ES2682759T3 - Bebida promotora de la salud - Google Patents

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ES2682759T3 ES13181725.6T ES13181725T ES2682759T3 ES 2682759 T3 ES2682759 T3 ES 2682759T3 ES 13181725 T ES13181725 T ES 13181725T ES 2682759 T3 ES2682759 T3 ES 2682759T3
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Abstract

Bebida caracterizada porque la bebida comprende aceite marino fresco en una emulsión aceite-en-agua, en la que el aceite marino tiene un valor totox inferior a 10, y además añadida con por lo menos un antioxidante no presente naturalmente en dicha emulsión aceite-en-agua, en la que el contenido de aceite marino es 0,5% - 5% en peso basado en el peso 5 total y en la que el por lo menos un antioxidante añadido es curcumina que no está naturalmente presente en la fase de agua o fase de aceite, pero es añadido separadamente a la bebida.

Description

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Bebida promotora de la salud Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a una nueva formula de bebida, que comprende aceite omega-3 marino fresco en una emulsion y antioxidantes, bien conocida por promover la salud en seres humanos, a un procedimiento para la produccion de dicha bebida y al uso de dicha bebida para la produccion de un medicamento.
Descripcion de la tecnica anterior
Los efectos promotores de salud de aceites poliinsaturados, son bien conocidos. Los efectos promotores de la salud de los antioxidantes son tambien conocidos. Sin embargo, se necesita una composicion que combine estos nutrientes en una formula, que de como resultado un aumento en la absorcion y donde el cuerpo sea capaz de utilizar de manera optima los nutrientes.
Existe la necesidad de nuevas composiciones, donde estos nutrientes nativos inestables promotores de la salud sean formulados, tal que cada componente se mantenga intacto y fresco.
El efecto de los acidos grasos omega-3 (EPA, DHA y DPA) sobre varias enfermedades y condiciones, tales como enfermedad cardiovascular, mental, de la piel y envejecimiento, esta bien documentado. La adicion de omega-3 como suplemento aumenta a nivel mundial. Existe un aumento en el consumo de productos que contienen omega- 3, y las autoridades de salud recomiendan altamente el omega-3 en la forma de pescado y/o suplementos alimenticios.
La tension oxidativa es un tipo de "tension qmmica" inducida por la presencia en nuestro cuerpo de cantidades anormales de radicales libres. Cualquiera que sea la causa, se cree que la tension oxidativa es responsable del envejecimiento prematuro y de una muy larga serie de enfermedades comunes - aproximadamente 100 - que vanan desde hipertension arterial hasta aterosclerosis, desde infarto hasta ictus, desde enfermedad de Parkinson hasta enfermedad de Alzheimer, desde colitis hasta pancreatitis, desde obesidad hasta diabetes, desde bronquitis cronica hasta reumatoide, desde SIDA hasta varios tipos de cancer.
El cuerpo esta protegido contra los radicales libres por antioxidantes, tanto producidos por sf mismo como antioxidantes suministrados a traves de alimentos y bebidas. Los antioxidantes pueden ser vitaminas, minerales y enzimas, sea solubles en grasa o solubles en agua.
En situaciones en las que el cuerpo esta sometido a aumento en la oxidacion (muchos radicales libres), el cuerpo podna no tener suficientes antioxidantes para neutralizar o inactivar los radicales libres. Ocurren reacciones de cadena destructivas, que podnan causar el aumento de la tension oxidativa danina.
Un procedimiento convencional para medir el estado oxidativo es el FRAS (Sistema Analftico de Radicales Libres). La prueba es evaluada en una unidad de medicion convencional llamada unidad Carr (por el qmmico Carratelli, el inventor de la prueba). El procedimiento es rapido y solo se requiere una gota de sangre tomada de la punta del dedo.
La tabla abajo da un panorama de valores oxidativos normales y elevados.
Valores FRAS:
Valores normales Valores lfmite
Tension oxidativa suave Tension oxidativa moderada Tension oxidativa severa
250 - 300 U.Carr
300 - 320 U.Carr (mostrando un valor ligeramente elevado de radicales libres, lo cual podna conducir a condiciones de tension oxidativa)
320 - 340 U.Carr
340 -400 U.Carr
400 - 500 U.Carr
La base teorica para los efectos de los antioxidantes es bien reconocida. Tambien se reconoce que la absorcion de antioxidantes en el cuerpo, desde suplementos antioxidantes, es un desaffo. Sin embargo, los estudios han demostrado que los antioxidantes en una forma no nativa o como vitaminas aisladas, son tomados de manera inadecuada por el cuerpo. Algunos estudios indican que la ingestion de elevadas dosis de vitaminas aisladas puede convertir los antioxidantes en prooxidantes, conduciendo a una elevada oxidacion del cuerpo. Los estudios y
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la literatura indican mejor absorcion y biodisponibilidad de antioxidantes presentes de modo natural, cuando son consumidos en alimentos, por ejemplo como frutas y vegetales.
Se sabe que los seres humanos que tienen severa tension oxidativa son frecuentemente deficientes en acidos grasos omega-3 (DHA y EPA), y poseen un bajo estado antioxidativo.
El dano oxidativo y deficiencia en antioxidantes son ahora mirados como factores cruciales para muchas enfermedades, y son probablemente la razon primaria para un reemplazo imperfecto de celulas viejas danadas, por celulas nuevas.
