ES2708703T3 - Producción, almacenamiento y uso de enzimas de degradación de paredes celulares - Google Patents

Producción, almacenamiento y uso de enzimas de degradación de paredes celulares Download PDF

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Abstract

Un proceso de degradación de componentes de las paredes celulares de plantas de materia vegetal, que comprende: (i) expresar en plantas o partes de las mismas una o más de una enzima de degradación de paredes celulares heteróloga o transfectar pantas o partes de las mismas con una molécula de ácido nucleico que comprende una construcción de ácido nucleico que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica una o más de una enzima de degradación de paredes celulares y que expresa en dicha planta o partes de la misma dicha una o más de una enzima de degradación de paredes celulares; (ii) cosechar dichas plantas o partes que contienen dicha una o más de una enzima de degradación de paredes celulares; (iii) almacenar la cosecha como un ensilado, siendo el tiempo de almacenamiento mínimo de 21 días; y (iv) tratar dicha materia vegetal con el ensilado de la etapa (iii) para degradar los componentes de las paredes celulares de plantas de la materia vegetal, en donde dicho tratamiento comprende la adición del ensilado de la etapa (iii) a dicha materia vegetal; en donde dicha una o más de una enzima de degradación de paredes celulares se selecciona entre endoglucanasas, exoglucanasas, exocelulasas, ß-glucosidasas y combinaciones de las mismas.

Description

DESCRIPCION
Produccion, almacenamiento y uso de enzimas de degradacion de paredes celulares
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a un proceso de degradacion de componentes de las paredes celulares de plantas de materia vegetal. La invencion tambien se refiere a un proceso de almacenamiento de enzimas de degradacion de las paredes celulares y a un uso de ensilado que contiene una o mas de una enzima de degradacion de paredes celulares activa para degradar componentes de paredes celulares de plantas de materia vegetal o para la produccion de bioalcohol. Ademas, se proporciona un proceso de produccion de un bioalcohol tal como bioetanol a partir de materia vegetal.
Antecedentes de la invencion
La produccion de bioalcohol, en gran parte bioetanol, se usa ampliamente en todo el mundo como aditivo para el combustible y la gasolina como un sustituyente al menos parcial de fuentes fosiles para combustibles. Las preocupaciones, justificadas o no, con respecto al cambio climatico agravadas por el dioxido de carbono derivado de los combustibles fosiles ha llevado a un aumento constante en la produccion de bioetanol en los ultimos anos. Sin embargo, la produccion de bioetanol a base de plantas cultivadas en campos de cultivo consume enormes areas de campo agncola limitado y, por lo tanto, compite con la produccion de alimentos y lleva a un aumento en los precios de los alimentos.
Los procesos convencionales para la produccion de bioetanol se basan en la fermentacion de glucosa derivada del almidon. Aunque la celulosa es un componente principal de las paredes celulares de plantas tambien consiste en unidades de glucosa, el bioetanol a base de celulosa (bioetanol celulosico) no ha tenido un papel significante hasta el momento en la produccion de bioetanol, puesta que la descomposicion de celulosa en glucosa resulta complicado a escala industrial. Por ejemplo, las etapas de hidrolisis qmmica para descomponer la celulosa en fragmentos de celulosa o glucosa se usan frecuentemente antes de emplearse procesos microbianos. Por estas razones, la celulosa, aunque se produce de forma abundante por las plantas, resulta complicada en convertirla en bioetanol. Por lo tanto, se desean en gran medida mejoras en el uso de celulosa para la produccion de bioalcohol. Se proporciona una revision sobre la produccion de biocombustible por Sticklen, Nature Reviews 9 (2008), 433-443.
Para evitar la hidrolisis qmmica o etapas pre-hidrolisis en la descomposicion de celulosa, se buscan ampliamente procesos enzimaticos (vease, por ejemplo, Bansal y col., Biotechnology Advances 27 (2009) 833-848). Sin embargo, se requieren multiples enzimas para descomponer la celulosa o el material de las paredes celulares en glucosa. Ademas, las enzimas requeridas para la descomposicion necesitan producirse en procesos de produccion independientes del proceso de fermentacion de la glucosa y representan un factor de alto coste para la produccion de bioalcohol celulosico. Ademas, estos procesos de produccion son procesos sofisticados que requieren conocimiento y equipamiento experto tal como se encuentra en la industria biotecnologica, pero no pueden llevarse a cabo de forma descentralizada tal como por agricultores en granjas en las que se produce la materia vegetal a convertir en bioalcohol, lo que hace que el proceso de produccion de bioalcohol completo a partir de celulosa sea complejo y no economico.
El documento WO 98/16651 A2 se refiere a la produccion de enzimas de degradacion de celulosa en plantas geneticamente recombinantes. Describe que se pueden usar plantas enteras transformadas para expresar celulasas directamente o anadidas a materia vegetal ensilada para aumentar el grado de fermentacion de la materia ensilada. Partiendo de la tecnica anterior, es un problema de la presente invencion proporcionar enzimas de degradacion de paredes celulares de plantas de modo economico. Es un problema adicional de la invencion proporcionar un proceso para la produccion y/o almacenamiento de enzimas de degradacion de paredes celulares de plantas que pueda llevarse a cabo facilmente tal como por los agricultores. Otro problema mas es proporcionar un proceso para degradar componentes de paredes celulares de plantas de materia vegetal y proporcionar un proceso para la produccion de bioalcohol.
Sumario de la invencion
Estos problemas se resuelven de acuerdo con las reivindicaciones. Tambien se describe:
(1) Un proceso de produccion de una preparacion de enzimas de degradacion de paredes celulares, que comprende: (i) expresar en plantas o partes de plantas una o mas de una enzima de degradacion de paredes celulares heterologa; (ii) cosechar dichas plantas o parte de planta que contiene dicha una o mas de una enzima de degradacion de paredes celulares; y (iii) almacenar la cosecha como un ensilado.
(2) Un proceso de produccion de una preparacion de enzimas de degradacion de paredes celulares, que comprende:
(i) transfectar pantas o partes de las mismas con una molecula de acido nucleico que comprende una construccion de acido nucleico que contiene una secuencia de nucleotidos que codifica una o mas de una enzima de degradacion de paredes celulares y que expresa en dicha planta o partes de la misma dicha una o mas de una enzima de degradacion de paredes celulares; (ii) cosechar dichas plantas o partes que contienen dicha una o mas de una enzima de degradacion de paredes celulares; y (iii) almacenar la cosecha como un ensilado.
(3) El proceso de acuerdo con (1) o (2), en donde dicha una o mas de una enzima de degradacion de paredes celulares es una enzima celulolftica seleccionada entre o tal como endoglucanasas, exoglucanasas, exocelulasas, p-glucosidasas o combinaciones de los mismos; hemicelulasas; pectinasas; y/o enzimas de degradacion de lignina.
(4) El proceso de acuerdo con una cualquiera de (1) a (3), en donde dichas enzimas de degradacion de paredes celulares son enzimas secretoras en el organismo del cual derivan.
(5) El proceso de acuerdo con cualquiera una de (1) a (4), en donde la etapa (iii) comprende almacenar dichas plantas o partes de las mismas cosechadas durante al menos 1 mes en una atmosfera reducida en oxfgeno a temperatura ambiente.
(6) El proceso de acuerdo con una cualquiera de (1) a (5), en donde la etapa (iii) comprende fermentacion o acidificacion de bacterias de acido lactico para producir condiciones addicas en dicho ensilado.
(7) El proceso de acuerdo con una cualquiera de (1) a (6), en donde dichas enzimas de degradacion de paredes celulares expresadas en el citosol de celulas de dichas plantas o partes de las mismas, o dichas enzimas de degradacion de paredes celulares estan dirigidas al apoplasto o plastidios de dicha plante o partes de planta. (8) El proceso de acuerdo con (1), en donde la etapa (i) comprende transfectar dichas plantas o partes de las mismas con una molecula de acido nucleico que comprende una construccion de acido nucleico que contiene una secuencia de ADN que codifica dicha una o mas enzima(s) de degradacion de paredes celulares.
(9) El proceso de acuerdo con una cualquiera de (1) a (8), en donde la etapa (i) comprende la pulverizacion aerea de partes de dicha planta con una suspension acuosa que contiene celulas de una cepa de Agrobacterium que comprende una molecula de ADN que comprende una construccion de acido nucleico que contiene una secuencia de ADN que codifica dicha una o mas de una enzima de degradacion de paredes celulares.
(10) El proceso de acuerdo con una cualquiera de (1) a (8), en donde la etapa (i) comprende la pulverizacion aerea de partes de dicha planta con una suspension acuosa que contiene celulas de una cepa de Agrobacterium que comprende una molecula de ADN que comprende una construccion de acido nucleico que codifica un replicon de ADN o ARN que codifica dicha una o mas de una enzima de degradacion de paredes celulares. (11) El proceso de acuerdo con cualquiera una de (1) a (10), en donde la etapa (iii) comprende almacenar las plantas o partes de plantas cosechadas en un contenedor o bolsa cerrada en condiciones de contenido de oxfgeno reducido para permitir la fermentacion de acido lactico.
(12) Ensilado que contiene una o mas de una enzima de degradacion de paredes celulares activa, dicho ensilado obtenible mediante el almacenamiento de planta o partes de plantas que contienen enzimas de degradacion de paredes celulares expresadas en un contenido de oxfgeno reducido para permitir la fermentacion de acido lactico, en donde dicha una o mas de una enzima de degradacion de paredes celulares puede ser heterologa con respecto a dicha planta o parte de planta.
Los inventores han encontrado sorprendentemente que las enzimas de degradacion de paredes celulares cuando se expresan en plantas, en especial cuando se expresan a un alto nivel, pueden almacenarse como un ensilado de estas plantas sobre penodos extendidos de tiempo con poca perdida de actividad enzimatica. Por lo tanto, las enzimas de degradacion de paredes celulares expresadas no necesitan purificarse a partir de otros componentes vegetales, tales como proteasas, para mantener la actividad, lo que ahorra costes considerables. Los inventores han encontrado adicionalmente que las enzimas que degradan materia de paredes celulares de plantas tienen una estabilidad excepcional cuando se almacena la planta o partes de planta que han expresado las enzimas. La estabilidad en estas condiciones es superior que en muchas protemas nativas. Por consiguiente, el almacenamiento en ensilado lleva a un enriquecimiento de estas enzimas en la protema soluble total. En la forma del ensilado de las plantas o partes de planta que contienen enzimas de degradacion de paredes celulares expresadas, las enzimas de degradacion de paredes celulares pueden almacenarse hasta que se requieran las enzimas, por ejemplo, para un proceso de degradacion de componentes de paredes celulares de plantas de materia vegetal en un proceso de produccion de un bioalcohol. Cuando se usa, se puede anadir el ensilado, en el medio de reaccion, a las plantas o materia de paredes celulares de materia vegetal del cual debena degradarse. La invencion tiene la ventaja que las plantas que contienen enzimas de degradacion de paredes celulares pueden producirse facilmente y almacenarse en una granja mediante el uso de tecnicas conocidas en general por un agricultor, como el ensilado de forraje que es un metodo ampliamente usado para conservar alimento de animales durante penodos en los que el forraje fresco es limitado. Se puede evitar la purificacion de enzimas de degradacion de paredes celulares de plantas y costes asociados con la misma. En la produccion de bioalcohol, el ensilado tambien se somete a sacarificacion y proceso de fermentacion de bioalcohol. Por lo tanto, la invencion tiene una eficacia sin precedentes y relacion costo eficacia.
Breve descripcion de las figuras
La Fig. 1 destaca la relacion entre las actividades de enzimas involucradas en la hidrolisis de celulosa. Las endoglucanasas escinden las cadenas de celulosa internamente, proporcionando extremos de cadena reductores y no reductores que se someten a escision de celobiohidrolasa (exoglucanasa). Las celobiohidrolasas escinden extremos de cadenas de celulosa que liberan celooligosacaridos, preferentemente celobiosa. La pglucosidasa hidroliza la celobiosa en glucosa.
La Fig. 2 muestra esquematicamente vectores que se usan para la optimizacion de la expresion transitoria de enzimas de degradacion de paredes celulares.
(A) modulos de provectores de extremo 5' basados en TMV: construccion de pICH22455 para expresion citosolica de protemas de interes con marcador (6)-His de extremo N y sitio de escision de enteroquinasa (His-EK); construcciones para el apoplasto dirigido contra pICH20155, pICH20188, pICH20388 y pIcH20999 que contiene presecuencias de direccionamiento de apoplasto de amilasa de arroz (apoRA), Nicotiana plumbaginifolia calreticulin (apoNC), pectinasa de manzana (apoAP) y amilasa de cebada (apoBA), respectivamente. El plasmido de plCH22464 contiene presecuencia de direccionamiento de apoplasto a partir de calreticulina de Nicotiana plumbaginifolia seguida por marcador de (6)-His y sitio de escision de enteroquinasa (His-EK). La construccion de pICH20030 para el direccionamiento de cloroplasto de la protema de interes expresada contiene presecuencia de direccionamiento de cloroplasto (CTP).
(B) modulos de provectores de extremo 3' basados en TMV: Los modulos de extremo 3' para la expresion de endoglucanasa E1 a partir de Acidothermus cellulolyticus (pNMD231), Exoglucanasa 1 (CBHI) a partir de Trichoderma reesei (pNMD241), exocelulasa E3 a partir de Thermobifida fusca (pNMD251), p-glucosidasa BGL4 a partir de Humicola grisea (pNMD910) y GFP (pICH7410).
(C) Modulo de integrasa de pICHl4011. LB y Rb , bordes izquierdo y derecho binarios, respectivamente; Pact, promotor 2 de actina de Arabidopsis; Phsp, promotor de protema de choque termico hsp 81.1 de Arabidopsis; T, terminador nos; RdRp, polimerasa de a Rn dependiente de ARN; MP, protema de movimiento; int, intron; AttP y AttB, sitios de recombinacion; apoRA, apoNC, apoAP y apoBA, presecuencias de direccionamiento de apoplasto a partir de a-amilasa de arroz, calreticulina de Nicotiana plumbaginifolia, pectinasa de manzana y amilasa de cebada, respectivamente; CTP, presecuencia de direccionamiento de cloroplasto; NLS, senal de localizacion nuclear.
La Fig. 3 proporciona una vision general sobre la inoculacion agrobacteriana para la optimizacion de la expresion transitoria de celulasas en Nicotiana benthamiana como fusiones traslacionales con respecto a distintas secuencias de extremo N. Para cada protema de fusion, se inocularon las muestras en 3 plantas distintas; la materia vegetal se cultivo a 7 u 8 dpi (dfas post inoculacion).
La FIg. 4 son fotograffas que muestran los fenotipos de hojas de Nicotiana benthamiana que expresan transitoriamente endoglucasa E1 a partir de Acidothermus cellulolyticus, exoglucanasa 1 (CBHI) a partir de Trichoderma reesei, exocelulasa E3 a partir de Thermobifida fusca y p-glucosidasa Bgl4 a partir de Humicola grisea como fusion con respecto a secuencias distintas a 8 dpi. Secuencias de fusion de extremo N:
1 - Marcador (6)-His y sitio de escision de enteroquinasa (His-EK);
2 - presecuencia de direccionamiento de apoplasto de amilasa de arroz;
3 - Presecuencia de direccionamiento de apoplasto de calreticulina de Nicotiana plumbaginifolia;
4 - Presecuencia de direccionamiento de apoplasto de calreticulina de Nicotiana plumbaginifolia seguida por marcador de (6)-His y sitio de escision de enteroquinasa (His-EK);
5 - presecuencia de direccionamiento de apoplasto de pectinasa de manzana;
6 - presecuencia de direccionamiento de apoplasto de a-amilasa de cebada;
7 - presecuencia de direccionamiento de cloroplasto;
8 - Presecuencia de direccionamiento de cloroplasto seguida por marcador de (6)-His y sitio de escision de enteroquinasa (His-EK).
La Fig. 5 muestra los resultados de optimizacion de expresion transitoria de celulasas mediante el cribado de fusiones de celulasa con respecto a distintas secuencias de extremo N para la expresion mas alta usando provectores de TMV. se inoculacion diluciones de 1:100 de cultivos de Agrobacterium mediante jeringa; se cosecho la materia vegetal a 11 dpi. Los extractos proteicos que conteman 10 pg de TSP se separaron en SDS-PAGE al 10 % y se tineron usando Coomassie. Se analizaron hojas de distintas edades (jovenes, de edad media y viejas) de cada planta. las vfas son las siguientes:
1 - Marcador de protemas pretenido de PageRuler™ (#SM0671, Fermentas);
2 - Tejido de hoja no infectado;
3 - fusion con marcador (6)-His y sitio de escision de enteroquinasa (His-EK);
4 - fusion con presecuencia de direccionamiento de apoplasto de amilasa de arroz;
5 - fusion con presecuencia de direccionamiento de apoplasto de calreticulina de Nicotiana plumbaginifolia; 6 - fusion con resecuencia de direccionamiento de apoplasto de calreticulina de Nicotiana plumbaginifolia seguida por marcador de (6)-His y sitio de escision de enteroquinasa (His-EK);
7 - fusion con presecuencia de direccionamiento de apoplasto de pectinasa de manzana;
8 - fusion con presecuencia de direccionamiento de apoplasto de a-amilasa cebada;
9 - fusion con presecuencia de direccionamiento de cloroplasto;
10 - fusion con presecuencia de direccionamiento de cloroplasto seguida por marcador de (6)-His y sitio de escision de enteroquinasa (His-EK);
11 -Albumina de suero bovino (Sigma, A4503);
12 - Albumina de suero bovino (A4503, Sigma).
La Fig. 6 muestra la optimizacion de la expresion transitoria de celulasas mediante cribado de fusiones de celulasa con respecto a distintas secuencias de extremo N para la actividad enzimatica mas alta por mg de TSP y gramos de peso en fresco de tejido vegetal usando provectores de TMV.
