CN102665686B - 用于递送治疗剂的阴离子核心组合物以及制备和使用所述组合物的方法 - Google Patents

用于递送治疗剂的阴离子核心组合物以及制备和使用所述组合物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及包含具有保护链和阴离子基团的聚合物骨架以及阳离子治疗剂的组合物。本发明涉及用于治疗感染、炎性疾病、过度生长及受损细胞和器官的组合物。

Description

用于递送治疗剂的阴离子核心组合物以及制备和使用所述组合物的方法
交叉引用
本申请要求于2009年9月9日提交的美国临时申请第61/240857号和2009年9月9日提交的美国临时申请第61/241004号的优先权。
联邦资助研究的声明
本发明是根据国立过敏与传染病研究院(NIAID)的编号为1R43AI078539的合同和国立糖尿病、消化及肾脏疾病研究所(NIDDK)的编号为1R43DK084724的合同项下的美国联邦政府的支持下而完成。美国联邦政府可对本文所述的主题拥有特定权益。
背景技术
新药、制剂和其它用于施用生物活性肽和蛋白质以及其它治疗剂和物质的系统的开发受到提供这些肽或蛋白质或其它物质以获得所需生理效应的需求的推动。对于肽和蛋白质，其中很多已被观察在胃肠道中是不稳定的并且因此可能需要对其进行稳定化或进行保护或者通过体循环进行递送。另外，低分子量的肽和蛋白质倾向于具有较短的生物半衰期，这是由于其通过肾脏和网状内皮系统从体循环有效清除。许多肽和蛋白质还可由于蛋白质水解(肽键切割)而失去其体内活性。
部分地出于避免这些不良效应的目的，可以使用药物递送系统。已经开发了药物递送策略以用于肽和蛋白质的体内递送，但其中大多数不能用于持续性递送。例如，经泵的药物连续全身性输注的使用对于需要高活动水平的非住院患者并不现实。输注具有生活质量的相关不利之处并且有潜在的静脉内(i.v.)路径感染。由具有允许药物透过的膜的胶囊构成的可植入泵的使用受到胶囊体积的限制。肽和蛋白质通常在胶囊内以浓缩的制剂使用并且发生聚集，由此而失去特定活性。在很多情况下，药物被释放于细胞外空间并且分布于淋巴中。其它可植入的生物可降解递送系统被植入或注射入表皮中。所述系统的成分通常由于周边细胞的生物活性而缓慢降解(即，由于降解维系这些植入物在一起的化学键的酶的释放)。
在生理条件下表面携带净正电荷并且具有碱性(高于pH7.5)的等电点(pI)的蛋白质可受益于本发明的组合物。碱性蛋白质的应用具有很大的治疗潜力，包括应用于治疗癌症和相关的肿瘤疾病、全身性感染、炎症以及神经系统疾病诸如阿尔茨海默氏症、帕金森氏症和朊蛋白病。对用于碱性(pI高于pH7.5)的蛋白质和肽的全身性递送的生物可降解药物递送载体存在着需求，其提供更长的体内循环、在血液中更高的稳定性，并且可更方便地施用。在本发明的一个实施方案中，受益于本发明的载体的抗感染剂是pI为9.56的溶葡球菌素。可潜在地用于在体内阻断特定的细胞内机制的大多数肽和药物需要碱性部分，诸如允许膜内化的氨基基团。通过与碱性残基连接，这些细胞作用肽和药物可渗透生物膜。这些碱性残基在有时候被统称为细胞穿透部分(cellpenetratingmoiety)或者细胞穿透肽(cellpenetratingpeptides)(Cell-PenetratingPeptide，UloLangel著，Pharmacoloy&ToxicologySeries，2002，CRCPress，NewYork)。
发明内容
在本发明的一个方面，提供了包含含有单体单元的聚合物骨架、与所述聚合物骨架共价连接的保护链、与所述聚合物骨架的单体单元共价键合的羧酸根、硫酸根、磺酸根或磷酸根阴离子基团以及与所述阴离子基团不通过中间离子(例如金属)直接静电连接的加载分子的组合物。在一个方面，所述阴离子基团的硫和/或磷原子彼此之间的间隔超过一个原子从而使其螯合特性最小化。所述的加载分子可包含：i)细胞穿透肽，ii)阴离子结合域，或iii)超过7.3的等电点。应该了解，加载分子与本发明的组合物之间的静电相互作用是主要的相互作用模式(Kd为10μM)而任何痕量的疏水相互作用(当其存在时)是微弱(Kd＞10μM)和不显著的。出于本说明书的目的，术语“阴离子结合域”是具有带正电的氮原子从而使该分子能够以低于10μM的解离常数结合羧酸根、硫酸根、磺酸根或磷酸根部分的任何分子部分。在一个相关方面，与药学可接受的赋形剂一起提供包含含有单体单元的聚合物骨架、与所述聚合物骨架共价连接的保护链、与所述聚合物骨架的单体单元共价键合的羧酸根、硫酸根、磺酸根或者磷酸根阴离子基团以及与所述阴离子基团不通过中间离子(例如金属)直接静电连接的加载分子的药物组合物，其中阴离子基团的硫和/或磷原子(当存在时)彼此之间的间隔超过一个原子，并且其中所述的加载分子包含：i)细胞穿透肽，ii)阴离子结合域，或iii)超过7.3的等电点。现发现，在无中间金属的情况下，含有螯合分子的聚合物可以结合金属结合肽/蛋白质。不期望受理论的束缚，通过使用带类似负性但是非螯合的部分(如硫酸根、磺酸根和磷酸根)对羧基基团进行衍生化从而去除螯合分子螯合金属的能力表明了结合肽和蛋白质的能力是通过离子相互作用实现的。
本发明的这些实施方案、其它实施方案以及它们的特征和特性将通过下文的详述、附图和权利要求而被明确。
通过引用并入
本说明书中提及的所有公开文献、专利和专利申请均通过引用的方式并入本文，其引用程度等同于将各个公开文献、专利或专利申请特定且个别地表明通过引用的方式并入。
附图简述
本发明的特定特征通过所附的权利要求进行特别地说明。对本发明的特征和优点的更好了解可通过参考下文示例性实施方案的详细描述和附图而获得，这些实施方案应用了本发明的原理。附图如下：
图1所示为本发明的一种阴离子核心组合物的例子。所示的本发明为具有聚合物骨架和直接静电结合于载体的阴离子基团的阳离子加载分子或碱性肽/蛋白质的组合物。本示意图描述了聚合物骨架，其具有：a)共价连接的侧保护链，b)共价连接的侧阴离子基团，所述阴离子基团源自羧酸根、硫酸根、磺酸根或磷酸根基团，其中阴离子基团随之与阳离子加载分子或碱性肽/蛋白质(等电点高于7但是在优选高于7.3并在更优选高于7.5)直接进行静电相互作用(没有中间离子)。本图并不对本发明所预想的组合物进行限制。
发明详述
定义
为方便计，在进一步描述本发明之前，在本说明书、实施例和所附的权利要求书中所使用的需要进一步解释的特定术语总结于此。这些定义应参照本公开的其余内容进行解读并且应被本领域的技术人员所理解。除非另外进行定义，否则本文所使用的全部技术和科学术语具有的含义与本领域的普通技术人员所通常理解的相同。
冠词“一”和“一个”被用于指一个以上(即，至少一个)该冠词语法上的修饰对象。例如，“一元件”指的是一个元件或多于一个元件。
术语“碱性蛋白质”是等电点为碱性(高于7)的蛋白质，其被称为“碱性蛋白质”，而等电点为酸性(低于7)的蛋白质被称为“酸性蛋白质”。蛋白质的溶解度在等电点处最低。蛋白质具有可电离的基团，诸如羧基基团和氨基基团。由于这些基团的电荷取决于pH，因此蛋白质分子根据pH可具有不同的电荷。在特定的pH下负电荷的数量与正电荷的数量相等，此pH为等电点，因此相似蛋白质之间的静电排斥在此点处最小并且溶解度也最低。但是，例如，在低于等电点的pH下，与在等电点处的电荷相比，氨基基团将获得额外的质子而使得该蛋白质获得额外正电荷，或者羧基基团将质子化而使得该蛋白质失去负电荷。为确定氨基或羧基基团的质子化是否造成蛋白质在酸化时的性质变化，这取决于起始的等电点pH。等电点高于8.0的碱性蛋白质的酸化趋向于中性pH，其发生变化的主要基团是氨基基团。低于pH7的进一步酸化将导致羧基基团的质子化，从而使其成为中性并且使所述蛋白质的总净电荷更为正性。所有的碱性蛋白质在中性pH下均具有超过负电荷的正电荷，这使其能够在中性pH下结合本发明的阴离子载体。由于羧基基团在介于5与7之间的pH下可失去负电荷，本发明载体的优选阴离子基团是硫酸根、磺酸根和磷酸根基团，其失去负电荷之前需要介于2与5之间的pH。羧基基团也是有用的，但是在多个羧基基团簇集在一起的情况下其将倾向于吸取带正电荷的金属离子，这使得在存在金属的情况下总净电荷更接近中性或阴性较弱。所述载体中的阴离子位点的数目越多，则金属干扰所述载体结合带正电的加载分子的能力的可能性就越低。
用于本发明目的的术语“载体”指的是本发明的组合物，其包含具有阴离子部分以及共价相连的保护链的聚合物骨架。
用于本发明目的的术语“骨架”指的是包含聚合物(线性的或分支的)的结构。
本文所使用的术语“衍生物”或“类似物”包括其核心结构与母体化合物的核心结构相同或非常类似但是其具有化学的或物理的修饰(诸如不同的或额外的基团)的化合物；该术语包括可连接于其它原子或分子上的母体化合物的共聚物。该术语还包括与母体肽或蛋白质具有至少50％的序列同一性的肽或蛋白质。该术语还包括与母体肽相比较具有与之相连的另外基团，例如另外的标记或标签，的肽。该术语还包括与母体聚合物相比具有与之相连的另外基团，例如烷氧基或甲氧基基团，的聚合物。
“等电点”(pI)，某些情况下简称为IEP，是特定分子或表面不携带净电荷时所处的pH。被称为两性离子的两性分子根据所述分子中存在的官能团而具有正电荷和负电荷。所述分子上的净电荷受其周边环境的pH的影响并且可由于质子(H+)的失去或获得而变得具更强的正电性或负电性。所述pI是所述分子不携带电荷或其负电荷和正电荷相等时所处的pH值。表面在天然情况下带电荷以形成双层。在常见情况下，当表面电荷决定离子为H+/OH-时，净表面电荷受到固体所浸入液体的pH影响。此外，pI为表面不携带净电荷时溶液的pH值。所述pI值可影响分子在给定pH下的溶解度。在对应于它们的pI的pH下，这样的分子在水或盐溶液中具有最低溶解度并且通常从溶液中沉淀析出。生物两性分子诸如蛋白质同时包含酸性和碱性官能团。组成蛋白质的氨基酸性质上可为正性、负性、中性或极性的，并且合在一起赋予蛋白质总体电荷。在低于其pI的pH下，蛋白质携带净正电荷；在高于其pI时他们携带净负电荷。因此，可根据其等电点(总电荷)使用被称为等电聚焦的技术在聚丙烯酰胺凝胶上分离蛋白质，该技术使用了pH梯度以分离蛋白质。等电聚焦也是2-D凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳的第一步。对于仅有一个氨基和一个羧基的氨基酸，所述pI可使用公式pI＝{{pK1+pK2}/2}由这一分子的pKa进行计算。对于具有超过两个可电离基团的氨基酸，诸如赖氨酸，使用相同的公式，但是这一次所使用的两个pKa是从该氨基酸的中性形式失去和获得电荷的两个基团的pKa。赖氨酸具有单一羧基pKa和两个氨基pKa值(其中一个位于R-基团上)，因此完全质子化的赖氨酸具有+2的净电荷。为获得中性电荷，可以对该赖氨酸进行两次去质子化，并且因此使用该R-基团和氨pKa值(见于标准氨基酸的列表)：pI＝{{9.06+10.54}/2}＝9.80。在多肽中，除末端基团之外，α氨基和羧基基团不是可电离化的因此不被计算。在这一情况下，仅仅R-基团(主要为赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸和谷氨酸)与pI计算最为相关。电泳凝胶的pH由用于该凝胶的缓冲液决定。如果缓冲液的pH高于跑样蛋白质的pI，该蛋白质将向正极迁移(负电荷被吸引到正极)。如果缓冲液的pH低于跑样蛋白质的pI，该蛋白质将向负极迁移。如果蛋白质用与其pI相等的缓冲液pH进行跑样，它将完全不迁移。对于单个的氨基酸也是如此。根据本发明的目的，高于7的pI被称为碱性蛋白质，但是对于本发明的加载分子最优选的pI超过7.3的生理pH，因为这些加载分子在生理pH下具有净正电荷。应当强调的是，对于诸如蛋白质这样的大加载分子，碱性pI不是将加载到载体中的唯一要求，因为具有带正电表面的斑块(patch)的存在足以实现与所述载体间的强静电相互作用。
术语“加载分子”是意图通过本发明的阴离子-核心组合物或载体对受试者进行递送的活性剂、治疗剂或成像剂。所述加载分子意图通过静电直接结合于所述载体的阴离子基团而不是与该载体共价连接。所述加载分子可以是在中性pH下包含带正电的氨基基团的肽或蛋白质。活性剂还包括带正电的有机小分子。
术语“天然存在的”或“天然的”在用于修饰对象时指的是该对象可在自然界中发现。例如，可从天然来源中分离并且未经有意修饰(如在实验室中)的骨架是天然存在的。术语“非天然存在的”或“非天然的”或“合成的”适用于经有意修饰(例如在实验室中)并且正常情况下未见于自然界中的对象。
术语“聚合物”是一种由通过共价化学键连接的重复结构单元组成的分子(或大分子)。此术语包括多聚氨基酸(具有重复的氨基酸；注意出于本说明书的目的，蛋白质不具有重复的氨基酸，因为它们的氨基酸沿着链发生变化)、聚烯丙胺、聚丙烯酸、聚乙烯亚胺、多糖和本说明书中所提及的其它聚合物骨架。出于使本说明书清楚的目的，术语“聚合物骨架”或“骨架聚合物”是非蛋白质性的聚合物。蛋白质性指的是天然存在的蛋白质或其衍生物，其不是同聚物并且具有由其三维构象所引起的酶学或生物学活性。聚氨基酸同聚物诸如多聚赖氨酸是非蛋白质性的。
使用本发明的组合物进行治疗的“患者”、“受试者”或“宿主”可以指人或非人动物。术语“哺乳类”在本领域中是已知的，且示例性的哺乳动物包括人、灵长类、牛、猪、狗、猫和啮齿类(如小鼠和大鼠)。
术语“肽/蛋白”指肽和蛋白质，其中肽具有50或更少的氨基酸，而蛋白质具有超过50个氨基酸并且可从细胞中分离或合成地制备。衍生物和片段也可分离或合成地制备。在理想情况下，本发明的肽/蛋白质加载分子具有超过pH7的等电点。但是，有可能肽/蛋白质活性剂的特定衍生物尽管具有酸性等电点，其可具有带正电基团的斑块，从而允许该类型的肽/蛋白质与所述载体的阴离子基团的相互作用。这一类型的加载分子应被本发明所涵盖。可通过氨基酸序列的截断或其它氨基酸或官能团的添加产生活性剂的衍生物。
基本介绍
本发明的实施方案针对基于载体的碱性蛋白质递送系统，包含骨架、共价连接于所述骨架的阴离子域和与所述载体的阴离子域离子结合或静电结合的碱性蛋白质。任选地，所述骨架可以包含多个聚乙二醇链以遮蔽或保护所述碱性蛋白质。保护的聚乙二醇链可提高大分子试剂的整体流体动力学半径，这可导致在血液中的延时循环(通过防止经肾脏的消除/过滤)并且提高在高血管透性位点处的保留/积累。
本发明的载体以提高的渗透性穿透被破坏或异常的血管屏障，但由于载体体积和流/压力的方向，载体不能流回血液循环中。这导致了异常血管屏障位点处的载体积累。这在以大肠杆菌诱导的大鼠肌肉组织细菌炎症模型中得到证明。或者，所述载体可被用于对进行血管外空间(extravascularspace)的渗漏的早期检测和对具有提高的血管渗透性的位点，例如炎症，进行特异性靶定。因此，所述载体在炎症位点的积累增加将允许载体结合的碱性蛋白质在感染部位的积累。
使用离子相互作用实现碱性蛋白质或其衍生物与所述骨架的结合。修饰的蛋白质或通过添加碱性氨基酸残基而衍生的蛋白质的使用可维持或增强离子相互作用。本发明载体中的阴离子基团的优点是提供了能够与所述载体的阴离子部分形成离子键的碱性蛋白质的可逆结合。所述的离子键合提供了碱性蛋白质/肽和药物与包含阴离子官能团的骨架的可逆解离。
所述的载体-阴离子部分-碱性蛋白质制剂可提供几种益处。例如，这样的制剂提供了较优的生物相容性、降低潜在毒性、降低免疫原性、提高血液停留时间、能够实现在炎症位点的位点特异性积累。本发明的载体具有高药物加载容量，以及与示例性碱性蛋白质例如溶葡球菌素的特异性可逆结合(实施例44)。
根据所呈现的结果，碱性蛋白质在不存在金属的情况下结合螯合部分。相互作用也可能通过与所述载体的保护链和/或其它成分的相互作用的辅助。通过以所述保护链(例如聚乙二醇链)对离子结合的碱性蛋白质进行针对诸如肽酶和抗体的保护的方式进行对本发明的载体的设计。另外，碱性蛋白质(如溶葡球菌素)和肽(如表1所示的肽以及它们的类似物和衍生物)与高分子量载体的结合可通过防止经肾超滤的排出、抗原呈递细胞的摄取和网状内皮系统的摄取而延长体内半衰期。
本发明的载体的元件和碱性蛋白质。
本发明的载体由可以是能够支持多阴离子基团的聚合物/共聚物的骨架构成，所述的阴离子基团源自羧基、硫酸根、磺酸根或磷酸根基团，其可结合(通过离子相互作用)活性剂或治疗分子(或加载分子)中带正电的氮。在本发明的进一步实施方案中，所述骨架进一步包含与该骨架共价连接的保护链。在一个方面，所述载体是生物相容的。单个成分在下文描述。
a.骨架
本发明载体的骨架可为线性或分支结构的聚合物或共聚物或它们的偶联物。所述骨架分子量介于1,000Da与200,000Da之间。在一些实施方案中，所述骨架分子量可介于1,500Da与100,000Da之间、或介于2,000Da-50,000Da之间、或介于2,000Da-30,000Da之间或介于2,000Da-25,000Da之间。在优选的情况下所述聚合物骨架源自天然存在的聚合物。也优选的是，所述聚合物骨架是水溶性的。
1)聚合的或共聚的聚合物骨架：
聚合物由通过共价化学键相连的重复结构单元所组成。共聚物是源自连接在一起的两种或更多种不同聚合物的聚合物。
在特定的实施方案中，所述组合物的骨架聚合物或骨架共聚物具有介于约500与5,000、10,000、15,000、20,000、25,000、30,000、40,000或50,000、60,000、70,000、80,000、90,000或100,000道尔顿之间的分子量，或更特别地具有介于2,000与50,000道尔顿之间的分子量。该数均分子量(Mn)也可大范围地变化，但一般处于约1,000到约120,000道尔顿的范围内，或甚至在约2,000到约70,000道尔顿的范围内，或甚至在约3,000到约50,000道尔顿的范围内。在特定的实施方案中，Mn在约5,000和45,000道尔顿之间变化。在所述聚合物骨架的给定样品内，可存在广范围的分子量。例如，样品内的分子可具有相差倍数为2、5、10、20、50、100或更大的分子量，或其平均分子量相差倍数为2、5、10、20、50、100或更大。所述骨架聚合物中单体的数目可从10(10-聚体)到1,000(1,000-聚体)之间变动。可选地，所述骨架聚合物可以大约为25、50、100、150、200、250、300、350、400或450-聚体，甚至更具体地介于100-聚体与250-聚体之间。所述聚合物骨架中的单体数目基本上决定了可经修饰以携带阴离子部分或保护链的官能团的数目。所述聚合物骨架的优选大小经选择以使所述载体分子(骨架、阴离子基团和保护链)在加载碱性加载分子之前的总体流体动力学直径低于100nm。
在一些实施方案中，所述聚合物骨架是具有包含氨基、羧基、羟基和巯基基团的重复性单体基团的非蛋白质性同聚物或异聚物并且可以是天然或合成来源的，其中所述重复性单体基团可共价修饰以进一步包含阴离子基团或更多的阴离子基团，诸如羧酸根、硫酸根、磺酸根或磷酸根基团和亲水性保护链。硫酸根、磺酸跟或磷酸根可与所述聚合物直接连接或使用具有多个羧基基团的间隔物，例如二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、乙二胺四乙酸(DTPA)、氨三乙酸(NTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)或柠檬酸为其中的一些，其允许负电荷作为单一侧基方便地连接和/或簇集到聚合物骨架上(不是所述骨架对于该骨架的分子完整性重要的部分)。所述骨架可经修饰以携带一个或多个阴离子侧基团。在其它实施方案中，所述聚合物骨架可以是具有重复疏水基团和亲水性保护链的非蛋白质性同聚物或异聚物，其中所述重复性疏水基团具有末端氨基、羧基、羟基和巯基基团或可经共价修饰以进一步包含一簇(两个或更多个)阴离子基团(诸如羧酸根、硫酸根、磺酸根或磷酸根部分)的任何可修饰官能团。本文所使用的术语“非蛋白质性多聚氨基酸”包括不是由活生物体天然形成的(除非该活生物体受到重组工程化)或不具有由其三维构象所产生的酶学或生物学活性的多聚氨基酸。在特定的实施方案中，所述聚合物骨架是可以具有D-或L-旋光性或两者而且为直链同聚物的多聚氨基酸。在特定的实施方案中，直链同聚物包括多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸、多聚精氨酸、多聚谷氨酸、多聚天冬氨酸、多聚丝氨酸、多聚酪氨酸或任何由氨基酸形成的其它酰氨连接的同聚物。在另一个优选的实施方案中，直链疏水性同聚物包括多聚丙氨酸、多聚缬氨酸、多聚亮氨酸、多聚异亮氨酸、多聚甘氨酸或多聚苯丙氨酸。这些疏水性多聚氨基酸可在一端进行修饰以包含成簇(两个或更多)的阴离子基团，诸如羧酸根、硫酸根、磺酸根或磷酸根或它们的组合，和在另一端进行修饰以包含亲水性保护链。如果所述骨架是包含多聚氨基酸的聚合物，其通常为非蛋白质性的，这意味着它并非具与其三维构象相关联的活性的天然存在的蛋白质。所述聚合物骨架可具有约600-1,000,000道尔顿的分子量，包括约1,000-70,000道尔顿的范围。也可使用其它具有重复性可修饰官能团的聚合物骨架，诸如具有重复性硫氢基(巯基)、氨基、羧基和羟基基团的聚合物骨架。来自生物来源的碳水化合物聚合物以及其中单体为非生物性的其它合成聚合物也可被用作为聚合物骨架。该聚合物骨架提供阴离子基团和亲水性保护链可以连接的多个位点。该骨架包括具有已经存在的羧酸根、硫酸根、磺酸根或磷酸根的骨架，且使得共价链接疏水性保护链如聚乙二醇或衍生物后可以不需要进一步的修饰。它们包括多糖，例如硫酸软骨素、硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、硫酸肝素、硫酸葡聚糖、岩藻聚糖硫酸酯和卡拉胶(Carrageenan)。可对这些骨架进行修饰以包含疏水性保护链从而获得本发明的载体成分，该载体成分可以与碱性加载分子离子连接从而完成本发明的组合物。作为其中所述骨架已经含有硫酸根、磺酸根或磷酸根基团的本发明的进一步实施方案，骨架可进一步进行修饰以包含另外的硫酸根、磺酸根或磷酸根基团，从而提高本发明的组合物的负电荷密度以进一步增强其结合碱性加载分子(具有高于7的等电点的加载分子)的能力。
聚合物骨架可包括多糖。多糖包含二糖、寡糖和最高可达数百万道尔顿的较大聚合物。聚合物骨架包括多糖、寡糖和其化学衍生的产物，其携带可修饰的羧基基团、醇基团或氨基基团，其例子可以有：多聚木糖醇、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、甘露糖醛酸、透明质酸、果胶酸、神经氨酸、藻酸、卡拉胶、氧化葡聚糖、胺化葡聚糖，例如连接的氨基基团。包括多糖的聚合物骨架可以是线性或分支的，可以被羧基化、羧甲基化、硫酸化或磷酸化。包括多糖的聚合物骨架可以与碳酸、二碳酸(dicarbonic)、硫酸、氨基磺酸、磷酸的衍生物反应以获得羧基、氨基羧基、羧甲基、硫酸、氨基或磷酸根基团的连接。包括多糖的聚合物骨架可通过对葡聚糖、甘露聚糖、木聚糖、支链淀粉、纤维素、壳聚糖(chytosan)、琼脂糖、岩藻依聚糖、半乳聚糖、阿拉伯聚糖、果聚糖、脱氧半乳聚糖、几丁质、石耳素、果聚糖或果胶进行化学改变而获得。另外，这些多糖可以由单糖(例如但不限于，葡萄糖、半乳糖、甘露糖、半乳糖、脱氧葡萄糖、核糖、脱氧核糖、阿拉伯糖、果糖、木糖、木酮糖和核酮糖)的异聚物或同聚物而呈现。
聚合物骨架还包括诸如聚乙烯亚胺、聚酰胺胺、聚烯丙胺、聚丙烯酸、聚醇(如，聚乙烯醇)的聚合物(线性或分支的)，羧基、氨基或醇基团可与其化学连接和/或可用于连接更多阴离子基团于其上。这些聚合物骨架可以是非生物的，羧基、氨基或醇基团可用于连接更多阴离子基团于其上。聚合物骨架可包含阴离子基团并且可进行进一步的修饰以增加阴离子基团的数目或增强阴离子基团的质量，例如将羧基基团转化为硫酸根、磺酸根或磷酸根基团。
在另一个实施方案中，作为聚合物骨架发挥作用的聚合物可以是聚乙二醇(PEG)，其具有在末端或末端附近的官能团从而形成成簇的(两个或更多个)阴离子基团，碱性蛋白质可以结合于其上。本实施方案可通过以下示意性地表示：PEG-阴离子基团*碱性蛋白质，其中该星号表示在本发明的元件之间作为非常特异性的关系的离子相互作用。或者，PEG可沿着其骨架进行功能化，从而使阴离子簇侧接于该骨架，碱性蛋白质可通过直接的静电相互作用与其结合。这一结构也可允许保护侧链。
b)阴离子部分或阴离子基团
可与所述骨架化学连接的阴离子基团的例子包括，-磷酸根、-硫酸根、-磺酸根和-羧基。蛋白质中的氨基基团与羧基基团的结合不及与诸如磷酸根、硫酸根和磺酸根的阴离子基团的结合强。这是由于羧基基团的pKa在6左右，而硫酸根、磺酸根和磷酸根的pKa低于3。这使得硫酸根、磺酸根和磷酸根的群体在高于3的pH下主要带负电。羧基基团群体在6或更高的pH下主要带负电，这给它在轻度酸性条件下形成阴离子造成一些限制。另外，大多数含多羧基的部分能够发生螯合作用，这可干扰加载分子或血液蛋白的需要金属的生理功能。优选的阴离子基团是磷酸根、硫酸根和磺酸根。但是，这并非将羧基基团排除于本发明的各种实施方案之外。本发明组合物中的阴离子基团可成簇定位。出于本说明书的目的，阴离子簇被定义为通过常见共价键连接于所述骨架的两个或多个阴离子基团并且各个阴离子电荷距离另一阴离子电荷不超过12个原子。阴离子基团源自于羧酸根、硫酸根、磺酸根和/或磷酸根。在优选的情况下，形成阴离子电荷的硫或磷原子彼此间隔超过三个原子以防止其成为金属的强螯合剂。一旦金属被螯合，该金属将在阴离子位点或簇中添加正电荷，从而使其结合阳离子的或等电点高于7的带正电的加载分子的能力下降。在一个实施方案中，金属被排除，因为它可潜在地产生强配位相互作用，这阻止可所述加载分子的定量释放。阴离子簇中的硫和/或磷原子之间的较大分隔可帮助降低或减弱载体的阴离子簇的螯合特性。通过该方式，加载分子的释放可利用生理盐促进。此外，除中合载体的阴离子特性之外，螯合作用也可使含金属或钙的加载分子如因子VIII失活。对于以其中磷原子只由一个原子分隔或电荷由三个原子分隔的双磷酸盐形式存在的磷酸盐更是如此。由于这一原因，双磷酸盐是金属的强螯合剂，其可使含过渡金属或碱土金属如钙的生物分子失活。形成本发明组合物中的阴离子基团的硫和磷原子由超过一个原子分隔，这使它们成为弱螯合剂。这可通过多羧基胺间隔物的使用而实现，其随后维持包含硫和/或磷原子的几个强阴离子基团。在本发明的实施方案中，阳离子加载分子与阴离子基团的组织关系是通过直接的离子相互作用并且不由任何其它二价金属离子介导。这样的组织关系使本发明区别于使用金属桥来连接加载分子的其它聚合物组合物。另外，本发明并不依赖于疏水相互作用来连接加载分子，因为带正电的或具有高于7.3的等电点的加载分子是水溶性的并且不太可能是非常疏水的。本发明的这些高度带电的加载分子排斥疏水性基团，这是本领域已知的。本发明的加载分子限于不与疏水性基团发生显著相互作用的那些加载分子(对疏水性基团的Kd高于50μM的加载分子)。由4个或更多个原子分隔的羧基基团簇也将使强螯合剂变弱或甚至为非螯合的，并且可被用作为本发明的阴离子簇。出于本说明书的目的，通过单一化学键侧接于所述骨架的阴离子基团或阴离子基团簇分子量不超过1,500道尔顿(不包括骨架分子量)。这是为了有利于对保护链的屏蔽，其中优选的分子量介于2,000道尔顿与20,000道尔顿之间。
c)保护链
保护链(可互换地被称为保护侧链或亲水性保护链)的例子包括聚乙二醇，其可通过二羧酸进行酯化以形成与二羧酸的酯的形式的聚乙二醇单酯、甲氧基聚乙二醇单酯(MPEG)或聚乙二醇和聚丙二醇单酯的共聚物，从而给予该共聚物的末端可被用于将其共价连接于骨架的羧基(见上文)。其它形式包括聚乙二醇-羧基、甲氧基聚乙二醇-羧基、聚乙二醇-羧甲基、甲氧基聚乙二醇-羧甲基、聚乙二醇单胺、甲氧基聚乙二醇单胺、聚乙二醇酰肼、甲氧基聚乙二醇酰肼、聚乙二醇和一个或多个以多聚氨基酸、多糖、聚酰胺胺、聚乙烯亚胺表示的聚合物的甲氧基聚乙二醇咪唑(imidazolide)嵌段共聚物，其中这些嵌段交替以产生线性嵌段共聚物。在一个实施方案中，保护链的总体分子量可以高于300道尔顿，但不超过10,000道尔顿。在一个实施方案中，通过单一连接将一个或多个保护链连接于所述聚合物骨架。
在本文所提供的一个实施例中，本发明的组合物包含聚合度介于2-10,000之间的线性聚合物骨架，分子量为300-25,000道尔顿的甲氧基聚乙二醇(mPEG)保护链和阴离子基团(其可来自硫酸根、磺酸根或磷酸根，但并不排除羧基基团作为阴离子基团)独立地和共价地连接于其上，其中所述的保护链和阴离子基团独立地与所述骨架进行连接或侧接。在另一个实施例中，所述聚合物骨架的聚合度介于25-1,000之间。在又另一个实施方案中，所述聚合物骨架的聚合度介于50与300之间。
d)活性剂：碱性蛋白质和肽
