ES2710199T3 - Nuevos inhibidores de PI3K/AKT/mTOR y usos farmacéuticos de los mismos - Google Patents

Abstract

Un compuesto que tiene la siguiente fórmula (i):**Fórmula** en donde X es O o S y Ri se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo (C1-C10), alcoxilo (C1-C10), alquenilo (C2- C10), alquinilo (C2-C10), OH, un átomo de flúor, un átomo de bromo y un átomo de yodo; o sus sales, hidratos o sales hidratadas farmacéuticamente aceptables o sus estructuras cristalinas polimorfas, racematos, diastereómeros o enantiómeros.

Description

DESCRIPCION

Nuevos inhibidores de PI3K/AKT/mTOR y usos farmaceuticos de los mismos

[0001] La presente invention se refiere a nuevos inhibidores de PI3K/AKT/mTOR, sus metodos de preparation y sus usos farmaceuticos.

[0002] Las fosfoinositidas 3-cinasas (tambien llamadas fosfatidilinositol 3- cinasas o PI3Ks) constituyen una familia de enzimas llpido cinasas que controlan un rango de procesos celulares a traves de su regulation de una red de vlas de transduction de senales, y han surgido como importantes objetivos terapeuticos en el contexto del cancer, la inflamacion y las enfermedades cardiovasculares.

[0003] Las PI3K se dividen en tres clases distintas: Clase I, II y III. Los PI3K de clase I son enzimas transductoras de senales intracelulares capaces de fosforilar el fosfatidilinositol-4,5-difosfato (PIP2) para formar el fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato (PIP3). La formation de PIP3 cumple una funcion en la activation dependiente de PI3K de la ruta PI3K/AKT/mTOR.

[0004] Dado que PIP3 esta restringido a la membrana plasmatica, permite el reclutamiento de AKT y PDK1 (PDK1 o protelna cinasa 1 dependiente de fosfoinositida) en la membrana plasmatica. La colocalizacion de PDK1 y AKT activados permite que ^a K^t se fosforile por PDK1 en la treonina 308, lo que lleva a la activacion parcial de AKT. AKT (tambien conocida como PKB, protelna cinasa B) es una protelna cinasa serina/treonina que regula la supervivencia y el metabolismo celular al unir y regular muchos efectores posteriores.

[0005] La activacion completa de AKT se produce tras la fosforilacion de la serina 473 por el complejo TORC2 que comprende la protelna cinasa mTOR (la diana en mamlferos de la rapamicina). La mTOR es una protelna cinasa clave que regula el crecimiento celular y el metabolismo para mantener la homeostasis celular y del organismo. mTOR se expresa de forma ubicua y constitutiva. Se encuentra en dos complejos: mTOR complejo 1 (mTORC1 o mTOR/raptor), que desempena un papel en la regulacion de la traduction y el crecimiento celular y mTOR complejo 2 (mTORC2 o mTOR/rictor), que regula varios sustratos, entre ellos AKT.

[0006] Se ha demostrado que la ruta de serialization de PI3K/AKT/mTOR es necesaria para una serie extremadamente diversa de actividades celulares, tales como crecimiento celular, proliferation, diferenciacion, motilidad, supervivencia y trafico intracelular. La inhibicion de la ruta PI3K/AKT/mTOR puede tener un interes particular en la prevention y/o tratamiento de tumores benignos o malignos, diabetes, trastornos relacionados con la edad, trastornos autoinmunes y rechazo de trasplantes (Don Benjamin et al. Nature Reviews Drug Discovery, 868, noviembre de 2011, vol.10). Tambien se ha demostrado que la inhibition de PI3K/AKT/mTOR implementa la agregacion y activacion de receptores de muerte en celulas tumorales (Beneteau, M. et al Localization of Fas/CD95 into the lipid rafts on down modulation of the phosphatidylinositol 3-kinase signaling pathway. Molecular cancer research: MCR 6, 604-613, (2008); Pizon, M. et al. Actin-independent exclusion of CD95 by PI3K/AKT signalling: Implications for apoptosis. European journal of immunology 41, (2011)).

[0007] Ya se conocen varios inhibidores de la ruta PI3K/AKT (X. Mao et al., 2010; y Shu-Qiang Yin et al., 4 de abril de 2013), como S14161 y su analogo S14147.

[0008] Por lo tanto, los inhibidores de PI3K/AKT/mTOR son un objetivo prometedor para el desarrollo de farmacos, en particular en la prevencion y/o el tratamiento de tumores benignos y/o malignos. Por lo tanto, existe la necesidad de proporcionar nuevos inhibidores de PI3K/AKT/mTOR.

[0009] El objetivo de la presente invencion es proporcionar nuevos inhibidores de la ruta PI3K/AKT/mTOR, y mas especlficamente inhibidores de mTOR. En una realization, los compuestos de la invencion pueden ser inhibidores competitivos de mTOR. Otro objetivo de la presente invencion es proporcionar nuevos inhibidores de la ruta PI3K/AKT/mTOR, que demuestren un efecto citotoxico en celulas tumorales, para la prevencion y/o el tratamiento de tumores, tales como tumores benignos y/o malignos.

[0010] Otro objetivo de la presente invencion es proporcionar nuevos inhibidores de la ruta PI3K/AKT/mTOR, que eviten la migration de celulas tumorales, para la prevencion y/o el tratamiento de tumores, en particular metastasis.

[0011] La presente solicitud describe un compuesto que tiene la formula (I):

donde:

- X es O S;

Ri, R² , R³ y R⁴ se eligen independientemente del grupo que consiste en:

H, alquilo (C₁-C₁₀), alcoxilo (C₁-C₁₀), alquenilo (C²-C¹⁰), alquinilo (C²-C¹⁰), OH, un atomo de fluor, un atomo de bromo, un atomo de yodo, O (C₁-C₁₀) alquileno-NHCO (C⁵-C¹⁰) alquileno- (C⁵-C¹⁰) heterocicloalquilo y O (C₁-C₁₀) alquileno-NH-CS-NH-R" con R" siendo:

donde:

- R² y R³ pueden formarse junto con los atomos de carbono que llevan un grupo arilo (C⁶-C¹⁰); y

- R" y el heterocicloalquilo (C⁵-C¹⁰) estan opcionalmente sustituidos con al menos un sustituyente seleccionado de OH y =O;

- EWG se elige del grupo que consiste en:

NO² , CHO, COR, CN, CN-OH, CONHR, CONRR’ y COOR; siendo elegidos R y R' independientemente el uno del otro de grupos alquilo (C₁-C₁₀);

- R⁵ es un arilo (C⁶-C¹⁰), un grupo heteroarilo (C⁵-C¹⁰), un cicloalquilo (C³-C¹⁰) o un grupo heterocicloalquilo (C³-C¹⁰); dichos arilo y heteroarilo estan opcionalmente sustituidos con al menos un sustituyente elegido independientemente entre halogeno, alcoxilo (C₁-C₁₀) y nitro;

R⁵ siendo diferente del grupo:

y en donde cuando EWG es COOMe, uno de R¹, R² , R³ o R⁴ es distinto a H; y siempre que el compuesto de formula (I) no sea uno de los siguientes compuestos:

o sus sales, hidratos o sales hidratadas farmaceuticamente aceptables o sus estructuras cristalinas polimorfas, racematos, diastereomeros o enantiomeros.

[0012] El documento CN 101849934 describe un inhibidor de PI3K (tambien llamado compuesto A), de formula:

Este compuesto se ha probado de acuerdo con las mismas pruebas biologicas que los compuestos de la invencion, como se describe a continuacion.

[0013] Los compuestos de formula (I) son inhibidores de la ruta PI3K/AKT/mTOR. En una realizacion particular, son inhibidores de mTOR.

[0014] Estas moleculas inhiben la ruta de PI3K/AKT/mTOR y son mas potentes que el compuesto A mencionado anteriormente y el conocido inhibidor de PI3K LY294002.

[0015] Incluso mas sorprendentemente, los nuevos inhibidores de PI3K/AKT/mTOR tambien muestran un aumento del efecto citototoxico sobre las celulas tumorales.

[0016] El termino "alquilo (C₁-C₁₀)" significa un grupo hidrocarburo alifatico saturado que puede ser lineal o ramificado que tiene de 1 a 10 atomos de carbono en la cadena. Los grupos alquilo preferidos tienen de 1 a 4 atomos de carbono en la cadena, los grupos alquilo preferidos son en particular grupos metilo o etilo. "Ramificado" significa que uno o mas grupos alquilo inferior tales como metilo, etilo o propilo estan unidos a una cadena de alquilo lineal.

[0017] El termino "alquileno (C₁-C₁₀)" significa un radical divalente hidrocarbonado alifatico saturado que puede ser lineal o ramificado con 1 a 10 atomos de carbono en la cadena. Los grupos alquileno preferidos pueden tener 3, 4, 5 o 6 atomos de carbono.

[0018] Por "cicloalquilo (C³-C¹⁰)" se entiende un grupo hidrocarbonado saturado clclico que tiene de 3 a 10 atomos de carbono, en particular grupos ciclopropilo o ciclohexilo.

[0019] Por "alquenilo (C²-C¹⁰)" se entiende un alquilo insaturado, que comprende al menos un doble enlace entre dos atomos de carbono y que comprende de 2 a 10 atomos de carbono, preferiblemente de 2 a 4 atomos de carbono.

[0020] Por "alquinilo (C²-C¹⁰)" se entiende un alquilo insaturado, que comprende al menos un enlace triple entre dos atomos de carbono y que comprende de 2 a 10 atomos de carbono, preferiblemente de 2 a 4 atomos de carbono, mas preferiblemente 2 atomos de carbono .

[0021] El termino "alcoxi (C₁-C₁₀)" se refiere a un grupo alquil-O- en el que el alquilo se define anteriormente. Los grupos alcoxi preferidos son grupos metoxi o etoxi.

[0022] El termino "arilo (C⁶-C¹⁰)" se refiere a un sistema de anillo de hidrocarburo aromatico monoclclico, biclclico o triclclico en el que cualquier atomo del anillo capaz de sustitucion puede estar sustituido con un sustituyente. Los ejemplos de grupos arilo incluyen, pero no se limitan a, fenilo.

[0023] El termino "heteroarilo (C⁵-C¹⁰)" se refiere a un sistema de anillo de hidrocarburo aromatico monoclclico, biclclico o triclclico, en el que cualquier atomo del anillo que pueda sustituirse puede estar sustituido por un sustituyente y en el que uno o mas atomos de carbono se reemplazan por uno o mas heteroatomos, tales como el(los) atomo(s) de nitrogeno, el(los) atomo(s) de oxlgeno y el(los) atomo(s) de sulfuro; por ejemplo, 1 o 2 atomos de nitrogeno, 1 o 2 atomos de oxlgeno, 1 o 2 atomos de sulfuro o una combinacion de distintos heteroatomos.

[0024] El termino "heterocicloalquilo" se refiere a un grupo alquilo mono o biclclico en el que uno o mas atomos de carbono estan reemplazados por uno o mas heteroatomos, tales como el(los) atomo(s) de nitrogeno, el(los) atomo(s) de oxlgeno y el(los) atomo(s) de sulfuro; por ejemplo, 1 o 2 atomos de nitrogeno, 1 o 2 atomos de oxlgeno, 1 o 2 atomos de sulfuro o una combinacion de distintos heteroatomos, como un atomo de sulfuro y dos atomos de nitrogeno. Los ejemplos de grupos heterocicloalquilo incluyen, pero no se limitan a, tetrahidropiranilo o hexahidro-tieno[3,4-d]imidazol.

[0025] El termino “halogeno” se refiere a los atomos del grupo 17 de la tabla periodica e incluye en particular atomos de fluor, cloro, bromo y yodo, mas preferiblemente atomos de fluor, cloro y bromo.

[0026] Los compuestos aqul descritos pueden tener centros asimetricos. Los compuestos de la presente invencion que contienen un atomo asimetricamente sustituido se pueden aislar en formas opticamente activas o racemicas. Es bien conocido en la tecnica como preparar formas opticamente activas, tales como por resolucion de formas racemicas o por slntesis a partir de materiales de partida opticamente activos. Estan previstas todas las formas quirales, diastereomericas, racemicas y todas las formas isomericas geometricas de un compuesto, a menos que la forma estereoqulmica o la forma isomerica esten especlficamente indicadas. En una realizacion, los compuestos de formula (I) estan en la forma enantiomerica R. En otra realizacion, los compuestos de formula (I) estan en la forma enantiomerica S.

[0027] El termino "sal farmaceuticamente aceptable" se refiere a sales que retienen la efectividad biologica y las propiedades de los compuestos de la invencion y que no son biologicamente o de otra manera indeseables farmaceuticamente. Las sales de adicion de acidos aceptables pueden prepararse a partir de acidos organicos e inorganicos, mientras que las sales de adicion de bases farmaceuticamente aceptables pueden prepararse a partir de bases organicas e inorganicas. Para una revision de las sales farmaceuticamente aceptables, vease Berge, et al. ((1977) J. Pharm. Sd, vol. 66, 1). Por ejemplo, las sales incluyen aquellas derivadas de acidos inorganicos tales como clorhldrico, bromhldrico, sulfurico, sulfamico, fosforico, nltrico y similares, as! como sales preparadas a partir de acidos organicos tales como acetico, propionico, succlnico, glicolico, estearico, lactico, malico, tartarico, citrico, ascorbico, pamoico, maleico, hidroximaleico, fenilacetico, glutamico, benzoico, saliclclico, sulfanllico, fumarico, metanosulfonico y toluenosulfonico y similares.

