ES2713402T3 - Procedimiento de producción de aceites de saturación baja - Google Patents

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ES2713402T3 ES13732032T ES13732032T ES2713402T3 ES 2713402 T3 ES2713402 T3 ES 2713402T3 ES 13732032 T ES13732032 T ES 13732032T ES 13732032 T ES13732032 T ES 13732032T ES 2713402 T3 ES2713402 T3 ES 2713402T3
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Abstract

Un procedimiento de producción de una composición de aceite de saturación baja que comprende: a) la mezcla de una fuente de triacilglicerol con una solución acuosa de una enzima saturasa en presencia de un emulsionante para obtener una emulsión, comprendiendo el triacilglicerol al menos un residuo de ácido graso saturado y al menos un residuo de ácido graso insaturado, y comprendiendo el emulsionante una sal alcalina de un ácido graso insaturado, b) la mezcla de un ácido acuoso con la emulsión para obtener una mezcla, en la que el ácido se encuentra en una cantidad suficiente para obtener un pH de aproximadamente 1-4 y convertir el emulsionante en un ácido graso insaturado libre y una sal, y c) la separación de la mezcla para obtener un aceite y una fase acuosa, comprendiendo el aceite la composición de aceite de saturación baja.

Description

DESCRIPCION
Procedimiento de produccion de aceites de saturacion baja
Referencia cruzada a aplicaciones relacionadas
Campo
En la presente memoria se proporciona un procedimiento enzimatico de produccion de aceites de saturacion baja a partir de triacilglicerol. El alcance de la presente invencion esta definido por el procedimiento de las reivindicaciones. Las enzimas usadas en los procedimientos de la presente memoria son enzimas saturasa. Los aceites producidos por los procedimientos de la presente memoria pueden ser usados en productos alimenticios.
Antecedentes
Es sabido que las dietas con altos niveles de grasas saturadas elevan el colesterol en sangre y que aumentan el riesgo de enfermedades cardiovasculares. Por lo tanto, es deseable disminuir la cantidad de grasas saturadas en los productos de consumo. La patente estadounidense n° 8.153.391 y la patente estadounidense n° 8.357.503 describen enzimas saturasa ejemplares que son utiles en la hidrolisis de residuos de acidos grasos saturados a partir de fuentes de triacilglicerol para obtener aceites de saturacion baja.
En ciertos aspectos, es deseable someter el aceite de saturacion baja hidrolizado a un desgomado enzimatico para eliminar los fosfolfpidos y los metales traza para producir un aceite deseado de larga vida util. Es importante recuperar los aceites de manera eficiente y rentable; en particular, cuando los procedimientos se llevan a cabo a escala de planta piloto o a escala industrial.
Ciertos emulsionantes usados para facilitar el procedimiento de hidrolisis pueden interferir en la recuperacion del aceite de saturacion baja al usar un refinado caustico al final de los procedimientos de hidrolisis y/o desgomado. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar un procedimiento para la produccion rentable de una composicion de aceite de saturacion baja a partir de una fuente de triacilglicerol.
Compendio de la invencion
En un aspecto, la invencion proporciona un procedimiento de produccion de una composicion de aceite de saturacion baja que comprende a) la mezcla de una fuente de triacilglicerol con una solucion acuosa de una enzima saturasa en presencia de un emulsionante para obtener una emulsion, comprendiendo el triacilglicerol al menos un residuo de acido graso saturado y al menos un residuo de acido graso insaturado, y comprendiendo el emulsionante un sal alcalina de un acido graso insaturado, b) la mezcla de un acido acuoso con la emulsion para obtener una mezcla, en la que el acido se encuentra en una cantidad suficiente para obtener un pH de aproximadamente 1-4 y convertir el emulsionante en un acido graso insaturado libre y una sal, y c) la separacion de la mezcla para obtener un aceite y una fase acuosa, comprendiendo el aceite la composicion de aceite de saturacion baja.
En una realizacion, el procedimiento comprende, ademas, entre las etapas b) y c): 1) la mezcla de una solucion acuosa de una base con la mezcla de la etapa b) para obtener una mezcla que tiene un pH de aproximadamente 4-9; 2) la mezcla de una enzima fosfolipasa seleccionada entre PLA1, PLA2, PLC y una combinacion de las mismas con la mezcla de la etapa c) para obtener una mezcla que comprende un aceite desgomado y una fase acuosa; 3) la separacion del aceite desgomado y la fase acuosa para obtener un aceite desgomado separado; y 4) la mezcla del aceite desgomado separado con una solucion acuosa de acido para obtener una mezcla que comprende una fase oleosa y una fase acuosa, encontrandose el acido en una cantidad suficiente para convertir el emulsionante en un acido graso insaturado libre y una sal.
En otra realizacion, el triacilglicerol comprende al menos un residuo de acido palmttico.
En otra realizacion, la enzima saturasa comprende una enzima palmitasa. En otra realizacion, la enzima saturasa i) esta codificada por una secuencia de acidos nucleicos que comprende la SEC ID N°: 3, o ii) comprende una secuencia de aminoacidos de la SEC ID N°:4.
En otra realizacion, el aceite que comprende la composicion de aceite de saturacion baja es sometido a fraccionamiento para separar el acido graso saturado libre y el aceite de saturacion baja. En una realizacion adicional, el fraccionamiento se realiza i) enfriando el aceite entre -20 y 20°C para solidificar el acido graso saturado libre, o ii) enfriando el aceite entre -10 y 10°C para solidificar el acido graso saturado libre.
En otra realizacion, la cantidad de base en la etapa 1) es suficiente para obtener un pH entre aproximadamente 4,5 y 7.
En otra realizacion, la fuente de triacilglicerol comprende un aceite algal, aceite vegetal o un aceite de origen animal, o aceite de soja. En otra realizacion, el emulsionante comprende oleato de potasio, oleato de sodio o una combinacion de los mismos. En una realizacion, el emulsionante es oleato de potasio.
En otra realizacion, el acido es acido fosforico, acido acetico, acido cftrico, acido tartarico, acido succmico, o una mezcla de los mismos. En otra realizacion, la base es hidroxido sodico, hidroxido potasico o una mezcla de los mismos.
En otra realizacion, la mezcla de la enzima saturasa con la fuente de triacilglicerol se realiza a una temperature entre 20 y 50°C.
En la presente memoria se da a conocer un procedimiento de produccion de una composicion de aceite de saturacion baja a partir de una fuente de triacilglicerol que comprende a) la mezcla de una fuente de triacilglicerol con una solucion acuosa de una enzima saturasa en presencia de un emulsionante para obtener una emulsion, comprendiendo el triacilglicerol al menos un residuo de acido graso saturado y al menos un residuo de acido graso insaturado, y comprendiendo el emulsionante una sal alcalina de un acido graso insaturado, b) la mezcla de un acido acuoso con la emulsion, en la que el acido se encuentra en una cantidad suficiente para convertir el emulsionante en un acido graso insaturado libre y una sal, c) la separacion de la mezcla para obtener un aceite y una fase acuosa. La etapa a) de mezcla se lleva a cabo en condiciones en las que la enzima saturasa esta activa. En ciertas realizaciones, el procedimiento comprende, ademas, el fraccionamiento de la fase oleosa para separar el acido graso saturado libre y la composicion de aceite de saturacion baja.
En la presente memoria se da a conocer un procedimiento de produccion de una composicion oleosa baja en palmitato a partir de una fuente de triacilglicerol que comprende a) la mezcla de una fuente de triacilglicerol con una solucion acuosa de una enzima palmitasa en presencia de un emulsionante para obtener una emulsion, en la que el triacilglicerol comprende al menos un residuo de acido graso palmitato y al menos un residuo de acido graso insaturado, y el emulsionante comprende una sal alcalina de un acido graso insaturado, b) la mezcla de un acido acuoso con la emulsion, encontrandose el acido en una cantidad suficiente para convertir el emulsionante en un acido graso insaturado libre y una sal, c) la separacion de una fase oleosa de una fase acuosa. En ciertas realizaciones, el procedimiento comprende, ademas, el fraccionamiento de la fase oleosa para separar el acido graso palmitato libre y la composicion de aceite de saturacion baja.
En ciertas realizaciones, los procedimientos aqu proporcionados comprenden, ademas, una etapa de desgomado del aceite. En ciertas realizaciones, la etapa de desgomado comprende el desgomado con agua, el desgomado con acido o el desgomado enzimatico. En los procedimientos de la presente memoria puede emplearse cualquier metodo de desgomado conocido para un experto en la tecnica. Se describen metodos ejemplares de desgomado en la patente estadounidense n° 4.049.686, la patente estadounidense n° 4.698.185, la patente estadounidense n° 5.239.096, la patente estadounidense n° 5.264.367, la patente estadounidense n° 5.286.886, la patente estadounidense n° 5.532.163, la patente estadounidense n° 6.001.640, la patente estadounidense n° 6.103.505, la patente estadounidense n° 6.127.137, la patente estadounidense n° 6.143.545, la patente estadounidense n° 6.172.248, la patente estadounidense n° 6.548.633, la patente estadounidense n° 7.226.771, la patente estadounidense n° 7.312.062, la patente estadounidense n° 7.494.676, la patente estadounidense n° 7.713.727, la patente estadounidense n° 8.192.782, la publicacion estadounidense n° 2008/0182322, la publicacion estadounidense n° 2009/0069587 y la publicacion estadounidense n° 2011/0136187.
