約４グラムを得た。
（実施例１５）
４０ＰＬＰＥＧ５３５ＤＴＰＡおよび４０ＰＬＰＥＧ５３５ＤＴＰＡＩＤＡの合成
これを、本発明の陰イオンコア組成物のうちのいくつかの合成のための開始材料として使用する。これを作製するために、１．０ｇの４０ＰＬ（Ｐ３９９５、Ｓｉｇｍａ、ロット番号０８５Ｋ５１０２）を、５０ｍｌの２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ中に溶解させた。アミノ基をＴＮＢＳアッセイにより測定し、２．８６ミリモルのＮＨ２／ｇが存在することが見出された。１７．５ｍｌの１０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ＝４．７中の、３グラムのＭＰＥＧＣ（メトキシポリエチレングリコール−カルボキシメチル；１ミリモル；ＭＷ＝５ｋＤａ；９．０ミリモル；Ｌａｙｓａｎ Ｂｉｏ；ロット番号１０８−４１；透明溶液）を、１５０ｍｇのＮＨＳＳ（ＭＷ＝２１７．１４；０．７ミリモル）、続いて、３００ｍｇのＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１；１．５７ミリモル）を添加することによって活性化させた。活性化を２０分間進行させた。ＭＰＥＧＣ溶液の総体積は、この段階では１８ｍｌであった。活性化させたＭＰＥＧＣを、４０ＰＬ溶液に添加し、反応させた。４５分後に、追加の３ｇのＭＰＥＧＣを、上記に従って、活性化させ、添加し、２時間反応させた。アミノ基をＴＮＢＳにより測定し、アミノ基は、１０３μＭ存在することが見出され、２８％の飽和を示した。ＴｏｓｏｈＧ４０００ＷＸＬカラム（０．７９×３０ｃｍ）を使用して、１５％アセトニトリルを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１１．９ｍＭホスフェート、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＰＯ４、ｐＨ７．４）を用いて、０．６ｍｌ／分の流速で溶出する分子ふるいクロマトグラフィーは、ＵＶ上の１１．７２分またはＲＩ上の１２．２０分（１８．４ｎｍ）の保持時間を示した。別の１．５ｇを、活性化させ、添加して、ＴＮＢＳにより測定した残存するアミノ基（９４ｍｌ中９１μＭまたは全部で１．８２ミリモル）に基づくと、３５％のアミノ基の飽和に達した。１．５ｇのＭＰＥＧの添加の後には、保持時間は、ＵＶ上の１１．６０分またはＲＩ上の１２．１０分または１９ｎｍとなった。４グラムのＤＴＰＡ−二無水物を添加し、ｐＨを連続的に調節して、ｐＨ７〜８の間に維持した。４時間後に、総アミノ基をＴＮＢＳにより測定し、総アミノ基は、０．０μＭ存在することが見出された。４０ＰＬＰＥＧ５３５ＤＴＰＡを含有する反応混合物を、１００ｋＤａの分画分子量（ＭＷＣＯ）を有する限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−１００−Ｅ−５Ａ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、２０倍の体積の水を用いて洗浄し、凍結乾燥して、４．７ｇを得た（４０ＰＬＰＥＧ５３５ＤＴＰＡ）。半分（２．３５ｇ）を、以下に従って、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）で飽和させた：ＩＤＡ（３ｇｒ）を、１０ｍｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳに加え、ｐＨを７．５に調節し、１Ｍ ＨＥＰＥＳ中で５０ｍｌに作り上げた。半分の４０ＰＬＰＥＧ５３５ＤＴＰＡを、３つの等しい部分（化学量論比に基づくと、各１．３ミリモルのカルボキシル）に分け、それぞれ（２５ｍｌ）を、２００μｌの１Ｍ ＭＥＳ、ｐＨ４．７を用いてｐＨ４．７としようとしたが、ｐＨは、４．７まで下がらず、したがって、２０μｌの６Ｎ ＨＣｌを添加した。これを、２ミリモルのＮＨＳＳ（４３４ｍｇ）および４．５ミリモルのＥＤＣ（８６４ｍｇ）の添加により活性化させた。２０分後に、活性化させた４０ＰＬＰＥＧ５３５ＤＴＰＡを、上記のＩＤＡに添加し、この操作を、さらに２回繰り返し、２時間撹拌した。生成物（４０ＰＬＰＥＧ５３５ＤＴＰＡＩＤＡ）を、２０倍の体積の水を用いて洗浄し、ろ過滅菌し（０．２μｍのポリスルホン製フィルター、Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）、凍結乾燥して、２．０ｇを得た（４０ＰＬＰＥＧ５３５ＤＴＰＡＩＤＡ）。
（実施例１６）
４０ＰＬＰＥＧ５３５ＤＴＰＡＳＯ、または４０ＰＬＰＥＧ５３５ＤＴＰＡＳＦ、または４０ＰＬＰＥＧ５３５ＤＴＰＡＰＯ、または４０ＰＬＰＥＧ５３５ＤＴＰＡＩＤＡＳＯ、または４０ＰＬＰＥＧ５３５ＤＴＰＡＩＤＡＳＦ、または４０ＰＬＰＥＧ５３５ＤＴＰＡＩＤＡＰＯの合成
この構造は、４０ｋＤａのポリリシンを含み、この場合、３５％のイプシロンアミノ基が、５ｋＤａのＭＰＥＧに共有結合的に連結しており、残存するアミノ基は、修飾してジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）のカルボニル基に共有結合的に連結するサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基を含有させたＤＴＰＡに共有結合的に連結している。本質的に、それぞれのＤＴＰＡが、スペーサーとして作用して、４つのサルフェート基のクラスターが、ポリリシン骨格につながるのを可能にする（また、その他の骨格も使用することができる）。４０ＰＬＰＥＧ５３５ＤＴＰＡまたは４０ＰＬＰＥＧ５３５ＤＴＰＡＩＤＡを、各クラスター中に数個に及ぶサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基を含有する、硫酸化した（またはスルホン化したまたはリン酸化した）キャリアに変換することができる。こうするためには、２グラムの４０ＰＬＰＥＧ５３５ＤＴＰＡまたは１グラムの４０ＰＬＰＥＧ５３５ＤＴＰＡＩＤＡを取り、それを、５０ｍｌの１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ４．７）中に溶解させる。キャリアを、０．３７ｇのＮＨＳＳ（ＭＷ＝２１７．１４；１．７ミリモル）、続いて、０．７５ｇのＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１；３．９ミリモル）を添加することによって活性化させ、２０分間活性化させる。別個の容器中で、０．５ｇの２−アミノエチルハイドロゲンサルフェート（ＡＥＳ；ＭＷ＝１４１；３．５ミリモル）または０．６ｇのスルファニル酸（ＳＮＡ；ＭＷ＝１７３；３．５ミリモル）または０．５ｇのＯ−ホスホリルエタノールアミン（ＯＰＥ；ＭＷ＝１４１；３．５ミリモル）を、２５ｍｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３、ｐＨを、ＮａＯＨを使用して７．８に調節する）中に溶解させ、開始アミノ基を、ＴＮＢＳにより測定し（Ｓｐａｄａｒｏら、１９７９年、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、９６巻、３１７〜３２９頁）、それはおよそ３．５ミリモルであるはずである。活性化されたキャリアをＡＥＳ（またはＳＮＡまたはＯＰＥ）溶液に添加する。２時間後に、別の０．７５ｇのＥＤＣを添加し、溶液を一晩撹拌する。アミノ基をＴＮＢＳにより測定して、アミノ基の減少量を決定する。アミノ基の減少量は、組み込まれたサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基の量と同等である。硫酸化した（またはスルホン化したまたはリン酸化した）キャリアを、１００ｋＤａのＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−１００−Ｅ−５Ａ；ＧＥ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して、２０倍の体積の水により洗浄し、ろ過滅菌し（０．２μｍのポリスルホン製フィルター、Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）、凍結乾燥する。この生成物（４０ＰＬＰＥＧ５３５ＤＴＰＡＳＯ、または４０ＰＬＰＥＧ５３５ＤＴＰＡＳＦ、または４０ＰＬＰＥＧ５３５ＤＴＰＡＰＯ、または４０ＰＬＰＥＧ５３５ＤＴＰＡＩＤＡＳＯ、または４０ＰＬＰＥＧ５３５ＤＴＰＡＩＤＡＳＦ、または４０ＰＬＰＥＧ５３５ＤＴＰＡＩＤＡＰＯ）は、骨格にぶら下がった最高４〜８個までのサルフェート、スルホネートまたはホスフェート基のクラスターを有する。
（実施例１７）
ポリリシン（ロット番号２００８０１２４ｂ）のアミノ基につながっているＮＴＡからの４０ＰＬＰＥＧ５３７ＮＤＡの合成
４０ＰＬＰＥＧ５３７ＮＤＡを、本発明の陰イオンコア組成物のうちのいくつかの合成のための出発材料として使用する。この構造は、４０ｋＤａのポリリシンを含み、この場合、３７％のアミノ基が、５ｋＤａのＭＰＥＧに共有結合的に連結しており、残存するアミノ基は、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）のカルボニル基のうちの１つに共有結合的に連結している。これを作製するために、１．０グラムの４０ＰＬ（Ｓｉｇｍａ、Ｐ３９９５、ロット番号１２７Ｋ５１０１；１ｇが、２．６２ミリモルのＮＨ２を含有する）を、５０ｍｌの４００ｍＭ ＨＥＰＥＳ中に溶解させた。２０ｍｌの１０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ＝４．７中の、５ｇのＭＰＥＧＣ（１ミリモル；ＭＷ＝５ｋＤａ；Ｓｉｇｍａ／Ｆｉｓｈｅｒ／Ｆｌｕｋａ；カタログ番号７０７１８；ロット番号６４７４８／１）を、２５０ｍｇのＮＨＳ（ＭＷ＝１１５．０９；２ミリモル）、続いて、５００ｍｇのＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１；１．８ミリモル）を添加することによって活性化させた。活性化を２０分間進行させる（総体積は２０ｍｌである）。活性化させたＭＰＥＧＣを、４０ＰＬ溶液（添加前、ｐＨ７．４５）に添加した。混合物を４時間反応させた。ＭＰＥＧの添加の前（２．６２ミリモル）および後（１．６４ミリモル）のアミノ基の測定は、ＰＥＧのアミノ基による飽和が３７％であることを示した。ＴｏｓｏｈＧ４０００ＷＸＬカラム（０．７９×３０ｃｍ）を使用して、１５％アセトニトリルを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１１．９ｍＭホスフェート、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＰＯ４、ｐＨ７．４）を用いて、０．６ｍｌ／分の流速で溶出する分子ふるいクロマトグラフィーは、１２．５分の保持時間（またはおよそ１６ｎｍの直径）を示した。これが、４０ＰＬＰＥＧ５３７ＤＡ溶液である。別個の容器中で、水中のＮＴＡ（ＭＷ＝１９１；１ｇまたは５．２ミリモル）を、１ｍｌの１０Ｎ ＮａＯＨを用いて中和し、２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ４．７を用いて緩衝した（総体積は１０ｍｌである）。これを、３４５ｍｇのＮＨＳ（ＭＷ＝１１５．０９；３ミリモル）の存在下で、１ｇ（５．２ミリモル）のＥＤＣを用いて活性化させた。２０分間の活性化の後に、これを、４０ＰＬＰＥＧ５３７ＤＡに添加し、ｐＨを、１０Ｎ ＮａＯＨを使用して７．８に調節した。２時間後に、追加の２ｇのＥＤＣを、添加し、一晩反応させた。総アミノ基を測定し、総アミノ基は、０．０３ミリモル存在することが見出された。この値を、反応前の１．６３ミリモルの元々のアミノ基と比較する。試料を、１００ｋＤａのＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−１００−Ｅ−５Ａ；ＧＥ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して、水の体積を２０回変えて洗浄し、ろ過滅菌し（０．２μｍのポリスルホン製フィルター；Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）、凍結乾燥して、４．１ｇの４０ＰＬＰＥＧ５３７ＮＤＡを得た。
（実施例１８）
４０ＰＬＰＥＧ５３７ＮＤＡＳＯ、または４０ＰＬＰＥＧ５３７ＮＤＡＳＦ、または４０ＰＬＰＥＧ５３７ＮＤＡＰＯの合成
この構造は、４０ｋＤａのポリリシンを含み、この場合、３７％のアミノ基が、５ｋＤａのＭＰＥＧに共有結合的に連結しており、残存するアミノ基は、ＮＴＡのカルボニル基のうちの１つに共有結合的に連結しており、ＮＴＡの残存するカルボニル基は、サルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基を含有するために修飾される。本質的に、それぞれのＮＴＡが、スペーサーとして作用して、２個のサルフェート（スルホネートまたはホスフェート）基のクラスターが、ポリリシン骨格につながるのを可能にする（また、その他の骨格も使用することができる）。４０ＰＬＰＥＧ５３７ＮＤＡを、各クラスター中に最高２個のサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基を含有する、硫酸化した（スルホン化したまたはリン酸化した）キャリアに変換することができる。こうするためには、２グラムのキャリア（４０ＰＬＰＥＧ５３７ＮＤＡ）を取り、それを、５０ｍｌの１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ４．７）中に溶解させる。キャリアを、０．１９ｇのＮＨＳＳ（ＭＷ＝２１７．１４；０．８７ミリモル）、続いて、０．３７ｇのＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１；１．９ミリモル）を添加することによって活性化させ、２０分間活性化させる。別個の容器中で、０．２５ｇの２−アミノエチルハイドロゲンサルフェート（ＡＥＳ；ＭＷ＝１４１；１．８ミリモル）または０．３１ｇのスルファニル酸（ＳＮＡ；ＭＷ＝１７３；１．８ミリモル）または０．２５ｇのＯ−ホスホリルエタノールアミン（ＯＰＥ；ＭＷ＝１４１；１．８ミリモル）を、２５ｍｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３、ｐＨを、ＮａＯＨを使用して７．８に調節する）中に溶解させ、開始アミノ基を、ＴＮＢＳにより測定し（Ｓｐａｄａｒｏら、１９７９年、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、９６巻、３１７〜３２９頁）、それはＡＥＳ（またはＳＮＡまたはＯＰＥ）の純度に応じて、およそ１．８ミリモルであるはずである。２０分間のキャリアの活性化の後に、キャリアに、ＡＥＳ（ＳＮＡまたはＯＰＥ）溶液を添加する。２時間後に、別の０．３７ｇのＥＤＣを添加し、溶液を一晩撹拌する。アミノ基をＴＮＢＳにより測定して、アミノ基の減少量を決定する。アミノ基の減少量は、組み込まれたサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基の量と同等である。硫酸化した（またはスルホン化したまたはリン酸化した）キャリアを、１００ｋＤａのＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−１００−Ｅ−５Ａ；ＧＥ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して、２０倍の体積の水により洗浄し、ろ過滅菌し（０．２μｍのポリスルホン製フィルター、Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）、凍結乾燥する。この生成物（４０ＰＬＰＥＧ５３７ＮＤＡＳＯ、または４０ＰＬＰＥＧ５３７ＮＤＡＳＦ、または４０ＰＬＰＥＧ５３７ＮＤＡＰＯ）は、骨格にぶら下がった最高２個のサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基のクラスターを有する。
（実施例１９）
２０ＰＬＰＥＧ５５０ＤＴＰＡＮＴＡの合成