La investigacion ha demostrado que los productos de oxidacion de acidos grasos son altamente reactivos y pueden afectar e interferir con los procedimientos intracelulares. Muchos suplementos de omega-3 disponibles comercialmente contienen aceite de pescado que tiene un grado significativo de oxidacion, que a su vez puede inducir efectos adversos sobre procedimientos intracelulares.
Aunque a estos suplementos dietarios se anaden frecuentemente antioxidantes, esto no revertira la rancidez ya presente en el suplemento dietario. Por otro lado, para prevenir la oxidacion adicional del aceite insaturado de pescado, los antioxidantes seran consumidos y finalmente (despues de algunos meses) cesaran. Asf, los antioxidantes en los suplementos dietarios disponibles comercialmente no induciran ningun efecto promotor de la salud en seres humanos. El documento WO 2007/064222A1 describe una composicion que comprende aceite de pescado y jugo, formando una emulsion estable aceite-en-agua. Asf, existe una necesidad por una nueva composicion que combine aceite fresco de pescado y antioxidantes espedficos, para suministrar una nueva formula de bebida que tenga efectos mejorados de promocion de la salud en seres humanos.
La invencion presente
Asf, el objeto de la presente invencion es suministrar una nueva formula de bebida que comprende aceite marino fresco omega-3 y antioxidantes, bien conocida por promover la salud en seres humanos.
Un objeto adicional de la presente invencion es suministrar un procedimiento para la produccion de la nueva formula de bebida, en la que el aceite de pescado es emulsificado y manipulado bajo condiciones suaves, a traves de un mmimo de pasos de procedimiento.
Un objeto adicional de la presente invencion es suministrar una bebida, para el uso como bebida terapeutica. Los antioxidantes espedficos que va a ser incluidos en la bebida son seleccionados de acuerdo con la enfermedad o transtorno que va a ser tratado.
Estos y otros objetos son logrados por la presente invencion, de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 14. Por ello, la presente invencion se refiere a una bebida que combina aceite marino fresco y antioxidantes espedficos. Los antioxidantes que tienen un efecto promotor de la salud en seres humanos estan presentes en la bebida para reducir la tension oxidativa en el ser humano, no con el proposito de estabilizar el aceite en la preparacion. La bebida puede ser una bebida funcional o una bebida terapeutica, una bebida para apagar la sed o una bebida ordinaria. Preferiblemente, la bebida tiene una base que contiene antioxidantes naturales, por ejemplo jugo de frutas o vegetales, te verde, pero puede usarse cualquier lfquido bebible.
La nueva bebida combina la emulsion estable de omega-3 conocida de la tecnica previa, y antioxidantes bien conocidos por promover la salud. La bebida revela sorprendentes caractensticas como absorcion de antioxidantes y el efecto de antioxidantes en el cuerpo. Comparada con la tecnica previa, donde en diferentes formulas se ingieren cantidades correspondientes de omega-3 y antioxidantes, la bebida de acuerdo con la presente invencion muestra una entrega mejorada, mejor absorcion y efecto mejorado en la tension oxidativa.
Tanto el aceite omega-3 como los antioxidantes presentes en la bebida de acuerdo con la invencion, son notablemente estables en la composicion, y el progreso de la rancidez y efectos de perdida de antioxidante son mucho menores que en los productos conocidos, formulados como capsulas separadas.
Un aspecto de la presente invencion se refiere a una bebida que comprende aceite marino fresco en una emulsion aceite-en-agua, donde el aceite marino tiene un valor totox inferior a 10, anadida ademas con por lo menos un antioxidante no naturalmente presente en dicha emulsion aceite-en-agua.
El termino aceite marino fresco describe un aceite preparado a partir de aceite fresco, donde todos los pasos del procedimiento son conducidos cuidadosamente y bajo estricto control de oxfgeno, de acuerdo con estandares funcionales de aceite, con objeto de prevenir la oxidacion del aceite. El aceite marino fresco tendra un bajo estado oxidativo, revelando un aceite incoloro sin el olor o sabor caractensticos del pescado. El nivel de oxidacion, dado como el valor totox (2 veces el valor de peroxido (PV) anadido al valor de anisidina (AV)), debena ser inferior a 10, preferiblemente inferior a 8, y mas preferiblemente inferior a 5. El aceite marino presente en muchos suplementos
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alimenticios actualmente contiene aceite con un valor totox mucho mayor, tipicamente 20 - 30 o incluso mayor.
El aceite marino fresco puede ser cualquier aceite rico en omega-3, por ejemplo aceite de pescado, aceite de foca o aceite de kril. El aceite puede estar mezclado con otros aceites poliinsaturados de origen vegetal, tales como aceite de algas y aceite herbal tal como aceite de primula y aceite de colza.
Una realizacion de la presente invencion suministra una bebida en la cual el contenido de aceite marino es 0,5% - 5% en peso basado en el peso total, preferiblemente en el intervalo de 0,5% - 3%, mas preferiblemente en el intervalo de 1,5%- 2,5%.
La emulsion aceite-en-agua es preparada mediante cualquier procedimiento convencional, preferiblemente como se describe, en los documentos noruegos NO 20044542, 20053136 y 20055620, del solicitante. En dichas emulsiones, los antioxidantes estan presentes para estabilizar el aceite durante la produccion y almacenamiento, no con el proposito de inducir ningun efecto promotor de la salud en seres humanos.