El procedimiento divulgado en la presente memoria de produccion de una composicion de aceite de saturacion baja a partir de un triacilglicerol comprende a) la mezcla de una fuente de triacilglicerol con una solucion acuosa de una enzima saturasa en presencia de un emulsionante para obtener una emulsion, comprendiendo el triacilglicerol al menos un residuo de acido graso saturado and al menos un residuo de acido graso insaturado, y comprendiendo el emulsionante una sal alcalina de un acido graso insaturado, b) la mezcla de una solucion acuosa de un acido con la emulsion para obtener una emulsion acida que tiene un pH menor de aproximadamente 4, c) la mezcla de una solucion acuosa de una base para obtener una mezcla que tiene un pH de aproximadamente 4-9, d) la mezcla de una enzima fosfolipasa seleccionada entre PLA1, PLA2, PLC o una combinacion de los mismos con la mezcla de la etapa c) para obtener una mezcla que comprende un aceite desgomado y una fase acuosa, e) la separacion del aceite desgomado y la fase acuosa para obtener un aceite desgomado separado, f) la mezcla del aceite desgomado separado con una solucion acuosa de acido para obtener una mezcla que comprende una fase oleosa y una fase acuosa, encontrandose el acido en una cantidad suficiente para convertir el emulsionante en un acido graso insaturado libre y una sal, y g) la separacion de una fase oleosa de la mezcla de la etapa f), comprendiendo el aceite una composicion de aceite de saturacion baja. La etapa a) de mezclado se lleva a cabo en condiciones en las que la enzima saturasa es activa.
En ciertas realizaciones, el aceite separado es fraccionado para separar el acido graso saturado libre y la composicion de aceite de saturacion baja.
El procedimiento dado a conocer en la presente memoria para la produccion de una composicion baja en aceite palmftico comprende a) la mezcla de una fuente de triacilglicerol con una solucion acuosa de una enzima palmitasa en presencia de un emulsionante para obtener una emulsion, comprendiendo el triacilglicerol al menos un residuo de acido graso palmftico y al menos un residuo de acido graso insaturado, y comprendiendo el emulsionante una sal alcalina de un acido graso insaturado, b) la mezcla de una solucion acuosa de un acido con la emulsion para obtener una emulsion acida que tiene un pH menor de aproximadamente 4, c) la mezcla de una solucion acuosa de una base para obtener una mezcla que tiene un pH de aproximadamente 4-9, d) la mezcla de una enzima fosfolipasa seleccionada entre PLA1, PLA2, PLC o una combinacion de los mismos con la mezcla de la etapa c) para obtener una mezcla que comprende un aceite desgomado y una fase acuosa, e) la separacion del aceite desgomado y la fase acuosa para obtener un aceite desgomado separado, f) la mezcla del aceite desgomado separado con una solucion acuosa de acido para obtener una mezcla que comprende una fase oleosa y una fase acuosa, encontrandose el acido en una cantidad suficiente para convertir el emulsionante en un acido graso insaturado libre y una sal, y g) la separacion de una fase oleosa de la mezcla de la etapa f), comprendiendo la fase oleosa una composicion baja en aceite palmftico. La etapa a) de mezclado se lleva a cabo en condiciones en las que la enzima palmitasa es activa. En ciertas realizaciones, la fuente de triacilglicerol usada en los procedimientos de la presente memoria es aceite de soja.
Enzimas saturasa ejemplares, que incluyen las enzimas palmitasa, para ser usadas en los procedimientos pueden ser obtenidas mediante metodos conocidos en la tecnica; por ejemplo, los metodos descritos en la patente estadounidense n° 8.153.391 y en la patente estadounidense n° 8.357.503.
En ciertas realizaciones, los procedimientos proporcionados en la presente memoria pueden ser adaptados para una produccion a escala industrial de aceites de saturacion baja.
Los aceites de saturacion baja, incluyendo los aceites con bajo contenido palmftico, tales como aceite de soja con bajo contenido palmftico, obtenidos por los procedimientos aqu proporcionados son utiles en productos alimenticios como aceite embotellado, aderezos para ensalada, mayonesa, cremas untables y aceites de cocina.
En ciertas realizaciones, en la presente memoria se proporciona un aceite de soja con bajo contenido palmftico, conteniendo el aceite de soja menos de aproximadamente un 5% de acido palmftico con respecto al peso total del aceite de soja. En ciertas realizaciones, el aceite de soja con bajo contenido palmftico contiene aproximadamente un 0,5-5% de acido palmftico con respecto al peso total del aceite de soja.
Breve descripcion de los dibujos
La Fig. 1 ilustra esquematicamente un procedimiento ejemplar para la produccion de aceites de saturacion baja. Descripcion detallada
Descripciones
Segun se usa en la presente memoria, el termino “saturasa” se refiere a una enzima que hidroliza esteres de acidos grasos saturados, pudiendo ser los esteres hidrolizados esteres de acidos grasos saturados y glicerol, umbeliferol y otros alcoholes.
Segun se usa en la presente memoria, el termino “palmitasa” se refiere a una enzima que hidroliza el acido palmftico, procedente, por ejemplo, de la cadena principal de glicerol. En la patente estadounidense n° 8.153.391 y la patente estadounidense n° 8.357.503 se describen saturasas ejemplares, incluyendo las enzimas palmitasa.
En ciertas realizaciones, las saturasas usadas en la presente memoria hidrolizan selectivamente al menos 45%, 50%, 55%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de los acidos grasos saturados. En otro aspecto, las palmitasas usadas en la presente memoria hidrolizan selectivamente acidos grasos de modo que al menos 45%, 50%, 55%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de acidos grasos hidrolizados sean acido palmftico. En otro aspecto, las estearatasas usadas en la presente memoria hidrolizan selectivamente los acidos grasos de modo que al menos 45%, 50%, 55%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de los acidos grasos hidrolizados sean acido estearico.
En ciertas realizaciones, las enzimas saturasa usadas en la presente memoria hidrolizan selectivamente un acido graso saturado— por ejemplo, un acido palmftico o un acido estearico—, a partir de una posicion Sn1, Sn2, y/o Sn3. Ejemplos de acidos grasos saturados que pueden ser hidrolizados en los procedimientos descritos en la presente memoria incluyen acidos grasos saturados que contienen 2-24 atomos de carbono. Acidos ejemplares incluyen, sin limitacion:
Caproico: CH3(CH2)4COOH
Capnlico: CH3(CH2^COOH
Caprico: CH3(CH2)aCOOH
Undecanoico: CH3(CH2)gCOOH
Laurico: (acido dodecanoico): CH3(CH2)10COOH
Minstico: (acido tetradecanoico): CH3(CH2)12COOH
Pentadecanoico: CH3(CH2)13c Oo H
Palmftico: (acido hexadecanoico): CH3(CH2) i4COOH
Margarico: CH3(CH2)i5COOH
Estearico (acido octadecanoico): CH3(CH2) i6COOH
Araqmdico (acido eicosanoico): CH3(CH2)i8COOH
Behenico: CH3(CH2)2oCOOH
Segun se usa en la presente memoria, “aceite de soja con bajo contenido palmftico” se refiere al aceite de soja obtenido despues del tratamiento con una enzima saturasa en los procedimientos descritos en la presente memoria. En ciertas realizaciones, el aceite de soja con bajo contenido palmftico contiene aproximadamente un 0,5-5% de acido palmftico con respecto al peso total del aceite de soja.
Segun se usa en la presente memoria, “aceite desgomado” se refiere a un aceite obtenido tras la eliminacion de la mayor parte de los fosfoftpidos y las lecitinas (denominados colectivamente gomas) del aceite. Los procedimientos usados mas comunmente en la industria para el desgomado de un aceite son el desgomado en agua, el desgomado en acido, el refinado caustico y el desgomado enzimatico. Se describen procedimientos ejemplares en la patente estadounidense n° 4.049.686, la patente estadounidense n° 4.698.185, la patente estadounidense n° 5.239.096, la patente estadounidense n° 5.264.367, la patente estadounidense n° 5.286.886, la patente estadounidense n° 5.532.163, la patente estadounidense n° 6.001.640, la patente estadounidense n° 6.103.505, la patente estadounidense n° 6.127.137, la patente estadounidense n° 6.143.545, la patente estadounidense n° 6.172.248, la patente estadounidense n° 6.548.633, la patente estadounidense n° 7.226.771, la patente estadounidense n° 7.312.062, la patente estadounidense n° 7.494.676, la patente estadounidense n° 7.713.727 y la patente estadounidense n° 8.192.782, y la publicacion estadounidense n° 2008/0182322, la publicacion estadounidense n° 2009/0069587; y la publicacion estadounidense n° 2011/0136187.