２０ＰＬＰＥＧ５５０ＤＴＰＡＮＴＡを、本発明の陰イオンコア組成物のうちのいくつかの合成のための出発材料として使用する。この構造は、２０ｋＤａのポリリシンを含み、この場合、５０％のアミノ基が、５ｋＤａのＭＰＥＧに共有結合的に連結しており、残存するアミノ基は、ＤＴＰＡのカルボニル基のうちの１つに共有結合的に連結している。ＤＴＰＡの残存するカルボニル基は、ビスカルボキシメチルリシンのイプシロンアミノ基（ａｍｉｎｏｇｒｏｕｐ）に連結している。これを作製するために、：ａ）１ｍＬまたは０．４ｇ当量の２０ＰＬ（Ｑ４９２６ ＳＡＦＣ、ロット番号０１８Ｋ７７７５；ＤＰ＝１２６；０．４ｇが、ＴＮＢＳにより、０．８９５ミリモルのＮＨ２を含有することが見出された）を、５ｍｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ中に溶解させた。これが、２０ＰＬ溶液である。ｂ）別個の容器中で、２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ＝４．７（３５ｍｌ）中の２．５ｇのＭＰＥＧを、１２５ｍｇのＮＨＳ（ＭＷ＝１１５．１４；１．０９ミリモル）および５００ｍｇのＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１；２．６０ミリモル）を添加することによって、撹拌しながら活性化させた。活性化を、２０分間進行させ、活性化させたＭＰＥＧＣを、ステップａの２０ＰＬ溶液中に直接添加した。反応混合物のｐＨを、１０Ｎ ＮａＯＨを１滴ずつ用いてｐＨ７．１にゆっくり調節し、一晩反応させた。アミノ基のＴＮＢＳによる分析は、０．４６４ミリモルのアミノ基が残存することを示した。このことは、５０％のＰＥＧの飽和を示している。これが、２０ＰＬＰＥＧ５５０ＤＡ溶液である。ｃ）ＴｏｓｏｈＧ４０００ＷＸＬカラム（０．７９×３０ｃｍ）を使用して、１５％アセトニトリルを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１１．９ｍＭホスフェート、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＰＯ４、ｐＨ７．４）を用いて、０．６ｍｌ／分の流速で溶出する分子ふるいクロマトグラフィーは、屈折率検出器における１２．８分の保持時間またはおよそ１４．４ｎｍの分子直径を示した。ｄ）ジエチレントリアミン五酢酸二無水物（１グラム；ＦＷ＝３５７．３；２．８０ミリモル）を添加し、１０Ｎ ＮａＯＨを用いてゆっくり滴定してｐＨ７．１とし、２時間撹拌した。２時間後に、アミノ基のＴＮＢＳによる測定は、０％のアミノ基が残存することを示した。ｅ）溶液のｐＨを、１０Ｎ ＮａＯＨを使用して７．５に調節して、未反応のＤＴＰＡの結晶が残存するように洗浄を促進した。溶液を、１００ｍｌに濃縮し、１００，０００のＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−１００−Ｅ−５Ａ；ＧＥ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して、水を１５回変えて洗浄し、凍結乾燥した。ＴｏｓｏｈＧ４０００ＷＸＬカラム（０．７９×３０ｃｍ）を使用して、１５％アセトニトリルを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１１．９ｍＭホスフェート、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＰＯ４、ｐＨ７．４）を用いて、０．６ｍｌ／分の流速で溶出する分子ふるいクロマトグラフィーは、屈折率検出器における１２．７分の保持時間またはおよそ１５．０４ｎｍの分子を示した。ｆ）２グラムのＮＴＡ−アミン（Ｎα，Ｎα，−ビス（カルボキシメチル）−Ｌ−リシン；ＭＷ＝２６２．２６＋５０％不純物、最高２モルの水および１０％無機物）または約４ミリモルのアミノ基を、１０ｍｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ中に溶解させた。アミノ基のＴＮＢＳによる分析は、ＮＴＡ−アミンの溶液が、３．４ミリモルのアミノ基を含有することを示した。ｇ）２０ＰＬＰＥＧ５５０ＤＴＰＡ（０．７０ミリモルのカルボキシル）を、１０ｍｌの２０ｍＭ ＭＥＳ中に溶解させ、１４０ｍｇのＮＨＳ（ＭＷ＝１１５．０９；１．２ミリモル）、続いて、５６０ｍｇのＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１；２．９ミリモル）を添加した。ｐＨが、ゆっくり上がったが、ＨＣｌにより５．５未満に維持した。この溶液をＮＴＡ溶液に添加し、ｐＨを、１０Ｎ ＮａＯＨを用いてｐＨ７．１に調節した。２時間後に、アミノ基の分析は、全部で３．２ミリモルのアミノ基が残存することを示した。このことは、０．２ミリモルのＮＴＡ−アミンが、０．８ｍｇのキャリアに組み込まれたことを示している。ｈ）溶液を１００ｍｌに濃縮し、１００，０００のＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−１００−Ｅ−５Ａ；ＧＥ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して、水を１５回変えて洗浄し、ろ過滅菌し（０．２μｍのポリスルホン製フィルター、Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）、凍結乾燥して、０．５ｇを得た（２０ＰＬＰＥＧ５５０ＤＴＰＡＮＴＡ；）。ＴｏｓｏｈＧ４０００ＷＸＬカラム（０．７９×３０ｃｍ）を使用して、１５％アセトニトリルを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１１．９ｍＭホスフェート、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＰＯ４、ｐＨ７．４）を用いて、０．６ｍｌ／分の流速で溶出する分子ふるいクロマトグラフィーによる分析は、屈折率検出器における１２．７分の保持時間を示した。このことは、分子直径が、およそ１５．０４ｎｍであることを示している。
（実施例２０）
２０ＰＬＰＥＧ５５０ＤＴＰＡＮＴＡＳＯ、または２０ＰＬＰＥＧ５５０ＤＴＰＡＮＴＡＳＦ、または２０ＰＬＰＥＧ５５０ＤＴＰＡＮＴＡＰＯの合成
この構造は、２０ｋＤａのポリリシンを含み、この場合、５０％のアミノ基が、５ｋＤａのＭＰＥＧに共有結合的に連結しており、残存するアミノ基は、ＤＴＰＡのカルボニル基のうちの１つに共有結合的に連結しており、ＤＴＰＡの残存するカルボニル基は、カルボキシメチルリシンのイプシロンアミノ基に連結している。カルボキシメチルリシンをさらに修飾して、それぞれがカルボキシメチルリシン（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｌｙｌｙｓｉｎｅ）のカルボキシル基につながる３つのサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基を含有させる。本質的に、それぞれのＤＴＰＡ（ＮＴＡ）３が、スペーサーとして作用して、１２個のサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基のクラスターが、ポリリシン骨格につながるのを可能にする（また、その他の骨格も使用することができる）。生成物（２０ＰＬＰＥＧ５５０ＤＴＰＡＮＴＡ）を、各クラスター中に最高１２個のサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基を含有する、硫酸化した（またはスルホン化したまたはリン酸化した）キャリアに変換することができる。こうするためには、２グラムのキャリア（２０ＰＬＰＥＧ５５０ＤＴＰＡＮＴＡ）を取り、それを、５０ｍｌの１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ４．７）中に溶解させる。キャリアを、１．１ｇのＮＨＳＳ（ＭＷ＝２１７．１４；５．１ミリモル）、続いて、２．２ｇのＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１；１１．５ミリモル）を添加することによって活性化させ、２０分間活性化させる。別個の容器中で、１．５ｇの２−アミノエチルハイドロゲンサルフェート（ＡＥＳ；ＭＷ＝１４１；１０．６ミリモル）または１．８ｇのスルファニル酸（ＳＮＡ；ＭＷ＝１７３；１０．６ミリモル）または１．５ｇのＯ−ホスホリルエタノールアミン（ＯＰＥ；ＭＷ＝１４１；１０．６ミリモル）を、２５ｍｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３、ｐＨを、ＮａＯＨを使用して７．８に調節する）中に溶解させ、開始アミノ基を、ＴＮＢＳにより測定する（Ｓｐａｄａｒｏら、１９７９年、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、９６巻、３１７〜３２９頁）。開始アミノ基は、ＡＥＳ（ＳＮＡまたはＯＰＥ）の純度に応じて、およそ１０．６ミリモルであるはずである。２０分間のキャリアの活性化の後に、キャリアを、ＡＥＳ（またはＳＮＡまたはＯＰＥ）溶液に添加する。２時間後に、別の２．２ｇのＥＤＣを添加し、溶液を一晩撹拌する。アミノ基をＴＮＢＳにより測定して、アミノ基の減少量を決定する。アミノ基の減少量は、組み込まれたサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基の量と同等である。硫酸化した（またはスルホン化したまたはリン酸化した）キャリアを、１００ｋＤａのＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−１００−Ｅ−５Ａ；ＧＥ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して、２０倍の体積の水により洗浄し、ろ過滅菌し（０．２μｍのポリスルホン製フィルター、Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）、凍結乾燥する。この生成物（２０ＰＬＰＥＧ５５０ＤＴＰＡＮＴＡＳＯ、または２０ＰＬＰＥＧ５５０ＤＴＰＡＮＴＡＳＦ、または２０ＰＬＰＥＧ５５０ＤＴＰＡＮＴＡＰＯ）は、最高１２個のサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基のクラスターを有し、それぞれが、骨格にぶら下がる。
（実施例２１）
３５ＰＥＰＥＧ１０３５ＮＴＡの合成
３５ＰＥＰＥＧ１０３５ＮＴＡを、本発明の陰イオンコア組成物のうちのいくつかの合成のための出発材料として使用する。この組成物は、ポリグルタミン酸（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、Ｓｔ Ｌｕｉｓ、Ｍｏ．、カタログ番号Ｐ４０３３、ＭＷ＝１５〜５０ｋＤａ；またはＦｉｓｈｅｒ Ｃｈｅｍ Ｃｏ．、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ、ＰＡ、カタログ番号ＩＣＮ１５１９１８９１、ＭＷ＝１５〜５０ｋＤａ）を、ポリマー骨格として有し、３５％のカルボキシル基が、１０ｋＤａのＭＰＥＧＡＭ（ＭＷ＝１０ｋＤａ、アミノ基を末端に有するＭＰＥＧ；Ｓｕｎｂｉｏ、Ｏｒｉｎｄａ、ＣＡ；カタログ番号Ｐ１ＡＭ−１０）で塞がれており、残存するカルボキシル基は、ニトリロ三酢酸で塞がれている。３５ＰＥＰＥＧ１０３５ＮＴＡを合成するためには、１．０ｇのポリ−グルタミン酸の開始カルボキシル基（１当量）を、ＫｏｂａｙａｈｉおよびＣｈｉｂａによるプロトコール（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９４年、２１９巻、１８９〜１９４頁）に従って測定する。１．０ｇのポリグルタミン酸（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、Ｓｔ Ｌｕｉｓ、Ｍｏ．、カタログ番号Ｐ４０３３；ＭＷ＝１５〜５０ｋＤａ、１グラム当たり１当量のカルボキシル基を有する）を取り、２５ｍｌの１０ｍＭ ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）緩衝液、ｐＨ４．７中に溶解させ、１当量のＮＨＳ（ＭＷ＝１１５．１４）および１当量のＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１）を添加し、撹拌して、ＰＥを２０分間活性化させる。別個の容器中で、０．３５当量のＭＰＥＧＡＭ（ＭＷ＝１０ｋＤａ、アミノ基を末端に有するＭＰＥＧ；Ｓｕｎｂｉｏ、Ｏｒｉｎｄａ、ＣＡ；カタログ番号Ｐ１ＡＭ−１０）を、２０ｍｌの０．２Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．８中に溶解させて、ＭＰＥＧＡＭ溶液を得る。２０分間のＰＥの活性化の後に、ＰＥをＭＰＥＧＡＭ溶液に添加し、反応を２時間進行させる。ＭＰＥＧＡＭの残存するアミノ基を、ＴＮＢＳにより測定すると、残存するアミノ基は存在しないはずであり、このことは、０．３５当量のアミノ基全てを、使い切り、ポリグルタミン酸にコンジュゲートさせたことを示している。残存するアミノ基が存在する場合、ｐＨを、６Ｎ ＨＣｌを用いて５に調節し、１当量のＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１）を添加し、２０分後に、ｐＨを調節して７．８に戻し、一晩反応させる。得られた３５ＰＥＰＥＧ１０３５溶液の一定分量を取り、流体力学直径を、分子ふるいクロマトグラフィーにより、ＴｏｓｏｈＧ４０００ＷＸＬカラム（０．７９×３０ｃｍ）、および溶出溶媒としての、１５％アセトニトリルを含有する、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１１．９ｍＭホスフェート、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＰＯ４、ｐＨ７．４）を使用して、０．６ｍｌ／分の流速で決定する。保持時間は、およそ１６〜２４ｎｍの流体力学直径と一致するはずである。ｐＨを、６Ｎ ＨＣｌを用いて下げて５に調節し、１．５当量のＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１）を添加し、２０分間活性化させる。２０分後に、この活性化させた４０ＰＥＰＥＧ１０３５溶液を、２５ｍｌの０．２Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．８中の、１０当量のＮα，Ｎα−ビスカルボキシメチル−リシン（ＭＷ＝２６２Ｄａ）に添加し、一晩反応させる。反応混合物を、１００ｍｌに濃縮し、１００ｋＤａのＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−１００−Ｅ−５Ａ）中で、水を１５回変えて洗浄する。試料を、（０．２μｍのポリスルホン製フィルター、Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を使用してろ過滅菌し、凍結乾燥する。得られた３５ＰＥＰＥＧ１０３５ＮＴＡの１０ｍｇ／ｍｌ溶液を作製し、流体力学直径を、分子ふるいクロマトグラフィーにより、ＴｏｓｏｈＧ４０００ＷＸＬカラム（０．７９×３０ｃｍ）、および溶出溶媒としての、１５％アセトニトリルを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１１．９ｍＭホスフェート、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＰＯ４、ｐＨ７．４）を使用して、０．６ｍｌ／分の流速で決定する。保持時間は、およそ１９〜２８ｎｍの流体力学直径と一致するはずである。
（実施例２２）
３５ＰＧＰＥＧ１０３５ＮＴＡＳＯ、または３５ＰＧＰＥＧ１０３５ＮＴＡＳＦ、または３５ＰＧＰＥＧ１０３５ＮＴＡＰＯの合成
この構造は、３５ｋＤａのポリグルタメートを含み、この場合、３５％のカルボキシル基が、１０ｋＤａのＭＰＥＧに共有結合的に連結しており、残存するカルボキシル基は、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）の誘導体であるビスカルボキシメチルリシンのイプシロンアミノ基に共有結合的に連結している。ＮＴＡをさらに修飾して、それぞれがＮＴＡのカルボニル基につながる３つのサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基を含有させる。本質的に、それぞれのＮＴＡが、スペーサーとして作用して、３つのサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基のクラスターが、ポリグルタミン酸骨格につながるのを可能にする（また、その他の骨格も使用することができる）。３５ＰＧＰＥＧ１０３５ＮＴＡを、各クラスター中に最高３つのサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基を有するサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基のクラスターを含有する、硫酸化した（またはスルホン化したまたはリン酸化した）キャリアに変換することができる。こうするためには、２グラムのキャリア（３５ＰＧＰＥＧ１０３５ＮＴＡ）を取り、それを、５０ｍｌの１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ４．７）中に溶解させる。キャリアを、０．２８ｇのＮＨＳＳ（ＭＷ＝２１７．１４；１．３ミリモル）、続いて、０．５６ｇのＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１；２．９ミリモル）を添加することによって活性化させ、２０分間活性化させる。別個の容器中で、０．３７ｇの２−アミノエチルハイドロゲンサルフェート（ＡＥＳ；ＭＷ＝１４１；２．６ミリモル）または０．４５ｇのスルファニル酸（ＳＮＡ；ＭＷ＝１７３；２．６ミリモル）または０．３７ｇのＯ−ホスホリルエタノールアミン（ＯＰＥ；ＭＷ＝１４１；２．６ミリモル）を、２５ｍｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３、ｐＨを、ＮａＯＨを使用して７．８に調節する）中に溶解させ、開始アミノ基を、ＴＮＢＳにより測定する（Ｓｐａｄａｒｏら、１９７９年、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、９６巻、３１７〜３２９頁）。開始アミノ基は、ＡＥＳ（またはＳＮＡまたはＯＰＥ）の純度に応じて、およそ２．６ミリモルであるはずである。２０分間のキャリアの活性化の後に、活性化キャリアを、ＡＥＳ（またはＳＮＡまたはＯＰＥ）溶液に添加する。２時間後に、別の０．５６ｇのＥＤＣを添加し、溶液を一晩撹拌する。アミノ基をＴＮＢＳにより測定して、アミノ基の減少量を決定する。アミノ基の減少量は、組み込まれたサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基の量と同等である。硫酸化した（またはスルホン化したまたはリン酸化した）キャリアを、１００ｋＤａのＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−１００−Ｅ−５Ａ；ＧＥ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して、２０倍の体積の水により洗浄し、ろ過滅菌し（０．２μｍのポリスルホン製フィルター、Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）、凍結乾燥する。この生成物（３５ＰＧＰＥＧ１０３５ＮＴＡＳＯ、または３５ＰＧＰＥＧ１０３５ＮＴＡＳＦ、または３５ＰＧＰＥＧ１０３５ＮＴＡＰＯ）は、最高３個のサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基のクラスターを有し、それぞれが、骨格にぶら下がる。
（実施例２３）
１０ＰＤＰＥＧ１０３５ＮＴＡの合成