[0028] En una realizacion particular, en la formula (I) como se define anteriormente, el EWG se elige del grupo que consiste en: NO² , CHO, COOR, CN, CN-OH y CONRR', siendo R y R' definidos anteriormente. Mas particularmente, el EWG se elige entre NO² , CHO, COOMe, CN, CN-OH y CONMe². Mas particularmente, EWG es NO² o CHO.

[0029] En una realizacion particular, Ri es H.

[0030] En una realizacion particular, R² es H, alquinilo(C2-C10), Br, F, I, OH, O(Ci-Cio)alquileno-NH-CO(Ci-Cio)alquileno-(C5-Cio)heterocicloalquilo o O(Ci-Cio)alquileno-NH-CS-NH-R" con R" siendo:

donde:

R" y el grupo heterocicloalquilo(C5-Cio) estan opcionalmente sustituidos con OH o = O;

o R² se forma con R³ junto con los atomos de carbono que llevan un grupo arilo(C6-Ci0).

[0031] En una realizacion, R² es H, alquinilo(C2-C4), Br, F, OH, alquileno(Ci-C⁵)-NHCO(Ci-C⁵)alquileno-(C⁵)heterocicloalquilo u O(Ci-C⁷)alquileno-NH-CS-NH-R" siendo R":

donde:

R" y el grupo heterocicloalquilo (C⁵) estan opcionalmente sustituidos con al menos un sustituyente seleccionado de OH o =O; o R² se forma con R³ junto con los atomos de carbono que llevan un grupo fenilo.

[0032] En una realizacion particular, dicho heterocicloalquilo (C⁵) es un hexahidro-tieno[3,4-d]imidazol. En otra realizacion, R² se elige entre H, Br, OH, C²-alquinilo,

o R² se forma con R³ junto con los atomos de carbono que llevan un grupo fenilo.

[0033] En otra realizacion, R² puede elegirse entre las formas H, Br, OH, C²-alquinilo o R² con R³ junto con los atomos de carbono que llevan un grupo fenilo.

[0034] En una realizacion particular, R³ es H, alcoxilo(Ci-Cio) o se forma junto con R² y los atomos de carbono que llevan un arilo (Ca- C¹⁰). Mas particularmente, R³ es H, alcoxilo(Ci- C³) tal como OCH³ , o se forma junto con R² y los atomos de carbono que llevan un grupo fenilo.

[0035] En una realizacion, R⁴ es H, halogeno o alcoxilo(Ci-Cio). En otra realizacion, R4 es H, Br, Cl, F o alcoxilo(Ci- C³). Mas particularmente, R⁴ es H, OCH³ , OC²H⁵ o Br.

[0036] En una realizacion particular, R⁵ es un arilo(Ca- Cio) o un heterocicloalquilo(C3-Cio) posiblemente sustituido. En otra realizacion, R⁵ es un fenilo posiblemente sustituido o un grupo tetrahidropiranilo.

[0037] En una realizacion particular, R⁵ es un grupo fenilo, sustituido con al menos un sustituyente elegido del grupo que consiste en: halogeno, nitro y alcoxilo(Ci-C4). Preferiblemente, R⁵ es un grupo fenilo, sustituido con al menos un sustituyente elegido del grupo que consiste en: F, Br, Cl, NO² y OCH³. En una realizacion particular, R⁵ es un grupo fenilo opcionalmente sustituido con F, Br, Cl o NO². En una realizacion particular, R⁵ es un fenilo sustituido en posicion para. En una realizacion, R⁵ no es un grupo tiofeno o un benzofurano.

[0038] En una realizacion particular, X es O. En una realizacion particular, X es S.

[0039] En una realizacion particular, EWG es NO², CHO, COOMe, CN, CN-OH o CONMe² y X es O. En una realizacion particular, EWG es NO² y X es S.

[0040] En otra realizacion particular, Ri y R³ son H, EWG es NO² , CHO, COOMe, CN, CN-OH o CONMe² y X es O.

[0041] En una realizacion particular, EWG es NO² , CHO, COOMe, CN, CN-OH o CONMe² , X es O y R⁵ es un fenilo posiblemente sustituido o un grupo tetrahidropiranilo.

[0042] En una realizacion particular, EWG es NO², CHO, COOMe, CN, CN-OH o CONMe², X es O, R⁵ es un fenilo posiblemente sustituido o un grupo tetrahidropiranilo y R⁴ se elige entre H, OCH³ , OC²H⁵ o Br .

[0043] En una realizacion particular, R² se forma junto con R³ y con los atomos de carbono que llevan un grupo fenilo, EWG es NO² y R⁴ es H.

[0044] En una realizacion particular, Ri, R² y R³ son H. En otra realizacion particular, Ri y R³ son H y R² es Br. En otra realizacion particular, Ri y R³ son H y R² y R⁴ son Br.

[0045] Las realizaciones particulares mencionadas anteriormente se pueden combinar entre si.

[0046] La presente solicitud tambien describe compuestos que tienen la siguiente formula (a):

en donde Ra es igual o diferente y se elige entre F, Br, Cl o NO2; y n es 1 o 3.

[0047] La presente solicitud tambien describe compuestos que tienen la siguiente formula (b):

en donde Rb es igual o distinto y se elige entre Br, Cl o NO2; y n es 1 o 3.

[0048] La presente solicitud tambien describe compuestos que tienen la siguiente formula (c):

en donde Rc es igual o distinto y se elige entre F, Br, Cl o NO² ;

Rc' es Br o OMe; y n es 1 o 3.

[0049] La presente solicitud tambien describe compuestos que tienen la siguiente formula (d):

en donde Rd es igual o distinto y se elige entre Br o OMe y n es 1 o 2.

[0050] La presente solicitud tambien describe compuestos que tienen la siguiente formula (e):

en donde Re es H, Br o F y Re' es Br u OEt.

[0051] La presente solicitud tambien describe compuestos que tienen la siguiente formula (f):

[0052] La presente solicitud tambien describe compuestos que tienen la siguiente formula (g):

en donde n es 1 o 2.

[0053] La presente solicitud tambien describe compuestos que tienen la siguiente formula (h):

en donde Rh se elige del grupo que consiste en COOMe, CONMe² , CNOH y CN, y en donde n es 1 o 2.

[0054] La presente invencion se refiere a compuestos que tienen la siguiente formula (i):

en donde X es O S y Ri se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo(C¹-C¹o), alcoxilo(C¹-C¹o), alquenilo(C²-C¹⁰), alquinilo(C²-C¹o), OH, un atomo de fluor , un atomo de bromo y un atomo de yodo;

o sus sales, hidratos o sales hidratadas farmaceuticamente aceptables o sus estructuras cristalinas polimorfas, racematos, diastereomeros o enantiomeros.

[0055] Preferiblemente, Ri se selecciona del grupo que consiste en H, un atomo de fluor, un atomo de bromo o un atomo de yodo y mas preferiblemente, Ri es H o Br.

[0056] La presente solicitud describe compuestos especlficos que tienen una de las siguientes formulas:

[0057] Preferiblemente, algunos compuestos especlficos de la invencion tienen una de las siguientes formulas:

o sus sales, hidratos o sales hidratadas farmaceuticamente aceptables o sus estructuras cristalinas polimorfas, racematos, diastereomeros o enantiomeros.

[0058] En una realizacion particular, el compuesto de formula (i) es:

[0059] En una realizacion particular, el compuesto de formula (I) es:

[0060] La presente solicitud tambien describe el compuesto de formula (I) definido anteriormente, para su uso para la prevencion y/o el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en: enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, enfermedades neurodegenerativas, canceres, rechazo al trasplante, enfermedades caracterizadas por un envejecimiento prematuro y esclerosis tuberosa.

[0061] La presente invencion tambien se refiere al compuesto de formula (i) definido anteriormente, para su uso para la prevencion y/o el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en: enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, enfermedades neurodegenerativas, canceres , rechazo de trasplante y enfermedades caracterizadas por un envejecimiento prematuro, siendo dicha enfermedad preferentemente un cancer, en particular cancer de mama.

[0062] Por el termino "cancer" se entienden tumores solidos malignos y/o canceres hematologicos diseminados y/o su metastasis. Los terminos "metastasis" o "enfermedades metastasicas" se refieren a tumores malignos secundarios formados por celulas de un tumor maligno primario, que se han trasladado a otra localizacion. El termino "canceres hematologicos" se refiere a los tipos de cancer que afectan la sangre, la medula osea y los ganglios linfaticos, como los mielomas, los linfomas o las leucemias.

[0063] Mas particularmente, la invencion se refiere al compuesto de formula (i) definido anteriormente para su uso para el tratamiento y/o prevencion de leucemia, linfoma, canceres colorrectales, canceres pancreaticos, canceres de pulmon, canceres de ovario, canceres de hlgado, cancer de mama, canceres, mas preferiblemente canceres de mama triple negativos y enfermedades metastasicas.

[0064] Preferiblemente, los compuestos de acuerdo con la invencion son utiles en la prevencion y/o el tratamiento del cancer de mama y/o la metastasis de tumores malignos primarios de mama. Por ejemplo, cancer de mama, se puede mencionar cancer de mama positivo para el receptor de estrogeno, cancer de mama positivo para HER2, cancer de mama positivo para el receptor de estrogeno resistente a antiestrogenos, cancer de mama positivo para HER2 refractario a trastuzumab (receptor del factor de crecimiento epidermico humano 2 positivo), cancer de mama y cancer de mama triple negativo (Pradip De et al. Cancer Treat. Rev., 2013). Mas preferiblemente, los canceres de mama a prevenir y/o tratar son canceres de mama triple negativos.

[0065] De hecho, se ha demostrado que los inhibidores de la ruta PI3K/AKT/mTOR tienen efectos antiproliferativos estadisticamente significativos (P. De et al. Cancer Treat. Rev. 2013). Una fraccion estadisticamente significativa de pacientes con recaida de cancer de mama y la ruta de senalizacion de PI3K/AKT/mTOR cumple una funcion fundamental en la resistencia a la quimioterapia observada en estos pacientes con cancer de mama (Miller, T. W., Balko, J. M. & Arteaga, C. L. Phosphatidylinositol 3-kinase and antiestrogen resistance in breast cancer. Journal of clinical oncology: official journal of the American Society of Clinical Oncology 29, 4452-4461, (2011)). El cancer de mama triple negativo, un subtipo que se distingue por la tincion inmunohistoquimica negativa para la expresion de los receptores de estrogeno y progesterona (ER/PR) y el receptor-2 del factor de crecimiento epidermico humano (HER2) representa entre el 10 y el 20 % de todos los canceres de mama. Los tumores triple negativos no pueden tratarse con terapia endocrina o terapias dirigidas a HER2. Dado que los canceres triple negativos demuestran niveles mas altos de activacion de AKT en comparacion con los canceres de mama no triple negativos (Adamo, B. et al. Phosphatidylinositol 3-kinase pathway activation in breast cancer brain metastases. Breast cancer research : BCR 13, R125, (2011)), la inhibicion de la ruta de senalizacion PI3K/AKT puede bloquear el proceso de supervivencia del tumor y la migracion celular en este subgrupo agresivo de tumor maligno.

[0066] En una realizacion particular, el compuesto de formula (i) definido anteriormente se usa para la prevencion y/o el tratamiento de la esclerosis tuberosa. La esclerosis tuberosa o el complejo de esclerosis tuberosa (TSC), tambien llamada enfermedad de Bourneville, es una rara enfermedad genetica autosomica dominante multisistemica que causa tumores no malignos (tumores benignos) en el cerebro y en otros organos vitales como los rinones, el corazon, los ojos, pulmones y piel. La TSC se puede caracterizar por la formacion de hamartia, hamartomas (tumores benignos como angiofibroma facial y nodulos subependimales), angiomiolipomas renales (tumores benignos), linfangiomomatosis pulmonar y, muy raramente, hamartoblastomas cancerosos.

[0067] En TSC, las mutaciones en los genes TCS1, que codifican para hamartina, y TSC2, que codifican para tuberina, conducen a un complejo de hamartintuberina que no inhibe la mTOR como deberia. mTOR se expresa asi de manera constitutiva en pacientes que sufren de TSC (Peter B. Crino et al., The New England Journal of Medicine, 28 de septiembre de 2006, 355; 1345-56).

