ES2694349T3 - Sistema novedoso de alteración de genomas para microorganismos - Google Patents
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Abstract
Un grupo de construcciones de direccionamiento, que comprende una primera construcción que comprende, en este orden, una primera región de homología con un genoma objetivo de un microorganismo, un sitio de reconocimiento para una endonucleasa y una primera parte de un marcador de selección y una segunda construcción que comprende, en este orden, una segunda parte del marcador de selección, una copia del sitio de reconocimiento de endonucleasas y una segunda región de homología con el genoma objetivo del microorganismo, por lo que la primera y la segunda regiones de homología con el genoma objetivo cada una comprende al menos 20 pares de bases (pb); un fragmento de la primera parte del marcador de selección se superpone con un fragmento que está presente en la segunda parte del marcador de selección, permitiendo la recombinación entre la primera y la segunda parte del marcador de selección, comprendiendo dicho fragmento preferiblemente entre 50 y 600 pb; una secuencia codificante que codifica la endonucleasa y que está acoplada a un promotor inducible está presente en la primera o segunda construcción; y una parte de la primera región de homología con el genoma objetivo en la primera construcción se duplica entre la copia del sitio de reconocimiento de endonucleasas y la segunda región de homología con el genoma objetivo en la segunda construcción; o una parte de la segunda región de homología con el genoma objetivo en la segunda construcción se duplica entre la primera región de homología con el genoma objetivo y el sitio de reconocimiento de endonucleasa en la primera construcción, comprendiendo dicha región duplicada entre 20 y 200 pb.
Description
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DESCRIPCION
Sistema novedoso de alteración de genomas para microorganismos Campo
La invención se refiere a los campos de la biología molecular y la ingeniería genética de microorganismos, especialmente de levaduras.
Introducción
La recombinación homóloga en microorganismos como la levadura se basa en un mecanismo de reparación de rotura de doble cadena, que se une a los fragmentos de ADN. Cuando se detecta una rotura de ADN de doble cadena, una exonucleasa degrada ambos extremos 5', después de lo cual se produce la invasión de la hebra de la plantilla homóloga. El mecanismo de síntesis de ADN repara las dos hebras y la ligadura del ADN completa el proceso sin ninguna eliminación [Storici et al., (2003). PNAS USA 100: 14994-9; Haber, (2000). Trends Genet 16: 259-264]. Aunque la reparación de la recombinación homóloga se producirá con tan solo 30 pb de homología, es mucho más eficiente con 200-400 pb [Sugawara et al., (2000). Mol Cell Biol 20: 5300-5309].
Un método alternativo para reparar una rotura de doble cadena se basa en la unión del extremo no homólogo, donde el heterodímero de las llamadas proteínas Ku agarra los extremos del cromosoma roto, lo que promueve la unión de proteínas adicionales. Estas proteínas adicionales procesan los extremos del ADN y los ligan, lo que generalmente crea una eliminación de varios nucleótidos [Storici et al., (2003). PNAS USA 100: 14994-9].
La ruta de reparación por recombinación homóloga se usó con éxito para construir un plásmido a partir de dos fragmentos de ADN co-transformados, que contenían regiones homólogas [Ma et al., (1987). Gene, 58: 201-16.26]. Los microorganismos, y especialmente las especies de S. cerevisiae, son organismos manejables para desarrollar nuevas técnicas [Kumar y Snyder, (2001). Nat Rev Genet 2: 302-312], en el que la alteración genética se realiza con ADN bicatenario o con ADN de cadena sencilla [Orr-Weaver et al., (1981). PNAS USA 78: 6354-6358; Moerschell et al., (1988). PNAS USA 85: 524-528]. S. cerevisiae puede captar y ensamblar al menos 38 oligonucleótidos de cadena simple y un vector de doble cadena lineal en un evento de transformación con superposiciones entre oligonucleótidos de tan solo 20 pares de bases y con una longitud de 200 nucleótidos [Gibson, (2009). Nucleic Acids Res 37: 6984-6990].
Una de las herramientas más poderosas en la caracterización funcional de productos genéticos desconocidos es la eliminación completa de genes en un cromosoma. La selección de genes se ha establecido con fragmentos de PCR flanqueados por secuencias homólogas tan cortas como 35-40 pb que permiten la transformación directa debido a la alta eficacia de la recombinación homóloga en S. cerevisiae [Baudin et al., (1993). Nucleic Acids Res 21: 3329-3330; Klinner y Schafer, (2004). FEMS Microbiol Rev 28: 201-223]. Sin embargo, en S. pastorianus que elabora la lager, la eficacia de la recombinación homóloga es baja debido a la compleja genética. Por lo tanto, las cepas de elaboración de cerveza lager requieren flancos superpuestos homólogos más largos (>400 pb) para tener una reparación o inserción de un casete de eliminación en el ADN genómico.
Para modificar genes múltiples, también es necesario reciclar marcadores. Los sistemas anteriores para la eliminación de genes y la posterior escisión del marcador contenían un marcador flanqueado por repeticiones directas de la secuencia de HisG bacteriana [Akada et al., (2002). Yeast 19: 393-402] o por dos sitios objetivo de una recombinasa específica del sitio [McNabb et al., (1997). Biotechniques, 22: 1134-1139; Storici et al., (1999). Levadura 15: 271-283; Gueldener et al., (2002). Nucleic Acids Res 30: e23; Iwaki y Takegawa, (2004). Biosci Biotechnol Biochem 68: 545-550]. Con este método, una copia de las repeticiones permanece en el cromosoma seleccionado. Sin embargo, cuando están presentes múltiples secuencias residuales en el genoma, el porcentaje de integraciones correctas en transformaciones de casete contra- seleccionables sucesivas disminuye dramáticamente [Davidson y Schiestl, (2000). Curr Genet 38: 188-190]. Múltiples sitios de destino pueden provocar reordenamientos cromosómicos. Por ejemplo, cuando cuatro conjuntos de repeticiones de loxP se ubicaron simultáneamente en el genoma, se produjeron reordenamientos cromosómicos a una frecuencia del 50% mediante la expresión de la recombinasa CRE. Esto significa que la orientación sucesiva en el mismo microorganismo requiere más detección en cada ronda para identificar un nocaut correcto [Delneri et al., (2000). Gene 252: 127-135].