(A) p-glucosidasa Bgl4, (B) endoglucanasa E1, (C) exoglucanasa CBHI, (D) exoglucanasa E3. Los extractos de TSP (protema soluble total) se preparan a partir de materia vegetal que expresa las siguientes fusiones de celulasa:
1 - Marcador (6)-His y sitio de escision de enteroquinasa (His-EK);
2 - presecuencia de direccionamiento de apoplasto de amilasa de arroz;
3 - Presecuencia de direccionamiento de apoplasto de calreticulina;
4 - Presecuencia de direccionamiento de apoplasto de calreticulina seguida por marcador de (6)-His y sitio de escision de enteroquinasa (His-EK);
5 - presecuencia de direccionamiento de apoplasto de pectinasa de manzana;
6 - presecuencia de direccionamiento de apoplasto de a-amilasa de cebada;
7 - presecuencia de direccionamiento de cloroplasto;
8 - Presecuencia de direccionamiento de cloroplasto seguida por marcador de (6)-His y sitio de escision de enteroquinasa (His-EK);
9 - Muestras de TSP preparadas a partir de materia vegetal no infectada.
La Fig. 7 muestra esquematicamente vectores basados en TMV que se usan para la produccion a gran escala preparatoria de enzimas de degradacion de paredes celulares:
construccion de pNMD1201 para expresion citosolica de p-glucosidasa BGL4 a partir de Humicola grisea, construccion de pNMD1213 para la expresion citosolica de BGL4 con marcador (6)-His de extremo N y sitio de escision de enteroquinasa (His-EK),
construccion de pNMD1192 para la expresion de BGL4 con presecuencia de direccionamiento de cloroplasto, construccion de pNMD1231 para la expresion de endoglucanasa E1 a partir de Acidothermus cellulolyticus como una fusion con presecuencia de direccionamiento de apoplasto a partir de amilasa de arroz, construccion de pNMD1181 para la expresion de exoglucanasa 1 (CBHI) a partir de Trichoderma reesei como una fusion con presecuencia de direccionamiento de apoplasto de amilasa de cebada,
construccion de pNMD1161 para la expresion de exocelulasa E3 a partir de Thermobifida fusca como una fusion con presecuencia de direccionamiento de apoplasto de pectinasa de manzana,
construccion de pNMD1129 para la expresion citosolica de E3 como una fusion con presecuencia de direccionamiento de cloroplasto seguida por marcador (6)-His y sitio de escision de enteroquinasa (His-EK). Para los comentarios de los elementos de construccion, vease la descripcion de la Fig. 2.
La Fig. 8 ilustra el analisis de distintos metodos de inoculacion para la expresion de celulasa mas alta de fusiones de celulasa seleccionadas: infiltracion por jeringa frente a pulverizacion con suspension de agrobacterias que albergan construcciones de TMV ensambladas. Analisis SDS-PAGE de expresion de celulasa en extractos en bruto. Las flechas indican las bandas de celulasa expresadas en casos en los que la celulasa no se expresa en gran medida en comparacion con otras bandas.
1 - Marcador de protemas pretenido de PageRuler™ (#SM0671, Fermentas);
2 - Tejido de hoja no infectado;
3 - p-glucosidasa de BGL4 a partir de Humicola grisea expresada en citosol (construccion de pNMD1201); 4 - Bgl4 expresado en citosol como una fusion con marcador (6)-His y sitio de escision de enteroquinasa (His-EK ) (construccion de pNMD1213);
5 - Bgl4 dirigido a cloroplasto (construccion de pNMD1192);
6 - endoglucanasa E1 a partir de Acidothermus cellulolyticus dirigido al apoplasto mediante fusion con presecuencia de amilasa de arroz (pNMD1231);
7 - exoglucanasa 1 (CBHI) a partir de Trichoderma reesei dirigida a apoplasto mediante la fusion con presecuencia de a-amilasa de cebada (pNMD1181);
8 - exocelulasa E3 a partir de Thermobifida fusca dirigida a apoplasto mediante fusion con presecuencia de pectinasa de manzana (pNMD1161);
9 - E3 dirigido a cloroplasto (presecuencia de direccionamiento de cloroplasto seguida por marcador de (6)-His y sitio de escision de enteroquinasa (His-EK) (pNMD1129).
La Fig. 9 muestra los resultados de una comparacion de distintos metodos de inoculacion para la expresion de celulasa mas alta de fusiones de celulasa seleccionadas: infiltracion por jeringa frente a pulverizacion con suspension de agrobacterias que albergan construcciones de TMV ensambladas. Analisis de la actividad enzimatica de las hojas de Nicotiana benthamiana inoculadas usando una jeringa (7 dpi, dilucion 1:100 de cultivo agrobacteriano DO600=1,3) y mediante pulverizacion (11 dpi, dilucion 1:1000 de cultivo agrobacteriano DO600=1,3).
(A) p-glucosidasa BGL4 a partir de Humicola grisea Bgl4. 1 - Bgl4 expresado en citosol (pNMD1201); 2 - Bgl4 expresado en citosol como una fusion con marcador (6)-His y sitio de escision de enteroquinasa (His-EK ) (pNMD1213); 3 - Bgl4 dirigido a cloroplasto (pNMD1192); 4 -tejido de hoja no infectado.
(B) endoglucanasa E1 a partir de Acidothermus cellulolyticus. 1 - Fusion de E1 con presecuencia de amilasa de arroz (pNMD1231); 2 - tejido de hoja no infectado.
(C) Exoglucanasa 1 (CBHI) a partir de Trichoderma reesei. 1 - Fusion de CBHI con presecuencia de aamilasa de cebada (pNMD1181); 2 - tejido de hoja no infectado.
(D) Exocelulasa E3 a partir de Thermobifida fusca. 1 - Fusion de E3 con presecuencia de pectinasa de manzana (pNMD1161); 2 - Fusion de E3 con presecuencia de direccionamiento de cloroplasto seguida por marcador de (6)-His y sitio de escision de enteroquinasa (His-EK ) (pNMD1129); 3 - tejido de hoja no infectado.
La Fig. 10 muestra los resultados de un analisis de las condiciones de almacenamiento de la materia vegetal que expresa fusiones de celulasa de p-glucosidase Bgl4 de Humicola grisea seleccionadas.
(A) Actividad enzimatica de muestras de TSP que contienen fusiones de p-glucosidasa Bgl4 de Humicola grisea extrafdas a partir de materia vegetal y almacenadas durante distintos penodos de tiempo en distintas condiciones; analisis de extractos de protemas en bruto
(B) y extractos de TSP (C) mediante SDS-PAGE con tincion Coomassie;
(D) porcentaje de estimacion de TSP de fusiones de Bgl4 recombinante (4 semanas de tiempo de almacenamiento). L - Marcador de protemas pretenido de PageRuler™ (#SM0671, Fermentas);
1 a 3 - materia vegetal almacenada a -80 °C;
4 a 6 - materia vegetal almacenada como ensilado;
7 a 9 - materia vegetal almacenada como masa en seco;
1, 4 y 7 - materia vegetal que expresa Bgl4 citosolico;
2, 5 y 8 - materia vegetal que expresa Bgl4 dirigido a cloroplasto;
3, 6 y 9 - materia vegetal no infectada.
La Fig. 11 muestra los resultados de un analisis de las condiciones de almacenamiento de la materia vegetal que expresa fusiones de endoglucanasa E1 de Acidothermus cellulolyticus y exoglucanasa CBHI de Trichoderma reesei seleccionadas.
(A) Actividad enzimatica de muestras de TSP que contienen fusiones de endoclucanasa E1 extrafdas de materia vegetal y almacenadas durante distintos penodos de tiempo en distintas (izquierda: 5 semanas; derecha: 14 semanas) en distintas condiciones. 1, 3 y 5 - materia vegetal que expresa E1 a partir de Acidothermus cellulolyticus dirigido al apoplasto mediante fusion con presecuencia de amilasa de arroz (pNMD1231); 2, 4 y 6 - materia vegetal no infectada;
(B) Actividad enzimatica de muestras de TSP que contienen fusiones de exoglucanasa CBHI de Trichoderma reesei extrafdas a partir de materia vegetal y almacenadas durante distintos penodos de tiempo en distintas condiciones. 7, 8 y 9 - materia vegetal que expresa CBHI dirigido a apoplasto (fusion con presecuencia de aamilasa de cebada, construccion de pNMD1181); 2, 4 y 6 - materia vegetal no infectada;
Analisis de extractos de protemas en bruto (C) y extractos de TSP (D) usando SDS-PAGE;
(E) porcentaje de estimacion de TSP de fusiones de E1 y CBHI recombinante (4 semanas de tiempo de almacenamiento);
1, 2 y 7 - materia vegetal almacenada a -80 °C;
3, 4 y 8 - materia vegetal almacenada como ensilado;
5, 6 y 9 - materia vegetal almacenada como masa en seco.
La Fig. 12 muestra el analisis de las condiciones de almacenamiento de materia vegetal que expresa fusiones de exocelulasa E3 de Thermobifida fusca seleccionadas.
(A) Actividad enzimatica de muestras de TSP que contienen fusiones de exoglucanasa E3 extrafdas a partir de materia vegetal y almacenadas durante distintos penodos de tiempo en distintas condiciones, 1, 4 y 7 -materia vegetal que expresa E3 dirigido a apoplasto con pectinasa de manzana TP; 2, 5 y 8 - materia vegetal que expresa fusion TP-His-EK-E3 de cloroplasto; 3, 6 y 9 - materia vegetal no infectada. Analisis de extractos de protemas en bruto (B) y extractos de t Sp (C) mediante SDS-PAGE con tincion Coomassie (7 semanas de tiempo de almacenamiento); (E) porcentaje de estimacion de TSP de fusiones de E3 recombinante (7 semanas de tiempo de almacenamiento).
1, 2 y 7 - materia vegetal almacenada a -80 °C;
3, 4 y 8 - materia vegetal almacenada como un ensilado;
5, 6 y 9 - materia vegetal almacenada como un masa en seco.
La Fig. 13 muestra los resultados de un cribaje para las relaciones optimas entre celulasas producidas a partir de plantas que proporcionan la conversion mas eficaz de celulosa a glucosa usando una mezcla de muestras de TSP que contienen p-glucosidasa BGL4 recombinante, endoglucanasa E1, exoglucanasa 1 (CBHI) y exocelulasa E3. (A) La actividad enzimatica se representa en mg de glucosa/mg de TSO de extractos de plantas que contienen enzimas. (B) La actividad enzimatica se representa en mg de glucosa/g de peso en fresco de materia vegetal que contiene enzimas. Para el cribaje se uso p-glucosidasa BGL4 a partir de Humicola grisea expresada en citosol (pNMD1201), endoglucanasa E1 dirigida a apoplasto a partir de Acidothermus cellulolyticus expresada como una fusion con presecuencia de amilasa de arroz (pNMD1231), exoglucanasa 1 (CBHI) dirigida a apoplasto a partir de Trichoderma reesei expresada como una fusion con presecuencia de a-amilasa de cebada (pNMD1181) y exocelulasa E3 dirigida a cloroplasto a partir de Thermobifida fusca (pNMD1129).
La Fig. 14 muestra el mapa del plasmido del vector basado en TMV para la expresion de endoglucanasa Cel5A citosolica a partir de Thermotoga maritima (A) y gel de protemas de SDS tenido con Coomassie cargado con extractos en bruto, que se corresponden a 1,5 mg de peso en fresco, a partir de tejido de hoja de Nicotiana benthamiana de plantas transfectadas mediante cepa ICF320 de Agrobacterium tumefaciens que porta construccion pNMD3081 (B). las vfas son las siguientes:
1 - Marcador de protemas pretenido de PageRuler™ (#SM0671, Fermentas);
2 - Tejido de hoja no infectado;
3 - tejido de hoja cosechado a los 11 dfas post pulverizacion con dilucion 10-2 de cultivo agrobacteriano; 4 - tejido de hoja cosechado a los 11 dfas post pulverizacion con dilucion 10-3 de cultivo agrobacteriano; 3 - tejido de hoja cosechado a los 14 dfas post pulverizacion con dilucion 10-4 de cultivo agrobacteriano; 4 - tejido de hoja cosechado a los 18 dfas post pulverizacion con dilucion 10-5 de cultivo agrobacteriano. La Fig. 15 muestra el analisis SDS-PAGE de biomasa vegetal que contiene endoglucanasa Cel5A expresada heterologicamente a partir de Thermotoga maritima cuando se almacena como ensilado. Para la expresion de endoglucanasa Cel5A, se transfectaron plantas de Nicotiana benthamiana mediante la cepa ICF320 de Agrobacterium tumefaciens que porta la construccion de pNMD3081 usando pulverizacion con diluciones de 1000 veces. Cuando se cosecha a los 11 dpi, la materia vegetal se almaceno a -80 °C o como ensilado durante 12 semanas. Se cargo un gel de protemas SDS tenidas con Coomassie con extractos de tampon de Laemmli en burto (Laemmli, que corresponde a 1,5 mg de peso en fresco) o extractos solubles totales (TSP, 5 |jg) a partir de tejido de hoja de Nicotiana benthamiana. las vfas son las siguientes:
1 - Marcador de protemas pretenido de PageRuler™ (#SM0671, Fermentas);
2 - Biomasa de hojas que contienen CeI5A despues de almacenamiento de congelacion a -80 °C;
3 - biomasa de hojas no infectadas despues de almacenamiento de congelacion a -80 °C;
4 - Biomasa de hojas que contienen CeI5A despues del almacenamiento como un ensilado;
5 - biomasa de hojas no infectadas despues del almacenamiento como ensilado;
6 - Biomasa de hojas que contienen CeI5A despues de almacenamiento de congelacion a -80 °C;
7 - biomasa de hojas no infectadas despues de almacenamiento de congelacion a -80 °C;
8 - Biomasa de hojas que contienen CeI5A despues del almacenamiento como un ensilado;
9 - biomasa de hojas no infectadas despues del almacenamiento como ensilado.
La Fig. 16 muestra los resultados de un analisis de las condiciones de almacenamiento de materia vegetal que expresa endoglucanasa Cel5A citosolica a partir de Thermotoga maritima. Cuando se cosecha a los 11 dpi, la materia vegetal se almaceno a -80 °C o como ensilado durante 12 semanas. Se calcula la actividad enzimatica por mg de TSP (A) y por g de peso en fresco de materia vegetal (B). las vfas son las siguientes:
1 - Biomasa de hojas que contienen CeI5A despues de almacenamiento de congelacion a -80 °C;
2 - biomasa de hojas no infectadas despues de almacenamiento de congelacion a -80 °C;
3 - Biomasa de hojas que contienen CeI5A despues del almacenamiento como un ensilado;
4 - biomasa de hojas no infectadas despues del almacenamiento como ensilado;
5 - celulasa (endo-1,4-p-D-glucanasa) a partir de especie de Trichoderma (Megazyme, E-CELTR).
Descripcion detallada de la invencion
El proceso de produccion de una preparacion de enzimas de degradacion de paredes celulares de plantas implica la expresion, en plantas o partes de las mismas, de una o mas de una enzima de degradacion de paredes celulares activa. Una parte de una planta puede ser una parte de planta unida a una planta viva completa tal como hojas o puede estar desprendida de una planta completa, en donde se prefiere la primera posibilidad. Se desea, en general, conseguir altos niveles de expresion de estas enzimas, puesto que altos niveles de expresion pueden contribuir en la estabilidad de la actividad enzimatica de las enzimas expresadas en la etapa de almacenamiento. Se han establecido metodos de alto nivel de expresion de protemas en plantas durante las ultimas dos decadas y son conocidos por el biotecnologo de plantas. Es posible usar plantas transgenicas codificando de forma estable la una o mas de una enzima de degradacion de paredes celulares de plantas en el genoma nuclear o del plastidio. Pueden usarse sistemas de expresion inducible para inducir la expresion en un estado de crecimiento deseado de la planta. El documento WO 2007137788 describe un sistema de expresion inducible que usa replicones (vmcos) expresados en plantas transgenicas. En el documento WO 2005/054481 se desvela un metodo de control de la expresion genica en plastidios.
En una realizacion, se usa expresion transitoria, en donde las plantas o partes de planta se transfectan en un punto de tiempo adecuado con una molecula de acido nucleico (vector) que comprende una construccion de acido nucleico que contiene una secuencia de acidos nucleicos que codifica dicha una o mas de una enzima(s) de degradacion de paredes celulares. Esta realizacion tiene la ventaja de que la decision sobre que enzima expresar puede retrasarse hasta casi antes del punto de transfeccion, mediante el cual el usuario puede reaccionar con un corto tiempo segun la demanda. El proceso de la invencion encaja, de este modo, con las necesidades del mercado actual tal como "comercio segun demanda". El termino "transitorio" se refiere a que no se usan metodos de seleccion para seleccionar celulas o plantas transfectadas con la molecula de acido nucleico (vector) o la construccion de acido nucleico en el fondo de celulas o plantas no transfectadas que usan, por ejemplo, agentes seleccionables y genes de marcadores seleccionables capaz de desintoxicar los agentes seleccionables. Como resultado, el acido nucleico transfectado no se introduce en general de forma estable en el ADN cromosomico de la planta. En cambio, los metodos de expresion transitorios hacen uso del efecto de la transfeccion en las mismas plantas transfectadas.
Un modo establecido de conseguir un alto nivel de expresion es el uso de replicones auto replicantes (vmcos) que contienen una secuencia nucleotida que codifica dicha una o mas enzima(s) de degradacion de paredes celulares. Los sistemas de expresion vmcos de plantas se han descrito en muchas publicaciones tanto para el uso de vectores vmcos de ADN como para el uso de vectores vmcos de ARN, tal como n los documentos WO2008028661, W02006003018, W02005071090, WO2005049839, WO2006012906, WO02101006 o WO02068664 y se citan otras muchas mas publicaciones en estos documentos.
Se conocen diversos metodos para introducir una molecula de acido nucleico en una planta o parte de planta para la expresion transitoria. Pueden usarse agrobacterias para transfectar plantas con una molecula de (ADN) vector o construccion de interes, por ejemplo, mediante agroinfiltracion. En el documento WO2009095183 se describe un sistema y un metodo para la infiltracion a gran escala de plantas mediante agrobacterias. En otra realizacion, las plantas o partes de plantas se pulverizan con una suspension acuosa que contiene celulas de una cepa de Agrobacterium, que es bien adecuada para aplicaciones a gran escala a muchas plantas tales como planta en un campo de cultivo. Tales procesos de pulverizacion se describen en detalle en el documento WO2012/019660.