1)蛋白质：碱性蛋白质和肽是领域所公认的等电点高于7的蛋白质和肽。碱性蛋白质包括金属外肽酶，例如溶葡球菌素，其为抗感染剂。本发明的载体可结合基本上大多数的碱性蛋白质或碱性蛋白质活性剂及其衍生物、片段和类似物，只要它们保持碱性或它们的等电点保持高于7。碱性蛋白质及其衍生物、片段和类似物可通过重组技术由DNA构建体产生。通过使用DNA重组技术或在合成过程中在序列中添加碱性氨基酸可使得等电点低于7的那些蛋白质具有高于7的等电点。所述的碱性氨基酸是赖氨酸和精氨酸。合成过程中可通过将碱性氨基酸添加于肽的末端而同时维持主要序列的生物活性将该肽形成碱性。或者，可添加碱性序列以使得该碱性序列一旦释放于血液中或进入细胞内时可被内源性(天然存在于生物体体内的)蛋白酶切割从而释放活性肽。本发明的碱性蛋白质活性剂可以是或不是重组产物。本发明的碱性蛋白质活性剂可以是可能涉及或不涉及阻止糖基化的DNA序列修饰的哺乳类细胞中重组产生的产物。本发明的碱性蛋白质活性剂可以从天然产生所述碱性蛋白质的生物体纯化的天然形式。本发明的碱性蛋白质活性剂可以纯化自生物体。例如，溶葡球菌素，一种示例性的碱性蛋白质，可从天然产生该蛋白质的生物体，例如模仿葡萄球菌(Staphylococcussimulans)或葡萄球菌(Staphylococcusstaphylolyticus)纯化。本发明的载体可结合于碱性蛋白及其类似物、衍生物和片段。
本发明的载体可结合碱性蛋白质及其类似物、衍生物和片段。在特定的实施方案中，本发明的载体结合溶葡球菌素。溶葡球菌素是本领域所公认的并且是对于金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)具有溶菌性。这包括具有与天然存在的溶葡球菌素基本相同的生物效应的溶葡球菌素衍生物和片段。溶葡球菌素可分离或通过合成方式制备。也可分离或合成制备衍生物和片段。溶葡球菌素的特定衍生物可具有不同的等电点或甚至具有低于7的等电点是可能的，但是只要在蛋白质中的正电荷簇远离负电荷，该蛋白质便可潜在地结合于本发明载体的阴离子基团。通过添加0.4M的NaCl来确定是否溶葡球菌素与载体的相互作用是直接的阴离子-阳离子相互作用和不通过多价金属离子。阴离子-阳离子相互作用可被0.4M的NaCl所破坏，而由多价金属离子通过配位键合介导的相互作用不能被0.4M的NaCl破坏(参见下文实施例)。在一个实施方案中，溶葡球菌素的衍生物可通过氨基酸序列的截断或其它氨基酸或官能团如氨基基团的添加而产生。在一个实施方案中，溶葡球菌素(包括其类似物、衍生物和片段)包含超过总的酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)的总的碱性氨基酸(赖氨酸和精氨酸)，由此赋予该蛋白质能够结合本发明的阴离子-核心载体的净正电荷。某些情况下，等电点低于7的蛋白质或肽可以在该分子的一端具有全部碱性氨基酸和在该分子的另一端具有全部酸性氨基酸，或者该蛋白质或肽可以使得酸性氨基酸被包埋和碱性氨基酸被暴露的方式折叠。在这种情况下，它仍可以结合于本发明的阴离子载体，只要碱性氨基酸位于分子的空间上隔离的区域。对等电点低于7的蛋白质或肽是否与本组合物的载体相互作用的确定需要使用本文所描述的和本领域的技术人员无需过度实验便可容易地实施的方法逐个地测定碱性。溶葡球菌素天然具有介于pH9-10之间的等电点，从而使其紧密结合于本发明的载体。因此，溶葡球菌素提供了带正电的氨基基团以使得无需对其进行合成修饰以包含碱性氨基酸。通过将载体溶液与溶葡球菌素溶液在15到37摄氏度的温度下进行混合可将溶葡球菌素加载于本发明的载体上。被加载的载体可冻干并在使用前重构。本发明的溶葡球菌素或一般的碱性蛋白可进一步修饰以包含更多碱性氨基酸从而增强与本发明的载体的结合。
溶葡球菌素，本发明的活性剂之一，是由葡萄球菌微生物的特定菌株产生的具有针对葡萄球菌的抗细菌活性的肽酶。溶葡球菌素是产自模仿葡萄球菌的25kDa的肽酶，该酶切割金黄色葡萄球菌细胞壁的肽间交联联(inter-peptidecross-bridge)所特有的甘氨酸-甘氨酸键，该酶的EC号名称为EC3.4.24.75。溶葡球菌素是示例性的碱性蛋白质，更特别地为甘氨酰-甘氨酰碱性蛋白质。
2)肽：细胞内作用肽类中包括可以改变信号转导通路的肽。为使所述肽改变信号转导通路，它们可能需要穿透细胞膜。肽穿透细胞膜的能力取决于彼此紧密靠近的碱性氨基酸的数目。这些彼此紧密靠近的碱性氨基酸被称为肽转导结构域(peptidetransductiondomain)或细胞穿透肽(UloLangel著Cell-PenetratingPeptides，Pharmacology&ToxicologySeries，2002，CRCPress，NewYork)。所有这些肽及其衍生物均是用于本发明的阴离子核心载体的理想加载分子。一般地，所有包含肽转导结构域或细胞穿透肽的肽(具有50或更少氨基酸的多肽)均可使用本发明的载体进行递送。所述的肽转导结构域或细胞穿透肽序列的特征在于存在5-10个氨基酸的序列，该序列具有比酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)数目至少超过2个的碱性氨基酸(赖氨酸和/或精氨酸)。在UloLangel所著题为Cell-PenetratingPeptides的书，Pharmacology&ToxicologySeries，2002，CRCPress，NewYork中描述了这些肽的一些例子，该文献以引用的方式并入本文。应当注意在所有的情况下，细胞穿透肽遵循相同的一般规则，即它包含5-10个氨基酸，具有比酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)数目至少多2个的碱性氨基酸(赖氨酸和/或精氨酸)。不幸的是，一旦进入需要循环，所有这些肽非常迅速地降解并被肾脏消除，从而需要施用大量的该肽(小鼠体内10mg/Kg)。这些肽将明显受益于本发明的载体。因为所有这些具有阳离子细胞穿透序列的细胞内作用肽具有碱性序列，因此它们均是用于本发明的阴离子核心组合物的理想加载分子。所述载体将提高该肽的血液循环半衰期并且使这些肽积累或靶向于疾病(例如类风湿性关节炎、慢性炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、动脉粥样硬化症和糖尿病等等)中存在的炎症位点。
a)抗炎肽和蛋白质
在一个实施方案中，可用于炎症的治疗的本发明的肽/蛋白质可以是阻断NKkB作用并且包含细胞穿透序列的肽。可受益于本发明组合物的慢性炎性疾病的例子是，例如类风湿性关节炎、慢性炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎和糖尿病。细胞穿透肽序列是包含允许穿透到细胞内部的一系列碱性氨基酸(如赖氨酸和精氨酸)的肽。该序列可连接于可抑制NFkB激活并因此防止炎症的序列。例如：(SEQIDNO：60)碱性肽-Thr-Ala-Lue-Asp-Trp-Ser-Trp-Lue-Gln-Thr-Glu-OH或(SEQIDNO：61)碱性肽-Thr-Thr-Lue-Asp-Trp-Ser-Trp-Lue-Gln-Met-Glu-OH。该类型肽的特定例子具有(SEQIDNO：1)(Lys)8-Gly-Gly-Thr-Ala-Lue-Asp-Trp-Ser-Trp-Lue-Gln-Thr-Glu(或KKKKKKKK-GG-TALDWSWLQTE：来自DaveS.等，2007，JournalofImmunology，179卷，p7852-7859页)序列。对这一序列的替代为(SEQIDNO：2)H-Asp-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-Thr-Ala-Leu-Asp-Trp-Ser-Trp-Leu-Gln-Thr-Glu-OH(或为DRQIKIWFQNRRMKWKK-TALDWSWLQTE：来自Shibata，W等，2007.JournalofImmunology，179卷，2681-2685页；Jimi，E.等，2004.Nat.Med.，10，617页；Siegmund，D等2001.J.Biol.Chem.276，43708页；May，M.J.等2000Science289，1550页；Li，Q.等，1999；andScience284，1999)。或者，序列(SEQIDNO：3)(Arg)8-Gly-Gly-Thr-Ala-Lue-Asp-Trp-Ser-Trp-Lue-Gln-Thr-Glu-OH(或RRRRRRRR-GG-TALDWSWLQTE)也是本发明的理想加载分子。SEQIDNO：1和#2的抑制性序列的类似物也是用于本发明的组合物的理想加载分子。它具有序列(TAT-NBD；SEQIDNO：4)H-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Gly-Thr-Thr-Lue-Asp-Trp-Ser-Trp-Lue-Gln-Met-Glu-OH(或YGRKKRRQRRRG-TTLDWSWLQME：来自Dai，S.等，2004，J.Biol.Chem.279(36)：37219页)。另一个例子是作用于细胞内水平以通过结合于激活JNK的JNK互作蛋白而阻止自身免疫炎性疾病的肽。其例子为连接于(SEQIDNO：62)Arg-Pro-Thr-Thr-Lue-Asn-Lue-Phe-OH的碱性肽(碱性肽-Arg-Pro-Thr-Thr-Lue-Asn-Lue-Phe-OH)。其更特别的例子具有序列(SEQIDNO：5)Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Arg-Pro-Lys-Arg-Pro-Thr-Thr-Lue-Asn-Lue-Phe(或YGRKKRRQRRRRPK-RPTTLNLF，来自Melino，M等，2008，JournalofImmunology，181卷，7300-7306页)。SEQIDNO：5的一部分Arg-Pro-Thr-Thr-Lue-Asn-Lue-Phe来自于JNK结合区域，且序列Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Arg-Pro-Lys-为细胞穿透肽或肽转导结构域。可实现与SEQIDNO：4相同目的的另一种序列是SEQIDNO：6(Arg)8-Arg-Pro-Thr-Thr-Lue-Asn-Lue-Phe-OH。当连接于碱性肽时可抑制炎症的另一种肽为P65-P1。该肽是与(SEQIDNO：63)Gln-Leu-Arg-Arg-Pro-Ser-Asp-Arg-Glu-Leu-Ser-Glu-OH连接的碱性肽。当连接于源自触角足肽(antennapedia)(PTD或肽转位结构域)的碱性肽时，其可抑制由脂多糖、白介素-1、冈田酸、佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯和过氧化氢诱导的NF-kB的激活。该肽可对于由TNF、阿霉素和顺铂所诱导的细胞凋亡的敏化细胞中发挥作用。p65-Pl包含单一磷酸化位点而且其对于抑制NF-kB活性是需要的。更具体地，所述序列是SEQIDNO：7H-Asp-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-Gln-Leu-Arg-Arg-Pro-Ser-Asp-Arg-Glu-Leu-Ser-Glu-OH(或DRQIKIWFQNRRMKWKK-QLRRPSDRELSE，来自Takada，Y.等，2004，J.Biol.Chem.279，15096页)。或者所述序列可以是(SEQIDNO：8)(Arg)8-Gln-Leu-Arg-Arg-Pro-Ser-Asp-Arg-Glu-Leu-Ser-Glu-OH。其它干扰NH-kB激活的序列包括与选自(SEQIDNO：64)-Gln-Arg-Lys-Arg-Gln-Lys-Leu-Met-Pro-OH(或RKRQKLMP，来自Lin，Y.-Z.等，1995.J.Biol.Chem.270，14255页)或者(SEQIDNO：65)-Asp-Asp-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Lue-Asp-Ser-Met-Lys-Asp-Glu-酰胺(或DDRHDSGLDSMKDE-NH2，来自Swaroop，N.等，2001，Pharm.Res.18，1631页；Traenckner，E.B.等，1995，EMBO.J.14，2876页)的序列相连接的碱性肽。更特别的例子是(SEQIDNO：9)(Arg)8-Gln-Arg-Lys-Arg-Gln-Lys-Leu-Met-Pro-OH和(SEQIDNO：10)(Arg)8-DDRHDSGLDSMKDE-NH2，皮质抑素(Cortistatin)-29(人)：(SEQIDNO：11)Pyr-Glu-Gly-Ala-Pro-Pro-Gln-Gln-Ser-Ala-Arg-Arg-Asp-Arg-Met-Pro-Cys-Arg-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Ser-Ser-Cys-Lys-OH(二硫键)。Pyr为焦谷氨酸。这代表抗炎性的免疫调控因子，其在败血性休克和克罗恩病的治疗中具有潜在的多步治疗应用(E.Gonzalez-Rey等，J.Exp.Med.，203，563页(2006)；E.Gonzalez-Rey等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103，4228页(2006))。这些肽或它们的衍生物是用于本发明的载体的加载分子的例子。
I型、II型和III型干扰素。干扰素具有抗炎性活性，尤其是I型干扰素。例如，干扰素β(pI＝8.9-9.7)是用于多发性硬化症的治疗的I型干扰素并且具有抗炎性活性。这些干扰素其中一些的碱性等电点和/或其表面上正电斑块的存在对于本发明的载体是理想的。这样的特性允许其结合本发明的载体。尽管本领域中学识丰富的和普通技术人员会预期以HB-EGF为例的这种结合会被血液组分所压制，我们惊异地发现这种与所述载体结合的方式可以经受血液组分的存在，这一结果是出人意料的。
b)抗感染肽(用于感染的治疗)
爪蟾抗菌肽(Magainin)是具有抗细菌和抗寄生虫活性的肽类抗生素，原本提取自爪蟾(Xenopuslaevis)的皮肤。爪蟾抗菌肽1和2是各具有23个氨基酸的紧密相关的肽，且不同之处在于两个置换。这些抗微生物肽具有广谱、非特异性的活性，其针对广泛的微生物，包括病毒、革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌、原生动物、酵母和真菌，并且还可对癌细胞具有溶血性和细胞毒性。爪蟾抗菌肽1是杀细菌性的。爪蟾抗菌肽1和2均对I型单纯疱疹病毒(HSV-1)和HSV-2表现出抑制作用(Williams，RW.等，BiophysicalJ.53，631A(1988)；Morvan，A.等，Mol.Mar.Biol.Biotechnol.3，327页(1994)；Matanic，A.等，Int.J.AntimicrobAgents23，382页(2004)；Zasloff，M.Proc.Natl.Acad.Sci.84，5449页(1987))。爪蟾抗菌肽1序列为(SEQIDNO：12)H-Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Leu-His-Ser-Ala-Gly-Lys-Phe-Gly-Lys-Ala-Phe-Val-Gly-Glu-Ile-Met-Lys-Ser-OH。该肽或其衍生物是用于本发明的载体的加载分子的一个例子。
爪蟾抗菌肽2当结合于酸性磷脂的时候呈现双亲性螺旋，从而形成一个由动态的肽-脂超分子复合物构成的孔。(SEQIDNO：13)H-Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Leu-His-Ser-Ala-Lys-Lys-Phe-Gly-Lys-Ala-Phe-Val-Gly-Glu-Ile-Met-Asn-Ser-OH(Zasloff，M.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.84，5449页(1987)；Cruciani，RA.等，EJPMOL8，187页(1992)；Corzo，G.等，Biochem.J.359，35页(2001)；Matsuzaki，K.等，Biochem.36，2104页(1997))。该肽或其衍生物是用于本发明的载体的加载分子的一个例子。
天蚕素A(CecropinA)(SEQIDNO：14；H-Lys-Trp-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-Ile-Glu-Lys-Val-Gly-Gln-Asn-Ile-Arg-Asp-Gly-Ile-Ile-Lys-Ala-Gly-Pro-Ala-Val-Ala-Val-Val-Gly-Gln-Ala-Thr-Gln-Ile-Ala-Lys-NH2)是天然存在的、线性、阳离子性37-残基抗微生物肽。天蚕素A通过耗散跨膜电化学离子梯度而杀灭细菌(Silvestro，L.等，BiophysicalJ.72，A195页(1997)；Andreu，D.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80，6475页(1983)；Silvestro，L.等，Biochem.36，11452页(1997))。该肽或其衍生物是用于本发明的载体的加载分子的一个例子。
天蚕素B(CecropinA)(SEQIDNO：15；Lys-Trp-Lys-Val-Phe-Lys-Lys-Ile-Glu-Lys-Met-Gly-Arg-Asn-Ile-Arg-Asn-Gly-Ile-Val-Lys-Ala-Gly-Pro-Ala-Ile-Ala-Val-Leu-Gly-Glu-Ala-Lys-Ala-Lue-NH2)是来自大蚕(giantsilkmoth)北美天蚕蛾(Hyalophoracecropia)的小抗菌肽。抗微生物肽作为病原体清除的效应器而对于先天宿主防御是关键的并且可以影响宿主细胞以促进伤口愈合(Kulagina，NV.等，SensActuatorsBChem.121，150页(2007)；Vaara，M.等，Antimicrob.AgentsChemo.38，2498页(1994)；Florack，D.等，TransgenicRes.4，132页(1995)；Lee，P.等，WoundRepairRegen.12，351页(2004))。这种肽或其衍生物是用于本发明的载体的加载分子的一个例子。
来自于人血小板因子4的人血小板因子4衍生肽(Humanplateletfactor4derivedpeptide)或C18G(SEQIDNO：16；H-Ala-Leu-Tyr-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Ser-Ala-Lys-Lys-Leu-Gly-OH)具有抗沙门氏菌的活性。C18G是源自人血小板因子IV的合成α-螺旋肽。该肽被发现是抗细菌性的并且具有抗沙门氏菌的活性(Coconnier-Polter，M-H.等，Appl.Environ.Microbiol.71，6115页(2005)；Darveau，R.等，J.Clin.Invest.90，447页(1992))。该肽或其衍生物是用于本发明的载体的加载分子的一个例子。
人富组蛋白(Histatin)-8【红血球凝集抑制肽(HIP)】(SEQIDNO：17；H-Lys-Phe-His-Glu-Lys-His-His-Ser-His-Arg-Gly-Tyr-OH)是人唾液富组蛋白(Hsts)中的一种，唾液富组蛋白属于唾液多肽家族，是小的阳离子富含组氨酸的肽。它们对白色念珠菌(Candidaalbicans)和新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)具有强力杀菌和抗真菌活性，并因此是抗念珠菌类的潜在治疗试剂。它们通过结合细胞膜、内化和破坏体积调控机制和线粒体功能杀死真菌细胞，从而导致产生反应性氧物质和非溶细胞性损失(Yoshida，M.等，Biol.Pharm.Bull.24，1267页(2001)；Ahmad，M.等，J.Histochem.Cytochem.52，361页(2004))。这种肽或其衍生物是用于本发明的载体的加载分子的一个例子。
人富组蛋白-5(SEQIDNO：18；H-Asp-Ser-His-Ala-Lys-Arg-His-His-Gly-Tyr-Lys-Arg-Lys-Phe-His-Glu-Lys-His-His-Ser-His-Arg-Gly-Tyr-OH)是具有强杀真菌特性的人碱性唾液抗微生物肽(Helmerhorst，E.等，J.Biol.Chem.274，7286页(1999))。这种肽或其衍生物是用于本发明的载体的加载分子的一个例子。
人富组蛋白-3或H3(SEQIDNO：19；H-Asp-Ser-His-Ala-Lys-Arg-His-His-Gly-Tyr-Lys-Arg-Lys-Phe-His-Glu-Lys-His-His-Ser-His-Arg-Gly-Tyr-Arg-Ser-Asn-Tyr-Leu-Tyr-Asp-Asn-OH)见于人唾液中并且具有强力的抗微生物特性。这种富含组氨酸的肽是前蛋白转化酶furin和PC7的抑制剂，但作为PC1的底物发挥作用(Basak，A.J.Pept.Res.49，596页(1997)；Koshlukova，S.等，InfectImmun.68，6848(2000))。这种肽或其衍生物是用于本发明的载体的加载分子的一个例子。
HNP-1或防御素人中性粒细胞肽-1(SEQIDNO：21；H-Ala-Cys-Tyr-Cys-Arg-Ile-Pro-Ala-Cys-Ile-Ala-Gly-Glu-Arg-Arg-Tyr-Gly-Thr-Cys-Ile-Tyr-Gln-Gly-Arg-Leu-Trp-Ala-Phe-Cys-Cys-OH(二硫桥：2-30、4-19、9-29))。哺乳动物防御素在嗜中性粒细胞、小肠的帕内特细胞和某些巨噬细胞的胞质嗜天青颗粒中非常丰富。HNP-1是具广泛抗微生物(革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌)和细胞毒性活性的肽。HNP-1降低腺病毒感染超过95％(Frick，I.等，J.Biol.Chem.278，16561页(2003)；Valore，E.等J.Clin.Invest.97，1624页(1996)；Mizukawa，N.等，AnticancerRes.20，1125(页2000)；Bastian，A.和H.Schafer，RegulPept.101，157页(2001))。这种肽或其衍生物是用于本发明的载体的加载分子的一个例子。
蜜蜂抗菌肽IA(ApidaecinIA)(SEQIDNO：22；H-Gly-Asn-Asn-Arg-Pro-Val-Tyr-Ile-Pro-Gln-Pro-Arg-Pro-Pro-His-Pro-Arg-Ile-OH)是见于免疫蜜蜂淋巴液(immunehoneybeelymph)中的独特的抗细菌肽衍生物。蜜蜂免疫肽，对抗微生物侵袭的蜜蜂体液防御的最主要成分，是一系列小的富含脯氨酸的18到20个残基的肽。它们抑制革兰氏阴性菌的存活；具有近乎即刻致死的活性，与传统的“溶解”机制无关，且涉及靶分子的立体选择性识别(Casteels-Josson，K.等，EMBOJ.12，1569(1993)；Casteels，P.J.Biol.Chem.269，26107页(1994)；Li，W.等，Pept.27，2350页(2006))。这种肽或其衍生物是用于本发明的载体的加载分子的一个例子。
红蝽素(Pyrrhocoricin)(SEQIDNO：23；H-Val-Asp-Lys-Gly-Ser-Tyr-Leu-Pro-Arg-Pro-Thr-Pro-Pro-Arg-Pro-Ile-Tyr-Asn-Arg-Asn-OH)。这种富含脯氨酸的阳离子抗菌肽红蝽素通过结合于70kDa的热休克蛋白DnaK并抑制蛋白质的折叠而杀死反应性的细菌(Cudic，M.等，Peptides23，2071页(2002)；Bulet，P.等，Dev.Comp.Immunol23，329(1999))。这种肽或其衍生物是用于本发明的载体的加载分子的一个例子。
杀手肽(Killerpeptide)1(KP1)(SEQIDNO：24(KLAKLAK)2-NH2)是螺旋抗微生物肽，其破坏高度阴离子细胞膜(细菌细胞膜比哺乳动物细胞膜更具阴离子性)并且优先杀死细菌细胞。较长的序列(SEQIDNO：25(KLAKLAK)3-NH2)更选择性地抗细菌细胞(Javadpour，M.M.等，J.Med.Chem.1996，39：3107-3113页)。这些肽或其衍生物是用于本发明的载体的理想加载分子。
人Cathelecidin片段104-15O(LL-37)：(SEQIDNO：26：LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES)。该18kDa的人阳离子抗微生物蛋白质属于cathelicidin家族。其从激活的嗜中性粒细胞释放。释放之后，37-氨基酸的α螺旋C末端被切除，从而形成了功能性的抗微生物肽LL-37。除了具有抗微生物性外，LL-37还结合LPC，并且此前证明这种结合降低了LPS诱导的从大鼠大动脉的一氧化氮释放并保护小鼠免于LPC致死。LL-37还被发现具有通过甲酰基肽受体FPRL1介导的免疫调节和趋化活性。由于人cathelicidin衍生肽LL-37结合并中和细菌脂多糖(LPS)，因此其可能在败血性休克的治疗中具有有益效果。其它的变体包括名为106(氨基酸106至140，SEQIDNO：27：GDFFRKSKEK-IGKEFKRIVQ-RIKDFLRNLV-PRTES)、110(氨基酸110至140，SEQIDNO：28：RKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES)的LL-37的N末端截断体、BMAP-27(SEQIDNO：30：GRFKRFRKKFKKLFKKLSPVIPLLHL-am)和更为疏水的变体18-聚体LLKKK(SEQIDNO：29：KLFKRIVKRI-LKFLRKLV)。LL-37、片段106和110以及18-聚体LLKKK在径向扩散分析中抑制大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念球菌的生长，抑制脂多糖诱导的血管一氧化氮产生并且类似地吸引嗜中性粒细胞。尽管与LL-37相比片段106和110在培养的细胞中引起较低的细胞溶解和DNA断裂，但18-聚体LLKKK诱导严重的细胞溶解。片段106和110的抗菌效果不受血清影响，尽管LL-37的效果被降低。N末端疏水性氨基酸从LL-37上的去除降低了其细胞毒性以及血清的抑制，而对其抗微生物或LPS中和作用不造成负面影响。因此这样的LL-37衍生肽可对患有败血症的受试者的治疗具有益处(Ciornei等，AntimicrobialAgentsandChemotherapy，2005，49(7)：2845-2850页；Bals等，J.Clin.Invest.，1999，103：1113-1117页；Deslouches等，AntimicrobialAgentsandChemotherapy，2005，49(8)3208-3216页)。这些肽或其衍生物是用于本发明的载体的理想加载分子的例子。
Protegrin-1或PG-1：(SEQIDNO：36：RGGRLCYCRRRFCVCVGR)和衍生物IB-367或依色加南(Iseganan)：SEQIDNO：37：RGGLCYCRGRFCVCVGR(Chen等，JournalofChromatographyA，853(1999)197-206页；Jang等，BMCStructuralBiology2007，7：21页；vanSaene等，vanSaene等，Chest，2007，132：1412页；Kollef等，America，JournalofRespiratoryandCriticalcare，2006，173页；Shi等，InfectionandImmunity，1998，66(8)：3611-3617页)。抗微生物肽的Protegrin家族在猪白细胞中被鉴定。已经鉴定了五种天然的protegrin序列(PG-1至PG-5)。这些天然protegrins包含16到18个氨基酸，是高度同源的并且共有为阳离子性、双亲性3-折叠的特征。所述分子在第6和15位以及在第8和13位的半胱氨酸残基之间具有二硫桥。依色加南，作为一种抗微生物，具有抗好氧性和厌氧性革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌以及真菌和酵母的活性。这些肽或其衍生物是用于本发明的载体的理想加载分子。
K4：(SEQIDNO：38：KKKKPLFGLFFGLF)是利用抗微生物肽数据库设计的抗微生物肽。该肽具有抗革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的强活性(溶解细菌细胞)，这些细菌包括人病原性细菌例如金黄色葡萄球菌和弧菌属的一些海洋细菌。该肽在溶细菌浓度下对于哺乳动物细胞是非毒性的(Duval等，Peptides，2009，30：1608-1612页)。这种肽或其衍生物是用于本发明的载体的加载分子的一个例子。