Para superar este problema, se usó un sistema para la eliminación de genes sin interrupciones en el que se utilizó un casete amplificado por PCR, que contiene un marcador URA3 unido a una secuencia de 40 pares de bases duplicada derivada del locus objetivo, para la interrupción de hIS3 y el reciclado de marcadores sin ninguna cicatriz genómica Akada et al., (2006). Yeast 23: 399-405]. Las colonias se seleccionaron por duplicado utilizando un ácido 5-fluoroorótico para identificar las colonias que habían perdido URA3 por recombinación entre las secuencias de 40 pares de bases duplicadas. Esto dio como resultado la eliminación de HIS3 sin secuencias extrañas residuales [Akada et al., (2006). Yeast 23: 399-405]. También se demostró que un largo tramo de 966 pares de bases era necesario para la orientación correcta del gen. El reemplazo de este estiramiento por una secuencia homóloga corta de 40 pb no generó transformantes [Akada et al., (2006). Yeast 23: 399-405].
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La eficacia de la orientación depende en parte de la presencia de una secuencia homóloga larga en una construcción de orientación [Davidson y Schiestl, (2000). Curr Genet 38: 188-190]. Sin embargo, la recombinación homóloga en algunos microorganismos, como por ejemplo la mayoría de las cepas de la levadura cervecera Saccharomyces pastorianus, es difícil de lograr, incluso en presencia de largas secuencias homólogas en la construcción dirigido (Murakami et al., 2012). Yeast, 29: 155-165.
Cuando la recombinación homóloga es menos eficiente, aumenta la posibilidad de obtener falsos positivos. Los falsos positivos por lo general son el resultado de eventos cruzados simples aleatorios.
La presente invención supera el problema de la orientación eficiente al proporcionar un grupo de construcciones de orientación, en las que la expresión correcta de un marcador de selección depende de un evento de recombinación entre las construcciones de orientación. Se encontró que la aparición de un evento de recombinación entre las construcciones de direccionamiento se mejora notablemente después de la integración de las construcciones de direccionamiento en el lugar de orientación correcto. Por lo tanto, el sistema objetivo de la presente invención, que comprende un conjunto de construcciones de orientación, aumenta considerablemente el porcentaje de construcciones correctamente integradas en microorganismos que expresan el marcador de selección, en comparación con un sistema de selección de un solo vector. La división del marcador en dos límites limita la aparición de falsos positivos debido a los eventos de un solo cruce. El enfoque de marcador dividido mejora la proporción de positivos verdaderos sobre falsos positivos (Nielsen et al., 2006). Fungal Gen Biol 43: 54-64).
La invención proporciona un grupo de construcciones dirigidas, que comprenden una primera construcción que comprende una primera región de homología con un genoma objetivo de un microorganismo, un sitio de reconocimiento para una endonucleasa y una primera parte de un marcador de selección, y una segunda construcción que comprende una segunda parte del marcador de selección, una copia del sitio de reconocimiento de endonucleasas y una segunda región de homología con el genoma objetivo del microorganismo, por lo que la primera y la segunda regiones de homología con el genoma objetivo comprenden cada una al menos 20 pares de bases (pb), dicho fragmento comprende preferiblemente entre 50 y 600 pb, por lo que una secuencia codificante que codifica la endonucleasa y que está acoplada a un promotor inducible está presente en la primera o segunda construcción; y mediante el cual una parte de la primera región de homología con el genoma objetivo en la primera construcción se duplica entre la copia del sitio de reconocimiento de endonucleasas y la segunda región de homología con el genoma objetivo en la segunda construcción; o una parte de la segunda región de homología con el genoma objetivo en la segunda construcción se duplica entre la primera región de homología con el genoma objetivo y el sitio de reconocimiento de endonucleasa en la primera construcción, comprendiendo dicha región duplicada entre 20 y 200 pb.
Dichas primera y segunda regiones de homología con el genoma objetivo comprenden cada una al menos 20 pares de bases (pb). En principio, no hay límite superior para la longitud de dichas primera y segunda regiones de homología. Sin embargo, por razones prácticas tales como la facilidad y eficiencia de generar las construcciones primera y segunda, dichas regiones de homología primera y segunda comprenden preferiblemente entre 20 pb y 100 kb, más preferiblemente entre 40 pb y 10 kb, más preferiblemente entre 50 pb y 5 kb, más preferido entre 100 bp y 1 kb.
Dicha región duplicada de homología con el genoma objetivo en la primera y segunda construcción de direccionamiento está preferiblemente entre 20 y 500 pb, preferiblemente entre 20 y 200 pb, preferiblemente entre 40 y 100 pb, preferiblemente alrededor de 80 pb. Dicha región duplicada de homología con el genoma objetivo en la primera y la segunda construcción de direccionamiento permite la eliminación ilesa del marcador del genoma objetivo mediante recombinación homóloga.