La cepa de Agrobacterium puede pertenecer a la especie de Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes que se usan comunmente para la transformacion y transfeccion de plantas y que son conocidas por el experto en la tecnica a partir del conocimiento general. La cepa de Agrobacterium compenre una molecula de ADN (plasmido Ti) que comprende una construccion de acido nucleico que contiene una secuencia de ADN de interes. La secuencia de ADN de interes codifica una o mas de una enzima a expresar en las plantas. La construccion de acido nucleico esta presente tipicamente en ADN-T de plasmidos Ti para la introduccion de la construccion nucleica en celulas vegetales mediante el sistema secretor de la cepa de Agrobacterium. Sobre la menos un lado o sobre ambos lados, la construccion de acido nucleicos esta flanqueada por una secuencia borde del ADN-T para permitir la transfeccion de dicha(s) planta(s) y la introduccion en las celulas de dicha planta de dicha construccion de acido nucleico. En la construccion de acido nucleico, la secuencia de ADN de interes esta presenta de modo que se puede expresar en celulas vegetales. Con este fin, la secuencia de ADN de interes, en dicha construccion de acido nucleico, bajo el control de un promotor activo en celulas vegetales. Ejemplos de la secuencia de ADN de interes son una secuencia de ADN que codifica un replicon vmco de ADN o un replicon vmco de ARN o un gen a expresar. El gen codifica la enzima a expresar en celulas de la(s) planta(s). Tambien los replicones vmcos codifican la enzima a expresar en las celulas de la(s) planta(s). La construccion de ADN puede comprender, ademas de la secuencia de ADN de interes, otras secuencias tales como secuencias reguladoras para la expresion de la secuencia de ADN de interes, tales como un promotor o terminador de transcripcion. La transferencia de genes mediados por Agrobacterium y vectores de los mismos son conocidos por el experto en la tecnica, por ejemplo, a partir de las referencias citadas anteriormente o a partir de los libros sobre biotecnologfa de plantas tales como Slater, Scott y Fowler, Plant Biotechnology, Segunda Edicion, Oxford University Press, 2008.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresion "promotor activo en celulas vegetales) se refiere a una secuencia de ADN que es capaz de controlar (iniciar) la transcripcion en una celula vegetal. Esto incluye cualquier promotor de origen vegetal, pero tambien cualquier promotor de origen no vegetal que sea capaz de dirigir la transcripcion en una celula vegetal, es decir, determinados promotores de origen vmco o bacteriano tal como CaMV35S (Harpster y col. (1988) Mol Gen Genet. 212(1):182-90, el promotor del virus del trebol subterraneo n.° 4 o n.° 7 (documento WO9606932), o promotores del gen del ADN-T pero tambien promotores espedficos de tejidos o espedficos de organos (por ejemplo, documento WO89/03887), promotores espedficos de organo-primordia (An y col. (1996) Plant Cell 8(1): 15-30), promotores espedficos de tallo (Keller y col., (1988) EMBO J. 7(12): 3625-3633), promotores espedficos de hoja (Hudspeth y col. (1989) Plant Mol Biol. 12: 579-589), promotores espedficos de mesofilo (tales como los promotores de Rubisco inducibles por luz), promotores espedficos de rafs (Keller y col.
(1989) Genes Dev. 3: 1639-1646), promotores espedficos de tuberculo (Keil y col. (1989) EMBO J. 8(5): 1323-1330), promotores espedficos de tejido vascular (Peleman y col. (1989) Gene 84: 359-369), promotores selectivos de estambre (documentos WO 89/10396, WO 92/13956), promotores espedficos de zona de dehiscencia (documento WO 97/13865) y similares. Para la expresion transitoria, promotores constitutivos, es decir, promotores que no se regulan segun su desarrollo, se usan preferentemente. Sin embargo, los promotores constitutivos pueden ser espedficos a tejido o espedficos a organo. Promotores preferentes son los que se usan en los Ejemplos que se describen a continuacion.
En el presente documento, el termino "construccion" se refiere a una construccion recombinante que codifica la una o mas de una enzima de degradacion de paredes celulares.
En realizaciones en donde se desea una fuerte expresion de una protema, la construccion de acido nucleico puede codificar un vector vmco (denominado en el presente documento como "replicon") que puede replicarse en celulas vegetales. Para ser replicante, el replicon contiene un orgen de replicacion que puede reconocerse por una polimerasa de acido nucleico presente en celulas vegetales, tal como mediante la polimerasa vmca expresada a partir del replicon. En el caso de vectores vmcos de ARN (denominados como "replicones de ARN"), los replicones se pueden formar mediante transcripcion bajo el control de un promotor activo en celulas vegetales, a partir de la construccion de ADN despues de que este ultimo se haya introducir en nucleo de la celula vegetal. En caso de replicones de ADN, los replicones se pueden formar mediante la recombinacion entre dos sitios de recombinacion que flanquean la secuencia que codifica el replicon vmco en la construccion de ADN, por ejemplo, tal como se describe en el documento WO00/17365 y WO 99/22003. Si el replicon se codifica mediante la construccion de ADN, son preferentes los replicones de ARN. El uso de vectores vmcos de ADN y ARN (replicones de ADN y ARN) se ha descrito en gran medida en la literatura durante los anos. Algunos ejemplos son las siguientes publicaciones de patente: WO2008028661, WO2007137788, WO2006003018, WO2005071090, WO2005049839, WO02097080, WO02088369, WO02068664. Un ejemplo de vectores vmicos de ADN son los basados en geminivirus. Para la presente invencion, los vectores vmcos o replicones basados en virus de ARN de plantas, son especialmente preferentes aquellos basados en virus de ARN unicatenarios de sentido positivo. Por consiguiente, el replicon vmico puede ser un replicon de ARN unicatenario de sentido positivo. Ejemplos de tales vectores vmicos son virus del mosaico del tabaco (TMV) y virus potex X (PVX). Vectores vmcos basados en virus potex y sistemas de expresion se describen en el documento EP2061890 o WO2008/028661. Muchos otros replicones vmcos de plantas se describen en las publicaciones de patente mencionadas anteriormente.
En una realizacion, la etapa (i) comprende la pulverizacion aerea de partes de dicha planta con una suspension acuosa que contiene celulas de una cepa de Agrobacterium que comprende una molecula de ADN que comprende una construccion de acido nucleico que codifica un ADN o, preferentemente, un replicon de ARN que codifica dicha una o mas de cuna enzima de degradacion de paredes celulares.
La suspension acuosa que se puede usar para pulverizar plantas o partes de plantas en el proceso de la invencion puede tener una concentracion de celulas de Agrobacterium de como maximo 1,1109 ufc/ml, que se corresponde aproximadamente a un cultivo de Agrobacterium en medio LB de una densidad optima de 600 nm de 1. Debido a la alta eficacia de transfeccion alcanzable, especialmente, si la pulverizacion se realiza con el uso de un abrasivo y/o un tensioactivo o agente humectante (vease a continuacion), se pueden usar concentraciones mucho mas inferiores, sin embargo, lo que permite el tratamiento de muchas plantas tales como campos de cultivo completos sin la necesidad de enormes fermentadores de produccion de Agrobacterium. Por lo tanto, la concentracion puede ser como maximo de 2,2107 ufc/ml, preferentemente como maximo 1,1107 ufc/ml, mas preferentemente como maximo de 4,4106 ufc/ml. En una realizacion, la concentracion es como maximo de 1,1106 ufc/ml de la suspension. Para evitar la determinacion de concentraciones celulares en terminos de ufc/ml, las concentraciones de suspensiones agrobacterianas se evaluan frecuentemente midiendo la densidad optica aparente a 600 nm usando un espectrofotometro. En el presente documento, la concentracion de 1,1107 ufc/ml se corresponde con una densidad optica calculada a 600 nm de 0,01, mediante la cual la densidad optica calculada se define por una dilucion de 100 veces con agua o tampon de una suspension que tiene una densidad optica de 1,0 a 600 nm. Asimismo, las concentraciones de 4,4106 ufc/ml y 1,1106 ufc/ml se corresponden con una densidad optica calculada a 600 nm de 0,004 y 0,001, respectivamente, mediante las cuales las densidades opticas calculadas se definen por una dilucion de 250 veces y 1000 veces, respectivamente, con agua o tampon de una suspension que tiene una densidad optica de 1,0 a 600 nm.
La suspension acuosa que contiene celulas de una cepa de Agrobacterium usada para pulverizar las plantas o partes de una planta puede contener al menos un abrasivo suspendido en dicha suspension para mejorar la eficacia de transfeccion. El abrasivo que puede usarse en un material de partmulas que es esencialmente insoluble en la suspension acuosa de celulas de Agrobacterium. Se cree que el abrasivo debilita, especialmente si se usa junto con un agente humectante, la superficie del tejido vegetal tal como las hojas y, mediante lo cual, facilita la penetracion de las celulas de Agrobacterium en el especio intercelular del tejido vegetal. Como resultado, la eficacia de transfeccion es alta.
El material de partmulas a usar como el abrasivo puede ser material de vehmulo como se usa comunmente como vehmulos en polvo humectable (WP) de formulaciones plaguicidas. En el contexto de polvos humectables, estos vehuculos tambien se denominan en el campo de las formulaciones de plaguicidas como "cargas" o "cargas inertes". Las formulaciones de polvos humectables son partes del conocimiento general en el campo de la proteccion vegetal. Se hace referencia al manual de ESPECIFICACIONES SOBRE PLAGUICIDAS, "Manual for Development and Use of FAO and WHO Specifications for Pesticides", editado por la Organizacion Mundial de la Salud (OMS) y la Organizacion de los Estados Unidos para la Agricultura y la Alimentacion, Roma, 2002, ISBN 92-5-104857-6. Formulaciones de polvos humectables para la proteccion de plantas se describen, por ejemplo, en los documentos EP 1810569, EP1488697, EP1908348 y EP0789510. El abrasivo puede ser un material mineral, tfpicamente un material inorganico. Ejemplos de tales materiales de vehuculos son tierra diatomacea, talco, arcilla, carbonato de calcio, bentonita, arcilla acida, atapulguita, ceolita, sericita, sepiolita o silicato calcico. Tambien es posible usar polvo de cuarzo tal como el polvo de cuarto altamente puro que se describe en el documento WO02/087324. Ejemplos preferentes son sflice, tal como sflice hidrofila precipitada y pirogena y carborundo. Se conocen las propiedades abrasivas de diluyentes o cargas tales como sflice usada en polvos humectables (vease, "Pesticide Application Methods" por G.A. Matthews, tercera edicion, Blackwell Science, 2000, en la pagina 52 del mismo).
Como productos comerciales de materiales inorganicos de partfculas para su uso como abrasivos, se pueden mencionar la sflice hidrofila Sipernat™ 22S y Sipernat™ 50 S, fabricada por Evonic Degussa. Otros productos son "Hi-Sil™ 257", una sflice sintetica, amorga, hidratada producida por PPG Industries Taiwan Ltd. o "Hubersorb 600™", una sflice de carcio sintetica, fabricada por Huber Corporation. Una sflice con tamano submicrometrico es Hi-Sil™ 233 (PPG Industries) que tiene un tamano de partfcula promedio de aproximadamente 0,02 pm.
El abrasivo puede tener un tamano de partfcula de mediana de entre 0,01 y 40, preferentemente de entre 0,015 y 30, mas preferentemente de entre 0,05 y 30, incluso mas preferentemente de entre 0,1 y 30, incluso mas preferentemente de entre 0,1 y 20, incluso mas preferentemente de entre 0,5 y 20 y lo mas preferentemente de entre el 1,0 y 16 pm. En una realizacion, el tamano de partfcula de mediana es de 0,015 y 1 o de entre 0,02 y 0,5 pm. El tamano de partfcula de mediana es el tamano de partfcula de mediana en volumen que puede medirse mediante difraccion laser usando un Mastersizer™ de Malvern Instruments, Ltd. Para evitar obstruir las boquillas de pulverizacion, el tamano de partfcula maxima de las partfculas mas grandes contenidas en el abrasivo debe ser como maximo de 45 pm, preferentemente como maximo de 40 pm, que puede determinarse mediante tamizado. Esta condicion se considera cumplida, si el resto de tamizado es de por debajo del 1,5 % en peso (segun ISO 3262­ 19). El abrasivo puede tener un valor D90 de como maximo 40 pm, preferentemente como maximo de 30 pm, medido mediante difraccion laser tal como se ha descrito anteriormente. Tfpicamente, el tamano de partfcula anterior se refiere a tamanos de partfcula primarios. El contenido del abrasivo en la suspension acuosa puede ser de entre 0,01 y 3, preferentemente de entre 0,02 y 2, mas preferentemente de entre 0,05 y 1 y incluso mas preferentemente de entre el 0,1 y 0,5 % en peso de dicha suspension.
La suspension acuosa util para pulverizar partes de las plantas contiene preferentemente un adyuvante de pulverizacion agncola. El adyuvante de pulverizacion puede ser un tensioactivo o un agente humectante. El tensioactivo o agente humectante tiene multiples ventajas. Reduce la tension superficial del agua de la suspension acuosa y hace que la superficie cerosa de las hojas de la planta sea mas permeable para las agrobacterias. Mejora ademas la estabilidad de la suspension y reduce el asentamiento del abrasivo en la suspension. Los tensioactivos utiles no estan particularmente limitados. Sin embargo, son preferentes los tensioactivos no ionicos. Una medicion frecuentemente usada para describir tensioactivos es el HLB (equilibrio hidrofilo/lipofilo). El HLB describe la capacidad del tensioactivo en asociarse con compuestos hidrofilos y lipofilos. Los tensioactivos con un alto equilibrio de HLB se asocian mejor con compuestos solubles en agua que con compuestos solubles en aceite. En el presente documento, el valor de HLB debe ser de 12 o superior, preferentemente al menos 13. Como tensioactivos no ionicos, tensioactivos de organo-silicona tales como heptametiltrisiloxano modificado con polialqulenoxido son los mas preferentes para su uso en la presente invencion. Un producto comercial es adyuvante de pulverizacion Silwet L77™ de GE Advanced Materials.
La suspension acuosa de agrobacterias puede producirse del siguiente modo. En un metodo, la cepa de Agrobacterium a usar en el proceso de la invencion se inocula en medio de cultivo y se cultivo a una elevada concentracion celular. Los cultivos mas grandes se pueden inocular con pequenos volumenes de un medio de cultivo altamente concentrado para obtener grandes cantidades del medio de cultivo. Las agrobacterias se cultivan en general hasta una concentracion celular que se corresponde con una DO a 600 nm de al menos 1, tfpicamente de aproximadamente 1,5. Tales suspensiones altamente concertadas se diluyen, a continuacion, para conseguir la concentracion celular deseada. Para diluir las suspensiones agrobacterianas altamente concentradas, se usa agua. El agua puede contener un tampon. El agua puede contener adicionalmente el tensioactivo anteriormente mencionado. Como alternativa, las suspensiones agrobacterianas concentradas pueden diluirse con agua y cualquier aditivo tal como el tensioactivo y las sustancias de tampon adicionales se anaden despues o durante el proceso de dilucion. El abrasivo puede anadirse antes, durante o despues de la dilucion. Sin embargo, es preferente agitar la suspension durante la adicion del abrasivo para dispersar uniformemente el abrasivo en la suspension agrobacteriana. La etapa de diluir la suspension agrobacteriana concentrada puede llevarse a cabo en el tanque de pulverizacion del pulverizador usado para la pulverizacion de las suspensiones diluidas.
El pulverizador a usar para transfectar plantas o partes de plantas en la etapa (i) del proceso de la invencion depende principalmente del numero de plantas o el area a pulverizar. Para una o un pequeno numero de plantas a pulverizar, se pueden usar pulverizadores de bomba tal como se usan ampliamente en el hogar y en jardinena. Estos pueden tener volumenes del tanque de pulverizacion de entre 0,5 y 2 litros. Para aplicaciones a mediana escala, se pueden usar pulverizadores hidraulicos operados manualmente tales como pulverizadores de mochila operados con palanca o pulverizadores de compresion operados manualmente. Sin embargo, la alta eficacia de transfeccion lograda en la invencion tiene su completo potencial en la transfeccion de muchas plantas tales como plantas que crecen en un campo de cultivo o en un invernadero. Con este fin, se pueden usar pulverizadores hidraulicos operados con energfa tales como pulverizadores hidraulicos montados sobre tractores equipados con barras pulverizadoras. Tambien son posibles tecnicas de aplicacion aerea usando helicopteros o avionetas para campos grandes. Todos estos tipos de pulverizadores con conocidos en la tecnica y se describen por ejemplos en el libro "Pesticide Application Methods" por G.A. Matthews, tercera edicion, Blackwell Science, 2000. Para asegurar una suspension homogenea en los tanques de pulverizacion de los pulverizadores, se deben agitar los pulverizadores de tamano pequeno o mediano en intervalos regulares o continuamente durante la pulverizacion. Pulverizadores grandes tales como los pulverizadores montados sobre tractor deben estar equipados con un agitador en el tanque de pulverizacion.
Considerando la presencia de celulas agrobacterianas y, opcionalmente, abrasivos en las suspensiones a pulverizar, los pulverizadores deben producir la pulverizacion de un tamano de gota de al menos una pulverizacion fina. Asimismo, se puede usar pulverizacion media o pulverizacion gruesa en la clasificacion de pulverizadores usados en el libro anteriormente mencionado por G.A. Matthews, paginas 74. El objetivo principal de la pulverizacion es humectar el tejido vegetal con la suspension. Por lo tanto, el tamano de gota exacto no resulta importante. Sin embargo, la eficacia de transfectacion puede mejorarse adicionalmente proporcionando el pulverizador a superficies vegetales con una presion aumentada.
En otra realizacion, la una o mas de una enzima de degradacion de paredes celulares se expresa en plantas transgenicas que contienen en su genoma nuclear una construccion recombinante que comprende un casete de expresion recombinantes que comprende un promotor activo en celulas vegetales y, operativamente unido al mismo, una secuencia de codificacion que codifica una enzima de degradacion de paredes celulares de plantas. Tales aspectos se describen, por ejemplo, en los documentos WO 98/16651 o WO 2007/100897.
En el proceso de produccion de la preparacion, la una o mas de una enzima de degradacion de paredes celulares puede expresarse en plantas multicelulares, de forma notable, plantas superiores. Se pueden usar tanto plantas monocotiledoneas como dicotiledoneas. Plantas de cultivo comunes utiles incluyen alfalfa, cebada, habas, canola, caupfs, algodon, mafz, trebol, loto, lentejas, altramuz, mijo, avena, guisantes, cacahuetes, arroz, centeno, meliloto, girasol, guisante de olor, soja, sorgo tricale, frijoles de batata, haba terciopelo, veza, trigo, glicinia y plantas de frutos secos. Las especies de plantas preferentes para practicar la presente invencion incluyen aunque no de forma limitante a, representativas de Gramineae, Compositeae, Solanaceae y Rosaceae. Plantas preferentes son plantas que normalmente no entran en la cadena alimentaria tales como se pueden usar especies de Nicotiana especies tales como N. tabacum y N. benthamiana.