Segun se usa en la presente memoria, “aceite de saturacion baja” se refiere al aceite obtenido despues de la eliminacion de uno o mas residuos acidos saturados de un resto de triacilglicerol en el aceite.
Segun se usa en la presente memoria, “aceite con bajo contenido palmftico” se refiere al aceite obtenido despues de la eliminacion de uno o mas residuos de acido palmftico de un resto de triacilglicerol en el aceite.
Segun se usa en la presente memoria, “fosfolipasas” se refiere a enzimas que presentan actividad con los fosfoftpidos. Segun se describe, por ejemplo, en la publicacion estadounidense n° 2009/0069587, los tipos de fosfolipasas se basan en la posicion en la molecula de fosfoftpido en la que reacciona la enzima, y son denominadas PLC, PLD y PLA, que incluye PLA1 y PLA2. En ciertas realizaciones, las enzimas PLA incluyen aciltransferasas, incluyendo, sin limitacion, las descritas en la patente estadounidense n° 8.192.782 y la publicacion estadounidense n° 2011/0136187.
En la presente memoria se da a conocer un procedimiento para la produccion de una composicion de aceite de saturacion baja que comprende a) la mezcla de una fuente de triacilglicerol con una solucion acuosa de una enzima saturasa en presencia de un emulsionante para obtener una emulsion, comprendiendo el triacilglicerol al menos un residuo de acido graso saturado y al menos un residuo de acido graso insaturado, y comprendiendo el emulsionante una sal alcalina de un acido graso insaturado, b) la mezcla de un acido acuoso con la emulsion, encontrandose el acido en una cantidad suficiente para convertir el emulsionante en un acido graso insaturado libre y una sal, c) la separacion de una fase oleosa y una fase acuosa. En ciertas realizaciones, el procedimiento comprende, ademas, el fraccionamiento de la fase oleosa para separar el acido graso saturado libre y la composicion de aceite de saturacion baja. La etapa a) de mezclado se lleva a cabo en condiciones de reaccion en las que la enzima saturasa es activa. Tales condiciones de reaccion, incluyendo las condiciones de pH y temperatura, son conocidas para un experto en la tecnica.
En la presente memoria se da a conocer un procedimiento para la produccion de una composicion baja en aceite palmftico que comprende a) la mezcla de una fuente de triacilglicerol con una solucion acuosa de una enzima palmitasa en presencia de un emulsionante para obtener una emulsion, comprendiendo el triacilglicerol al menos un residuo de acido palmftico y al menos un residuo de acido graso insaturado, y comprendiendo el emulsionante una sal alcalina de un acido graso insaturado, b) la mezcla de un acido acuoso con la emulsion, encontrandose el acido en una cantidad suficiente para convertir el emulsionante en un acido graso insaturado libre y una sal, c) la separacion de una fase oleosa y una fase acuosa. En ciertas realizaciones, el procedimiento comprende, ademas, el fraccionamiento de la fase oleosa para separar el acido palmftico y la composicion baja en aceite palmftico.
El procedimiento dado a conocer en la presente memoria para la produccion de una composicion de aceite de saturacion baja comprende a) la mezcla de una fuente de triacilglicerol con una solucion acuosa de una enzima saturasa en presencia de un emulsionante para obtener una emulsion, comprendiendo el triacilglicerol al menos un residuo de acido graso saturado y al menos un residuo de acido graso insaturado, y comprendiendo el emulsionante una sal alcalina de un acido graso insaturado, b) la mezcla de una solucion acuosa de un acido con la emulsion para obtener una emulsion acida que tiene un pH menor de aproximadamente 4, c) la mezcla de una solucion acuosa de una base para obtener una mezcla que tiene un pH de aproximadamente 4-9, d) la mezcla de una enzima fosfolipasa seleccionada entre PLA1, PLA2, PLC y una combinacion de las mismas con la mezcla de la etapa c) para obtener una mezcla que comprende un aceite desgomado y una fase acuosa, e) la separacion del aceite desgomado y la fase acuosa para obtener un aceite desgomado separado, f) la mezcla del aceite desgomado separado con una solucion acuosa de acido para obtener una mezcla que comprende una fase oleosa y una fase acuosa, encontrandose el acido en una cantidad suficiente para convertir el emulsionante en un acido graso insaturado libre y una sal, y g) la separacion de la fase oleosa de la mezcla de la etapa f), comprendiendo la fase oleosa una composicion de aceite de saturacion baja.
El procedimiento dado a conocer en la presente memoria para la produccion de una composicion baja en aceite palmftico comprende a) la mezcla de una fuente de triacilglicerol con una solucion acuosa de una enzima palmitasa en presencia de un emulsionante para obtener una emulsion, comprendiendo el triacilglicerol al menos un residuo de acido graso palmftico y al menos un residuo de acido graso insaturado, y comprendiendo el emulsionante una sal alcalina de un acido graso insaturado, b) la mezcla de una solucion acuosa de un acido con la emulsion para obtener una emulsion acida que tiene un pH menor de aproximadamente 4, c) la mezcla de una solucion acuosa de una base para obtener una mezcla que tiene un pH de aproximadamente 4-9, d) la mezcla de una enzima fosfolipasa seleccionada entre PLA1, PLA2, PLC y una combinacion de las mismas con la mezcla de la etapa c) para obtener una mezcla que comprende un aceite desgomado y una fase acuosa, e) la separacion del aceite desgomado y la fase acuosa para obtener un aceite desgomado separado, f) la mezcla del aceite desgomado separado con una solucion acuosa de acido para obtener una mezcla que comprende una fase oleosa y una fase acuosa, encontrandose el acido en una cantidad suficiente para convertir el emulsionante en un acido graso insaturado libre y una sal, y g) la separacion de la fase oleosa de la mezcla de la etapa f), comprendiendo la fase oleosa una composicion baja en aceite palmftico. En ciertas realizaciones, la fase oleosa separada es fraccionada para separar el acido palmftico y la composicion baja en aceite palmftico.
En ciertas realizaciones, los procedimientos proporcionados en la presente memoria pueden ser adaptados para una produccion a escala industrial de aceites de saturacion baja.
En ciertas realizaciones, la cantidad de acido en la etapa b) es suficiente para obtener un pH de aproximadamente 1­ 4, 2-4 o 3-4. En ciertas realizaciones, la cantidad de base en la etapa c) es suficiente para obtener un pH de aproximadamente 4-6,5, 5,5-7, 7-8 u 8-9.
En ciertas realizaciones, la fase oleosa separada es enfriada entre -20 y 20°C, entre -15 y 15°C, entre -10 y 10°C, entre -5 y 5°C, o entre 0 y 5°C para solidificar el acido graso saturado, incluyendo acido palmftico. El acido graso saturado solidificado es separado mediante metodos conocidos en la tecnica para obtener la composicion de aceite de saturacion baja.
Las fuentes de triacilglicerol que pueden ser usadas en los metodos proporcionados en la presente memoria incluyen, sin limitacion, cualquier aceite algal, aceite vegetal, o una grasa o aceite de origen animal; por ejemplo, aceite de Neochloris oleoabundans, aceite de Scenedesmus dimorphus, aceite de Euglena gracilis, aceite de Phaeodactylum tricornmutum, aceite de Pleurochrysis carterae, aceite de Prymnesium parvum, aceite de Tetraselmis chui, aceite de Tetraselmis suecica, aceite de Isochrysis galbana, aceite de Nannochloropsis salina, aceite de Botryococcus braunii, aceite de Dunaliella tertiolecta, aceite de la especie Nannochloris, aceite de la especie Spirulina, aceite de Chlorophycease (algas verdes) y aceite de Bacilliarophy, aceite canola, aceite de ricino, aceite de coco, aceite de cilantro, aceite de mafz, aceite de semilla de algodon, aceite de avellana, aceite de semilla de canamo, aceite de linaza, aceite de Limmanthes alba, aceite de oliva, aceite de palma, aceite de palmiste, aceite de cacahuete, aceite de colza, aceite de salvado de arroz, aceite de cartamo, aceite de sasanqua, aceite de soja, aceite de semilla de girasol, tall oil, aceite de camelia, variedades de aceites naturales que tienen composiciones de acidos grasos alteradas a traves de organismos modificados geneticamente (GMO) o de reproduccion genetica tradicional, tales como aceites ricos en acido oleico, pobres en acido linolenico o de saturacion baja (aceite canola rico en acido oleico, aceite de soja pobre en acido linolenico o aceites de girasol ricos en acido estearico); grasas animales (sebo, manteca, grasa de mantequilla y grasa de pollo), aceites de pescado (aceite de eulacon, aceite de hftgado de bacalao, aceite de reloj anaranjado, aceite de sardina, aceite de arenque y aceite de sabalo atlantico), o mezclas de cualesquiera de los anteriores. En una realizacion, la fuente de triacilglicerol en los procedimientos de la presente memoria es aceite de soja. En otra realizacion, las fuentes de triacilglicerol en los procedimientos de la presente memoria son aceites en bruto no desgomados o semiprocesados, incluyendo aceites de soja en bruto no desgomados o semiprocesados (desgomados, refinados qmmicamente, decolorados y/o desodorizados cuando se anade lecitina).