La primera construcción comprende preferiblemente, en este orden, una primera región de homología con un gen objetivo de un microorganismo, un sitio de reconocimiento para una endonucleasa y una primera parte de un marcador de selección. La segunda construcción comprende preferiblemente, en este orden, una segunda parte del marcador de selección, una secuencia de codificación que codifica la endonucleasa y que está acoplada a un promotor inducible, una copia del sitio de reconocimiento de endonucleasas, una copia de una parte de la primera región de homología con el gen objetivo que está presente en la primera construcción, y una segunda región de homología con el gen objetivo del microorganismo. Esta configuración se representa en la FIG. 1.
El término construcción, como se usa en este documento, se refiere a un segmento de ácido nucleico construido artificialmente. Una construcción preferida es un vector, preferiblemente un vector que contiene genes de resistencia bacteriana para el crecimiento en bacterias. Una construcción más preferida es un plásmido, un ADN de doble cadena lineal o circular que es capaz de replicarse en bacterias independientemente del ADN cromosómico.
El gen objetivo puede ser cualquier gen de un microorganismo, preferiblemente de una levadura, cuya secuencia genómica deba alterarse. El término gen, como se usa en el presente documento, se refiere a una parte del genoma del microorganismo que comprende partes intrónicas y exónicas de un gen, la región promotora de dicho gen y secuencias genómicas que median la expresión de dicho gen, como por ejemplo secuencias potenciadoras.
El experto entenderá que las construcciones de direccionamiento pueden usarse preferiblemente para alterar un gen de un microorganismo. Por lo tanto, la divulgación proporciona además un conjunto de construcciones de direccionamiento
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que comprenden una primera construcción que comprende una primera región de homología con un gen objetivo de un microorganismo, un sitio de reconocimiento para una endonucleasa y una primera parte de un marcador de selección y una segunda construcción que comprende una segunda parte del marcador de selección, una copia del sitio de reconocimiento de endonucleasas y una segunda región de homología con el gen objetivo del microorganismo, por lo que un fragmento de la primera parte del marcador de selección se superpone con un fragmento que está presente en el segunda parte del marcador de selección, que permite la recombinación entre la primera y la segunda parte del marcador de selección; por lo que una secuencia codificante que codifica la endonucleasa y que está acoplada a un promotor inducible está presente en la primera o segunda construcción; y mediante el cual una parte de la primera región de homología con el gen objetivo en la primera construcción se duplica entre la copia del sitio de reconocimiento de endonucleasa y la segunda región de homología con el gen objetivo en la segunda construcción; o una parte de la segunda región de homología con el gen objetivo en la segunda construcción se duplica entre la primera región de homología con el gen objetivo y el sitio de reconocimiento de endonucleasa en la primera construcción. Dicha región duplicada de homología con el gen objetivo en la primera y segunda construcción de direccionamiento está preferiblemente entre 20 y 200 pb, preferiblemente entre 40 y 100 pb, preferiblemente alrededor de 80 pb.
El término alteración de la secuencia genómica incluye el reemplazo de uno o más nucleótidos, la inserción de uno o más nucleótidos y/o la eliminación de uno o más nucleótidos en cualquier lugar dentro de un genoma, preferiblemente dentro de un gen.
Por ejemplo, si la primera y la segunda región de homología con un gen objetivo comprenden secuencias genómicas adyacentes del gen, la sustitución de uno o más nucleótidos en la primera región de homología y/o en la segunda región de homología dará lugar a una alteración del gen que sigue a la orientación homóloga con el conjunto de construcciones de direccionamiento de acuerdo con la invención. Dicho reemplazo de uno o más nucleótidos está preferiblemente en la región de homología con el gen objetivo que está presente en la primera y en la segunda construcción.
Dicha alteración de la secuencia genómica es preferiblemente una eliminación de uno o más nucleótidos, preferiblemente en cualquier lugar dentro del gen. Por ejemplo, si la primera y la segunda región de homología con un gen objetivo comprenden secuencias genómicas del gen que están separadas en el genoma del organismo, una alteración del gen después del direccionamiento homólogo con el conjunto de construcciones de direccionamiento de acuerdo con la invención da como resultado una eliminación de la región que estaba ubicada entre la primera y la segunda región de homología en el cromosoma parental.
Dicho microorganismo es preferiblemente un microorganismo aneuploide, preferiblemente una levadura aneuploide. El término aneuploidía, como se usa en este documento, se refiere a la presencia de un número anormal de cromosomas dentro de una célula o un organismo que difiere del número normal de cromosomas para ese organismo. Un microorganismo aneuploide puede tener uno o más cromosomas extra o faltantes. El término microorganismo aneuploide incluye un microorganismo poliploide. En los hongos, se sabe que la aneuploidía confiere resistencia a los fármacos antifúngicos y permite una rápida evolución adaptativa [Calo et al., (2013). PLoS Pathog 9(3): e1003181].
Dicho microorganismo, preferiblemente microorganismo aneuploide, preferiblemente es un Ascomycota, preferiblemente una especie Saccharomycotina, preferiblemente un Saccharomyces sensu stricto (Saccharomyces paradoxus, S. mikatae, S. bayanus, S. eubayanus, S. kudriavzevii, S. paradoxus, S. arboricolus), Kazachstania, Naumovozyma, Nakaseomyces, Vanderwaltozyma, Zygosaccharomyces, Lachancea, Kluyveromyces, Eremothecium, Torulaspora, Ogataea, Debaryomyces, Clavispora, Candida, Komagataella, y/o Yarrowia. Un organismo preferido es la levadura de cerveza Lager Saccharomyces pastorianus.