La fase acuosa de la emulsion aceite-en-agua es preferiblemente una fase acuosa que contiene antioxidantes naturales, por ejemplo jugos de fruta/vegetales, te verde, te blanco, y te herbal. El jugo puede ser un jugo recientemente comprimido o jugo en la forma de concentrado de jugo o pure de jugo diluido para obtener un jugo normal listo para consumir. La fase acuosa puede contener tambien protemas tales como soja, protema de avena, protemas de suero y/o protemas de leche.
De acuerdo con la invencion, los terminos antioxidantes anadidos o anadidos adicionalmente deben ser entendidos como antioxidantes no presentes naturalmente presentes en la fase acuosa o fase de aceite, sino anadidos separadamente. El antioxidante anadido adicionalmente puede ser similar a uno o mas antioxidantes naturalmente presentes en la fase acuosa o fase de aceite, o diferentes. El por lo menos un antioxidante anadido adicionalmente puede ser uno o una combinacion de dos o mas antioxidantes.
Los antioxidantes utiles de acuerdo con la presente invencion son antioxidantes conocidos por tener efectos promotores de la salud en seres humanos. Los antioxidantes utiles son por ejemplo astaxantina, vitamina E, vitamina C, beta-caroteno, luteina, licopeno, zeaxantina, glutation, flavonoides, carotenoides, fenoles de planta, polifenoles, coenzima Q10, reservatrol, curcumina, picnogenol, selenio, cobre, zinc y magnesio. Los antioxidantes pueden estar presentes individualmente o en una mezcla de dos o mas. Los antioxidantes pueden ser seleccionados para satisfacer propositos espedficos, es decir los efectos deseables en la salud que van a ser alcanzados. Como ejemplos, una bebida de acuerdo con la invencion que comprende luteina y zeaxantina tendra probablemente un impacto positivo en diferentes condiciones del ojo. Una bebida de acuerdo con la invencion que comprende el antioxidante curcumina rica es adecuada para aliviar la inflamacion y combatir las infecciones. Una bebida de acuerdo con la invencion, que comprende CoQ10 puede ser util para los trastornos neurologicos. Ademas, una bebida de acuerdo con la invencion que comprende picnogenol puede ser benefica para reducir osteoartritis. El beta-caroteno anadido a dicha bebida puede ser util para trastornos respiratorios y CoQ10 y selenio seran utiles para trastornos cardiovasculares.
En una realizacion de la presente invencion, a la bebida pueden anadirse prebioticos y/o probioticos.
En una realizacion de la presente invencion, la bebida puede ser carbonatada.
Un aspecto adicional de la presente invencion se refiere a un procedimiento para la produccion de una bebida, de acuerdo con la invencion, que comprende los siguientes pasos:
a) se anaden antioxidantes y agentes saborizantes solubles en aceite, junto con el emulsificante a la fase de aceite,
b) se anaden aditivos solubles en agua a la fase acuosa,
c) se mezclan las fases de aceite y acuosa, para dar una emulsion homogenea,
d) opcionalmente, la emulsion obtenida es sometida a procedimientos de pasteurizacion y/u homogenizacion,
e) se enfna la emulsion obtenida y se envasa en recipientes desechables limpios; en el que todos los pasos son ejecutados bajo estricto control de oxfgeno.
De modo alternativo, el procedimiento para la produccion de una bebida de acuerdo con la invencion comprende los siguientes pasos:
a) se anaden a la fase de aceite los antioxidantes y agentes saborizantes solubles en aceite,
b) a la fase acuosa se anaden los aditivos solubles en agua,
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c) se mezclan la fase de aceite y la fase acuosa y se anade el emulsificante, seguido por mezcla suave para lograr una emulsion homogenea,
d) la emulsion obtenida es sometida opcionalmente a procedimientos de pasteurizacion y/u homogenizacion,
e) se enfna la emulsion obtenida y se empaca en recipientes desechables limpios; en el que todos los pasos son ejecutados bajo estricto control de oxfgeno.
Un aspecto adicional de la presente invencion se refiere a una bebida para el uso como una bebida terapeutica. Otros aspectos se relacionan con el uso de una bebida de acuerdo con la invencion, para la produccion de una preparacion medica, para la profilaxis o tratamiento de enfermedades asociadas con tension oxidativa elevada, tales como cancer o trastornos neurologicos. La presente divulgacion describe tambien el uso de la bebida para la produccion de una preparacion medicinal para la profilaxis o tratamiento de enfermedades asociadas con trastornos cardiovasculares y trastornos respiratorios. Sorprendentemente se ha hallado que la nueva formula de bebida que combina acidos grasos omega-3 frescos y por lo menos un antioxidante anadido, tiene un mejorado efecto promotor de la salud, comparado con suplementos alimenticios donde se ingieren aceite marino y antioxidantes en formulas separadas, por ejemplo capsulas, pfldoras o comprimidos. Se cree que la formulacion espedfica de la invencion es de gran importancia, que presenta los nutrientes esenciales y agentes espedficos de promocion de salud (acidos grasos poliinsaturados y antioxidantes anadidos) al sistema digestivo y a las celulas, en un formato altamente benefico para las celulas y el cuerpo.
Figuras
La figura 1 muestra el efecto de aceite marinos sobre la peroxidacion de lfpidos en celulas U937. Las celulas fueron incubadas por 48 h con diferentes concentraciones de acidos grasos omega-3, de diferentes vendedores, como se muestra en la leyenda. En el eje X se indican las concentraciones. El eje Y muestran los niveles relativos de peroxidacion de lfpidos, usando fluorescencia mediada por DPPP como un sensor. Se indica la desviacion estandar.
Realizaciones
La invencion sera ahora ilustrada en mas detalle, con referencia a los siguientes ejemplos de comparacion.