１０ＰＤＰＥＧ１０３５ＮＴＡを、本発明の陰イオンコア組成物のうちのいくつかの合成のための出発材料として使用する。この組成物は、ポリアスパラギン酸（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、Ｓｔ Ｌｕｉｓ、Ｍｏ．、カタログ番号Ｐ５３８７、ＭＷ＝５〜１５ｋＤａ）を、ポリマー骨格として有し、３５％のカルボキシル基が、１０ｋＤａのＭＰＥＧＡＭ（ＭＷ＝１０ｋＤａ、アミノ基を末端に有するＭＰＥＧ；Ｓｕｎｂｉｏ、Ｏｒｉｎｄａ、ＣＡ；カタログ番号Ｐ１ＡＭ−１０）で塞がれており、残存するカルボキシル基は、ニトリロ三酢酸で塞がれている。１．０ｇのポリ−グルタミン酸の開始カルボキシル基１当量を、ＫｏｂａｙａｈｉおよびＣｈｉｂａによるプロトコール（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９４年、２１９巻、１８９〜１９４頁）に従って測定する。１０ＰＤＰＥＧ１０３５ＮＴＡを合成するためには、１．０ｇのポリアスパラギン酸（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、Ｓｔ Ｌｕｉｓ、Ｍｏ．、カタログ番号Ｐ４０３３；ＭＷ＝１５〜５０ｋＤａ、１グラム当たり１当量のカルボキシル基を有する）を取り、２５ｍｌの２０ｍＭ ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）緩衝液、ｐＨ４．７中に溶解させて、ＰＤ溶液を作製する。０．２５当量のＭＰＥＧＡＭ（ＭＷ＝１０ｋＤａ、アミノ基を末端に有するＭＰＥＧ；Ｓｕｎｂｉｏ、Ｏｒｉｎｄａ、ＣＡ；カタログ番号Ｐ１ＡＭ−１０）を、２０ｍｌの８０％エタノール中に溶解させ、ＰＤ溶液に添加して、ＰＤＰＥＧ溶液を作製する。ＰＤＰＥＧ溶液に、１当量のＮＨＳ（ＭＷ＝１１５．１４）および１当量のＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１）を撹拌しながら添加する。ｐＨを、６Ｎ ＨＣｌを用いて、ｐＨ４．７〜５．０に２０分間維持する。２０分間の活性化の後に、ｐＨを、１０ｍｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４を添加することによって７．８に調節する。ｐＨを、１０Ｎ ＮａＯＨを１滴ずつ用いて７．８に調節する。反応を２時間進行させ、ＭＰＥＧＡＭの残存するアミノ基を、ＴＮＢＳにより測定すると、残存するアミノ基は存在しないはずであり、このことは、０．３５当量のアミノ基全てを、使い切り、ポリアスパラギン酸にコンジュゲートさせたことを示している。残存するアミノ基が存在する場合には、１当量のＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１）を添加し、一晩反応させる。得られた１０ＰＤＰＥＧ１０３５溶液の一定分量を取り、流体力学直径を、分子ふるいクロマトグラフィーにより、ＴｏｓｏｈＧ４０００ＷＸＬカラム（０．７９×３０ｃｍ）、および溶出溶媒としての、１５％アセトニトリルを含有する、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１１．９ｍＭホスフェート、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＰＯ４、ｐＨ７．４）を使用して、０．６ｍｌ／分の流速で決定する。保持時間は、およそ１２〜１８ｎｍの流体力学直径と一致するはずである。ｐＨを、６Ｎ ＨＣｌを用いて下げて５に調節し、１．５当量のＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１）を添加し、２０分間活性化させる。２０分後に、この活性化させた１０ＰＤＰＥＧ１０３５溶液を、２５ｍｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．８中の、１０当量のＮα，Ｎα−ビスカルボキシメチル−リシン（ＭＷ＝２６２Ｄａ）に添加し、一晩反応させる。反応混合物を、１００ｍｌに濃縮し、１００ｋＤａのＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−１００−Ｅ−５Ａ）中で、水を１５回変えて洗浄する。試料を、（０．２μｍのポリスルホン製フィルター、Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を使用してろ過滅菌し、凍結乾燥する。得られた１０ＰＤＰＥＧ１０３５ＮＴＡの１０ｍｇ／ｍｌ溶液を作製し、流体力学直径を、分子ふるいクロマトグラフィーにより、ＴｏｓｏｈＧ４０００ＷＸＬカラム（０．７９×３０ｃｍ）、および溶出溶媒としての、１５％アセトニトリルを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１１．９ｍＭホスフェート、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＰＯ４、ｐＨ７．４）を使用して、０．６ｍｌ／分の流速で決定する。保持時間は、およそ１４〜２０ｎｍの流体力学直径と一致するはずである。
（実施例２４）
１０ＰＤＰＥＧ１０３５ＮＴＡＳＯ、または１０ＰＤＰＥＧ１０３５ＮＴＡＳＦ、または１０ＰＤＰＥＧ１０３５ＮＴＡＰＯの合成
この構造は、１０ｋＤａのポリアスパルテートを含み、３５％のカルボキシル基が、１０ｋＤａのＭＰＥＧに共有結合的に連結しており、残存するカルボキシル基は、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）の誘導体であるビスカルボキシメチルリシンのイプシロンアミノ基に共有結合的に連結している。ＮＴＡをさらに修飾して、それぞれがＮＴＡのカルボニル基につながった３つのサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基を含有させる。本質的に、それぞれのＮＴＡが、スペーサーとして作用して、３つのサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基のクラスターが、ポリアスパラギン酸骨格につながるのを可能にする（また、その他の骨格も使用することができる）。１０ＰＤＰＥＧ１０３５ＮＴＡを、各クラスター中に最高３つのサルフェート基を有するサルフェート基のクラスターを含有する、硫酸化した（またはスルホン化したまたはリン酸化した）キャリアに変換することができる。こうするためには、２グラムの１０ＰＤＰＥＧ１０３５ＮＴＡを取り、それを、５０ｍｌの１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ４．７）中に溶解させる。キャリアを、０．２８ｇのＮＨＳＳ（ＭＷ＝２１７．１４；１．３ミリモル）、続いて、０．５６ｇのＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１；２．９ミリモル）を添加することによって活性化させ、２０分間活性化させる。別個の容器中で、０．３７ｇの２−アミノエチルハイドロゲンサルフェート（ＡＥＳ；ＭＷ＝１４１；２．６ミリモル）または０．４５ｇのスルファニル酸（ＳＮＡ；ＭＷ＝１７３；２．６ミリモル）または０．３７ｇのＯ−ホスホリルエタノールアミン（ＯＰＥ；ＭＷ＝１４１；２．６ミリモル）を、２５ｍｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３、ｐＨを、ＮａＯＨを使用して７．８に調節する）中に溶解させ、開始アミノ基を、ＴＮＢＳにより測定し（Ｓｐａｄａｒｏら、１９７９年、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、９６巻、３１７〜３２９頁）、開始アミノ基は、ＡＥＳ（またはＳＮＡまたはＯＰＥ）の純度に応じておよそ２．６ミリモル存在するはずである。２０分間活性化させたキャリアを、ＡＥＳ（またはＳＮＡまたはＯＰＥ）溶液に添加する。２時間後に、別の０．５６ｇのＥＤＣを添加し、溶液を一晩撹拌する。アミノ基をＴＮＢＳにより測定して、アミノ基の減少量を決定し、アミノ基の減少量は、組み込まれたサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基の量と同等である。硫酸化した（またはスルホン化したまたはリン酸化した）キャリアを、１００ｋＤａのＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−１００−Ｅ−５Ａ；ＧＥ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して２０倍の体積の水により洗浄し、ろ過滅菌し（０．２μｍのポリスルホン製フィルター、Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）、凍結乾燥する。この生成物（１０ＰＤＰＥＧ１０３５ＮＴＡＳＯ、または１０ＰＤＰＥＧ１０３５ＮＴＡＳＯ、または１０ＰＤＰＥＧ１０３５ＮＴＡＳＦ、または１０ＰＤＰＥＧ１０３５ＮＴＡＰＯ）は、骨格にぶら下がった１つのクラスター当たり最高３つのサルフェート（スルホネートまたはホスフェート）基のクラスターを有するであろう。
（実施例２５）
１０ＰＳＰＥＧ１０３５ＮＴＡの合成
１０ＰＳＰＥＧ１０３５ＮＴＡを、本発明の陰イオンコア組成物のうちのいくつかの合成のための出発材料として使用する。この組成物は、ポリセリン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、Ｓｔ Ｌｕｉｓ、Ｍｏ．、カタログ番号Ｐ５８５７、ＭＷ＝５〜１５ｋＤａ）を、ポリマー骨格として有し、３５％のヒドロキシル基が、１０ｋＤａのＭＰＥＧＡＭ（ＭＷ＝１０ｋＤａ、アミノ基を末端に有するＭＰＥＧ；Ｓｕｎｂｉｏ、Ｏｒｉｎｄａ、ＣＡ；カタログ番号Ｐ１ＡＭ−１０）で塞がれており、残存するヒドロキシル基は、ニトリロ三酢酸で塞がれている。この組成物を調製するためには、全てのヒドロキシル基を、カルボキシル基に、コハク酸無水物を使用して変換する。手短に述べると、１ｇのポリセリンを、２５ｍｌのジオキサン中に溶解させ、５．２グラムのコハク酸無水物（理論上のヒドロキシル基の総数の５倍モル過剰量）、および触媒としての、９００ｍｇのＮ，Ｎ’−ジメチルアミノピリジン（Ｎ，Ｎ’−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｙｒｉｄｉｎｅ）を添加し、混合物を６０℃で３時間インキュベートする。ジオキサンを、４０℃における回転蒸発により除去し、固体を水中に溶解させ、ＮａＯＨを用いて中和し、３ｋＤａ−ＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−３−Ｅ−５Ａ）中で、水を１５回変えて洗浄する。得られた生成物（ＰＳ）を、（０．２μｍのポリスルホン製フィルター、Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を使用してろ過滅菌し、凍結乾燥する。１．０ｇのＰＳ中の開始カルボキシル基（１当量）を、ＫｏｂａｙａｈｉおよびＣｈｉｂａによるプロトコール（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９４年、２１９巻、１８９〜１９４頁）に従って測定する。１０ＰＳＰＥＧ１０３５ＮＴＡを合成するためには、１．０ｇのＰＳ（１当量のカルボキシル基を有する）を取り、２５ｍｌの１０ｍＭ ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）緩衝液、ｐＨ４．７中に溶解させ（ＰＳ溶液）、１当量のＮＨＳ（ＭＷ＝１１５．１４）および１当量のＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１；４ミリモル）を添加し、２０分間撹拌して、活性化させる。別個の容器中で、０．３５当量のＭＰＥＧＡＭ（ＭＷ＝１０ｋＤａ、アミノ基を末端に有するＭＰＥＧ；Ｓｕｎｂｉｏ、Ｏｒｉｎｄａ、ＣＡ；カタログ番号Ｐ１ＡＭ−１０）を、２０ｍｌの０．２Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．８中に溶解させて、ＭＰＥＧＡＭ溶液を作製する。２０分間のＰＳの活性化の後に、ＰＳ溶液を、ＭＰＥＧＡＭ溶液に添加し、反応を２時間進行させる。ＭＰＥＧＡＭの残存するアミノ基を、ＴＮＢＳにより測定すると、残存するアミノ基は、存在しないはずであり、このことは、０．３５当量のＭＰＥＧＡＭのアミノ基全てを、使い切り、ＰＳにコンジュゲートさせたことを示している。残存するアミノ基が存在する場合には、ｐＨを、６Ｎ ＨＣｌを用いて５に調節し、１当量のＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１）を添加し、２０分後に、ｐＨを調節して７．８に戻し、一晩反応させる。得られた１０ＰＳＰＥＧ１０３５溶液の一定分量を取り、流体力学直径を、分子ふるいクロマトグラフィーにより、ＴｏｓｏｈＧ４０００ＷＸＬカラム（０．７９×３０ｃｍ）、および溶出溶媒としての、１５％アセトニトリルを含有する、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１１．９ｍＭホスフェート、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＰＯ４、ｐＨ７．４）を使用して、０．６ｍｌ／分の流速で決定する。保持時間は、およそ１３〜１８ｎｍの流体力学直径と一致するはずである。ｐＨを、６Ｎ ＨＣｌを用いて下げて５に調節し、１．５当量のＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１）を添加し、２０分間活性化させる。２０分後に、この活性化させた１０ＰＳＰＥＧ１０３５溶液を、２５ｍｌの０．２Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．８中の、１０当量のＮα，Ｎα−ビスカルボキシメチル−リシン（ＭＷ＝２６２Ｄａ）に添加し、一晩反応させる。反応混合物を、１００ｍｌに濃縮し、１００ｋＤａ−ＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−１００−Ｅ−５Ａ）中で、水を１５回変えて洗浄する。試料を、（０．２μｍのポリスルホン製フィルター、Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を使用してろ過滅菌し、凍結乾燥する。得られた１０ＰＳＰＥＧ１０３５ＮＴＡの１０ｍｇ／ｍｌ溶液を作製し、流体力学直径を、分子ふるいクロマトグラフィーにより、ＴｏｓｏｈＧ４０００ＷＸＬカラム（０．７９×３０ｃｍ）、および溶出溶媒としての、１５％アセトニトリルを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１１．９ｍＭホスフェート、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＰＯ４、ｐＨ７．４）を使用して、０．６ｍｌ／分の流速で決定する。保持時間は、およそ１４〜１９ｎｍの流体力学直径と同じはずである。
（実施例２６）
１０ＰＳＰＥＧ１０３５ＮＴＡＳＯ、または１０ＰＳＰＥＧ１０３５ＮＴＡＳＦ、または１０ＰＳＰＥＧ１０３５ＮＴＡＰＯの合成
この構造は、１０ｋＤａのポリセリンを含み、３５％のヒドロキシルキシル（ｈｙｄｒｏｘｙｌｘｙｌ）基が、１０ｋＤａのＭＰＥＧに共有結合的に連結しており、残存するヒドロキシル基は、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）の誘導体であるビスカルボキシメチルリシンのイプシロンアミノ基に共有結合的に連結している。ＮＴＡをさらに修飾して、それぞれがＮＴＡのカルボニル基につながった３つのサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基を含有させる。本質的に、それぞれのＮＴＡが、スペーサーとして作用して、３つのサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基のクラスターが、ポリアスパラギン酸骨格につながるのを可能にする（また、その他の骨格も使用することができる）。１０ＰＳＰＥＧ１０３５ＮＴＡ（上記を参照されたい）を、各クラスター中に最高３つのサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基を有するサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基のクラスターを含有する、硫酸化した（またはスルホン化したまたはリン酸化した）キャリアに変換することができる。こうするためには、２グラムの１０ＰＳＰＥＧ１０３５ＮＴＡ（上記）を取り、それを、５０ｍｌの１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ４．７）中に溶解させる。キャリアを、０．２８ｇのＮＨＳＳ（ＭＷ＝２１７．１４；１．３ミリモル）、続いて、０．５６ｇのＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１；２．９ミリモル）を添加することによって活性化させ、２０分間活性化させる。別個の容器中で、０．３７ｇの２−アミノエチルハイドロゲンサルフェート（ＡＥＳ；ＭＷ＝１４１；２．６ミリモル）または０．４５ｇのスルファニル酸（ＳＮＡ；ＭＷ＝１７３；２．６ミリモル）または０．３７ｇのＯ−ホスホリルエタノールアミン（ＯＰＥ；ＭＷ＝１４１；２．６ミリモル）を、２５ｍｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３、ｐＨを、ＮａＯＨを使用して７．８に調節する）中に溶解させ、開始アミノ基を、ＴＮＢＳにより測定し（Ｓｐａｄａｒｏら、１９７９年、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、９６巻、３１７〜３２９頁）、開始アミノ基は、ＡＥＳ（またはＳＮＡまたはＯＰＥ）の純度に応じておよそ２．６ミリモル存在するはずである。２０分間活性化させたキャリアを、ＡＥＳ（またはＳＮＡまたはＯＰＥ）溶液に添加する。２時間後に、別の０．５６ｇのＥＤＣを添加し、溶液を一晩撹拌する。アミノ基をＴＮＢＳにより測定して、アミノ基の減少量を決定し、アミノ基の減少量は、組み込まれたサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基の量と同等である。硫酸化した（またはスルホン化したまたはリン酸化した）キャリアを、１００ｋＤａのＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−１００−Ｅ−５Ａ；ＧＥ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して２０倍の体積の水により洗浄し、ろ過滅菌し（０．２μｍのポリスルホン製フィルター、Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）、凍結乾燥する。この生成物（１０ＰＳＰＥＧ１０３５ＮＴＡＳＯ、または１０ＰＳＰＥＧ１０３５ＮＴＡＳＦ、または１０ＰＳＰＥＧ１０３５ＮＴＡＰＯ）は、骨格にぶら下がった１つのクラスター当たり最高３つのサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基のクラスターを有するであろう。
（実施例２７）
１０ＰＴＰＥＧ１０３５ＮＴＡの合成