Indolicidin：Indolicidin是存在于牛嗜中性细胞的胞质颗粒内的13个氨基酸的抗微生物肽。Indolicidin是分离自哺乳动物骨髓细胞的抗微生物肽cathelicidin家族的成员。作为天然存在的肽，indolicidin具有由39％的色氨酸和23％的脯氨酸构成的独特组成(SEQIDNO：39：ILPWKWPWWPWRR-am；以及变体，SEQIDNO：40：ILPWKWPWWPWRR-meth；SEQIDNO：41：ILKKWPWWPWRRK；SEQIDNO：42：ILKKWPWWPWRRK-meth)，并且在自然界中该肽在C末端被酰胺化。Indolicidin具有针对革兰氏阴性和阳性细菌、真菌和原生动物的活性。这些肽或其衍生物是用于本发明的载体的理想加载分子。
人乳铁传递蛋白片段(hLF1-11)：(SEQIDNO：43：GRRRRSVQWCA)人乳铁传递蛋白(HLF)是粘膜表面和嗜中性细胞的非特异性防御的主要成分，并且具有抗多种病原体的活性。使用对应于前11个N末端氨基酸的合成肽(被称为hLF(1-11))进行的研究具有细菌杀灭活性(Nebbering等，InfectionandImmunity，2001，69(3)：1469-1476页)。这种肽或其衍生物是用于本发明的载体的加载分子的一个例子。
鲎肽(Polyphemusin)1和鲎肽素(Tachyplesin)I：(SEQIDNO：44：RRWCFRVCYRGFCYRKCR-NH2；SEQIDNO：44：KWCFRVCYRGICYRRCR-NH2)。鲎肽素来自于日本鲎(Japanesehorseshoecrab)三刺鲎(Tachypleustridentatus)，鲎肽来自于美国(美洲鲎Limuluspolyphemus)。这些肽长为17-18氨基酸残基，包含两个二硫键并且具有酰胺化的C末端精氨酸。这两个肽家族均具有抗细菌活性，除了阻止诸如甲型流感病毒和HIV的包膜病毒的复制外，还抑制革兰氏阳性和革兰氏阴性菌种以及真菌的生长。这些肽或其衍生物是用于本发明的载体的理想加载分子。
干扰素γ(pI＝8.5-9.5)是具有抗病毒活性并且可被用于治疗肝炎感染和其它病毒感染的II型干扰素。干扰素β(pI＝pI＝8.9-9.7)是具有抗病毒活性并且可被用于治疗肝炎感染的I型干扰素。这些干扰素具有碱性等电点，并且属于用于本发明的载体的理想加载分子。
c)生长刺激因子(用于组织损伤的治疗)
PR39，抗细胞凋亡因子(SEQIDNO：31；H-Arg-Arg-Arg-Pro-Arg-Pro-Pro-Tyr-Leu-Pro-Arg-Pro-Arg-Pro-Pro-Pro-Phe-Phe-Pro-Pro-Arg-Leu-Pro-Pro-Arg-Ile-Pro-Pro-Gly-Phe-Pro-Pro-Arg-Phe-Pro-Pro-Arg-Phe-Pro-OH)最初分离自猪的小肠，这一富含脯氨酸和精氨酸的39个氨基酸的肽亦见于嗜中性细胞嗜天青颗粒和巨噬细胞中。该肽在细胞迁移和伤口愈合的转移潜能中发挥作用；结合于NADPH氧化酶复合蛋白p47phox7和信号传导衔接蛋白p130Cas。并且最近，PR39被发现抑制组织缺氧所诱导的细胞凋亡并且在内皮细胞中降低半胱天冬酶-3活性(Wu，J.等，Circulation109，1660页(2004))。PR39的衍生物包括SEQIDNO：32：RRRPRPPYLPRPRPPPFFPPRLPPRI或PR26；SEQIDNO：33：RRRPRPPYLPRPRPPPFFP或PR19；SEQIDNO：34：RRRPRPPYLPR或PR11；以及相关肽诸如SEQIDNO：35：RLCRIVVIRVCR或Bactenecin(Agerberth，B.等，Eur.J.Biochem.，202，849-854页，1991；Boman，H.G.等，Infect.Immun.，61，2978-2984页，1993；Agerberth，B.等，Vet.Immunol.Immunopathol.，54，127-131页，1996；Gallo，R.L.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91，11035-11039页，1994；Li，J.等，Circ.Res.，81，785-796页，1997；Gudmundsson，G.H.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92，7085-7089页，1995；Li，J.等，Nature.Med.，6，49-55页，2000；Li，J.等，Nature.Med.，6，356，2000；Gao，Y.等，J.Clin.Invest.，106，439-448页，2000；Bao，J.等，Am.J.Physiol.HeartCirc.Physiol.，281，2612-2618页，2001；Madhani等，BiochimicaetBiophysicaActa1588(2002)232-240页)。这些肽或其衍生物是用于本发明的载体的理想加载分子。
TGF-β激活肽。源自凝血酶敏感蛋白(TSP-1)的转化生长因子β(TGF-β)激活肽。这一碱性基序(SEQIDNO：46)H-Lys-Arg-Phe-Lys-NH2(KRFK)与Trp-Xaa-Xaa-Trp序列结合诱导强的肝素结合。该序列Trp-Xaa-Xaa-Trp是TSP-1的氨基酸412-415并且足以激活潜伏的TGF-β(Shultz-Cherry，S.等，J.Biol.Chem.270，7304(1995)；Guo，N.等，J.Biol.Chem.267，19349页(1992))。源自上述基序的序列的例子为SEQIDNO：48(H-Lys-Arg-Phe-Lys-Gln-Asp-Gly-Gly-Trp-Ser-His-Trp-Ser-Pro-Trp-Ser-Ser-OH；或KRFKQDGGWSHWSPWSS)和SEQIDNO：49(H-Lys-Arg-Phe-Lys-Gln-Asp-Gly-Gly-Trp-Ser-His-Trp-Ser-Pro-OH；或KRFKQDGGWSHWSP)。这些肽或其衍生物是用于本发明的载体的理想加载分子。
d)生长抑制剂(用于癌症和细胞或瘢痕过度生长的治疗)
α干扰素pI＝8.8-9.1)是I型干扰素，其可被用于一些类型的癌症的治疗。α干扰素可被用于治疗肾脏癌症、恶性黑色素瘤、皮肤黑色素瘤、多发性骨髓瘤和类癌肿瘤。其还可被用于治疗特定类型的淋巴瘤和白血病。干扰素γ(pI＝8.5-9.5)是具有抗成瘢活性(抑制疮疤形成细胞的过度生长/活性)并且可被用于治疗肝硬化、肺部纤维化、慢性肉芽肿病、骨硬化病和结核病所诱导的瘢痕发生的II型干扰素。瘢痕发生或过度结缔组织沉积可由化学物质或感染而导致。
TGF-β抑制剂，其源自或包含SEQIDNO：56(FCLGPCPYIWSLDT或Tb143-56)，SEQIDNO：57(TSLDASIWAMMQNA或P144)，SEQIDNO：58(KRIWFIPRSSWYERA或P17)，和SEQIDNO：58(TSLDATMIWTMM)中的任意一种。这些肽可经修饰以包含碱性残基从而能够结合本发明的载体，所产生的组合物可用于肝硬化、肺部纤维化、慢性肉芽肿病、骨硬化病和结核病诱导的瘢痕发生的治疗。
bFGF抑制剂(SEQIDNO：50；H-Lys-Arg-Thr-Gly-Gln-Tyr-Lys-Leu-OH)：该肽对应于bFGF的人、牛(119-126)、小鼠、大鼠(118-125)和肝素结合生长因子2(118-125)的残基。其抑制bFGF受体的二聚化和激活(Yayon，A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，10643页(1993))。该肽或其衍生物是用于本发明的载体的加载分子的一个例子。
成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)衍生肽：FGF-2是神经胶质瘤的自发增殖中的自分泌生长因子。FGF-2衍生肽(SEQIDNO：51；H-Met-Trp-Tyr-Arg-Pro-Asp-Leu-Asp-Glu-Arg-Lys-Gln-Gln-Lys-Arg-Glu-OH)抑制恶性神经胶质瘤的生长。这种16残基的肽具有类似于FGF-2的推定受体结合域的构象。其抑制人神经胶质瘤细胞的生长并且是用于恶性神经胶质瘤的潜在的新治疗产品(Kono，K.等，J.Neuro-Oncology63，163页(2003))。该肽或其衍生物是用于本发明的载体的加载分子的一个例子。
卡律蝎毒素(Charybdotoxin)(SEQIDNO：52；Pyr-Phe-Thr-Asn-Val-Ser-Cys-Thr-Thr-Ser-Lys-Glu-Cys-Trp-Ser-Val-Cys-Gln-Arg-Leu-His-Asn-Thr-Ser-Arg-Gly-Lys-Cys-Met-Asn-Lys-Lys-Cys-Arg-Cys-Tyr-Ser-OH(二硫桥：7-28、13-33和17-35))：卡律蝎毒素(ChTX)是Ca2+激活的K+通道阻滞剂。其使外周T细胞去极化并且阻断其丝裂原诱导的增殖。ChTX是分离自蝎-以色列金蝎(Leiurusquinquestriatushebraeus)的毒液的高度碱性肽(Leonard，R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89，10094页(1992)；Gimenez-Gallego，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85，3329页(1988)；Sugg，E.等，J.Biol.Chem.265，18745页(1990))。这种肽或其衍生物是用于本发明的载体的加载分子的一个例子。
触角足肽BakBH2(Ant-BH3)(71-89)融合肽(SEQIDNO：53：H-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-Met-Gly-Gln-Val-Gly-Arg-Gln-Leu-Ala-Ile-Ile-Gly-Asp-Asp-Ile-Asn-Arg-Arg-Tyr-OH)。这是包含与触角足肽融合的BakBH3结构域的氨基酸71至89片段的融合肽。该Bcl-2同源性3(BH3)结构域对于Bcl-2蛋白质家族的促凋亡成员的死亡诱导和二聚化特性至关重要，所述促凋亡成员包括Bak、Bax和Bad。对应于Bak的BH3结构域的合成肽结合Bal-xL，拮抗其抗凋亡功能，并且当通过与触角足肽的同源异型蛋白内化结构域融合而递送到完整细胞中时快速诱导凋亡。Holinger，E.等，J.Biol.Chem.274，13298页(1999)。这种肽或其衍生物是用于本发明的载体的加载分子的一个例子。
肿瘤靶向的促凋亡肽：(SEQIDNO：54：H-Cys-Asn-Gly-Arg-Cys-Gly-Gly-D-Lys-D-Leu-D-Ala-D-Lys-D-Leu-D-Ala-D-Lys-D-Lys-D-Leu-D-Ala-D-Lys-D-Leu-D-Ala-D-Lys-NH2(具有肽内二硫键并且D代表氨基酸的D-异构体))。这与CNGRCGGklaklakklaklak-NH2(二硫键)或CNGRC-GG-(klaklak)2-NH2(具有肽内二硫键)相同，其中小写字母的氨基酸代码代表对应氨基酸的D-异构体。该肽由两个功能域组成，一方面为“导向(homing)”或靶向结构域，其引导该肽朝向所靶向的细胞并且使其内化，另一方面为程序性细胞死亡诱导序列。所述靶向结构域包含Asn-Gly-Arg(NGR)基序，其被证明可用于向肿瘤血管递送各种抗肿瘤化合物和病毒颗粒。作为程序性细胞死亡诱导序列，合成的14氨基酸肽klaklakklaklak，亦称为(klaklak)2，被选择，因为其在杀死真核细胞所需浓度的1％浓度下杀死细菌。该促凋亡结构域在细胞外是非毒性的，但在被内化进入靶向细胞时通过破坏线粒体膜而具有毒性。因此，靶向的促凋亡肽代表潜在的新型抗癌剂。它们结合了两种水平的特异性：“导向”至所靶向的细胞和进入后这些细胞的选择性凋亡(H.M.Ellerby等，Nat.Med.，5，1032页(1999)；G.Colombo等，J.Biol.Chem.，277，47891页(2002)；L.A.Plesniak等，ProteinSci.，13，1988页(2004))。这种肽或其衍生物是用于本发明的载体的加载分子的一个例子。表1中所示的序列是基于本领域已知的各氨基酸的单字母简称并且所示的氨基酸可为D或L异构体。“Pyr”表示焦谷氨酸，“am”表示在羧基末端胺化，“meth”表示甲基化。
表1：作为本发明的元件的肽加载分子的例子
静电结合于本发明的载体的蛋白质和肽可导致更持久的体内循环时间、在血液中更高的稳定性和/或更方便的施用(例如，更快的施用，如通过推注而不输注，以及更低频度的施用，如几日一次而不是输注或每日一次)。碱性蛋白质活性剂的长期施用通常可能是免疫原性的。基于载体的制剂一般产生低于基于PEG的递送系统的免疫原性，因此碱性蛋白质或肽被预计在本发明的组合物中具有较低的免疫原性。活性剂的“直接聚乙二醇化”是蛋白质与PEG的直接键合并且可导致活性的丧失。然而，与共价结合于具保护侧链的载体骨架的阴离子基团进行静电结合的阳离子蛋白质或肽可产生稳定的长循环时间的聚乙二醇化的替代方案。在一个实施方案中，加载分子与可为组合物成分的疏水基团之间的相互作用相比，加载分子和组合物的阴离子基团之间的相互作用在血液中更为稳定。本发明的载体可作为冷冻保护剂和大分子稳定剂而发挥作用，从而其在溶液中以及在冻干和重构过程中保护碱性蛋白质或肽活性剂。
尽管静电结合的蛋白质或肽/载体组合在本文中被描述为组合物，但它们可以或者被理解为包含静电键的化合物。在各个不同的实施方案中，本文中未列出的可能改变本发明的操作的组分可被排除而仍然允许包含改变必需组分的操作的组分。本文未列出的可能改变本发明的操作的特征可通过使用用于描述本发明的必需特征的短语“基本由......组成”而排除。然而，短语“基本由......组成”的使用并不排除那些不改变必需组分的操作的特征。在一个实施方案中，“基本由......组成”意味着离子相互作用的Kd低于10μM并且不存在Kd低于10μM的其它相互作用，如疏水相互作用。
持续释放
当本发明的载体被用于配制蛋白质或肽活性剂的时候，如与单独施用所述活性剂相比该活性剂在血液中的更持久存在所证明的，观察到所述活性剂在延长时间内的释放。载体与活性剂的结合通过特定解离常数(Kd)限定，该常数可被本领域的技术人员容易地测定。释放通过游离活性剂的浓度确定，以使得当游离活性剂浓度下降(由于体内降解或者清除)并且不再满足Kd的时候，更多的活性剂将被释放以满足该Kd。Kd是游离活性剂浓度与阴离子簇(未结合所述活性剂)浓度两者的乘积除以与阴离子基团结合的活性剂浓度。对于形成超分子结构诸如胶束、脂质体和其它结构的本发明的组合物，释放率仍然遵循Kd，但由于区室化(compartmentalization)，Kd仅在特定的区室中被满足。然而，各种不同区室的长期混合将导致该活性剂最终释放进入周边环境。在涉及或不涉及区室化的这两种情况下，释放分布均将导致有效量(例如，约0.00001mg/kg/小时至10mg/kg/小时)的活性剂的延长递送(超过，例如1到约4,000小时，或者约4到1500小时)。该制剂的优点是比连续施用到每日一次或甚至每周一次频率更低的推注施用。这将在血液内提供与未制剂的活性剂相比具有更低的波动的更为恒定的活性剂水平。推注施用的频率应根据受试者的需要而变化并且可被本领域的技术人员容易地确定。不期望受理论的束缚，在一个实施方案中，本发明相对于包含疏水部分的载体的优势在于本发明的制造工艺，其可以允许在无需有机溶剂的情况下使用水。水性系统可以代表一种显著的制造优势。
治疗用途
使用本发明的组合物进行治疗的“患者”、“受试者”或“宿主”可以意指人或者非人类动物。本发明的碱性蛋白质(阳离子蛋白质)可用于治疗例如但不限于，细菌感染、癌症和相关肿瘤疾病以及阿尔茨海默氏症的这类疾病和障碍。在一个实施方案中，本发明的组合物可用于制造以用于多种用途的药剂，包括，例如用于治疗受试者的任何疾病或其它可治疗病症。
A)炎症的治疗
在一个实施方案中，本发明的具有包含SEQIDNO：1-11或其衍生物或类似物的加载分子的组合物可被用于治疗炎症。可受益于本发明的组合物的慢性炎性疾病的例子是：类风湿性关节炎、慢性炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎和糖尿病。
B)感染的治疗
在一个实施方案中，本发明的具有包含SEQIDNO：12-45或其衍生物或类似物的加载分子的组合物可被用于治疗感染。在另一个实施方案中，本发明的碱性蛋白质可用于细菌感染的治疗。用于治疗的示例性活性剂包括溶葡球菌素，一种在生理pH下具有总体正电荷的碱性蛋白质。溶葡球菌素切割革兰氏阳性细菌细胞壁肽聚糖中的五甘氨酸交联桥。金黄色葡萄球菌对该酶的溶细菌效应尤为敏感，因为它的细胞壁包含高比例的五甘氨酸交联桥。溶葡球菌素是用于治疗多药物抗性金黄色葡萄球菌介导的感染(包括心内膜炎、骨髓炎、导管相关感染和MRSA介导的社区获得性疖病(communityacquiredfurunculosis)以及肺炎)的潜在的系统治疗方法。
C)组织或细胞损伤的治疗
在一个实施方案中，本发明的碱性蛋白质包括转化生长因子(TGF-α、-β1、-β2、-β3；pI8-9)、血管内皮生长因子(VEGF-A、-B、-C、-D；pI8.0-9.5)、成纤维细胞生长因子(FGF，具有22个成员；pI8.0-9.0)、肝细胞生长因子(HGF；具有结合硫酸根残基的正性位点)、神经生长因子(NGF，pI8.5-9.5)和血小板源性生长因子(PDGF-AA、-BB、-AB；pI8.5-10)。这些生长因子可用于刺激受伤器官的生长，例如糖尿病情况下的胰岛或心肌梗死情况下的心脏。这些生长因子可使用本发明的载体进行配制或者与之组合并且被用于糖尿病或心肌梗死的治疗。上述蛋白质在生理pH下具有总体正电荷或具有正电荷斑块并且能够结合本发明的载体的阴离子基团。包括肝素结合EGF(HB-EGF)、β细胞素(BTC)、双调蛋白(AR)、表皮调节素(EPR)、Epigen(EPR)和神经调节素的表皮生长因子(EGF)家族的其它成员具有能够结合硫酸根部分的结合位点并且可以使用本发明的载体进行配制。TGF-α、VEGF和HB-EGF可用于在糖尿病中使胰岛细胞生长。在另一个实施方案中，本发明的具有包含SEQIDNO：31-34和46-49或其衍生物或类似物的加载分子的组合物可被用于治疗组织或细胞损伤。在又另一个实施方案中，本发明的加载分子可以是成纤维细胞生长因子(FGF；pI9.6)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)或不含唾液酸的促红细胞生成素(pI8.5)中的任何一种。FGF家族的所有成员均具有碱性等电点或在其表面上具有可结合本发明的载体中的阴离子基团的带正电荷的斑块。这些生长因子可用于需要器官再生的放射或者化学损伤的治疗。例如，对放射性物质的意外暴露将受益于长效FGF(具有本发明的阴离子核心载体的FGF制剂)的使用，其将改善肠粘膜和骨髓的再生。促红细胞生成素在本发明的阴离子核心载体中的制剂通过加速骨髓的恢复而有益于骨髓损伤或崩溃的治疗，特别是当促红细胞生成素的水平由于本发明的载体而维持较长的时期时。
D)癌症或过度生长的治疗
在另一个实施方案中，本发明的具有包含SEQIDNO：50-55或其衍生物或类似物的加载分子的组合物可被用于治疗癌症或过度生长。
施用和剂量
使用本发明的组合物进行治疗的“患者”“受试者”或“宿主”可以意指人或非人类动物。
术语“药学可接受的赋形剂”是本领域所公认的并且指的是与组合物一起被施用的药学可接受的材料、组合物或媒介物，例如液体或固体填充剂、稀释剂、溶剂或包封材料。各赋形剂在与补充物的其它成份相容并且不伤害受试者的意义上是“可接受的”。可用作药学可接受的赋形剂的材料的一些例子包括：(1)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)粉状西黄蓍胶(tragacanth)；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石粉；(8)诸如可可脂和栓剂蜡的赋形剂；(9)油类，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油或大豆油；(10)二醇类，例如丙二醇；(11)多元醇，例如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲溶液；以及(21)药用制剂中使用的其它非毒性相容物质。
本发明的肽/蛋白质活性剂的剂量应根据受试者的症状、年龄和体重、疾病或障碍的特性和严重程度、施用路径以及对受试者联合施用的其它药物/活性剂而变化。应始终给以确保所述肽/蛋白质的益处超过在毒性和其它副作用方面给受试者带来的风险的剂量。在其中活性剂是溶葡球菌素的实施方案中，剂量取决于感染的严重程度以及其它补充抗生素的形式。在其中活性剂是抗炎剂的实施方案中，剂量取决于炎症的严重性和炎症的病因以及其它补充抗炎药物的形式。在其中活性剂是生长因子的实施方案中，剂量取决于生长因子的安全性和可耐受性及超过风险的益处，以及是否所述生长因子被单独使用或与其它生长因子和生长因子诱导剂(在糖尿病情况下，奥美拉唑)组合使用。任何所述制剂可以以单一剂量或分割剂量进行施用。可通过本领域的技术人员已知的技术或根据本文的教导容易地确定本发明的肽/蛋白质制剂的剂量。另外，本发明包括本发明的一种或者多种制剂与一种或多种抗生素或其它治疗剂的混合物。在特定的实施方案中，本发明的包含溶葡球菌素的载体可与选自以下的任何一种或多种其它抗生素一起施用：阿莫西林、氨苄青霉素、阿度西林、阿洛西林、氨曲南、枯草菌素(bactacin)、苄星青霉素、苄星青霉素V(benzathinephenoxymethylpenicillin)、苄星青霉素G、比阿培南、羧苄西林、头孢乙腈、头孢羟氨苄、头孢氨苄、头孢来星、头孢洛宁、头孢噻啶、头孢噻吩、头孢匹林、头孢曲秦、头孢西酮、头孢氮氟、头孢唑啉、头孢拉定、头孢沙定、头孢替唑、头孢克罗、头孢孟多、头孢米诺、头孢尼西、头孢雷特、头孢替安、头孢丙烯、头孢拉宗、头孢呋辛、头孢唑南、头霉素(如头孢西丁、头孢替坦、头孢美唑)、碳头孢烯(如氯碳头孢)、头孢卡品、头孢达肟、头孢地尼、头孢托仑、头孢他美、头孢克肟、头孢甲肟、头孢地嗪、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢咪唑、头孢匹胺、头孢泊肟、头孢磺啶、头孢他啶、头孢特仑、头孢布烯、头孢噻林、头孢唑肟、头孢曲松、氧头孢烯(如氟氧头孢、拉氧头孢)、头孢吡肟、头孢唑兰、头孢匹罗、头孢喹肟、头孢比普(ceftobiprole)、氯霉素、氯己定(chlorohexidine)、克林霉素、氯甲西林、氯唑西林、粘菌素、环丝氨酸、达托霉素、多尼培南、强力霉素、依匹西林、厄他培南、红霉素、法罗培南、磷霉素、庆大霉素、亚胺培南、利奈唑胺、美西林、美罗培南、甲氧苯青霉素、甲氧西林、美洛西林、米诺环素、莫匹罗星、萘夫西林、新霉素、苯唑西林、帕尼培南、培那西林、非奈西林、苯氧甲基青霉素(V)、哌拉西林、多粘菌素、多粘菌素B、普鲁卡因青霉素、丙匹西林、奎奴普丁/达福普汀、雷莫拉宁、利福霉素、利福平、磺苄西林、替考拉宁、替加环素、替吉莫南、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑以及万古霉素。在特定的实施方案中，本发明的包含碱性蛋白质的载体可与选自以下的任何一种或多种其它抗生素一起施用：氨曲南、枯草菌素、头孢他啶、氯霉素、氯己定、克林霉素、达托霉素、强力霉素、红霉素、庆大霉素、利奈唑胺、甲氧西林、米诺环素、莫匹罗星、新霉素、苯唑西林、多粘菌素、奎奴普丁/达福普汀、利福霉素、利福平、替考拉宁、替莫西林、替卡西林、替加环素、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑和万古霉素。在特定的实施方案中，本发明的包含碱性蛋白的载体可与任何糖肽抗生素以碱性蛋白质比糖肽抗生素的0.1∶1与20∶1的重量比一起施用。在特定的实施方案中，重量比介于0.5∶1与7∶1之间。糖肽抗生素可选自万古霉素、替考拉宁和雷莫拉宁。本发明的组合物可以是适用于静脉内、肌内、皮下、腹膜内、鞘内或局部施用的形式。
本发明还涉及在人类受试者中治疗葡萄球菌感染的方法，包括：施用本发明的包含静电连接于溶葡球菌素的具有阴离子电荷的载体的组合物，其中溶葡球菌素以1mg到150mg/kg体重/日的量施用于人类受试者；并且对所述人类受试者施用50到250mg/kg体重/日的β-内酰胺抗生素。所述的β-内酰胺抗生素可与载体和溶葡球菌素一起施用，以使得β-内酰胺在人类受试者体内的剂量为100到200mg/kg体重/日。所述的β-内酰胺抗生素可以是青霉素、头孢菌素、表霉烯(penem)、碳青霉烯或单环内酰胺(monobactam)。属于青霉素类的β-内酰胺抗生素包括氨苄青霉素类(如阿莫西林、氨苄青霉素和依匹西林)；羧苄青霉素类(如羧苄西林、替卡西林、替莫西林)；脲基青霉素(ureidopenicillin)类(阿洛西林、哌拉西林、美洛西林)；以及其它(如美西林、磺苄西林、苄青霉素(G)阿度西林、培那西林、氯甲西林、苄星青霉素、普鲁卡因青霉素，苯氧甲基青霉素(V)、丙匹西林、苄星青霉素(benzathine)、苯氧甲基青霉素、非奈西林、苯唑西林、氯唑西林、甲氧西林、萘夫西林)。属于头孢菌素类的β-内酰胺抗生素是：头孢乙腈、头孢羟氨苄、头孢氨苄、头孢来星、头孢洛宁、头孢噻啶、头孢噻吩、头孢匹林、头孢曲秦、头孢西酮、头孢氮氟、头孢唑啉、头孢拉定、头孢沙定、头孢替唑、头孢克罗、头孢孟多、头孢米诺、头孢尼西、头孢雷特、头孢替安、头孢丙烯、头孢拉宗、头孢呋辛、头孢唑南、头霉素、碳头孢烯、头孢卡品、头孢达肟、头孢地尼、头孢托仑、头孢他美、头孢克肟、头孢甲肟、头孢地秦、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢咪唑、头孢匹胺、头孢泊肟、头孢磺啶、头孢他啶、头孢特仑、头孢布烯、头孢噻林、头孢唑肟、头孢曲松、氧头孢烯、头孢吡肟、头孢唑兰、头孢匹罗、头孢喹肟和头孢比普。属于碳青霉烯类的β-内酰胺抗生素为比阿培南、多尼培南、厄他培南、亚胺培南、美罗培南和帕尼培南。作为青霉烯的β-内酰胺抗生素是法罗培南。
在特定的实施方案中，肽/蛋白质制剂的剂量一般介于约0.01ng至约1000mg碱性蛋白质每千克体重的范围，特别地介于约1ng至约100mg碱性蛋白质每千克，和更特别地介于约100ng至约20mg碱性蛋白质每千克的范围。更优选的剂量范围为约100ng至约20mg碱性蛋白质每千克。肽/蛋白质相对于制剂中载体重量的量可介于载体重量的约1％至1000％之间。在一个实施方案中，碱性蛋白质相对于制剂中的载体重量的量可介于载体重量的约5％至500％之间。在其它实施方案中，碱性蛋白质相对于制剂中的载体重量的量可介于约可介于载体重量的约10％至100％之间。
在本发明中，可能需要对有效剂量或有效量以及对制剂施用的时间选择上的任何可能影响进行鉴定。这可通过本文所述的常规实验，使用一组或多组动物(优选每组至少五只动物)或在适当情况下在人体试验中完成。可通过施用并且根据测量一种或多种与目标疾病/障碍/感染相关的指标而评价该施用的效果并且将这些指标的治疗后值与治疗前同样指标的值进行比较而对所述的肽/蛋白质制剂的效能进行评价。
在给定受试者体内产生最高效治疗的精确施用时间和任何特定化合物的量取决于碱性蛋白质的活性、药代动力学和生物利用率、所述受试者的生理状况(包括年龄、性别、疾病类型和阶段、一般身体状况、对给定药物剂量和类型的反应性)、施用途径等等。本文所描述的指导原则可被用于对该治疗进行优化，例如确定最佳施用时间和/或施用量，这仅需要包括监测受试者和调节剂量和/时机的常规实验。
治疗可以低于化合物的最佳剂量的较小剂量开始。之后，剂量可以小幅度地提高直至达到最佳疗效。
本发明的溶葡球菌素制剂与其它抗生素或其它治疗剂的组合使用可降低溶葡球菌素制剂的所需剂量。这是因为其它抗生素或其它治疗剂的效应可与该溶葡球菌素制剂互补。在这样的联合治疗中，不同活性剂可以共同地或者独立地递送，并且可以同时地或者在一日内的不同时间递送。
可通过在细胞培养物或实验动物中的标准药学程序测定本发明的抗细菌肽/蛋白质制剂的毒性和疗效，例如用于测定LD50、ED50、MIC(依然抑制测试微生物生长的产物最低浓度)和/或MBC(杀灭或对测试生物体具有杀菌性的最产物低浓度)。表现出高治疗指标的制剂是优选的。尽管可以使用表现出毒性副作用的制剂，应注意载体-抗细菌肽/蛋白质复合物在所需位点的积累以降低副作用。