Se supone que S. pastorianus es un híbrido de S. cerevisiae y S. eubayanus. El tamaño del genoma de S. pastorianus es hasta un 60% mayor que el de S. cerevisiae, e incluye grandes partes de los dos genomas. S. cerevisiae contiene un grupo haploide de 16 cromosomas, que varían en tamaño desde 200 hasta 2,200 kb. El tamaño del genoma de S. pastorianus es de 24-50 Mb. Adicionalmente, las especies de Saccharomyces aneuploides reportadas son S. monacensis y S. uvarum. Albertin y Marullo (2012) proporcionan una descripción general de los hongos poliploides. Proc R Soc B 279: 2497-2509.
Dicho marcador de selección es preferiblemente un marcador de selección auxotrópico o un marcador de selección dominante, que son conocidos por un experto. Los marcadores auxotróficos preferidos incluyen URA3, KIURA3; CaURA3; HIS3; his5; LEU2; KILEU2; LYS2; TRP1; ADE1; ADE2; y MET15. Los marcadores dominantes preferidos incluyen KanMX; Sh ble; hph CUP1; SFA1; dehH1; PDR3-9; AUR1-C; nat pat; ARO4-OFP; SMR1; FZF1-4; y DsdA. En la Tabla 1 se proporciona una descripción general de los marcadores preferidos que se utilizan habitualmente en los organismos de levadura.
Dicha primera construcción comprende preferiblemente una primera parte, preferiblemente los primeros dos tercios o la primera mitad, de una región que codifica el marcador de selección. Por ejemplo, URA3, también denominado YEL021W, codifica la enzima orotidina-5'-fosfato (OMP) descarboxilasa que cataliza la sexta etapa enzimática en la biosíntesis de novo de pirimidinas, que convierten la OMP en monofosfato de uridina (UMP). La proteína codificada tiene 267 aminoácidos, que está codificada por una secuencia de ácido nucleico de 801 pares de bases (pb). Dicha primera construcción comprende preferiblemente entre 200 y 600 pb de la región de codificación de URA3, más preferiblemente
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entre 300 y 500 pb. La segunda construcción comprende preferiblemente entre 200 y 600 pb de la región de codificación de URA3, más preferiblemente entre 300 y 500 pb.
La región de superposición entre la primera y la segunda parte del marcador de selección está preferiblemente entre aproximadamente 20 pb y 800 pb, preferiblemente entre aproximadamente 50 pb y aproximadamente 600 pb, preferiblemente alrededor de 200 pb.
Un marcador de selección preferido es URA3. URA3 codifica orotidina 5-fosfato descarboxilasa (ODCasa), que es una enzima que cataliza una reacción involucrada en la síntesis de ribonucleótidos de pirimidina en el ARN de levadura. La pérdida de la actividad de ODCasa conduce a una falta de crecimiento celular a menos que se agregue uracilo o uridina a los medios. Cuando está presente un gen URA3 funcional, los microorganismos auxotróficos pueden crecer en ausencia de uracilo y/o uridina. En contraste, la adición de ácido 5-fluoroorótico en presencia de un gen URA3 funcional resulta en la formación de un compuesto tóxico, provocando la muerte de los microorganismos. Por lo tanto, URA3 permite tanto la selección positiva como la negativa.
Un marcador de selección preferido adicional es proporcionado por una secuencia de nucleótidos que codifica agmatina ureohidrolasa (agmatinasa) (EC.3.5.3.11) o guanidino-ácido hidrolasa (guanidinobutirasa; EC.3.5.3.7). Los microorganismos, preferiblemente de la familia Saccharomytacea, incluidas las cepas de S. cerevisiae, no pueden crecer en guanidinobutirato y/o agmatina como única fuente de nitrógeno. Tanto la guanidino-ácido hidrolasa como la agmatinasa catalizan la formación de urea, una fuente de nitrógeno comúnmente asimilada por microorganismos como la S. cerevisiae. Por lo tanto, la agmatinasa y la guanidinobutirasa presentan las características esenciales de un marcador seleccionable de “ganancia de función” potencial en microorganismos como S. cerevisiae, cuando se cultivan en guanidinobutirato y/o agmatina como única fuente de nitrógeno. Un gen de guanidinobutirasa preferido codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de GenBank XP_456325.1, o una parte enzimáticamente activa de la misma. Un gen de agmatina ureohidrolasa preferido codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de GenBank AAC75974.1, o una parte enzimáticamente activa de la misma.
Dicho marcador de selección está acoplado a un promotor que dirige la expresión del marcador de selección en el microorganismo, y un terminador que media la formación eficaz del extremo 3' del ARNm. Dicho promotor es preferiblemente un promotor de levadura, preferiblemente un promotor de levadura seleccionado de un gen glicolítico PGI1, PFK1, PFK2, FBA1, TPI1, TDH1, TDH3, PGK1, GPM1, ENO1, ENO2 y de promotor ACT1, TEF1, AgTEF2, PMA1. Dicho promotor también puede emplearse para expresar un marcador de selección dominante. Los terminadores de varios genes son conocidos por los expertos y se han empleado, por ejemplo, en vectores de expresión, incluidos los terminadores de los genes CYC1, TrP1, AdH1, MF1, fLp y D (Romanos et al., 1992). Yeast 8: 423-488).