Los emulsionantes usados en los procedimientos de la presente memoria comprenden sales alcalinas de acidos grasos insaturados. En los procedimientos descritos en la presente memoria puede usarse cualquier sal alcalina de un acido graso insaturado conocida para un experto en la tecnica. En ciertas realizaciones, el emulsionante es una sal alcalina de un acido graso insaturado de cadena larga. En ciertas realizaciones, el emulsionante tiene un HLB mayor que 12, 14, 16 o 18. En ciertas realizaciones, el emulsionante tiene un HLB de 12-18, 12-16, 12-14, 14-18, 14­ 16 o 16-18. En ciertas realizaciones, el emulsionante tiene un HLB de 12, 14, 16 o 18. En ciertas realizaciones, el emulsionante es seleccionado entre oleato de sodio, oleato de potasio, linoleato de sodio, linoleato de potasio, linolenato de sodio, linolenato de potasio o una combinacion de los mismos. En una realizacion, el emulsionante es seleccionado entre oleato de potasio y oleato de sodio.
En ciertas realizaciones, la cantidad de emulsionante usada en los procedimientos de la presente memoria es aproximadamente 1-10%, 2-8%, 2-6%, 2-5% o 3-5% con respecto al peso total del aceite. En una realizacion, la cantidad de emulsionante usada es aproximadamente 1, 3, 5, 7 o 10% con respecto al peso total del aceite.
En ciertas realizaciones, el mezclado de la etapa a) comprende el mezclado por cizallamiento para obtener la emulsion. En ciertas realizaciones, el aceite o grasa se mezcla con el emulsionante antes de la adicion de la enzima saturasa. En ciertas realizaciones, la mezcla de aceite/grasa y emulsionante se homogeniza antes y/o despues de la adicion de la enzima para garantizar una emulsion uniforme.
En una realizacion, el mezclado por cizallamiento se efectua durante aproximadamente 5-30 minutos, aproximadamente 5-20 minutos, aproximadamente 5-15 minutos, aproximadamente 7-15 minutos, aproximadamente 7-12 minutos o aproximadamente 10 minutos con un mezclador de cizalla, tal como un Ultra Turrax® T-50. En otra realizacion, el mezclado por cizallamiento se efectua en un mezclador de cizalla en lrnea, tal como un DISPAX REACTOR durante menos de aproximadamente 1 minuto.
En ciertas realizaciones, la mezcla de reaccion de la etapa a) comprende aproximadamente entre un 1 y un 30% de agua con respecto al peso total de los reactivos. En ciertas realizaciones, la mezcla de reaccion de la etapa a) comprende aproximadamente del 1 al 20%, 1-15%, 1-10%, 1-5%, 5-25% o 10-25% de agua con respecto al peso total de los reactivos. En una realizacion, la mezcla de reaccion comprende aproximadamente un 1, 3, 5, 7, 10, 15, 17 o 20% de agua con respecto al peso total de los reactivos.
En ciertas realizaciones, el procedimiento proporcionado en la presente memoria reduce el contenido saturado, incluyendo el contenido de palmitato del aceite/grasa hasta aproximadamente un 15% o menos, un 10% o menos o un 5% o menos con respecto al peso total del aceite/grasa. En ciertas realizaciones, el contenido saturado, incluyendo el contenido de palmitato del aceite/grasa se reduce hasta aproximadamente un 10, 7, 5, 4, 3, 2, 1% o menos con respecto al peso total del aceite/grasa. En ciertas realizaciones, el procedimiento proporcionado en la presente memoria reduce el contenido saturado, incluyendo el contenido de palmitato del aceite/grasa hasta aproximadamente un 0,5-20%, 3-15%, 3-10%, 3-7%, 3-5%, 2-10%, 2-7%, 2-5%, 1-15%, 1-12%, 1-10%, 1-8%, 1-7% o 1-5%, 1-3%, 0,5­ 7%, 0,5-5%, 0,5-3% o menos.
En los procedimientos proporcionados en la presente memoria, puede usarse cualquier acido adecuado para ser usado en un producto alimenticio. Acidos ejemplares incluyen, sin limitacion acido fosforico, acido acetico, acido dtrico, acido tartarico, acido succmico y una mezcla de los mismos. En una realizacion, el acido es acido cftrico. Bases ejemplares para ser usadas en la presente memoria incluyen, sin limitacion, hidroxido sodico e hidroxido potasico.
En una realizacion, la enzima saturasa, incluyendo la enzima palmitasa, es anadida en una sola porcion. En una realizacion, la enzima saturasa, incluyendo la enzima palmitasa, es anadida en multiples porciones. En una realizacion, la enzima saturasa, incluyendo la enzima palmitasa, es anadida a la fuente de triacilglicerol a una temperatura entre aproximadamente 15 y 50°C, entre aproximadamente 20 y 40°C, entre aproximadamente 22 y 30°C o entre aproximadamente 22 y 25°C.
En ciertas realizaciones, los procedimientos proporcionados en la presente memoria comprenden, ademas, los procedimientos proporcionados en la presente memoria comprenden, ademas, una etapa de desgomado del aceite que comprende el desgomado con agua, el desgomado con acido o el desgomado enzimatico. En los procedimientos de la presente memoria puede usarse cualquier metodo de desgomado conocido para un experto en la tecnica. Se describen metodos ejemplares de desgomado are en la patente estadounidense n° 4.049.686, la patente estadounidense n° 4.698.185, la patente estadounidense n° 5.264.367, la patente estadounidense n° 5.532.163, la patente estadounidense n° 6.001.640, la patente estadounidense n° 6.103.505, la patente estadounidense n° 6.127.137, la patente estadounidense n° 6.143.545, la patente estadounidense n° 6.172.248, la patente estadounidense n° 6.548.633, la patente estadounidense n° 7.713.727, la patente estadounidense n° 7.226.771, la patente estadounidense n° 7.312.062, la patente estadounidense n° 7.494.676, la patente estadounidense n° 8.192.782, la publicacion estadounidense n° 2008/0188322, la publicacion estadounidense n° 2009/0069587, la publicacion estadounidense n° 2011/0136187.
Las cantidades de enzimas saturasa, palmitasa, PLA y PLC usadas en los procedimientos proporcionados en la presente memoria dependen de las condiciones de reaccion, del tipo de aceite y del tipo de enzima usado. En ciertas realizaciones, la cantidad de enzima usada se encuentra en el intervalo entre 10 y 20.000 unidades, entre 20 y 10.000 unidades, entre 50 y 5.000 unidades o entre 100 y 2.000 unidades, por 1 kg de aceite.
El procedimiento dado a conocer en la presente memoria para la produccion de una composicion baja en aceite palmftico comprende a) la mezcla de una fuente de triacilglicerol con una solucion acuosa de una enzima palmitasa en presencia de oleato de potasio para obtener una emulsion, comprendiendo el triacilglicerol al menos un residuo de acido palmftico y al menos un residuo de acido graso insaturado, b) la mezcla de una solucion acuosa de acido cftrico para ajustar el pH a menos de aproximadamente 4, en una realizacion a menos de aproximadamente 2, c) la mezcla de una solucion acuosa de hidroxido sodico para obtener una mezcla que tiene un pH de aproximadamente 4-9, en una realizacion aproximadamente 4,5-7, d) la mezcla de una enzima fosfolipasa seleccionada entre PLA1, PLA2, PLC y una combinacion de cualquiera de las dos PLA y de PLC para obtener una mezcla que comprende un aceite desgomado y una fase acuosa, e) la separacion del aceite desgomado y la fase acuosa, f) la mezcla del aceite desgomado con una solucion acuosa de acido cftrico para obtener una mezcla que comprende una fase oleosa y una fase acuosa, encontrandose el acido cftrico en una cantidad suficiente para convertir el oleato de potasio del aceite en un acido oleico libre y la sal citrato potasico, y g) la separacion de la fase oleosa, que comprende una composicion baja en aceite palmftico, acido palmftico y acido oleico libre. En ciertas realizaciones, la fase oleosa separada es fraccionada para separar el acido palmftico y la composicion baja en aceite palmftico.
En ciertas realizaciones, la fase oleosa separada es enfriada hasta 0-5°C para solidificar el acido palmftico. El acido palmftico solidificado es separado para obtener la composicion baja en aceite palmftico.
En ciertas realizaciones, la composicion de aceite de saturacion baja es sometida a etapas adicionales de procesamiento conocidas en la tecnica, que incluyen la decoloracion o la desodorizacion, segun pueda ser necesario o deseable, dependiendo del uso final para que el que este prevista la composicion oleosa.
Procedimientos ejemplares
En la FIG. 1 se ilustra un procedimiento ejemplar en un diagrama de flujo.