从细胞培养分析和动物研究中所获得的数据可被用于配置用于人体的剂量范围。重要的是，任何载体-抗细菌肽/蛋白质复合物制剂的剂量应血液中提供高于MIC而具有很小或没有毒性的循环浓度范围。所述剂量可根据使用的剂型和采用的施用途径而在此范围内变动。对于本发明的药剂，治疗有效剂量可从细菌培养分析中进行初步估测从而获得MIC和MBC。制剂的剂量可基于提供高于根据细胞培养中测定的MIC和/或MBC的循环血浆浓度的剂量而从动物模型中推导。这样的信息可被用于更准确地确定人体内的可用剂量。
本发明的载体-抗细菌肽/蛋白质复合物可被用于以药膏、糊剂、乳膏或凝胶的形式进行外部施用，并且可以进一步包含赋形剂，例如动物和植物脂、油类、蜡类、石蜡、淀粉、西黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅氧烷、膨润土、硅酸、滑石和氧化锌或其混合物。
具有本发明的碱性蛋白的载体可被用于以粉末或喷剂形式进行外部施用，并且可以进一步包含赋形剂，例如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末或这些物质的混合物。喷剂可另外包含惯用的推进剂，例如氯氟烃和挥发性非取代烃类，例如丁烷和丙烷。
本发明的载体-肽/蛋白质复合物可被用于以气溶胶形式进行外部施用。这可通过制备包含本发明的组合物但不与固体共价连接的水性气溶胶、脂质体制剂或固体颗粒而实现。可以使用非水性(如碳氟化合物推进剂)的悬液。可以使用声波雾化器，因为其使药剂对可导致化合物降解的剪切的暴露降至最低。通常情况下，通过将制剂的水性溶液或悬液与传统的药学可接受载体和稳定剂一起配制制备水性气溶胶。赋形剂和稳定剂根据特定化合物的需求而变化，但通常包括非离子表面活性剂(吐温、泊洛尼克或聚乙二醇)、无害的蛋白质如血清白蛋白、山梨聚糖酯、油酸、卵磷脂、氨基酸如甘氨酸、缓冲液、盐、糖或糖醇。气溶胶一般由等渗溶液制备。
适用于肠胃外施用的包含本发明的载体-肽/蛋白质复合物的药用组合物包含与一种或多种药学可接受的无菌等渗水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳液或与可正好在使用前重构为无菌可注射溶液或悬浮液的无菌粉末组合的一种或多种补充剂成分，其可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使得该制剂与目标受体的血液等渗的溶质或者悬浮或增稠剂。
可被用于本发明的药物组合物中的适当的水性和非水性赋形剂的例子包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等等)及它们的适当混合物、植物油如橄榄油，以及可注射有机酯类如油酸乙酯。适当的流动性可，例如，通过使用包衣材料如卵磷脂、在分散剂的情况下通过维持所需颗粒尺寸以及通过使用表面活性剂来维持。
试剂盒
本发明还提供了试剂盒用于方便和有效地实施本发明的试剂盒。这样的试剂盒包含本发明的载体-肽/蛋白质复合物或其组合中的任何一种，以及有利于遵从本发明的方法的手段。在载体-肽/蛋白质复合物制剂的情况下，这样的试剂盒提供了用于确保接受治疗的受试者以正确的剂量和正确的方式摄取合适的活性剂的方便和有效的手段。这样的试剂盒的实施手段包括有助于根据本发明的方法施用活性剂的任意手段。这样的实施手段包括指导说明、包装和分配手段以及它们的组合。试剂盒组分可被包装以用于手工或部分自动或全自动地实施上述方法。在涉及到试剂盒的其它实施方案中，本发明涵盖了包含本发明的组合物并且任选地包含其使用指导说明的试剂盒。样品可以来自多种来源包括血清、血浆、全血、尿液、组织提取物、细菌提取物、病毒提取物、真菌提取物或任何怀疑存在碱性蛋白质(例如溶葡球菌素)或需对其存在进行定量的样品的液体。
在一个方面，本发明涉及包含组合物的试剂盒，该组合物包含：(i)聚合物骨架；(ii)与所述骨架共价连接或键合的硫酸根、磺酸根或磷酸根部分的阴离子基团；(iii)具有带正电荷基团的活性剂，其静电结合于阴离子基团离子；以及(iii)与所述骨架共价连接或键合的保护链。这样的试剂盒的用途包括，例如，治疗应用。这样的试剂盒可具有多种其它用途，包括，例如，成像、靶定、诊断、治疗、疫苗接种等等。
实施例
本发明通过以下实施例进行进一步阐明。这些实施例仅被提供以用于说明目的，并非意在以任何方式对本发明的范围和内容进行限制。
除非另外说明，本说明书和权利要求书内使用的表示成份的量、反应条件等等的所有数字应被理解为在所有情况下均由术语“大约”修饰。因此，除非有相反的说明，本说明书和所附的权利要求书内给出的数值参数均为可根据本发明意图获得的所需特性而变化的近似数。
尽管本发明的优选的实施方案已在本文示出和描述，本领域的技术人员应明了这样的实施方案仅仅通过举例的方式而提供。应当理解在实施本发明中可以使用对本文所述的本发明的实施方案的明显替代方案。
具有源自多糖的聚合物骨架的组合物的实施例
实施例1：HPPEG52g的合成：将2gMPEGAM(MW＝5kDa；0.4mmol；Lysan；批号111-102；soln中澄清)溶解于10ml水中并加入5ml的1MHEPESpH7.3和100μl的10NNaOH以将pH调节至7.8。氨基通过TNBS进行测量并发现在2g中总共含0.579mmol的NH2。在独立容器内，将1g肝素钠盐(使用尺寸排阻层析法以球蛋白作为标准物测定其为25kDa，目录号41121-1GAcros.批号B0128763；MW＝～593+4钠-4H＝681Da/二糖；1gHP具有1.47mmol的理论羧基基团，假定羧基处无取代)溶解于5ml水中(总体积)。氨基通过TNBS进行测量并测得可忽略的总共2.6μmol每克的量。通过加入80mg的NHSS(MW＝115.14；0.7mmol)和285mg的EDC(MW＝191.71；1.5mmol)而对该HP溶液(5ml)进行20分钟的活化。随后将该溶液加入至MPEGAM溶液中并且使其反应3小时。三小时后，对氨基基团进行测量并测得其为总共192μmol，表明67％的MPEG被用掉。在次日对氨基基团再次进行测量并测得其为总共84μmol，表明85％的PEG被用掉。在50,000MWCO的超滤盒(UFP-50-E-5A)中使用15次换液的1MNaCl和10次换液的水对该反应混合物进行洗涤。样品HPPEG52g经过滤除菌(0.2μm聚砜滤器，Nalgene，Rochester，NY)并被冻干，产量为1.86克。1mg/ml进行分析并包含0+/-5μM的NH2或0hmol/mg。10mg/ml进行GPC的测量并表明保留时间为14分钟(约11.5nm)。
实施例2：HPPEG104G的合成：将4gMPEGAM(MW＝10kDa；0.4mmol；Sunbio；批号C1AM-010-05053)溶解于10ml水中并加入5ml的1MHEPESpH7.3和100μl的10NNaOH以将pH调节至7.8。通过TNBS对氨基基团进行测量并测得其在4g中总共含0.528mmol的NH2。这显得具有超出预期的更多氨基，可能MPEGAM具有较小的分子量。在独立的容器内，将1g肝素钠盐(使用尺寸排阻色谱法以球蛋白作为标准物测定其为25kDa，目录号41121-1GAcros.批号B0128763；MW＝～593+4钠-4H＝681Da/二糖；1gHP具有1.47mmol的理论羧基基团，假定羧基处无取代)溶解于5ml水中(总体积)。通过TNBS对氨基基团进行测量并测得其在每克中含可忽略的总共2.2μmol的量。通过加入80mg的NHSS(MW＝115.14；0.7mmol)和285mg的EDC(MW＝191.71；1.5mmol)而对该HP溶液(5ml)进行20分钟的活化。随即将该溶液加入MPEGAM溶液中并且使其反应3小时。三小时后，对氨基基团进行测量并测得其总共为152μmol，表明71％的MPEG被用掉。在次日对氨基基团再次进行测量并测得其总共为58μmol，表明89％的PEG被用掉。在50,000MWCO的超滤盒(UFP-50-E-5A)中使用15次换液的1MNaCl和10次换液的水对该反应混合物进行洗涤。样品HPPEG52g经过滤(使用来自Fisher的#5滤纸)并被冻干，产量为2.05克。1mg/ml进行分析并包含0+/-5μM的NH2或0nmol/mg。10mg/ml进行GPC的测量并表明保留时间为13.2分钟(约17nm)。
实施例3：50CSPEG106G的合成：该组合物具有硫酸软骨素或CS(鲨源，来自FisherScientific，Pittsburg，PA.目录号21355，分子量＝50kDa)以作为具有与6克10KDaMPEGAM(分子量＝10kDa的具有末端氨基基团的MPEG；Sunbio，Orinda，CA；目录号P1AM-10)/克CS进行反应的羧基基团的聚合物骨架。该组合物包含能够结合pI高于7的肽/蛋白质或小分子的阴离子基团。另外，其余的羧基基团可进一步修饰以包含更多硫酸根、磺酸根或磷酸根基团。50CSPEG106G如下进行制备；将6克MPEGAM(分子量＝10kDa的具有末端氨基基团的MPEG；Sunbio，Orinda，CA；目录号P1AM-10)溶于20ml80％的乙醇中，向该溶液中加入5ml的1MHEPES并使用10N的NaOH将pH调节至pH7.8。通过TNBS对氨基基团进行测量并测得其为0.91mmol。在独立容器内，将1克的CS溶解于8ml的水中以获得CS溶液，并且通过加入115mg的NHS(分子量＝115.14；1mmol)和随后加入575mgEDC(分子量＝191.71；3mmol)而活化羧基基团。20分钟的活化之后，将其直接加入MPEGAM中。2小时之后，测得总氨基基团为0.24mmol，这表明74％的MPEG被合并。将反应混合物浓缩至100ml并在100kDaMWCO的超滤盒(UFP-100-E-5A)中使用15次换液的水进行洗涤。50CSPEG106G样品经过滤除菌(0.2μm聚砜滤器，Nalgene，Rochester，NY)并被冻干，产量为2.4克。1mg/ml进行分析并且包含4.8+/-5μMNH2或4.8nmol/mg。通过尺寸排阻色谱法使用TosohG4000WXL对10mg/ml的50CSPEG106G进行分析并且显示保留时间为10.7分钟(约29.8nm)。
实施例4：50CSPEG106GNTA的合成：所产生的50CSPEG106G(参见上文)可被转化成为50CSPEG106GNTA并随后被转化成为50CSPEG106GNTASO(参见下文)。所产生的50CSPEG106G(参见上文)如下被转化成为50CSPEG106GNTA：根据Kobayahi和Chiba的方案(Analyticalbiochemistry1994，219卷，189-194页)测量2.4克50CSPEG106G的剩余的羧基基团。为合成50CSPEG106G，取2.4克50CSPEG106G(具有1当量的羧基基团)并溶解于25ml的20mMMES(2-(N-吗啉)乙磺酸(Pierce，Rockford，IL)缓冲液pH4.7中以获得50CSPEG106G溶液。加入1当量NHS和2当量EDC(分子量＝191.71)并且进行20分钟的活化。20分钟后将该活化的50CSPEG106G溶液加入至含10当量的Nα，Nα-双羧甲基赖氨酸(分子量＝262Da)的25ml1MHEPES的缓冲液pH7.4中并且使其反应过夜。将反应混合物浓缩至100ml并在100kDaMWCO的超滤盒(UFP-100-E-5A)中使用15次换液的水进行洗涤。对50CSPEG106GNTA产物进行过滤除菌(使用0.2μm聚砜滤器，Nalgene，Rochester，NY)并进行冻干。制备所产生的50CSPEG106GNTA的10mg/ml溶液，并通过尺寸排阻色谱法使用TosohG4000WXL柱(0.79×30cm)和作为洗脱溶剂的包含15％乙腈的磷酸盐缓冲盐水(PBS；11.9mM磷酸盐，137mMNaCl，2.7mMKPO4，pH7.4)在0.6ml/分钟的流速下测定流体动力学直径。保留时间应与约30-40nm的直径一致。
实施例5：50CSPEG106GNTASO或50CSPEG106GNTASF或50CSPEG106GNTAPO的合成：该结构包含具有与6克的10kDaMPEG反应的羧基基团和共价连接于作为氨三乙酸(NTA)衍生物的双羧甲基赖氨酸的ε氨基基团的剩余羧基基团的50kDa的硫酸软骨素。NTA经进一步修饰以包含三个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团，各基团连接于NTA的羰基基团。基本上，各NTA作为间隔物发挥作用以使成簇的三个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团连接于硫酸软骨素骨架上。50CSPEG106GNTA(参见上文)可被转化成为包含成簇的硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团的硫酸化(或磺酸化或磷酸化)载体，各簇具有最多三个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团。为此，取2克50CSPEG106GNTA并溶解于50ml的10mMMES缓冲液(pH4.7)中。通过加入0.28g的NHSS(分子量＝217.14；1.3mmol)并加入0.56g的EDC(分子量＝191.71；2.9mmol)激活载体并且允许活化20分钟。在独立容器中将0.37g的2-氨基乙基硫酸氢酯(AES；分子量＝141；2.6mmol)或0.45g的对氨基苯磺酸(SNA；分子量＝173；2.6mmol)或0.37g的O-磷脂酰乙醇胺(OPE；分子量＝141；2.6mmol)溶解于25ml的1MHEPES缓冲液中(pH7.3，使用NaOH保持pH在7.3)并且通过TNBS对初始氨基基团进行测量(Spadaro等，1979，Anal.Chem.，96，317-329页)，其应为约2.6mmol，这取决于AES(或SNA或OPE)的纯度。将活化载体加入AES(或SNA或OPE)溶液中并搅拌溶液过夜。通过TNBS测量氨基基团以测定氨基基团减少量，其等同于合并的硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团的量。使用100kDaMWCO超滤盒(UFP-100-E-5A；GE-Amersham)以20倍体积的水洗涤硫酸化(或磺酸化或磷酸化)的载体，过滤除菌(0.2μm聚砜滤器，Nalgene，Rochester，NY)并进行冻干(50CSPEG106GNTASO或50CSPEG106GNTASF或50CSPEG106GNTAPO)。该产物具有侧接骨架的最多三个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团的簇。
实施例6：14HPPEG104G的合成：这一组合物具有14kDa的肝素(H4784-1GSigma.批号047K1195；分子量14kDa；1g具有0.827mmol的羧基基团)作为与4克10KDaMPEGAM(分子量＝10kDa的具有末端氨基基团的MPEG；Sunbio，Orinda，CA；目录号P1AM-10)反应的羧基基团的聚合物骨架。该组合物包含能够结合pI高于7的肽/蛋白质或小分子的阴离子基团。另外，其余的羧基基团可进一步经修饰以包含更多的硫酸根、磺酸根或磷酸根基团。14HPPEG104G如下进行制备：A)将1g肝素(HP)钠盐(H4784-1GSigma.批号047K1195；1g的HP具有0.827mmol的羧基基团)溶于8ml水中(HP溶液)。B)在独立容器中，将4gMPEG-AM(分子量＝10000；0.4mmol；Sunbio；批号C1AM-010-05053；在soln中澄清)溶解于15ml的80％乙醇中并将所述HP溶液直接加入MPEG-AM中。C)将反应物加入20mMMESpH＝4.7中，加入水以清除沉淀。通过加入80mg的NHS(分子量＝115.14；0.7mmol)和380mg的EDC(分子量＝191.71；2mmol)开始反应并且搅拌20分钟。20分钟后，将4ml的1MHEPES加入溶液中并且使用10NNaOH一次一滴地将pH缓慢调节至pH7.8，并使其反应过夜。取等份试样以测定来自MPEG-AM的剩余氨基基团并测定合并的MPEG。氨基基团被测得为总共0.011mmol，这表明所有MPEG被合并(14HPPEG104G)。D)将反应混合物浓缩至100ml并在100,000MWCO的超滤盒(UFP-100-E-5A)中使用20次换液的水进行洗涤，过滤除菌(0.2μm聚砜滤器，Nalgene，Rochester，NY)并冻干，产量为2.4克。1mg/ml进行分析并包含0+/-5μM的NH2或0nmol/mg。E)使用TosohG4000WXL柱(0.79×30cm)并在0.6ml/分钟流速下以包含15％乙腈的磷酸盐缓冲盐水(PBS；11.9mM磷酸盐，137mMNaCl，2.7mMKPO4，pH7.4)进行洗脱的尺寸排阻色谱显示保留时间为12.7分钟(约13.8nm)。
实施例7：14HPPEG104GNTA的合成：所产生的14HPPEG104G(参见上文)可被转化成为14HPPEG104GNTA并随后被转化为14HPPEG104GNTASO、14HPPEG104GNTASF或14HPPEG104GNTAPO(参见下文)。所产生的14HPPEG104G(参见上文)如下可被转化为14HPPEG104GNTA：根据Kobayahi和Chiba的方案(Analyticalbiochemistry1994，219卷，189-194页)测量2.4克14HPPEG104G中剩余的羧基基团。为合成14HPPEG104GNTA，取2.4克14HPPEG104G(羧基基团)并溶解于25ml的20mMMES(2-(N-吗啉)乙磺酸(Pierce，Rockford，IL)缓冲液pH4.7中以获得14HPPEG104G溶液。加入1当量NHS和2当量EDC(分子量＝191.71)并且进行20分钟的活化。20分钟后将该活化的14HPPEG104G溶液加入至含10当量的Nα，Nα-双羧甲基赖氨酸(分子量＝262Da)的25ml1MHEPES的缓冲液pH7.4内并且使其反应过夜。测量剩余的氨基基团以测定NTA合并的程度。将反应混合物浓缩至100ml并在100kDaMWCO的超滤盒(UFP-100-E-5A)中使用15次换液的水进行洗涤。对该14HPPEG104GNTA产物进行过滤除菌(使用0.2μm聚砜滤器，Nalgene，Rochester，NY)并进行冻干。制备所产生的14HPPEG104GNTA的10mg/ml溶液，并通过尺寸排阻色谱法使用TosohG4000WXL柱(0.79×30cm)和作为洗脱溶剂的包含15％乙腈的磷酸盐缓冲盐水(PBS；11.9mM磷酸盐，137mMNaCl，2.7mMKPO4，pH7.4)在O.6ml/分钟的流速下测定流体动力学直径。保留时间应与约15-20nm的直径一致。
实施例8：14HPPEG104GNTASO或14HPPEG104GNTASF或14HPPEG104GNTAPO的合成：该结构由14kDa的肝素构成，其中27％的理论羧基基团共价连接于10kDaMPEG并且剩余的羧基基团共价连接于作为氨三乙酸(NTA)衍生物的双羧甲基赖氨酸的ε氨基基团。NTA经进一步修饰以包含三个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团，各基团均连接于NTA的羰基基团。基本上，各NTA作为间隔物发挥作用以使成簇的三个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团连接于肝素骨架上(也可使用其它骨架)。为此，取2克14HPPEG104GNTA并溶解于50ml的10mMMES缓冲液(pH4.7)中。载体通过加入0.28g的NHSS(分子量＝217.14；1.3mmol)和随后加入0.56g的EDC(分子量＝191.71；2.9mmol)进行活化，并且使活化进行20分钟。在独立的容器中将0.37g的2-氨基乙基硫酸氢酯(AES；分子量＝141；2.6mmol)或0.45g的对氨基苯磺酸(SNA；分子量＝173；2.6mmol)或0.37g的O-磷脂酰乙醇胺(OPE；分子量＝141；2.6mmol)溶解于25ml的1MHEPES缓冲液中(pH7.3，使用NaOH保持pH在7.3)并且通过TNBS对初始氨基基团进行测量(Spadaro等，1979，Anal.Chem.，96，317-329页)，其应为约2.6mmol，取决于AES(或SNA或OPE)的纯度。20分钟之后，将活化载体加入AES(或SNA或OPE)溶液中。过夜反应之后，通过TNBS测量氨基基团以测定氨基基团减少量，其等同于合并的硫酸根(或磺酸根、或磷酸根)基团的量。使用100kDaMWCO超滤盒(UFP-100-E-5A；GE-Amersham)以20倍体积的水洗涤硫酸化(或磺酸化或磷酸化)的载体，过滤除菌(0.2μm聚砜滤器，Nalgene，Rochester，NY)并进行冻干(14HPPEG104GNTASO或14HPPEG104GNTASF或14HPPEG104GNTAPO)。该产物应具有侧接骨架的每簇最多三个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团的簇。
实施例9：1000HYPEG1035NTA的合成：这将被用作合成本发明的一些阴离子核心组合物的起始材料。该组合物具有透明质酸或HY(SigmaChem.Co.StLuisMo.，目录号53747，分子量＝1000kDa)作为聚合物骨架，具有35％的理论羧基基团被10KDaMPEGAM(分子量＝10kDa的具有末端氨基基团的MPEG；Sunbio，Orinda，CA；目录号P1AM-10)所取代并且剩余的羧基基团被氨三乙酸所占据。为此，可在不添加更多的羧基基团的情况下使用透明质酸或可以添加额外的羧基基团。为添加额外的羧基基团，可根据Tijsen等人的方案(CarbohydratePolymers2001，45卷：219-226页)将透明质酸中的羟基基团转化为羧基基团。在Tijsen等人的方案结束时，在3kDa-MWCO的超滤盒(UFP-3-E-5A)中以15次换液的水洗涤羧甲基化的透明质酸(hyaluronan)。对所产生的产物进行过滤除菌(使用0.2μm聚砜滤器，Nalgene，Rochester，NY)并进行冻干以获得具有额外羧基基团的透明质酸。在1000HYPEG1035NTA合成之前，根据Kobayahi和Chiba的方案(Analyticalbiochemistry1994，219卷，189-194页)对1.0gHY(其可为无额外羧基基团的HY或经修饰以具有额外的羧基基团的HY)的起始羧基基团(1当量)进行测量。为合成1000HYPEG1035NTA，取1.0g的HY(具有1当量的羧基基团)并溶解于25ml的20mMMES(2-(N-吗啉)乙磺酸，Pierce，Rockford，IL)缓冲液pH4.7中以获得HY溶液。将0.35当量的MPEGAM(分子量＝10kDa的具有末端氨基基团的MPEG；Sunbio，Orinda，CA；目录号P1AM-10)溶解于20ml的80％乙醇中并将之加入HY溶液中以制备HYPEG溶液。向该HYPEG溶液加入1当量NHS(分子量＝115.14)和1当量EDC(分子量＝191.71)溶液同时进行搅拌。使用6NHCl维持pH于4.7-5.0二十分钟。在二十分钟的活化之后，通过加入10ml的1MHEPESpH7.4将pH调节至7.8并进一步使用10NNaOH一次一滴地调节pH至7.8。使该反应进行2小时并且通过TNBS测量MPEGAM的剩余氨基基团，其应为零，这表明全部0.35当量的氨基基团已经用尽并且被偶联于HY。如果存在剩余的氨基基团，加入1当量的EDC(分子量＝191.71)并使其反应过夜以形成1000HYPEG1035。取所产生的1000HYPEG1035溶液的等份试样并通过尺寸排阻色谱法使用TosohG4000WXL柱(0.79×30cm)和包含15％乙腈的磷酸盐缓冲盐水(PBS；11.9mM磷酸盐，137mMNaCl，2.7mMKPO4，pH7.4)作为洗脱溶剂在0.6ml/分钟的流速下测定流体动力学直径。该保留时间应与约30-50nm的直径一致。使用6NHCl下调pH至5并且添加1.5当量的EDC(分子量＝191.71)和活化20分钟。20分钟后将该活化的1000HYPEG1035溶液加入至含10当量的Nα，Nα-双羧甲基赖氨酸(分子量＝262Da)的25ml1MHEPES缓冲液pH7.4内并且使其反应过夜。将反应混合物浓缩至100ml并在100kDa-MWCO的超滤盒(UFP-100-E-5A)中使用15次换液的水进行洗涤。对1000HYPEG1035NTA产物进行过滤除菌(使用0.2μm聚砜滤器，Nalgene，Rochester，NY)并进行冻干。制备所产生的1000HYPEG1035NTA的10mg/ml溶液，并通过尺寸排阻色谱法使用TosohG4000WXL柱(0.79×30cm)和包含15％乙腈的磷酸盐缓冲盐水(PBS；11.9mM磷酸盐，137mMNaCl，2.7mMKPO4，pH7.4)作为洗脱溶剂在0.6ml/分钟的流速下测定流体动力学直径。保留时间应与约30-70nm的直径一致。
实施例10：1000HYPEG1035NTASO或1000HYPEG1035NTASF或1000HYPEG1035NTAPO的合成：该结构由1000kDa的透明质酸构成，其中35％的理论羧基基团共价连接于10kDaMPEG并且剩余的羧基基团共价连接于作为氨三乙酸(NTA)衍生物的双羧甲基赖氨酸的ε氨基基团。NTA经进一步修饰以包含三个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团，各基团连接于NTA的羰基基团。基本上，各NTA作为间隔物发挥作用以使成簇的三个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团被连接于透明质酸骨架上(也可使用其它骨架)。1000HYPEG1035NTA(参见上文)可被转化以包含硫酸根(或磺酸根或磷酸根)，各簇中具有最多三个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团。为此，取2克所述1000HYPEG1035NTA并溶解于50ml的10mMMES缓冲液(pH4.7)中。所述载体通过加入0.28g的NHSS(分子量＝217.14；1.3mmol)和随后加入0.56g的EDC(分子量＝191.71；2.9mmol)进行活化，并且使活化进行20分钟。在独立容器中将0.37g的2-氨基乙基硫酸氢酯(AES；分子量＝141；2.6mmol)或0.45g的对氨基苯磺酸(SNA；分子量＝173；2.6mmol)或0.37g的O-磷脂酰乙醇胺(OPE；分子量＝141；2.6mmol)溶解于25ml的1MHEPES缓冲液中(pH7.3，使用NaOH保持pH在7.3)并且通过TNBS对初始氨基基团进行测量(Spadaro等，1979，Anal.Chem.，96，317-329页)，其应为约2.6mmol，这取决于AES(或SNA或OPE)的纯度。20分钟之后，将活化载体加入AES(或SNA或OPE)溶液中。进行过夜反应之后，通过TNBS测量氨基基团以测定氨基基团的减少量，其等同于合并的硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团的量。使用100kDaMWCO超滤盒(UFP-100-E-5A；GE-Amersham)以20倍体积的水洗涤所述的硫酸化(或磺酸化或磷酸化)载体，过滤除菌(0.2μm聚砜滤器，Nalgene，Rochester，NY)并进行冻干(1000HYPEG1035NTASO或1000HYPEG1035NTASF或1000HYPEG1035NTAPO)。该产物具有侧接骨架的每簇最多三个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团的簇。