La primera o segunda construcción de direccionamiento comprende una secuencia de codificación que codifica una endonucleasa y que está acoplada a un promotor inducible. La endonucleasa es preferiblemente una endonucleasa de corte raro tal como, por ejemplo, PacI (secuencia de reconocimiento de objetivo 5-TTAATTAA); AscI (secuencia de reconocimiento de objetivos 5-GGCGCGCC) y AsiSI (secuencia de reconocimiento de objetivos 5-GCGATCGC). PacI, AscI y AsiSI están disponibles en New England Biolabs. La endonucleasa más preferiblemente es una endonucleasa de direccionamiento específico. El término endonucleasa de direccionamiento específico se refiere a una endonucleasa que se codifica como genes independientes dentro de los intrones, como una fusión con una proteína huésped, o como una inteína de auto-empalme. En la Tabla 2 se proporciona una lista preferida de endonucleasas de direccionamiento específico. Ejemplos adicionales de nucleasas de direccionamiento específico son I-DirI, I-NjaI, I-NanI, I-NitI, F-TevI, F- TevII, F-CphI, PI-MgaI, I-CsmI, que son conocidas por los expertos. En Benjamin K (solicitud de patente US2012/052582) se proporcionan ejemplos adicionales de nucleasas de direccionamiento específico. Una nucleasa de direccionamiento específico preferida es PI-PspI (New England Biolabs; secuencia de reconocimiento 5'- TGGCAAACAGCTATTATGGGTATTATGGGT)) o PI-SceI (New England Biolabs; secuencia de reconocimiento 5- ATCTATGTCGGGTGCGGAGAAAGAGGTAAT). Se conocen las secuencias de codificación de la mayoría de las endonucleasas de direccionamiento específico. Por ejemplo, la secuencia de codificación de PI-SceI y de PI-PspI está disponible en las bases de datos públicas (número de acceso de GenBank Z74233.1 y número de acceso de Genbank U00707.1, respectivamente). El experto en la materia entenderá que una secuencia que difiere de la secuencia disponible públicamente para una nucleasa todavía puede codificar la nucleasa. Por ejemplo, el término región codificante de PI- PspI incluye una secuencia que se desvía de la secuencia disponible públicamente, por ejemplo, por optimización de codones, pero que aún expresa una endonucleasa activa que reconoce y digiere la secuencia de reconocimiento objetivo indicada.
Dicha endonucleasa está bajo el control de un promotor inducible. El término promotor inducible, como se usa en el presente documento, se refiere a un promotor cuya expresión puede regularse. Los promotores inducibles son conocidos por los expertos. Ejemplos de promotores inducibles que se han empleado en levaduras son el promotor GAL1 y el promotor GAL10, ambos inducibles por galactosa, el promotor SUC2, que es inducible por sacarosa, el promotor MAL12, inducible por maltosa; el promotor CUP1, que es inducible por cobre, y los promotores tetO7 y tetO2, que son inducibles por tetraciclina [Gari et al., (1997). Yeast 13: 837-48; Yen et al., 2003). Yeast 20 1255-62]. Un promotor inducible preferido es el promotor GAL1.
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Un sitio de reconocimiento que comprende la secuencia de reconocimiento del objetivo para la endonucleasa, se ubica adyacente a (detrás) la primera región de homología con un gen objetivo de un microorganismo en la primera construcción. Una copia de este sitio de reconocimiento está ubicada adyacente a (delante de) la segunda región de homología con el gen objetivo del microorganismo en la segunda construcción. El experto entenderá que cuando una parte de la primera región de homología con el gen objetivo en la primera construcción se duplica entre la copia del sitio de reconocimiento de endonucleasa y la segunda región de homología con el gen objetivo en la segunda construcción, dicha copia del sitio de reconocimiento se encuentra adyacente a (frente a) la duplicación de la primera región de homología con el gen objetivo en la segunda construcción. Alternativamente, el sitio de reconocimiento está ubicado adyacente a (detrás) la parte duplicada de la segunda región de homología con el gen objetivo en la primera construcción cuando una parte de la segunda región de homología con el gen objetivo en la segunda construcción se duplica en la primera construcción. El marcador de selección, incluidas las secuencias del promotor y del terminador, y la región codificante de la endonucleasa, incluido el promotor inducible, se encuentran entre el sitio de reconocimiento en la primera construcción y la copia de este sitio de reconocimiento en la segunda construcción.
La invención proporciona además un método para alterar un genoma, preferiblemente un gen objetivo, en un microorganismo, que comprende proporcionar el grupo de construcciones de direccionamiento de acuerdo con la invención a dicho microorganismo, y seleccionar un microorganismo en el que el genoma ha sido alterado. Dicha selección de un microorganismo en el que el genoma ha sido alterado se realiza preferiblemente mediante la selección de un microorganismo que exprese funcionalmente un marcador de selección recombinado.
Como se indicó aquí anteriormente, la aparición de un evento de recombinación entre las construcciones de direccionamiento se mejora notablemente después de la integración de las construcciones de direccionamiento en el locus de direccionamiento correcto. Por lo tanto, la presencia de un marcador de selección funcionalmente recombinante es altamente indicativa de la presencia de construcciones de direccionamiento correctamente integradas en el genoma objetivo y, por lo tanto, de un genoma alterado en el microorganismo.
Como se indicó aquí anteriormente, los términos alterar, alteración y alterado se refieren a la sustitución de uno o más nucleótidos, la inserción de uno o más nucleótidos y/o la eliminación de uno o más nucleótidos en cualquier lugar dentro del gen objetivo.
Se puede realizar un reemplazo de uno o más nucleótidos alterando uno o más nucleótidos en la primera región de homología y/o en la segunda región de homología. Cuando la primera región de homología y la segunda región de homología cubren regiones adyacentes del genoma, preferiblemente un gen objetivo, la integración de los vectores de direccionamiento dará como resultado una alteración del genoma. Cuando está presente, dicha sustitución de uno o más nucleótidos se realiza preferiblemente alterando uno o más nucleótidos en la región de superposición de la homología con el genoma que está presente en la primera y en la segunda construcción.
