ES2690400T3 - Agente de contraste y su uso para obtención de imágenes - Google Patents
Agente de contraste y su uso para obtención de imágenes Download PDFInfo
- Publication number
- ES2690400T3 ES2690400T3 ES13762489.6T ES13762489T ES2690400T3 ES 2690400 T3 ES2690400 T3 ES 2690400T3 ES 13762489 T ES13762489 T ES 13762489T ES 2690400 T3 ES2690400 T3 ES 2690400T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- imaging
- particles
- particle
- images
- obtaining
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 title claims abstract description 68
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 title description 21
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 305
- 229920001606 poly(lactic acid-co-glycolic acid) Polymers 0.000 claims abstract description 54
- 229910052688 Gadolinium Inorganic materials 0.000 claims abstract description 39
- UIWYJDYFSGRHKR-UHFFFAOYSA-N gadolinium atom Chemical compound [Gd] UIWYJDYFSGRHKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 39
- 238000012285 ultrasound imaging Methods 0.000 claims abstract description 19
- UJMWVICAENGCRF-UHFFFAOYSA-N oxygen difluoride Chemical compound FOF UJMWVICAENGCRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 15
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 claims description 79
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 66
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 30
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 18
- 239000013522 chelant Substances 0.000 claims description 14
- DPNNNPAKRZOSMO-UHFFFAOYSA-K gadoteridol Chemical group [Gd+3].CC(O)CN1CCN(CC([O-])=O)CCN(CC([O-])=O)CCN(CC([O-])=O)CC1 DPNNNPAKRZOSMO-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 14
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 14
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 13
- 229960005451 gadoteridol Drugs 0.000 claims description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 10
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 10
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 claims description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 7
- VFTFKUDGYRBSAL-UHFFFAOYSA-N 15-crown-5 Chemical compound C1COCCOCCOCCOCCO1 VFTFKUDGYRBSAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims description 6
- 239000013618 particulate matter Substances 0.000 claims description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 5
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 4
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000002059 diagnostic imaging Methods 0.000 claims description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 2
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 claims description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 2
- XQQZRZQVBFHBHL-UHFFFAOYSA-N 12-crown-4 Chemical compound C1COCCOCCOCCO1 XQQZRZQVBFHBHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- XEZNGIUYQVAUSS-UHFFFAOYSA-N 18-crown-6 Chemical compound C1COCCOCCOCCOCCOCCO1 XEZNGIUYQVAUSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 claims 2
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 claims 2
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 claims 2
- 229940029030 dendritic cell vaccine Drugs 0.000 claims 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 claims 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims 2
- CAKZCCWLOCDNJK-UHFFFAOYSA-N 2,2,3,3,5,5,6,6,8,8,9,9,11,11,12,12,14,14,15,15-icosafluoro-1,4,7,10,13-pentaoxacyclopentadecane Chemical compound FC1(F)OC(F)(F)C(F)(F)OC(F)(F)C(F)(F)OC(F)(F)C(F)(F)OC(F)(F)C(F)(F)OC1(F)F CAKZCCWLOCDNJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 58
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 26
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 25
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 25
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 20
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 19
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 18
- 229920006926 PFC Polymers 0.000 description 17
- 102100038567 Properdin Human genes 0.000 description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 description 17
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 16
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 15
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 13
- MOFVSTNWEDAEEK-UHFFFAOYSA-M indocyanine green Chemical compound [Na+].[O-]S(=O)(=O)CCCCN1C2=CC=C3C=CC=CC3=C2C(C)(C)C1=CC=CC=CC=CC1=[N+](CCCCS([O-])(=O)=O)C2=CC=C(C=CC=C3)C3=C2C1(C)C MOFVSTNWEDAEEK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 13
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 13
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 13
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 10
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 10
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 10
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 9
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 9
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 description 7
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 7
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 7
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 7
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 7
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 6
- 239000002961 echo contrast media Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 6
- TXEYQDLBPFQVAA-UHFFFAOYSA-N tetrafluoromethane Chemical compound FC(F)(F)F TXEYQDLBPFQVAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 5
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 5
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 5
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Chemical compound OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N Lactic Acid Natural products CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 229920001774 Perfluoroether Polymers 0.000 description 4
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 4
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 4
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 4
- YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N Fluorine atom Chemical compound [F] YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 3
- 238000000441 X-ray spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 3
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 3
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 3
- OCDAWJYGVOLXGZ-VPVMAENOSA-K gadobenate dimeglumine Chemical compound [Gd+3].CNC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO.CNC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO.OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)C(C([O-])=O)COCC1=CC=CC=C1 OCDAWJYGVOLXGZ-VPVMAENOSA-K 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 3
- KAVGMUDTWQVPDF-UHFFFAOYSA-N perflubutane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F KAVGMUDTWQVPDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229950003332 perflubutane Drugs 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 210000003314 quadriceps muscle Anatomy 0.000 description 3
- SFZCNBIFKDRMGX-UHFFFAOYSA-N sulfur hexafluoride Chemical compound FS(F)(F)(F)(F)F SFZCNBIFKDRMGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960000909 sulfur hexafluoride Drugs 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N Iron oxide Chemical compound [Fe]=O UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 229910018503 SF6 Inorganic materials 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 2
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000004205 dimethyl polysiloxane Substances 0.000 description 2
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002592 echocardiography Methods 0.000 description 2
- -1 for example Polymers 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 2
- 230000001617 migratory effect Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- WTWWXOGTJWMJHI-UHFFFAOYSA-N perflubron Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)Br WTWWXOGTJWMJHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012831 peritoneal equilibrium test Methods 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 description 2
- 238000012636 positron electron tomography Methods 0.000 description 2
- 238000012877 positron emission topography Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000002603 single-photon emission computed tomography Methods 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 2
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- RKDVKSZUMVYZHH-UHFFFAOYSA-N 1,4-dioxane-2,5-dione Chemical compound O=C1COC(=O)CO1 RKDVKSZUMVYZHH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004293 19F NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- XBBVURRQGJPTHH-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyacetic acid;2-hydroxypropanoic acid Chemical compound OCC(O)=O.CC(O)C(O)=O XBBVURRQGJPTHH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 206010015866 Extravasation Diseases 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 208000003098 Ganglion Cysts Diseases 0.000 description 1
- 101100533652 Homo sapiens SLIRP gene Proteins 0.000 description 1
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241001635529 Orius Species 0.000 description 1
- 229920000436 Poly(lactide-co-glycolide)-block-poly(ethylene glycol)-block-poly(lactide-co-glycolide) Polymers 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 241001085205 Prenanthella exigua Species 0.000 description 1
- 102100025491 SRA stem-loop-interacting RNA-binding protein, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 208000005400 Synovial Cyst Diseases 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000003917 TEM image Methods 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000002583 angiography Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229910052790 beryllium Inorganic materials 0.000 description 1
- ATBAMAFKBVZNFJ-UHFFFAOYSA-N beryllium atom Chemical compound [Be] ATBAMAFKBVZNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000003633 blood substitute Substances 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000004581 coalescence Methods 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 229940039231 contrast media Drugs 0.000 description 1
- 239000000110 cooling liquid Substances 0.000 description 1
- 239000007771 core particle Substances 0.000 description 1
- 239000000495 cryogel Substances 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002389 environmental scanning electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000036251 extravasation Effects 0.000 description 1
- 238000005189 flocculation Methods 0.000 description 1
- 230000016615 flocculation Effects 0.000 description 1
- 238000005188 flotation Methods 0.000 description 1
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- NBVXSUQYWXRMNV-UHFFFAOYSA-N fluoromethane Chemical compound FC NBVXSUQYWXRMNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 229940096814 gadobenate dimeglumine Drugs 0.000 description 1
- 239000007863 gel particle Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 201000010235 heart cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 208000024348 heart neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011503 in vivo imaging Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 229960004657 indocyanine green Drugs 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000005865 ionizing radiation Effects 0.000 description 1
- 230000003447 ipsilateral effect Effects 0.000 description 1
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- JJTUDXZGHPGLLC-UHFFFAOYSA-N lactide Chemical compound CC1OC(=O)C(C)OC1=O JJTUDXZGHPGLLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002082 metal nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 239000002923 metal particle Substances 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000324 minimal toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000009022 nonlinear effect Effects 0.000 description 1
- 238000012633 nuclear imaging Methods 0.000 description 1
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012014 optical coherence tomography Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 238000011192 particle characterization Methods 0.000 description 1
- 229960004065 perflutren Drugs 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 1
- 230000003334 potential effect Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001878 scanning electron micrograph Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000264 spin echo pulse sequence Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003325 tomography Methods 0.000 description 1
- 231100000820 toxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 238000009834 vaporization Methods 0.000 description 1
- 230000008016 vaporization Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/22—Echographic preparations; Ultrasound imaging preparations ; Optoacoustic imaging preparations
- A61K49/222—Echographic preparations; Ultrasound imaging preparations ; Optoacoustic imaging preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, liposomes
- A61K49/225—Microparticles, microcapsules
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/0002—General or multifunctional contrast agents, e.g. chelated agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
- A61K49/0013—Luminescence
- A61K49/0017—Fluorescence in vivo
- A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
- A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
- A61K49/0032—Methine dyes, e.g. cyanine dyes
- A61K49/0034—Indocyanine green, i.e. ICG, cardiogreen
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
- A61K49/0063—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres
- A61K49/0069—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres the agent being in a particular physical galenical form
- A61K49/0089—Particulate, powder, adsorbate, bead, sphere
- A61K49/0091—Microparticle, microcapsule, microbubble, microsphere, microbead, i.e. having a size or diameter higher or equal to 1 micrometer
- A61K49/0093—Nanoparticle, nanocapsule, nanobubble, nanosphere, nanobead, i.e. having a size or diameter smaller than 1 micrometer, e.g. polymeric nanoparticle
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
- A61K49/18—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, microcapsules, liposomes
- A61K49/1818—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, microcapsules, liposomes particles, e.g. uncoated or non-functionalised microparticles or nanoparticles
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/22—Echographic preparations; Ultrasound imaging preparations ; Optoacoustic imaging preparations
- A61K49/221—Echographic preparations; Ultrasound imaging preparations ; Optoacoustic imaging preparations characterised by the targeting agent or modifying agent linked to the acoustically-active agent
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Radiology & Medical Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Acoustics & Sound (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Uso de una partícula de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) que comprende un perfluoro-éter corona y gadolinio para obtención de imágenes in vitro, en el que la obtención de imágenes se selecciona del grupo que consiste en obtención de imágenes acústica, obtención de imágenes fotoacústica, obtención de imágenes por ultrasonidos y obtención de imágenes por coherencia óptica.
Description
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
DESCRIPCIÓN
Agente de contraste y su uso para obtención de imágenes Campo de la invención
La presente invención se refiere a la obtención de imágenes médicas potenciada por agente de contraste. En particular, los agentes de contraste proporcionados son útiles para la obtención de imágenes de células, terapia celular y selección como diana in vivo y aplicaciones de administración de fármacos.
Antecedentes de la invención
La terapia celular es un campo extremadamente prometedor, que podría curar potencialmente estados tales como diabetes, cardiopatía y cáncer. Actualmente hay más de 15.000 ensayos clínicos en curso que implican alguna forma de terapia celular (
www.clinicaltrials.gov). Un obstáculo clave en el desarrollo y la optimización de la terapia celular es que hay medios insuficientes para monitorizar las células una vez que están en el paciente, de manera no invasiva.
www.clinicaltrials.gov). Un obstáculo clave en el desarrollo y la optimización de la terapia celular es que hay medios insuficientes para monitorizar las células una vez que están en el paciente, de manera no invasiva.
La obtención de imágenes podría proporcionar una solución clínicamente aplicable para monitorizar las células terapéuticas una vez en el paciente, en lo que se refiere a su viabilidad, localización, número y funcionalidad (véase Srinivas M, Aarntzen EH, Bulte JW, Oyen WJ, Heerschap A, de Vries IJ, Figdor CG. Imaging of cellular therapies. Adv Drug Deliv Rev. 30 de agosto de 2010;62(11 ):1080-93).
Se ha intentado desarrollar agentes adecuados para marcar células de modo que puedan visualizarse usando varias técnicas de obtención de imágenes, tales como técnicas de 1H-IRM, 19F-IRm, obtención de imágenes por fluorescencia y obtención de imágenes acústica, incluyendo obtención de imágenes por ultrasonidos y fotoacústica.
El uso de ultrasonidos en los procedimientos médicos de obtención de imágenes se conoce bien en la técnica. Es la modalidad de obtención de imágenes clínica usada más frecuentemente. Los ultrasonidos se conocen como una técnica económica, no invasiva, en tiempo real con un historial de seguridad bien establecido. Puede usarse para estudios longitudinales y el uso repetido no es perjudicial para el organismo. Los dispositivos de ultrasonidos no producen ninguna radiación ionizante y su funcionamiento no implica el uso de radiomarcadores. Los dispositivos para realizar obtención de imágenes por ultrasonidos son portátiles y ya se usan ampliamente. La obtención de imágenes por ultrasonidos es potencialmente cuantitativa y no es una modalidad de obtención de imágenes de cuerpo completo y, por tanto, está limitada a órganos diana. La obtención de imágenes por ultrasonidos está limitada con respecto a la profundidad de la obtención de imágenes.