Es posible expresar la una o mas de una enzima de degradacion de paredes celulares en el citosol de dichas plantas o partes de plantas. En este caso, no se anade a la enzima ningun peptido de senal que dirige la enzima en el compartimento particular. Un peptido de senal presente en la enzima para secretar la enzima desde el organismo nativo a partir del cual la enzima se origina puede omitirse para la expresion en el proceso de la presente invencion. Sin embargo, los peptidos de senal de protemas secretoras de bacterias resultan, en general, no funcionales o de baja fiabilidad en plantas, no es necesario omitir el peptido de senal natural cuando las enzimas de bacterias o Archaea estan expresadas en plantas en el proceso de la presente invencion.
En una realizacion, la enzima expresada en las plantas o partes de las mismas se dirigen a un compartimento celular deseado. Compartimentos deseados son plastidios o el apoplasto. El direccionamiento a estos compartimentos tiene la ventaja adicional de que la(s) enzima(s) de degradacion de paredes celulares expresadas y dirigidas se retiran del citoplasma donde reside la mayona de proteasas, lo que puede contribuir a la estabilidad de las enzimas cuando se almacenan. El direccionamiento de una enzima expresada en una planta a un compartimento celular puede conseguirse mediante la fusion de un peptido de senal adecuado a la enzima para formar una protema de fusion que comprende el peptido de senal y la enzima. El direccionamiento de protemas expresadas en plantas al apoplasto se conoce, por ejemplo, a partir del documento WO03020938, y puede conseguirse fusionando un peptido de senal (tambien denominado en el presente documento como "PT" por peptido de transito) a la enzima, en donde el peptido se senal se dirige a la enzima en el retmulo endoplasmatico (ER) y la trayectoria secretora. El polipeptido capaz de unirse a la protema de fusion a un componente de pared celular usado en el documento WO03020938 puede omitirse de la protema de fusion de esta referencia cuando se usa en el proceso de la presente invencion. Todos los peptidos de senal de protemas conocidos por secretarse o dirigirse por plantas al apoplasto pueden usarse para dirigir la enzima al apoplasto. Ejemplos preferentes son los peptidos de senal de calreticulina de tabaco o de aamilasa de arroz. Ejemplos preferentes son los peptidos de senal de metilesterasa de pecina o de tirosina de N. tabacco y protema rica en lisina (NtTLPR). Un ejemplo adicional es el peptido de senal de la isoperoxidasa apoplastica del calabacm (APRX) (Carpin y col., 200l, The Plant Cell, 13, 511-520). El peptido de senal debe estar comprendido en la protema de fusion de modo que sea funcional para dicho direccionamiento. Esta condicion debe cumplirse en cualquier emplazamiento en la protema de fusion. En general, sin embargo, el peptido de senal se posiciona en el extremo N de la encima para un direccionamiento eficaz de la enzima al apoplasto. El documento EP 1 867 724 A2 describe la produccion de enzima de degradacion de paredes celulares y el direccionamiento al apoplasto o plastidios.
El direccionamiento de protemas expresadas en plantas a plastidios mediante fusion de un peptido de transito de plastidio a la protema o enzima tambien se conoce a partir de muchas publicaciones tales como en el documento WO2004101797 y referencias que se citan en el presente documento. Se han investigado los detalles de los sitios de escision de protemas vegetales dirigidas a plastidios (Gavel & Von Heijne 1990, FEBS Lett., 261, 455-458). Se usan diversos peptidos de transito (PT) de cloroplasto en los ejemplos del presente documento. Ejemplos de publicaciones que describen la expresion en plantas de enzimas celulolfticas y direccionamiento a plastidios son los documentos US 6.013.860; WO 98/11235 y US 2002/0062502.
Las enzimas de degradacion de paredes celulares expresadas y usadas en los procesos de la presente invencion son generalmente enzimas heterologas con respecto a la planta o parte de la planta en las que se expresan, es decir, la planta o parte de planta no produce la enzima de forma natural. En muchos casos, las enzimas pueden originarse de bacterias, Archaea o de hongos. Es posible optimizar el uso de codones de genes que codifican estas enzimas para su expresion en plantas, de forma notable, en la planta empleada para expresarlas. La optimizacion de codones es un metodo estandar para aumentar el rendimiento de expresion. Los genes optimizados por codones y acidos nucleicos pueden solicitarse de fuentes comerciales tales como Entelechon GmbH, Regensburg, Alemania. En el presente documento, una enzima de degradacion de paredes celulares es una enzima que puede degradar al menos un componente polimerico de paredes celulares de plantas o un producto de degradacion oligomerico de tales componentes polimerico. Las paredes celulares de plantas contienen celulosa, hemicelulosa, p-1,4-glicano, pectina y lignina, todos los cuales son poftmeros. Excepto para la lignina, estos poftmeros son polisacaridos. Las enzimas capaces de degradar poftmeros de paredes celulares de plantas o productos de degradacion oligomericos de los mismos se producen mediante varios organismos que puede usar estos compuestos polimericos como fuente de carbono o que crecen en plantas en descomposicion. En general, estos son microorganismos que pertenecen a bacterias, archaea y hongos, pero tambien algunos protozoos y termitas producen celulasas. Los rumiantes dependen de microorganismos que expresan celulasa para descomponer la celulosa. Puesto que los biopoftmeros de paredes celulares de plantas son polimericos, no pueden degradarse dentro de celulas de estos organismos. Por consiguiente, las enzimas de degradacion de paredes celulares se secretan generalmente en el entorno y degradan componentes de paredes celulares de plantas y/o productos de degradacion oligomericos de componentes de paredes celulares de plantas, en el medio extracelular. Productos de degradacion de molecula pequena, en la mayona di- o monosacaridos tales como D-glucosa, pueden absorberse por los organismos y usarse como nutrientes.
En el presente documento, los terminos "oligomero" o "producto de degradacion oligomerico" se refiere a compuestos realizados de al menos 2 restos de monomeros. Por lo tanto, en lo que se refiere a oligomeros sacandicos o producto de degradacion oligomerico de polisacaridos, los disacaridos son oligosacaridos. Como ejemplo, la celobiosa es un oligosacarido.
Al contrario de muchas protemas intracelulares la expresion y la degradacion de las cuales esta firmemente regulada por los organismos, las enzimas de degradacion de paredes celulares secretoras se optimizan por evolucion para que sean enzimas bastante estables que pueden soportar bastante bien una variedad de condiciones atmosfericas en el medio extracelular para ser eficaces para la degradacion de las paredes celulares de la planta extracelular. Los inventores asumen que estas circunstancias son la razon de la sorprendentemente alta estabilidad de las enzimas de degradacion de paredes celulares cuando se almacenan en ensilado, tal como se encontro cuando se llevo a cabo la presente invencion.
Con respecto a las enzimas de degradacion de paredes celulares, la invencion no esta limitada, siempre y cuando la una o mas de una enzima de degradacion de paredes celulares se selecciona entre endoglucanasas, exoglucanasas, exocelulasas, p-glucosidasas y combinaciones de las mismas. En general, la una o mas de una enzima de degradacion de paredeces celulares es heterologa con respecto a la planta o parte en la que se expresa en la invencion. Las enzimas son generalmente de origen microbiano, de forma notable, bacteriano, archaebacteriano u origen fungico. Se pueden realizar modificaciones a tales enzimas usando metodos generales de ingeniena genetica. Se pueden usar enzimas implicadas en la degradacion de cualquiera de los componentes de pared celular de planta principal. Por lo tanto, se usan enzimas celulolfticas en la invencion. Se pueden usar adicionalmente hemicelulasas, pectinasas y/o enzimas de degradacion de lignina. En una realizacion importante, se usan enzimas celulolfticas, es decir, enzimas que escinden enlaces p-1,4-glicosfdicos entre restos de glucosa en compuestos que contienen restos de glucosa unida p-1,4-glicosfdicamente. Las enzimas celulolfticas tambien se denominan en el presente documento como "celulasas". La celulosa consiste en unidades de D-glucosa que estan unidas mediante enlaces p-1,4-glicosfdicos y la una o mas de una enzima de degradacion de paredes celulares usada en la invencion son enzimas celulolfticas (celulasas). Varias enzimas estan implicadas en la descomposicion enzimatica de la celulosa y las enzimas celulolfticas comprenden multiples grupos que incluyen:
- endoglucanasas (p-1,4-glucanglucanohidrolasas, EC3.2.1.4) que escinden al zar enlaces p-1,4-glicosfdicos internos (lejos de los extremos de cadena) de la celulosa;
- exoclucanasas o celobiohidrolasas (EC3.2.1.91) que producen celobiosa atacando la celulosa a partir de los extremos de cadena reductores (celobiohidrolasa I) o atacando la celulosa de los extremos no reductores de las cadenas de celulosa (celobiohidrolasa II); y
- p-glucosidasas (EC 3.2.1.21) que convierten la celobiosa en glucosa.
Existe un gran cuerpo de literatura sobre todos los aspectos de las enzimas celuloltticas de muchas funtes distintas y las perspectivas de derivar combustible a partir de celulosa ha llevado a un aumento de investigacion en este campo durante la ultima decada. En una realizacion interesante, se usan las enzimas derivadas de organismos extremofflicos tales como termofilos o acidofilos, puesto que estos tienen particularmente una alta estabilidad. La Tabla 1 muestra enzimas de cada uno de los grupos de celulosa anteriormente enumerados que se han usado en los ejemplos.
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Puesto que se requieren enzimas de varios grupos para degradar la celulosa en glucosa, es preferente proporcionar al menos una enzima de cada uno de los grupos anteriores cuando se va a degradar materia vegetal que contiene paredes celulares de plantas. Esto puede conseguirse expresando dos o mas tales enzimas en una planta o expresando una enzima por planta. En el ultimo caso, dos o mas plantas que han expresado distintas enzimas celulolfticas pueden mezclarse en una relacion deseada antes de la etapa de almacenamiento (iii) y almacenarse juntas en la etapa (iii). Como alternativa, dos o mas ensilados cada uno obtenido a partir de una planta que ha expresado una enzima puede combinarse cuando se lleva a cabo un proceso de degradacion de componentes de las paredes celulares de plantas de materias vegetales. En una realizacion, se usa un ensilado que contiene una endoglucanasa, una celobiohidrolasa I y una celobiohidrolasa II. En otra realizacion, se usa un ensilado que contiene una endoglucanasa, una celobiohidrolasa I, una celobiohidrolasa II y una p-glucosidasa.
Las hemicelulosas son heteropolfmero polisacandicos tales como arabinoxilanos, presentes junto con la celulosa en casi todas las paredes celulares de las plantas. La hemicelulosa tiene una estructura aleatoria, amorfa con poca resistencia. Se hidroliza facilmente mediante acido diluido o base asf como muchas enzimas de hemicelulasa. La hemicelulosa contiene varios monomeros de azucar distintos. Por ejemplo, ademas de glucosa, los monomeros de azucar en hemicelulosa pueden incluir xilosa, manosa, galactosa, ramnosa y arabinosa. Las hemicelulosas contienen la mayona de los azucares de D-pentosa. La xilosa es, en general, el monomero de azucar presente en la mayor cantidad, aunque el acido manuronico y el acido galacturonico tambien tienden a estar presentes. A diferencia de la celulosa, la hemicelulosa consiste en cadenas mas cortas, 500-3.000 unidades de azucar al contrario de 7.000­ 15.000 moleculas de glucosa por polfmero que se observa generalmente en la celulosa. Ademas, la hemicelulosa es un polfmero ramificado, mientras que la celulosa no es ramificada. Las xilanasas microbianas utiles se revisan por Beg y col. in Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 56, No. 3-4, 326-338. La conversion de hemicelulosa se describe, por ejemplo, por Saba en J. Ind. Microbiol. Biotechnol. (2003) 30: 279-291.
La pectina es otro polfmero de pared celular principal que se encuentra en todas las plantas terrestres (Willats y col., 2001, Plant Mol Biol, 47, 9-27). La pectina es una red polimerica compleja de polisacaridos como el homogalacturonano y el rhamnogalacturonano. El componente monomerico principal de esta red es el acido galacturonico y no la glucosa como en el caso de la celulosa. Las enzimas para la degradacion de pectina son conocidas en la tecnica. Un ejemplo es la poligalacturonasa, la mas ampliamente estudiada entre la familia de las enzimas pectinoltticas. Las poligalacturonasas (PGasas) son enzimas pectinolfticas que catalizan la escision hidrolttica de la cadena de acido poligalacturonico con la introduccion de agua por todo el puente de oxfgeno. Las PGasas implicadas en la hidrolisis de sustancias pecticas son la endo-PGasa (E.C. 3.2.1.15) y la exo-PGasa (E.C.
3.2.1.67). Las endo-PGasas se distribuyen ampliamente entre hongos, bacterias y muchas levaduras. Tambien se encuentran en plantas superiores y algunos nematodos parasfticos vegetales. Se han dado a conocer a partir de muchos microorganismos, incluidos Aureobasidiumpullulans, Rhizoctonia solani Kuhn, Fusarium moniliforme, Neurospora crassa, Rhizopus stolonifer, especie de Aspergillus, Thermomyces lanuginosus, Peacilomyces clavisporus. Las endo-PGasas tambien se han clonado y estudiado geneticamente en una gran cantidad de especies microbianas. Por el contrario, las exo-PGasas aparecen menos frecuentemente. Se han dado a conocer en especies de Erwinia carotovora, Agrobacterium tumefaciens, Bacteroides thetaiotamicron, Alternaria mali Fusarium oxysporum, Ralstonia solanacearum, Bacillus. Para su revision, vease Jayani y col., 2005, Process Biochemistry, 40, 2931-2944. Las enzimas desveladas en el presente documento pueden usarse en la presente divulgacion.
Las enzimas secretoras de degradacion de lignina tales como peroxidasa de lignina se expresan mediante hongos de podredumbre blanca y marron, tales como Phanerochaete chrysosporium, y degradan la red de lignina polimerica mediante reacciones radicales catalizadas por peroxidasas.
Tal como se ha indicado anteriormente con respecto a las enzimas celulolfticas, las enzimas de degradacion de paredes celulares a partir de microorganismos termofflicos u otras enzimas termoestables pueden resultar ventajosas con respecto a la estabilidad en la etapa de almacenamiento de los procesos de la invencion asf como en el uso posterior para degradar materia vegetal. Esto tambien es de aplicacion a enzimas de degradaciond e paredes celulares distintas de las enzimas celulolfticas. De acuerdo con Vieille, Biotechnol Annu Rev. 1996;2:1-83, las enzimas sintetizadas por termofilos (organismos con temperaturas de crecimiento optimas > 60 °C) e hipertermofilos (temperaturas de crecimiento optimas > 80 °C) son ftpicamente termoestables (resistentes a la inactivacion irreversibles a elevadas temperaturas) y termofilas (optimamente activas a elevadas temperaturas, es decir, > 60 °C). Tales enzimas termoestables se denominas como "termoenzimas". Algunos termofilo pueden crecer a 90 °C o por encima y algunos tienen un maximo por encima de 100 °C. Los procariotas tienen un crecimiento optimo entre 80 °C y aproximadamente 113 °C y se denominan hipertermofilos. Normalmente no crecen por debajo de los 55 °C (Microbiology, 5a edicion, Lansing M Prescott, Donald A Klein, John P Harley). Muchos procesos biotecnologicos importantes utilizan enzimas termofilas debido a su capacidad de soportar calor intenso (Madigan MT, Martino JM (2006). Brock Biology of Microorganisms (11a ed.). Pearson. paginas 136. ISBN 0-13-196893-9).
La una o mas de una enzima usada en la invencion puede ser termoestable y/o termofila. Las enzimas usadas en la invencion tienen una temperatura optima de actividad a > 60 °C. La temperatura optima de una enzima puede determinarse llevando a cabo ensayos de actividad a un pH optimo en diversas temperaturas para determinar el optimo de temperatura, por ejemplo, tal como se describe por Takashima y col., J. Biotechnol. 1996; 50(2-3):137-47.
Las celulasas termoestables y hemicelulasas se revisan por Haki y Rakshit, Bioresource Technology, Vol. 89, tema I, 2003, paginas 17-34. Estas enzimas, a saber, las enumeradas en las Tablas 5 y 6 pueden usarse en los procesos de la presente invencion. Turner y col., Microbial Cell Factories 2007, 6:9 revisa termofilos y enzimas termoestables, entre otras cosas, para la biodegradacion y modificacion de lignocelulosa y para la produccion de biocombustible. Las enzimas mencionadas en las secciones "Conversion de celulosa mediante celulasas", "Conversiones de hemicelulosa" y "Conversion de pectinas" de Turner y col., pueden usarse en los procesos de la presente invencion. Taylor y Vaisman, BMC Structural Biology 2010, 10(Suppl 1):S5 describen la discriminacion de protemas termofilos y mesofilas. Li y col., revisan caractensticas estructurales de termoenzimas en Biotechnology Advances, 23 (2005) tema 4, 271-333. AGstab de protemas termofilas es de 5 a 20 kcal/mol superiores de las de las protemas mesofilas.