１０ＰＴＰＥＧ１０３５ＮＴＡを、本発明の陰イオンコア組成物のうちのいくつかの合成のための出発材料として使用する。この組成物は、ポリトレオニン （Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、Ｓｔ Ｌｕｉｓ、Ｍｏ．、カタログ番号Ｐ８０７７、ＭＷ＝５〜１５ｋＤａ）を、ポリマー骨格として有し、３５％のヒドロキシル基が、１０ｋＤａのＭＰＥＧＡＭ（ＭＷ＝１０ｋＤａ、アミノ基を末端に有するＭＰＥＧ；Ｓｕｎｂｉｏ、Ｏｒｉｎｄａ、ＣＡ；カタログ番号Ｐ１ＡＭ−１０）で塞がれており、残存するヒドロキシル基は、ニトリロ三酢酸で塞がれている。この組成物を調製するためには、全てのヒドロキシル基を、カルボキシル基に、コハク酸無水物を使用して変換する。手短に述べると、１ｇのポリトレオニンを、２５ｍｌのジオキサン中に溶解させ、４．５グラムのコハク酸−無水物（１グラムのポリトレオニン中の理論上のヒドロキシル基の５倍モル過剰量）、および触媒としての９００ｍｇのＮ，Ｎ’−ジメチルアミノピリジンを添加し、混合物を６０℃で３時間インキュベートする。ジオキサンを、４０℃における回転蒸発により除去し、固体を水中に溶解させ、ＮａＯＨを用いて中和し、３ｋＤａ−ＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−３−Ｅ−５Ａ）中で、水を１５回変えて洗浄する。得られた生成物（ＰＴ）を、（０．２μｍのポリスルホン製フィルター、Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を使用してろ過滅菌し、凍結乾燥して、ＰＴを得る。１．０ｇのＰＴ中の開始カルボキシル基（１当量）を、ＫｏｂａｙａｈｉおよびＣｈｉｂａによるプロトコール（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９４年、２１９巻、１８９〜１９４頁）に従って測定する。１０ＰＴＰＥＧ１０３５ＮＴＡを合成するためには、１．０ｇのＰＴ（１当量のカルボキシル基を有する）を取り、２５ｍｌの１０ｍＭ ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）緩衝液、ｐＨ４．７中に溶解させ（ＰＴ溶液）、１当量のＮＨＳ（ＭＷ＝１１５．１４）、１当量のＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１）を添加し、２０分間活性化させる。別個の容器中で、０．３５ＸミリモルのＭＰＥＧＡＭ（ＭＷ＝１０ｋＤａ、アミノ基を末端に有するＭＰＥＧ；Ｓｕｎｂｉｏ、Ｏｒｉｎｄａ、ＣＡ；カタログ番号Ｐ１ＡＭ−１０）を、２０ｍｌの０．２Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．８中に溶解させて、ＭＰＥＧＡＭ溶液を作製する。２０分間のＰＴの活性化の後に、ＰＴ溶液を、ＭＰＥＧＡＭ溶液に添加し、反応を２時間進行させる。ＭＰＥＧＡＭの残存するアミノ基を、ＴＮＢＳにより測定すると、残存するアミノ基は、存在しないはずであり、このことは、０．３５当量のアミノ基全てを、使い切り、ＰＴにコンジュゲートさせたことを示している。残存するアミノ基が存在する場合には、ｐＨを、６Ｎ ＨＣｌを用いて５に調節し、１当量のＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１）を添加し、２０分後に、ｐＨを調節して７．８に戻し、一晩反応させる。得られた１０ＰＴＰＥＧ１０３５溶液の一定分量を取り、流体力学直径を、分子ふるいクロマトグラフィーにより、ＴｏｓｏｈＧ４０００ＷＸＬカラム（０．７９×３０ｃｍ）、および溶出溶媒としての、１５％アセトニトリルを含有する、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１１．９ｍＭホスフェート、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＰＯ４、ｐＨ７．４）を使用して、０．６ｍｌ／分の流速で決定する。保持時間は、およそ１２〜１８ｎｍの流体力学直径と一致するはずである。ｐＨを、６Ｎ ＨＣｌを用いて下げて５に調節し、１．５当量のＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１）を添加し、２０分間活性化させる。２０分後に、この活性化させた１０ＰＴＰＥＧ１０３５溶液を、２５ｍｌの０．２Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．８中の、１０当量のＮα，Ｎα−ビスカルボキシメチル−リシン（ＭＷ＝２６２Ｄａ）に添加し、一晩反応させる。反応混合物を、１００ｍｌに濃縮し、１００ｋＤａ−ＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−１００−Ｅ−５Ａ）中で、水を１５回変えて洗浄する。１０ＰＴＰＥＧ１０３５ＮＴＡ生成物を、（０．２μｍのポリスルホン製フィルター、Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹを使用して）ろ過滅菌し、凍結乾燥する。得られた１０ＰＴＰＥＧ１０３５ＮＴＡの１０ｍｇ／ｍｌ溶液を作製し、流体力学直径を、分子ふるいクロマトグラフィーにより、ＴｏｓｏｈＧ４０００ＷＸＬカラム（０．７９×３０ｃｍ）、および溶出溶媒としての、１５％アセトニトリルを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１１．９ｍＭホスフェート、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＰＯ４、ｐＨ７．４）を使用して、０．６ｍｌ／分の流速で決定する。保持時間は、およそ１４〜２０ｎｍの流体力学直径と一致するはずである。
（実施例２８）
１０ＰＴＰＥＧ１０３５ＮＴＡＳＯ、または１０ＰＴＰＥＧ１０３５ＮＴＡＳＦ、または１０ＰＴＰＥＧ１０３５ＮＴＡＰＯの合成
この構造は、１０ｋＤａのポリトレオニンを含み、３５％のヒドロキシルキシル基が、１０ｋＤａのＭＰＥＧに共有結合的に連結しており、残存するヒドロキシル基は、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）の誘導体であるビスカルボキシメチルリシンのイプシロンアミノ基に共有結合的に連結している。ＮＴＡをさらに修飾して、それぞれがＮＴＡのカルボニル基につながった３つのサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基を含有させる。本質的に、それぞれのＮＴＡが、スペーサーとして作用して、３つのサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基のクラスターが、ポリトレオニン骨格につながるのを可能にする（また、その他の骨格も使用することができる）。１０ＰＴＰＥＧ１０３５ＮＴＡ（上記を参照されたい）を、各クラスター中に最高３つのサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基を有するサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基のクラスターを含有する、硫酸化した（またはスルホン化したまたはリン酸化した）キャリアに変換することができる。こうするためには、２グラムの１０ＰＴＰＥＧ１０３５ＮＴＡを取り、それを、５０ｍｌの１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ４．７）中に溶解させる。キャリアを、０．２８ｇのＮＨＳＳ（ＭＷ＝２１７．１４；１．３ミリモル）、続いて、０．５６ｇのＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１；２．９ミリモル）を添加することによって活性化させ、２０分間活性化させる。別個の容器中で、０．３７ｇの２−アミノエチルハイドロゲンサルフェート（ＡＥＳ；ＭＷ＝１４１；２．６ミリモル）または０．４５ｇのスルファニル酸（ＳＮＡ；ＭＷ＝１７３；２．６ミリモル）または０．３７ｇのＯ−ホスホリルエタノールアミン（ＯＰＥ；ＭＷ＝１４１；２．６ミリモル）を、２５ｍｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３、ｐＨを、ＮａＯＨを使用して７．８に調節する）中に溶解させ、開始アミノ基を、ＴＮＢＳにより測定し（Ｓｐａｄａｒｏら、１９７９年、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、９６巻、３１７〜３２９頁）、開始アミノ基は、ＡＥＳ（またはＳＮＡまたはＯＰＥ）の純度に応じておよそ２．６ミリモル存在するはずである。２０分間活性化させたキャリアを、ＡＥＳ（またはＳＮＡまたはＯＰＥ）溶液に添加する。２時間後に、別の０．５６ｇのＥＤＣを添加し、溶液を一晩撹拌する。アミノ基をＴＮＢＳにより測定して、アミノ基の減少量を決定し、アミノ基の減少量は、組み込まれたサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基の量と同等である。硫酸化した（またはスルホン化したまたはリン酸化した）キャリアを、１００ｋＤａのＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−１００−Ｅ−５Ａ；ＧＥ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して２０倍の体積の水により洗浄し、ろ過滅菌し（０．２μｍのポリスルホン製フィルター、Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）、凍結乾燥する。この生成物（１０ＰＴＰＥＧ１０３５ＮＴＡＳＯ、または１０ＰＴＰＥＧ１０３５ＮＴＡＳＦ、または１０ＰＴＰＥＧ１０３５ＮＴＡＰＯ）は、骨格にぶら下がった１つのクラスター当たり最高３つのサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基のクラスターを有するであろう。
（実施例２９）
２０ＰＹＰＥＧ１０３５ＮＴＡの合成
２０ＰＹＰＥＧ１０３５ＮＴＡを、本発明の他の陰イオンコア組成物の合成のための出発材料として使用する。この組成物は、ポリチロシン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、Ｓｔ Ｌｕｉｓ、Ｍｏ．、カタログ番号Ｐ１８００、ＭＷ＝１０〜４０ｋＤａ）を、ポリマー骨格として有し、３５％のヒドロキシル基が、１０ｋＤａのＭＰＥＧＡＭ（ＭＷ＝１０ｋＤａ、アミノ基を末端に有するＭＰＥＧ；Ｓｕｎｂｉｏ、Ｏｒｉｎｄａ、ＣＡ；カタログ番号Ｐ１ＡＭ−１０）で塞がれており、残存するヒドロキシル基は、ニトリロ三酢酸で塞がれている。この組成物を調製するためには、全てのヒドロキシル基を、カルボキシル基に、コハク酸無水物を使用して変換する。手短に述べると、１ｇのポリチロシンを、２５ｍｌのジオキサン中に溶解させ、２．９グラムのコハク酸無水物（１グラムのポリチロシン中の理論上のヒドロキシル基の５倍モル過剰量）、および触媒としての９００ｍｇのＮ，Ｎ’−ジメチルアミノピリジンを添加し、混合物を６０℃で３時間インキュベートする。ジオキサンを、４０℃における回転蒸発により除去し、固体を水中に溶解させ、ＮａＯＨを用いて中和し、３ｋＤａ−ＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−３−Ｅ−５Ａ）中で、水を１５回変えて洗浄する。得られた生成物（ＰＹ）を、（０．２μｍのポリスルホン製フィルター、Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を使用してろ過滅菌し、凍結乾燥して、ＰＹを得る。１．０ｇのＰＹ中の開始カルボキシル基（１当量）を、ＫｏｂａｙａｈｉおよびＣｈｉｂａによるプロトコール（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９４年、２１９巻、１８９〜１９４頁）に従って測定する。２０ＰＹＰＥＧ１０３５ＮＴＡを合成するためには、１．０ｇのＰＹ（１当量のカルボキシル基を有する）を取り、２５ｍｌの１０ｍＭ ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）緩衝液、ｐＨ４．７中に溶解させ（ＰＹ溶液）、１当量のＮＨＳ（ＭＷ＝１１５．１４）、１当量のＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１）を添加し、２０分間撹拌し、活性化させる。別個の容器中で、０．３５当量のＭＰＥＧＡＭ（ＭＷ＝１０ｋＤａ、アミノ基を末端に有するＭＰＥＧ；Ｓｕｎｂｉｏ、Ｏｒｉｎｄａ、ＣＡ；カタログ番号Ｐ１ＡＭ−１０）を、２０ｍｌの０．２Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．８中に溶解させて、ＭＰＥＧＡＭ溶液を作製する。活性化ＰＹ溶液を、ＭＰＥＧＡＭ溶液に添加し、反応を２時間進行させる。ＭＰＥＧＡＭの残存するアミノ基を、ＴＮＢＳにより測定すると、残存するアミノ基は、存在しないはずであり、このことは、０．３５当量のアミノ基全てを、使い切り、ＰＹにコンジュゲートさせたことを示している。残存するアミノ基が存在する場合には、ｐＨを、６Ｎ ＨＣｌを用いて５に調節し、１当量のＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１）を添加し、２０分後に、ｐＨを調節して７．８に戻し、一晩反応させる。得られた２０ＰＹＰＹＧ１０３５溶液の一定分量を取り、流体力学直径を、分子ふるいクロマトグラフィーにより、ＴｏｓｏｈＧ４０００ＷＸＬカラム（０．７９×３０ｃｍ）、および溶出溶媒としての、１５％アセトニトリルを含有する、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１１．９ｍＭホスフェート、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＰＯ４、ｐＨ７．４）を使用して、０．６ｍｌ／分の流速で決定する。保持時間は、およそ１３〜１８ｎｍの流体力学直径と一致するはずである。ｐＨを、６Ｎ ＨＣｌを用いて下げて５に調節し、１．５当量のＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１）を添加し、２０分間活性化させる。２０分後に、これを、２５ｍｌの０．２Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．８中の、１０当量のＮα，Ｎα−ビスカルボキシメチル−リシン（ＭＷ＝２６２Ｄａ）に添加し、一晩反応させる。反応混合物を、１００ｍｌに濃縮し、１００ｋＤａ−ＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−１００−Ｅ−５Ａ）中で、水を１５回変えて洗浄する。試料を、（０．２μｍのポリスルホン製フィルター、Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹを使用して）ろ過滅菌し、凍結乾燥する。得られた２０ＰＹＰＥＧ１０３５ＮＴＡの１０ｍｇ／ｍｌ溶液を作製し、流体力学直径を、分子ふるいクロマトグラフィーにより、ＴｏｓｏｈＧ４０００ＷＸＬカラム（０．７９×３０ｃｍ）、および溶出溶媒としての、１５％アセトニトリルを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１１．９ｍＭホスフェート、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＰＯ４、ｐＨ７．４）を使用して、０．６ｍｌ／分の流速で決定する。保持時間は、およそ１４〜２０ｎｍの流体力学直径と一致するはずである。
（実施例３０）
２０ＰＹＰＥＧ１０３５ＮＴＡＳＯ、または２０ＰＹＰＥＧ１０３５ＮＴＡＳＦ、または２０ＰＹＰＥＧ１０３５ＮＴＡＰＯの合成
この構造は、２０ｋＤａのポリチロシンを含み、３５％のヒドロキシルキシル基が、１０ｋＤａのＭＰＥＧに共有結合的に連結しており、残存するヒドロキシル基は、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）の誘導体であるビスカルボキシメチルリシンのイプシロンアミノ基に共有結合的に連結している。ＮＴＡをさらに修飾して、それぞれがＮＴＡのカルボニル基につながった３つのサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基を含有させる。本質的に、それぞれのＮＴＡが、スペーサーとして作用して、３つのサルフェート基のクラスターが、ポリチロシン骨格につながるのを可能にする（また、その他の骨格も使用することができる）。２０ＰＹＰＥＧ１０３５ＮＴＡ（上記参照されたい）を、各クラスター中に最高３つのサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基を有するサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基のクラスターを含有する、硫酸化した（またはスルホン化したまたはリン酸化した）キャリアに変換することができる。こうするためには、２グラムの２０ＰＹＰＥＧ１０３５ＮＴＡを取り、それを、５０ｍｌの１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ４．７）中に溶解させる。キャリアを、０．２８ｇのＮＨＳＳ（ＭＷ＝２１７．１４；１．３ミリモル）、続いて、０．５６ｇのＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１；２．９ミリモル）を添加することによって活性化させ、２０分間活性化させる。別個の容器中で、０．３７ｇの２−アミノエチルハイドロゲンサルフェート（ＡＥＳ；ＭＷ＝１４１；２．６ミリモル）または０．４５ｇのスルファニル酸（ＳＮＡ；ＭＷ＝１７３；２．６ミリモル）または０．３７ｇのＯ−ホスホリルエタノールアミン（ＯＰＥ；ＭＷ＝１４１；２．６ミリモル）を、２５ｍｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３、ｐＨを、ＮａＯＨを使用して７．８に調節する）中に溶解させ、開始アミノ基を、ＴＮＢＳにより測定し（Ｓｐａｄａｒｏら、１９７９年、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、９６巻、３１７〜３２９頁）、開始アミノ基は、ＡＥＳ（またはＳＮＡまたはＯＰＥ）の純度に応じておよそ２．６ミリモル存在するはずである。２０分間活性化させたキャリアを、ＡＥＳ（またはＳＮＡまたはＯＰＥ）溶液に添加する。２時間後に、別の０．５６ｇのＥＤＣを添加し、溶液を一晩撹拌する。アミノ基をＴＮＢＳにより測定して、アミノ基の減少量を決定し、アミノ基の減少量は、組み込まれたサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基の量と同等である。硫酸化した（またはスルホン化したまたはリン酸化した）キャリアを、１００ｋＤａのＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−１００−Ｅ−５Ａ；ＧＥ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して２０倍の体積の水により洗浄し、ろ過滅菌し（０．２μｍのポリスルホン製フィルター、Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）、凍結乾燥する。この生成物（２０ＰＹＰＥＧ１０３５ＮＴＡＳＯ、または２０ＰＹＰＥＧ１０３５ＮＴＡＳＦ、または２０ＰＹＰＥＧ１０３５ＮＴＡＰＯ）は、骨格にぶら下がった１つのクラスター当たり最高３つのサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基のクラスターを有するであろう。