En un procedimiento ejemplar, se usan aproximadamente 1000 kg de aceite de soja en bruto. El aceite es calentado hasta aproximadamente 70°C y mezclado con un agitador de tanque para su homogenizacion. Si se usa como material de partida aceite no desgomado en bruto, no se anade lecitina alguna al aceite. Si se usan otras fuentes de aceite, incluyendo un aceite desgomado, se anaden hasta aproximadamente 50 kg de lecitina de soja (0 a 5% p/p de aceite) a aproximadamente 70°C y se forma una mezcla uniforme con un agitador de tanque. El aceite es enfriado hasta aproximadamente 20 a 50°C. Se bombean en el aceite aproximadamente 50 kg de enzima formulada con palmitasa a traves de un caudaftmetro de masas. Se bombean en el aceite aproximadamente 10 a 50 kg de agua (1 a 5% p/p de aceite) a traves de un caudaftmetro de masas. El aceite es bombeado a traves de un mezclador de cizalladura elevada produciendo una emulsion mecanica de agua en aceite en el tanque de reaccion 1. El aceite se mezcla durante aproximadamente 24 a 48 horas a una temperatura entre aproximadamente 20 y 50°C. Se anaden y se mezclan aproximadamente 30 a 50 kg de emulsionante de oleato de potasio (3 a 5% p/p de aceite). Se bombean en el aceite aproximadamente 50 kg de enzima formulada con palmitasa a traves de un caudaftmetro de masas. El aceite sera bombeado a traves de un segundo mezclador de cizalladura elevada, produciendo una emulsion mecanica de agua en aceite en el tanque de reaccion 2.
El aceite se mezcla durante aproximadamente 24 a 72 horas a una temperatura entre aproximadamente 25 y 40°C. Se anaden al aceite aproximadamente 50 partes por millon de Lecitase® Ultra (PLA1) (0,005% p/p de aceite) y/o aproximadamente 200 partes por millon de Purifine® PLC (0,02% p/p de aceite). El aceite se mezcla durante aproximadamente 1 a 4 horas. El aceite es bombeado a traves de un intercambiador de calor hasta aproximadamente 85°C, siendo centrifugado a continuacion. La fase mas ligera de aceite que contiene el acido palmftico y el oleato de potasio escindidos (1030 a 1050 kg) se separa de la fase pesada, que comprende gomas humedas y protema desnaturalizada (130 a 200 kg).
La capa oleosa es enfriada hasta aproximadamente 0 a 5°C y agitada lentamente durante aproximadamente 24 horas. Se deja que el acido graso palmftico solidifique, permitiendo el fraccionamiento del acido palmftico. Opcionalmente, se anaden 1 a 10 kg (0,1 a 1% p/p de aceite) de tierra de diatomeas para contribuir al filtrado del aceite tratado. El filtrado, que comprende el aceite con bajo contenido palmftico y el oleato de potasio (857 a 1008 kg), es separado del precipitado, que comprende acido palmftico y tierra de diatomeas (40 a 160 kg). El precipitado es calentado hasta aproximadamente 100°C y filtrado para obtener un filtrado que comprende acido palmftico (37 a 137 kg).
Se recoge el material retenido en el filtro que comprende tierra de diatomeas (1,3 a 13 kg).
Procesamiento del aceite tratado con palmitasa
Conversion de jabon en acido:
El filtrado que comprende el aceite con bajo contenido palmftico y oleato de potasio, descrito anteriormente, es calentado hasta aproximadamente 50 a 70°C en un tanque agitado. Se bombea en el aceite una solucion de acido cftrico a aproximadamente el 50% para convertir los jabones de oleato de potasio en acido oleico (12 a 20 kg al 50% p/p). En ciertas realizaciones, el tratamiento con acido para convertir los jabones de potasio en acido graso puede producirse opcionalmente inmediatamente despues de la etapa de centrifugado descrita mas arriba, antes del enfriamiento y la separacion de los acidos grasos palmfticos.
Decoloracion:
El aceite es calentado hasta aproximadamente 60°C en un tanque agitado, en el que se anaden aproximadamente 1 a 5 kg de tierra decolorante activada con acido (Tonsil Optimum FF o equivalente) como una suspension espesa. Se aplica un vacfo de aproximadamente 10 kPa (100 mBar) y el aceite es calentado hasta aproximadamente 90 a 120°C durante aproximadamente 30 minutos. El aceite es filtrado para obtener una fraccion oleosa que contiene aceite con bajo contenido palmftico y acidos grasos oleicos (851 a 1007 kg), y una fraccion solida que contiene tierra decolorante agotada (1,3 a 6,5 kg). En ciertas realizaciones, la extraccion del acido graso palmftico puede producirse despues del proceso de decoloracion antes de la etapa de desodorizacion.
Desodorizacion:
La fraccion oleosa es calentada hasta aproximadamente 250°C a 50 a 300 Pa (0,5 a 3 mBar), anadiendose aproximadamente 0,1 a 3% (p/p de aceite) de vapor durante aproximadamente 30 a 180 minutos. El aceite es enfriado hasta aproximadamente 100°C, anadiendose aproximadamente 1 a 25 ppm de acido dtrico al 50% para quelar cualquier metal traza. El vado se rompe con nitrogeno para prevenir la exposicion del aceite al aire. Tras descargar el aceite del equipo de vado, el aceite es filtrado a traves de una bolsa de 5 micrometros para eliminar los metales quelados. El aceite es almacenado bajo una capa de nitrogeno.
Del procedimiento se obtienen el aceite con bajo contenido palmftico refinado, decolorado y desodorizado (786 a 967,7 kg) y un destilado desodorizador que contiene acido graso oleico (39 a 65 kg). El destilado puede ser tratado con una solucion de KOH a aproximadamente el 50% para formar oleato de potasio, que ha de ser reutilizado en el procedimiento (10 a 20 kg).
Enzimas ejemplares usadas en el procedimiento
En la patente estadounidense n° 8.153.391 y la patente estadounidense n° 8.357.503 se describen una saturasa ejemplar, que incluye enzimas palmitasa, y metodos de obtencion de las enzimas.
Las enzimas ejemplares comprenden un polipeptido seleccionado del grupo constituido por polipeptidos sinteticos y recombinantes aislados que tienen una actividad de saturasa, incluyendo palmitasa, en el que el polipeptido
i) esta codificado por un acido nucleico que comprende una secuencia de acidos nucleicos que tiene una identidad de secuencias de al menos un 85% con respecto a la SEC ID N°: 1 y tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o mas, o la totalidad, de los cambios de residuos de bases enumerados en la Tabla A, la Tabla B o la Tabla C que siguen, codificando el acido nucleico al menos un polipeptido que tiene una actividad de saturasa, incluyendo palmitasa.
Tabla A
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Tabla B
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Tabla B-continuacion
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Tabla C
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o
ii) tiene una identidad de secuencias de al menos un 85% con respecto a la SEC ID N°: 2 en una region de al menos aproximadamente 100 residuos, y que tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o mas, o la totalidad, de los cambios de residuos de aminoacidos enumerados en la Tabla A, la Tabla B o la Tabla C anteriores, o
iii) comprende una secuencia de aminoacidos de la SEC ID N°: 2, pero tambien comprende al menos una de las modificaciones de residuos de aminoacidos D61A; D61E; R72E; R72K; E116A; E116Q; E116R; E116T; E116V; S133A; I151G; I151A; V163R; D164R, o una combinacion de las mismas, o
iv) comprende una secuencia de aminoacidos de la SEC ID N°: 2, pero tambien comprende al menos una de las modificaciones de residuos de aminoacidos I20L; V62S; G77P; V83C; D88H; Y113G; E116T; E116G; H140K; K146S; I167S; L180E; E194M; A211Q; S212Y; G215C; G215V; G215W; A218H; A218S; V223A; A225M; A225Q, o una combinacion de las mismas, o
v) comprende una secuencia de aminoacidos de la SEC ID N°: 2, pero tambien comprende las siguientes modificaciones de residuos de aminoacidos D61E; R72K; V83M, r 85Y, V163R y R172H.
En ciertas realizaciones, la secuencia de polipeptidos aqrn usada es codificada por un acido nucleico que comprende una secuencia de acidos nucleicos que tiene una identidad de secuencias de al menos 85%, 98%, 90%, 95% con respecto a la SEC ID N°: 1, y tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o mas, o la totalidad, de los cambios de residuos de bases enumerados en la Tabla A, la Tabla B o la Tabla C.
En ciertas realizaciones, la secuencia de polipeptidos aqrn usada tiene una identidad de secuencias de al menos 85%, 88%, 90%, 95% con respecto a la SEC ID N°:2, y tiene uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce o mas, o la totalidad, de los cambios de residuos de aminoacidos enumerados en la Tabla A, la Tabla B o la Tabla C.