Otros ejemplos de enzimas de degradacion de paredes celulares que pueden usarse en la presente invencion son las seguientes endoglucanasas mencionadas en el documento WO 2009/155601. Los genes de endoglucanasa pueden obtenerse a partir de Aspergillus aculeatus (Patente de EE.UU. n.° 6.623.949; documento WO 94/14953), Aspergillus kawachii (patente de EE.UU. n.° 6.623.949), Aspergillus oryzae (Kitamoto y col., Appl. Microbiol. Biotechnol, 1996, 46: 538-544; patente de EE.UU. n.° 6.635.465), Aspergillus nidulans (Lockington y col., Fungal Genet. Biol., 2002, 37: 190-196), Cellulomonas fimi (Wong y col., Gene, 1986, 44: 315-324), Bacillus subtilis (MacKay y col., Nucleic Acids Res., 1986, 14: 9159-9170), Cellulomonas pachnodae (Cazemier y col., Appl. Microbiol. Biotechnol., 1999, 52: 232-239), Fusarium equiseti (Goedegebuur y col., Curr. Genet., 2002, 41 : 89-98), Fusarium oxysporum (Hagen et al, Gene, 1994, 150: 163-167; Sheppard y col., Gene, 1994, 150: 163-167), Humicola insolens (U.S. Pat. No. 5,912,157; Davies y col., Biochem J., 2000, 348: 201-207), Hypocrea jecorina (Penttila y col., Gene, 1986, 45: 253-263), Humicola grisea (Goedegebuur y col., Curr. Genet., 2002, 41 : 89-98), Micromonospora cellulolyticum (Lin y col., J. Ind. Microbiol, 1994, 13: 344-350), Myceliophthora thermophila (patente de EE.UU. n.° 5.912.157), Rhizopus oryzae (Moriya y col., J. Bacteriol, 2003, 185: 1749-1756), Trichoderma reesei (Saloheimo y col., Mol. Microbiol., 1994, 13: 219-228), and Trichoderma viride (Kwon y col., Biosci. Biotechnol. Biochem., 1999, 63: 1714-1720; Goedegebuur y col., Curr. Genet., 2002, 41 :89-98) o la endo-1,4-p-glucanasa E1 (n.° de acceso de GeneBank. U33212, secuencia de aminoacidos proporciona en la pagina 13 del documento WO 2009/155601) descrito en el documento US 5.275.944 que tiene una temperatura optima de 83 °C.
Ejemplos de celobiohidrolasas como enzimas de degradacion de paredes celulares para su uso en la invencion se mencionan en el documento WO 2009/155601; se codifican mediante genes de celobiohidrolasa que pueden obtener a partir de Acidothermus cellulolyticus, Acremonium cellulolyticus (Patente de EE.UU. n.° 6.127.160), Agaricus bisporus (Chow y col., Appl. Environ. Microbiol, 1994, 60: 2779-2785), Aspergillus aculeatus (Takada y col., J. Ferment. Bioeng., 1998, 85: 1-9), Aspergillus niger (Gielkens y col., Appl. Environ. Microbiol., 65: 1999, 4340­ 4345), Aspergillus oryzae (Kitamoto y col., Appl. Microbiol. Biotechnol, 1996, 46: 538-544), Athelia rolfsii (n.° de acceso de EMBL a B103461), Chaetomium thermophilum (N.° de acceso de EMBL AX657571 y CQ838150), Cullulomonas fimi (Meinke y col., Mol. Microbiol., 1994, 12: 413-422), Emericella nidulans (Lockington y col., Fungal Genet. Biol, 2002, 37: 190-196), Fusarium oxysporum (Hagen y col., Gene, 1994, 150: 163-167), especie de Geotrichum 128 (n.° de acceso de EMBL AB089343), Humicola grisea (de Oliviera y Radford, Nucleic Acids Res., 1990, 18: 668; Takashima y col, J. Biochem., 1998, 124: 717-725), Humicola nigrescens (n.° de acceso de EMBL AX657571), Hypocrea koningii (Teeri y col., Gene, 1987, 51 : 43-52), Mycelioptera thermophila (n.° de acceso de EMBL AX657599), Neocallimastix patriciarum (Denman y col., Appl. Environ. Microbiol, 1996, 62: 1889-1896), Phanerochaete chrysosporium (Tempelaars y col., Appl. Environ. Microbiol., 1994, 60: 4387-4393), Thermobifida fusca (Zhang, Biochemistry, 1995, 34: 3386-3395), Trichoderma reesei (Terri y col., BioTechnology, 1983, 1 : 696­ 699; Chen y col., BioTechnology, 1987, 5: 274-278) y Trichoderma viride (n.° de acceso de EMBL A4368686 y A4368688).
genes de p-D-glucosidasa que pueden usarse en la presente invencion pueden obtenerse a partir de Aspergillus aculeatus (Kawaguchi y col, Gene, 1996, 173: 287-288), Aspergillus kawachi (Iwashita y col, Appl. Environ. Microbiol., 1999, 65: 5546-5553), Aspergillus oryzae (documento WO 2002/095014), Cellulomonas biazotea (Wong y col., Gene, 1998, 207: 79-86), Penicillium funiculosum (documento WO 200478919), Saccharomycopsis betabuligera (Machida y col, Appl. Environ. Microbiol., 1988, 54: 3147-3155), Schizosaccharomyces pombe (Wood y col., Nature, 2002, 415: 871-880) y Trichoderma reesei (Barnett y col., BioTechnology, 1991, 9: 562-567).
Varias las enzimas de degradacion de paredes celulares, secuencias de codificacion de las mismas y metodos de expresion en plantas se describen en el documento EP 1867724 A2.
Genes o secuencias de codificacion que codifican enzimas de degradacion de paredes celulares para su uso en la presente invencion pueden optimizarse por codones de acuerdo con el uso de codones en la planta en la que se van a expresar de acuerdo con metodos conocidos en general. Los genes o secuencias de codificacion peuden estar optimizadas por codones de acuerdo con el uso de codores en el genero de planta en la que se van a expresar, preferentemente, estan optimizados por codones de acuerdo con el uso de codones preferente en la especie de planta en la que se van a expresar. Tales metodos de optimizacion de codones son de practica estandar en el tecnica y se realizan comercialmente mediante compares de smtesis de oligonucleotidos o genetica tales como Entelechon GmbH (Bad Abbach, Alemania). La optimizacion de codones para la expresion genetica en un genero o especie de planta particular puede combinarse con otras optimizaciones geneticas, entre otros, para contenido GC homogeneo, estructura secundaria de mARN, evitar sitios de union cnpticos, repeticiones de codones y motivos, sitios de restriccion, etc., por ejemplo, por Entelechon GmbH.
Cuando las plantas o partes de la misma han expresado suficientes cantidades de enzima de degradacion de pared celular en la etapa (i), se cosechan. La cosecha de dichas plantas o partes de plantas puede realizar mediante medios convencionales conocidos en la tecnica para las plantas empleadas. La cosecha puede comprender la eliminacion de partes de plantas no deseadas. Por ejemplo, se puede desear retirar materia de hojas de tuberculos de patata o escarabajos. Con otras plantas, las rafces se pueden retirar. La cosecha tambien puede comprender la trituracion, rastrillado, picado y cortado de las plantas o partes de plantas deseadas, como se realiza generalmente con el mafz a ensilar. Despues, la cosecha se ensila en la etapa de almacenamiento del proceso.
El ensilado de cosechas se usa ampliamente por los agricultores para la conservacion de forrajes como suministro de alimentos de animales durante penodos en los que el forraje es limitado o no esta disponible. Por lo tanto, el ensilado tambien es una tecnica bien establecida que puede llevarse a cabo de acuerdo con procedimientos conocidos de las plantas empleadas en el proceso de la invencion. El proceso de ensilado comprende una fermentacion microbiana anaerobica de azucares solubles en agua con respecto a acido lactico, disminuyendo el pH a un punto que inhibe la fermentacion microbiana adicional. El fin es una cafda del pH rapida para minimizar las perdidas de la fermentacion de nutrientes de las materias primas, especialmente la protema. La literatura sobre ensilado de cosechas de plantas es abundante y el conocimiento sobre las condiciones tales como contenido de humedad adecuado del material a ensilar es conocido y puede someterse a ensayo experimentalmente, vease, por ejemplo: "Preparation, Maintenance and Utilisation of Maize Silage: A Review" por Castenada, C., Birch, C. J. and Dryden, G. (2003); en: Birch, C. J. y Wilson, S. R. Versatile Maize - Golden Opportunities: 5a Australian Maize Conference Proceedings, City Golf Club, Toowoomba, (67-75). 18 - 20 February, 2003; y "Troubleshooting Silage Problems: How to identify potential problems" by Robert J. Van Saun and A. Jud Heinrichs, Department of Dairy and Animal Science; the Pennsylvania State University, http://www.das.psu.edu/research-extension/dairy/nutrition/pdf/ troubleshootsilage08125.pdf). Una seleccion de referencias de literatura sobre materia vegetal de ensilado es la siguiente: el documento US 5.053.233 desvela, entre otro, el uso de aditivos. Otras publicaciones sobre plantas en ensilado y el suo de aditivos son: Adesogan y col., J. Dairy Sci. 86 (2003) 1789-1796; Conaghan y col., J. Dairy Sci.
93 (2010) 628-643; Kung y col., J. Dairy Sci. 87 (2004) 1310-1316; Weinberg, "Preservation of forage crops by solid state lactic acid fermentation-ensiling" en: Current developments in solid state fermentation, 2008, paginas 443-467; Woolford, M. K. (1984), Grass and Forage Science 39: 53-57; M.E. McCullough, Journal of Dairy Science, Vol. 52, tema 10, Octubre 1969, 1605-1608. Ademas, se hace referencia al manual "Successful silage", eds.: Alan G. Kaiser, John W. Piltz, Helen M. Burns y Neil W. Griffiths, Top Fodder, publicado por Dairy Australia and New South Wales Department of Primary Industries, Australia, 2004. El manual esta disponible online en: www.dpi.nsw.gov.au/agriculture/field/pastures- and-rangelands/silage/successful-silage. Las condiciones para el ensilado de mafz inmaduro se encuentran en Shao y col., Biotechnology for Biofuels 2010, 3:12.
La fermentacion del acido lactico empieza generalmente automaticamente mediante bacterias de acido lactico presente en el entorno o en la planta que va a almacenarse. Es, sin embargo, tambien posible inocular la cosecha a ensilar mediante organismos productores de acido lactico adicionales. Se pueden usar productos comerciales para este fin, tales como SIlo-King, Agri-King Inc., Fulton, USA containing Lactobacillus plantarum, Pediococcus pentosaceus y Enterococcus faecium.
De forma alternativa o adicional para conseguir la cafda en pH mediante organismos productos de acido lactico, acidos, preferentemente acidos organicos tales como acido acetico, acido propionico o acido butmco pueden anadirse a la cosecha. De este modo, puede conseguirse una rapida cafda en pH.
La cosecha, opcionalmente despues de haber secado la materia vegetal cosechada a un contenido de humedad adecuado, se pone en un contenedor o silo y se compacta opcionalmente como se requiere para evitar aire excesivo en el contenedor o silo. Como se ha mencionado anteriormente, se pueden anadir organismos productos de acido lactico al ensilado. Ademas o alternativamente, es posible anadir aditivos de ensilado al material de ensilado. Los aditivos de ensilado son conocidos. Ejemplos de aditivos de ensilado son los nitritos, la hexamina, el benzoato de sodio, el propionato de sodio, el acido formico, el acido propionico y el amoniaco y mezclas de los mismos. Mezclas de benzoato de sodio y propionato de sodio o mezclas de benzoato de sodio y acido propionico son aditivos de ensilado convencionales. Una orientacion detallada sobre el uso de aditivos de ensilado se proporciona en el capftulo 7 del manual "Successful silage" citado anteriormente.
El contenedor o silo se cubre o cierra, a continuacion, para permitir que se desarrollen condiciones anaerobicas. Los contenedores/silo pueden ser silos solidos convencionalmente usados en la agricultura. Como alternativa, bolsas de plastico flexibles pueden hechas de polietileno pueden usarse para ensilar la cosecha. El aire en exceso puede retirarse de las bolsas de plastico antes de sellarlas usando una bomba de vacfo para reducir el contenido de oxfgeno.
Cuando se almacena, el ensilado se somete a diversas fases, incluida una fase aerobica, una fase de fermentacion y una fase estable. En la fase aerobica, los microorganismos aerobicos consumen el oxfgeno restante, mediante lo cual se consiguen las condiciones anaerobicas. En la fase de fermentacion, el crecimiento de bacterias anaerobicas produce acido lactico que disminuye el pH. Un bajo pH reduce la actividad de las enzimas proteolfticas y detiene el crecimiento de algunas bacterias anaerobicas. La fase de fermentacion puede durar de 7 a 30 dfas. Esta fase cesa cuando la fermentacion de azucares por las bacterias de acido lactico cesa o bien debido al bajo pH que detiene el crecimiento bacteriano o por agotamiento de azucar de bajo peso molecular. Posiblemente, despues de una fase de fermentacion secundaria debido al crecimiento de esporas clostridiales, se alcanza una fase estable que se caracteriza por poca actividad biologica. En la fase estable, el ensilado puede almacenarse con poco cambio adicional durante penodos extendidos de tiempo, por ejemplo, mas de 100 dfas, preferentemente mas de 200 dfas e incluso mas de 300 dfas. Aunque no existe un lfmite superior estricto, pueden mencionarse 365 dfas como tal lfmite superior para el almacenamiento del ensilado. La alta flexibilidad del tiempo de almacenamiento en el ensilado es ideal para almacenar el ensilado hasta que se use el ensilado para degradar los componentes de las paredes celulares de las plantas de materia vegetal. El tiempo de almacenamiento mmimo en la etapa (iii) o en el proceso de almacenamiento de enzimas de paredes celulares de plantas es de 21 dfas. El ensilado puede almacenarse a temperatura ambiente sin calentamiento o enfriamiento externo. El ensilado se somete internamente a cambios en la temperatura en el transcurso de las fases del ensilado mencionadas anteriormente.
Las condiciones de almacenamiento en el ensilado pueden someterse a ensayo a pequena escala de laboratorio antes de llevar a cabo un proceso a gran escala industrial. Un sistema de modelo de fermentacion de ensilado a escala de laboratorio se describe por Johnson y col., J. Appl. Microbiol. 98 (2005) 106-113. Este sistema de modelo puede emplearse para someter a ensayo condiciones de ensilado tales como densidad de envasado, contenido de humedad de la materia a ensilar, etc. para cosechas de plantas para las cuales hay menos experiencia que del ensilado convencional de alimentos de animales. Tal como se describe por Johnson y col., las condiciones de ensilado determinadas a pequena escala pueden usarse para determinar las condiciones de ensilado a escalas mas grandes.
Por consiguiente, cuando se almacena la cosecha como un ensilado en la etapa (iii), la cosecha se coloca en un contenedor (descrito anteriormente) de modo que puede desarrollarse una atmosfera con contenido de oxfgeno reducido en el contenedor. Esto puede comprender cubrir o cerrar el contenedor para reducir o evitar el intercambio de aire con el entorno fuera del contenedor. En contenedores grandes tales como silos usados en granjas, una capa superior de la cosecha en el silo puede funcionar como cubierta del contenedor que evita el intercambio de aire con las capas de la cosecha por debajo de la capa superior de la cosecha.
La cosecha se almacena en la etapa (iii) durante al menos 21 dfas, preferentemente durante al menos 1 mes en dicho ensilado, es decir, en una atmosfera de contenido de oxfgeno reducido. El almacenamiento se realiza, en general, a temperatura ambiente, lo que significa que el ensilado ni se caliente ni se enfna por el exterior. La cosecha puede almacenarse en dicho ensilado durante 2 o 3 meses. Sin embargo, no se almacena, en general, mas de 12 meses, preferentemente no mas de 8 meses, mas preferentemente no mas de 5 meses, ya que, a pesar de la excepcional estabilidad de las enzimas de degradacion de paredes celulares expresadas en el ensilado, la actividad de las enzimas expresadas disminuye, en general, con un tiempo de almacenamiento en aumento en el ensilado. Tiempo de almacenamiento adecuados para una celulasa dada expresada en una planta o parte de planta particular puede determinarse experimentalmente y seguirse con el tiempo, de forma similar como se realiza en los Ejemplos. En el presente documento, los tiempos de almacenamiento se inician cuando se cierra o se cubre el contenedor que contiene la cosecha.
En el proceso de almacenamiento de enzimas de degradacion de paredes celulares de plantas, las plantas o partes de plantas cosechadas que contienen expresada una o mas de una enzima de degradacion de paredes celulares de plantas puede almacenarse en un ensilado tal como se ha descrito anteriormente en la etapa (iii) del proceso de la invencion. Distintas plantas o partes de plantas que contienen distintas enzimas expresadas pueden ensilarse juntas para producir un ensilado que contiene dos o mas enzimas de degradacion de paredes celulares tales como todas las enzimas requeridas para degradar celulosa tal como se ha descrito anteriormente.
El producto obtenido u obtenible en la etapa (iii) del proceso de la invencion es el ensilado usado en la invencion. El ensilado contiene una o mas de una enzima de degradacion de paredes celulares de plantas activa. La actividad de la enzima puede determinarse de acuerdo con metodos generalmente conocidos para la enzima en cuestion. Tales ensayos de actividad para varias enzimas se describen en los ejemplos. En general, estos metodos requieren la etapa de homogeneizacion y/o extraccion para producir protema soluble total (TSP) del ensilado. Tambien es posible llevar a cabo mas etapas de purificacion antes de la determinacion de actividad de una enzima en cuestion.
El ensilado usado en la invencion contiene enzimas activas capaces de degradar componentes de paredes celulares de plantas. Por lo tanto, el ensilado puede usarse en un proceso de degradacion de componentes de las paredes celulares de plantas de materia vegetal. La aplicacion principal del ensilado es en un proceso de produccion de bioalcohol, a saber, bioetanol, a partir de material lignocelulosico. Hay una literatura abundante en procesos para degradar componentes de paredes celulares de plantas de diversos materiales lignocelulosicos en oligosacaridos, preferentemente, monosacaridos, un proceso tambien denominado como sacarificacion. La sacarificacion puede ser seguida por la fermentacion, el proceso en el que los monosacaridos y, opcionalmente, pequenos oligosacaridos obtenidos en la sacarificacion se fermentan en alcohol. Las levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae se usan tfpicamente para la fermentacion de alcohol. En una realizacion, las etapas de sacarificacion y fermentacion se combinan en un proceso simultaneo conocido como "SSF" que significa "sacarificacion y fermentacion simultanea".
Publicaciones sobre SSF son, entre otros, los siguientes: Kristensen y col., Biotechnology for Biofuels 2008, 1:5; Olofsson y col., Biotechnology for Biofuels 2008, 3:17; Doran-Peterson y col., Methods Mol Biol. 2009; 581:263-80. Por consiguiente, el proceso de degradacion de componentes de paredes celulares de plantas de materia vegetal y el proceso de produccion de un bioalcohol comprende una etapa de sacarificacion de materia vegetal tratando la materia vegetal con un ensilado que se describe en el presente documento. El ultimo proceso tambien comprende una etapa de fermentacion de bioalcohol para producir bioalcohol a partir de glucosa producida en la etapa de sacarificacion.