实施例11：60PGAPEG1035NTA的合成：这将被用作用于合成本发明的一些阴离子核心组合物的起始材料。该组合物具有果胶或聚半乳糖醛酸(聚果胶酸钠；SigmaChem.Co.StLuisMo.目录号p3889，分子量＝60kDa)作为聚合物骨架，其中35％的理论羧基基团被10KDaMPEGAM(分子量＝10kDa的具有末端氨基基团的MPEG；Sunbio，Orinda，CA；目录号P1AM-10)所取代且剩余的羧基基团被氨三乙酸所占据。将60PGAPEG1035NTA修饰成为60PGAPEG1035NTASO、60PGAPEG1035NTASF和60PGAPEG1035NTAPO，其中SO、SF和PO为共价连接于NTA的羰基基团的硫酸根、磺酸根和磷酸根；该修饰根据上文对其它含NTA组合物的描述而进行。为制备60PGAPEG1035NTA，可在不添加更多羧基基团的情况下使用起始果胶或可以添加额外的羧基基团。为添加额外的羧基基团，可根据Tijsen等人的方案(CarbohydratePolymers2001，45卷：219-226页)将透明质酸中的羟基基团转化成为羧基基团。在Tijsen等人的方案的结束时，在3kDa-MWCO的超滤盒(UFP-3-E-5A)中以15次换液的水洗涤羧甲基化的果胶。对所产生的产物(PMA)进行过滤除菌(使用0.2μm聚砜滤器，Nalgene，Rochester，NY)并进行冻干以获得具额外的羧基基团的果胶。某些情况下，果胶有显著百分比的羧基基团被甲基基团封闭。这可使用酸去除而暴露果胶中的所有羧基基团。简言之，根据Constenla和Lazano(LatinAmericanAppliedResearch2003，33卷，91-96页)将2g果胶溶解于100水中并且使用浓HCl调节pH至0.5和在80℃下保持2小时。使用NaOH进行中和并且在3kDa-MWCO的超滤盒(UFP-3-E-5A)中以15次换液的水进行洗涤。对所产生的产物使用(0.2μm聚砜滤器，Nalgene，Rochester，NY)进行过滤除菌并进行冻干。该果胶可根据上文所述进行处理以增加羧基基团的量。如上所述可以使用任何果胶(PGA)制备60PGAPEG1035NTA，其未经处理或经处理以增加羧基基团。在60PGAPEG1035NTA合成之前，根据Kobayahi和Chiba的方案(Analyticalbiochemistry1994，219卷，189-194页)对1.0gPGA(其可为无额外羧基基团的PGA或经修饰以具有额外的羧基基团的PGA)的起始羧基基团(1当量)进行测量。为合成60PGAPEG1035NTA，取1.0g的PGA(具有1当量的羧基基团)并溶解于50ml的20mMMES(2-(N-吗啉)乙磺酸，Pierce，Rockford，IL)缓冲液pH4.7中以获得PGA溶液。将0.35当量的MPEGAM(分子量＝10kDa的具有末端氨基基团的MPEG；Sunbio，Orinda，CA；目录号P1AM-10)溶解于20ml的80％乙醇中并将之添加到PGA溶液中以制备PGAPEG溶液。向PGAPEG溶液加入1当量NHS(分子量＝115.14)和1当量EDC(分子量＝191.71)溶液，同时进行搅拌。使用6NHCl维持pH于4.7-5.0二十分钟。二十分钟的活化之后，通过加入10ml的1MHEPES，pH7.4调节pH至7.8并使用10NNaOH逐滴地将pH调节至7.8。使该反应进行2小时并且通过TNBS测量MPEGAM的剩余氨基基团，其应为零，这表明全部0.35当量的氨基基团已经用尽并且被偶联于PGA。如果MPEGAM中存在剩余的氨基基团，使用6NHCl将pH调节至5并加入1当量的EDC(分子量＝191.71)，20分钟后将pH调回7.8并使其反应过夜以形成60PGAPEG1035。取所产生的60PGAPEG1035溶液的等份试样并通过尺寸排阻色谱法使用TosohG4000WXL柱(0.79×30cm)和作为洗脱溶剂的包含15％乙腈的磷酸盐缓冲盐水(PBS；11.9mM磷酸盐，137mMNaCl，2.7mMKPO4，pH7.4)在0.6ml/分钟的流速下测定流体动力学直径。保留时间应与约18-30nm的直径一致。使用6NHCl下调pH至5并且添加1.5当量的EDC(分子量＝191.71)并活化20分钟。20分钟后将该活化的60PGAPEG1035溶液加入至含10当量的Nα，Nα-双羧甲基赖氨酸(分子量＝262Da)的25ml1MHEPES缓冲液pH7.4内并且使其反应过夜。将反应混合物浓缩至100ml并在100kDaMWCO的超滤盒(UFP-100-E-5A)中使用15次换液的水进行洗涤。对该60PGAPEG1035NTA产物进行过滤除菌(使用0.2μm聚砜滤器，Nalgene，Rochester，NY)并进行冻干。制备所产生的60PGAPEG1035NTA的10mg/ml溶液，并通过尺寸排阻色谱法使用TosohG4000WXL柱(0.79×30cm)和作为洗脱溶剂的包含15％乙腈的磷酸盐缓冲盐水(PBS；11.9mM磷酸盐，137mMNaCl，2.7mMKPO4，pH7.4)在0.6ml/分钟的流速下测定流体动力学直径。保留时间应与约20-40nm的直径一致。
实施例12：30CHIPEG1035DTPA的合成：这将被用作用于合成本发明的一些阴离子核心组合物的起始材料。该组合物具有壳多糖(SigmaChem.Co.StLuisMo.目录号448869，分子量＝35kDa)作为聚合物骨架，其中35％的理论氨基基团被10KDaMPEGC(分子量＝10kDa；具有末端羧基基团的甲氧基聚乙二醇；来自Lysanbio；Arab，AL)所占据且剩余的氨基基团被二亚乙基二胺五乙酸(DTPA)所占据。将30CHIPEG1035DTPA修饰成为30CHIPEG1035DTPASO、30CHIPEG1035DTPASF和30CHIPEG1035DTPAPO，其中SO、SF和PO为共价连接于DTPA的羰基基团的硫酸根、磺酸根和磷酸根；该修饰根据上文对其它含羧基的组合物的描述而进行。为合成30CHIPEG1035DTPA，取1.0g的盐酸壳多糖(根据TNBS测量具有1当量的氨基基团)并溶解于25ml的1MHEPES缓冲液pH7.4(Pierce，Rockford，IL)中以获得30CHI溶液。在独立容器中，将0.35当量的MPEGC(分子量＝10kDa；具有末端羧基基团的甲氧基聚乙二醇；来自Lysanbio；Arab，AL)溶解于具有20mMMESpH＝4.7的60ml的80％乙醇溶液(1200μl的1MMES加入至60ml)中，加入0.5当量的NHS(分子量＝115.14)，一旦溶解之后，加入1当量的EDC(分子量＝191.71；10.43mmol)，同时进行搅拌，并且使活化进行20分钟。将活化的MPEGC直接加入30CHI溶液中，使反应进行2小时并且通过TNBS测量氨基基团以确保35％的氨基基团饱和度，否则加入更多的适量的活化MPEGC。此即为30CHIPEG1035溶液。使用TosohG4000WXL柱(0.79×30cm)和包含15％乙腈的磷酸盐缓冲盐水洗脱液(PBS；11.9mM磷酸盐，137mMNaCl，2.7mMKPO4，pH7.4)在0.6ml/分钟的流速下进行尺寸排阻色谱。保留时间应与约14-17nm的分子直径一致。加入5当量的DTPA二酐(分子量＝357；SigmaChemCo.，StLouis，MO.目录号D6148)，随后加入200μl的TEA。使用10NNaOH缓慢滴定反应物至pH7.1并搅拌4小时。使用TNBS反应确认无氨基基团存留，其为完全反应的指示，并且确认制备了30CHIPEG1035DTPA产物。使用TosohG4000WXL柱(0.79×30cm)以包含15％乙腈的磷酸盐缓冲盐水洗脱液(PBS；11.9mM磷酸盐，137mMNaCl，2.7mMKPO4，pH7.4)在0.6ml/分钟的流速下进行尺寸排阻色谱。保留时间应与约17-21nm的分子直径一致。使用100,000MWCO超滤盒(UFP-100-E-5A；GE-Amersham)以15倍体积的水洗涤所产生的30CHIPEG1035DTPA并进行冻干。
实施例13：40DXPEG1035NTA的合成：这将被用作用于合成本发明的一些阴离子核心组合物的起始材料。该组合物具有葡聚糖或多糖(α-1，6，具有α-1，4支链；SigmaChem.Co.StLuisMo.目录号31389，分子量＝40kDa)作为聚合物骨架，其中35％的羟基用10kDaMPEGAM(分子量＝10kDa的具有末端氨基基团的MPEGAM；Sunbio，Orinda，CA；目录号P1AM-10)衍生化且剩余的羟基基团被氨三乙酸所占据。将40DXPEG1035NTA修饰成为40DXPEG1035NTASO、40DXPEG1035NTASF和40DXPEG1035NTAPO，其中SO、SF和PO为共价连接于NTA的羰基基团的硫酸根、磺酸根和磷酸根；该修饰根据上文对其它含羧基的组合物的描述而进行。为制备40DXPEG1035NTA，起始葡聚糖羟基基团被转化成为羧基基团。为添加羧基基团，可根据Tijsen等人的方案(CarbohydratePolymers2001，45卷：219-226页)将葡聚糖中的羟基基团转化成为羧基基团。简言之，将10克葡聚糖悬浮于100ml的90％丙醇/水中并加入4克NaOH颗粒和在40℃下搅拌过夜。根据Tijsen等人的描述(CarbohydratePolymers2001，45卷：219-226页)，于次日加入10克单氯乙酸钠(SigmaChemCo.StLuis，MO.目录号291773)。在反应结束时，在3kDa-MWCO的超滤盒(UFP-3-E-5A)中以15次换液的水洗涤羧甲基化的葡聚糖。对所产生的产物(DX)使用(0.2μm聚砜滤器，Nalgene，Rochester，NY)进行过滤除菌并进行冻干以获得羧甲基化的葡聚糖。在合成40DXPEG1035NTA之前，根据Kobayahi和Chiba的方案(Analyticalbiochemistry1994，219卷，189-194页)对1.0gDX的起始羧基基团(1当量)进行测量。为合成40DXPEG1035NTA，取1.0g的DX(具有1当量的羧基基团)并溶解于50ml的20mMMES(2-(N-吗啉)乙磺酸，Pierce，Rockford，IL)缓冲液pH4.7中以获得DX溶液。将0.35当量的MPEGAM(分子量＝10kDa的具有末端氨基基团的MPEG；Sunbio，Orinda，CA；目录号P1AM-10)溶解于20ml的80％乙醇中并将之添加入DX溶液以制备DXPEG溶液。向DXPEG溶液中加入1当量NHS(分子量＝115.14)和1当量EDC(分子量＝191.71)溶液，同时进行搅拌。使用6NHCl维持pH于pH4.7-5.0二十分钟。二十分钟的活化之后，通过加入10ml的1MHEPES，pH7.4将pH调节至7.1。如果pH低于7.1，使用10NNaOH逐滴调节pH经达到7.1。使该反应进行2小时并且通过TNBS测量MPEGAM的剩余氨基基团，其应为零，表明全部0.35当量的氨基基团已经用尽并且被偶联于PGA。如果MPEGAM中存在剩余的氨基基团，使用6NHCl将pH调节至5并加入1当量的EDC(分子量＝191.71)，20分钟后将pH调回7.1并使其反应过夜以形成40DXPEG1035。取所产生的40DXPEG1035溶液的等份试样并通过尺寸排阻色谱法使用TosohG4000WXL柱(0.79×30cm)和作为洗脱溶剂的包含15％乙腈的磷酸盐缓冲盐水(PBS；11.9mM磷酸盐，137mMNaCl，2.7mMKPO4，pH7.4)在0.6ml/分钟的流速下测定流体动力学直径。保留时间应与约14-20nm的直径一致。使用6NHCl下调pH至5并且添加1.5当量的EDC(分子量＝191.71)和活化20分钟。20分钟后将该活化的40DXPEG1035溶液加入至含10当量的Nα，Nα-双羧甲基赖氨酸(分子量＝262Da)的25ml1MHEPES缓冲液pH7.4内并且使其反应过夜。将包含40DXPEG1035NTA的反应混合物浓缩至100ml并在100kDa-MWCO的超滤盒(UFP-100-E-5A)中使用15次换液的水进行洗涤。对40DXPEG1035NTA产物进行过滤除菌(使用0.2μm聚砜滤器，Nalgene，Rochester，NY)并进行冻干。制备所产生的40DXPEG1035NTA的10mg/ml溶液，并通过尺寸排阻色谱法使用TosohG4000WXL柱(0.79×30cm)和包含15％乙腈的磷酸盐缓冲盐水(PBS；11.9mM磷酸盐，137mMNaCl，2.7mMKPO4，pH7.4)的0.6ml/分钟流速的洗脱液测定流体动力学直径。保留时间应与约17-25nm的直径一致。
具有源自多聚氨基酸的聚合物骨架的组合物的实施例
实施例14：20PLPEG1030DTPASO或20PLPEG1030DTPASF或20PLPEG1030DTPAPO的合成：该结构由20kDa的多聚赖氨酸构成，其中30％的ε-氨基基团共价连接于10kDa的MPEG并且剩余的氨基基团共价连接于二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)，该DTPA经修饰以包含共价连接于DTPA的羰基基团的硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团。基本上，各DTPA作为间隔物发挥作用以使成簇的四个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团连接于多聚赖氨酸骨架(也可使用其它骨架)。这如下进行合成：A)将1克的20kDa多聚赖氨酸(20PL；来自SAFC，货号Q4926，批号018K7775；DP＝126)溶解于6.5ml的1MHEPES中。通过TNBS对氨基基团进行测量并且测得其为2.4mmolNH2/g。此即20PL溶液。B)在独立容器中，将5g的MPEGC(甲氧基聚乙二醇羧甲基；分子量＝10kDa；0.5mmol；LaysanBio；批号108-108)溶解于具有10mM的MES缓冲液pH＝4.7和120mg的NHS(分子量＝115.14；1.0mmol)的12.5ml的80％乙醇中。一旦溶解，加入320g的EDC(分子量＝191.71；1.7mmol)，同时进行搅拌。使活化进行20分钟。将活化的MPEGC加入20PL溶液中。使用10N的NaOH逐滴缓慢调节pH至pH7.8并使其反应过夜。取等份试样用以通过TNBS进行氨基基团测量并且测得其为1.6mmol，这表明33.5％的PEG饱和度。此即为20PLPEG1030DA溶液。C)使用TosohG4000WXL柱(0.79×30cm)在0.6ml/分钟的流速下以包含15％乙腈的磷酸盐缓冲盐水(PBS；11.9mM磷酸盐，137mMNaCl，2.7mMKPO4，pH7.4)进行洗脱的尺寸排阻色谱显示保留时间为11.3分钟(直径约23.9nm)。D)将3.5g的DTPA(二亚乙基三胺五乙酸二酐；分子量＝357.32；9.8mmol；6摩尔等量的氨基基团)加入至步骤B的溶液(20PLPEG1030DA；1.6mmolNH2)中并随后加入100μlTEA(三乙胺)。使用10N的NaOH将混合物缓慢滴定至pH7.8并且使其反应过夜。对氨基基团进行测量并测得其为0μM。使用50ml50％乙醇稀释反应混合物并在100,000MWCO的超滤盒(UFP-100-E-5A)中使用10次换液的水进行洗涤。该溶液在水中被浓缩至100ml。E)将12.7mmol的2-氨基乙基硫酸氢酯(AES；C2H7N-SO4；分子量＝141.14；12.7mmol；Acros；Cas#926-39-6；批号A004514401)或对氨基苯磺酸(SNA，C6H7N-SO3；分子量＝173.19；12.7mmol；Acros；Cas#121-57-3；批号A018717701)或O-磷脂酰乙醇胺(C2H8N-PO4；分子量＝141.06；12.7mmol；Acros；Cas#1071-23-4；批号0001437763)溶解于25ml的1MHEPES中。使用10N的NaOH将该混合物缓慢滴定至pH7.8。通过TNBS对氨基基团进行测量并测得其为约16mmolNH2。F)将步骤D中的溶液(20PLPEG1030DTPA；4×1.6＝6.4mmol羧基)制备于10mMMESpH＝4.7中(向110ml中加入1100μL的1MMES)并且加入880mg的NHS(分子量＝115.14；7.7mmol)。一旦溶解，通过加入4gEDC(分子量＝191.71；21mmol)开始活化并且使其进行20分钟。将活化的载体加入溶液E和使其反应过夜。取等份试样用以通过TNBS进行氨基基团分析并且测得其为约9mmol，这表明DTPA完全被硫酸根(或磺酸根或磷酸根)饱和。此即为所述20PLPEG1030DTPASO或20PLPEG1030DTPASF或20PLPEG1030DTPAPO溶液。F)使用100kDaMWCO的超滤盒(UFP-100-E-5A，来自GE)以10次换液的水洗涤该溶液，并进一步浓缩至100ml。G)将样品过滤除菌(0.2μm聚砜滤器，Nalgene，Rochester，NY)并进行冻干，产量为～4克。
实施例15：40PLPEG535DTPA和40PLPEG535DTPAIDA的合成：这将被用作用于合成本发明的一些阴离子核心组合物的起始材料。为此，将1.0g的40PL(P3995Sigma批号085K5102)溶解于50ml的200mMHEPES。通过TNBS分析对氨基基团进行测量并测得其为2.86mmolNH2/g。17.5ml10mMMESpH＝4.7中的3克MPEGC(甲氧基聚乙二醇-羧甲基；1mmol；分子量＝5kDa；9.0mmol；LaysanBio；批号108-41；在soln中澄清)通过加入150mgNHSS(分子量＝217.14；0.7mmol)和随后加入300mgEDC(分子量＝191.71；1.57mmol)而进行活化。使活化进行20分钟。此阶段的MPEGC溶液的总体积为18ml。将活化的MPEGC加入40PL溶液中并使其反应。45分钟后，另外的3gMPEGC被活化并如上加入和使其反应2小时。通过TNBS对氨基基团进行测量并测得其为103μM，给出了28％的饱和度。使用在0.6ml/分钟的流速下以包含15％乙腈的磷酸盐缓冲盐水(PBS；11.9mM磷酸盐，137mMNaCl，2.7mMKPO4，pH7.4)进行洗脱的TosohG4000WXL柱(0.79×30cm)进行的尺寸排阻色谱显示在UV上保留时间为11.72分钟或在RI上保留时间为12.20分钟(18.4nm)。将另外的1.5g进行活化并加入以达到35％的氨基基团饱和度，基于TNBS测量的(94ml中的91μM或总计1.82mmol)剩余氨基基团。再加入另外的1.5gMPEG后，UV上的保留时间变成11.60分钟或RI上的保留时间变成12.10分钟或者19nm。加入4克DTPA二酐并连续调节pH以维持pH于7到8之间。4小时后，通过TNBS对该总氨基基团进行测量并测得其为0.0μM。包含40PLPEG535DTPA的反应混合物使用分子量截留值(MWCO)为100kDa的超滤盒(UFP-100-E-5A；GEHealthcare)以20倍体积的水进行洗涤并冻干，产生了4.7g(40PLPEG535DTPA)。根据下文使用亚氨基二乙酸(IDA)对其一半(2.35g)进行饱和：将IDA(3g)制备到10ml的1MHEPES中，将pH调节至7.5并且在1MHEPES中制备成50ml。将一半40PLPEG535DTPA等分为三份(根据化学计量各含1.3mmol羧基)并各使用200μl的1MMESpH4.7进行制备(25ml)，pH不降至4.7并因此加入20μl的6NHCl。通过加入2mmolNHSS(434mg)和4.5mmolEDC(864mg)对其进行活化。20分钟之后，将活化的40PLPEG535DTPA加入至上文IDA中并且再重复2次和搅拌2小时。该产物(40PLPEG535DTPAIDA)使用20倍体积的水进行洗涤，过滤除菌(0.2μm聚砜滤器，Nalgene，Rochester，NY)并冻干，产生了2.0g(40PLPEG535DTPAIDA)。
实施例16：40PLPEG535DTPASO或40PLPEG535DTPASF或40PLPEG535DTPAPO或40PLPEG535DTPAIDASO或40PLPEG535DTPAIDASF或40PLPEG535DTPAIDAPO的合成：该结构由40kDa的多聚赖氨酸构成，其中35％的ε-氨基基团共价连接于5kDa的MPEG并且剩余的氨基基团共价连接于二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)，该DTPA经修饰以包含共价连接于DTPA的羰基基团的硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团。基本上，各DTPA作为间隔物发挥作用以使成簇的四个硫酸根基团被连接于多聚赖氨酸骨架(也可使用其它骨架)。40PLPEG535DTPA或40PLPEG535DTPAIDA可被转化成为包含最多各簇数个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团的硫酸化(或磺酸化或磷酸化)的载体。为此，取2克40PLPEG535DTPA或1克40PLPEG535DTPAIDA并溶解于50ml的10mMMES缓冲液(pH4.7)中。通过加入0.37g的NHSS(分子量＝217.14；1.7mmol)和随后加入0.75g的EDC(分子量＝191.71；3.9mmol)对该载体进行活化，并且使活化进行20分钟。在独立容器中将0.5g的2-氨基乙基硫酸氢酯(AES；分子量＝14l；3.5mmol)或0.6g的对氨基苯磺酸(SNA；分子量＝173；3.5mmol)或0.5g的O-磷脂酰乙醇胺(OPE；分子量＝141；3.5mmol)溶解于25ml的1MHEPES缓冲液(pH7.3，使用NaOH将pH调节至7.8)中并且通过TNBS对初始氨基基团进行测量(Spadaro等，1979，Anal.Chem.，96，317-329页)，其应为约3.5mmol。将活化的载体加入AES(或SNA或OPE)溶液中。2小时后加入另外的0.75gEDC并搅拌溶液过夜。通过TNBS测量氨基基团以测定氨基基团的减少量，其等同于合并的硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团的量。使用100kDaMWCO超滤盒(UFP-100-E-5A；GE-Amersham)以20倍体积的水洗涤硫酸化(或磺酸化或磷酸化)的载体，过滤除菌(0.2μm聚砜滤器，Nalgene，Rochester，NY)并进行冻干。该产物(40PLPEG535DTPASO或40PLPEG535DTPASF或40PLPEG535DTPAPO或40PLPEG535DTPAIDASO或40PLPEG535DTPAIDASF或40PLPEG535DTPAIDAPO)具有侧接骨架的成簇的最多达4-8个硫酸根、磺酸根或磷酸根基团。
实施例17：由连接于多聚赖氨酸(批号20080124b)的氨基基团的NTA合成40PLPEG537NDA：40PLPEG537NDA被用作用于合成本发明的一些阴离子核心组合物的起始材料。该结构由40kDa的多聚赖氨酸构成，其中37％的氨基基团共价连接于5kDa的MPEG并且剩余的氨基基团共价连接于氨三乙酸(NTA)的羰基基团之一。为此，取1克40PL(SigmaP3995，批号127K5101；1g包含2.62mmol的NH2)溶解于50ml的400mMHEPES。对20ml10mMMESpH＝4.7中的5克MPEGC(1mmol；分子量＝5kDa；Sigma/Fisher/Fluka；目录号70718；批号64748/1)通过加入250mgNHS(分子量＝115.09；2mmol)和随后加入500mgEDC(分子量＝191.71；1.8mmol)而进行活化。使活化进行20分钟(总体积为20ml)。将活化MPEGC加入40PL溶液中(加入前pH7.45)。使该混合物反应4小时。加入MPEG之前的氨基基团测量值(2.62mmol)和之后的测量值(1.64mmol)表明氨基基团的PEG饱和度为37％。使用在0.6ml/分钟的流速下以包含15％乙腈的磷酸盐缓冲盐水(PBS；11.9mM磷酸盐，137mMNaCl，2.7mMKPO4，pH7.4)进行洗脱的TosohG4000WXL柱(0.79×30cm)的尺寸排阻色谱显示了保留时间为12.5分钟(或直径约16nm)。此即为40PLPEG537DA溶液。在独立容器中，使用1ml的10NNaOH将NTA(分子量＝191；1g或5.2mmol)在水中进行中和并且使用20mM的MESpH4.7对其进行缓冲(总体积为10ml)。这使用1g(5.2mmol)EDC在存在345mgNHS(分子量＝115.09；3mmol)的情况下进行活化。活化进行20分钟后，将其加入40PLPEG537DA中并使用10N的NaOH将pH调节至7.8。2小时之后，加入另外2gEDC并使其反应过夜。对总氨基基团进行测量并测得其为0.03mmol，将该值与反应前的1.63mmol初始氨基基团进行比较。样品使用100kDaMWCO超滤盒(UFP-100-E-5A；GE-Amersham)以20倍体积的水进行洗涤，过滤除菌(0.2μm聚砜滤器，Nalgene，Rochester，NY)并进行冻干，产生了4.1g的40PLPEG537NDA。
实施例18：40PLPEG537NDASO或40PLPEG537NDASF或40PLPEG537NDAPO的合成：该结构由40kDa的多聚赖氨酸构成，其中37％的氨基基团共价连接于5kDa的MPEG并且剩余的氨基基团共价连接于NTA的羰基基团之一，并且NTA的剩余羰基基团经修饰以包含硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团。基本上，各NTA作为间隔物发挥作用以使成簇的两个硫酸根(磺酸根或磷酸根)基团连接于多聚赖氨酸骨架(也可使用其它骨架)。40PLPEG537NDA可被转化成为包含各簇最多两个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团的硫酸化(磺酸化或磷酸化)的载体。为此，取2克载体(40PLPEG537NDA)并溶解于50ml的10mMMES缓冲液(pH4.7)中。载体通过加入0.19g的NHSS(分子量＝217.14；0.87mmol)和随后加入0.37g的EDC(分子量＝191.71；1.9mmol)进行活化，并且使活化进行20分钟。在独立容器中，将0.25g的2-氨基乙基硫酸氢酯(AES；分子量＝141；1.8mmol)或0.31g的对氨基苯磺酸(SNA；分子量＝173；1.8mmol)或0.25g的O-磷脂酰乙醇胺(OPE；分子量＝141；1.8mmol)溶解于25ml的1MHEPES缓冲液(pH7.3，使用NaOH将pH调节为7.8)中并且通过TNBS对初始氨基基团进行测量(Spadaro等，1979，Anal.Chem.，96，317-329页)，其应为约1.8mmol，这取决于AES(或SNA或OPE)的纯度。进行20分钟的载体活化之后将AES(或SNA或OPE)溶液加入载体中。2小时之后，加入另外0.37gEDC并且搅拌该溶液过夜。通过TNBS测量氨基基团以测定氨基基团减少量，其等同于合并的硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团的量。使用100kDaMWCO超滤盒(UFP-100-E-5A；GE-Amersham)以20倍体积的水洗涤硫酸化(或磺酸化或磷酸化)的载体，过滤除菌(0.2μm聚砜滤器，Nalgene，Rochester，NY)并进行冻干。该产物(40PLPEG537NDASO或0PLPEG537NDASF或40PLPEG537NDAPO)具有侧接骨架的成簇的最多两个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团。