Las secuencias de acidos nucleicos y polipeptidos a las que se hace referencia anteriormente son las siguientes:
SEC ID N°:1
atgctgaaaccgcctccctacggacgcctgctgcgcgaactggccgatatcccggccatcgtgacggcaccgttccggggcg ctgcgaaaatgggcaaactggcggatggcgagccggtactggtgctgcccggcttcctggccgacgacaacgccacctcggt gctgcgcaagaccttcgatgtcgcgggctttgcctgttcgggctgggaacgcggcttcaacctcggcattcgtggcgacctcgt ggaccggctggtcgaccggctgcgggcggtgtcggaggcggccggtggtcagaaggtgatcgtggtcggctggagcctcg gcggcctctatgcgcgcgagctgggccacaaggcgcccgaactgatccggatggtcgtcacgctcggcagtccgttcgcggg cgacctccacgccaaccatgcgtggaagatctacgaggcgatcaacagccacacggtcgacaacctgccgatcccggtcgatt tccagattaagccgccggtgcgcaccatcgcggtgtggtcgccgctcgacggggtggtggcgccggagacctcggaaggct cgcccgagcagtcggacgagcggctagagctggcggtgacccacatgggctttgccgcatcgaagaccggggccgaggct gtggtccggctggtcgcggcgcggctctag
SEC ID N°:2 (codificada por la SEC ID N°: 1):
codigo de 1 letra:
MLKPPPYGRLLRELADIPAIVTAPFRGAAKMGKLADGEPVLVLPGFLADDNATS VLRKTFDVAGFACSGWERGFNLGIRGDLVDRLVDRLRAVSEAAGGQKVIVVGW SLGGLYARELGHKAPELIRMVVTLGSPFAGDLHANHAWKIYEAINSHTVDNLPIP VDFQIKPPVRTIAVWSPLDGVVAPETSEGSPEQSDERLELAVTHMGFAASKTGAE AVVRLVAARL-
codigo de 3 letras:
Met Leu Lys Pro Pro Pro Tyr Gly Arg Leu Leu Arg Glu Leu AlaAsp Ile Pro Ala Ile Val Thr Ala Pro Phe Arg Gly Ala Ala Lys Met Gly Lys Leu Ala Asp Gly Glu Pro Val Leu Val Leu Pro Gly Phe LeuAla Asp Asp Asn Ala Tor Ser Val Leu Arg Lys Thr Phe Asp Val Ala Gly Phe Ala Cys Ser Gly Trp Glu Arg Gly Phe Asn Leu Gly Ile Arg Gly Asp Leu Val Asp Arg Leu Val Asp Arg Leu Arg Ala Val Ser GluAla Ala Gly Gly Gln Lys Val Ile Val Val Gly Trp Ser Leu Gly Gly Leu Tyr Ala Arg Glu Leu Gly His Lys Ala Pro Glu Leu Ile Arg MetVal Val Thr Leu Gly Ser Pro Phe Ala Gly Asp Leu His Ala Asn HisAla Trp Lys Ile Tyr Glu Ala Ile Asn Ser His Thr Val Asp Asn Leu Pro Ile Pro Val Asp Phe Gln Ile Lys Pro Pro Val Arg Thr Ile AlaVal Trp Ser Pro Leu Asp Gly Val Val Ala Pro Glu Tor Ser Glu Gly Ser Pro Glu Gln Ser Asp Glu Arg Leu Glu Leu Ala Val Thr His Met Gly Phe Ala Ala Ser Lys Thr Gly Ala Glu Ala Val Val Arg Leu ValAla Ala Arg Leu
SEC ID N°:3:
ATGCTCAAGCCCCCACCTTACGGCCGTCTGCTCCGCGAACTGGCTGATATCCCGG CGATCGTGACTGCTCCGTTCCGCGGCGCAGCCAAAATGGGCAAACTGGCTGATGG CGAGCCGGTACTGGTGCTGCCCGGCTTCCTGGCGGACGACAACGCGACCAGCGT GCTGCGGAAGACCTTCGAGGTCGCCGGCTTTGCGTGCAGCGGCTGGGAAAAGGG CTTCAACCTCGGCATTCGTGGCGACCTCATGGACTACCTGGTCGACCGCCTGCGC GCCGTGAGCGAGGCCGCGGGGGGGCAGAAGGTTATCGTGGTCGGCTGGAGTCT CGGCGGCCTCTACGCCCGGGAGCTTGGCCACAAGGCCCCCGAACTGATCAGGAT GGTCGTCACGCTCGGCTCTCCGTTCGCCGGCGACCTCCACGCGAACCATGCCTG GAAGATCTACGAGGCCATCAACTCCCACACGGTCGACAACCTGCCGATCCCGCGC GATTTCCAGATTAAGCCGCCGGTGCATACCATCGCCGTGTGGAGCCCGCTCGACG GGGTGGTGGCCCCGGAGACGAGCGAAGGCAGCCCCGAGCAGAGCGACGAGCGC TTGGAGCTGGCCGTGACCCACATGGGCTTTGCGGCTAGCAAGACCGGGGCGGAG GCAGTGGTCCGCCTGGTCGCCGCCCGCCTCTGA
SEC ID N°:4 (codificada por la SEC ID N°:3):
codigo de 1 letra:
MLKPPPYGRLLRELADIPAIVTAPFRGAAKMGKLADGEPVLVLPGFLADDNATS VLRKTFEVAGFACSGWEKGFNLGIRGDLMDYLVDRLRAVSEAAGGQKVNVGW SLGGLYARELGHKAPELIRMVVTLGSPFAGDLHANHAWKIYEAINSHTVDNLPIP RDFQIKPPVHTIAVWSPLDGVVAPETSEGSPEQSDERLELAVTHMGFAASKTGAE AVVRLVAARL-
codigo de 3 letras:
Met Leu Lys Pro Pro Pro Tyr Gly Arg Leu Leu Arg Glu Leu AlaAsp Ile Pro Ala Ile Val Tor Ala Pro Phe Arg Gly Ala Ala Lys Met Gly Lys Leu Ala Asp Gly Glu Pro Val Leu Val Leu Pro Gly Phe LeuAla Asp Asp Asn Ala Tor Ser Val Leu Arg Lys Tor Phe Glu Val Ala Gly Phe Ala Cys Ser Gly Trp Glu Lys Gly Phe Asn Leu Gly Ile Arg Gly Asp Leu Met Asp Tyr Leu Val Asp Arg Leu Arg Ala Val Ser GluAla Ala Gly Gly Gln Lys Val Ile Val Val Gly Trp Ser Leu Gly Gly Leu Tyr Ala Arg Glu Leu Gly His Lys Ala Pro Glu Leu Ile Arg MetVal Val Thr Leu Gly Ser Pro Phe Ala Gly Asp Leu His Ala Asn HisAla Trp Lys Ile Tyr Glu Ala Ile Asn Ser His Thr Val Asp Asn Leu Pro Ile Pro Arg Asp Phe Gln Ile Lys Pro Pro Val His Thr Ile AlaVal Trp Ser Pro Leu Asp Gly Val Val Ala Pro Glu Thr Ser Glu Gly Ser Pro Glu Gln Ser Asp Glu Arg Leu Glu Leu Ala Val Thr His Met Gly
Phe Ala Ala Ser Lys Thr Gly Ala Glu Ala Val Val Arg Leu Val Ala
Ala Arg Leu
En una realizacion, la enzima palmitasa usada en los procedimientos proporcionados en la presente memoria comprende una secuencia de aminoacidos de la SEC ID N°:2 y comprende, ademas, las siguientes modificaciones de residuos de aminoacidos: D61E; R72K; V83M, R85Y, V163R y R172H.
En una realizacion, la enzima palmitasa usada en los procedimientos proporcionados en la presente memoria es codificada por un acido nucleico que comprende una secuencia de acidos nucleicos de la SEC ID N°:3.
En una realizacion, la enzima palmitasa usada en los procedimientos proporcionados en la presente memoria comprende una secuencia de aminoacidos de la SEC ID N°:4.
En una realizacion, la enzima palmitasa usada en los procedimientos proporcionados en la presente memoria tiene una secuencia de aminoacidos de la SEC ID N°:2 y tiene, ademas, las siguientes modificaciones de residuos de aminoacidos: D61E; R72K; V83M, R85Y, V163R y R172H.
En una realizacion, la enzima palmitasa usada en los procedimientos proporcionados en la presente memoria es codificada por una secuencia de acidos nucleicos de la SEC ID N°:3.
En una realizacion, la enzima palmitasa usada en los procedimientos proporcionados en la presente memoria tiene una secuencia de aminoacidos de la SEC ID N°:4.
En los ejemplos que siguen se definen diversas realizaciones del procedimiento. En cada uno de los ejemplos que siguen, el mezclador de cizalla usado es un Ultra Turrax® T-50. La enzima PLA1 fue Lecitase® Ultra, y la enzima PLC fue Purifine®.
Ejemplo 1: Procedimiento enzimatico
En este ejemplo, se uso aceite de soja en bruto que tema la siguiente composicion:
Contenido de acido palmttico-10,8%
Fosforo - 567,7 ppm
Calcio - 48,53 ppm
Magnesio - 45,14 ppm
Acido graso libre 0,43%.