Los componentes de paredes celulares de materia vegetal que se van a degradar pueden ser los mismos o distintos del ensilado de la invencion. Sin embargo, en la aplicacion principal de la invencion, la materia vegetal es distinta del ensilado de la invencion obtenido en la etapa (iii). La materia vegetal que es distinta del ensilado difiere de las plantas de las cuales se obtiene el ensilado al menos en que la materia vegetal no contiene la enzima de degradacion de paredes celulares expresada en la planta a partir de la cual se obtiene el ensilado y no contiene una construccion que codifica tal enzima.
La materia vegetal a tratar en los procesos de degradacion y produccion de alcohol de la invencion puede ser cualquier material de residuos agncolas vegetales tal como paja. Es preferente materia vegetal rica en celulosa. Principalmente, sin embargo, estos procesos se usan para tratar materia vegetal de plantas espedficamente cultivadas para la produccion de bioalcohol. No existen lfmites estrictos para el origen de la materia vegetal a emplear. La materia vegetal puede ser de plantas anuales, bianuales o perennes. Se pueden usar tanto plantas monocotiledoneas como dicotiledoneas, mediante las cuales se prefieren plantas ricas en celulosa. Ejemplos de plantas anuales son plantas de cereales tales como cebada, trigo, avena. Una planta preferente es el mafz. Ejemplos de plantas perennes son plantas lenosas, a saber, arboles. Materia vegetal de distintas fuentes vegetales puede mezclarse y tratarse como una mezcla. La materia vegetal se tritura preferentemente a conminutas antes de someterla a los procesos de la invencion para aumentar el area de superficie y un facil ataque por las enzimas de degradacion.
En el proceso de degradacion de los componentes de las paredes celulares o en el proceso de produccion del bioalcohol de la invencion, la etapa de tratamiento de materia vegetal con el ensilado puede precederse mediante una etapa de pretratamiento para cambiar la estructura ffsica y/o qmmica de las paredes celulares de la materia vegetal. Tales etapas de pretratamiento son conocidas en la tecnica (vease, por ejemplo, Sticklen, Nature Reviews 9 (2008), 433-443). La mayona de conceptos para la produccion de bioetanol a partir de lignocelulosa empieza con una hidrolisis termoqmmica de la parte de hemicelulosa (pretratamiento), seguida por hidrolisis enzimatica de la parte de celulosa. El fin del pretratamiento es alterar la estructura lignocelulosica y aumentar la tasa de hidrolisis enzimatica de principalmente la celulosa (Kristensen y col., Biotechnology for Biofuels 2008, 1:5). Esto debe realizarse con una formacion minima de compuestos que inhiben los microorganismos de fermentacion. El area de superficie accesible se entiende como uno de los factores mas importantes que afectan la eficacia de la degradacion de celulosa enzimatica. En madera sin tratar solo una pequena fraccion de los capilares de las paredes celulares es accesible para las enzimas. El pretratamiento, sin embargo, aumenta el area disponible de varios modos: i) se forman fragmentos y roturas que proporcionan un area aumentada, ii) la fraccion de hemicelulosa se hidroliza lo que disminuye los efectos protectores, iii) la lignina tambien se somete a cambios estructurales y la madera se deslignifica en diversos grados, dependiendo de la tecnologfa de pretratamiento. Por lo tanto, la proteccion de las microfibrillas y la oclusion de poros, provocada por la lignina, puede eliminarse. Otros factores, que se cree que influyen en la digestibilidad en SSF, son la cristalinidad del sustrato y el grado de polimerizacion. La materia vegetal pretratada tambien se considera "materia vegetal" para los fines de la presente invencion.
Los metodos de pretratamiento pueden dividirse en metodos ffsicos y qmmicos y se usan comunmente combinaciones de estos dos (vease, por ejemplo, la revision escrita por Mosier y col. Bioresour Technol 2005, 96(6):673-686). El tipo de materia prima afecta la eleccion del metodo de pretratamiento. La hemicelulosa es, por ejemplo, acetilada a un alto grado en materiales ricos en xilano. Puesto que se libera acetato durante la hidrolisis, el pretratamiento de estos materiales es hasta cierto grado autocatalftico y requiere menos acido anadido y condiciones de proceso mas suaves. Sin embargo, el acetato liberado se anade a la toxicidad de los hidrolizados de hemicelulosa (vease: Biotechnology for Biofuels 2008, 1:5). El pretratamiento de expansion/explosion de fibras de amomaco (AFEX) es un metodo atractivo para el tratamiento de restos agncolas, proporcionando celulosa altamente digestible. El AFEX despolimeriza la lignina, retira la hemicelulosa y descristaliza la celulosa. La temperatura moderada y el pH tambien minimizan la formacion de productos de degradacion de azucar. Otro metodo de pretratamiento es el metodo con cal, basado en hidroxido de calcio (o sodio). Los pretratamientos alcalinos se llevan a cabo a temperaturas mas bajas durante tiempos de residencia largos y como en el metodo de AFEX, se obtiene una deslignificacion de la biomasa. AFEX se describe, entre otros, en Shao y col., Biotechnology for Biofuels 2010, 3:12 y las referencias 8-12 que se citan en el presente documento.
Despues del pretratamiento opcional, la materia vegetal opcionalmente pretratada se somete a tratamiento con el ensilado para la sacarificacion en la etapa (iv) o la etapa (b). Esta etapa se lleva a cabo, en general, en un medio de reaccion acuoso, preferentemente en reactores de tanque agitado o fermentadores. La temperatura y el pH del medio de reaccion se establecen de modo que la(s) enzima(s) contenidas en el medio de reaccion tiene(n) suficiente actividad. Se anade el ensilado que contiene al menos una enzima de degradacion de paredes celulares expresada tal como se ha descrito en el presente documento. Otras enzimas requieras para la degradacion de paredes celulares se pueden anadir en el medio de reaccion a partir de otras fuentes. Preferentemente, se anade el ensilado que contiene multiples enzimas distintas implicadas en la degradacion de celulosa o de paredes celulares. Cuando se usan multiples enzimas de degradacion de paredes celulares, se seleccionan preferentemente de modo que tienen una temperatura y un pH similares optimos de modo que la actividad enzimatica puede obtenerse para todas las enzimas usadas en las mismas o similares condiciones de pH y temperatura.
El ensilado se anade, de modo que, las enzimas de degradacion de paredes celulares contenidas en el mismo entran facilmente en el medio de reaccion. Puesto que el almacenamiento en ensilado destruye parcialmente la estructura de las plantas o partes de las mismas que contiene las enzimas, el ensilado puede anadirse al medio de reaccion tal cual, a saber, si las enzimas se dirigen al apoplasto. Como alternativa, el ensilado puede triturarse o homogeneizarse antes de la adicion al medio de reaccion para promover la entrada de las enzimas en el medio de reaccion. En el medio de reaccion, el material de paredes celulares a partir de la materia vegetal ensilada tambien se degrada por las enzimas. Por lo tanto, la materia vegetal que se origina de las platas que han expresado las enzimas tambien se usa para la produccion de monosacaridos y bioalcohol, lo que contribuye en la excelente eficacia y relacion costo eficacia de la presente invencion.
Las condiciones para la etapa de sacarificacion (etapa (iv) o etapa (b)) en la invencion son similares a las condiciones conocidas en la tecnica para la sacarificacion usando celulasas anadidas, vease, por ejemplo, Teymouri y col., Appl. Biochem. Biotechnol. (2004) 116, 1183-1192; Ransom y col., Appl. Biochem. Biotechnol (2007) 36, 207­ 220; Oraby y col., Transgenic Res. (2007) 16, 739-749. La relacion de mezcla de la cantidad de ensilado con respecto a la cantidad de materia vegetal (distinta del ensilado) no queda particularmente limitada. La relacion puede encontrarse en un intervalo de 100:1 a 1:1000, preferentemente, en un intervalo de 10:1 a 1:100, mas preferentemente de 1:1 a 1:10 en peso determinado sobre la base de materia en seco. La sacarificacion se lleva a cabo, en general, en reactores o fermentadores con condiciones de pH, temperatura y mezcla controladas. La duracion de la sacarificacion se escoge de modo que se obtiene un grado deseable de sacarificacion. Una etapa de sacarificacion puede durar de 1 a 200 horas, preferentemente de 5 a 4 horas. La sacarificacion puede llevarse a cabo a temperatura de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 70 °C, preferentemente de aproximadamente 35 a 60 °C dependiendo de las enzimas de degradacion de paredes celulares usadas y su concentracion presente. El pH se selecciona para la alta actividad de las enzimas de degradacion de paredes celulares y puede encontrarse en el intervalo de 4 y aproximadamente 7, preferentemente de un pH de 4,5 a 6.
En la etapa de fermentacion (c) del proceso de produccion de bioalcohol, los monosacaridos producidos en la etapa de sacarificacion se convierten en bioalcohol tal como bioetanol. Como se ha mencionado anteriormente, la sacarificacion y fermentacion pueden llevarse a cabo simultaneamente (vease, por ejemplo, Biotechnology for Biofuels 2008, 1:5). Como alternativa, estas etapas se llevan a cabo consecutivamente. Para fermentar monosacaridos en alcohol, se puede emplear un microorganismo tal como se conoce de la produccion de bioetanol basada en almidon. Se pueden usar levaduras tales como la Saccharomyces cerevisiae y se conocen muchas cepas de las mismas para la produccion de alcohol. Las condiciones para la fermentacion de alcohol son conocidos a partir de los procesos de produccion de bioalcohol basados en glucosa derivada de almidon. El bioalcohol producido puede, a continuacion, aislarse y purificarse, por ejemplo, usando destilacion.
Ejemplos
La invencion se describe adicionalmente usando ejemplos que no limitan el alcance de proteccion.
Ejemplo de referencia 1: Determinacion de concentracion de celulas de Agrobacterium en cultivo liquido en terminos de unidades formadoras de colonias (ufc)
La concentracion de celulas de Agrobacterium en suspension lfquida en terminos de unidades formadoras de colonias por ml (ufc/ml) de suspensiones lfquidas puede determinarse usando el siguiente protocolo. Las celulas de la cepa ICF 320 de Agrobacterium tumefaciens transformada con la construccion pNMD620 se cultivo en 7,5 ml de medio de LBS lfquido que contema 25 mg/l de kanamicina (AppliChem, A1493) y 50 mg/l de rifampicina (Carl Roth, 4163.2). El cultivo bacteriano se incubo a 28 °C con agitacion continua. La absorbancia o densidad optica de cultivo bacteriano expresada en unidades de absorbancia (UA) se controlo en 1 ml de alfcuotas del cultivo usando un espectrofotometro a 600 nm de longitud de onda (DO600). La concentracion celular estimada como un numero de unidades formadoras de colonia por mililitro de cultivo lfquido (ufc/ml) puede analizarse en valores de DO600 de 1; 1,3; 1,5; 1,7 y 1,8. Para este fin, 250 pl de alfcuotas del cultivo lfquido se diluyeron con medio de LBS para conseguir un volumen final de 25 ml (dilucion 1:100). 2,5 ml de tal dilucion de 1:100 se mezclaron con 22,5 ml de LBS para conseguir la dilucion de 1:1.000. Las diluciones de cultivo lfquido de 1:100; 1:1.000; 1:10.000; 1:100.000; 1:1.000.000; 1:10.000.000 y 1:100.000.000 se prepararon de modo similar. Las alfcuotas de las ultimas tres diluciones se extendieron sobre medio de LBS solidificado de agar complementado con 25 mg/l de kanamicina y 50 mg/l de rifampicina (250 pl de cultivo bacteriano por placa de 90 mm de diametro). La colocacion en placas de los alfcuotas para cada dilucion se llevo a cabo por triplicado. Despues de 2 dfas de incubacion a 28 °C, se recontaron las colonias bacterianas de cada placa. La colocacion en placas de diluciones de 1: 1.000.000 y 1:10.000.000 dio como resultado en unos pocos cientos y pocas docenas de colonias por placa, respectivamente. Hasta el momento, la dilucion de 1:100.000.000 proporciono solo pocas colonias por placa, esta dilucion no se uso para el calculo de la concentracion celular. Se estimo la concentracion celular de acuerdo con la formula: ufc/ml = 4 x numero de colonias por placa x factor de dilucion.
Para transformar las concentraciones celulares tal como se midio mediante mediciones de absorbancia a 600 nm (en medio de LB) y en terminos de unidades formadoras de celulas, se usa la siguiente relacion en el presente documento: una DO600 de 1,0 se corresponde con 1,1 x109 ufc/ml.
Ejemplo 1: Vectores usados en los siguientes ejemplos
Se realizaron vectores virales basados en el virus del mosaico del tabaco (TMV) con capacidad de movimiento celula a celula disenados como provectores que contienen partes complementarias de replicon viral y vectores ensamblados que contienen replicon viral completo. Se crearon basandose en los vectores descritos en Marillonnet y col. (2004), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (18) 6852-685), documento WO 02/88369.
Los provectores del TMV del modulo del extremo 5' tienen ARN-polimerasa de ARN dependiente de ARN (RdRp) de TMV dirigida por el promotor 2 de actina de Arabidopsis que contiene 14 intrones, la protema de movimiento (PM) del TMV con 2 intrones y distintas secuencias de fusion seguidas por una media parte del extremo 5' del intron, una sitio de recombinacion de attP y un terminador de nopalina sintasa (Nos). El fragmento completo se clona entre los bordes izquierdo y derecho del ADN-T del vector binario. Las secuencias de fusion incluyen marcador His(6) con sitio de escision de enteroquinasa (His-EK) (construccion de plCH22455, la secuencia de nucleotidos de su ADN-T se proporciona como SEQ ID NO: 1), presecuencia de direccionamiento (TP) de apoplasto de a-amilasa de arroz 3A (plCH20155), TP de apoplasto de calreticulina de Nicotiana plumbaginifolia (pICH20188), TP de apoplasto de pectinasa de manzana (pICH20388), TP de apoplasto de a-amilasa de cebada (pICH20999), TP-His(6)-EK de apoplasto de calreticulina de Nicotiana plumbaginifolia (pICH22464), PTde cloroplasto dicotiledoneo artificial (pICH20030) y TP-His-EK de cloroplasto dicotiledoneo artificial (pICH22474) (Fig. 2A).
En los modulos del provector del extremo 3' de provectores del TMV, un sitio de recombinacion de attB se sigue por una media parte del extremo 3' del intron, el gen de interes que codificas las secuencias y una region no traducida del TMV en el extremo 3' (3'RNT) asf como un terminador de nopalina sintasa (Nos). El fragmento completo se clona entre los bordes izquierdo y derecho del ADN-T del vector binario. Los genes de interes usados en estas construcciones codificaban endoglucanasa E1 de Acidothermus cellulolyticus (pNMD231; la secuencia de nucleotidos de la region de ADN-T se proporciona como SEQ ID NO: 2), Exoglucanasa 1 (CBHI) de Trichoderma reesei (pNMD241; la secuencia de nucleotidos de la region de ADN-T se proporciona como SEQ ID NO: 3), exocelulasa E3 de Thermobifida fusca (pNMD251; la secuencia de nucleotidos de la region de ADN-T se proporciona como SEQ ID NO: 4), p-glucosidasa BGL4 a partir de Humicola grisea (pNMD910; la secuencia de nucleotidos de la region de ADN-T se proporciona como SEQ ID NO: 5) y GFP (pICH7410) (Fig. 2B). Las secuencias de codificacion de todos los genes de interes menos GFP se optimizaron por codones para Nicotiana benthamiana y se sintetizaron mediante Entelechon GmbH (Bad Abbach, Alemania).
El modulo del vector de la integrasa plCH14011 alberga un gen de la integrasa PhiC31 dirigido por el promotor de choque termico con una senal de localizacion nuclear (NLS) y un terminador Nos insertado entre los bordes izquierdo y derecho del ADN-T (Fig. 2C). La secuencia de nucleotidos de la region de ADN-T se proporciona como SEQ ID NO: 6.
Los vectores del TMV ensamblados contienen RdRp del TMV dirigidos por el promotor de la Actina 2 con 14 intrones, PM del TMV con 2 intrones, secuencia de fusion y secuencia de codificacion del gen de interes, una region no traducida del TMV del extremo 3' (3' RNT) asf como un terminador Nos. El fragmento completo se inserta entre los bordes izquierdo y derecho del ADN-T del vector binario. pNMD1201 (secuencia de nucleotidos de su ADN-T se proporciona como as SEQ ID NO: 7), las construcciones de pNMD1213 y pNMD1192 contienen p-glucosidasa BGL4 de Humicola grisea sin ninguna secuencia de fusion, BGL4 fusionado con Hi-EK de extremo N y BGL4 fusionado con TP de cloroplasto dicotiledoneo artificial, respectivamente. La construccion de pNMD1231 porta endoglucanasa E1 de Acidothermus cellulolyticus fusionada con TP de apoplasto de a-amilasa de arroz 3A. pNMD1181 contiene Exoglucanasa 1 (CBHI) de Trichoderma reesei fusionada con TP de apoplasto de a-amilasa de cebada. pNMD1161 (secuencia de nucleotidos de su ADN-T se proporciona como SEQ ID NO: 8) y pNMD1129 contiene exocelulasa E3 de Thermobifida fusca fusionada con TP de apoplasto de pectinasa de manzana y TP-His-EK de cloroplasto dicotiledoneo artificial, respectivamente. El vector de pNMD560 contiene ORF de GFP sin ninguna secuencia de fusion (Fig. 7).
Se expreso Endoglucanase Cel5A a partir de Thermotoga maritima de la construccion de pNMD3081. En la Fig. 14 se muestra un mapa de plasmidos del vector basado en el TMV para la expresion de endoglucanasa Cel5A citosolica.
Detalles sobre las enzimas celulolfticas empleadas son los siguientes. La Endoglucanasa E1 es de la bacteria termofila Acidothermus cellulolyticus 11B (Swiss-Prot: P54583; EC 3.2.1.4). Es una enzima termoestable con una temperatura optima de 81 °C y un pH optimo de aproximadamente 5 a aproximadamente 6 (Himmel y col., 1994; Sakon y col., 1996). Es una protema secretada con peptido de senal de extremo N escindible. El precursor proteico consiste en 562 restos de aminoacidos; el peptido de senal abarca los primeros 41 aminoacidos; la region 42-562 aa se corresponde con la protema madura. Una secuencia de nucleotidos que se corresponde con la parte madura de la protema (42-662 aa) sin peptido de senal nativo se optimizo por codones para la Nicotiana benthamiana y se sintetizo mediante Entelechon GmbH (Bad Abbach, Alemania). Esta secuencia se subclono en vectores de expresion del TMV.