实施例19：20PLPEG550DTPANTA的合成：20PLPEG550DTPANTA将被用作用于合成本发明的一些阴离子核心组合物的起始材料。该结构由20kDa的多聚赖氨酸构成，其中50％的氨基基团共价连接于5kDa的MPEG并且剩余的氨基基团共价连接于DTPA的羰基基团之一。DTPA的剩余羰基基团被连接于双羧甲基化赖氨酸的ε-氨基基团。为此：a)将1mL或0.4g当量的20PL(Q4926SAFC批号018K7775；DP＝126；根据TNBS测得0.4g包含0.895mmol的NH2)溶解于5ml的1MHEPES中。此即为20PL溶液。b)在独立容器内，通过在搅拌的同时加入125mgNHS(分子量＝115.14；1.09mmol)和500mgEDC(分子量＝191.71；2.60mmol)活化在20mMMESpH＝4.7(35ml)中的2.5gMPEG。活化进行20分钟并将活化的MPEGC直接加入至步骤a中的20PL溶液中。通过用10NNaOH而将反应混合物的pH逐滴地缓慢调节至pH7.1，并使其反应过夜。通过TNBS进行的氨基基团分析显示剩余0.464mmol的氨基基团，表明50％的PEG饱和度。此即为20PLPEG550DA溶液。c)使用在0.6ml/分钟的流速下以包含15％乙腈的磷酸盐缓冲盐水(PBS；11.9mM磷酸盐，137mMNaCl，2.7mMKPO4，pH7.4)进行洗脱的TosohG4000WXL柱(0.79×30cm)的尺寸排阻色谱在折光率检测器中显示保留时间为12.8分钟或约14.4nm的分子直径。d)加入二亚乙基三胺五乙酸二酐(1克；FW＝357.3；2.80mmol)并且使用10NNaOH缓慢滴定至pH7.1和搅拌2小时。2小时之后，通过TNBS进行的氨基基团测量显示0％的氨基基团剩余。e)使用10NNaOH将溶液的pH调节至7.5以利用洗涤作为晶体的未反应DTPA残余。将该溶液浓缩至100ml并使用100,000MWCO超滤盒(UFP-100-E-5A；GE-Amersham)以15次换液的水进行洗涤并冻干。使用在0.6ml/分钟的流速下以包含15％乙腈的磷酸盐缓冲盐水(PBS；11.9mM磷酸盐，137mMNaCl，2.7mMKPO4，pH7.4)进行洗脱的TosohG4000WXL柱(0.79×30cm)的尺寸排阻色谱在折光率检测器中显示了保留时间为12.7分钟或约15.04nm的分子。f)将2克NTA-胺(Nα，Nα-双羧甲基-L-赖氨酸；分子量＝262.26+50％杂质，最多2mol水和10％无机物)或～4mmol氨基基团溶解于10ml的1MHEPES中。通过TNBS进行的氨基基团分析显示该NTA-胺溶液包含3.4mmol的氨基基团。g)将20PLPEG550DTPA(0.70mmol羧基)溶解于10ml的20mMMES中并加入140mgNHS(分子量＝115.09；1.2mmol)，随后加入560mgEDC(分子量＝191.71；2.9mmol)。pH缓慢上升但通过HCl维持在5.5之下。将该溶液加入NTA溶液中并使用10NNaOH将pH调节至pH7.1。2小时之后，氨基基团分析显示剩余总计3.2mmol的氨基基团，这表明0.2mmol的NTA-胺合并入0.8mg的载体中。h)将溶液浓缩至100ml并使用100,000MWCO超滤盒(UFP-100-E-5A；GE-Amersham)以15次换液的水进行洗涤，过滤除菌(0.2μm聚砜滤器，Nalgene，Rochester，NY)并冻干，产生了0.5g(20PLPEG550DTPANTA)。使用在0.6ml/分钟的流速下以包含15％乙腈的磷酸盐缓冲盐水(PBS；11.9mM磷酸盐，137mMNaCl，2.7mMKPO4，pH7.4)进行洗脱的TosohG4000WXL柱(0.79×30cm)的尺寸排阻色谱分析在折光率检测器中显示了保留时间为12.7分钟，其显示约15.04nm的分子直径。
实施例20：20PLPEG550DTPANTASO或20PLPEG550DTPANTASF或20PLPEG550DTPANTAPO的合成：该结构由其中50％的氨基基团共价连接于5kDa的MPEG并且剩余的氨基基团共价连接于DTPA的羰基基团之一的20kDa的多聚赖氨酸构成，并且DTPA的剩余羰基基团连接于羧甲基化赖氨酸的ε-氨基基团。羧甲基化赖氨酸经进一步修饰以包含三个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团，其各连接于羧甲基化赖氨酸的羧基基团。基本上，各DTPA(NTA)3作为间隔物发挥作用以使成簇的十二个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团连接于多聚赖氨酸骨架(也可使用其它骨架)。产物(20PLPEG550DTPANTA)可被转化成为包含各簇最多十二个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团的硫酸化(或磺酸化或磷酸化)载体。为此，取2克载体(20PLPEG550DTPANTA)并溶解于50ml的10mMMES缓冲液(pH4.7)中。通过加入1.1g的NHSS(分子量＝217.14；5.1mmol)和随后加入2.2g的EDC(分子量＝191.71；11.5mmol)对该载体进行活化，并且使活化进行20分钟。在独立容器中将1.5g的2-氨基乙基硫酸氢酯(AES；分子量＝141；10.6mmol)或1.8g的对氨基苯磺酸(SNA；分子量＝173；10.6mmol)或1.5g的O-磷脂酰乙醇胺(OPE；分子量＝141；10.6mmol)溶解于25ml的1MHEPES缓冲液(pH7.3，使用NaOH将pH调节为7.8)中并且通过TNBS对初始氨基基团进行测量(Spadaro等，1979，Anal.Chem.，96，317-329页)，其应为约10.6mmol，这取决于AES(或SNA或OPE)的纯度。进行20分钟的载体活化之后将载体加入AES(或SNA或OPE)溶液中。2小时之后，加入另外2.2gEDC并且搅拌溶液过夜。通过TNBS测量氨基基团以测定氨基基团的减少量，其等同于合并的硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团的量。使用100kDaMWCO超滤盒(UFP-100-E-5A；GE-Amersham)以20倍体积的水洗涤硫酸化(或磺酸化或磷酸化)的载体，过滤除菌(0.2μm聚砜滤器，Nalgene，Rochester，NY)并进行冻干。该产物(20PLPEG550DTPANTASO或20PLPEG550DTPANTASF或20PLPEG550DTPANTAPO)具有各侧接骨架的最多十二个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团的簇。
实施例21：35PEPEG1035NTA的合成：35PEPEG1035NTA将被用作用于合成本发明的一些阴离子核心组合物的起始材料。该组合物具有多聚谷氨酸(SigmaChem.Co.StLuisMo.目录号P4033，分子量＝15-50kDa；或FisherChemCo.Pittsburg，PA，目录号ICN15191891，分子量＝15-50kDa)作为聚合物骨架，其中35％的羧基基团被10kDa的MPEGAM(分子量＝10kDa的具有末端氨基基团的MPEG；Sunbio，Orinda，CA；目录号P1AM-10)所占据并且剩余的羧基基团被氨三乙酸所占据。为合成35PEPEG1035NTA，根据Kobayahi和Chiba的方案(Analyticalbiochemistry1994，219卷，189-194页)对1.0g多聚谷氨酸的起始羧基基团(1当量)进行测量。取1.0g的多聚谷氨酸(SigmaChem.Co.StLuisMo.目录号P4033，分子量＝15-50kDa；具有1当量的羧基基团/克)，溶解于25ml的10mMMES(2-(N-吗啉)乙磺酸，Pierce，Rockford，IL)缓冲液pH4.7中并加入1当量NHS(分子量＝115.14)和1当量EDC(分子量＝191.71)，并且进行搅拌以对PE进行20分钟活化。在独立容器中，将0.35当量MPEGAM(分子量＝10kDa的具有末端氨基基团的MPEG；Sunbio，Orinda，CA；目录号P1AM-10)溶解于20ml0.2MHEPES，pH7.8中以获得MPEGAM溶液。PE活化20分钟之后，将PE加入MPEGAM溶液中并使反应进行2小时。通过TNBS测量MPEGAM的剩余氨基基团且其应为零，表明全部0.35当量的氨基基团已经用尽并且被偶联于多聚谷氨酸。如果存在剩余的氨基基团，使用6NHCl调节pH至5并加入1当量的EDC(分子量＝191.71)，20分钟后将pH调节回7.8并使其反应过夜。取所产生的35PEPEG1035溶液的等份试样并通过尺寸排阻色谱法使用TosohG4000WXL柱(0.79×30cm)和作为洗脱溶剂的包含15％乙腈的磷酸盐缓冲盐水(PBS；11.9mM磷酸盐，137mMNaCl，2.7mMKPO4，pH7.4)在0.6ml/分钟的流速下测定流体动力学直径。保留时间应与约16-24nm的流体动力学直径一致。使用6NHCl下调pH至5并且添加1.5当量的EDC(分子量＝191.71)和活化20分钟。20分钟后将该活化的40PEPEG1035溶液加入含10当量的Nα，Nα-双羧甲基赖氨酸(分子量＝262Da)的25ml0.2MHEPES缓冲液pH7.8内并且使其反应过夜。将反应混合物浓缩至100ml并在100kDaMWCO的超滤盒(UFP-100-E-5A)中使用15次换液的水进行洗涤。对该样品(使用0.2μm聚砜滤器，Nalgene，Rochester，NY)进行过滤除菌并进行冻干。制备所产生的35PEPEG1035NTA的10mg/ml溶液，并通过尺寸排阻色谱法使用TosohG4000WXL柱(0.79×30cm)和作为洗脱溶剂的包含15％乙腈的磷酸盐缓冲盐水(PBS；11.9mM磷酸盐，137mMNaCl，2.7mMKPO4，pH7.4)在0.6ml/分钟的流速下测定流体动力学直径。保留时间应与约19-28nm的流体动力学直径一致。
实施例22：35PGPEG1035NTASO或35PGPEG1035NTASF或35PGPEG1035NTAPO的合成：该结构由35kDa的多聚谷氨酸构成，其中35％的羧基基团共价连接于10kDaMPEG并且剩余的羧基基团共价连接于作为氨三乙酸(NTA)衍生物的双羧甲基赖氨酸的ε氨基基团。NTA经进一步修饰以包含三个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团，各连接于NTA的羰基基团。基本上，各NTA作为间隔物发挥作用以使成簇的三个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团连接于多聚谷氨酸骨架(也可使用其它骨架)。35PGPEG1035NTA可被转化成为包含硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团簇的硫酸化(或磺酸化或磷酸化)的载体，各簇具有最多三个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团。为此，取2克载体(35PGPEG1035NTA)并溶解于50ml的10mMMES缓冲液(pH4.7)中。载体通过加入0.28g的NHSS(分子量＝217.14；1.3mmol)和随后加入0.56g的EDC(分子量＝191.71；2.9mmol)进行活化，并且使活化进行20分钟。在独立容器中将0.37g的2-氨基乙基硫酸氢酯(AES；分子量＝141；2.6mmol)或0.45g的对氨基苯磺酸(SNA；分子量＝173；2.6mmol)或0.37g的O-磷脂酰乙醇胺(OPE；分子量＝141；2.6mmol)溶解于25ml的1MHEPES缓冲液(pH7.3，使用NaOH调节pH至7.8)中并且通过TNBS对初始氨基基团进行测量(Spadaro等，1979，Anal.Chem.，96，317-329页)，其应为约2.6mmol，这取决于AES(或SNA或OPE)的纯度。20分钟的载体活化之后，将活化载体加入AES(或SNA或OPE)溶液中。2小时之后，加入另外的0.56gEDC并搅拌该溶液过夜。通过TNBS测量氨基基团以测定氨基基团的减少量，其等同于合并的硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团的量。使用100kDaMWCO超滤盒(UFP-100-E-5A；GE-Amersham)以20倍体积的水洗涤硫酸化(或磺酸化或磷酸化)的载体，过滤除菌(0.2μm聚砜滤器，Nalgene，Rochester，NY)并进行冻干。该产物(35PGPEG1035NTASO或35PGPEG1035NTASF或35PGPEG1035NTAPO)具有各侧接骨架的最多三个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团的簇。
实施例23：10PDPEG1035NTA的合成：10PDPEG1035NTA将用作用于合成本发明的一些阴离子核心组合物的起始材料。该组合物具有多聚天冬氨酸(SigmaChem.Co.StLuisMo.目录号P5387，分子量＝5-15kDa)作为聚合物骨架，其中35％的羧基基团被10kDa的MPEGAM(分子量＝10kDa的具有末端氨基基团的MPEG；Sunbio，Orinda，CA；目录号P1AM-10)所占据并且剩余的羧基基团被氨三乙酸所占据。根据Kobayahi和Chiba的方案(Analyticalbiochemistry1994，219卷，189-194页)对1当量的1.0g多聚谷氨酸的起始羧基基团进行测量。为合成10PDPEG1035NTA，取1.0g的多聚天冬氨酸(SigmaChem.Co.StLuisMo.目录号P4033；分子量＝15-50kDa，具有1当量的羧基基团/克)并溶解于25ml的20mMMES(2-(N-吗啉)乙磺酸，Pierce，Rockford，IL)缓冲液pH4.7中以制备PD溶液。将0.25当量MPEGAM(分子量＝10kDa的具有末端氨基基团的MPEG；Sunbio，Orinda，CA；目录号P1AM-10)溶解于20ml的80％乙醇并加入PD溶液中从而制备PDPEG溶液。向PDPEG溶液中加入1当量NHS(分子量＝115.14)和1当量EDC(分子量＝191.71)，同时进行搅拌。使用6NHCl将pH维持在pH4.7-5.0二十分钟。活化20分钟之后，通过加入10ml1MHEPESpH4.7将pH调节至7.8。使用10NNaOH逐滴调节pH至7.8。使反应进行2小时并通过TNBS测量MPEGAM的剩余氨基基团，其应为零，表明全部0.35当量的氨基基团已经用尽并且被偶联于多聚天冬氨酸。如果存在剩余的氨基基团，加入1当量EDC(分子量＝191.71)并使其反应过夜。取所产生的10PDPEG1035溶液的等份试样并通过尺寸排阻色谱法使用TosohG4000WXL柱(0.79×30cm)和作为洗脱溶剂的包含15％乙腈的磷酸盐缓冲盐水(PBS；11.9mM磷酸盐，137mMNaCl，2.7mMKPO4，pH7.4)在0.6ml/分钟的流速下测定流体动力学直径。保留时间应与约12-18nm的流体动力学直径一致。使用6NHCl下调pH至5并且添加1.5当量的EDC(分子量＝191.71)和活化20分钟。20分钟后将该活化的10PDPEG1035溶液加入至含10当量的Nα，Nα-双羧甲基赖氨酸(分子量＝262Da)的25m11MHEPES缓冲液pH7.8内并且使其反应过夜。将反应混合物浓缩至100ml并在100kDaMWCO的超滤盒(UFP-100-E-5A)中使用15次换液的水进行洗涤。对该样品使用(0.2μm聚砜滤器，Nalgene，Rochester，NY)进行过滤除菌并进行冻干。制备所产生的10PDPEG1035NTA的10mg/ml溶液，并通过尺寸排阻色谱法使用TosohG4000WXL柱(0.79×30cm)和作为洗脱溶剂的包含15％乙腈的磷酸盐缓冲盐水(PBS；11.9mM磷酸盐，137mMNaCl，2.7mMKPO4，pH7.4)在0.6ml/分钟的流速下测定流体动力学直径。保留时间应与约14-20nm的流体动力学直径一致。
实施例24：10PDPEG1035NTASO或10PDPEG1035NTASF或10PDPEG1035NTAPO的合成：该结构由10kDa的多聚天冬氨酸构成，其中35％的羧基基团共价连接于10kDaMPEG并且剩余的羧基基团共价连接于作为氨三乙酸(NTA)衍生物的双羧甲基赖氨酸的ε氨基基团。NTA经进一步修饰从而包含三个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团，各基团连接于NTA的羰基基团。基本上，各NTA作为间隔物发挥作用以使成簇的三个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团被连接于多聚天冬氨酸骨架(也可使用其它骨架)。10PDPEG1035NTA可被转化成为包含各簇中的三个硫酸根基团的硫酸化(或磺酸化或磷酸化)的载体。为此，取2克10PDPEG1035NTA并溶解于50ml的10mMMES缓冲液(pH4.7)中。载体通过加入0.28g的NHSS(分子量＝217.14；1.3mmol)和随后加入0.56g的EDC(分子量＝191.71；2.9mmol)进行活化，并且使活化进行20分钟。在独立容器中将0.37g的2-氨基乙基硫酸氢酯(AES；分子量＝141；2.6mmol)或0.45g的对氨基苯磺酸(SNA；分子量＝173；2.6mmol)或0.37g的O-磷脂酰乙醇胺(OPE；分子量＝141；2.6mmol)溶解于25ml的1MHEPES缓冲液(pH7.3，使用NaOH调节pH至7.8)中并且通过TNBS对初始氨基基团进行测量(Spadaro等，1979，Anal.Chem.，96，317-329页)，其应为约2.6mmol，这取决于AES(或SNA或OPE)的纯度。将20分钟活化的载体加入AES(或SNA或OPE)溶液中。2小时之后，加入另外的0.56gEDC并搅拌该溶液过夜。通过TNBS测量氨基基团以测定氨基基团的减少量，其等同于合并的硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团的量。使用100kDaMWCO超滤盒(UFP-100-E-5A；GE-Amersham)以20倍体积的水洗涤硫酸化(或磺酸化或磷酸化)的载体，过滤除菌(0.2μm聚砜滤器，Nalgene，Rochester，NY)并进行冻干。该产物(10PDPEG1035NTASO或10PDPEG1035NTASO或10PDPEG1035NTASF或10PDPEG1035NTAPO)具有侧接骨架的每簇最多三个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团的簇。
实施例25：10PSPEG1035NTA的合成：10PSPEG1035NTA被用作用于合成本发明的一些阴离子核心组合物的起始材料。该组合物具有多聚丝氨酸(SigmaChem.Co.StLuisMo.目录号P5857，分子量＝5-15kDa)作为聚合物骨架，其中35％的羟基被10KDaMPEGAM(分子量＝10kDa的具有末端氨基基团的MPEG；Sunbio，Orinda，CA；目录号P1AM-10)所占据并且剩余的羟基基团被氨三乙酸所占据。为制备该组合物，使用琥珀酸酐将所有的羟基基团转化成为羧基基团。简言之，将1g多聚丝氨酸溶解于25ml的二氧六环中并且加入5.2克琥珀酸酐(相对于总理论羟基基团五倍摩尔过量)和900mgN，N′-二甲基氨基吡啶以作为催化剂，并该混合物在60℃下孵育3小时。通过在40℃下进行旋转蒸发去除二氧六环，将固体溶解于水中，使用NaOH进行中和并在3kDa-MWCO的超滤盒(UFP-3-E-5A)中以15次换液的水进行洗涤。对所产生的产物(PS)使用(0.2μm聚砜滤器，Nalgene，Rochester，NY)进行过滤除菌并进行冻干。根据Kobayahi和Chiba的方案(Analyticalbiochemistry1994，219卷，189-194页)对1.0gPS的起始羧基基团(1当量)进行测量。为合成10PSPEG1035NTA，取1.0g的PS(具有1当量的羧基基团)，溶解于25ml的10mMMES(2-(N-吗啉)乙磺酸，Pierce，Rockford，IL)缓冲液pH4.7中(PS溶液)，加入1当量的NHS(分子量＝115.14)和1当量的EDC(分子量＝191.71；4mmol)，并且搅拌20分钟以进行活化。在独立容器中，将0.35当量的MPEGAM(分子量＝10kDa的具有末端氨基基团的MPEG；Sunbio，Orinda，CA；目录号P1AM-10)溶解于20mlpH7.8的0.2MHEPES中以制备MPEGAM溶液。PS活化20分钟之后，将PS溶液加入MPEGAM溶液并使反应进行2小时。通过TNBS测量MPEGAM的剩余氨基基团并且其应为零，这表明全部0.35当量的MPEGAM氨基基团已经用尽并且被偶联于所述PS。如果存在剩余的氨基基团，使用6NHCl调节pH至5并加入1当量的EDC(分子量＝191.71)，20分钟后将pH调回至7.8并使其反应过夜。取所产生的10PSPEG1035溶液的等份试样并通过尺寸排阻色谱法使用TosohG4000WXL柱(0.79×30cm)和作为洗脱溶剂的包含15％乙腈的磷酸盐缓冲盐水(PBS；11.9mM磷酸盐，137mMNaCl，2.7mMKPO4，pH7.4)在0.6ml/分钟的流速下测定流体动力学直径。保留时间应与约13-18nm的流体动力学直径一致。使用6NHCl下调pH至5并且添加1.5当量的EDC(分子量＝191.71)和活化20分钟。20分钟后将该活化的10PSPEG1035溶液加入含10当量的Nα，Nα-双羧甲基赖氨酸(分子量＝262Da)的25ml0.2MHEPES缓冲液pH7.8内并且使其反应过夜。将反应混合物浓缩至100ml并在100kDaMWCO的超滤盒(UFP-100-E-5A)中使用15次换液的水进行洗涤。对该样品使用(0.2μm聚砜滤器，Nalgene，Rochester，NY)进行过滤除菌并进行冻干。制备所产生的10PSPEG1035NTA的10mg/ml溶液，并通过尺寸排阻色谱法使用TosohG4000WXL柱(0.79×30cm)和作为洗脱溶剂的包含15％乙腈的磷酸盐缓冲盐水(PBS；11.9mM磷酸盐，137mMNaCl，2.7mMKPO4，pH7.4)在0.6ml/分钟的流速下测定流体动力学直径。保留时间应与约14-19nm的流体动力学直径一致。
实施例26：10PSPEG1035NTASO或10PSPEG1035NTASF或10PSPEG1035NTAPO的合成：该结构由10kDa的多聚丝氨酸构成，其中35％的羟基基团共价连接于10kDaMPEG并且剩余的羟基基团共价连接于作为氨三乙酸(NTA)衍生物的双羧甲基赖氨酸的ε氨基基团。NTA经进一步修饰从而包含三个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团，各基团连接于NTA的羰基基团。基本上，各NTA作为间隔物发挥作用以使成簇的三个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团被连接于所述多聚天冬氨酸骨架(也可使用其它骨架)。10PSPEG1035NTA(参见上文)可被转化成为包含各簇最多三个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团的硫酸根(或磺酸根、或磷酸根)基团簇的硫酸化(或磺酸化或磷酸化)载体。为此，取2克10PSPEG1035NTA(参见上文)并溶解于50ml的10mMMES缓冲液(pH4.7)中。载体通过加入0.28g的NHSS(分子量＝217.14；1.3mmol)和随后加入0.56g的EDC(分子量＝191.71；2.9mmol)进行活化，并且使活化进行20分钟。在独立容器中将0.37g的2-氨基乙基硫酸氢酯(AES；分子量＝141；2.6mmol)或0.45g的对氨基苯磺酸(SNA；分子量＝173；2.6mmol)或0.37g的O-磷脂酰乙醇胺(OPE；分子量＝141；2.6mmol)溶解于25ml的1MHEPES缓冲液(pH7.3，使用NaOH调节pH至7.8)中并且通过TNBS对初始氨基基团进行测量(Spadaro等，1979，Anal.Chem.，96，317-329页)，其应为约2.6mmol，取决于AES(或SNA或OPE)的纯度。将20分钟活化的载体加入AES(或SNA或OPE)溶液中。2小时之后，加入另外的0.56gEDC并搅拌该溶液过夜。通过TNBS测量氨基基团以测定氨基基团的减少量，其等同于合并的硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团的量。使用100kDaMWCO超滤盒(UFP-100-E-5A；GE-Amersham)以20倍体积的水洗涤硫酸化(或磺酸化或磷酸化)载体，过滤除菌(0.2μm聚砜滤器，Nalgene，Rochester，NY)并进行冻干。该产物(10PSPEG1035NTASO或10PSPEG1035NTASF或10PSPEG1035NTAPO)具有侧接骨架每簇最多三个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团的簇。
实施例27：10PTPEG1035NTA的合成：10PTPEG1035NTA将被用作用于合成本发明的一些阴离子核心组合物的起始材料。该组合物具有多聚苏氨酸(SigmaChem.Co.StLuisMo.目录号P8077，分子量＝5-15kDa)作为聚合物骨架，其中35％的羟基基团被10KDaMPEGAM(分子量＝10kDa的具有末端氨基基团的MPEG；Sunbio，Orinda，CA；目录号P1AM-10)所占据并且剩余的羟基基团被氨三乙酸所占据。为制备该组合物，使用琥珀酸酐将所有的羟基基团转化成为羧基基团。简言之，将1g多聚苏氨酸溶解于25ml的二氧六环中并且加入4.5克琥珀酸酐(相对于1克多聚苏氨酸中的理论羟基基团五倍摩尔过量)和900mgN，N′-二甲基氨基吡啶作为催化剂，并将该混合物在60℃下孵育3小时。通过在40℃下进行旋转蒸发去除二氧六环，将固体溶解于水中，使用NaOH进行中和并在3kDa-MWCO的超滤盒(UFP-3-E-5A)中以15次换液的水进行洗涤。对所产生的产物(PT)使用(0.2μm聚砜滤器，Nalgene，Rochester，NY)进行过滤除菌并进行冻干以获得PT。根据Kobayahi和Chiba的方案(Analyticalbiochemistry1994，219卷，189-194页)对1.0gPT中的起始羧基基团(1当量)进行测量。为合成10PTPEG1035NTA，取1.0g的PT(具有1当量的羧基基团)，溶解于25ml的10mMMES(2-(N-吗啉)乙磺酸，Pierce，Rockford，IL)缓冲液pH4.7中(PT溶液)，加入1当量的NHS(分子量＝115.14)和1当量的EDC(分子量＝191.71；4mmol)，并且进行20分钟活化。在独立容器中，将0.35×mmol的MPEGAM(分子量＝10kDa的具有末端氨基基团的MPEG；Sunbio，Orinda，CA；目录号P1AM-10)溶解于20ml0.2MHEPES，pH7.8中以制备MPEGAM溶液。PT活化进行20分钟之后，将PT溶液加入MPEGAM溶液中并使反应进行2小时。通过TNBS测量MPEGAM的剩余氨基基团并且其应为零，表明全部0.35当量的氨基基团已经用尽并且被偶联于PT。如果存在剩余的氨基基团，使用6NHCl调节pH至5并加入1当量的EDC(分子量＝191.71)，20分钟后将pH调回至7.8并使其反应过夜。取所产生的10PTPEG1035溶液的等份试样并通过尺寸排阻色谱法使用TosohG4000WXL柱(0.79×30cm)和作为洗脱溶剂的包含15％乙腈的磷酸盐缓冲盐水(PBS；11.9mM磷酸盐，137mMNaCl，2.7mMKPO4，pH7.4)在0.6ml/分钟的流速下测定流体动力学直径。保留时间应与约12-18nm的流体动力学直径一致。使用6NHCl下调pH至5并且添加1.5当量的EDC(分子量＝191.71)和活化20分钟。20分钟后将该活化的10PTPEG1035溶液加入至含10当量的Nα，Nα-双羧甲基赖氨酸(分子量＝262Da)的25ml的0.2MHEPES缓冲液pH7.8内并且使其反应过夜。将反应混合物浓缩至100ml并在100kDa-MWCO的超滤盒(UFP-100-E-5A)中使用15次换液的水进行洗涤。对该10PTPEG1035NTA产物进行过滤除菌(使用0.2μm聚砜滤器，Nalgene，Rochester，NY)并进行冻干。制备所产生的10PTPEG1035NTA的10mg/ml溶液，并通过尺寸排阻色谱法使用TosohG4000WXL柱(0.79×30cm)和作为洗脱溶剂的包含15％乙腈的磷酸盐缓冲盐水(PBS；11.9mM磷酸盐，137mMNaCl，2.7mMKPO4，pH7.4)在0.6ml/分钟的流速下测定流体动力学直径。保留时间应与约14-20nm的流体动力学直径一致。