Bebida de acuerdo con la invencion
El aceite marino usado en todas las preparaciones fue aceite de salmon Xalar de Marine Harvest Ingredients, numero de lote: 099000F016. El valor totox estaba por debajo de 5 y la preparacion fue conducida de acuerdo con estandares funcionales de aceite.
Ejemplo 1
Bebida que comprende emulsion de omega-3 marino fresco y astaxantina.
%
Agua, purificada
42,31
Jugo vegetal
45,00
Extracto de romero 201
0,02
Toco 50
0,01
Grindsted 3115
1,00
Jugo concentrado de manzana
10,00
Aroma natural a limon
0,15
Astaxantina
0,01
Aceite marino
1,50
Suma
100,00
Jugo vegetal Granini Grindsted 3115 de Dansico 5 Aroma natural a limon de Firmencih
Polvo de Haematococcus pluvialis calidad alimenticia (complejo de astaxantina esterificada en la forma de biomasa de algas haematococcus pluvialis), suministrado por: Sinochem Hebei corporation, 707 Lianmeng, Shijiazhuang, China
Ejemplo 2
10 Bebida que comprende emulsion de omega-3 marino fresco, suministrada con vitaminas C y E.
% kg
Extracto de romero 201
0,02 0,16
Toco 50
0,01 0,08
Grindsted 3115
1,00 8,00
Concentrado de manzana
6,05 48,40
Concentrado de manzana granada
2,40 19,20
Concentrado de Aronia
0,80 6,40
Concentrado de pera
6,49 51,92
Agua, purificada
81,00 648,00
Sabor de naranja/mandarina
0,10 0,80
Sabor de frambuesa
0,12 0,96
Vitamina C
0,01 0,80
Selenio
0,4
Vitamina E
0,08
Aceite marino
2,00 16,00
Suma
100,00 800,80
Sabor natural de frambuesa de Firmenich Sabor natural de naranja/mandarina de Firmenich
Vitamina E: D-alfa, D-beta, D-delta, D- gamma tocoferol y D-gamma tocotrenol
Vitamina C: L- ascorbato de calcio (neutro acido)
Selenio: L (+) metionina de selenio; todos de G.O Johnsen Ejemplo 3
5 Bebida que comprende acidos grasos omega-3 marinos frescos emulsificados y licopeno y luteina.
%
Extracto de romero 201
0,020
Toco 50
0,01
Grindsted 3115
1,00
Protema de suero
0,45
Concentrado de manzana
6,23
Concentrado de granada
2,40
Concentrado de Aronia
0,88
Concentrado de pera
5,56
Agua, purificada
81,48
Sabor a naranja/mandarina
0,10
Sabor a frambuesa
0,20
Aceite marino
1,50
Lyconat (6% de licopeno)
0,12
Lutenat (10% de luteina)
0,05
Suma
100,00
Extracto de romero 201, Toco 50 y Grindsted 3115 de Dansico Protema de suero de Arla Foods Agentes saborizantes naturales de Firmenich 10 Licopeno natural (Lyconat) de Vitatene Luteina natural (Lutenat) de Vitatene Ejemplo 4
Bebida que comprende acidos grasos omega-3 marinos frescos emulsificados y luteina.
%
Extracto de romero 201
0,020
Toco 50
0,01
Grindsted 3115
1,00
Concentrado de manzana
3,23
Conc.de granada
1,40
Concentrado de uva
2,56
Leche de soja
58,40
Agua, purificada
31,42
Sabor a albaricoque
0,25
Sabor a limon
0,10
Aceite marino
1,50
Luteina
0,11
Suma
100,00
Extracto de romero 201, Toco 50 y Grindsted 3115 de Danisco Agentes saborizantes naturales de Firmenich
5 Aceite de salmon por Marine Harvest Ingredients, valor Totox por debajo de 5 y procesado de acuerdo con estandares funcionales de aceite
Luteina natural (Lutenat 10% OS) de Vitatene, Italia
Ejemplo 5
Bebida que comprende acidos grasos omega-3 marinos frescos emulsificados y CoQ10 y selenio.
%
Extracto de romero 201
0,02
Toco 50
0,01
Protemas de suero
0,35
Grindsted 3115
1,20
Concentrado de manzana
6,66
Concentrado de granada
1,90
Concentrado de Aronia
2,56
Agua, purificada
84,15
Saborizante a mangostino
0,25
Saborizante Umbu
0,10
Aceite marino
2,50
CoQ10 (10%)
0,30
Selenio
50 |ig
Vitamina D
1,5 |ig
suma
100,00
10
Extracto de romero 201, Toco 50 y Grindsted 3115 de Dansico Agentes saborizantes naturales de Cargill
Selenio suministrado por: Sinochem Hebei corporation, 707 Lianmeng, Shijiazhuang, China Coenzyme Q10 de DSM
15 Vitamina D de G.O Johnsen
Protemas de suero (Lacprodan) de Arla Foods
5
10
15
20
25
30
35
40
Ejemplo 6
Procedimiento de produccion
1. Fase de aceite
Se mezcla el aceite con extracto de romero, Toco 50 (una preparacion antioxidante favorable para la estabilizacion del aceite). Es importante que durante el procesamiento, el aceite este protegido contra la oxidacion. Despues de ello, se anade el emulsificante (Grindsted 3115) al aceite, se mezcla suavemente a temperatura ambiente hasta obtener una mezcla homogenea. Se anaden entonces los agentes saborizantes.