La Exoglucanasa 1 (CBH1) es del hongo mesofilo de Trichoderma reesei (tambien conocido como Hypocrea jecorina) (Swiss-Prot: P62694; EC 3.2.1.91). Es una protema secretada con peptido de senal de extremo N escindible. El precursor proteico consiste en 513 aminoacidos, peptidos de senal abarcan los primeros 17 aminoacidos. Es una enzima mesofila con una temperatura optima de 45-50 °C y un pH optimo de 5 (Baket y col., 1998). La secuencia de nucleotidos que se corresponde con la parte madura de la protema (18-662 aa) sin peptido de senal nativo optimizada por codones para la Nicotiana benthamiana y sintetizada mediante Entelechon GmbH (Bad Abbach, Alemania) se uso para subclonarse en vectores de expresion del TMV.
La Beta-1,4-exocelulasa (E3) es de la bacteria termofila de Thermobifida fusca (GenBank: AAA62211; EC 3.2.1.91). Es una protema secretada; el precursor proteico consiste en 596 restos de aminoacidos, incluido peptido de senal de extremo N 38 aa y la parte madura (39-596 aa). E3 es termoestable, que retiene su total actividad despues de 16 horas a 55 °C. Tambien tiene un amplio pH optimo alrededor de 7-8, reteniendo el 90 % de su maxima actividad entre un pH 6 y 10 (Zhang y col., 1995, 2000). La secuencia de nucleotidos que se corresponde con la parte madura de la protema (39-596 aa) sin peptido de senal nativo optimizada por codones para la Nicotiana benthamiana y sintetizada mediante Entelechon GmbH (Bad Abbach, Alemania) se uso para subclonarse en vectores de expresion del TMV.
La p-glucosidasa BGL4 es del hongo termofilo de Humicola grisea (GenBank: BAA74958; EC 3.2.1.21). Es un polipeptido de 476 aminoacidos. La literatura que describe BGL4 no contiene ninguna indicacion sobre la presencia de peptido de senal de extremo N escindible; ademas, el software TargetP 1.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/) no identifica ningun peptido de senal de extremo N esta secuencia de protemas. La enzima BGL4 es termoestable, con una temperatura optima de 60 °C. El pH optimo de esta enzima 6,0 y retiene mas del 80 % de su actividad relativa en el intervalo de pH 6,0-11,00 despues de 20 h a 4 °C (Takashima y col. 1999). La secuencia de nucleotidos que se corresponde con la longitud completa de la protema (39-596 aa) se optimizo por codones para la Nicotiana benthamiana y se sintetizo mediante Entelechon GmbH (Bad Abbach, Alemania). Esta secuencia se uso para subclonarse en vectores de expresion del TMV.
La endoglucanasa Cel5A de Thermotoga maritima se describe en Pereira JH y col. (2010) Biochemical characterization and crystal structure of endoglucanase Cel5A from the hyperthermophilic Thermotoga maritima. J Struct Biol. 172(3): 372-9; y Mahadevan SA y col. (2008) Site-directed mutagenesis and CBM engineering of Cel5A (Thermotoga maritima). FEMS Microbiol Lett. 287(2): 205-11. Algunas propiedades basicas se proporcionan en la Tabla 1. La exoglucanasa 1 (CBHI) de Humicola grisea se describe en Takashima, S. y col., (1996) Cloning, sequencing, and expression of the cellulase genes of Humicola grisea var. thermoidea. J Biotechnol. 50:137-147. Algunas propiedades basicas de esta enzima se proporcionan en la Tabla 1.
Las secuencias de nucleotidos de las secuencias de codificacion optimizadas con codones de las enzimas de degradacion de paredes celulares usadas en los ejemplos son las siguientes:
SEQ ID NO 9: secuencia de codificacion optimizada de p-glucosidasa Bgl4 a partir de Humicola grisea (BAA74958.1);
SEQ ID NO 10: secuencia de codificacion de la endoglucanasa Cel5A a partir de Thermotoga maritima (3MMW_D);
SEQ ID NO 11: secuencia de codificacion de la endoglucanasa E1 a partir de Acidothermus cellulolyticus (P54583.1) parte madura sin peptido de senal);
SEQ ID NO 12: secuencia de codificacion de la exoglucanasa 1 (CBHI) a partir de Trichoderma reesei (P62694.1) parte madura sin peptido de senal);
SEQ ID NO 13: secuencia de codificacion de la Exoglucanasa 1 (CBHI) a partir de Humicola grisea (D63515) parte madura sin peptido de senal);
SEQ ID NO 14: secuencia de codificacion de la exocelulasa E3 a partir de Thermobifida fusca (AAA62211.1) parte madura (sin peptido de senal).
Ejemplo 2: El direccionamiento a compartimentos celulares mejora el nivel de expresion y actividad enzimatica de enzimas de degradacion de paredes celulares recombinantes
Ensayo sobre la expresion de celulasas en distintos compartimentos celulares (citosol, cloroplasto y apoplasto). Para este fin se expresaron enzimas celuloltticas como fusiones traslacionales con presecuencias de direccionamiento correspondientes usando modulos de provectores del TMV (Marillonnet y col., 2004, vease mas arriba), documento WO 02/88369.
Se cultivaron plantas de Nicotiana benthamiana en el invernadero (temperatura dfa y noche de 19-23 °C y 17-20 °C, respectivamente, con 12 h de luz y 35-70 % de humedad). Se usaron plantas de seis semanas de edad para las inoculaciones.
Para la transfeccion de la planta, los cultivos durante la noche de Agrobacterium saturados se ajustaron a una DOaoo=1,3 (~1,2x109 ufc/ml) con medio de inoculacion de Agrobacterium (AIM: 10 mM de MES pH 5,5, 10 mM de MgSO4). Se llevaron a cabo mas diluciones de cultivos con AIM y la inoculacion se llevo a cabo mediante infiltracion usando una jeringa sin aguja.
Para analizar materia vegetal que expresaba fusiones de celulasa con respecto a distintas presecuencias de direccionamiento de actividad de celulasa, se inoculo una mezcla de dilucion de cepas de Agrobacterium que portaban provectores del TMV del extremo 5' (dilucion de 100 veces con respecto a la mezcla final), provectores del TMV del extremo 3' (dilucion de 100 veces) o construccion de integrasa (dilucion de 10 veces), respectivamente, con una jeringa sin aguja en 3 hojas de distinta edad de Nicotiana benthamiana. En la Fig. 3 se muestra una vision sobre las inoculaciones para la optimizacion de la expresion transitoria de celulasas recombinantes.
Se incubaron plantas de Nicotiana benthamiana inoculadas en un invernadero en las condiciones descritas anteriormente durante 11 dfas. Se observaron fenotipos variables en las zonas de inoculacion que variaban desde una fuerte necrosis (por ejemplo, endoglucanasa E1 expresada en citosol) a tejido parcialmente inafectado (todas las fusiones de p-glucosidasa bGL4) (Fig. 4).
La materia vegetal de 3 hojas de distinta edad se cosecho usando el barrenador de corteza de 7 a 11 dpi (dfas post inoculacion) en muestras por triplicado, se congelo en nitrogeno lfquido y se almaceno a -80 °C. La materia vegetal cosechada se analizo usando SDS-PAGE y ensayos de actividad enzimatica.
Analisis de SDS-PAGE con tincion de Coomassie
Para la SDS-PAGE, se trituraron aproximadamente 50 mg en peso fresco de materia de hoja de Nicotiana benthamiana en nitrogeno lfquido y se prepararon extractos de protemas crudos con 5 volumenes de 2 x tampon de Laemmli. Se extrajo la protema soluble total (TSP) a pequena escala a partir de -150 mg de materia vegetal en peso fresco triturada en nitrogeno lfquido con 5 volumenes de tampon de extraccion preenfriado (EB: 50 mM de acetato de sodio pH 5,5, 100 mM de NaCl, 10 % (v/v) de glicerol en agua). Para la extraccion, las muestras se agitaron vorticialmente despues de la adicion de EB y se incubaron sobre hielo durante 30 min con agitacion vorticial de vez en cuando. Los residuos celulares se separaron mediante centrifugacion durante 10 min a 13.000 rpm y 4 °C dos veces.
La concentracion de protemas de extractos de TSP se determino mediante el ensayo de Bradford usando un Ensayo de protemas de Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, GmbH, Munich, Alemania) y Albumina de suero bovino (Sigma-Aldrich, Co., St-Louis, USA) como patron. Para el analisis mediante SDS-PAGE, se anadio tampon de Laemmli a las muestras de TSP con una concentracion final de 1x.
Las muestras de protemas de desnaturalizaron a 95 °C durante 5 min, se separaron en 10 % de gel de poliacrilamida y se tineron usando Solucion de tincion de protemas de PageBlue™ (Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, Alemina). Se llevo a cabo una estimacion del porcentaje de fusion de celulasa recombinante de TSP mediante comparacion de los extractos de TSP con respecto a cantidades conocidas de BSA (Sigma-Aldrich) sobre geles de poliacrilamida tenidos con Coomassie.
La Fig. 5 resume el analisis de SDS-PAGE de la expresion para distintas fusiones traslacionales de Endoglucanasa E1 a partir de Acidothermus cellulolyticus, Exoglucanasa 1 (CBHI) a partir de Trichoderma reesei, Exocelulasa E3 a partir de Thermobifida fusca y p-glucosidasa BGL4 a partir de Humicola grisea. Se encontro una significante variacion del nivel de expresion dependiendo de la presecuencia de direccionamiento. Se demostro una alta expresion para todas las fusiones de p-glucosidasa BGL4 con la acumulacion mas alta en citosol y cloroplasto, aunque en el ultimo caso, la escision de la presecuencia de direccionamiento no fue completa. En el caso de la Endoglucanasa E1, la acumulacion mas alta se mostro en formas dirigidas a apoplasto; la acumulacion en citosol y cloroplasto fue inferior. Se encontro un patron de expresion similar para la Exoglucanasa 1 (CBHI) con diferencias significativas entre las presecuencias de direccionamiento de apoplasto sometidas a ensayo. De manera sorprendente, el CBHI expresado como una fusion con TP de apoplasto de a-amilasa de cebada no fue detectable despues de la tincion con Coomassie. Todas las fusiones de Exoglucanasa E3 se expresaron bien con la mejor acumulacion en citosol y cloroplasto. Se encontro un desplazamiento de migracion electroforetico en formas dirigidas a apoplasto sugiriendo que estas protemas estas glicosiladas.
Mediciones de actividad enzimatica
Ensayo de actividad de celulasa de Endoglucanasa E1 y celobiohidrolasa CBHI
Se determino la actividad enzimatica usando p-nitrofenil-p-D-celobiosida como sustrato. 100 |jg de extractos de TSP vegetales se incubaron en 50 mM de NaAc pH 5,5, 100 mM de NaCI, 5 % (v/v) de glicerol, complementados con o sin 5 mM de p-nitrofenil-p-D-celobiosida como blancos de enzimas, respectivamente, en un volumen final de 1 ml a 50 °C durante de 1 a 24 horas. Los almuotas de la mezcla de reaccion se retiraron en distintos puntos de tiempo y se diluyeron 1:10 con 0,15 M de glicina pH 10,0 para finalizar la reaccion. La concentracion de p-nitrofenol (pNP) liberado de p-nitrofenil-p-D-celobiosida se determino mediante medicion de la absorbancia a 405 nm. La celulasa de enzimas comerciales (endo-1,4-p-D-glucanasa) a partir de especie de Trichoderma (Megazyme, Bray, Irlanda) y celobiohidrolasa (CBHI) a partir de especie de Trichoderma (Megazyme) sirvieron como controles positivos. Las actividades enzimaticas se expresaron sobre materia vegetal en peso fresco en gramos o una base de TSP.
Ensayo de actividad de celulasa de p-glucosidasa Bgl4
Para la determinacion de la actividad de la p-glucosidasa, se uso celobiosa como sustrato. Se incubaron distintas cantidades de protemas de extractos de TSP que variaban de 1-40 |jg en 50 mM de NaAc pH 5,5, 100 mM de NaCI, 5 % (v/v) de glicerol complementado con o sin 5 mM de celobiosa como blancos de enzimas (mezcla con sustrato pero sin enzima), respectivamente, en un volumen final de 1 ml a 50 °C durante 30 min. La concentracion de glucosa liberada en las muestras se determino mediante Kit (Megazyme) de D-glucosa (Formato GOPOD). La celobiasa de enzimas comerciales a partir de Aspergillus niger (sinonimo: Novozyme 188; Sigma-Aldrich) sirvio como control positivo. La actividad de la p-glucosidasa se calculo en unidades de celobiasa (CBU) de acuerdo con UIPAC o unidades internacionales (UI) tal como se describe en Ghose y col., 1987, y las actividades enzimaticas se expresaron sobre materia vegetal en peso fresco en gramos o una base de TSP.
Ensayo de actividad de celulasa de exoglucanasa E3
Para la determinacion de la actividad de la exoglucanasa, se uso el sustrato de celulosa microcristalina insoluble de Avicel (celulosa de Sigmacell tipo 20; Sigma-Aldrich). 100 jg de extractos de TSP vegetales se incubaron en 50 mM de NaAc pH 5,5, 50 mM de NaCI, 5 % (v/v) de glicerol, 0,02 % de azida de sodio, 1,2 mg/ml de Novozyme 188 (pglucosidasa; Sigma-Aldrich), complementados con o sin un 1 % (p/v) de Avicel como blancos de enzimas, respectivamente, en un volumen final de 3 ml a 50 °C y 90 rpm durante 120 horas. Los almuotas de la mezcla de reaccion se retiraron en distintos puntos de tiempo (2 h, 4 h, 24 h, 48 h, 72 h y 120 h) para la determinacion de la concentracion de glucosa usando el Kit (Megazyme) de D-glucosa (Formato GOPOD). La celobiohidrolasa (CBHI) de enzimas comerciales a partir de especie de Trichoderma (Megazyme) sirvio como control positivo. Las actividades enzimaticas se expresaron sobre materia vegetal en peso fresco en gramos o una base de TSP.
El analisis de las actividades enzimaticas de fusiones traslacionales expresadas se resume en la Fig. 6. La actividad de p-glucosidasa BGL4 mas alta se encontro en citosol y cloroplasto, que se correlaciona con los datos de acumulacion de protemas recombinantes (Fig. 6A). En el caso de la Endoglucanasa E1, la actividad mas alta se detecto en formas dirigidas a apoplasto, que se correlaciona de nuevo con la acumulacion de protemas recombinantes (Fig. 6B). Lo mismo se encontro para la Exoglucanasa CBHI (Fig. 6C). Por el contrario, no se encontro una correlacion clara para la Exoglucanasa E3 sugirieron que una multiplicacion adecuada fue muy importante para la actividad enzimatica (Fig. 6D). La forma citosolica con alta expresion proporciona actividad enzimatica relativamente baja; la actividad mas alta se encontro para la forma dirigida de cloroplasto con marcador His (acumulacion de protemas recombinantes alta) y forma dirigida de apoplasto dirigido con presecuencia de pectinasa de manzana (acumulacion relativamente baja). Curiosamente, se encontro una pobre actividad enzimatica en la forma dirigida a cloroplasto sin marcador His.
Las fusiones que proporcionaron mayor actividad enzimatica se seleccionaron para clonar vectores ensamblados a usar para la produccion a gran escala preparatoria de enzimas de degradacion de paredes celulares (Fig. 7). Incluyen dos formas de p-glucosidase bGL4 a partir de Humicola grisea para la expresion citosolica (sin ninguna presecuencia (pNMD1201) y con His-EK de extremo N (pNMD1213)) asf como BGL4 con presecuencia de direccionamiento de cloroplasto (pNMD1192). Para la Endoglucanasa E1 a partir de Acidothermus cellulolyticus, se selecciono una fusion con presecuencia de direccionamiento de apoplasto a partir de a-amilasa de arroz (construccion de pNMD1231). En el caso de la Exoglucanasa 1 (CBHI) a partir de Trichoderma reesei, fue la fusion con el TP de apoplasto de a-amilasa de cebada (construccion de pNMD1181). Se crearon dos construcciones para la exocelulasa E3 de Thermobifida fusca que contema fusiones con TP de apoplasto y TP de cloroplasto de pectinasa de manzana seguido por His-EK (pNMD1161 y pNMD1129, respectivamente). Ademas, la construccion de pNMD560 que contema la insercion de la secuencia de codificacion de GFP se uso como control de transfeccion agrobacteriano.
Ejemplo 3: La pulverizacion con agrobacterias proporciona niveles de expresion similares de enzimas de degradacion de paredes celulares que con infiltracion
Analizamos dos metodos distintos de inoculacion para la expresion de celulasa mas alta de fusiones de celulasa seleccionadas: infiltracion por jeringa frente a pulverizacion con suspensiones de agrobacterias que albergan los mismos vectores de TMV ensamblados. Para la transfeccion de la planta, los cultivos durante la noche de Agrobacterium (DO600=1-3) se diluyeron con medio de inoculacion de Agrobacterium (AIM, 10 mM de MES, pH 5,5, 10 mM de MgSO4). Para la pulverizacion, se anadio 0,1 % de Silwet L-77 (v/v) (Kurt Obermeier GmbH & Co. KG, Bad Berleburg, Alemania) a la solucion. Se usaron diluciones de cultivos agrobacterianos 1:100 y 1:1.000 para la infiltracion con jeringa y pulverizacion, respectivamente, como provision de la mayor expresion (datos no mostrados). Se usaron plantas de Nicotiana benthamiana de seis semanas de edad para la inoculacion con cultivos agrobacterianos. La materia vegetal se cosecho a los 4, 7, 11 y 14 dpi (dfas post infeccion) y se uso para el analisis de SDS-PAGE y la evaluacion de la actividad enzimatica tal como se describe en el Ejemplo 2.