Normalmente, se emplean microburbujas llenas de gas como agentes de contraste en la obtención de imágenes por ultrasonidos. Con frecuencia tienen un tamaño relativamente grande (1000-10000 nm de diámetro) lo que generalmente es inadecuado para el marcaje celular. Además, también son inadecuadas para obtener imágenes de vasos sanguíneos más pequeños, por ejemplo en la obtención de imágenes de tumores. Tales microburbujas llenas de gas tienen una vida útil corta, normalmente del orden de segundos a minutos. También adolecen de la desventaja adicional de que puede producirse daño celular cuando las burbujas de gas explotan. Además, las microburbujas llenas de gas son inestables, de modo que no pueden almacenarse durante una cantidad de tiempo significativa; normalmente tienen que usarse inmediatamente tras la hidratación. Finalmente, tales agentes grandes no pueden dejar la circulación y por tanto presentan oportunidades muy limitadas de selección como diana in vivo o aplicaciones de administración de fármacos. Su gran tamaño también apoya la eliminación rápida por los riñones, lo que limita adicionalmente su vida útil in vivo.
Agentes de contraste de ultrasonidos y su uso se revisan en Ultrasound contrast agents: basic principles. Eur J Radiol. Mayo de 1998;27 Supl 2:S157-60 y Kiessling et al., Theranostics 2011, volumen 1, 127- 134.
La solicitud de patente estadounidense 20100158815 describe el uso de agentes de contraste que se internalizan en una célula para mejorar la visibilidad por ultrasonidos de la célula. Sin embargo, esto tiene la desventaja inherente de que el agente es gaseoso e inestable para el seguimiento celular más allá de algunas horas.
La solicitud de patente estadounidense 20110020239 proporciona métodos para marcar células ex vivo para aplicaciones de obtención de imágenes, y no describe en detalle ningún agente de contraste particular.
El documento WO2012/113733 describe nanopartículas como medios de contraste de TMR (tomografía por resonancia magnética) para el diagnóstico del carcinoma hepatocelular.
El documento WO00/71172 describe un sistema de unión específico de sitio, composiciones de obtención de imágenes nucleares que comprenden compuestos perfluoro-orgánicos y métodos para la obtención de imágenes.
El documento XP040626761, Srinivas et al. en la Sociedad internacional para resonancia magnética en medicina
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
(mayo de 2012) da a conocer partículas clínicas, no en emulsión, de gadolinio/perfluorocarbono para 19F-IRM.
Pese a los muchos agentes de contraste que se han descrito hasta la fecha, existe una gran necesidad en la técnica de agentes de contraste estables, asequibles y eficaces, adecuados para la obtención de imágenes celular, preferiblemente con técnicas de obtención de imágenes por ultrasonidos y fotoacústica. Ambos serían métodos ideales mediante los cuales monitorizar células terapéuticas, si las células pudieran marcarse con un marcador o agente de contraste adecuado para la detección. La técnica preferiblemente debe ser cuantitativa. Además, los agentes de contraste por ultrasonidos también podrían aplicarse a angiografía por ultrasonidos, obtención de imágenes de tumores, etc.
Sumario de la invención
Se encontró que la visibilidad por ultrasonidos y fotoacústica de partículas mejora enormemente cuando la partícula contiene un perfluoro-éter corona en combinación con gadolinio.
Tales partículas pueden emplearse ventajosamente en obtención de imágenes cualitativa o cuantitativa, tal como obtención de imágenes acústica incluyendo obtención de imágenes fotoacústica y por ultrasonidos, obtención de imágenes por IRM, tal como obtención de imágenes por 19F, obtención de imágenes por 1H incluyendo obtención de imágenes ponderadas en T1 y T2, SPECT, PET, escintigrafía y obtención de imágenes por fluorescencia. Esto puede emplearse entonces en marcaje celular, microscopía, histología, aplicaciones dirigidas, administración de fármacos o para obtener imágenes de vasculatura o perfusión in vivo e in vitro.
Descripción detallada de la invención
Se presentan ahora en el presente documento agentes de contraste mejorados para su uso en ultrasonidos y otras técnicas de detección. En el presente documento se describe una partícula que contiene un perfluoro-éter corona en combinación con gadolinio.
Se ejemplifica una partícula de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) que comprende un perfluoro-éter corona y gadolinio. Se mostró que tales partículas tienen un rendimiento mejorado en la obtención de imágenes por ultrasonidos, así como en la obtención de imágenes por IRM (1H y 19F). Las partículas también pueden detectarse usando obtención de imágenes por fluorescencia o bioluminescencia si se incorpora o bien un colorante fluorescente o bien luciferasa (o ácido nucleico que codifica para luciferasa) en la partícula [Pharm Res 2004; 21:354-364].
El término “poli(ácido láctico-co-glicólico)” o PLGA es un término reconocido en la técnica y significa un polímero biodegradable de monómeros de ácido láctico y glicólico de longitud y composición variable. Las partículas de PLGA también pueden comprender polímeros de adición tales como por ejemplo polietilenglicol (PEG, Curr Drug Deliv. Octubre de 2004;1 (4):321 -33). Las partículas de PLGA se conocen en la técnica y se han descrito para su uso en la obtención de imágenes (por ejemplo, Biomaterials. Septiembre de 2010;31(27):7070-7). La estructura del PLGA se muestra en la fórmula 1 (x e y indican el número de unidades de ácido láctico y glicólico, respectivamente).
Fórmula 1
También se han sugerido partículas de PLGA llenas con gas para su uso en ultrasonidos. La solicitud de patente CN 101574530A describe el uso de un agente de contraste por ultrasonidos de microburbujas multipoliméricas de PLGA-PEG-PLGA en el que la microburbuja comprende un gas, tal como perfluoropropano, decafluorobutano o hexafluoruro de azufre.
Ahora se ha encontrado que las partículas de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) que comprenden un compuesto orgánico fluorado líquido son particularmente adecuadas para la obtención de imágenes por ultrasonidos y fotoacústica, y que el rendimiento de una partícula de este tipo puede potenciarse enormemente cuando está presente un metal en la partícula.
El término “un” o “una”, tal como se usa en el presente documento se refiere a al menos uno. Por tanto, un compuesto orgánico fluorado ha de interpretarse como uno o más compuestos fluorados.
El término “partícula” se usa en el presente documento en su significado típico en la técnica. El término se refiere específicamente a partículas de polímero que están en forma sólida cuando se secan a temperatura ambiente
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
debido a las propiedades físicas del polímero de matriz.
Publicaciones tales como Invest Radiol. Marzo de 2006;41(3):305-12, Radiology. Agosto de 2013;268(2):470-80 y varias más, usan el término “nanopartículas de perfluorocarbono” para describir “gotitas de emulsión de perfluorocarbono” que no son “partículas” tal como se describe en el presente documento. Sólo una publicación, el documento WO2912/113733, enumera verdaderas partículas que contienen un agente específico de perfluorocarbono y gadolinio. Sin embargo, en el presente documento el perfluorocarbono actúa como portador inerte y no es un agente activo, y las partículas están restringidas a 1H-IRM en carcinoma hepatocelular.
Por tanto, los liposomas, las micelas y las gotitas de emulsión no están incluidos en el término partículas tal como se usa en el presente documento, ya que consisten en un recubrimiento de tensioactivo líquido (normalmente un lípido) sobre la fase dispersa, que también es un líquido. Las partículas según la invención no contienen tensioactivo y también son estables a ciclos repetidos de congelación/descongelación y liofilización. Las gotitas de emulsión no pueden recuperarse intactas mediante liofilización, y las emulsiones se someten a floculación, flotación, coalescencia y maduración de Ostwald. Estos efectos no se aplican a las partículas en medio líquido, también conocido como “sol”, que en el presente documento se define como un sólido dispersado en una fase continua líquida.
Además, las verdaderas partículas, como aquellas según la invención, pueden precipitarse, a diferencia de las emulsiones, que contienen una dispersión de gotitas diminutas que no pueden recuperarse intactas mediante precipitación. Obsérvese que las gotitas de emulsión con frecuencia se denominan inapropiadamente “partículas” o “nanopartículas” en la bibliografía biológica, aunque este término es químicamente inexacto.
Además, el término partícula tal como se usa en el presente documento indica un pequeño objeto localizado al que pueden atribuirse varias propiedades físicas o químicas, tales como volumen o masa. Las partículas de la presente invención son micropartículas o nanopartículas con un tamaño de entre 1 y 1000 nanómetros, preferiblemente entre 10 y 1000 nanómetros, tales como entre 50 y 500 nanómetros. La distribución de tamaño es de manera preferible de alrededor de un máximo de entre 50 - 500 nanómetros, tales como alrededor de 100 - 300 tal como 200 nanómetros.
En una realización preferida, las partículas son biodegradables y/o biocompatibles.
Varias partículas juntas en una disolución pueden formar una materia particulada o suspensión coloidal o sol, que también está dentro del alcance de la invención. El término materia particulada se usa en el presente documento para indicar una composición que consiste esencialmente en partículas, tales como nanopartículas y/o micropartículas.
El término “líquido”, tal como se usa en el presente documento, se refiere al estado físico líquido de un compuesto cuando está en forma aislada a temperatura corporal (37 grados Celsius) a presión atmosférica normal (aproximadamente 1000 hectopascales).
En determinadas aplicaciones, tal como se ejemplifica en el presente documento, se usaron ventajosamente perfluoro-éter coronas. El término “perfluoro-éter corona” (PFCE) ha de interpretarse como un perfluorocarbono cíclico que contiene carbono, oxígeno y flúor unido covalentemente a una estructura de anillo estable. Normalmente, el PFCE puede ser un polímero.
Un perfluoro-éter corona particularmente útil es perfluoro-éter 15-corona-5, cuya estructura se muestra en la fórmula 2.
Debe indicarse que las partículas según la invención están de manera preferible esencialmente libres de tensioactivo, lo que significa que contienen menos del 0,1% de tensioactivo, preferiblemente menos del 0,01% de tensioactivo, más preferiblemente menos del 0,001%, tal como menos del 0,0001% o el 0,00001%. Esto también se indica en el presente documento como esencialmente libre de tensioactivo. Preferiblemente, las partículas no contienen ningún tensioactivo en absoluto. Esto se indica en el presente documento como libre de tensioactivo.
Fórmula 2
5
10
15
20
25
30
35
40
Se encontró que el rendimiento de las partículas que comprenden el perfluoro-éter corona en obtención de imágenes por ultrasonidos y fotoacústica podría mejorarse enormemente cuando se incluía gadolinio en la partícula.
Los quelatos de gadolinio están disponibles comercialmente tal como por ejemplo, una composición denominada “Prohance ®” que comprende gadoteridol. La estructura del gadoteridol se muestra en la fórmula 3.
Por tanto, la invención se refiere a una partícula que está esencialmente libre de tensioactivo, preferiblemente que está libre de tensioactivo, que comprende un perfluoro-éter corona y un quelato de gadolinio. Una partícula particularmente preferida es una partícula que consiste en un polímero, más específicamente una partícula de PLGA.
Fórmula 3
Las partículas de PLGA pueden sintetizarse en un amplio intervalo de tamaños. Ventajosamente, las partículas tienen dimensiones de manera que sea factible el marcaje celular, incluyendo las distribuciones de tamaño particularmente ventajosas de 100 - 300 nanómetros, tal como de 150 - 250 nm, tal como alrededor de 200 nanómetros. El término “alrededor de” o “aproximadamente” en este contexto significa más o menos del 10%. Este intervalo de tamaño es particularmente ventajoso para la extravasación de vasos sanguíneos pequeños para aplicaciones de selección como diana in vivo.
Se encontró que las partículas según la invención eran adecuadas para el marcaje celular in situ o in vivo, y para ese fin, contienen ventajosamente un agente de selección como diana.
El término “agente de selección como diana” se refiere en el presente documento a un agente que dirige las partículas a un sitio relevante o a una célula o tipo celular particular in vivo o in vitro. Los agentes de selección como diana particularmente ventajosos incluyen anticuerpos y ligandos de receptor.
Las partículas también pueden detectarse mediante otros métodos aparte de ultrasonidos. Las partículas pueden detectarse usando obtención de imágenes fotoacústica, sin la adición de colorantes fluorescentes u otros agentes. Sorprendentemente, se ha encontrado que las partículas de PLGA con PFCE pueden detectarse usando obtención de imágenes fotoacústica, potenciando la señal mediante la adición de metal, tal como gadolinio. La absorción máxima se produce a alrededor de 706 nm. Es posible la adición de colorantes o agentes de contraste fotoacústicos, tales como IC-Green®; estos pueden seleccionarse para absorber a una frecuencia máxima igual o diferente que el PFC en las partículas de PLGA. También se encontró que las partículas pueden detectarse in vivo, por ejemplo tras inyección intramuscular en ratones. Las células marcadas con las partículas también pueden detectarse usando obtención de imágenes fotoacústica, en simuladores tanto in vivo como in vitro. Las partículas de PLGA que contienen PFCE son suficientes para la detección usando obtención de imágenes fotoacústica, tanto in vitro como in vivo; y este efecto se potencia mediante la adición de metales. Un ejemplo de una partícula adecuada es una
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
partícula de PLGA de alrededor de 200 nm de diámetro que contiene PFCE y gadoteridol.