（実施例３１）
２０ＰＣＰＥＧ１０３５ＤＴＰＡの合成
２０ＰＣＰＥＧ１０３５ＤＴＰＡを、本発明のその他の陰イオンコア組成物の合成のための出発材料として使用する。この組成物は、ポリシステイン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、Ｓｔ Ｌｕｉｓ、Ｍｏ．、カタログ番号Ｐ１８００、ＭＷ＝１０〜４０ｋＤａ）を、ポリマー骨格として有し、３５％のチオール基が、１０ｋＤａのＭＰＥＧＣ（ＭＷ＝１０ｋＤａ；ＳｕｎＢｒｉｇｈｔ；ＭＥ−１００ＨＳ；ロット番号Ｍ６２５０３；透明溶液）で塞がれており、残存するチオール基は、ジエチレントリアミン五酢酸（ｄｉｅｔｈｙｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）（ＤＴＰＡ）で塞がれている。この組成物を調製するためには、全てのチオール基を、アミノ基に、アミノエチル−８（Ｎ−（ヨードエチル）トリフルオロアセトアミド（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、カタログ番号２３０１０）を使用して変換する。手短に述べると、１ｇのポリシステインを、２５ｍｌの２０ｍＭトリシン緩衝液、ｐＨ８．５中に溶解させ、４．７グラムのアミノエチル−８（Ｎ−（ヨードエチル）トリフルオロアセトアミド（１グラムのポリシステイン中の理論上のチオール基の２倍モル過剰量）を添加し、混合物を室温で３時間インキュベートする。３ｋＤａ−ＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−３−Ｅ−５Ａ）中で、水を１５回変えて洗浄する。得られた生成物（ＰＣ）を、（０．２μｍのポリスルホン製フィルター、Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を使用してろ過滅菌し、凍結乾燥して、ＰＣを得る。１．０ｇのＰＣ中の開始アミノ基（１当量）を、上記に従って、ＴＮＢＳを使用して測定する。２０ＰＣＰＥＧ１０３５ＤＴＰＡを合成するためには、１．０ｇのＰＣ（１当量のアミノ基を有する）を取り、２５ｍｌの０．２Ｍ
ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．８（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）中に溶解させて、２０ＰＣ溶液を得る。別個の容器中で、０．３５当量のＭＰＥＧＣ（ＭＷ＝１０ｋＤａ；カルボキシル基を末端に有するメトキシＰＥＧ、Ｌｙｓａｎ ｂｉｏ；Ａｒａｂ、ＡＬ製）を、６０ｍｌの１０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ＝４．７中に溶解させ、０．５当量のＮＨＳ（ＭＷ＝１１５．１４）を添加し、溶解したら、１当量のＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１；１０．４３ミリモル）を撹拌しながら添加し、活性化を２０分間進行させる。活性化させたＭＰＥＧＣを、２０ＰＣ溶液に直接添加し、反応を２時間発生させ、アミノ基をＴＮＢＳにより測定して、アミノ基の３５％の飽和を保証し、そうでなければ、活性化させたＭＰＥＧＣのさらなる適切な量を添加する。これが、２０ＰＣＰＥＧ１０３５溶液である。分子ふるいクロマトグラフィーを、ＴｏｓｏｈＧ４０００ＷＸＬカラム（０．７９×３０ｃｍ）を使用して実施し、１５％アセトニトリルを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１１．９ｍＭホスフェート、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＰＯ４、ｐＨ７．４）を用いて、０．６ｍｌ／分の流速で溶出する。保持時間は、およそ１４〜１７ｎｍの流体力学直径と一致するはずである。５当量のＤＴＰＡ二無水物（ＭＷ＝３５７．３２；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ Ｃｏ．、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ。カタログ番号２８４０２５）、続いて、２００μＬのＴＥＡを添加する。反応物を、１０Ｎ ＮａＯＨを用いてゆっくり滴定してｐＨ７．８とし、４時間撹拌した。ＴＮＢＳ反応を使用して、アミノ基が残存せず、反応が完全であること、および２０ＰＣＰＥＧ１０３５ＤＴＰＡ生成物が作製されたことを確認する。分子ふるいクロマトグラフィーを、ＴｏｓｏｈＧ４０００ＷＸＬカラム（０．７９×３０ｃｍ）を使用して実施し、１５％アセトニトリルを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１１．９ｍＭホスフェート、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＰＯ４、ｐＨ７．４）を用いて、０．６ｍｌ／分の流速で溶出する。保持時間は、１７〜２１ｎｍの分子直径と一致するはずである。得られた２０ＰＣＰＥＧ１０３５ＤＴＰＡを、１００，０００ＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−１００−Ｅ−５Ａ；ＧＥ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して、１５倍の体積の水を用いて洗浄し、凍結乾燥した。
（実施例３２）
２０ＰＣＰＥＧ１０３５ＤＴＰＡＳＯ、または２０ＰＣＰＥＧ１０３５ＤＴＰＡＳＦ、または２０ＰＣＰＥＧ１０３５ＤＴＰＡＰＯの合成
この構造は、２０ｋＤａのポリシステインを含み、この場合、３５％のチオール基が、１０ｋＤａのＭＰＥＧに共有結合的に連結しており、残存するチオール基は、エチレンジアミン四酢酸（ＤＴＰＡ）のカルボニル基のうちの１つに共有結合的に連結している。ＤＴＰＡをさらに修飾して、それぞれがＤＴＰＡのカルボニル基につながった４つのサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基を含有させる。本質的に、それぞれのＤＴＰＡが、スペーサーとして作用して、４つのサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基のクラスターが、ポリシステイン骨格につながるのを可能にする（また、その他の骨格も使用することができる）。２０ＰＣＰＥＧ１０３５ＤＴＰＡ（上記を参照されたい）を、各クラスター中に最高４つのサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基を有するサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基のクラスターを含有する、硫酸化した（またはスルホン化したまたはリン酸化した）キャリアに変換することができる。こうするためには、２グラムの２０ＰＣＰＥＧ１０３５ＤＴＰＡを取り、それを、５０ｍｌの１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ４．７）中に溶解させる。キャリアを、０．２８ｇのＮＨＳＳ（ＭＷ＝２１７．１４；１．３ミリモル）、続いて、０．５６ｇのＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１；２．９ミリモル）を添加することによって活性化させ、２０分間活性化させる。別個の容器中で、０．３７ｇの２−アミノエチルハイドロゲンサルフェート（ＡＥＳ；ＭＷ＝１４１；２．６ミリモル）または０．４５ｇのスルファニル酸（ＳＮＡ；ＭＷ＝１７３；２．６ミリモル）または０．３７ｇのＯ−ホスホリルエタノールアミン（ＯＰＥ；ＭＷ＝１４１；２．６ミリモル）を、２５ｍｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３、ｐＨを、ＮａＯＨを使用して７．８に調節する）中に溶解させ、開始アミノ基を、ＴＮＢＳにより測定し（Ｓｐａｄａｒｏら、１９７９年、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、９６巻、３１７〜３２９頁）、開始アミノ基は、ＡＥＳ（またはＳＮＡまたはＯＰＥ）の純度に応じておよそ２．６ミリモル存在するはずである。２０分間活性化させたキャリアを、ＡＥＳ（またはＳＮＡまたはＯＰＥ）溶液に添加する。２時間後に、別の０．５６ｇのＥＤＣを添加し、溶液を一晩撹拌する。アミノ基をＴＮＢＳにより測定して、アミノ基の減少量を決定し、アミノ基の減少量は、組み込まれたサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基の量と同等である。硫酸化した（またはスルホン化したまたはリン酸化した）キャリアを、１００ｋＤａのＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−１００−Ｅ−５Ａ；ＧＥ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して２０倍の体積の水により洗浄し、ろ過滅菌し（０．２μｍのポリスルホン製フィルター、Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）、凍結乾燥する。この生成物（２０ＰＣＰＥＧ１０３５ＤＴＰＡＳＯ、または２０ＰＣＰＥＧ１０３５ＤＴＰＡＳＦ、または２０ＰＣＰＥＧ１０３５ＤＴＰＡＰＯ）は、骨格にぶら下がった１つのクラスター当たり最高４つのサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基のクラスターを有するであろう。
非生物学的モノマーに由来するポリマー骨格を有する組成物の実施例
（実施例３３）
１５ＰＡＬＰＥＧ１０３５ＤＴＰＡの合成
１５ＰＡＬＰＥＧ１０３５ＤＴＰＡを、本発明の陰イオンコア組成物のうちのいくつかの合成のための出発材料として使用する。この組成物は、ポリアリルアミンの塩酸塩（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、Ｓｔ Ｌｕｉｓ、Ｍｏ．、カタログ番号２８３２１５、ＭＷ＝１５ｋＤａ）を、ポリマー骨格として有し、３５％のアミノ基が、１０ｋＤａのＭＰＥＧＣ（ＭＷ＝１０ｋＤａ；ＳｕｎＢｒｉｇｈｔ；ＭＥ−１００ＨＳ；ロット番号Ｍ６２５０３；透明溶液）で塞がれており、および残存するアミノ基は、エチレンジアミン四酢酸（ｅｔｈｙｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）（ＤＴＰＡ）で塞がれている。１５ＰＡＬＰＥＧ１０３５ＤＴＰＡを合成するためには、１．０ｇのポリアリルアミンの塩酸塩（ＴＮＢＳにより測定すると、１当量のアミノ基を有する）を取り、２５ｍｌの０．２Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．４（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）中に溶解させて、１５ＰＡＬ溶液を得る。別個の容器中で、０．３５当量のＭＰＥＧＣ（ＭＷ＝１０ｋＤａ；カルボキシル基を末端に有するメトキシＰＥＧ、Ｌｙｓａｎ ｂｉｏ；Ａｒａｂ、ＡＬ製）を、６０ｍｌの２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ＝４．７中に溶解させ、０．５当量のＮＨＳ（ＭＷ＝１１５．１４）を添加し、溶解したら、１当量のＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１；１０．４３ミリモル）を添加し、２０分間撹拌する。２０分後に、活性化させたＭＰＥＧＣを、１５ＰＡＬ溶液に直接添加し、２時間後に、アミノ基をＴＮＢＳにより測定して、アミノ基の３５％の飽和を保証し、そうでなければ、活性化させたＭＰＥＧＣのさらなる適切な量を添加する。これが、１５ＰＡＬＰＥＧ１０３５溶液である。分子ふるいクロマトグラフィーを、ＴｏｓｏｈＧ４０００ＷＸＬカラム（０．７９×３０ｃｍ）を使用して実施し、１５％アセトニトリルを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１１．９ｍＭホスフェート、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＰＯ４、ｐＨ７．４）を用いて、０．６ｍｌ／分の流速で溶出する。保持時間は、およそ１４〜１７ｎｍの分子直径と一致するはずである。５当量のＤＴＰＡ二無水物（ＭＷ＝３５７．３２；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ Ｃｏ．、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ。カタログ番号２８４０２５）、続いて、２００μＬのＴＥＡを添加する。反応を、１０Ｎ ＮａＯＨを用いてゆっくり滴定してｐＨ７．８とし、４時間撹拌する。ＴＮＢＳ反応を使用して、アミノ基が残存せず反応が完全であること、および１５ＰＡＬＰＥＧ１０３５ＤＴＰＡ生成物が作製されたことを確認する。分子ふるいクロマトグラフィーを、ＴｏｓｏｈＧ４０００ＷＸＬカラム（０．７９×３０ｃｍ）を使用して実施し、１５％アセトニトリルを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１１．９ｍＭホスフェート、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＰＯ４、ｐＨ７．４）を用いて、０．６ｍｌ／分の流速で溶出する。保持時間は、１７〜２１ｎｍの分子直径と一致するはずである。得られた１５ＰＡＬＰＥＧ１０３５ＤＴＰＡを、１００，０００ＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−１００−Ｅ−５Ａ；ＧＥ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して１５倍の体積の水を用いて洗浄し、凍結乾燥する。
（実施例３４）
１５ＰＡＬＰＥＧ１０３５ＤＴＰＡＳＯ、または１５ＰＡＬＰＥＧ１０３５ＤＴＰＡＳＦ、または１５ＰＡＬＰＥＧ１０３５ＤＴＰＡＰＯの合成
この構造は、１５ｋＤａのポリアリルアミンを含み、この場合、３５％のアミノ基が、１０ｋＤａのＭＰＥＧに共有結合的に連結しており、残存するアミノ基は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）のカルボニル基のうちの１つに共有結合的に連結している。ＤＴＰＡをさらに修飾して、それぞれがＤＴＰＡのカルボニル基につながった４つのサルフェート基を含有させる。本質的に、それぞれのＤＴＰＡが、スペーサーとして作用して、４つのサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基のクラスターが、ポリアリルアミン骨格につながるのを可能にする（また、その他の骨格も使用することができる）。１５ＰＡＬＰＥＧ１０３５ＤＴＰＡ（上記を参照されたい）を、各クラスター中に最高４つのサルフェート基を有するサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基のクラスターを含有する、硫酸化した（またはスルホン化したまたはリン酸化した）キャリアに変換することができる。こうするためには、２グラムの１５ＰＡＬＰＥＧ１０３５ＤＴＰＡを取り、それを、５０ｍｌの１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ４．７）中に溶解させる。キャリアを、０．２８ｇのＮＨＳＳ（ＭＷ＝２１７．１４；１．３ミリモル）、続いて、０．５６ｇのＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１；２．９ミリモル）を添加することによって活性化させ、２０分間活性化させる。別個の容器中で、０．３７ｇの２−アミノエチルハイドロゲンサルフェート（ＡＥＳ；ＭＷ＝１４１；２．６ミリモル）または０．４５ｇのスルファニル酸（ＳＮＡ；ＭＷ＝１７３；２．６ミリモル）または０．３７ｇのＯ−ホスホリルエタノールアミン（ＯＰＥ；ＭＷ＝１４１；２．６ミリモル）を、２５ｍｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３、ｐＨを、ＮａＯＨを使用して７．８に調節する）中に溶解させ、開始アミノ基を、ＴＮＢＳにより測定し（Ｓｐａｄａｒｏら、１９７９年、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、９６巻、３１７〜３２９頁）、開始アミノ基は、ＡＥＳ（またはＳＮＡまたはＯＰＥ）の純度に応じておよそ２．６ミリモル存在するはずである。２０分間活性化させたキャリアを、ＡＥＳ（またはＳＮＡまたはＯＰＥ）溶液に添加する。２時間後に、別の０．５６ｇのＥＤＣを添加し、溶液を一晩撹拌する。アミノ基をＴＮＢＳにより測定して、アミノ基の減少量を決定し、アミノ基の減少量は、組み込まれたサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基の量と同等である。硫酸化した（またはスルホン化したまたはリン酸化した）キャリアを、１００ｋＤａのＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−１００−Ｅ−５Ａ；ＧＥ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して２０倍の体積の水により洗浄し、ろ過滅菌し（０．２μｍのポリスルホン製フィルター、Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）、凍結乾燥する。この生成物（１５ＰＡＬＰＥＧ１０３５ＤＴＰＡＳＯ、または１５ＰＡＬＰＥＧ１０３５ＤＴＰＡＳＦ、または１５ＰＡＬＰＥＧ１０３５ＤＴＰＡＰＯ）は、骨格にぶら下がった１つのクラスター当たり最高４つのサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基のクラスターを有するであろう。
（実施例３５）
２０ＰＭＡＰＥＧ１０３５ＮＴＡの合成