El analisis SDS-PAGE (Fig. 8) demostro que para la mayona de las fusiones de celulasa, la infiltracion con jeringa y pulverizacion de agrobacterias proporciona niveles de expresion comparables. Se observo pocos dfas de retraso de acumulacion de protemas recombinantes en el suministro por pulverizacion, lo que puede explicarse por el bajo numero de celulas de hojas inicialmente dirigidas por Agrobacterium. p-glucosidasa BGL4 citosolica a partir de Humicola grisea expresada a partir de un vector del TMV ensamblado con inoculacion por jeringa de una dilucion de 1:100 de cultivo de Agrobacterium (7 dpi) e inoculacion por pulverizacion de una dolucion de 1:1.000 (11 dpi) se estimo que formaban aproximadamente el 55 % y el 50 % del TSP, respectivamente. Asimismo, BGL4 dirigido a cloroplasto formo aproximadamente el 75 % del TSP despues de la infiltracion y el 60 & del TSP despues de la pulverizacion. En el caso de la Exoglucanasa 1 (CBHI) a partir de Trichoderma reesei expresada como una fusion con TP de apoplasto de a-amilasa de cebada, los valores correspondientes fueron el 6,5 % y el 3,5 % del TSP. La fusion de exocelulasa E3 de Thermobifida fusca de TP-His-EK de cloroplasto formo aproximadamente el 30 % y el 25 % del TSP, respectivamente; y la fusion de TP-E3 de apoplasto de pectinasa de manzana proporciono aproximadamente el 7 % y el 2,5 % del TSP, respectivamente. Se encontro una diferencia mas significante para la Endoglucanasa E1 dirigida a apoplasto a partir de Acidothermus cellulolyticus (fusion con a-amilasa de arroz) en la que la infiltracion con jeringa dio como resultado una acumulacion de protemas recombinantes de aproximadamente el 15 % de TSP y mediante pulverizacion de aproximadamente el 2 % de TSP.
Las actividades enzimaticas de todas las cuatro enzimas se calcularon basandose en los g en peso en freso de materia vegetal correlacionado con los datos de expresion de protemas recombinantes (Fig. 9). BGL4, CBHI y E1 proporcionaron actividades enzimaticas comparables despues de la infiltracion y pulverizacion; la actividad E3 despues de la pulverizacion fue inferior.
Ejemplo 4: El almacenamiento de biomasa vegetal que contiene celulasa como un ensilado evita la degradacion de protemas de celulasa recombinantes y mantiene su actividad enzimatica
Materia vegetal inoculada con diluciones de 1:1.000 de cultivos de Agrobacterium que portaban construcciones del TMV ensambladas se cosecho 11 dpi como una agrupacion de plantas. Se retiro el nervio central de las hojas y el limbo de las hojas se corto en piezas de aproximadamente 5 cm2 de tamano usando una hoja de bistun. Las piezas de hojas se extendieron y se deshidrataron o bien a 55 °C durante 20 h para su almacenamiento como masa seca o durante 22 h a temperatura ambiente (TA) para su almacenamiento como ensilado. La materia de hojas deshidratada (45-58 % de peso en fresco) se complemento con 2 % (p/peso en seco) de acido propionico, sal de sodio (AppliChem, Darmstadt, Alemania) y se envaso en bolsas de plastico usando un sellador de alimentos al vado comercial (Food Saver V2040-I, Sunbeam Products, Inc., Boca Raton, EEUU) para su conservacion. Esta materia vegetal se almaceno como ensilado a TA durante 1-4 meses.
150 mg de alfcuotas en peso fresco (9 discos de hojas de 1 cm de diametro agrupados a partir de 3 hojas comparables) se cosecharon en triplicados (3 muestras a partir de hojas de distinta edad) a partir de materia vegetal identica usada para la preparacion del ensilado. Las muestras se congelaron en nitrogeno lfquido y se almacenaron a -80 °C.
El ensilado que se almaceno hasta 16 semanas tema un color marron y un pH de aproximadamente 5,3. La determinacion de la concentracion de protemas de las muestras de TSP revelo que las muestras de TSO preparadas a partir de ensilado o a partir de materia vegetal secada a 55 °C contema una cantidad reducida de protema extrafble en comparacion con la materia vegetal almacenada a -80 °C.
Para el analisis de la actividad de la p-glucosidasa, 1,2,5, 5 y 25 pg de muestras de TSP vegetales se incubaron con 50 mM de NaAc pH 5,5, 100 mM de NaCI, 5 % (v/v) de glicerol, 5 mM de celobiosa a 50 °C durante 30 min. La liberacion de glucosa se cuantifico usando el Kit de GOPOD (MEgazyme) y se uso para calcular la actividad enzimatica en unidades de celobiosa (CBU) o unidades internacionales (UI) por mg de cantidad de protema analizada o en CBU y UI por g de materia vegetal en peso en fresco o g de enzima comercial. Debido a la baja cantidad de protemas extrafble a partir de materia vegetal secada, solo 5 pg de TSP de estas muestras podna analizarse lo que muestra solo actividades enzimaticas pobres (datos no mostrados).
Las actividades de la p-glucosidasa de muestras de TSP preparadas a partir de materia vegetal con un penodo de almacenamiento de 4, 8 o 16 semanas se comparan en la FIG. 10A y son muy similares, sugiriendo que la extension del penodo de almacenamiento parece no tener un efecto negativo significante en las celulasas de BGL4 recombinantes. El SDS-PAGE demostro que la BGL4 recombinante permanecio estable en ensilado (Fig. 10B y C); en el mismo penodo de tiempo, la protema vegetal sin tratar se degrada casi completamente. La recuperacion de protemas de BGL4 a partir de biomasa en seco fue muy baja debido a la pobre degradacion o pobre extractabilidad.
Para BGL4 citosolica, el contenido de porcentaje en TSP extrafdo a partir de materia vegetal almacenada a -80 °C se estimo que fue del 60 %, mientras que el contenido de porcentaje en TSP extrafdo a partir de ensilado fue del 95 %. Para bGL4 dirigido a cloroplasto, los valores correspondientes son del 60 % y del 90 %, respectivamente (Fig. 10D). Tal aumento en el contenido en TSP observado durante el almacenamiento en ensilado puede explicarse por la degradacion de protemas vegetales sin tratamiento.
Las fusiones de Endoglucanasa E1 de Acidothermus cellulolyticus y Exoglucanasa 1 (CBHI) de Trichoderma reesei permanecen estables y retienen su actividad enzimatica durante el almacenamiento de la biomasa vegetal como un ensilado tal como se muestra en la FIg. 11A-D. De nuevo, el contenido de porcentaje de CBHI en TSP extrafdo a partir de ensilado (35 %) es superior al TSP extrafdo a partir de material almacenado a -80 °C (12,5 %) (Fig. 11E).
Se observo una buena estabilidad proteica durante el almacenamiento de la biomasa vegetal como un ensilado tambien para la exocelulasa E3 recombinante a partir de Thermobifida fusca (Fig. 12A-C). Para la fusion de E3 con TP de apoplasto de pectinasa de manzana, el contenido de porcentaje en TSP extrafdo a partir de materia vegetal almacenada a -80 °C se estimo que fue del 5 % y del 18 % en TSP extrafdo a partir de ensilado. Para la fusion de TP-His-EK-E3 de cloroplasto estos valores son del 25 % y del 15 %, respectivamente (Fig. 12D).
Asimismo, la endoglucanasa E1 a partir de Thermotoga maritima muestra un alto nivel de expresion despues de la transfeccion de pulverizacion agrobacteriana de plantas de Nicotina benthamiana usando vectores virales basados en el TMV (Fig. 14). La protema recombinante permanece estable y retiene la actividad enzimatica durante el almacenamiento de biomasa vegetal como ensilado tal como se muestra en la Fig. 14 y 15.
Ejemplo 5: La mezcla de celulasas recombinantes producidas de plantas convierte eficazmente celulosa en glucosa
Para analizar la actividad enzimatica total de una mezcla de distintas clases de celulasas expresadas in planta en la conversion de celulosa en glucosa, se inocularon plantas de N. benthamiana para la produccion de celulasas pulverizandolas con diluciones de 1:1.000 de cultivos de Agrobacterium que portan vectores del TMV ensamblados. Para este experimento, cada fusion de p-glucosidasa BGL4 (citosolica), Endoglucanasa E1 (fusion con TP de apoplasto de a-amilasa de arroz), exoglucanasa CBHI (fusion con TP de apoplasto de a-amilasa de cebada) y exoglucanasa E3 (fusion de TP de cloroplasto-His-EK) se escogio basandose en los siguientes criterios: expresion mas alta in planta y actividad enzimatica mas alta (tambien en almacenamiento de materia vegetal).
Para evaluar la actividad de la celulasa total, se estimo el porcentaje de celulasas recombinantes en extractos de TSP y se incubo una mezcla de 20 |jg de endo- y exocelulasas (E1, CBHI y E3 en cantidades variables) y 100­ 1000 jg de p-glucosidasa (Bgl4) en 50 mM de NaAc pH 5,5, 80 mM de NaCl, 8 % (v/v) de glicerol, 0,02 % de azida de sodio, complementados con o sin un 1 % (p/v) de Avicel como blancos de enzimas, respectivamente, en un volumen final de 5 ml a 50 °C y 90 rpm en un agitador durante 144 horas. Los almuotas de la mezcla de reaccion se retiraron en distintos puntos de tiempo (2 h, 24 h, 48 h, 72 h y 144 h) para la determinacion de la concentracion de glucosa usando el Kit (Megazyme) de D-glucosa (Formato GOPOD). La actividad de las mezclas de celulasa se calculo como mg de liberacion de glucosa por mg de TSP (Fig. 13A) o por peso en fresco en gramos de materia vegetal (Fig. 13B).
Las muestras que conteman 20 jg de una mezcla de TP-E1 de apoplasto de amilasa de arroz, TP-CBHI de apoplasto de a-amilasa de cebada y TP-His-EK-E3 de cloroplasto y 500 jg de Bgl4 (relacion (1:1:0):25; (2:1:1):25; y (2:2:1):25)) mostraron la liberacion de glucosa total mas alta. Los calculos de la actividad de la celulasa como liberacion de glucosa en mg de glucosa/mg de TSO o mg de glucosa/g de materia vegetal en peso fresco indica la actividad enzimatica mas alta para 20 jg de una apo TP-E1 de mezcla de amilasa de arroz, apo TP-CBHI de aamilasa de cebada y His-EK-E3 de TP de cloroplasto y 100 jg de Bgl4 (relacion (1:1:1 ):5) sin influencia significante de la alteracion de las relaciones entre endo- y exoglucanasas sobre la cantidad de produccion de glucosa (relacion (1:1:1 ):25; (2:1:1):25; (1:2:1 ):25; (1:1:2):25 o (2:2:1):25). A 2:2:1 relacion para E1, CBHI y E3 proporcionaron la liberacion de azucar mas alta en el analisis de Baker y col., 1998, aqrn una relacion de 2:1:1 para E1, CBHI y E3 proporciona al menos ninguna produccion de glucosa significativamente mas alta cuando se calcula por g de materia vegetal en peso fresco o mg de TSP. En resumen para este experimento, usando celulasas expresadas in planta, la degradacion de celulosa mas eficaz se espera observarse para una mezcla de E1, CBHI, E3 y Bgl4 de(1:1:1):5 o (2:1:1):5 cuando se hace referencia a g de materia vegetal en peso fresco.
Con respecto a la cantidad de liberacion de glucosa total, debe tenerse en cuenta la eficacia en costes de un exceso mas grande de Bgl4, puesto que aumenta la liberacion de glucosa en muestras con relaciones (1: 1: 1): 10, (1:1:1 ):25 y (1:1:1 ):50 en comparacion con (1:1:1 ):5 (para minimizar una inhibicion putativa de endo- y exoglucanasas mediante celobiosa y para la conversion completa de celobiosa en glucosa). La composicion particular de una mezcla cuaternaria de celulasas analizada que proporciona la produccion de glucosa mas alta variara probablemente con el grado de variacion de la expresion enzimatica in planta y la estimacion del porcentaje de TSP.
La Tabla 2 resume los datos experimentales obtenidos en la expresion y el almacenamiento con varias enzimas celulolfticas. Se proporcionan los niveles de acumulacion de protemas y de actividad de las celulasas analizadas. Se

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un proceso de degradacion de componentes de las paredes celulares de plantas de materia vegetal, que comprende:
(i) expresar en plantas o partes de las mismas una o mas de una enzima de degradacion de paredes celulares heterologa o transfectar pantas o partes de las mismas con una molecula de acido nucleico que comprende una construccion de acido nucleico que contiene una secuencia de nucleotidos que codifica una o mas de una enzima de degradacion de paredes celulares y que expresa en dicha planta o partes de la misma dicha una o mas de una enzima de degradacion de paredes celulares;
(ii) cosechar dichas plantas o partes que contienen dicha una o mas de una enzima de degradacion de paredes celulares;
(iii) almacenar la cosecha como un ensilado, siendo el tiempo de almacenamiento mmimo de 21 dfas; y
(iv) tratar dicha materia vegetal con el ensilado de la etapa (iii) para degradar los componentes de las paredes celulares de plantas de la materia vegetal, en donde dicho tratamiento comprende la adicion del ensilado de la etapa (iii) a dicha materia vegetal;
en donde dicha una o mas de una enzima de degradacion de paredes celulares se selecciona entre endoglucanasas, exoglucanasas, exocelulasas, p-glucosidasas y combinaciones de las mismas.
2. El proceso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde dicha materia vegetal es distinta de dicho ensilado de la etapa (iii).
3. El proceso segun la reivindicacion 1 o 2, en donde un ensilado que contiene una endoglucanasa, un ensilado que contiene una exoglucanasa, un ensilado que contiene una exocelulasa y un ensilado que contiene una p-glucosidasa se mezclan en una relacion deseada antes del tratamiento de dicha materia vegetal para obtener una relacion deseada de enzimas celulolfticas y tratar dicha materia vegetal en la etapa (iv) en un medio de reaccion acuosa con la mezcla obtenida de ensilados.
4. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la etapa (i) comprende la pulverizacion aerea de partes de dicha planta con una suspension acuosa que contiene celulas de una cepa de Agrobacterium que comprende una molecula de ADN que comprende una construccion de acido nucleico que contiene una secuencia de ADN que codifica dicha una o mas de una enzima de degradacion de paredes celulares.
5. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la etapa (i) comprende la pulverizacion aerea de partes de dicha planta con una suspension acuosa que contiene celulas de una cepa de Agrobacterium que comprende una molecula de ADN que comprende una construccion de acido nucleico que codifica un replicon de ADN o ARN que codifica dicha una o mas de una enzima de degradacion de paredes celulares.
6. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la etapa (iii) comprende almacenar dichas plantas o partes de las mismas cosechadas durante al menos 1 mes en una atmosfera de contenido de oxfgeno reducido.
7. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicha materia vegetal se trata con dicho ensilado en un medio de reaccion que es preferentemente un medio de reaccion acuoso.
8. Un proceso de produccion de un bioalcohol tal como bioetanol a partir de materia vegetal, que comprende:
(a) proporcionar u obtener, de acuerdo con las etapas de (i) a (iii) de la reivindicacion 1, un ensilado mediante la fermentacion de planta so partes de planta que contienen expresada una o mas de una enzima de degradacion de paredes celulares que puede ser heterologa con respecto a dichas plantas o partes de planta,
(b) tratar dicha materia vegetal o un producto obtenido mediante el pretratamiento de dicha materia vegetal, en un medio de reaccion acuoso con el ensilado de la etapa (a) para producir glucosa u otros productos de degradacion de celulosa a partir de celulosa contenida en dicha materia vegetal, en donde el tratamiento comprende la adicion de dicho ensilado a dicha materia vegetal o dicho producto obtenido mediante pretratamiento de dicha materia vegetal, y
(c) fermentar el producto obtenido en la etapa (b) para producir dicho bioalcohol a partir de dicha glucosa, en donde las etapas (b) y (c) pueden llevarse a cabo simultaneamente en el mismo vaso de reaccion o continuamente y, en donde dicha una o mas de una enzima de degradacion de paredes celulares se selecciona entre endoglucanasas, exoglucanasas, exocelulasas, p-glucosidasas y combinaciones de las mismas.
9. El proceso de acuerdo con la reivindicacion 8, en donde la etapa (a) comprende el almacenamiento de dichas plantas o partes de planta que contiene dicha una o mas de una enzima de degradacion de paredes celulares durante al menos 1 mes en una atmosfera con contenido de oxfgeno reducido.
10. El proceso segun la reivindicacion 1 u 8, en donde dichas planta so partes de las mismas contienen una molecula de acido nucleico que comprende una construccion de acido nucleico que contiene una secuencia de nucleotidos que codifica dicha una o mas de una enzima de degradacion de paredes celulares expresada a partir de dicha construccion.
11. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la etapa (iii) de la reivindicacion 1 o la etapa (a) de la reivindicacion 8 comprende la fermentacion de bacterias de acido lactico y/o la acidificacion por adicion de un acido para producir condiciones addicas en dicho ensilado.
12. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde dicha una o mas de una enzima de degradacion de paredes celulares son enzimas secretoras en el organismo del cual derivan; y/o en donde dicha(s) enzima(s) de degradacion de paredes celulares se expresa(n) en el citosol de celulas de dichas plantas o partes de las mismas, o dicha(s) enzima(s) de degradacion de paredes celulares esta(n) dirigida(s) al apoplasto o plastidios de dicha plante o partes de planta.
13. Un proceso de almacenamiento de enzimas de degradacion de paredes celulares, que comprende el almacenamiento, como un ensilado, de plantas o partes de plantas que contienen una construccion de acido nucleico que contiene una secuencia de nucleotidos que codifica una o mas de una enzima de degradacion de paredes celulares y una o mas de una enzima de degradacion de paredes celulares expresada partir de dicha construccion, conteniendo dicha planta o partes de plantas dicha(s) enzima(s) dirigida(s) a el apoplasto o a los plastidios de dicha planta o partes de planta, en donde dicha una o mas de una enzima de degradacion de paredes celulares se selecciona entre endoglucanasas, exoglucanasas, exocelulasas, p-glucosidasas y combinaciones de las mismas.
14. Uso de un ensilado de plantas o partes de las mismas que contiene una o mas de una enzima de degradacion de paredes celulares capaz de degradar un componente de pared celular de planta para degradar componentes de paredes celulares de plantas de una materia vegetal o para producir un bioalcohol, comprendiendo dicho uso una etapa de adicion de dicho ensilado a dicha materia vegetal, en donde dicha una o mas de una enzima de degradacion de paredes celulares se selecciona entre endoglucanasas, exoglucanasas, exocelulasas, pglucosidasas y combinaciones de las mismas.
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