Encontramos que las partículas también eran adecuadas para la obtención de imágenes por IRM. “Obtención de imágenes por IRM” a este respecto significa obtención de imágenes por resonancia magnética e incluye obtención de imágenes por 1H y multinuclear, tal como obtención de imágenes por 19F. Además, la obtención de imágenes puede estar ponderada en T1, T2 o en densidad de protones.
Las partículas según la invención también pueden comprender un colorante, tal como un colorante fluorescente o una proteína fluorescente o un ácido nucleico que codifica para un agente fluorescente. Esto permite la obtención de imágenes por fluorescencia de las partículas, incluyendo análisis in vivo, así como análisis histológicos u otros análisis microscópicos.
Otros modos de detectar las partículas es mediante la incorporación de un radionúclido en la partícula. Esto permite la autorradiografía, escintigrafía, SPECT, PET u otros métodos de detección que pueden detectar compuestos radiactivos. Además, mediante la incorporación de la enzima luciferasa o un vector de ácido nucleico que codifica para luciferasa (u otras enzimas relacionadas), puede usarse bioluminiscencia para la detección in vivo.
Las partículas también pueden detectarse usando técnicas de coherencia óptica, incluyendo tomografía de coherencia óptica.
Leyenda de las figuras
Figura 1: Gráfico que muestra la distribución de diámetro de las partícula para partículas de PLGA con PFCE, gadolinio e IC-Geen®. La distribución promedio fue de 181 nm. La representación gráfica muestra la distribución de diámetros de partícula para 6 mediciones independientes. El estrecho solapamiento indica alta reproducibilidad.
Figura 2: Imagen de partículas en gel a valores de MI crecientes. Las imágenes por ultrasonidos se muestran en agua desgasificada (agua con el aire retirado, como control negativo), partícula de PLGA que comprende PFCE (perfluoro-éter 15-corona-5) o PFCE más gadolinio (PFCE - Gd) y agua del grifo normal (que ha disuelto el aire aparece más brillante). La interpretación de la imagen se proporciona como una tabla debajo de la imagen en la que + indica una señal positiva y - una señal negativa en comparación con el control de agua desgasificada.
Figura 3: Diagramas que muestran el cambio en el diámetro, velocidad de recuento o PDI (índice de polidispersidad, indicativo de la extensión de distribución de diámetro) tras la exposición a ultrasonidos de baja (MI = 2,0, oscuridad) y alta energía (MI=0,1, gris claro) durante 30 segundos. Se usaron partículas de PLGA que comprenden PFCE, con un contenido en gadolinio alto y bajo (ejemplo 1) y se compararon con partículas de PLGA sin gadolinio. Los gráficos se representaron gráficamente como un porcentaje del diámetro de partícula inicial tras la exposición a energía de ultrasonidos alta y baja. El diámetro de partícula inicial fue de 180 nm. Los cambios ligeros tras la exposición a ultrasonidos están dentro de un intervalo aceptable para marcaje celular y otras aplicaciones.
Figura 4: Imágenes que muestran el efecto de la concentración de partículas en contraste. Se expusieron las partículas a ultrasonidos de baja energía (MI = 0,2) en pocillos en un gel de agarosa. Se muestra que las partículas de PLGA que contienen PFCE y gadolinio fueron fácilmente visibles a 20 mg por ml, mientras que las concentraciones de 2 y 0,2 mg por ml fueron menos visibles. PFCE indica pocillos con partículas que comprenden partículas de PLGA que comprenden PFCE sin un metal añadido. Las imágenes se tomaron inmediatamente tras la adición de partículas para impedir la sedimentación o coagulación de partículas en el fondo del pocillo. Los datos indican una relación entre la concentración de partículas y el contraste de imágenes que puede aprovecharse para la cuantificación.
Figura 5: Imagen de experimentos ex vivo realizada con partículas según la invención y un control de la técnica anterior. Se inyectaron partículas según la invención en tejido hepático y se visualizaron con ultrasonidos (MI=0,2). Las imágenes se tomaron inmediatamente después de la inyección. Las imágenes tomadas tras 5 minutos no indicaron ningún cambio. Se emplearon partículas de PFCE con diferentes cantidades de Gd añadidas durante la síntesis (alta, media y baja, ejemplo 1), junto con partículas de BR14. BR14 es un agente de contraste de microburbujas comercial. Las regiones de inyección se indican mediante los recuadros.
Figura 6: Imágenes de experimentos ex vivo empleando partículas según la invención. Se prepararon partículas de PLGA con PFCE y alto contenido en Gd esencialmente tal como se describe en el ejemplo 1. Se inyectó tejido hepático con 200 microlitros de agua desgasificada (flecha) o 200 microlitros de agua que contenía 5 mg de partículas. Se adquirieron imágenes inmediatamente después de la inyección (panel izquierdo) y tras 2 horas a temperatura ambiente (panel derecho). El contraste con respecto a las partículas es claramente visible y no mostró cambio a lo largo del tiempo.
Figura 7: Gráficos que muestran una caracterización de ultrasonidos en modo A de microburbujas de BR14 tal como se describe en el ejemplo 10. Los recuadros indican la región relevante a lo largo de la muestra. Las señales dentro de esos recuadros (es decir los picos) indican que la muestra es activa a ultrasonidos.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Figura 8: Gráficos que muestran la caracterización en modo A de microburbujas de Sonovue® tal como se describe en el ejemplo 10. Sonovue® es un agente de contraste de microburbujas de ultrasonidos comercial vendido para uso clínico. Los recuadros indican la región relevante a lo largo de la muestra. Las señales dentro de estos recuadros (es decir los picos) indican que la muestra es activa a ultrasonidos.
Figura 9: Gráficos que muestran la caracterización en modo A de partículas según la invención tal como se describe en el ejemplo 10. Los recuadros indican la región relevante a lo largo de la muestra. Las señales dentro de estos recuadros (es decir los picos) indican que la muestra es activa a ultrasonidos.
Figura 10: Imagen que muestra el marcaje de células con partículas según la invención. Se marcaron células dendríticas con partículas de PLGA según la invención tal como se describe en el ejemplo 11. Las células o bien no se marcaron (panel izquierdo) o bien se marcaron con partículas de PLGA que comprenden PFCE y gadolinio (panel derecho) las células marcadas con PFCE-Gd son claramente visibles. Las células no marcadas no son visibles con respecto al fondo. Los círculos indican la región con las células.
Figura 11: Imagen que muestra que las partículas según la invención son adecuadas para la obtención de imágenes celulares multimodal. Pudieron visualizarse dos millones de células dendríticas humanas primarias marcadas con partículas de PLGA que comprenden PFCE, alto contenido en gadolinio e IcG, usando ultrasonidos (panel izquierdo), obtención de imágenes por fluorescencia (segundo panel) y obtención de imágenes por resonancia magnética (IRM, paneles tercero, cuarto y quinto). Las imágenes de fluorescencia se editaron para mostrar la región fluorescente en imágenes de escala de grises. Los tres paneles de IRM muestran (a la izquierda) una imagen por 1H-IRM ponderada en T1 (la región hiperintensa con las células se indica mediante la flecha, (centro) una imagen por 19F RM donde sólo son visibles las células marcadas y (derecha) una superposición de la exploración de 19F sobre la exploración de 1H.
Figura 12: Imágenes por ultrasonidos de la pata de un ratón antes y después de la inyección de 5 mg de partículas según la invención en el músculo cuádriceps. El panel muestra imágenes tomadas inmediatamente antes y después de la inyección, así como 2,5 horas después de la inyección. La flecha indica potenciación de contraste debido a las partículas, detectables tanto inmediatamente después de la inyección así como 2,5 h después.
Figura 13: (A) Se muestra una representación en diagrama de las partículas para partículas de alrededor de 200 nm de diámetro que contienen perfluoro-éter 15-corona-5 (PFCE) como PFC, IC-Green® como colorante fluorescente y gadoteridol (Prohance®, Bracco) dentro del polímero de PLGA. (B) Se sometieron a prueba 10 mg de diversos PFC para contraste acústico a diferentes valores de MI que oscilan entre 0,2-1. Se usó agua desgasificada como control negativo, seguido por partículas de PLGA vacío (sin PFC) y partículas con diversos PFC, concretamente PFhexano, PFdecalina, PFO y PFCE. La adición de Gd a las partículas de PFCE potencia adicionalmente la señal. Se obtuvieron imágenes de las partículas en pocillos en un simulador de gel. (C) Se inyectaron 10 mg de partículas de PLGA que contienen PFO o PFCE con concentraciones decrecientes de Gd en hígado de cerdo y se obtuvieron las imágenes. Se inyectaron 200 ul de BR14 como control. La región de atenuación que se produce con BR14 se indica con ]; está ausente de todas las partículas. (D) Se obtuvieron imágenes de 0,2, 2 y 20 mg de partículas que contienen PFCE, PFCE-Gd, PFO-Gd y PFO solo en un simulador de gel. Se obtuvieron imágenes de agua desgasificada de manera similar como control. Se representaron gráficamente las intensidades de señal en los pocillos que resultan de las partículas, mostrando una relación lineal entre la concentración de las partículas y el contraste acústico, y las de las partículas de PFCE-Gd dan como resultado un contraste mucho más alto. (E) Imágenes por ultrasonidos de 2,5, 5 y 20 mg de partículas de PFCE-Gd inyectadas en tejido hepático en 100 ul. (F) Imágenes de EDX (microscopía electrónica con difracción de rayos X) que muestran la localización de IC-Green, PFCE y Gd (de izquierda a derecha, respectivamente) superpuesta sobre la imagen de microscopía electrónica (EM) correspondiente. El PFCE y el colorante se localizan en el borde exterior de la partícula, mientras que el quelato de Gd es interno. La barra de escala indica 200 nm.
Figura 14: (A) También se midió el contenido en 19F de las partículas tras la insonación. Se expusieron las partículas a 60 segundos de excitación por ultrasonidos a un MI de 1,3 (dispositivo de exploración de 7,5 MHz, enfoque a 0,5 cm). (B) Se adquirieron datos de DLS antes y después de que las partículas se expusieran a ultrasonidos, igual que anteriormente. Se muestran el diámetro medio de partícula (nm), la velocidad de recuento media (kcps) y PDI (de arriba abajo). (C) Distribuciones de diámetro de gotitas para las partículas antes y después de la exposición a energía de ultrasonidos. (D) Se adquirieron imágenes de SEM sobre las partículas antes (izquierda) y después de sonicación con sonda. No se observaron cambios en las partículas. La barra de escala bar indica 500 nm.
Figura 15: (A) Comportamiento de diferentes partículas irradiadas por una onda de ultrasonidos de energía creciente. Los resultados se normalizan para la respuesta de agua del grifo y muestran que para las microburbujas de Sonovue (Bracco) la respuesta se colapsa rápidamente a medida que aumenta la presión. En cambio, las partículas muestran una respuesta creciente, lo que demuestra su estabilidad a altas presiones de ultrasonidos. Las partículas con mayor contenido en Gd (PFCE-Gdhi) funcionaron mejor. Se usó PFCE líquido como control. (B) Representación esquemática de la configuración lateral y desde arriba. Una dispersión de las partículas se lava y se
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
estabiliza en un capilar de vidrio cuadrado y se usa un material eléctrico para crear una onda estacionaria en el microcanal, que enfoca las partículas en el nodo o antinodos de presión. El panel inferior representa el efecto de enfoque sobre las partículas en el tiempo de izquierda a derecha En el experimento real, las partículas están estacionarias en el canal y se enfocan en el mismo momento en todo el canal. (C) Ejemplos de imágenes procesadas posteriormente para una muestra de partículas de PFCE-Gd (izquierda) y partículas de PFOB (derecha). Las partículas de PFCE se mueven hacia el nodo de presión ubicado en el medio del canal, mientras que el PFOB se mueve hacia los antinodos de presión ubicados en el lateral de los canales. (D) Una sección transversal de dispersión de diversas partículas calculada usando la teoría de la esfera rígida en comparación con la sección transversal de dispersión de una burbuja recubierta, en función del tamaño de las partículas. Un símbolo cuadrado indica un signo positivo para la fuerza de radiación, lo que se traduce en un movimiento dirigido hacia el centro del capilar, mientras que los círculos indican un signo negativo para la fuerza de radiación.
Figura 16: (A) Obtención de imágenes por fluorescencia, 1H y 19F (color falso) IRM y ultrasonidos de 2 millones de DC marcadas con partículas que contienen PFCE, IC-Green y Gd. Se inyectaron las células en una muestra de tejido hepático ex vivo antes de la obtención de imágenes. (B) Se marcaron 10 millones de DC con las partículas indicadas y se obtuvieron imágenes usando ultrasonidos en los pocillos. (C) Se marcaron 0,2-3 millones de células con partículas que contienen PFCE, Gd y se obtuvieron imágenes usando ultrasonidos en un simulador de gel. Se representaron gráficamente las intensidades de señal resultantes para células marcadas y no marcadas.