Dicha alteración de una secuencia genómica es preferiblemente una eliminación de uno o más nucleótidos en cualquier lugar dentro de un genoma, preferiblemente dentro de un gen. Por ejemplo, si la primera y la segunda región de homología con un genoma objetivo comprenden secuencias genómicas que se separan en el genoma del organismo, una alteración del genoma después del direccionamiento homólogo con el grupo de construcciones de direccionamiento de acuerdo con la invención resultará en una supresión de la región que estaba ubicada entre la primera y la segunda región de homología en el cromosoma parental.
La invención proporciona además un método para producir un microorganismo que comprende un genoma alterado, preferiblemente un gen alterado, el método que comprende proporcionar el conjunto de construcciones de direccionamiento de acuerdo con la invención a dicho microorganismo, y seleccionar un microorganismo en el que el genoma ha sido alterado y que expresa funcionalmente un marcador de selección recombinada.
El método para producir un microorganismo que comprende un genoma alterado comprende preferiblemente inducir el promotor inducible para la expresión de la endonucleasa, eliminando así el marcador de selección y la región codificante de la endonucleasa, incluido el promotor inducible, del genoma objetivo.
La divulgación proporciona además un microorganismo, que comprende una alteración genómica que se produce mediante los métodos de la invención. Cuando están presentes, las regiones duplicadas de homología con el genoma objetivo en la primera y segunda construcción de direccionamiento aseguran la eliminación sin interrupciones del marcador del genoma objetivo mediante recombinación homóloga. El microorganismo resultante comprende solo la alteración o alteraciones que estaban presentes en la primera y/o segunda construcción de direccionamiento, o que fueron inducidas por recombinación de las construcciones de direccionamiento en el genoma de direccionamiento, como una inserción en el genoma de direccionamiento o una eliminación del genoma direccionamiento.
La invención proporciona además un microorganismo, que comprende una alteración genómica, preferiblemente una alteración de un gen objetivo, la alteración que comprende una inserción de un marcador de selección recombinante funcionalmente y una secuencia de codificación para una endonucleasa que está acoplada a un promotor inducible, por lo que el genoma objetivo comprende una copia de una secuencia de reconocimiento para la endonucleasa en ambos sitios de la inserción.
La invención proporciona además un método para producir un microorganismo que comprende un genoma alterado, el método comprende proporcionar un microorganismo que comprende una alteración del genoma, preferiblemente de un gen objetivo, la alteración comprende una inserción de un marcador de selección recombinante funcionalmente y una 5 secuencia de codificación para una endonucleasa que está acoplada a un promotor inducible, por lo que el genoma objetivo comprende una copia de una secuencia de reconocimiento para la endonucleasa en ambos sitios de la inserción, e induce al promotor inducible a eliminar las secuencias de ácido nucleico entre las secuencias de reconocimiento de la endonucleasa. Nuevamente, cuando están presentes, las regiones duplicadas de homología con el gen objetivo en la primera y la segunda construcción de direccionamiento aseguran la eliminación sin interrupción del marcador del genoma 10 objetivo mediante recombinación homóloga al proporcionar al ADN genómico una pequeña pieza homóloga para volver a conectar las cadenas de ADN rotas eficientemente. El microorganismo resultante comprende solo la alteración o alteraciones que estaban presentes en la primera y/o segunda construcción de direccionamiento, o que fueron inducidas por recombinación de las construcciones de direccionamiento en el genoma de direccionamiento, como una inserción en el genoma de direccionamiento o una eliminación del genoma, preferiblemente una inserción en un gen objetivo o una 15 eliminación del gen objetivo o una eliminación de dentro del gen objetivo.
Tabla 1
- Marcadores auxotróficos
- Gen marcador
- Modo de acción Reciclabe/método Referencia
- URA3
- Repara deficiencia de uracilo Sí/Selección negativa con 5- FOA Alani E, Cao L & Kleckner N (1987) A method for gene disruption that allows repeated use of URA3 selection in the construction of multiply disrupted yeast strains. Genetics 116: 541-545. Langlerouault F & Jacobs E (1995) A method for performing precise alterations in the yeast genome using a recyclable selectable marker. Nucleic Acids Res 23: 3079-3081.
- KlURA3
- Repara deficiencia de uracilo Sí/Selección negativa con 5- FOA Shuster JR, Moyer D & Irvine B (1987) Sequence of the Kluyveromyces lactis URA3 gene. Nucleic Acids Res 15: 8573-8573.
- CaURA3
- Repara deficiencia de uracilo Sí/Selección negativa con 5- FOA Losberger C & Ernst JF (1989) Sequence and transcript analysis of the C. albicans URA3 gene encoding Orotidine- 5'Phosphate Decarboxylase. Curr Genet 16: 153-157.
- HIS3
- Repara deficiencia de histidina No/-- Wach A, Brachat A, Alberti-Segui C, Rebischung C & Philippsen P (1997) Heterologous HIS3 marker and GFP reporter modules for PCR-targeting in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 13: 1065-1075.
- his5
- Repara deficiencia de histidina No/-- Wach A, Brachat A, Alberti-Segui C, Rebischung C & Philippsen P (1997) Heterologous HIS3 marker and GFP reporter modules for PCR-targeting in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 13: 1065-1075.
- LEU2
- Repara deficiencia de leucina No/-- Brachmann CB, Davies A, Cost GJ, Caputo E, Li JC, Hieter P & Boeke JD (1998) Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast 14: 115-132.
- KlLEU2
- Repara deficiencia de leucina No/-- Zhang YP, Chen XJ, Li YY & Fukuhara H (1992) LEU2 gene homolog in Kluyveromyces lactis. Yeast 8: 801-804.
- LYS2
- Repara deficiencia de lisina Sí/Selección negativa con alfaaminoadipato Chattoo BB, Sherman F, Azubalis DA, Fjellstedt TA, Mehnert D & Ogur M (1979) Selection of lys2 mutants of the yeast Saccharomyces cerevisiae by the utilization of alphaaminoadipate. Genetics 93: 51-65.