实施例28：10PTPEG1035NTASO或10PTPEG1035NTASF或10PTPEG1035NTAPO的合成：该结构由10kDa的多聚苏氨酸构成，其中35％的羟基基团共价连接于10kDaMPEG并且剩余的羟基基团共价连接于作为氨三乙酸(NTA)衍生物的双羧甲基赖氨酸的ε氨基基团。NTA经进一步修饰以包含三个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团，各基团连接于NTA的羰基基团。基本上，各NTA作为间隔物发挥作用以使成簇的三个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团被连接于多聚苏氨酸骨架(也可使用其它骨架)。10PTPEG1035NTA(参见上文)可被转化成为包含硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团簇的硫酸化(或磺酸化或磷酸化)载体，各簇具有最多三个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团。为此，取2克10PTPEG1035NTA并溶解于50ml的10mMMES缓冲液(pH4.7)中。载体通过加入0.28g的NHSS(分子量＝217.14；1.3mmol)并随后加入0.56g的EDC(分子量＝191.71；2.9mmol)进行活化，并且使活化进行20分钟。在独立容器中将0.37g的2-氨基乙基硫酸氢酯(AES；分子量＝141；2.6mmol)或0.45g的对氨基苯磺酸(SNA；分子量＝173；2.6mmol)或0.37g的O-磷脂酰乙醇胺(OPE；分子量＝141；2.6mmol)溶解于25ml的1MHEPES缓冲液(pH7.3，使用NaOH调节pH至7.8)中并且通过TNBS对初始氨基基团进行测量(Spadaro等，1979，Anal.Chem.，96，317-329页)，其应为约2.6mmol，这取决于AES(或SNA或OPE)的纯度。将20分钟活化的载体加入AES(或SNA或OPE)溶液中。2小时之后，加入另外的0.56gEDC并搅拌溶液过夜。通过TNBS测量氨基基团以测定氨基基团的减少量，其等同于合并的硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团的量。使用100kDaMWCO超滤盒(UFP-100-E-5A；GE-Amersham)以20倍体积的水洗涤硫酸化(或磺酸化或磷酸化)的载体，过滤除菌(0.2μm聚砜滤器，Nalgene，Rochester，NY)并进行冻干。该产物(10PTPEG1035NTASO或10PTPEG1035NTASF或10PTPEG1035NTAPO)具有侧接骨架的每簇最多三个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团的簇。
实施例29：20PYPEG1035NTA的合成：20PYPEG1035NTA将被用作用于合成本发明的一些阴离子核心组合物的起始材料。该组合物具有多聚酪氨酸(SigmaChem.Co.StLuisMo.目录号P1800，分子量＝10-40kDa)作为聚合物骨架，其中35％的羟基基团被10KDaMPEGAM(分子量＝10kDa的具有末端氨基基团的MPEG；Sunbio，Orinda，CA；目录号P1AM-10)所占据并且剩余的羟基基团被氨三乙酸所占据。为制备该组合物，使用琥珀酸酐将所有的羟基基团转化成为羧基基团。简言之，将1g多聚酪氨酸溶解于25ml的二氧六环中并且加入2.9克琥珀酸酐(相对于1克多聚酪氨酸中的理论羟基基团五倍摩尔过量)和900mgN，N′-二甲基氨基吡啶以作为催化剂，并将该混合物在60℃下孵育3小时。通过在40℃下进行旋转蒸发而去除二氧六环，将固体溶解于水中，使用NaOH进行中和并在3kDa-MWCO的超滤盒(UFP-3-E-5A)中以15次换液的水进行洗涤。对所产生的产物(PY)使用(0.2μm聚砜滤器，Nalgene，Rochester，NY)进行过滤除菌并进行冻干以获得PY。根据Kobayahi和Chiba的方案(Analyticalbiochemistry1994，219卷，189-194页)对1.0gPY的起始羧基基团(1当量)进行测量。为合成20PYPEG1035NTA，取1.0g的PY(具有1当量的羧基基团)并溶解于25ml的10mMMES(2-(N-吗啉)乙磺酸，Pierce，Rockford，IL)缓冲液pH4.7中(PY溶液)，加入1当量的NHS(分子量＝115.14)和1当量的EDC(分子量＝191.71)，并且搅拌20分钟以进行活化。在独立容器中，将0.35当量的MPEGAM(分子量＝10kDa的具有末端氨基基团的MPEG；Sunbio，Orinda，CA；目录号P1AM-10)溶解于20ml的pH7.8的0.2MHEPES中以制备MPEGAM溶液。将活化的PY溶液加入MPEGAM溶液中并使反应进行2小时。通过TNBS测量MPEGAM的剩余氨基基团并且其应为零，表明全部0.35当量的氨基基团已经用尽并且被偶联于PY。如果存在剩余的氨基基团，使用6NHCl调节pH至5并加入1当量的EDC(分子量＝191.71)，20分钟后将该pH调回至7.8并使其反应过夜。取所产生的20PYPYG1035溶液的等份试样并通过尺寸排阻色谱法使用TosohG4000WXL柱(0.79×30cm)和作为洗脱溶剂的包含15％乙腈的磷酸盐缓冲盐水(PBS；11.9mM磷酸盐，137mMNaCl，2.7mMKPO4，pH7.4)在0.6ml/分钟的流速下测定流体动力学直径。保留时间应与约13-18nm的流体动力学直径一致。使用6NHCl下调pH至5并且添加1.5当量的EDC(分子量＝191.71)和活化20分钟。20分钟后将该溶液加入含10当量的Nα，Nα-双羧甲基赖氨酸(分子量＝262Da)的25mlpH7.8的0.2MHEPES缓冲液中并且使其反应过夜。将反应混合物浓缩至100ml并在100kDaMWCO的超滤盒(UFP-100-E-5A)中使用15次换液的水进行洗涤。对该样品使用(0.2μm聚砜滤器，Nalgene，Rochester，NY)进行过滤除菌并进行冻干。制备所产生的20PYPEG1035NTA的10mg/ml溶液，并通过尺寸排阻色谱法使用TosohG4000WXL柱(0.79×30cm)和包含15％乙腈的作为洗脱溶剂的磷酸盐缓冲盐水(PBS；11.9mM磷酸盐，137mMNaCl，2.7mMKPO4，pH7.4)在0.6ml/分钟的流速下测定流体动力学直径。保留时间应与约14-20nm的流体动力学直径一致。
实施例30：20PYPEG1035NTASO或20PYPEG1035NTASF或20PYPEG1035NTAPO的合成：该结构由20kDa的多聚酪氨酸构成，其中35％的羟基基团共价连接于10kDaMPEG并且剩余的羟基基团共价连接于作为氨三乙酸(NTA)衍生物的双羧甲基赖氨酸的ε氨基基团。NTA经进一步修饰以包含三个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团，各基团连接于NTA的羰基基团。基本上，各NTA作为间隔物发挥作用以使成簇的三个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团被连接于多聚酪氨酸骨架(也可使用其它骨架)。20PYPEG1035NTA(参见上文)可被转化成为包含硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团簇的硫酸化(或磺酸化或磷酸化)载体，各簇中具有最多三个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团。为此，取2克20PYPEG1035NTA并溶解于50ml的10mMMES缓冲液(pH4.7)中。载体通过加入0.28g的NHSS(分子量＝217.14；1.3mmol)并随后加入0.56g的EDC(分子量＝191.71；2.9mmol)进行活化，并且使活化进行20分钟。在独立容器中将0.37g的2-氨基乙基硫酸氢酯(AES；分子量＝141；2.6mmol)或0.45g的对氨基苯磺酸(SNA；分子量＝173；2.6mmol)或0.37g的O-磷脂酰乙醇胺(OPE；分子量＝141；2.6mmol)溶解于25ml的1MHEPES缓冲液(pH7.3，使用NaOH调节pH至7.8)中并且通过TNBS对初始氨基基团进行测量(Spadaro等，1979，Anal.Chem.，96，317-329页)，其应为约2.6mmol，这取决于AES(或SNA或OPE)的纯度。将20分钟活化的载体加入AES(或SNA或OPE)溶液中。2小时之后，加入另外的0.56gEDC并搅拌该溶液过夜。通过TNBS测量氨基基团以测定氨基基团的减少量，其等同于合并的硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团的量。使用100kDaMWCO超滤盒(UFP-100-E-5A；GE-Amersham)以20倍体积的水洗涤硫酸化(或磺酸化或磷酸化)的载体，过滤除菌(0.2μm聚砜滤器，Nalgene，Rochester，NY)并进行冻干。该产物(20PYPEG1035NTASO或20PYPEG1035NTASF或20PYPEG1035NTAPO)具有侧接骨架的每簇最多三个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团的簇。
实施例31：20PCPEG1035DTPA的合成：20PCPEG1035DTPA将被用作用于合成本发明的一些阴离子核心组合物的起始材料。该组合物具有多聚半胱氨酸(SigmaChem.Co.StLuisMo.目录号P1800，分子量＝10-40kDa)作为聚合物骨架，其中35％的巯基基团被10kDa的MPEGC(分子量＝10kDa；SunBright；ME-100HS；批号M62503；在溶液中澄清)所占据并且剩余的巯基基团被二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)所占据。为制备该组合物，使用氨乙基-8(N-(碘乙基)三氟乙酰胺)(Pierce，Rockford，IL，目录号23010)将所有的巯基基团转化成为氨基基团。简言之，将1g的多聚半胱氨酸溶解于25ml的20mMN-三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)缓冲液pH8.5中并加入4.7克氨乙基-8(N-(碘乙基)三氟乙酰胺)(相对于1克多聚半胱氨酸中的理论巯基基团2倍摩尔过量)并将该混合物在室温孵育3个小时。在3kDa-MWCO的超滤盒(UFP-3-E-5A)中以15次换液的水进行洗涤。对所产生的产物(PC)使用(0.2μm聚砜滤器，Nalgene，Rochester，NY)进行过滤除菌并进行冻干以获得PC。如上使用TNBS对1.0gPC的起始氨基基团(1当量)进行测量。为合成20PCPEG1035DTPA，取1.0g的PC(具有1当量的氨基基团)并溶解于25ml的0.2MHEPES缓冲液pH7.8中(Pierce，Rockford，IL)以获得20PC溶液。在独立容器中，将0.35当量的MPEGC(分子量＝10kDa；具有末端羧基基团的甲氧基聚乙二醇；来自Lysanbio；Arab，AL)溶解于60ml的10mMMESpH＝4.7中，加入0.5当量的NHS(分子量＝115.14)，一旦溶解，在进行搅拌的同时加入1当量的EDC(分子量＝191.71；10.43mmol)并使活化进行20分钟。将活化的MPEGC直接加入20PC溶液中，使该反应进行2小时并通过TNBS测量氨基基团以确保35％的氨基基团饱和度，否则再加入适量的活化MPEGC。此即为20PCPEG1035溶液。使用TosohG4000WXL柱(0.79×30cm)以包含15％乙腈的磷酸盐缓冲盐水(PBS；11.9mM磷酸盐，137mMNaCl，2.7mMKPO4，pH7.4)洗脱液在0.6ml/分钟的流速下进行尺寸排阻色谱。保留时间应与约14-17nm的流体动力学直径一致。加入5当量的DTPA二酐(分子量＝357.32；SigmaChemCo.，StLouis，MO.目录号284025)，随后加入200μl的TEA。使用10N的NaOH将该反应物缓慢滴定至pH7.8并搅拌4小时。使用TNBS反应确认无氨基基团残留，其为完全反应的指示，并且确认制备了20PCPEG1035DTPA。使用TosohG4000WXL柱(0.79×30cm)以包含15％乙腈的磷酸盐缓冲盐水(PBS；11.9mM磷酸盐，137mMNaCl，2.7mMKPO4，pH7.4)洗脱液在0.6ml/分钟的流速下进行尺寸排阻色谱。保留时间应与17-21nm的分子直径一致。使用100,000MWCO超滤盒(UFP-100-E-5A；GE-Amersham)以15倍体积的水洗涤所产生的20PCPEG1035DTPA并进行冻干。
实施例32：20PCPEG1035DTPASO或20PCPEG1035DTPASF或20PCPEG1035DTPAPO的合成：该结构由20kDa的多聚半胱氨酸构成，其中35％的巯基基团共价连接于10kDa的MPEG并且剩余的巯基基团共价连接于二亚乙基二胺四乙酸(DTPA)的羰基之一。DTPA经进一步修饰以包含四个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团，各基团连接于DTPA的羰基基团。基本上，各DTPA作为间隔物发挥作用以使成簇的四个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团被连接于多聚半胱氨酸骨架上(也可使用其它骨架)。20PCPEG1035DTPA(参见上文)可被转化成为包含硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团簇的硫酸化(或磺酸化或磷酸化)载体，各簇具有最多四个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团。为此，取2克20PCPEG1035DTPA并溶解于50ml的10mMMES缓冲液(pH4.7)中。载体通过加入0.28g的NHSS(分子量＝217.14；1.3mmol)并随后加入0.56g的EDC(分子量＝191.71；2.9mmol)进行活化，并且使活化进行20分钟。在独立容器中将0.37g的2-氨基乙基硫酸氢酯(AES；分子量＝141；2.6mmol)或0.45g的对氨基苯磺酸(SNA；分子量＝173；2.6mmol)或0.37g的O-磷脂酰乙醇胺(OPE；分子量＝141；2.6mmol)溶解于25ml的1MHEPES缓冲液(pH7.3，使用NaOH调节pH至7.8)中并且通过TNBS对初始氨基基团进行测量(Spadaro等，1979，Anal.Chem.，96，317-329页)，其应为约2.6mmol，这取决于AES(或SNA或OPE)的纯度。将20分钟活化的载体加入AES(或SNA或OPE)溶液中。2小时之后，加入另外的0.56gEDC并搅拌该溶液过夜。通过TNBS测量氨基基团以测定氨基基团的减少量，其等同于合并的硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团的量。使用100kDaMWCO超滤盒(UFP-100-E-5A；GE-Amersham)以20倍体积的水洗涤硫酸化(或磺酸化或磷酸化)的载体，过滤除菌(0.2μm聚砜滤器，Nalgene，Rochester，NY)并进行冻干。该产物(20PCPEG1035DTPASO或20PCPEG1035DTPASF或20PCPEG1035DTPAPO)具有侧接于骨架的每簇最多四个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团的簇。
具有源自非生物性单体的聚合物骨架的组合物的实施例
实施例33：15PALPEG1035DTPA的合成：15PALPEG1O35DTPA将被用作用于合成本发明的一些阴离子核心组合物的起始材料。该组合物具有聚烯丙胺盐酸盐(SigmaChem.Co.StLuisMo.目录号283215，分子量＝15kDa)作为聚合物骨架，其中35％的氨基基团被10kDaMPEGC(分子量＝10kDa；SunBright；ME-100HS；批号M62503；在溶液中澄清)所占据并且剩余的氨基基团被乙二胺四乙酸(DTPA)所占据。为合成15PALPEG1035DTPA，取1.0g的聚烯丙胺盐酸盐(根据TNBS的测量具有1当量的氨基基团)并溶解于25ml的pH7.4的0.2MHEPES缓冲液(Pierce，Rockford，IL)中以获得15PAL溶液。在独立容器中，将0.35当量的MPEGC(分子量＝10kDa，具有末端羧基基团的甲氧基聚乙二醇；来自Lysanbio；Arab，AL)溶解于60ml的20mMMESpH＝4.7中，加入0.5当量的NHS(分子量＝115.14)，一旦溶解，加入1当量的EDC(分子量＝191.71；10.43mmol)，并且搅拌20分钟。20分钟之后，将活化的MPEGC直接加入15PAL溶液中，2小时后通过TNBS测量氨基基团以确保35％的氨基基团饱和度，否则再加入适量的活化MPEGC。此即为15PALPEG1035溶液。使用TosohG4000WXL柱(0.79×30cm)以包含15％乙腈的磷酸盐缓冲盐水(PBS；11.9mM磷酸盐，137mMNaCl，2.7mMKPO4，pH7.4)洗脱液在0.6ml/分钟的流速下进行尺寸排阻色谱。保留时间应与约14-17nm的分子直径一致。加入5当量的DTPA二酐(分子量＝357.32；SigmaChemCo.，StLouis，MO.目录号284025)，随后加入200μl的TEA。使用10N的NaOH将该反应物缓慢滴定至pH7.8并搅拌4小时。使用TNBS反应确认无氨基基团残留，表明完全反应，并且确认形成了15PALPEG1035DTPA产物。使用TosohG4000WXL柱(0.79×30cm)以包含15％乙腈的磷酸盐缓冲盐水(PBS；11.9mM磷酸盐，137mMNaCl，2.7mMKPO4，pH7.4)洗脱液在0.6ml/分钟的流速下进行尺寸排阻色谱。保留时间应与约17-21nm的分子直径一致。使用100,000MWCO超滤盒(UFP-100-E-5A；GE-Amersham)以15倍体积的水洗涤所产生的15PALPEG1035DTPA并进行冻干。
实施例34：15PALPEG1035DTPASO或15PALPEG1035DTPASF或15PALPEG1035DTPAPO的合成：该结构由15kDa的聚烯丙胺构成，其中35％的氨基基团共价连接于10kDa的MPEG并且剩余的氨基基团共价连接于二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)的羰基基团之一。DTPA经进一步修饰以包含四个硫酸根基团，各基团连接于DTPA的羰基基团。基本上，各DTPA作为间隔物发挥作用以使成簇的四个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团被连接于聚烯丙胺骨架(也可使用其它骨架)。15PALPEG1035DTPA(参见上文)可被转化成为包含硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团簇的硫酸化(或磺酸化或磷酸化)载体，各簇具有最多四个硫酸根基团。为此，取2克15PALPEG1035DTPA并溶解于50ml的10mMMES缓冲液(pH4.7)中。载体通过加入0.28g的NHSS(分子量＝217.14；1.3mmol)并随后加入0.56g的EDC(分子量＝191.71；2.9mmol)进行活化，并且使活化进行20分钟。在独立容器中将0.37g的2-氨基乙基硫酸氢酯(AES；分子量＝141；2.6mmol)或0.45g的对氨基苯磺酸(SNA；分子量＝173；2.6mmol)或0.37g的O-磷脂酰乙醇胺(OPE；分子量＝141；2.6mmol)溶解于25ml的1MHEPES缓冲液(pH7.3，使用NaOH调节pH至7.8)中并且通过TNBS对初始氨基基团进行测量(Spadaro等，1979，Anal.Chem.，96，317-329页)，其应为约2.6mmol，这取决于AES(或SNA或OPE)的纯度。将20分钟活化的载体加入AES(或SNA或OPE)溶液中。2小时之后，加入另外的0.56gEDC并搅拌该溶液过夜。通过TNBS测量氨基基团以测定氨基基团的减少量，其等同于合并的硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团的量。使用100kDaMWCO超滤盒(UFP-100-E-5A；GE-Amersham)以20倍体积的水洗涤硫酸化(或磺酸化或磷酸化)载体，过滤除菌(0.2μm聚砜滤器，Nalgene，Rochester，NY)并进行冻干。该产物(15PALPEG1035DTPASO或15PALPEG1035DTPASF或15PALPEG1035DTPAPO)具有侧接于骨架的每簇最多四个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团的簇。
实施例35：20PMAPEG1035NTA的合成：20PMAPEG1035NTA将被用作用于合成本发明的一些阴离子核心组合物的起始材料。该组合物具有聚甲基甲基丙烯酸酯(SigmaChem.Co.StLuisMo.目录号81498，分子量＝20kDa)作为聚合物骨架，其中35％的甲氧基基团被10KDaMPEGAM(分子量＝10kDa的具有末端氨基基团的MPEG；Sunbio，Orinda，CA；目录号P1AM-10)取代并且剩余的甲氧基基团被氨三乙酸所占据。为制备该组合物，使用甲醇/KOH将聚甲基甲基丙烯酸酯(SigmaChem.Co.StLuisMo.目录号81498，分子量＝20kDa)中的所有甲氧基基团去除以获得聚甲基丙烯酸(PMA)。简言之，将2g的聚甲基甲基丙烯酸酯溶解于25ml的10％甲醇KOH中并且回流96小时。使用HCl进行中和，并且通过在40℃下旋转蒸发除去甲醇，将固体溶解于水中并且在3kDa-MWCO的超滤盒(UFP-3-E-5A)中以15次换液的水进行洗涤。对所产生的产物(PMA)使用(0.2μm聚砜滤器，Nalgene，Rochester，NY)进行过滤除菌并进行冻干以获得PMA。根据Kobayahi和Chiba的方案(Analyticalbiochemistry1994，219卷，189-194页)对1.0gPMA的起始羧基基团(1当量)进行测量。为合成20PMAPEG1035NTA，取1.0g的PMA(具有1当量的羧基基团)并溶解于25ml的10mMMES(2-(N-吗啉)乙磺酸，Pierce，Rockford，IL)缓冲液pH4.7中(PS溶液)，并通过加入1当量的NHS(分子量＝115.14)和1当量的EDC(分子量＝191.71)进行活化。在独立容器中，将0.35当量的MPEGAM(分子量＝10kDa的具有末端氨基基团的MPEG；Sunbio，Orinda，CA；目录号P1AM-10)溶解于10ml的0.2M的HEPES中并使用10N的NaOH将pH调节至7.8。20分钟的PMA活化之后，将PMA加入MPEGAM溶液中。使反应进行2小时，通过TNBS测量MPEGAM的剩余氨基基团并且其应为零，表明全部0.35当量的氨基基团已经用尽并且被偶联于PMA。如果存在剩余的氨基基团，使用6NHCl调节pH至5并加入1当量的EDC(分子量＝191.71)，20分钟后将该pH调回至7.8并使其反应过夜。聚所产生的20PMAPEG1035溶液的等份试样并通过尺寸排阻色谱法使用TosohG4000WXL柱(0.79×30cm)和作为洗脱溶剂的包含15％乙腈的磷酸盐缓冲盐水(PBS；11.9mM磷酸盐，137mMNaCl，2.7mMKPO4，pH7.4)在0.6ml/分钟的流速下测定流体动力学直径。保留时间应与约13-18nm的直径一致。使用6NHCl下调pH至5并且添加1.5当量的EDC(分子量＝191.71)并且活化20分钟。20分钟后将该活化的20PMAPEG1035溶液加入含10当量的Nα，Nα-双羧甲基赖氨酸(分子量＝262Da)的25ml1MHEPES缓冲液pH7.4内并且使其反应过夜。将反应混合物浓缩至100ml并在100kDaMWCO的超滤盒(UFP-100-E-5A)中使用15次换液的水进行洗涤。对该20PMAPEG1035NTA产物进行过滤除菌(使用0.2μm聚砜滤器，Nalgene，Rochester，NY)并进行冻干。制备所产生的20PMAPEG1035NTA的10mg/ml溶液，并通过尺寸排阻色谱法使用TosohG4000WXL柱(0.79×30cm)和包含15％乙腈的作为洗脱溶剂的磷酸盐缓冲盐水(PBS；11.9mM磷酸盐，137mMNaCl，2.7mMKPO4，pH7.4)在0.6ml/分钟的流速下测定流体动力学直径。保留时间应与约16-20nm的直径一致。
实施例36：20PMAPEG1035NTASO或20PMAPEG1035NTASF或20PMAPEG1035NTAPO的合成：该结构由20kDa的聚甲基丙烯酸酯构成，其中35％的羧基基团共价连接于10kDaMPEG并且剩余的羧基基团共价连接于作为氨三乙酸(NTA)衍生物的双羧甲基赖氨酸的ε氨基基团。NTA经进一步修饰以包含三个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团，各基团连接于NTA的羰基基团。基本上，各NTA作为间隔物发挥作用以使成簇的三个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团连接于聚甲基丙烯酸酯骨架上(也可使用其它骨架)。20PMAPEG1035NTA(参见上文)可被转化成为包含硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团簇的硫酸化(或磺酸化或磷酸化)载体，各簇中具有最多三个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团。为此，取2克20PMAPEG1035NTA并溶解于50ml的10mMMES缓冲液(pH4.7)中。载体通过加入0.28g的NHSS(分子量＝217.14；1.3mmol)并随后加入0.56g的EDC(分子量＝191.71；2.9mmol)进行活化，并且使活化进行20分钟。在独立容器中将0.37g的2-氨基乙基硫酸氢酯(AES；分子量＝141；2.6mmol)或0.45g的对氨基苯磺酸(SNA；分子量＝173；2.6mmol)或0.37g的O-磷脂酰乙醇胺(OPE；分子量＝141；2.6mmol)溶解于25ml的1MHEPES缓冲液(pH7.3，使用NaOH调节pH至7.8)中并且通过TNBS对初始氨基基团进行测量(Spadaro等，1979，Anal.Chem.，96，317-329页)，其应为约2.6mmol，这取决于AES(或SNA或OPE)的纯度。将20分钟活化的载体加入AES(或SNA或OPE)溶液中。2小时之后，加入另外的0.56gEDC并搅拌该溶液过夜。通过TNBS测量氨基基团以测定氨基基团的减少量，其等同于合并的硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团的量。使用100kDaMWCO超滤盒(UFP-100-E-5A；GE-Amersham)以20倍体积的水洗涤硫酸化(或磺酸化或磷酸化)载体，过滤除菌(0.2μm聚砜滤器，Nalgene，Rochester，NY)并进行冻干。该产物(20PMAPEG1035NTASO或20PMAPEG1035NTASF或20PMAPEG1035NTAPO)具有侧接于骨架的每簇最多三个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团的簇。
实施例37：15PACPEG1035NTA的合成：15PACPEG1035NTA将被用作用于合成本发明的一些阴离子核心组合物的起始材料。该组合物具有聚丙烯酸或PAC(SigmaChem.Co.StLuisMo.目录号81123，分子量＝16kDa)作为聚合物骨架，其中35％的羧基基团连接于10kDa的MPEGAM(分子量＝10kDa的具有末端氨基基团的MPEG；Sunbio，Orinda，CA；目录号P1AM-10)并且剩余的羧基基团被氨三乙酸所占据。根据Kobayahi和Chiba的方案(Analyticalbiochemistry1994，219卷，189-194页)对1.0gPAC的起始羧基基团(1当量)进行测量。为合成15PACPEG1035NTA，取1.0g的PAC(具有1当量的羧基基团)并溶解于25ml的10mMMES(2-(N-吗啉)乙磺酸，Pierce，Rockford，IL)缓冲液pH4.7中(PAC溶液)。向PAC溶液中加入1当量NHS(分子量＝115.14)和1当量EDC(分子量＝191.71)，同时进行搅拌以对PAC进行活化。在独立容器中，将0.35当量MPEGAM(分子量＝10kDa的具有末端氨基基团的MPEG；Sunbio，Orinda，CA；目录号P1AM-10)溶解于20ml0.2MHEPES中并使用NaOH将pH调节至7.8从而获得MPEGAM。PAC活化20分钟之后，将PAC溶液加入MPEGAM溶液中。使反应进行2小时，通过TNBS测量MPEGAM的剩余氨基基团并且其应为零，表明全部0.35当量的氨基基团已经用尽并且被偶联于PAC。如果在MPEGAM中存在剩余的氨基基团，使用6NHCl调节pH至5并加入1当量的EDC(分子量＝191.71)，20分钟后将该pH调回7.8并使其反应过夜以形成15PACPEG1035。取所产生的15PACPEG1035溶液的等份试样并通过尺寸排阻色谱法使用TosohG4000WXL柱(0.79×30cm)和作为洗脱溶剂的包含15％乙腈的磷酸盐缓冲盐水(PBS；11.9mM磷酸盐，137mMNaCl，2.7mMKPO4，pH7.4)在0.6ml/分钟的流速下测定流体动力学直径。保留时间应与约12-17nm的直径一致。使用6NHCl下调pH至5并且添加1.5当量的EDC(分子量＝191.71)并且活化20分钟。20分钟后将该活化的15PACPEG1035溶液加入至含10当量的Nα，Nα-双羧甲基赖氨酸(分子量＝262Da)的25ml1MHEPES缓冲液pH7.4内并且使其反应过夜。将反应混合物浓缩至100ml并在100kDaMWCO的超滤盒(UFP-100-E-5A)中使用15次换液的水进行洗涤。对15PACPEG1035NTA产物进行过滤除菌(使用0.2μm聚砜滤器，Nalgene，Rochester，NY)并进行冻干。制备所产生的15PACPEG1035NTA的10mg/ml溶液，并通过尺寸排阻色谱法使用TosohG4000WXL柱(0.79×30cm)和作为洗脱溶剂的包含15％乙腈的磷酸盐缓冲盐水(PBS；11.9mM磷酸盐，137mMNaCl，2.7mMKPO4，pH7.4)在0.6ml/分钟的流速下测定流体动力学直径。保留时间应与约15-20nm的直径一致。