[0068] Los compuestos de formula (I) tambien estan disenados como farmacos antienvejecimiento: se sabe que la inhibicion de la ruta de mTOR tiene un efecto positivo en la vida util de los ratones (Dudley W. Lamming et al., J. Clin. Invest. 2013 123 (3): 980-989). Por consiguiente, los compuestos de formula (I) se pueden usar para la prevencion y/o el tratamiento de "enfermedades caracterizadas por un envejecimiento prematuro" tal como la progeria. Se ha demostrado que la rapamicina, un inhibidor de mTOR, mejora la senescencia prematura en celulas derivadas de pacientes con progeria Hutchinson-Gilford (Dudley W. Lamming et al., J. Clin. Invest. 2013; 123 (3): 980-989).

[0069] El papel de la ruta PI3K/AKT/mTOR en el envejecimiento esta relacionado con trastornos relacionados con la edad, como los trastornos neurodegenerativos (Don Benjamin et al. Nature Reviews Drug Discovery, 868, noviembre de 2011, vol.10 y Dudley W Lamming et. al, J. Clin. Invest. 2013; 123 (3): 980-989). El termino "enfermedades neurodegenerativas" incluye patologias caracterizadas por la perdida progresiva de la estructura y/o funcion de las neuronas, que a veces conducen a su muerte. Entre las enfermedades neurodegenerativas, se pueden citar la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer o la enfermedad de Huntington.

[0070] Ademas, se ha demostrado que la inhibicion de la ruta PI3K/AKT/mTOR cumple una funcion en la diabetes, trastornos relacionados con la edad, trastornos autoinmunes y rechazo de trasplantes (Don Benjamin et al. Nature Reviews Drug Discovery, 868, noviembre de 2011, vol.10).

[0071] Los compuestos de formula (I) definidos anteriormente tambien pretenden prevenir y/o tratar la diabetes tipo II (Dudley W. Lamming et. al, J. Clin. Invest. 2013; 123 (3): 980-989).

[0072] Los terminos "enfermedades inflamatorias" se refieren a enfermedades caracterizadas por una inflamacion cronica. Por "inflamacion" se entienden los fenomenos por los cuales el cuerpo humano generalmente se defiende contra la agresion y puede manifestarse en varios sintomas como hinchazon, calor o enrojecimiento de la piel. Los terminos "enfermedades autoinmunes" se refieren a enfermedades en las cuales el sistema inmunologico esta desregulado, lo que significa que la respuesta inmune del cuerpo contra sustancias o tejidos normalmente presentes en el cuerpo es inapropiada. Entre las enfermedades autoinmunes, se puede citar la enfermedad de Crohn o el lupus eritematoso sistemico (lupus). El termino "rechazo de trasplante" se refiere a la reaccion del huesped contra el injerto o la enfermedad de injerto contra huesped. En una realizacion, el compuesto de formula (I) como se define anteriormente se puede usar como un farmaco inmunosupresor, mas particularmente como un farmaco inmunosupresor para prevenir el rechazo del trasplante.

[0073] En el contexto de la invencion, el termino "tratar" o "tratamiento", como se usa en este documento, significa revertir, aliviar, inhibir el progreso o prevenir el trastorno o afeccion al que se aplica dicho termino, o uno o mas slntomas de tal trastorno o enfermedad.

[0074] La presente invencion tambien se refiere a una composicion farmaceutica, que comprende un compuesto que tiene la formula (i) como se define anteriormente, en asociacion con al menos un excipiente farmaceuticamente aceptable.

[0075] La presente invencion tambien se refiere a un farmaco, que comprende un compuesto que tiene la formula (i) como se define anteriormente.

[0076] Si bien es posible que los compuestos de la invencion que tienen la formula (i) se administren solos, se prefiere presentarlos como composiciones farmaceuticas. Las composiciones farmaceuticas, tanto para uso veterinario como para uso humano, utiles segun la presente invencion, comprenden al menos un compuesto que tiene la formula (i) como se definio anteriormente, junto con uno o mas vehlculos farmaceuticamente aceptables y posiblemente otros ingredientes terapeuticos.

[0077] En ciertas realizaciones preferidas, los ingredientes activos necesarios en terapia de combinacion pueden combinarse en una unica composicion farmaceutica para administracion simultanea.

[0078] Como se usa en este documento, el termino "farmaceuticamente aceptable" y sus variaciones gramaticales, como se refieren a composiciones, vehlculos, diluyentes y reactivos, se usan de manera intercambiable y representan que los materiales pueden administrarse a un mamlfero sin la produccion de efectos fisiologicos indeseables, tales como nauseas, mareos, trastornos gastricos y similares.

[0079] La preparacion de una composicion farmacologica que contiene ingredientes activos disueltos o dispersados en la misma se entiende bien en la tecnica y no es necesario que se limite en base a la formulacion. Normalmente, tales composiciones se preparan como inyectables, como soluciones llquidas o suspensiones; sin embargo, tambien pueden prepararse formas solidas adecuadas para disolucion, o suspensiones, en llquido antes de su uso. La preparacion tambien puede ser emulsionada. En particular, las composiciones farmaceuticas pueden formularse en forma de dosificacion solida, por ejemplo, capsulas, comprimidos, plldoras, polvos, grageas o granulos.

[0080] La eleccion del vehlculo y el contenido de sustancia activa en el vehlculo se determinan generalmente de acuerdo con la solubilidad y las propiedades qulmicas del compuesto activo, el modo particular de administracion y las disposiciones que deben observarse en la practica farmaceutica. Por ejemplo, se pueden usar excipientes como lactosa, citrato de sodio, carbonato de calcio, fosfato dicalcico y agentes desintegrantes tales como almidon, acidos alglnicos y ciertos silicatos complejos combinados con lubricantes como estearato de magnesio, lauril sulfato de sodio y talco para preparar los comprimidos. Para preparar una capsula, es ventajoso usar lactosa y polietilenglicoles de alto peso molecular. Cuando se usan suspensiones acuosas, pueden contener agentes emulsionantes o agentes que facilitan la suspension. Tambien se pueden usar diluyentes tales como sacarosa, etanol, polietilenglicol, propilenglicol, glicerol y cloroformo o mezclas de estos.

[0081] Las composiciones farmaceuticas pueden administrarse en una formulacion adecuada para seres humanos y animales mediante administracion topica o sistemica, incluidas oral, rectal, nasal, bucal, ocular, sublingual, transdermica, rectal, topica, vaginal, parenteral (incluidas subcutanea, intraarterial, intramuscular, intravenosa, intradermica, intratecal y epidural), suboccipital e intraperitoneal. Se apreciara que la ruta preferida puede variar, por ejemplo, con la enfermedad del destinatario.

[0082] Las formulaciones pueden prepararse en forma de dosificacion unitaria mediante cualquiera de los metodos bien conocidos en la tecnica de la farmacia. Tales metodos incluyen la etapa de asociar el ingrediente activo con el vehlculo que constituye uno o mas ingredientes accesorios. En general, las formulaciones se preparan asociando de manera uniforme e Intima el ingrediente activo con portadores llquidos o portadores solidos finamente divididos o ambos, y luego, si es necesario, dando forma al producto.

Descripcion de las figuras:

[0083]

La Figura 1 y la Figura 6 muestran el porcentaje de muerte celular de las celulas T leucemicas Jurkat, en comparacion con la concentracion de algunos compuestos de formula (I).

Las Figuras 2, 3, 4 y 5 muestran el porcentaje de muerte celular de las celulas T leucemicas CEM, frente a la concentracion de algunos compuestos de formula (I).

La Figura 7 y la Figura 8 muestran la actividad PI3K, representada por el nivel de fosforilacion de AKT, frente al tiempo de incubacion de celulas CEM con compuestos de formula (I) a una concentracion de 10 pM.

La Figura 9 y la Figura 10 muestran el porcentaje de muerte celular de celulas de cancer de mama triple negativas (respectivamente lineas celulares MDAMB-468 y MDA-MB-231), frente a la concentracion de algunos compuestos de formula (I).

La Figura 11 muestra una parte del cinoma realizado por KinaseProfiler™ con el compuesto 25 a 1 pM. Muestra la selectividad del compuesto 25 para la proteina mTOR con respecto a 243 cinasas humanas.

La Figura 12 muestra la union del compuesto 48 a mTOR y su actividad inhibidora. La Figura 12A muestra la inhibicion de la fosforilacion de AKT en la serina 473 y de 4EBP1 en la treonina 37/46. La Figura 12B muestra la union del compuesto 48 a la proteina mTOR.

La Figura 13 muestra la tolerancia in vivo del compuesto 25 en ratones. La Figura 13A muestra el peso corporal de los ratones analizados en gramos frente al tiempo en dias. La Figura 13B muestra el porcentaje de supervivencia de los ratones analizados frente al tiempo en dias.

La Figura 14 muestra la actividad citotoxica de los compuestos de la invencion en celulas TSC2'/_ y TSC2+/+. La Figura 14A muestra el numero de celulas TSC2'/' (circulos blancos) y TSC2+/+ (circulos negros) obtenidas en cultivo a lo largo del tiempo (en horas). La Figura 14B muestra el porcentaje de muerte celular (actividad metabolica) de TSC2-/- (circulos blancos) y TSC2+/+ (circulos negros) frente a la concentracion de compuesto 25 en pM. La Figura 14C muestra el porcentaje de muerte celular (actividad metabolica) de TSC2'/' (circulos blancos) y TSC2+/+ (circulos negros) frente a la concentracion de rapamicina en pM.

La Figura 15 muestra los resultados de una inmunotransferencia que demuestra que el compuesto 25 inhibe la actividad de mTORC1 en celulas TSC2-/".

La Figura 16 muestra los resultados de una inmunotransferencia que demuestra que el compuesto 25 inhibe las actividades de mTORC1 y mTORC2.

La Figura 17 muestra que el compuesto 25 inhibe la migracion celular de celulas MDA-MB-231 (Figura 17B) y de celulas BT549 (Figura 17A).

[0084] Los siguientes ejemplos muestran la inhibicion mejorada de PI3K/AKT/mTOR y el aumento del efecto citotoxico de los compuestos de formula (I). Algunos ejemplos preparativos tambien se dan a continuacion, sin limitation de la presente invencion.

EJEMPLOS PREPARATIVOS:

1. Preparacion de los compuestos 1 a 40:

Procedimiento general para preparar compuestos de formula (I) en donde EWG es NO2:

[0085]

[0086] La mezcla de derivado de nitroestireno (1 mmol), compuesto de salicilaldehido (1 mmol) y acido pipecolico (0,2 mmol) en 1,5 ml de tolueno seco se calento a 80-100 °C durante 24-72 h bajo una atmosfera de nitrogeno (conversion seguida por TLC). Despues de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla se cargo directamente en la columna de gel de silice para que la separation diera el cromeno deseado (rendimientos = 40-75 %). La temperatura ambiente esta comprendida entre 18 °C y 25 °C.

[0087] R¹, R² , R³ , R⁴ , R⁵ y X se definen anteriormente.

Procedimiento general para preparar compuestos de formula (I) en donde EWG es CHO:

[0088]

[0089] La mezcla de derivado de cinamaidehldo (1 mmol), compuesto de salicilaldehido (1 mmol) y 1,1,3,3-tetrametilguanidina (0,2 mmol) en 1,5 ml de tolueno seco se calento a 80-100 °C durante 48-72 h bajo atmosfera de nitrogeno (conversion seguida por TLC). Despues de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla se cargo directamente en la columna de gel de sllice para que la separacion diera el cromeno deseado (rendimientos = 30-55 %). La temperatura ambiente esta comprendida entre 18 °C y 25 °C.

[0090] R¹, R², R³ , R⁴ , R⁵ y X se definen anteriormente. Los productos de partida utilizados se obtuvieron de la siguiente manera:

2. Preparacion de los compuestos 41 a 63:

Preparacion de los compuestos 50 y 51

Acido dimetiltiocarbamico O-(4-bromo-2-formilfenilo) ester

[0091]

[0092] A una disolucion de 5-bromosalicilaldehldo (5,0 g, 25,0 mmol) en acetonitrilo seco (25 ml) se le anadio carbonato de potasio (13,75 g, 100,0 mmol, 4,0 eq.) a temperatura ambiente. Despues de 10 minutos, se anadio cloruro de dimetiltiocarbamollo (3,7 g, 30,0 mmol, 1,2 eq.) y la mezcla se calento a reflujo durante 4 h. Luego, la mezcla de reaccion se enfrio a temperatura ambiente, se diluyo con EtOAc y se lavo con una solucion acuosa saturada de NaHCO3. Las capas organicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y el filtrado se concentro a presion reducida. El compuesto del tltulo se purifico por cromatografla en columna sobre gel de sllice mediante PE/EtOAc 9/1 a 7/3 como eluyente que proporciona un solido amarillo (5,5 g, 77 %). Pf = 144-146 °C. 1H-RMN (CDCla, 500 MHz) 53,42 (s, 3H), 3,47 (s, 3H), 7,03 (d, J = 8,5, 1H), 7,72 (dd, J = 8,5, 2,2, 1H), 8,02 (d, J = 2.2, 1H), 9,99 (s, 1H). 13C-RMN (CDCla, 125 MHz) 539,0, 43,5, 119,9, 126,3, 130,5, 132,1, 137,6, 154,3, 186,7, 186,7.