2. Antioxidantes
Se mezclan los antioxidantes solubles en aceite con la fase de aceite, y se mezclan los antioxidantes solubles en agua con la fase acuosa, antes del calentamiento. Opcionalmente, se mezclan los antioxidantes solubles en agua con la fase acuosa, despues del calentamiento mediante sistemas especializados tales como Flexdose (Tetra Pack solution), o se anaden dentro de un tanque esteril a traves de un procedimiento ultra puro.
3. Fase acuosa
Se llena un tanque con agua purificada y desionizada. Se anade la fase de aceite a la fase acuosa.
Opcionalmente, puede mezclarse la fase de aceite con la fase acuosa, despues de lo cual se anade el emulsificante y se obtiene una emulsion. Se anaden entonces los concentrados de fruta a la emulsion obtenida y se mezcla completamente.
Alternativamente, la emulsion obtenida puede ser sometida a una pasteurizacion rapida (aproximadamente 90°C por 8 s), seguida por homogenizacion y enfriamiento a una temperatura de 4 - 8°C.
Finalmente se empaca la bebida en recipientes asepticos hermeticos, preferiblemente recipientes de una sola dosificacion, por ejemplo Tetra Brick de aproximadamente 200ml y se almacena a 6-8°C hasta el uso.
Tiene que implementarse estricto control de oxfgeno en todos los pasos, para evitar la oxidacion del aceite marino.
Efectos promotores de la salud de la bebida de acuerdo con la invencion
Materiales y procedimientos
Para investigar los efectos fisiologicos de la bebida de acuerdo con la invencion, se ha analizado la oxidacion de PUFAs en membranas de celula. Se uso un sensor fluorescente de peroxidacion de lfpidos llamado difenil-1- pirenilfosfina (DPPP), para evaluar la peroxidacion de lfpidos. La DPPP se incorpora rapidamente dentro de la membrana celular, y por oxidacion emite luz, la cual puede ser medida mediante un fluorometro (Okimotoa et al., FEBS Letter, junio de 2000). Se analizaron y compararon muestras de acuerdo con la invencion y muestras que contienen aceite de pescado de capsulas comercialmente disponibles de aceite marino.
Preparacion de la muestra
Se uso bebida como se describe en el Ejemplo 3 y se identifico como muestra 1 = Smartfish.
La bebida contiene 900 mg de omega-3 por 200 ml de bebida. Las cantidades de licopeno y luteina eran 16 mg y 10 mg de luteina por 900 mg de omega-3, respectivamente.
Fecha de caducidad: 15 de agosto de 2009. Sabor y olor fresco frutal. No pudo experimentarse olor o sabor de aceite de pescado. Apariencia homogenea jugosa roja oscura.
Se prepararon muestras de referencia a partir de capsulas comercialmente disponibles que contienen aceite marino.
Muestra 1 de referencia = Triomega
Triomega (Numero de lote: 56416408; Midelfart) que contiene 620mg de omega-3 por g de aceite.
Fecha de caducidad: 06 de noviembre de 2010. Color: Claro. Olor: Debil pero detectable.
Muestra 2 de referencia= Omega 3
Omega 3 (Numero de lote: 58212708 , Eldorado) que contiene 570 mg de omega-3 por g de aceite.
Fecha de caducidad: 27 de octubre de 2010. Color: claro; Olor: debil pero detectable Muestra 3 de referencia= Direct Care
CAREMAX (Numero de lote 71105, Direct Care) que contiene 600 mg de omeg-3 por g de aceite.
Fecha de caducidad: octubre de 2009; Color: marron; Olor: fuerte.
5 Las muestras 1 y 2 de referencia estan disponibles en las tiendas y fueron compradas en tiendas de comestibles. La muestra 3 de referencia 3 fue ordenada via internet.
Los aceites marinos fueron recolectados de las capsulas usando una jeringa y se mezclaron con el mismo emulsificante que se usa en la bebida de acuerdo con la invencion, es decir Grindsted 3115. Se mezclaron 1,5 g de aceite marino con 0,75 g de emulsificante (aceite marino:emulsificante 2:1). Se anadio medio celular para dar un 10 volumen total de 10 ml para dar una emulsion aceite-en-agua. Luego de la adicion de medio se sometio a agitacion con vortex.
A la muestra 1 se anade licopeno y luteina. Asf, los aceites marinos de las capsulas fueron suplementados con licopeno y luteina para corresponder a la cantidad de licopeno y luteina presentes en la muestra 1.
Licopeno y luteina fueron comprados de Sigma-Aldrich y disueltos en DMSO (Sigma-Aldrich) hasta soluciones 15 madre que contienen 3,6 pg/ml o 2,2 pg/ml, respectivamente. Se anadieron 10 pl de las soluciones madre a 316 pl de aceite marino de las muestras de referencia, para alcanzar las cantidades correspondientes de licopeno y luteina como en la muestra 1 de la invencion. La tabla 1 dada a continuacion muestra la preparacion de soluciones madre y la adicion a las muestras de referencia.