Figura 17: (A) Imágenes por ultrasonidos del músculo cuádriceps de un ratón antes, inmediatamente después (0 h) y 2,5 horas después de la inyección de 5 mg de partículas de PFCE-Gd (flecha). El ratón no tenía trabas y se permitió que se moviera libremente después de la inyección. (B) Imágenes por ultrasonidos de alta frecuencia del nódulo linfático inguinal de un ratón antes (izquierda) y después (derecha) de la inyección de 0,1 mg de partículas de PFCE- Gd. El contraste medio del nódulo cambió desde 230 hasta 2662 unidades arbitrarias después de la inyección. (C) Se inyectaron a los ratones 20 mg partículas de PFCE-Gd s.c. y se monitorizaron durante 2 semanas. Las imágenes (de arriba abajo) muestran los riñones, bazos, hígados y nódulos linfáticos inguinales ipsilaterales de drenaje y contralaterales de control de un ratón de control y dos ratones inyectados. Además, los ratones no mostraron ningún cambio en el peso o el comportamiento (no mostrado).
Ejemplos
Ejemplo 1: Preparación de partículas que comprenden perfluoro-éter 15-corona-5.
Se disolvió PLGA (0,09 gramos) en 3 ml diclorometano en un tubo de vidrio. Se añadió perfluoro-éter 15-corona-5 líquido (890 microlitros) seguido por 50 ml de una disolución de Prohance ® (una disolución 3 mg/ml de gadoteridol) diluido en agua. Opcionalmente, pueden añadirse agentes adicionales, tales como un colorante fluorescente, al fluorocarbono en esta fase. Si se requería una partícula fluorescente, se añadió 1 mg de IcG o IC-Green (verde de indocianina, Akorn Pharmaceuticals) a la disolución.
Tal como se detalla a continuación en el presente documento, se prepararon partículas con un contenido alto, medio y bajo de gadolinio. Para ese fin, la disolución mencionada anteriormente de Prohance ® en agua comprendía 11,5, 5,75 y 2,85 ml respectivamente de Prohance ® añadido con agua hasta 50 ml de disolución. Entonces se añadió toda la mezcla gota a gota en 25 ml de una disolución de poli(alcohol vinílico) en agua (20 gramos/litro) bajo sonicación constante (sonicador digital Branson 250; ciclo de 3 minutos con 60 s encendido y 10 s apagado y temperatura máxima de 20 grados Celsius y amplitud del 30%; se usó una copa de cuerno). Entonces se colocó la emulsión resultante a 4 grados Celsius y se permitió que se evaporara con agitación constante durante aproximadamente 12 horas hasta que quedaban 24 ml de disolución. Entonces se colocó un volumen igual de agua y se centrifugó la emulsión a 21000 g durante 30 minutos a 4 grados Celsius. Se lavó el sedimento con agua dos veces y se liofilizó la suspensión resultante a -60 grados Celsius, durante al menos 24 horas. Entonces se colocaron las partículas en tubos sellados y se almacenaron a -80 grados Celsius. A menos que se establezca otra cosa, las partículas usadas en los experimentos descritos en el presente documento son las partículas con el mayor contenido en gadolinio.
Ejemplo 2: Caracterización de partículas
Se encontró que las partículas tal como se prepararon anteriormente eran estables durante al menos un año cuando se mantuvieron a -20 grados Celsius en forma seca. Las partículas eran también estables en disolución a concentraciones de trabajo durante al menos 3 meses a menos 4 grados Celsius.
Se determinó el diámetro de partículas preparadas según el ejemplo 1 usando dispersión de luz dinámica (DLS) tal como se describió previamente (Biomaterials. Septiembre de 2010; 31(27):7070-7). La figura 1 muestra que el tamaño de partícula oscilada entre 80 y 500 nm con un pico nítido a 181 nm. La figura 1 muestra los resultados de 6 síntesis individuales e independientes. Los resultados son idénticos; todas las curvas se solapan esencialmente, indicando una alta reproducibilidad. La distribución de diámetro de partícula permanecía estable durante varios meses. Se liofilizaron las partículas y se congelaron para su almacenamiento. Sin embargo, las partículas almacenadas como alícuotas en agua (congeladas) eran también estables.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Las partículas preparadas según el ejemplo 1 con un contenido en gadolinio alto y medio, disueltas en agua a una concentración de 1 mg/ml parecían ser excepcionalmente estables en las condiciones de obtención de imágenes por ultrasonidos. Se midieron el diámetro de partícula y la velocidad de recuento (indicativa del número de partículas) antes y después de la exposición a MI de ultrasonidos bajo y alto (MI=0,1 y 2,0) durante 30 s. La velocidad de recuento indica aproximadamente el número de partículas por muestra, y por tanto si las partículas se destruyeron por los ultrasonidos. El gráfico de velocidad de recuento indica que el aumento del contenido en Gd mejora la estabilidad de las partículas a la exposición a ultrasonidos. No se encontraron cambios en el diámetro, la velocidad de recuento o PDI (indicativo de la dispersión de la distribución de diámetro) tras la exposición a ultrasonidos de alta energía durante 30 s (figura 3).
Se concluye a partir de los datos presentados en la figura 3 que las partículas según la invención son estables incluso en las condiciones de ultrasonidos más duras y que el aumento del contenido en Gd mejora la estabilidad de las partículas a la exposición a ultrasonidos.
Ejemplo 3: Obtención de imágenes por ultrasonidos in vitro.
Se usó un transductor de matriz lineal (L11-3) con frecuencia central de 7,5 MHz para todas las exploraciones de ultrasonidos (SONOS 7500, Philips Medical Systems, Best, Países Bajos). El MI era variable, desde 0,1-2,0, tal como se indica. La ganancia se fijó normalmente al 90%.
Los simuladores de gel consistían en disolución del 8% de gelatina (Dr. Oetker, Ede, Países Bajos) y el 2% de agar (Agar Powder CMN, Boom, Meppel, Países Bajos) (estos geles se mostraban brillantes en las imágenes por ultrasonidos).
Se realizó la exposición a ultrasonidos a un índice mecánico (MI) que oscilaba entre 0,2 y 1. El MI es una métrica de seguridad que indica cuánta energía se transfiere al sujeto o muestra durante la obtención de imágenes; los límites clínicos son 1,9 para obtención de imágenes de diagnóstico y 1,0 para exploraciones obstétricas).
Ejemplo 4: Obtención de imágenes por ultrasonidos ex vivo
Se usó un transductor de matriz lineal (L11-3) con frecuencia central de 7,5 MHz para todas las exploraciones de ultrasonidos (SONOS 7500, Philips Medical Systems, Best, Países Bajos). El MI era variable, desde 0,1-2,0, tal como se indica. La ganancia se fijó normalmente al 90%.
Ejemplo 5: Obtención de imágenes por ultrasonidos in vivo
Se usó un transductor de matriz lineal (L11-3) con frecuencia central de 7,5 MHz para todas las exploraciones de ultrasonidos (SONOS 7500, Philips Medical Systems, Best, Países Bajos). El MI era variable, desde 0,1-2,0, tal como se indica. La ganancia se fijó normalmente al 90%.
Ejemplo 6: El gadolinio mejora la visibilidad a los ultrasonidos de las partículas.
Se prepararon partículas de PLGA/PFCE según el ejemplo 1 con un alto contenido en Gd y se sometieron a prueba para determinar su visibilidad a los ultrasonidos según el protocolo del ejemplo 3. Los resultados se muestran en la figura 2. Se muestra en la misma que la adición de gadolinio potencia la señal de ultrasonidos. Se concluye que la adición de gadolinio proporciona una mejora de la visibilidad a los ultrasonidos de partículas que comprenden un compuesto orgánico fluorado.
Ejemplo 7: Cuantificación.
Se sometieron a prueba partículas de PLGA/PFCE preparadas según el ejemplo 1 con un alto contenido en Gd para determinar su visibilidad a los ultrasonidos según el protocolo del ejemplo 3. Se usaron diferentes concentraciones de partículas; 20, 2 y 0,2 mg/ml, diluidas en agua. Los resultados se muestran en la figura 4. Se muestra en la misma que la señal de ultrasonidos es proporcional a la concentración de partículas usada. Se concluye que las partículas según la invención son útiles en la obtención de imágenes por ultrasonidos cuantitativa. En experimentos independientes se confirmó que podrían visibilizarse tan sólo 200.000 células cuando se marcan con las partículas según la invención.
Ejemplo 8: Comparación con la técnica anterior
Se inyectaron partículas de PLGA que contenían PFCE líquido y cantidades altas, medias y bajas de gadolinio en hígado de cerdo y se visualizaron mediante ultrasonidos (MI = 0,2), esencialmente según el protocolo del ejemplo 4. Para comparación, también se inyectó en el hígado de cerdo BR14, una partícula comercialmente disponible (Bracco Diagnostics) de 3000 nm que comprende un núcleo de gas perfluorobutano.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Se observó una respuesta cuantitativa de las partículas que contenían Gd que no se destruyó tras la exposición a ultrasonidos. Cuantitativa en este sentido significa que la señal aumenta con el aumento del contenido en gadolinio de las partículas. Además, las partículas según la invención no producen una denominada sombra, tal como se obtiene habitualmente con partículas de núcleo de gas. Este efecto de sombra estaba notablemente presente por debajo del área de inyección de BR14 (figura 5). Se concluye que las partículas según la invención proporcionan propiedades ventajosas en comparación con la técnica anterior, tanto al nivel de una respuesta cuantitativa que no se destruye tras la exposición a ultrasonidos así como la ausencia de una sombra. Esto último permite un análisis mucho más detallado del área en investigación.
Ejemplo 9 Las partículas según la invención permanecen visibles a lo largo del tiempo.
Se inyectaron las partículas preparadas según el ejemplo 1 (5 mg de partículas con un alto contenido en gadolinio en 200 microlitros de agua) en el tejido hepático según el protocolo del ejemplo 4. Se inyectó agua como control. Los resultados en la figura 6 muestran que las partículas eran claramente visibles en tejido hepático incluso tras 2 horas a temperatura ambiente. Los agentes de contraste de la técnica anterior que comprenden un núcleo gaseoso tienen normalmente vidas útiles mucho más cortas especialmente tras la exposición a energía de ultrasonidos [Phys Med Biol. 21 de marzo de 2009; 54(6):R27-57]. Se concluyó a partir de los datos de la figura 6 que las partículas según la invención proporcionan una señal duradera en la obtención de imágenes por ultrasonidos. También se observa la ausencia de un efecto de sombra en este experimento.
Ejemplo 10: comparación cara a cara con partículas de la técnica anterior
Se compararon muestras que contenían agentes de contraste de la técnica anterior con los agentes de contraste según la invención. Se expusieron los agentes tal como se indica (BR14 en la figura 7, Sonovue en la figura 8 y partículas de PLGA que contienen PFCE y alto contenido en gadolinio en la figura 9) a ultrasonidos y se registraron y se representaron gráficamente los ecos resultantes. El modo A o modo de amplitud es una técnica de caracterización de ultrasonidos convencional. El eje y representa la amplitud de la señal recibida y el eje x es el tiempo. También se generan ecos a partir de las paredes del recipiente y otras superficies de contacto. La región relevante (que contiene la muestra) se indica mediante un recuadro en las imágenes. Se muestran datos a 4 voltajes diferentes (equivalentes a diferentes valores de MI). Las representaciones gráficas se muestran para microburbujas de BR14 y SonoVue (ambos disponibles comercialmente) y partículas de PLGA/PFCE más Gd, preparadas tal como se describe en el ejemplo 1.
Todas las estaban a 5 mg en 200 ul. Se colocaron las muestras en soportes en un tanque de agua con un transductor enfocado a 5 MHz (Panametrics NDT A308S, 1,5 pulgadas de distancia focal). Se conectó el transductor a un receptor de pulsos (Squarewave 5066PR) activado por un generador de retardos para funcionar en pulsos individuales (generador de retardos BNC modelo 575). La salida del receptor se encaminó a un osciloscopio (Tektronix 4034) fijado en modo individual. Se fijó el foco al centro del soporte(es decir, a la muestra) y se registró la señal dispersada hacia atrás. Se fijó la frecuencia a 5-6 MHz (frecuencia del centro del transductor) y se varió el voltaje aplicado desde 100-400 V. Se procesaron los datos obtenidos usando una transformada de Hilbert.
Los datos muestran que las partículas que contienen gadolinio según la invención tienen un rendimiento comparable si no superior en comparación con los agentes comerciales. Además, los agentes comerciales se destruyeron por el experimento pero las partículas según la invención no.
Ejemplo 11 Marcaje celular.
Se marcaron células dendríticas (DC) humanas primarias con las partículas esencialmente tal como se describe en Biomaterials. Septiembre de 2010; 31(27):7070-7 y NMR Biomed. Septiembre de 2012; 25(9):1095-103. En los mismos, el marcaje de células se describe con partículas de PLGA que comprenden policarbonos fluorados sin metal en el núcleo. Se encontró que el metal adicional tal como se usa en las partículas según la invención no tenía efecto sobre la viabilidad, el fenotipo, la funcionalidad y la capacidad migratoria de las células. Además, la captación celular de las partículas no se ve afectada por el contenido en metal de la partícula. Esto no es sorprendente ya que sólo se expone el PLGA. Además, el contenido en metal real de las partículas es minúsculo y no se espera que afecte a las células. La carga de gadolinio total suministrada por millón de células es casi 100 veces menor que la dosis clínica aprobada de gadolinio para uso in vivo.
Se obtuvieron imágenes de 10 millones de células dendríticas (DC) marcadas colocándolas en pocillos en gel de agarosa. En este caso, se obtuvieron imágenes del fondo del pocillo ya que las células se asientan muy rápidamente en el fondo. Los resultados se muestran en figura 10. Se concluye que las células pueden visualizarse bien usando partículas según la invención en obtención de imágenes por ultrasonidos.