- TPP1
- Repara deficiencia de triptofano No/-- Brachmann CB, Davies A, Cost GJ, Caputo E, Li JC, Hieter P & Boeke JD (1998) Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast 14: 115-132.
- ADE1
- Repara deficiencia de adenina No/-- Nakayashiki T, Ebihara K, Bannai H & Nakamura Y (2001) Yeast [PSI+] “prions” that are crosstransmissible and susceptible beyond a species
- ADE2
- Repara deficiencia de adenina No/-- Brachmann CB, Davies A, Cost GJ, Caputo E, Li JC, Hieter P & Boeke JD (1998) Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast 14: 115-132.
- MET15
- Repara deficiencia de metionina Sí/Selección negativa con metil-mercurio Singh A & Sherman F (1974) Association of methionine requirement with methyl mercury resistant mutants of yeast. Nature 247: 227-229.
- Marcadores dominantes
- Gen marcador
- Modo de acción Reciclabe/método Referencia
- KanMX
- Resistencia a G418 No/-- Wach A, Brachat A, Pohlmann R & Philippsen P (1994) New heterologous modules for classical or PCR-based gene disruptions in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 10: 1793-1808.
- ble
- Resistencia a fleomicina No/-- Gatignol A, Baron M & Tiraby G (1987) Phleomycin resistance encoded by the ble gene from transposon Tn5 as a dominant selectable marker in Saccharomyces cerevisiae. Mol Gen Genet 207: 342-348.
- Sh ble
- Resistencia a Zeocina No/-- Drocourt D, Calmels T, Reynes JP, Baron M & Tiraby G (1990) Cassettes of the Streptoalloteichus hindustanus ble gene for transformation of lower and higher eukaryotes to phleomycin resistance. Nucleic Acids Res 18: 4009-4009.
- hph
- Resistencia a higromicina No/-- Gritz L & Davies J (1983) Plasmid encoded Higromicina-B resistance the sequence of Higromicina-B phosphotransferase gene and its expression in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae. Gene 25: 179-188.
- Cat
- Resistencia a cloramfenicol No/-- Hadfield C, Cashmore AM & Meacock PA (1986) An efficient cloramfenicol resistance marker for Saccharomyces cerevisiae and Escherichia coli. Gene 45: 149-158.
- CUP1
- Resistencia a Cu2+ No/-- Henderson RCA, Cox BS & Tubb R (1985) The transformation of brewing yeasts with a plasmid containing the gene for copper resistance. Curr Genet 9: 133-138.
- SFA1
- Resistencia a formaldehido No/-- Van den Berg MA & Steensma HY (1997) Expression cassettes for formaldehido and fluoroacetato resistance, two marcadores dominantes in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 13: 551-559.
- dehHI
- Resistencia a fluoroacetato No/-- Van den Berg MA & Steensma HY (1997) Expression cassettes for formaldehido and fluoroacetato resistance, two marcadores dominantes in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 13: 551-559.
- PDR3-9
- Resistencia a múltiples fármacos No/-- Lackova D & Subik J (1999) Use of mutated PDR3 gene as a dominant selectable marker in transformation of prototrophic yeast strains. Folia Microbiol 44: 171-176.
- AUR1-C
- Resistencia a aureobasidina No/-- Hashida-Okado T, Ogawa A, Kato I & Takesako K (1998) Transformation system for prototrophic industrial yeasts using the AUR1 gene as a dominant selection marker. FEBS Lett 425: 117-122.
- nat
- Resistencia a nourseotricina No/-- Goldstein AL & McCusker JH (1999) Three new dominant drug resistance cassettes for gene disruption in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 15: 1541-1553.
- CYH2
- Resistencia a cicloheximida No/-- Delpozo L, Abarca D, Claros MG & Jimenez A (1991) Cicloheximida resistance as a yeast cloning marker. Curr Genet 19: 353-358.
- pat
- Resistencia a bialafos No/-- Goldstein AL & McCusker JH (1999) Three new dominant drug resistance cassettes for gene disruption in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 15: 1541-1553.
- ARO4OFP
- Resistencia a o- Fluoro-DL- fenilalanina No/-- Cebollero E & Gonzalez R (2004) Comparison of two alternative dominant selectable markers for wine yeast transformation. Appl Environ Microb 70: 7018-7023.
- SMR1
- Resistencia a metil sulfometurón No/-- Xie Q & Jimenez A (1996) Molecular cloning of a novel allele of SMR1 which determines sulfometuron methyl resistance in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Microbiol Lett 137: 165-168.
- FZF1-4
- Aumento de tolerancia a sulfito No/-- Cebollero E & Gonzalez R (2004) Comparison of two alternative dominant selectable markers for wine yeast transformation. Appl Environ Microb 70: 7018-7023.
- DsdA
- Resistencia a D- Serina No/-- Vorachek-Warren MK & McCusker JH (2004) DsdA (D-serine deaminase): a new heterologous MX cassette for gene disruption and selection in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 21: 163-171.
- amdS
- Permitir el crecimiento en acetamida Sí/ Fluoroacetamida Selten G, Swinkels B & Van Gorcom R (2000) Selection Gen marcador free recombinant strains: A method for obtaining them and the use of these strains. Pat.no.US6051431. Swinkels B, Selten G, Bakhuis J, Bovenberg R & Vollebregt A (1997) The use of homologous amdS genes as selectable markers. Patent application WO97/06261.