Tabla 1: preparacion de soluciones madre y adicion de licopeno y luteina
Licopeno en DMSO Luteina en DMSO Vol anadido a 3.160 pM de w3
Solucion madre
3,6 pg/pl (1 mg/277 pl DMSO) 2,2 pg/pl (1 mg/454 pl DMSO) 10 pl de cada uno
20 Tabla 2: Resumen de la preparacion de muestras
Omega-3 (w 3) Mol w 3 /g Licopeno Luteina
Muestra 1 Smartfish
900 mg/200 ml de jugo 14 pmol/g de jugo 16 mg/900 mg w 3 10 mg/900 mg w 3
Muestra 1 de referencia Triomega
620 mg/g de aceite 1,94 mmol/g de aceite 11 mg/620 mg w 3 6,8 mg/620 mg w 3
Muestra 2 de referencia Omega 3
570 mg /g de aceite 1,78 mmol/g de aceite 10,1 mg/570 mg w 3 10,1 mg/570 mg w 3
Muestra 3 de referencia Direct care
600 mg/g de aceite 1,87 mmol/g de aceite 10,7 mg/600 mg w 3 10,7 mg/600 mg w 3
Para todas las muestras
18pg /mg w 3 11pg /mg w 3
Celulas
U937 (ATCC No CRL-1593.2mr), una lmea celular de monoblasto humano, que fueron infectadas de manera estable con NF-kB-RE acoplada con luciferasa. Las celulas fueron cultivadas en RPMI + L-glut, 10 % FCS, 2x P/S, 25 higromicina.
Las celulas fueron incubadas con muestra 1 y muestras 1-3 de referencia en concentraciones de acidos grasos omega-3 que variaban de 1 pM a -3.000 pM para 48 horas. Las muestras fueron suplementadas con lipoprotema lipasa, la cual hidroliza y libera acidos grasos desde la estructura de los trigliceridos, como se describe abajo.
Sonda para peroxidacion de lipidos:
Se compro difenil-1-pirenilfosfina (DPPP, D7894, numero de lote 29055W) de Invitrogen. MW 386,43 g/mol, 5 mg. Excitacion/emision: 351/380 nm. Solucion madre: 5 mM (5 mg en 2,6 ml de DMSO).
Lipasa
5 Se anadieron 10 unidades de lipoprotema lipasa de leche bovina (de Sigma-Aldrich, L2254, numero de lote 114K7430) a las celulas que contienen las concentraciones mas altas de acidos grasos omega-3 en los aceites marinos. A continuacion de la dilucion de las muestras, se diluyo la lipasa de manera acorde. Asf, la minima concentracion de las muestras ricas en omega-3 (1 |jM) contema 0,003 unidades de lipoprotema lipasa.
Tratamiento de las celulas y mediciones de oxidacion de DPPP, LDH y contenido de protema
10 Se prepararon la muestra 1 de acuerdo con la invencion y muestras 1-3 de referencias que contienen licopeno y luteina, como soluciones madre que contienen 14.000 jM y 300.000 jM de acidos grasos omega-3, respectivamente. Las concentraciones de acidos grasos omega-3 fueron calculadas sobre la base de contenido de omega-3 listado en las descripciones de producto. Dado que las muestras son aceites de pescado, los acidos grasos omega-3 son presentados a las celulas como trigliceridos y no como acidos grasos libres. Ellos fueron 15 diluidos adicionalmente para dar concentraciones finales en el medio celular, que variaban de 1 a 3.160 jmol/L en triplicados (vease la tabla 5 para el ajuste de la placa). Se anadieron licopeno, luteina y lipoprotema lipasa a muestras diluidas destinadas a celulas con 3.160 jM de omega-3, y se diluyeron adicionalmente de acuerdo con las tablas 3 y 4. Se inocularon celulas (105) en placas de 96 pozos con 100 jl de medio. Antes de la adicion de las muestras, se cambio el medio y a las celulas se anadieron 50 jl de medio/pozo. Luego se anadieron a las celulas 20 50 jl de las diferentes diluciones que contienen todos los ingredientes indicados. Se incubaron entonces las celulas
por 48 h a 37 °C y se prepararon para la evaluacion de fluorescencia con DPPP, de acuerdo con un procedimiento ligeramente modificado, descrito por Okimotoa (Okimotoa et al., FEBS Letter, junio de 2000)
Tabla 3: diluciones de muestra 1 de acuerdo con la invencion
Conc. (jM) Omega-3 Vol (jL) Vol del medio (jL) Vol total (jL)
Madre de aceite
14.000 2.000
6.320* 450 550 1.000
2.000* 316 684 1.000
632* 316 684 1.000
200* 316 684 1.000
63,2* 316 684 1.000
* o CM 316 684 1.000
6,32* 316 684 1.000
2* 316 684 1.000
Tabla 4: dilucion de muestras 1-3 de referencia
Conc. (jM) Omega-3 Vol (jL) Vol del medio (jL) Vol total (jL)
Madre de aceite
300.000
6.320* 21 979 1.000
2.000* 316 684 1.000
632* 316 684 1.000
200* 316 684 1.000
63,2* 316 684 1.000
* o CM 316 684 1.000
6,32* 316 684 1.000
2* 316 684 1.000
*las concentraciones estan indicadas como 2x de la concentracion final en el medio celular, porque fue diluida adicionalmente cuando se anadieron 50pl de las soluciones a las celulas que contienen 50 pl de medio celular.