实施例38：15PACPEG1035NTASO或15PACPEG1035NTASF或15PACPEG1035NTAPO的合成：该结构由15kDa的聚丙烯酸构成，其中35％的羧基基团共价连接于10kDaMPEG并且剩余的羧基基团共价连接于作为氨三乙酸(NTA)衍生物的双羧甲基赖氨酸的ε氨基基团。NTA经进一步修饰以包含三个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团，各基团连接于NTA的羰基基团上。基本上，各NTA作为间隔物发挥作用以使成簇的三个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团被连接于聚丙烯酸骨架上(也可使用其它骨架)。15PACPEG1035NTA(参见上文)可被转化为包含硫酸根基团的簇的硫酸化(或磺酸化或磷酸化)载体，各簇中具有最多三个硫酸根基团。为此，取2克15PACPEG1035NTA并溶解于50ml的10mMMES缓冲液(pH4.7)中。载体通过加入0.28g的NHSS(分子量＝217.14；1.3mmol)并随后加入0.56g的EDC(分子量＝191.71；2.9mmol)进行活化，并且使活化进行20分钟。在独立容器中将0.37g的2-氨基乙基硫酸氢酯(AES；分子量＝141；2.6mmol)或0.45g的对氨基苯磺酸(SNA；分子量＝173；2.6mmol)或0.37g的O-磷脂酰乙醇胺(OPE；分子量＝141；2.6mmol)溶解于25ml的1MHEPES缓冲液(pH7.3，使用NaOH调节pH至7.8)中并且通过TNBS对初始氨基基团进行测量(Spadaro等，1979，Anal.Chem.，96，317-329页)，其应为约2.6mmol，这取决于AES(或SNA或OPE)的纯度。将20分钟活化的载体加入AES(或SNA或OPE)溶液中。2小时之后，加入另外的0.56gEDC并搅拌溶液过夜。通过TNBS测量氨基基团以测定氨基基团的减少量，其等同于合并的硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团的量。使用100kDaMWCO超滤盒(UFP-100-E-5A；GE-Amersham)以20倍体积的水洗涤硫酸化(或磺酸化或磷酸化)载体，过滤除菌(0.2μm聚砜滤器，Nalgene，Rochester，NY)并进行冻干。该产物(15PACPEG1035NTASO或15PACPEG1035NTASF或15PACPEG1035NTAPO)具有侧接于骨架的每簇最多三个硫酸根(或磺酸根或磷酸根)基团的簇。
无特定可修饰官能团的聚合物骨架的应用
实施例39：多聚甘氨酸、多聚丙氨酸、多聚缬氨酸、苯丙氨酸、聚氧乙二醇(polyoxyethyleneglycol)、聚氧丙二醇(polyoxypropylenegktcol)等(在本实施例中作为一组称为INRT)作为聚合物骨架的应用通过使用非特异性光反应性异双功能交联剂(其可在整个这些聚合物中引入羧基功能团)而成为可能。光反应性异双功能交联剂的例子包括NHS-双吖丙啶(diazirine)(琥珀酰亚胺基4，4′-叠氮戊酸酯)、NHS-LC-双吖丙啶(琥珀酰亚胺基6-(4，4′-叠氮戊酰胺)己酸酯)、NHS-SS-双吖丙啶(琥珀酰亚胺基2-([4，4′-叠氮戊酰胺]乙基)-1，3′-二硫代丙酸酯)、硫代-NHS-双吖丙啶(硫代琥珀酰亚胺基4，4′-叠氮戊酸酯)、硫代-NHS-LC-双吖丙啶(硫代琥珀酰亚胺基6-(4，4′-叠氮戊酰胺)己酸酯)、硫代-NHS-SS-双吖丙啶(硫代琥珀酰亚胺基2-([4，4’-叠氮戊酰胺]乙基)-1，3′-二硫代丙酸酯)、ANB-NOS(N-5-叠氮基-2-硝基苯甲酰氧基琥珀酰亚胺)、NHS-ASA(N-羟基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基水杨酸)、SADP(N-琥珀酰亚胺基(4′-叠氮基苯基)-1，3′-二硫代丙酸酯)、硫代-SAND(硫代琥珀酰亚胺基-2-(m-叠氮基-o-硝基苯甲酰氨基)-乙基-1，3′-丙酸酯)、SANPAH(N-琥珀酰亚胺基-6-(4′-叠氮基-2′-硝基苯基氨基)己酸酯)、硫代-HSAB(N-羟基硫代琥珀酰亚胺基-4-叠氮基苯甲酸酯)、硫代-NHS-LC-ASA(硫代琥珀酰亚胺基[4-叠氮基水杨酰基氨基]-己酸酯)、硫代-SADP(N-硫代琥珀酰亚胺基(4-叠氮基苯基)-1，3′-二硫代丙酸酯)、硫代-SAED(硫代琥珀酰亚胺基2-[7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酰氨基]乙基-1，3′-二硫代丙酸酯)、硫代-SANPAH(N-硫代琥珀酰亚胺基-6-(4′-叠氮基-2′-硝基苯基氨基)己酸酯)、硫代-SBED(硫代-N-羟基琥珀酰亚胺基-2-(6-[生物素酰氨基]-2-(p-叠氮苯甲酰氨基)-己酰氨基)乙基-1，3′-二硫代丙酸酯)以及硫代-SFAD(硫代琥珀酰亚胺基-(全氟叠氮苯甲酰氨基)-乙基-1，3′-二硫代丙酸酯)。所有这些试剂均由Pierce，Rockford，IL商购得到。光反应试剂是当暴露于紫外或可见光时变成反应性的化学惰性试剂。这些试剂中的传统光反应性基团是芳基叠氮化物。芳基叠氮化物在暴露于UV光时形成可引发与双键的加成反应，在无N-H位点(如伯胺)的情况下插入C-H中(这正是INRT聚合物的情况)的氮宾基团。当样品中存在伯胺的时候，与N-H路径的反应具优势地位，这必须加以避免。在光活化前和光活化期间的所有步骤中样品溶液中必须避免含巯基的还原剂(如DTT或2-巯基乙醇)。这些试剂还原叠氮化物。琥珀酰亚胺酯双吖丙啶(SDA)试剂是一类新型交联剂，其将已被证实的胺反应性化学作用与高效的基于双吖丙啶的光化学作用相结合用于与几乎任何其它官能团进行光交联。基于双吖丙啶的光交联剂具有比基于苯基叠氮化物的光交联剂更优良的光稳定性并且易于使用长波长UV光(330-370nm)进行活化。在下面合成实施例中，INRT将指代不具有方便的可修饰基团的聚合物。
实施例40：20INRTPEGG1035NTA的合成：该组合物具有INRT作为聚合物骨架，其中35％的光引入羧基基团连接于10KDaMPEGAM(分子量＝10kDa，MPEGAM具有末端氨基基团；Sunbio，Orinda，CA；目录号P1AM-10)并且剩余的羧基基团被氨三乙酸所占据。如上文所述，一旦NTA被引入聚合物，则硫酸根、磺酸根和磷酸根的加入是直接的(参见上文)。一旦硫酸根、磺酸根和磷酸根被引入，NTA的螯合功能显著降低或消除。为向INRT聚合物引入羧基基团，将2g的INRT(20KDa)溶解于50-100ml的适当溶剂中，加入20-40mmol的硫代-NHS-双吖丙啶并将溶液暴露于UV光(330-370nm)2-10分钟。将pH调节至9并在室温下放置2小时以切除NHS和暴露羧基基团用于分析和质量控制测试。在3kDa-MWCO的超滤盒(UFP-3-E-5A)中以15次换液的水洗涤修饰的产物。对所产生的羧基化产物(20INRT)使用(0.2μm聚砜滤器，Nalgene，Rochester，NY)进行过滤除菌并进行冻干以获得20INRT。在将20INRT用于20INRTPEGG1035NTA的合成之前，根据Kobayahi和Chiba的方案(Analyticalbiochemistry1994，219卷，189-194页)对1.0g的20INRT中的起始羧基基团(1当量)进行测量。如果1克的20INRT中存在低于1mmol的羧基，通过重复上述过程而引入更多的羧基。为合成20INRTPEGG1035NTA，取1.0g的INRT(具有1当量的羧基基团)并溶解于50ml的10mMMES(2-(N-吗啉)乙磺酸，Pierce，Rockford，IL)缓冲液pH4.7中以获得INRT溶液。在进行搅拌的同时向INRTPEG溶液中加入1当量的NHS(分子量＝115.14)和1当量的EDC(分子量＝191.71)溶液，从而进行20分钟活化。在独立容器中，将0.35当量的MPEGAM(分子量＝10kDa的具有末端氨基基团的MPEG；Sunbio，Orinda，CA；目录号P1AM-10)溶解于20ml0.2M的HEPES中并且使用NaOH调节pH至7.8。20分钟的INRT活化之后，加入INRT溶液以制备INRTPEG溶液。使反应进行2小时，通过TNBS测量MPEGAM的剩余氨基基团并且其应为零，表明全部0.35当量的氨基基团已经用尽并且被偶联于所述INRT。如果MPEGAM中存在剩余的氨基基团，使用6NHCl调节pH至5并加入1当量的EDC(分子量＝191.71)，20分钟后将pH调回至7.1并使其反应过夜以形成20INRTPEGG1035。取所产生的20INRTPEGG1035溶液的等份试样并通过尺寸排阻色谱法使用TosohG4000WXL柱(0.79×30cm)和作为洗脱溶剂的包含15％乙腈的磷酸盐缓冲盐水(PBS；11.9mM磷酸盐，137mMNaCl，2.7mMKPO4，pH7.4)在0.6ml/分钟的流速下测定流体动力学直径。保留时间应与约12-17nm的直径一致。使用6NHCl下调pH至5并且添加1.5当量的EDC(分子量＝191.71)并且活化20分钟。20分钟后将该活化的20INRTPEGG1035溶液加入含10当量的Nα，Nα-双羧甲基赖氨酸(分子量＝262Da)的25ml1MHEPES缓冲液pH7.4中并且使其反应过夜。将反应混合物浓缩至100ml并在100kDa-MWCO的超滤盒(UFP-100-E-5A)中使用15次换液的水进行洗涤。对该20INRTPEGG1035NTA产物进行过滤除菌(使用0.2μm聚砜滤器，Nalgene，Rochester，NY)并进行冻干。制备所产生的20INRTPEGG1O35NTA的10mg/ml溶液，并通过尺寸排阻色谱法使用TosohG4000WXL柱(0.79×30cm)和作为洗脱溶剂的包含15％乙腈的磷酸盐缓冲盐水(PBS；11.9mM磷酸盐，137mMNaCl，2.7mMKPO4，pH7.4)在0.6ml/分钟的流速下测定流体动力学直径。保留时间应与约16-22nm的直径一致。
实施例41：阴离子相互作用与金属桥相互作用的区分：在存在和不存在高盐浓度的情况下，使用对七种不同的载体进行50％加载(其中加载分子的以重量计的量为所使用的载体重量的50％)而进行结合研究。阴离子相互作用可通过高浓度的NaCl(0.4M)消除而金属桥相互作用不会被高浓度的NaCl轻易地消除。在本研究中测试了下列载体：CSPEG104G、HPPEG105G、20PLPEG1030DTPA、20PLPEG1030DTPASO、20PLPEG1030DTPASF和20PLPEG1030DTPAPO。20PLPEG570DANTA-Zn是具有20kDa的多聚赖氨酸骨架的载体，其中70％的氨基基团被5kDaMPEG衍生化并且剩余的氨基基团使用双羧甲基赖氨酸进行氨三乙酸的衍生化。在该情况下，使用琥珀酸作为赖氨酸的ε氨基基团和双羧甲基赖氨酸之间的间隔物。所产生的产物(20PLPEG570DANTA-Zn)随后被锌离子饱和并被用于证明金属桥相互作用。在下文的结合研究中，除使用6xHis溶葡球菌素作为金属桥阳性对照的对照之外，在该实验中不使用金属。为进行该研究，使用溶葡球菌素(50％载体重量(0.125mg))对250μl溶液(10mMHEPES/400mMNaCl，或仅10mMHEPES)中的0.25mg的载体进行加载并在室温下孵育二小时。分析重复进行三次。将所有的溶液在13000rpm下离心12分钟(Eppendorf微量离心)以排除可能干扰分析的沉淀物的可能性。上清液使用100kDaMWCO膜(纤维素)以13000rpm进行12分钟过滤用以除去载体-肽复合物(结合的)。通过TNBS分析对滤液(含游离溶葡球菌素)进行分析(结果在下表2中显示)。【TNBS分析：通过将30μl的1M三硝基苯磺酸溶液(Fluka目录号92823)加入至12ml的0.1M的四硼酸钠pH9.2中而制备TNBS溶液。在透明96孔平板中将150μl的滤液和标准品加入指定孔内。将100μl的TNBS溶液加入孔内(终体积250μl)。将平板孵育30分钟并通过BioScan在420nm下测量吸光值】下表2显示溶葡球菌素与本发明的组合物的相互作用是通过阴离子相互作用而非通过金属桥相互作用。对于阳性对照，其显示(最后一列)6-his溶葡球菌素通过金属离子相互作用与含锌(形成金属桥所需的多价金属离子)的对照载体相互作用，这由0.4M的NaCl不能将6-his溶葡球菌素从载体上移除所证明。表2中第二行是加载于阴离子载体的溶葡球菌素的类型。表2中第三行是在孵育混合物中存在0.4MNaCl时的未结合于载体的总溶葡球菌素的百分比(注意钠和钾离子并非多价的并且不形成多配位复合物)。表2中第四行是在孵育混合物中无NaCl时未结合于载体的总溶葡球菌素的百分比。注意6-His溶葡球菌素的结合对0.4M的NaCl具有抗性(金属桥阳性对照)。在存在多价金属离子的情况下(此处未出示)，非常令人惊讶的是结合于本发明的阴离子核心组合物的天然溶葡球菌素保持了对0.4M的NaCl的敏感性，这表明无金属桥存在。
表2：显示了不与载体结合的加载于载体上的总溶葡球菌素的百分比(游离的未结合溶葡球菌素)。
实施例42：溶葡球菌素和本发明的阴离子核心载体组合物之间的相互作用的Kd测定：测定了溶葡球菌素和各种不同载体之间的解离常数(Kd)。在不存在多价金属离子的情况下测量了溶葡球菌素与下列载体的Kd：CSPEG104G、HPPEG104G、20PLPEG1030DTPA、20PLPEG1030DTPASO、20PLPEG1030DTPASF和20PLPEG1030DTPAPO。批号20090508被加载25％-150％的溶葡球菌素(与载体重量相比)以测量Kd。CSPEG104G加载150％-500％的溶葡球菌素。上文所列的载体样品加载50％-250％的溶葡球菌素以测量Kd。根据以上实施例44对结合的和游离的溶葡球菌素进行分离。根据上文描述通过TNBS分析对所有样品进行测量以测定游离的和结合的。使用游离和结合的信息进行Scatchard作图(y-轴为结合/游离和x-轴为结合)。从Scatchard图计算Kd和载体容量(斜率为-1/Kd和x截距为容量)并总结于表3中。其显示溶葡球菌素(具有9.56的碱性等电点的蛋白质)与本发明的阴离子核心组合物之间存在直接相互作用。在混合物中无中间多价金属离子存在并且仍然观察到纳摩尔范围的Kd。另外，相互作用对高NaCl浓度敏感，这表明为离子相互作用而非配位键合。
表3：所有的阴离子核心载体结合溶葡球菌素，最有效的结合剂是高度硫酸化的多糖(肝素)。
实施例43：溶葡球菌素PK研究：四种载体被选择用于PK研究。CSPEG106G、HPPEG105G、20PLPEG1030-DTPA和20PLPEG1030-DTPA-SO被加载等同于50％载体重量的溶葡球菌素。通过将适量载体和溶葡球菌素共同溶解于水中并且孵育两小时，然后冻干而获得这些制剂。将各冻干制剂(包括未配制的单独溶葡球菌素)溶解于盐水中并通过缓慢(至少1分钟)的i.v.推注(12mg溶葡球菌素/Kg)经侧尾静脉施用于SpragueDawley大鼠(n＝4)。在5分钟、15分钟、30分钟、60分钟、120分钟、4小时、6小时、24小时、32小时(30小时)和48小时从眼窝取血样并置于包含蛋白酶抑制剂(AEBSF、抑肽酶、E-64、EDTA和亮肽素)的试管中。通过在13,000rpm下离心而获得血清。所有血清均在-80℃下储存直至用于分析。在该分析中对于各个时间点使用10μl的血清。如下通过活性分析测量溶葡球菌素的活性：制备贮备缓冲液(10×)以包含1MMOPS/10％吐温(重量计)/5mMEDTA/pH7.3。在黑色96孔平板中制备最终反应混合物(200μl)以包含5μg底物、100mMMOPS、1％的吐温20、0.5mM的EDTA，pH7.3以及10μl的血清样品。将样品最后加入并且在加入后混合各孔并使用乙醇润湿的移液器吸头除去溶液中的泡沫。使用Chameleon96孔微平板荧光仪(Bioscan)每7.5分钟监测荧光(激发485nm/发射535nm)的提高2小时。该底物在溶葡球菌素对其进行蛋白水解切割时给出荧光产物。
表4：显示了使用本发明的各种不同阴离子核心组合物配制的溶葡球菌素的PK特征。
实施例44：各种治疗肽与本发明的阴离子核心组合物的结合：可在细胞内发挥作用并且包含使其能穿透细胞膜的碱性氨基酸残基的抗炎肽(SEQIDNO：2；SEQIDNO：7；SEQIDNO：31)。使它们穿透细胞膜的相同特性使其结合于本发明的载体。使用这些肽进行了与本发明的五种不同的阴离子核心载体的结合研究。在本研究中对下列无金属载体进行测试：CSPEG104G、HPPEG105G、20PLPEG1030DTPA、20PLPEG1030DTPASO、20PLPEG1030DTPASF和20PLPEG1030DTPAPO。对于本研究，使用肽(0.02mg)加载250μl溶液(100mMHEPES/100mMNaCl)中的0.1mg(用于20％加载)或1mg(用于2％加载)的各载体并在室温下孵育两小时。分析重复进行两次。溶液均在13000rpm下离心12分钟以排除可能干扰分析的沉淀物的可能性。上清液使用100kDaMWCO膜(纤维素)以13000rpm进行12分钟过滤以除去载体-肽复合物(结合的)。通过HPLC分析对滤液(游离肽)进行分析。下表5显示对于大多数肽而言具有PEG的肝素是最佳载体，但任何阴离子载体可用于SEQIDNO：2的肽。
表5：显示了不与载体结合的(游离)和剩余的结合于载体的肽的总肽百分比。
实施例45：SEQIDNO：2和本发明的阴离子核心载体组合物之间相互作用的Kd测定：SEQIDNO：2是IKKγNEMO结合域(NBD)抑制肽，由于它抑制NFkB激活而可用于各种不同的炎性疾病中。对NBD和各种载体之间的解离常数(Kd)进行了测定。使用下列载体在无多价金属离子的情况下对NBD的Kd进行了测量：HPPEG105G、20PLPEG1030-DTPASO和20PLPEG1030DTPAPO。HPPEG105G和20PLPEG1030DTPAPO使用100-300％的NBD进行加载以测量Kd。20PLPEG1030DTPASO使用50-150％的NBD进行加载。如上通过HPLC对所有未结合的NBD进行测量。利用游离和结合的信息绘制Scatchard图(y-轴为结合值/游离和x-轴为结合)。从Scatchard图计算Kd和载体容量(斜率为-1/Kd和x截距为容量)并将结果总结于表6中。
表6：显示了各种载体对NBD的Kd和容量。
载体 HPPEG105G 20PLPEG1030DTPASO 20PLPEG1030DTPAPO
批号# 20090825 20090831b 20090902
容量 32位点 72位点 112位点
Kd 925nM 2.4μM 1.5μM
实施例46：肝素结合(HB)-表皮生长因子(-EGF)与本发明载体的结合。HB-EGF是表皮生长因子EGF-相关的生长因子，其通过EGF受体传导信号并且刺激平滑肌细胞(SMC)、成纤维细胞、上皮细胞和角质形成细胞的增殖。HB-EGF在多种细胞类型和组织，包括血管内皮细胞和SMC、巨噬细胞、骨骼肌、角质形成细胞和特定的肿瘤细胞中表达。HB-EGF特异性结合肝素和硫酸肝素蛋白聚糖的能力明显不同于其它EGF样分子，并且可能与HB-EGF对平滑肌细胞发挥的(相对于EGF)增强的促有丝分裂活性相关。人HB-EGF基因编码208个氨基酸的跨膜蛋白质，其可被蛋白水解切割以产生可溶性的HB-EGF。转化生长因子-α(TGF-α)是EGF相关多肽生长因子，其通过EGF受体传导信号并且刺激广泛的表皮细胞和上皮细胞的增殖。其由单核细胞、角质形成细胞和各种肿瘤细胞产生。TGF-α在培养细胞中诱导转化锚固独立性。人、鼠和大鼠TGF-α具有物种交叉反应性的。重组人TGF-α是与EGF具有约40％的序列同源性的50个氨基酸的多肽(5.5kDa)，包括形成3个分子内二硫键的6个保守的半胱氨酸残基。β细胞素和双调蛋白均为EGF家族的成员。其成员对于本发明的载体组合物是理想的加载分子的另一个生长因子家族是本领域已知具有超过12个成员的成纤维细胞生长因子(FGF)家族。这些生长因子意图用于加载在本发明的组合物中并非由于它们具有高于7的等电点，而是因为在它们的结构中具有能够结合羧酸根、硫酸根、磺酸根或磷酸根的阴离子结合位点。下表7显示了结合于本发明的载体的EGF。为进行本研究，使用加载EGF(0.01mg)的250μl溶液(100mMHEPES/100mMNaCl)中的2mg各载体并且在室温下孵育2小时。分析重复进行两次。溶液在13000rpm下离心12分钟以排除可能干扰分析的沉淀物的可能性。未观察到沉淀。上清液使用100kDaMWCO膜(纤维素)以13000rpm进行12分钟过滤以除去载体-肽复合物(结合的)。通过酶联免疫吸附分析(R&Dsystems；Minneapolis，MN)对滤液(游离EGF)进行分析。下表7显示了结合于本发明的载体的EGF。
表7：显示了未结合载体(游离)的和剩余的结合载体的EGF的总EGF的百分比。
实施例47：等电点(pI)高于7.3的加载分子(蛋白质或肽)在血液中受益于载体的保护。当加载分子与本发明的载体混合并注射进入动物体内时，等电点低于7.3的加载分子的血液循环时间与未制剂的对照相比未延长(表8)。然而，当加载分子与本发明的载体进行混合并注射进入动物体内时，等电点高于7.3的加载分子的血液循环时间与未制剂的对照相比延长(表8)。在一个实施方案中，加载分子必须具有高于7.3的pI以从本发明的载体受益。
表8：该表显示了碱性(pI＞7.3)加载分子与本发明的载体相结合时体内血液循环时间的延长。
*N.D.表示该水平未被检测或处于背景水平。所有背景信号已从读取值中减去。用于GLP1和肝素结合EGF的分析方法分别为来自于Millipore(Bedford，MA)和R&Dsystems(Minneapolis，MN)的酶联免疫吸附分析试剂盒并且根据制造商的说明而使用。用于溶葡球菌素的分析方法是当受到溶葡球菌素降解的时候增强荧光的FRET分析，并且使用荧光微板阅读仪(MolecularDevices，CA)监测分析溶液。用于PR39的分析方法是荧光素标记的PR39的直接荧光读数。
哺乳动物的脉管系统为内衬阴离子电荷并且血液成分(蛋白质和细胞)均为阴离子的。其它诸如甘油三酯的中性成分被带负电的脂蛋白所包封。令人吃惊和出乎意料的是，所述阴离子载体和阳离子加载分子(碱性加载分子)之间的离子相互作用的完整性在血液中得以维持。血液具有280mOsmol或约150mM盐的摩尔渗透压浓度，其可破坏离子相互作用。另外，血液包含阴离子蛋白质和为阴离子性的细胞，并可与加载分子竞争或结合加载分子并且使其脱离本发明的阴离子载体。阴离子血管壁还可将加载分子从载体上移除。上述结果仍然显示，这些生理作用力并未克服加载分子和本发明的阴离子载体之间的离子相互作用。
尽管本发明的优选的实施方案已在本文中示出并描述，本领域的技术人员应明了这样的实施方案仅以示例的形式提供。应当了解对本文所述的本发明的实施方案的各种不同的替代方案可被用于本发明的实施。应注意出于澄清本发明的范围的目的，本发明的组合物以模块进行描述，诸如聚合物骨架、保护链、阴离子基团和加载分子。各个模块并非意在成为其它模块的固有组分。例如，在特定的实施方案中，骨架包含用于形成维持该骨架完整的酰胺的羧基基团，这些羧基基团不同于组成其它模块如阴离子基团的羧基基团(即，在解释权利要求时不应使用循环论证)。在特定的实施方案中，天然情况下包含阴离子基团(羧基、硫酸根、磺酸根或磷酸根)的聚合物将根据本说明书的目的进行处理以包含本发明组合物的骨架(第一模块)和阴离子基团(第二模块)。在其它实施方案中，阴离子基团设想的组成有别于可存在于聚合物骨架中的任何阴离子基团。构成特定组成的模块以限定的方式彼此相关并且在对权利要求书的解释中各个模块不应互相重叠。

Claims (11)

1.一种组合物，其包含：
(a)聚合物，其包含
(i)选自多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸、多聚精氨酸、多聚谷氨酸、多聚天冬氨酸、多聚半胱氨酸、多聚丝氨酸、多聚苏氨酸、多聚酪氨酸、肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、硫酸角质素、卡拉胶、果胶、透明质酸、岩藻依聚糖、葡聚糖、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酸和聚烯丙胺的聚合物骨架；
(ii)多个聚乙二醇或甲氧基聚乙二醇链，其中各链通过单一连接共价连接于所述聚合物骨架；
(iii)多个阴离子基团，各个阴离子基团包含一个或多个各自独立地选自硫酸根、磺酸根、磷酸根和羧基的阴离子部分，所述阴离子基团通过单一化学键与所述聚合物骨架的单体单元共价键合；以及
(b)在不存在中间金属离子的情况下通过静电相互作用直接连接于所述聚合物的阴离子基团的加载分子；
其中所述加载分子
(i)包含细胞穿透肽；
(ii)包含阴离子结合域；或
(iii)具有高于7.3的等电点；
其中所述组合物具有低于100nm的直径。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述加载分子选自：(i)肽；(ii)蛋白质；以及(iii)有机小分子。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述加载分子是包含5-10个氨基酸的细胞穿透连续序列的肽或蛋白质，该序列中碱性氨基酸赖氨酸和精氨酸的数目减去酸性氨基酸谷氨酸和天冬氨酸的数目等于2或更大。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述肽中的细胞穿透连续序列由选自：i)Lys-Lys-Lys-Lys，2)Lys-Lys-Lys-Arg，3)Lys-Lys-Arg-Lys，4)Lys-Lys-Arg-Arg，5)Lys-Arg-Arg-Lys，6)Lys-Arg-Arg-Arg，以及7)Arg-Arg-Arg-Arg的序列组成，其中任何氨基酸为D或L异构体并且所述序列的所示的定向为氨基至羧基或羧基至氨基。
5.根据权利要求1任一项所述的组合物，其中所述加载分子包含选自SEQIDNO:1-59、溶葡球菌素、表皮生长因子(EGF)、干扰素、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)，转化生长因子(TGF)、神经生长因子(NGF)以及血小板源性生长因子(PDGF)的试剂；或者
选自SEQIDNO:1的最后11个氨基酸，SEQIDNO:5的最后8个氨基酸，SEQIDNO:7的最后12个氨基酸，SEQIDNO:9的最后10个氨基酸和SEQIDNO:10的最后14个氨基酸的试剂；或者
选自SEQIDNO:1-11的抗炎剂；或者
选自溶葡球菌素、干扰素和SEQIDNO:12-45的抗感染剂；或者
选自端值包括在内的SEQIDNO:31-34、46-49、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)，转化生长因子(TGF)、神经生长因子(NGF)以及血小板源性生长因子(PDGF)的生长因子或抗凋亡剂；或者
选自SEQIDNO:50-59和干扰素的生长抑制剂。
6.根据权利要求1-5任一项所述的组合物，其中所述聚合物骨架是多聚赖氨酸，且所述阴离子基团是羧基。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述加载分子选自SEQIDNO:26-29、32-34、EGF和HGF。
8.根据权利要求1-5任一项所述的组合物，其中所述聚合物骨架是软骨素。
9.根据权利要求1-2和5-6任一项所述的组合物，其中所述加载分子是肝素结合EGF。
10.根据权利要求1-2和5-6任一项所述的组合物，其中所述加载分子是溶葡球菌素。
11.根据权利要求1-2和5-6任一项所述的组合物，其中所述加载分子是SEQIDNO:31。
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