Acido dimetiltiocarbamico S-(4-bromo-2-formilfenil) ester

[0093]

[0094] El O-(4-bromo-2-formilfenil) ester del acido dimetiltiocarbamico (5,4 g, 18,7 mmol) se calento sin diluir a 150 °C durante 15 h, luego se enfrio a temperatura ambiente. El compuesto del titulo se purifico por cromatografia en columna sobre gel de silice mediante PhMe/Et2O 95/5 a 90/10 como eluyente que proporciona un solido amarillo (1,1 g, 20 %). Pf = 116-118 °C. 1H-RMN (CDCb, 300 MHz) 53,03 (s, 3H), 3,16 (s, 3H), 7,42 (d, J = 8,2, 1H), 7,70 (dd, J = 8,2, 2,4, 1H), 8,14 ( d, J = 2,4, 1H), 10,25 (s, 1H). 13CRMN (CDCl3, 75 MHz) 5 37,1, 37,3, 124,9, 131,1, 131,6, 136,5, 138,7, 138,9, 164,6, 189,8.

6-bromo-2-(4-bromofenil)-3-nitro-2H-tiocromeno (50)

[0095] A una disolucion de ester S-(4-bromo-2-formilfenil) de acido dimetiltiocarbamico (200 mg, 0,69 mmol) en metanol (4,3 ml) se le anadio una solucion acuosa de NaOH (0,8 M, 4,3 ml, 3,45 mmol, 5 eq.) a temperatura ambiente. Despues de 2 h, se anadio una disolucion acuosa al 10 % (p/v) de acido citrico seguida de agua y la mezcla se extrajo con EtOAc. Las capas organicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y el filtrado se concentro a presion reducida. El tiofenol bruto resultante se disolvio en tolueno seco y se anadio 1-bromo-4-(2-nitrovinil)benceno (158 mg, 1 eq., 0,69 mmol) seguido de acido pipecolico (45 mg, 0,5 eq., 0,35 mmol). La mezcla de reaccion se calento a 100 °C durante 12 h, luego se enfrio a temperatura ambiente. El disolvente se elimino a presion reducida y el compuesto del titulo se purifico por cromatografia en columna sobre gel de silice mediante PE/PhMe 4/1 como eluyente, lo que proporciona un solido amarillo (115 mg, 39 %).

Ester O- (2,4-dibromo-6-formilfenilo) de acido dimetiltiocarbamico

[0096]

[0097] A una disolucion de 3,5-dibromosalicilaldehido (1,2 g, 4,3 mmol) en tetrahidrofurano seco (10 ml) se le anadio hidruro de sodio (60 % en aceite, 0,19 g, 4,7 mmol, 1,1 eq.) a 0 °C . Despues de 15 minutos a 0 °C y 1 hora a temperatura ambiente, se anadio una disolucion de cloruro de dimetiltiocarbamoilo (0,65 g, 5,2 mmol, 1,2 eq.) en tetrahidrofurano seco (2 ml) a 0 °C y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 12 h. Luego se anadio una solucion acuosa saturada de NH4Cl y la mezcla se extrajo con EtOAc. Las capas organicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO⁴ , se filtraron y el filtrado se concentro a presion reducida. El compuesto del titulo se purifico por cromatografia en columna sobre gel de silice mediante PE/Et2O 9/1 a 7/3 como eluyente, que proporciona un solido amarillo (0,4 g, 25 %). 1H RMN (CDCla, 500 MHz) 53,48 (s, 3H), 3,49 (s, 3H), 7,96 (d, J = 2,4, 1H), 7,99 (d, J = 2,4, 1H), 9,94 (s, 1H). 13C-RMN (CDCb, 125 MHz) 539,2, 43,8, 119,6, 120,2, 130,8, 132,3, 140,4, 151,9, 185,1, 186,2.

Ester S-(2,4-dibromo-6 formilfenil) de acido dimetiltiocarbamico

[0098]

[0099] El ester O-(2,4-dibromo-6-formilfenil) de acido dimetiltiocarbamico (0,26 g, 0,71 mmol) se calento solo a 150 °C durante 15 h, luego se enfrio a temperatura ambiente. El compuesto del fitulo se purifico por cromatografia en columna sobre gel de silice mediante PhMe/Et2O 9/1 como eluyente, que proporciona un solido amarillo (0,17 g, 53 %). Pf = 134-136 °C. 1H-RMN (CDCb, 500 MHz) 53,04 (s, 3H), 3,22 (s, 3H), 8,06 (d, J = 2,2, 1H), 8,09 (d, J = 2,2, 1H), 10,25 (s, 1H). 13C-RMN (CDCb, 125 MHz) 537,3, 37,4, 125,2, 130,7, 132,6, 133,0, 140,0, 140,9, 163,1, 189,7 6,8-dibromo-2-(4-bromofenil)-3-nitro-2H-tiocromeno (51)

[0100] A una solucion de ester S-(2,4-dibromo-6-formilfenil) de acido dimetiltiocarbamico (160 mg, 0,43 mmol) en metanol (2,7 ml) se anadio una disolucion acuosa de NaOH (0,8 M, 2,7 ml, 2,15 mmol, 5 eq.) a temperatura ambiente. Despues de 2 h, se anadio una disolucion acuosa al 10 % (p/v) de acido cltrico seguida de agua y la mezcla se extrajo con EtOAc. Las capas organicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y el filtrado se concentro a presion reducida. El tiofenol crudo resultante se disolvio en tolueno seco y se anadio 1-bromo-4-(2-nitrovinil) benceno (98 mg, 1 eq., 0,43 mmol) seguido de acido pipecolico (28 mg, 0,5 eq., 0,22 mmol). La mezcla de reaccion se calento a 100 °C durante 12 h, luego se enfrio a temperatura ambiente. El disolvente se elimino a presion reducida y el compuesto del tltulo se purifico por cromatografla en columna sobre gel de sllice mediante PE/PhMe 4/1 como eluyente, seguido de una cromatografla preparativa de capa fina mediante PE/PhMe 3/2 como eluyente, que proporciona un solido amarillo (40 mg, 19 %).

Preparacion de compuestos 44 y 52

[0101] Una disolucion de derivado de salicilaldehldo se coloco en tolueno seco y se le anadio 1-bromo-4-(2-nitrovinil) benceno (1,1 eq.) seguido de tetrametilguanidina (0,5 eq.) y acido benzoico (0,5 eq.). La mezcla de reaccion se calento a 100 °C durante 16 h, luego se enfrio a temperatura ambiente. El disolvente se elimino a presion reducida y el compuesto del tltulo se purifico por cromatografla en columna sobre gel de sllice mediante PhMe/Et²O 7/3 como eluyente, que da un solido amarillo.

Preparacion de compuestos 55 y 56

[0102] A una disolucion de acido carboxllico 53 o 54 en metanol, se anadio cloruro de tionilo (1,6 eq.). La mezcla de reaccion se calento a reflujo durante 20 h, luego se enfrio a temperatura ambiente. El disolvente se elimino a presion reducida y el compuesto del tltulo se purifico por cromatografla en columna sobre gel de sllice mediante PhMe/PE 3/1 como eluyente.

Preparacion de compuestos 57 y 58

[0103] A una disolucion de acido carboxllico 53 o 54 en cloruro de metileno en presencia de una gota de DMF, se anadio cloruro de oxalilo (1,15 eq.). La mezcla de reaccion se agito 20 h a temperatura ambiente y se anadieron Me²NH.HCl (2 eq.) y Et3N (5 eq.). La mezcla de reaccion se agito 4 h a temperatura ambiente y despues de la adicion de HCl 1 M, la fase acuosa se extrajo con EtOAc. Las capas organicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y el filtrado se concentro a presion reducida. El compuesto del tltulo se purifico por cromatografla en columna sobre gel de sllice mediante CH²Ch/AcOEt 8/2 como eluyente.

Preparacion de los compuestos 59 y 60

[0104] A una solucion de aldehldo 44 o 52 en metanol, se anadieron sucesivamente clorhidrato de hidroxilamina (5 eq.) y trietilamina (5 eq.). La mezcla de reaccion se agito 16 h a temperatura ambiente. Despues de la adicion de HCl 1 M, la solucion se extrajo con EtOAc. Las capas organicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y el filtrado se concentro a presion reducida. El compuesto del tltulo se purifico por cromatografla en columna sobre gel de sllice mediante PhMe/PE 7/3 como eluyente.

Preparacion de ciano 61 y 62

[0105] Una disolucion de aldehldo 44 o 52 y NH²OH.HCl (1,5 eq.) en DMSO se agito a 100 °C durante 20 h. Despues de la adicion de agua, la solucion se extrajo con Et²O. Las capas organicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y el filtrado se concentro a presion reducida. El compuesto del tltulo se purifico por cromatografla en columna sobre gel de sllice mediante PE/AcOEt 85/15 como eluyente.

Datos analiticos:

8-etoxi-2-(4-fluorofenil)-3-nitro-3,4-dihidro-2H-cromeno (compuesto A)

[0106] 1H RMN (CDCla, 500 MHz): 5 (ppm) = 1,36 (s, 3 H, J = 7,1 Hz), 3,97-4,08 (m, 2 H, J = 7,1 Hz), 6; 64 (s , 1 H), 6,93-6,99 (m, 5 H), 7,37 (d, 1 H; J = 5,2 Hz), 7,38 (d, 1 H, J = 5,2 Hz), 8,03 (s, 1 H).

13C RMN (CDCla, 125 MHz): 5 (ppm) = 164,2, 162,2, 148,0, 143,0, 141,3, 132,6, 129,5, 128,9, 128,8, 122,6, 122,2, 118,9, 118,7, 115,8, 115,6, 65,2, 14,7.

2-(4-fluorofenil)-8-metoxi-3-nitro-3,4-dihidro-2H-cromeno (1)

[0107] 1H RMN (CDCls, 500 MHz): 5 (ppm) = 4,11 (s, 3 H), 6,93 (s, 1 H), 7,24-7,30 (m, 5 H), 7,66 (d, 2 H), 7,69 (d, 1 H), 8,33 (s, 1 H).

13C RMN (CDCls, 125 MHz): 5 (ppm) = 164,3, 162,3, 148,7, 142,5, 141,3, 132,6, 129,3, 129,0, 128,9, 122,6, 122,1, 118,6, 115,9, 115,7, 56,3.

6,8-dibromo-2-(4-fluorofenil)-3-nitro-3,4-dihidro-2H-cromeno (2)

[0108] 1H RMN (CDCIa, 500 MHz) 5 (ppm) = 6,68 (s, 1 H), 7,02 (m, 2 H), 7,34 (d, 1 H), 7,36 (d, 1 H), 7,40 (s, 1 H), 7,65 (s, 1 H), 7,94 (s, 1 H).

13C RMN (CDCl3, 125 MHz) 5 (ppm) = 164,4, 162,4, 149,3, 142,5, 139,1, 131,6, 128,9, 128,8, 127,4, 120,6, 116,9, 116,2, 116,0, 114,8, 112,4.

2-(4-fluorofenil)-7-metoxi-3-nitro-3,4-dihidro-2H-cromeno (3)

[0109] 1H RMN (CDCla, 500 MHz) 5 (ppm) = 6,39 (d, 1 H), 6,53 (s, 1 H), 6,57 (dd, 1 H), 7,0 (m, 2 H), 7,24 ( d, 1 H), 7,34-7,36 (m, 2 H), 8,04 (s, 1 H).

13C RMN (CDCla, 125 MHz) 5 (ppm) = 165,2, 164,2, 162,3, 155,4, 138,2, 133,0, 131,8, 129,9, 129,0, 115,9, 115,8, 110.0, 109,9, 102,3, 55,7.

2-(4-fluorofenil)-3-nitro-3,4-dihidro-2H-benzo[g]cromeno (5)

[0110] 1H RMN (CDCls, 300 MHz) 5 (ppm) = 6,49 (s, 1 H), 6,90-6,97 (m, 4 H), 7,23-7,31 (m, 5 H), 7,99 (s, 1 H).

13C RMN (CDCls, 75 MHz) 5 (ppm) = 164,9, 161,6, 153,3, 141,0, 134,5, 132,8, 132,7, 130,5, 129,4, 129,1, 128,9, 128,5, 127,1, 122,7, 117,8, 117,3, 116,0, 115,7.

6-bromo-2-(4-fluorofenil)-8-metoxi-3-nitro-3,4-dihidro-2H-cromeno (6)

[0111] 1H RMN (CDCls, 300 MHz) 5 (ppm) = 3,76 (s, 3 H), 6,59 (s, 1 H), 6,94-7,03 (m, 4 H), 7,49 (d, 1 H), 7,53 (d, 1 H), 7,92 (s, 1 H).

6-bromo-2-(4-fluorofenil)-3-nitro-3,4-dihidro-2H-cromeno (7)

[0112] 1H RMN (CDCl3, 300 MHz) 5 (ppm) = 6,54 (s, 1 H), 6,75 (d, 1 H, J = 8,6 Hz), 7,00 (t, 2 H, J = 8,6 Hz), 7,32 (d, 1 H, J = 5,2 Hz), 7,35 (d, 1 H, J = 5,2 Hz), 7,45 (d, 1 H, J = 2,3 Hz), 7,96 (s, 1 H).