Tabla 5: ajuste de placa; concentracion de Omega-3
DPPP
+ + + +
Lipasa
+ + + +
Muestra 1 "Smartfish" Muestra 1 de referencia "Triomega" Muestra 2 de referencia "Omega 3" Muestra 3 de referencia "Care direct"
1 2 3 CO LO (J) 00 10 11 12
A
3.160 pM 3.160 pM 3.160 pM 3.160 pM
B
1.000 pM 1.000 pM 1.000 pM 1.000 pM
C
316 pM 316 pM 316 pM 316 pM
D
100 pM 100 pM 100 pM 100 pM
E
31,6 pM 31,6 pM 31,6 pM 31,6 pM
F
10 pM 10 pM 10 pM 10 pM
G
3,16 pM 3,16 pM 3,16 pM 3,16 pM
H
1 pM 1 pM 1 pM 1 pM
Para mediciones con DPPP, se lavaron las celulas 2 veces en solucion salina amortiguada con fosfato y se anadio 5 DPPP hasta una concentracion final de 50 pmol/L. Esto fue hecho en condiciones de oscuridad para evitar la oxidacion de DPPP inducida por la luz. Se midio entonces la fluorescencia de las celulas que contienen la DPPP, usando un espectrofluorometro (Spectramax Molecular Devices) 3 horas despues de la adicion de DPPP.
Las mediciones de protema fueron hechas en productos de lisis celular despues de las evaluaciones de DPPP. Las protemas fueron medidas de acuerdo con un kit Bio-rad (ensayo de absorbancia colorimetrica), y usadas para 10 calcular los valores relativos.
5
10
15
20
25
Resultados
La Tabla 6 muestra valores fluorescentes normalizados en Smartfish, emulsion (control) y muestras de referencia, a continuacion de la incubacion de celulas U937 por 48 h. La fluorescencia esta basada en la oxidacion de DPPP con subsiguiente cambio de la intensidad fluorescente. Los datos son presentados como valores normalizados corregidos para el contenido de protema en productos de lisis celular. Se indica +/- la desviacion estandar.
Tabla 6
Concentraciones de Omega-3
Muestra 1 Smartfish Emulsion de control Muestra 1 de referencia Triomega Muestra 2 de referencia Omega 3 Muestra 3 de referencia Care direct
1 pM
DPPP SD 100,0 +/-7,0 100,0 +/-7,9 100,0 +/-2,1 100,0 +/-4,7 100,0 +/-9,6
3,16 pM
DPPP SD 98,0 +/-7,5 100,0 +/-8,0 97,7 +/-1,1 101,2 +/-8,6 101,6 +/-6,7
10 pM
DPPP SD 97, +/- 66,2 98,4 +/-3,8 106,2 +/-5,5 106,1 +/-13,3 111,9 +/-4,6
31,6 pM
DPPP SD 102,2 +/-9,8 101,8 +/-2,1 106,0 +/-9,7 117,9 +/-17,0 114,9 +/-8,9
100 pM
DPPP SD 95,1 +/-9,9 105,1 +/-3,7 98,5 +/-0,8 132,1 +/-23,5 121,7 +/-11,8
316 pM
DPPP SD 94,2 +/-14,2 113,3 +/-3,7 107,2 +/-11,1 132,9 +/-19,2 137,1 +/-8,1
1.000 pM
DPPP SD 97,2 +/-7,6 102,3 +/-11,5 110,6 +/-2,7 136,3 +/-43,6 168,9 +/-11,7
3.160 pM
DPPP SD 95,2 +/-15,1 98,2 +/-9,2 121,9 +/-13,0 176,0 +/-31,7 239,1 +/-12,8
Efecto de aceites marinos en la peroxidacion de lipidos en celulas U937
Los resultados muestran que no se observo oxidacion detectable de lfpidos en celulas incubadas con la muestra de acuerdo con la invencion, a ninguna de las dosificaciones usadas, cuando se compara con los controles que recibieron solo medio celular (datos no mostrados) o una emulsion sin aceite anadido. Para las muestras de referencia, se encontro un aumento en la peroxidacion de lfpidos, dependiente de la dosificacion. De modo notable, el grado de peroxidacion de lfpidos era coincidente con el olor y apariencia de color de los productos de aceite marino. Olor y color son indicativos de la oxidacion del aceite. La adicion de licopeno y luteina a los aceites en concentraciones comparables con las de la muestra 1 de acuerdo con la invencion, no fue suficiente para inhibir la peroxidacion de lfpidos.
Como se aprecia en la tabla 6 y en la figura 1, no se observo efecto en fluorescencia mediada por DPPP, con las dos concentraciones mas bajas, es decir 1 pM y 3.16 pM, de la muestra de acuerdo con la invencion o las muestras de referencia. Esto indica que a estas concentraciones no ha ocurrido peroxidacion detectable de lfpidos en la membrana de la celula. A mayores concentraciones se observa un debil aumento para todos los aceites, exceptuando la muestra de acuerdo con la invencion. Desde 10 pM y hacia arriba, parece ser evidente un cambio gradual en la senal. A 100 pM hay una diferencia significativa entre la muestra 1 de acuerdo con la invencion y la muestra 3 de referencia, (Care direct) (p=0,045), mientras se nota una tendencia para la muestra 1 de referencia (Triomega) y muestra 2 de referencia (Omega 3). A 316 pM y 1000 pM se hallo una diferencia significativa entre la
5
10
15
20
25
30
muestra de acuerdo con la invencion y todas las muestras de referencia. La diferencia fue incluso mas pronunciada a la maxima concentracion, es decir 3.160 pM. El maximo grado de peroxidacion de Upidos fue hallado con la muestra 3 de referencia (Care direct), mientras la muestra 1 de referencia (Triomega) dio el menor grado de peroxidacion de lfpidos, de los tres productos comercialmente disponibles de aceite marino. De modo notable, la muestra de acuerdo con la invencion no afecto la peroxidacion de lfpidos en ninguna de las concentraciones usadas.