Claims (15)
- 5101520253035404550556065REIVINDICACIONES1. Un grupo de construcciones de direccionamiento, que comprende una primera construcción que comprende, en este orden, una primera región de homología con un genoma objetivo de un microorganismo, un sitio de reconocimiento para una endonucleasa y una primera parte de un marcador de selección y una segunda construcción que comprende, en este orden, una segunda parte del marcador de selección, una copia del sitio de reconocimiento de endonucleasas y una segunda región de homología con el genoma objetivo del microorganismo, por lo que la primera y la segunda regiones de homología con el genoma objetivo cada una comprende al menos 20 pares de bases (pb);un fragmento de la primera parte del marcador de selección se superpone con un fragmento que está presente en la segunda parte del marcador de selección, permitiendo la recombinación entre la primera y la segunda parte del marcador de selección, comprendiendo dicho fragmento preferiblemente entre 50 y 600 pb;una secuencia codificante que codifica la endonucleasa y que está acoplada a un promotor inducible está presente en la primera o segunda construcción; yuna parte de la primera región de homología con el genoma objetivo en la primera construcción se duplica entre la copia del sitio de reconocimiento de endonucleasas y la segunda región de homología con el genoma objetivo en la segunda construcción; o una parte de la segunda región de homología con el genoma objetivo en la segunda construcción se duplica entre la primera región de homología con el genoma objetivo y el sitio de reconocimiento de endonucleasa en la primera construcción, comprendiendo dicha región duplicada entre 20 y 200 pb.
- 2. El grupo de construcciones de direccionamiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el fragmento superpuesto del marcador de selección es de aproximadamente 200 pares de bases (pb).
- 3. El grupo de construcciones de direccionamiento de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la región duplicada de homología con el genoma objetivo en la primera y segunda construcciones de direccionamiento es preferiblemente de aproximadamente 80 pb.
- 4. El grupo de construcciones de direccionamiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, por lo que la endonucleasa es una endonucleasa de direccionamiento específico.
- 5. El grupo de construcciones de direccionamiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, por lo que el marcador seleccionable es un marcador auxotrófico y/o un marcador dominante.
- 6. El grupo de construcciones de direccionamiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, por lo que el promotor inducible se selecciona entre el promotor GAL1, el promotor GAL10, el promotor SUC2, el promotor MAL12, CUP1 y un promotor regulable por tetraciclina.
- 7. El grupo de construcciones de direccionamiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el microorganismo es un microorganismo aneuploide.
- 8. El grupo de construcciones de direccionamiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el microorganismo es una Ascomycota, preferiblemente una Saccharomycotina.
- 9. El grupo de construcciones de direccionamiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el microorganismo es Saccharomyces pastorianus.
- 10. Un método para alterar un genoma en un microorganismo, que comprende proporcionar el grupo de construcciones de direccionamiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 a dicho microorganismo, y seleccionar un microorganismo en el que el genoma ha sido alterado.
- 11. Un método para producir un microorganismo que comprende una alteración genómica, el método que comprende proporcionar el conjunto de construcciones de direccionamiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 19 a dicho microorganismo, y seleccionar un microorganismo en el que el genoma ha sido alterado y que se expresa funcionalmente. El marcador de selección recombinada.
- 12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, que comprende además inducir el promotor inducible para la expresión de la endonucleasa.
- 13. Un microorganismo, que comprende una alteración genómica que se produce mediante el método de la reivindicación 11.
- 14. Un microorganismo, que comprende una alteración genómica, la alteración comprende la inserción de un marcador de selección funcional recombinante y una secuencia de codificación que codifica una endonucleasa y que está acopladaa un promotor inducible, por lo que el sitio de inserción comprende una copia de una secuencia de reconocimiento para la endonucleasa en ambos sitios de la inserción.
- 15. Un método para producir un microorganismo comprende una región cromosómica alterada, el método comprende 5 proporcionar el microorganismo de acuerdo con la reivindicación 14, e inducir al promotor inducible a eliminar las secuencias de ácido nucleico entre las secuencias de reconocimiento de la endonucleasa.Vector 1Vector 2Primera parte de gen objetivo gce| r
imagen1 FIG. 1Codón de iniciación LacZa Sitio de cebado inverso M13 jSitio de cebado T3M&QCTNmk e&jm&rzkc gccmgctca oammccc tgactamsgGTG>T1A10CT"T ’TfffTOGftLlí&CT OTTFAOTAA’TO CGO 'I5'T OGvOT'TAATTTGOG AGTGA'IG'TOC—“| Spe I Pst I Eme l . EcoR IíSACmG'T'CCT Gafel^M Acd&A!TÍC<3C CÍG&TC&GGA CG!TC€ÁMTT ÍTGCTTAAQCQ GGA&lSitio de cebado T7EcoR IJLÑor iGMCTCGCOG ItfCCCG «raUbQOSOCSitio de cebado (-20) directo M13COi\jimagen2 FIG. 2cocoimagen3 ,ApoI - EcoRI (396), Eco53kI (404)/'" ... Bañil - SacI (406)V > Acc65I (408)y.. Aval - BsoBI - Kpnl - TspMI - Xmal (412)■ ;:(y..• BmeTllOI (413)...... . Smal (414). : 3a ni i: (417)Xbal (423)Salí (429)Accl (430)Hhi.II (431). PstI - Sbfl (439)BfuAI - BspMI (442)Sphl (445)India (447)FIG. 2, Continuación5!Se AR010Scelimagen4 ScelHHbimagen5 Casete de eliminación (3820 bp)amdS¡-ScelScelM--------[80 bpFIG. 3ACasete de eliminación (3820 bp)imagen6 imagen7 5’ScARO10 3'ScARO10 i —i iFIG. 3BVector 2CaíOíVector 1Sitio I-Scelimagen8 imagen9 - 400 bp80bpSitio I-ScelSitio I-Scel80bpFIG. 4
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