8-bromo-2-(4-fluorofenil)-3-nitro-3,4-dihidro-2H-cromeno (8)

[0113] 1H RMN (CDCl³ , 300 MHz) 5 (ppm) = 6,60 (s, 1 H), 6,81 (t, 1 H), 6,90 (t, 2 H), 7,20 (dd, 1 H), 7,27­ 7,30 (m, 2 H), 7,44 (dd, 1 H), 7,94 (s, 1 H).

6-bromo-2-(4-bromo-fenil)-3-nitro-2H-cromeno (9)

[0114] 1H RMN (CDCl3, 300 MHz) 5 (ppm) = 6,52 (s, 1 H), 6,77 (d, 1 H, J = 8,6 Hz), 7,23 (d, 2 H, J = 8,6 Hz), 7,45 (m, 4 H), 7,61 (dd, 1 H, J = 6,1 y 2,9 Hz), 7,97 (s, 1 H).

13C RMN (CDCl3, 75 MHz) 5 (ppm) = 73,8, 114,8, 119,1, 119,6, 124,0, 128,0, 128,7, 132,2, 132,5, 135,2, 136,9, 141.7, 152,2.

6-bromo-2-(4-cloro-fenil)-3-nitro-2H-cromeno (10)

[0115] 1H RMN (CDCb, 300 MHz) 5 (ppm) = 6,54 (s, 1 H), 6,77 (d, 1 H, J = 8,6 Hz) 7,29-7,32 (m, 4 H), 7,39­ 7,46 (m, 2 H), 7,97 (s, 1 H).

13C RMN (CDCl3, 75 MHz) 5 (ppm) = 73,7, 114,7, 119,0, 119,5, 127,9, 128,3, 128,4, 129,2, 129,8, 130,2, 132,4, 134.7, 135,7, 136,8, 137,6, 141,6, 152,0.

6-bromo-2-(4-nitro-fenil)-3-nitro-2H-cromeno (11)

[0116] 1H RMN (CDCl3, 300 MHz) 5 (ppm) = 6,66 (s, 1 H), 6,81 (d, 1 H, J = 8,6 Hz), 7,43-7,56 (m, 4 H), 8,02 (s, 1H), 8,21 (m, 2H).

13C RMN (CDCl3, 75 MHz) 5 (ppm) = 73,2, 115,2, 119,0, 119,3, 124,2, 128,0, 128,6, 132,7, 137,2, 141,0, 142,9, 148,5, 152,0.

2- (4-bromo-fenil)-8-etoxi-3-nitro-2H-cromeno (13)

[0117] 1H RMN (CDCl3, 300 MHz) 5 (ppm) = 1,39 (t, 3 H, J = 6,9 Hz), 4,04 (q, 2 H, J = 7,1 Hz), 6,62 (s, 1 H), 6,69 (m, 3 H), 7,28 (m, 2 H), 7,44 (dd, 2 H, J = 8,4 y 1,6 Hz), 8,03 (s, 1 H).

13C RMN (CDCl3, 75 MHz) 5 (ppm) = 14,7, 65,0, 73,2, 118,5, 118,8, 122,1, 122,7, 123,4, 128,5, 129,6, 131,8, 135,7, 141.0, 142,8, 147,9.

2-(4-cloro-fenil)-8-etoxi-3-nitro-2H-cromeno (14)

[0118] 1H RMN (CDCIa, 300 MHz) 5 (ppm) = 1,38 (t, 3 H, J = 7 Hz), 3,97-4,08 (m, 2 H), 6,63 (s, 1 H), 6,91­ 6,96 (m, 3 H), 7,25-7,34 (m, 4 H), 8,03 (s, 1 H).

13C RMN (CDCla, 75 MHz) 5 (ppm) = 14,7, 65,0, 73,1, 118,6, 118,9, 122,2, 122,6, 128,3, 129,0, 129,6, 135,3, 141,1, 142,9, 148,0.

2-,(4-nitro-fenil)-8-etoxi-3-nitro-2H-cromeno (15)

[0119] 1H RMN (CDCla, 300 MHz) 5 (ppm) = 1,41 (t, 3 H, J = 7,0 Hz), 4,06 (m, 2 H), 6,74 (s, 1 H), 6,95 (m, 3)

H), 7,58 (d, 2 H, J = 8,5 Hz), 8,07 (s, 1 H), 8,15 (d, 2 H, J = 8,9 Hz).

13C RMN (CDCI³, 75 MHz) 5 (ppm) = 14,7, 64,9, 72,6, 118,4, 118,6, 122,2, 123,1, 123,9, 127,7, 130,1, 140,5, 142,4, 143,7, 147,9, 148,28.

2-(2-cIoro-feniI)-8-etoxi-3-nitro-2H-cromeno (16)

[0120] 1H RMN (CDCI³ , 300 MHz) 5 (ppm) = 1,29 (t, 3 H, J = 7,0Hz), 3,94 (q, 2 H, J = 3,6Hz), 7,00 (m, 3 H), 7,11-7,27 (m, 3 H), 7,28 (m, 2 H), 7,49 (dd, 1 H, J = 1,0, 7,9 Hz), 8,17 (s, 1 H).

13C RMN (CDCI³, 75 MHz) 5 (ppm) = 14,7, 65,8, 70,8, 118,9, 120,6, 122,5, 122,6, 127,0, 128,0, 130,5, 130,6, 130,9, 133.0, 134,5, 140,1, 143,2, 148,14.

8-bromo-2-(4-bromo-feniI)-3-nitro-2H-cromeno (18)

[0121] 1H RMN (CDCI³ , 300 MHz) 5 (ppm) = 6,67 (s, 1 H), 6,92 (t, 1 H, J = 7,9 Hz), 7,29 (m, 2 H), 7,46 (m, 2)

H), 7,45-7,61 (m, 2 H), 8,03 (s, 1 H).

13C RMN (CDCI³ , 75 MHz) 5 (ppm) = 72,8, 111,5, 119,4, 123,7, 123,8, 128,5, 128,9, 129,6, 132,1, 135,2, 137,5, 141,5, 150,1.

8-bromo-2-,(4-cIoro-feniI)-3-nitro-2H-cromeno (19)

[0122] 1H RMN (CDCI³ , 300 MHz) 5 (ppm) = 6,69 (s, 1 H), 6,93 (t, 1 H, J = 7,7 Hz), 7,28-7,35 (m, 5 H), 7,56

(dd , 1 H, J = 6,5 y 1,5 Hz), 8,03 (s, 1 H).

13C RMN (CDCI³ , 75 MHz) 5 (ppm) = 73,7, 111,4, 119,3, 123,6, 128,2, 128,8, 129,0, 129,50, 134,6, 135,5, 137,5, 141.5, 150,0.

8-bromo-2-(4-nitro-feniI)-3-nitro-2H-cromeno (20)

[0123] 1H RMN (CDCI³, 300 MHz) 5 (ppm) = 6,80 (s, 1 H), 6,94 (t, 1 H, J = 7,0 Hz), 7,31 (dd, 1 H, J = 7,0 y 1,0

Hz ), 7,59 (m, 3 H), 8,07 (s, 1 H), 8,20 (d, 2 H, J = 7,0 Hz).

13C RMN (CDCI³ , 75 MHz) 5 (ppm) = 73,3, 111,5, 119,2, 124,1, 124,5, 127,8, 129,4, 129,7, 129.8.136.0. 137.8.143.0.149.9.

6-bromo-2-(4-bromo-feniI)-8-metoxi-3-nitro-2H-cromeno (22)

[0124] 1H RMN (CDCI³, 300 MHz) 5 (ppm) = 3,82 (s, 3 H), 6,60 (s, 1 H), 7,04 (d, 1 H, J = 2,1 Hz), 7,08 (d, 1 H, J = 2,1 Hz), 7,24 (td, 2 H, J = 2,2 y 8,3 Hz), 7,47 (td, 2 H, J = 2,2 y 8,6 Hz,), 7,95 (s, 1 H).

13C RMN (CDCI³, 75 MHz) 5 (ppm) = 56,5, 73,6, 111,4, 119,7, 119,5, 123,9, 128,0, 128,5, 129,5, 132,1, 135,1, 141,7,149,3.

6-bromo-2-(4-cIoro-feniI)-8-metoxi-3-nitro 2H-cromeno (23)

[0125] 1H RMN (CDCI³ , 300 MHz) 5 (ppm) = 3,82 (s, 3 H), 6,60 (s, 1 H), 7,08 (dd, 2 H, J = 13,1 y 2,0 Hz); 7,3

(s, 4 H), 7,95 (s, 1 H).

6-bromo-2-(4-nitro-feniI)-8-metoxi-3-nitro-2H-cromeno (24)

[0126] 1H RMN (CDCI³, 300 MHz) 5 (ppm) = 3,86 (s, 3 H) 6,75 (s, 1 H), 7,07 (d, 1 H, J = 2,1 Hz), 7,11 (d, 1 H , J = 2,1Hz), 7,55 (td, 2 H, J = 2,0 y 8,5Hz), 7,99 (s, 1 H), 8,19 (td, 2 HJ = 2,0 y 8,9Hz,).

6,8-dibromo-2-(4-bromo-feniI)-3-nitro-2H-cromeno (25)

[0127] 1H RMN (CDCI³, 300 MHz) 5 (ppm) = 6,67 (s, 1 H), 7,24 (m, 2 H), 7,40 (d, 1 H, J = 2,2 Hz), 7,48 (m, 2)

H, J = 8,5 y 1,95 Hz), 7,67 (d, 1 H, J = 2,2 Hz), 7,95 (s, 1 H).

13C RMN (CDCI³ , 75 MHz) 5 (ppm) = 73,9, 112,4, 114,8, 120,6, 124,1, 127,5, 128,4, 129,5, 121,5, 132,2, 132,7, 134.6, 139,1, 142,2, 149,2.

6,8-dibromo-2-(4-cIoro-feniI)-3-nitro-2H-cromeno (26)

[0128] 1H RMN (CDCIa, 300 MHz) 5 (ppm) = 6,68 (s, 1 H), 7,41 (d, 1 H, J = 2,0 Hz), 7,43 (d, 2 H, J = 8,0 Hz), 7,49 (m, 2 H, J = 8,0 Hz), 7,67 (d, 1 H, J = 2,0 Hz), 7,98 (s, 1 H).

6,8-dibromo-2-(4-nitro-fenil)-3-nitro-2H-cromeno (27)

[0129] 1H RMN (CDCl³, 300 MHz) 5 (ppm) = 828 (d, 2 H, J = 8,3 Hz), 8,00 (s, 1 H), 7,70 (dd, 1 H, J = 1,0 y 2,2 Hz ), 7,58 (td, 2 H, J = 2,0 y 8,5 Hz), 7,44 (d, 1 H, J = 2,2 Hz), 6,80 (s, 1 H).

13C RMN (CDCl3, 75 MHz) 5 (ppm) = 73,4, 112,4, 115,3, 120,3, 124,2, 127,8, 128,1, 131,8, 139,5, 142,4, 148,98. 2-(4-bromo-fenil)-6-etinil-3-nitro-2H-cromeno (32)

[0130] 1H RMN (CDCla, 300 MHz) 5 (ppm) = 3,06 (s, 1 H), 6,54 (s, 1 H), 6,82 (d, 1 H, J = 6,0 Hz), 7,23 (m, 2) H), 7,45 (m, 4 H), 8,00 (s, 1 H).

13C RMN (CDCla, 75 MHz) 5 (ppm) = 155,4, 141,3, 137,9, 135,4, 133,9, 132,1, 128,7, 128,5, 124,0, 117,8, 117,5, 116,7, 81,8, 73,9.

6-bromo-2-fenil-2H-cromeno-3-carbaldehldo (33)

[0131] 1H RMN (CDCls, 300 MHz) 5 (ppm) = 6,32 (s, 1H), 6,76 (d, 1 H, J = 8,2 Hz), 7,27-7,32 (m, 5 H), 7,34­ 7,38 (m, 3 H), 9,65 (s, 1 H).

6-bromo-2-(4-fluoro-fenil)-2H-cromeno-3-carbaldehldo (34)

[0132] 1H RMN (CD CDCl3Cl3, 300 MHz) 5 (ppm) = 6,29 (s, 1 H), 6,76 (d, 1H, J = 8,8 Hz), 6,97 (m, 2 H), 7,27­ 7,32 (m, 3 H), 7,38 (m, 3 H), 9,65 (s, 1 H).

8-etoxi-2-fenil-2H-cromeno-3-carbaldehldo (35)

[0133] 1H RMN (CDCls, 300 MHz) 5 (ppm) = 1,37 (t, 3 H, J = 7,0 Hz), 4,04 (q, 2 H, J = 3,9) 6,43 (s, 1 H) 6,86 (m, 2 H), 6,92 (m, 1 H, J = 5,3 Hz), 7,25 (m, 3 H), 7,35 (m, 2 H), 7,38 (s, 1 H); 9,67 (s, 1 H).