Ejemplo 12 Obtención de imágenes celulares multimodal
Se visualizaron células marcadas con partículas según la invención ex vivo con obtención de imágenes por ultrasonidos, obtención de imágenes por fluorescencia e IRM.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Se prepararon partículas que contenían un colorante fluorescente según ejemplo 1 y se usaron en obtención de imágenes multimodal. Los resultados se muestran en la figura 11. Se concluye que las partículas según la invención son visibles con ultrasonidos e IRM (tanto 1H como 19F) y si contienen un colorante adicional, también en obtención de imágenes por fluorescencia. Imagen de ultrasonidos: Las células son los puntos blancos brillantes. Fluorescence: El asterisco (*) indica las células. Las presencia del colorante fluorescente, IcG, permite la obtención de imágenes por fluorescencia). IRM: se produce contraste de T1 (flecha) debido al Gd), y la señal de 19F surge del PFCE (color falso).
Ejemplo 13 Análisis histológicos y de microscopía
Se prepararon partículas que contenían un colorante fluorescente según ejemplo 1 y se usaron en análisis histológicos, esencialmente tal como se describe en Biomaterials. Septiembre de 2010; 31(27):7070-7 y NMR Biomed. Septiembre de 2012; 25(9):1095-103. En el mismo, el marcaje de células se describe con partículas de PLGA que comprenden policarbonos fluorados sin metal en el núcleo. No se encontraron diferencias en el comportamiento intracelular e in vivo de las partículas según la invención y se concluye que la adición de un colorante fluorescente a las partículas de la invención permite un estudio intracelular de las partículas, así como un análisis histológico tras la transferencia in vivo.
Ejemplo 14 Obtención de imágenes in vivo
Se prepararon partículas según el ejemplo 1 con un alto contenido en gadolinio. Se inyectaron cinco mg de partículas en el músculo cuádriceps y se obtuvieron imágenes por ultrasonidos según el protocolo del ejemplo 5. La figura 12 muestra los resultados antes de la inyección, inmediatamente después de la inyección y 2,5 horas tras la inyección. Puede concluirse a partir de la figura 12 que las partículas son fácilmente visibles in vivo y que el contraste debido a las partículas persiste, incluso tras 2,5 horas in vivo.
Ejemplo 15 Experimentos adicionales
Las partículas consisten en PLGA que atrapa un PFC, con un diámetro de alrededor de 200 nm. Pueden añadirse restos adicionales tales como colorantes fluorescentes o quelatos de metales solubles. Se puso el foco sobre partículas (figura 13A) que contenían perfluoro-éter 15-corona-5 (PFCE) como PFC, gadoteridol (un quelato de Gd soluble; Bracco Diagnostics Inc.) ya que esta combinación daba como resultado el mejor contraste para ultrasonidos y 19F-IRM. También se incluye el colorante fluorescente IC-Green (Akorn Inc.), pero no necesariamente para contraste acústico. Se sometieron a prueba partículas de PLGA similares con diferentes PFC in vitro en un simulador de gel a diversos valores del índice mecánico (MI) (figura 13B). Se encontró que las partículas de PFCE con el quelato de Gd (PFCE-Gd) mostraban el contraste más alto a todos los MI. También se encontró que el contenido en Gd afecta al contraste de ultrasonidos (figura 13C), en donde se sometieron a prueba concentraciones de 40, 20, 10 y 0 mg de Gd por mg de partículas de PFCE; el contenido en Gd más alto da como resultado el mejor contraste. El contenido en 19F de las partículas permaneció constante a 8x1018 19F/mg. En este caso, se usaron microburbujas de BR14 (Bracco) como referencia (microburbujas de gas perfluorobutano con una distribución promedio de aproximadamente 3000 nm). Se usaron partículas de PFO como control negativo. Además, las partículas demuestran una alta razón de dispersión con respecto a atenuación (STAR) deseable que está indicada por la región de atenuación más pequeña bajo las partículas (resaltada bajo BR14 en la imagen). Todos los experimentos adicionales se llevaron a cabo con partículas de PFCE con el mayor contenido en Gd (PFCE-Gdhi, a menos que se indique otra cosa). En las figuras 1d y e, se obtuvieron imágenes de las partículas o bien en simuladores de gel o bien tras inyección en una muestra de tejido in vitro. La figura 13D examina la relación entre la concentración de partículas y el contraste, con agua desgasificada como control negativo. Las intensidades de señal para regiones de interés (ROI) a lo largo de la muestras se representaron gráficamente para comparación. Se llevó a cabo un experimento similar usando sólo las partículas de PFCE-Gd inyectadas en tejido (figura 13E), en donde también existe una clara relación entre concentración y señal. Finalmente, se observaron los datos de espectroscopía de rayos X de energía dispersiva (EDX) de las partículas de PFCE-Gd superpuestas sobre imágenes de microscopía electrónica (EM) correspondientes. Se muestran las distribuciones para IC-Green, PFCE y Gd. El Gd, y en un menor grado IC-Green, parecen estar distribuidos por toda la partícula, mientras que el PFCE parece más concentrado a lo largo de la periferia, aunque todavía dentro de la matriz de PLGA. La distribución de Gd era diferente con partículas similares preparadas usando un quelato de Gd ligeramente diferente, gadobenato dimeglumina (MultiHance; Bracco), en donde el Gd se confinó a lo largo de la periferia de las partículas como con el PFCE (datos no mostrados). De manera interesante, estas partículas no mostraron contraste potenciado en imágenes por ultrasonidos.
Estabilidad de partículas
Se muestra que las partículas son estables a la insonación, incluyendo sonicación con sonda de energía extremadamente alta. Se inyectaron partículas de PFCE-Gd in vitro en una muestra de tejido, con agua corriente como control (flecha, figura 6). Se obtuvieron imágenes de la muestra inmediatamente, y 2 horas después, se dejaron a temperatura ambiente. No se observó ningún cambio en el contraste con respecto a las partículas. Todo el
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
contraste debido al agua corriente (a partir de burbujas de aire disuelto) se disipó inmediatamente tras la inyección, ya que el líquido se dispersa a través del tejido. Se midió el contenido en flúor de partículas que contienen PFCE, Gd y IC-Green o partículas con PFCE y IC-Green sólo usando 19F RMN, antes y después de la exposición a energía de ultrasonidos durante 60 segundos (figura 14A). Ningún cambio en el contenido en PFCE era evidente para ninguna partícula, indicando que el PFCE no se pierde durante la generación de contraste acústico, tal como puede si el PFCE se vaporiza. Además, no se observaron cambios en el diámetro de partícula, la velocidad de recuento media (indicativa del número de partículas por volumen unitario) y el PDI (una medida de la dispersión de la distribución de diámetro; figura 14B). Estos datos muestran que las partículas no se ven afectadas por la energía de ultrasonidos. La figura 14C muestra distribuciones de diámetro de gotita representativas para las partículas de PFCE-Gd antes y después de la insonación. No se produce ningún cambio en la distribución de diámetro de gotita debido a insonación. Se observó lo mismos cuando se observaron las partículas usando EM (figura 14E), aunque en este caso se expusieron las partículas a sonicación con sonda, lo que da como resultado una deposición de energía mucho más alta que la obtención de imágenes por ultrasonidos. Finalmente, las partículas pueden almacenarse fácilmente durante al menos 6 meses sin cambios en las características de DLS (no mostradas), como polvo liofilizado.
Caracterización acústica
Se midió el comportamiento de las partículas cuando se irradiaron mediante una onda de ultrasonidos de energía creciente (figura 15A), junto con microburbujas de Sonovue (Bracco; burbujas de hexafluoruro de azufre con distribución promedio de 2500 nm). La respuesta para microburbujas colapsa rápidamente ya que la presión aumenta debido a la pérdida de burbujas, mientras que las partículas muestran una respuesta creciente. Se usó como control PFCE líquido puro. Las otras partículas sometidas a prueba son PFCE y PFCE con un contenido en Gd alto y bajo (PFCE-Gdhi y PFCE-Gdlo).
Se cuantificó la actividad acústica y la ecogenicidad de las partículas usando un método basado en la fuerza de radiación acústica16. La señal dispersada hacia atrás mediante un agente de contraste de ultrasonidos y la fuerza de radiación que actúa sobre la misma tienen el mismo origen y por tanto puede lograrse una medida del coeficiente de dispersión midiendo el desplazamiento en un campo acústico definido (figura 15B). Se usó un elemento piezoeléctrico para generar una onda estacionaria en un capilar de vidrio cuadrado, con partículas dispersadas de manera homogénea. La creación de una onda estacionaria de ultrasonidos induce migración hacia el nodo de presión o antinodo ubicado en el medio y los lados del canal respectivamente en el plazo de unos pocos segundos. Se registró el movimiento de las partículas con una cámara de alta velocidad y se analizó (figura 15C).
Las fuerzas que actúan sobre una partícula al azar en un campo acústico incluyen la fuerza de arrastre17, la fuerza de masa añadida que describe la aceleración del fluido circundante posteriormente al movimiento18 de la partícula y la fuerza de radiación que dirige el movimiento de la partícula. La ecuación de conservación del momento puede escribirse a partir de estas tres fuerzas con el fin de determinar la trayectoria de una partícula de tamaño dado. En una primera aproximación, se supone que las partículas obedecen la teoría bien aceptada que describe la interacción de una esfera rígida con un campo acústico al azar16. La fuerza de radiación puede descomponerse en dos participaciones procedentes de la descomposición del campo sobre los armónicos esféricos en donde fe sólo depende de la densidad relativa y fe sólo de la capacidad de compresión relativa. La fuerza de radiación (Fr) sobre una partícula en una onda estacionaria es entonces:
2
VpPg
4poco
A + 2 ^eaí(A)
sin (2ky)
en donde p0 es la densidad de masa del fluido, Pa es la presión de la onda acústica, Vp el volumen de la partícula, ca la velocidad del sonido en el fluido y k el vector de onda.
Puede mostrarse que para una nanopartícula de polímero la parte imaginaria del coeficiente fe puede ser insignificante. La presión dispersada hacia atrás se refiere entonces a la fuerza de radiación en la dirección del transductor mediante:
A partir de esta expresión, la sección transversal de la dispersión en intensidad puede definirse como la potencia dispersada total con respecto a la intensidad de entrada:
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
El contraste de ultrasonidos se origina a partir de la onda de presión reflejada por superficies de contacto no planas o dispersada a partir de pequeños dispersores o bien presentes en los tejidos o bien inyectados artificialmente. La dispersión de las partículas puede producirse a través de dispersión geométrica, que es el caso para la mayoría de las partículas y corresponde a la teoría presentada en las ecuaciones, o comportamientos de vibración resonante para burbujas de contraste que dispersan por ejemplo una onda acústica mediante vibraciones radiales de amplitud alta. La sección transversal de la dispersión representa entonces la sección eficaz sobre la que la partícula que va a reemitirse absorbe la intensidad acústica de una manera esférica y está relacionada cuadráticamente con la generación de contraste. La sección transversal eficaz para las muestras se presenta en la figura 15D. La línea azul discontinua representa el comportamiento de dispersión de una burbuja recubierta normalmente usada para la generación de contraste de ultrasonidos según la teoría de Rayleigh-Plesset19. La dispersión geométrica para estas burbujas de contraste es menor que la dispersión por vibración en el intervalo considerado y es por tanto insignificante. Las partículas de PFCE-Gd, no PLGA o PFCE sólo, muestran un coeficiente de dispersión 8 órdenes de magnitud mayor que el predicho para una burbuja del mismo tamaño (figura 15D). De manera interesante, el coeficiente de dispersión de la mayoría de las partículas era similar al esperado para una burbuja recubierta de tamaño comparable. Sin embargo, tales burbujas pequeñas son altamente inestables y no pueden usarse en la práctica. Además la preparación de las partículas con PFCE modifica drásticamente su comportamiento y mejora su eficacia, particularmente tras la adición de Gd. Al contrario que las otras muestras, las nanopartículas a base de PFCE se desplazan hacia el antinodo de presión (figura 15C) como lo haría una burbuja pequeña y presentan un coeficiente de dispersión aumentado en 2 órdenes de magnitud en comparación con burbujas del mismo tamaño (figura 15D). La obtención de imágenes de velocidad ultra alta de las partículas20 no mostró cambios en las partículas con la insonación (datos no mostrados).
Mareaje celular y obtención de imágenes
Se marcaron DC humanas tal como se usa en ensayos clínicos2 y se obtuvieron imágenes de las mismas. No se observaron efectos sobre la viabilidad celular en relación con controles no marcados. El trabajo previo con partículas similares, excepto sin el quelato de Gd, no ha mostrado efecto del marcaje sobre las células con respecto a la expresión de marcadores de maduración, la capacidad para activar células T y la capacidad migratoria21, 22. Se detectaron fácilmente células marcadas usando fluorescencia, MR y obtención de imágenes por ultrasonidos tras la inyección en una muestra de tejido ex vivo (figura 16A). Se inyectaron 2 millones de células marcadas. Se llevó a cabo en primer lugar obtención de imágenes por ultrasonidos, seguido por obtención de imágenes por MR y fluorescencia; la persistencia de la fluorescencia y particularmente la señal de 19F-IRM indica que las partículas no se dañan por la exposición a ultrasonidos. La figura 16B muestra 10 millones de DC en un simulador de gel, en donde las células o bien no se marcaron, se marcaron con partículas de PFO o bien con partículas de PFCE-Gd. De nuevo, queda claro que las células marcadas con partículas de PFCE-Gd muestran el mayor contraste. Finalmente, se realizó una serie de dilución de estas células y se obtuvieron imágenes usando ultrasonidos (figura 16C). Se obtuvieron imágenes de 3-0,2 millones de células marcadas o no marcadas. Se representa gráficamente la intensidad relativa para una ROI que abarca los pocillos, que muestra una clara potenciación del contraste.