２０ＰＭＡＰＥＧ１０３５ＮＴＡを、本発明の陰イオンコア組成物のうちのいくつかの合成のための出発材料として使用する。この組成物は、ポリメチルメタクリレート（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、Ｓｔ Ｌｕｉｓ、Ｍｏ．、カタログ番号８１４９８、ＭＷ＝２０ｋＤａ）を、ポリマー骨格として有し、３５％のメトキシ基が、１０ｋＤａのＭＰＥＧＡＭ（ＭＷ＝１０ｋＤａ、アミノ基を末端に有するＭＰＥＧ；Ｓｕｎｂｉｏ、Ｏｒｉｎｄａ、ＣＡ；カタログ番号Ｐ１ＡＭ−１０）で置き換わっており、残存するメトキシ基は、ニトリロ三酢酸で塞がれている。この組成物を調製するためには、ポリメチルメタクリレート（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、Ｓｔ Ｌｕｉｓ、Ｍｏ．、カタログ番号８１４９８、ＭＷ＝２０ｋＤａ）中の全てのメトキシ基を、メタノール／ＫＯＨを使用して除去して、ポリメタクリル酸（ｐｏｌｙｍｅｔｈｙｌａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ）（ＰＭＡ）を得る。手短に述べると、２ｇのポリメチルメタクリレート（ｐｏｌｙｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈｃｒｙｌａｔｅ）を、２５ｍｌの１０％メタノール性ＫＯＨ中に溶解させ、９６時間還流する。ＨＣｌを用いて中和し、メタノールを、４０℃における回転蒸発により除去し、固体を水中に溶解させ、３ｋＤａ−ＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−３−Ｅ−５Ａ）中で、水を１５回変えて洗浄する。得られた生成物（ＰＭＡ）を、（０．２μｍのポリスルホン製フィルター、Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を使用してろ過滅菌し、凍結乾燥して、ＰＭＡを得る。１．０ｇのＰＭＡ中の開始カルボキシル基（１当量）を、ＫｏｂａｙａｈｉおよびＣｈｉｂａによるプロトコール（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９４年、２１９巻、１８９〜１９４頁）に従って測定する。２０ＰＭＡＰＥＧ１０３５ＮＴＡを合成するためには、１．０ｇのＰＭＡ（１当量のカルボキシル基を有する）を取り、２５ｍｌの１０ｍＭ ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）緩衝液、ｐＨ４．７中に溶解させ（ＰＳ溶液）、１当量のＮＨＳ（ＭＷ＝１１５．１４）および１当量のＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１）を添加することによって活性化させる。別個の容器中で、０．３５当量のＭＰＥＧＡＭ（ＭＷ＝１０ｋＤａ、アミノ基を末端に有するＭＰＥＧ；Ｓｕｎｂｉｏ、Ｏｒｉｎｄａ、ＣＡ；カタログ番号Ｐ１ＡＭ−１０）を、１０ｍｌの０．２Ｍ
ＨＥＰＥＳ中に溶解させ、１０Ｎ ＮａＯＨを用いて、ｐＨを上げて７．８に調節する。２０分間のＰＭＡの活性化の後に、ＰＭＡを、ＭＰＥＧＡＭ溶液に添加する。反応を２時間進行させ、ＭＰＥＧＡＭの残存するアミノ基を、ＴＮＢＳにより測定すると、残存するアミノ基は存在しないはずであり、このことは、０．３５当量のアミノ基全てを、使い切り、ＰＭＡにコンジュゲートさせたことを示している。残存するアミノ基が存在する場合には、ｐＨを、６Ｎ ＨＣｌを用いて５に調節し、１当量のＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１）を添加し、２０分後に、ｐＨを調節して７．８に戻し、一晩反応させる。得られた２０ＰＭＡＰＥＧ１０３５溶液の一定分量を取り、流体力学直径を、分子ふるいクロマトグラフィーにより、ＴｏｓｏｈＧ４０００ＷＸＬカラム（０．７９×３０ｃｍ）、および溶出溶媒としての、１５％アセトニトリルを含有する、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１１．９ｍＭホスフェート、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＰＯ４、ｐＨ７．４）を使用して、０．６ｍｌ／分の流速で決定する。保持時間は、およそ１３〜１８ｎｍの直径と一致するはずである。ｐＨを、６Ｎ ＨＣｌを用いて下げて５に調節し、１．５当量のＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１）を添加し、２０分間活性化させる。２０分後に、この活性化させた２０ＰＭＡＰＥＧ１０３５溶液を、２５ｍｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．４中の、１０当量のＮα，Ｎα−ビスカルボキシメチル−リシン（ＭＷ＝２６２Ｄａ）に添加し、一晩反応させる。反応混合物を、１００ｍｌに濃縮し、１００ｋＤａ−ＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−１００−Ｅ−５Ａ）中で、水を１５回変えて洗浄する。２０ＰＭＡＰＥＧ１０３５ＮＴＡ生成物を、（０．２μｍのポリスルホン製フィルター、Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹを使用して）ろ過滅菌し、凍結乾燥する。得られた２０ＰＭＡＰＥＧ１０３５ＮＴＡの１０ｍｇ／ｍｌ溶液を作製し、流体力学直径を、分子ふるいクロマトグラフィーにより、ＴｏｓｏｈＧ４０００ＷＸＬカラム（０．７９×３０ｃｍ）、および溶出溶媒としての、１５％アセトニトリルを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１１．９ｍＭホスフェート、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＰＯ４、ｐＨ７．４）を使用して、０．６ｍｌ／分の流速で決定する。保持時間は、およそ１６〜２０ｎｍの直径と一致するはずである。
（実施例３６）
２０ＰＭＡＰＥＧ１０３５ＮＴＡＳＯ、または２０ＰＭＡＰＥＧ１０３５ＮＴＡＳＦ、または２０ＰＭＡＰＥＧ１０３５ＮＴＡＰＯの合成
この構造は、２０ｋＤａのポリメチルアクリレートを含み、この場合、３５％のカルボキシル基が、１０ｋＤａのＭＰＥＧに共有結合的に連結しており、残存するカルボキシル基は、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）の誘導体であるビスカルボキシメチルリシンのイプシロンアミノ基に共有結合的に連結している。ＮＴＡをさらに修飾して、それぞれがＮＴＡのカルボニル基につながった３つのサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基を含有させる。本質的に、それぞれのＮＴＡが、スペーサーとして作用して、３つのサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基のクラスターが、ポリメチルアクリレート骨格につながるのを可能にする（また、その他の骨格も使用することができる）。２０ＰＭＡＰＥＧ１０３５ＮＴＡ（上記を参照されたい）を、各クラスター中に最高３つのサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基を有するサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基のクラスターを含有する、硫酸化した（またはスルホン化したまたはリン酸化した）キャリアに変換することができる。こうするためには、２グラムの２０ＰＭＡＰＥＧ１０３５ＮＴＡを取り、それを、５０ｍｌの１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ４．７）中に溶解させる。キャリアを、０．２８ｇのＮＨＳＳ（ＭＷ＝２１７．１４；１．３ミリモル）、続いて、０．５６ｇのＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１；２．９ミリモル）を添加することによって活性化させ、２０分間活性化させる。別個の容器中で、０．３７ｇの２−アミノエチルハイドロゲンサルフェート（ＡＥＳ；ＭＷ＝１４１；２．６ミリモル）または０．４５ｇのスルファニル酸（ＳＮＡ；ＭＷ＝１７３；２．６ミリモル）または０．３７ｇのＯ−ホスホリルエタノールアミン（ＯＰＥ；ＭＷ＝１４１；２．６ミリモル）を、２５ｍｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３、ｐＨを、ＮａＯＨを使用して７．８に調節する）中に溶解させ、開始アミノ基を、ＴＮＢＳにより測定し（Ｓｐａｄａｒｏら、１９７９年、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、９６巻、３１７〜３２９頁）、開始アミノ基は、ＡＥＳ（またはＳＮＡまたはＯＰＥ）の純度に応じておよそ２．６ミリモル存在するはずである。２０分間活性化させたキャリアを、ＡＥＳ（またはＳＮＡまたはＯＰＥ）溶液に添加する。２時間後に、別の０．５６ｇのＥＤＣを添加し、溶液を一晩撹拌する。アミノ基をＴＮＢＳにより測定して、アミノ基の減少量を決定し、アミノ基の減少量は、組み込まれたサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基の量と同等である。硫酸化した（またはスルホン化したまたはリン酸化した）キャリアを、１００ｋＤａのＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−１００−Ｅ−５Ａ；ＧＥ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して２０倍の体積の水により洗浄し、ろ過滅菌し（０．２μｍのポリスルホン製フィルター、Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）、凍結乾燥する。この生成物（２０ＰＭＡＰＥＧ１０３５ＮＴＡＳＯ、または２０ＰＭＡＰＥＧ１０３５ＮＴＡＳＦ、または２０ＰＭＡＰＥＧ１０３５ＮＴＡＰＯ）は、骨格にぶら下がった１つのクラスター当たり最高３つのサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基のクラスターを有するであろう。
（実施例３７）
１５ＰＡＣＰＥＧ１０３５ＮＴＡの合成
１５ＰＡＣＰＥＧ１０３５ＮＴＡを、本発明の陰イオンコア組成物のうちのいくつかの合成のための出発材料として使用する。この組成物は、ポリアクリル酸（ｐｏｌｙｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ）またはＰＡＣ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、Ｓｔ Ｌｕｉｓ、Ｍｏ．、カタログ番号８１１２３、ＭＷ＝１６ｋＤａ）を、ポリマー骨格として有し、３５％のカルボキシル基が、１０ｋＤａのＭＰＥＧＡＭ（ＭＷ＝１０ｋＤａ、アミノ基を末端に有するＭＰＥＧ；Ｓｕｎｂｉｏ、Ｏｒｉｎｄａ、ＣＡ；カタログ番号Ｐ１ＡＭ−１０）に連結しており、残存するカルボキシル基は、ニトリロ三酢酸で塞がれている。１．０ｇのＰＡＣ中の開始カルボキシル基（１当量）を、ＫｏｂａｙａｈｉおよびＣｈｉｂａによるプロトコール（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９４年、２１９巻、１８９〜１９４頁）に従って測定する。１５ＰＡＣＰＥＧ１０３５ＮＴＡを合成するためには、１．０ｇのＰＡＣ（１当量のカルボキシル基を有する）を取り、２５ｍｌの１０ｍＭ ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）緩衝液、ｐＨ４．７中に溶解させる（ＰＡＣ溶液）。１当量のＮＨＳ（ＭＷ＝１１５．１４）および１当量のＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１）を、ＰＡＣ溶液に撹拌しながら添加して、ＰＡＣを活性化させる。別個の容器中で、０．３５当量のＭＰＥＧＡＭ（ＭＷ＝１０ｋＤａ、アミノ基を末端に有するＭＰＥＧ；Ｓｕｎｂｉｏ、Ｏｒｉｎｄａ、ＣＡ；カタログ番号Ｐ１ＡＭ−１０）を、２０ｍｌの０．２Ｍ ＨＥＰＥＳ中に溶解させ、ｐＨを、ＮａＯＨを使用して７．８に調節して、ＭＰＥＧＡＭを得る。２０分間のＰＡＣの活性化の後に、ＰＡＣ溶液を、ＭＰＥＧＡＭ溶液に添加する。反応を２時間進行させ、ＭＰＥＧＡＭの残存するアミノ基を、ＴＮＢＳにより測定すると、残存するアミノ基は、存在しないはずであり、このことは、０．３５当量のアミノ基全てを、使い切り、ＰＡＣにコンジュゲートさせたことを示している。ＭＰＥＧＡＭ中に残存するアミノ基が存在する場合には、ｐＨを、６Ｎ ＨＣｌを用いて５に調節し、１当量のＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１）を添加し、２０分後に、ｐＨを調節して７．８に戻し、一晩反応させて、１５ＰＡＣＰＥＧ１０３５を形成する。得られた１５ＰＡＣＰＥＧ１０３５溶液の一定分量を取り、流体力学直径を、分子ふるいクロマトグラフィーにより、ＴｏｓｏｈＧ４０００ＷＸＬカラム（０．７９×３０ｃｍ）、および溶出溶媒としての、１５％アセトニトリルを含有する、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１１．９ｍＭホスフェート、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＰＯ４、ｐＨ７．４）を使用して、０．６ｍｌ／分の流速で決定する。保持時間は、およそ１２〜１７ｎｍの直径と一致するはずである。ｐＨを、６Ｎ ＨＣｌを用いて下げて５に調節し、１．５当量のＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１）を添加し、２０分間活性化させる。２０分後に、この活性化させた１５ＰＡＣＰＥＧ１０３５溶液を、２５ｍｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．４中の、１０当量のＮα，Ｎα−ビスカルボキシメチル−リシン（ＭＷ＝２６２Ｄａ）に添加し、一晩反応させる。反応混合物を、１００ｍｌに濃縮し、１００ｋＤａ−ＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−１００−Ｅ−５Ａ）中で、水を１５回変えて洗浄する。１５ＰＡＣＰＥＧ１０３５ＮＴＡ生成物を、（０．２μｍのポリスルホン製フィルター、Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹを使用して）ろ過滅菌し、凍結乾燥する。得られた１５ＰＡＣＰＥＧ１０３５ＮＴＡの１０ｍｇ／ｍｌ溶液を作製し、流体力学直径を、分子ふるいクロマトグラフィーにより、ＴｏｓｏｈＧ４０００ＷＸＬカラム（０．７９×３０ｃｍ）、および溶出溶媒としての、１５％アセトニトリルを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１１．９ｍＭホスフェート、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＰＯ４、ｐＨ７．４）を使用して、０．６ｍｌ／分の流速で決定する。保持時間は、およそ１５〜２０ｎｍの直径と一致するはずである。
（実施例３８）
１５ＰＡＣＰＥＧ１０３５ＮＴＡＳＯ、または１５ＰＡＣＰＥＧ１０３５ＮＴＡＳＦ、または１５ＰＡＣＰＥＧ１０３５ＮＴＡＰＯの合成
この構造は、１５ｋＤａのポリアクリル酸を含み、この場合、３５％のカルボキシル基が、１０ｋＤａのＭＰＥＧに共有結合的に連結しており、残存するカルボキシル基は、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）の誘導体であるビスカルボキシメチルリシンのイプシロンアミノ基に共有結合的に連結している。ＮＴＡをさらに修飾して、それぞれがＮＴＡのカルボニル基につながった３つのサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基を含有させる。本質的に、それぞれのＮＴＡが、スペーサーとして作用して、３つのサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基のクラスターが、ポリアクリル酸骨格につながるのを可能にする（また、その他の骨格も使用することができる）。１５ＰＡＣＰＥＧ１０３５ＮＴＡ（上記を参照されたい）を、各クラスター中に最高３つのサルフェート基を有するサルフェート基のクラスターを含有する、硫酸化した（またはスルホン化したまたはリン酸化した）キャリアに変換することができる。こうするためには、２グラムの１５ＰＡＣＰＥＧ１０３５ＮＴＡを取り、それを、５０ｍｌの１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ４．７）中に溶解させる。キャリアを、０．２８ｇのＮＨＳＳ（ＭＷ＝２１７．１４；１．３ミリモル）、続いて、０．５６ｇのＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１；２．９ミリモル）を添加することによって活性化させ、２０分間活性化させる。別個の容器中で、０．３７ｇの２−アミノエチルハイドロゲンサルフェート（ＡＥＳ；ＭＷ＝１４１；２．６ミリモル）または０．４５ｇのスルファニル酸（ＳＮＡ；ＭＷ＝１７３；２．６ミリモル）または０．３７ｇのＯ−ホスホリルエタノールアミン（ＯＰＥ；ＭＷ＝１４１；２．６ミリモル）を、２５ｍｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３、ｐＨを、ＮａＯＨを使用して７．８に調節する）中に溶解させ、開始アミノ基を、ＴＮＢＳにより測定し（Ｓｐａｄａｒｏら、１９７９年、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、９６巻、３１７〜３２９頁）、開始アミノ基は、ＡＥＳ（またはＳＮＡまたはＯＰＥ）の純度に応じておよそ２．６ミリモル存在するはずである。２０分間活性化させたキャリアを、ＡＥＳ（またはＳＮＡまたはＯＰＥ）溶液に添加する。２時間後に、別の０．５６ｇのＥＤＣを添加し、溶液を一晩撹拌する。アミノ基をＴＮＢＳにより測定して、アミノ基の減少量を決定し、アミノ基の減少量は、組み込まれたサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基の量と同等である。硫酸化した（またはスルホン化したまたはリン酸化した）キャリアを、１００ｋＤａのＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−１００−Ｅ−５Ａ；ＧＥ−Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して２０倍の体積の水により洗浄し、ろ過滅菌し（０．２μｍのポリスルホン製フィルター、Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）、凍結乾燥する。この生成物を、（０．２μｍのポリスルホン製フィルター、Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）、凍結乾燥する。この生成物（１５ＰＡＣＰＥＧ１０３５ＮＴＡＳＯ、または１５ＰＡＣＰＥＧ１０３５ＮＴＡＳＦ、または１５ＰＡＣＰＥＧ１０３５ＮＴＡＰＯ）は、骨格にぶら下がった１つのクラスター当たり最高３つのサルフェート（またはスルホネートまたはホスフェート）基のクラスターを有する。