Se anadieron a un tanque de acero inoxidable aproximadamente 165,3 kg de aceite de soja en bruto filtrado. El tanque fue agitado a 70 rpm a 22,8°C. Se anadieron aproximadamente 6 kg de palmitasa formulada (numero de lote LIP 29241-PK005; se anadieron 2 kg de agua a 3 botellas que conteman 80 gramos de enzima en polvo). El aceite fue mezclado por cizallamiento durante 15 minutos con un Ultra Turrax® T-50. La mezcla se realizo en el tanque a 70 rpm durante 24 horas. Se anadieron al tanque aproximadamente 9 kg de oleato de potasio (obtenidos en Viva Corporation (India)) y fueron mezclados por cizallamiento durante 10 minutos con un Ultra Turrax® T-50. Se anadieron al tanque otros 8 kg de palmitasa formulada (lote 29241-PK005, obtenido en Verenium Corporation) preparada como anteriormente y fueron mezclados por cizallamiento durante 15 minutos con un Ultra Turrax® T- 50. La mezcla se realizo en el tanque durante 48 horas.
Se anadieron aproximadamente 165,3 gramos de acido cftrico al 50% (p/p) y fueron mezclados durante 1 hora, seguido por la adicion de 264 gramos de hidroxido sodico al 10% (p/p). Los contenidos fueron debidamente mezclados. Se anadieron aproximadamente 8,25 gramos de Lecitase® Ulta PLA1 de Novozyme y fueron mezclados durante aproximadamente 2 horas. La mezcla de reaccion fue calentada hasta 80°C, y centrifugada. La emulsion mecanica fue separada en capas oleosa y acuosa. No se observo ningun problema de separacion en esta etapa (aproximadamente 14 kg de agua presente en el sistema > 10%). El analisis de una muestra de la fraccion oleosa mostro la siguiente composicion:
Contenido de acido palmttico 2,9%
Fosforo- 59,43 ppm
Calcio- 29,09 ppm
Magnesio -16,49 ppm
Hierro - por debajo de la deteccion
Ejemplo 2: Refinado caustico
Se efectuo un intento de refinado caustico de la capa oleosa obtenida anteriormente. La capa oleosa tema un contenido de acido graso libre (FFA) del 12,4%. En este estudio, unicamente se neutralizo un 2% del FFA. La capa oleosa fue calentada hasta aproximadamente 80°C mientras se mezclaba. Se anadieron aproximadamente 7,52 kg de hidroxido sodico al 10% (p/p) y fueron mezclados lentamente durante 10 minutos, formando inesperadamente una emulsion. El aceite fue centrifugado. Sin embargo, el aceite que salio de la centnfuga fue una emulsion que tema una consistencia semejante a la de la mayonesa, y no pudo se separado en capas oleosa y acuosa. No fue posible refinar causticamente el aceite tratado con palmitasa.
Se anadieron a la emulsion aproximadamente 20 litros de agua y se dejo que reposaran durante la noche en un intento por separar la emulsion. Se crefa que dejar que las moleculas de agua en la emulsion tuvieran tiempo de unirse separana las capas oleosa y acuosa. No se observo separacion alguna.
Sin entrar en consideraciones teoricas, se crefa que la adicion de hidroxido sodico para reducir los acidos grasos libres (FFA) formaba una emulsion muy fuerte con el agua y el aceite.
Ejemplo 3: Refinado fis ico
El aceite tratado con palmitasa del Ejemplo 1 fue sometido a un refinado ffsico despues del tratamiento con un acido. En esta etapa se usaron aproximadamente 120 kg de aceite tratado con palmitasa. Se anadieron al aceite aproximadamente 10 kg de acido cftrico acuoso al 50% (p/p). La mezcla de reaccion fue mezclada durante aproximadamente 30 minutos. Las fases acuosa y oleosa fueron separadas centrifugando el material a 80°C. En esta etapa, la cantidad de acido graso libre fue aproximadamente un 19%, y los jabones fueron aproximadamente 304 ppm.
Ejemplo 4: Decoloracion y desodorizacion
La fase oleosa fue sometida a una etapa de decoloracion como sigue: se anadieron 298 gramos de TrySil® S615, 995 gramos de BASF FF 105 y 500 gramos de adyuvante de filtrado. La mezcla fue calentada hasta 105°C a un vado de 6 kPa (60 mBar) y mezclada durante 30 minutos (blanqueador). El aceite fue filtrado a traves de un filtro de placa y tela.
El aceite decolorado tema un contenido de FFA de aproximadamente un 21,15%, jabon = 0 ppm, fosforo = 0 ppm, valor de peroxido (PV) = 0,0 y acido palmttico= 3,7%.
El aceite decolorado fue desodorizado calentando al vado hasta 260°C con un 3% de vapor de borboteo por hora durante 5 horas. El aceite fue enfriado hasta 100°C y el vado fue roto con nitrogeno. El analisis del aceite desodorizado mostro lo siguiente:
FFA--0,45%
PV=0,00
Fosforo -- 0 ppm
Acido palmttico -- 4,2%.
Ejemplo 5: Procedimiento enzimatico
En este ejemplo, se uso aceite de soja en bruto que tema la composicion siguiente:
Contenido de acido palmttico -10,2%
Fosforo-681,4 ppm
Calcio-61,2 ppm
Magnesio - 64,2 ppm
Hierro - 0,59 ppm
Se anadieron a un tanque de acero inoxidable aproximadamente 127 kg de aceite de soja en bruto filtrado. El tanque fue agitado a 70 rpm a 31°C. Se anadieron aproximadamente 8 kg de palmitasa formulada (lote numero 060512; se anadieron 2 kg de agua a 4 botellas que conteman 80 gramos de enzima en polvo liofilizada). El aceite fue mezclado por cizallamiento durante 15 minutos con un Ultra Turrax® T-50. El tanque fue agitado a 70 rpm y cubierto. Se tomaron muestras del aceite despues de 45 horas de reaccion.
No hada oleato de potasio de calidad reactiva disponible para el ensayo, asf que se produjo un lote rapido de jabones de potasio anadiendo 1,62 kg de hidroxido potasico disuelto en 1,47 kg de agua. La solucion de hidroxido potasico fue anadida muy lentamente a 8,26 kg de aceite de soja refinado y decolorado. Una vez se hubo anadido al aceite toda la solucion caustica, la mezcla solucion caustica:aceite fue mezclada por cizallamiento con un mezclador Ultra Turrax® T-50 durante 30 minutos. La temperatura aumento de la temperatura ambiente hasta aproximadamente 71°C. Una vez la mezcla hubo enfriado hasta la temperatura ambiente, los jabones de potasio fueron anadidos al aceite, aproximadamente 6 horas despues de que se hubiera extrafdo la muestra a las 45 horas. Se tomaron muestras del aceite antes de la adicion de los jabones de potasio.
Se anadieron aproximadamente 10 kg de palmitasa formulada (lote numero 060512; se anadieron 2 kg de agua a 4 botellas que conteman 80 gramos de enzima en polvo liofilizada). El aceite fue mezclado por cizallamiento durante 15 minutos con un Ultra Turrax® T-50. El tanque fue agitado a 70 rpm y cubierto. Se extrajeron muestras adicionales a las 70 horas y las 95 horas despues de la carga inicial de enzima palmitasa.
Se anadieron aproximadamente 9 gramos de Lecitase® Ultra (lote numero LYN05035) y aproximadamente 26 gramos de Purifine® PLC (lote numero 190AU008A1) y fueron mezclados por cizallamiento durante 15 minutos. Se anadieron aproximadamente 3,81 kg de agua y fueron mezclados por cizallamiento durante 15 minutos. El aceite fue agitado a 45 - 47°C durante dos horas.
Se anadieron al aceite aproximadamente 4 kg de acido cftrico al 50% (p/p) y fueron mezclados por cizallamiento durante 5 minutos. Se anadio acido para convertir los jabones de potasio de soja en acidos grasos. A continuacion, el aceite fue calentado hasta 85°C y centrifugado. El aceite contema 304 ppm de jabon, por lo que el aceite se lavo con un 5% de agua caliente (p/p) para eliminar el jabon restante.
El aceite caliente (a aproximadamente 85°C) fue enfriado entonces con agitacion de 70 rpm en un tanque encamisado de acero inoxidable con agua a 4,5°C. Se dejo que el tanque siguiera enfriandose durante la noche con agitacion. Aproximadamente 14 horas mas tarde, el aceite en el tanque alcanzo los 8°C.
Se anadieron aproximadamente 1,8 kg de adyuvante de filtrado al tanque agitado y se dejo que se volviera uniforme durante aproximadamente 30 minutos. El aceite enfriado fue filtrado entonces usando un filtro de placa y tela para eliminar el acido palmftico solido. Tras el filtrado se recogieron aproximadamente 72 kg de aceite tratado con palmitasa.
TABLA 1
Figure imgf000017_0001
Esta claro, por los datos de la Tabla 1, que los jabones de potasio generados rapidamente no eran neutros y que el exceso de hidroxido potasico desactivo la palmitasa tras su adicion.
Ejemplo 6: Procedimiento enzimatico
Los 72 kg de aceite de soja tratado con palmitasa del Ejemplo 4 fue calentado hasta 70 - 72°C en un tanque. Se anadieron al aceite 6 kg de oleato de potasio (obtenido en Viva Corporation (India), lote numero POT/115). Se anadio 1,0 kg de lecitina de soja (3FUB, lote numero T180007025 de Bunge) y la mezcla fue enfriada con una agitacion de 70 rpm hasta 23°C.