Obtención de imágenes in vivo y toxicidad
Se inyectaron por vía intramuscular partículas de PFCE-Gd en un ratón (figura 17A). Se muestran imágenes antes, inmediatamente después y 2 horas después de la inyección. Se anestesió el ratón durante la inyección, pero entonces se le permitió que se recuperara antes de la siguiente sesión de obtención de imágenes. Por tanto, las partículas se dispersaron dentro del musculo en algún grado debido al movimiento del ratón. Además, no es posible obtener exactamente el mismo plano de obtención de imágenes que con las imágenes previas. A pesar de estos problemas, las partículas inyectadas son claramente detectables. Se adquirieron estas imágenes en un escáner de ultrasonidos clínico.
Se obtuvieron imágenes de las partículas tras inyecciones intranodales en ratones (figura 17B). Estas inyecciones imitan la situación clínica, en donde pueden inyectarse células directamente en los ganglios linfáticos de pacientes en terapia de vacunación con DC23. Sin embargo, debido al pequeño volumen que puede inyectarse en ganglios linfáticos murinos (menos de 10 pl), sólo se inyectaron partículas (0,1 mg) en lugar de células. En estos experimentos, 0,1 mg corresponden a 100.000 células, dada una captación celular constante, mientras que normalmente se inyectan 3-15 millones de células en ensayos clínicos. Se llevó a cabo ultrasonidos de alta resolución a 21 MHz, con el fin de localizar los ganglios linfáticos que normalmente están 2 mm por debajo en su eje largo. El contraste medio del ganglio cambió más de 10 veces tras la inyección de las partículas. No se detectó contraste a las 18 horas tras la inyección (no mostrado). Tampoco se detectó señal de fluorescencia, incluso con ganglios linfáticos extirpados, lo que sugiere adicionalmente que las partículas se aclararon del nódulo inyectado.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Finalmente, se estudió la toxicidad de las partículas (figura 17C) en ratones en los que se inyectaron por vía subcutánea 20 mg de las partículas, que es una dosis muy grande. Los ratones se monitorizaron durante 2 semanas, en relación con controles no inyectados. No se observaron cambios en el peso, comportamiento o aspecto durante este periodo. En el punto final, se sacrificaron los ratones y se pesaron y examinaron sus órganos. No se observaron diferencias significativas en relación con animales de control; en particular, se examinaron estrechamente los riñones, los bazos, los hígados y los ganglios linfáticos drenantes. Tomados conjuntamente con la falta de efecto tras el marcaje celular y las evidencias de aclaramiento, estos datos indican que las partículas son biocompatibles.
Ejemplo 16 Procedimientos y métodos adicionales Síntesis de partículas
Se obtuvieron partículas tal como se describió anteriormente 22, con la adición de gadoteridol de ProHance (Bracco Imaging Europe, Ámsterdam). Brevemente, se añadió 1 g de poli(alcohol vinílico) disuelto en 50 ml de agua solo o en agua y ProHance, 1780 pl para Gdhi y 1400 para Gdlo, gota a gota a 180 mg de PLGA (Resomer RG 502 H, razón molar de lactida:glicolida de 48:52 a 52:48; Boehringer Ingelheim, Alemania) disuelto en diclorometano con 890 pl de PFCE (Exfluor Inc, Texas EE.UU.) o 232 pl DE PFO (Perfluoron, Alcon Inc), en hielo, con sonicación usando un dispositivo Digital Sonifier 250 (Branson, Danbury, EE.UU.) con una copa de cuerno que oscila a una potencia de 40% durante 2 minutos en impulsos de 10 segundos . Se realizó dispersión de luz dinámica en un dispositivo Zetasizer Nano de Malvern. Se midió el contenido en Gd usando espectrometría de masas. Las partículas de PFCE-Gdlo contienen 20 pg/mg y las de PFCEGdhi 40 pg/mg.
Obtención de imágenes in vitro
Se llevó a cabo obtención de imágenes por ultrasonidos in vitro en muestras en un simulador de gel o inyectado en tejido hepático bovino usando un dispositivo de exploración SONOS 7500 de Philips usando un transductor de matriz lineal (11-3L) con una frecuencia central de 7,5 MHz. Los valores de MI se limitaron a 0,2. Se usó un transductor de matriz lineal (L11-3) con frecuencia central de 7,5 MHz para las exploraciones de ultrasonidos (SONOS 7500, Philips Medical Systems, Best, Países Bajos). El MI era variable, desde 0,1-2,0, tal como se indica en el texto. La ganancia se fijó normalmente al 90%.
Los simuladores de gel consistían en disolución del 8% de gelatina (Dr. Oetker, Ede, Países Bajos) y el 2 % agar (Agar Powder CMN, Boom, Meppel, Países Bajos) en peso (estos geles se mostraron brillantes en las imágenes por ultrasonidos), o criogel de poli(alcohol vinílico) (se calentó el 15% en peso de PVA (Boom, Meppel, Países Bajos), el 20% en peso de líquido de enfriamiento (Koelvloeistof Basic Safe, Halfords, Países Bajos) y el 65% en peso de agua hasta ~90 grados Celsius en un cilindro cerrado hasta que se formó un líquido homogéneo. Tras verter en un molde y un ciclo de congelación-descongelación (12 horas a -25°C y posteriormente 12 horas a 20°C)).). Se llevaron a cabo análisis en el contraste (figura 13D) trazando una región de interés sobre los pocillos y midiendo la intensidad de píxel promedio usando el dispositivo Image J (Institutos Nacionales de Salud estadounidenses, Betesda, Maryland, EE.UU.).
Se realizó obtención de imágenes por MR y espectroscopía en un sistema de MR 11.7T (Bruker Biospin, Ettlingen, Alemania), equipado con un imán con perforación horizontal, usando una bobina de volumen doble de 1H/19F. Los ajustes de imagen fueron TR/TE de 800/10,5 ms, vóxeles de 2x2x2 mm, matriz de 256x128 y 2 promedios para 1H usando una secuencia espín eco; 960/46 ms, vóxeles de 4x4x4 mm, matriz de 64x32, 512 promedios usando una secuencia RARE con un factor 8 de RARE.
Para la obtención de imágenes por fluorescencia, se colocaron ratones o tubos de muestra en un dispositivo FluorVivo 300 (INDEC BioSystems, Santa Clara, CA, EE.UU.). Los tiempos de exposición fueron de entre 0,05 y 0,15 s.
Aislamiento y marcaje celulares
Se aislaron DC humanas primarias de sangre de donante tal como se describe21, y se marcaron con 5 mg de partículas por millón de células los días 3-8 del periodo de cultivo in vitro. Se lavaron las células minuciosamente (tres veces) antes de su uso. Se contaron las células viables usando un contador de células con exclusión de azul de tripano.
Obtención de imágenes in vivo
Se alojaron ratones en condiciones especificadas libres de patógenos en el Central Animal Laboratory (Nijmegen, Países Bajos). Todos los experimentos se realizaron según las directrices para el cuidado de animales del Nijmegen Animal Experiments Committee. Se llevó a cabo la obtención de imágenes por ultrasonidos in vivo usando un sistema VisualSonics Vevo 2100 con un transductor MS550S. Se anestesió a los ratones usando isoflurano.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Se realizaron inyecciones intranodales con una jeringa de microlitros NanoFil (World Precisión Instruments, Alemania) con guía microscópica.
Mediciones de EM y EDX
Se fijó la muestra sobre una placa de vidrio mediante la evaporación del líquido de suspensión. Entonces se depositó una capa de oro sobre la muestra antes de la observación mediante un microscopio electrónico de barrido ambiental FEI ESEM XL30 a 20 kV y ampliaciones de hasta 60.000x.
Se realizó microscopía electrónica de transmisión (TEM) y TEM-EDS, TEM acoplada con espectroscopia de rayos X por dispersión de energía (EDS) en un sistema del estado de la técnica 200 KV JEOL TEM 2100 con un punto de resolución de 0,24 nm. El microscopio está equipado con dos cámaras de Gatan: Gatan 833 Orius y Gatan 890 ultrascan para obtener la mayor resolución y sensibilidad a una tensión de aceleración de 200 kV y dos sistemas detectores, STEM y EDS (espectroscopía de rayos X por dispersión de energía) para el análisis elemental. Se usaron un portamuestras convencional para las mediciones de TEM y un portamuestras de berilio para las mediciones de EDS. Se prepararon las muestras colocando una gota (6 - 10 ul) de la disolución sobre una rejilla de Cu recubierta de carbono (200 de malla, EM science) y se secaron al aire. Las imágenes de TEM permitieron la visualización de las nanopartículas y su distribución de tamaño, mientras que la obtención de imágenes electrónica secundaria permitió el examen de la composición química de las nanopartículas y el mapeo elemental y la distribución de imágenes elemental.
Caracterización acústica
Los resultados presentados en la figura 15A se obtuvieron usando un receptor de generador de impulsos Panametrics 5077PR conectado a un transductor Panametrics 5MHz A308S. Un portamuestras que contenía cubetas de 4,4 mm de grosor estaba realizado de polidimetilsiloxano (PDMS) y se colocó en el foco del transductor. Para cada serie, se tomó una referencia de agua. La configuración experimental consistió en un capilar cuadrado de aproximadamente 380 micrómetros de tamaño unido a un cristal piezoeléctrico, con el fin de generar una onda estacionaria acústica en el capilar a la frecuencia de 1,94 MHz, tal como se representa en la figura 15B. El movimiento de las partículas se registra a 125 tramas por segundo mediante el uso de una cámara de alta velocidad photron APX conectada a un microscopio Olympus. Se usa un objetivo 10x para la visualización. Las señales se generaron con un generador de longitud de onda arbitraria Tabor AWG y se amplificaron con un amplificador de potencia ENI 350L. Debido a la rápida acumulación de emisión, los experimentos se realizaron a bajas presiones para limitar el efecto de la emisión en el fluido. El análisis se logra usando Matlab®. En particular, se obtienen las curvas PIV usando OpenPlV, un software gratuito. Se usaron dos métodos simultáneamente para analizar el registro óptico, para una mayor precisión. El primero es un análisis de PIV, que se basa en la correlación transversal de las submatrices de la imagen. Puede obtenerse un desplazamiento relativo a partir del análisis de PIV y reajustarse a la geometría conocida. Un segundo método se basa en la obtención del promedio en la dirección horizontal. Se añade la línea de píxel resultante a las anteriores en una trama individual, tal como se presenta en la figura 15C.
Prueba de toxicidad in vivo
Se inyectaron 20 mg de partículas s.c. en ratones, y se observaron los ratones durante 2 semanas en relación con los controles sin tratar. Se extrajeron los órganos para su observación y se pesaron tras el periodo de 2 semanas.
Ejemplo 17. Discusión adicional
Los PFC tienen propiedades acústicas únicas, especialmente con respecto a una velocidad de sonido muy baja24 que puede influir en sus propiedades de contraste. Se han usado previamente gotitas de PFC para ultrasonidos, aunque estas requiere vaporización del PFC, y tienden a tener dimensiones submicrométricas 7’ 15, 25-28. Los PFC también se han mezclado con metales para su uso como agentes de contraste, normalmente para IRM. Sin embargo, estos tienden a estar con nanopartículas metálicas sólidas, tales como cristales de óxido de hierro 29 30. El papel de un quelato de Gd soluble, y específicamente gadoteridol en contraposición a otros quelatos similares, es evidente en los datos (por ejemplo, figura 13C), pero sigue sin estar definido. No hay bibliografía sobre la potenciación de señales acústicas usando quelatos metálicos solubles, aunque frecuentemente se usan partículas metálicas sólidas como CA de ultrasonidos 29, 31-33. Por tanto, actualmente no hay bibliografía sobre quelatos metálicos solubles que potencien PFC líquidos que permanecen en forma líquida, para ultrasonidos. Las pruebas de que PFCE permanece líquido en las partículas incluyen su alto punto de ebullición (145°C), la falta de cambios en los datos de DLS y EM, y el contenido en flúor (figura 14), y la capacidad para realizar 19F-IRM incluso después de la insonación (figura 16A).