特定の修飾可能な官能基を有さないポリマー骨格の使用。
（実施例３９）
ポリグリシン、ポリアラニン、ポリバリン、フェニルアラニン、ポリオキシエチレングリコール、ポリオキシプロピレングリコール等（この実施例では、グループとして、ＩＮＲＴと呼ぶ）の、ポリマー骨格としての使用は、カルボキシル官能基を、これらのポリマー全体を通して導入することができる非特異的な光反応性のヘテロ二官能性架橋剤の使用により可能となる。
光反応性のヘテロ二官能性架橋剤の例として、ＮＨＳ−ジアジリン（スクシンイミジル４，４’−アジペンタノエート）、ＮＨＳ−ＬＣ−ジアジリン（スクシンイミジル６−（４，４’−アジペンタンアミド）ヘキサノエート）、ＮＨＳ−ＳＳ−ジアジリン（スクシンイミジル２−（［４，４’−アジペンタンアミド］エチル）−１，３’−ジチオプロピオネート）、スルホ−ＮＨＳ−ジアジリン（スルホスクシンイミジル４，４’−アジペンタノエート）、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ジアジリン（スルホスクシンイミジル６−（４，４’−アジペンタンアミド）ヘキサノエート）、スルホ−ＮＨＳ−ＳＳ−ジアジリン（スルホスクシンイミジル２−（［４，４’−アジペンタンアミド］エチル）−１，３’−ジチオプロピオネート）、ＡＮＢ−ＮＯＳ（Ｎ−５−アジド−２−ニトロベンゾイルオキシサクシンイミド）、ＮＨＳ−ＡＳＡ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジドサリチル酸）、ＳＡＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル（４−アジドフェニル）−１，３’−ジチオプロピオネート）、スルホ−ＳＡＮＤ（スルホスクシンイミジル−２−（ｍ−アジド−ｏ−ニトロベンズアミド）−エチル−１，３’−プロピオネート（ｐｒｏｐｒｉｏｎａｔｅ））、ＳＡＮＰＡＨ（Ｎ−スクシンイミジル−６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート）、スルホ−ＨＳＡＢ（Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドベンゾエート）、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＡＳＡ（スルホスクシンイミジル［４−アジドサリチルアミド］−ヘキサノエート）、スルホ−ＳＡＤＰ（Ｎ−スルホスクシンイミジル（４−アジドフェニル）−１，３’−ジチオプロピオネート）、スルホ−ＳＡＥＤ（スルホスクシンイミジル２−［７−アミノ−４−メチルクマリン−３−アセトアミド］エチル−１，３’ジチオプロピオネート）、スルホ−ＳＡＮＰＡＨ（Ｎ−スルホスクシンイミジル−６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート）、スルホ−ＳＢＥＤ（スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−２−（６−［ビオチンアミド］−２−（ｐ−アジドベンズアミド）−ヘキサノアミド）エチル−１，３’−ジチオプロピオネート）、およびスルホ−ＳＦＡＤ（スルホスクシンイミジル−（ペルフルオロアジドベンズアミド）−エチル−１，３’−ジチオプロピオネート）が挙げられる。これらの試薬は全て、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬから市販されている。光反応性の試薬は、紫外光または可視光に曝されると反応性になる、化学的には不活性な試薬である。これらの試薬中の伝統的な光反応性の基は、アリールアジドである。アリールアジドがＵＶ光に曝されると、これは、ナイトレン基を形成し、ナイトレン基は、二重結合との付加反応、Ｎ−Ｈの部位（例えば、一級アミン）の非存在下では、Ｃ−Ｈへの挿入を開始することができ、この挿入は、ＩＮＲＴポリマーの場合に当てはまる。試料中に一級アミンが存在する場合には、Ｎ−Ｈの経路との反応が優位を占め、これは回避しなければならない。チオール含有還元剤（例えば、ＤＴＴまたは２−メルカプトエタノール）を、試料溶液中では、光活性化の前および間の全てのステップの間に回避しなければならない。これらの試薬は、アジドを還元する。スクシンイミジル−エステルのジアジリン（ＳＤＡ）試薬は、実績のあるアミン反応性の化学的性質と効率的なジアジリンに基づいた光化学的性質との組合せである新しいクラスの架橋剤であって、ほとんどあらゆるその他の官能基に光架橋結合する。ジアジリンに基づいた光架橋剤は、フェニルアジドに基づいた光架橋剤よりも良好な光安定性を示し、長波のＵＶ光（３３０〜３７０ｎｍ）により容易に活性化される。以下の合成の実施例では、ＩＮＲＴを、容易に修飾可能な基を有さないポリマーと呼ぶ。
（実施例４０）
２０ＩＮＲＴＰＥＧＧ１０３５ＮＴＡの合成
この組成物は、ＩＮＲＴを、ポリマー骨格として有し、３５％の、光により導入したカルボキシル基が、１０ｋＤａのＭＰＥＧＡＭ（ＭＷ＝１０ｋＤａ、アミノ基を末端に有するＭＰＥＧＡＭ；Ｓｕｎｂｉｏ、Ｏｒｉｎｄａ、ＣＡ；カタログ番号Ｐ１ＡＭ−１０）に連結しており、残存するカルボキシル基は、ニトリロ三酢酸で塞がれている。上記したように、ＮＴＡを、ポリマー中に導入したら、サルフェート、スルホネートおよびホスフェートの付加は簡単である（上記を参照されたい）。サルフェート、スルホネートおよびホスフェートを導入すると、ＮＴＡのキレート化機能は、顕著に低下するかまたは排除される。カルボキシル基を、ＩＮＲＴポリマーに導入するためには、２ｇのＩＮＲＴ（２０ｋＤａ）を、５０〜１００ｍｌの適切な溶媒中に溶解させ、２０〜４０ミリモルのスルホ−ＮＨＳ−ジアジリンを添加し、溶液を、ＵＶ光（３３０〜３７０ｎｍ）に２〜１０分間曝す。ｐＨを９に調節し、室温で２時間放置して、ＮＨＳを切断し、カルボキシル基を、分析および品質管理試験のために曝露させる。修飾した生成物を、３ｋＤａ−ＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−３−Ｅ−５Ａ）中で、水を１５回変えて洗浄する。得られたカルボキシル化した生成物（２０ＩＮＲＴ）を、（０．２μｍのポリスルホン製フィルター、Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を使用してろ過滅菌し、凍結乾燥して、２０ＩＮＲＴを得る。２０ＩＮＲＴを、２０ＩＮＲＴＰＥＧＧ１０３５ＮＴＡの合成のために使用する前に、１．０ｇの２０ＩＮＲＴ中の開始カルボキシル基（１当量）を、ＫｏｂａｙａｈｉおよびＣｈｉｂａによるプロトコール（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９４年、２１９巻、１８９〜１９４頁）に従って測定する。１グラムの２０ＩＮＲＴ中に１ミリモル未満のカルボキシルしか存在しない場合には、より多くのカルボキシルを、上記のプロセスを反復することによって導入する。２０ＩＮＲＴＰＥＧＧ１０３５ＮＴＡを合成するためには、１．０ｇのＩＮＲＴ（１当量のカルボキシル基を有する）を取り、５０ｍｌの１０ｍＭ ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）緩衝液、ｐＨ４．７中に溶解させて、ＩＮＲＴ溶液を得る。ＩＮＲＴＰＥＧ溶液に、１当量のＮＨＳ（ＭＷ＝１１５．１４）および１当量のＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１）溶液を撹拌しながら添加して、２０分間活性化させる。別個の容器中で、０．３５当量のＭＰＥＧＡＭ（ＭＷ＝１０ｋＤａ、アミノ基を末端に有するＭＰＥＧ；Ｓｕｎｂｉｏ、Ｏｒｉｎｄａ、ＣＡ；カタログ番号Ｐ１ＡＭ−１０）を、２０ｍｌの０．２Ｍ ＨＥＰＥＳ中に溶解させ、ｐＨを、ＮａＯＨを使用して７．８に調節する。２０分間のＩＮＲＴの活性化の後に、ＩＮＲＴ溶液に添加して、ＩＮＲＴＰＥＧ溶液を作製する。反応を２時間進行させ、ＭＰＥＧＡＭの残存するアミノ基を、ＴＮＢＳにより測定すると、残存するアミノ基は存在しないはずであり、このことは、０．３５当量のアミノ基全てを、使い切り、ＩＮＲＴにコンジュゲートさせたことを示している。ＭＰＥＧＡＭ中に残存するアミノ基が存在する場合には、ｐＨを、６Ｎ ＨＣｌを用いて５に調節し、１当量のＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１）を添加し、２０分後に、ｐＨを調節して７．１に戻し、一晩反応させて、２０ＩＮＲＴＰＥＧＧ１０３５を形成する。得られた２０ＩＮＲＴＰＥＧＧ１０３５溶液の一定分量を取り、流体力学直径を、分子ふるいクロマトグラフィーにより、ＴｏｓｏｈＧ４０００ＷＸＬカラム（０．７９×３０ｃｍ）、および溶出溶媒としての、１５％アセトニトリルを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１１．９ｍＭホスフェート、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＰＯ４、ｐＨ７．４）を使用して、０．６ｍｌ／分の流速で決定する。保持時間は、およそ１２〜１７ｎｍの直径と一致するはずである。ｐＨを、６Ｎ ＨＣｌを用いて下げて５に調節し、１．５当量のＥＤＣ（ＭＷ＝１９１．７１）を添加し、２０分間活性化させる。２０分後に、この活性化させた２０ＩＮＲＴＰＥＧＧ１０３５溶液を、２５ｍｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．４中の、１０当量のＮα，Ｎα−ビスカルボキシメチル−リシン（ＭＷ＝２６２Ｄａ）に添加し、一晩反応させる。反応混合物を、１００ｍｌに濃縮し、１００ｋＤａ−ＭＷＣＯの限外ろ過カートリッジ（ＵＦＰ−１００−Ｅ−５Ａ）中で、水を１５回変えて洗浄する。２０ＩＮＲＴＰＥＧＧ１０３５ＮＴＡ生成物を、（０．２μｍのポリスルホン製フィルター、Ｎａｌｇｅｎｅ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹを使用して）ろ過滅菌し、凍結乾燥する。得られた２０ＩＮＲＴＰＥＧＧ１０３５ＮＴＡの１０ｍｇ／ｍｌ溶液を作製し、流体力学直径を、分子ふるいクロマトグラフィーにより、ＴｏｓｏｈＧ４０００ＷＸＬカラム（０．７９×３０ｃｍ）、および溶出溶媒としての、１５％アセトニトリルを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１１．９ｍＭホスフェート、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＰＯ４、ｐＨ７．４）を使用して、０．６ｍｌ／分の流速で決定する。保持時間は、およそ１６〜２２ｎｍの直径と一致するはずである。
（実施例４１）
陰イオン相互作用と金属架橋相互作用との区別
結合研究を、高い塩濃度の存在下および非存在下において、７つの異なるキャリア上への５０％積荷（積荷分子の重量に関する量が、使用するキャリアの重量の５０％である）を用いて実施した。陰イオン相互作用は、高い濃度のＮａＣｌ（０．４Ｍ）により排除することができ、一方、金属架橋相互作用は、高い濃度のＮａＣｌでは容易に排除することができない。この研究に関しては、以下のキャリアを試験した：ＣＳＰＥＧ１０４Ｇ、ＨＰＰＥＧ１０５Ｇ、２０ＰＬＰＥＧ１０３０ＤＴＰＡ、２０ＰＬＰＥＧ１０３０ＤＴＰＡＳＯ、２０ＰＬＰＥＧ１０３０ＤＴＰＡＳＦ、および２０ＰＬＰＥＧ１０３０ＤＴＰＡＰＯ。２０ＰＬＰＥＧ５７０ＤＡＮＴＡ−Ｚｎは、２０ｋＤａのポリリシン（ｐｌｏｌｙｓｉｎｅ）骨格を有するキャリアであり、この場合、７０％のアミノ基が、５ｋＤａのＭＰＥＧで誘導体化されており、残存するアミノ基は、ビスカルボキシメチルリシン（ｂｉｃａｒｂｘｙｍｅｔｈｙｌ ｌｙｓｉｎｅ）を使用して、ニトリロ三酢酸で誘導体化されていた。この場合には、コハク酸を、リシンのイプシロンアミノ基と、ビスカルボキシメチルリシン（ｂｉｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｌｙｓｉｎｅ）との間のスペーサーとして使用した。次いで、得られた生成物（２０ＰＬＰＥＧ５７０ＤＡＮＴＡ−Ｚｎ）を、亜鉛イオンで飽和し、金属架橋相互作用の実証のために使用した。下記の結合研究では、この実験中、金属架橋の陽性対照としての、６×Ｈｉｓリゾスタフィンを用いた対照を除き、金属を使用しなかった。この研究のために、２５０μｌの溶液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／４００ｍＭ ＮａＣｌ、または１０ｍＭ ＨＥＰＥＳのみ）中の０．２５ｍｇのキャリアに、リゾスタフィン（キャリア重量の５０％（０．１２５ｍｇ））を積荷し、ＲＴで２時間インキュベートした。分析を、三つ組で行った。全ての溶液を、１３０００ｒｐｍで１２分間遠心分離して（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ製の微量遠心機）、分析を妨げる恐れがある沈殿ペレットの可能性を排除した。上清を、１００ｋＤａのＭＷＣＯのメンブラン（セルロース）を使用して、１３０００ｒｐｍで１２分間ろ過して、キャリア−ペプチドの複合体（結合型）を除去した。ろ液（遊離のリゾスタフィンを含有する）を、ＴＮＢＳアッセイにより分析した（結果を、下記の表２に示す）。［ＴＮＢＳアッセイ：３０μｌの１Ｍピクリルスルホン酸溶液（Ｆｌｕｋａ、カタログ番号９２８２３）を、１２ｍｌの０．１Ｍ四ホウ酸ナトリウム、ｐＨ９．２中に添加することによって、ＴＮＢＳ溶液を調製した。透明な９６ウエルのプレート中に、１５０μｌのろ液および標準物質を添加して、ウエルを割り当てた。１００μｌのＴＮＢＳ溶液を、ウエルに添加した（２５０μｌの最終体積）。プレートを、３０分間インキュベートし、４２０ｎｍにおける吸光度を、ＢｉｏＳｃａｎにより測定した］。下記の表２は、リゾスタフィンと本発明の組成物との相互作用は、金属架橋相互作用によってではなく、陰イオン相互作用を通して生じることを示す。陽性対照については、６−ｈｉｓリゾスタフィンは、亜鉛（金属架橋を形成するのに必要な多価の金属イオン）を含有する対照のキャリアと、金属イオン相互作用を通して相互作用することが示される（最後の列）。このことは、０．４Ｍ ＮａＣｌが、キャリアから６−ｈｉｓリゾスタフィンを排除することができないことから明らかである（最後の列）。表２の第２の行は、陰イオン性のキャリアに積荷したリゾスタフィンのタイプである。表２の第３の行は、インキュベーション混合物中に、０．４Ｍ ＮａＣｌが存在する場合の、キャリアに結合しなかった総リゾスタフィンのパーセントである（ナトリウムイオンおよびカリウムイオンは、多価ではなく、多配位錯体を形成しないことに留意されたい）。表２の第４の行は、インキュベーション混合物中に、ＮａＣｌが存在しない場合の、キャリアに結合しなかった総リゾスタフィンのパーセントである。６−Ｈｉｓ ｌｙｓｏの結合は、０．４Ｍ ＮａＣｌに対して耐性を示す（金属架橋の陽性対照）ことに留意されたい。多価の金属イオンの存在下（ここでは、未表示）で、未変性のリゾスタフィンの、本発明の陰イオンコア組成物への結合が、０．４Ｍ ＮａＣｌに対して感受性の状態を維持することは非常に驚くべきであり、このことは、金属架橋が発生していないことを示している。
表２：キャリアに積荷し、キャリアに結合しなかった総リゾスタフィン（遊離の未結型リゾスタフィン）のパーセントを示す。
（実施例４２）
リゾスタフィンと本発明の陰イオンコアキャリア組成物との間の相互作用のＫｄの決定
リゾスタフィンと種々のキャリアとの間の解離定数（Ｋｄ）を決定した。リゾスタフィンのＫｄを、多価の金属イオンの非存在下で、以下のキャリアを用いて測定した：ＣＳＰＥＧ１０４Ｇ、ＨＰＰＥＧ１０４Ｇ、２０ＰＬＰＥＧ１０３０ＤＴＰＡ、２０ＰＬＰＥＧ１０３０ＤＴＰＡＳＯ、２０ＰＬＰＥＧ１０３０ＤＴＰＡＳＦ、および２０ＰＬＰＥＧ１０３０ＤＴＰＡＰＯ。ロット番号２００９０５０８に、（キャリアの重量と比較して）２５％〜１５０％のリゾスタフィンを積荷して、Ｋｄを測定した。ＣＳＰＥＧ１０４Ｇに、１５０％〜５００％のリゾスタフィンを積荷した。上記に列挙したキャリアの試料に、５０％〜２５０％のリゾスタフィンを積荷して、Ｋｄを測定した。結合型および遊離のリゾスタフィンを、上記の実施例４４に従って分離した。全ての試料を、上記の記載に従って、ＴＮＢＳアッセイにより測定して、遊離および結合型を決定した。遊離および結合型の情報を用いて、スキャッチャードプロットを構築した（ｙ軸が、結合型／遊離であり、ｘ軸が、結合型である）。スキャッチャードプロットから、Ｋｄおよびキャリアの能力を計算し（勾配が、−１／Ｋｄであり、ｘ切片が、能力である）、表３に要約した。これは、リゾスタフィン（９．５６の塩基性の等電点を有するタンパク質）と、本発明の陰イオンコア組成物との間に直接的な相互作用があることを示している。混合物中に、媒介する多価の金属イオンは存在せず、にもかかわらず、ナノモル濃度の範囲のＫｄを観察した。さらに、相互作用は、高いＮａＣｌ濃度に対しては感受性も示した。このことは、配位結合ではなく、イオン性の相互作用を示している。
表３：陰イオンコアキャリアは全て、リゾスタフィン（ｌｙｓｏｓｏｓｔａｐｈｉｎ）と結合するが、最も有効な結合剤は、高度に硫酸化した多糖（ヘパリン）の結合剤である。
（実施例４３）
リゾスタフィンのＰＫ研究