6-bromo-3-nitro-2-(tetrahidro-piran-4-il)-2H-cromeno (36)

[0134] 1H RMN (CDCls, 300 MHz) 5 (ppm) = 1,45 (m, 2 H), 1,68 (m, 2 H), 2,07 (m, 1 H); 3,27 (m, 2 H), 3,95 (m, 2 H); 5,48 (d, 1 H, J = 6,4 Hz), 6,85 (d, 1 H, J = 8,6 Hz), 7,40 (d, 1 H, J = 2,3 Hz), 7,45 (dd, 1 H, J = 8,6 y 2,3 Hz), 7,79 (s, 1 H).

8-bromo-3-nitro-2-(tetrahidro-piran-4-il)-2H-cromeno (37)

[0135] 1H RMN (CDCls, 300 MHz) 5 (ppm) = 1,45 (m, 2 H); 1,83 (m, 2 H), 2,07 (m, 1 H), 3,28 (m, 2 H), 3,97 (m, 2 H), 5,60 (d, 1 H, J = 6,7 Hz), 6,91 (t, 1 H, J = 7,7 Hz), 7,24 (dd, 1 H, J = 6,2 y 1,4 Hz), 7,58 (dd, 1 H, J = 6,5 y 1,5 Hz), 7,86 (s, 1 H).

6,8-dibromo-3-nitro-2-(tetrahidro-piran-4-il)-2H-cromeno (39)

[0136] 1H RMN (CDCls, 300 MHz) 5 (ppm) = 1,43 (m, 2 H), 1,76 (m, 2 H), 2,05 (m, 1H, H-5), 3,28 (m, 2 H) , 3,98 (m, 2 H), 5,59 (d, 1 H, J = 6,6 Hz), 7,37 (d, 1 H, J = 2,2 Hz), 7,71 (d, 1 H, J = 2,2 Hz), 7,78 ( s, 1 H).

6-bromo-8-metoxi-3-nitro-2-(tetrahidro-piran-4-il)-2H-cromeno (40)

[0137] 1H RMN (CDCl3, 300 MHz) 5 (ppm) = 1,49 (m, 2 H), 1,72 (m, 2 H), 2,04 (m, 1 H), 3,26 (m, 2 H), 3,89 ( s, 3 H); 3,98 (m, 2 H), 5,53 (d, 1 H, J = 6,86 Hz), 7,04 (d, 1 H, J = 2,1 Hz), 7,07 (d, 1 H, J = 2,1 Hz), 7,78 (s, 1 H). 6-bromo-2-(4-bromofenil)-2H-cromeno-3-carbaldehldo (44)

[0138] Pf = 144-146 °C. 1H RMN (CDCb, 300 MHz) 56,27 (s, 1H), 6,76 (d, J = 8.5, 1H), 7,19 (d, J = 8,5, 2H), 7,35-7,40 (m, 4H), 7,43 ( s, 1H), 9,66 (s, 1H).

13C RMN (CDCl3, 75 MHz) 573,7, 113,9, 119,0, 121,5, 123,0, 128,5, 131,5, 131,8, 134,0, 136,2, 137,4, 139,2, 153,4, 189,6.

2-(4-bromo-fenil)-3-nitro-2H-cromen-6-ol (45)

(MMJ)

[0139] 1H RMN (300 MHz, CDCI³) 56,47 (s, 1H), 6,71-6,86 (m, 2H), 6,80 (s, 1H), 7,22 (d, J = 8,5, 2H), 7,44 (d, J = 8,5, 2H), 7,97 (s, 1H).

13C RMN (75 MHz, CDCI³) 573,2, 115,6, 118,1, 118,4, 121,6, 123,5, 128,7, 129,6, 131,9, 135,6, 141,3, 146,6, 151,6. Compuesto (47)

(MJ / 4 / 140-1)

[0140] 1H RMN (500 MHz, CDCla) 51,39-1,47 (m, 2H), 1,621,74 (m, 4H), 1,93-2,02 (m, 2H), 2,21 (t, J = 7,4, 2H), 2,68 (d, J = 12,8, 1H), 2,84-2,88 (dd, J = 4,7, 12,8, 1H), 3,08-3,14 (m, 1H), 3,38-3,45 (m, 2H), 3,96 (t, J = 6,0 , 2H), 4,24-4,27 (m, 1H), 4,41-4,45 (m, 1H), 5,57 (bs, 1H), 6,44 (t, J = 5,6, 1H), 6,47 (s, 1H), 6,53 (bs, 1H), 6,77 (d, J = 8.6, 1H), 6,85 (t, J = 2,7, 1H), 6,88 (dd, J = 2,9, 8,6, 1H), 7,21 (d, J = 8,4, 2H), 7,43 (d, J = 8,4, 2H), 8,02 (s, 1H). 13C RMN (125 MHz, CDCla) 5 25,6, 28,0, 28,1, 29,1, 35,8, 36,9, 40,5, 55,6, 60,3, 61,8, 66,7, 73,3, 114,6, 114,6, 118,4, 118,4, 121,4, 121,4, 123,5, 128,7, 129,7 , 131,9, 135,6, 141,2, 147,2, 154,0, 163,9, 173,6.

Compuesto (48)

(MJ/4/188-2)

[0141] 1H RMN (500 MHz, CDCI³) 51,38-1,44 (m, 2H), 1,601,74 (m, 4H), 1,94-1,99 (m, 2H), 2,21 (t, J = 7,2, 2H), 2,68 (d, J = 12,7, 1H), 2,84-2,88 (m, 1H), 3,09-3,13 (m, 1H), 3,38-3,41 (m, 2H), 3,94 (t, J = 5,8, 2H), 4,24-4,27 (m, 1H), 4,41-4,45 (m, 1H), 5,51 (bs, 1H), 6,41 (bs, 1H), 6,53 (bs, 1H), 6,60 (s, 1H), 6,84 (t, J = 2,2, 1H), 7,11 (d, J = 2,0, 1H), 7,25 (dd, J = 2,2, 8,6, 2H), 7,44 (d, J = 8,6, 2H), 8,02 (s, 1H).

13C RMN (125 MHz, CDCI³) 5 25,5, 27,9, 28,0, 29,0, 35,8, 36,5, 40,5, 55,5, 60,1, 61,6, 66,7, 73,4, 111,5, 114,5, 114,5, 119,5, 123,6, 123,7, 123,7, 128,4, 129,2 , 129,2, 131,9, 135,0, 142,0, 142,0, 144,0, 154,0, 163,9, 173,4.

Compuesto (49)

(MJ/4/191-1)

[0142] 1H RMN (500 MHz, CDCI³) 5 1,37-1,47 (m, 4H), 1,57-1,63 (m, 2H), 1,69-1,74 (m, 2H), 3,50-3,53 (m, 2H), 3,95 (t , J = 6,2, 2H), 6,56 (dd, J = 2,2, 8,6, 2H), 6,60 (d, J = 8,6, 2H), 6,67 (d, J = 2,2, 2H), 6,72 (s, 1H), 7,17 (d, J = 8,2, 1H), 7,26 (d, J = 2,7, 1H), 7,28 (d, J = 2,7, 1H), 7,34 (d, J = 8,5, 2H), 7,57 (d, J = 8,5, 2H), 7,71-7,74 (m, 1H), 8,07 (bs, 1H), 8,22 (s, 1H), 8,38 (s, 1H), 9,85 (bs, 1H), 10,11 (s, 2H).

13C RMN (125 MHz, DMSO) 525,1, 26,0, 28,2, 28,4, 30,7, 35,7, 68,3, 72,8, 82,9, 102,1, 109,6, 110,2, 112,4, 115,8, 119,9, 122,7, 122,8, 128,9, 129,0, 129,7, 131,7 , 135,3, 141,6, 142,8, 151,7, 153,8, 159,3, 162,2, 168,4.

6-bromo-2-(4-bromofeniI)-3-nitro-2H-tiocromeno (50)

[0143] 1H RMN (CDCI³ , 300 MHz) 55,50 (s, 1H), 7,05 (d, J = 8.6, 2H), 7,13 (d, J = 8,4, 1H), 7,36 (d, J = 8,6, 2H), 7,44 (dd, J = 8,4, 2,2, 1H), 7,61 (d, J = 2,2, 1H), 8,13 (s, 1H).

13C RMN (CDCI³ , 75 MHz) 539,2, 119,7, 122,7, 127,8, 128,7, 129,8, 130,6, 131,0, 132,1, 134,2, 135,1, 138,3, 144,0.

6,8-dibromo-2-(4-bromofeniI)-3-nitro-2H-tiocromeno (51)

[0144] 1H RMN (CDCI³ , 300 MHz) 55,59 (s, 1H), 7,06 (d, J = 8,5, 2H), 7,38 (d, J = 8,6, 2H), 7,57 (d, J = 1,9, 1H), 7,71 (d, J = 1,9, 1H), 8,10 (s, 1H).

13C RMN (CDCI³ , 75 MHz) 540,1, 119,2, 122,1, 122,9, 127,9, 130,5, 130,8, 132,3, 133,1, 133,3, 138,1, 138,2, 144,1.

6,8-dibromo-2-(4-bromofeniI)-2H-cromeno-3-carbaIdehldo (52)

[0145] 1H RMN (CDCI³, 300 MHz) 56,42 (s, 1H), 7,19 (d, J = 8,2, 2H), 7,33 (s, 1H), 7,34 (d, J = 2,2, 1H), 7,42 (d, J = 8,2, 2H), 7,65 (d, J = 2,2, 1H), 9,72 (s, 1H).

13C RMN (CDCI³ , 75 MHz) 574,1, 112,2, 114,0, 122,6, 123,1, 128,2, 130,6, 131,8, 134,8, 136,8, 138,5, 138,6, 150,4, 189,3.

Acido 6-bromo-2-(4-bromofeniI)-2H-cromeno-3-carboxlIico (53)

[0146] Pf = 208-210 °C. 1H RMN (DMSO-d6, 300 MHz) 56,23 (s, 1H), 6,78 (d, J = 8,6, 1H), 7,22-7,32 (m, 2H), 7.38 (dd, J = 8,6, 2,5 , 1H), 7,50-7,60 (m, 2H), 7,66 (d, J = 2,5, 1H), 7,74 (s, 1H).

13C RMN (DMSO- d6, 75 MHz) 574,0, 112,9, 118,6, 122,1, 122,5, 125,9, 129,3, 131,1, 131,9, 131,6, 134,4, 137,7, 151.6, 165,3.

Acido 6,8-dibromo-2(4-bromofeniI)-2H-cromeno-3-carboxlIico (54)

[0147] Pf = 256-258 °C. 1H RMN (DMSO- da, 300 MHz) 57,71 (d, J = 2,3, 1H), 6,37 (s, 1H), 7,29 (d, J = 8,4, 2H), 7,56 (d, J = 8,5, 2H ), 7,71 (d, J = 2,3, 1H), 7,73-7,78 (m, 2H).

13C RMN (DMSO- d6, 75 MHz) 575,1, 111,5, 113,8, 122,8, 124,1, 127,3, 129,6, 131,2, 131,5, 132,2, 136,8, 137,8, 149.1, 165,5.

Metil-6-bromo-2-(4-bromofenil)-2H-cromeno-3-carboxilato (55)

[0148] Pf = 118-120 °C. 1H RMN (CDCb, 300 MHz) 53,77 (s, 3H), 6,22 (s, 1H), 6,67 (d, J = 7,9, 1H), 7,21 (d, J = 8,5, 2H), 7,27-7,31 (m , 2H), 7,41 (d, J = 8,5, 2H), 7,59 (s, 1H).

13C RMN (CDCla, 75 MHz) 552,2, 74,7, 113,7, 118,7, 122,0, 123,1, 125,1, 128,9, 131,1, 131,8, 132,2, 134,9, 137,5, 152.3, 164,7.

Metil 6,8-dibromo-2-(4-bromofenil)-2H-cromo-3carboxilato (56)

[0149] 1H RMN (CDCb, 300 MHz) 53,81 (s, 3H), 6,36 (s, 1H), 7,21-7,31 (m, 3H), 7,38-7,48 (m, 2H), 7,55 (d, J = 2,2, 1H), 7,57 (s, 1H).

13C RMN (CDCb, 75 MHz) 552,4, 75,0, 111,9, 113,9, 123,1, 123,2, 126,1, 128,7, 130,2, 131,8, 131,9, 137,0, 137,3, 149.4, 164,5.

6-bromo-2-(4-bromofenil)-N,N-dimetil-2H-cromeno-3-carboxamida (57)

[0150] 1H RMN (CDCb, 500 MHz) 52,96 (s, 6H), 6,18 (s, 1H), 6,54 (s, 1H), 6,71 (d, J = 8,6, 1H), 7,19 (d, J = 2.4, 1H), 7,27 (d, J = 1,3, 3H), 7,44 (d, J = 8,4, 2H).

13C RMN (CDCb, 125 MHz) 535,2, 38,5, 76,8, 113,5, 118,1, 121,8, 122,9, 123,2, 128,6, 130,0, 130,4, 131,8, 133,4, 137,9, 151,6, 167,8.