Se observó de manera indiscutible la actividad acústica de las partículas y se midió en los experimentos presentados aún cuando el mecanismo preciso por el cual las partículas retrodispersan las ondas de ultrasonidos sigue siendo vago. Los registros de velocidad ultraalta 20 descartan cualquier acontecimiento de cavitación. Además, las bajas presiones usadas para la caracterización acústica (15 kPa) dejan poca posibilidad para efectos no lineales o cavitación. Por tanto, tienen que investigarse nuevos mecanismos. Este trabajo no puede realizarse con una
5
10
15
20
25
30
35
40
45
configuración típica de 90°, ya que las teorías predicen directividades de las ondas dispersadas, que también parecen indicadas por la baja sombra de las partículas (figura 13C). Se necesitará investigar teorías más complejas 4 35 con el fin de tener en cuenta los efectos potenciales de la cubierta sobre el comportamiento acústico. Un estudio acústico exhaustivo para desentrañar completamente el mecanismo físico, está más allá del alcance del trabajo actual. Por ahora, se sospecha una forma de resonancia no trivial de las partículas para explicar la fuerza de la señal recibida, ya que todas las resonancias mecánicas para este tipo de sistema se dan a frecuencias mucho más altas..
Las partículas de PLGA que contienen PFC han mostrado previamente una captación celular excelente con toxicidad mínima. De hecho, la carga de 19F celular, un parámetro clave para estudios de 19F-IRM, lograda con estas partículas es la mayor notificada hasta ahora 36. No se espera que la adición del quelato de Gd afecte significativamente a la captación o a otras características de las partículas, debido a su concentración extremadamente baja. Además, el contenido en Gd es varias órdenes de magnitud menor que la dosis clínica recomendada actual (tabla 1). Lo mismo es cierto para PLGA, PFC y IC-Green (tabla 1). El aclaramiento de estos componentes también está bien estudiado. Esto es una ventaja importante con respecto a otros agentes de contraste de ultrasonidos estables, que normalmente son sólidos, tales como nanopartículas de oro o sílice 9 10 11, y tienen tiempos de retención prolongados in vivo retención 12 y menos aplicabilidad clínica 13.
Las partículas de PLGA de 200 nm con PFCE y quelato de Gd (Gadoteridol, Bracco) descritas en el presente documento producen alto contraste acústico, sin resultar afectadas por la energía de ultrasonidos. En particular, las partículas son lo suficientemente pequeñas como para dejar la circulación (una limitación importante de los agentes de microburbujas actuales, que se limitan a la circulación debido a su gran tamaño y su vida útil más corta). Además, las partículas también son estables a sonicación con sonda de alta energía (figura 14D). Tal estabilidad es esencial para aplicaciones a largo plazo tales como selección como diana in vivo para regiones fuera del endotelio, y para marcaje celular. También se ha demostrado que las partículas pueden usarse para la generación de contraste a altas frecuencias (figura 17B), lo que permite obtención de imágenes a alta resolución y por tanto, el desarrollo de modelos animales pequeños para estudios de obtención de imágenes basados en ultrasonidos. Las partículas puede realizarse fácilmente para uso clínico en condiciones de GMP. Esto, junto con la falta de toxicidad observada tanto en células como in vivo, demuestra su idoneidad para uso humano. Las partículas de PLGA también se han aplicado ampliamente en la bibliografía a diversos usos tales como administración dirigida de fármacos y vacunas, y se han sometido a diversas modificaciones, incluyendo la adición de radioligandos37 y el recubrimiento con PEG para obtener partículas “discretas” 38. Puede controlarse la velocidad de degradación de partículas y la posterior velocidad de liberación de fármacos, tiempos de circulación y funcionalidades multimodales 39 22 40. Todas estas modificaciones sieguen siendo posibles con estas partículas, lo que permite su adaptación cuando es necesario.
La obtención de imágenes por ultrasonidos es idealmente adecuada para el estudio de agentes terapéuticos personalizados, pero su potencial no se ha explotado debido a la falta de agentes de contraste biocompatibles, estables, adecuados. Las partículas descritas en el presente documento pueden adaptarse fácilmente a la obtención de imágenes multimodal en aplicaciones clínicas y preclínicas, incluyendo seguimiento celular y administración de fármacos dirigida.
Tabla 1
- Compuesto
- Antes del uso humano Dosis recomendada Dosis estimada (por millón de DC) Ruta de aclaramiento
- PLGA
- Soportes, partículas para administración 41 de vacunas Varía con la aplicación; normalmente 30 mg < 1 mg metabolismo celular normal
- PFC, por ejemplo Perfluoron (Alcon Inc) Oxygent (Alliance Pharma) PFCE
- cirugía ocular sustituto sanguíneo señal de 19F-IRM 8 mg > 100 g n/d 0,1 - 0,3 ng (dependiendo del subconjunto de DC) exhalación en pulmones; los PFC no se metabolizan in vivo
- Quelato de Gd, por ejemplo ProHance Multihance (ambos de Bracco)
- Agente de contraste intravenoso para 1H- IRM 4000 mg < 1 mg eliminado por los riñones
- IC-Green (pulsión)
- contraste intravenoso 35 mg < 5 mg eliminado por los riñones
Bibliografía
1. Srinivas, M. et al. Imaging of cellular therapies. Adv Drug Deliv Rev 62, 1080-1093 (2010).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
2. Aarntzen, E.H. et al. Early identification of antigen-specific immune responses in vivo by [18F]-labeled 3’-fluoro- 3’- deoxy-thymidine ([18F]FLT) PET imaging. Proc Natl Acad Sci USA 108, 18396-18399 (20ll).
3. Aarntzen, E.H. et al. Targeting of 111 In-labeled dendritic cell human vaccines improved by reducing number of cells. Clin Cancer Res 19, 1525-1533 (2013).
4. Qin, S., Caskey, C.F. & Ferrara, K.W. Ultrasound contrast microbubbles in imaging and therapy: physical principles and engineering. Phys Med Biol 54, R27-57 (2009).
5. Sirsi, S. & Borden, M. Microbubble Compositions, Properties and Biomedical Applications. Bubble Sci Eng Technol 1,3-17 (2009).
6. Kiessling, F., Huppert, J. & Palmowski, M. Functional and molecular ultrasound imaging: concepts and contrast agents. Curr Med Chem 16, 627-642 (2009).
7. Reznik, N. et al. The efficiency and stability of bubble formation by acoustic vaporization of submicron perfluorocarbon droplets. Ultrasonics 53, 1368-1376 (2013).
8. Aggeli, C., Giannopoulos, G., Lampropoulos, K., Pitsavos, C. & Stefanadis, C. Adverse bioeffects of ultrasound contrast agents used in echocardiography: true safety issue or “much ado about nothing”? Curr Vasc Pharmacol 7, 338-346 (2009).
9. Delogu, L.G. et al. Functionalized multiwalled carbon nanotubes as ultrasound contrast agents. Proc Natl Acad Sci USA 109, 16612-16617 (2012).
10. Jokerst, J.V., Khademi, C. & Gambhir, S.S. Intracellular aggregation of multimodal silica nanoparticles for ultrasound-guided stem cell implantation. Sci Transl Med 5, 177ra135 (2013).
11. Chung, E., Nam, S.Y., Ricles, L.M., Emelianov, S.Y. & Suggs, L.J. Evaluation of gold nanotracers to track adipose-derived stem cells in a PEGylated fibrin gel for dermal tissue engineering applications. Int J Nanomedicine 8, 325-336 (2013).
12. Longmire, M., Choyke, P.L. & Kobayashi, H. Clearance properties of nano-sized particles and molecules as imaging agents: considerations and caveats. Nanomedicine (Lond) 3, 703-717 (2008).
13. Lin, C., Fugetsu, B., Su, Y. & Watari, F. Studies on toxicity of multi-walled carbon nanotubes on Arabidopsis T87 suspension cells. J Hazard Mater 170, 578-583 (2009).
14. Kang, S.T. & Yeh, C.K. Intracellular acoustic droplet vaporization in a single peritoneal macrophage for drug delivery applications. Langmuir 27, 13183-13188 (2011).
15. Strohm, E.M., Min Rui, Michael C Kolios, Ivan Gorelikov, Naomi Matsuura in IEEE International Ultrasonics Symposium Proceedings 495-4982010).
16. Settnes, M. & Bruus, H. Forces acting on a small particle in an acoustical field in a viscous fluid. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys 85, 016327 (2012).
17. Mettin, R. & Doinikov, A.A. Translational instability of a spherical bubble in a standing ultrasound wave. Applied Acoustics 70, 1330-1339 (2009).
18. Magnaudet, J. & Eames, I. The Motion of High-Reynolds-Number Bubbles in Inhomogeneous Flows. Annual Review of Fluid Mechanics 32, 659-708 (2000).
19. Leighton, T.G. The Acoustic Bubble. (Academic Press, 1996).
20. Gelderblom, E.C. et al. Brandaris 128 ultra-high-speed imaging facility: 10 years of operation, updates, and enhanced features. Rev Sci Instrum 83, 103706 (2012).
21. Bonetto, F. et al. A large-scale (19)F MRI-based cell migration assay to optimize cell therapy. NMR Biomed 25, 1095-1103 (2012).
22. Srinivas, M. et al. Customizable, multi-functional fluorocarbon nanoparticles for quantitative in vivo imaging using 19F MRI and optical imaging. Biomaterials 31,7070-7077 (2010).
23. Aarntzen, E.H. et al. In vivo imaging of therapy-induced anti-cancer immune responses in humans. Cell Mol Life Sci 70, 2237-2257 (2013).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
24. Strohm, E.M., Michael C. Kolios in IEEE International Ultrasonics Symposium 2368-23712011).
25. Matsunaga, T.O. et al. Phase-change nanoparticles using highly volatile perfluorocarbons: toward a platform for extravascular ultrasound imaging. Theranostics 2, 1185-1198 (2012).
26. Reznik, N. et al. Optical studies of vaporization and stability of fluorescently labelled perfluorocarbon droplets. Phys Med Biol 57, 7205-7217 (2012).
27. Sheeran, P.S., Luois, S.H., Mullin, L.B., Matsunaga, T.O. & Dayton, P.A. Design of ultrasonically-activatable nanoparticles using low boiling point perfluorocarbons. Biomaterials 33, 3262-3269 (2012).
28. Szijjarto, C., Rossi, S., Waton, G. & Krafft, M.P. Effects of perfluorocarbon gases on the size and stability characteristics of phospholipid-coated microbubbles: osmotic effect versus ¡ntertacial film stabilization. Langmuir 28, 1182-1189 (2012).
29. Li, A. et al. Superparamagnetic perfluorooctylbromide nanoparticles as a multimodal contrast agent for US, MR, and CT imaging. Acta Radiol 54, 278-283 (2013).
30. Barnett, B.P. et al. Use of perfluorocarbon nanoparticles for non-invasive multimodal cell tracking of human pancreatic islets. Contrast Media Mol Imaging 6, 251-259 (2011).
31. Li, F. et al. Preparation of gold nanoparticles/functionalized multiwalled carbon nanotube nanocomposites and its glucose biosensing application. Biosens Bioelectron 24, 1765-1770 (2009).
32. Niu, C. et al. Doxorubicin loaded superparamagnetic PLGA-iron oxide multifunctional microbubbles for dualmode US/MR imaging and therapy of metastasis in lymph nodes. Biomaterials 34, 2307-2317 (2013).
33. Niu, D. et al. Facile synthesis of magnetite/perfluorocarbon co-loaded organic/inorganic hybrid vesicles for dual- modality ultrasound/magnetic resonance imaging and imaging-guided high-intensity focused ultrasound ablation. Adv Mater 25, 2686-2692 (2013).
34. Strifors, H.C. & Gaunard, G.C. Differences in the acoustic echoes from submerged elastic shells containing different fluids. Ultrasonics 30, 107-112 (1992).
35. Kovalev, V.A. Matching of asymptotic approximations in the problem of the scattering of acoustic waves by an elastic spherical shell. Journal of Applied Mathematics and Mechanics 66, 581-590 (2002).
36. Srinivas, M., Boehm-Sturm, P., Figdor, C.G., de Vries, I.J. & Hoehn, M. Labeling cells for in vivo tracking using (19)F MRI. Biomaterials 33, 8830-8840 (2012).
37. D’Souza, M. & DeSouza, P. Preparation and testing of cyclosporine microsphere and solution formulations in the treatment of polyarthritis in rats. Drug Dev Ind Pharm 24, 841-852 (1998).
38. Avgoustakis, K. Pegylated poly(lactide) and poly(lactide-co-glycolide) nanoparticles: preparation, properties and possible applications in drug delivery. Curr Drug Deliv 1,321-333 (2004).
39. Mahapatro, A. & Singh, D.K. Biodegradable nanoparticles are excellent vehicle for site directed in-vivo delivery of drugs and vaccines. J Nanobiotechnology 9, 55 (2011).
40. Jain, A.K., Das, M., Swarnakar, N.K. & Jain, S. Engineered PLGA nanoparticles: an emerging delivery tool in cancer therapeutics. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 28, 1-45 (2011).
41. Lu, J.M. et al. Current advances in research and clinical applications of PLGA-based nanotechnology. Expert Rev Mol Diagn 9, 325-341 (2009).
42. Hahn, T. et al. Visualization and quantification of intestinal transit and motor function by real-time tracking of 19F labeled capsules in humans. Magn Reson Med 66, 812-820 (2011).
Claims (18)
- 5101520253035404550556065REIVINDICACIONES1. Uso de una partícula de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) que comprende un perfluoro-éter corona y gadolinio para obtención de imágenes in vitro, en el que la obtención de imágenes se selecciona del grupo que consiste en obtención de imágenes acústica, obtención de imágenes fotoacústica, obtención de imágenes por ultrasonidos y obtención de imágenes por coherencia óptica.