４つのキャリアを、ＰＫ研究ために選択した。ＣＳＰＥＧ１０６Ｇ、ＨＰＰＥＧ１０５Ｇ、２０ＰＬＰＥＧ１０３０−ＤＴＰＡ、および２０ＰＬＰＥＧ１０３０−ＤＴＰＡ−ＳＯに、キャリア重量の５０％に相当するリゾスタフィンを積荷した。これらの製剤は、適切な量のキャリアおよびリゾスタフィンを、水中に一緒に溶解させ、２時間インキュベートし、続いて、凍結乾燥することによって得た。それぞれの凍結乾燥した製剤（製剤化されていないリゾスタフィン単独を含む）を、生理食塩水中に溶解させ、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（ｎ＝４）に、外側尾静脈を介する緩慢な（少なくとも１分の）ｉ．ｖ．ボーラス（１２ｍｇのリゾスタフィン／Ｋｇ）により投与した。血液試料を、眼窩静脈叢から、５分、１５分、３０分、６０分、１２０分、４時間、６時間、２４時間、３２時間（３０時間）および４８時間の時点で採取し、プロテアーゼ阻害剤（ＡＥＢＳＦ、アプロチニン、Ｅ−６４、ＥＤＴＡおよびロイペプチン）を含有する試験管中に入れた。血清を、１３，０００ｒｐｍにおける遠心分離により得た。全ての血清を、アッセイで使用するまで、−８０℃で保存した。このアッセイでは、１０μｌの血清を各時点で使用した。リゾスタフィンの活性を、活性アッセイにより、以下に従って測定した：１Ｍ ＭＯＰＳ／１０重量％Ｔｗｅｅｎ／５ｍＭ ＥＤＴＡ／ｐＨ７．３を含有するストック緩衝液（１０×）を調製した。５μｇの基質、１００ｍＭ ＭＯＰＳ、１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．３、および１０μｌの血清試料を含有する最終反応混合物（２００μＬ）を、黒色の９６ウエルのプレート中に調製した。試料は、最後に添加し、添加後に、ウエルを混合し、溶液中の気泡を、エタノールで湿らせたピペットの先端を使用して除去した。蛍光（Ｅｘ４８５ｎｍ／Ｅｍ５３５ｎｍ）の増加を、Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ９６ウエルマイクロプレート蛍光光度計（Ｂｉｏｓｃａｎ）を使用して、７．５分毎に２時間モニターした。リゾスタフィンが、基質をタンパク質の分解により切断すると、基質から蛍光生成物が生じた。
表４：種々の本発明の陰イオンコア組成物と共に製剤化したリゾスタフィンのＰＫプロファイルを示す。
（実施例４４）
種々の治療用ペプチドの、本発明の陰イオンコア組成物に対する結合
抗炎症ペプチド（配列番号２；配列番号７；配列番号３１）は、細胞内で作用し、これらのペプチドが膜を貫通するのを可能にする塩基性アミノ酸残基を含有する。これらのペプチドが膜を貫通するのを可能にする同じ特性が、これらが本発明のキャリアに結合するのを可能にする。結合研究を、これらのペプチドを用いて、異なる本発明の陰イオンコアキャリア５つに対して実施した。以下の金属を含有しないキャリアを、この研究に関して試験した：ＣＳＰＥＧ１０４Ｇ、ＨＰＰＥＧ１０５Ｇ、２０ＰＬＰＥＧ１０３０ＤＴＰＡ、２０ＰＬＰＥＧ１０３０ＤＴＰＡＳＯ、２０ＰＬＰＥＧ１０３０ＤＴＰＡＳＦ、および２０ＰＬＰＥＧ１０３０ＤＴＰＡＰＯ。この研究のために、２５０μｌの溶液（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／１００ｍＭ ＮａＣｌ）中の、０．１ｍｇ（２０％積荷のため）または１ｍｇ（２％積荷のため）の各キャリアに、ペプチド（０．０２ｍｇ）を積荷し、ＲＴで２時間インキュベートした。分析を、二つ組で行った。溶液を全て、１３０００ｒｐｍで１２分間遠心分離して、分析を妨げる恐れがある沈殿ペレットの可能性を排除した。上清を、１００ｋＤａのＭＷＣＯのメンブラン（セルロース）を使用して、１３０００ｒｐｍで１２分間ろ過して、キャリア−ペプチドの複合体（結合型）を除去した。ろ液（遊離のペプチド）を、ＨＰＬＣアッセイにより分析した。下記の表５は、ＰＥＧを有するヘパリンが、ペプチドのうちのほとんどのための最良のキャリアであったが、陰イオン性のキャリアはいずれも、ペプチド配列番号２のために使用することができることを示す。
表５：キャリアに結合しなかった（遊離の）総ペプチドのパーセントを示すが、残りのペプチドは、キャリアに結合した。
（実施例４５）
配列番号２と本発明の陰イオンコアキャリア組成物との間の相互作用のＫｄの決定
配列番号２は、ＩＫＫγ ＮＥＭＯ結合ドメイン（ＮＢＤ）阻害ペプチドであり、種々の炎症性疾患に有用である。これは、このペプチドが、ＮＦｋＢの活性化を阻害するからである。ＮＢＤと種々のキャリアとの間の解離定数（Ｋｄ）を決定した。ＮＢＤのＫｄを、多価の金属イオンの非存在下で、以下のキャリアを用いて測定した：ＨＰＰＥＧ１０５Ｇ、２０ＰＬＰＥＧ１０３０−ＤＴＰＡＳＯ、および２０ＰＬＰＥＧ１０３０ＤＴＰＡＰＯ。ＨＰＰＥＧ１０５Ｇおよび２０ＰＬＰＥＧ１０３０ＤＴＰＡＰＯに、１００％〜３００％のＮＢＤを積荷して、Ｋｄを測定した。２０ＰＬＰＥＧ１０３０−ＤＴＰＡＳＯに、５０％〜１５０％のＮＢＤを積荷した。全ての未結合のＮＢＤを、上記に従って、ＨＰＬＣにより測定した。遊離および結合型の情報を用いて、スキャッチャードプロットを構築した（ｙ軸が、結合型／遊離であり、ｘ軸が、結合型である）。スキャッチャードプロットから、Ｋｄおよびキャリアの能力を計算し（勾配が、−１／Ｋｄであり、ｘ切片が、能力である）、結果を、表６に要約した。
表６：ＮＢＤに対する、種々のキャリアのＫｄおよび能力を示す。
（実施例４６）
ヘパリン結合性（ＨＢ）−上皮成長因子（−ＥＧＦ）の、本発明のキャリアに対する結合
ＨＢ−ＥＧＦは、上皮成長因子ＥＧＦ関連成長因子であり、ＥＧＦ受容体を通してシグナル伝達を行い、平滑筋細胞（ＳＭＣ）、線維芽細胞、上皮細胞および角化細胞の増殖を刺激する。ＨＢ−ＥＧＦは、血管内皮細胞およびＳＭＣ、マクロファージ、骨格筋、角化細胞、ならびに特定の腫瘍細胞を含めた、多数の細胞型および組織において発現する。ＨＢ−ＥＧＦの、ヘパリンおよびヘパラン硫酸プロテオグリカン（ｈｅｐａｒｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ）に特異的に結合する能力は、その他のＥＧＦ様分子とは明確に異なり、ＨＢ−ＥＧＦが平滑筋細胞に対して発揮する、ＥＧＦと比べて増強された分裂促進活性に関連があり得る。ヒトＨＢ−ＥＧＦ遺伝子は、２０８個のアミノ酸の膜貫通型タンパク質をコードし、このタンパク質は、タンパク質の分解により切断されて、可溶性のＨＢ−ＥＧＦを産生することができる。形質転換成長因子−アルファ（ＴＧＦ−α）は、ＥＧＦ関連ポリペプチド成長因子であり、ＥＧＦ受容体を通してシグナル伝達を行い、広い範囲の上皮性細胞および上皮細胞の増殖を刺激する。この成長因子は、単核球、角化細胞、および種々の腫瘍細胞により生産される。ＴＧＦ−αは、培養細胞において、形質転換の足場非依存性を誘発する。ヒト、マウスおよびラットのＴＧＦ−αは、種交差反応性を示す。組換えヒトＴＧＦ−αは、５０個のアミノ酸のポリペプチド（５．５ｋＤａ）であり、ＥＧＦとおよそ４０％の配列相同性を共有し、６つの保存されているシステイン残基を含み、これらは、３つの分子内ジスルフィド結合を形成する。ベータセルリンおよびアンフィレギュリンの両方が、ＥＧＦファミリーのメンバーである。そのメンバーが本発明のキャリア組成物のための理想的な積荷分子となるであろう別の成長因子ファミリーは、１２個超のメンバーを有することが当技術分野で公知の線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーである。これらの成長因子を、本発明の組成物中に積荷することを意図する。これは、それらの成長因子が、７超の等電点を有するからではなく、それらの構造中に、カルボキシレート、サルフェート、スルホネートまたはホスフェートに結合することが可能である陰イオン性の結合部位を有するからである。下記の表５は、ＥＧＦの、本発明のキャリアに対する結合を示す。この研究のために、２５０μｌの溶液（１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／１００ｍＭ ＮａＣｌ）中の２ｍｇの各キャリアに、ＥＧＦ（０．０１ｍｇ）を積荷し、ＲＴで２時間インキュベートした。分析を、二つ組で行った。溶液は全て、１３０００ｒｐｍで１２分間遠心分離して、分析を妨げる恐れがある沈殿ペレットの可能性を排除した。沈殿は観察されなかった。上清を、１００ｋＤａのＭＷＣＯのメンブラン（セルロース）を使用して、１３０００ｒｐｍで１２分間ろ過して、キャリア−ペプチドの複合体（結合型）を除去した。ろ液（遊離のＥＧＦ）を、Ｅｌｉｓａ Ａｓｓａｙ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）により分析した。下記の表５は、ＥＧＦの、本発明のキャリアに対する結合を示す。
表５：キャリアに結合しなかった（遊離の）総ＥＧＦのパーセントを示すが、残りのＥＧＦは、キャリアに結合した。
（実施例４７）
７．３超の等電点（ｐＩ）を有する積荷分子（タンパク質またはペプチド）は、血中におけるキャリアの保護から利益を得る。
積荷分子を、本発明のキャリアと混合し、動物中に注射した場合、７．３未満の等電点を有する積荷分子の血液循環時間は、製剤化されていない対照と比較して延長しない（表７）。しかし、積荷分子を、本発明のキャリアと混合し、動物中に注射した場合、７．３超の等電点を有する積荷分子については、血液循環時間が、製剤化されていない対照と比較して延長する（表７）。一実施形態では、本発明のキャリアから利益を得るためには、積荷分子は、７．３超のｐＩを有さなければならない。
表７：これは、本発明のキャリアと組み合わせた場合の、塩基性（ｐＩ＞７．３）の積荷分子のｉｎ ｖｉｖｏにおける血液循環時間の延長を示す。
＊Ｎ．Ｄ．は、レベルが、検出されないかまたはバックグラウンドのレベルであることを示す。全てのバックグラウンドのシグナルを、読取り値から減じた。ＧＬＰ１およびヘパリン結合性ＥＧＦのために使用するアッセイはそれぞれ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）製およびＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）製のＥｌｉｓａアッセイキットであり、製造元の指示に従って使用する。リゾスタフィンのために使用したアッセイは、リゾスタフィンにより分解されると、蛍光が増加するＦＲＥＴアッセイであり、アッセイ溶液を、蛍光マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＣＡ）を使用してモニターした。ＰＲ３９のために使用するアッセイは、フルオレセインで標識したＰＲ３９の直接的な蛍光の読取りである。
哺乳動物の血管構造は、陰イオン性の電荷（プロテオグリカン）で裏打ちされており、血液の構成要素（タンパク質および細胞）は全て、陰イオン性である。トリグリセリド等のその他の中性の構成成分は、負に荷電したリポタンパク質中に詰まっている。陰イオン性のキャリアと陽イオン性積荷分子（塩基性の積荷分子）との間のイオン性の相互作用の完全性が、血中で維持されることは驚くべきことであり、予想外である。血液は、イオン性の相互作用を破壊することができる２８０ミリオスモルまたは約１５０ｍＭ塩の重量オスモル濃度を有する。さらに、血液は、陰イオン性のタンパク質および陰イオン性である細胞を含有し、これらは、本発明の陰イオン性のキャリアと競合すること、または積荷分子に結合し、本発明の陰イオン性のキャリアからそれらを取り出こともできる。また、陰イオン性の血管壁は、キャリアから積荷分子を除去することもできる。にもかかわらず、上記の結果は、これらの生理学的な力は、積荷分子と本発明の陰イオン性のキャリアとの間のイオン性の相互作用を圧倒しないことを示している。
本発明の好ましい実施形態を、本明細書に示し、記載してきたが、当業者には、そのような実施形態は、例示のためのみに提供されていることが明らかであろう。本明細書に記載する本発明の実施形態に対する種々の代替物を、本発明を実行する際に利用することができることを理解すべきである。本発明の範囲を明確にするために、本発明の組成物は、ポリマー骨格、保護鎖、陰イオン基、および積荷分子等のブロックとして記載されていることに留意すべきである。各ブロックは、その他のブロックの固有の構成成分であることを意図しない。例えば、特定の実施形態では、骨格は、骨格を未変化の状態で保持するアミドを形成するために使用するカルボキシル基を含有するが、そのようなカルボキシル基は、陰イオン基等のその他のブロックを構成するカルボキシル基と同じではない（すなわち、特許請求の範囲を解釈する際に、循環論法を使用すべきではない）。特定の実施形態では、陰イオン基（カルボキシル、サルフェート、スルホネート（ｓｕｆｏｎａｔｅ）またはホスフェート）を天然に含有するポリマーは、本明細書の目的では、本発明の組成物の骨格（第１のブロック）および陰イオン基（第２のブロック）の両方を含有するものとして取り扱う。その他の実施形態では、陰イオン基を有することを想定する組成は、ポリマー骨格中に存在し得るいずれの陰イオン基とも明確に異なる。特許請求の範囲の解釈においては、特定の組成物を構成するブロックは、定義された様式において相互に関連があり、各ブロックは、相互に重複してはならない。

Claims (13)

  1. ポリリシン、ポリオルニチン、ポリアルギニン、ポリグルタメート、ポリアスパルテート、ポリシステイン、ポリセリン、ポリトレオニン、ポリチロシン、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、カラゲナン、ペクチン、ヒアルロナン、フコイダン、デキストラン、ポリメチルアクリル酸、ポリアクリル酸、およびポリアリルアミンからなる群から選択されるポリマー骨格と、
    複数のペンダント保護鎖であって、各保護鎖が、直鎖状ポリ（エチレングルコール）および直鎖状直鎖状メトキシポリ（エチレングリコール）からなる群から独立に選択され、該ポリマー骨格上のモノマーユニットに一つの共有結合によって、共有結合的に連結する、複数のペンダント保護鎖と、
    複数の陰イオン基であって、各陰イオン基が１つまたは複数の陰イオン部分を含み、各陰イオン部分は、サルフェート、スルホネート、ホスフェート、およびカルボキシルからなる群から独立に選択され、該陰イオン基が、該ポリマー骨格のモノマーユニットに化学単結合によって共有結合的に結合する、複数の陰イオン基と、
    媒介する金属イオンを伴うことなく該陰イオン基に静電相互作用によって直接連結した活性剤であって、
    ｉ）細胞浸透性ペプチドを含み、または
    ｉｉ）陰イオン結合ドメインを含み、または
    ｉｉｉ）７．３超の等電点を有する
    活性剤と
    を含む組成物。
  2. 前記活性剤の少なくとも８５％が、１００ｍＭ水性ＮａＣｌ溶液の存在下で、陰イオン基に連結したままである、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記活性剤が、（ｉ）ペプチド、（ｉｉ）タンパク質、および（ｉｉｉ）小有機分子からなる群から選択される、請求項１または２に記載の組成物。
  4. 前記活性剤が、塩基性アミノ酸（リシンおよびアルギニン）の数から酸性アミノ酸（グルタメートおよびアスパルテート）の数を引いた数が２以上である、５〜１０アミノ酸の細胞浸透性の連続した配列を含むペプチドまたはタンパク質である、請求項１または２に記載の組成物。
  5. 前記ペプチド中の前記細胞浸透性の連続した配列が、１）Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、２）Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ、３）Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ、４）Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ、４）Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ、５）Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ、 および６）Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇからなる群から選択される配列を含み、任意のアミノ酸は、Ｄ異性体であっても、Ｌ異性体であってもよく、提示された該配列の配向は、アミノからカルボキシであっても、カルボキシルからアミノであってもよい、請求項４に記載の組成物。
  6. 請求項１または２に記載の組成物であって、前記活性剤が、
    配列番号１〜５９のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド、リゾスタフィン、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インターフェロン、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、および血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）からなる群から選択される作用物質；あるいは
    配列番号１の最後の１１アミノ酸、配列番号５の最後の８アミノ酸、配列番号７の最後の１２アミノ酸、配列番号９の最後の１０アミノ酸、および配列番号１０の最後の１４アミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチド；あるいは
    抗炎症剤であって、配列番号１〜１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドである、抗炎症剤；あるいは
    リゾスタフィン、インターフェロン、および配列番号１２〜４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドからなる群から選択される、抗感染症薬；あるいは
    配列番号３１〜３４および配列番号４６〜４９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチド、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、および血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）からなる群から選択される成長因子または抗アポトーシス剤；あるいは
    配列番号５０〜５９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドおよびインターフェロンからなる群から選択される、成長阻害剤、を含む、組成物。
  7. 前記骨格が、ポリリシンであり、前記陰イオン基が、カルボキシルである、請求項１から６のいずれかに記載の組成物。
  8. 前記活性剤が、配列番号２６〜２９および３２〜３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチド、ＦＧＦ、およびＨＧＦからなる群から選択される、請求項７に記載の組成物。
  9. 前記骨格がコンドロイチンである、請求項１から６のいずれかに記載の組成物。
  10. 前記活性剤がヘパリン結合性ＥＧＦである、請求項１から３および６から７のいずれかに記載の組成物。
  11. 前記活性剤がリゾスタフィンである、請求項１から３および６から７のいずれかに記載の組成物。
  12. 前記活性剤が配列番号３１のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項１から３および６から７のいずれかに記載の組成物。
  13. 架橋を実質的に欠く、請求項１から１２のいずれかに記載の組成物。
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