Se anadieron al aceite aproximadamente 6,6 kg de palmitasa formulada (lote numero LIP 29241PK05; se anadieron 2,2 kg de agua a 3 botellas que conteman 100 gramos de enzima en polvo liofilizada). El aceite fue mezclado por cizallamiento durante 15 minutos con un Ultra Turrax® T-50. El tanque fue agitado a 70 rpm y cubierto.
Se extrajeron muestras tras un tiempo de reaccion de 24, 48 y 72 horas y fueron analizadas para encontrar su contenido de acido palmftico. Los resultados aparecen en la Tabla 2.
TABLA 2
Figure imgf000017_0002
El aceite fue calentado hasta 40 a 45°C con agitacion. Se anadieron al aceite aproximadamente 36 gramos de acido cftrico al 50% (p/p) y fueron mezclados por cizallamiento durante 10 minutos. Se anadieron al aceite 50,1 ml de hidroxido sodico 4 normal y fueron mezclados por cizallamiento durante 10 minutos. Se anadieron 3 gramos de Lecitase® Ultra (lote numero LYN05035), 12 gramos de Purifine® PLC (lote numero 190AU015A1) y 1 kg de agua y fueron mezclados por cizallamiento durante 10 minutos. El tanque fue cubierto y agitado durante 4 horas para permitir que las fosfolipasas destruyeran los fosfoftpidos. Se anadieron 1,2 kg de acido cftrico al 50% (p/p) para convertir el oleato de potasio en acidos grasos. El aceite fue calentado hasta 85°C y centrifugado. La emulsion mecanica fue separada en capas oleosa y acuosa.
Ejemplo 7: Procedimiento enzimatico
En este ejemplo, se uso aceite de soja en bruto que tema la composicion siguiente:
Contenido de acido palmftico-10,8%
Fosforo - 767,8 ppm
Calcio-71,2 ppm
Magnesio - 74,9 ppm
Hierro - 0,7 ppm
Acido graso libre-0,89%
Se anadieron a un tanque de acero inoxidable aproximadamente 120 kg de aceite de soja en bruto filtrado. El aceite fue calentado hasta 76°C con una agitacion de 70 rpm, y luego enfriado hasta 23°C. Se anadieron al tanque aproximadamente 6 kg de palmitasa formulada (lote numero LIP29241-PK05; se anadieron 2 kg de agua a 3 botellas que conteman 100 gramos de enzima en polvo liofilizada). El aceite fue mezclado por cizallamiento durante 15 minutos con un Ultra Turrax® T-50. El tanque fue agitado a 70 rpm y cubierto. El aceite fue muestreado despues de 24, 48 y 72 horas despues de la carga inicial de palmitasa, y fue analizado en busca de su contenido de acido palmftico.
Se anadieron al aceite 1,0 kg de lecitina de soja (3FUB, lote numero T180007025 de Bunge) y 6 kg de oleato de potasio (obtenido en Viva Corporation (India), lote numero POT/115). La mezcla fue mezclada por cizallamiento durante 15 minutos con un Ultra Turrax®. Se anadieron aproximadamente 6 kg de palmitasa formulada (lote numero LIP 29241PK05; se anadieron 2 kg de agua a 3 botellas que conteman 100 gramos de enzima en polvo liofilizada). El aceite fue mezclado por cizallamiento durante 15 minutos con un Ultra Turrax® T-50. El tanque fue agitado a 70 rpm y cubierto. El aceite fue muestreado 96 y 144 horas despues de la carga inicial de palmitasa.
El aceite fue calentado hasta aproximadamente 45°C. Se anadieron al aceite aproximadamente 60 gramos de acido cftrico al 50% (p/p) y fueron mezclados por cizallamiento durante 10 minutos. Se anadieron al aceite 100,2 ml de hidroxido sodico 4 normal y la mezcla fue mezclada por cizallamiento durante 10 minutos. Se anadieron 6 gramos de Lecitase® Ultra (lote numero LYN05035), 24 gramos de Purifine® PLC (lote numero 190AU015A1), y 2 kg de agua y fueron mezclados por cizalladura durante 10 minutos. El tanque fue cubierto y agitado durante 4 horas para permitir que las fosfolipasas destruyeran los fosfoftpidos. Se anadieron 2,4 kg de acido cftrico al 50% (p/p) para convertir el oleato de potasio en acidos grasos. El aceite fue calentado hasta 85°C y centrifugado. La emulsion mecanica fue separada en capas oleosa y acuosa. La capa oleosa fue analizada para encontrar su contenido de acido palmftico.
TABLA 3
Figure imgf000018_0001
Experimento 8: Eliminacion del acido graso palmftico
Los aceites tratados con palmitasa de los Experimentos 5 y 6 fueron combinados para la eliminacion del acido palmftico utilizando un fraccionamiento en seco. La mezcla de aceite:acido graso contema un total de un 9,1% de acido palmftico. El aceite fue calentado hasta 80°C con agitacion para garantizar que el aceite era completamente ftquido. El aceite fue colocado en un MoBulizer™. El aceite fue enfriado isotermicamente hasta aproximadamente 10°C con agua enfriada a aproximadamente 10°C y mantenido durante 8 horas para permitir la formacion de cristales (tiempo total de cristalizacion de 20,3 horas). A continuacion, el aceite fue filtrado usando un filtro de laboratorio L-Frac™. La presion obtenida durante el filtrado fue de 600 kPa (6 bar). La fraccion de olema o el aceite ftquido obtenido tema un contenido residual de acido palmftico en la mezcla del 3,9% (aproximadamente 1,5% estaba unido a la cadena principal de glicerol y 2,4% estaba como acido palmftico libre). La fraccion de estearina o los solidos obtenidos teman un contenido de acido palmftico de aproximadamente un 33%. A continuacion, el aceite podfa ser decolorado y refinado ffsicamente para eliminar los acidos grasos restantes.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento de produccion de una composicion de aceite de saturacion baja que comprende:
a) la mezcla de una fuente de triacilglicerol con una solucion acuosa de una enzima saturasa en presencia de un emulsionante para obtener una emulsion, comprendiendo el triacilglicerol al menos un residuo de acido graso saturado y al menos un residuo de acido graso insaturado, y comprendiendo el emulsionante una sal alcalina de un acido graso insaturado,
b) la mezcla de un acido acuoso con la emulsion para obtener una mezcla, en la que el acido se encuentra en una cantidad suficiente para obtener un pH de aproximadamente 1-4 y convertir el emulsionante en un acido graso insaturado libre y una sal, y
c) la separacion de la mezcla para obtener un aceite y una fase acuosa, comprendiendo el aceite la composicion de aceite de saturacion baja.
2. El procedimiento de la reivindicacion 1 que, ademas, comprende, entre las etapas b) y c):
1) la mezcla de una solucion acuosa de una base con la mezcla de la etapa b) para obtener una mezcla que tiene un pH de aproximadamente 4-9,
2) la mezcla de una enzima fosfolipasa seleccionada entre PLA1, PLA2, PLC y una combinacion de las mismas con la mezcla de la etapa c) para obtener una mezcla que comprende un aceite desgomado y una fase acuosa,
3) la separacion del aceite desgomado y la fase acuosa para obtener un aceite desgomado separado, y 4) la mezcla del aceite desgomado separado con una solucion acuosa de acido para obtener una mezcla que comprende una fase oleosa y una fase acuosa, encontrandose el acido en una cantidad suficiente para convertir el emulsionante en un acido graso insaturado libre y una sal.
3. El procedimiento de las reivindicaciones 1 o 2 en el que el triacilglicerol comprende al menos un residuo de acido palmftico.
4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en el que la enzima saturasa comprende una enzima palmitasa.
5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la enzima saturasa i) esta codificada por una secuencia de acidos nucleicos que comprende la SEC ID N°: 3, o ii) comprende una secuencia de aminoacidos de la SEC ID N°:4.
6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 en el que el aceite que comprende la composicion de aceite de saturacion baja es sometido a fraccionamiento para separar el acido graso saturado libre y el aceite de saturacion baja.
7. El procedimiento de la reivindicacion 6 en el que el fraccionamiento se realiza i) enfriando el aceite entre -20 y 20°C para solidificar el acido graso saturado libre, o ii) enfriando el aceite entre -10 y 10°C para solidificar el acido graso saturado libre.
8. El procedimiento de la reivindicacion 2 en el que la cantidad de base en la etapa 1) es suficiente para obtener un pH entre aproximadamente 4,5 y 7.
9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 en el que la fuente de triacilglicerol comprende i) un aceite algal, aceite vegetal o un aceite de origen animal, o ii) aceite de soja.
10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 en el que el emulsionante comprende oleato de potasio, oleato de sodio o una combinacion de los mismos.
11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 en el que el emulsionante es oleato de potasio.
12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 en el que el acido es acido fosforico, acido acetico, acido dtrico, acido tartarico, acido succmico y una mezcla de los mismos.
13. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12 en el que la base es hidroxido sodico, hidroxido potasico o una mezcla de los mismos.
14. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13 en el que la mezcla de la enzima saturasa con la fuente de triacilglicerol se realiza a una temperatura entre 20 y 50°C.
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