6.8- bromo-2-(4-bromofenil)-N,N-dimetil-2H-cromeno-3-carboxamida (58)

[0151] 1H RMN (CDCb, 500 MHz) 52,99 (s, 6H), 6,29 (s, 1H), 6,56 (s, 1H), 7,15 (d, J = 2,2, 1H), 7,22-7,34 (m , 2H), 7,44 (d, J = 8,5, 2H), 7,52 (d, J = 2,2, 1H).

13C RMN (CDCb, 125 MHz) 535,3, 38,5, 111,3, 113,7, 122,9, 123,0, 123,1, 128,4, 129,2, 131,3, 131,8, 136,0, 137,3, 148.6, 162,3, 167,5.

6-bromo-2-(4-bromofenil)-2H-cromeno-3-carbaldehldo oxima (59)

[0152] Pf = 158-160 °C. 1H RMN (DMSO- d6, 500 MHz) 56,28 (s, 1H), 6,74 (d, J = 8,7, 1H), 7,09 (s, 1H), 7,29 (dd, J = 8,5, 3,2, 3H), 7,47 (d, J = 2,4, 1H), 7,49-7,57 (m, 2H), 7,97 (s, 1H), 11,44 (s, 1H).

13C RMN (DMSO- d6, 125 MHz) 574,3, 113,5, 119,0, 122,4, 124,3, 126,0, 130,0, 130,0, 130,2, 132,0, 133,0, 137,8, 147.6, 151,4.

6.8- bromo-2-(4-bromofenil)-2H-cromeno-3-carbaldehldo oxima (60)

[0153] Pf = 214-216 °C. 1H RMN (DMSO- d6, 500 MHz) 56,43 (s, 1H), 7,10 (s, 1H), 7,30 (d, J = 8,4, 2H), 7,52 (dd, J = 17,8, 5,4, 3H), 7,62 (d, J = 2,3, 1H), 8,01 (s, 1H), 11,57 (s, 1H).

13C RMN (DMSO- d6, 125 MHz) 575,0, 111,4, 113,8, 122,6, 125,5, 125,5, 129,5, 129,9, 131,1, 132,0, 134,9, 137,4, 147.4, 148,3.

6-bromo-2-(4-bromofenil)-2H-cromeno-3-carbonitrilo (61)

[0154] Pf = 136-138 °C. 1H RMN (CDCb, 500 MHz) 55,88 (s, 1H), 6,75 (d, J = 8,6, 1H), 7,23 (s, 1H), 7,27 (d, J = 2,3, 1H), 7,31 (d, J = 8,4, 2H), 7,37 (dd, J = 8,7, 2,4, 1H), 7,50-7,56 (m, 2H).

13C RMN (CDCb, 125 MHz) 5 75,6, 107,8, 114,5, 116,1, 118,8, 120,7, 124,0, 128,8, 130,6, 132,3, 135,7, 135,7, 137.1, 151,9.

6,8-dibromo-2-(4-bromofenil)-2H-cromeno-3-carbonitrilo (62)

[0155] Pf = 196-198 °C. 1H RMN (CDCb, 500 MHz) 56,01 (s, 1H), 7,23 (d, J = 1,1, 2H), 7,33 (d, J = 8,5, 2H), 7,54 (d, J = 8,5, 2H), 7,63 (d, J = 2,2, 1H).

13C RMN (CDCb, 125 MHz) 5 75,8, 108,6, 112,1, 114,6, 115,8, 121,6, 124,1, 128,5, 129,8, 132,3, 135,2, 136,6, 138,3, 148,9.

8-bromo-2-(4-bromo-fenil)-3-nitro-2H-cromeno-6-ol (63)

(MJ/4/180-2)

[0156] 1H RMN (500 MHz, CDCI³) 55,16 (bs, 1H), 6,61 (s, 1H), 6,77 (d, J = 2,9, 1H), 7,08 (d, J = 2,9, 1H), 7,24 (d, J = 8,5, 2H), 7,45 (d, J = 8,5, 2H), 8,05 (s, 1H).

13C RMN (125 MHz, CDCla) 5 73,5, 111,6, 115,5, 119,7, 123,7, 124,4, 128,4, 128,7, 132,0, 135,0, 142,3, 144,1, 151,0.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: efecto citotoxico de los compuestos de formula (I).

[0157] Se ha demostrado que las llneas celulares Jurkat y CEM son adictas a la ruta de serialization PI3K/AKT/mTOR para sobrevivir y proliferar (Beneteau, M. et. al. Localization of Fas/CD95 into the lipid rafts on down-modulation of the phosphatidylinositol 3-kinase signaling pathway. Molecular cancer research: MCR 6, 604­ 613, (2008); Pizon, M. et al. Actin independent exclusion of CD95 by PI3K/AKT signalling: Implications for apoptosis. European journal of immunology 41, (2011)).

Protocolo:

[0158] Las llneas de celulas T leucemicas Jurkat y CEM se incubaron durante 24 horas (ver Figuras 1, 2, 3, 4 y 5) o durante 20 horas (ver Figura 6) con compuestos de formula (I) y con el compuesto A, en las concentraciones indicadas y la muerte celular se evaluo mediante el ensayo de viabilidad MTT, que estima el estado metabolico de la celula.

Resultados:

[0159] Los resultados se muestran en las Figuras 1, 2, 3, 4, 5 y 6. Los compuestos de formula (I) desencadenan una fuerte senal de muerte celular en celulas CEM y Jurkat de acuerdo con la medicion del ensayo de MTT.

[0160] En las figuras 1 y 2, el compuesto A muestra un porcentaje menor de muerte celular que la mayorla de los compuestos de formula (I).

[0161] En las figuras 3, 4 y 5, LY294002 muestra un porcentaje de muerte celular mucho mas bajo que los compuestos de formula (I).

[0162] Estos resultados demuestran la fuerte actividad citotoxica de los compuestos de formula (I), en comparacion con otros inhibidores de la ruta PI3K/AKT/mTOR como el compuesto A y LY294002.

Ejemplo 2: actividad inhibidora de la ruta PI3K/AKT/mTOR de los compuestos de formula (I).

Protocolo:

[0163] La celula CEM se incubo con 10 pM de cada uno de los compuestos mencionados de formula (I) durante los tiempos indicados y luego las celulas se lisaron y se cargaron 100 pg de protelna por llnea y se resolvieron mediante SDS-PAGE. Los niveles de fosforilacion de AKT (sello distintivo de la activation de PI3K) y AKT total (control de carga) se analizaron mediante inmunoelectrotransferencia y la cantidad de fosforilacion de AKT relativa a la cantidad total de protelna AKT se cuantifico mediante analisis densitometrico, se exploro la intensidad de cada banda y el nivel de fosforilacion de AKT se declaro a la cantidad de AKT total y se represento el porcentaje de AKT fosforilado.

Resultados:

[0164] Como se muestra en las Figuras 7 y 8, los compuestos de formula (I) son inhibidores muy fuertes de la actividad PI3K/AKT, en particular los compuestos 9, 10, 13, 14, 18, 19 y 25 (ver Figura 8). Los otros compuestos probados tambien muestran una fuerte actividad inhibitoria (ver Figura 7).

[0165] Se debe tener en cuenta que el compuesto A, que se ha descrito en la tecnica anterior como inhibidor de PI3K, muestra una actividad inhibidora muy debil sobre PI3K, incluso sin actividad inhibitoria (ver Figuras 7 y 8). Ademas, como se muestra en la Figura 8, los compuestos de formula (I) muestran una actividad inhibitoria mas fuerte sobre la ruta PI3K/AKT/mTOR que LY294002.

[0166] Los resultados confirman que los compuestos de la invention inhiben fuertemente la ruta de PI3K/AKT/mTOR y son mas potentes que otros inhibidores de la ruta de PI3K/AKT/mTOR tales como el compuesto A y LY294002, especialmente mucho mas potentes que el compuesto A.

Ejemplo 3: IC⁵⁰ in cellulo de compuestos de formula (I).

Protocolo:

[0167] Las celulas CEM se incubaron durante 2 horas con las concentraciones indicadas de cada uno de los compuestos mencionados de formula (I). Las celulas se lisaron y se cargaron 100 mg de protelna por llnea en una SDS-PAGE. Las bandas de la fosforilacion de AKT y la AKT completa observadas mediante inmunoelectrotransferencia se analizaron y cuantificaron mediante analisis densitometrico. Basandose en estos valores, se midio una IC⁵⁰ in cellulo (media concentracion inhibitoria maxima) para cada compuesto de formula (I).

[0168] La IC⁵⁰ obtenida de los compuestos evaluado se menciona a continuacion en la Tabla 1:

Tabla 1

[0169] Cabe destacar que, entre los compuestos ensayados, el reactivo mas eficaz designado como compuesto 9, posee una IC⁵⁰ in cellulo a 0,4 |^j M, que es mucho mas eficiente que la IC⁵⁰ de LY294002, que es mayor que 10 mM.

Ejemplo 4: Compuestos de formula (I) como potentes inductores de muerte celular en celulas de cancer de mama triple negativo.

Protocolo:

[0170] Las llneas de celulas tumorales triple negativas MDA-MB-231 y MDA-MB-468 se incubaron con las concentraciones indicadas de cada compuesto de formula (I) mencionado durante 24 horas y luego se evaluo la muerte celular mediante un ensayo de ^mT^t .

Resultados:

[0171] En contraste con LY294002, los compuestos de formula (I) implementan una fuerte senal de muerte celular en celulas tumorales de mama triple negativas MDA-MB-231 y M^dA-MB-468 (ver Figuras 9 y 10). Estos resultados confirman que los compuestos de formula (I) son de interes para prevenir y/o tratar los canceres de mama, especialmente el cancer de mama triple negativo.

Ejemplo 5: Compuestos de formula (I) como potentes inductores de muerte celular en celulas de cancer de mama no triples negativas.

Protocolo:

[0172] Las llneas celulares de cancer de mama positivo a ER MCF-7 y T47-D y las llneas celulares de cancer de mama positivo a HER2 MDAMB-453 y BT474 (tambien positivo a ER) se incubaron con la concentracion indicada de cada compuesto mencionado de formula (I) durante 24 horas y luego se evaluo la muerte celular mediante ensayo MTT.

Resultados:

[0173] Los resultados se muestran en las tablas a continuacion:

Para cada llnea celular, el porcentaje de muerte celular (promedio de cuatro experimentos para las llneas celulares MCF-7 y T47-D, y dos experimentos para las llneas celulares MDA-MB-453 y BT474) se da en vista del aumento de la concentracion de cada compuesto evaluado de la invencion.

Llnea celular MCF-7 (ER-positivo)

[0174]

Llnea celular T47-D (ER-positivo)

[0175]

Llnea celular MDA-MB-453 (HER2-positivo)

[0176]

Llnea celular BT474 (ER-positivo/HER2-positivo)

[0177]

[0178] Los porcentajes de muerte celular inducidos por los compuestos de formula (I) son mas altos que los porcentajes de muerte celular inducidos por LY294002 con concentraciones de 6,25 a 50 pM. En algunos casos, los porcentajes de muerte celular inducidos por los compuestos de formula (I) son mayores que los porcentajes de muerte celular inducidos por LY294002 con concentraciones de 0,390625 a 50 pM.

[0179] Los compuestos de formula (I) implementan una fuerte senal de muerte celular en las celulas tumorales MCF-7, T47-D, BT474 y MDA-MB 453. Estos resultados confirman que los compuestos de formula (I) son de interes para prevenir y/o tratar el cancer de mama.

Ejemplo 6: Los compuestos de formula (I) inhiben la ruta de PI3K/AKT/mTOR y se unen a mTOR.

[0180] Figura 12A:

La inhibicion del nivel de fosforilacion de AKT en la serina 473, diana de mTORC2 y 4EBP1 (tambien llamada protelna 1 de union al factor 4E de iniciacion de la traduccion eucariotica) en treoninas 37/46, que son dianas de mTORCI, por el compuesto 48 (compuesto 25 vinculado a biotina) se evaluo por inmunotransferencia. El total de AKT y 4EBP1 se agregaron como controles de carga.

[0181] Estos resultados muestran que la fosforilacion de AKT y 4EBP1 disminuye con el aumento de las concentraciones del compuesto 48. Estos resultados muestran que los compuestos de formula (I) inhiben la ruta PI3K/AKT/mTOR mediante la inhibicion de la fosforilacion de los efectores posteriores de mTOR como AKT y 4EBP1.

[0182] Figura 12B:

Los compuestos 25 y 48 (compuesto 25 unido a biotina) (1 pM) se incubaron con celulas T leucemicas CEM durante los tiempos indicados. Luego, las celulas se lisaron en tampon RIPA y la biotina se inmunoprecipito mediante perlas magneticas recubiertas con estreptavidina. Las perlas se lavaron y la presencia de mTOR se analizo en el complejo asociado con el compuesto 48 mediante inmunotransferencia.