- 2. Uso según la reivindicación 1, en el que el perfluoro-éter corona se selecciona del grupo que consiste en perfluoro-éter 15-corona-5, perfluoro-éter 12-corona-4 y perfluoro-éter 18-corona-6.
- 3. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 2, en el que el gadolinio es un quelato de gadolinio.
- 4. Uso según la reivindicación 3, en el que el quelato de gadolinio es gadoteridol.
- 5. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, en el que la partícula comprende un agente dedetección, tal como un colorante, tal como un colorante fluorescente o un radionúclido.
- 6. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5, en el que la partícula está comprendida en una materia particulada en la que el diámetro medio de partícula es un valor de entre 100 y 300 nanómetros, preferiblemente de entre 150 - 250 nanómetros, tal como 200 nanómetros.
- 7. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 6, en el que la partícula o materia particulada está esencialmente libre de tensioactivo o está libre de tensioactivo.
- 8. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 7, en el que la obtención de imágenes se selecciona del grupo que consiste en obtención de imágenes de diagnóstico, obtención de imágenes de metástasis o vasculatura, obtención de imágenes cuantitativa, obtención de imágenes cualitativa, obtención de imágenes de vacunas celulares, obtención de imágenes de agentes terapéuticos celulares, obtención de imágenes de vacunas de células dendríticas, obtención de imágenes de células madre y obtención de imágenes de células beta de islotes.
- 9. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 8, en el que la obtención de imágenes se seleccionadel grupo que consiste en marcaje celular in vitro, microscopía in vitro e histología in vitro.
- 10. Partícula de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) que comprende un perfluoro-éter corona y gadolinio parasu uso en la obtención de imágenes in vivo, en el que la obtención de imágenes se selecciona del grupo que consiste en obtención de imágenes acústica, obtención de imágenes fotoacústica, obtención de imágenes por ultrasonidos y obtención de imágenes por coherencia óptica.
- 11. Partícula para su uso según la reivindicación 10, en la que el perfluoro-éter corona se selecciona del grupo que consiste en perfluoro-éter 15-corona-5, perfluoro-éter 12-corona-4 y perfluoro-éter 18-corona-6.
- 12. Partícula para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 10-11, en la que el gadolinio es un quelato de gadolinio.
- 13. Partícula para su uso según la reivindicación 12, en la que el quelato de gadolinio es gadoteridol.
- 14. Partícula para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 10-13, en el que la partícula comprendeun agente de detección, tal como un colorante, tal como un colorante fluorescente o un radionúclido.
- 15. Partícula para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 10-14, en la que la partícula está comprendida en una materia particulada en la que el diámetro medio de partícula es un valor de entre 100 y 300 nanómetros, preferiblemente de entre 150 - 250 nanómetros, tal como 200 nanómetros.
- 16. Partícula para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 10-15, en la que la partícula o materia particulada está esencialmente libre de tensioactivo o está libre de tensioactivo.
- 17. Partícula para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 10-16, en la que la obtención de imágenes se selecciona del grupo que consiste en obtención de imágenes de diagnóstico, obtención de imágenes terapéutica, obtención de imágenes de metástasis o vasculatura, obtención de imágenes cuantitativa, obtención de imágenes cualitativa, obtención de imágenes de vacunas celulares, obtención de imágenes de agentes terapéuticos celulares, obtención de imágenes de vacunas de células dendríticas, obtención de imágenes de células madre y obtención de imágenes de células beta de islotes.
- 18. Partícula para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 10-17, en la que la obtención de imágenes se selecciona del grupo que consiste en marcaje celular in vivo, microscopía in vivo, obtención deimágenes in vivo de vasculatura o perfusión e histología in vivo.Partícula para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 10-18, en la que la partícula comprende un agente terapéutico o un agente de selección como diana, tal como un fármaco, un ligando de receptor o un anticuerpo.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP12184562.2A EP2708244A1 (en) | 2012-09-14 | 2012-09-14 | Contrast agent and its use for imaging. |
| EP12184562 | 2012-09-14 | ||
| PCT/EP2013/069079 WO2014041150A1 (en) | 2012-09-14 | 2013-09-14 | Contrast agent and its use for imaging |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2690400T3 true ES2690400T3 (es) | 2018-11-20 |
Family
ID=46851866
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES13762489.6T Active ES2690400T3 (es) | 2012-09-14 | 2013-09-14 | Agente de contraste y su uso para obtención de imágenes |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11185600B2 (es) |
| EP (2) | EP2708244A1 (es) |
| JP (1) | JP6293149B2 (es) |
| CA (1) | CA2884154C (es) |
| DK (1) | DK2895201T3 (es) |
| ES (1) | ES2690400T3 (es) |
| WO (1) | WO2014041150A1 (es) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2708244A1 (en) | 2012-09-14 | 2014-03-19 | Stichting Katholieke Universiteit | Contrast agent and its use for imaging. |
| EP3316966A1 (en) * | 2015-07-01 | 2018-05-09 | Stichting Katholieke Universiteit | Polymeric nanoparticles for enhancing hifu-induced ablation |
| RU2599500C1 (ru) * | 2015-08-04 | 2016-10-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН) | Контрастирующий агент для введения фтор-19 метки в белки, содержащие остатки лизина |
| EP3216464A1 (en) | 2016-03-11 | 2017-09-13 | Stichting Katholieke Universiteit Nijmegen | Process for preparation of beads for imaging |
| KR101740464B1 (ko) * | 2016-10-20 | 2017-06-08 | (주)제이엘케이인스펙션 | 뇌졸중 진단 및 예후 예측 방법 및 시스템 |
| JP6770747B2 (ja) * | 2017-03-10 | 2020-10-21 | 国立大学法人茨城大学 | 新規な含フッ素環状有機化合物とその製造方法並びに前記含フッ素環状有機化合物からなる相間移動触媒及び金属イオン捕捉剤 |
| US11491244B2 (en) | 2017-06-02 | 2022-11-08 | Sunnybrook Research Institute | Labeled fluorocarbon agents for positron emission tomography imaging |
| CN108014349B (zh) * | 2017-12-28 | 2021-04-16 | 重庆医科大学附属第二医院 | 一种载基因的多功能造影剂的制备方法及其应用 |
| CN110152019A (zh) * | 2019-06-10 | 2019-08-23 | 中国人民解放军第四军医大学 | 仿生双模态相变型纳米级超声造影剂及其制备方法 |
| CN110433296A (zh) * | 2019-08-16 | 2019-11-12 | 哈尔滨医科大学 | 一种19f-mr/荧光多模式分子成像及载药的诊疗一体化纳米探针及制备方法和应用 |
| WO2022196621A1 (ja) | 2021-03-17 | 2022-09-22 | Tdk株式会社 | 含フッ素化合物および造影剤 |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5958371A (en) * | 1995-06-08 | 1999-09-28 | Barnes-Jewish Hospital | Site specific binding system, nuclear imaging compositions and methods |
| DE69811931T2 (de) * | 1997-10-27 | 2003-12-18 | Res Corp Technologies Inc | Mri-mittel für die verabreichung von therapeutischen mitteln |
| JP2003521475A (ja) * | 1999-05-25 | 2003-07-15 | バーンズ−ジューウィッシュ・ホスピタル | 部位特異的結合系、核画像化組成物及び方法 |
| JP2001114713A (ja) * | 1999-10-15 | 2001-04-24 | Schering Ag | ガドリニウム内包フラロールおよびその造影剤としての使用 |
| US20030004533A1 (en) * | 2001-05-04 | 2003-01-02 | Concentric Medical | Bioactive polymer vaso-occlusive device |
| EP1713513B1 (en) * | 2004-01-16 | 2014-06-04 | Carnegie Mellon University | Cellular labeling for nuclear magnetic resonance techniques |
| US7483732B2 (en) * | 2004-04-15 | 2009-01-27 | Boston Scientific Scimed, Inc. | Magnetic resonance imaging of a medical device and proximate body tissue |
| US20110020239A1 (en) | 2007-05-14 | 2011-01-27 | The Johns Hopkins University | Methods for in vivo imaging of cells |
| JP5398189B2 (ja) | 2008-07-23 | 2014-01-29 | 株式会社日立製作所 | 磁気共鳴イメージング装置 |
| US8940277B2 (en) | 2008-11-06 | 2015-01-27 | University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education | Intracellular microbubble for imaging an anatomical site |
| CN101574530A (zh) | 2009-06-18 | 2009-11-11 | 福建医科大学附属协和医院 | 一种新型plga-peg-plga共聚物微泡超声造影剂及其制备方法 |
| US8709451B2 (en) * | 2010-01-20 | 2014-04-29 | University Of Utah Research Foundation | Stable nanoemulsions for ultrasound-mediated drug delivery and imaging |
| WO2012113733A1 (de) * | 2011-02-21 | 2012-08-30 | Johann Wolfgang Goethe-Universität, Frankfurt Am Main | Nanopartikel als mrt-kontrastmittel zur diagnostik des hepatozellulären karzinoms |
| EP2708244A1 (en) | 2012-09-14 | 2014-03-19 | Stichting Katholieke Universiteit | Contrast agent and its use for imaging. |
-
2012
- 2012-09-14 EP EP12184562.2A patent/EP2708244A1/en not_active Withdrawn
-
2013
- 2013-09-14 JP JP2015531585A patent/JP6293149B2/ja active Active
- 2013-09-14 US US14/428,350 patent/US11185600B2/en active Active
- 2013-09-14 CA CA2884154A patent/CA2884154C/en active Active
- 2013-09-14 DK DK13762489.6T patent/DK2895201T3/en active
- 2013-09-14 EP EP13762489.6A patent/EP2895201B1/en active Active
- 2013-09-14 WO PCT/EP2013/069079 patent/WO2014041150A1/en active Application Filing
- 2013-09-14 ES ES13762489.6T patent/ES2690400T3/es active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2895201A1 (en) | 2015-07-22 |
| CA2884154C (en) | 2021-07-20 |
| JP6293149B2 (ja) | 2018-03-14 |
| CA2884154A1 (en) | 2014-03-20 |
| US11185600B2 (en) | 2021-11-30 |
| US20150250905A1 (en) | 2015-09-10 |
| JP2015534549A (ja) | 2015-12-03 |
| DK2895201T3 (en) | 2018-10-29 |
| EP2708244A1 (en) | 2014-03-19 |
| WO2014041150A1 (en) | 2014-03-20 |
| EP2895201B1 (en) | 2018-07-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2690400T3 (es) | Agente de contraste y su uso para obtención de imágenes | |
| Perera et al. | Contrast enhanced ultrasound imaging by nature-inspired ultrastable echogenic nanobubbles | |
| Brismar et al. | Magnetite nanoparticles can be coupled to microbubbles to support multimodal imaging | |
| Paul et al. | Encapsulated microbubbles and echogenic liposomes for contrast ultrasound imaging and targeted drug delivery | |
| RU2207808C2 (ru) | Применение контрастных агентов в форме частиц в диагностической визуализации для изучения физиологических параметров | |
| Teraphongphom et al. | Nanoparticle loaded polymeric microbubbles as contrast agents for multimodal imaging | |
| Li et al. | Spontaneous nucleation of stable perfluorocarbon emulsions for ultrasound contrast agents | |
| US20080319320A1 (en) | Method of imaging lymphatic system using nanocapsule compositions | |
| Mountford et al. | Condensation phase diagrams for lipid-coated perfluorobutane microbubbles | |
| Zullino et al. | From micro-to nano-multifunctional theranostic platform: effective ultrasound imaging is not just a matter of scale | |
| US20130129635A1 (en) | Polymerized shell lipid microbubbles and uses thereof | |
| US20150023881A1 (en) | Contrast agent for combined photoacoustic and ultrasound imaging | |
| Barmin et al. | Optoacoustic/fluorescent/acoustic imaging probe based on air-filled bubbles functionalized with gold nanorods and fluorescein isothiocyanate | |
| Li et al. | Acoustic characterization and enhanced ultrasound imaging of long‐circulating lipid‐coated microbubbles | |
| Luo et al. | Novel DiR and SPIO nanoparticles embedded PEG-PLGA nanobubbles as a multimodalimaging contrast agent | |
| Welch et al. | Perfluorocarbon nanodroplet size, acoustic vaporization, and inertial cavitation affected by lipid shell composition in vitro | |
| Feshitan et al. | Magnetic resonance properties of Gd (III)-bound lipid-coated microbubbles and their cavitation fragments | |
| Maksimova et al. | Multilayer Polymer Shell Perfluoropentane Nanodroplets for Multimodal Ultrasound, Magnetic Resonance, and Optoacoustic Imaging | |
| Di Paola et al. | Echographic imaging of tumoral cells through novel nanosystems for image diagnosis | |
| de Leon et al. | Bubble trouble: conquering microbubble limitations in contrast enhanced ultrasound imaging by nature-inspired ultrastable echogenic nanobubbles | |
| CN114748646B (zh) | 一种超声、荧光双重显影负载量子点纳米泡及其制备方法和应用 | |
| EP3216464A1 (en) | Process for preparation of beads for imaging | |
| Lin | Phase-change contrast agent and its applications in contrast-enhanced ultrasound and photoacoustic imaging | |
| Kauerová | Targeting nanoparticle drug carriers: Functionalized microbubbles and their application in ultrasonography | |
| Thomas et al. | Contrast-enhanced sonography with biomimetic lung surfactant nanodrops |