Los estudios en seres humanos han mostrado que la ingestion de acidos grasos omega-3 como suplementos puede alcanzar 10-20 % del total de acidos grasos en plasma (revision de Masson et al., J Cardiovasc.Med, 2007). Dado que las concentraciones de los acidos grasos totales en plasma, como trigliceridos, estan en el intervalo de 1-5 mM, las concentraciones de aceite de pescado en plasma pueden alcanzar 100 a 1.000 pM despues de la ingesta oral de aceite de pescado. En el presente estudio se encontro aumento en la peroxidacion de lfpidos para todas las muestras de referencia en este intervalo de concentracion, lo cual puede ser mirado como fisiologicamente relevante.
De modo sorprendente se ha encontrado que la muestra 1 de acuerdo con la invencion ofrece una mayor proteccion contra la peroxidacion de lfpidos, comparada con las muestras de referencia. No se encontro cambio detectable en la peroxidacion de lfpidos para ninguna de las concentraciones usadas para la muestra 1. Se observo un incremento dependiente de la dosificacion, en la peroxidacion de lfpidos para todas las tres muestras de referencia, independientemente del hecho segun el cual la vida util de todas las capsulas no habfa expirado y todas las capsulas conteman antioxidantes para estabilizar el aceite de pescado durante el almacenamiento. El efecto sobre la peroxidacion de lfpidos de los comprimidos a base de aceite marinos, fue diferente entre los proveedores. El olor mas fuerte de aceite de pescado y coloracion del aceite (marron), que son indicativos de la oxidacion, fueron encontrados en la muestra 3 de referencia (Care direct), lo cual dio como resultado mas peroxidacion de lfpidos. La vida util de este producto expira en octubre de 2009. Las muestras 1 y 2 de referencia que expiran en octubre/noviembre de 2010 indujeron tambien significativa peroxidacion de lfpidos de las celulas. La adicion de licopeno y luteina a las muestras de referencia no permitio evidentemente suficiente proteccion para inhibir la peroxidacion de lfpidos.
Asf, la presente invencion suministra una nueva formula de bebida, en la que el aceite fresco de pescado y los antioxidantes anadidos estan protegiendo las celulas contra la tension oxidativa de una manera mucho mas eficiente que los aceites de pescado disponibles comercialmente anadidos con cantidades correspondientes de antioxidantes. Dado que se cree que la tension oxidativa es responsable de una larga serie de enfermedades, esta nueva formula de bebida tiene un gran potencial como bebida promotora de la salud.

Claims (14)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    REIVINDICACIONES
    1. Bebida caracterizada porque la bebida comprende aceite marino fresco en una emulsion aceite-en-agua, en la que el aceite marino tiene un valor totox inferior a 10, y ademas anadida con por lo menos un antioxidante no presente naturalmente en dicha emulsion aceite-en-agua, en la que el contenido de aceite marino es 0,5% - 5% en peso basado en el peso total y en la que el por lo menos un antioxidante anadido es curcumina que no esta naturalmente presente en la fase de agua o fase de aceite, pero es anadido separadamente a la bebida.
  2. 2. Bebida de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que el valor totox es menor a 8.
  3. 3. Bebida de acuerdo con la reivindicacion 2, en la que el valor totox es menor a 5.
  4. 4. Bebida de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que el contenido de aceite marino es 0,5% - 3% en peso basado en el peso total.
  5. 5. Bebida de acuerdo con la reivindicacion 4, en la que el contenido de aceite marino es 1,5% - 2,5% en peso basado en el peso total.
  6. 6. Bebida de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la fase acuosa en la emulsion aceite-en-agua comprende antioxidantes naturales presentes de modo natural en la fase acuosa.
  7. 7. Bebida de acuerdo con la reivindicacion 6, en la que la fase acuosa es una base de jugo.
  8. 8. Bebida de acuerdo con la reivindicacion 6, en la que la fase acuosa es una base de te.
  9. 9. Bebida de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la fase acuosa comprende ademas protemas.
  10. 10. Procedimiento de produccion de una bebida de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por los pasos de:
    a) se anaden antioxidantes y agentes saborizantes solubles en aceite, junto con el emulsificante a la fase de aceite,
    b) se anaden aditivos solubles en agua a la fase acuosa,
    c) se mezclan las fases de aceite y acuosa, hasta una emulsion homogenea,
    d) opcionalmente, la emulsion obtenida es sometida a procedimientos de pasteurizacion y/u homogenizacion,
    e) se enfna la emulsion obtenida y se envasa en recipientes desechables limpios; en el que todos los pasos son ejecutados bajo estricto control de oxfgeno.
  11. 11. Procedimiento para la produccion de una bebida de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizado por los pasos de:
    a) a la fase de aceite se anaden antioxidantes y agentes saborizantes solubles en aceite,
    b) a la fase acuosa se anaden aditivos solubles en agua,
    c) se mezclan las fases de aceite y acuosa, y se anade el emulsificante, seguido por mezcla suave para lograr una emulsion homogenea,
    d) opcionalmente se somete la emulsion obtenida a procedimientos de pasteurizacion y/u homogenizacion,
    e) se enfna la emulsion obtenida y se envasa en recipientes desechables limpios; en el que todos los pasos son ejecutados bajo estricto control de oxfgeno.
  12. 12. Bebida de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para su uso como un medicamento.
  13. 13. Bebida de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para su uso en profilaxis o tratamiento de cancer.
  14. 14. Bebida de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para su uso en profilaxis o tratamiento de trastornos neurologicos.
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