[0183] Los resultados muestran que el compuesto 48 se une a mTOR. Por lo tanto, los compuestos de formula (I) se dirigen a la protelna mTOR en llneas celulares tumorales.

Ejemplo 7: Toxicidad de los compuestos de la invencion in vivo

[0184] La actividad toxica in vivo del compuesto 25 se estudio como se indica a continuacion.

[0185] Los ratones recibieron inyecciones intravenosas repetidas del compuesto 25 (10 mg/kg) o vehlculo. Los resultados muestran que el tratamiento con el compuesto 25 no mostro toxicidad en ratones: el peso corporal de los ratones analizados se mantuvo y todos los ratones sobrevivieron a los 7 dlas (ver Fig. 13A y 13B).

Ejemplo 8: Actividad citotoxica de los compuestos de la invencion en celulas TSC2-/- y TSC2+/+.

[0186] Las celulas AML (AngioMioLipoma) de un paciente (donacion generosa del Dr. M. Pende, Paris) se enriquecieron para celulas TSC2-/-, como modelo de esclerosis tuberosa. Estas celulas se han reconstituido con TSC2 de tipo salvaje (TSC2+/+). La proliferacion celular se evaluo en celulas de angiomiolipomas y sus homologos se reconstituyeron con TSC2 de tipo salvaje. La Figura 14A muestra el numero de celulas obtenido en el tiempo.

[0187] La viabilidad celular se evaluo mediante un ensayo MTT. Las celulas se incubaron durante 16 horas en un medio que contenla suero de ternera fetal al 1 % suplementado con las concentraciones indicadas de los dos inhibidores de mTOR, compuesto 25 o rapamicina (ver Figuras 14B y 14C). Los datos representan la media y la desviacion estandar de tres experimentos independientes.

[0188] Estos resultados muestran que las celulas TSC2-/- son mas sensibles al compuesto 25 que las TSC2+/+ de tipo salvaje. Ademas, el compuesto 25 de la invencion es mas eficaz para matar celulas TSC2-/- que la rapamicina, que se usa en el tratamiento de la esclerosis tuberosa.

[0189] Por lo tanto, los compuestos de la invencion son utiles para tratar la esclerosis tuberosa y son mas eficaces que la rapamicina.

Ejemplo 9: Los compuestos de la invencion inhiben la actividad de mTORC1 en celulas TSC2-/-[0190] Las celulas AML (1,106 celulas) deficitarias para TSC2 (TS2-/-) o reconstituidas con TSC2 de tipo salvaje (TSC2+/+) (donacion generosa del Dr. M. Pende, Paris) se trataron o no se trataron durante los tiempos indicados con 10 pM de compuesto 25 o rapamicina y luego las celulas se lisaron. Se cargaron 100 pg de protelna y se resolvieron mediante SDS-PAGE y se realizaron las inmunotransferencias indicadas. El total de S6 y p-actina sirven como controles de carga. S6 se fosforila por p70S6K en su serina 240 y 244. 4EBP1 se fosforila por mTORC1 en su treonina en las posiciones 37 y 46. p70S6K y 4EBP1 son sustratos directos de mTORC1. La fosforilacion de 4EBP1 dirigida por mTORC1 se puede monitorizar mediante la aparicion de una banda de alto peso molecular que desaparece en presencia del compuesto 25 o rapamicina (ver la Figura 15). Es de destacar que la restauracion de la expresion de TS2 en celulas de AML reduce el nivel basal de la fosforilacion de S6 y 4EBP1.

[0191] Estos resultados muestran que los compuestos de la invencion, tales como el compuesto 25, inhiben la actividad de mTORCI en celulas TSC2+/+.

Ejemplo 10: Inhibition competitiva de mTOR por los compuestos de la invention.

[0192] A diferencia de la rapamicina, que cuando se une a FKBP12 interactua con e inhibe la actividad cinasa de mTORCI, los inhibidores de mTOR competitivos se dirigen tanto a mTORCI como a mTORC2.

[0193] Las celulas CEM (1,106 celulas) se incubaron con las concentraciones indicadas de compuesto 25 durante 2 horas y los lisados de las celulas se sometieron a analisis de inmunoelectrotransferencia. La actividad inhibitoria del compuesto 25 en los sustratos de mTORCI p70S6KThr389 y 4EBP1-Thr37 y 46 y en el sustrato de mTORC2 Akt-Ser473 y en el sustrato de PDK1 Akt-Thr308 se evaluo mediante inmunotransferencia. El total de 4EBP1, p70S6K, Akt y p-actina sirven como controles de carga. Los compuestos de la invencion y mas particularmente el compuesto 25 pueden ser inhibidores competitivos de mTOR porque inhiben los sustratos mTORC1 (4EBP1 y p70S6K) y mTORC2 (AKT en S473) como se muestra en la Figura 16.

Ejemplo 11: Prevention de la migration celular por los compuestos de la invencion en celulas de cancer de mama triple negativo (TNBC)

[0194] CD95L (tambien conocido como FasL) pertenece a la familia TNF (Factor de Necrosis Tumoral) y es el ligando para el "receptor de la muerte" CD95 (Fas/APO1). Esta citoquina transmembrana puede ser escindida por metaloproteasas para producir un ligando soluble. Este CD95L procesado naturalmente (cl-CD95L) en pacientes con cancer de mama triple negativo desencadena la migracion de celulas cancerosas y, al hacerlo, aumenta el riesgo de diseminacion metastasica en estos pacientes. A diferencia de la membrana unida a CD95L, cl-CD95L fracasa en inducir la apoptosis y en su lugar promueve la formation de un receptosoma atlpico aqul denominado Motility-Inducing Signaling Complex (MISC).

[0195] La formacion de MISC conduce a la induction de la ruta de serialization de fosfoinositida 3-cinasa (PI3K) prooncogenica / diana en mamlferos de rapamicina (mTOR.

[0196] Las llneas celulares de TNBC (MDA-MB-231 y BT549) se preincubaron durante 1 hora en presencia o ausencia de una cantidad no citotoxica del compuesto 25 (1 pM) y luego se trataron o no se trataron con CD95L (100 ng/ml) durante 24 horas. La migracion celular se analizo mediante el ensayo de camara de Boyden. Las celulas tenidas con Giemsa que migraban se lisaron y la absorbancia se midio a una longitud de onda de 560 nm. Los valores representan los medios ±SEM de tres experimentos realizados de forma independiente.

* p<0,05 segun lo calculado mediante la prueba de Mann-Whitney de dos colas.

[0197] Los resultados muestran que 1 pM del compuesto 25 fue suficiente para anular la migracion de las celulas tumorales estimuladas con el factor promigratorio CD95L (vease la Figura 17).

Material y metodos de los ejemplos:

Anticuerpos y otros reactivos

[0198] LY294002 y Wortmannin se adquirieron de Calbiochem (Merck Chemicals Ltd., Nottingham, Reino Unido). Los antisueros Anti-mTOR, anti-4EBP, anti-4EBP fosforilada, anti-AKT y anti-AKT fosforilada fueron de Cell Signaling Technology, Inc (Boston, MA, EE. UU.).

Lfneas celulares

[0199] Las llneas de celulas T leucemicas humanas Jurkat y CEM y las llneas de celulas T del linfoma H9 se cultivaron en RPMI suplementado con 8 % (v/v) de FCS inactivado por calor y L-glutamina 2 mM a 37 °C en una incubadora de CO² al 5 %. Las llneas celulares de cancer de mama humano BT549, BT474, MDA-MB-231, MDA-MB-468, MDA-MB-453, T47D y MCF7 se cultivaron en DMEM complementado con 8 % v/v de suero de ternera fetal inactivado por calor (FCS) y 2 mM de glutamina L a 37 °C en una incubadora de CO² al 5 %. Todas las celulas procedlan de la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (ATCC, LGC Standards, Molsheim, Francia).

Inmunoprecipitacion del compuesto 25-biotina (compuesto 48)

[0200] Se preincubaron celulas CEM (107 celulas) durante los tiempos indicados con 1 pM de compuesto 25 o compuesto 48, se lavaron con PBS y se lisaron usando tampon RIPA [Tris 50 mM pH 7,4, NP-40 al 1 %, Nadesoxicolato al 0,5 %, SDS al 0,1%, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, inhibidores de la proteasa y fosfatasa (Sigma)]. A continuation, el compuesto 48 se inmunoprecipito usando perlas magneticas recubiertas con estreptavidina (Ademtech, Burdeos, Francia) y despues de un lavado exhaustivo, el complejo inmunitario se resolvio mediante SDS-PAGE y se revelo mTOR mediante inmunoelectrotransferencia.

Inmunotransferencias

[0201] Excepto por los experimentos de inmunoprecipitacion en los que las celulas se lisaron con tampon RIPA, las celulas se lisaron durante 30 min a 4 °C en tampon de lisis (HEPES 25 mM pH 7,4, Triton X-100 al 1 % v/v, NaCl 150 mM, EGTA 2 mM complementado con una mezcla de inhibidores de proteasa). La concentracion de protelna se determino mediante el metodo del acido bicinconlnico (Pierce, Rockford, IL, EE. UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las protelnas se resolvieron mediante SDS-PAGE al 8, 10 o 12 % y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido). La membrana se bloqueo 15 min con TBST (Tris 50 mM, NaCl 160 mM, Tween 20 al 0,05 % v/v, pH 7,4) que contenla un 5b% p/v de leche desnatada (TBSTM). El anticuerpo primario se incubo durante la noche a 4 °C en TBSTM. La membrana se lavo intensivamente (TBST) y luego se anadio IgG1 o IgG2a antirraton marcada con peroxidasa (CliniSciences, Nanterre, Francia) durante 45 min. Las protelnas se visualizaron con el kit de sustrato de quimioluminiscencia mejorada (ECL RevelBlOt®, Ozyme, Saint Quentin en Yvelines, Francia).

Ensayos de muerte celular

[0202] La viabilidad celular se evaluo mediante el ensayo de viabilidad de bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio (MTT) (1). En resumen, se cultivaron celulas (4x104 por pocillo) durante 20 h en placas de 96 pocillos de fondo plano con diversas concentraciones del inductor de apoptosis. Luego se agregaron a cada pocillo 0,015 ml de MTT (5 mg/ml en PBS) y se incubaron durante 4 horas a 37 °C. Los precipitados de sal de formazan se disolvieron agregando 0,115 ml de alcohol isopropllico que contenla acido formico al 1 % (v/v), y la absorbancia se midio a 570 nm.

Ensayos de motilidad in vitro

[0203] Despues de la hidratacion con membrana de las camaras de Boyden (Millipore, Molsheim, Francia) que contienen membranas de poros de 8 mm, se agregaron 105 celulas a la camara superior. La camara inferior se lleno con medio con bajo contenido de suero (1 %) en presencia o ausencia de cl-CD95L (100 ng/ml). Las celulas de cancer de mama se incubaron durante 24 h. Para cuantificar la invasion, las celulas se fijaron con metanol y se tineron con Giemsa. Las celulas tenidas se eliminaron luego del lado superior de la membrana con un hisopo con punta de algodon y se tomaron cinco imagenes representativas de cada insercion de las celulas invasoras desde el lado contrario. Para cada experimento, las celulas invasoras se lisaron y se midio la absorbancia a 560 nm.

Bibliograffa

[0204] Weichert H, Blechschmidt I, Schroder S, Ambrosius H. The MTT-assay as a rapid test for cell proliferation and cell killing: application to human peripheral blood lymphocytes (PBL). Allerg Immunol (Leipz).

1991;37:139-44.

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto que tiene la siguiente formula (i):

en donde X es O o S y Ri se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo (C₁-C₁₀), alcoxilo (C₁-C₁₀), alquenilo (C₂-C₁₀), alquinilo (C₂-C₁₀), OH, un atomo de fluor, un atomo de bromo y un atomo de yodo;

o sus sales, hidratos o sales hidratadas farmaceuticamente aceptables o sus estructuras cristalinas polimorfas, racematos, diastereomeros o enantiomeros.

2. El compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que Ri se selecciona del grupo que consiste en H, un atomo de fluor, un atomo de bromo o un atomo de yodo.

3. El compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, que tiene una de las siguientes formulas:

y

o sus sales, hidratos o sales hidratadas farmacéuticamente aceptables o sus estructuras cristalinas polimorfas, racematos, diastereomeros o enantiomeros.

4. El compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, que tiene la siguiente formula:

o sus sales, hidratos o sales hidratadas farmaceuticamente aceptables o sus estructuras cristalinas polimorfas, racematos, diastereomeros o enantiomeros.5

5. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para uso en la prevention y/o el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en: enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, enfermedades neurodegenerativas, canceres, rechazo de trasplantes y enfermedades caracterizadas por un envejecimiento prematuro.

6. El compuesto para el uso de acuerdo con la reivindicacion 5, en el que la enfermedad se selecciona entre los canceres.

7. El compuesto para el uso de acuerdo con la reivindicacion 6, en el que el cancer es cancer de mama.

8. El compuesto que tiene la formula (i) de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para uso en la prevencion y/o el tratamiento de la esclerosis tuberosa.